CN112877359A

CN112877359A - CRISPR/cas系统及其在构建INHA突变的高繁殖力猪核移植供体细胞中的应用

Info

Publication number: CN112877359A
Application number: CN202110171581.5A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 马翔; 曾为俊; 王磊; 程锐; 赵泽英; 陶裴裴; 黄彩云
Original assignee: Hangzhou Hexinyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2021-06-01

Abstract

本发明公开了CRISPR/cas系统及其在构建INHA突变的高繁殖力克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪INHA基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pKG‑GE3载体；所述的gRNA表达载体表达序列如SEQ ID NO：31所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

CRISPR/cas系统及其在构建INHA突变的高繁殖力猪核移植供体细胞中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CRISPR/cas9系统及其在构建INHA突变的高繁殖力克隆猪核供体细胞中的应用。

背景技术

猪是我国最早驯化的家畜之一，其在历史的长河中一直是人类重要的肉料动物。中国人爱食猪肉，与千百年来的饮食文化有关。2000年以来，猪肉在我国的肉类消费占比中都超过70％，是我国最主要的消费肉类。目前，我国有超过4000万头存栏的能繁母猪，如果每头母猪平均每胎能多产一头仔猪，按照每年两胎计算，我国就可以减少饲养300-400万头母猪，这将能够降低每头肉猪的饲养成本，提升养猪生产的经济效益。

影响猪产仔数的重要因素之一是猪的排卵数，排卵数受到促卵泡素(FSH)水平的影响，而FSH的分泌受一种性腺激素即抑制素(Inhibin)的调节。Inhibin具有强烈的抑制FSH分泌的作用，其可以反馈抑制垂体前叶FSH的释放，进而抑制卵泡的生长发育。Inhibin是一种由性腺分泌的糖蛋白激素，由一个α亚基和一个β亚基构成。β亚基有两种亚型：β_A和β_B，αβ_A构成Inhibin A,αβ_B构成Inhibin B。INHA基因编码Inhibinα亚基，该亚基是抑制素发挥生理功能必不可少的。已有研究证明，抑制INHA基因的表达能够促进卵泡的发育，提高排卵率。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。因此，本发明基于CRISPR/cas9系统进行了INHA基因的突变，并获得了Inhibin基因敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育高繁殖力猪种奠定了基础。INHA的功能丧失将能够有效提高雌性克隆猪的排卵率，进而提高其繁殖力，增加养猪业的经济效益。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于猪INHA基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供一种用于INHA基因编辑的靶点gRNA及其表达载体。

本发明的又一目的是提供所述的CRISPR/Cas9系统、gRNA表达载体的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪INHA基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；所述的gRNA表达载体表达序列如SEQ ID NO：31所示的gRNA。

作为本发明的一种优选，所述的gRNA表达载体以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架。

作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体是将SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子克隆到pKG-U6gRNA骨架载体所得。

作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

一种用于INHA基因编辑的靶点gRNA，序列如SEQ ID NO：37所示。

一种针对猪INHA基因的gRNA表达载体，以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架，表达SEQ ID NO：31所示的gRNA。

作为本发明的一种优选，所述的表达载体是将SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子克隆到pKG-U6gRNA骨架载体所得。

本发明所述的CRISPR/Cas9系统、所述的针对猪INHA基因的gRNA表达载体在构建高繁殖力克隆猪核供体细胞中的应用。

一种重组猪成纤维细胞，由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建INHA基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建INHA基因敲除的高繁殖力克隆猪中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。

而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)本发明针对INHA基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型，获得靶标基因突变的概率高达75％，大大优于使用胚胎注射技术的基因编辑递送方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得突变的概率。

(4)利用本发明所得到的突变型单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因突变的克隆猪，并且该突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应的基因编辑猪，可大大缩短基因编辑猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.1以18只猪的基因组DNA为模板采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3的步骤3.4中的测序峰图。

图12为实施例4中步骤4.4.4以基因组DNA为模板采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图13为实施例4中步骤4.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图14为实施例4中步骤4.4.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图15为实施例4中步骤4.4.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图16为实施例4中步骤4.4.5判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的构建

1.1构建质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(图5)，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQ ID NO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signal

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signal的片段(SEQ ID NO：7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

1.2构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)(图7)插入质粒pKG-U6gRNA(图6)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

实施例2质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.1靶点gRNA设计及构建

2.1.1使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计

RAG1-g4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)

合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)

RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)

RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。

2.1.2设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物

RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.12)

RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.13)

2.1.3gRNA重组载体的构建及克隆

1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；

2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA Oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应60min；

5)转化

按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。

2.1.4gRNA载体构建

1)将合成的RAG1-gRNA4S和RAG1-gRNA4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)将会表达SEQ ID NO.14所示的RAG1-gRNA4。

2.1.5gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认RAG1-gRNA4载体构建成功。

2.2猪原代成纤维细胞制备

2.2.1取初生从江香猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；

其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。

2.2.3用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基

(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，得到细胞沉淀以备下一步的细胞转染实验

2.3质粒配比优化

2.3.1共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.3.2共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon kit)与Neon TM transfectionsystem电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转DNA溶液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将上述2.2.6制备得到的细胞沉淀使用1ml PBS磷酸缓冲液(Solarbio)清洗，并转移到1.5ml离心管中，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μL细胞悬液，加入至步骤1)中的电转DNA液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；

5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；

6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后12-18h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

2.3.3基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.4.1共转染分组情况

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pX330摩尔比为3:1。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.4.2共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3筛选高效的INHA基因gRNA靶点

猪INHA基因信息：编码inhibin subunit alpha蛋白；位于猪5号染色体；GeneID为397386，Sus scrofa。猪INHA基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.XP_020930352.1(linear CON 12-JAN-2018)所示,氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。基因组DNA中，猪INHA基因具有2个外显子，其中第2外显子及其上下游各100bp序列如SEQ ID NO：16所示。

3.1INHA基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪INHA基因第2外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的INHA基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654。采用INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图10。

INHA-E2-JDF178：5’-CTGCGCTGTCCTCTCTGTTC-3’(SEQ ID NO：17)；

INHA-E2-JDR654：5’-AGTGCTGGGTGAGAAGGTTG-3’(SEQ ID NO：18)。

3.2靶点gRNA设计及构建

通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。

4个靶点分别如下：

sgRNA_INHA-E2-g1靶点：5’-CCTCTGCAGCAGGCGCAGCG-3’(SEQ ID NO：19)；

sgRNA_INHA-E2-g2靶点：5’-CCTGCTGCAGAGGCCCCCGG-3’(SEQ ID NO：20)；

sgRNA_INHA-E2-g3靶点：5’-GTGGCAGTCGGCGTGCACAG-3’(SEQ ID NO：21)；

sgRNA_INHA-E2-g4靶点：5’-AGATGTTGAGGGAAGCTCTG-3’(SEQ ID NO：22)。

合成的INHA基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

INHA-E2-gRNA1-S：5’-caccgCCTCTGCAGCAGGCGCAGCG-3’(SEQ ID NO：23)；

INHA-E2-gRNA1-A：5’-aaacCGCTGCGCCTGCTGCAGAGGc-3’(SEQ ID NO：24)；

INHA-E2-gRNA2-S：5’-caccgCCTGCTGCAGAGGCCCCCGG-3’(SEQ ID NO：25)；

INHA-E2-gRNA2-A：5’-aaacCCGGGGGCCTCTGCAGCAGGc-3’(SEQ ID NO：26)；

INHA-E2-gRNA3-S：5’-caccGTGGCAGTCGGCGTGCACAG-3’(SEQ ID NO：27)；

INHA-E2-gRNA3-A：5’-aaacCTGTGCACGCCGACTGCCAC-3’(SEQ ID NO：28)；

INHA-E2-gRNA4-S：5’-caccgAGATGTTGAGGGAAGCTCTG-3’(SEQ ID NO：29)；

INHA-E2-gRNA4-A：5’-aaacCAGAGCTTCCCTCAACATCTc-3’(SEQ ID NO：30)。

INHA-E2-gRNA1-S、INHA-E2-gRNA1-A、INHA-E2-gRNA2-S、INHA-E2-gRNA2-A、INHA-E2-gRNA3-S、INHA-E2-gRNA3-A、INHA-E2-gRNA4-S、INHA-E2-gRNA4-A均为单链DNA分子。

3.3制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。

分别合成INHA-E2-gRNA1-S和INHA-E2-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)表达SEQ ID NO：31所示的sgRNA_INHA-E2-g1。

分别合成INHA-E2-gRNA2-S和INHA-E2-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)表达SEQ ID NO：32所示的sgRNA_INHA-E2-g2。

分别合成INHA-E2-gRNA3-S和INHA-E2-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)表达SEQ ID NO：33所示的sgRNA_INHA-E2-g3。

分别合成INHA-E2-gRNA4-S和INHA-E2-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)。质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)表达SEQ ID NO：34所示的sgRNA_INHA-E2-g4。

3.4INHA基因不同靶点gRNA的编辑效率比较

从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用INHA-E2-JDF178和INHA-E2-JDR654组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图11。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为68％、5％、8％、1％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNA_INHA-E2-g1的靶点为最优靶点。

实施例4构建INHA基因敲除的从江香猪单细胞克隆

4.1猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

4.2使用构建好的pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞

配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。其中pKG-U6gRNA(INHA-E2-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

共转染操作方法同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

4.3INHA基因敲除单细胞克隆株的筛选

4.3.1将步骤4.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到每孔含100μL完全培养基的96孔板中，每孔放置一个细胞；

4.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；

4.3.3待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3细胞收集在1.5mL离心管中备后续基因型测定；

4.3.4待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

4.4INHA基因敲除的单细胞克隆鉴定

4.4.1向步骤4.3.3收集在1.5mL离心管中的细胞中加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞,得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后细胞裂解液于-20℃保存；

4.4.2采用前述针对INHA基因E14的引物对(INHA-E2-JDF178/INHA-E2-JDR654)，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增INHA基因靶点区域，检测单细胞克隆的靶基因突变情况，目的PCR产物长度为477bp；

4.4.3使用PCR常规反应扩增INHA基因靶点区域；

4.4.4将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图12，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。

4.4.5将测序结果与INHA靶点信息进行比对，从而判断该单细胞克隆是否为INHA基因敲除。

编号为2、4、9、12、20的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。编号为7、8、16的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为3、5、11、14、15、18、19的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为1、6、10、13、17的单细胞克隆的基因型为野生型。得到INHA基因编辑单细胞克隆的比率为75％，纯合敲除率为40％。

示例性的测序比对结果如图13至图16，其中图13是克隆号为INHA-1的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为野生型；图14是克隆号为INHA-5的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为杂合突变型；图15是克隆号为INHA-2的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图16是克隆号为INHA-7的测序结果与野生型参考序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表1：

表1 INHA基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

上述的杂合突变及纯合突变单细胞克隆株均可用来进行基因编辑猪的克隆生产。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> CRISPR/cas系统及其在构建INHA突变的高繁殖力猪核移植供体细胞中的应用

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060

caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420

gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447

<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccatccaa agtttttaaa gga 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtggcagat gtcacagttt agg 23

<210> 14

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 15

<211> 339

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 15

Met Gly Arg Gly Asp Trp Gly Gly Pro Gly Gln Thr Leu Thr Glu Gly

1 5 10 15

Ala Gln Gly Trp Val Trp Val His Arg Trp Gln Gly Gln Val Ser Tyr

20 25 30

Val Ala Ser Ala Ala Pro Leu Ala Val Gly Pro Thr Glu Trp Ala Trp

35 40 45

Leu Pro Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Cys Pro Gly Gln Gly Ala

50 55 60

Arg Cys Gly Asp Glu Pro Ala Ala Gly Glu Leu Ala Arg Glu Ala Glu

65 70 75 80

Glu Gly Leu Phe Thr Tyr Val Phe Arg Pro Ser Gln His Thr Arg Ser

85 90 95

Arg Gln Val Thr Ser Ala Gln Leu Trp Phe His Thr Gly Leu Asp Arg

100 105 110

Gln Gly Met Ala Ala Ala Asn Ser Ser Gly Pro Leu Leu Asp Leu Leu

115 120 125

Ala Leu Ser Ser Arg Gly Pro Val Ala Val Pro Met Ser Leu Gly Gln

130 135 140

Ala Pro Pro Arg Trp Ala Val Leu His Leu Ala Ala Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Leu Leu Thr His Pro Val Leu Val Leu Leu Leu Arg Cys Pro Leu Cys

165 170 175

Ser Cys Ser Ala Arg Pro Glu Ala Thr Pro Phe Leu Val Ala His Thr

180 185 190

Arg Ala Arg Pro Pro Ser Gly Gly Glu Arg Ala Arg Arg Ser Thr Ala

195 200 205

Pro Leu Pro Trp Pro Trp Ser Pro Ala Ala Leu Arg Leu Leu Gln Arg

210 215 220

Pro Pro Glu Glu Pro Ala Val His Ala Asp Cys His Arg Ala Ser Leu

225 230 235 240

Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Asp Arg Trp Ile Val His Pro

245 250 255

Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly Leu Pro Thr

260 265 270

Leu Pro Asn Leu Pro Leu Ser Val Pro Gly Ala Pro Pro Thr Pro Val

275 280 285

Gln Pro Leu Leu Leu Val Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys Ala Ala Leu

290 295 300

Pro Gly Thr Met Arg Ser Leu Arg Val Arg Thr Thr Ser Asp Gly Gly

305 310 315 320

Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr Gln His Cys

325 330 335

Ala Cys Ile

<210> 16

<211> 1034

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 16

gcaggctcct gagtggcagc cagatcctgc ctgttgagga ggaggggtcc caggttctgc 60

cagtcagggc tgccctctcc cttccttctg cctcctgcag gtgcccgctg tggggacgag 120

ccagctgctg gagagctggc ccgggaggct gaggagggcc tcttcacata tgtattccgg 180

ccgtcccagc acacacgcag ccgccaggtg acttcagctc agctgtggtt ccacacggga 240

ctggacagac aggggatggc agccgccaat agctctgggc ccctgctgga cctgctggca 300

ctatcatcca ggggtcctgt ggctgtgccc atgtcactgg gccaggcgcc ccctcgctgg 360

gctgtgctgc acctggccgc ctctgccctc cctttgttga cccacccagt cctggtgctg 420

ctgctgcgct gtcctctctg ttcctgctca gcccggcccg aggccacccc cttcctggtg 480

gcccacactc gggccaggcc acccagcgga gggggagagg gcccgacgct ccaccgcccc 540

tctgccctgg ccttggtccc ccgccgcgct gcgcctgctg cagaggcccc cggaggaacc 600

cgctgtgcac gccgactgcc acagagcttc cctcaacatc tccttccagg agctgggctg 660

ggaccggtgg atcgtgcacc ctcccagttt catcttccac tactgtcacg ggggctgcgg 720

gctgccgacc ctgcccaacc tgcccctgtc tgtccctggg gcccccccta cccctgtcca 780

gcccctgttg ttggtgccag gggctcagcc ctgctgcgct gctctcccgg ggaccatgag 840

gtccctacgc gttcgcacca cctcggatgg aggttactct ttcaagtacg agacagtgcc 900

caaccttctc acccagcact gtgcctgcat ctaagggtgt cccgctggtg gccaagctcc 960

cacaggcacc agcctggagg aaggcagagt tcccacctcc cctttccttc cgcctctccg 1020

cctggaggct cccc 1034

<210> 17

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcaggctcct gagtggcagc cagatcctgc ctgttgagga ggaggggtcc caggttctgc 60

cagtcagggc tgccctctcc cttccttctg cctcctgcag gtgcccgctg tggggacgag 120

ccagctgctg gagagctggc ccgggaggct gaggagggcc tcttcacata tgtattccgg 180

ccgtcccagc acacacgcag ccgccaggtg acttcagctc agctgtggtt ccacacggga 240

ctggacagac aggggatggc agccgccaat agctctgggc ccctgctgga cctgctggca 300

ctatcatcca ggggtcctgt ggctgtgccc atgtcactgg gccaggcgcc ccctcgctgg 360

gctgtgctgc acctggccgc ctctgccctc cctttgttga cccacccagt cctggtgctg 420

ctgctgcgct gtcctctctg ttcctgctca gcccggcccg aggccacccc cttcctggtg 480

ctgcgctgtc ctctctgttc 500

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agtgctgggt gagaaggttg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctctgcagc aggcgcagcg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cctgctgcag aggcccccgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtggcagtcg gcgtgcacag 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

agatgttgag ggaagctctg 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccgcctct gcagcaggcg cagcg 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaaccgctgc gcctgctgca gaggc 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caccgcctgc tgcagaggcc cccgg 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaacccgggg gcctctgcag caggc 25

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caccgtggca gtcggcgtgc acag 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaacctgtgc acgccgactg ccac 24

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caccgagatg ttgagggaag ctctg 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaaccagagc ttccctcaac atctc 25

<210> 31

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ccucugcagc aggcgcagcg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 32

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccugcugcag aggcccccgg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 33

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

guggcagucg gcgugcacag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 34

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

agauguugag ggaagcucug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种用于猪INHA基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；所述的gRNA表达载体表达序列如SEQ ID NO：31所示的gRNA。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA表达载体以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA表达载体是将SEQID NO：23和SEQ ID NO：24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子克隆到pKG-U6gRNA骨架载体所得。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的CRISPR/Cas9系统，其特征在于所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

5.一种用于INHA基因编辑的靶点gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO：37所示。

6.一种针对猪INHA基因的gRNA表达载体，其特征在于以全序列如SEQ ID NO.3所示的pKG-U6gRNA为载体骨架，表达SEQ ID NO：31所示的gRNA。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体是将SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子克隆到pKG-U6gRNA骨架载体所得。

8.权利要求1～4中任一项所述的CRISPR/Cas9系统、权利要求6或7所述的针对猪INHA基因的gRNA表达载体在构建高繁殖力克隆猪核供体细胞中的应用。

9.一种重组猪成纤维细胞，其特征在于由权利要求1～4中任一项所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

10.权利要求9所述的重组细胞在构建INHA基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建INHA基因敲除的高繁殖力克隆猪中的应用。