CN112608941B

CN112608941B - 用于构建mc4r基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用

Info

Publication number: CN112608941B
Application number: CN202011504254.9A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 马翔; 刘璐; 曾为俊; 王磊; 程锐; 赵泽英; 陶裴裴; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112608941A

Abstract

本发明公开了用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用。该系统包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，所述的gRNA表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG‑U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR 系统及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

背景技术

肥胖症(Obesity)是指体脂肪累积过多而对健康造成负面影响的身体状态，可能导致寿命减短及各种健康问题。尽管肥胖通常受到遗传和环境的共同影响，但肥胖症实际上是可遗传且由多基因作用的，只是不同人的易感性存在差异。在极少数情况下，遗传性肥胖症是由致病突变直接干扰能量稳态或脂肪沉积，例如人类单基因肥胖病的发生。其中，黑皮质素4受体(MC4R)基因的突变是造成人类先天性肥胖症最重要的基因之一。MC4R表达的增加可抑制食物的摄入，突变造成MC4R功能的丧失可引起肥胖、食欲亢进和严重的高胰岛素血症。因此，迫切需要开发出基于MC4R突变导致的先天性肥胖症动物模型以尽快解开发病机制谜团并为进一步的治疗奠定基础。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面的要求较低，且猪体型大小和生理功能与人类近似，是理想的人类疾病模型动物。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统。

本发明的另一目的是提供用于MC4R基因编辑的gRNA及其表达载体。

本发明的又一目的是提供所述的CRISPR/Cas9系统在构建MC4R基因突变的猪重组细胞中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体。

为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，我们在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；

5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：

1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；

2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；

3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；

4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；

5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；

6)转录终止信号：bGH polyA signal；

7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。

自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。

CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。

EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。

WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。

3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。

作为本发明的一种优选，针对猪MC4R基因的gRNA表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示。

作为本发明进一步优选,该表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA，其靶点如SEQIDNO.18所示。

作为本发明更进一步优选,所述的针对猪MC4R基因的gRNA表达载体由SEQ IDNO.26和SEQ ID NO.27所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得。

作为本发明的进一步优选,所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

一种重组细胞，由本发明所述的用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建MC4R基因敲除的克隆猪中的应用；优选在构建MC4R基因敲除的先天性肥胖症克隆猪中的应用。

针对猪MC4R基因的gRNA，序列如SEQ ID NO.22所示。

一种针对猪MC4R基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA；且该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体优选由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA的限制性内切酶BbsI位点所得。

本发明所述的CRISPR/Cas9系统、所述的gRNA表达载体在构建猪MC4R基因突变的猪重组细胞中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本也高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。

而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、营养代谢、疾病发病机制方面等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本较灵长类低得多；而且猪作为人类长期以来的肉食性动物，用猪作为疾病模型动物在动物保护和伦理等方面的要求较低。

(2)本发明针对猪MC4R基因设计了四个gRNA，从中筛选高效gRNA后再进行预设靶点的敲除，可有效降低后期鉴定筛选的工作量，并可直接用PCR产物测序来检测基因编辑效率。

(3)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(4)采用本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型[纯合突变(包括双等位基因相同变异的突变和双等位基因不同变异的突变)、杂合突变或野生型]，获得纯合突变的概率为30％～50％，大大优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得纯合突变的概率(低于5％)。

(5)利用本发明所得到的纯合突变单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因纯合突变的克隆猪，并且该纯合突变可稳定遗传。

在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得纯合突变后代的概率非常低(低于5％)，需要进行后代的杂交选育，这不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

本发明为通过基因编辑手段获得先天性肥胖症猪模型奠定了坚实的基础，将有助于研究并揭示由MC4R突变引起的先天性肥胖症发病机制，进一步的可用于进行药物筛选、药效检测、疾病病理、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为成功治疗人类因MC4R突变导致的先天性肥胖症提供有力的实验手段。本发明对于先天性肥胖症药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为质粒配比优化时的测序结果。

图9为质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较时的测序结果。

图10为实施例3中以18只猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3的步骤四中的测序峰图。

图12为实施例4中得到的单细胞克隆的靶基因PCR产物电泳图。

图13为编号MC4R-6的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。

图14为编号为MC4R-20的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。

图15为编号为MC4R-15的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。

图16为编号为MC4R-4的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO₂、5％O₂的恒温培养箱。

制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，除毛，然后用75﹪酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液。

实施例1、质粒的构建

1.1构建质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始质粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ IDNO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(图5)，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQ IDNO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signals

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signals的片段(SEQ ID NO：7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。

SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。

1.2构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)(图7)插入质粒pKG-U6gRNA(图6)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

实施例2、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

选择位于RAG1基因的高效gRNA靶点：

RAG1-gRNA4的靶点：5’-AGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：9)。

用于扩增和检测包含靶点的片段的引物如下：

RAG1-nF126：5’-CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA-3’(SEQ ID NO：10)；

RAG1-nR525：5’-TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG-3’(SEQ ID NO：11)

从初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。

一、制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。分别合成RAG1-4S和RAG1-4A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

RAG1-4S：5’-caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG-3’(SEQ ID NO：12)；

RAG1-4A：5’-aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc-3’(SEQ ID NO：13)。

RAG1-4S和RAG1-4A均为单链DNA分子。

二、质粒配比优化

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为：3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染致猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。

2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。培养总时间为48小时。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。

电泳后回收目的条带并进行测序，测序结果见图8。

通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。第一组至第三组的基因编辑效率依次为9％、53％、66％。第四组不发生基因编辑。结果表明，第三组编辑效率最高，确定单gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。三、质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

1、共转染

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。

通过利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的编辑效率。RAG1-B组不发生基因编辑。RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率依次为28％、68％。测序结果示例性峰图见图9。结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3、用于MC4R基因敲除的靶点筛选

猪MC4R基因信息：编码melanocortin 4receptor蛋白；位于猪1号染色体；GeneID为397359，Sus scrofa。猪MC4R基因编码的蛋白质如GENBANK ACCESSION NO.NP_999338.1(linear CON 12-JAN-2018)所示。基因组DNA中，猪MC4R基因具有1个外显子，其中第1外显子如SEQ ID NO：14所示，其编码的蛋白质片段如SEQ ID NO：15所示。一、MC4R基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。

分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用引物对(引物对的靶序列包括猪MC4R基因第12外显子)进行PCR扩增，然后进行电泳。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的MC4R基因序列进行比对分析。根据比对结果，设计用于检测突变的引物(引物本身避开可能的突变位点)。设计的用于检测突变的引物为：MC4R-E1-F/MC4R-E1-R。采用MC4R-E1-F/MC4R-E1-R组成的引物对对18只猪的基因组DNA进行PCR扩增后的电泳图见图10。

MC4R-E1-F：5’-TCCACTTCTGGAACCGCAG-3’(SEQ ID NO：16)；

MC4R-E1-R：5’-TCCAACCCGCTTAACTGTCAT-3’(SEQ ID NO：17)。

二、筛选靶点

通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。

4个靶点分别如下：

sgRNA_MC4R-E1-g1靶点：5’-CATCACCCTATTAAACAGCA-3’(SEQ ID NO：18)；

sgRNA_MC4R-E1-g2靶点：5’-CCTATTAAACAGCACGGACA-3’(SEQ ID NO：19)；

sgRNA_MC4R-E1-g3靶点：5’-ATGCTGGTGAGCGTTTCCAA-3’(SEQ ID NO：20)；

sgRNA_MC4R-E1-g4靶点：5’-CTACAGATGAAAAAGTACAT-3’(SEQ ID NO：21)。

三、制备重组质粒

取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。

分别合成MC4R-E1-gRNA1-S和MC4R-E1-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)。质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)表达SEQ ID NO：22所示的sgRNA_MC4R-E1-g1。

分别合成MC4R-E1-gRNA2-S和MC4R-E1-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g2)。质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g2)表达SEQ ID NO：23所示的sgRNA_MC4R-E1-g2。

分别合成MC4R-E1-gRNA3-S和MC4R-E1-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g3)。质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g3)表达SEQ ID NO：24所示的sgRNA_MC4R-E1-g3。

分别合成MC4R-E1-gRNA4-S和MC4R-E1-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g4)。质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g4)表达SEQ ID NO：25所示的sgRNA_MC4R-E1-g1。

MC4R-E1-gRNA1-S：5’-caccGCATCACCCTATTAAACAGCA-3’(SEQ ID NO：26)；

MC4R-E1-gRNA1-A：5’-aaacTGCTGTTTAATAGGGTGATGC-3’(SEQ ID NO：27)；

MC4R-E1-gRNA2-S：5’-caccGCCTATTAAACAGCACGGACA-3’(SEQ ID NO：28)；

MC4R-E1-gRNA2-A：5’-aaacTGTCCGTGCTGTTTAATAGGC-3’(SEQ ID NO：29)；

MC4R-E1-gRNA3-S：5’-caccGATGCTGGTGAGCGTTTCCAA-3’(SEQ ID NO：30)；

MC4R-E1-gRNA3-A：5’-aaacTTGGAAACGCTCACCAGCATC-3’(SEQ ID NO：31)；

MC4R-E1-gRNA4-S：5’-caccGCTACAGATGAAAAAGTACAT-3’(SEQ ID NO：32)；

MC4R-E1-gRNA4-A：5’-aaacATGTACTTTTTCATCTGTAGC-3’(SEQ ID NO：33)。

MC4R-E1-gRNA1-S、MC4R-E1-gRNA1-A、MC4R-E1-gRNA2-S、MC4R-E1-gRNA2-A、MC4R-E1-gRNA3-S、MC4R-E1-gRNA3-A、MC4R-E1-gRNA4-S、MC4R-E1-gRNA4-A均为单链DNA分子。

四、不同靶点的编辑效率比较

1、共转染

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g2)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g3)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3。

第五组：猪原代成纤维细胞，未进行任何转染操作。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后裂解细胞并提取基因组DNA，采用MC4R-E1-F和MC4R-E1-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。回收目标片段并进行测序，测序峰图见图11。利用Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为42％、36％、2％、0％。第五组不发生基因编辑。结果表明，第一组编辑效率最高，sgRNA_MC4R-E1-g1的靶点为最优靶点。

实施例4、制备MC4R基因编辑的单细胞克隆

用初生从江香猪(雌性，血型AO)的耳组织制备猪原代成纤维细胞。

1、共转染

将质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(MC4R-E1-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3。

3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，用完全培养液洗涤，再用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单细胞至96孔板的不同孔中(每个孔1个细胞，每个孔中装有100μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。

4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中用于后续的基因型测序检测)。

5、取步骤4的6孔板，培养至细胞长至80％汇合度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

6、取步骤4的离心管，取细胞，提取基因组DNA，采用MC4R-E1-FMC4R-E1-F和MC4R-E1-R组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照。电泳图见图12。图12中的泳道编号与表1中的细胞编号一致。

7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。

猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为野生型。如果某一单细胞克隆的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为杂合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单细胞克隆的基因型为野生型。

结果见表1。编号为4、5、54的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。编号为3、8、13、15、16、18、21、25、31、37、41、44、47、51的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为9、10、17、20、28、34、39、43、46、53、55的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为22的单细胞克隆没有扩增出目的条带，无法判断其基因型，其余单细胞克隆均为野生型，得到基因编辑单细胞克隆的比率为28/54(即52％)。

示例性的测序比对结果见图13至图16。图13是编号为MC4R-6的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为野生型。图14是编号为MC4R-20的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为杂合突变型。图15是编号为MC4R-15的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。图16是编号为MC4R-4的单细胞克隆的正向测序与野生型比对的结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型。

表1MC4R基因敲除的单细胞克隆基因型鉴定

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> 用于构建MC4R基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的CRISPR系统及其应用

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060

caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420

gcaagagatc ttcagcaacg agatggc 447

<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 480

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

gtcttctaac atgcggggac gtggaggaaa atcccggccc aaccgagtac aagcccacgg 960

tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtcccca gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg 1020

ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg atccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg 1080

agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg 1140

acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt 1200

tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

tcggagtctc gcccgaccac cagggcaagg gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag 1380

tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc 1440

tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac 1500

cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccccatccaa agtttttaaa gga 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtggcagat gtcacagttt agg 23

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 14

<211> 1999

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 14

agaagcagag gaggagccac tgtgcacatt tttttttccc cttcacacac cataaaaatc 60

acagaggcaa ctaacactca cagcaaagct tcaggttggg aactgattct ctctgcgagg 120

cagctgatct gagcatgcgc acacagattc attcttctcc caatagcaca gcagccgcta 180

ggaaaattat tttgaaaaga cctgaatgca ttaagactaa agttaaagtg gaagtgagaa 240

caaaatatca aacagcagac tcgacagaga atgagcgtct tgaagcctaa gatttcaaag 300

tgatgctaat cagagcccta cctgaaagag actaaaaact ccatttcaag cttcggagca 360

tgtgatattt attcacaaca ggcattccaa tttcagcctc ataactttca gacagataaa 420

gacttggaga aaatcgctga ggctacctga cccaggagct taaatcaggt cagaggggat 480

ctcaacccac ctggcgcagg atgaactcaa cccatcacca tggaatgcat acttctctcc 540

acttctggaa ccgcagcacc tacggactgc acagcaatgc cagtgagccc cttggaaaag 600

gctactctga aggaggatgc tacgagcaac tttttgtctc tcctgaggtg tttgtgactc 660

tgggtgtcat aagcctgttg gagaacattc tggtgattgt ggccatagcc aagaacaaga 720

atctgcattc acccatgtac tttttcatct gtagcctggc tgtggctgat atgctggtga 780

gcgtttccaa tgggtcagaa accattgtca tcaccctatt aaacagcacg gacacggacg 840

cacagagttt cacagtgaat attgataatg tcattgactc agtgatctgt agctccttac 900

tcgcctcaat ttgcagcctg ctttcgattg cagtggacag gtattttact atcttttatg 960

ctctccagta ccataacatt atgacagtta agcgggttgg aatcatcatc agttgtatct 1020

gggcagtctg cacggtgtcg ggtgttttgt tcatcattta ctcagatagc agtgctgtta 1080

ttatctgcct cataaccgtg ttcttcacca tgctggctct catggcttct ctctatgtcc 1140

acatgttcct catggccaga ctccacatta agaggatcgc cgtcctccca ggcactggca 1200

ccatccgcca aggtgccaac atgaaggggg caattaccct gaccatcttg attggggtct 1260

ttgtggtctg ctgggccccc ttcttcctcc acttaatatt ctatatctcc tgcccccaga 1320

atccatactg tgtgtgcttc atgtctcact ttaatttgta tctcatcctg atcatgtgta 1380

attccatcat cgatcccctg atttatgcac tccggagcca agaactgagg aaaaccttca 1440

aagagatcat ctgttgctat cccctgggtg gcctctgtga tttgtctagc agatattaaa 1500

tggggacaga ggagacttat aaatgcaagc ataagagact ttctccttac acagtctgga 1560

caatatgctt caacaacagc attttcttgt aaggcatcag ttgagacatt ctattgtata 1620

aatttaagtt cgtgattctg ctcagtctct gtgtattttt aaggtcttgc taccttttgg 1680

ctgtaaaatg tttatctata ctacaggtta taggcacaat ggatttataa aaaagaaaaa 1740

agtccttatg aaaagttaat taatgtatct tgtcattcga aaggatttga cacattgctt 1800

gttttagtaa aatggaaatc acagtttcat taaatatatc ctaataaatg gttgctaata 1860

ttacactata caacgctgaa gtgtagaggt ttgattctag cattgagggg agaaatactg 1920

aaacaagtgt ttaatcatta aaaaataagc tgaaatttca actaatttaa taaaacatgc 1980

tcattctccc tgtgcagaa 1999

<210> 15

<211> 213

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 15

Met Asn Ser Thr His His His Gly Met His Thr Ser His Trp Asn Arg

1 5 10 15

Ser Thr Tyr Gly His Ser Asn Ala Ser Gly Lys Gly Tyr Ser Gly Gly

20 25 30

Cys Tyr Val Ser Val Val Thr Gly Val Ser Asn Val Val Ala Ala Lys

35 40 45

Asn Lys Asn His Ser Met Tyr Cys Ser Ala Val Ala Asp Met Val Ser

50 55 60

Val Ser Asn Gly Ser Thr Val Thr Asn Ser Thr Asp Thr Asp Ala Ser

65 70 75 80

Thr Val Asn Asp Asn Val Asp Ser Val Cys Ser Ser Ala Ser Cys Ser

85 90 95

Ser Ala Val Asp Arg Tyr Thr Tyr Ala Tyr His Asn Met Thr Val Lys

100 105 110

Arg Val Gly Ser Cys Trp Ala Val Cys Thr Val Ser Gly Val Tyr Ser

115 120 125

Asp Ser Ser Ala Val Cys Thr Val Thr Met Ala Met Ala Ser Tyr Val

130 135 140

His Met Met Ala Arg His Lys Arg Ala Val Gly Thr Gly Thr Arg Gly

145 150 155 160

Ala Asn Met Lys Gly Ala Thr Thr Gly Val Val Val Cys Trp Ala His

165 170 175

Tyr Ser Cys Asn Tyr Cys Val Cys Met Ser His Asn Tyr Met Cys Asn

180 185 190

Ser Asp Tyr Ala Arg Ser Arg Lys Thr Lys Cys Cys Tyr Gly Gly Cys

195 200 205

Asp Ser Ser Arg Tyr

210

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccacttctg gaaccgcag 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tccaacccgc ttaactgtca t 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

catcacccta ttaaacagca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctattaaac agcacggaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgctggtga gcgtttccaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctacagatga aaaagtacat 20

<210> 22

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caucacccua uuaaacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 23

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccuauuaaac agcacggaca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 24

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

augcugguga gcguuuccaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 25

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cuacagauga aaaaguacau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

caccgcatca ccctattaaa cagca 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aaactgctgt ttaatagggt gatgc 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caccgcctat taaacagcac ggaca 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aaactgtccg tgctgtttaa taggc 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caccgatgct ggtgagcgtt tccaa 25

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaacttggaa acgctcacca gcatc 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caccgctaca gatgaaaaag tacat 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaacatgtac tttttcatct gtagc 25

Claims

1.一种用于猪MC4R基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含Cas9表达载体和针对猪MC4R基因的gRNA表达载体；所述的Cas9表达载体为质粒全序列如SEQ ID NO.2所示的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体；所述的针对猪MC4R基因的gRNA表达载体由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27所示的单链DNA退火而成的双链插入载体骨架pKG-U6gRNA所得；该表达载体表达SEQ ID NO.22所示的gRNA，其靶点如SEQ ID NO.18所示；所述的的载体骨架pKG-U6gRNA的质粒全序列如SEQ ID NO.3所示；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为3:1。

2.一种敲除猪MC4R基因的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

3.权利要求2所述的重组细胞在构建MC4R基因敲除的克隆猪中的应用。

4.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪MC4R基因敲除的猪重组细胞中的应用。