JP2002541765A

JP2002541765A - Ｍｓｈ５を削除したマウス及びその利用法

Info

Publication number: JP2002541765A
Application number: JP2000589033A
Authority: JP
Inventors: ウィンフライドエデルマン; リチャードディーコロドナー; ジェフェリーダブリューポラード; ラジュエスクチャーラパティ
Original assignee: アルバートアインステインカレッジオブメディスン; ダナファーバーキャンサーインスティテュート
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2002-12-10
Also published as: WO2000036910A9; CA2355631A1; CN1352523A; US20050153922A1; EP1139732A1; US6444873B1; AU2389300A; AU2004203028A1; CN1298844C; WO2000036910A1; US7211375B1; AU771957B2

Abstract

(57)【要約】数多くの状態の治療法をスクリーニングするために有用であるMSH5遺伝子が誤発現される、たとえばトランスジェニックマウスなどの動物。また、in vivoまたはin vitroなどで評価される治療法の評価方法であって、MSH5誤発現動物またはその由来細胞へ前記治療法を施行するステップと、生殖能指標に対する前記治療法の作用を判定し、それにより前記生殖能治療法を評価するステップとを含む生殖能治療法の評価方法。また、避妊剤の同定法も記述する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】政府による資金提供ここに記述される発明は、米国国立予防衛生研究所交付金によって支援された
ものである。米国政府は本発明において特定の権利を有する。

【０００２】発明の分野本発明は、MutS相同体5（MSH5）遺伝子が誤発現する動物に関連し、かつその
ような動物もしくはその由来細胞を用いた方法、たとえば生殖能治療の評価法な
どに関連する。

【０００３】発明の背景 MutS相同体5（MSH5）はDNAミスマッチ修復に関与することが知られているたん
ぱく質ファミリの一つである (Modrich, P. & Lahue (1996) Annu. Rev. Bioche
m. 65, 101-133; Kolodner, R. (1996) Genes Dev. 10, 1433-1442) 。MSH2, ML
H1 及びMSH6 の生殖系変異は、遺伝性非ポリポーシス結腸癌（HNPCC）またはリ
ンチ症候群(Leach, F.S. et al. (1993) Cell 75, 1215-1225; Bronner, C.E. e
t al. (1994) Nature 368, 258-261; Papadopoulos, N. et al. (1994) Science
263, 1625-1629; Akiyama, Y. et al. (1997) Cancer Res. 57, 3920-3923; Mi
yaki, M. et al. (1997) Nature Genet. 17, 271-272)の原因となる。マウスに
おけるMsh2, Mlh1 、Msh6及びPms2の不活性化は、腸及びその他の癌の遺伝的素
因の原因となる(de Wind, N.et al. (1995) Cell 82, 321-330; Reitmair, A.H.
et al. (1995) Nature Genet. 11, 64-70)。酵母菌についての初期の研究では
、減数分裂におけるMSH5を含むいくつかのこれらのたんぱく質の役割を明らかに
した(Hollingsworth, N.M.,et al. (1995) Genes & Development 9, 1728-1739
; Ross-Macdonald, P. & Roeder, G.S. (1994) Cell 79, 1069-1080)。マウス
の遺伝子ターゲティング研究では、ほ乳類の減数分裂におけるMLH1及びPMS2の役
割を確認した(Baker, S.M. et al. (1995) Cell 82, 309-320; Edelmann, W. et
al. (1996) Cell 85, 1125-1134; Baker, S.M. et al. Nature Genet. 13, 336
-342)。

【０００４】発明の概要本発明は、MutS相同体5（MSH5）遺伝子が無発現変異するようなホモ接合型で
ある動物の作製、及びこれらの動物が生殖不能であるという観察に、少なくとも
一部基づいている。したがって、本発明は、MutS相同体5（MSH5）たんぱく質を
コードする遺伝子を誤発現させた非ヒト動物を特徴とする。

【０００５】好適な実施例では、動物、好ましくはトランスジェニック動物は、非ヒト霊長
類、または小型ブタなどのブタ、サル、ヤギ、またはラットなどの齧歯類などの
ほ乳類であるが、好ましくはマウスである。

【０００６】好適な実施例では、MSH5たんぱく質をコードする遺伝子の発現を、野生型動物
に比べて減少させる。たとえば、MSH5たんぱく質のレベルは、野生型動物と比較
して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または100%抑制されていてよい。

【０００７】好適な実施例では、MSH5たんぱく質をコードする遺伝子の誤発現は、MSH5遺伝
子の破壊により生じる。たとえば、このたんぱく質全体または一部分をコードす
るDNAの除去により、MSH5遺伝子を破壊することができる。

【０００８】好適な実施例では、動物は誤発現MSH5遺伝子にとってヘテロ接合型、またはホ
モ接合型であってよく、たとえば、MSH5導入遺伝子にとってヘテロ接合型または
ホモ接合型のトランスジェニック動物であってよい。

【０００９】好適な実施例では、当該動物は、MSH5遺伝子をトランスジェニック破壊、好ま
しくは挿入または欠失させて、その遺伝子産物を不活性化したトランスジェニッ
クマウスである。

【００１０】別の態様では、本発明は、動物または細胞に導入すると、その動物または細胞
にMSH5遺伝子誤発現を生じる、ある核酸分子を特徴とする。好ましい実施例では
、その核酸分子は、挿入または欠失および好ましくは標識配列の挿入などの破壊
を含むMSH5ヌクレオチド配列を含む。たとえば、核酸分子は、図１に示すターゲ
ティング作成物であってよい。

【００１１】別の態様では、本発明は、生殖能治療の評価法を特徴とする。その方法には、
たとえばトランスジェニックマウスまたはその由来細胞などMSH5誤発現動物への
治療の施行、および、生殖能治療を評価するための、たとえば精子数、精巣サイ
ズ、または卵母細胞の形態などの生殖能指標への治療法の作用の判定、が含まれ
る。本方法はin vivoまたはin vitroで行われてよい。

【００１２】好適な実施例では、その動物または細胞は、ここに記述された動物または細胞
である。その他の好適な実施例では、本方法はMSH5遺伝子の発現が阻害されたト
ランスジェニックマウスを用いる。さらに他の好適な実施例では、本方法はMSH5
遺伝子の発現が阻害されたトランスジェニックマウスに由来する細胞を用いる。

【００１３】別の態様では、本発明はMSH5活性を変調する化合物の同定法を特徴とする。本
方法は、MSH5と検査用化合物を接触させ、検査用化合物がMSH5活性に及ぼす作用
を明らかにすることを含み、それによりMSH5活性を変調する化合物を同定する。
好適な実施例ではMSH5活性は阻害される。

【００１４】別の態様では、本発明はMSH5活性の変調法を特徴とする。本方法はMSH5または
MSH5を発現する細胞を、MSH5活性を変調するために十分な量（たとえば十分な濃
度）の、MSH5と結合する化合物に接触させることを含む。好適な実施例では、MS
H5活性が阻害され、たとえば本方法は避妊に用いられてもよい。

【００１５】別の態様では、本発明は生殖能疾患または障害を有するまたは発症する危険性
のある被験者を識別する方法を特徴とする。本方法は、前述の被験者からサンプ
ルを採取し、そのサンプルを、MSH5に選択的にハイブリッド形成する核酸プロー
ブまたはプライマと接触させ、異常なMSH5発現または活性がサンプル中に存在す
るかどうかを判定し、その結果、生殖能疾患または障害を有するまたは発症する
危険性のある被験者を識別することを含む。

【００１６】別の態様では、本発明は、ここに記述されたMSH5誤発現動物などのMSH5誤発現
動物から分離された細胞、または精製された細胞製剤を特徴とする。好適な実施
例では、細胞は、MSH5たんぱく質をコードする遺伝子が誤発現されるトランスジ
ェニック細胞である。細胞、好ましくはトランスジェニック細胞は卵母細胞また
は精母細胞であってよい。

【００１７】好適な実施例では、当該細胞はトランスジェニック突然変異遺伝子にとってヘ
テロ接合型またはホモ接合型である。

【００１８】本発明の他の特徴及び利点は、後述の詳細な説明及び請求の範囲で明らかにな
るであろう。

【００１９】発明の詳細な説明本発明は、MutS相同体5（MSH5）遺伝子が無発現変異するようなホモ接合型で
ある動物の作製、及びこれらの動物が生殖不能であるという観察に、少なくとも
一部基づいている。したがって、本発明は、MutS相同体5（MSH5）たんぱく質を
コードする遺伝子が誤発現する非ヒト動物を特徴とする。好適な実施例では、そ
の動物は、好ましくはトランスジェニック動物である。

【００２０】ここで用いられる「トランスジェニック動物」は、ブタ、サル、ヤギまたはマ
ウスなどの齧歯類などの、非ヒトほ乳類などの動物で、その動物の一つ以上、好
ましくは基本的にはすべての細胞に導入遺伝子が含まれている動物を含む。顕微
注射、形質移入、または組み換えウィルスの感染などによる感染などによる細胞
前駆体への直接的または間接的導入により、導入遺伝子を細胞に導入する。遺伝
子操作という言葉は、組み換えDNA分子の導入を含む。この分子は染色体内に組
み込まれてもよく、または染色体外複製DNAでもよい。

【００２１】ここで用いられる「齧歯類」とは、系統学における齧歯目に属するすべての動
物を意味する。

【００２２】ここで用いられる「誤発現」という言葉は、非野生型パターンの遺伝子発現を
含む。ここで用いられる発現には、転写段階、mRNA安定性などの転写後の段階、
翻訳段階、及び翻訳後の段階を含む。誤発現は、非野生型レベルの発現、すなわ
ち過剰または過少な発現、遺伝子が発現する時間または段階に関して野生型とは
異なる発現パターン、たとえばある決められた発生期間または時期における（野
生型と比較した）発現の増加または減少、ある所定の細胞型または組織型におけ
る（野生型と比較して）発現の減少に関して野生型とは異なる発現パターン、ス
プライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または発現したポリペプチド
の生物学的活性の点で野生型とは異なる発現パターン、環境刺激または細胞外刺
激の遺伝子発現への影響の点で野生型と異なる発現パターン、たとえば刺激の強
度が増加または減少した場合に発現が（野生型と比較して）増加または減少した
パターン、が含まれる。誤発現には、トランスジェニック核酸からのいかなる発
現も含まれる。誤発現には、たとえば遺伝子またはその制御配列のすべてまたは
一部の削除により引き起こされることがある、遺伝子または導入遺伝子の欠失ま
たは不発現が含まれる。

【００２３】ここで用いられる「ノックアウト」という言葉は、導入遺伝子の挿入により動
物またはその由来細胞の内性遺伝子が破壊されている、動物またはその細胞を意
味する。この破壊は、その動物または細胞のMSH5を実質的に消去するものでもよ
い。

【００２４】好適な実施例では、MSH5たんぱく質をコードする遺伝子の誤発現は、MSH5遺伝
子の破壊により生じる。たとえば、MSH5遺伝子は、そのたんぱく質のすべてまた
は一部をコードするDNAの除去により破壊することができる。

【００２５】好適な実施例では、その動物は、誤発現させるMSH5遺伝子にとってヘテロ接合
型またはホモ接合型であってよく、たとえば、MSH5導入遺伝子にとってヘテロ接
合型またはホモ接合型なトランスジェニック動物であってよい。

【００２６】好適な実施例では、その動物は、MSH5遺伝子をトランスジェニック破壊、好ま
しくは挿入または欠失させて、当該遺伝子産物を不活性化したトランスジェニッ
クマウスである。

【００２７】別の態様では、本発明は、動物または細胞に導入すると、その動物または細胞
にMSH5遺伝子誤発現を生じる、ある核酸分子を特徴とする。好適な実施例では、
当該核酸分子は、挿入または欠失などの破壊及び好ましくは標識配列の挿入を含
むMSH5ヌクレオチド配列を含む。野生型MSH5のヌクレオチド配列は当業において
公知であり、たとえばその内容をそれに言及することによりここに編入すること
とするWinand, N.J.et al. (1998) Genomics 53, 69-80に記述されている。たと
えば、当該核酸分子は、図１に示すようにターゲティング作成物であってよい。

【００２８】ここで用いられる「標識配列」という言葉は、(a)関心の対象である遺伝子（M
SH5遺伝子など）の発現を破壊するような核酸作成物（ターゲティング作成物な
ど）の一部として用いられ、(b)ターゲティング作成物をそのゲノムに組み込ま
せて有した細胞の識別に用いられる核酸分子を意味する。たとえば、標識配列は
、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、またはたとえばアルカリ
ホスファターゼ、カラシペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシ
ダーゼなど、細胞中では一般に発見されない検定可能酵素など、検出可能な特徴
を細胞上に残すたんぱく質をコードする配列であってもよい。

【００２９】ここで用いられる「遺伝子の破壊」は、たとえばコード領域の変化などの、遺
伝子配列の変化を意味する。破壊には、挿入、欠失、点突然変異、及び反転など
の再配列を含む。破壊は、当該遺伝子の野生型即ち自然発生配列と比較して細胞
内の遺伝子発現を減少または防止するように、天然のMSH5 DNA配列（一つ以上の
エキソンなど）領域に、及び／または、当該遺伝子のプロモータ領域に生じるも
のでもよい。「破壊」は従来の無作為突然変異法または部位指定法により誘発さ
れてもよい。破壊は遺伝子組み換え的に導入されてもよい。遺伝子全体の削除は
破壊である。好ましい破壊は、ヘテロ接合型の場合、MSH5レベルを野生型の約50
％まで減少させ、ホモ接合型の場合、基本的にMSH5を除去するものである。

【００３０】別の態様では、本発明は生殖能治療の評価法を特徴とする。本発明には、MSH5
誤発現動物またはその細胞に治療を行い、治療が生殖能指標に与える作用を明ら
かにし、それにより生殖能治療を評価することが含まれる。本方法は、in vivo
またはin vitroで行われてよい。ここで用いられる「生殖能指標」には、精子数
、精巣の大きさ、または卵母細胞の形態など、生殖に関連したあらゆるパラメタ
も含まれる。

【００３１】ここで用いられる「動物または細胞への治療の施行」は、動物または細胞に治
療を施行、送達、又は適用することを意味するものと意図されている。治療薬に
関して、「投与する」とは、治療薬を動物の望まれる部位に送達する適切な経路
により、治療薬を動物に接触、または調剤、送達、または適用することを意味す
るものと意図されており、非経口または経口経路、筋肉内注射、皮下／皮内注射
、静脈注射、口腔投与、経皮送達、及び鼻腔内または呼吸器経路投与のいずれか
による送達方法を含む。

【００３２】好適な実施例では、その動物または細胞は、ここに記述された動物または細胞
である。他の好適な実施例では、本方法にはMSH5遺伝子の発現が阻害されている
トランスジェニックマウスを用いる。さらに他の好適な実施例では、その方法は
、MSH5遺伝子の発現が阻害されているトランスジェニックマウス由来の細胞を用
いる。

【００３３】別の態様では、本発明はMSH5活性を変調する化合物の同定方法を特徴とする。
本方法は、MSH5を検査用化合物に接触させるステップと、検査用化合物のMSH5活
性への作用を明らかにし、それによりMSH5活性を変調する化合物を同定するステ
ップとを含む。好適な実施例では、MSH5活性が阻害される。

【００３４】ここに用いられる「化合物」には、たとえばペプチド、ペプチドミメティック
、低分子、またはその他の薬物など、MSH5たんぱく質に結合し、たとえばMSH5発
現またはMSH5活性などに対する刺激作用または阻害作用を有するか、もしくはた
とえばMSH5基質の発現または活性などへの刺激作用または阻害作用を有する、あ
らゆる薬剤が含まれる。

【００３５】別の態様では、本発明はMSH5活性の変調方法を特徴とする。本方法は、MSH5ま
たはMSH5を発現している細胞を、MSH5活性を変調するのに十分な量の、MSH5に結
合する化合物に接触させることを含む。好適な実施例では、例えば避妊などにお
いてMSH5の活性が阻害される。

【００３６】ここに用いられる「避妊」は生殖の防止を含むが、生殖能力を破壊しないこと
が望ましい。

【００３７】別の態様では、本発明は生殖能疾患または障害を有する、または発症の危険性
のある被験者を識別する方法を特徴とする。本方法には、前述の被験者からサン
プルを採取し、そのサンプルをMSH5に選択的にハイブリッド形成する核酸プロー
ブまたはプライマと接触させ、異常なMSH5発現または活性がサンプル中に存在す
るかどうかを判定し、それにより、生殖能疾患または障害を有するまたは発症す
る危険性のある被験者を識別することが含まれる。

【００３８】ここに用いられる「生殖能疾患または障害」には、生殖に影響するあらゆる疾
患、障害または状態が含まれる。生殖能疾患には、生殖子、つまり卵子及び精子
の発達に異常がある状態や、胎仔が満期産を迎えることができない状態が含まれ
る。このような生殖能障害の例には、精子数低下、習慣性流産、及び排卵異常が
含まれる。

【００３９】別の態様では、本発明は、ここに記述されたMSH5誤発現動物などのMSH5誤発現
動物から分離された細胞、または精製された細胞製剤を特徴とする。好適な実施
例では、その細胞は、MSH5たんぱく質をコードする遺伝子が誤発現されるトラン
スジェニック細胞である。細胞、好ましくはトランスジェニック細胞は卵母細胞
または精母細胞である。

【００４０】好適な実施例では、細胞はトランスジェニック突然変異遺伝子にとってヘテロ
接合型、またはホモ接合型である。

【００４１】ここに用いられる「トランスジェニック細胞」は、導入遺伝子を有する細胞を
意味する。

【００４２】ここに用いられる「精製製剤」は、被験者の細胞を、数または重量で少なくと
も10%、好ましくは50%、さらに好ましくは90% 含む製剤である。

【００４３】本発明の詳細を、以下の小節に記述することとする。

【００４４】 MSH5ターゲティング作成物の調製ターゲティング作成物の生成に用いられるMSH5ヌクレオチド配列を、ある部位
を消化するように選択された特定の制限酵素を用いて消化し、標識遺伝子をコー
ドする新たなDNA配列を、このMSH5ヌクレオチド配列内の適当な位置に挿入でき
るようにする。標識遺伝子は、天然遺伝子の発現を阻止するように働くように挿
入すべきである。その位置は切断しようとする配列内の制限部位、及びエキソン
配列またはプロモータ配列もしくはその両方に割り込むかどうか（つまり、MSH5
遺伝子発現を阻害するために必要な、正確な挿入部位）など、様々な要因に依存
するであろう。場合によっては、標識遺伝子をターゲティング作成物に挿入した
場合にそのターゲティング作成物の長さが元のゲノム配列に比較できるように、
抑制される遺伝子の一つ以上のエキソンの一部またはすべてを、実際に除去する
ことが望ましい場合もある。このような場合、適当な長さの断片が除去できるよ
うに、適切な制限酵素を用いてゲノムDNAを切断する。

【００４５】標識配列は、どのような検出可能及び／または検定可能なヌクレオチド配列で
あってもよい。たとえば、標識遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子であっても、また
はゲノム中の発現が容易に検出できる他の遺伝子であってよい。標識遺伝子は、
それ自体のプロモータ、または挿入された先の細胞内で活性である供給源から得
られる別の強力なプロモータに連結させてもよく、また、MSH5遺伝子のプロモー
タを用いて転写されてもよい。標識遺伝子は、当該遺伝子の3'末端に結合したポ
リA配列を有していてもよく、この配列は遺伝子の転写を終了させるように働く
。たとえば、標識遺伝子は、(a)たとえば原生生物宿主細胞の場合のアンピシリ
ン、テトラサイクリン、またはカナマイシン、及びほ乳類細胞の場合のネオマイ
シン、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの抗生物質またはその他の
毒素に対する耐性を付与する、（b）細胞の栄養要求欠乏の補足をする、または(
c)複合培地から得られない必須栄養素を補給する、たんぱく質であってよい。

【００４６】 MSH5 DNA配列を適切な制限酵素で消化後、当業に知られ、Sambrook et al., M
olecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed., Cold Spring Harbor L
aboratory Press: 1989に記述されその内容がそれに言及することによりここに
編入される方法を用いて、標識遺伝子配列をMSH5 DNA配列に連結する。

【００４７】好ましくは、連結させるDNA断片の末端が適合性であるとよく、これは適合性
末端を生じる酵素ですべての断片を制限するか、または結合の前に末端を平滑化
することにより達成される。平滑化は、たとえばクレノー断片（DNAポリメラー
ゼI）を用いる方法など、粘着末端を充填する、当業で公知の方法で行われる。

【００４８】連結したターゲティング作成物は、胚性幹細胞に直接挿入されるか、または挿
入の前に増幅のために適切なベクタにまず配置してもよい。好ましいベクタはp
BluescriptII SKベクタ（ストラタジーン社、カリフォルニア州サンディエゴ）
またはpGEM7（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）など、バクテリア細胞
中で迅速に増幅されるものである。

【００４９】トランスジェニックマウスの作成胚性幹細胞の形質移入マウス胚性幹細胞（ES細胞）を、トランスジェニック（たとえばノックアウト
）MSH5マウスの作製に用いることができる。ターゲティング作成物を生殖細胞系
で伝えさせるためには、発生中の胚の生殖細胞系に組み込まれ、その一部となる
ことが可能であれば、いかなるES細胞系も、ここでの使用に適している。たとえ
ば、ES細胞生成に用いることができるマウス系は、129J系である。好ましいES細
胞系はマウス細胞系D3（アメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ番号
CRL 1934）である。当業に知られ、その内容がそれに言及することによりここに
編入されるRobertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pract
ical Approach, E.J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C., 1987, in
Bradley et al., Current Topics in Devel. Biol., 20:357-371, 1986 及びin
Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986に記述され
ている方法で、その細胞をDNA挿入のために培養、調製することができる。

【００５０】ノックアウト作成物は、たとえばSambrook et al.に記述されるような当業で
公知の方法により、ES細胞に導入することができる。適切な方法には、電気穿孔
法、顕微注入法、及びリン酸カルシウム処理法がある。

【００５１】 ES細胞に導入されるターゲティング作成物は、好ましくは直線状である。ベク
タ配列内のみで切断しMSH5遺伝子配列内では切断しないように選択した適切な制
限酵素でDNAを消化することで、直線化を行なうことができる。

【００５２】ターゲティング作成物の導入後、その作成物の存在について、その細胞をスク
リーニングする。その細胞のスクリーニングは様々な方法を用いてよい。標識遺
伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、その細胞を、耐性遺伝子がない場合に致
死濃度である抗生物質の存在下で培養してよい。生存したそれらの細胞はノック
アウト作成物を組み込んだものと推定される。ES細胞ゲノムDNAのサザンブロッ
トも使用してよい。標識遺伝子が活性を検出できる酵素（ベータガラクトシダー
ゼなど）をコードしている遺伝子である場合、その酵素基質を適切な条件下でそ
の細胞に加え、その酵素活性を分析してもよい。

【００５３】ターゲティング作成物が適切に組み込まれた細胞を特定するためには、標準方
法を用いてES細胞からDNAを抽出してもよい。DNAはその後、特定の制限酵素で消
化されたゲノムDNAに特異的なパターンでハイブリッド形成するよう設計された
一つ又は複数のプローブを用いて、サザンブロットでプローブしてもよい。その
代わりに、またはそれに加えて、ターゲティング作成物を適当な位置に有する細
胞だけが適当なサイズのDNA断片を生成するように、特定のサイズ及び配列のDNA
断片を増幅するように特別に設計したプローブを用いたPCRによって、ゲノムDNA
を増幅してもよい。

【００５４】胚への注入／移植胚操作及び顕微注入法の手順は、たとえばManipulating the Mouse Embryo (C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1986、その
内容はそれに言及することによりここに編入される）などに記述されている。同
様の方法は、他のトランスジェニック動物を生成するためにも用いられている。
例示的な実施例の場合、マウス接合体は、妊馬マ血清（PMS)による処理後、４８
時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピンで処理をして過剰排卵を起こした生後６週の
雌から採取する。初回抗原刺激を受けた雌を雄と一緒にして、翌朝膣栓を調べる
。擬妊娠した雌を発情について選抜し、確認済みの生殖不能精管切除雄と一緒に
して、レシピエントとして用いる。接合体を採取し、卵丘細胞を除去する。さら
に、未分化胚芽細胞を収集してもよい。前核胚は、雄と交配させた雌マウスから
回収される。雌は、卵胞の成長を誘発するために妊馬血清、PMS、で、そして排
卵を誘発するためにヒト絨毛性ゴナドトロピン、hCG、で処理する。胚は、ダル
ベッコ改良リン酸緩衝食塩水（DPBS)中に回収し、10%ウシ胎仔血清を補充したダ
ルベッコ改良基本培地（DMEM）中に維持する。

【００５５】 MSH5ターゲティング作成物の顕微注入は、顕微鏡に取り付けた標準マイクロマ
ニピュレータを用いて行ってよい。例えば、胚は、通常、顕微微小注入中、100
マイクロリットルの油下DPBS滴中に維持する。雄前核にDNA溶液を顕微注入する
。前核の膨潤により、注入の成功が観察される。同様の技術を用いて、未分化胚
芽細胞に組み換えES細胞を注入してもよい。注入直後、胚は、たとえば精管切除
した雄マウスと交配した成熟マウスなどの雌レシピエントに移される。一般的な
プロトコルでは、雌レシピエントを麻酔し、腰部周囲を切開して卵管を露出し、
胚を卵管膨大部領域に転換する。体壁を縫合し、皮膚は創傷挟子で閉じる。

【００５６】ターゲティング作成物の存在に関するスクリーニングトランスジェニック（たとえばノックアウト）動物は、標準プロトコルにより
、生後に識別することができる。尾の組織から得たDNAは、サザンブロット及び
／またはPCRを用いてターゲティング作成物が存在するかどうか、スクリーニン
グしてもよい。モザイク状と思われる子孫は、それらが生殖細胞系にターゲティ
ング作成物を有すると確信できれば、それらを相互に交配することで、ホモ接合
型ノックアウト動物を生じさせる。仔の生殖細胞系に伝達が起きるかどうかが明
白でない場合は、親または他の系統と交配させて、仔にヘテロ接合性についてス
クリーニングを行ってもよい。ヘテロ接合体は、DNAのサザンブロット及び／ま
たはPCR増幅で識別される。

【００５７】このヘテロ接合体は、その後、ホモ接合型トランスジェニック仔を生成するた
めに、お互いに交配してよい。ホモ接合体は、この交配で作られたマウスや、ヘ
テロ接合体であるとわかっているマウス及び野生型マウスから得られた、等量の
ゲノムDNAのサザンブロットにより識別されよう。サザンブロットをスクリーニ
ングするプローブは、後述するように設計することができる。

【００５８】ノックアウト仔の識別及び特徴づけのその他の方法は、当業に知られている。
たとえば、ノックアウトされた遺伝子、標識遺伝子、またはその両方のいずれか
をコードする転写産物の存在の有無を明らかにするためにmRNAをプローブする場
合、ノーザンブロットを用いてもよい。さらに、これらの仔の様々な組織中でノ
ックアウトされた遺伝子の発現レベルを評価するために、ウェスタンブロットを
用い、ノックアウトされた遺伝子（たとえばMSH5たんぱく質）によりコードされ
たたんぱく質に対する抗体や、または、標識遺伝子が発現される場合はこの遺伝
子産物に対する抗体で、ウェスタンブロットをプローブしてもよい。最後に、仔
から得た様々な細胞のin situ分析（たとえば細胞を固定し抗体で標識する）及
び／またはFACS（蛍光活性化細胞ソーティング）分析を、適切な抗体を用いて行
い、ターゲティング作成物の遺伝子産物の存在の有無を探索してもよい。

【００５９】その他のトランスジェニック動物本発明の方法に用いられるトランスジェニック動物はほ乳類、鳥類、爬虫類ま
たは両生類であってよい。ここに記述される用途に適したほ乳類には、反芻動物
、有蹄動物、家畜ほ乳類、及び酪農動物が含まれる。好ましい動物には、ヤギ、
羊、ラクダ、雌牛、ブタ、馬、雄牛、ラマ、鶏、ガチョウ、及び七面鳥が含まれ
る。このような動物の調製法及び使用法は、当業で公知である。トランスジェニ
ックブタの作製プロトコルは、White and Yannoutsos, Current Topics in Comp
lement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94、米国特許No. 5,523,
226; 米国特許No. 5,573,933; PCT 出願 WO93/25071; 及び PCT 出願 WO95/047
44に見ることができる。トランスジェニックラットの作製プロトコルは、Bader
and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp.
3:S81-S87, 1996に見ることができる。トランスジェニック雌牛の作製プロトコ
ルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinke
rt, Academic Press, Incに見ることができる。トランスジェニック羊の作製プ
ロトコルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A.
Pinkert, Academic Press, Incに見ることができる。

【００６０】 MSH5トランスジェニックマウスの使用 MSH5誤発現マウスなどの動物、または細胞は、たとえば生殖障害などのMSH5関
連障害の治療法のスクリーニングに用いることができる。ある範囲の投与量の候
補治療を、動物または細胞に施行してもよい。評価されている障害治療法に対す
る作用について、様々な時点で有効性を検定してもよい。

【００６１】このような治療法は、生殖能指標に及ぼす、その治療の作用を判定することに
より評価することができる。このようなパラメータには、精子数、精巣の大きさ
、または卵母細胞の形態が含まれる。たとえば、生殖能の状態の治療には、動物
の卵巣変性の治療が含まれ、それによりヒト被験者に施行するのに適切な治療法
を明らかにする。

【００６２】本発明の方法は、減数分裂など細胞プロセスにおけるMSH5機能の機序を明らか
にするために、MSH5除去動物由来の細胞を研究するために用いてもよい。たとえ
ば、MSH5誤発現動物から細胞を分離し、MSH5経路中または独立した経路中のMSH5
の下流に作用する薬剤を同定するために用いてもよい。

【００６３】候補治療法ここに記述される方法を用いて評価される候補治療法には、(a)MSH5誤発現動
物または細胞への治療薬（たとえば薬物、化学物質、抗体、たんぱく質、核酸ま
たはその他の物質）の投与、(b)MSH5誤発現動物への食餌療法の施行、(c)MSH5誤
発現動物または細胞へのイオン化放射線の照射、が含まれてもよい。前述の治療
法のどのような組み合わせもMSH5誤発現動物または細胞に施行されてもよい。候
補治療法が評価されている障害または状態の発症前、発症と同時に、及び／また
は発症後に、その治療法を施行することができる。MSH5誤発現動物への治療薬の
投与は、経口、非経口、または局所的に行ってもよい。

【００６４】予知／診断検定法本発明は、診断検定法及び予後検定法を予後（予知）目的で用い、その方法に
より個人を予防的に治療する予知医学の分野にも関連する。したがって、本発明
のある態様は、生物学的サンプル（たとえば血液、血清、細胞、組織）に関連し
てMSH活性と共にMSH5たんぱく質及び／または核酸発現を判定し、それにより、
ある患者が、たとえば不妊などの異常MSH5発現または活性に関連する疾患または
障害に罹患しているか、またはそのような障害を発症する危険性があるかどうか
を判定する診断検定法に関連する。本発明は、ある患者がMSH5たんぱく質、核酸
発現、または活性に関連する障害を発症する危険性があるかどうかを判定する予
後（または予知）検定法も提供する。たとえば、MSH5遺伝子の突然変異は、生物
学的サンプルで検定することができる。このような検定法は、予後または予知目
的のために用いることが可能で、それによりMSH5たんぱく質、核酸発現または活
性を特徴とするまたは関連する障害の発症前に個人を予防的に治療することがで
きる。

【００６５】スクリーニング検定法本発明は、変調剤、すなわちMSH5たんぱく質に結合し、たとえばMSH5発現また
はMSH5活性などに対する刺激または阻害作用を有し、またはたとえばMSH5基質の
発現または活性に対する刺激または阻害作用を有する、候補または検査用化合物
または薬剤（たとえばペプチド、ペプチドミメティック、低分子または他の薬剤
）を同定する方法（ここでは「スクリーニング検定法」とも呼ぶ）を提供する。

【００６６】ある実施例では、本発明は、MSH5たんぱく質またはポリペプチドあるいは生物
学的に活性なその一部の基質である候補または検査用化合物のスクリーニング検
定法を提供する。別の実施例では、本発明は、MSH5たんぱく質またはポリペプチ
ドあるいは生物学的に活性なその一部分に結合するか、またはそれらの活性を変
調する候補または検査用化合物のスクリーニング検定法を提供する。本発明の検
査用化合物は、生物学的ライブラリ、空間アドレッサブル平行固相または液相ラ
イブラリ、逆重畳積分を要する合成ライブラリ法、「1-ビーズ1-化合物」ライブ
ラリ法、及びアフィニティクロマトグラフィ選別を用いた合成ライブラリ法を含
め、当業で公知のコンビナトリアル・ライブラリ法のうちの多くのアプローチの
いずれかを用いて得ることができる。生物学的ライブラリのアプローチはペプチ
ドライブラリに限定されるが、その他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチ
ドオリゴマ、または化合物の低分子ライブラリに応用できる(Lam, K.S. (1997)
Anticancer Drug Des. 12:145)。

【００６７】治療法本発明の別の態様は、治療を目的とした、MSH5発現または活性の変調法に関連
する。したがって、例示的実施例では、本発明の変調法は、細胞を、MSH5または
MSH5たんぱく質の一つ以上の活性を変調する薬剤に接触させるステップを含む。
MSH5たんぱく質活性を変調する薬剤は、核酸またはたんぱく質、MSH5たんぱく質
の自然発生標的分子、MSH5抗体、MSH5作用薬または拮抗薬、MSH5作用薬または拮
抗薬のペプチドミメティック、または他の低分子であってよい。ある実施例では
、その薬剤は、一つ以上のMSH5活性を刺激する。このような刺激薬剤の例には、
活性MSH5たんぱく質や、細胞に導入された、MSH5をコードする核酸分子が含まれ
る。別の実施例では、その薬剤は一つ以上のMSH5活性を阻害する。そのような阻
害薬剤の例には、アンチセンスMSH5核酸分子、抗MSH5抗体、及びMSH5阻害剤が含
まれる。これらの変調法は、in vitro（たとえば、その細胞を薬剤と共に培養す
る）またはその代わりにin vivo（たとえば、その薬剤を被験者に投与する）で
行われてもよい。このように、本発明は、たとえば生殖障害など、MSH5たんぱく
質または核酸分子の異常発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した
患者を治療する方法を提供する。ある実施例では、本方法は、MSH5発現または活
性を変調（たとえば、上方調節または下方調節）する薬剤（たとえば、ここに記
述されるスクリーニング検定法により同定された薬剤）または薬剤の組み合わせ
を投与するステップを含む。別の実施例では、本方法はMSH5発現または活性の減
少または異常を補うために、治療としてMSH5たんぱく質または核酸分子を投与す
るステップを含む。

【００６８】 MSH5活性の刺激は、MSH5が異常に下方調節されている場合、及び／またはMSH5
活性の増加が有益な効果をもたらすと考えられる場合には望ましい。たとえば、
MSH5活性の刺激は、MSH5が下方調節されている場合、及び／またはMSH5活性の増
加が有益な効果をもたらすと考えられる場合には、望ましい。同様に、MSH5活性
の阻害は、MSH5が異常に上方調節されている場合、及び／またはMSH5活性の減少
が有益な効果をもたらすと考えられる場合には望ましい。

【００６９】本発明は以下の実施例によりさらに具体的に説明されるが、以下の実施例を限
定的なものとして捉えられてはならない。この出願全体に引用されたすべての参
考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、それに言及することによりこ
こに編入したものである。

【００７０】実施例材料及び方法マウスMsh5 cDNAクローニングマウスMsh5遺伝子の元のセグメントは、BALB/cゲノムDNA（クロンテック社）
及びヒトcDNA配列に基づくプライマGTGCTGTGGAATTCAGGATAC (センス; SEQ ID NO
:1) 及び CCAGAACTCTCTGGAGAAGC (アンチセンス; SEQ ID NO:2) を用いて、PCR
により得られた。マウスMsh5コード配列の残りは、アドバンテージcDNA PCRキッ
ト及び遺伝子特異的プライマCTCCACTATCCACTTCATGCCAGATGC (センス; SEQ ID NO
:3) 及び GCTGGGGAGGACACTGGAAGGACTCTCA (アンチセンス, ヒト3'-非翻訳cDNA配
列に基づく; SEQ ID NO:4)を用いて、RT-PCRによりクローニングされた。

【００７１】マウスMsh5ゲノム座は、ゲノム・システムズ社によりスクリーニングされたP1
マウス胚性幹細胞ゲノムライブラリからクローニングされ、３個のクローン1105
1、11052、11053を生成した。

【００７２】 pMsh5ex18ターゲティングベクタの作成エキソン18を有するゲノムMsh5断片は、マウスゲノムシャロン35、129/Olaフ
ァージライブラリのスクリーニングにより得られた。エキソン18を有する3.8 kb
のHindIII 断片は、pBluescript SK+/-へサブクローニングされ、2.0kbのBgIII
PGKハイグロカセットを、BgIII/AatIIアダプタを用いて、エキソン18中のコド
ン528にあるAatIII部位へクローニングした。その結果得られた遺伝子ターゲテ
ィングクローンは、pMsh5ex18と命名された。

【００７３】胚性幹細胞の電気穿孔ターゲティングベクタpMsh5ex18(50ug)を、WW6 ES細胞内に電気穿孔注入し（I
offe, E. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7357-7361に記述）
、ハイグロマイシン耐性コロニーを分離し、正方向プライマA 5'-AGCTGGAGAACCT
GGACTCTC -3' (SEQ ID NO:5) 及び逆方向プライマB 5'-TGGAAGGATTGGAGCTACGG-3
' (SEQ ID NO:6)を用いてPCRによりスクリーニングした。陽性ES細胞コロニーは
、ターゲティング・イベントに特異的な1.5kbのPCR断片により特定された。６つ
の陽性細胞系、MSH5-1、MSH5-33、MSH5-41、MSH5-52、MSH5-58及びMSH5-109が特
定され、高分子量のDNAのNsiI消化、及びターゲティング・ベクタに含まれてい
ないエキソン13から14の間の5'イントロン領域に向けた0.8kbのEcoRI/HindIIIプ
ローブを用いたサザンブロット分析により、ターゲティングが正しく起きたこと
が示唆された。

【００７４】ノーザンブロット分析生後24日雄から得たポリA RNA 4mgを、1.0%アガロースホルムアルデヒドゲル
上で分離し、ニトロセルロース・メンブレン上に移し、エキソン3から8に相当す
るMsh5プローブ、完全長マウスMsh4 cDNA、及び、ヒトβアクチンプローブ、に
ハイブリッド形成した。

【００７５】ウェスタンブロット分析ウェスタンブロット分析では、生後23日雄の精巣抽出物から得た等量のたんぱ
く質を、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、イモビロン-P（ミリポア
社）メンブレン上に移した。その膜を、TBS、0.1%ツイーン-20、5%脱脂粉乳、10
%ヤギ血清（シグマ社）の中で遮断し、1:1,000希釈の一次抗MSH5抗体と一緒にイ
ンキュベートした。結合したたんぱく質は、1:30,000希釈されたヤギ抗マウスIg
G西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（シグマ社）を用いて、化学蛍光法で検出
した。

【００７６】組織学 e18から生後（pp）5週の間のMsh5+/+及び Msh5-/-雌の卵巣を取り出し、ブア
ン液または4％緩衝ホルマリンに30-360分間固定し、その後70％エタノールへ移
した。精巣は、4％緩衝ホルマリンの経心灌流により固定され、その後新鮮な固
定液中に一晩置いた。組織学のために、通常の方法によりすべての組織を処理し
、3から5mmに断片化した。

【００７７】染色体 Counce and Meyer ( Counce, S.J. & Meyer, G.F. (1973) Chromosoma 44, 23
1-253に記述、その内容はそれに言及することによりここに編入する) の方法に
改良を加えたものに従って、染色体スプレッドを調製した。スプレッドは、50％
硝酸銀中、65℃で６時間銀染色（電子顕微鏡のため）するか、またはMoensの方
法（Spyropoulos, B. & Moens, P.B. (1994) Methods in Molecular Biology 33
, 131-139に記述、その内容はそれに言及することによりここに編入する)に従っ
て、染色体関連たんぱく質を免疫蛍光によってローカリゼーションした。

【００７８】例１：Msh5^-/-マウスの作製及び分析ほ乳類におけるMSH5の役割を評価するために、Msh5に無発現変異を持つマウス
を作製し特徴付けを行った。Msh5^-/-マウスは生存可能であるが生殖不能である
。これらのマウスの減数分裂は第一分裂前期における染色体対合の破壊のために
重篤な影響を受けている。この減数分裂不全は、精巣サイズの縮小及び卵巣構造
の完全な喪失を引き起こす。これらの結果は、正常なMSH5機能は、減数分裂の進
行、及び雌においては性腺の維持に必須であることを示している。

【００７９】マウスMsh5ゲノムクローンを分離し、これを用いて、改変Msh5座を持つ二つの
ES細胞株（図1B参照）からマウスを生成するために用いた遺伝子ターゲティング
ベクタ（図1A参照）を作成した。そのマウスは、改変遺伝子座をメンデルの法則
に従って伝達しており、ホモ接合Msh5^-/-マウスは生存可能であった。Msh5転写
産物またはたんぱく質は、生後24日のマウスの精巣には検出されなかった（図1D
参照）。これらのデータは、改変Msh5座は機能性MSH5たんぱく質をコードしてい
ないということを示唆する。マウス精巣では、第一減数分裂は、生後11日目に始
まり（図２A参照）、第一分裂前期は13日目に開始する。Msh5はヒト及びマウス
の性腺に高度に発現し、マウスの場合、減数分裂開始と同時である。Msh5^-/-雄
は正常の性行動がみられたが、精巣上体精子の完全な欠損のために不妊であった
。Msh5^-/-成体雄の精細管を検査したところ、精子形成が重篤に破壊されており
（図2BC参照）、精巣サイズの70％縮小を引き起こしていることが明らかになっ
た。突然変異雄には、A及びB型精原細胞と同様に間質ライジッヒ細胞及び精細管
セルトリ細胞が存在しているが、正常な太糸期精母細胞はみられない（図2D-G参
照）。生後17日目、Msh5^-/-雄の精細管上皮はかなり高密度に充填しているが、
生殖細胞核抗原１(GCNA1, Enders, G.C. & May, J.J. (1994) Developmental Bi
ology. 163, 331-340に記述、その内容はそれに言及することによりここに編入
する)局在化の低下、及びアポトーシスの増加（図3A、B、C、D参照)の両方に見
られるように、生殖細胞喪失の初期兆候が明白である。生後23日目までには、野
生型マウスの精細管は円形精子細胞を有するようになる（図3E、G参照）。反対
に、Msh5^-/-精細管の高レベルのアポトーシスが生殖細胞を消耗させ（図3F、H）
、成体になる頃には、精子形成細胞群のほぼ全体が消失する(図3I-L参照)。減数
分裂の進行を分析するために、減数分裂染色体スプレッドを光学顕微鏡レベル、
及び電子顕微鏡レベルで検査した。生後23日の野生型スプレッドの場合、銀染色
により、細糸期、接合糸期、太糸期、及び複糸期を含め、ある範囲の染色体構造
が明らかになった（図4A参照）。しかし、野生型細胞では92％を越える（255/27
7）ものに、接合糸期以降に染色体構造がみられるのに対し、４匹のMsh5^-/-雄で
は、588/602(97.7%)の精細胞に、接合した染色体がみられない（図4B参照）こと
が明らかとなった。Msh5^-/-雄から得たすべての精母細胞は一価染色体を有し、
減数分裂の接合糸期／太糸期に相当する濃度であった。残りの14個の細胞では、
予測される280対の染色体のうち、部分的に対合した染色体が29対しか観察され
なかった（図4C）。このうち少なくとも半分（15/29）が異なる長さの染色体を
含んでおり、この対合は非相同であることを示唆している。

【００８０】合糸期複合体（SC）のリコンビネーション及び形成に必要であるとして知られ
ているSYCP1、SYCP3、及びRAD51たんぱく質の染色体会合(Moens, P.B. et al. (
1998) Current Topics in Molecular Biology 37, 241-263; Plug, A.W.,et al.
(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5920-5924) も検査した。複合抗血清
を使用した、減数分裂染色体上でのSYCP1及びSYCP3の免疫蛍光ローカリゼーショ
ンにより、野生型雄由来の精母細胞中ではSCが正常に獲得されていることが実証
され、顕著に凝縮した二価体20対を有する太糸期精母細胞が特定できた。Msh5^-/ ^- 精母細胞では、すべての染色体は明らかにSYCP1/SYCP3シグナルに会合しており
、軸方向要素形成は達成したが凝縮二価体はみられなかったということを示唆し
た。Msh5^-/-精母細胞では、RAD51は一価染色体に沿って散在するフォーカスに見
いだされ、これらのフォーカスの数及び輝度は、野生型雄由来の細糸期または接
合糸期染色体上よりも、ほとんどのMsh5^-/-雄細胞中により多く出現し、野生型
精母細胞ではみられた減少がみられないことから、太糸期への進行が無いことを
示唆している。非接合染色体突然変異マウスにRAD51が存在するということは、
減数分裂が開始して、MSH5不在でも二重鎖の開裂が進行するかもしれないという
ことを示唆している。

【００８１】雌減数分裂におけるMSH5の役割を検査するために、Msh5^-/-成体の卵巣機能を
評価した。この変異体は野生型雄と交尾せず、正常な発情周期もみられなかった
。Msh5^-/-雌は正常な構造の卵管及び子宮構造を持っているが、目で識別できる
子宮は持っていない（図5D、E参照）。その代わり、Msh5雌の卵嚢は空であるか
、または1-4個の嚢胞を持つ嚢状構造を有することがより多い（図5E参照）。生
後３日目にMsh5^-/-雌の卵巣は少なめの卵母細胞を有した（図5A、B参照）。生後
25日目までには、Msh5^-/-雌の卵巣は、発生の後腔段階にあるとみられる１−３
個の卵胞の小群に縮小しており、野生型卵巣では原始性卵胞が豊富にあるのに対
し、卵母細胞も時折ある程度であった（図5C参照）。生後25日のMsh5^-/-雌にお
ける卵母細胞の存在は、Wassarman, P.M. (1998) Annual Review of Biochemist
ry. 57, 415-442に記述され、その内容はそれに言及することによりここに編入
される、卵母細胞特異的たんぱく質、ゾナペルシダ3（ZP3）の転写産物をRT-PCR
で検出して確認された。しかし、成体におけるZP3転写産物は野生型卵巣でしか
検出することができなかった（図5F参照）。したがって、Msh5^-/-雌の卵巣は出
生時には正常サイズであるが、進行的に変性して発育不全となり、生後３日目前
から成体に至るまで卵母細胞数の減少を伴う。

【００８２】野生型卵巣のMsh5発現をRT-PCRで検査した。Msh5発現はe16、e18及び生後１日
目の卵巣で検出されたのは、雌の減数分裂開始時と一致し、MSH5が卵巣減数分裂
に直接的な役割を果たしている可能性と矛盾しなかった。胚発生後期では、ホモ
接合変異雌の卵巣は正常な数の卵母細胞を有している（図6A、C参照）。しかし
、HアンドE断片を検査すると、野生型とMsh5^-/-の卵母細胞には染色体構造にわ
ずかな相違があることが明らかとなり、野生型卵母細胞が容易に確認可能な染色
体を有している（図6B参照）のに対し、ホモ接合変異卵母細胞では核内容物の凝
集が特徴となっていた（図6D参照）。生後３日目には、Msh5^-/-雌の卵巣の卵母
細胞数は野生型卵巣にある数と比較して激減しており（図6E、G参照）、太糸期
卵母細胞に特徴的なGCNA1染色がみられなかった（図6F、H参照）。生後６日目に
は、野生型雌の卵巣全体には、容易に確認可能な卵母細胞を含む大型の原始性卵
胞が分布していたが（図6I、J参照）、Msh5^-/-雌の卵巣では、卵母細胞プールは
ひどく消失していた。

【００８３】これらの結果は、MSH5は染色体対合及び／または接合に必要であるということ
を示すものである。MSH相同体と相互作用する、その他のマウスMutHLS遺伝子、P
ms2およびMlh1で変異を起こさせても、減数分裂異常のために生殖不能となる。
しかし、これらのマウスでは、減数分裂が異常になる段階が異なる。Pms2^-/-マ
ウスでは、染色体対合は破壊されるが、異常ではあるが精子細胞及び精子が観察
された。Mlh1^-/-マウスでは、正常の対合が検出されたが、太糸期後減数分裂段
階はほとんどみられなかった。これらの結果から、これらのたんぱく質は異なる
減数分裂段階において別個な役割を担っていることが示唆される。

【００８４】成体Msh5^-/-雌では、卵巣構造の完全な喪失のために、表現型は雄よりもさら
に劇的である。Msh5^-/-雄と同様に、生殖細胞は生殖隆起に集まるが、卵母細胞
は接合糸期より後には進行しない。e18の卵母細胞の進行性の喪失は、Msh5^-/-精
母細胞にみられるように、減数分裂不全、及び、アポトーシスを生じるチェック
ポイントの活性化の結果、生じるようである。この結果、生後６日目には卵母細
胞がほぼ完全に消滅し、卵巣が変性を始めて、成体では卵巣が完全に消滅するか
、またはいくつかの大きな卵胞から成るようになる。卵母細胞の変性が原因で卵
包形成が開始しなくなることから、このプロセスのために、また卵巣の形態を維
持するために、卵母細胞と周囲の間質との間で相互作用があるに違いないと示唆
される。Dmc1^-/-マウスにみられる雌の表現型は、Msh5^-/-のものとは異なり、同
様に初期新生仔期に対合／接合不全及び卵母細胞の喪失がみられるが、成体にお
いて少なくとも、発育不全ではあるが卵巣を維持している。これらの相違は、MS
H5はDMC1よりもわずかに早い時期に必要となるか、またはDMC1機能に部分的な重
複があるのか、いずれかを示唆している。

【００８５】雌Msh5-/-マウスの卵巣の表現型とターナー症候群患者の表現型には類似点が
ある。どちらの場合も、子宮内にいる間及び新生仔期に卵母細胞を急速に喪失し
、続いて卵巣が変性する。X染色体レベル（ターナー症候群患者の場合のように
）か、または染色体群全体であるか（Msh5^-/-卵母細胞の場合のように）、いず
れにせよ相同染色体対合不全がアポトーシスチェックポイントを誘発して、最終
的に完全な卵巣変性を引き起こしている可能性がある。

【００８６】等価物当業者であれば、ごく通常の実験を用いるのみで、ここに説明された特定の実
施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価
物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の請求の範囲の包含するところで
ある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Msh5ヌルマウス作製法の概略図である。図1Aは遺伝子ターゲティン
グ戦略を表している。図1BはNsiIで消化された尾DNAのサザンブロットを表して
いる。ヘテロ接合体交配により生じた606匹の仔をDNA分析した結果、Msh5^+/+が1
84匹、Msh5^+/-が275匹、Msh5^-/-が147匹生じており、メンデルの突然変異対立形
質の伝達法則が確認された。図1Cは、Msh5^+/+及びMsh5^-/-マウス精巣から得られ
たRNAの、異なるプローブを用いたノーザンブロットを表している。図1Dは、雄
の精巣から得られたたんぱく質の、抗MSH5抗体を用いたウェスタンブロットを表
している。

【図２】 Msh5^+/-雄における精子形成の破壊を表している。図2Aは、生後8日
から29日までの野生型雄、及び成体野生型及びMsh5^+/-雄の精巣における、Msh5
（上段）およびアクチン（下段）のmRNA発現を表している。図2B-Eは野生型雄（
B,D）及びMsh5^+/-雄（C,E）から得た成体精巣のHアンドE染色切片を表しており
、Msh5欠乏雄ではチゴネマ期を越えると精母細胞が消失していることを示してい
る。Leはライジッヒ細胞、Sはセルトリ細胞、AはA型精原細胞、BはB型精原細胞
、PLは前レプトテン期精母細胞、Lはレプトテン期精母細胞、Zは接合糸期精母細
胞、Pは太糸期精母細胞、RSは円形精子細胞、ESは細長い精子細胞、Spは精子で
ある。図2F、Gは、生後29日の雄から得た野生型（F）及びMsh5^-/-（G）精巣断片
上の生殖細胞の免疫ローカリゼーションを、抗GCNA1抗体（薄青色の対比染色に
対して赤色の免疫反応たんぱく質）を用いて表しており、野生型精巣では精母細
胞、精子細胞、及び精子が豊富にみられ、MSH5欠乏精巣ではGCNA1陽性細胞は少
ししかみられない（B、Cではスケールバー＝100mm、D-Gではスケールバー＝25mm
）。

【図３】発育中のMsh5^+/-雄の生殖細胞の進行的な消失を表している。図3A
、B、E、F、I、Jは、野生型（A、E、I）及びMsh5^+/-（B、F、J）雄の精巣の抗GC
NA1抗体を用いた生殖細胞の免疫ローカリゼーションを表し、Msh5欠乏マウスで
は生後１７日から生殖細胞が急速に消失しているのに対し、Msh5^+/+雄の精細管
内にある精子形成細胞の密度及び種類は増加していることを示している。図3C、
D、G、H、K、Lは、野生型（C、G、K）及びMsh5^+/-（D、H、L）雄から得た精巣の
TUNEL染色を表しており、生後１７日からの連続的なアポトーシスを示している
のに対し、野生型から得た精細管内では同じ時間枠内でみられるアポトーシスの
レベルは非常に低いことを示している（スケールバー＝100mm）。

【図４】 Msh5精母細胞の接合前の減数分裂の破壊を表している。図4A-Cは、
野生型（A）及びMsh5^+/-（B、C）の精巣から得た精母細胞を銀染色したものを表
しており、MSH5が不在の場合、完全な対形成不全（B）またはいくつかの部分的
な対形成（C）がみられる。パネル（C）の矢印は、部分的な対形成がみられる染
色体を示している。これらの染色体の多くは、不均等に対形成しているように見
えることに注目されたい。

【図５】 Msh5^+/- 雌の卵母細胞の喪失とそれに続く卵巣の変性を表している
。図5A、Bは、生後３日の野生型（A)及びMsh5^+/-（B）雌から得た卵巣を表し、G
CNA1染色された卵細胞を示している。図5Cは、生後２５日のMsh5^+/-雌から得た
卵巣全体を表し（HアンドE染色）、そこには３個の卵胞と変性した組織しかない
。図5D、Eは、成体野生型（D）及びMsh5^+/-雌（E）から得た卵巣をHアンドE染色
したものを表しており、Msh5が不在の場合に卵母細胞及び卵巣の構造を完全に喪
失していることを示している。Bは卵嚢、Ovは卵管を示す。すべての場合におい
て、スケールバー＝200mmである。図5Fは、生後25日及び成体の野生型及びMsh5⁺ ^/- 卵巣内でのZP3及びアクチンの発現を表している。

【図６】 Msh5^+/-雌における卵子形成の破壊が卵胞形成不全を引き起こして
いることを示す。図6A-Dは、e18野生型（A、B）及びMsh5^+/-（C、D）胚から得た
卵巣を表し、抗GCNA1（A、C）またはHアンドE（C、D）染色した卵原細胞の減数
分裂染色体の詳細なローカリゼーションを示している（C、D）。図6E-Hは、生後
3日の野生型（E、F）及びMsh5^+/-（G、H）雌から得た卵巣中の卵母細胞のGCNA1
ローカリゼーションを表している。矢印の先端は、太糸期卵母細胞（前太糸期卵
母細胞がむらなく赤色に染色されるのに比べ、核が点状に赤色染色される）を示
し、矢印は初期の始原性卵胞の出現を示している。図6I、Jは、生後６日の野生
型から得た卵巣中の卵母細胞の、GCNA1ローカリゼーションを表している（減数
分裂停止にある卵母細胞まで過染色されている）。矢印は始原性卵胞を示し、o
は卵母細胞を示す。A、C、E、G及びIのスケールバー＝100mm、B、D、F、H及びJ
のスケールバー＝25mmである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者エデルマンウィンフライドアメリカ合衆国ニューヨーク州 10471 ブロンクスアーリントンアベニュー 5800 アパートメント 10エイチ (72)発明者コロドナーリチャードディーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92130 サンディエゴキッビングスロード 13468 (72)発明者ポラードジェフェリーダブリューアメリカ合衆国ニューヨーク州 10025 ニューヨークダブリューナインティーシックススストリート 275 ダブリュー (72)発明者クチャーラパティラジュエスアメリカ合衆国コネチカット州 06820 ダリエンファイブグラシーレーンＦターム(参考） 2G045 AA25 BA14 CA25 CA26 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB03 FB07 JA04 JA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 MSH5遺伝子をコードする遺伝子が誤発現される、非ヒト動物。
【請求項２】前記動物がトランスジェニック動物である、請求項１に記載の
動物。
【請求項３】前記トランスジェニック動物がマウスである、請求項２に記載
の動物。
【請求項４】 MSH5たんぱく質のすべてまたは一部をコードしているDNAの除
去により前記MSH5遺伝子が破壊されている、請求項１に記載の動物。
【請求項５】前記動物が、前記破壊された遺伝子にとってホモ接合型である
、請求項４に記載の動物。
【請求項６】前記動物が、前記破壊された遺伝子にとってヘテロ接合型であ
る、請求項４に記載の動物。
【請求項７】前記動物が、前記MSH5遺伝子がトランスジェニック破壊された
トランスジェニックマウスである、請求項１に記載の動物。
【請求項８】前記破壊が、挿入または欠失である、請求項７に記載の動物。
【請求項９】生殖能治療法の評価方法であって、MSH5誤発現動物またはその
由来細胞へ前記治療法を施行するステップと、生殖能指標に対する前記治療法の
作用を判定し、それにより前記生殖能治療法を評価するステップと、を含む方法
。
【請求項１０】前記治療法がin vivoで評価される、請求項９に記載の方法
。
【請求項１１】前記治療法がin vitroで評価される、請求項９に記載の方法
。
【請求項１２】前記MSH5誤発現動物がトランスジェニックマウスである、請
求項９に記載の方法。
【請求項１３】 MSH5活性を変調する化合物を同定する方法であって、 (a) MSH5を検査用化合物に接触させるステップと、 (b) MSH5活性に対する検査用化合物の作用を判定し、それによりMSH5活性を
変調する化合物を同定するステップとを含む方法。
【請求項１４】前記MSH5活性が阻害される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】 MSH5、またはMSH5を発現している細胞を、前記MSH5活性を変
調するのに十分な濃度の、MSH5と結合する化合物に接触させるステップを含む、
前記MSH5活性の変調方法。
【請求項１６】前記MSH5活性が阻害される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記方法が避妊に用いられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】生殖能疾患または障害を有する、または発症する危険性のあ
る被験者を識別する方法であって、 (a) 前記被験者からのサンプルを採取するステップと、 (b) MSH5と選択的にハイブリッド形成する核酸プローブまたはプライマと前
記サンプルとを接触させるステップと、 (c) 異常MSH5発現または活性が前記サンプルに存在するかどうかを判定し、
それにより、生殖能疾患または障害を有する、または発症の危険性のある被験者
を識別するステップとを含む、方法。
【請求項１９】 MSH5誤発現動物から分離した細胞、または精製細胞製剤。
【請求項２０】前記細胞がトランスジェニック細胞である、請求項１９に記
載の細胞。
【請求項２１】前記トランスジェニック細胞がマウス細胞である、請求項２
０に記載の細胞。