DE69937638T2

DE69937638T2 - Caspase-9 defiziente tiere und deren verwendung

Info

Publication number: DE69937638T2
Application number: DE69937638T
Authority: DE
Inventors: Keisuke Waltham KUIDA; Richard A. Guilford FLAVELL
Original assignee: Yale University; Vertex Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Yale University; Vertex Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-06-02
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: EP1084260B1; EP1084260A2; US7323616B2; US20040255343A1; US20090205062A1; AU4318799A; DE69937638D1; EP1932914A3; EP1932914A2; WO1999063097A2; JP2002517202A; WO1999063097A9; WO1999063097A3

Description

TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft genetisch manipulierte Tiere, die in der Expression der Caspase-9, einem Protein, das in den programmierten Zelltod involviert ist, defizient sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Apoptose ist eine wichtige biologische Funktion für das Beibehalten der Homöostase in vielzelligen Organismen. Dieser Vorgang wird genetisch bestimmt, und es ist gezeigt worden, dass er einer der grundlegenden Mechanismen ist, der während der Evolution konserviert wurde [M. D. Jacobsen et al., Cell, 88, S. 347-54 (1997)].
Der Vorgang des Zelltods in Säugern involviert Mitglieder der Caspase-Genfamilie, die aus mindestens zehn Mitgliedern besteht [E. S. Alnemri et al., Cell, 87, S. 171 (1996)]. Alle Caspasen sind Cystein-Proteasen und werden als eine Vorläuferform synthetisiert. Caspasen werden durch Spaltung des Vorläufers bei spezifischen Asp-Resten aktiviert. Dies stellt ein aktives Heterodimer her, das aus einer 20 kDa- und einer 10 kDa-Untereinheit besteht. Dieses Heterodimer dimerisiert dann mit sich selbst, was ein Tetramer bildet. Die Aktivierung von Caspasen wird wahrscheinlich durch autokatalytische Vorgänge oder eine Kaskade unter den Caspase-Proteasen vermittelt. Sobald Caspasen aktiviert sind, spalten sie eine Vielfalt von Zielproteinen, was Änderungen in den Zellen, die mit der Apoptose assoziiert sind, bewirkt.
Eine neuere Arbeit über den apoptotischen Vorgang hat offengelegt, dass die Aktivierung von Caspase-3 mit der DNA-Fragmentierung assoziiert ist [X. Liu et al., Cell, 89, S. 175-84 (1997)]. Drei Faktoren sind in die Caspase-3-Aktivierung involviert – Apaf-1 (Apoptose-Protease aktivierende Faktoren), Cytochrom-c (das ein wesentliches Element für mitochondriale Funktionen ist) und Caspase-9 [Zou et al. (1997); X. Liu et al. (1996), Cell, 86, S. 147-57; P. Li et al., Cell 91, S. 479-89 (1997); und Duan H. et al. (1996); J. Biol. Chem. 271, S. 16720-16724].
Auf dem Fachgebiet sind auch Caspase-1 defekte Mäuse bekannt; siehe WO 98/06263 und WO 96/12025 , und Caspase-3 defekte Mäuse, auch bekannt als CPP32; siehe Kuida K. et al. (1996), Nature 384, S. 368-372. Das Verstehen der Mechanismen des programmierten Zelltods hat wichtige Auswirkungen für das Verhindern von Entwicklungs-Abnormalitäten so wie für die Verhinderung des Nervenzelltods, der Degeneration von glatten und Herzmuskeln und des Zelltods, der mit einer viralen Infektion assoziiert ist. Daher gibt es einen großen Bedarf, um Mittel zur Untersuchung der Apoptose sowie zum Entwickeln von Inhibitoren derselben zu erhalten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Produzieren von nicht-menschlichen Säugern oder nicht-menschlichen Embryonen, insbesondere von Mäusen, bereit, deren Genom heterozygot für eine Mutation ist, die in das Caspase-9-Gen eingebracht wurde, wobei die Mutation im homozygoten Zustand in einem funktionell defekten Caspase-9-Gen und abnormaler Gehirnentwicklung resultiert. Die Erfindung betrifft auch genetisch veränderte nicht-menschliche Säuger oder nicht-menschliche Embryonen, die keine funktionelle Caspase-9 exprimieren. Solche Tiere können durch die Verfahren dieser Erfindung oder durch verwandte Verfahren produziert werden. Die Erfindung wird durch die Ausführungsformen der angefügten Ansprüche weiter charakterisiert.
Die Caspase-9 defizienten nicht-menschlichen Säuger oder nicht-menschliche Embryonen dieser Erfindung zeigen eine Abnormalität im Gehirn. Überzählige Zellen werden im Vorderhirn, dem Rautenhirn und dem Rückenmark gefunden. Darüber hinaus sind die Apoptose und DNA-Fragmentierung in Dexamethason-behandelten Thymocyten, die von den Caspase-9 defekten nicht-menschlichen Säugern oder nicht-menschlichen Embryonen dieser Erfindung erhalten wurden, reduziert. Diese und andere Daten, die hierin präsentiert werden, zeigen, dass Caspase-9 eine stromaufwärts-wirkende Caspase ist, die für die Aktivierung von einer oder mehreren Caspasen in der Caspase-Kaskade verantwortlich ist. Daher spielt die Caspase-9 eine wichtige Rolle in der neuronalen Apoptose, der Apoptose von Herz- und glattem Muskel und der Apoptose, die mit viraler Infektion assoziiert ist.
Daher betrifft ein weiterer Aspekt, der hierin beschrieben ist, die Verhinderung von Apoptose durch Inhibieren der Caspase-9-Aktivität. Solche Inhibitoren schließen polyclonale und monoclonale Antikörper, die spezifisch für Caspase-9 sind, Antisense-Nucleotide, die spezifisch an Caspase-9-DNA oder -mRNA hybridisieren, maßgeschneiderte enzymatische Nucleotide, die ähnlich zu Ribozymen sind, die spezifisch Caspase-9-mRNA spalten, und andere Moleküle, die unten diskutiert werden, ein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1, Feld A, zeigt die Clonierungsstrategie für das Bilden eines nicht-funktionellen Caspase-9-Gens. Feld B zeigt die Elektrophorese der revers transkribierten, PCR-amplifizierten mRNA einer Caspase-9-Knockout-Maus und einer Wildtyp-Maus, wobei ein Caspase-9-spezifischer Primer oder ein Actinspezifischer Primer als Primer eingesetzt wurden. Feld C zeigt einen Northern-Blot der Gesamt-mRNA von Wildtyp-Mausembryonen von verschiedenem Alter, die mit Caspase-9-, Caspase-3- und apaf-1-spezifischen Sonden sondiert wurde.
2 zeigt den neuronalen Phänotyp in Caspase-9+/-- und Caspase-9-/--Mausembryonen bei E10,5 (Felder A und B), E13,5 (Felder C und D) und E16,5 (Felder E und F).
3 zeigt Nissl-gefärbte Gehirnschnitte von Caspase-9+/-- und Caspase-9-/--Mausembryonen bei E13,5 (Felder A und B), eine stärkere Vergrößerung derselben Schnitte (Felder C und D); Nissl-gefärbte Gehirnschnitte von Caspase-9+/- und Caspase-9-/--Mausembryonen bei E16,5 (Felder E und F) und Rückenmarkschnitte von Caspase-9+/-- und Caspase-9-/--Mausembryonen bei E16,5 (Felder G und H).
4 zeigt halbdünne Nissl-gefärbte Horizontalschnitte des Vorderhirns von Caspase-9+/-- und Caspase-9-/--Mausembryonen bei E10,5 (Felder A und B). Eine stärkere Vergrößerung der eingerahmten Bereiche in den Feldern A und B ist in den Feldern C und D gezeigt. Feld E zeigt die Tunel-Färbung eines horizontalen Gehirnschnitts eines Caspase-9-/--Mausembryos bei E12. Feld F zeigt die Verteilung der TUNEL⁺-Zellen in Caspase-9+/+- und Caspase-9-/--Embryonen.
5 zeigt das Überleben von Caspase-9+/+- und Caspase-9-/--Thymocyten in % in der Anwesenheit von Medium alleine („MED"), 2 μM Dexamethason (DEX), 1 μM Staurosporin („STA") oder 1 μg/ml anti-Maus-Fas-Antikörper + 30 mg/ml Cycloheximid („FAS") nach 6 Stunden (Feld A) oder 24 Stunden (Feld B). Genomische DNA, die von den Thymocyten isoliert wurden, die, wie oben beschrieben, behandelt wurden, sind in den Feldern C und D gezeigt.
5, Feld A, zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese von ³⁵S-Methionin-markierter Caspase-3, die mit einer cytosolischen S-100-Fraktion von embryonalen Caspase-9+/+-E15,5- und Caspase-9-/--Gehirnen oder Thymocyten in der Anwesenheit oder Abwesenheit von dATP und/oder Cytochrom c behandelt wurde. Feld B zeigt eine SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese von ³⁵S-Methioninmarkierter Caspase-3, die mit einer cytosolischen S-100-Fraktion von embryonalen Caspase-9-/--E15,5-Gehirnen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von dATP, Cytochrom c und/oder in vitro transkribierter und translatierter Caspase-9 behandelt wurde.
6 zeigt Gehirnschnitte von Caspase-9+/+-(Feld A) oder Caspase-9-/--(Feld B) E12,5-Embryonen, die mit einem Antikörper gefärbt wurden, der spezifisch für aktivierte Caspase-3 ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt genetisch veränderte Tiere bereit, die in der Caspase-9-Expression defekt sind. Der Begriff „Tier", wie hierin verwendet, schließt alle Säuger mit der Ausnahme von Menschen ein. Vorzugsweise ist das genetisch veränderte Tier ein Nager. Bevorzugter ist es eine Maus.
Der erste Schritt in der Bildung der genetisch veränderten Tiere dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines genomischen Caspase-9-Clons. Dies kann durch Sondieren einer genomischen Genbank mit einer Caspase-9-spezifischen Sonde erreicht werden. Solche Sonden können Caspase-9-spezifische Primer sein, die, wenn sie im Zusammenhang mit der PCR-Technologie angewendet werden, genomische Caspase-9-spezifische DNA amplifizieren. Alternativ kann die Sonde eine Caspase-9-cDNA oder ein Fragment davon sein. Solch eine cDNA kann auch durch Sondieren einer cDNA-Genbank mit Caspase-9-spezifischen Primern, gefolgt von einer PCR, erhalten werden. Alternativ kann die cDNA durch spezifisches reverses Transkribieren von mRNA, die Caspase-9 codiert, durch die Verwendung von Caspase-9-spezifischen Primern hergestellt werden. Caspase-9-spezifische Primer werden in den Beispielen unten dargelegt.
Sobald der genomische Clon isoliert ist, muss die DNA mutiert werden, um sie unfähig für das Codieren eines funktionellen Caspase-9-Proteins zu machen. Dies kann durch eine Vielfalt von Verfahren erreicht werden, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, wie ortsgerichtete Mutagenese oder Ausschneiden eines Teils der codierenden Region des Gens mit oder ohne begleitendes Ersetzen der ausgeschnittenen DNA durch eine alternative DNA.
Es ist bekannt, dass das Pentapeptid-Motiv QACXG (wobei „X" ein Arginin oder Glycin ist, SEQ ID NO: 7) unter den Mitgliedern der Caspase-Familie konserviert ist und für die Aktivität notwenig zu sein scheint. Dementsprechend wird eine Deletion oder Mutation der DNA, die diesen Teil der Caspase-9 codiert, das resultierende Gen unfähig machen, eine funktionelle Caspase-9 zu exprimieren. Es wird bevorzugt, dass die DNA, die diesen Teil der Caspase-9 codiert, durch DNA ersetzt wird, die ein Markergen codiert, sodass die Zellen, die mit der resultierenden DNA transformiert sind, leicht identifiziert werden können. Vorzugsweise wird die Region des genomischen Clons, der das Pentapeptid-Motiv enthält, durch DNA ersetzt, die das neo-Gen codiert, das später als ein Marker für die Transformanten dienen kann.
Das endgültige Konstrukt, das das nicht-funktionelle Caspase-9-Gen enthält, wird dann linearisiert und in einen Zelltyp, der von derselben Tierart ist wie das erwünschte genetisch veränderte Tier, eingebracht oder transfiziert und verwendet, um einen solchen Zelltyp zu transformieren. Vorzugsweise ist jener Zelltyp eine embryonale Stammzelle. Das endgültige Ziel ist, dass eine homologe Rekombination zwischen dem Wildtyp-Caspase-9-Gen in den Chromosomen der Zelle und dem mutierten Caspase-9-Gen im Vektor erfolgt. Zellen, die dieses mutierte Caspase-9-Gen enthalten, werden durch das Markergen identifiziert.
Im Fall des neo-Markergens suchten wir nach Zellen, die resistent gegen G418 und Gancyclovir waren. Eine homologe Rekombination wird durch Southern- Blot-Verfahren unter Verwendung einer Sonde, die spezifisch für das Markergen ist, bestätigt.
Sobald eine rekombinante Zelle identifiziert worden ist, wird sie dann in eine Blastocyste von der erwünschten Tierart injiziert. Das resultierende chimäre Tier wird dann mit einem normalen Tier gepaart, um heterozygote Nachkommen zu produzieren. Diese Nachkommen werden dann untereinander gepaart, um ein Tier zu erhalten, das homozygot für ein nicht-funktionelles Caspase--9-Gen ist.
Die Bestätigung, dass ein genetisch verändertes Tier produziert wurde, das defekt in der Caspase-9-Produktion ist, kann durch Analyse der mRNA oder der exprimierten Proteine jenes Tiers auf das Fehlen von Molekülen, die der Caspase-9 entsprechen (mRNA oder Protein), erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt, der hierin beschrieben wird, obwohl er kein Teil der vorliegenden Erfindung ist, ist eine Zusammensetzung von Inhibitoren der Caspase-9-Expression oder der Caspase-9-Aktivität für die Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern einer Krankheit oder eines Zustands, die/der mit der Caspase-9-Expression assoziiert ist. Insbesondere wird eine Zusammensetzung von solchen Inhibitoren für die Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern von Entwicklungs-Abnormalitäten, Nervenzelltod, Degeneration von glattem und Herzmuskel und Zelltod, der mit einer viralen Infektion assoziiert ist, beschrieben, obwohl sie kein Teil der vorliegenden Erfindung ist.
In diesen wird eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung, umfassend ein Molekül, das entweder die Expression von Caspase-9 oder die Aktivität von Caspase-9 inhibiert, für die Verabreichung an einen Patienten, der an der Krankheit oder dem Zustand leidet, beschrieben. Solche Moleküle schließen monoclonale und polyclonale Antikörper, die spezifisch für Caspase-9 oder Epitope davon sind, Oligonucleotide, die spezifisch an Caspase-9-DNA hybridisieren, um die Transkription von funktioneller Caspase-9-mRNA zu verhindern, Oligonucleotide, die spezifisch an Caspase-9-mRNA hybridisieren, um die Expression von Caspase-9 zu verhindern, und Ribozyme, die spezifisch Caspase-9-mRNA spalten, ein, sind aber nicht darauf limitiert.
In Anbetracht, dass sowohl die genomische DNA-Sequenz, die cDNA-Sequenz und die Aminosäuresequenz von Caspase-9 bekannt sind, liegt die Bildung der verschiedenen Caspase-9-Inhibitoren, auf die oben Bezug genommen wurde (auf der DNA-, mRNA- und Protein-Ebene), wohl im Bereich des Fachwissens.
Damit diese Erfindung vollständiger verstanden wird, werden die folgenden Beispiele dargelegt. Diese Beispiele dienen nur dem Zweck der Veranschaulichung und sollen nicht ausgelegt werden, den Rahmen der Erfindung in irgendeiner Weise zu limitieren.
BEISPIEL 1
Herstellung von Caspase-9-defizienten Mäusen
Menschliche Caspase-9-cDNA wurde durch PCR von Jurkat-Zellen unter Verwendung von Caspase-9-spezifischen Primern (5'-ATG GAC GAA GCG GAT CGG CGG C-3' (SEQ ID NO: 1) und 5'-TTA TGA TGT TTT AAA GAA AAG-3' (SEQ ID NO: 2)) amplifiziert. Die genomische 129SV/J-Genbank (Stratagene) wurde mit der cDNA gescreent, um einen genomischen Maus-Caspase-9-Clon zu erhalten. Ein acht kb-HindIII-NotI-Fragment, das einen Teil enthält, der das Pentapeptid-Motiv, das unter den Caspase-Familie-Mitgliedern konserviert ist, codiert, wurde in pBlueScript (Stratagene) subcioniert. Das resultierende Plasmid wurde mit XbaI verdaut und mit glatten Enden versehen. Ein EcoRI-HindIII-Fragment der neo-Gen-Kassette [K. Nakayama et al., Science, 261, S. 1584-88 (1993)] wurde auch mit glatten Enden versehen und an das Plasmid ligiert, das das genomische Maus-Caspase-9-Fragment enthielt. Das Plasmid wurde dann mit XhoI und NotI verdaut und in den tk-Kassettenvektor [K. Nakayama et al. (1993), vorstehend] subcioniert. Der resultierende Vektor, der in 1A gezeigt ist, schließt eine neo-Genkassette ein, die ein 1,0 kb-XbaI-Fragment ersetzt, das das aktive Pentapeptid-Motiv (QACGG) codiert, flankiert von 7 kb der genomischen Caspase-9-Sequenz.
Das Konstrukt wurde durch NotI linearisiert und in W9,5-ES-Zellen transfiziert. Clone, die gegen G418 und Gancyclovir resistent sind, wurden selektiert, und eine homologe Rekombination wurde durch das Southern-Blot-Verfahren bestätigt. Einer von 32 gescreenten Clonen war positiv für die homologe Rekombination, und eine einzelne Integration des Konstrukts wurde durch Hybridisierung mit der neospezifischen Sonde bestätigt.
Chimäre Mäuse wurden durch Injektion dieses Clons in C57BL/6-Blastocysten hergestellt. Die resultierenden männlichen chimären Mäuse wurden mit C57BL/6-Weibchen gepaart, um heterozygote Mäuse zu erhalten.
Das Kreuzen der heterozygoten Mäuse wurde durchgeführt, um Caspase-9 defiziente Mäuse herzustellen. Das Kreuzen der heterozygoten Mäuse stellte postnatale Caspase-9-/--Mäuse in einer Frequenz von weniger als 2% der Gesamtzahl der gescreenten Mäusen her, während die Knockout-Embryonen bis zu dem Alter vom embryonalen Tag (E)16,5 in einem Mendelschen Verhältnis gewonnen wurden (siehe Tabelle 1, unten). Die meisten homozygoten Mäuse starben daher während des perinatalen Zeitraums. Tabelle 1. Genotypen von Mäusen, die aus heterozygoten Paarung erzeugt wurden.
Pränatal zeigten die Caspase-9-/--Feten hochgradig wiederholbare ZNS-Abnormalitäten wie Hyperzellularität und ventrikuläre Hypertrophie, ähnlich zu den Beobachtungen in den Caspase-3-Knockout-Mäusen [K. Kuida et al., Nature, 384, S. 368-72 (1996)]. Interessanterweise zeigten homozygote Mäuse keine groben Abnormalitäten in anderen Organen. Die seltenen homozygoten Mäuse, die die Geburt überlebten, besaßen nur feine Unterschiede im Gehirn, wenn überhaupt. Wir glauben, dass der genetische Hintergrund der individuellen Mäuse diese Variabilität im Phänotyp von postnatalen Caspase-9-/-beeinflusste, wie es in p53-defizienten Mäusen gezeigt worden ist [V. P. Sah et al., Nat. Genetics, 10, S. 175-80 (1995)].
BEISPIEL 2
RT-PCR-Analyse von Caspase-9-mRNA
Gesamt-RNA wurde von der Niere der Caspase-9-Knockout-Mäuse durch Trizol-Reagenz (Gibco-BRL) isoliert. Fünf Mikrogramm Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Superscript-Präamplifications-Systems (Gibco-BRL) revers transkribiert, und die resultierenden Matrizen wurden einer PCR-Reaktion mit Caspase-9-spezifischen Primern (5'-GCC ATG GAC GAA GCG GAT CGG CGG-3' (SEQ ID NO: 3) und 5'-GGC CTG GAT GAA GAA GAG CTT GGG (SEQ ID NO: 4)) oder mit Primern, die spezifisch für γ-Actin sind [Chang et al., J. Exp. Med., 180, S. 1367-74 (1994)], unterzogen.
Das Fehlen von intakter Caspase-9-mRNA in Caspase-9-/--Mäusen wurde durch RT-PCR-Analyse bestätigt (1B).
BEISPIEL 3
Northern-Blot-Analyse
Um die mRNA-Expression von Genen zu untersuchen, die an der Caspase-Kaskade beteiligt sind, wurde eine Northern-Blot-Analyse mit spezifischen Sonden für Caspase-9, Caspase-3 und apaf-1 über den Verlauf der Entwicklung von Wildtyp-Mäusen durchgeführt.
Poly(A)+-RNA-Blots (Clontech) wurden über Nacht mit zufallsgeprimter menschlicher Caspase-9-cDNA, Hamster-Caspase-3-cDNA [Wang et al., EMBO J., 15, S. 1012-20 (1996)] oder menschlicher apaf-1-cDNA in Express-hyb-Puffer (Clontech) bei 37°C hybridisiert. Die apaf-1-cDNA wurde von HeLa-Marathon-Ready-cDNA (Clontech) durch PCR unter Verwendung von apaf-1-spezifischen Primern (5'-GGG G ATG CAT GCA AAA GCT CGA-3' (SEQ ID NO: 5) und 5'-CTG GCT GCA ATT CTT CTC TGT AAG-3' (SEQ ID NO: 6)) amplifiziert. Die Blots wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS für 1 h bei Raumtemperatur, gefolgt von 0,2 × SSC/0,1% SDS für 1 h bei 50°C gewaschen. Die Blots wurden dann mit einem Fuji BAS-1500 Bio-Image-Analysegerät analysiert.
Wie in 1 C gezeigt, wird Caspase-9-mRNA so früh wie in E7 exprimiert und wird dann nach E15 herunterreguliert. Im Gegensatz dazu werden sowohl Caspase-3- als auch apaf-1-mRNA beginnend bei E11 hochreguliert und werden danach stabil exprimiert. Daher werden alle drei Gene zusammen exprimiert und bilden wahrscheinlich nach E7 einen funktionellen apoptotischen Signalweg.
BEISPIEL 4
Histologie und Immuncytochemie
Feten, die in 4% Paraformaldehyd fixiert wurden, wurden in Paraffin eingebettet und in 10 μm-Abständen geschnitten. Coronale Gehirn- oder horizontale Körperschnitte wurden mit 0,1% Cresylviolett gefärbt. Für halbdünne Schnitte wurden die Embryonen in 4% Paraformaldehyd und 1,5% Glutaraldehyd fixiert, in Plastik eingebettet, und 1 μm-Reihenschnitte wurden mit 1% Toluidinblau gefärbt.
Der neuronale Phänotyp von Caspase-9-/--Mäusen wird äußerlich so bald wie in E10,5 als ein Defekt im Verschluss des dorsalen Neuralrohrs an der Verbindung zwischen dem Mittelhirn und dem Rautenhirn ersichtlich (2A und 2B). An E13,5 (2C und 2D) ist dieser dorsale Defekt noch ersichtlich, obwohl nach Außen keine Defekte in anderen ZNS-Strukturen (z. B. Telencephalon und Rückenmark) ersichtlich sind. Dennoch gibt es an E16,5 (2E und 2F) eine deutliche Exencephalie, wobei das gesamte Gehirn über die Ebene des Rautenhirns außerhalb des Kopfes exponiert ist. Zusätzlich erscheint das hervortretende Gehirn größer und in der Morphologie verändert. Es sind vermutlich diese Veränderungen, die die Position des Gehirns im Bezug auf Merkpunkte im Kopf verschieben.
Die Untersuchung der histologischen Caspase-9-/--Schnitte offenbart eine weitverbreitete Vergrößerung der proliferativen Populationen im Vorderhirn und Mittelhirn sowie eine Stenose der cerebralen Ventrikel. Am E13,5 (3A und 3B) ist der Thalamus größer, und die lateralen und dritten Ventrikel sind verstopft. Zusätzlich gibt es Diskontinuitäten und Heterotopien, die in der Wand des Telencephalons ersichtlich sind, wobei die proliferative ventrikuläre Zone und die postmitotische corticale Platte vollständig unterbrochen und eingestülpt sind (3C und 3D). An E16,5 ist das Erscheinen des Gehirns mit einer Verlagerung der Ventrikel des Telencephalon durch eine ausgedehnte Mittelhirn-Population, die oben auf dem Gehirn heraustritt, deutlich verändert (3E und 3F). Die dunkle Färbung in den Caspase-9-/--Gehirnschnitten weist darauf hin, dass im Vergleich zu Kontrollen mehr proliferative Zellen vorliegen. Im Gegensatz dazu scheinen die Größe und Entwicklung des Rückenmarks in Caspase-9-/--Mäusen nicht betroffen, wie es auch andere nicht-neurale Organe wie das Herz und die Lungen sind (3G und 3H).
Um die Mechanismen zu bestimmen, die den groben strukturellen Änderungen im Caspase-9-/--Vorderhirn zu Grunde liegen, untersuchten wir die Wirkung des Knockouts auf die Häufigkeit von Zellen, die durch Apoptose sterben. In horizontalen halbdünnen Schnitten verdeckt an E10,5 (4A und 4B) das vergrößerte Epithelium des Telencephalons den Ventrikel in den Mutanten. Darüber hinaus fehlten pyknotische Zellen, die normalerweise während der normalen Gehirnentwicklung beobachtet werden, in Caspase-9-/--Embryonen. Zum Beispiel werden pyknotische Ansammlungen in der Lamina terminalis des Vorderhirns, die den morphogenetischen Zelltod repräsentieren, der schlussendlich die Hemisphären trennt (4C und 4D), eliminiert, wobei die resultierende Lamina aufgrund der Anstiege in der Zellzahl und Zelldichte dicker ist.
BEISPIEL 5
TUNEL-Färbung
Für TUNEL-Färbungen, um eine DNA-Fragmentierung nachzuweisen, wurden 4% Paraformaldehyd-fixierte E12-Köpfe in 30% Saccharose kryokonserviert, gefroren und horizontal geschnitten. Gefrorene horizontale 20 μm-Gehirnschnitte wurden in 0,26 E/ml TdT und 1X des bereitgestellten Puffers (Life Technologies) und 20 μM biotinyliertem 16-dUTP (Boehringer Mannheim) für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Schnitte wurden dann dreimal in PBS (pH 7,4) gewaschen und für 30 min mit 2% BSA in PBS (pH 7,4) blockiert. Die Schnitte wurden dann mit FITC-gekoppeltem Streptavidin (Jackson Immunoresearch), 1:100 in PBS, für 30 Minuten inkubiert, abgespült und dann mit dem Kern-Farbstoff Propidiumiodid (1 μg/ml, Sigma) gegengefärbt.
Das Ergebnis des TUNEL-Tests an E12-Gehirnschnitten ist in 4E gezeigt. Wir maßen eine beinahe zehnfache Reduktion in der Zahl der TUNEL-positiven Zellen überall im Gehirn in den Caspase-9-Knockouts (4F). Diese Daten weisen deutlich darauf hin, dass die Gehirn-Missbildungen in Caspase-9-/--Mäusen aufgrund einer reduzierten Apoptose erfolgen und dass die Caspase-9-vermittelte Apoptose daher für eine normale Gehirnentwicklung in vivo entscheidend ist.
BEISPIEL 6
Apoptose-Test unter Verwendung von Thymocyten
Um die Rolle von Caspase-9 in Apoptose-Signalwegen in anderen Systemen zu untersuchen, verwendeten wir primäre Kulturen von Thymocyten. Obwohl sich Thymocyten von Caspase-9-/--Tieren normal ohne Unterschiede in der Zahl der Thymocyten oder im Verhältnis von Oberflächenmarkern wie CD4, CD8 oder CD3 entwickelten (Daten nicht gezeigt), forderten wir die Thymocyten mit einigen apoptotischen Stimuli heraus: Dexamethason, Staurosporin und anti-Fas-Antikörper.
Die Thymocyten wurden von Wildtyp- und Caspase-9-/--Mäusen isoliert. Eine Million Zellen wurden mit 2 μM Dexamethason (Sigma), 1 μM Staurosporin (Sigma), 1 μg/ml anti-Maus-Fas-Antikörper (PharMingen) plus 30 mg/ml Cycloheximid (Sigma) oder 10% FCS-Medium nur für 6 h oder 24 h behandelt. Die Proben wurden mit Annexin V (Boehringer Mannheim) und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) (Sigma) gefärbt, um apoptotische Zellen für ein FACS-Sortieren (Becton Dickinson) zu markieren.
Obwohl früher keine Unterschiede in der Kinetik des Thymocyten-Überlebens zwischen Wildtyp- und Caspase-3-/--Mäusen beobachtet wurden [K. Kuida et al., Nature, 384, S. 368-72 (1996)], zeigten Caspase--/--Thymocyten variable Antworten auf diese Apoptose-induzierenden Stimuli. Caspase-9-defiziente Thymocyten waren resistent gegen Dexamethason-induzierten Zelltod. Staurosporininduzierte Caspase-9-/--Thymocyten zeigten ein reduziertes Überleben, das vergleichbar mit dem Tod war, der in Kontrollen gesehen wurde (5). Zusätzlich unterzogen sich Knockout-Thymocyten einer Apoptose als Antwort auf eine anti-Fas-Antikörper-Anwendung in einer ähnlichen Weise wie die Wildtyp-Zellen.
BEISPIEL 7
DNA-Fragmentierungs-Test
DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Isolierungskits (LeMax Biotech) isoliert und einer Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel unterzogen. Die Gele wurden durch Ethidiumbromid gefärbt und durch einen Scanner wurden Aufnahmen gemacht.
Caspase-9-defekte Thymocyten unterzogen sich auch nach 24 Stunden einer Behandlung mit Dexamethason keiner DNA-Fragmentierung. Die DNA-Fragmentierung wurde auch bei der Antwort auf Staurosporin eliminiert. Zusätzlich unterzogen sich Knockout-Thymocyten einer DNA-Fragmentierung.
Diese Daten legen nahe, dass, während Caspase-9 für einen Dexamethasoninduzierten Zelltod notwendig sein kann, andere Mechanismen die durch Staurosporin- und Fas vermittelten Todessignalwege vermitteln. Verschiedene Angriffe scheinen daher sogar im selben Zelltyp getrennte apoptotische Signalwege anzuwenden. Interessanterweise begannen Caspase-9-/--Thymocyten dennoch, ihre DNA nach 36 und 48 Stunden einer kontinuierlichen Dexamethason- oder Staurosporin-Behandlung zu spalten (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass Langzeit-Angriffe schlussendlich die Blockierung der DNA-Fragmentierung, die durch eine Caspase-9-Deletion auferlegt wird, umgehen können.
BEISPIEL 8
Test für die Spaltung von Caspase-3
Um die funktionellen Folgen einer Caspase-9-Deletion zu untersuchen, verwendeten wir ein in vitro-Verfahren, um die Aktivierung von stromabwärts wirkenden Caspasen wie der Caspase-3 zu testen.
Menschliche Volllängen-Caspase-3-cDNA wurde unter Verwendung des TNT-Schnellkopplungs-Transkriptions-/Translationssytems (Promega) und ³⁵S-Methionin (Amersham) transkribiert und translatiert. Um die rekombinante Caspase-9 herzustellen, wurde die Volllängen-Caspase-9-cDNA unter Verwendung desselben Systems translatiert. Cytosolische S-100-Fraktionen wurden erhalten, wie von Liu et al., Cell, 86, S. 147-57 (1996) beschrieben. Ein Aliquot der in vitro-transiatierten Caspase-3 wurde mit 20 μg der cytosolischen S-100-Fraktion in der Anwesenheit von 1 mM zusätzlichem MgCl₂ mit oder ohne Cytochrom c oder dATP bei 30°C für 1 h in einem Endvolumen von 20 μl inkubiert. Für die Wiederherstellung der Caspase-9-Aktivität wurden 5 μl des Translationsreaktionsansatzes oder eines Reticulocyten-Lysats zu der Reaktion zugegeben. Am Ende der Inkubation wurden 7 μl 4 × SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion zugegeben und die Proben auf einem 16% SDS-PAGE-Gel einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und einer Phosphobilddarstellungs-Platte ausgesetzt und durch ein Fuji BAS-1500-Bio-Image-Analysegerät analysiert.
Während cytosolische Wildtyp-S-100-Fraktionen die Caspase-3 spalten konnten, konnten cytosolische Fraktionen, die von Caspase-9-/--Zellen isoliert wurden, Caspase-3 nicht spalten (5A). Diese Daten zeigen, dass Caspase-9 eine notwendige Caspase stromaufwärts im Aktivierungs-Signalweg ist und dass die Phänotypen, die wir in Caspase-9-/--Tieren beobachteten, aufgrund des Fehlens der Aktivierung von stromabwärts wirkenden Caspasen wie der Caspase-3 vorliegen.
Darüber hinaus stellte die Zugabe von in vitro-translatierter Caspase-9 zu cytosolischen S-100-Extrakten von Caspase-9-/--Gehirnzellen die Fähigkeit, Caspase-3 zu spalten, wieder her, was nahe legt, dass alle anderen erforderlichen Elemente in Caspase-9-/--Zellen vorhanden sind (5B).
Interessanterweise und im Gegensatz zu einem früheren Bericht [Liu et al., Cell, 86, S. 147-57 (1996)] erforderten Lysate von Kontrollzellen, die die stromabwärts wirkende Caspase spalten konnten, kein zusätzliches dATP (5A und 5B). Dies legt nahe, dass die intrazelluläre Konzentration von dATP in den Geweben, die wir verwendeten, hoch genug war, um Apaf-1 zu aktivieren, und dass die Freisetzung von Cytochrom c das erforderliche Element für die Iniziierung des Aktivierungsvorgangs ist.
Das Fehlen der in vitro-Caspase-3-Spaltung in den Caspase-9-/--Gehirnlysaten legte nahe, dass die Gehirn-Missbildungen in den Mutanten in vivo durch einen beeinträchtigten Caspase-3-abhängigen apoptotischen Signalweg verursacht werden können. Um diese Möglichkeit zu testen, untersuchten wir die in vivo-Aktivierung von Caspase-3 unter Verwendung eines Antikörpers (CM1), der spezifisch für die p20-Untereinheit der Caspase-3 ist und der nur aktivierte Caspase-3 erkennt. Tag E12,5-Embryonen wurden in Bouin-Lösung fixiert, in 30% Saccharose kryokonserviert und dann horizontal geschnitten.
In Wildtyp- und heterozygoten E12,5-Embryonen wurde in der ektodermalen Oberfläche und sporadisch im ganzen sich entwickelnden Nervensystem verteilt eine positive Färbung für aktivierte Caspase-3 gefunden (6A). Bei starker Vergrößerung war eine Färbung für aktive Caspase-3 sowohl im Cytoplasma als auch im kondensierten Nukleus vorhanden (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu wurde, obwohl CM1-positive Zellen in den meningealen und ektodermalen Oberflächen von Caspase-9-/--Embryonen gesehen wurden, keine solche Färbung im Nervengewebe gefunden (6B). Daher weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Caspase-9 stromaufwärts wirkt und entscheidend für die Aktivierung von Caspase-3 im entstehenden Nervensystem in vivo ist.
Während wir eine Reihe von Ausführungsformen dieser Erfindung beschrieben haben, ist es augenscheinlich, dass unsere grundlegenden Konstruktionen verändert werden können, um andere Ausführungsformen bereitzustellen, die die Produkte, Vorgehensweisen und Verfahren dieser Erfindung anwenden. Daher wird es geschätzt werden, dass der Rahmen dieser Erfindung vielmehr durch die angefügten Ansprüche als durch die spezifischen Ausführungsformen, die als Beispiel dargelegt worden sind, definiert werden soll. Sequenzprotokoll

Claims

Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder transgener, nicht-menschlicher Embryo, dessen Genom heterozygot für eine in das Caspase-9-Gen eingebrachte Mutation ist, wobei die Mutation im homozygoten Zustand in einem funktionell defekten Caspase-9-Gen und abnormaler Gehirnentwicklung resultiert.
Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder transgener, nicht-menschlicher Embryo davon, dessen Genom homozygot für eine in das Caspase-9-Gen eingebrachte Mutation ist, wobei dem Säuger oder Embryo ein funktionelles Caspase-9-Gen fehlt und das/der durch abnormale Gehirnentwicklung charakterisiert ist.
Transgener, nicht-menschlicher Säuger oder Embryo nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Tier eine Maus ist.
Zelle, isoliert von einem transgenen, nicht-menschlichen Säuger oder einem transgenen, nicht-menschlichen Embryo nach Anspruch 1 oder 2.
Zelle nach Anspruch 4, wobei die Zelle ein Thymozyt ist.