DE69920698T2 - Transgenes nichthumanes tier mit inaktivem peg3 und dessen verwendung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Peg3-Gen und die Erkenntnis, dass es an Wärmeregulierung, Fettleibigkeit (Adipositas), dem Verhalten der Mutter, dem Geruchssinn (Olfactus), männlichem Verhalten, Apoptose, Zellüberleben und -abbau sowie infektiösen Krankheiten beteiligt ist.
  • Das Peg3-Gen wurde in einem Screen hinsichtlich der Expression epigenetisch markierter Gene in Mäusen identifiziert. Epigenetisch markierte („imprinted") Gene zeigen ein ungewöhnliches Expressionsmuster, da ihre Expression ausschließlich durch ihren parentalen Ursprung bestimmt wird. Peg3 weist Imprinting auf, wobei die paternale Kopie des Gens in Nachkommen exprimiert wird, während die maternale Kopie inaktiv ist. Das Gen exprimiert eine mRNA einer Größe von etwa 9 kb, die für ein ungewöhnliches Zink-Finger-Protein mit 11 weit beabstandeten „C2H2"-Motiven und 2 Gruppen von Aminosäure-Wiederholungen kodiert: Die vorhergesagte Größe des Proteins ist 1.572 Aminosäuren. Siehe Kuroiwa et al., Nature Genetics 12, 186–189 (1996). Die Sequenz von Peg3 ist in GenBank, Zugriffsnummer AF038939 (NCBI – REF 363877) zu finden.
  • Peg3 wird früh in der Entwicklung von Somiten, Kiemenbögen und anderen mesodermalen Geweben exprimiert. In Erwachsenen wird es vor allem im Gehirn exprimiert, z.B. in der medialen präoptischen Hypothalamusregion, in den Amygdala sowie im Riechkolben (Bulbus olfactorius). Es wird auch in wenigen anderen Adultgeweben wie z.B. in der Nebenniere exprimiert. Die Funktion des Gens ist unbekannt, obwohl von Kuroiwa et al., ebda., festgehalten wird, dass sich das Gen auf eine Region von Mäuse-Chromosom 7 ausdehnt, das mit der Humanchromosomen-Position für Gene syntenisch ist, die mit myotonischer Dystrophie und Tumorsuppression assoziiert sind.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Anmelder entwickelten ein transgenes Mäusemodell, in dem das Peg3-Gen zerstört wurde. Es wurden einige überraschende phänotypische Veränderungen festgestellt, insbesondere Adipositas, niedrigere Kerntemperatur, beeinträchtigtes mütterliches Verhalten, abnormales männliches Verhalten, kleinere Körpergröße bei der Geburt und Reduktion spezifischer Neuronen im Hypothalamus. Außerdem stellte sich heraus, dass sich bei den Mäusen trotz Einnahme einer geringeren Nahrungsmenge als bei den Tieren der Kontrollgruppe Fettleibigkeit entwickelte. Diese Erkenntnisse legen nahe, dass Peg3 bei der Regulierung von Körpergewicht und Temperatur eine Rolle spielt, und bieten ein Modellsystem, in dem Therapien zur Behandlung von Adipositas, Stoffwechselstörungen, Wachstumsregulierung und Verhalten untersucht werden können.
  • Die Erfindung bietet ein Verfahren zur Prüfung eines mutmaßlichen Modulators für Körpergewicht, das die Verabreichung dieses mutmaßlichen Modulators an ein transgenes nichtmenschliches Tier umfasst, das als Ergebnis einer genetischen Modifikation eine inaktive Kopie des Peg3-Gens umfasst oder das Peg3 in einer Menge exprimiert, die größer als jene des Wildtyps ist.
  • Die Entdeckung der Funktion des Peg3-Gens ermöglicht die Untersuchung anderer Gene, die an der Stoffwechselregulierung beteiligt sind; die Erfindung bietet somit ein Verfahren zum Screenen auf Gene, die an der Regulierung von Körpergewicht oder Temperatur beteiligt sind, welches Verfahren die Bereitstellung eines Peg3-Proteins, das In-Kontakt-Bringen des Proteins mit anderen Zellproteinen und die Bestimmung, an welche Zellproteine sich das Peg3-Protein binden kann, umfasst. Solche Gene können isoliert werden, was einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt.
  • Die Rolle von Peg3 in Mäusen erlaubt die Bestimmung eines PEG3-Genotyps bei Menschen mit einer phänotypischen Störung, die mit Fettleibigkeit oder Wärmeregulierung assoziiert ist, mittels eines Verfahrens, das einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt. Dieses Verfahren umfasst Folgendes:
    Bereitstellen von Nucleinsäure aus einer Gruppe fettleibiger Patienten und einer Kontrollgruppe nicht-fettleibiger Patienten;
    Analysieren der Nucleinsäure; und
    Bestimmen eines oder mehrere Merkmale der mit dem fettleibigen Phänoytp assoziierten Nucleinsäure.
  • Ein analoges Verfahren kann auf Proteinebene unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt werden, um Epitope von PEG3 zu ermitteln, die sich in bestimmten Gruppen unterscheiden – entweder hinsichtlich der relativen Bindungsstärke oder hinsichtlich ihrer Gegenwart oder Abwesenheit.
  • Die anhand dieses Screenings identifizierten Unterschiede der Proteinepitope oder des Genotyps können dazu dienen, ein Verfahren zur Prüfung der Anfälligkeit eines Individuums für Fettleibigkeit oder einer Wärmeregulierungsstörung bereitzustellen, umfassend das Analysieren der Nucleinsäure dieses Individuums auf ein oder mehrere Merkmale des PEG3-Gens, die mit Adipositas oder Wärmeregulierungsstörungen assoziiert sind.
  • Die Ausdrücke „umfasst/umfassen/umfassend" werden hierin gleichbedeutend wie „enthält/enthalten/enthaltend" oder „beinhaltet/beinhalten/beinhaltend" verwendet.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • PEG3-Gen
  • Peg3, das von den Anmeldern in Mäusen zerstört wurde, ist das Gen, dessen Sequenz in GenBank unter der Zugriffsnummer AF038939 zu finden ist (diese Offenbarung ist hierin durch Verweis aufgenommen) und das sich in Mäusen in der proximalen Region von Chromosom 7 befindet. Der Ausdruck „Peg3" umfasst hierin jedoch auch Allel-Formen des Wildtyps dieses Gens in Mäusen sowie Homologe in anderen Tieren, etwa Säugetieren, wie z.B. Menschen. „PEG3" bezieht sich hierin spezifisch auf das Human-Homolog des Gens und auf Diagnoseverfahren u.dgl., die mit Menschen oder menschlichen Proben durchgeführt werden. Das Human-PEG3-Gen wurde isoliert, und seine Teilsequenz ist in der NCBI-Datenbank (AB006625, Homo sapiens-mRNA für das KIAA0287-Gen, partielles cds) zu finden. Die 5'-Region, umfassend das erste Exon (Nucleotide 1–174) von PEG3 ist auch in GenBank-Eintrag AC006115 zu finden; es zeigt sich hohe Homologie mit der Mäuse-Peg3-Sequenz (GenBank-Zugriffsnummer AF105262), die gemeinsam mit AF105266 weitere Peg3-Sequenzen darstellt. Die komplette Sequenz kann unter Verwendung von Primern auf Basis der Datenbanksequenz als Sonden auf cDNA-Bibliotheken oder durch Erweiterung einer mRNA-Quelle des Gens mittels PCR bestimmt werden. Die EST W49208 und W90868 (Database Est) bieten weitere Mäuse-Peg3-Quellen; HS201-228 und HS403225 (Database Est) bieten weitere Humanquellen von PEG3-Sequenzen.
  • Eine Wildtyp-Sequenz ist hierin jede beliebige Sequenz, die in Mäusen oder anderen Tieren zu finden ist, die in Bezug auf Gewicht und Temperaturregulierung phänotypisch normal sind.
  • Homologe Sequenzen können durch auf dem Gebiet bekannte Routineverfahren ermittelt werden. Nucleinsäuresequenzen, die für die Gesamtheit oder einen Teil eines Peg3-Gens und/oder seiner regulatorischen Elemente kodieren, können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung der hierin enthaltenen Informationen und Verweise sowie unter Zuhilfenahme der auf dem Gebiet bekannten Techniken problemlos hergestellt werden (siehe z.B. Sambrook, Fritsch und Maniatis, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, und Ausubel et al., „Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1992). Diese Techniken umfassen (i) die Anwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Proben derartiger Nucleinsäure, z.B. aus genomischen Quellen, (ii) chemische Synthese oder (iii) die Herstellung von cDNA-Sequenzen.
  • Beispielsweise sehen PCR-Klonierungstechniken die Verwendung von Primern (z.B. mit etwa 15–50 Nucleotiden) auf Basis der Sequenz von Mäuse-Peg3 für eine Region von mRNA oder für genomische DNA vor, die für die mRNA kodiert, die kloniert werden soll. Die Primer werden mit der mRNA oder DNA (z.B. aus einer Hirnzelle, insbesondere einer Fötenhirnzelle) oder anderen embryonalen oder fötalen Geweben in Kontakt gebracht; es erfolgt PCR unter Bedingungen, die zur Amplifikation der gewünschten Region führen, und ein amplifiziertes Fragment wird isoliert (z.B. durch Reinigung des Reaktionsgemisches auf einem Agarosegel). Die Primer können so ausgebildet sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen zweckmäßigen Klonierungsvektor kloniert werden kann.
  • Solche Techniken können dazu dienen, die Gesamtheit oder einen Teil eines Peg3-Gens aus anderen Tieren zu erhalten, z.B. aus Amphibien oder Säugetieren. Genomische Klone, die ein Peg3-Gen und seine Introns und Promotorregionen enthalten, können auch in analoger Weise erhalten werden – beginnend mit genomischer DNA aus einer primären Zelle wie etwa einer Leberzelle, einer Gewebekulturzelle oder einer Bibliothek wie etwa einer Phagen-, Cosmid-, YAC- (künstliches Hefe-Chromosom), BAC- (künstliches bakterielles Chromosom) oder PAC- (künstliches P1/P2-Phagen-Chromosom) Bibliothek.
  • Alternativ dazu können Homologe gebildet werden, indem cDNA oder genomische DNA-Bibliotheken hergestellt oder erhalten werden und solche Bibliotheken mit Sonden sondiert werden, die die Gesamtheit oder einen Teil des Peg3-Mäuse-Gens umfassen; dies erfolgt unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz (z.B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50 °C bis etwa 60 °C).
  • Im Allgemeinen sind Homologe zu zumindest etwa 60 %, noch bevorzugter zumindest 70 % und sogar zumindest 80 %, z.B. zumindest 90 %, 95 %, 98 % oder 99%, homolog mit Mäuse-Peg3 innerhalb des offenen mRNA-Leserahmens. Säugetier-Homologe sind besonders vorzuziehen.
  • Prozentuelle Homologie (auch als Identität bezeichnet) von DNA und Aminosäuresequenzen kann unter Anwendung im Handel erhältlicher Algorithmen berechnet werden. Die folgenden Programme (zur Verfügung gestellt vom National Center for Biotechnology Information) können zur Bestimmung von Homologien verwendet werden, BLAST, gapped BLAST und PSI-BLAST, die mit Standardparametern eingesetzt werdeb können. Der Algorithmus (GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI, USA) bedient sich des Needleman-Wunsch-Algorithmus, um zwei vollständige Sequenzen vergleichend anzuordnen, was die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Im Allgemeinen werden die Standardparameter verwendet; es gelten: Gap Creation Penalty = 12 und Gap Extension Penalty = 4. Die Verwendung der Ausdrücke „homolog" oder „Homologie" impliziert hierin keinerlei notwendige evolutionäre Beziehung zwischen verglichenen Sequenzen; dies steht beispielsweise in Einklang mit der herkömmlichen Verwendung von Ausdrücken wie „homologe Rekombination" – die einzige Voraussetzung ist hier, dass zwei Nucleotidsequenzen ausreichend ähnlich sind, um unter den geeigneten Bedingungen zu rekombinieren.
  • „Inaktiv"
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist davon auszugehen, dass der Ausdruck „inaktive Kopie des Peg3-Gens" jegliche Nicht-Wildtyp-Variante des Gens umfasst, die zum fettleibigen oder hypothermischen Phänotyp oder zu Verhaltensstörungen führt. Somit kann das Gen in seiner Gesamtheit deletiert oder mutiert werden, so dass das Tier ein verkürztes Protein produziert, z.B. mittels Einsetzung eines Stoppcodons und gegebenenfalls stromauf angeordneter Kodiersequenzen in den offenen Leserahmen des Peg3-Gens. Ebenso kann der offene Leserahmen intakt und die inaktive Kopie des Gens durch Mutationen in den Promotorregionen gebildet sein.
  • Allgemein kann die Inaktivierung des Gens durch zielgerichtete homologe Rekombination erfolgen. Dafür geeignete Techniken sind als solche auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Sie können in unterschiedlicher Weise durchgeführt werden. Eine typische Strategie besteht darin, zielgerichtete homologe Rekombination durchzuführen, um das Gen des Wildtyps in einer embryonalen Stammzelle (ES-Zelle) zu substituieren, zu modifizieren oder zu deletieren. Ein Targeting-Vektor, der ein modifiziertes Peg3-Gen umfasst, wird durch Elektroporation, Lipofektion oder Mikroinjektion in ES-Zellen eingesetzt. In einigen ES-Zellen paart sich der Targeting-Vektor mit der verwandten chromosomalen DNA-Sequenz und überträgt die gewünschte, vom Vektor getragene Mutation durch homologe Rekombination in das Genom. Screening- oder Anreicherungsverfahren dienen dazu, die transfizierten Zellen zu identifizieren, und es wird eine transfizierte Zelle kloniert und als reine Population aufrechterhalten. Als nächstes werden die modifizierten ES-Zellen in die Blastozyste eines Präimplantations-Mäuseembryos eingesetzt, oder es wird – alternativ dazu – eine Aggregationschimäre gebildet, in der die ES-Zellen zwischen zwei Blastozysten positioniert sind, die mit den ES-Zellen fusionieren, um eine einzige chimäre Blastozyste zu bilden. Die chimäre Blastozyste wird chirurgisch in den Uterus einer Leihmutter übertragen, wo die Entwicklung bis zur Geburt fortschreiten kann. Das resultierende Tier ist eine Chimäre von normalen und Donorzellen. Typischerweise stammen die Do norzellen aus einem Tier mit einem klar unterscheidbaren Phänotyp, wie z.B. Hautfarbe, so dass die chimäre Nachkommenschaft leicht identifizierbar ist. Die Nachkommenschaft wird dann gezüchtet und ihre Nachkommen gekreuzt, was zu Heterozygoten und Homozygoten bezüglich der abgezielten Mutation führt. Die Erzeugung transgener Tiere wird von Capecchi, M.R., Science 244, 1288–1292 (1989); Valancius und Smithies, Mol. Cell. Biol. 11, 1402–1408 (1991); und Hasty et al., Nature 350, 243–246 (1991), ausführlich beschrieben, wobei diese Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind.
  • Die homologe Rekombination im Gen-Targeting kann für die Ersetzung des Peg3-Gens des Wildtyps mit einer spezifisch definierten Mutantenform verwendet werden (z.B. verkürzt oder mit einer oder mehreren Substitutionen).
  • Das inaktive Gen kann auch eines sein, dessen Expression entweder permanent oder temporär selektiv blockiert sein kann. Für permanente Blockierung kann gesorgt werden, indem das Gen als Reaktion auf ein Signal deletiert wird. Ein Beispiel dafür ist das cre-lox-System, wobei Phagen-lox-Stellen an beiden Enden des Transgens oder zumindest zwischen einem ausreichenden Abschnitt davon angeordnet sind (z.B. in zwei Exons auf beiden Seiten eines oder mehrerer Introns). Die Expression von cre-Recombinase bewirkt Exzision und Zirkularisierung der Nucleinsäure zwischen den zwei lox-Stellen. Verschiedene Linien transgener Tiere, insbesondere von Mäusen, stehen derzeit auf dem Gebiet der Erfindung zur Verfügung, die cre-Recombinase in einer hinsichtlich der Entwicklung oder des Gewebes eingeschränkten Weise exprimieren; siehe z.B. Tsien, Cell, Bd. 87(7), 1317–1326 (1996), und Betz, Current Biology, Bd. 6(10), 1307–1316 (1996). Diese Tiere können mit den transgenen lox-Tieren der Erfindung gekreuzt werden, um die Funktion des Peg3-Gens zu untersuchen. Ein alternativer Steuermechanismus ist das Vorsehen eines Promotors aus einem Tetracyclin-Resistenz-Gen, tet, in den Steuerregionen des Peg3-Locus, so dass sich das der Zelle zugesetzte Tetracyclin an den Promotor bindet und die Expression des Peg3-Gens blockiert. Alternativ dazu könnten GAL4, VP16 und andere Transaktivatoren zwecks Modulation der Peg3-Expression verwendet werden, z.B. jener eines das Peg3-Gen umfassenden Transgens. Außerdem könnte Peg3 auch im ektopen Stellen exprimiert werden, d.h. in Stellen, wo das Gen normalerweise – zeitlich oder räumlich – nicht exprimiert wird.
  • Transgene Targeting-Techniken können zur Deletion des Peg3-Gens herangezogen werden. Verfahren für gerichtete Gen-Deletion werden von Brenner et al., WO 94/21787 (Cell Genesys) beschrieben; diese Offenbarung ist hierin durch Verweis aufgenommen.
  • Eine weitere Alternative ist das Insertieren eines Vektors in das Peg3-Gen, der für die Expression eines gekürzten Gens des Wildtyps sorgt, durch Spleißen einer Exon-mRNA an eine Spleiß-Akzeptorstelle und in Nicht-Peg3-Gen-Sequenz.
  • Es sei auf die weiter unten angeführten Beispiele für die Produktion geeigneter transgener Mäuse verwiesen, worin das Gen durch einen Vektor aufgebrochen wird, der ein Marker-Gen und ein Stoppcodon umfasst. Der zur Veranschaulichung der Erfindung verwendete Peg3-Targetingvektor enthält Folgendes:
    • (1) eine Spleiß-Akzeptorstelle am 5'-Ende, die die Insertion der βgeo-Selektionskassette innerhalb eines Introns ermöglicht;
    • (2) translationale Stoppcodons in den 3 Leserahmen, die vorzeitige translationale Termination des gerichteten Gens sicherstellen;
    • (3) eine interne Ribosomen-Eingangsstelle (IRES) stromauf von βgeo, wodurch präferentielle Translations-Reinitiation am 5'AUG von βgeo im Fusionstranskript unabhängig von der Translations-Initiation im endogenen Gen ermöglicht wird;
    • (4) ein Promotor-loses βgeo-Gen, das aus einer Rahmen-internen Fusion zwischen den bakteriellen Genen lacZ und neo besteht (kodiert für ein bifunktionelles Protein), was sowohl die Selektion gerichteter Klone als auch die Analyse des Expressionsmusters des gerichteten Gens während der Entwicklung erlaubt; und
    • (5) ein SV40-Polyademethylierungs-Signal in der Nähe des Endes des Kassetten-terminierenden Transkripts des Fusionsgens.
  • Ähnliche Konstrukte können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung gewählt werden, um Vektoren bereitzustellen, die die Inaktivierung des Peg3-Locus erzielen. In einem der Targeting-Konstrukte ist die βgeo-Kassette stromab von der Peg3-Translations-Startstelle an Exon 3 insertiert. Dies sorgt für ein verkürztes Protein, das anhand der Nachkommenschaft detektierbar ist. Analoge Verfahren können in anderen Mäusen oder nichtmenschlichen Säugetieren angewendet werden, z.B. die Verwendung anderer Markerproteine wie etwa Luciferase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase und Green Fluorescent Protein.
  • Peg3-exprimierende transgene Tiere
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung eines nichtmenschlichen Tiers vorgesehen, das Peg3 in einer Menge exprimiert, die größer als jene des Wildtyps ist. Vorzugsweise bedeutet dies, dass das Peg3-Gen zumindest in 120–200 % jener Menge exprimiert wird, die man in Tieren des Wildtyps der gleichen Spezies vorfindet, wenn das Gen exprimierende Zellen (z.B. Hypothalamus) verglichen werden. Dieses Gen könnte an einer ektopen Position exprimiert werden, an der das Peg3-Gen zeitlich oder räumlich normalerweise nicht exprimiert wird. Vergleiche können günstigerweise durch Northern Blotting und Quantifizierung der Transkriptmenge erfolgen. Das höhere Expressionsausmaß kann auf die Gegenwart einer oder mehrerer – beispielsweise von 2 oder 3 – zusätzlicher Kopien von Peg3 oder auf Modifikation der Peg3-Gene zurückzuführen sein, um Überexpression zu bewirken, z.B. durch Einführen eines starken Promotors oder Enhancers in operabler Verbindung mit dem Gen des Wildtyps. Wenn man Tiere mit zusätzlichen Kopien von Genen versehen möchte, kann dies unter Anwendung von Techniken erfolgen, die hierin in Zusammenhang mit der Bereitstellung von „Knock-out"-Tieren beschrieben sind.
  • Ein weiterer Aspekt betrifft die Verwendung von Tieren, in denen das Peg3-Gen an einer ektopen Position exprimiert wird. Dies bedeutet, dass das Gen an einer Position oder zu einem Zeitpunkt während der Entwicklung exprimiert wird, die bzw. der in einem Tier des Wildtyps nicht auftritt. Beispielsweise kann das Gen mit einem entwicklungsregulierten Promotor wie z.B. Wnt-1 u.dgl. (Echeland, Y. et al., Development 120, 2213–2224 (1998); Rinkenberger, J.C. et al., Dev. Genet. 21, 6–10 (1997) oder einem gewebespezifischen Promotor wie z.B. HoxB (Machonochie, M.K. et al., Genes & Dev. 11, 1885–1895 (1997)) verbunden sein.
  • Tiere dieses Aspekts der Erfindung können auch als Modelle für die Entwicklung von Prüfungen hinsichtlich Modulatoren von Fettleibigkeit, Temperaturregelung oder Ver haltensstörungen verwendet werden. Solche Tiere können als zusätzliche Kontrollgruppen für Tests der Erfindung dienen, die ein inaktives Peg3-Gen umfassen.
  • Nichtmenschliches Tier
  • Nichtmenschliche Tiere der Erfindung können bezüglich des inaktiven Peg3-Gens homozygot oder heterozygot sein. Wenn heterozygote Tiere verwendet werden, ist es vorzuziehen, dass das inaktive (oder zwecks Expression anderweitig modifizierte) Gen im Tier paternal vererbt wird. Dies deshalb, weil das maternale Peg3-Gen unterdrückt wird und inaktiv ist. Heterozygote, in denen das modifizierte Gen maternal vererbt wird, sind allerdings auch Teil der Erfindung. Säugetiere sind hierin nichtmenschliche Primaten, Nagetiere, Hasen, Schafe, Rinder, Ziegen und Schweine. Zu Nagetieren zählen hierin Mäuse, Ratten und Meerschweinchen. Zu Amphibien zählen hierin Frösche. Fische, wie z.B. Zebrafische, eignen sich ebenfalls.
  • Die transgenen nichtmenschlichen Säugetiere der Erfindung können für experimentelle Zwecke zur Untersuchung von Adipositas, Wärmeregulierung oder Verhaltensstörungen und für die Entwicklung von Therapien verwendet werden, die die Symptome oder das Fortschreiten von Zuständen lindern bzw. stoppen sollen, die durch einen Defekt im Peg3-Gen hervorgerufen werden. Unter „experimentellen Zwecken" ist hierin die zulässige Verwendung in Tierversuchen unter Einhaltung der herrschenden Gesetze zu verstehen, die für die solche Experimente durchführende Forschungseinrichtung gelten.
  • Testverfahren
  • Die Erfindung kann in Verfahren angewandt werden, die mutmaßliche Modulatoren von Gewicht, Temperaturregelung oder Verhalten prüfen sollen. Im Allgemeinen wird eine Versuchsgruppe transgener nichtmenschlicher Tiere der Erfindung gemeinsam mit einer Kontrollgruppe von Tieren der gleichen Spezies untersucht – vorzugsweise mit Tieren des gleichen Stamms, die auch eine inaktive Kopie des Peg3-Gens aufweisen, gegebenenfalls mit einer Kontrollgruppe von Tieren des Wildtyps. Die Tiere aller Gruppen erhalten Nahrung, die hypo-, hyper- oder isokalorisch sein kann, wobei die Gewichtszunahme oder der Gewichtsverlust der Testgruppe gemessen und mit geeigneten Kontrollgruppen verglichen wird. Üblicherweise erhalten die Versuchstiere einen Überschuss an Nahrung, deren Aufnahme dann durch Messen des Unterschieds zwischen der zur Verfügung gestellten Nahrung und der nach einer Zeitdauer noch verbleibenden Nahrung bestimmt wird.
  • Der mutmaßliche Modulator kann jede beliebige Kandidatensubstanz sein, die an der Regulierung von Gewicht, Temperatur oder Verhalten beteiligt sein kann. Beispiele für solche Kandidaten sind Hormone oder andere Peptide (z.B. Leptin, Insulin, Schilddrüsenhormon, TNF) (Huang, Q. et al., Endocrinology 139, 1524–1532 (1998); Hwang, C.S. et al., Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 13, 231–259 (1997), Prostaglandine, synthetische oder natürlich vorkommende chemische Verbindungen, z.B. Pflanzenextrakte, Steroide, Benzodiazepene, Dexfluoramphetamine oder andere Amphetamin-Derivate (Popovich, N.G. et al., J. Am. Pharm. Assoc. Wash. 37, 31–39 (1997)). Verbindungen können an Versuchstiere auf jedem zweckmäßigen Weg verabreicht werden, z.B. oral oder durch intravenöse Injektion, obwohl auch andere Verabreichungsweisen (z.B. bukkal, nasal, transdermal, rektal usw.) nicht ausgeschlossen sind. Die Dosis eines mutmaßlichen Modulators hängt von seiner Beschaffenheit und seinem Wirkungsgrad ab und kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung unter Berücksichtigung der Beschaffenheit der Prüfsubstanz ermittelt werden.
  • In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden die Versuchstiere in der Prüfung mutmaßlicher Gewichtsmodulatoren verwendet. Die Untersuchung der anderen Wirkungen von Peg3-Knockout ist jedoch auch möglich. Beispielsweise können sich die mutmaßlichen Modulatoren, die korrekte Wärmeregulierung wiederherstellen oder die Temperaturreduktion einschränken (Gong et al., J. Biol. Chem. 26, 24129–24132 (1997)), möglicherweise dafür eignen, Zustände wie etwa Hypothermie oder Pyrexie beliebigen Ursprungs zu behandeln, z.B. Pyrexie infolge von Endotoxin-Stimulus während Infektion (Doig, G.S. et al., Crit. Care Med. 25, 1956–1561 (1997), mit Zellnekrose assoziierte Pyrexie oder Hyperpyrexie als Folge von Halothan-Verabreichung oder Verabreichung eines anderen Medikaments (Kim, S.H. et al., J. Trauma 44, 485–491 (1998)).
  • Außerdem können die phänotypischen Auswirkungen auf das Verhalten, insbesondere das maternale Verhalten, als Determinante für die Entwicklung medikamentöser Therapien für Depression, z.B. postnatale Depression oder andere Verhaltensstörungen, verwendet werden. Die phänotypischen Wirkungen können auch bei der Entwicklung von Therapien zur Modifikation von Olfactus, Kognition und männlichem Verhalten herangezogen werden.
  • In einem weiteren Aspekt de Erfindung ist die Verwendung transgener Tiere mit einem inaktiven oder modifizierten Peg3-Gen vorgesehen. Die Manipulation von Peg3-Funktion oder die Verabreichung von gewichtsregulierenden Verbindungen an solche transgenen Tiere kann zu einer Veränderung des Fett-Muskel-Verhältnisses von Haus- und Nutztieren führen.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung beobachteten die Anmelder, dass im präoptischen Nucleus des Hypothalamus deutlich weniger Oxytocin-enthaltende Neuronen in transgenen Tieren zu finden sind als in Vergleichstieren. Dies legt nahe, dass sich entweder weniger Neuronen bildeten oder dass sie – eine sehr interessante Vermutung – durch einen mehrerer Prozesse abgebaut wurden. Peg3 kann daher für die Steuerung von Zelltod oder -abbau, insbesondere im Nervensystem, eine wichtige Rolle spielen. Demzufolge bietet die vorliegende Erfindung transgene Tiere in Verfahren zur Prüfung von Verbindungen mit der Fähigkeit, den Abbau von Neuronen im Gehirn oder anderen Geweben zu steigern oder zu unterdrücken. Die Messung der Aktivität, Menge oder Integrität von Peg3 kann auch als diagnostischer oder Staging-Test für Krankheiten dienen, die Zelltod und -abbau umfassen, z.B. die Alzheimer-Krankheit. Außerdem können Verbindungen, die Zellabbau über den Peg3-Weg modifizieren, in Verfahren zur Krebsbehandlung zum Einsatz kommen.
  • Demzufolge können in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung transgene Tiere in einem Verfahren zur Prüfung der potenziellen Karzinogenität von Verbindungen verwendet werden, indem eine Prüfverbindung an ein transgenes Tier der Erfindung verabreicht und dann bestimmt wird, ob das Tier ein höheres Risiko aufweist, einen Tumor zu entwickeln, als nicht-transgene Kontrolltiere und/oder unbehandelte transgene Kontrolltiere.
  • Tiere der Erfindung können auch als Rezipienten von Xenotransplantaten, insbesondere Xenotransplantaten menschlicher Tumorzellen, dienen. Der FXC-Wert von Anti- Tumor-Verbindungskandidaten kann dann in transgenen Tieren geprüft werden, um die Wirkungsweise der Versuchsverbindung zu analysieren und zu bestimmen, welche Wirkungsweise einen Weg verfolgt, der von Peg3 reguliert wird oder es erfordert.
  • Gen-Screening
  • Die Identifikation von Peg3 als Regulator von Gewicht, Temperatur und Verhalten stellt eine Möglichkeit dar, weitere Gene zu identifizieren, die mit Peg3 in Wechselwirkung treten und so die beobachteten Phänotypen regulieren können. Somit umfasst die Erfindung Prüfverfahren und Mittel, diese durchzuführen. Im Allgemeinen beruhen solche Tests auf dem Detektieren der Wechselwirkung des Peg3-Proteins mit anderen Proteinen auf Proteinebene.
  • Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Durchführung eines Zwei-Hybrid-Screening-Tests. Zwei-Hybrid-Tests können gemäß den Verfahren von Fields und Song, Nature 340, 245–246 (1989) durchgeführt werden. In einem solchen Test werden die DNA-Bindungsdomäne (DBD) und die transkriptionale Aktivierungsdomäne (TA) des Hefe-GAL4-Transkriptionsfaktors mit dem ersten bzw. zweiten Molekül fusioniert, dessen Wechselwirkung untersucht werden soll. Ein funktionaler GAL4-Transkriptionsfaktor wird nur wiederhergestellt, wenn zwei Moleküle von Interesse miteinander in Wechselwirkung treten. Somit kann die Wechselwirkung der Moleküle durch Verwendung eines Reporter-Gens gemessen werden, das operabel mit einer GAL4-DNA-Bindungsstelle verbunden ist, die zur Aktivierung der Transkription des Reporter-Gens fähig ist. Es können anstelle von GAL4-TAD andere transkriptionelle Aktivatordomänen verwendet werden, z.B. die virale VP16-Aktivierungsdomäne. Im allgemeinen können Fusionsproteine produziert werden, die DNA-Bindungsdomänen und Aktivierungsdomänen enthalten.
  • Im vorliegenden Fall können Polypeptide der Erfindung als Fusionsproteine mit einer zweckmäßigen Domäne exprimiert werden, und Kandidaten für zweite Polypeptide, mit denen sich jene der Erfindung assoziieren können, können als Fusionsproteine mit einer geeigneten korrespondierenden Domäne produziert werden. Dies kann in geeigneten Zellen, z.B. Hefe-, Insekten- oder Säugetierzelllinien erfolgen. Alternativ dazu können Bibliotheken wie z.B. Phage-Display-Bibliotheken solcher Fusionsproteine mit einem Fusionspolypeptid der Erfindung gescrennt werden.
  • Die Verwendung des Zwei-Hybrid-Ansatzes ermöglicht die Isolierung des Gens (oder zumindest eines Abschnitts davon, der zum Klonieren des gesamten Gens dienen kann), das für das Protein kodiert, das mit Peg3-Protein in Wechselwirkung steht.
  • Eine alternative Methode ist die Immunfällung. Es können Antikörper gegen Peg3 gebildet und dazu verwendet werden, dieses Protein aus Zellen, in denen es produziert wird, unter Bedingungen, in denen ein mit Peg3 assoziiertes Protein mitgefällt wird, einer Immunfällung zuzuführen. Das Protein kann durch traditionelle Proteinchemie analysiert und die Primärsequenz dazu verwendet werden, Sonden zu bilden, um es zu klonieren. Alternativ dazu können die Daten in Bezug auf die Primärsequenz mit EST-Datenbanken für Genkandidaten verglichen werden.
  • Isolierte Sequenzen von auf diese Weise erhältlichen Nucleinsäuren bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
  • Peg3-Genotypen
  • Die Erkenntnis, dass Peg3 mit den hierin angeführten phänotypischen Störungen assoziiert ist, ermöglicht die Entwicklung genetischer Marker, um die Prädisposition eines Individuums gegenüber Adipositas oder anderen Störungen zu ermitteln. Somit kann in einem weiteren Aspekt der Erfindung das Peg3-Gen aus fettleibigen Probanden, z.B. menschlichen Probanden, analysiert und mit dem in nicht-fettleibigen Probanden identifizierten Gen verglichen werden. Im Fall menschlicher Probanden sind fettleibige Individuen vorzugsweise jene mit einem Body-Mass-Index (BMI, berechnet als Gewicht (kg) dividiert durch Körpergröße (m) zum Quadrat) von über 25, vorzugsweise über 30.
  • Nucleinsäure – z.B. mRNA aus Peg3 exprimierenden Zellen oder DNA aus beliebigen Zellen – kann durch jedes in Frage kommende Verfahren zum Detektieren von Variation in Individuen analysiert werden. Geeignete Verfahren sind die Bestimmung von Restriktionsfragment-Längepolymorphismen (RFLP), PCR-Produkt-Polymorphis men (d.h. die Länge einer amplifizierten Region des Gens (produziert unter Einsatz eines Primerpaars)), direktes Sequenzieren der Gesamtheit oder eines Teils des Gens oder Heteroduplex-Analyse. Ein oder mehrere dieser Techniken kann zur Bestimmung der Merkmale im Peg3-Gen fettleibiger Individuen dienen, das mit Fettleibigkeit assoziiert ist. Ebenso können Assoziationen mit anderen Störungen festgelegt werden.
  • Die Assoziation muss nicht notwendigerweise eine sein, die bei 100 % der fettleibigen Probanden und 0 % der nicht-fettleibigen Probanden vorliegt. Vorhersage-Marker für phänotypische Merkmale können jene sein, die mit höherer Häufigkeit in der Probandenpopulation als in der Kontrollgruppe auftreten. Somit können Marker entwickelt werden, die eine höhere Prädisposition gegenüber Adipositas oder anderen mit Peg3-Defizienz assoziierten Merkmalen aufzeigen, so dass Risikopatienten vor dem Auftreten von Symptomen behandelt werden können.
  • In analoger Weise können Individuen, die Symptome beliebiger jener Störungen aufweisen, die gemäß den Untersuchungen der Anmelder mit Peg3-Inaktivierung assoziiert sind, hinsichtlich des Peg3-Proteins gescreent werden, z.B. mittels Antikörpern gegen das Protein. Antikörper können unter Anwendung von Techniken erhalten werden, die auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Verfahren zur Produktion von Antikörpern sind z.B. das Immunisieren eines Säugetiers (z.B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens) mit einem Polypeptid der Erfindung. Antikörper können unter Anwendung einer Vielzahl von auf dem Gebiet bekannten Techniken aus immunisierten Tieren erhalten und gescreent werden, vorzugsweise mittels Bindung von Antikörper an das Antigen von Interesse. Beispielsweise kommen Western Blotting-Techniken oder Immunfällung in Frage (Armitage et al., Nature 357, 80–82 (1992)).
  • Als Alternative oder Ergänzung zum Immunisieren eines Säugetiers mit einem Peptid kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper aus einer rekombinant produzierten Bibliothek exprimierter variabler Immunglobulin-Domänen erhalten werden, z.B. unter Verwendung von Lambda-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen auf ihren Oberflächen aufweisen; siehe z.B. WO 92/01047.
  • Antikörper der Erfindung können in unterschiedlicher Weise modifiziert sein. Der Ausdruck „Antikörper" ist hierin so auszulegen, dass er jede Bindungssubstanz umfasst, die eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. Somit umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, die zur Bindung eines Antigens oder eines anderen Bindungspartners fähig sind, z.B. das Fab-Fragment, bestehend aus den VL-, CH-, C1- und CH1-Domänen; das Fd-Fragment, bestehend aus VH- und CH1-Domänen; das Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und CH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers; das dAbFragment, bestehend aus einer CH-Domäne; isolierte CDR-Regionen und F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment mit zwei Fab-Fragmenten, die durch eine Disulfidbrücke in der Hinge-Region verbunden sind. Einzelkettige Fv-Fragmente sind auch möglich.
  • Antikörper können gegen Epitope des Peg3-Proteins gebildet werden; Unterschiede hinsichtlich der Bindung der Antikörper an Körperproben fettleibiger Individuen (oder von an Hypothermie oder einer Verhaltensstörung Leidenden) und von Individuen der Kontrollgruppe können vergleichen werden, um ein Epitop zu ermitteln, dessen Bindung zwischen den zwei Gruppen divergiert.
  • Die Identifikation von Nucleinsäure- oder Proteinmarkern des Peg3-Gens, das mit Fettleibigkeit, Temperaturregulierung, Verhaltensstörungen, Apoptose, Zellüberleben oder Resistenz gegenüber infektiösen Krankheiten assoziiert ist, bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung. Diagnostische Verfahren und Marker können auf Proben eines individuellen Probanden eingesetzt werden, um die Prädisposition dieses Individuums gegenüber einem dieser Zustände zu bestimmen oder die Prognose zur Behandlung des Zustands zu erstellen. Wenn sich beispielsweise herausstellt, dass bestimmte Polymorphismen wie etwa Deletionen, Kürzungen oder Substitutionen des Peg3-Gens des Wildtyps mit einem dieser Zustände assoziiert sind, kann eine Nucleinsäuresonde gebildet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit des jeweiligen Polymorphismus zu detektieren.
  • Tests zum Detektieren von Nucleinsäure umfassen im Allgemeinen das In-Kontakt-Bringen einer DNA oder RNA enthaltenden menschlichen oder tierischen Körperprobe mit einer Sonde, die ein Polynucleotid oder einen Primer der Erfindung umfasst, unter hybridisierenden Bedingungen und das Detektieren der Bildung von Doppel strang-DNA zwischen der Sonde und Nucleinsäure in der Probe. Eine derartige Detektion kann unter Anwendung von Techniken wie z.B. PCR oder durch Immobilisieren der Sonde auf einem festen Träger, Entfernen von Nucleinsäure in der Probe, die nicht an die Sonde hybridisiert ist, und anschließendes Detektieren von Nucleinsäure, die an die Sonde hybridisierte, erfolgen. Alternativ dazu kann die Nucleinsäureprobe auf einem festen Träger immobilisiert und die Menge der an einen solchen Träger gebundenen Sonde detektiert werden. Geeignete Prüfverfahren dieses oder eines anderen Formats sind z.B. in WO 89103891 und WO 90/13667 beschrieben.
  • Für solche Techniken verwendete Sonden können in Form einer kurzen Sonde (z.B. mit 15–50, z.B. 18–4 Nucleotiden) vorliegen, die an die Sequenz des Wildtyps und nicht an die mit Krankheit assoziierte Sequenz oder umgekehrt hybridisieren kann. Die Sonde kann in einem Set mit zweckmäßigen Vergleichsreagenzien, Bedienungsanleitungen u.dgl. bereitgestellt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die Nucleinsäureprobe in Form von Vollchromosomen vorliegen, z.B. als Metaphase-Spread. Die Nucleinsäure-Sonde oder der Primer der Erfindung kann mit einem fluoreszierenden Marker markiert werden, um die chromosomale Position eines Peg3-Gens im Spread zu detektieren.
  • In ähnlicher Weise können Antikörper, die zur Bindung diagnostisch signifikanter Epitope von Peg3 fähig sind, in einem Set, zusammen mit Vergleichen, Anweisungen u.dgl., bereitgestellt werden. Immunoassay-Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen üblicherweise Folgendes:
    • (a) Bereitstellen eines Antikörpers, der zur Bindung eines Epitops von Peg3 fähig ist;
    • (b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die für die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes sorgen; und
    • (c) Bestimmen, ob sich Peg3 umfassender Antikörper-Antigen-Komplex gebildet hat.
  • Peg3-Therapeutika
  • Die Identifikation einer Funktion von Peg3 in der oben erläuterten Wiese bietet ein neues Ziel von Therapeutika. Modulatoren von Peg3 (erhalten durch die Testverfahren der Erfindung) können dazu dienen, eine Vielzahl an Zuständen zu behandeln, z.B. Depression, beeinträchtigte mütterliche Fürsorge, aberrante Wärmeregulierung und Adipositas. Diese kann – in Form von spät einsetzender Fettleibigkeit – mit dem Alter auftreten, teilweise infolge von Veränderungen des Energiehaushalts und mangelnder Wärmeregulierung; Peg3 bildet somit ein Ziel, das die zwei miteinander in Verbindung bringt, und kann für die Entwicklung von auf solche Krankheitszustände ausgerichteten Behandlungen entscheidend sein.
  • Die Identifikation von Peg3-Allelen oder Polymorphismen in Humanpopulationen, die mit Fettleibigkeit assoziiert sind, bietet eine Möglichkeit, Individuen mit Prädisposition gegenüber Adipositas in einem Frühstadium zu identifizieren; dies ebnet den Weg für geeignete Behandlungsmethoden oder Änderungen des Lebensstils, die die Wirkung eines riskoassoziierten Allels oder Phänotyps reduzieren können.
  • Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele erklärt.
  • Materialien und Verfahren
  • Konstruktion von Targeting-Vektoren
  • Genomische Peg3-Klone wurden aus zwei Phagen-Bibliotheken, λKO und λPS (Nehls, 1994), von Mäusestamm 129/Sv unter Verwendung von Peg3-cDNA-Klonen als Sonden isoliert. Das DNA-Insert der Phagen wurde in Plasmidform (in pKS+) nach der Infektion von cre-Recombinase-exprimierendem E. coli-Stamm BNN132 exzidiert. Die Struktur des Peg3-Gens wurde teilweise festgelegt; der mutmaßliche offene Leserahmen beginnt bei Exon 3, und alle Zink-Finger-Motive werden vom letzten Kodierungsexon 9 kodiert (Li, 1997). Ein genomisches Klon pB*, das Exons 3–9 von Peg3 überspannt, wurde als Rückgrat des Targeting-Vektors verwendet. Ein 4,8 kb großes Xhol-Fragment der IRES-βgeo-Selektionskassette aus plFstop wurde in die Xhol-Stelle von pb* in der gleichen transkriptionalen Orientierung wie Peg3 insertiert, um den Peg3aβgeo-Targeting-Vektor zu erzeugen.
  • Elektroporation und Screening von ES-Zellklonen
  • ES-Zellen wurden im Wesentlichen gemäß bereits beschriebenen Verfahren manipuliert (Robertson, 1987; Joyner, 1993). R1-ES-Zellen (Nagy, 1993) wurden auf Feederschichten von mit Mitomycin C behandelten primären embryonalen Fibroblasten (PEF) in ES/LIF-Medium bei 37 °C mit 6 % CO2 kultiviert. 50 μg Notl-linearisierter Targeting-Vektor wurde in 107 ES-Zellen in 1 ml Kulturmedium bei 125 μF und 250 V elektroporiert. Anschließend wurden die Zellen auf NeoPEF-Feedern in ES/LIF-Medium 1 Tag lang kultiviert, gefolgt von Selektion in Gegenwart von 150 μg/ml G418 über 10 Tage. Resistente Kolonien wurden gezüchtet und in Doppelansätzen in 24-Napf-Platten expandiert: einer, um gefrorene Stammkulturen zu erhalten, der andere, um DNA für Southern-Analyse zu präparieren.
  • Erzeugung chimärer, heterozygoter und homozygoter Mäuse
  • Die gerichteten ES-Klone wurden karyotypisiert (Tada, M. et al., EMBO J. 21, 6510-6520 (1997)) und in 2,5 dpc ("days post coitum", Tage nach dem Koitus) MF1- (oder C57BL/6J-) Blastozysten injiziert, die in scheinträchtige Weibchen übertragen wurden. Die chimäre männliche Nachkommenschaft wurde mit MF1- (oder C57BL/6J-) Weibchen gepaart und Keimlinien-Übertragung durch die Agouti-Fellfarbe in den Nachkommen erkannt. Heterozygoten, die das mutierte Allel vom Vater vererbt bekamen, wurden durch β-gal-Einfärbung ihrer Schwanzknospen oder Dottersackmembran (im Falle von Embryonen) oder Zehen (im Falle von Neugeborenen bei 10 dpp) oder durch DNA-Southern-Analyse detektiert. Die Nachkommenschaft aus Kreuzungen von Heterozygoten wurde durch eine Kombination von β-gal-Einfärbung und DNA-Southern- oder PCR-Analyse der Genotypisierung unterzogen.
  • Southern- und Northern-Analyse
  • Genomische DNA wurden unter Verwendung von Proteinase-K/SDS-Lyse-Lösung isoliert (Hogan et al., 1994). Voll-RNA aus Embryonen oder ES-Zellen wurden unter Verwendung des Gibco BRL TRIzol®-Reagens gebildet und Poly A+ RNA mittels des Quiagen OligotexTM-Direkt-mRNA-Kits gereinigt. Northern- und Southern-Analyse erfolgten auf der Grundlage herkömmlicher Arbeitsvorschriften (z.B. Sambrook et al., 1992, s.o.).
  • Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und PCR
  • Die reverse Transkriptionsreaktion erfolgte unter Verwendung von 0,5–1 μg Voll-RNA in einem 20 μl-Volumen, umfassend 1,0 μM Zufalls-Hexamer-Primer, 1,0 U/μl RNase-Inhibitor, 1 × Reaktionspuffer, 0,5 mM dNTP und 10,0 U/μl MMLV reverse Transkriptase (Clontech) bei 42 °C 1 h lang. PCR erfolgte mit 1 ml reversen Transkriptionsprodukten oder 1/2500 Volumen Schwanz-DNA (1 cm Länge bei 10 dpp) in einer 50 ml-Reaktion, umfassend 1 × PCR-Puffer, 200 mM dNTP, 0,5 mM jedes Primers und 0,05 Einheit/m Taq-DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim). Die Reaktion wurde einem Denaturierungsschritt (3 min bei 93 °C), 30 oder 35 Zyklen (30 s bei 93 °C, 30 s bei (Primer-Temperatur – 5)°C und 1 min/kb der Länge von PCR-Produkten bei 72 °C) und einem letzten Verlängerungsschritt (5 min bei 72 °C) unterzogen. Es wurden die folgenden Primer verwendet:
  • Histologie und histochemische Analyse
  • Embryonen oder Gewebe wurden in 4 % Formaldehyd/PBS bei 4 °C über Nacht (für Routine-Histologie) oder über wenige Stunden (für Cryo-Schnitt-β-gal-Einfärbung und Immunohistochemie).
  • Whole-mount-β-gal-Einfärbung
  • Embryonen und Gewebe wurden in der Fixierlösung (2 % Formaldehyd, 0,2 % Glutaraldehyd, 0,02 % NP-40, 1 mM MgCl2 und 0,24 mM Natriumdesoxycholat in PBS) 1–2 h lang bei 4 °C fixiert und mit β-gal-Einfärbungslösung (1 mg/ml X-gal, 4 mM K4Fe(CN)6-3H2O, 4 mM K3Fe(CN)6, 2 mM MgCl2 und 0,02 % NP-40 in PBS) bei 30 °C im Dunkeln eingefärbt, bis sich die Farbe entwickelte. Die Embryonen wurden in 4 % Formaldehyd in PBS bei 4 °C postfixiert, dehydriert und in 70 % Ethanol gelagert.
  • Cryo-Schnitt-β-gal-Einfärbung
  • Fixierte Gewebe wurden in 30 % Saccharose in PBS bei 4 °C über Nacht äquilibriert und auf Trockeneis gefroren. Die 15 mm-dicken Cryo-Schnitte wurden mit β-gal-Einfärbungslösung eingefärbt, postfixiert und mit Eosin oder Nuclear Fast-Rot (Kernechtrot) gegengefärbt.
  • Immunohistochemie
  • Das Immunofärben erfolgte unter Einsatz des Bectastain® ABC Elite-Kits. Schnitte wurden in 4 % Formaldehyd in PBS postfixiert, mit 0,25 % Trypsin 5 min lang bei Raumtemperatur verdaut und mit der ABC-Blockierlösung 1 h lang blockiert. Die Schnitte wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen Mäuse-Prolactin (UCB), Mäuse-Wachstumshormon (UCB) oder adrenocorticotropes Hormon (ACTH 1-24) (Biogenesis), 1000fach verdünnt in der ABC-Blockierlösung, 0,3 % Triton X-100 und 0,2 % NaN3 bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Antikörper wurden unter Verwendung des biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG/Avidin-DH-biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-N/DAB-NI-Systems detektiert. Vor dem Inkubieren mit Avidin-DH-biotinylierter Merrettich-Peroxidase H wurden die Schnitte mit 0,3 % H2O2 in Methanol 30 min lang behandelt, um endogene Peroxidase zu inaktivieren. Schließlich wurden die Schnitte dehydriert und in DPX montiert.
  • Analyse des mütterlichen Verhaltens
  • 3 Gruppen von Weibchen – jungfräuliche Weibchen im Alter von 50–60 Tagen, primipare, unmittelbar postpartale Weibchen und multipare menstruierende bzw. geschlechtsreife Weibchen – wurden auf mütterliches Verhalten untersucht (Yeo und Keverne, 1986). Im Falle der postpartalen Weibchen wurden ihre eigenen Jungen vorübergehend aus den Käfigen entfernt. 3 Neugeborene wurden getrennt voneinander gegenüber dem Nest jedes im Käfig untersuchten Weibchens platziert und die Nestmaterialien in den Mittelpunkt des Käfigs verschoben. Die Reaktionen der Weibchen (Beschreibung siehe unten) wurden für die folgenden 30 min aufgezeichnet. (1) Rückholung: Das Weibchen hob das Junge auf und brachte es in ihr Nest zurück. (2) Nestbau: Das Weibchen brachte Nestmaterialien in ihr Nest. (3) Kauern über dem Jungen: Das Weibchen kauerte über den 3 Jungen und wölbte seinen Rücken so, dass es sie stillen konnte. Folgende Zeiten wurden aufgezeichnet: Die Zeit bis zum Zurückholen des ersten Jungen (Latenzperiode des Zurückholens) und aller 3 Jungen (Rückholzeit), des Nestbaus (Latenzperiode des Nestbaus) und des Kauerns über den Jungen (Latenzperiode des Kauerns).
  • Männliches Sexualverhalten
  • Um das männliche Sexualverhalten zu untersuchen, wurden einzelne Mutanten oder jungfräuliche männliche Vergleichstiere mit Weibchen im Östrus in einem 15-minütigen Standard-Interaktionstest untersucht. Alternativ dazu wurden einzelne Kontrolltiere und jungfräuliche Mutantenmännchen in einen großen Käfig mit 5 Weibchen gesteckt, von denen nur eines im Östrus war. Die Fähigkeit der Männchen, dieses Weibchen zu identifizieren und Sexualverhalten an den Tag zu legen, wurde analysiert.
  • Körpergewicht- und Fütterungsanalyse
  • Für diesen Versuch wurden Tiere einzeln untergebracht, um Konkurrenz zwischen den Tieren zu vermeiden; die Unterbringungsbedingungen waren standardmäßig – Temperatur, t 21 ± 1 °C mit 15 Lüftungen/h. Umgekehrte Beleuchtungsphasen (Licht ein 19:00 Uhr, Licht aus 7:00 Uhr). Jedes Tier erhielt 100 g „Expanded Diet (erweiterte Nahrung). Die Nahrung war immer im Überfluss vorhanden. Jedes Tier erhielt 100 g RM3-Expanded Diet. In wöchentlichen Intervallen wurde die übrig gebliebene Nahrung gewogen und durch weitere 100 g Nahrung ersetzt. Der durchschnittliche Nahrungsverbrauch betrug 27–35 g/Woche/Maus. In wöchentlichen Intervallen wurden die Tiere gewogen und ihre rektale Temperatur um 9:00 jede Woche aufgezeichnet. Die Kontrolltiere und männlichen Mutanten waren hinsichtlich des Alters (17 Monate) abgestimmt. Sie wurden 16 Wochen lang überwacht.
  • Ergebnisse
  • Targeting des Peg3-Gens
  • RT-PCR-Analyse ergab, dass Peg3 in ES-Zellen exprimiert wird. Um das Peg3-Gen zu zerstören und gleichzeitig sein Expressionsmuster zu verfolgen, wurde der Peg3βgeo-Targeting-Vektor konstruiert, der eine promotorlose IRES-βgeo-Selektionskassette (insertiert in Exon 5 von Peg3) enthält. Die interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) ermöglicht die präferentielle Translationsinitiation am 5'AUG von βgeo im Fusionstranskript (Mountford und Smith, 1995). Diese Kassette besteht aus den Translations-Stoppcodons in 3 Leserahmen am 5'-Ende und aus dem SV40-Polyadenylierungssignal am 3'-Ende, um die Expression der endogenen bzw. Fusionsgene zu terminieren.
  • Der linearisierte Targeting-Vektor wurde in R1-ES-Zellen Elektroporation unterzogen (Nagy et al., 1993). 17 von 68 (25 %) G418-resistente Klone wurden als homologe Rekombinanten durch Southern-Analyse mit einer externen 5'- und 3'-Sonde detektiert. Die Einzelkopie-Ersetzung des Targeting-Konstrukts wurde unter Verwendung eines 5'-Fragments von βgeo bestätigt. Die hohe Häufigkeit homologer Rekombination spiegelte die selektive Anreicherung sowohl aus der Promotor-Trap als auch der IRES-Funktion wider.
  • Erzeugung von Peg3βgeo-Mausmutanten
  • 2 Klone mit normaler Chromosomenzahl wurden in MF1-Blastozysten injiziert, weitere 4 in C57BL/6J-Blastozysten. Männlicher Chimären wurden mit MF1- oder (C57BL/6J-) Weibchen gekreuzt. Männliche Chimären mit 100 % Keimlinienübertragung wurden mit 129/Sv-Weibchen gepaart, um das Peg3βgeo-Allel auf einem gekreuzten genetischen Hintergrund zu bilden. Da die Peg3-Expression nur des paternalen Allels erfolgt (Kuroiwa et al., 1996, s.o.), kann man davon ausgehen, dass die Peg3βgeo-Phänotypmutation und die lacZ-Expression nach paternaler Übertragung dieses Allels detektiert wird. (Nachstehend werden Heterozygote, die Peg3βgeo vom Vater bzw. der Mutter vererbt bekommen, als +/– bzw. –/+ Mäuse bezeichnet.) Die +/– Mäu se wurden durch β-gal-Einfärbung von Zehen oder Southern-Analyse von Schwanz-DNA identifiziert. Sie waren kleiner und wurden im erwarteten Mendelschen Verhältnis (50 %) erhalten. Außerdem spaltete das Kreuzen von +/– Mäusen die 4 Genotypen (+/+, +/–, –/+ und –/–) etwa im Verhältnis von 1:1:1:1 auf.
  • Die Expression von Peg3 in Peg3βgeo-Embryomutanten wurde durch Northern-Analyse unter Verwendung einer Peg3-cDNA-Sonde untersucht, die an eine Region 3' von der βgeo-Inertionsstelle hybridisiert. In den +/+ und –/+ Embryonen mit einer intakten paternalen Kopie wurde die9 kb-Peg3-mRNA voller Länge deutlich detektiert. Im Gegensatz dazu gab es keine oder wenige Transkripte in +/– und –/– Embryonen. Die gleiche Membran wurde mit Human-GAPDH-cDNA neu sondiert, um etwa gleiche Mengen der 4 verwendeten Proben zu bestätigen. Andererseits hybridisierte ein 5'-Fragment der βgeo-Kassette nur in +/– und –/– Embryomutanten an ein 5-6 kb großes Haupttranskript. Die Größe dieses Transkripts stimmte mit dem erwarteten Peg3βgeo-Fusionstranskript überein, das an der SV40-Polyadenylationsstelle am 3'-Ende der βgeo-Kassette endet. Eine weitere Raumtemperatur-PCR-Analyse detektierte aberrante Peg3βgeo-Transkripte in den +/– Embryomutanten: eines war durch das Primerpaar amplifiziert, das für Exons 4 und 6 von Peg3 spezifisch ist, und flankiert die βgeo-Insertionsstelle, das andere war durch das Primerpaar amplifiziert, das für neo und Exon 6 spezifisch ist, und flankiert die 3'-Integrationsstelle von βgeo. DNA-Sequenzierung zeigte, dass das erste den Großteil der βgeo-Kassette und Exon 5 deletiert und dass dem zweiten die 3'-Hälfte von Exon 5 fehlt (beide Phänomene sind auf alternatives Spleißen zurückzuführen). Trotzdem enthalten beide Transkripte Translations-Stoppcodons innerhalb des offenen Peg3-Leserahmens, der an Exon 3 beginnt. Es stehen derzeit Antikörper gegen den C-Terminus des Peg3-Proteins nicht zur Verfügung, und deshalb können die Anmelder auch nicht beweisen, ob Peg3βgeo als echtes Null-Allel oder als Hypomorph agiert. Doch die Peg3-Funktion muss aufgrund der beobachteten dramatischen Reduktion seiner Transkription beeinträchtigt sein.
  • Expression von Peg3βgeo während der Mäuse-Entwicklung
  • Die Expression von lacZ wurde in Peg3βgeo +/– Heterozygoten in verschiedenen Entwicklungsstadien durch Whole Mount oder histochemische Cryo-Schnitt-β-gal-Einfärbung untersucht. Proben des Wildtyps wurden parallel eingefärbt; sofern unten nicht anders angegeben, wies keine β-gal-Aktivität auf.
  • Expression von lacZ während der Embryogenese
  • Die β-gal-Aktivität wurde zunächst schwach in den extraembryonalen Geweben von frühen Postimplantations-Embryonen (6,5 dpc) detektiert. Später war die Einfärbung in der Dottersack-, Amnion- und Chorionmembran sowie in der Allantois deutlich, und dies setzte sich während der übrigen Trächtigkeit fort. In Embryonen von 7,5 dpc war die β-gal-Aktivität im Kopffalten-Ektoderm, im lateralen Mesoderm und im Primitivstreifen zu sehen. Ein ähnliches Muster war bei der Expression von Peg3-mRNA durch Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung zu beobachten. 8,5 dpc war die β-gal-Einfärbung in den prospektiven Darmregionen stark, in den Somiten schwach und im Neuralrohr nicht vorhanden. 9,5 und 12,5 dpc stimmte das Einfärbungsmuster gut mit dem Expressionsmuster von Peg3-mRNA überein, die von Kuroiwa et al., 1986, s.o., bereits beschrieben wurde; ein hohes Maß an Aktivität war vor allem in aus Mesoderm und Endoderm stammenden Geweben wie z.B. im sich entwickelnden Darm und Skelett feststellbar. Zusätzliche Stellen mit lacZ-Expression waren die Extremitätenknospen, die Augen- und Ohrenbläschen und das Oberflächenektoderm.
  • Expression von lacZ während des postnatalen Lebens
  • Das Expressionsmuster von lacZ bei Neugeborenen ähnelte jenem der Embryonen, während sich das Muster im adulten Stadium nachhaltig veränderte. Die β-gal-Einfärbung war in der Zunge, in der Rippe, in der Interkostalmuskulatur und in der Darmwand der Neugeborenen stark, doch die Signale nahmen ab oder blieben nur in einer Untergruppe von Zellen in adulten Tieren bestehen. Schwache endogene β-gal-Aktivität wurde im neonatalen Darm des Wildtyps festgestellt. Mit Ausnahme der Regionen einschließlich des Hypothalaus, wo Peg3 bekanntermaßen stark exprimiert wird (Kuroiwa et al., 1996), wies das Gehirn relativ niedrige β-gal-Aktivität in Neugeborenen auf. Die Aktivität nahm jedoch im adulten Stadium zu. Ein starkes β-gal-Signal wurde auch im Atrium des Herzens, in der mittleren und vorderen Hypophyse und im Nebennierenmark detektiert; die Einfärbungsmuster blieben während des postnatalen Lebens bestehen. Keine β-gal-Einfärbung wurde im Thymus, in der Milz und in der Leber festgestellt.
  • Wachstumsreduktion von Peg3βgeo-Mutanten
  • Peg3βgeo +/– Mäuse waren kleiner als ihre geschlechtsmäßig angepassten (+/+) Geschwister des Wildtyps. Sie waren proportional gesehen zwergwüchsig, wie sich dies anhand ihres relativ geringeren Gewichts in ihren Organen (und Karkassen) zeigte. Um zu bestimmen, wann ihr Wachstum beeinflusst wurde, wurden die Würfe aus (+/+ × +/–) Kreuzungen 1, 10 und 30 dpp ("days post partum", Tage nach der Geburt) gewogen. 1 dpp wiesen die +/– Mutanten 80–85 % des normalen Gewichts auf. Dieses Verhältnis blieb auf den MF1/129/Sv- oder C57BL/6J/129/Sv-Mischhintergründen relativ konstant, nahm aber ab Zeitpunkt der Entwöhnung auf dem 129/Sv-Kreuzungshintergrund auf 65 % ab. Die adulten 129/Sv-Mutanten holten jedoch mit 80-85 % des normalen Gewichts auf. Die Würfe von (+/– × +/–) Kreuzungen auf dem MF1/129/Sv-Hintergrund wurden ebenfalls analysiert. In Bezug auf die Wachstumsrate, waren die paternalen Heterozygoten (+/–) ähnlich den Homozygoten (–/–), während die maternalen Heterozygoten (–/+) von Mäusen des Wildtyps (+/+) nicht unterscheidbar waren; die erste Gruppe war kleiner als die zweite Gruppe. Die weitere Untersuchung während der Embryogenese ergab, dass die Wachstumsverlangsamung der +/– Embryonen 16 dpc offensichtlich (8 %), aber 18 dpc signifikant war (15 %). Außerdem waren ihre Plazenten in diesen Stadien um 20–30 % kleiner. Diese Ergebnisse zeigen, dass die paternale Übertragung von Peg3βgeo fötale und plazentale Wachstumsverlangsamung sowie postnatale Wachstumsverlangsamung (auf dem Kreuzungshintergrund) bewirkte.
  • Beeinträchtigtes mütterliches Verhalten in weiblichen Peg3βgeo-Mutanten
  • Überraschenderweise starben alle Jungen aus den ersten Kreuzungen zwischen 129/sv +/– Mutanten innerhalb weniger Tage, was man auf dem Mischhintergrund nicht beobachtete. Die Jungen wurden intakt geboren und konnten von den Pflegemüttern gerettet werden, was ein Problem mit den +/– Mutantenmüttern nahe legt. Daher wurden die weiblichen Mutanten mit ihren Geschwistern des Wildtyps (jeweils gepaart mit den männlichen Mutanten) hinsichtlich ihrer Fürsorgefähigkeit verglichen (Tabelle 1, +/– × +/– im Vergleich zu +/+ × +/–). 10 von 12 (83 %) der Weibchen des Wildtyps zogen ihre ersten Würfe auf, und 68 % ihrer Nachkommenschaft wuchs bis zur Entwöhnung heran. Im Gegensatz dazu überlebte nur 1 von 12 (8 %) der ersten Würfe und 7 % der Jungen der weiblichen Mutanten. Die 10fache Abnahme der Überlebensrate der Jungen legt nahe, dass der Phänotyp der Peg3βgeo-Mutation und nicht der Wirkung der schlechten 129/Sv-Züchtungserbanlage zuzuschreiben ist. Ähnliche Ergebnisse wurden für 5 Monate alte Weibchen erzielt, die mit Männchen des Wildtyps gepaart wurden (Tabelle 1, +/– × +/+ im Vergleich zu +/+ × +/+); nur 1 von 8 weiblichen Mutanten stillte bzw. kümmerte sich um ihre ersten Würfe – im Vergleich zur Mehrheit (6/7) der Weibchen des Wildtyps. Dies bestätigte, dass das Sterben der Mäusejungen durch Mutantenmütter verursacht wurde, da es selbst bei Fehlen von Mutanten der Väter und Jungen eintrat (Peg3βgeo ist nach der maternalen Übertragung inaktiv); außerdem zeigte sich, dass die Still- bzw. Fürsorgedefekte in den weiblichen Mutanten ungeachtet ihrer Größe auftraten. Trotzdem verbesserte sich ihre Still- bzw. Fürsorgefähigkeit mit steigender Anzahl an Geburten. 50 % (5/10) der weiblichen Mutanten zeigten nach der zweiten Geburt und 70 % (7/10) nach der dritten Geburt Still- bzw. Fürsorgefähigkeit.
  • Es ist bekannt, dass unreif geborene Nagetierjungen für das Überleben beträchtliche mütterliche Zuwendung benötigen, z.B. ein warmes Nest und die Mutter, die die Jungen wieder ins Nest zurückbringt, sich über sie kauert und sie stillt (Numan, 1994a). Im Gegensatz zu neugeborenen Jungen, die normal von Müttern großgezogen werden, stellte sich heraus, dass jene, deren Mütter primipare Peg3βgeo-Mutanten waren, in den Käfigen verstreut lagen, was auf einen Mangel mütterlicher Fürsorge hindeutet. Die Anmelder untersuchten daher das mütterliche Verhalten der primiparen postpartalen Mutanten (+/–) und der Weibchen des Wildtyps gegenüber ihren Neugeborenen. Die Weibchen des Wildtyps brachten das erste bzw. alle Jungen innerhalb von 28 ± 11,6 s bzw. 190 ± 107 s zurück. Im Gegensatz dazu brauchten die weiblichen Mutanten etwa das 11- bzw. 3fache der Zeit, um diese Verhaltensweise in Angriff zu nehmen und abzuschließen. 97,8 s ± 58 s, nachdem den Weibchen des Wildtyps die Jungen präsentiert wurden, begannen sie mit dem Nestbau, während die weiblichen Mutanten eine 8fach längere Latenzperiode an den Tag legten. Die weiblichen Mutanten begannen während der 900 s dauernden Versuchsdauer kein einziges Mal, sich über die Jungen zu kauern, während die Weibchen des Wildtyps dies nach 390 ± 121 s taten. Ihre eingeschränkte mütterliche Aufmerksamkeit war nicht auf die Unfähigkeit zurückzuführen, die Jungen zu beobachten, da sie sie ebenso beschnüffelten wie die Weibchen des Wildtyps.
  • Nichtträchtige Mäuse zeigen auch mütterliches Verhalten, obwohl ihre mütterliche Aufmerksamkeit nicht so unmittelbar ist wie bei postpartalen Weibchen (Numan, 1994a). Um die Frage zu klären, ob die Peg3βgeo-Mutation mütterliches Verhalten außerhalb des Kontexts der Entbindung beeinflusst, wurden jungfräuliche und multipare menstruierende Weibchen untersucht. In Übereinstimmung mit der Erkenntnis, dass vorherige mütterliche Erfahrung die Expression von mütterlichem Verhalten erleichtert (Numan, 1994a), wiesen die multiparen Weibchen (mütterliche Erfahrung) eine Latenzperiode auf, die in Bezug auf die meisten Messungen sowohl auf dem Wildtyp- als auch auf dem Peg3βgeo-Hintergrund zwischen den jungfräulichen und postpartalen Weibchen lag. Wenn die zwei Genotypen miteinander verglichen wurden, brauchten die weiblichen Mutanten mit oder ohne Erfahrung bedeutend länger, alle Jungen wieder zurückzuholen und Nestbauaktivitäten an den Tag zu legen. Obwohl sich während der Versuchsdauer diese menstruierenden Weibchen nur selten über die Jungen kauerten, zeigten die meisten (5/6) der multiparen Weibchen des Wildtyps dieses Verhalten nach 1,5 Stunden Kontakt mit den Jungen, während dies wenige (1/6) der multiparen weiblichen Mutanten taten. Insgesamt belegen die Ergebnisse, dass die weiblichen Peg3βgeo-Mutanten ungeachtet der Frage der Entbindung weniger mütterlich waren als die Weibchen des Wildtyps.
  • Tabelle 1: Fürsorgedefekte in Peg3βgeo +/– und –/– Weibchen
    Figure 00290001
  • Die eingeschränkte mütterliche Aufmerksamkeit in den weiblichen Peg3βgeo-Mutanten korrelierte mit starker Peg3-Expression im adulten Gehirn; dies brachte die Erfinder dazu, das Expressionsmuster im Gehirn weiter zu untersuchen. Die Expression von Peg3-mRNA, die in Hirnregionen weit verbreitet war, wurde in Hypothalamuskernen deutlich beobachtet, z.B. im medialen präoptischen Bereich (MPOA) sowie im limbischen System wie etwa in den medialen Amygdala, im zentralen Kern der Amygdala, im Hippocampus und im Gyrus dentatus. Studien wie z.B. Läsions- und Messerschnittexperimente zeigten deutlich die Beteiligung dieser Regionen am mütterlichen Verhalten (Numan, 1994b). Dieses hier beobachtete Expressionsmuster von Peg3 legt nahe, dass das Gen auf diese Regionen einwirken kann, um mütterliches Verhalten zu beeinflussen.
  • Einer der molekularen Marker zum Kartieren der neuralen Schaltkreise, die am mütterlichen Verhalten beteiligt sind, ist die Fos-Gen-Familie, da die Mitglieder dieser Familie wie etwa c-Fos und FosB im MPOA postpartaler Weibchen oder jungfräuli cher Weibchen aktiviert werden, deren Mütterlichkeit nach dem Kontakt mit Jungen induziert wird (Brown et al., 1996; Calamandrei und Keverne, 1994). Außerdem zeigten FosB-defiziente Mäuse ein beeinträchtigtes mütterliches Verhalten Brown et al., 1996). Die Anmelder untersuchten dann, ob die FosB-positiven aktivierten neuronalen Schaltkreise in Peg3βgeo-Mutanten normal sind. Das Immunfärben mit FosB-Antikörper ergab, dass FosB-positive neuronale Zellen in den jungfräulichen Mutanten nach Kontakt mit Jungen in einem Ausmaß zunahmen, das mit dem Wildtyp vergleichbar ist. Somit schien dieser neuronale Schaltkreis durch die Peg3βgeo-Mutation nicht beeinflusst zu sein. Im Gegensatz zur FosB-Induktion wies β-gal-Einfärbung von Mutantengehirn-Cryo-Schnitten ein Muster auf, das jenem der Peg3-Expression ähnelt; außerdem traten keine deutlichen Veränderungen nach der durch die Jungen induzierten mütterlichen Aufmerksamkeit auf. Ferner konnte man keine deutliche anatomische Anomalie in den Mutantengehirnen während dieser Studien feststellen.
  • Reduzierte Oxytocin-produzierende Zellen in Peg3βgeo-Mutantenmüttern
  • Die Jungen von Mutantenmüttern nahmen während der Fütterungszeit weniger Gewicht zu als jene von Weibchen des Wildtyps. Dies könnte das Ergebnis eingeschränkter mütterlicher Aufmerksamkeit (s.o.) und/oder eines Laktationsproblems in den weiblichen Mutanten sein. Um diese Möglichkeiten zu untersuchen, maßen die Erfinder den Gewichtszuwachs der Jungen dieser Weibchen. Nach 2-stündiger Trennung von den Jungen waren die Mutantenmütter langsamer, die Verhaltensweise des Kauerns über die Jungen an den Tag zu legen als Mütter des Wildtyps (15,3 im Vergleich zu 8,7 min, p < 0,004). Die Jungen der Weibchen des Wildtyps nahmen nach 6 h und nach 24 h zu. Im Gegensatz dazu nahmen die Jungen der Mutanten nicht nach 6 h, sondern erst nach 24 h zu. Da alle Jungen 1 h nach der Trennung an den Zitzen hingen, muss die nicht erfolgte Gewichtszunahme in der zweiten Gruppe auf das Laktationsproblem in den weiblichen Mutanten zurückzuführen sein.
  • Die weiblichen Mutanten schienen relativ normale Brustdrüsen aufzuweisen (beurteilt anhand ihrer histologischen Morphologie prä- als auch post-partum). Das Ausspritzen der Milch hängt sowohl von der Saugstimulation der Jungen als auch von der Funktion von Oxytocin ab. Es stellte sich heraus, dass sie durch Immunfärbung weni ger Oxytocin-exprimierende Zellen in ihrem Hypothalamus aufweisen als Weibchen des Wildtyps.
  • Männliches Sexualverhalten
  • Die Paarung von Männchen und Weibchen im Östrus in einem herkömmlichen 15-Minuten-Interaktionstest zeigte keine signifikante Differenz zwischen Peg3-Männchen und 129 Kontrolltieren. Als jedoch ein jungfräuliches Männchen in einen großen Käfig mit 5 Weibchen gesteckt wurde (nur eines davon war im Östrus), ergaben sich signifikante Unterschiede im Verhalten der männlichen Mutanten und der 129 Kontrolltiere. Die männlichen Mutanten zeigten Interesse an den Weibchen, aber sie konnten das Weibchen im Östrus viel langsamer identifizieren und Sexualverhalten initiieren.
  • Latenzperiode bis zum Besteigen (min)
    Figure 00310001
  • Körpergewicht und Füttern
  • Der Gesamtfutterverbrauch, Gewichtszuwachs und rektale Temperaturwert wurden in Gruppen transgener Mäuse und Kontrolltiere untersucht. Die Kontrollgruppe (5 Tiere) und Mutantengruppe (6 Tiere) waren hinsichtlich des Alters (17 Monate) und Geschlechts (männlich) aufeinander abgestimmt. Die Tiere wurden über eine Dauer von 16 Wochen kontrolliert. Ihr Gewicht, Futterverbrauch und rektaler Temperaturwert wurden in wöchentlichen Intervallen aufgezeichnet. Dies führte zu einem deutlichen Gewichtszuwachs im Vergleich zur Kontrollgruppe (p > 0,003), während gleichzeitig der Futterverbrauch durch die Tiermutanten niedriger war als durch die Kontrolltiere. Die Kern- bzw. Rektaltemperatur der Mäusemutanten war auch signifikant niedriger als jene in den Kontrolltieren (p > 0,005).
  • Literaturverweise:
    • Nehls, M., et al (1994) Biotechniques 17, 770–775
    • Li, E., et al (1993) Nature 366: 362–365
    • Robertson, E. J., (1987) Teratocarcinoma and embryonic stem cells: A parctical approach., IRL, Oxford University Press, UK
    • Joyner, A. L., Ed (1993) Gene targeting. A practical approach. IRL Press, Oxford University Press, Oxford, UK
    • Nagy, A., et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8424–8428
    • Hogan, B., et al (1994) Manipulating the mouse embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
    • Yeo J. A. G. and Keverne, E. B., (1986) Physiol-Behav. 37, 23–26
    • Mountford, P. S. and Smith, A. G., (1995) Trends-Genet. 1995:11:179–184
    • Numan-M. and Numan-MJ., (1994) Behav-Neurosci. 1994 109: 379–394
    • Numan, M.,(1994) Acta Paediatr Suppl 397: 19–28 996) Cell 86: 297–309
    • Brown et al., (1996) Cell 86: 297–309
    • Calamandrei, G. and Keverne, E. B., (19994) Behav-Neurosci. 1994 Feb: 108(1): 113–120

Claims (10)

  1. Verfahren zur Prüfung eines mutmaßlichen Modulators für Körpergewicht oder Wärmeregulierung, umfassend das Verabreichen dieses mutmaßlichen Modulators an entweder (a) ein transgenes nichtmenschliches Tier, das eine inaktive Kopie des Peg3-Gens als Ergebnis einer genetischen Modifikation umfasst, oder (b) ein transgenes nichtmenschliches Tier, das Peg3 in einer Menge exprimiert, die größer als jene der Wildtyps ist, und die Bestimmung des Einflusses des mutmaßlichen Modulators auf das Körpergewicht oder die Wärmeregulierung des nichtmenschlichen Tiers.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Einfluss auf das Körpergewicht bestimmt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Einfluss auf die Wärmeregulierung bestimmt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Tier ein Nagetier ist.
  5. Verwendung eines transgenen nichtmenschlichen Tiers, das ein inaktives oder modifiziertes Peg3-Gen als Ergebnis einer genetischen Modifikation umfasst, wobei das Tier eine im Vergleich zu einer Wildtyp-Kontrolle veränderte Wärmeregulierung und/oder Gewichtsregulierung aufweist, bei der Prüfung eines mutmaßlichen Modulators des Körpergewichts und/oder der Wärmeregulierung.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Peg3-Gen inaktiv ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, worin das Peg3-Gen eine Mutation umfasst.
  8. Verwendung eines transgenen nichtmenschlichen Tiers, das Peg3 in größerer Menge als die Wildtypmenge exprimiert, wobei das Tier eine im Vergleich zu einer Wildtyp-Kontrolle veränderte Wärmeregulierung und/oder Gewichtsregulierung auf weist, bei der Prüfung eines mutmaßlichen Modulators des Körpergewichts und/oder der Wärmeregulierung.
  9. In-vitro-Verfahren zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen einem Peg3-Genotyp bei menschlichen oder tierischen Subjekten und Fettleibigkeit oder anomaler Wärmeregulierung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Analyse der Peg3-Nucleinsäure in einer Nucleinsäureprobe, die das Peg3-Gen enthält, von einer Gruppe von fettleibigen Subjekten und einer Kontrollgruppe von nichtfettleibigen Subjekten; und Bestimmung eines oder mehrerer mit dem fettleibigen Phänotyp zusammenhängender Merkmale dieser Nucleinsäure.
  10. Verfahren zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen einem Peg3-Genotyp bei menschlichen oder tierischen Subjekten und Fettleibigkeit oder anomaler Wärmeregulierung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Analyse des Peg3-Proteins in einer Körperprobe, die das Peg3-Protein enthält, von einer Gruppe von fettleibigen Subjekten und einer Kontrollgruppe von nichtfettleibigen Subjekten; und Bestimmung eines oder mehrerer mit dem fettleibigen Phänotyp zusammenhängender Merkmale dieses Proteins.
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