CN107955818B - 一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途，具体地，本发明提供了一种非人灵长类动物的神经疾病动物模型的制备方法，该方法包括以下步骤：(a)提供非人灵长类动物的细胞，将所述细胞中的PRRT2基因失活或显著下调，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞；(b)利用步骤(a)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的细胞，再生制备得到PRRT2基因失活或显著下调的神经疾病动物模型。本发明的动物模型是一种有效的神经疾病动物模型，可用于研究运动失调、头痛、以及智力低下等神经疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。

Description

一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种非人灵长类动物神经疾病动物模型的建立方法及其用途。

背景技术

富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2)最初受到关注是因为其被指出可能是阵发性运动失调的致病基因，包括的临床症状有：(1)阵发性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD)(Chen,Wan-Jin,etal.,Exome sequencing identifies truncating mutations in PRRT2 that causeparoxysmal kinesigenic dyskinesia.Nature Genetics 2011 Dec,43(12),1252-U1116.Wang,Jun-Ling,et al.,Identification of PRRT2 as the causative gene ofparoxysmal kinesigenic dyskinesias.Brain 2011 Dec,134,3490-3498.)、(2)阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis，PKC)(Li,Jingyun,et al.,Targeted genomic sequencing identifies PRRT2mutations as acause of paroxysmal kinesigenic choreoathetosis.Journal of Medical Genetics2012 Feb,49(2),76-78.)、(3)伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍(paroxysmalkinesigenic dyskinesia with infantileconvulsions，PKD/IC)(Lee,Hsien-Yang,etal.,Mutations in the gene PRRT2 cause paroxysmal kinesigenic dyskinesia withinfantile convulsions.Cell Reports 2012 Jan 26,1(1),2-12.)。

更深入的研究发现PRRT2还可能与其他疾病症状有关系，包括但不限于如下症状：阵发性非运动诱发性运动障碍(paroxysmal nonkinesigenic dyskinesia，PNKD)(Liu,Qing.,et al.,Mutations in PRRT2 result in paroxysmal dyskinesias with markedvariability in clinical expression.Journal of Medical Genetics 2012 Feb,49(2),79-82.)、进行性共济失调(progressive ataxia)(Castelnovo,Giovanni,et al.,Progressive ataxia related to PRRT2 gene mutation.Journal of the NeurologicalSciences 2016 Aug 15,367,220-221.)、良性家族性婴儿癫痫(benign familialinfantile epilepsy，BFIE)(Heron,Sarah E.,et al.,PRRT2Mutations Cause BenignFamilial Infantile Epilepsy and Infantile Convulsions with ChoreoathetosisSyndrome.American Journal of Human Genetics 2012 Jan 13,90(1),152-160.)、偏头痛(migraine)(Cloarec,R.,et al.,PRRT2 links infantile convulsions andparoxysmal dyskinesia with migraine.Neurology 2012 Nov,79(21),2097-2103.)、偏瘫型偏头痛(hemiplegic migraine)(Dale,Russell.C.,et al.,Familial PRRT2mutation with heterogeneous paroxysmal disorders including paroxysmaltorticollis and hemiplegic migraine.Developmental Medicine and ChildNeurology 2012 Oct,54(10),958-960.)、阵发性斜颈(paroxysmal torticollis)(Dale,Russell.C.,et al.,Familial PRRT2 mutation with heterogeneous paroxysmaldisorders including paroxysmal torticollis and hemiplegicmigraine.Developmental Medicine and Child Neurology 2012 Oct,54(10),958-960.)、睡眠中阵发性运动障碍(paroxysmal hypnogenic dystonia，PHD)(Liu,Xiao-Rong,et al.,Paroxysmal hypnogenic dyskinesia is associated with mutations in thePRRT2 gene.Neurology:Genetics 2016 Apr,2(2),e66.)、周期性共济失调(episodicataxia，EA)(Gardiner,Alice.R.,et al.,PRRT2 gene mutations From paroxysmaldyskinesia to episodic ataxia and hemiplegic migraine.Neurology 2012 Nov,79(21),2115-2121.)、智力低下(mental retardation)(Labate,Angelo,et al.,Homozygousc.649dupC mutation in PRRT2 worsens the BFIS/PKD phenotype with mentalretardation,episodic ataxia,and absences.Epilepsia 2012 Dec,53(12),e196-e199.)。

人PRRT2的杂合突变不仅导致多样的临床症状，还表现为非完全显性，即有的单个等位基因上得突变携带者不会发病(Van Vliet,Rianne,et al.,PRRT2 phenotypes andpenetrance of paroxysmal kinesigenic dyskinesia and infantileconvulsions.Neurology 2012 Aug,79(8),777-784.)。

人PRRT2的纯合突变可能会导致严重的后果，同一个病人可能会有上述的几种症状，特别是智力低下(Labate,Angelo,et al.,Homozygous c.649dupC mutation inPRRT2worsens the BFIS/PKD phenotype with mental retardation,episodic ataxia,and absences.Epilepsia 2012 Dec,53(12),e196-e199.Delcourt,Marion,et al.,Severe phenotypic spectrum of biallelic mutations in PRRT2 gene.Journal ofNeurology Neurosurgery and Psychiatry 2015 Jul,86(7),782-785.)。

Prrt2基因的表达对基因的突变敏感，截短形式蛋白无法表达从而导致Prrt2缺乏，这可能是mRNA不稳定所致(Wu,Li,et al.,PRRT2 truncated mutations lead tononsense-mediated mRNA decay in Paroxysmal KinesigenicDyskinesia.Parkinsonism&Related Disorders 2014 Dec,20(12),1399-1404.)。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是指核酸酶Cas9在一段针对目的DNA片段的RNA的引导下，在特异位点切割目的DNA，诱发DNA修复，在修复过程中造成基因片段的插入、删除和突变等基因组DNA的改变(Sander,Jeffry D,et al.,CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targeting genomes.Nat Biotechnol 2014 Apr,32(4),347-355.)。

目前还没有通过改变Prrt2基因能表现出与人的PRRT2基因涉及的疾病的一种或多种症状相似症状的动物模型的报道，而动物模型是疾病研究和药物开发的有力的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以较好地模拟临床上原发性的运动失调、头痛、智力低下，个体之间不存在手术操作或者药物剂量导致的差异，其遗传背景高度一致，可以作为研究运动失调、头痛、智力低下的发病机理和新药筛选的非人灵长类动物的神经疾病的动物模型。

具体地，本发明的目的在于提供一种研究PRRT2涉及运动失调、头痛、智力低下疾病的动物模型，通过靶向操作食蟹猴的Prrt2基因，得到剔除Prrt2的食蟹猴模型。本发明的另一目的在于提供靶向食蟹猴的sgRNA，及其在制备Prrt2疾病的食蟹猴模型中的应用。

本发明的第一方面提供了一种非人灵长类动物的神经疾病动物模型的制备方法，包括以下步骤：

(a)提供非人灵长类动物的细胞，将所述细胞中的富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2)基因失活或显著下调，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞；

(b)利用步骤(a)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的细胞，再生制备得到PRRT2基因失活或显著下调的神经疾病动物模型。

在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括如下步骤：

(a1)利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因进行剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

在另一优选例中，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的一个或多个外显子进行剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

在另一优选例中，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的编码区(如外显子1至外显子4)或非编码区(如5’UTR)中进行剔除或基因编辑，从而得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

在另一优选例中，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的外显子2至外显子4中一个或多个外显子剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

在另一优选例中，所述CRISPR基因编辑技术为CRISPR-Cas9基因编辑技术。

在另一优选例中，所述步骤(a1)中包括将sgRNA和cas9mRNA混合物注射至非人灵长类动物细胞的细胞核中。

在另一优选例中，所述步骤(a1)中包括将携带有sgRNA和cas9mRNA编码序列的载体转染到灵长类动物细胞核中。

在另一优选例中，所述携带有sgRNA和cas9mRNA编码序列的载体是病毒载体。

在另一优选例中，所述sgRNA进入到灵长类动物细胞核以后，能够靶向Prrt2基因，并在cas9的作用下对Prrt2基因进行编辑，导致Prrt2基因产生特异性突变。

在另一优选例中，所述sgRNA序列选自下组：

(i)对应的识别DNA序列为SEQ ID NO.1-6任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；

在另一优选例中，所述灵长类动物细胞为受精卵细胞。

在另一优选例中，所述受精卵细胞处于单个细胞状体阶段。

在另一优选例中，所述灵长类动物为猴子。

在另一优选例中，所述猴子为食蟹猴。

在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括如下步骤：

(b1)利用步骤(a)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞制备得到嵌合非人灵长类动物；

(b2)将步骤(b1)中得到的嵌合非人灵长类动物和正常野生型非人灵长类动物交配繁育，在后代中筛选获得PRRT2基因失活或显著下调的杂合子非人灵长类动物；

(b3)通过将步骤(b2)中得到的杂合子非人灵长类动物相互交配获得PRRT2基因失活或显著下调的纯合子非人灵长类动物，从而得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型。

在另一优选例中，在步骤(b3)中，还包括步骤(b4)：将PRRT2基因失活或显著下调的纯合子非人灵长类动物与同一物种的神经元特异性敲除工具非人灵长类动物进行杂交，从而获得神经元特异性的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型。

在另一优选例中，所述将PRRT2基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。

在另一优选例中，所述基因失活包括PRRT2基因不表达，或表达没有活性的PRRT2蛋白。

在另一优选例中，所述的PRRT2基因失活是神经元特异性的PRRT2基因失活。

在另一优选例中，所述非人灵长类动物为猴，较佳地包括食蟹猴、狨猴、猕猴。

在另一优选例中，所述步骤(b)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：

(c1)运动失调，所述运动失调包括：阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症、伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性非运动诱发性运动障碍、进行性共济失调、良性家族性婴儿癫痫、阵发性斜颈、睡眠中阵发性运动障碍、周期性共济失调；

(c2)头痛，所述头痛包括：偏头痛、偏瘫型偏头痛；

(c3)智力低下。

本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述方法制备的非人灵长类动物模型的用途，将该模型用作研究神经疾病的动物模型。

在另一优选例中，所述神经疾病包括：运动失调、头痛、智力低下。

在另一优选例中，所述运动失调包括：阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症、伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性非运动诱发性运动障碍、进行性共济失调、良性家族性婴儿癫痫、阵发性斜颈、睡眠中阵发性运动障碍、周期性共济失调；

在另一优选例中，所述头痛包括：偏头痛、偏瘫型偏头痛；

本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述方法制备的非人灵长类动物模型的用途，其中，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经疾病的治疗剂。

在另一优选例中，所述神经疾病包括：运动失调、头痛、智力低下。

本发明第四方面提供了一种筛选或鉴定治疗或缓解神经疾病的潜在治疗剂的方法，包括以下步骤：

(a)在测试组中，在测试化合物的存在下，将测试化合物施用于本发明第一方面所述方法制备的非人灵长类动物模型，对测试组的所述动物模型的行为进行行为学分析、并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，对对照组的所述动物模型的行为进行行为学分析；

(b)对测试组和对照组动物模型的行为进行比较，其中，与对照组相比，如果施用了测试化合物的动物模型中表征神经疾病行为得到改善，则表明该测试化合物可作为神经疾病的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)筛选或鉴定的潜在治疗剂施用于本发明第一方面所述方法制备的非人灵长类动物模型，从而测定其对所述动物模型的行为的影响。

在另一优选例中，所述改善是在统计学上具有显著性意义的改善。

本发明第五方面提供了一种非人灵长类动物模型，用本发明第一方面所述方法制备。

在另一优选例中，对于PRRT2基因失活而言，所述的非人灵长类动物模型是杂合的或纯合的。

在另一优选例中，所述的PRRT2基因失活是神经元特异性的PRRT2基因失活。

本发明第六方面提供了一种非人灵长类动物细胞的用途，所述细胞中的富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2)基因失活或显著下调，用于制备构建非人灵长类动物的神经疾病动物模型的生物制剂。

在另一优选例中，所述生物制剂为液态制剂。

本发明第七方面提供了一种PRRT2基因或其蛋白的失活剂或下调剂的用途，用于制备构建非人灵长类动物的神经疾病动物模型的制剂。

在另一优选例中，所述失活剂包括抑制剂。

在另一优选例中，所述的PRRT2基因或其蛋白的失活剂或下调剂选自：

(i)靶向PRRT2基因的sgRNA；

(ii)携带有sgRNA编码序列的载体；

在另一优选例中，所述载体为病毒载体。

本发明第八方面提供了一种PRRT2基因失活剂或下调剂，所述基因失活剂或下调剂为sgRNA，所述sgRNA序列选自下组：

(i)对应的识别序列为SEQ ID NO.1-6任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(a)限定的序列互补的多核苷酸；

在另一优选例中，所述sgRNA对应的识别DNA序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了11号和12号猴嵌合率测定的结果。

图2显示了11号猴显示异常表现之握拳。

图3显示了11号猴显示的头痛样异常表现。

图4显示了11号猴显示的智力缺陷异常即1周岁后尚未学会用手吃苹果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的神经疾病模型，它是PRRT2基因被剔除或失活的食蟹猴或其他非人灵长类动物。本发明的动物模型是一种有效的神经疾病动物模型(尤其是运动失调模型和智力低下模型)，可用于研究运动失调、头痛、智力低下等神经疾病、并可以用于特定药物的筛选和测试试验。在此基础上完成了本发明。

PRRT2基因

人富含脯氨酸的跨膜蛋白2(proline-rich transmembrane protein 2，PRRT2)基因(Entrez Gene:112476)位于人染色体16p11.2，包含四个外显子，其中第1个外显子不编码蛋白。可能通过不同的mRNA剪接编码三种不同的蛋白异构体。其中主要的异构体1包含340个氨基酸残基，物种间相对保守(与哺乳动物相比约80％，与斑马鱼相比约30％)。异构体1主要包含富脯氨酸结构域和两个跨膜结构域。预测的包含394个氨基酸的异构体2有更长的羧基端，而包含299个氨基酸残基的异构体3是一种异构体1的截短型(Valtorta,F.,etal.,PRRT2:from Paroxysmal Disorders to Regulation of Synaptic Function.Trendsin Neurosciences 2016 Sep 10,39(10),668-679.)。

食蟹猴(Macaca fascicularis)的Prrt2基因(Gene ID:102124815)与人的PRRT2基因同源度约为97％，蛋白同源度约为96％。

人类和啮齿类的证据都表明PRRT2是神经系统特异表达的蛋白，其分子功能可能涉及：PRRT2可定位于突触可能影响神经信号的传递；PRRT2可能影响神经元的迁移；PRRT2可能是神经递质释放相关蛋白复合体的重要成员(Valtorta,F.,et al.,PRRT2:fromParoxysmal Disorders to Regulation of Synaptic Function.Trends inNeurosciences 2016 Sep 10,39(10),668-679.)。

如背景技术部分所述，人类PRRT2的突变导致的疾病范围很广，包括的临床症状有：(1)阵发性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD)；(2)阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症(paroxysmal kinesigenic choreoathetosis，PKC)；(3)伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍(paroxysmal kinesigenic dyskinesia withinfantileconvulsions，PKD/IC)；阵发性非运动诱发性运动障碍(paroxysmalnonkinesigenic dyskinesia，PNKD)；进行性共济失调(progressive ataxia)；良性家族性婴儿癫痫(benign familial infantile epilepsy，BFIE)；偏头痛(migraine)；偏瘫型偏头痛(hemiplegic migraine)；阵发性斜颈(paroxysmal torticollis)；睡眠中阵发性运动障碍(paroxysmal hypnogenic dystonia，PHD)；周期性共济失调(episodic ataxia，EA)；智力低下(mental retardation)等。

应理解，术语“PRRT2”还包括各种天然存在的PRRT2基因的野生型和变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的PRRT2蛋白的核苷酸序列，编码野生型PRRT2蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于猴(食蟹猴)之外的其他灵长类动物时，该术语指PRRT2基因在该灵长类动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的PRRT2(已知猴(食蟹猴)PRRT2基因与人类PRRT2基因的cDNA同源度约为97％，氨基酸序列的同源度约为96％)。

PRRT2基因或其蛋白的失活剂

在本发明中，所述PRRT2的失活剂包括全部失活或部分失活。

本发明的PRRT2蛋白的失活剂包括(a)抑制剂，所述抑制剂的例子包括(但并不限于)：小分子化合物、抗体、反义核酸、miRNA、siRNA、或其组合；(b)PRRT2基因的敲除剂；(c)靶向PRRT2基因的sgRNA、携带有sgRNA编码序列的载体、或其组合。

在一个优选例中，PRRT2基因的失活剂为sgRNA，所述sgRNA对应的识别DNA序列选自下组：

(i)SEQ ID NO.1-6任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(a)限定的序列互补的多核苷酸。

运动失调、头痛、智力低下相关疾病

运动失调指随意和自主运动的过多或过少，过少表现为运动迟缓或运动不能。而过多则表现为复杂的症状，主要可以分为5大类：舞蹈症、肌张力障碍、肌阵挛、抽动和震颤。引起运动异常的原因也较复杂，主要涉及基底核(包括尾状核、壳核、苍白球、黑质、脚桥核等)、小脑、大脑皮层、脑干、脊髓等(运动障碍疾病的原理与实践.(美)范恩主编；陈生弟等译.人民卫生出版社，2013.5ISBN978-7-117-16775-8)。PRRT2引起的运动失调涉及舞蹈症和肌张力障碍，具体的疾病涉及脑区和机制仍在研究中。

按世界卫生组织对头痛的描述：“头痛疾病位居神经系统最为常见的疾患之列，其特征为反复发作的头痛。头痛是少数原发性头痛疾病具有的令人痛苦并且丧失能力的一个特点，这些原发性头痛疾病为：偏头痛、紧张型头痛和丛集性头痛。头痛也可能会由其它许多疾病造成或者继发，最常见的是药物过度使用性头痛。”头痛是一种常见的疾病，99％的人在一生中会经历头痛。头痛给患者及家庭带来巨大的负担。很多头痛的致病原因和机制仍然不清楚。据当前已有报道，PRRT2涉及到偏头痛(migraine)和偏瘫型偏头痛(hemiplegic migraine)等头痛类型。

智力低下(mental retardation)，又称精神发育迟滞、智力落后或精神发育不全，是小儿常见的一种发育障碍。智力低下主要表现在社会适应能力、学习能力和生活自理能力低下。有报道表明人PRRT2的纯合突变可能与智力低下有关，具体的发病机制不明。

基因失活

对于功能未知基因的研究可采用许多方法，例如使有待研究的基因失活，分析所得的遗传修饰的表型变化，进而获得该基因的功能信息。这一研究方法的另一优点是可以将基因功能和疾病进行关联，从而在获得基因功能的同时也能获得该基因作为潜在药物或者药物靶点所能治疗的疾病信息和疾病动物模型。基因失活的方法可通过基因剔除、基因中断或基因插入的方式来完成。其中，基因剔除技术是研究人类基因在整体中的功能的非常强有力的手段。

基因显著下调

基因显著下调是指以野生型基因表达量设为1，与野生型相比，经CRISPR基因编辑技术编辑后的基因的表达量为≤1/2、较佳地≤1/3、更佳地≤1/4、最佳地≤0。

动物模型

在本发明中，提供了一种非常有效的神经疾病的非人灵长类动物模型。

在本发明中，非人灵长类动物的例子包括(但并不限于)：食蟹猴、狨猴、猕猴。

如本文所用，术语“PRRT2基因失活”包括一个或两个PRRT2基因被失活的情况，即包括PRRT2基因杂合地和纯合地失活。例如，PRRT2基因失活的食蟹猴可以是杂合或纯合的食蟹猴。

在本发明中，可基因剔除或转入外源基因(或片段)而使PRRT2基因失活等方法制备PRRT2基因失活的非人灵长类动物(如食蟹猴)。在本领域中，通过基因剔除或转入外源基因而使靶基因失活的技术是已知的。

在本发明的另一优选例中，PRRT2基因的失活是通过基因剔除实现的。

在本发明的另一优选例中，PRRT2基因的失活是通过PRRT2基因中插入外源基因(或片段)而实现的。

用本发明方法获得的纯合或杂合的食蟹猴可育。失活的PRRT2基因可以孟德尔规律遗传给后代食蟹猴。

在一优选例中，本发明提供了一种缺失PRRT2基因的纯合食蟹猴模型动物。

候选药物或治疗剂

在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗神经疾病的候选药物或治疗剂的方法。

在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、糖类、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明可以较好地模拟临床上原发性的运动失调、头痛、智力低下等疾病。

(2)个体之间不存在手术操作或者药物剂量导致的差异，其遗传背景高度一致。

(3)可以作为研究运动失调、头痛、智力低下的发病机理和新药筛选的有力工具。

(4)本发明神经疾病模型的遗传稳定。

(5)用本发明方法获得的纯合或杂合的动物模型可育。基因编辑后的杂合食蟹猴具有生殖能力，失活的PRRT2基因可以孟德尔规律遗传给后代食蟹猴。

(6)本发明的神经疾病动物模型表现出多种神经疾病样的症状，因此可以广泛用于神经类疾病的药物筛选和测试，包括原发性的运动失调、头痛、智力低下等。

(7)本发明首次揭示了剔除或失活PRRT2基因所得到的动物模型还可以同时用于PRRT2缺乏相关的其它疾病。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》((美)J.萨姆布鲁克(Joseph Sambrook)，(美)D.W.拉塞尔(David W.Russell)著黄培堂主译，ISBN:978-7-122-01148-0)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，本发明所用试剂和材料均市售可得或可按文献方法制备。未作特殊说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。

材料和方法

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向剔除食蟹猴的Prrt2基因。

材料

根据食蟹猴的Prrt2基因设计的sgRNA对应识别的DNA序列如下：

sg-1：5'-GATGGCAGCCAGCAGCTCTG-3’(SEQ ID No.1)

sg-3：5'-GACCTCAGCTTAAGCCCAGG-3’(SEQ ID No.2)

sg-6：5'-GCTGCAGCAGCTGGTTGAGG-3’(SEQ ID No.3)

sg-10：5'-GGCCAAGCTCTTAAGCATCG-3’(SEQ ID No.4)

sg-11：5'-GCCTCCTGCGTCATCAACTT-3’(SEQ ID No.5)

sg-12：5'-CAGGCAGGGGAGGAATGGAA-3’(SEQ ID No.6)

方法

靶向剔除食蟹猴的Prrt2基因的方法、实施步骤主要包括：

1.sgRNA和cas9mRNA的制备

2.sgRNA的基因组编辑效率检测

3.精子和卵子采集

4.单精子注射形成受精卵

5.显微注射

6.代孕及分娩

7.嵌合率测定

8.疾病症状观察

本发明涉及的PRRT2基因打靶的食蟹猴模型显示出了类似PRRT2突变病人的运动失调、头痛、智力低下等异常，为PRRT2涉及的疾病的研究和药物开发提供了动物模型。

实施例1：sgRNA和cas9mRNA的制备

Cas9mRNA的制备。使用携带T7启动子的引物cas9-F(SEQ ID No.7：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3’)和引物cas9-R(SEQ ID No.8：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’)及编码含有Cas9的模板质粒如pX330(Addgene Plasmid#42230)进行PCR扩增，把得到的PCR产物经电泳、纯化(普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)，天根生化科技(北京)有限公司)得到产物T7-NLS-hSpCas9-NLS序列，以此产物为模板进行体外转录(mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA kit(Ambion,AM1344))并加上多聚腺苷酸尾(Poly(A)Tailing Kit(Ambion,AM1350))。从而得到cas9mRNA，经纯化(MEGAclear kit(Ambion,AM1908))后溶于不含RNA酶的水中备用。

制备sgRNA。使用携带T7启动子、特异性识别靶点的序列的上游引物GAAATTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID No.9)-靶向序列-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ IDNo.17)，以及下游引物sg-R及模板pX330(Addgene Plasmid#42230)进行PCR反应，产物经纯化、转录(MEGA shortscript T7kit(Ambion,AM1354))从而得到sgRNA，再经纯化(MEGAclear kit(Ambion,AM1908))后溶于不含RNA酶的水中备用。

此实施例中用到的制备sgRNA的引物有：

sg-10-F

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGCCAAGCTCTTAAGCATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.10)

sg-11-F

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCTCCTGCGTCATCAACTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.11)

sg-12-F

5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGGCAGGGGAGGAATGGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.12)

sg1-F

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGATGGCAGCCAGCAGCTCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.13)

sg3-F

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGACCTCAGCTTAAGCCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.14)

sg6-F

5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTGCAGCAGCTGGTTGAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID No.15)

sg-R

5’-TTGTGAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’(SEQ ID No.16)

实施例2：sgRNA的基因组编辑效率检测

猴和鼠的杂交胚胎，或猴的胚胎用于筛选sgRNA的基因组编辑效率。

为了构建猴的胚胎，利用单精子显微注射技术，把单个猴的精子注射至猴的卵细胞中。在受精卵仍然处于单个细胞状体的阶段，将上述的cas9mRNA及sgRNA的混合物(分别是100和50ng/μl)注射至受精卵细胞核中(Narishige IM-300 Microinjector)。把注射得到的合子置于预平衡的HECM-9培养基中于、37℃、含5％CO₂的培养箱中培养。

为了构建猴和鼠的杂交胚胎，我们把猴的精子注射至鼠的卵细胞中，然后人工激活，激活使用含有氯化锶和细胞松弛素B而不含钙离子的CZB培养基。在受精卵仍然处于单个细胞状体的阶段，同样地将sgRNA和cas9mRNA(分别是100和50ng/μl)的混合液注射至受精卵细胞核中(Narishige IM-300Microinjector)。杂交胚胎使用KSOM培养基，培养条件为37℃，5％CO₂。培养约3.5天后得到囊胚。用试剂盒(Qiagen REPLI-g Mini Kits(Cat#150023))提取猴桑椹胚或囊胚的基因组，用巢氏PCR法扩增得到基因打靶区域的DNA片段，并将其测序。把测得基因突变的胚胎数与总胚胎鼠的比值即为sgRNA的基因组编辑效率。sg-1、sg-3和sg-6单个注射到猴和鼠的杂交胚胎测得编辑效率分别为5/6、3/4和4/4。sg-10、sg-11和sg-12三个混合一起注射进猴的胚胎测得总编辑效率为8/8。

实施例3：精子和卵子采集

通过阴茎电刺激射精法收集得到精液。

雌猴每天都进行月经周期的观察，月经周期正常的雌猴被选择进行超数排卵和卵子收集。具体过程为，在月经周期的第3天开始每天肌肉注射两次计量为25IU的重组人卵泡雌激素(recombinant human follicle-stimulating hormone，rhFH)(Gonal-F，Serono)，持续8-9天。然后注射1000IU剂量的人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotrophin，hCG)(Ovidrel，Serono)。在注射hCG约32-36小时后，用腹腔镜收集直径2-8mm的卵细胞。收集到的卵细胞置于预平衡了的培养基中培养成熟。

实施例4：显微注射

下面以sgRNA-10、sgRNA-11、sgRNA-12制备Prrt2突变的食蟹猴为例。利用单精子显微注射技术，把单个精子注射至卵细胞中。在受精卵仍然处于单个细胞状体的阶段，将上述的cas9mRNA及sgRNA-10、sgRNA-11、sgRNA-12的混合物(分别是100、50、50、50ng/μl)注射至受精卵细胞核中(Narishige IM-300 Microinjector)。把注射得到的合子置于预平衡的HECM-9培养基中于、37℃、含5％CO₂的培养箱中培养。

实施例5：代孕及分娩

显微注射后第二天把胚胎转移至输卵管。将3-4原核期的胚胎转移入排卵后0-3天的代孕猴的输卵管壶部靠中位置。雌猴怀孕直到分娩得到首建猴。

实施例6：嵌合率测定

采集首建猴的皮肤样本，提取基因组(TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN,DP304))，针对基因打靶位点进行PCR扩增，扩增后的产物克隆入T载体(

Easy，promega)，然后挑取单克隆进行测序分析得到嵌合率。

本实施例得到两只首建食蟹猴，分别命名为11号和12号。嵌合率结果如图1所示。测得两只猴的嵌合率分别为17/17和14/14。其中11号猴的Prrt2的几种突变均造成DNA的较大片段删除。11号猴显示出了一些人类PRRT2疾病相关的异常症状，12号猴未发现与11号猴的异常表现相似的症状，可能原因是5/14的突变为单氨基酸残基的突变，此突变产生的突变蛋白可能仍然有功能。

对比例1：大鼠/小鼠PRRT2基因敲除实验

在大鼠/小鼠上面敲除PRRT2基因(干细胞方法/Cas9方法)不能很好的模拟人类的疾病。其中PRRT2基因敲除小鼠可观察到极低比例(<1％)的运动失调，运动失调表现为运动不能或姿势异常，且同一只鼠运动失调发生次数少，有症状的鼠基本都只观察到1次，时间持续数分钟至两小时。PRRT2基因敲除大鼠则未观察到明显的疾病表现。

说明PRRT2基因与疾病症状关系较复杂。虽然PRRT2在哺乳动物之间比较保守，但其缺失导致的后果却不相同。常用的模式动物如大鼠/小鼠大多数表现正常，极少出现的症状也只是人类PRRT2缺失相关疾病的一种，不能很好的模拟人类的疾病。

对比例2：

在啮齿类动物可成功应用的传统的基因打靶技术如干细胞技术，核移植技术等未能成功的应用于非人灵长类动物的基因打靶(Chan,Anthony W.S.,Progress andprospects for genetic modification of nonhuman primate models in biomedicalresearch.ILAR Journal 2013 54(2),211-223.)。当前被证明可成功对非人灵长类动物进行基因编辑的技术是CRISPR/Cas9技术(Niu,Yuyu,et al.,Generation of Gene-ModifiedCynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-CellEmbryos.Cell 2014Feb 13,156(4),836-843.)。

实施例7：PRRT2突变嵌合食蟹猴行为学分析

以Prrt2基因剔除的食蟹猴12号为例，出生两周后直到一岁期间进行疾病症状观察。出生两周至四个月期间可观察到运动失调包括阵发性运动诱发性运动障碍样症状、阵发性非运动诱发性运动障碍样症状，异常姿态，下肢僵硬等。在出生后5个月左右观察到了头痛样症状，表现为弯曲躯干把头压低至玩具、卫生纸或饲养笼的地面上，双手握拳并摇动身体。症状发生频繁，持续时间约1月。在1周岁时观察到刻板运动盒智力低下样症状，表现为绕食物转圈数分钟之后才食用，且不会使用手吃食物，直接用嘴去够食物。

利用普通摄像机即可进行异常症状的观察和记录。由于运动失调是动态的过程，因此图片仅展示了运动失调有关的握拳状态，如图2所示。头痛样表现如图3所示。智力低下的表现在于一岁仍未学会使用手吃食物，例如苹果(如图4所示)。

以上实施方式只是较佳的实施方式中的一种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (30)

1.一种非人灵长类动物的神经疾病动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 提供非人灵长类动物的细胞，将所述细胞中的富含脯氨酸的跨膜蛋白PRRT2基因失活或显著下调，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞；

(b) 利用步骤(a)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的细胞，再生制备得到PRRT2基因失活或显著下调的神经疾病动物模型，在步骤（a）中，还包括如下步骤：

(a1)利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因进行剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞，所述CRISPR基因编辑技术为CRISPR-Cas9基因编辑技术。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的一个或多个外显子进行剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的编码区或非编码区中进行剔除或基因编辑，从而得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR基因编辑技术，将所述PRRT2基因中的外显子2至外显子4中一个或多个外显子剔除或中断，得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（a1）中包括将sgRNA和cas9 mRNA混合物注射至非人灵长类动物细胞的细胞核中。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（a1）中包括将携带有sgRNA和cas9mRNA编码序列的载体转染到灵长类动物细胞核中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述携带有sgRNA和cas9 mRNA编码序列的载体是病毒载体。

8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述sgRNA进入到灵长类动物细胞核以后，能够靶向Prrt2基因，并在cas9的作用下对Prrt2基因进行编辑，导致Prrt2基因产生特异性突变。

9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述sgRNA序列选自下组：

(i) 对应的识别DNA序列为SEQ ID NO.1-6任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(a)限定的序列互补的多核苷酸。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵长类动物细胞为受精卵细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述受精卵细胞处于单个细胞状体阶段。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灵长类动物为猴子。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（b）中，还包括如下步骤：

(b1)利用步骤(a)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物细胞制备得到嵌合非人灵长类动物；

(b2)将步骤(b1)中得到的嵌合非人灵长类动物和正常野生型非人灵长类动物交配繁育，在后代中筛选获得PRRT2基因失活或显著下调的杂合子非人灵长类动物；

(b3)通过将步骤(b2)中得到的杂合子非人灵长类动物相互交配获得PRRT2基因失活或显著下调的纯合子非人灵长类动物，从而得到PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤（b3）中，还包括步骤（b4）：将PRRT2基因失活或显著下调的纯合子非人灵长类动物与同一物种的神经元特异性敲除工具非人灵长类动物进行杂交，从而获得神经元特异性的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PRRT2基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因失活包括PRRT2基因不表达，或表达没有活性的PRRT2蛋白。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PRRT2基因失活是神经元特异性的PRRT2基因失活。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中得到的PRRT2基因失活或显著下调的非人灵长类动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：

（c1）运动失调，所述运动失调包括：阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症、伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性非运动诱发性运动障碍、进行性共济失调、良性家族性婴儿癫痫、阵发性斜颈、睡眠中阵发性运动障碍、周期性共济失调；

（c2）头痛，所述头痛包括：偏头痛、偏瘫型偏头痛；

（c3）智力低下。

19.一种权利要求1所述方法制备的非人灵长类动物模型的用途，其特征在于，将该模型用作研究神经疾病的动物模型，所述神经疾病选自下组：

（c1）运动失调，所述运动失调包括：阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性运动诱发性舞蹈手足徐动症、伴随婴儿惊厥的阵发性运动诱发性运动障碍、阵发性非运动诱发性运动障碍、进行性共济失调、良性家族性婴儿癫痫、阵发性斜颈、睡眠中阵发性运动障碍、周期性共济失调；

（c2）头痛，所述头痛包括：偏头痛、偏瘫型偏头痛；

（c3）智力低下。

20.一种权利要求1所述方法制备的非人灵长类动物模型的用途，其中，将该模型用于筛选或鉴定可减轻或治疗神经疾病的治疗剂。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述神经疾病包括：运动失调、头痛、智力低下。

22.一种筛选或鉴定治疗或缓解神经疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 在测试组中，在测试化合物的存在下，将测试化合物施用于权利要求1所述方法制备的非人灵长类动物模型，对测试组的所述动物模型的行为进行行为学分析、并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，对对照组的所述动物模型的行为进行行为学分析；

(b)对测试组和对照组动物模型的行为进行比较，其中，与对照组相比，如果施用了测试化合物的动物模型中表征神经疾病行为得到改善，则表明该测试化合物可作为神经疾病的潜在治疗剂。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤（c），将步骤（b）筛选或鉴定的潜在治疗剂施用于权利要求1所述方法制备的非人灵长类动物模型，从而测定其对所述动物模型的行为的影响。

24.一种非人灵长类动物细胞的用途，其特征在于，所述细胞中的富含脯氨酸的跨膜蛋白PRRT2基因失活或显著下调，用于制备构建非人灵长类动物的神经疾病动物模型的生物制剂。

25.一种PRRT2基因或其蛋白的失活剂或下调剂的用途，其特征在于，用于制备构建非人灵长类动物的神经疾病动物模型的制剂。

26.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述失活剂包括抑制剂。

27.如权利要求25所述的用途，其特征在于，所述的PRRT2基因或其蛋白的失活剂或下调剂选自：

（i）靶向PRRT2基因的sgRNA；

（ii）携带有sgRNA编码序列的载体。

28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，所述载体为病毒载体。

29.一种PRRT2基因失活剂或下调剂，其特征在于，所述基因失活剂或下调剂为sgRNA，所述sgRNA序列选自下组：

(i) 对应的识别序列为SEQ ID NO.1-6任一所示的序列，或其组合；

(ii)与(a)限定的序列互补的多核苷酸。

30.如权利要求29所述的PRRT2基因失活剂或下调剂，其特征在于，所述sgRNA对应的识别DNA序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列。

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