JP2002518056A - アッセイにおけるＰｅｇ３遺伝子の使用、並びに肥満、体温調節および行動障害に関連する産物 - Google Patents

アッセイにおけるＰｅｇ３遺伝子の使用、並びに肥満、体温調節および行動障害に関連する産物

Info

Publication number
JP2002518056A
JP2002518056A JP2000556047A JP2000556047A JP2002518056A JP 2002518056 A JP2002518056 A JP 2002518056A JP 2000556047 A JP2000556047 A JP 2000556047A JP 2000556047 A JP2000556047 A JP 2000556047A JP 2002518056 A JP2002518056 A JP 2002518056A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peg3
gene
protein
mice
obesity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000556047A
Other languages
English (en)
Inventor
スラニ，アジム
Original Assignee
ケンブリッジ ユニヴァーシティ テクニカル サービスイズ リミティッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ケンブリッジ ユニヴァーシティ テクニカル サービスイズ リミティッド filed Critical ケンブリッジ ユニヴァーシティ テクニカル サービスイズ リミティッド
Publication of JP2002518056A publication Critical patent/JP2002518056A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Peg3遺伝子に欠陥のある動物が、肥満、体温調節の異常、および母性行動障害等の行動異常を含む複数の表現型形質を負うとの所見に関する。本発明は、Peg3遺伝子の不活性コピーを含んでなるトランスジェニック非ヒト動物を提供し、上述したような症状を治療する新規な療法のアッセイにおいてこのような動物をモデル系として使用するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、Peg3遺伝子に関し、また、この遺伝子が、体温調節、肥満および母
性行動、嗅覚作用、雄性行動(male behaviour)、アポトーシス、細胞の生存およ
び変性、並びに感染性疾患に関与するとの所見に関するものである。
【０００２】 Peg3遺伝子は、マウスにおけるインプリンティングを受ける遺伝子(imprinted
gene)の発現に関してのスクリーニングに際して同定されたものである。インプ
リンティングを受ける遺伝子は、その発現が親の起源によって厳密に決められて
いるため、特殊な発現パターンを示す。Peg3はインプリンティングを示し、子孫
においては遺伝子の父系コピーが発現される一方、母系コピーは休止している。
この遺伝子は、11個の広く間隔の開いた「C2H2」モチーフと２種類のアミノ酸反
復配列を有する特殊なジンクフィンガータンパク質をコードする約９kbのサイズ
のmRNAを発現する。タンパク質の推定サイズは1,572アミノ酸である。Kuroiwaら
(1996), Nature Genetics 12:186-189を参照のこと。Peg3の配列は、受託番号AF
038939でGenBankに見出すことができる(NCBI-REF 363877)。
【０００３】 Peg3は、体節、鰓弓および他の中胚葉性組織の発生初期に発現される。成体で
は、視床下部内側視索前野、扁桃並びに嗅球を含む脳で優勢に発現される。また
、わずかではあるが、副腎等の他の成体組織でも発現される。この遺伝子の機能
は未知であるが、Kuroiwaら(同著)には、この遺伝子がマウスの７番染色体の領
域にマッピングすることが述べられており、この領域は、筋緊張性ジストロフィ
ーと腫瘍抑制に関与する遺伝子のヒト染色体上の位置とシンテニーである。
【０００４】発明の開示 本発明者らは、Peg3遺伝子を分断させたトランスジェニックマウスモデルを開
発した。本発明者らは、複数の驚くべき表現型の変化、特に、肥満、深部体温の
低下、母性行動障害、雄性行動異常、出生時の体長低下、視床下部における特定
のニューロンの減少を観察している。さらに肥満は、対照動物よりも摂飼量が少
ないにも係わらず、このマウスに現れることが判明した。これらの所見からは、
体重調節および体温調節におけるPeg3の役割が示唆され、肥満、代謝平衡異常、
成長調節および行動を治療するための療法を研究することのできるモデル系が提
供される。
【０００５】 従って、本発明は、Peg3遺伝子の不活性なコピーを含んでなるトランスジェニ
ック非ヒト動物、特に齧歯動物を提供する。 本発明はさらに、体重の推定モジュレーターを試験する方法を提供する。この
方法は、前記推定モジュレーターを本発明の動物へ投与し、推定モジュレーター
の身体代謝に及ぼす作用を判定することを含んでなるものである。
【０００６】 さらなる態様では、本発明はまた、行動の推定モジュレーターを試験する方法
を提供する。この方法は、前記推定モジュレーターを本発明の動物へ投与し、推
定モジュレーターの行動に及ぼす作用を判定することを含んでなるものである。
【０００７】 Peg3遺伝子の機能の発見によって、代謝調節に関与する他の遺伝子の検索が可
能になるため、本発明はまた、体重または体温の調節に関与する遺伝子をスクリ
ーニングする方法を提供する。この方法は、Peg3タンパク質を得て、そのタンパ
ク質を他の細胞性タンパク質と接触させ、どの細胞性タンパク質にPeg3タンパク
質が結合し得るかを判定することを含んでなるものである。このような遺伝子は
単離可能であり、これにより本発明のさらなる態様が形成される。
【０００８】 マウスにおけるPeg3の役割から、本発明のさらなる態様を形成する方法によっ
て、肥満または体温調節に関与する表現型障害のあるヒトのPEG3遺伝子型を決定
することが可能である。この方法は、 肥満患者群と肥満ではない患者からなる対照群より核酸を得、 前記核酸を分析し、そして 肥満表現型に関連する前記核酸の１つ以上の特徴を判定する ことを含んでなるものである。
【０００９】 タンパク質レベルで類似の方法を行うこともでき、抗体を用いて、結合の相対
強度またはエピトープの有無のいずれかで群ごとに異なるPEG3のエピトープを判
定する。 このようなスクリーニングで判定されるタンパク質エピトープまたは遺伝子型
の違いを利用することにより、肥満または体温調節障害に対する個体の罹患性を
試験する方法を提供することが可能である。この方法は、前記個体の核酸を、PE
G3遺伝子関連肥満または体温調節障害の１つ以上の特徴について分析することを
含んでなるものである。
【００１０】 本明細書中、用語「含んでなる(compriseおよびcomprising)」は、「含む(inc
ludeおよびincluding)」の意味に解するものとする。 発明の詳細な説明 PEG3遺伝子 本発明者らがマウスにおいて分断したPeg3は、その配列が受託番号AF038939で
GenBankに登録されており(その開示内容は、参照により本明細書に含まれるもの
とする)、マウスの７番染色体の近位(proximal)領域に位置する遺伝子である。
しかしながら、本明細書中でいう「Peg3」には、マウスにおけるこの遺伝子の野
生型対立遺伝子形態、並びにヒト等の哺乳動物を含む他の動物に見られる相同体
が含まれる。「PEG3」という場合には、具体的にはこの遺伝子のヒト相同体を指
し、本明細書中では、ヒトまたはヒト由来サンプルに対して実施する診断方法等
に関して使用する。ヒトPEG3遺伝子は単離されており、その部分配列はNCBIデー
タベースで入手可能である(AB006625、KIAA0287遺伝子のヒトmRNA、部分cds)。P
EG3の第１のエキソンを含む5’領域(ヌクレオチド1-174)もGenBankに登録されて
いる(AC006115)。この領域は、マウスPeg3配列であるGenBank受託番号AF105262
に対して高い相同性を示し、AF105266と共に、さらなるPeg3配列に該当する。デ
ータベース配列に基づくプライマーをcDNAライブラリーに対するプローブとして
使用するか、またはPCRによって遺伝子のmRNA源を伸長させて、完全な配列を決
定することができる。EST W49208とEST W90868(Database Est)からは別のマウス
Peg3供給源が得られ、HS201228とHS403225(Database Est)からは別のヒトPEG3配
列の供給源が得られる。
【００１１】 野生型配列は、体重調節および体温調節に関する限り、正常な表現型を示すマ
ウスまたは他の動物に見られる任意の配列と考えられる。 相同配列は、当該技術分野において従来慣用の方法論によって決定することが
可能である。Peg3遺伝子および／またはその調節エレメントを全てまたは一部コ
ードする核酸配列は、当業者であれば、本明細書中に含まれる情報や参考文献お
よび当該技術分野で公知の技術(例えば、Sambrook, FritschおよびManiatis, “
Molecular Cloning, A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, 1989,並びにAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology, John W
iley and Sons, 1992を参照)を利用して容易に調製することができる。このよう
な技術としては、(i)このような核酸(例えば、ゲノム供給源由来)のサンプルを
増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用、(ii)化学合成、または(iii)
cDNA配列の調製が挙げられる。
【００１２】 例えばPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)クローニング技術の場合には、クローニン
グするのに望ましいmRNAまたはこのmRNAをコードするゲノムDNAの領域に対して
マウスPeg3配列に基づくプライマー(例えば、約15-50ヌクレオチド)を使用する
。そのプライマーを、mRNAもしくはDNA(例えば、脳細胞、特に胎児脳細胞より取
得)または他の胚組織もしくは胎児組織と接触させ、所望の領域が増幅するよう
な条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、例えば、反応混合物をアガロースゲル
で精製して増幅断片を単離する。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含む
ように設計することが可能であり、これにより、増幅DNAを適切なクローニング
ベクターへクローニングすることができる。
【００１３】 このような技術を利用して、両生類または哺乳動物等の他の動物由来のPeg3遺
伝子の全てまたは一部を取得することが可能である。同様に、肝細胞等の一次細
胞、組織培養細胞、またはファージ、コスミド、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細
菌人工染色体)もしくはPAC(P1/P2ファージ人工染色体)ライブラリー等のライブ
ラリーに由来するゲノムDNAから開始して、Peg3遺伝子とそのイントロンおよび
プロモーター領域を含むゲノムクローンを取得することも可能である。
【００１４】 あるいは、cDNAライブラリーもしくはゲノムDNAライブラリーを作製または取
得し、中〜高ストリンジェンシーの条件下(例えば、0.03Ｍ塩化ナトリウムおよ
び0.03Ｍクエン酸ナトリウム、約50℃〜約60℃)で、このようなライブラリーをP
eg3マウス遺伝子の全部もしくは一部を含んでなるプローブで探索することによ
り、相同体を取得することも可能である。
【００１５】 一般に、相同体は、mRNAのオープンリーディングフレーム内においてマウスPe
g3に対して少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも70％、さらには少なく
とも80％(例えば、少なくとも90％、95％、98％もしくは99％)相同である。哺乳
動物の相同体が特に好適である。 DNA配列およびアミノ酸配列の相同性(％)(同一性ともいう)は、市販のアルゴ
リズムを使用して計算することができる。以下のプログラム(National Center f
or Biotechnology Informationより提供)を使用して相同性を決定してもよい：B
LAST、ギャップ挿入BLAST(gapped BLAST)、およびPSI-BLAST(いずれもデフォル
トパラメータで使用可能)。アルゴリズムGAP(Genetics Computer Group, Madiso
n, WI)。GAPでは、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズムを使用して、一致の数
が最大となり、かつギャップの数が最小となる２つの完全配列間のアライメント
をとる。通常、デフォルトパラメータを使用するが、ギャップ開始ペナルティ(g
ap creation penalty)を12とし、ギャップ延長ペナルティを４とする。本明細書
中では、用語「相同性」および「相同」のいずれを使用しても、比較した配列間
の進化上必要な関係を意味するわけではなく、例えば、２つのヌクレオチド配列
が適当な条件下で組換えを起こす程度に十分に類似していることを単に必要とす
る「相同組換え」等の用語を通常使用するのと同程度のことである。
【００１６】「不活性」 本発明では、Peg3遺伝子の不活性なコピーをいう場合には、肥満表現型もしく
は低体温表現型または行動障害を生じる前記遺伝子のあらゆる非野生型変異体が
含まれることを理解されたい。従って、この遺伝子を完全に欠失させてもよいし
、または動物から末端切断タンパク質が産生されるように、例えば終結コドンと
任意に上流にあるコード配列をPeg3遺伝子のオープンリーディングフレームへ導
入することによって突然変異させてもよい。また、オープンリーディングフレー
ムは無傷であってもよく、その場合にはプロモーター領域の突然変異によって該
遺伝子の不活性コピーを得る。
【００１７】 通常、遺伝子の不活化は、標的化相同組換え（targeted homologous recombin
ation）によって行うことができる。これを行うための技術は当該技術分野で自
体公知である。遺伝子の不活化は様々な方法で行うことが可能である。典型的な
方法は、標的化相同組換えを使用して胚幹(ES)細胞の野生型の遺伝子を置換、改
変または欠失させるものである。改変Peg3遺伝子を含んでなるターゲティングベ
クターをエレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェク
ションによってES細胞へ導入する。一部のES細胞中で、ターゲティングベクター
は同起源の染色体DNA配列と対を形成し、ベクターに保有されている所望の突然
変異を相同組換えによってゲノムへ導入する。スクリーニング手法または濃縮手
法を使用してトランスフェクトされた細胞を同定し、トランスフェクトされた細
胞をクローニングして純性集団として維持する。次いで、改変ES細胞を着床前の
マウス胚の未分化胚芽細胞へ注入するか、あるいは２つの未分化胚芽細胞間にES
細胞を配置して集合キメラを調製し、ES細胞と融合させて単一キメラ未分化胚芽
細胞を形成させる。このキメラ未分化胚芽細胞を代理母の子宮へ外科的に移し、
そこで出産まで発育させる。得られた動物は、正常細胞とドナー細胞とのキメラ
である。典型的には、ドナー細胞は、キメラ子マウスが容易に同定されるよう、
皮膚の色といった明らかに識別可能な表現型を有する動物由来のものである。次
いでこの子マウスを繁殖させ、その子孫を異種交配すると、標的突然変異用のヘ
テロ接合体およびホモ接合体が得られる。トランスジェニック動物の作製は、Ca
pecchi, M. R., 1989, Science 244:1288-1292; ValanciusおよびSmithies, 199
1, Mol. Cell. Biol. 11:1402-1408;並びにHastyら, 1991, Nature 350:243-246
に詳細に記載されている(これらの開示内容は参照により本明細書に含まれるも
のとする)。
【００１８】 遺伝子ターゲティングにおける相同組換えを利用して、野生型Peg3遺伝子を特
定の変異体形態(例えば、末端切断体または１つ以上の置換を含む形態)に置き換
えることができる。 不活性遺伝子は、その発現を永久にまたは一時的に選択的に阻止し得るもので
あってもよい。永続的な阻止は、シグナルに応答して遺伝子を欠失させる手段を
供給することにより達成可能である。このような手段の例は、ファージlox部位
をトランスジーンの両末端または少なくともその十分な部分の間(例えば、両側
に位置する２つのエキソンまたは１つ以上のイントロン中)に供給するcre-lox系
である。creリコンビナーゼの発現によって２つのlox部位の間の核酸が切出され
て環化する。発生過程でまたは組織限定的にcreリコンビナーゼを発現するトラ
ンスジェニック動物の各種系統、特にマウスは、当該技術分野で現在入手可能で
ある。例えば、Tsien, Cell, Vol.87 (7):1317-1326(1996)およびBetz, Current
Biology, Vol.6 (10):1307-1316(1996)を参照のこと。これらの動物を本発明の
loxトランスジェニック動物と交配させてPeg3遺伝子の機能を検討する。別の制
御機構は、テトラサイクリン耐性遺伝子由来のプロモーター(tet)をPeg3遺伝子
座の制御領域へ供給することである。これにより、テトラサイクリンを細胞へ添
加すると、プロモーターへの結合が起こり、Peg3遺伝子の発現が阻止される。あ
るいは、GAL4、VP16および他のトランスアクチベーターを使用して、Peg3遺伝子
を含むトランスジーンの発現といったPeg3発現をモジュレートすることもできる
。さらに、Peg3を異所性部位、即ち、遺伝子が時間的または場所的に通常は発現
しない部位で発現させることも可能である。
【００１９】 トランスジェニックターゲティング技術を利用して、Peg3遺伝子を欠失させる
こともできる。標的遺伝子の欠失の方法は、Brennerら, WO94/21787(Cell Genes
ys)に記載されている(この開示内容は、参照により本明細書に含まれるものとす
る)。 別の方法は、スプライス受容部位に対してエキソンmRNAをスプライシングして
非Peg3遺伝子配列にすることで末端切断野生型遺伝子の発現をもたらすベクター
を、Peg3遺伝子へ挿入するものである。
【００２０】 マーカー遺伝子と終結コドンを含んでなるベクターによって上記遺伝子が分断
された適切なトランスジェニックマウスの作製については、添付の実施例を参照
されたい。本発明を説明するのに使用するPeg3ターゲティングベクターは、 (1)βgeo選択カセットをイントロン内に挿入するための、5’末端側スプライ
ス受容部位、 (2)標的遺伝子の成熟前翻訳終結を確実にする３つのリーディングフレーム中
の翻訳終結コドン、 (3)内在性遺伝子での翻訳開始とは独立に、融合転写産物中のβgeoの5’AUGに
て選択翻訳を再開するための、βgeoの上流に位置する内部リボソーム結合部位(
internal ribosome entry site; IRES)(MountfordおよびSmith, Trends in Gene
tics II, 179-184, 1995)、 (4)細菌遺伝子lacZとneoをフレーム内で融合させたものであって、発生の際に
標的クローンの選択と標的遺伝子の発現パターンの分析の双方を可能にする二機
能性タンパク質をコードするプロモーターを含まないβgeo遺伝子、ならびに (5)融合遺伝子の転写を終結させるための、カセットの末端付近に位置するSV4
0ポリアデニル化(polyademethylation)シグナル、 を含むものである。
【００２１】 当業者であれば、同様の構築物を作製して、Peg3遺伝子座を不活化するベクタ
ーを得ることは可能である。ターゲティング構築物の１つでは、βgeoカセット
をエキソン３のPeg3翻訳開始部位の下流に挿入する。これにより、子孫で検出可
能な末端切断タンパク質がもたらされる。同様の方法を他のマウスまたはヒト以
外の哺乳動物に使用してもよく、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール・アセ
チルトランスフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質といった他のマーカータンパ
ク質の使用が挙げられる。
【００２２】Peg3遺伝子発現トランスジェニック動物 本発明のさらに別の実施形態においては、野生型よりも高レベルにPeg3遺伝子
を発現する非ヒト動物を提供する。好ましくは、このことは、遺伝子を発現する
細胞(例えば視床下部)を比較した時に、Peg3遺伝子が少なくとも同じ種の野生型
動物で見られるものの１２０％から２００％のレベルで発現されることを意味す
る。また、Peg3遺伝子を、この遺伝子が時間的または空間的に通常は発現されな
いような異所性部位に発現させることができる。ノーザンブロッティングおよび
転写レベルの定量により適宜比較することができる。Ｐｅｇ３の別のコピーが一
つかそれ以上、例えば二つか三つ存在することによって、または例えば強力なプ
ロモーターもしくはエンハンサーを野生型遺伝子に機能し得るように連結するこ
とによってPeg3遺伝子を改変して過剰発現させることで、高レベルに発現させる
ことができる。「ノックアウト」動物の供給に関して本明細書に記載した技術を
用いて、遺伝子の追加コピーを有する動物を供給することができる。
【００２３】 別の態様においては、Peg3遺伝子を異所性部位に発現させる動物が提供される
。このことは、発達中、野生型動物では生じないような、場所または時間に、該
遺伝子が発現されることを意味する。例えば、該遺伝子は、発達上調節されるプ
ロモーター、例えばＷｎｔ−１およびその他（Echeland, Y. ら、Development 1
20, 2213-2224, 1998; Rinkenberger, J.C. ら、Dev. Genet. 21, 6-10, 1997),
または組織特異的なプロモーター、例えばHoxB(Machonochie, M.K. ら、Genes
& Dev 11, 1885-1895, 1997）に連結させてよい。
【００２４】 本発明のこの態様の動物は、肥満、体温調節、または行動障害のモジュレータ
ーのためのアッセイの開発用モデルとして用いてもよい。これらの動物は、不活
性のPeg3遺伝子を含む本発明のアッセイ用に別の対照群として利用してよい。
【００２５】非ヒト動物 本発明の非ヒトの動物は、不活性Peg3遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ
接合性であってよい。ヘテロ接合性の動物を使う場合は、不活性（または発現の
ために改変されている）の遺伝子がその動物において父系遺伝されていると好ま
しい。これは、母系Peg3遺伝子は抑制されており沈黙遺伝子であることによる。
しかし、この改変された遺伝子が母系的に遺伝されるヘテロ接合体も本発明の一
部を成す。哺乳動物には、非ヒトの霊長類、げっ歯動物、ウサギ、ヒツジ、ウシ
、ヤギ、ブタが含まれる。げっ歯動物には、マウス、ラット、およびモルモット
が含まれる。両生動物には、カエルが含まれる。魚としては例えばゼブラフィッ
シュ（Zebra fish）を利用してもよい。
【００２６】 本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物は、肥満、体温調節、または行動
障害の研究、およびPeg3遺伝子の欠損により引き起こされるこうした状態の症状
または悪化を軽減するために設計される治療法を開発するための、試験目的に用
いてよい。この「試験」は、動物試験またはこうした試験が行われる研究施設に
適用可能な、広く行われている法律の下での試験目的に利用して差し支えないこ
とを意味する。
【００２７】試験方法 本発明は、体重、体温調節、または行動の推定モジュレーターをアッセイする
ために設計された方法において利用してよい。通常、本発明の非ヒトトランスジ
ェニック動物の試験群は、同じ種 − 好ましくはPeg3遺伝子の不活性コピーをも
有する同じ株の動物の対照群、および任意に野生型動物の対照群と共に試験され
る。全ての群の動物には、低いか、高いか、または等しいカロリーの食餌を供給
する。また試験群の体重増加または減少を測定し、適切な対照群と比較する。通
常、試験動物には食餌を多めに与え、与えた食餌と一定時間経過後に残る食餌と
の差を測定してその摂取量を決定する。
【００２８】 推定モジュレーターは、体重、体温または行動調節に関与するのであればどの
候補物質でもよい。例えば、候補物質には、ホルモンまたはその他ペプチド（例
えばレプチン、インスリン、甲状腺、ホルモン、ＴＮＦを含む）、（Huang, Q.
ら、Endocrinology 139、1524−1532、1998；Hwang, C.S. ら、Ann．Rev. Cell.
Dev. Biol. 13, 231−259、1997）、プロスタグランジン、合成または天然化学
化合物、例えば植物の抽出物、ステロイド、ベンゾジアゼピン、デキスフルオロ
アンフェタミン、またはその他アンフェタミン誘導体（Popovich, N.G. ら、J.
Am. Pharm. Assoc. Wash., 37, 31-39, 1997）が含まれる。化合物は、任意の適
切な経路、例えば、経口または静脈内注射により試験動物に投与してよいが、そ
の他の経路（例えば口腔内、経鼻、経皮、直腸内なども含む）でもよい。推定モ
ジュレーターの用量は、その特性と効力に依存するものであり、試験物質の特性
を考慮して当業者が決定してよい。
【００２９】 本発明の好ましい態様においては、試験動物を体重の推定モジュレーターのア
ッセイに用いる。しかし、Ｐｅｇ３ノックアウトのその他の表現型の影響の研究
にも有用である。例えば、適切な体温調節を回復させるか、または体温の低下を
軽減する推定モジュレーター（Gongら、J. Biol. Chem. 26, 24129-24132, 1997
）は、例えば低体温症、あるいは、感染期間中のエンドトキシンの刺激による発
熱 （Doig, G.S. ら、Crit. Care. Med. 25, 1956-1961, 1997）、細胞の壊死に
関連する発熱、またはハロタンもしくはその他の薬物投与の結果としての高熱症
（Kim, S.H. ら、 J. Trauma 44, 485-491, 1998）などあらゆる原因による発熱
等の状態の治療に有用と考えられる。
【００３０】 さらに、行動、特に母性行動に対する表現型的な影響は、生後のうつ病または
その他行動障害を含むうつ病のための薬物療法の開発における決定因子として利
用できる。この表現型の影響はまた、嗅覚、認知および雄性行動を修正するため
の療法の開発において利用してもよい。
【００３１】 本発明のさらに別の態様においては、不活性かまたは改変したPeg3遺伝子をも
つトランスジェニック動物を提供する。Peg３の機能を操作するか、または体重
調節化合物をこれらトランスジェニック動物に投与することによって、家畜の脂
肪対筋肉比を変えることもできる。 本発明のさらに別の態様において、視床下部の視索前方の核にてみられるオキ
シトシン含有ニューロンが、対照動物に比して本発明者らのトランスジェニック
動物では有意に少ないことが確認された。このことは、これらニューロンが全く
形成しなかったか、または重要な点であるが複数のプロセスの1つによって変性
したかのどちらかを意味する。従って、Peg３は特に神経系における細胞死また
は変性の制御に重要であると考えられる。このことから、本発明では、脳または
その他組織におけるニューロンの変性を増強または抑制する能力を使って化合物
を試験する方法にトランスジェニック動物を提供する。Peg３の活性、量、また
は恒常性を測定することによって、アルツハイマー病のような細胞死や細胞変性
に関わる病気の診断検査または病期検査に利用してもよい。さらに、Peg３経路
を経て細胞変性を変える化合物を、癌の治療方法に用いても良い。
【００３２】 このように、本発明のさらに別の実施形態においては、試験化合物を本発明の
トランスジェニック動物に投与し、非トランスジェニック対照および／または未
処理のトランスジェニック対照と比較してこの動物における腫瘍の発生リスクが
増しているかどうかを決定することによって、化合物のもつ発ガン性の可能性を
試験する方法に利用してもよい。
【００３３】 本発明の動物は、異種移植、特にヒト腫瘍細胞の異種移植のレシピエントとし
ても利用してよい。次いで、抗腫瘍化合物候補の効能（FXC）をこうしたトラン
スジェニック動物にて試験し、この試験化合物の作用機序を分析してはたしてこ
の作用機序がPeg３によって調節されるかまたはPeg３を必要とする経路を経るも
のかどうかを決定してもよい。
【００３４】遺伝子のスクリーニング 体重、体温および行動の調節因子としてPeg３を同定することで、観察される
表現型を調節するためにPeg3と相互作用し得る遺伝子をさらに同定する手段が提
供される。つまり本発明はこれを達成するためのアッセイ方法および手段を提供
する。通常このようなアッセイは、Peg３タンパク質とその他タンパク質とのタ
ンパク質レベルでの相互作用の検出に基づく。
【００３５】 これを成すための方法の1つでは、ツーハイブリッドスクリーニングアッセイ
を用いる。ツーハイブリッドアッセイは、FieldsとSong（Nature 340; 245-246,
1989）により開示された方法に従ったものでよい。このようなアッセイでは、
酵母GAL4転写因子のDNA結合ドメイン（DBD）と転写活性化ドメイン（TAD）とが
それぞれ第一および第二分子に融合し、その相互作用を調べる。機能的GAL4転写
因子は、目的の2つの分子が相互作用する際にのみ回復される。従って、前述の
レポーター遺伝子の転写を活性化できるGAL4 DNA結合部位に、機能し得る形で
連結されたリポーター遺伝子を利用し、これら分子の相互作用を測定する。GAL4
TADの代わりに、その他の転写アクチベータードメイン、例えばウイルスのVP1
6活性化ドメインを使っても良い。通常は、DNA結合ドメインと活性化ドメインを
含む融合タンパク質を作成する。
【００３６】 最近の例では、本発明のポリペプチドを、適当なドメインをもつ融合タンパク
質として発現させてもよい。また、本発明のポリペプチドが結合するであろう、
第二の候補ポリペプチドを、適当な対応ドメインをもつ融合タンパク質として生
産できる。これは、適切な細胞、例えば酵母、昆虫または哺乳動物の細胞系にて
実行できる。あるいは、こうした融合タンパク質のファージ展示ライブラリー等
のライブラリーを、本発明の融合ポリペプチドを使ってスクリーニングしてもよ
い。
【００３７】 ツーハイブリッド法を利用すると、Peg３タンパク質と相互作用するタンパク
質をコードする遺伝子（または遺伝子全体をクローン化するのに使用できる少な
くともその一部）を単離できる。 別の方法として、免疫沈降があげられる。タンパク質がPeg３と結合して共に
沈降するような条件下で、このタンパク質を該タンパク質が産生される細胞から
免疫沈降させるために、Peg３に対する抗体を作成および使用してよい。このタ
ンパク質は従来のタンパク質化学やそれをクローン化するためのプローブを設計
するのに用いる一次配列によって分析できる。あるいは、一次配列データを候補
遺伝子に関してESTデータベースと比較してもよい。 このようにして取得可能な単離された核酸配列は本発明のさらに別の態様を形
成する。
【００３８】Peg3遺伝子型 Peg３が本明細書に述べる表現型の障害に関わるという発見により、肥満また
はその他障害に対する個体の感受性を決定するための遺伝マーカーの開発が可能
になる。したがって、本発明のさらに別の態様においては、ヒトの被験者を含む
、過肥の被験体からのPeg3遺伝子を、過肥でない被験体に見られるこの遺伝子と
比較して、分析することができる。ヒトの被験者である場合、過肥の被験者の肥
満指数（b.m.i. : 体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で割って算出）が25より高
く、好ましくは30より高い被験者が好ましい。
【００３９】 核酸、例えばPeg３を発現する細胞由来のｍRNA、または任意の細胞由来のDNA
を、個体における変異を検出するための適当な手段によって、分析してもよい。
適切な方法には、制限断片長多型（RFLP）、PCR産物多型性（すなわちプライマ
ー対を用いて生成した遺伝子の増幅領域の長さ）、遺伝子の全部もしくは一部の
直接配列決定、またはヘテロ二本鎖分析が含まれる。肥満と関連する過肥の個体
のPeg3遺伝子中の特徴を決定するのには、1つかそれ以上のこうした方法を用い
ることができる。同様に、その他障害との関連も決定できる。
【００４０】 関連があるとして認めるのに、過肥の被験体で100％に、また非過肥の被験体
で０％に認められるものである必要はない。表現型形質の予測マーカーは、対照
よりも被験体群で高頻度で確認されるものであればよい。このように肥満リスク
の上昇またはその他Peg3欠失が関わる形質を示すマーカーを開発すれば、リスク
のある個体を症状が現れる前に治療できる。
【００４１】 類似の方法で、本発明者らがPeg3の不活性化に関わることを確認した、これら
障害のどれかの症状を示す個体を、Peg３タンパク質について、例えばこのタン
パク質に対する抗体を使ってスクリーニングしてもよい。抗体は、当業界で標準
的な方法を用いて得られる。抗体を産生する方法には例えば、哺乳動物（例えば
マウス、ラット、ウサギ）を本発明のポリペプチドを使って免疫する方法があげ
られる。当業界で公知の各種の方法のいずれかを用いて、免疫した動物から抗体
を取得し、好ましくは目的抗原に対する抗体の結合を利用してスクリーニングで
きる。例えば、ウェスタンブロッティング法または免疫沈降を利用してよい（Ar
mitageら、Nature, 357:80-82, 1992）。
【００４２】 ペプチドを使って哺乳動物を免疫する代わりに、またはこれに加えて、例えば
その表面に機能的イムノグロブリン結合ドメインを展示する（例についてはWO92
／01047を参照）λバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使う
などして、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に生成したライブ
ラリーから、タンパク質に特異的な抗体を取得できる。
【００４３】 本発明による抗体は、いくつかの方法を使って改変してよい。実際、「抗体」
の用語は、必要な特異性をもつ結合ドメインを有する任意の結合物質を含むと解
釈すべきである。したがって、本発明には、抗原またはその他結合パートナーと
結合できる抗体フラグメントが含まれる。例えば、VL、VH、ClおよびCHｌドメイ
ンから成るFabフラグメント；VHおよびCHｌドメインから成るFdフラグメント；
抗体の１腕にあるVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント；VHドメインから
成るdAbフラグメント；単離されたCDR領域およびF(ab')２フラグメントすなわち
ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する二つのFabフラグメントを含む
２価のフラグメント、などが含まれる。単鎖のFvフラグメントも含まれる。
【００４４】 抗体は、Peg3タンパク質のエピトープに対して作成してよい。過肥の個体（ま
たは低体温症もしくは行動障害を患っている個体）および対照個体からの生体試
料へのこの抗体の結合における違いを比較して、その結合が二群間で異なるエピ
トープを決定する。 本発明のさらに別の態様は、肥満、体温調節、行動障害、アポトーシス、細胞
生存または感染症に対する抵抗性に関わるPeg3遺伝子の核酸またはタンパク質マ
ーカーを同定することである。各個体においてこれらの状態の１つが発症するリ
スク、またはこうした状態を治療するための予後を決定するのに、個々の被験体
から得たサンプルに診断法および診断マーカーを利用できる。例えば、野生型Pe
g3遺伝子の欠失、トランケーションまたは置換のような特定の多型性がこれらの
状態の１つと関連することが確認された場合、特定の多型性の有無を検出するた
めに、核酸プローブを調製できる。
【００４５】 核酸の検出試験では通常、DNAあるいはRNAを含むヒトまたは動物の生体試料を
、ハイブリダイズする条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはプライマーを含
んで成るプローブに接触させ、サンプル中でこのプローブと核酸間に形成される
二重鎖を全て検出する。このような検出では、PCRなどの技術を利用するか、ま
たはこのプローブを固相支持体上に固定化し、サンプル中のプローブにハイブリ
ダイズしない核酸を除去し、このプローブとハイブリダイズした核酸を検出する
。あるいは、このサンプル核酸を固相支持体上に固定化して、このような支持体
に結合するプローブの量を検出することもできる。例えば、WO89／03891およびW
O90／13667においてその他任意の形式の適切なアッセイ法をみることができる。
【００４６】 こうした技術にて用いるプローブは、野生型配列にハイブリダイズ可能で疾患
に関連する配列にはハイブリダイズできないか、またはその逆の短いプローブ（
例えば18から24ヌクレオチドなどの15から50ヌクレオチド）の形であってよい。
このプローブは、適切な対照試薬、指示書、その他と一緒にキットに梱包された
ものでよい。
【００４７】 また別の実施形態では、このサンプル核酸は、例えば（分裂）中期に散在して
いる、全染色体の形であってよい。本発明の核酸プロ−ブまたはプライマーは、
散在しているPeg3遺伝子の染色体位置を検出するために、蛍光標識で標識してよ
い。 同様に、診断上有意なPeg3のエピトープに結合できる抗体も同じように対照、
指示書、その他と一緒にキットに梱包されていてよい。イムノアッセイ法は当業
界で公知であり、通常、以下を含んで成る： (a) Peg3のエピトープに結合できる抗体を提供すること、 (b) 抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下で、生物学的サンプルと該抗体とを
インキュベートすること、および (c) Peg３を含んで成る抗体−抗原複合体形成の有無を決定すること。
【００４８】Peg３療法 上記の方法でPeg3に関する役割を同定することで、治療薬の新しい標的が提供
される。本発明のアッセイ法により取得されるPeg3のモジュレーターは、例えば
うつ病、母性保護障害（impaired maternal care）、体温調節異常および肥満な
どを含む各種の状態を治療するのに用いることができる。後者は、晩発性の肥満
の形で、部分的にはエネルギーバランスの変化や体温調節の欠如のために老化と
共に起こり得るが、Peg３はこの二つを連結する標的を形成するため、このよう
な状態の適切な治療の考案に重要である。
【００４９】 肥満に関連するヒトの集団におけるPeg3の対立遺伝子または多型性を同定する
ことにより、初期の肥満のリスクをもつ個体を識別する手段が提供され、その結
果、適切な治療法や、またはリスクに関わる対立遺伝子または表現型の影響を低
減し得るライフスタイルの変化の導入が提供される。 本発明を以下の実施例により例示する。
【００５０】材料と方法 標的ベクターの構築 マウス129／Sv株の二つのファージライブラリー、λKOおよびλPS（Nehls、19
94）から、Peg３ｃDNAクローンをプローブとして用いて Peg３ゲノムクローン
を単離した。creリコンビナーゼ発現大腸菌BNN132株の感染後、ファージに挿入
したDNAをプラスミド（ｐＫＳ＋）の形に切り出した。Peg3遺伝子の構造を部分
的に確立した。推定オープンリーディングフレームはエクソン３で始まり、全て
の亜鉛フィンガーモチーフは、最後にコードするエクソン９によりコードされる
（Li、1997）。Peg３のエクソン３から９にわたるゲノムクローンｐB＊を、ター
ゲティングベクターのバックボーンとして用いた。PIFstopからのIRES−βgeo選
択カセットのXhoI−断片4．8ｋｂを、ｐB*のXhoI部位に、Peg３と同じ転写方向
に挿入し、Peg3βgeoターゲティングベクターを作製した。
【００５１】ES細胞クローンのエレクトロポレーションとスクリーニング ES細胞は主に記載（Robertson、1987；Joyner、1993）の通りに操作した。R1
ES細胞（Nagy、1993）は、マイトマイシンCで処理した一次胚繊維芽細胞（PEFs
）のフィーダー層上、ES／LIF培地中、6％CO2、37℃で培養した。NotIで線状に
したターゲティングベクター50μgを、エレクトロポレーションにより、１mlの
培地中125μFと250Vで107個のES細胞に導入した。次いで、この細胞をES/LIF培
地中NeoPEFフィーダー上1日間培養した後、150μg／mlのG418の存在下で10日間
選択にかけた。24ウェルプレート中、耐性クローンは2倍に増殖した。このうち1
つを冷凍ストック取得用、もうひとつはサザン分析用のDNAの調製用とした。
【００５２】キメラ、ヘテロ接合型、ホモ接合型マウスの作製 標的としたESクローンを核型分析し（Tada、M.ら、EMBO J.21、6510−6520、
1997）、2．5 dpc MF1 （またはC57BL/6J）胚盤胞に注入し、偽妊娠させたメス
のマウスに転移させた。キメラの雄の子孫をMF1（またはC57BL/6J）のメスと繁
殖させたところ、子孫の毛皮が野ネズミ色であることから、生殖細胞系の伝達が
確認された。父親から突然変異した対立遺伝子を受け継いだヘテロ接合体を、そ
の尾芽もしくは卵黄嚢膜（例えば胎児）もしくは足指（10 dppの新生児）のβ-g
al染色またはDNAのサザン分析によって検出した。ヘテロ接合体の異種交配から
得た子孫を、β-gal染色および、DNAのサザンまたはPCR分析のどちらかと組み合
わせて遺伝子型分析した。
【００５３】サザンおよびノーザン分析 ゲノムDNAを、記載（Hoganら、1994）の通りプロテイナーゼ K/SDS細胞溶解溶
液を用いて単離した。胚またはES細胞由来の全RNAを、Gibco BRL TRIzol（登録
商標）試薬を使って調製し、またQiagen OligotexTM direct mRNAキットを使っ
てPoly A+ RNAを精製した。ノーザンおよびサザン分析は、標準的なプロトコル
（例えば先に引用したSambrookら、1992）に基づいて行った。
【００５４】逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（RT-PCR）およびPCR 1.0 μMのランダムヘキサマープライマー、1．0U/μlのRNase阻害剤、1ｘ反応
緩衝液、0．5mMのdNTPおよび10．0U/μlのMMLV逆転写酵素（Clontech）を含む溶
液20μl中、0．5〜1μgの全RNAを使って、逆転写反応を42℃で1時間行った。1ｘ
PCR緩衝液、200mM dNTP、各0.5ｍMのプライマーおよび0.05単位／mlのTaq DNA
ポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を含む50 ml の反応溶液中、1mlの逆転
写産物または、1/2500容量の尾のDNA（10 dppで1cm長）を使って、PCRを行った
。反応は、変性工程（93℃で3分）を30または35サイクル[93℃で30秒、(プライ
マーのTm‐5)℃で30秒、およびPCR産物の長さ1 kbにつき1分で72℃]ならびに最
終の伸長工程（72℃で５分）で行った。下記のプライマーを用いた。
【００５５】組織学および組織化学的分析 胚または組織を４％ホルムアルデヒド／PBSで４℃で一晩（ルーティング組織
学の場合）、または数時間（凍結切片(cryosection)β−gal染色および免疫組織
化学の場合）で固定した。
【００５６】 ホールマウント (whole mount)β−gal染色 胚および組織を固定液（PBS中に２％ホルムアルデヒド、0.2％グルタルアルデ
ヒド、0.02％NP-40、１mM MgCl2、および0.24mMデオキシコール酸ナトリウム）
で４℃で１〜２時間固定し、β−gal染色液（PBS中に１mg/ml X-gal、４mM K4Fe
(CN)6-3H2O、４mM K3Fe(CN)6、２mM MgCl2、および0.02％ NP-40）で30℃、暗所
で色が確認されるまで染色した。胚に関しては、PBS中の４％ホルムアルデヒド
で４℃で後固定(postfix)し、脱水し、70％エタノール中で保存した。
【００５７】 （凍結切片β−gal染色） 固定された組織をPBS中30％スクロースで４℃で一晩平衡化し、ドライアイス
上で凍結させた。厚さ15mmの凍結切片をβ−gal染色液で染色し、後固定し、エ
オシンまたはヌークレアファーストレッド(nuclear fast red)で対抗染色(count
er-stain)した。
【００５８】 （免疫組織学） Vectastain（登録商標） ABC Elite kitを使用し、免疫染色を行なった。切片
をPBS中の４％ホルムアルデヒドで後固定し、５分間室温にて0.25％トリプシン
で消化し、ABCブロッキング液で１時間ブロックした。次に切片を、ABCブロッキ
ング液、0.3％Triton X-100および0.2％NaN3で1000倍希釈したマウスプロラクチ
ン（UCB）、マウス成長ホルモン（UCB）、または副腎皮質刺激ホルモン(ACTH 1-
24)(Biogenesis)に対するポリクローナル抗体で室温にて一晩インキュベートし
た。ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG/アビジンDH-ビオチン化西洋ワサビペルオキシ
ダーゼH/DAB-NI系を使用して抗体を検出した。アビジンDH-ビオチン化西洋ワサ
ビペルオキシダーゼHでインキュベートする前に、切片をメタノール中の0.3％H2 O2で30分間処理し、内在性のペルオキシダーゼを不活性化した。最後に切片を脱
水し、DPXに固定した。
【００５９】母性行動分析 雌の３グループ、すなわち生後50〜60日の交配経験のない雌、初産後まもない
雌、および反復経産の雌について母性行動に関する試験を行なった(YeoおよびKe
verne, 1986年)。産後の雌について、実子マウスを一時的にケージから取り出し
た。３匹の新生児マウスをケージの中の各被検雌マウスの巣の位置とは反対の位
置に別々に置いた。次に雌の反応を30分間記録した。その結果を以下に示す。（
１）取り戻し：雌は子マウスをくわえ巣の位置に連れ帰った。（２）巣の形成：
雌は巣を作る材料を巣に持ち帰った。（３）子マウス上への覆い被さり：雌は３
匹の子マウス上に覆い被さり、背をそらせて授乳の姿勢をとった。最初の子マウ
スを取り戻し（取り戻し潜伏期間）次に３匹すべての子マウスを取り戻して（取
り戻し期間）、巣を形成して（巣形成潜伏期間）、子マウス上に覆い被さる（覆
い被さり潜伏期間）までの時間を記録した。
【００６０】雄性性行動 雄性の性行動を試験するために、変異個体または交配経験のない対照雄マウス
について、発情期の雌マウスとの標準の15分相互作用試験を実施した。あるいは
、対照個体および交配経験のない変異雄マウスを、内１匹のみが発情期にある５
匹の雌マウスと共に大型のケージに入れた。この発情期にある雌マウスを探し出
し、性行動を開始する雄マウスの能力を調べた。
【００６１】体重および 摂食の分析 この実験を行なうにあたっては、動物間の競争を回避するために、標準的な動
物飼育条件のもと、すなわち温度がt21℃±１℃、１時間に15回空気を入れ換え
る条件で、単独で飼育した。逆転照明（19時に点灯、７時に消灯）を実施した。
各動物に100gmの過剰餌（Expanded Diet）を与えた。餌は常に余っている状態で
あった。各動物に100gmのRM3過剰餌(RM3 expanded diet)を与えた。１週間毎に
残った餌の重さを測定し、さらに100gmの餌と置換した。餌の平均消費量は、27
〜35gm／週／マウスであった。さらに１週間毎にマウスの体重を測定し、また直
腸温度を各週９時に記録した。対照雄マウスおよび変異雄マウスの月齢を17ヶ月
と定めた。これらマウスを16週間にわたり観察した。
【００６２】結果 Peg3遺伝子のターゲティング RT-PCR分析によって、Peg3がES細胞内で発現することが判明した。Peg3遺伝子
を破壊すると共にこの遺伝子の発現パターンを検証するために、Peg3のエキソン
５にプロモーター非含有のIRES-βgeo選択カセットを組み込んだPeg3βgeoター
ゲティングベクターを作製した。内部リボソームエントリーサイト(IRES)は、融
合転写物においてβgeoの5’AUGで選択的な翻訳開始を可能にするものである（M
ountfordおよびSmith、1995年）。このカセットは、5’末端にある３つのリーデ
ィングフレームにおける翻訳終結コドン、および3’末端にあるSV40ポリアデニ
ル化シグナルからなり、それぞれが内在性遺伝子および融合遺伝子の発現を終結
させる。
【００６３】 線状のターゲティングベクターをR1 ES細胞内に電気穿孔した (Nagyら、1993
年)。5’および3’外部プローブを使用したサザン分析によって、68のG418耐性
クローンのうち17クローン（25％）が相同組換え体として検出された。βgeoの5
’断片を使用して、ターゲティング構築物の単一コピー置換を確認した。相同組
換えが高頻度で認められたことは、プロモータートラップおよびIRES機能の両方
からの選択性が豊富であることを反映している。
【００６４】Peg3 βgeo 変異マウスの作製 正常な染色体数を保有する２クローンをMF1胚盤胞内に注入し、別の４クロー
ンをC57BL/6J胚盤胞内に注入した。雄のキメラをMF1（またはC57BL/6J）の雌と
一緒に飼育した。100％生殖細胞系伝達である雄のキメラを129/Sv雌と交配させ
、近交系遺伝子背景においてPeg3βgeo対立遺伝子を樹立した。Peg3の発現は父
系対立遺伝子のみによるものであるため（Kuroiwaら、1996年、上記）、この対
立遺伝子の父系伝達後に、Peg3βgeo変異表現型およびlacZの発現が認められる
ことが予想される。(以後、父親または母親からPeg3βgeoを受け継いだヘテロ接
合体をそれぞれ、+/-マウスまたは-/+マウスと呼ぶ。) +/-マウスを足指のβ-g
al染色、または尾DNAのサザン分析によって同定した。これらのマウスは小型で
あり、予想されるメンデル比（50％）で再生された。さらに、+/-マウスの異種
交配では、４つの表現型（+/+、+/-、-/+、および-/-）が約1:1:1:1の割合で分
離された。
【００６５】 Peg3βgeo変異胚におけるPeg3の発現について、βgeoの挿入部位の領域3’に
ハイブリダイズする、Peg3cDNAプローブを使用したノーザン分析によって検証し
た。無傷父系コピーをもつ+/+および-/+の胚で、９kbの完全長Peg3 mRNAがはっ
きりと検出された。対照的に、+/-および-/-の胚では、転写が全く行なわれなか
ったか、行なわれたとしてもごくわずかであった。同一の膜をヒトGAPDH cDNAと
再びプローブして、使用した４サンプルとほぼ同量を確認した。一方、βgeoカ
セットの5’断片を、+/-および-/-の変異胚中のみにある、主要な５〜６kb転写
物にハイブリダイズした。この転写物のサイズについては、βgeoカセットの3’
末端のSV40ポリアデニル化部位で終結する、推定Peg3βgeo融合転写物と一致す
ることが認められている。さらに、RT-PCT分析によって、+/-変異胚で異所性Peg
3βgeo転写物が検出された。すなわち、Peg3のエキソン４と６に特異的でβgeo
挿入部位およびその他の部位にフランキングするプライマー対によって増幅され
る転写物、neoとエキソン６に特異的でβgeoの3’組込み部位にフランキングす
るプライマー対によって増幅される転写物である。DNA配列決定によって、共に
選択的スプライシングにより、前者はβgeoカセットの大部分とエキソン５を欠
失し、後者はエキソン５の3’側半分を欠失していることが明らかになった。し
かしながら、どちらの転写物も、エキソン３から始まるPeg3のオープンリーディ
ングフレーム内に翻訳終結コドンを含んでいる。現段階では、Peg3タンパク質の
Ｃ末端に対する抗体は入手されておらず、このため、Peg3βgeoが真の無価値の
対立遺伝子(true null allele)、または低次形態(hypomorph)遺伝子として機能
するかどうかを証明することは不可能である。しかしながら、Peg3はその転写物
中では劇的に減少することが認められるため、Peg3はその機能を十分に果たさな
いに違いない。
【００６６】マウス発達中のPeg3 βgeo の発現 lacZの発現を、さまざまな発達段階におけるPeg3βgeo +/-ヘテロ接合体中で
、ホールマウント（全固定）または凍結切片β−gal組織化学的染色によって検
証した。野生型のサンプルを対照として染色したが、以下で特に指摘する場合を
除き、これら野生型サンプルの中でβ−gal活性を示したものはなかった。
【００６７】 （胚形成時におけるlacZの発現） まず、6.5dpcの初期移植後胚の胚体外組織で、微弱なβ−gal活性を検出した
。その後、卵黄嚢、羊膜および柔毛膜、ならびに尿膜において明らかな染色が認
められ、その染色は残りの妊娠期間を通じて持続した。7.5dpcの胚では、匹褶外
胚葉、側中胚葉、原条でβ−gal活性が認められた。Peg3 mRNAの発現に関しても
、ホールマウントin situハイブリダイゼーションによって同様のパターンが観
察された。8.5dpcの胚では、予定消化管領域ではβ−gal染色が強く、体節では
弱く、神経管ではβ−gal染色は認められなかった。9.5dpcおよび12.5dpcの胚に
おける染色パターンは、kuroiwaら（1986年、上記）が発表したPeg3 mRNAの発現
パターンによく対応するものであり、高レベルの活性が、発達中の消化管や骨格
などの中胚葉および内胚葉由来の組織に主に存在していた。 lacZが発現するそ
の他の部位は、肢芽、眼胞および耳胞、ならびに表面外胚葉であった。
【００６８】 （出生後生活におけるlacZの発現） 新生児マウスにおけるlacZの発現パターンは、胚におけるlacZの発現パターン
と類似したものであったが、その発現パターンは成体に至るまでの段階で大きく
変化した。新生児マウスの舌、肋骨、肋間筋および腸壁で強いβ−gal染色が認
められたが、成体ではそうしたシグナルは減少するか、または細胞のサブセット
においてのみ維持された。野生型の新生児マウスの消化管で、微弱な内在性のβ
−gal活性が認められた。Peg3が大量に発現することが知られている視床下部等
の領域を除いて（Kuroiwaら、1996年）、新生児マウスの脳では、相対的に低レ
ベルのβ−gal活性しか認められなかった。しかしながら、この活性は成体段階
までに増大した。心臓の心房、中間下垂体および前下垂体、ならびに副腎髄質で
も強力なβ−galシグナルが検出され、この染色パターンは出生後の生活を通じ
て持続された。胸腺、脾臓、および肝臓では、いかなるβ−gal染色も観察され
なかった。
【００６９】Peg3βgeo変異マウスの成長減退 Peg3βgeo +/-マウスは、同性の野生型(+/+)同腹子より小型であった。これ
らのマウスは、組織（および骨組）の重さが相対的に軽かったことから明らかな
ように、比例的矮小体であった。いつこれらマウスの成長が影響を受けたかを決
定するために、(+/+ × +/-)の交配から得られた同腹子の体重を、１dpp、10dpp
および30dppで測定した。１dppでは+/-変異マウスの体重は、正常体重の80〜85
％であった。この比率は、MF1/129/SvまたはC57BL/6J/129/Svを交配した背景で
も相対的に一定であったが、129/Svを同系交配した背景では、体重は離乳時期ま
でに65％に減少した。しかしながら、129/Sv成体変異マウスでは、正常体重の80
〜85％まで体重を取り戻した。MF1/129/Sv背景における(+/- × +/-)の交配から
得られる同腹子の体重についても分析した。成長速度に関しては、父系ヘテロ接
合体(+/-)はホモ接合体(-/-)に類似していたが、母系ヘテロ接合体(-/+)は野生
型マウス(+/+)と区別がつかず、すなわち、前者のグループは後者のグループよ
りも小型であった。胚形成時に実施したさらなる実験によって、+/- 胚の成長遅
延は16dpcで明らかであるが（８％）、18dpcで有意になることが示された（15％
）。さらにその胎盤は、これら２段階において20〜30％小型であった。これらの
結果は、Peg3βgeoの父系伝達が、胎児および胎盤の成長遅延や、さらに同系交
配が行なわれた背景では出生後の成長遅延を招くことを示すものである。
【００７０】Peg3βgeo変異雌マウスにおける母性行動障害 顕著なことに129/Sv +/-変異マウス間の最初の交配により出生したすべての子
マウスは数日のうちに死亡したため、交配の背景に関する観察は行なわなかった
。無傷で生まれ、継母マウスによって救出された子マウスは、 +/-変異母マウス
がもつ問題を有しているようにみえた。このため、これら変異雌マウスおよび野
生型の同胞マウスを、それぞれ変異雄マウスと交配させ、その養育能力に関する
比較を行なった（表１、+/- × +/- 対 +/+ × +/-）。12匹の野生型雌マウスの
うち10匹が（83％）、最初の出産で産まれた同腹子に対して授乳し、それら子マ
ウスのうち68％が離乳するまで成長した。対照的に、最初の同腹子に授乳した変
異雌マウスは12匹のうちわずか１匹（８％）にすぎず、離乳時まで生存した子マ
ウスは７％であった。子マウスの生存率が10分の１にまで減少したことは、129/
Svの不良な繁殖株の影響を受けたというより、むしろその表現型がPeg3βgeo変
異に関係していることを示すものである５ヶ月齢の変異雌マウスを野生型の雄マ
ウスと交配させた場合にも、同様の結果が得られた（表１、+/- × +/+ 対 +/+
× +/+）。すなわち、大部分の野生型雌マウスが最初の同腹子を養育したのと比
較して（７匹中６匹）、８匹の変異雌マウスのうち、最初の同腹子を養育したの
はわずか１匹だけであった。変異父マウスおよび変異子マウスの不在下でさえも
こうしたことが起こったことから（Peg3βgeoは母系伝達後は顕れない）、子マ
ウスが死亡した原因は変異母マウスであることが確認され、また変異雌マウスの
養育障害は、マウスのサイズとは関係がないことがわかった。しかしながら、出
産回数が増加するにつれてこうした変異雌マウス養育能力は改善されていった。
すなわち、変異雌マウスの50％（10匹中５匹）が２度めの出産では養育能力を示
し、３度目の出産では70％（10匹中７匹）が養育能力を示した。
【００７１】 未成熟で産まれる齧歯類の子は、例えば温暖な巣の提供、巣への仔の取り戻し
行動、覆い被さり行動および授乳など、生存していくために相当な母親の保護を
必要とすることは公知である（Numan、1994a）。母親から正常な毛づくろいを受
ける新生児マウスとは対照的に、初産のPeg3βgeo変異雌マウスから産まれた子
マウスはケージ内のあちこちに散在し、母親による保護が欠如していることが示
された。このため我々は、次に初産後の変異マウス(+/-)および野生型雌マウス
の、３匹の新生児マウスに対する母性行動に関する実験を行なった。野生型雌マ
ウスは、最初の子マウスを28±11.6秒以内に、そしてすべての子マウスを190±1
07秒以内に、それぞれ取り戻した。対照的に、変異雌マウスは、同様の行動を開
始してから完了するまでに、それぞれに約11倍および3倍の時間を費やした。野
生型雌マウスは、子マウスを取り戻してから97.8±58秒後には巣を作り始めたが
、変異雌マウスでは８倍も長い潜在期間を示した。変異雌マウスは、900秒間の
実験の間、子マウスの上に覆い被さる兆しは全く見せなかったが、野生型雌マウ
スは390±121秒後に覆い被さった。変異雌マウスは野生型雌マウスと同程度に子
マウスの臭いを嗅いでいたので、こうした変異雌マウスの母性反応障害は、観察
される子マウス側の問題のせいではなかった。
【００７２】 また、非妊娠マウスも、産後の雌マウスほど迅速な反応ではないにしろ母性行
動を示す（Numan、1994年）。Peg3βgeo変異が出産時以外の母性行動にも影響を
及ぼすかどうかを議論するために、交配経験のない雌マウスおよび反復経産の雌
マウスについて実験を行なった。以前の母性経験が母性行動の発現を容易にする
(Numan, 1994a)という事実と一致するかのように、経産雌マウス（母性経験有り
）は潜在期間に関して、野生型およびPeg3βgeo +/-の両方の背景における測定
の大半で、交配未経験雌マウスと産後雌マウスの中間の結果を示した。重要なこ
とは、２つの遺伝子型を比較する際、母性経験の有る無しにかかわらず、変異雌
マウスは、すべての子マウスを取り戻し巣形成行動を示すのに有意に長い時間を
費やしたということである。これら反復経産の変異マウスは、実験の間、子マウ
スの上に覆い被さることはほとんどなかったが、野生型の経産雌マウスの大半（
６匹中５匹）は、子マウスに接触した後1.5時間でこの行動を示した。一方で、
この覆い被さり行動を示した経産変異マウスはほんのわずかであった（６匹中１
匹）。こうした実験結果を考慮すると、出産経験に関係なく、Peg3βgeo変異雌
マウスは野生型雌マウスよりも母性的でないことが明らかである。
【００７３】
【表１】 産後の母性反応障害は、子マウスの死亡の原因となる可能性がある。
【００７４】 Peg3βgeo変異雌マウスの母性反応障害は、成体マウスの脳内における強いPeg
3発現と関連していることから、脳内におけるPeg3の発現パターンについてさら
に調査してみることにする。脳のさまざまな領域に広く分布しているPeg3 mRNA
の発現は、内側視索前部（MPOA）などの視床下部核や、 内側扁桃体、床核条(be
d nucleus stria)、海馬および歯状回などの大脳辺縁系で顕著に観察された。障
害およびナイフカット実験等の研究から、母性行動にはこれらの領域が関与して
いることが明らかとなった（Numan、1994b）。ここで観察されたPeg3の発現パタ
ーンは、遺伝子がこれらの領域で作用し母性行動に影響を及ぼす可能性を示唆す
るものである。
【００７５】 母性行動に関係のある神経回路をマッピングするのに用いられる分子マーカー
の１つに、Fos遺伝子ファミリーがある。このファミリーのメンバーであるc-Fos
やFosBなどは産後の雌マウスまたは交配経験のない雌マウスのMPOAで活性化され
、子に接触した後の母性反応を誘導する（Brownら、1996年； Calamandreiおよ
びKeverne、1994年）。さらにFosBを欠如しているマウスは、母性行動障害を示
した（Brownら、1996年）。次に我々は、Peg3βgeo変異マウスにおいて、FosB陽
性活性化神経回路が正常であるかどうかを検証した。FosB抗体を使用した免疫染
色によって、子マウスに接触した後の交配未経験変異マウスにおいて、野生型マ
ウスと同等のレベルまでFosB陽性の神経細胞が増大していることが明らかとなっ
た。これにより、この神経回路はPeg3βgeo変異による影響を受けないことがわ
かった。
【００７６】 FosB誘導とは異なり、変異マウスの脳の凍結切片のβ−gal染色は、Peg3発現
の場合と同様のパターンを示し、仔に対する母性反応を示した後にも明らかな変
化は見られなかった。さらに、これらの実験の間中、変異マウスの脳内に顕著な
解剖学的異常性は全く見られなかった。
【００７７】Peg3βgeo変異母親マウスにおけるオキシトシン生産細胞の減少 Peg3βgeo変異雌マウスから産まれた子マウスは、野生型雌マウスから産まれ
た子マウスと比較して、授乳期間の体重増加が少ないことが判明した。これはお
そらく母性反応障害（前記参照）および／または変異雌マウスにおける乳汁分泌
に関する問題に起因するものと考えられる。こうした可能性を調査するために、
これらPeg3βgeo変異雌マウスから産まれた子マウスの体重増加を測定した。子
マウスが産まれた後の２時間の間に、変異母親マウスは、野生型母親マウスに比
べて覆い被さり行動をとるのに時間を要した（15.3 vs 8.7秒、ｐ<0.004）。野
生型雌マウスから産まれた子マウスは、６時間後および24時間後に体重が増加し
た。対照的に、変異雌マウスから産まれた子マウスは、６時間後には全く体重が
増加せず、24時間後になってようやく体重が増えた。すべての子マウスは誕生後
1時間で母親マウスの乳匹に接触していたので、後のグループで体重が増加しな
かったのは、変異雌マウスにおける乳汁分泌問題が原因となっているに違いない
。
【００７８】 Peg3βgeo変異雌マウスは、産前および産後の組織形態学から判断されるよう
に、比較的正常な乳腺を有している。母乳の分泌は、子マウスのよる吸引刺激と
オキシトシンの作用の両方によるものである。Peg3βgeo変異雌マウスに関して
は、野生型雌マウスと比較して、視床下部におけるオキシトシン発現細胞の数が
少ないことがその免疫染色から判明している。
【００７９】雄性性行動 標準の15分間相互作用試験によって、雄マウスと発情期の雌マウスを交配した
ところ、Peg3雄マウスと129の対照マウスの間で有意な相違はないことが明らか
になった。しかしながら、うち１匹だけが発情している５匹の雌マウスがいる大
型のケージに１匹の交配未経験雄マウスを入れると、129匹の対照マウスと比較
して変異雄マウスの行動に有意な相違が見られた。変異雄マウスも雌に興味を示
しはしたが、発情している雌を同定するのにも、性行動を開始するのにも対照マ
ウスに比べてはるかに時間を要した。
【００８０】 交尾のため雌に乗るまでの潜在時間（分） 変異雄マウス 11.58 ± 0.96 t=2.53 df10 対照雄マウス 8.03 ± 1.02 p<0.02体重および授乳 餌の全消費量、体重増加および直腸温度を、形質転換マウスおよび対照マウス
のグループで測定した。対照グループ（５匹）と変異グループ（６匹）のマウス
の月齢および性別を一致させた（雄、17ヶ月）。これらのマウスを16週間にわた
り観察した。体重、餌の消費および直腸温度を１週間毎に観察した。これにより
、対照グループ(p>0.003)と比較して変異マウスの体重が著しく増加したが、一
方で変異マウスによる餌の消費量は、対照マウスよりも低いという結果を得た。
また、変異マウスのコア（直腸）の温度も、対照マウスよりも有意に低かった(p
>0.005)。
【００８１】参考文献 Nehls, M., ら (1994) Biotechniques 17, 770-775 Li, E., ら (1993) Nature 366: 362-365 Robertson, E. J., (1987) Teratocarcinoma and embryonic stem cells: A pra
ctical approach., IRL, Oxford University Press, UK Joyner, A. L., 編 (1993) Gene targeting. A practical approach. IRL Press
, Oxford University Press, Oxford, UK Nagy, A., ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8424-8428 Hogan, B., ら (1994) Manipulating the mouse embryo. Cold Spring Harbor L
aboratory Press, New York Yeo, J. A. G.およびKeverne, E. B., (1986) Physiol-Behav. 37, 23-26 Mountford, P. S.およびSmith, A. G., (1995) Trends-Genet. 1995:11:179-184 Numan-M.およびNuman-MJ., (1994) Behav-Neurosci. 1994 108: 379-394 Numan, M., (1994) Acta Paediatr Suppl 397: 19-28 Brownら (1996) Cell 86: 297-309 Calamandrei, G.およびKeverne, E. B., (1994) Behav-Neurosci. 1994 Feb: 10
8(1): 113-120
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１月１８日（２００１．１．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 3/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA35 AA40 CB17 CB30 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 FB03 JA06 4B024 AA11 CA04 CA09 DA02 GA14 HA12 4B063 QA01 QA08 QA12 QA18 QQ02 QQ42 QR33 QR56 QR59 QR62 QR72 QR80 QS12 QS25 QS34 4C084 AA17 BA35 NA14 ZA701 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA50 FA74

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Peg3遺伝子の不活性コピーを含んでなる、トランスジェニッ
    ク非ヒト動物。
  2. 【請求項２】 野生型よりも高レベルでPeg3を発現する、トランスジェニッ
    ク非ヒト動物。
  3. 【請求項３】 齧歯動物である、請求項１または２記載のトランスジェニッ
    ク動物。
  4. 【請求項４】 体重の推定モジュレーターを試験する方法であって、前記推
    定モジュレーターを請求項１、２または３記載の動物へ投与し、推定モジュレー
    ターが身体代謝に及ぼす作用を判定することを含んでなる前記方法。
  5. 【請求項５】 行動の推定モジュレーターを試験する方法であって、前記推
    定モジュレーターを請求項１、２または３記載の動物へ投与し、推定モジュレー
    ターが行動に及ぼす作用を判定することを含んでなる前記方法。
  6. 【請求項６】 体重または体温の調節に関与する遺伝子をスクリーニングす
    る方法であって、Peg3タンパク質を用意し、前記タンパク質を他の細胞性タンパ
    ク質と接触させ、どの細胞性タンパク質にPeg3タンパク質が結合し得るかを判定
    することを含んでなる前記方法。
  7. 【請求項７】 ツーハイブリッドアッセイまたは免疫沈降法の形態である、
    請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記Peg3タンパク質が結合する細胞性タンパク質をコードす
    る遺伝子を単離することをさらに含んでなる、請求項６または７記載の方法。
  9. 【請求項９】 ヒト被験者または動物被験体のPeg3遺伝子型と、肥満または
    体温調節に関与する表現型障害との関連性を判定する方法であって、 肥満被験体からなる群と肥満ではない被験体からなる対照群より核酸を得、 前記核酸を分析し、そして 肥満表現型に関与する前記核酸の１つ以上の特徴を判定する ことを含んでなる前記方法。
  10. 【請求項１０】 ヒト被験者または動物被験体のPeg3遺伝子型と、肥満また
    は体温調節に関与する表現型障害との関連性を判定する方法であって、 肥満被験体からなる群と肥満ではない被験体からなる対照群よりPeg3タンパク
    質を含む身体サンプルを得、 前記Peg3タンパク質を分析し、そして 肥満表現型に関与する前記タンパク質の１つ以上の特徴を判定する ことを含んでなる前記方法。
  11. 【請求項１１】 肥満または体温調節障害に対する被験体の罹患性を試験す
    る方法であって、前記被験体の核酸を、肥満または体温調節障害に関与するPeg3
    遺伝子またはPeg3タンパク質の１つ以上の特徴について分析することを含んでな
    る前記方法。
  12. 【請求項１２】 前記被験体がヒト被験者である、請求項８〜１１のいずれ
    か一項に記載の方法。
JP2000556047A 1998-06-25 1999-06-25 アッセイにおけるＰｅｇ３遺伝子の使用、並びに肥満、体温調節および行動障害に関連する産物 Pending JP2002518056A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9813778.9A GB9813778D0 (en) 1998-06-25 1998-06-25 Assay methods and means
GB9813778.9 1998-06-25
PCT/GB1999/002009 WO1999067407A2 (en) 1998-06-25 1999-06-25 Transgenetic non-human animal which comprises an inactive peg3 gene, and the use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002518056A true JP2002518056A (ja) 2002-06-25

Family

ID=10834401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000556047A Pending JP2002518056A (ja) 1998-06-25 1999-06-25 アッセイにおけるＰｅｇ３遺伝子の使用、並びに肥満、体温調節および行動障害に関連する産物

Country Status (9)

Country Link
US (2) US6448468B1 (ja)
EP (1) EP1090116B1 (ja)
JP (1) JP2002518056A (ja)
AU (1) AU4522399A (ja)
CA (1) CA2329939A1 (ja)
DE (1) DE69920698T2 (ja)
ES (1) ES2229721T3 (ja)
GB (1) GB9813778D0 (ja)
WO (1) WO1999067407A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL160189A0 (en) * 2001-08-24 2004-07-25 Zeiss Stiftung Method for producing contacts and printed circuit packages
US10127295B2 (en) * 2009-06-05 2018-11-13 Microsoft Technolofy Licensing, Llc Geographic co-location service for cloud computing
EP2404500A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-11 Universite Pierre Et Marie Curie - Paris 6 A transgenic animal as a model for identifying adult stem cells, and uses thereof
WO2023196818A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California Genetic complementation compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
CA2329939A1 (en) 1999-12-29
EP1090116A2 (en) 2001-04-11
DE69920698T2 (de) 2005-12-01
WO1999067407A3 (en) 2000-04-20
ES2229721T3 (es) 2005-04-16
DE69920698D1 (de) 2004-11-04
US20030018987A1 (en) 2003-01-23
WO1999067407A2 (en) 1999-12-29
GB9813778D0 (en) 1998-08-26
AU4522399A (en) 2000-01-10
EP1090116B1 (en) 2004-09-29
US6448468B1 (en) 2002-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuang et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models.
Supp et al. Sp4, a member of the Sp1-family of zinc finger transcription factors, is required for normal murine growth, viability, and male fertility
Brewer et al. Wnt1-Cre-mediated deletion of AP-2α causes multiple neural crest-related defects
JP6443811B2 (ja) Ｍｒａｐ２ノックアウト
Wylie et al. Tissue-specific inactivation of murine M6P/IGF2R
Kotkow et al. Complexity of the erythroid transcription factor NF-E2 as revealed by gene targeting of the mouse p18 NF-E2 locus.
JP6282591B2 (ja) 遺伝子ノックイン非ヒト動物
US6313373B1 (en) Tissue specific promoters and transgenic mouse for the screening of pharmaceuticals
US6753456B2 (en) Point mutant mice with hypersensitive alpha 4 nicotinic receptors: dopaminergic pathology and increased anxiety
JP2001211782A (ja) ｔｏｂ遺伝子欠損ノックアウト非ヒト哺乳動物
US6448468B1 (en) Transgenetic mouse which comprises an inactive Peg3 gene, and the use thereof
US20040216178A1 (en) Regulation of mdm2 function
Yang et al. Impaired motor coordination in mice that lack punc
JP2000515386A (ja) Ｋｕ欠損細胞と非ヒトトランスジェニック動物
US9295239B2 (en) MO-1 conditional knock-out non-human animal and uses thereof
Szeto et al. Analysis of imprinted murine Peg3 locus in transgenic mice
US6689937B2 (en) Transgenic mouse model of basal cell carcinoma
AU741340B2 (en) Non human transgenic animal in which the expression of the gene coding for insulin is deleted
JP2002541765A (ja) Ｍｓｈ５を削除したマウス及びその利用法
US5850002A (en) Animal models for loss and gain of Hox11 function
JP2006524049A (ja) 突然変異α２／δ１遺伝子を含有する動物および細胞
US7022892B1 (en) Non-human genetically modified mammal lacking the alpha-fetoprotein
JP2003506056A (ja) 腫瘍抑制遺伝子ａｎｘ７のノックアウトマウス
Kumar et al. Transgenic mice as models of disease
JP2004154093A (ja) 新しい病態モデルとしてのｈｓｆ１遺伝子欠損動物