DE69233477T2 - Transgene nicht-menschliche tiere ohne prionprotein - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung bezieht sich auf transgene, nicht-menschliche Säugetiere und Vögel („Tiere"), die aufgrund des Fehlens von endogenem Prionenprotein („PrP") nicht empfänglich gegenüber spongiformen Enzephalopathien (d.h. Scrapies-ähnliche oder Prionenkrankheiten) sind. Genauer gesagt bezieht sich diese Erfindung auf Target-Moleküle, die in der Lage sind, PrP-Gene zu zerstören, auf PrP-Gene, die durch solche Target-Moleküle zerstört worden sind und daher unfähig sind, funktionales Prionenprotein zu exprimieren, auf Kulturzellen, die transformiert sind, so dass sie solche zerstörten Gene aufweisen, auf nicht-menschliche Säugetiere und Vögel, die aus diesen transformierten Zellen abgeleitet worden sind, und auf die transgenen Nachkommen solcher Tiere.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Prionen sind infektiöse Pathogene, die in Menschen und Tieren spongiforme Enzephalopathien verursachen. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Die vorherrschende Hypothese ist zur Zeit die, dass für die Infektiosität des Prionenproteins kein Nukleinsäure-Bestandteil notwendig ist.
  • Kuru, die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ("CJD") und das Gerstmann-Strussler-Scheinker-Syndrom ("GSS") sind tödliche, menschliche neurodegenerative Krankheiten, die durch Prionen verursacht werden. Scrapie bei Schafen und Ziegen ist die am besten untersuchte Prionen-Krankheit. Bovine Spongiforme Enzephalopathie ("BSE" oder "Rinderwahnsinn") ist eine Prionen-Krankheit, die derzeit die Rindfleischindustrie in Großbritannien bedroht. Die übertragbare Nerz-Enzephalopathie und die chronische Erschöpfungskrankheit bei Hirschen und Elchen werden auch für Prionen-Krankheiten gehalten. Die pathologischen Eigenschaften von Prionen-Krankheiten umfassen neuronale Vakuolisierung, astrocytische Gliose und amyloide Plaques mit Filamenten, die aus Prionenproteinen zusammengesetzt sind.
  • Ein wesentlicher Schritt bei der Untersuchung von Prionen und den Krankheiten, die diese verursachen, war die Entdeckung und Reinigung eines Proteins, das als Prionenprotein („PrP") bezeichnet wurde (Bolton et al., Science 218, pp. 1309–11 (1982); Prusiner et al., Biochemistry 21, pp. 6942–50 (1982); McKinley et al., Cell 35, pp. 57–62 (1983)). Seither wurden vollständige Prionenprotein-kodierende Gene kloniert, sequenziert und in transgenen Tieren exprimiert. PrPC wird durch ein in einfacher Kopie vorliegendes Wirtsgen codiert (Basler et al. Cell 46, pp. 417–28 (1986)), und wird normalerweise auf der äußeren Oberfläche von Neuronen vorgefunden. Eine führende Hypothese ist die, dass Prionen-Krankheiten durch die Umwandlung von PrPC in eine modifizierte Form, die als PrPSc bezeichnet wird, entstehen.
  • Die eigentliche biologische oder physiologische Funktion von PrPC ist nicht bekannt. Vorschläge, dass dieses mit der Acetylcholin-Rezeptor-Induzierenden Aktivität ("ARIA") identisch ist, müssen noch bestätigt werden (Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, pp. 7664–68 (1991)). Das PrP-Gen wurde jedoch in allen bislang untersuchten Säugetieren gefunden, so z.B. in Hamster (Basler et al., Cell 46, pp. 417–28 (1986)), Maus (Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 6372–76 (1986)), Mensch (Kretzschmar et al., DNA 5, 315–24 (1986); Puckett et al., Am. J. Hum. Genet. 49, 320–29 (1991)), Ratte (Westaway und Prusiner, Nucl. Acids Res. 14, 2035–44 (1986)), Rind (Goldmann et al., J.Gen.-Virol. 72 pp. 201–04 (1991)), Schaf (Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, pp. 2476–80 (1990)), und Ziege (Westaway und Prusiner, oben). Das PrP-Gen wurde auch in Hühnern gefunden (Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, pp. 7664–68 (1991)).
  • Außerdem scheint es, da PrPC sowohl in Nervenzellen des Gehirns (Kretzschmar et al., Am. J. Pathol. 122, pp. 1–5 (1986)) als auch in Lymphozyten exprimiert wird (Cashman et al., Cell 61, pp. 185–92 (1990)) und eine hohe Umsatzrate zeigt (Caughey et al., J. Virol. 63, pp. 15–81 (1989); Borchelt et al., J. Cell. Biol. 110, pp. 743–52 (1990)), dass dieses eine wesentliche physiologische Rolle spielt.
  • Die zentrale Rolle des PrPC in Scrapies-ähnlichen Erkrankungen wird durch verschiedene Hinweislinien angedeutet. Das infektiöse Agens wird zusammen mit PrPSc durch verschiedene Verfahren aufgereinigt (Prusiner, Science 216, pp. 136–44 (1982); Diringer et al., Nature 306, pp. 476–78 (1983); McKinley et al., Cell 35, pp. 57–62 (1983); Hope et al., EMBO J. 5, pp. 2591–97 (1986)), einschließlich Affinitätsreinigung auf einer anti-PrP Antikörpersäule (Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, pp. 6617–21 (1988)), SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, pp. 7240–44 (1990)) und HPLC (Safar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, pp. 6373–77 (1990)).
  • Weiterhin wird die Empfänglichkeit eines Wirtes gegenüber Scrapie zumindest teilweise durch die Beschaffenheit seiner Prn-p-Allele bestimmt (Dickinson et al., J. Comp. Pathol. 78, pp. 293–99 (1968); Dickinson und Meikle, Mol. Gen. Genet. 112, pp. 73–79 (1971); Carlson et al., Cell 46, pp. 503–11 (1986); Hunter et al., J. Gen. Virol. 68, pp. 2711–16 (1987); Carlson et al., Proc. Natl. Acad. Aci USA 86, pp. 7475–79 (1989); Race et al., J. Gen. Virol. 71, pp. 493–97 (1990); Westaway et al., Neuron 7, pp. 59–68 (1991)).
  • Schließlich stehen bestimmte Mutationen im PrP-Gen, wie z.B. ein Austausch von Prolin gegen Leucin in Position 102, eng mit einer Morbidität in einigen familiären Formen von spongiformen Enzephalopathien in Zusammenhang (Hsiao et al., Nature 338, pp. 342–45 (1989); Hsiao und Prusiner, Neuroloav 40, pp. 1820–27 (1990)).
  • Weiterhin unterliegen Mäuse, die ein PrP-Transgen mit dem analogen Aminosäure-Austausch tragen, einer spontanen, Scrapie-ähnlichen Krankheit (Hsiao et al., Science 250, pp. 1587–90 (1990)). Bislang gibt es jedoch keinen Weg, diese Krankheit zu verhindern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung löst das oben genannte Problem. Sie bezieht sich auf nicht-menschliche Säugetiere und Vögel ohne funktionale PrP-Gene, die daher frei von Prionen-Proteinen sind. Diese transgenen Tiere überleben nicht nur und entwickeln sich normal, sondern sie sind auch gegenüber Prionenkrankheiten nicht empfänglich. Genau gesagt bezieht sich diese Erfindung auf PrP-Gene, die zerstört und daher unfähig sind, Prionen-Proteine zu exprimieren, auf nicht-menschliche Säugetier- oder Vogelzellen, die mit solchen zerstören Genen transformiert worden sind, auf nicht-menschliche Säugetiere und Vögel, die aus diesen transformierten Zellen abgeleitet sind, und auf die transgenen Nachkommen solcher Tiere.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Konstruktion des Plasmids pBluescriptPrP-2 aus dem Westaway-Cosmid und dem Plasmid pBluescript.
  • 2 zeigt die Konstruktion des Plasmids pRVPrPNeoPA2 aus den Plasmiden pBluescriptPrP-2 und pMC1Neo.
  • 3 zeigt die Konstruktion des "Fragment 1" und "Fragment 2, die verwendet werden, um das Targetplasmid pRVPrP3 zu bilden.
  • 4 zeigt die Herstellung des "Fragment 3" mittels der Polymerase-Kettenreaktion ("PCR"), unter Verwendung des linearisierten pBluescript-PrP2 als Maritze. "Fragment 3" wird für die Konstruktion des Targetplasmids pRVPrP3 verwendet.
  • 5 zeigt die Konstruktion des Targetplasmids aus den Fragmenten 1–3, und die Excision des Targetfragments aus dem Targetplasmid.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet:
    kritische Stelle: Stelle (oder Stellen) in einem PrP-Gen, die für die Expression eines funktionalen Prionenproteins erforderlich sind.
    Zerstörungssequenz: Nukleotidsequenz in einem Target-Molekül, die durch ortsspezifische Integration des Target-Moleküls ein Zielgen zerstört, um so die Expression funktionalen PrP-Proteins zu unterbinden.
    ES-Zellen: embryonale Stammzellen
    Expressionskontrollsequenz: Nukleotidsequenz, die die Transkription einer Nukleotidsequenz ermöglicht und reguliert, wenn sie mit dieser wirksam verbunden ist.
    Homologe Rekombination: Neuanordnung von DNA-Abschnitten an einer Sequenz-spezifischen Stelle (oder Stellen) innerhalb oder zwischen DNA-Molekülen mittels Basenpaarungsmechanismen.
    Homologe Region: Sequenz innerhalb des Zielgen-Lokus, die ausgewählt wurde, um sie in Target-Molekül zu duplizieren, mit ausreichender Länge und Homologie, um mittels homologer Rekombination eine ortsspezifische Integration des Target-Moleküls in den Zielgen-Lokus zu ermöglichen.
    PCR: Polymerase Kettenreaktion.
    PrP: Prionenprotein.
    Prn-P: Gen, das für ein Prionenprotein codiert.
    Zielgen-Lokus: Chromosomaler Bereich des Zielgens, das die für PrP codierende Sequenz, die Kontrollsequenz für die PrP-Expression, in 3'-Richtung von PrP gelegene nicht translatierte Sequenzen sowie in 5'- und 3'-Richtung vom PrP-Gen gelegene Nachbarbereiche auf dem Chromosom enthält.
    Target-Fragment: Targetmolekül, das aus einem Fragment aus dem Target-Plasmid besteht.
    Target-Molekül: lineares oder cirkuläres DNA-Molekül, das in der Lage ist, ein PrP-Zielgen in einer transfizierten Zelle durch homologe Rekombination spezifisch zu zerstören, um so die Expression von funktionalem PrP-Protein zu unterbinden. Target-Plasmid: Zwischenstufe bei der Konstruktion des Target-Fragments
  • Der erste Schritt bei der Herstellung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren der vorliegenden Erfindung ist es, eine DNA-Sequenz („Target-Molekül") herzustellen, die geeignet ist, ein PrP-Gen in tierischen Zellen, die dieses Gen tragen, spezifisch zu zerstören und so dieses Gen disfunktional zu machen. Das Target-Molekül wird dann verwendet, um tierische Zellen zu transfizieren und die funktionalen PrP-Gene in diesen Zellen zu zerstören. Die transgenen tierischen Zellen können dann verwendet werden, um die transgenen nicht-menschlichen Säugetiere und Vögel der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • DNA-Target-Moleküle, die sich gemäß der vorliegenden Erfindung eignen, ein funktionales, in einer Zelle vorliegendes PrP-Gen zu zerstören, können mit Hilfe von wohlbekannten Informationen und Methoden aus dem Stand der Technik hergestellt werden.
  • Jedes DNA-Target-Molekül der vorliegenden Erfindung hat zwei wesentliche Funktionen. Diese wesentlichen Funktionen sind es, in ein natives, in der Zelle vorliegendes PrP-Gen (Zielgen-Lokus) zu integrieren und die PrP-Genexpression, die mit diesem Lokus im Zusammenhang besteht, so unterbinden, so dass keine funktionale PrP-Expression möglich ist. Diese beiden wesentlichen Funktionen hängen von zwei grundsätzlichen strukturellen Eigenschaften des Target-Moleküls ab.
  • Die erste grundsätzliche strukturelle Eigenschaft des Target-Moleküls ist ein Paar von Abschnitten, die homolog zu ausgewählten Abschnitten auf dem Zielgen-Lokus ist. Diese Homologie (im Bezug sowohl auf Sequenzidentität als auch Länge) bewirkt, dass sich das Target-Molekül mittels Basenpaarungsmechanismen an der ausgewählten Stelle in den Zielgen-Lokus in den transfizerten Zellen integriert.
  • Homologe Rekombination ist die Neuanordnung von DNA-Abschnitten an einer sequenzspezifischen Stelle (oder Stellen) innerhalb oder zwischen DNA-Molekülen mittels Basenpaarungsmechanismen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine besondere Form der homologen Rekombination, die manchmal als „Gen-Targeting" bezeichnet wird. Beim Gen-Targeting wird ein exogenes „Targetmolekül" (oder „Target-Fragment") in Zellen eingeführt. Das Target-Molekül hat einen oder mehrere Abschnitte, die homolog mit einem chromosomalen Gen („Zielgen") sind, das modifiziert oder ersetzt werden soll. Die homologen Abschnitte von Zielgen und Target-Molekül führen zu einer ortsspezifischen Integration der exogenen Sequenz. Natürlich kann die exogene Sequenz so gestaltet sein, dass sie einen existierenden Defekt im vorliegenden Gen korrigiert oder ein funktionales vorliegendes Gen ausschaltet („zerstört"). Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Zerstörung von PrP-Genen. Gen-Targeting, bei dem die Struktur eines spezifischen, bereits in der Zelle vorliegenden Gens beeinflusst wird, muss von anderen Arten der stabilen Transformation unterschieden werden, bei denen die Integration von fremder DNA zur Expression nicht ortsspezifisch ist, und deshalb die Struktur eines bestimmten, bereits in der Zelle vorliegenden Gens nicht vorhersagbar beeinflusst.
  • Die zweite grundsätzliche strukturelle Eigenschaft des Target-Moleküls der vorliegenden Erfindung ist eine Zerstörungs-Sequenz zwischen den homologen Abschnitten. Diese Zerstörungs-Sequenz verhindert die Expression des funktionalen Prionenproteins durch das PrP-Zielgen nach dem Austausch eines Abschnitts dieses Zielgens durch das integrierte Target-Molekül.
  • Ein Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Ausgestaltungen des Target-Moleküls gegen das PrP-Gen hergestellt werden können, die die oben angegebenen strukturellen und funktionalen Erfordernisse erfüllen. Beispiel 1 (unten) beschreibt die eigentliche Konstruktion eines Target-Moleküls gegen das PrP-Gen, das verwendet wurde, um die transgenen Mäuse der vorliegenden Erfindung herzustellen. Die folgende Diskussion legt Überlegungen und Parameter dar, die verwendet werden können, um andere Target-Moleküle gegen das PrP-Gen zu entwickeln, oder die verwendet werden können, um transgene Mäuse, Hamster, Hasen, Schafe, Schweine, Rinder, Hühner und andere Säugetiere und Vögel herzustellen, ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Parameter des Target-Moleküls, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verändert werden können, umfassen die Länge der homologen Regionen, welche Regionen des Zielgen-Lokus dupliziert werden sollen, um als homologe Regionen des Target-Moleküls zu dienen, die Länge der Zerstörungs-Sequenz, die Identität der Zerstörungs-Sequenz, und welche Sequenz des Zielgens durch das Target-Molekül ersetzt werden soll.
  • Die Länge der homologen Regionen, die die Zerstörungssequenz des Target-Moleküls der vorliegenden Erfindung flankieren, kann ohne einen wesentlichen Einfluss auf die Durchführbarkeit der Erfindung erheblich variieren. Die homologen flankierenden Regionen müssen eine ausreichende Länge aufweisen, um eine wirksame Heteroduplex-Formation zwischen einem Strang des Target-Moleküls und einem Strang eines Chromosoms einer transfizierten Zelle am PrP-Zielgen-Lokus auszubilden. Die Erhöhung der Länge der homologen Regionen fördert die Ausbildung einer Heteroduplex-Formation und damit die Effizienz des Targetings. Es wird jedoch angenommen, dass die Zunahme der Effizienz des Targetings, die sich mit jedem zusätzlichen homologen Basenpaar einstellt, schließlich zurückgeht und durch praktische Schwierigkeiten bei der Herstellung der Target-Moleküle begrenzt wird, wenn die homologen Regionen mehrere tausend Basenpaare überschreiten. Ein bevorzugter Bereich für die Länge jeder homologen Region beträgt 50 bis 5000 Basenpaare, und ungefähr 500 Basenpaare werden am meisten bevorzugt. Es sollte weiterhin angemerkt werden, dass die genaue Länge des homologen DNA-Target-Moleküls in der Praxis von der Anordnung von Restriktionsstellen im und um das PrP-Gen abhängt. Für eine Diskussion der Länge der Homologie, die für ein Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen erforderlich ist, siehe Hasty et al. (Mol. Cell Biol. 11, 5586–91 (1991)).
  • Es gibt einen ausreichenden Spielraum für die Auswahl, welche Regionen des Zielgen-Lokus als homologe Regionen im Target-Molekül dupliziert werden. Die grundsätzlichen Bedingungen sind, dass die PrP-Zielgen-Sequenz, die durch den zerstörenden Abschnitt ersetzt werden soll, zwischen den Abschnitten des Zielgen-Lokus liegen müssen, die als die homologen Regionen im Target-Molekül dupliziert wurden, und dass der Austausch der Zielgen-Sequenz das PrP-Gen disfunktional machen muß. Es sollte angemerkt werden, dass die Nukleotidsequenzen des Zielgen-Lokus, die für die Homologie in dem Target-Molekül ausgewählt wurden, nach Integration des Target-Moleküls unverändert bleiben. Diese Sequenzen des Zielgen-Lokus werden lediglich durch die duplizierten (homologen) Sequenzen im Target-Molekül ersetzt. Die Identität zwischen den ausgewählten Abschnitten des Zielgen-Lokus und den homologen Abschnitten des Target-Moleküls ist das Mittel, über welches das Target-Molekül die Zerstörungsequenz genau in das PrP-Zielgen einschleust. Die ausgewählten homologen Regionen können innerhalb der für PrP kodierenden Sequenz liegen, aber es ist nicht erforderlich, dass sie dies tun. Z.B. könnte in einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung eine homologe Region in 5'-Richtung vom PrP-Gen liegen, und die andere Promotorregion könnte in 3'-Richtung vom PrP-Gen liegen. Bevorzugt werden das PrP-Startcodon und der 5'-terminale Bereich der für PrP kodierenden Sequenz zwischen den ausgewählten homologen Regionen liegen und so durch die Zerstörungssequenz ersetzt werden, so dass kein Bereich des Prionenproteins exprimiert werden kann. Noch bevorzugter ist es, dass es, wenn die Zerstörungssequenz einen selektierbaren Marker (oder jedes andere Gen) enthält, ein Stopcodon gibt, das stromabwärts der für den Marker minimal erforderlichen codierenden Sequenz und im selben Leseraster wie die für den Marker kodierende Sequenz angeordnet ist, um so eine durchgängige Translation zu verhindern, die zu einem PrP-Fusionsprotein mit PrP-Aktivität führen könnte. Aus praktischen Gründen ist neben der Bedingung, dass eine kritische Stelle des PrP-Gens zwischen den homologen Abschnitten liegen muss (so dass es zerstört wird), die hauptsächliche Bedingung für die Auswahl der homologen Abschnitte die Verfügbarkeit der klonierten Ssequenzen und das Vorhandensein von Restriktionsstellen in diesen Sequenzen. Bevorzugt werden die Abschnitte, die als homologe Abschnitte ausgewählt werden, keine Sequenzen enthalten, die länger als ungefähr 20 Nukleotide sind, und von denen bekannt ist, dass sie anderswo in dem Genom, das modifiziert werden soll, vorkommen. Eine weitreichende Homologie zwischen dem Targetmolekül und anderen (nicht Ziel-) Stellen im Genom könnte die Targeting-Effizienz vermindern, indem Targetmoleküle zu nicht-produktiven Heteroduplices an nicht-Ziel-Stellen geleitet werden.
  • Die Länge der Zerstörungssequenz, die die homologen Regionen des Target-Moleküls trennt, kann ohne einen erheblichen Effekt auf die Durchführbarkeit der vorliegenden Erfindung ebenfalls variieren. Die Mindestlänge der Zerstörungssequenz beträgt ein Basenpaar. Die Insertion eines einzigen Basenpaars in die kodierende Sequenz für PrP würde zu einer Leseraster-Verschiebungs-Mutation führen und könnte so die Expression eines funktionalen Prionenproteins verhindern. Alternativ könnte die Substitution eines einzigen Basenpaars zur Substitution einer Aminosäure an einer kritischen Stelle im Prionenprotein und lediglich zur Expression eines disfunktionalen Prionenproteins führen. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass der Austausch eines einzigen Basenpaars durch spontane Mutation einer Reversion zur Wildtyp-Sequenz unterliegen kann. Aus diesem Grund ist die Zerstörung von Sequenzen, die länger sind als ein Basenpaar, bevorzugt. Auf der anderen Seite wäre es unwahrscheinlich, dass die übermäßige Länge einer Zerstörungssequenz einen Vorteil gegenüber einer Zerstörungssequenz mit gemäßigter Länge verleiht, und sie könnte die Wirksamkeit der Transfektion oder des Targetings verringern. In diesem Zusammenhang ist eine übermäßige Länge viele Male länger als der Abstand zwischen den ausgewählten homologen Regionen auf dem Zielgen. Eine bevorzugte Länge der Zerstörungssequenz liegt zwischen 2 und 2000 Basenpaaren. Eine noch bevorzugtere Länge der Zerstörungssequenz ist eine Länge, die ungefähr dem Abstand zwischen den Regionen auf dem Zielgen-Lokus, die zu den homologen Regionen aus dem Target-Molekül passen, entspricht.
  • Es gibt einen weiten Spielraum für die Auswahl der Zerstörungssequenz, da die zerstörende Funktion nicht sequenzspezifisch ist. Es ist erforderlich, dass die Nukleotidsequenz der zerstörenden Region kein funktionales Prionenprotein exprimiert, und kein Protein oder Polypeptid exprimiert, das gegenüber der transformierten Zelle toxisch ist. Es ist außerdem bevorzugt, dass die Zerstörungssequenz nicht übermäßig homolog gegenüber Stellen im Genom der transfizierten Zelle ist. Eine solche Homologie würde wahrscheinlich die Effizienz des Target-Moleküls vermindern, und seine Funktion schwer beeinträchtigen.
  • Für einige Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Zerstörungssequenz eine doppelte Funktion hat, das heißt, dass sie sowohl ein selektierbarer Marker als auch eine Zerstörungssequenz ist. In diesen Ausgestaltungen wird die Länge und die Identität der Zerstörungssequenz im Wesentlichen durch die kodierende Sequenz und die angegliederten Expressions-Kontrollsequenzen des detektierbaren Markers bestimmt. Das Gen für den selektierbaren Marker ermöglicht eine positive Selektion von transfizierten Zellen, die das Target-Molekül aufgenommen und integriert haben. Der Bedarf eines selektierbaren Markers hängt von den Verfahren ab, die für die Transfektion der Zellen und die Produktion der transgenen Tiere ausgewählt wurden. Die Auswahl dieser Verfahren hängt wiederum von der Tierart ab, an welcher diese Erfindung ausgeführt wird. Z.B. weist ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von transgenen Vögeln (unten beschrieben) keinen selektierbaren Marker auf. In einem anderen Beispiel (Beispiel 1 und 2 unten) umfasst ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von transgenen Mäusen murine ES-Zellen, und ein bevorzugtes Verfahren für die Transfektion von ES-Zellen ist die Elektroporation, bei welcher ein selektierbar Marker bevorzugt wird. Der bevorzugte selektierbare Marker ist das antibiotische Resistenzgen Neomycin-Phosphotransferase („Neo"). Ein Neo-Gen mit Expressions-Kontroll-Sequenzen eines Säugetiers ist käuflich erhältlich (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Obwohl Neo für die Selektion von Säugetier-Zellen bevorzugt wird, können auch andere Markergene wie Thymidinkinase, Dihydrofolat-Reductase, Hygromycin B-Phosphotransferase, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Adenosindeaminase, Asparaginsynthetase und CAD (Carbamyl-Phosphat-Synthetase/Aspartat-Transcarbamylase/Dihydroorotase) zusammen mit geeigneten Kulturmedien verwendet werden.
  • Im Plasmid pRVPrP3, das in Beispiel 1 und den 1–5 gezeigte Target-Plasmid der vorliegenden Erfindung, wurden 72% (Codons 4 bis 187) der für PrP codierenden Sequenz durch ein Fragment ersetzt, das ein Neo-Gen unter der Kontrolle des HSV TK Promoters enthält (Thomas und Capecchi, Cell 51, pp. 503–12 (1987)).
  • In dieser Diskussion wird das Target-Molekül als ein lineares DNA-Molekül beschrieben. Es sollte jedoch beachtet werden, dass ein Target-Molekül der vorliegenden Erfindung auch als ein zirkuläres DNA-Molekül ausgestaltet sein könnte. Ein zirkuläres Target-Molekül könnte ein Paar homologe Regionen aufweisen, die durch eine zerstörende Region getrennt sind, so wie es für ein lineares Target-Molekül beschrieben ist. Alternativ könnte ein zirkuläres Target-Molekül eine einzige homologe Region aufweisen. Bei Integration im Zielgen-Lokus würde das zirkuläre Molekül linearisiert werden, und einen Bereich der homologen Region an jedem Ende aufweisen. Auf diese Weise werden aus der einzigen homologen Region praktisch zwei homologe Regionen, wie in der Diskussion linearer Target-Moleküle beschrieben ist (siehe Watson et al., Molecular Biology of the Gene (4. Auflage), Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, p. 606). Ein unterscheidender Aspekt eines zirkulären Target-Moleküls mit einer einzigen homologen Region ist der, dass dieses die Zerstörungssequenz in das Zielgen inseriert und dieses zerstört, ohne irgendeinen Teil des Zielgens zu ersetzen. Ein zweiter unterscheidender Aspekt ist der, dass die einzige homologe Region innerhalb des Zielgens liegen muss und zumindest in 5'-Richtung zu einer kritischen Stelle in der für PrP kodierenden Sequenz liegen muss.
  • Die obige Diskussion konzentriert sich auf die Zerstörung von PrP-Genen durch homologe Rekombination zur Bildung von nicht-menschlichen transgenen Tieren ohne Prionenproteine – die bevorzugte Ausgestaltung. In einer anderen Ausgestaltung liefert die vorliegende Erfindung jedoch auch heterozygote nicht-menschliche Tiere mit einem Gen, das für Prionenprotein codiert. Solche Tiere sind zumindest teilweise gegen Scrapie geschützt. Sie produzieren Prionenproteine, jedoch auf einem erniedrigten Niveau, und zwar aufgrund des Gendosis-Effekts (Wildtyp-Tiere haben zwei Prionengene). Und dieses erniedrigte Prionenprotein-Niveau verleiht eine wesentliche Resistenz gegen spongiforme Enzephalopathie.
  • Die Absenkung des Prionenprotein-Niveaus ohne Zerstörung des PrP-Gens ist daher ein alternatives Mittel zur Bildung einer Resistenz gegen spongiforme Enzephalopathie. Ein Fachmann kann z.B. durch Anwendung wohlbekannter Antisense-Techniken die Prionenprotein-Niveaus vorteilhaft reduzieren. Antisense-Techniken können z.B. in einem von zwei verschiedenen Ansätzen verwendet werden.
  • Der erste Antisense-Ansatz ist die Herstellung von nicht-menschlichen transgenen Tieren, deren Zellen Prionen-Antisense-Sequenzen transkribieren. Der zweite Antisense-Ansatz ist die therapeutische Verabreichung von Antisense-Oligonukleotiden an nicht-transgene Tiere und Menschen, die eine beginnende spongiforme Enzephalopathie haben.
  • Ribozyme sind RNA-Moleküle mit Endoribonuklease-Aktivität. Ribozym-Sequenzen können mit Antisense-Sequenzen kombiniert werden, um die Produktion eines bestimmten Proteins spezifisch zu inhibieren. Ein durchschnittlicher Fachmann kann Prionenprotein-Niveaus vorteilhaft reduzieren, indem er Ribozym-Sequenzen mit Prionen-Antisense-Sequenzen kombiniert, wodurch die Endoribonuklease-Aktivität spezifisch gegen die Prionen-mRNA gerichtet wird, um so die Biosynthese von Prionenprotein zu inhibieren.
  • Ein solches Prionen-Antisense-Ribozym-RNA-Molekül kann indirekt durch Transkription eines rekombinanten DNA-Konstrukts in den Zellen von transgenen nicht-menschlichen Tieren bereitgestellt werden. Alternativ kann ein solches Prionen-Antisense-Ribozym-RNA-Molekül direkt durch therapeutische Verabreichung des RNA-Moleküls an nicht-transgene Tiere oder Menschen bereitgestellt werden. Für eine grundsätzliche Diskussion der Ribozym-Techniken siehe unter anderem: Cech, "Ribozymes and Their Medical Implications", J. American Medical Association, vol. 260, pp. 3030–34 (1988); Haseloff und Gerlach, "Simple RNA Enzymes with New and Highly Specific Endoribonuclease Activities", Nature, Vol. 334, pp. 585–91 (1988).
  • Aus der obigen Diskussion sollte erkennbar sein, dass die Durchführung der vorliegenden Erfindung einen DNA-Klon erfordert, der zumindest einen Bereich des PrP-Zielgens aufweist, oder DNA-Klone, die Sequenzen aufweisen, zwischen denen zumindest ein Bereich des PrP-Zielgens liegt. Solche DNA-Klone, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung erforderlich sind, können mit einer Vielzahl von Mitteln erhalten werden. Maus- (Locht et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, pp. 6372–76 (1986)), Hamster- (Basler et al., Cell, 46, pp. 417–28 (1986)), Schaf- (Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, pp. 2476–80 (1990)), Rind- (Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72, pp. 201–04 (1991)) und Mensch-PrP-Gene (Kretzschmar et al., DNA 5, pp. 315–24 (1986)) wurden kloniert und sequenziert. DNA-Klone, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung mit diesen Arten geeignet sind, können erhalten werden, indem die in den oben zitierten Publikationen dargestellten Verfahren zur Klonierung von PrP-Genen befolgt werden, durch Verwendung der darin publizierten Sequenzen zur chemischen Synthese der PrP-Gene oder Abschnitten daraus, oder durch Verwendung der publizierten Sequenzen für die chemische Synthese von Oligonukleotid-Sonden, die in wohlbekannten Verfahren verwendet werden können, um PrP- Gensequenzen aus einer cDNA-Library oder einer genomischen Library zu isolieren. Die publizierten Nukleotidsequenzen eines PrP-Gens einer Spezies können verwendet werden, um ein PrP-Gen aus einer anderen Spezies zu erhalten, ohne unangemessene Experimente durchzuführen, da die Nukleotidsequenzen aller bekannten für PrP kodierenden Regionen hochkonserviert sind (80%–90% identisch). Zusätzlich sind sogar die nicht translatierten 3'-gelegenen Regionen in Hamstern, Schafen und Menschen konserviert. Die Verwendung einer PrP-Gensequenz aus einer Sequenz zur Isolation eines PrP-Gens aus einer anderen Spezies wurde durch Goldmann et al. (siehe oben) demonstriert, die ein PrP-Gen aus Schaf isolierten, indem sie eine genomische Schaf-Library mit einer PrP-cDNA von Hamster screenten.
  • Die bevorzugte Methode zur Gewinnung einer klonierten PrP-Gensequenz ist:
    • (a) Verwendung von publizierten PrP-Gensequenz-Daten zur Synthese von Oligonukleotid-Primern (die die Enden des gewünschten DNA-Fragments darstellen) unter Verwendung bekannter Techniken, und
    • (b) Verwendung der in (a) hergestellten Primer in bekannten PCR-Verfahren, wobei DNA aus der interessierenden Tierspezies als Matritze dient.
  • DNA-Target-Moleküle, die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden, um PrP-Gene zu zerstören, können verwendet werden, um tierische Zellen mit wohlbekannten Techniken zu transfizieren. Eine solche Transfektion führt zu den DNA-Sequenzen dieser Erfindung, die die funktionalen PrP-Gene in diesen tierischen Zellen zerstören. Der Zelltyp, der für die Transfektionen mit dem Target-Molekül gegen PrP ausgewählt wird, muss pluripotent sein. Die definierende Eigenschaft von pluripotenten Zellen ist eine entwicklungsmäßige Plastizität, die für die Produktion eines nicht-menschlichen transgenen Tieres erforderlich ist. Nicht-menschliche pluripotente Zellen sind beispielsweise Oocyten, Spermien und embryonale Zellen. Oocyten und embryonale Zellen werden für die Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Die Tier-Spezies ist ein wesentlicher Faktor für die Auswahl des für die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendeten pluripotenten Zelltyps. Z.B. sind ES-Zellkulturen noch nicht für alle Spezies vollständig entwickelt.
  • Einzellige Embryos (auch als Zygoten bezeichnet) werden für die Transfektion und Produktion von transgenen, nicht-menschlichen Säugetieren, wie z.B. Schweinen, Schafen und Rindern, bevorzugt. Einzellige Embryos werden entweder chirurgisch gewonnen oder durch in vitro-Fertilisation hergestellt. Embryonale Stammzellen, die in Kultur gehalten werden, werden für die Produktion von transgenen kleinen Säugetieren, wie z.B. Mäusen und Hamstern, bevorzugt. Embryonale Zellen eines frisch gelegten Eis werden für die Produktion von transgenen Vögeln, wie z.B. Hühnern, bevorzugt.
  • Die Methode von Krimpenfort et al. (Bio/Technology 9, pp. 844–47 (1991)) wird für die Herstellung von transgenen Rindern und anderen großen Säugetieren gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Bei dieser Methode werden unreife Oocyten durch Aspiration von Follikeln aus Ovarien geschlachteter Tiere gesammelt. Die Oocyten werden mit Standardmethoden in vitro befruchtet. Das DNA-Target-Molekül wird mittels Mikroinjektion nach einem geeigneten Zeitintervall nach Oocyten-Befruchtung (zwischen 16 und 23 Stunden bei Rindern) in den Pronukleus des einzelligen Embryos eingebracht. Für die Mikroinjektion von bovinen Zygoten wird wegen deren Undurchsichtigkeit Differentialinterferenzkontrast-Mikroskopie bevorzugt.
  • Die Embryos werden über einen geeigneten Zeitraum nach der Mikroinjektion (neun Tage bei Rindern) kultiviert und werden dann bezüglich Entwicklung und normalem Erscheinungsbild bewertet. Ein nicht-menschliches Tier, dessen Östrus am selben Tag begann, an dem die Oocyten befruchtet wurden, wird als Empfänger für ein oder zwei kultivierte Embryonen, die sich zu dem kompakten Morula- oder Blaustulastadium entwickelt haben, verwendet.
  • In einem alternativen Mikroinjektions-Einsatz zur Herstellung von nicht-menschlichen transgenen Säugetieren, einschließlich Schafen und Rindern, werden frühe Embryos chirurgisch aus den Eileitern superovulierender, künstlich besamter Säugetiere gewonnen, einer Mikroinjektion mit dem PrP-Target-Molekül unterzogen, und zurück in das Spender-Weibchen oder ein anderes physiologisch empfängliches Weibchen zur Austragung übertragen (Ebert et al., Bio/Technology 9, pp. 835–38 (1991)). Die Verwendung von Embryos, die durch in vivo-Fertilisation gewonnen wurden, kann eine geringfügig höhere Anzahl an transgenen Tieren pro Embryo liefern, aber die Methode ist arbeitsintensiver als die oben beschriebene Methode von Krimpenfort et al. Für eine Diskussion der chirurgischen Techniken, die verwendet werden, um einzellige Embryos aus Schafen zu gewinnen, siehe die PCT-Veröffentlichung WO 90/08832.
  • ES-Zellkultur kann verwendet werden, um transgene, nicht-menschliche Tiere der vorliegenden Erfindung ohne Mikroinjektion herzustellen. Für eine Diskussion über die Kultur von ES-Zellen und deren Verwendung für die Herstellung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren siehe die PCT-Veröffentlichung WO 90/0154. ES-Zellen werden für die Herstellung von kleinen transgenen Säugetieren mit kurzen Generations-Intervallen und großen Wurfgrößen bevorzugt. Generations-Intervall und Wurfgröße sind Faktoren, die berücksichtigt werden müssen, weil die ES-Zell-Methode chimäre Tiere liefert. Vorteile der ES-Zell-Methode sind, dass ES-Zellen in großer Anzahl in Kultur gehalten werden können, und sie können wirkungsvoll mittels Standard-Elektroporations-Techniken transformiert werden. Nach der Elektroporation werden die transformierten ES-Zellklone durch Verwendung einer positiven Selektion auf ein Markergen innerhalb des DNA-Target-Moleküls isoliert. Vor Verwendung für die Herstellung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren werden die ausgewählten ES-Zellklone auf die Anwesenheit von zerstörten PrP-Genen hin analysiert. ES-Zellen aus einem Klon, bei dem festgestellt wurde, dass er ein zerstörtes PrP-Gen aufweist, werden in kultivierte Blastozyten injiziert. Nach der Implantation der Blastozyten in utero werden die ES-Zellen Teil des Embryo und führen zu chimären Tieren. In den chimären, nicht-menschlichen Tieren sind nur die Körpergewebe, die auf die transgenen ES-Zellen zurückgehen, transgen. Allerdings übertragen transgene Keimzellen das Transgen gemäß normaler Vererbungsprinzipien auf die Nachkommen.
  • Fusion mit bakteriellen Protoplasten, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion und DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion wurden verwendet, um fremde DNA in Säugetier-Zellen einzuführen. Obwohl diese Methoden in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind sie nicht bevorzugt.
  • Herstellung transgener Vögel
  • Transgene Vögel wurden hergestellt (Salter et al., Virology, 157, pp. 236–40 (1987); Bosselman et al., Science 243, 533–35 (1989); Europäische Patentveröffentlichung 0424044A1). Allerdings macht die Vogel-Anatomie und -Physiologie die Manipulation und Kultur des frühen Embryos unmöglich. Daher sind Techniken wie die direkte Mikroinjektion des Pronukleus einzelner Zellen oder die Elektroporation von ES-Zellen, die für Säugetier-Systeme bevorzugt werden, für Vogel-Systeme nicht geeignet. Für die Durchführung der vorliegenden Erfindung in Vogel-Systemen wird die unten beschriebene Methode von Bosselman et al. bevorzugt.
  • Obwohl der Embryo von frisch gelegten, fruchtbaren Vogeleiern eine erhebliche Entwicklung vollzogen hat, ist er weiterhin pluripotent. Die Injektion eines modifizierten Vogel-Leukosevirus, der die fremde DNA („Transgen") trägt, in den Eidotter in die Nähe des Embryos führt zu einer Infektion embryonaler Zellen und zu einer Integration des Transgens in das Genom dieser Zellen. Die resultierenden Vögel (Generation „G-0") sind Chimären und tragen das Transgen in ihren Keimzellen mit ausreichender Häufigkeit. Anschliessend wird ein genetisches Screening der G-0-Vögel, gefolgt durch konventionelle Tierzucht und Testen der Nachkommen, durchgeführt, um Vögel zu erhalten, die für das Transgen homozygot sind. Das bevorzugte Verfahren für die Herstellung von transgenen Vögeln ohne PrP-Gene umfasst:
    • (1) Einschleusen des DNA-Target-Fragments in einen von einem Retrovirus abgeleiteten Vogelvektor durch konventionelle rekombinante DNA-Techniken,
    • (2) Injektion des das Target-Fragment tragenden Retrovirus in das Eidotter eines frisch gelegten fruchtbaren Eis in der Nähe des Embryos,
    • (3) Screening frisch geschlüpfter Küken (G-0) auf integrierte provirale/Target-Fragment DNA (z.B. durch ein Dot-Blot-Verfahren),
    • (4) Verfahren virämischer männlicher G-0-Vögel, die in Schritt (3) ausgewählt wurden, mit spezifischen, pathogen-freien Weibchen,
    • (5) Screening von Küken (Generation "G-1"), die in Schritt (4) hergestellt wurden, auf integrierte provirale/Target-Fragment DNA,
    • (6) Verpaaren von G-1-Vögeln miteinander, und
    • (7) Screening von Küken (Generation "G-2"), die in Schritt (6) hergestellt wurden, auf ortsspezifische Integration des Target-Fragments (z.B. durch PCR-Techniken oder Southern-Hybridisierungsanalyse).
  • Die obige Disussion konzentriert sich auf die Unterscheide zwischen der Herstellung transgener Säugetiere und transgener Vögel. Es sollte erkennbar sein, dass die Durchführung der vorliegenden Erfindung an Vogelspezies ein geeignetes kloniertes PrP-Gen zur Herstellung des Target-Fragments erfordert. Ein solches Gen kann mittels konventioneller rekombinanter DNA-Techniken, einschließlich der Verwendung von publizierten partiellen Aminosäure-Sequenzen von Hühner-PrP zur Synthese von Oligonukleotid-Sonden für das Screening einer Vogel-DNA-Library, erhalten werden. Eine andere Methode zur Gewinnung eines Vogel-PrP-Gens umfaßt das Screening einer Vogel-DNA-Library mit einem Fragment eines vorher klonierten Säugetier-PrP-Gens. Ein Fachmann wird außerdem erkennen, dass, da bei der oben beschriebenen Methode zur Herstellung eines transgenen Vogels kein Antibiotikaresistenz-Marker verwendet wird, die Zerstörungssequenz, die bei der Konstuktion des Target-Moleküls in das klonierte PrP-Gen inseriert wird, kein Antibiotikaresistenz-Gen sein muß.
  • Im Hinblick auf das obige sollte erkennbar sein, dass die Durchführung dieser Erfindung nicht auf eine bestimmte Tierspezies, auf einen bestimmten pluripotenten Zelltyp für die Transformation durch die fremde DNA oder auf eine bestimmte Technik zur Einführung fremder DNA in die pluripotente Zelle beschränkt ist. Der Fachmann kann leicht Zellkulturen und DNA-Einführungssysteme auswählen, die für die Tierspezies geeignet sind.
  • Die Maus ist ein geeignetes Modellsystem für die vorliegende Erfindung. Zusätzlich zu den offensichtlichen günstigen Kosten für das Füttern und die Haltung, die mit der Verwendung von kleinen Säugetierarten einhergehen, sind die große Wurfgröße und die kurze Schwangerschaftsperiode wichtige Erwägungen für das schnelle Fortschreiten der Erfindung. Darüber hinaus hat die experimentelle Übertragung von Scrapie auf Mäuse und Hamster (Chandler, Lancet 1, pp. 1378–79 (1961); Zlotnik und Rennie, J. Comb. Pathol. 75, pp. 147–57 (1965)) ein wertvolles Labormodell für die Bestimmung der Eigenschaften des infektiösen Agenz und für die Untersuchung der Krankheit bereitgestellt. Während die unten ausgeführten Beispiele Experimente wiedergeben, die aus den eben genannten Gründen an Mäusen durchgeführt wurden, wurde die Gentransfer-Technik, die für die Durchführung dieser Erfindung erforderlich ist, bereits auf kommerziell wichtiges Vieh wie Schafe, Ziegen, Schweine und Rinder ausgedehnt (Pursel et al. Science 244, pp. 1281–88).
  • Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele ausgeführt. Es sollte klar sein, dass diese Beispiele nur zu Zwecken der Erläuterung da sind, und nicht dahin auszulegen sind, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken. In all diesen Beispielen wurden alle molekularen Klonierreaktionen gemäß der Methoden aus T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) oder J. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press (1989) durchgeführt, wobei kommerziell erhältliche Enzyme verwendet wurden, soweit nicht anders vermerkt.
  • Beispiel 1
  • Konstruktion zielgerichteter DNA-Molekül für die Zerstörung von für Prionen kodierende Sequenzen durch homologe Rekombination
  • Wir konstruierten den Target-Vektor pRVPrP-3 (1–5) durch Ersetzen der Codons 4 bis 187 des 254 Codons enthaltenden offenen Leserasters für PrP (552 Bp, die sich von Nukleotid 10 bis 562 erstrecken), durch ein 1.1 kB-Fragment, das den HSV-TK Promoter enthält, dem ein Neomycin-Phosphotransferase-Gen („Neo") folgt. Das Neo-Gen verleiht eine Resistenz gegen Neomycin, Kanamycin und G418 (Genecitin®). Die DNA-Ausgangsmaterialien bestanden aus dem Westaway-Cosmid (ein Geschenk von David Westaway) (unten beschrieben), dem Plasmid pBluescript, einem kommerziell erhältlichen Säugetier-Expressionsplasmid (siehe Short et al., Nuc. Acids Res. 16, p. 7583 (1988); Produktinformationen von Strategene Cloning Systems) und pMC1NeoPA, einem kommerziell erhältlichen Resistenz-Plasmid gegen Neomycin (siehe Thomas und Capecchi, Cell, 51, pp. 503–12 (1987); Produktinformationen von Strategene Cloning Systems).
  • Das Westaway-Cosmid besteht aus (BamHI und EcoRI-verbundenem) pUC 18 (siehe Produktinformationen von GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD; Yanisch-Perron et al., Gene 33, p. 103 (1985)) mit einer 8.9 kB BamHI-BamHI-Insertion aus dem Mausgenom, die das Prn-p Exon 3 (welches für das gesamte Prionenprotein codiert) und einen Teil des benachbarten Introns enthält. Wir klonierten ein 4.2 kB BamHI-EcoRI Fragment mit Exon 3 und dem Teil des Introns in die durch BamHI und EcoRI verbundene Multiple Cloning Site ("MCS") von pBluescript, um ein erstes vorläufiges Plasmid herzustellen, pBluescriptPrP2 (1). Wir schnitten das Neo-Gen und seine Expressions-Kontrollsequenzen ("NeoPA Expressionsbox") aus pMC1Neo mit XhoI und SalI heraus und inserierten diese mittels blunt-end-Ligation an der BstEII-Schnittstelle (in der Nähe des Codons 187) des Exon 3, um ein zweites vorläufiges Plasmid, pRVPrPNeoPA2 (2), herzustellen.
  • Der finale Schritt bei der Konstruktion des Target-Plasmids pRVPrP3 umfasst die Ligation von 3 Fragmenten (5). "Fragment 1 ", das 5.5 kB PstI-ClaI-Fragment aus pBluescriptPrP2, enthält den Bluescript-Vektor und die PrP-Intronsequenz zwischen der BamHI-Schnittstelle und der PstI-Schnittstelle (3). "Fragment 2", das 1.7 kB XhoI-ClaI Fragment aus pRVPrPNeoPA-2, enthält die NeoPA-Expressionsbox, gefolgt von der verbleibenden, für PrP kodierenden, stromabwärts der zerstörten BstEII-Schnittstelle gelegenen Sequenz, nicht kodierende Sequenzen, die sich bis zur EcoRI-Schnittstelle erstrecken, und einen Teil der Bluescript MCS-Region (3)."Fragment 3", das erforderlich ist, um den Bereich zwischen der PstI-Schnittstelle im Intron und der XhoI-Schnittstelle am 5'-Ende der NeoPA-Box wiederherzustellen, wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") hergestellt, wobei das linearisierte pBluescript-PrP2 als Matritze verwendet wurde.
  • Der Primer für das 5'-Ende, "P5" (SEQ ID NO: 1)
    (5')GCTTTCTTCA AGTCCTTGCT CCTGCTGTAG(3')
    ist komplementär zu stromaufwärts der PstI-Schnittstelle gelegenen Intron-Sequenzen.
  • Der Primer für das 3'-Ende, "PrP-Xho" (SEQ ID NO: 2)
    (5')TGACTCGAGG GTTCGCCATG ATGACT(3')
    ist komplementär zu der Intron-Exon-Grenze und weist eine künstliche XhoI-Schnittstelle (unterstrichen) in der Nähe seines 5'-Endes auf. Wir erhielten das 0.49 kB lange "Fragment 3" durch Verdau des Reaktionsprodukts mit PstI und XhoI. "Fragment 3" erstreckt sich von der PstI-Schnittstelle bis Position +10 (gezählt ab dem PrP-Startcodon).
  • Wir isolierten das 4.8 kB ClaI-SacII-Fragment aus pRVPrP-3 zur Verwendung als Target-Fragment für Transfektionen (5). Das Target-Fragment enthält die NeoPA-Box, die an einem Ende durch die Maus-Intronsequenz und einen Teil der 5'-gelegenen nicht-kodierenden PrP-Sequenz und am anderen Ende durch die 3' gelegenen 28% der kodierenden PrP-Sequenz und den 3' gelegenen nicht-kodierenden Bereich des PrP-Gens flankiert wird.
  • Beispiel 2
  • Herstellung und Charakterisierung von ES-Zellen und Mäusen mit zerstörten Prn-p-Genen Zellkultur und Elektroporation
  • Wir kultivierten murine embryonale Stammzellen ("ES") der Linie AB-1 murine (abgeleitet aus Agouti sv129-Mäusen) auf bestrahlten, G418-resistenten SNL76/7-Feeder-Zellen, die den Leukämie-Inhibitionsfaktor ("LIF") exprimieren, und überführten jeden zweiten Tag 1/6 in DMEM 20% FCS. Beide Zelllinien wurden von A. Bradley (McMahon und Bradley, Cell 62, 1073–85, (1990)) zur Verfügung gestellt.
  • Wir verteilten ungefähr 3 × 107 trypsinisierte Zellen in 1.4 ml PBS in 2 Küvetten und führten in jeder Küvette eine Elektroporation mit ungefähr 10 μg eines gereinigten ClaI-SacII Target-Fragments, das in Beispiel 1 (oben) beschrieben ist, durch. Für die Elektroporation benutzten wir Standard-Techniken (siehe allgemein Chu et al., Nuc. Acids. Res. 15, p. 1311 (1987)) und ein kommerziell erhältliches Gerät (BioRad GenePulses). Unsere Elektroporations-Parameter waren 240 V/500 F.
  • Identifikation der ES-Zellen, die das mittels homologer Rekombination integrierte Target-Fragment aufweisen
  • Wir verwendeten eine zweistufige Selektions-Strategie, um ES-Klone zu izieren, die das Target-Fragment mittels homologer Rekombination am richtigen identifOrt integriert hatten. Da das Target-Fragment die NeoPA-Box enthält, exprimieren die Zellen, die das Fragment entweder durch zufällige Insertion oder mittels homologer Rekombination in ein Chromosom integrieren, eine Resistenz gegen Neomycin. Nach der Elektroporation plattierten wir die Zellen auf (10) 90 mm-Feederplatten aus. Nach 24 Stunden gaben wir als ersten Selektionsschritt 0.3 mg G418/ml Medium hinzu. Nach 10–12 Tagen übertrugen wir G418-resistente Kolonien in einzelne Wells einer 96-Well-Platte, trypsinisierten sie und resuspendierten sie. Wir plattierten Aliquots der Zellsuspensionen auf bestrahlten Feeder-Zellen in 48-Well-Masterplatten aus und vereinigten die in jedem Well verbleibenden Zellen in Gruppen von 12. Wir verwendeten PCR-Techniken (siehe allgemein Sambrook et al., (oben), Kapitel 14), um G418-resistente Kolonien, die das mittels homologer Rekombination integrierte Target-Fragment aufweisen, zu identifizieren. Wir lysierten ungefähr 50000 Zellen für jede PCR-Analyse. Unsere PCR-Techniken entsprachen im Wesentlichen denen, die durch Saiki et al. (Science, 239, pp. 487–91 (1988)) beschrieben worden sind. Wir führten 35 Zyklen à 1 min. bei 94°C und 3 min. bei 70°C durch, mit den Primern "P3" (SEQ ID NO: 3)
    (5')ATTCGCAGCG CATCGCCTTC TATCGCC(3')
    der komplementär zum 3'-Ende der NeoPA-Box ist, und "P4" (SEQ ID NO: 4)
    (5')CCTGGGAATGAACAAAGGTTTGCTTTCAAC(3')
    der komplementär zu den genomischen PrP-Sequenzen ist, die an das Target-Fragment angrenzen (5). Diese Primer führen nur dann zu einem 850-Bp PCR-Produkt, wenn das Target-Fragment innerhalb des PrP-Lokus integriert ist. Eine ES-Zelle zur Positivkontrolle wurde hergestellt, indem D3 ES-Zellen mit einem Konstrukt transformiert wurden, das zusätzliche 3'-flankierende Sequenzen (das in 1 gezeigte 1.3 kB EcoRI-XbaI-Segment) mit der Primer-Bindungsstelle für P4 enthielt, die dem Target-Vektor fehlen.
  • Nachdem der transformierte murine ES-Zellklon ESΔP-37/10 beim PCR-Screening positive Resultate zeigte (oben), verwendeten wir eine Southern-Hybridisierungsanalyse, um zu bestätigen, dass der ESΔP-37/10-Klon ein Prn-p-Allel aufwies, das durch das Target-Fragment zerstört worden war. Unsere Sonde für die Southern-Analyse war die Sonde A, ein 0.650 kB BstEII-EcoRI-Fragment, das zum 3'-Ende des Target-Fragments passt, und das sowohl mit endogenen als auch exogenen PrP-Sequenzen hybridisiert.
  • Herstellung von chimären Mäusen aus transformierten ES-Zellen
  • Wir injizierten Blastocysten von C57BL/6-Mäusen (schwarz) mit ESΔP-37/10-Zellen, und implantierten die Blastocysten in Leihmütter (Genotyp ICR), so wie es im Wesentlichen durch Bradley ("Production and Analysis of Chimaeric Mice", in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J. Robertson, Hrsg.) Oxford IRL Press, pp. 113–51, (1987)) beschrieben ist. Ungefähr 45% der entstehenden Nachkommen waren teilweise, und 35% mehr als 90%, chimär in Bezug auf die Agouti-Fellfarbe.
  • Beispiel 3
  • Transgene Mäuse: Analyse der Zucht und der Nachkommen
  • Chimäre Männchen wurden im Alter von sieben Wochen mit C57BL/6J-Weibchen verpaart. Von 22 fruchtbaren Männchen übertrugen 9 hochgradige und 3 mittelgradige (20–30%) Chimären den Agouti-Marker auf ihre Nachkommen. Wir bestimmten die Genotypen der Nachkommen durch PCR-Analyse der Tail-DNA (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press (1986)). Wir verwendeten die Primer P10 und P4 in verschiedenen Reaktionen, um die Anwesenheit des normalen PrP-Allels (1.1 kB-Bande) zu zeigen. Primer P10 (SEQ ID NO: 5)
    (5')GTACCCATAA TCAGTGGAAC AAGCCCAGC(3')
    hybridisiert mit den PrP-Sequenzen, die durch die NeoPA-Box in dem rekombinierten Allel ersetzt wurden. Proben wurden 35 mal für 1 min. auf 94°C, 2 min. auf 66°C und 1 min. auf 70°C gebracht. Wir bestätigen die PCR-Genotyp-Ergebnisse mittels Southern-Hybridisierungsanalyse. Für die Southern-Analyse blotteten und hybridisierten wir XbaI-verbundene DNA entweder mit der Sonde A (siehe oben) oder einer Sonde, die die NeoPA-Sequenz aufwies und aus pMC1NeoPA (Stratagene) abgeleitet worden war.
  • Das Screening von 147 Agouti-Nachkommen zeigte, dass ungefähr 50% heterozygot für das zerstörte Prn-P-Allel waren. Die Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigte die Anwesenheit des zerstörten Gens ("Prn-p0"). Es hatte sich nur eine einzelne Kopie der Target-Sequenz in das Maus-Genom integriert, was durch die Tatsache gezeigt wird, dass eine für das Neo-Gen spezifische Sonde nur mit einem einzigen XbaI-Fragment der erwarteten Länge von 4 kB hybridisierte. Da die Target-Sequenz nur eine einzige XbaI-Stelle enthielt, sollte jedes Integrations-Ereignis weitere Fragmente mit 4.8 oder 5.4 kB liefern, abhängig von deren relativer Anordnung zueinander.
  • Die Verpaarung von Prn-p0/+-Heterozygoten lieferte 103 oberflächlich nicht unterscheidbare Nachkommen. Die PCR-Analyse der DNA der 103 Nachkommen zeigte, dass 23% homozygot für das Wildtyp-Prp-Gen, 52% heterozygot und 25% homozygot für das zerstörte PrP-Gen waren. Die Southern-Hybridisierungsanalyse bestätigte den Genotyp der homozygoten Prn-p0/0-Mäuse. Die durchschnittliche Lebensdauer dieser Homozygoten wurde noch nicht bestimmt, aber bis zur 13. Woche traten keine spontanen Todesfälle auf.
  • Beispiel 4
  • Analyse von Hirngewebe homozygoter Prn-p0/0-Mäuse
  • Die Northern-Analyse von Prn-p0/0-Mäusen zeigte keine detektierbare Mengen vollständiger PrP-mRNA. Allerdings entdeckten wir durch Verwendung einer Neo-Sonde oder Sonde A wie erwartet ein Neo-PrP-Fusionstranskript. Ähnlich zeigte die Western-Analyse von Hirnextrakten von Prn-p0/0-Mäusen mit polyklonalen anti-PrP-Antikörpern kein detektierbares Prionenprotein.
  • Example 5
  • Grobe Anatomie von homozygoten Prn-p0/0-Mäusen
  • Wir beobachten bei den homozygoten Prn-p0/0-Mäusen keine wesentlichen Abnormitäten. Die Hirnanatomie, die durch mikroskopische Untersuchungen von Serienschnitten beurteilt wurde, erschien normal. Einige Mäuse zeigten lokale Vakuolisierungen im Hippocampus, aber deren Häufigkeit war ähnlich der beim Wildtyp, bei heterozygoten Prn-p0/+ und homozygoten Prn-p0/0-Tieren. Die Vakuolisierung des Hippocamous steht daher nicht im Zusammenhang mit der Zerstörung des PrP-Gens.
  • Beispiel 6
  • Resistenz gegen Scrapie-Infektion
  • Mäuse ohne Prionenprotein
  • Wir unterzogen 57 homozygote Prn-p0/0-Mäuse (ohne Prionenprotein) und 57 Prn-p+/+mice (Normalkontrollen) einer Impfung mit Scrapies. Wir impften die Mäuse beider Gruppen intrazerebral mit einer hohen Dosis (ungefähr 107 infektiöse Einheiten) Maus-adaptierter Prionen der Chandler-Linie. Wir töteten 4 Tiere aus der Gruppe nach 4 Tagen sowie nach 2, 8, 12 und 20 Wochen. Aus jedem getöteten Tier entnahmen wir das Gehirn und die Milz, um die Infektiosität zu betimmen. Wir unterwarfen das Gehirn auch einer histologischen Untersuchung.
  • Die Normalkontroll-Mäuse zeigten ab dem 158 ± 11 Tag Scrapie-Symptome, und sie starben am 171 ± 11 Tag. Die Mäuse ohne Prionenprotein erschienen 252 Tage nach der Impfung noch gesund, was 49 Tage war, nach dem die letzten Prn-p+/+ Kontrollen starben.
  • Das Zeitreihen-Experiment zur Infektiosität zeigte, dass Hirnextrakte von Kontroll-Mäusen 12 Wochen nach der Impfung in CD-1 Indikatormäuse nach 140 Tagen eine Krankheit auslösen. Bei den entsprechenden Tests mit Hirn- oder Milzextrakten von Mäusen ohne Prionenprotein trat keine erkennbare Übertragung von Scrapie auf.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Mäuse ohne Prionenproteine vollständig gegen spongiforme Enzephalopathie geschützt sind. Die obigen Ergebnisse zeigen auch, dass Mäuse ohne Prionenprotein Scrapie nicht übertragen können.
  • Mäuse mit einem verringerten Niveau an Prionenprotein
  • Heterozygote Prn-p0/+-Mäuse haben anstelle von zwei Genen nur eines, das für Prionenprotein codiert. Solche Heterozygote produzieren Prionenprotein, aber auf Grund des Gen-Dosis-Effekts auf einem niedrigeren Niveau.
  • Um die Scrapie-Resistenz, die durch ein geringeres (aber nicht Null) Prionenprotein-Niveau resultiert, zu testen, impften wir eine Prn-p0/+-Heterozygote intrazerebral mit ungefähr 107 infektiösen Einheiten Maus-adaptierter Prionen der Chandler-Linie. Die Heterozygote erschien 260 Tage nach der Impfung gesund. In einem ähnlichen Scrapie-Resistenztest mit einer Gruppe heterozygoter Prn-p0/+-Mäuse erschienen die heterozygoten Mäuse 150 Tage nach der Impfung gesund.
  • Die Demonstration, dass Prn-p0/+-heterozygote Mäuse sehr viel resistenter gegen Scrapie sind als eine Wildtyp-Maus (d.h. Prn-p+/+) zeigt, dass auch eine gemäßigte Reduktion der Prionenprotein-Synthese zumindest einen teilweisen Schutz gegen spongiforme Enzephalopathie verleiht.
  • Beispiel 7
  • Gen-Komplementations-Tests
  • Um schlüssig zu zeigen, dass die beobachtete Resistenz gegenüber einer Scrapie-Infektion und Übertragung durch die Abwesenheit von Prionenprotein verursacht wurde, führten wir Prionen-Gene in unsere transgene Prn-p0/0-Mauslinie ein und testeten diese auf die Wiederherstellung der Empfänglichkeit für Scrapie. In diesem Experiment verwendeten wir tgHaPrn-p-Mäuse. Die tgHaPrn-p-Linie (die durch Stanley Prusiner et al. hergestellt wurde) ist homozygot für ein Chromosom, das 30–50 Kopien des Prn-P-Gens des Syrischen Hamsters trägt. Die tgHaPrn-p Mauslinie ist höchst empfänglich gegenüber Hamsterprionen und etwas weniger empfänglich gegenüber Mäuseprionen als Wildtyp-(Prn-p+/+)-Mäuse. Wir verpaarten Prn-p0/0)-Mäuse mit tgHaPrn-p-Mäusen und identifizierten Prn-p0/+/HaPrn-p0/+-Nachkommen. Wir kreuzten diese Nachkommen mit Prn-p0/0-Mäusen rück und identifizierten die Prn-p0/0/HaPrn-p0/+-Individuen. Wir impften (wie oben beschrieben) Gruppen von 9–11 Prn-p0/0/HaPrn-p0/+-Mäusen mit Maus-Scrapie-Prionen der Chandler-Linie oder mit Hamster-Prionen der Sc237-Linie. Die Mäuse, die mit der Hamster-Prionenlinie Sc237 geimpft worden waren, zeigten nach 56 ± 3 Tagen neurologische Symptome und starben nach 59 ± 5 Tagen. Bis 140 Tage nach der Impfung waren die Mäuse, die das Mäuseprion erhielten, ohne Krankheitssymptome.
  • Sequenzliste
    Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001

Claims (8)

  1. DNA-Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Target-Molekül, das spezifisch Prionenprotein-Gensequenzen in Säuger- oder Vogelzellen inaktivieren kann, wobei das Gen kein funktionelles Prionenprotein exprimieren kann; b) Plasmid pRVPrP3, dessen Konstruktion in den 1 his 5 dargestellt ist; und c) dem 4,8 kB ClaI-SacII-Fragment des Plasmids.
  2. Nicht-menschliche Säugerzelle oder Vogelzelle, umfassend das Target-Molekül nach Anspruch 1.
  3. Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder Vogel, umfassend die Zelle nach Anspruch 2.
  4. Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder Vogel nach Anspruch 3, der auf Grund des Fehlens des Prionenproteins nicht empfänglich für Prionenprotein-Krankheiten ist.
  5. Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder Vogel nach Anspruch 3 oder 4, wobei ein oder mehrere Prionenprotein codierendes) Gen(e), in dessen Keimzellen oder somatischen Zellen durch ein Ziel-Molekül inaktiviert worden sind, wobei das/die zerstörten Gene) kein funktionelles Prionenprotein exprimieren kann/können.
  6. Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder Vogel nach einem der Ansprüche 3 bis 5, der zu einer Gattung gehört ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Mus; b) Rattus; c) Mesocricetus; d) Oryctolagus; e) Sus; f) Ovis; und g) Bos.
  7. Verwendung des DNA-Moleküls nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung spongiformer Enzephalopathien.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die spongiforme Enzephalopathie Kuru, Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom, Traberkrankheit (Scrapie), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), chronische Erschöpfungskrankheit (CWD) oder übertragbare Nerz-Enzephalopathie (TME) ist.
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