CN112680453B

CN112680453B - Crispr系统及其在构建stxbp1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用

Info

Publication number: CN112680453B
Application number: CN202110106168.0A
Authority: CN
Inventors: 牛冬; 汪滔; 陶裴裴; 曾为俊; 王磊; 程锐; 赵泽英; 马翔; 黄彩云
Original assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Current assignee: Nanjing Qizhen Genetic Engineering Co Ltd
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112680453A

Abstract

本发明公开了CRISPR系统及其在构建STXBP1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用。一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含序列如SEQ ID NO.2所示的Cas9高效表达载体pKG‑GE3和针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体，该载体以序列如SEQ ID NO.3所示的pKG‑U6gRNA为载体骨架，表达序列如SEQ ID NO.35所示的gRNA。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体有了显著的提高。

Description

CRISPR系统及其在构建STXBP1突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

背景技术

癫痫(Epilepsy)即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。由于异常放电的起始部位和传递方式的不同，癫痫发作的临床表现复杂多样，可表现为发作性运动、感觉、自主神经、意识及精神障碍等症状。癫痫患者经过正规的抗癫痫药物治疗，约70％的患者其发作是可以得到控制的，其中50％～60％的患者经2～5年的治疗可以痊愈，患者可以和正常人一样地工作和生活。癫痫的发病机制非常复杂，中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致癫痫发作，其主要与离子通道神经递质及神经胶质细胞的改变有关。

癫痫性脑病(Epileptic encephalopathies，EEs)是癫痫性异常导致进展性脑部功能障碍，是一种儿童期常见的脑部疾病，以多种严重的癫痫症候群为特征的神经系统功能紊乱性疾病。EEs是发生在婴儿和儿童的严重痉挛性疾病，首次发病多见儿童、青年时期，男性高于女性，儿童死亡率是成人的10倍，然而病因、发病机制仍不十分明确，年龄依赖性是EEs的共同特征，早发性癫痫性脑病(Early-onset epileptic encephalopathies，EOEE)包括早发性肌阵挛脑病(Early myoclonic epileptic encephalopathy，EMEE)、大田原综合征(Ohtahara syndrome，OS)、婴儿恶性游走性部分性癫痫(Malignant migratingpartial seizures in infancy，MMPSI)、West综合征、Lennox-Gastaut(LGS)综合征及Dravet综合征等。

大田原综合征是由日本学者大田原(Ohtahara)于1977年首次报道，是一种早期婴儿型癫痫性脑病，伴抑制-爆发波型脑电图改变，是年龄依赖性癫痫性脑病的一种，其主要特点为3个月以内特别是新生儿期发病，频繁的成串或单次强直痉挛发作，多数在清醒和睡眠中均可见到。患儿多有非对称性先天性脑结构异常，治疗困难，发作难以控制，据国外文献报导，约1/3的患儿在两岁内死亡，存活到学龄期的患儿多伴有严重的精神、运动发育障碍，预后极差。

突触融合蛋白结合蛋白1(STXBP1，也称为MUNC18-1)是突触前神经递质释放机制的重要组成部分，由STXBP1基因编码，在神经元中表达，调节神经元钙通道敏感性，负责突触间神经递质的释放，促进突触囊泡的沉淀与膜融合，参与突触囊泡循环。在人类中，STXBP1杂合突变导致了几种最严重的癫痫性脑病，包括大田原综合征、West综合征、Lennox-Gastaut综合征、Dravet综合征以及其他类型的早发性癫痫性脑病。此外，STXBP1是散发性智力障碍和发育障碍中最常见的突变基因之一。所有STXBP1脑病患者均表现出智力残疾，大部分为中度至重度，并且95％的患者患有癫痫病。超过90％的患者患有运动障碍，例如肌张力障碍，痉挛，共济失调，肌张力低下和震颤。已有研究结果显示STXBP1脑病主要是由单倍体不足引起的，超过60％的报道突变是缺失、无意义突变、移码或剪接位点变异，错义变体使蛋白质不稳定并引起聚集以进一步减少野生型(WT)蛋白质水平。因此，本发明基于STXBP1基因突变开发了克隆猪核移植供体细胞，后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育出活体猪模型，体内STXBP1的部分功能丧失将为模拟STXBP1脑病和研究其发病机理提供研究工具，并为相关药物的开发及临床应用提供有效的实验数据，也为成功治疗人类相关疾病奠定基础。

基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。猪作为大动物，是人类长期以来主要的肉食供应动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供猪STXBP1基因的gRNA及其表达载体。

本发明的另一目的是提供一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统及其应用。

本发明的又一目的是提供一种重组细胞。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

猪STXBP1基因的gRNA靶点，其特征在于序列如SEQ ID NO.17所示。

猪STXBP1基因的gRNA，其特征在于序列如SEQ ID NO.35所示。

一种针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体，该表达载体表达SEQ ID NO.35所述的gRNA。

作为本发明的一种优选，该表达载体的载体骨架为pKG-U6gRNA，质粒全序列如SEQID NO.3所示。

作为本发明的进一步优选，所述的gRNA表达载体是将SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得。

一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，包含本发明所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体；所述的Cas9表达载体为pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，该质粒全序列如SEQ ID NO.2所示。

为了增加Cas9质粒的基因编辑能力，申请人在购自addgene(Plasmid#42230，fromZhang Feng lab)pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称PX330)载体的基础上进行改造得到pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)。PX330的图谱如图1，改造方式如下：

1)去除原载体gRNA骨架中多余无效的序列；

2)改造启动子：将原有启动子(chickenβ-actin启动子)改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；

3)增加核定位信号：在Cas9的N端及C端均增加核定位信号编码序列(NLS)，增加Cas9的核定位能力；

4)增加双筛选标记：原载体无任何筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，在Cas9的C端，插入P2A-EGFP-T2A-PURO，赋予载体荧光和抗性筛选能力；

5)插入WPRE和3’LTR等调控基因表达的序列：在基因读码框最后插入WPRE、3’LTR等序列，可增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

改造后载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称pKG-GE3)及改造位点如图2，质粒全序列如SEQ ID NO：2所示；pKG-GE3的主要元件有：

1)gRNA表达元件：U6 gRNA scaffold；

2)启动子：EF1a启动子和CMV增强子；

3)含多个NLS的Cas9基因：含N端和C端多核定位信号(NLS)的Cas9基因；

4)筛选标记基因：荧光和抗性双筛选标记元件P2A-EGFP-T2A-PURO；

5)增强翻译的元件：WPRE和3’LTR增强Cas9及筛选标记基因的翻译效率；

6)转录终止信号：bGH polyA signal；

7)载体骨架：包括Amp抗性元件和ori复制子等。

质粒pKG-GE3中，具有特异融合基因；所述特异融合基因编码特异融合蛋白；

所述特异融合蛋白自N端至C端依次包括如下元件：两个核定位信号(NLS)、Cas9蛋白、两个核定位信号、自剪切多肽P2A、荧光报告蛋白、自裂解多肽T2A、抗性筛选标记蛋白；

质粒pKG-GE3中，由EF1a启动子启动所述特异融合基因的表达；

质粒pKG-GE3中，所述特异融合基因下游具有WPRE序列元件、3’LTR序列元件和bGHpoly(A)signal序列元件。

质粒pKG-GE3中，依次具有如下元件：CMV增强子、EF1a启动子、所述特异融合基因、WPRE序列元件、3’LTR序列元件、bGH poly(A)signal序列元件。

所述特异融合蛋白中，Cas9蛋白上游的两个核定位信号为SV40核定位信号，Cas9蛋白下游的两个核定位信号为nucleoplasmin核定位信号。

所述特异融合蛋白中，荧光报告蛋白具体可为EGFP蛋白。

所述特异融合蛋白中，抗性筛选标记蛋白具体可为Puromycin蛋白。

自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”(发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”(发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)。

特异融合基因具体如SEQ ID NO：2中第911-6706位核苷酸所示。

CMV增强子如SEQ ID NO：2中第395-680位核苷酸所示。

EF1a启动子如SEQ ID NO：2中第682-890位核苷酸所示。

WPRE序列元件如SEQ ID NO：2第6722-7310位核苷酸所示。

3’LTR序列元件如SEQ ID NO：2中第7382-7615位核苷酸所示。

bGH poly(A)signal序列元件如SEQ ID NO：2中第7647-7871位核苷酸所示。

作为本发明的一种优选，所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为1～3:1，进一步优选3:1。

本发明所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪STXBP1基因突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用。

一种重组细胞，由本发明所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。

本发明所述的重组细胞在构建STXBP1基因突变的克隆猪中的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。

大小鼠等啮齿类动物不论从生理、病理及体型上，均与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。灵长类动物扩繁速度慢、数量少、成本高，动物保护及伦理等方面的要求也较高。而猪就没有上述缺点，同时猪的克隆技术非常成熟，饲养及克隆成本较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。

(2)本发明中经过实验验证改造的pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO载体相对改造前的pX330载体，更换了更强的启动子及添加了增强蛋白翻译的元件，提高了Cas9的表达，并且增加了核定位信号个数，提高了Cas9蛋白的核定位能力，具有更高的基因编辑效率。本发明还在载体中加入了荧光标记及抗性标记，使其更方便运用于载体阳性转化细胞的筛选及富集。采用本发明筛选的gRNA联合改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑,编辑效率比原载体提高100％以上。

(3)本发明针对STXBP1基因的不同靶点gRNA设计了相应的表达载体，通过筛选获得具有较高编辑效率的gRNA及其表达载体。配合本发明改造的Cas9高效表达载体进行基因编辑，通过靶标基因PCR产物测序结果可分析出所获细胞的基因型，获得靶标基因突变的概率为40％，大大优于使用胚胎注射技术的模型制备方法(即受精卵注射基因编辑材料)中获得突变的概率。

(4)利用本发明所得到的突变型单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到含靶标基因突变的克隆猪，并且该突变可稳定遗传。

本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。

附图说明

图1为质粒pX330的结构示意图。

图2为质粒pU6gRNACas9的结构示意图。

图3为pU6gRNA-eEF1a Cas9载体的结构图谱。

图4为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体图谱。

图5为质粒pKG-GE3的结构示意图。

图6为质粒pKG-U6gRNA的结构示意图。

图7为将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA的示意图。

图8为实施例2中步骤2.3.3的测序峰图。

图9为实施例2中步骤2.4.3的测序峰图。

图10为实施例3中步骤3.2.3以猪的基因组DNA为模板分别采用STXBP1-E14g-F3/STXBP1-E14g-R360(组1)、STXBP1-E14g-F3/STXBP1-E14g-R423(组2)、STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360(组3)、STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R423(组4)组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图11为实施例3中步骤3.2.4以18只猪的基因组DNA为模板采用STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图12为实施例3中步骤3.6.4以基因组DNA为模板采用STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图13为实施例4中步骤4.4.4以基因组DNA为模板采用STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图14为实施例5中步骤5.4.4以基因组DNA为模板采用STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360组成的引物对进行PCR扩增后的电泳图。

图15为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为野生型的示例性测序峰图。

图16为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位相同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

图17为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为杂合突变型的示例性测序峰图。

图18为实施例5中步骤5.4.5判定靶基因为双等位不同变异的纯合突变型示例性测序峰图。

具体实施方式

实施例1、质粒的构建

1.1 构建质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(简称质粒pKG-GE3)

原始出发质粒为pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(简称质粒pX330)，序列如SEQ ID NO：1所示。质粒pX330的结构示意图见图1。SEQ ID NO：1中，第440-725位核苷酸组成CMV增强子，第727-1208位核苷酸组成chickenβ-actin启动子，第1304-1324位核苷酸编码SV40核定位信号(NLS)，第1325-5449位核苷酸编码Cas9蛋白，第5450-5497位核苷酸编码nucleoplasmin核定位信号(NLS)。

以pX330质粒为基础，构建质粒pU6gRNA eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO(图5)，简称质粒pKG-GE3，核苷酸如SEQ ID NO：2所示。与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予载体荧光和真核细胞抗性筛选能力；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

pKG-GE3质粒构建方法如下：

(1)去除gRNA骨架中多余无效的序列

质粒pX330用BbsI、XbaI酶切，回收载体片段(约8313bp左右)，利用多片段重组法合成插入片段175bp(SEQ ID NO：4)，与回收后载体片段重组得到pU6gRNACas9载体(图2)。

(2)改造启动子及增强子

对构建好的pU6gRNACas9载体，用XbaI和AgeI内切酶去除启动子(chickenβ-actin启动子)及增强子序列(CMV增强子)，回收线性载体序列约7650bp，并利用多片段重组法合成554bp的包含CMV增强子及EF1a启动子的序列(SEQ ID NO：5)，与酶切后载体pU6gRNACas9重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9载体(图3)。

(3)Cas9基因N端增加NLS序列

将构建好的载体pU6gRNA-eEF1a Cas9使用AgeI、BglII酶切，回收7786bp载体序列，并将增加了NLS的序列补充到酶切位点，即利用多片段重组法合成447bp的包括2个核定位信号及部分切除的Cas9编码序列(SEQ ID NO：6)，重组得到pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS载体(图4)。

(4)Cas9基因C端加入NLS、P2A-EGFP-T2A-PURO、WPRE-3’LTR-bGH polyA signal

以上构建好的载体命名为pU6gRNA-eEF1a Cas9+nNLS，使用FseI、SbfI酶切，回收载体序列7781bp，利用多片段重组法合成2727bp的包括NLS-P2A-EGFP-T2A-PURO-WPRE-3’LTR-bGH polyA signal的片段(SEQ ID NO：7)，与载体片段重组得到载体pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，简称pKG-GE3，质粒图谱如图5，核苷酸序列见SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin抗性蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。SEQ ID NO：2中，第911-6706形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发被裂解成三个独立的蛋白，即Cas9蛋白、EGFP蛋白和Puro抗性蛋白。

与质粒pX330相比，质粒pKG-GE3主要进行了如下改造：①去除残留的gRNA骨架序列(GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTT)，降低干扰；②将原有chickenβ-actin启动子改造为具更高表达活性的EF1a启动子，增加Cas9基因的蛋白表达能力；③在Cas9基因的上游和下游均增加核定位信号编码基因(NLS)，增加Cas9蛋白的核定位能力；④原质粒无任何真核细胞筛选标记，不利于阳性转化细胞的筛选和富集，依次在Cas9基因的下游插入P2A-EGFP-T2A-PURO编码基因，赋予真核细胞荧光及嘌呤霉素抗性双重筛选标记；⑤插入WPRE元件和3’LTR序列元件，增强Cas9基因的蛋白翻译能力。

1.2 构建pKG-U6gRNA载体

来源pUC57载体，通过EcoRV酶切位点，连接pKG-U6gRNA插入序列(含U6启动子、BbsI酶切位点和sgRNA骨架序列的DNA片段，序列如SEQ ID NO：8所示)，反向插入到pUC57载体，得到pKG-U6gRNA载体全序列(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)(图7)插入质粒pKG-U6gRNA(图6)，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。

实施例2 质粒配比优化以及质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.1 靶点gRNA设计及构建

2.1.1 使用Benchling对RAG1基因进行靶点gRNA设计

RAG1-g4：AGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.9)

合成针对上述RAG1基因靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

RAG1-gRNA4S：caccgAGTTATGGCAGAACTCAGTG(SEQ ID NO.10)

RAG1-gRNA4A：aaacCACTGAGTTCTGCCATAACTc(SEQ ID NO.11)

RAG1-gRNA4S、RAG1-gRNA4A均为单链DNA分子。

2.1.2 设计用于扩增和检测包含RAG1 gRNA靶点片段的引物

RAG1-nF126：CCCCATCCAAAGTTTTTAAAGGA(SEQ ID NO.12)

RAG1-nR525：TGTGGCAGATGTCACAGTTTAGG(SEQ ID NO.13)

2.1.3 gRNA重组载体的构建及克隆

1)用限制性内切酶BbsI消化1ug pKG-U6gRNA质粒；

2)酶切的pKG-U6gRNA质粒跑琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶浓度1％，即1g琼脂糖凝胶加入到100mL电泳缓冲液中)分离，用胶回收试剂盒(Vazyme)纯化回收酶切产物；

3)将2.1.1所述靶点合成的2条互补DNA Oligo，通过以下退火程序形成与pKG-U6gRNA载体BbsI酶切后粘性末端互补的DNA双链，示意如图7：

95℃，5min然后以5℃/min的速率降至25℃；

4)按照以下体系启动连接反应：室温反应10min

37℃反应60min；

5)转化

按照感受态细胞(Vazyme)说明书进行操作。

2.1.4 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒送通用公司测序，经序列比对确认质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)构建成功，该质粒将会表达SEQ ID NO.14所示的RAG1-gRNA4。

2.2 猪原代成纤维细胞制备

2.2.1 取初生从江香猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，75﹪酒精浸泡30-40s；

2.2.2 用含5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)的PBS洗涤5次，不含P/S的PBS洗一次；

其中5％P/S的PBS配方为：5％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+95％PBS，5％、95％为体积百分比。

2.2.3 用剪刀将组织剪碎，加入5mL 0.1％的胶原酶(Sigma)溶液，37℃摇床消化1h；

2.2.4 500g离心5min，去上清，将沉淀用1mL完全培养基重悬，铺入含10mL完全培养基并已用0.2％明胶(VWR)封盘的10cm细胞培养皿中。

其中，细胞完全培养基的配方为：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基

(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio)，15％、83％、1％、1％为体积百分比。

2.2.5 置于37℃，5％CO2(体积百分比)、5％O2(体积百分比)的恒温培养箱中进行培养；

2.2.6 将细胞培养至长满皿底60％左右时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶将细胞消化下来，然后加入完全培养基终止消化，将细胞悬液转入15mL离心管中，400g离心4min，弃去上清，得到细胞沉淀以备下一步的细胞转染实验。

2.3 质粒配比优化

2.3.1 共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.44μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.56μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为1：1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.72μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.28μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为2：1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。即质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3的摩尔配比为3：1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染至猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：1μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.3.2 共转染操作方法

使用哺乳动物成纤维细胞核转染试剂盒(Neon kit)与Neon TM transfectionsystem电转仪进行转染实验。

1)按照上述分组配制电转DNA溶液，混匀过程中注意切勿产生气泡；

2)将上述2.2.6制备得到的细胞沉淀使用1ml PBS磷酸缓冲液(Solarbio)清洗，并转移到1.5ml离心管中，600g离心6min，弃去上清，使用11μL电转基本溶液Opti-MEM重悬细胞，重悬过程中要避免气泡的产生；

3)吸取10μL细胞悬液，加入至步骤1)中的电转DNA液中混匀，混匀过程中注意切勿产生气泡；

4)将试剂盒带有的电转杯放置于Neon TM transfection system电转仪杯槽内，加入3mL Buffer E；

5)用电转枪吸取10μL步骤3)得到的混合液，插入点击杯内，选择电转程序(1450V10ms3pulse)，电击转染后立即在超净台内将电转枪中混合液转入到6孔板中，每孔含3mL的完全培养液(15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％P/S(Gibco Penicillin-Streptomycin)+1％HEPES(Solarbio))；

6)混匀后放置于37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养；

7)电转后12-18h换液，36-48h用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

2.3.3 基因编辑效率分析

提取2.3.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出第一组、第二组、第三组的编辑效率依次为9％、53％、66％，测序结果示例性峰图见图8。分析认定第三组的基因编辑效率最高，即确定gRNA质粒与Cas9质粒最适用量为摩尔比3：1，质粒实际用量为0.92μg：1.08μg。

2.4 质粒pX330和质粒pKG-GE3的效果比较

2.4.1 共转染分组情况

RAG1-330组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pX330共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pX330，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pX330摩尔比为3:1。

RAG1-KG组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)和质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

RAG1-B组：将质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(RAG1-gRNA4)。

2.4.2 共转染操作方法

同本实施例中2.3.2。

2.4.3 基因编辑效率分析

提取2.4.2中收集的细胞基因组DNA，采用RAG1-nF126和RAG1-nR525组成的引物对进行PCR扩增，将产物进行测序。测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出RAG1-330组、RAG1-KG组的编辑效率分别为28％、68％，测序结果示例性峰图见图9，结果表明，与采用质粒pX330相比，采用质粒pKG-GE3使得基因编辑效率显著提高。

实施例3 筛选高效的STXBP1基因靶点gRNA(第一次测试)

3.1 基因组DNA的提取

使用Vazyme公司FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit(VazymeCat.DC102-01)分别进行18只猪(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)耳组织的基因组DNA的柱式提取，使用NanoDrop进行定量，-20℃保存备用。

3.2 STXBP1基因敲除预设靶点及邻近基因组序列保守性分析

3.2.1 猪STXBP1基因信息

突触融合蛋白结合蛋白1(syntaxin binding protein 1)；位于1号染色体；GeneID为100517927，Sus scrofa。猪STXBP1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。已有研究结果表明STXBP1基因杂合缺失突变与多种严重的早发性癫痫性脑病有关，在猪基因组DNA中，STXBP1基因具有20个外显子，其中第14外显子序列(含部分第13内含子和部分第14内含子序列)如SEQ ID NO.16所示。

3.2.2 STXBP1基因敲除预设靶点外显子及邻近基因组序列PCR扩增引物设计

根据查到的猪STXBP1基因组序列

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010443.5？report＝genbank& from＝268116124&to＝268205805)，设计引物扩增前述18只猪基因组样品STXBP1基因外显子14的位点。

使用Oligo7软件进行引物设计，设计结果如下：

STXBP1-E14g-F50：CCACGCTACAAATCCCAGACAT

STXBP1-E14g-R360：TCTCTCTTTCCCAGCTGCCTCASTXBP1-E14g-F3：CACAGCGCTTTATGGGAGCACG

STXBP1-E14g-R423：CTGAGCCACGACGGGAACTGAG3.2.3STXBP1基因组PCR扩增引物筛选

使用猪(雌性1#)耳朵组织提取的基因组为模板，使用设计的两条上游引物和两条下游引物组合，Max酶(Vazyme公司货号：P505)进行PCR，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳以筛选好的扩增引物，结果如图10，组1：STXBP1-E14g-F3/STXBP1-E14g-R360；组2：STXBP1-E14g-F3/STXBP1-E14g-R423；组3：STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360；组4：STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R423。优选STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360引物对进行目的片段扩增。

3.2.4 18只猪STXBP1基因片段PCR扩增

分别以18个基因组模板(雄性A、B、C、D、E、F、G、H雌性1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，引物STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360，Max酶进行STXBP1基因组片段的扩增，产物(310bp)进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图11。

3.2.5 STXBP1基因序列保守性分析

以上PCR扩增产物，使用扩增引物进行测序(通用生物公司测序)，将测序结果与公共数据库中的STXBP1基因序列进行比对分析。根据比对结果，扩增片段序列相对保守，所设计的引物本身无可能的突变位点。

3.3 靶点gRNA设计及构建

3.3.1 使用Benchling进行靶点gRNA设计

设计靶点已避开可能的突变位点，使用Benchling进行靶点gRNA设计：

https://benchling.com/

STXBP1基因敲除靶点设计如下：

STXBP1-E14-g1：CTTGTCGTAAGTGCTGACAT

STXBP1-E14-g2：CATTGGCATCCAGCAGAATGSTXBP1-E14-g3：AGATGTAGAGAAGGATGATG

STXBP1-E14-g4：TGGGGACGATGGCTCTCATG

合成的STXBP1基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

STXBP1-E14-g1S：caccgCTTGTCGTAAGTGCTGACAT(SEQ ID NO.25)

STXBP1-E14-g1A：aaacATGTCAGCACTTACGACAAGc

STXBP1-E14-g2S：caccgCATTGGCATCCAGCAGAATG

STXBP1-E14-g2A：aaacCATTCTGCTGGATGCCAATGc

STXBP1-E14-g3S：caccgAGATGTAGAGAAGGATGATG

STXBP1-E14-g3A：aaacCATCATCCTTCTCTACATCTc

STXBP1-E14-g4S：caccgTGGGGACGATGGCTCTCATG

STXBP1-E14-g4A：aaacCATGAGAGCCATCGTCCCCAc

STXBP1-E14-g1S、STXBP1-E14-g1A、STXBP1-E14-g2S、STXBP1-E14-g2A、STXBP1-E14-g3S、STXBP1-E14-g3A、STXBP1-E14-g4S、STXBP1-E14-g4A均为单链DNA分子。

3.3.2 gRNA重组载体的构建及克隆

步骤见实施例2中2.1.3。

1)将合成的STXBP1-E14-g1S和STXBP1-E14-g1A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g1)。该质粒将会表达STXBP1-E14-gRNA1，STXBP1-E14-gRNA1序列如下：

CUUGUCGUAAGUGCUGACAUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

2)将合成的STXBP1-E14-g2S和STXBP1-E14-g2A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g2)。该质粒将会表达STXBP1-E14-gRNA2，STXBP1-E14-gRNA2序列如下：

CAUUGGCAUCCAGCAGAAUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3)将合成的STXBP1-E14-g3S和STXBP1-E14-g3A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g3)。该质粒将会表达STXBP1-E14-gRNA3，STXBP1-E14-gRNA3序列如下：

AGAUGUAGAGAAGGAUGAUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

4)将合成的STXBP1-E14-g4S和STXBP1-E14-g4A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g4)。该质粒将会表达STXBP1-E14-gRNA4，STXBP1-E14-gRNA4序列如下：

UGGGGACGAUGGCUCUCAUGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu

3.3.3 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g1)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g2)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g3)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g4)载体均构建成功。

3.4 猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

3.5 使用构建好的gRNA质粒、Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞

3.5.1 共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g1)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g1)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g2)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g2)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g3)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g3)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g4)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g4)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

3.5.2 共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

3.6 STXBP1基因不同靶点gRNA的编辑效率分析

3.6.1 分别向步骤3.5.2中所收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞，得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10×extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

75℃15min—95℃5min—4℃，反应结束后细胞裂解液于-20℃保存；

3.6.2 采用前述针对STXBP1基因E14的引物对(STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360)，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增STXBP1基因靶点区域，检测其突变情况，目的PCR产物长度为310bp；

3.6.3 使用常规PCR反应扩增STXBP1基因靶点区域；

3.6.4 将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图12，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出STXBP1-E14-g1、STXBP1-E14-g2、STXBP1-E14-g3、STXBP1-E14-g4不同靶点的编辑效率依次为7％、5％、0、6％。结果表明，4种gRNA的编辑效率均低于10％，本次未筛选到较优的高效gRNA。

实施例4 筛选高效的STXBP1基因靶点gRNA(第二次测试)

4.1 靶点gRNA设计及构建

4.1.1 使用Benchling进行靶点gRNA设计

https://benchling.com/

STXBP1基因敲除靶点设计如下：

STXBP1-E14-g5：ATCCAGCAGAATGGGGACGA(SEQ ID NO.17)

STXBP1-E14-g6：TGCCGAAGGGGAGAAGATCA(SEQ ID NO.18)

STXBP1-E14-g7：CATGGGCACGGATGCCGAAG(SEQ ID NO.19)

STXBP1-E14-g8：GACATTGGCATCCAGCAGAA(SEQ ID NO.20)

STXBP1-E14-g9：ATGGGGACGATGGCTCTCAT(SEQ ID NO.21)

STXBP1-E14-g10：CCCTTCGGCATCCGTGCCCA(SEQ ID NO.22)

合成的STXBP1基因共4个靶点的插入序列互补DNA Oligo如下：

STXBP1-E14-g5S：caccgATCCAGCAGAATGGGGACGA(SEQ ID NO.23)

STXBP1-E14-g5A：aaacTCGTCCCCATTCTGCTGGATc(SEQ ID NO.24)

STXBP1-E14-g6S：caccgTGCCGAAGGGGAGAAGATCA(SEQ ID NO.25)

STXBP1-E14-g6A：aaacTGATCTTCTCCCCTTCGGCAc(SEQ ID NO.26)

STXBP1-E14-g7S：caccgCATGGGCACGGATGCCGAAG(SEQ ID NO.27)

STXBP1-E14-g7A：aaacCTTCGGCATCCGTGCCCATGc(SEQ ID NO.28)

STXBP1-E14-g8S：caccGACATTGGCATCCAGCAGAA(SEQ ID NO.29)

STXBP1-E14-g8A：aaacTTCTGCTGGATGCCAATGTC(SEQ ID NO.30)

STXBP1-E14-g9S：caccgATGGGGACGATGGCTCTCAT(SEQ ID NO.31)

STXBP1-E14-g9A：aaacATGAGAGCCATCGTCCCCATc(SEQ ID NO.32)

STXBP1-E14-g10S：caccgCCCTTCGGCATCCGTGCCCA(SEQ ID NO.33)

STXBP1-E14-g10A：aaacTGGGCACGGATGCCGAAGGGc(SEQ ID NO.34)

STXBP1-E14-g5S、STXBP1-E14-g5A、STXBP1-E14-g6S、STXBP1-E14-g6A、STXBP1-E14-g7S、STXBP1-E14-g7A、STXBP1-E14-g8S、STXBP1-E14-g8A、STXBP1-E14-g9S、STXBP1-E14-g9A、STXBP1-E14-g10S、STXBP1-E14-g10A均为单链DNA分子。

4.1.2 gRNA重组载体的构建及克隆

同实施例2中2.1.3。

4.1.3 gRNA载体构建

1)将合成的STXBP1-E14-g5S和STXBP1-E14-g5A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)将会表达SEQ ID NO.35所示的STXBP1-E14-gRNA5。

2)将合成的STXBP1-E14-g6S和STXBP1-E14-g6A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)将会表达SEQ ID NO.36所示的STXBP1-E14-gRNA6。

3)将合成的STXBP1-E14-g7S和STXBP1-E14-g7A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)将会表达SEQ ID NO.37所示的STXBP1-E14-gRNA7。

4)将合成的STXBP1-E14-g8S和STXBP1-E14-g8A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)将会表达SEQ ID NO.38所示的STXBP1-E14-gRNA8。

5)将合成的STXBP1-E14-g9S和STXBP1-E14-g9A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)将会表达SEQ ID NO.39所示的STXBP1-E14-gRNA9。

6)将合成的STXBP1-E14-g10S和STXBP1-E14-g10A混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)。质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)将会表达SEQ ID NO.40所示的STXBP1-E14-gRNA10。

4.1.4 gRNA载体鉴定

从LB平板上挑取单克隆置入加有相应抗生素的LB培养液内，37℃恒温摇床内培养12-16h后小提质粒后送通用公司测序，经序列比对确认pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)、pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)载体均构建成功。

4.2 猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

4.3 使用构建好的gRNA质粒、Cas9质粒(pKG-GE3)共转染猪原代成纤维细胞。

4.3.1 共转染分组情况

第一组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第二组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g6)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第三组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g7)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第四组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g8)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第五组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g9)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第六组：将质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)：1.08μg质粒pKG-GE3，其中pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g10)与pKG-GE3摩尔比为3:1。

第七组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转染操作。

4.3.2 共转染操作方法

同实施例2中2.3.2。

4.4 STXBP1基因不同靶点gRNA的编辑效率分析

4.4.1 分别向步骤4.3.2中收集在1.5mL离心管中的5组细胞加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞，得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

4.4.2 采用前述针对STXBP1基因E14的引物对(STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360)，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增STXBP1基因靶点区域，检测其突变情况，目的PCR产物长度为310bp；

4.4.3 使用常规PCR反应扩增STXBP1基因靶点区域；

4.4.4 将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图13，将目的产物及其附近产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出STXBP1-E14-g5、STXBP1-E14-g6、STXBP1-E14-g7、STXBP1-E14-g8、STXBP1-E14-g9、STXBP1-E14-g10不同靶点的编辑效率依次为21％、3％、0、3％、0、4％。结果表明，STXBP1-E14-g5编辑效率最高，优选为最优靶点。

实施例5 构建STXBP1基因敲除的从江香猪单细胞克隆

5.1 猪原代成纤维细胞制备

同实施例2中2.2。

5.2 使用构建好的pKG-U6gRNA(STXBP1-E14-g5)质粒、pKG-GE3质粒共转染猪原代成纤维细胞

同实施例2中2.3.2，但不使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞于1.5mL离心管中。

5.3 STXBP1基因敲除单细胞克隆株的筛选

5.3.1 将步骤5.2所得电转48h的群体细胞，使用胰蛋白酶进行消化，完全培养基中和，500g离心5min，去上清，将沉淀用200μL完全培养基重悬，并适当稀释，用口吸管挑取单细胞转移到每孔含100μL完全培养基的96孔板中，每孔放置一个细胞；

5.3.2 37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱中进行培养，每2～3天换一次细胞培养基，期间用显微镜观察每孔细胞生长情况，排除无细胞及非单细胞克隆的孔；

5.3.3 待96孔板的孔中细胞长满孔底，使用胰蛋白酶消化并收集细胞，其中2/3细胞接种到含有完全培养基的6孔板中，剩余的1/3的细胞收集在1.5mL离心管中备后续基因型测定；

5.3.4 待6孔板长至80％汇合度时使用0.25％(Gibco)的胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。

5.4 STXBP1基因敲除的单细胞克隆鉴定

5.4.1 向步骤5.3.3收集在1.5mL离心管中的细胞中加入10μL KAPA2G裂解液裂解细胞,得到释放出基因组DNA的细胞裂解液。

KAPA2G裂解液配制体系如下：

10X extract Buffer 1μL

Enzyme 0.2μL

ddH2O 8.8μL

5.4.2 采用前述针对STXBP1基因E14的引物对(STXBP1-E14g-F50/STXBP1-E14g-R360)，并以上述细胞裂解液为DNA模板，进行PCR扩增STXBP1基因靶点区域，检测单细胞克隆的靶基因突变情况，目的PCR产物长度为310bp；

5.4.3 使用PCR常规反应扩增STXBP1基因靶点区域；

5.4.4 将PCR反应产物进行电泳，电泳结果如图14，泳道编号与单细胞克隆编号一致。回收PCR扩增产物并测序。

5.4.5 将测序结果与STXBP1靶点信息进行比对，从而判断该单细胞克隆是否为STXBP1基因敲除。

编号为3、13的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同变异的纯合突变型。编号为6的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同变异的纯合突变型。编号为2、8、15、17、19的单细胞克隆的基因型为杂合突变型。编号为1、4、5、7、9、10、11、12、14、16、18、20的单细胞克隆的基因型为野生型。得到STXBP1基因编辑单细胞克隆的比率为40％。

示例性的测序比对结果如图15至图18，其中图15是克隆号为STXBP1-1的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为野生型；图16是克隆号为STXBP1-2的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为杂合突变型；图17是克隆号为STXBP1-13的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位基因相同变异的纯合突变型；图18是克隆号为STXBP1-6的反向测序与已公布序列的比对结果，判定为双等位基因不同变异的纯合突变型。

通过具体序列的分析，各单细胞克隆基因型如表1：

表1 STXBP1基因敲除单细胞克隆基因型鉴定

上述的杂合突变及纯合突变单细胞克隆株均可用来进行模型猪的克隆生产，从而模拟不同严重程度的癫痫性脑病。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 南京启真基因工程有限公司

<120> CRISPR系统及其在构建STXBP1 突变的癫痫性脑病克隆猪核供体细胞中的应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8484

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

<210> 2

<211> 10476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc tagcgcgtgc 360

gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccgttac ataacttacg gtaaatggcc 420

cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aatagtaacg ccaataggga 480

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 540

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 600

ggcattgtgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 660

tagtcatcgc tattaccatg ggggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg 720

ggggaggggt cggcaattga tccggtgcct agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa 780

gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg 840

cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggttggac 900

cggtgccacc atggactata aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta 960

caaagacgat gacgataaga tggcccccaa aaagaaacga aaggtgggtg ggtccccaaa 1020

gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt acagcatcgg 1080

cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt acaaggtgcc 1140

cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat 1200

cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga agagaaccgc 1260

cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga tcttcagcaa 1320

cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct tcctggtgga 1380

agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta 1440

ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca gcaccgacaa 1500

ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt 1560

cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct 1620

ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc 1680

caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc tgatcgccca 1740

gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga gcctgggcct 1800

gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc agctgagcaa 1860

ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga 1920

cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgagagt 1980

gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat acgacgagca 2040

ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg agaagtacaa 2100

agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg gcggagccag 2160

ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg gcaccgagga 2220

actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg 2280

cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc attctgcggc ggcaggaaga 2340

tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga ccttccgcat 2400

cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga tgaccagaaa 2460

gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg gcgcttccgc 2520

ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg agaaggtgct 2580

gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga ccaaagtgaa 2640

atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga aaaaggccat 2700

cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga aagaggacta 2760

cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag atcggttcaa 2820

cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg acttcctgga 2880

caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac tgtttgagga 2940

cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg acaaagtgat 3000

gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga agctgatcaa 3060

cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt ccgacggctt 3120

cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta aagaggacat 3180

ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg ccaatctggc 3240

cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg acgagctcgt 3300

gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca gagagaacca 3360

gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg aagagggcat 3420

caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc agctgcagaa 3480

cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg accaggaact 3540

ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga gctttctgaa 3600

ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg gcaagagcga 3660

caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc agctgctgaa 3720

cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga gaggcggcct 3780

gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc ggcagatcac 3840

aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg agaatgacaa 3900

gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg atttccggaa 3960

ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc acgacgccta 4020

cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg aaagcgagtt 4080

cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga gcgagcagga 4140

aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact ttttcaagac 4200

cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga caaacggcga 4260

aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga aagtgctgag 4320

catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct tcagcaaaga 4380

gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg actgggaccc 4440

taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg tggtggccaa 4500

agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg ggatcaccat 4560

catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt ctggaagcca agggctacaa 4620

agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg agctggaaaa 4680

cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg aactggccct 4740

gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc tgaagggctc 4800

ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag cacaagcact acctggacga 4860

gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg ctaatctgga 4920

caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc aggccgagaa 4980

tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca agtactttga 5040

caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg ccaccctgat 5100

ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc tgggaggcga 5160

caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg gcggctccaa 5220

gcggcctgcc gcgacgaaga aagcgggaca ggccaagaaa aagaaaggat ccggcgcaac 5280

aaacttctct ctgctgaaac aagccggaga tgtcgaagag aatcctggac cggtgagcaa 5340

gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5400

cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5460

cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5520

cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5580

cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5640

cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5700

cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5760

caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5820

gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 5880

gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac 5940

ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6000

cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagggct ccggcgaggg 6060

caggggaagt cttctaacat gcggggacgt ggaggaaaat cccggcccaa ccgagtacaa 6120

gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc 6180

cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg 6240

ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg 6300

ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg 6360

ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc 6420

gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct 6480

ggccaccgtc ggagtctcgc ccgaccacca gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct 6540

ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc 6600

ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc 6660

cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg caagcccggt gcctgaacgc gttaagtcga 6720

caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 6780

tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 6840

tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 6900

gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 6960

tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 7020

tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 7080

gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 7140

cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 7200

caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 7260

tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc gtcgacttta 7320

agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga aaagggggga 7380

ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 7440

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 7500

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 7560

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagggcc 7620

cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 7680

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 7740

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 7800

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 7860

gggctctatg gcctgcaggg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt 7920

atttcacacc gcatacgtca aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980

cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg 8040

ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100

taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160

aacttgattt gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220

ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280

tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggtctatt 8340

ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400

ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 8460

cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg 8520

cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 8580

caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca 8640

tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 8700

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 8760

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 8820

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 8880

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 8940

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 9000

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 9060

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 9120

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 9180

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 9240

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 9300

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 9360

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga 9420

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 9480

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc 9540

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 9600

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt 9660

cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa 9720

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt 9780

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt 9840

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt 9900

tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga 9960

taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag 10020

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata 10080

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg 10140

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga 10200

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca 10260

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa 10320

acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt 10380

tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 10440

ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 10476

<210> 3

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgccaagctt gcatgcaggc ctctgcagtc gacgggcccg ggatccgatg 2280

ataaacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc 2340

tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac 2400

gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat 2460

ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt 2520

gtggaaagga cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag 2580

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttc 2640

tagcgcgtgc gccaattctg cagacaaatg gctctagagg tacccataga tctagatgca 2700

ttcgcgaggt accgagctcg aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 2760

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 2820

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 2880

ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatggt 2940

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 3000

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3060

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3120

<210> 4

<211> 175

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 120

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataa 175

<210> 5

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctgcagaca aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 60

gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 120

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 180

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 240

gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 300

tcgctattac catgggggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 360

gggtcggcaa ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 420

tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 480

tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtt ggaccggtgc 540

caccatggac tata 554

<210> 6

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagaacaca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 60

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gcccccaaaa agaaacgaaa 120

ggtgggtggg tccccaaaga agaagcggaa ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga 180

caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac 240

cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag 300

catcaagaag aacctgatcg gagccctgct gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac 360

ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata caccagacgg aagaaccgga tctgctatct 420

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<210> 7

<211> 2727

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa gggcggctcc aagcggcctg 60

ccgcgacgaa gaaagcggga caggccaaga aaaagaaagg atccggcgca acaaacttct 120

ctctgctgaa acaagccgga gatgtcgaag agaatcctgg accggtgagc aagggcgagg 180

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 240

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 300

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 360

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 420

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acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 540

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 600

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 660

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 720

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 780

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 840

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaaggg ctccggcgag ggcaggggaa 900

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tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac 1260

agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg 1320

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cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg gtgcctgaac gcgttaagtc gacaatcaac 1560

ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 1620

cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 1680

tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 1740

ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 1800

gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 1860

cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 1920

ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg 1980

ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 2040

cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 2100

gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcgtcgactt taagaccaat 2160

gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg 2220

gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt 2280

agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca 2340

ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa 2400

ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcaggg cccgtttaaa 2460

cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc 2520

ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg 2580

aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg 2640

acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta 2700

tggcctgcag gggcgcctga tgcggta 2727

<210> 8

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataaacatg tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcga gaagacctgt tttagagcta gaaatagcaa 300

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 360

ctagcgcgtg cgccaattct gcagacaaat ggctctagag gtacccatag 410

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agttatggca gaactcagtg 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caccgagtta tggcagaact cagtg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaaccactga gttctgccat aactc 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccatccaa agtttttaaa gga 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgtggcagat gtcacagttt agg 23

<210> 14

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aguuauggca gaacucagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 15

<211> 603

<212> PRT

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 15

Met Ala Pro Ile Gly Leu Lys Ala Val Val Gly Glu Lys Ile Met His

1 5 10 15

Asp Val Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Glu Trp Lys Val Leu Val

20 25 30

Val Asp Gln Leu Ser Met Arg Met Leu Ser Ser Cys Cys Lys Met Thr

35 40 45

Asp Ile Met Thr Glu Gly Ile Thr Ile Val Glu Asp Ile Asn Lys Arg

50 55 60

Arg Glu Pro Leu Pro Ser Leu Glu Ala Val Tyr Leu Ile Thr Pro Ser

65 70 75 80

Glu Lys Ser Val His Ser Leu Ile Ser Asp Phe Lys Asp Pro Pro Thr

85 90 95

Ala Lys Tyr Arg Ala Ala His Val Phe Phe Thr Asp Ser Cys Pro Asp

100 105 110

Ala Leu Phe Asn Glu Leu Val Lys Ser Arg Ala Ala Lys Val Ile Lys

115 120 125

Thr Leu Thr Glu Ile Asn Ile Ala Phe Leu Pro Tyr Glu Ser Gln Val

130 135 140

Tyr Ser Leu Asp Ser Ala Asp Ser Phe Gln Ser Phe Tyr Ser Pro His

145 150 155 160

Lys Ala Gln Met Lys Asn Pro Ile Leu Glu Arg Leu Ala Glu Gln Ile

165 170 175

Ala Thr Leu Cys Ala Thr Leu Lys Glu Tyr Pro Ala Val Arg Tyr Arg

180 185 190

Gly Glu Tyr Lys Asp Asn Ala Leu Leu Ala Gln Leu Ile Gln Asp Lys

195 200 205

Leu Asp Ala Tyr Lys Ala Asp Asp Pro Thr Met Gly Glu Gly Pro Asp

210 215 220

Lys Ala Arg Ser Gln Leu Leu Ile Leu Asp Arg Gly Phe Asp Pro Ser

225 230 235 240

Ser Pro Val Leu His Glu Leu Thr Phe Gln Ala Met Ser Tyr Asp Leu

245 250 255

Leu Pro Ile Glu Asn Asp Val Tyr Lys Tyr Glu Thr Ser Gly Ile Gly

260 265 270

Glu Ala Arg Val Lys Glu Val Leu Leu Asp Glu Asp Asp Asp Leu Trp

275 280 285

Ile Ala Leu Arg His Lys His Ile Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Thr

290 295 300

Arg Ser Leu Lys Asp Phe Ser Ser Ser Lys Arg Met Asn Thr Gly Glu

305 310 315 320

Lys Thr Thr Met Arg Asp Leu Ser Gln Met Leu Lys Lys Met Pro Gln

325 330 335

Tyr Gln Lys Glu Leu Ser Lys Tyr Ser Thr His Leu His Leu Ala Glu

340 345 350

Asp Cys Met Lys His Tyr Gln Gly Thr Val Asp Lys Leu Cys Arg Val

355 360 365

Glu Gln Asp Leu Ala Met Gly Thr Asp Ala Glu Gly Glu Lys Ile Lys

370 375 380

Asp Pro Met Arg Ala Ile Val Pro Ile Leu Leu Asp Ala Asn Val Ser

385 390 395 400

Thr Tyr Asp Lys Ile Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Leu Lys Asn

405 410 415

Gly Ile Thr Glu Glu Asn Leu Asn Lys Leu Ile Gln His Ala Gln Ile

420 425 430

Pro Pro Glu Asp Ser Glu Ile Ile Thr Asn Met Ala His Leu Gly Val

435 440 445

Pro Ile Val Thr Asp Ser Thr Leu Arg Arg Arg Ser Lys Leu Glu Arg

450 455 460

Lys Glu Arg Ile Ser Glu Gln Thr Tyr Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro

465 470 475 480

Ile Ile Lys Asp Ile Met Glu Asp Thr Ile Glu Asp Lys Leu Asp Thr

485 490 495

Lys His Tyr Pro Tyr Ile Ser Thr Arg Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr

500 505 510

Thr Ala Val Ser Ala Arg Tyr Gly His Trp His Lys Asn Lys Ala Pro

515 520 525

Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Pro Arg Leu Ile Ile Phe Ile Leu Gly Gly

530 535 540

Val Ser Leu Asn Glu Met Arg Cys Ala Tyr Glu Val Thr Gln Ala Asn

545 550 555 560

Gly Lys Trp Glu Val Leu Ile Gly Ser Thr His Ile Leu Thr Pro Thr

565 570 575

Lys Phe Leu Met Asp Leu Arg His Pro Asp Phe Arg Glu Ser Ser Arg

580 585 590

Val Ser Phe Glu Asp Gln Ala Pro Thr Met Glu

595 600

<210> 16

<211> 1100

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<400> 16

agtccagcca ggcagaggct ccttaaacta tcaaggcttc tcaggtgtgg gaagtgcatc 60

ccctgaagcc ctgatccctc tgccgggctt catacctctc gaggacagac caggatcgag 120

gctttccctg aggccttggc acaggtgcac gcacctgcac ggaacagcct acaaaagatg 180

gtgaagaagg gcgctttctg gctttggaaa gcgaaaccca ggctcttgct acggccatag 240

acaccgtcac cgattacagc agtgctcatc acagcgcttt atgggagcac gagtacccgt 300

ttggaacctt cgtcacccac gctacaaatc ccagacatct ttgcacaacc ggtgttgtaa 360

cagttcccgt ctatgcagac tgtggcagaa acagagccaa cgtggtatgt cttctgcagg 420

acctggccat gggcacggat gccgaagggg agaagatcaa ggaccccatg agagccatcg 480

tccccattct gctggatgcc aatgtcagca cttacgacaa gatccgcatc atccttctct 540

acatcttttt gaagaacggt aggaaggggg gagtagagga gggcccagac cttcttgggg 600

gaaatgaggc agctgggaaa gagagagaga gagagagaga gagcagagcg gaaaacagtt 660

taaaagacaa aacgctcagt tcccgtcgtg gctcagtggt taacgaatcc gactaggaac 720

catgaggttg caggttcgat ccctggcctt gctcagtggg ttaaggatcc agcattgcca 780

tgagctatga tgtaggtcgt agacgctgct tggatcccgc attgctgtgg ctgtggtgta 840

ggctggtggc tacagctccg attagacccc tagcctggga atctccatat gccgcaggtg 900

cagccctaga aaaagacaaa caataaaaaa taaaataaaa gacaaagaaa agggaaggaa 960

aggggtgttg aagacaaaga tccaaggggc tcttcacgcc tgaggaagtg taatgcgggc 1020

agatcacttg cagctggagg ccgagtgtcc tccaccaccc tccgccccgc ccatgcttct 1080

ggaactgatc agagggacga 1100

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atccagcaga atggggacga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgccgaaggg gagaagatca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

catgggcacg gatgccgaag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gacattggca tccagcagaa 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggggacga tggctctcat 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cccttcggca tccgtgccca 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccgatcca gcagaatggg gacga 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaactcgtcc ccattctgct ggatc 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caccgtgccg aaggggagaa gatca 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaactgatct tctccccttc ggcac 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

caccgcatgg gcacggatgc cgaag 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaaccttcgg catccgtgcc catgc 25

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caccgacatt ggcatccagc agaa 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aaacttctgc tggatgccaa tgtc 24

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caccgatggg gacgatggct ctcat 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaacatgaga gccatcgtcc ccatc 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

caccgccctt cggcatccgt gccca 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aaactgggca cggatgccga agggc 25

<210> 35

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

auccagcaga auggggacga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 36

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

ugccgaaggg gagaagauca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 37

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

caugggcacg gaugccgaag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 38

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gacauuggca uccagcagaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 39

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

auggggacga uggcucucau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 40

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cccuucggca uccgugccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims

1.一种用于猪STXBP1基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其特征在于包含针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体和Cas9表达载体；所述的针对猪STXBP1基因的gRNA表达载体是将SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的单链DNA退火得到的具有粘性末端的双链DNA分子插入载体骨架pKG-U6gRNA的BbsI限制性内切酶位点所得；载体骨架pKG-U6gRNA的质粒全序列如SEQ IDNO.3所示，该表达载体表达SEQ ID NO.35所示的gRNA，其靶点序列如SEQ ID NO.17 所示；所述的Cas9表达载体为pU6gRNA-eEF1a-mNLS-hSpCas9-EGFP-PURO，该质粒全序列如SEQ IDNO.2所示；所述的gRNA表达载体和Cas9表达载体的摩尔比为3:1。

2.权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统在构建猪STXBP1基因敲除的猪重组细胞中的应用。

3.一种猪STXBP1基因敲除的猪重组细胞，其特征在于由权利要求1所述的CRISPR/Cas9系统共转染猪原代成纤维细胞经验证后所得。