DE60034877T2

DE60034877T2 - MENSCHLICHE, FüR NEUROGENIN 3 KODIERENDE NUKLEOTIDSEQUENZEN

Info

Publication number: DE60034877T2
Application number: DE60034877T
Authority: DE
Inventors: Michael S. San Francisco GERMAN; Joseph San Francisco LIN
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-03-29
Also published as: CA2365961A1; DE60034877D1; WO2000059936A1; IL145545A; EP1165603A4; EP1165603A1; AU2004202206A1; EP1165603B1; ATE362486T1; JP2003530066A; AU770685B2; AU4049700A; IL145545A0

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen das Fachgebiet von Nucleotidsequenzen, die für Transkriptionsfaktoren kodieren, die in Wachstum und Differenzierung, insbesondere Entwicklung der Pan kreasinselzellen, involviert sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diabetes mellitus ist die dritt-häufigste Todesursache in den USA und der führende Grund für Erblindung, Nierenversagen und Amputation. Diabetes ist auch ein Hauptgrund für frühzeitige Herzinfarkte und Schlaganfall und ist für 15 % der Gesundheitsversorgungskosten der USA verantwortlich. Etwa 5 % der Amerikaner und 20 % jener über 65 Jahre haben Diabetes.
Diabetes entsteht durch das Unvermögen der β-Zellen in den Langerhansschen Inseln im Inselorgan des Pankreas, adäquates Insulin zu produzieren, um Stoffwechselbedürfnisse zu erfüllen. Diabetes wird in zwei klinische Formen unterteilt: Typ-1-Diabetes (oder insulinabhängiger Diabetes) und Typ-2-Diabetes (oder nicht-insulinabhängiger Diabetes). Typ-1-Diabetes wird durch den Verlust der insulinproduzierenden β-Zellen verursacht. Typ-2-Diabetes ist eine stärker genetisch bedingte Erkrankung als Typ-1-Diabetes (Zonana & Rimoin, N. Engl. J. Med. 295, 603 (1976)), bricht für gewöhnlich in höherem Lebensalter aus und macht etwa 90 % der Diabetesfälle in den USA aus. Bei betroffenen Personen stellt sich sowohl ein Rückgang der Kapazität des Pankreas, Insulin zu produzieren, und ein Defekt der Fähigkeit, das Insulin zu nützen (Insulinresistenz), ein. Fettleibigkeit verursacht Insulinresistenz, und etwa 80 % der Personen mit Typ-2-Diabetes sind klinisch fettleibig (mehr als 20 % über dem idealen Körpergewicht). Leider weiß etwa die Hälfte der in den USA lebenden Typ-2-Diabetiker nicht, dass sie erkrankt sind. Klinische Symptome, die mit Typ-2-Diabetes assoziiert sind, bleiben unter Umständen bis zu einem späten Krankheitsstadium unerkannt, und die Frühsignale werden oft falsch interpretiert, wodurch eine Verzögerung in der Behandlung und verstärkte Komplikationen auftre ten. Während die Rolle der Genetik in der Ätiologie von Typ-2-Diabetes klar ist, sind die genauen involvierten Gene weitgehend unbekannt.
Insulin wird ausschließlich aus β-Zellen in den Langerhansschen Inseln des Pankreas hergestellt. Im Verlauf der Entwicklung entwickeln sich die Inselzellen, einschließlich β-Zellen, aus einem nicht-differenzierten Vorläufer innerhalb der wachsenden Pankreasanlage. Beim Wachsen der Anlage werden aus den nicht-differenzierten Zellen Gänge gebildet, und es sind diese Zellen, die als Vorläufer dienen. Die Gangzellen scheinen die Kapazität zu behalten, sich während des gesamten Lebens zu Inselzellen zu differenzieren, und wenn das Pankreas geschädigt ist, bilden sich aus den Gangzellen neue Inselzellen.
Dieser Entwicklungsprozess ist aus mehreren Gründen klinisch relevant. Erstens ist die Bildung von Inselzellen und insbesondere β-Zellen notwendig, um Insulin herzustellen und den Energiestoffwechsel zu kontrollieren. Wenn der Prozess der β-Zellentwicklung in irgendeiner Weise gestört ist, prädisponiert dies diese Person für die spätere Entwicklung von Diabetes. Deshalb sind Gene, die in diesen Prozess involviert sind, Kandidatengene für neonatalen Diabetes, Maturity-Onset-Diabetes (MODY) oder Typ-2-Diabetes. Die Sequenz dieser Gene kann zur Identifikation von Personen verwendet werden, die ein Risiko aufweisen, Diabetes zu entwickeln, oder zur Entwicklung neuer pharmakologischer Mittel, um Diabetes zu vermeiden und zu behandeln.
Zweitens ist bei Personen mit Diabetes wie oben beschrieben die Insulinproduktion gestört. Bei Typ-1-Diabetes ist die Störung durch die Zerstörung der β-Zellen bedingt, während bei Typ-2-Diabetes die Insulinproduktion intakt, aber unzulänglich ist. Die Behandlung von Typ-1-Diabetes sowie von vielen Fällen von Typ-2-Diabetes kann das Ersetzen der β-Zellen umfassen. Während das Ersetzen von β-Zellen auf verschiedene Arten erreicht werden kann, ist die Entwicklung neuer β-Zellen aus Vorläuferzellen entweder in Kultur oder in vivo beim Patienten die physiologischste. Um dies zu erreichen, sind Moleküle erforderlich, welche die β-Zelldifferenzierung kontrollieren.
Aus diesen Gründen wurden im Diabetesfachgebiet beträchtliche Bemühungen angestellt, um Inselvorläuferzellen zu identifizieren und Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von Betazellen zu entwickeln. Bis heute ist dies weitgehend erfolglos geblieben. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit diesem Problem.
Relevante Literatur

Ein kloniertes Fragment von Maus-Ngn3 ist in Sommer et al., Mol. Cell. Neurosci. 8, 221 (1996), beschrieben.
cDNA und Aminosäuresequenzen von murinem Ngn3 und muriner atonaler Säugetier-Homologie-4B (MATH4B) sind in GenBank Zugangsnummer U76208 bzw. Y09167 beschrieben.
cDNA und Aminosäuresequenzen des Rattenrelaxationstranskriptionsregulators sind in GenBank Zugangsnummer Y10619 beschrieben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren zur Erzeugung einer insulinproduzierenden β-Zelle, welches das Einführen eines Ngn3-Polypeptids oder eines für Ngn3 kodierenden Vektors, der in der Lage ist, Ngn3 zu exprimieren, in Zellen einer Zellkultur und das Züchten dieser Zellkultur zur Erzeugung einer insulinproduzierenden β-Zelle; sowie die Verwendung einer für Ngn3 kodierenden Nucleinsäure oder Ngn3-Polypeptid zur Erzeugung einer insulinproduzierenden β-Zelle in einer Invitro-Zellkultur umfasst. Weitere Merkmale der Erfindung sind Wirtszellen, die ein rekombinantes Ngn3-Polypeptid oder einen rekombinanten Vektor umfassen, der für Ngn3 kodiert, worin die Wirtszelle in der Lage ist, eine insulinproduzierende Zelle zu erzeugen, und die Verwendung einer fast entwickelten oder reifen β-Zelle, die aus Zellen kultiviert wird, in die eine für Ngn3 kodierende Nucleinsäure oder ein Ngn3-Polypeptid eingeführt worden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit Ngn3 in Verbindung stehenden Erkrankung, wie z.B. Diabetes.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevor die vorliegenden Nucleotid- und Polypeptidsequenzen beschrieben werden, muss erklärt werden, dass diese Erfindung nicht auf eine besondere Methodologie, Protokolle, Zelllinie, Vektoren beschränkt ist und Reagenzien, die als solche beschrieben sind, natürlich variieren können. Es ist auch klar, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zwecke der Beschreibung von besonderen Ausführungsformen dient und den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken soll, der nur durch die Ansprüche im Anhang eingeschränkt ist.
Es muss erwähnt werden, dass, wie hierin und in den Ansprüchen im Anhang verwendet, die Singularformen „ein", „eine" und „der, die, das", wenn durch den Kontext nicht eindeutig anders angegeben, sich auch auf Pluralformen beziehen können. Daher umfasst zum Beispiel der Verweis auf „eine Wirtszelle" eine Vielzahl solcher Wirtszellen und der Verweis auf „den Antikörper" den Verweis auf einen oder mehrere Antikörper und Äquivalente davon, die Fachleuten bekannt sind, und so weiter.
Wenn nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Termini dieselbe Bedeutung, welche normalerweise ein Fachmann auf dem Fachgebiet, dem die Erfindung angehört, darunter versteht. Obwohl jegliche Verfahren, Vorrichtungen und Materialien, die den hierin beschriebenen ähnlich sind oder ihnen entsprechen, in der Umsetzung oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können, sind nun die bevorzugten Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
Alle hierin erwähnten Publikationen sind hierin durch Verweis zum Zwecke der Beschreibung und Offenbarung zum Beispiel der Zelllinien, Vektoren und Methodolo gien aufgenommen, die in den Publikationen beschrieben sind, die in Verbindung mit der gegenwärtig beschriebenen Erfindung verwendet werden können. Die hierin diskutierten Publikationen sind einzig für ihre Offenbarung vor dem Hinterlegungsdatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Nichts hierin ist als Eingeständnis auszulegen, dass die Erfinder nicht berechtigt sind, einer solchen Offenbarung durch eine vorherige Erfindung vorzugreifen.
Definitionen
„Polynucleotid" bezeichnet wie hierin verwendet ein Oligonucleotid, Nucleotid und Fragmente oder Abschnitte davon sowie Peptidnucleinsäuren (PNA), Fragmente, Abschnitte oder Antisense-Moleküle davon und DNA oder RNA von genomischem oder synthetischem Ursprung, die einzel- oder doppelsträngig sein können und den Sense- oder Antisense-Strang repräsentieren. Wo „Polynucleotid" verwendet wird, um eine spezifische Polynucleotidsequenz zu bezeichnen (z.B. ein für Ngn3-Polypeptid kodierendes Polynucleotid), umfasst „Polynucleotid" Polynucleotide, die für ein Polypeptid kodieren, das mit dem erwähnten Polypeptid funktionell äquivalent ist, z.B. Polynucleotide, die degenerierte Varianten sind, oder Polynucleotide, die für eine biologisch aktive Variante oder Fragmente des angeführten Polypeptids kodieren, einschließlich Polynucleotide, die eine wesentliche Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität in Bezug auf die hierin bereitgestellten Sequenzen aufweisen. Auf ähnliche Weise bezeichnet das hierin verwendete „Polypeptid" ein Oligopeptid, Peptid oder Protein. Wo hierin „Polypeptid" verwendet wird, um eine Aminosäuresequenz eines natürlich auftretenden Proteinmoleküls zu bezeichnen, sollen „Polypeptid" und ähnliche Termini die Aminosäuresequenz nicht auf die vollständige, native Aminosäuresequenz beschränken, die mit dem erwähnten Proteinmolekül assoziiert ist, aber stattdessen biologisch aktive Varianten oder Fragmente umfassen, einschließlich Polypeptide mit wesentlicher Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität in Bezug auf hierin bereitgestellte Aminosäuresequenzen.
Unter „Antisensepolynucleotid" versteht man ein Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz, die zu einer bestimmten Polynucleotidsequenz komplementär ist (z.B. einer Polynucleotidsequenz, die für ein Ngn3-Polypeptid kodiert), einschließlich Polynucleotidsequenzen, die mit der Transkription oder Translation der gegebenen Polynucleotidsequenz assoziiert sind (z.B. ein Promotor eines Polynucleotids, das für ein Ngn3-Polypeptid kodiert), wo das Antisense-Polynucleotid in der Lage ist, sich an eine für Ngn3-Polypeptide kodierende Polynucleotidsequenz zu binden. Von besonderem Interesse sind Antisense-Polynucleotide, die in der Lage sind, Transkription und/oder Translation eines für Ngn3 kodierenden Polynucleotids entweder in vitro oder in vivo zu hemmen.
„Peptidnucleinsäure" bezeichnet wie hierin verwendet ein Molekül, die ein Oligomer umfasst, zu welchem ein Aminosäurerest, wie z.B. Lysin, und eine Aminogruppe hinzugefügt worden sind. Diese kleinen Moleküle, die auch Antigenmittel genannt werden, stoppen die Transkriptionsverlängerung durch Bindung an ihren komplementären (Matrizen-)Strang von Nucleinsäure (Nielsen et al., Anticancer Drug. Des. 8, 53–63(1993)).
Wie hierin verwendet bezeichnet „Ngn3-Polypeptid" eine Aminosäuresequenz eines rekombinanten oder nicht-rekombinanten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von (i) einem nativen Ngn3-Polypeptid, ii) einem biologisch aktiven Fragment eines Ngn3-Polypeptids, iii) von biologisch aktiven Polypeptidanaloga eines Ngn3-Polypeptids oder (iv) einer biologisch aktiven Variante eines Ngn3-Polypeptids. Ngn3-Polypeptide der Erfindung können aus einer beliebigen Spezies gewonnen werden, z.B. Säugetier- oder Nichtsäugetier (z.B. Reptilien, Amphibien, Vögel (z.B. Huhn)), insbesondere Säugetier, einschließlich Menschen, Nagetieren (z.B. murinen oder Ratten), bovinen, ovinen, porcinen, murinen oder equinen Spezies, vorzugsweise Ratte oder Mensch, aus einer natürlichen, synthetischen, halbsynthetischen oder rekombinanten Quelle. „Menschliches Ngn3-Polypeptid" bezeichnet die Aminosäuresequenzen von isoliertem menschlichem Ngn3-Polypeptid, das aus einem Menschen erhalten wird, und soll alle natürlich auftretenden Allelvarianten umfassen und die Aminosäuresequenz nicht auf die vollständige native Aminosäuresequenz beschränken, die mit dem erwähnten Proteinmolekül in assoziiert ist.
Wie hierin verwendet bezeichnet „eine Antigenaminosäuresequenz" eine Aminosäuresequenz, die entweder alleine oder in Verbindung mit einem Trägermolekül eine Antikörperantwort in einem Säugetier auslösen kann.
Eine „Variante" eines menschlichen Ngn3-Polypeptids wird als Aminosäuresequenz definiert, die durch eine oder mehrere Aminosäuren verändert ist. Die Variante kann „konservative" Veränderungen aufweisen, worin eine substituierte Aminosäure ähnliche Strukturen oder chemische Eigenschaften aufweist, z.B. das Ersetzen von Leucin durch Isoleucin. Seltener kann eine Variante „nichtkonservative" Veränderungen aufweisen, z.B. das Ersetzen eines Glycins mit einem Tryptophan. Ähnliche geringfügige Varianten können auch Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beides umfassen. Anleitungen zur Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne biologische oder immunologische Aktivität abzuschaffen, kann unter Einsatz von fachbekannten Computerprogrammen festgestellt werden, z.B. DNAStar-Software.
Eine „Deletion" wird als Veränderung von entweder Aminosäure- oder Nucleotidsequenz definiert, in welcher eine oder mehrere Aminosäure- bzw. Nucleotidreste im Vergleich zu einer Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz eines natürlich auftretenden Ngn3-Polypeptids fehlen.
Eine „Insertion" oder „Addition" ist diese Veränderung in einer Aminosäure- oder Nucleotidsequenz, die zur Addition einer oder mehrerer Aminosäure- oder Nucleotidreste im Vergleich zu einer Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz eines natürlich auftretenden Ngn3-Polypeptids geführt haben.
Eine „Substitution" resultiert aus dem Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren oder Nucleotide durch unterschiedliche Aminosäuren oder Nucleotide im Vergleich zu einer Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz eines natürlich auftretenden Ngn3-Polypeptids.
Der Begriff „biologisch wirksam" bezeichnet menschliches Ngn3-Polypeptid mit strukturellen, regulierenden oder biochemischen Funktionen eines natürlich auftretenden Ngn3-Polypeptdis. Auf ähnliche Weise definiert „immunologisch aktiv" die Fähigkeit eines natürlichen, rekombinanten oder synthetischen menschlichen Ngn3-Polypeptids oder eines Oligopeptids davon, eine spezifische Immunantwort bei einem geeigneten Tier oder Zellen zu induzieren und sich mit spezifischen Antikörpern zu verbinden.
Der Begriff „Derivat" bezeichnet wie hierin verwendet die chemische Modifikation einer Nucleinsäure, die für ein menschliches Ngn3-Polypeptid kodiert, oder des menschlichen Ngn3-Polypeptids, für welches kodiert wird. Das Ersetzen von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe kann eine solche Modifikation veranschaulichen. Ein Nucleinsäurederivat kodiert für ein Polypeptid, das wesentliche biologische Eigenschaften eines natürlichen Ngn3-Polypeptids behält.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „isoliert" eine Verbindung von Interesse (z.B. entweder ein Polynucleotid oder ein Polypeptid), das sich in einer Umwelt befindet, die sich von jener unterscheidet, in der die Verbindung natürlich auftritt. „Isoliert" bezeichnet Verbindungen, die innerhalb von Proben vorliegen, die für die Verbindung von Interesse im Wesentlichen angereichert sind und/oder in welchen die Verbindung von Interesse teilweise oder im Wesentlichen gereinigt ist.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „im Wesentlichen gereinigt" eine Verbindung (z.B. entweder ein Polynucleotid oder ein Polypeptid), die aus einer natürlichen Umwelt entfernt wird und zumindest zu 60 % frei, vorzugsweise 75 % frei und am bevorzugtesten 90 % frei, von anderen Komponenten ist, mit welchen es natürlich assoziiert ist.
„Stringenz" tritt typischerweise in einem Bereich von etwa Tm – 5°C (5°C unter der Tm der Sonde) bis etwa 20°C bis 25°C unter Tm auf. Wie Fachleute verstehen werden, kann eine Stringenzhybridisierung verwendet werden, um identische Polynucle otidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren oder ähnliche oder verwandte Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
Der Begriff „Hybridisierung" umfasst wie hierin verwendet „ein Verfahren, durch welches ein Strang von Nucleinsäure sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung bindet" (Coombs, Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY (1994)). Amplifikation, wie sie in der Polymerasekettenreaktionstechnologie durchgeführt wird, ist in Dieffenbach et al., PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY (1995), beschrieben.
Unter „Transformation" versteht man eine permanente oder vorübergehende genetische Veränderung, vorzugsweise eine permanente genetische Veränderung, die in einer Zelle nach Inkorporation von neuer DNA (d.h. DNA exogen zur Zelle) induziert wird. Genetische Veränderung kann entweder durch Inkorporation der neuen DNA in das Genom der Wirtszelle oder durch vorübergehende oder stabile Aufrechterhaltung der neuen DNA als episomales Element erreicht werden. Wo die Zelle eine Säugetierzelle ist, kann eine permanente genetische Veränderung im Allgemeinen durch die Einführung von DNA in das Genom der Zelle erreicht werden.
Unter „Konstrukt" versteht man eine rekombinante Nucleinsäure, im Allgemeinen rekombinante DNA, die zum Zwecke der Expression von (einer) spezifischen Nucleotidsequenz(en) erzeugt worden ist oder zur Herstellung anderer rekombinanter Nucleotidsequenzen verwendet werden soll.
Unter „operabel gebunden" versteht man, dass eine DNA-Sequenz und (eine) Regulationssequenz(en) so verbunden sind, dass sie Genexpression erlauben, wenn die geeigneten Moleküle (z.B. Transkriptionsaktivatorproteine) an die Regulationssequenz(en) gebunden sind.
Unter „operativ insertiert" versteht man, dass eine Nucleotidsequenz von Interesse an eine Nucleotidsequenz angrenzend positioniert ist, welche die Transkription und Translation der eingeführten Nucleotidsequenz von Interesse steuert (d.h. die Pro duktion von z.B. einem Polypeptid erleichtert, für welches eine Ngn3-Sequenz kodiert).
Unter einer „Ngn3-assozierten Erkrankung" versteht man ein physiologisches Leiden oder eine Erkrankung assoziiert mit geänderter Ngn3-Funktion (z.B. aufgrund von abnormer Ngn3-Expression oder einem Defekt bei der Ngn3-Expression oder im Ngn3-Protein). Solche mit Ngn3 assoziierte Erkrankungen können Erkrankungen umfassen, müssen aber nicht notwendigerweise auf diese beschränkt sein, die mit reduzierten Insulinspiegeln oder der Fähigkeit assoziiert sind, Insulin zu nützen (z.B. Hyperglykämie, Diabetes (z.B. Typ-1- und Typ-2-Diabetes) und dergleichen).
Unter „Subjekt" oder „Patient" versteht man ein Säugetiersubjekt, für welches eine Diagnose oder Therapie erwünscht ist, insbesondere Menschen. Andere Subjekte können Rinder, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Pferde und so weiter umfassen. Von besonderem Interesse sind Subjekte mit Ngn3-assoziierten Erkrankungen, die behandelt werden können (z.B. um Symptome, die mit der Erkrankung assoziiert sind, zu lindern) durch Expression von für Ngn3 kodierender Nucleinsäure in einer Zelle des Subjekts (z.B. durch In-vivo-Einführung der für Ngn3 kodierenden Nucleinsäure in das Subjekt oder durch Einpflanzen von Ngn3-exprimierenden Zellen (z.B. β-Zellvorläufern) oder fast entwickelten oder reifen β-Zellen, die aus Ngn3-exprimierenden Zellen kultiviert werden, in das Subjekt, wobei die Zellen Insulin produzieren).
Der Begriff „Transgen" wird hierin verwendet, um Genmaterial zu beschreiben, das künstlich in das Genom eines Säugetiers insertiert worden ist oder wird, insbesondere in eine Säugetierzelle eines lebenden Tiers.
Unter „transgenem Organismus" versteht man einen nicht-menschlichen Organismus (z.B. einzellige Organismen (z.B. Hefe), Säugetiere, Nicht-Säugetiere (z.B. Nematode oder Drosophila)) mit einer nicht-endogenen (d.h. heterologen) Nucleinsäuresequenz, die als extrachromosomales Element in einem Teil ihrer Zellen vorliegt oder stabil in ihre Keimbahn-DNA integriert ist.
Unter einem „transgenen Tier" versteht man ein nicht-menschliches Tier, für gewöhnlich ein Säugetier, mit einer nicht-endogenen (d.h. heterologen) Nucleinsäuresequenz, die als extrachromosomales Element in einem Teil ihrer Zelle vorliegt oder stabil in ihre Keimbahn-DNA integriert ist (d.h. in der Genomsequenz der meisten oder aller ihrer Zellen). Heterologe Nucleinsäure wird in die Keimbahn solcher transgenen Tiere durch genetische Manipulation von z.B. Embryos oder embryonalen Stammzellen des Wirtstiers eingeführt.
Ein „Knock-Out" eines Targetgens bedeutet eine Änderung der Sequenz des Gens, die zu einem Rückgang der Funktion des Targetgens führt, vorzugsweise einer solchen, dass Targetgenexpression nicht-detektierbar oder insignifikant ist. Ein Knockout eines Ngn3-Gens bedeutet, dass die Funktion des Ngn3-Gens im Wesentlichen verringert worden ist, sodass Ngn3-Epression nicht detektierbar ist oder nur in unbedeutendem Ausmaß gegenwärtig ist. Transgene „Knock-out"-Oragnismen der Erfindung können transgene Tiere mit einem heterozygoten Knock-out des Ngn3-Gens oder einem homozygoten Knock-out des Ngn3-Gens sein. „Knock-outs" umfassen auch bedingte Knock-outs, wo eine Änderung des Tartgetgens z.B. nach Exposition jedes Tiers gegenüber einer Substanz erfolgt, welche die Targetgenänderung fördert, nach Einführung eines Enzyms, das Rekombination der Targetgenstelle fördert (z.B. Cre im Cre-Lox-System), oder nach einem anderen Verfahren zur postnatalen Steuerung der Targetgenänderung.
Ein „Knock-In" eines Targetgens bedeutet eine Änderung des Wirtszellgenoms, die zu einer geänderten Expression des Targetgens führt (z.B. erhöhter (einschließlich ektopischer) oder verringerter Expression), z.B. durch Einführung einer weiteren Kopie des Targetgens oder durch operatives Einführen einer regulierenden Sequenz, die eine erhöhte Expression einer endogenen Kopie des Targetgens bereitstellt. Transgene „Knock-in"-Organismen der Erfindung können transgene Tiere mit einem heterozygoten Knock-in des Ngn3-Gens oder einem homozygoten Knock-in des Ngn3-Gens umfassen. „Knock-ins" umfassen auch bedingte Knock-ins.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifikation und Isolation einer Polynucleotidsequenz, die für ein menschliches Neurogenin3-(Ngn3-) Polypeptid kodiert, sowie der menschlichen und murinen Ngn3-Promotoren. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung solche für menschliches Ngn3-Polypeptid kodierenden Polynucleotide sowie menschliche Ngn3-Polypeptide, für welche solche Polynucleotide kodieren. Expression von Ngn3 ist an die Pankreasentwicklung gebunden. Speziell ist die Ngn3-Expression der frühest verfügbare Marker von Zellen, die sich in Inselzellen entwickeln. Da Ngn3-Expression ausgelöscht ist, bevor die Zellen vollständig differenziert sind, markiert Ngn3 in einzigartiger Weise die Vorläuferzellen. Der Beweis, dass diese Zellen Inselzellvorläufer sind, basiert auf drei Beweisstücken: 1) Expressionsmuster. Ngn3-Zellen sind über die Pankreasgangzellen verstreut, wobei eine geringe Zahl an die Gänge angrenzend gegenwärtig ist. 2) Timing. Das Auftreten von Ngn3-positiven Zellen erfolgt parallel zur Bildung von neuen Inselzellen während der Entwicklung. 3) Ngn3-positive Zellen co-exprimieren andere endokrine Transkriptionsfaktoren, einschließlich β-Zelltranskriptionsfaktor Nkx-6.1. Es ist bekannt, dass Nkx6.1 in β-Zellen und β-Zellvorläufern in diesem Stadium der Pankreasentwicklung exprimiert wird, und das Knock-out des Nkx-6.1-Gens in Mäusen verursacht einen spezifischen Defekt der β-Zellentwicklung, aber keinen Defekt in der Bildung von anderen Pankreaszellen (siehe z.B. WO 99/05258 ).
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der hierin offenbarten Polynucleotide, um die Identifikation und Isolation von Polynucleotid- und Polypeptidsequenzen mit Homologie zu einem menschlichen Ngn3-Polypeptid der Erfindung zu erleichtern. Die menschlichen Ngn3-Poylpeptide und -Polynucleotide der Erfindung sind auch zur Identifikation von Verbindungen, die menschliches Ngn3-Polypeptid binden, nützlich, insbesondere Verbindungen, die menschliches Ngn3-Polypeptid binden, mit Agonisten- oder Antagonistaktivität für menschliches Ngn3-Polypeptid. Zusätzlich dazu sind die menschlichen Ngn3-Polypeptide und -Polynucleotide der Erfindung in der Diagnose, Prävention und Behandlung von Erkrankung, die mit der biologischen Aktivität des menschlichen Ngn3-Polypeptids assoziiert ist, nützlich.
Die für menschliches Ngn3-Polypeptid kodierenden Polynucleotide der Erfindung können auch in der Entwicklung von β-Zellen in Kultur und in vivo verwendet werden, als Molekularsonde, mit welcher die Struktur, der Ort und die Expression des menschlichen Ngn3-Polypeptids und verwandter Polypeptide in Säugetieren (einschließlich Menschen) bestimmt werden, und zur Untersuchung potenzieller Assoziationen zwischen Erkrankungszuständen oder klinischen Erkrankungen und Defekten oder Änderungen der Struktur, Expression oder Funktion des menschlichen Ngn3-Polypeptids.
Ngn3-Nucleinsäure
Der Begriff „Ngn3-Gen" wird generisch verwendet, um Ngn3-Gene und ihre alternierenden Formen zu bezeichnen. „Ngn3-Gen" soll auch den offenen Leseraster, der für spezifische Ngn3-Polypeptide kodiert, Introns und angrenzende nichtkodierende 5'- und 3'-Nucleotidsequenzen bezeichnen, die in die Regulation von Expression involviert sind, von bis zu etwa 1 kb über der kodierenden Region, aber möglicherweise weiter in beide Richtungen. Die DNA-Sequenzen, die für Ngn3 kodieren, können cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment davon sein. Das Gen kann in einen geeigneten Vektor zur extrachromosomalen Aufrechterhaltung und zur Integration in den Wirt eingeführt werden.
Der wie hierin verwendete Begriff „cDNA" soll alle Nucleinsäuren umfassen, welche die Anordnung der Sequenzelemente teilen, die in nativen reifen mRNA-Spezies zu finden sind, wo Sequenzelemente Exons (z.B. Sequenzen, die für offene Leseraster des kodierten Polypeptids kodieren) und nicht-kodierende 3'- und 5-Regionen sind. Normalerweise haben mRNA-Spezies zusammenhängende Exons mit den dazwischen liegenden Introns, die durch Kern-RNA-Spleißen entfernt werden, um einen kontinuierlichen offenen Leseraster zu schaffen, der für das Ngn3-Polypeptid kodiert.
Während andere genomische Ngn3-Sequenzen anderer Quellen keine nicht zusammenhängenden offenen Leseraster aufweisen (z.B. wo introns die für Protein kodierenden Regionen unterbrechen), hat die menschliche genomische Ngn3-Sequenz keine Introns, welche die kodierende Sequenz unterbrechen. Eine genomische Sequenz von Interesse umfasst die Nucleinsäure, die zwischen dem Initiationscodon und dem Stoppcodon gegenwärtig ist, wie in den angeführten Sequenzen definiert, einschließlich alle Introne, die normalerweise in einem nativen Chromosom gegenwärtig sind. Sie kann weiters die nicht-translatierten 3'- und 5'-Regionen umfassen, die in der reifen mRNA zu finden sind. Sie kann weiters spezifische Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen umfassen, wie z.B. Promotoren, Enhancer etc., einschließlich etwa 1 kb, aber möglicherweise mehr, von flankierender genomischer DNA, entweder am 5'- oder 3'-Ende der transkribierten Region. Die genomische DNA kann als Fragment von 100 kbp oder weniger isoliert werden und im Wesentlichen frei von flankierender Chromosomensequenz sein.
Die Sequenz dieser 5'-Region und weiterer 5'-Stromaufsequenzen und 3'-Stromabsequenzen kann für Promotorelemente verwendet werden, einschließlich Enhancerbindungsstellen, die Expression in Geweben bereitstellen, wo Ngn3 exprimiert wird. Die Sequenzen der Ngn3-Promotorelemente der Erfindung können auf den Nucleotidsequenzen beliebiger Spezies basieren (z.B. Säugetier oder Nicht-Säugetier (z.B. Reptilien, Amphibien, Vögel (z.B. Huhn)), insbesondere Säugetier, einschließlich Menschen, Nagetieren (z.B. murine oder Ratten), boviner, oviner, porciner, muriner oder equiner Spezies, vorzugsweise Ratte oder Mensch) und können aus einer beliebigen Quelle isoliert oder produziert werden, ob sie natürlich, synthetisch, halbsynthetisch oder rekombinant ist.
Die gewebsspezifische Expression von Ngn3 ist zur Bestimmung des Expressionsmusters nützlich und zur Bereitstellung von Promotoren, die das native Expressionsmuster nachahmen. Natürlich auftretende Polymorphismen in der Promotorregion sind zur Bestimmung natürlicher Variationen in der Expression nützlich, insbesondere jene, die mit Erkrankung assoziiert sein können. Alternativ dazu können Mutationen in die Promotorregion eingeführt werden, um die Wirkung geänderter Expression in experimentell definierten Systemen zu bestimmen. Verfahren zur Identifikation spezifischer DNA-Motive, die in die Bindung von Transkriptionsfaktoren involviert sind, sind fachbekannt, z.B. Sequenzähnlichkeit zu bekannten Bindungsmotiven, Gel-Retentionsanalysen etc. Für Beispiele siehe Blackwell et al., Mol. Med. 1, 194–205 (1995), Mortlock et al., Genome Res. 6, 327–33 (1996), und Joulin und Richard-Foy, Eur. J. Biochem. 232, 620–626 (1995).
In einer Ausführungsform wird der Ngn3-Promotor dazu verwendet, die Expression von Genen auf Inselzellvorläufern zu steuern. Wie unten diskutiert, wird Ngn3 in Inselzellvorläufern während der Entwicklung von β-Zellen exprimiert. Daher kann die in der Entwicklung getimte Expression, die vom Ngn3-Promotor gelenkt wird, dazu genutzt werden, die Expression von heterologen Genen zu erleichtern, die operabel an den Ngn3-Promotor gebunden sind. Exemplarische Gene von Interesse, die aus dem Ngn3-Promotor exprimiert werden können, umfassen Gene, die für Wachstumsfaktoren oder Onkogene kodieren (z.B. um die β-Zellvorläuferpopulation auszudehnen und/oder unbegrenzt zu vermehren), Markergene (z.B. zur Markierung der Vorläuferzellen zur Selektion und/oder Verfolgung), Reportergene (z.B. Luciferase, CAT etc. z.B. zur Identifikation von Mechanismen zur Regulation des Ngn3-Promotors und/oder zur Suche nach bioaktiven Mitteln (z.B. Kandidatenpharmazeutika), die den Promotor regulieren) und dergleichen, sind aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt.
Die Regulationssequenzen können dazu verwendet werden, cis-wirkende Sequenzen zu identifizieren, die zur Transkriptions- oder Translationsregulation von Ngn3-Expression erforderlich sind, insbesondere in verschiedenen Geweben oder Entwicklungsstadien und zur Identifikation von cis-wirkenden Sequenzen und trans-wirkenden Faktoren, die Ngn3-Expression regulieren oder vermitteln. Solche Transkriptions- oder Translationskontrollregionen können operabel an ein Ngn3-Gen oder andere Gene gebunden sein, um die Expression von Wildtyp- oder geänderten Ngn3- oder anderen Proteinen von Interesse in den kultivierten Zellen oder in embryonalen, fötalen oder erwachsenen Geweben zu fördern, und zur Gentherapie. Ngn3- Transkriptions- oder -Translationskontrollregionen können auch dazu verwendet werden, extrazelluläre Signalmoleküle zu identifizieren, die Ngn3-Promotoraktivität und daher die Ngn3-Expression und Inselzellbildung regulieren.
Die Nucleinsäurezusammensetzungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können in geeigneter Form für alle oder einen Teil der Ngn3-Polypeptide kodieren. Fragmente der DNA-Sequenz können durch chemische Synthese von Oligonucleotiden gemäß herkömmlicher Verfahren, durch Restriktionsenzymverdau, durch PCR-Amplifikation etc. erhalten werden. Meistens bestehen DNA-Fragmente aus zumindest zehn zusammenhängenden Nucleotiden, für gewöhnlich zumindest etwa 15 nt, noch üblicher zumindest etwa 18 nt bis etwa 20 nt, noch üblicher zumindest etwa 25 nt bis etwa 50 nt. Solche kleinen DNA-Fragmente sind als Primer für PCR, für das Hybridisierungsscreening etc. nützlich. Größere DNA-Fragmente, d.h. größer als 100 nt, sind zur Produktion des Polypeptids nützlich, für welches kodiert wird. Zur Verwendung in Amplifikationsreaktionen, wie z.B. PCR, wird ein Primer-Paar verwendet. Die exakte Zusammensetzung der Primersequenzen ist für die Erfindung nicht entscheidend, aber für die meisten Anwendungen hybridisieren die Primer unter stringenten Bedingungen an die betreffende Sequenz, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Es ist bevorzugt, ein Primerpaar auszuwählen, das ein Amplifikationsprodukt von zumindest etwa 50 nt, vorzugsweise zumindest etwa 100 nt, erzeugt. Algorithmen zur Selektion von Primersequenzen sind im Allgemeinen bekannt und in handelsüblichen Softwarepaketen verfügbar. Amplifikationsprimer hybridisieren an komplementäre Stränge von DNA und primen gegeneinander.
Das Ngn3-Gen wird in wesentlicher Reinheit isoliert und erhalten, im Allgemeinen als ein Gen, das kein intaktes Säugetierchromosom ist. Für gewöhnlich wird DNA im Wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuresequenzen erhalten, die keine Ngn3-Sequenz oder Fragment davon erhalten, wobei diese im Allgemeinen zumindest etwa 50 %, für gewöhnlich zumindest etwa, 90 % rein und typischerweise „rekombinant" ist, d.h. flankiert von einem oder mehreren Nucleotiden, mit welchen sie normalerweise nicht auf einem natürlich auftretenden Chromosom assoziiert ist.
Die DNA-Sequenzen werden auf verschiedenste Weise verwendet. Sie können als Sonden zur Identifikation von Homologen von Ngn3 verwendet werden. Säugetierhomologe haben wesentliche Sequenzähnlichkeit miteinander, d.h. zumindest 75 %, für gewöhnlich zumindest 90 %, noch gewöhnlicher 95 %, Sequenzidentität. Sequenzähnlichkeit und Sequenzidentität werden basierend auf einer Referenzsequenz berechnet, die eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein kann, wie z.B. ein konserviertes Motiv, eine kodierende Region, flankierende Region etc. Eine Referenzsequenz ist üblicherweise zumindest etwa 18 nt lang, noch üblicher zumindest etwa 30 nt lang, und kann sich bis zur vollständigen, Sequenz erstrecken, die verglichen wird. Algorithmen zur Sequenzanalyse sind fachbekannt, wie z.B. BLAST, die in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403–10 (1990), beschrieben sind. Zum Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird die prozentuelle Identität für die Polynucleotide der Erfindung unter Einsatz des BLASTN-Programms mit den Standard-Einrichtungen wie in http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jform=0 mit ausgewähltem DUST-Filter bestimmt. Der DUST-Filter ist auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/filtered.html beschrieben.
Nucleinsäuren mit Sequenzähnlichkeit werden durch Hybridisierung unter Bedingungen geringer Stringenz detektiert, z.B. bei 50°C und 6 X SSC (0,9 M Kochsalzlösung/0,09 M Natriumcitrat), und bleiben gebunden, wenn sie einer Waschung bei 55°C in 1 X SSC (0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat) unterworfen werden. Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter höchst stringenten Bedingungen bestimmt werden, z.B. bei 50°C oder höher und 0,1 X SSC (15 mM Kochsalzlösung/0,15 mM Natriumcitrat). Durch die Verwendung von Sonden, insbesondere markierten Sonden, von DNA-Sequenzen können homologe oder verwandte Gene isoliert werden. Die Quelle homologer Gene kann jede beliebige Spezies sein, z.B. Primatenspezies, insbesondere Menschen, Nagetiere, wie z.B. Ratten und Mäuse, Hunde, Katzen, Rinder, Schafe, Pferde, Hefe, Drosophila, Caenhorabditis etc.
Die für Ngn3 kodierende DNA kann dazu verwendet werden, die Expression des Gens in einer biologischen Probe zu identifizieren. Die Art, in welcher Zellen auf die Gegenwart von besonderen Nucleotidsequenzen, als genomische DNA oder RNA, sondiert werden, ist in der Literatur gut etabliert und erfordert hier keine weitere Ausführung. mRNA wird aus einer Zellprobe isoliert. mRNA kann durch RT-PCR unter Einsatz reverser Transkriptase amplifiziert werden, um einen komplementären DNA-Strang zu bilden, gefolgt von Polymerasekettenreaktionsamplifikation unter Einsatz von Primern, die für die betreffenden DNA-Sequenzen spezifisch sind. Alternativ dazu wird die mRNA-Probe durch Gelelektrophorese getrennt, auf einen geeigneten Träger transferiert, z.B. Nitrocellulose, Nylon etc., und dann mit einem Fragment der betreffenden DNA als Sonde sondiert. Andere Verfahren, wie z.B. Oligonucleotidligationstest, In-situ-Hybridisierungen und Hybridisierung an DNA-Sonden, die auf einem festen Chip angeordnet werden, können ebenfalls Anwendung finden. Detektion von mRNA, die an eine Ngn3-Sequenz hybridisiert, zeigt Ngn3-Genexpression in der Probe.
Die Ngn3-Nucleinsäuresequenz kann aus einer Reihe von Gründen modifiziert werden, insbesondere wo sie intrazellulär verwendet werden, zum Beispiel durch Bindung an ein Nucleinsäurespaltmittel, z.B. ein chelatiertes Metallion, wie z.B. Eisen oder Chrom, zur Spaltung des Gens; oder dergleichen.
Die Sequenz des Ngn3-Lokus, einschließlich flankierender Promotorregionen und kodierender Regionen, kann auf verschiedenste fachbekannte Art mutiert werden, um Veränderungen der Promotorstärke, der Sequenz des Proteins, für welches kodiert wird, etc., auf welche abgezielt wird, zu erzeugen. Die DNA-Sequenz oder das Produkt einer solchen Mutation ist im Wesentlichen den hierin bereitgestellten Sequenzen ähnlich, d.h. sie werden sich durch zumindest ein Nucleotid oder eine Aminosäure unterscheiden und können sich durch zumindest zwei, aber nicht mehr als zehn Nucleotide oder Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzänderungen können Substitutionen, Insertionen oder Deletionen sein. Deletionen können weiters große Änderungen umfassen, wie z.B. Detektion einer Domäne oder eines Exons. Andere Modifikationen von Interesse umfassen Epitopmarkierung, z.B. mit dem FLAG-System, HA etc. Für Studien der subzellulären Lokalisierung können Fusionsproteine mit grünfluoreszierenden Proteinen (GFP) verwendet werden. Solche mutierten Gene können verwendet werden, um Struktur-Funktionsbeziehungen von Ngn3- Polypeptiden mit anderen Polypeptiden zu studieren (z.B. Nkx-6.1, das mit Ngn3 coexprimiert wird) oder um Eigenschaften der Proteine zu ändern, die deren Funktion oder Regulation beeinflussen. Solche modifizierten Ngn3-Sequenzen können zum Beispiel zur Erzeugung von transgenen Tieren verwendet werden.
Es sind Verfahren zur In-vitro-Mutagenese klonierter Gene bekannt. Beispiele für Protokolle zum Scannen von Mutationen sind in Gustin et al., Biotechniques 14, 22 (1993); Barany, Gene 37, 111–23 (1985), Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. 199, 537–9 (1985), und Prentki et al., Gene 29, 303–13 (1984), beschrieben. Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, 15.3–15.108 (1989), Weiner et al., Gene 126, 35–41 (1993), Sayers et al., Biotechniques 13, 592–6 (1992), Jones und Winistorfer, Biotechniques 12, 528–30 (1992), Barton et al., Nucleic Acids Res. 18, 7349–55 (1990), Marotti und Tomich, Gene Anal. Tech. 6, 67–70 (1989), und Zhu, Anal. Biochem. 177, 120–4 (1989), beschrieben.
Transgene Ngn3-Tiere
Die für Ngn3 kodierenden Nucleinsäuren können dazu verwendet werden, genetisch modifzierte nicht-menschliche Tiere oder ortsspezifische Genmodifikationen in Zelllinien zu erzeugen. Der Begriff „transgen" soll genetisch modifizierte Tiere mit einer Deletion oder einem anderen Knock-out von Ngn3-Genaktivität umfassen, mit einem exogenen Ngn3-Gen, das in den Wirtszellen stabil transmittiert wird, „Knock-in" mit geänderter Ngn3-Genexpression oder mit einem exogenen Ngn3-Promotor, der operabel an ein Reportergen gebunden ist. Von besonderem Interesse sind homozygote und heterozygote Knock-outs von Ngn3.
Transgene Tiere können durch homologe Rekombination erzeugt werden, wo der Ngn3-Lokus geändert wird. Alternativ dazu wird ein Nucleinsäurekonstrukt zufällig in das Genom integriert. Vektoren zur stabilen Integration umfassen Plasmide, Retroviren und andere Tierviren, YACs und dergleichen. Transgene Säugetiere sind von Interesse, vorzugsweise ein Säugetier einer Gattung, ausgewählt aus der Gruppe be stehend aus Mus (z.B. Mäuse), Rattus (z.B. Ratten), Oryctologus (z.B. Kaninchen) und Mesocricetus (z.B. Hamster). Noch bevorzugter ist das Tier eine Maus, die einen Defekt oder eine andere Änderung der Ngn3-Genexpression oder -Funktion aufweist. Ohne sich an die Theorie halten zu müssen, ist Ngn3 ein Transkriptionsfaktor, der in Inselzellvorläufern während der Entwicklung des Pankreas exprimiert wird, wobei transgene Tiere, die über geänderte Ngn3-Genexpression verfügen, nützliche Modelle der Pankreasentwicklung sind.
Ein „Knock-out"-Tier wird genetisch manipuliert, um endogene Ngn3-Funktion im Wesentlichen zu reduzieren oder zu eliminieren, vorzugsweise so, dass die Targetgenexpression nicht detektierbar oder insignifikant ist. Verschiedene Ansätze können dazu verwendet werden, das „Knock-out" zu erreichen. Es kann eine Chromosomendeletion aller oder eines Teils des nativen Ngn3-Homologs induziert werden. Deletionen von nicht-kodierenden Regionen, insbesondere der Promotorregion, regulierenden 3'-Sequenzen, Enhancern oder Deletionen von einem Gen, das die Expression der Ngn3-Gene aktiviert. Ein funktionelles Knock-out kann auch durch die Einführung eins Anti-Sense-Konstrukts erreicht werden, das die Expression des nativen Ngn3-Gens blockiert (siehe zum Beispiel Li und Cohen, Cell 85, 319–329 (1996)).
Es können ebenfalls bedingte Knock-outs von Ngn3-Genfunktion erzeugt werden. Bedingte Knock-outs sind transgene Tiere, die einen Defekt der Ngn3-Genfunktion nach Exposition des Tiers gegenüber einer Substanz zeigen, welche die Targetgenänderung fördert, Einführung eines Enzyms, das die Rekombination an der Targetgenstelle fördert (z.B. Cre im Cre-LoxP-System), oder ein anderes Verfahren zur Steuerung der Targetgenänderung.
Zum Beispiel kann ein transgenes Tier mit einem bedingten Knock-out des Ngn3-Gens unter Einsatz von Cre-loxP-Rekombinationssystem produziert werden (siehe z.B. Kilby et al., Trends Genet. 9, 413–421 (1993)). Cre ist ein Enzym, das die DNA zwischen zwei Erkennungsstellen spaltet, das loxP genannt wird. Dieses System kann auf eine Reihe von Arten verwendet werden, um bedingte Knock-outs von Ngn3 zu schaffen. Zum Beispiel können zwei unabhängige transgene Mäuse produ ziert werden: ein Transgen für eine Ngn3-Sequenz, flankiert von loxP-Stellen, und ein zweites Transgen für Cre. Das Cre-Transgen kann unter der Kontrolle eines induzierbaren oder durch die Entwicklung regulierten Promotors stehen (Gu et al., Cell 73, 1155–1164 (1993), Gu et al., Science 265, 103–106 (1994)) oder unter der Kontrolle eines gewebsspezifischen oder zelltypspezifischen Promotors (z.B. eines pankreasspezifischen Promotors oder gehirngewebsspezifischen Promotors). Das Ngn3-Transgen wird dann mit dem Cre-Transgen gekreuzt, um Nachkommen, denen das Ngn3-Gen fehlt, nur in jenen Zellen zu produzieren, die Cre während der Entwicklung exprimierten.
Es können transgene Tiere erzeugt werden, die ein exogenes Ngn3-Gen besitzen. Zum Beispiel kann das transgene Tier ein „Knock-in" eines Ngn3-Gens umfassen, sodass das Wirtszellgenom eine Änderung enthält, die zu geänderter Expression eines Ngn3-Gens führt (z.B. erhöhter (einschließlich ektopischer) oder verringerter Expression), z.B. durch Einführung einer weiteren Kopie des Targetgens oder durch operative Insertion einer Regulationssequenz, die eine erhöhte Expression einer endogenen Kopie des Targetgens bereitstellt. Transgene „Knock-in"-Organismen können aus transgenen Tieren bestehen, die Ober ein heterozygotes „Knock-in" des Ngn3-Gens oder ein homozygotes Knock-in des Ngn3 verfügen. „Knock-ins" umfassen auch bedingte Knock-Ins.
Das exogene Gen, das in das Wirtszellgenom eingeführt wird, um ein transgenes Tier zu erzeugen, stammt für gewöhnlich entweder aus einer anderen Spezies als der Tierwirt oder wird andererseits in ihrer kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz geändert. Das eingeführte Gen kann ein Wildtypgen, ein natürlich auftretender Polymorphismus oder eine genetisch manipulierte Sequenz sein, zum Beispiel jene, die zuvor beschrieben sind, die über Deletionen, Substitutionen oder Insertionen in den kodierenden oder nicht-kodierenden Regionen verfügen. Die eingeführte Sequenz kann für ein Ngn3-Polypeptid kodieren oder den Ngn3-Promotor verwenden, der operabel an ein Reportergen gebunden ist. Wo das eingeführte Gen eine kodierende Sequenz ist, ist es für gewöhnlich operabel an einen Promotor, der konstitutiv oder induzierbar ist, und andere Regulationssequenzen gebunden, die für Expression im Wirtstier erforderlich sind.
Spezifische Konstrukte von Interesse umfassen unter anderem Anti-Sense-Ngn3 oder ein Ribozym basierend auf einer Ngn3-Sequenz, die Ngn3-Expression sowie Expression von dominant negativen Ngn3-Mutationen und Überexpression eines Ngn3-Gens blockieren. Ein detektierbarer Marker, wie z.B. lacZ, kann in den Ngn3-Lokus eingeführt werden, wo eine Hinaufregulierung der Expression des entsprechenden Ngn-Gens zu einer einfach detektierbaren Veränderung des Phänotyps führt. Konstrukte, die eine Promotorregion der Ngn3-Gene in Kombination mit dem Reportergen oder mit der kodierenden Region von Ngn3 verwenden, sind ebenfalls von Interesse. Konstrukte, die über eine Sequenz verfügen, die für ein trunkiertes oder geändertes (z.B. mutiertes) Ngn3 kodieren, sind ebenfalls von Interesse.
Die modifizierten Zellen oder Tiere sind zum Studium der Funktion und der Regulation von Ngn3 und anderen Proteinen nützlich, die in den Entwicklungsweg der β-Zellen des Pankreas involviert sind. Solche modifizierten Zellen oder Tiere sind z.B. auch zum Studium der Funktion und Regulation von Genen nützlich, deren Expression durch Ngn3 beeinflusst ist, sowie zum Studium der Entwicklung von insulinsekretierenden Zellen im Pankreas. Daher sind transgene Tiere der Erfindung zur Identifikation von Stromabtargets von Ngn3 nützlich, als solche können Targets eine Rolle in Phänotypen spielen, die mit Defekten in Ngn3 assoziiert sind.
Tiere können auch in funktionellen Studien, Arzneimittelscreening etc. nützlich sein, um die Wirkung eines Kandidatenarzneimittels auf Inselzellentwicklung, β-Zellfunktion und -entwicklung oder Symptome, die mit Erkrankung oder Leiden assoziiert sind, die mit Ngn3-Defekten in Verbindung stehen (z.B. auf Symptome, die mit reduzierter Insulinsekretion assoziiert sind (z.B. wie jene, die mit einem diabetischen Syndrom, einschließlich Typ-2-Diabetes, assoziiert sind)). Eine Reihe kleiner Deletionen und/oder Substitutionen kann in den Ngn3-Genen hergestellt werden, um die Rolle von verschiedenen, für Polypeptid kodierenden Regionen in der DNA-Bindung, Transkriptionsregulation etc. zu bestimmen. Durch Bereitstellung der Expression von Ngn3-Protein in Zellen, in welchen es normalerweise nicht produziert wird (z.B. ektopische Expression), können Veränderungen des Zellverhaltens induziert werden. Diese Tiere sind zur Untersuchung von Modellen zur Vererbung von Erkrankungen, die mit Diabetes assoziiert sind, z.B. dominant vs. rezessiv, und relativen Wirkungen verschiedener Allele und synergistische Wirkungen zwischen Ngn3 und anderer Gene an anderer Stelle im Genom nützlich.
DNA-Konstrukte für homologe Rekombination umfassen zumindest einen Abschnitt des Ngn3-Gens mit der gewünschten genetischen Modifikation und umfassen Regionen von Homologie zum Targetlokus. DNA-Konstrukte für zufällige Integration müssen keine Regionen von Homologie umfassen, um Rekombination zu vermitteln. Üblicherweise sind Marker für positive und negative Selektion enthalten. Verfahren zur Erzeugung von Zellen mit Genmodifikationen, auf welche abgezielt wird, durch homologe Rekombination sind fachbekannt. Für verschiedene Verfahren zur Transfektion von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990).
Für embryonale Stammzellen (ES-Zellen) kann eine ES-Zelllinie verwendet werden, oder embryonale Zellen können frisch aus dem Wirt erhalten werden, z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen etc. Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Wachstumsschicht oder in Gegenwart geeigneter Wachstumsfaktoren gezüchtet, wie z.B. Leukämiehemmfaktor (LIF). Wenn ES-Zellen transformiert worden sind, können sie dazu verwendet werden, transgene Tiere zu erzeugen. Nach Transformation werden die Zellen auf einer Wachstumsschicht in einem geeigneten Medium ausplattiert. Zellen, die das Konstrukt enthalten, werden durch Verwendung eines selektiven Mediums detektiert. Nach ausreichend Wachstumszeit für die Kolonien werden diese geerntet und auf das Auftreten homologer Rekombination oder Integration des Konstrukts analysiert. Jene Kolonien, die positiv sind, können dann zur Embryomanipulation und Blastozysteninjektion verwendet werden. Blastozysten werden dann von 4 bis 6 Wochen alten superovulierten Weibchen erhalten. Die ES-Zellen werden trypsiniert, und die modifizierten Zellen werden in das Blastozöl der Blastozyste injiziert.
Nach Injektion werden die Blastozysten zu jedem Uterushorn scheinschwangerer Weibchen zurückgeleitet. Den Weibchen wird ermöglicht, ihre Jungen auszutragen, und der resultierende Wurf wird auf mutierte Zellen untersucht, die das Konstrukt besitzen. Durch Bereitstellen eines anderen Phänotyps der Blastozyste und der ES-Zellen können chimäre Nachkommen einfach detektiert werden.
Die chimären Tiere werden auf die Gegenwart des modifizierten Gens gescreent. Chimäre Tiere, die über die Modifikation verfügen (normalerweise chimäre Männchen), werden mit Wildtyp-Tieren gepaart, um Heterozygoten zu produzieren, und die Heterozygoten werden gepaart, um Homozytogen zu produzieren. Wenn Genänderungen an einem bestimmten Punkt in der Entwicklung Letalität verursachen, können die Gewebe oder Organe als allogene oder kongene Verpflanzungen oder Transplantate oder In-vitro-Kultur aufrechterhalten werden.
Eine Untersuchung der genetischen Funktion kann Nicht-Säugetiermodelle verwenden, insbesondere unter Einsatz jener Organismen, die biologisch und genetisch gut charakterisiert sind, wie z.B. C. elegans, D. melanogaster und S. cerevisiae. Zum Beispiel können Transposon-(Tc1-) Insertionen in das Nematodenhomolog eines Ngn3-Gens oder einer Promotorregion eines Ngn3-Gens hergestellt werden. Die Ngn3-Gensequenzen können dazu verwendet werden, definierte genetische Läsionen einem Knock-out zu unterwerfen oder zu ergänzen, um die physiologischen und biochemischen Wege zu bestimmen, die in die Funktion von Inselzellen involviert sind. Es ist bekannt, dass menschliche Gene Mutationen in niedrigen eukaryotischen Modellen komplementieren können.
Erzeugung von Ngn3-Polypeptiden
Für Ngn3 kodierende Nucleinsäure kann dazu verwendet werden, Volllängen-Ngn3-Polypeptide oder Fragmente davon, insbesondere Fragmente, die den funktionellen Domänen entsprechen, DNA-Bindungsstellen etc. und einschließlich Fusionen der betreffenden Polypeptide an andere Proteine oder Teile davon zu synthetisieren. Zur Expression kann eine Expressionskassette verwendet werden, die eine Transkripti ons- und Translationsinitiationsregion, die induzierbar oder konstitutiv sein kann, wo die kodierende Region unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptionsinitiationsregion operabel gebunden ist, und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion bereitstellt. Es können verschiedene Transkriptionsinitiationsregionen dazu verwendet werden, die im Expressionswirt funktionell sind.
Wie oben diskutiert umfasst die Erfindung sowohl isolierte, natürlich auftretende Ngn3-Polypeptide als auch rekombinante Ngn3-Polypeptide und funktionelle Äquivalente solcher rekombinanten und/oder natürlich auftretenden Ngn3-Polypeptide, z.B. biologisch aktive Varianten, die wesentliche oder signifikante Aminosäuresequenzähnlichkeit und/oder Sequenzidentität mit einer hierin bereitgestellten Ngn3-Aminosäuresequenz teilen. Wesentliche Identität, unter Verweis auf Ngn3-Polypeptide der Erfindung, sind Polypeptide mit zumindest etwa 70 %, typischerweise zumindest etwa 80 % und vorzugsweise zumindest etwa 90 % bis etwa 95 %, Identität mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder jene, für welche Polynucleotide kodieren, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynucleotid hybridisieren, das über die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 3 verfügt. Die prozentuelle Identität für die Polypeptide der Erfindung wird unter Einsatz des BLASTP-Programms mit Standardeinstellungen, wie unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jform=0 beschrieben, mit dem ausgewählten DUST-Filter bestimmt. Der DUST-Filter ist unter http://www.ncbi.nlm.nih.qov/BLAST/filtered.html beschrieben.
Dementsprechend umfassen die Ngn3-Polynucleotide und -Polypeptide dieser Erfindung ohne Einschränkung Ngn3-Polypeptide und -Polynucleotide, die in Primaten, Nagetieren, Hunden, Katzen, Pferden, Nematoden, Hefe und dergleichen zu finden sind, und die natürlichen und nicht-natürlichen Varianten davon.
Die Polypeptide können in Prokaryoten oder Eukaryoten gemäß herkömmlicher Wege exprimiert werden, abhängig vom Zweck der Expression. Für eine Produktion des Proteins, einen einzelligen Organismus, wie z.B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, oder Zellen eines höheren Organismus, wie z.B. Wirbeltiers, insbesondere Säugetiers, in großem Rahmen können z.B. COS7-Zellen als Expressionswirtszellen verwendet werden. In vielen Situationen kann es wünschenswert sein, die Ngn3-Gene in Säugetierzellen zu exprimieren, insbesondere wo die Polypeptide, für welche kodiert wird, von nativer Faltung und Posttranslationsmodifikationen profitieren. Kleine Peptide können ebenfalls im Laboratorium synthetisch hergestellt werden.
Mit der Verfügbarkeit der Polypeptide in großen Mengen durch die Verwendung eines Expressionswirts können die Polypeptide isoliert und gemäß herkömmlicher Verfahren isoliert werden. Ein Lysat kann aus dem Expressionswirt hergestellt werden und das Lysat unter Einsatz von HPLC, Ausschlusschromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie oder anderen Reinigungsverfahren gereinigt werden. Das gereinigte Polypeptid ist im Allgemeinen zumindest etwa 80 % rein, vorzugsweise zumindest etwa 90 % rein und kann bis zu bzw. einschließlich 100 % rein sein. Rein bedeutet frei von anderen Proteinen sowie Zelltrümmern.
Die Ngn3-Polypeptide können zur Produktion von Antikörpern verwendet werden, wo kurze Fragmente Antikörper bereitstellen, die für ein besonderes Polypeptid spezifisch sind, und größere Fragmente oder das gesamte Protein ermöglichen die Produktion von Antikörpern auf der Oberfläche des Polypeptids. Antikörper können gegen Wildtyp- oder Variantenformen von Ngn3 gezüchtet werden. Antikörper können gegen isolierte Peptide gezüchtet werden, die diesen Domänen entsprechen, oder gegen natives Protein, z.B. durch Immunisierung mit Zellen, die Ngn3 exprimieren, Immunisierung mit Liposomen, die Ober Ngn3-Polypeptide verfügen, die in die Membran insertiert sind, usw.
Antikörper werden gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt, wo das exprimierte Polypeptid oder Protein als Immunogen allein oder konjugiert an bekannte immunogene Träger, z.B. KLH, pre-S HBsAg, andere virale oder eukaryotische Proteine oder dergleichen verwendet wird. Es können auf geeignete Weise verschiedene Adjuvanzien mit einer Reihe von Injektionen verwendet werden. Für monoklonale Antikörper nach einer oder mehreren Boosterinjektionen wird die Milz isoliert, die Lymphozyten durch Zellfusion immortalisiert und dann auf Antikörperbindung hoher Affinität gesc reent. Die immortalisierten Zellen, d.h. Hybridome, welche die gewünschten Antikörper produzieren, können dann vermehrt werden. Zur weiteren Beschreibung siehe Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1988). Wenn erwünscht kann die mRNA, die für die Schwer- und Leichtketten kodiert, isoliert und durch Klonieren in E. coli mutagenisiert werden und die Schwer- und Leichtketten gemischt werden, um die Affinität des Antikörpers weiter zu verstärken. Alternativen zu In-vivo-Immunisierung als Verfahren zur Züchtung von Antikörpern umfassen die Bindung an Phagen-„Display"-Bibliotheken, für gewöhnlich in Verbindung mit In-vitro-Affinitätsreifung.
Isolation von Ngn3-Allelvarianten und -Homoloqen in anderen Spezies
Andere Säugetier-Ngn3-Gene können identifiziert werden, und ihre Funktion kann unter Einsatz von Ngn3-Genen, die in der Erfindung verwendet werden, charakterisiert werden. Andere Ngn3-Gene von Interesse umfassen unter anderem Säugetiere (z.B. Menschen, Nagetiere (z.B. Mäuse oder Ratten) Rinder, Katzen, Hunde und dergleichen) und Nicht-Säugetiere (z.B. Huhn, Reptilien und dergleichen). Es sind Verfahren zur Identifikation, Isolation, Sequenzierung und Charakterisierung eines unbekannten Gens basierend auf seiner Homologie zu einer bekannten Gensequenz fachbekannt (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press (1989)).
Arzneimittelscreening
Es können die Tiermodelle der Erfindung sowie Verfahren unter Einsatz von Ngn3-Polypeptiden in vitro verwendet werden, um Kandidatenmittel zu identifizieren, die Ngn3-Expression beeinflussen (z.B. durch Beeinflussung von Ngn3-Promotorfunktion) oder mit Ngn3-Polypeptiden Wechselwirken. Mittel von Interesse können jene umfassen, die Ngn3-Aktivität und/oder -Expression verstärken, hemmen, regulieren oder auf andere Weise beeinflussen. Mittel, die Ngn3-Aktivität und/oder -Expression ändern, können zum Beispiel zur Behandlung oder zum Studium von Erkrankungen verwendet werden, die mit verringerter Ngn3-Aktivität assoziiert sind (z.B. Diabetes oder andere Pankreaserkrankungen), und/oder, um die Entwicklung von Inselzelivorläufern entweder in vitro oder in vivo zu erleichtern. Kandidatenmittel sollen synthetische Moleküle umfassen (z.B. Kleinmolekülarzneimittel, Peptide oder andere synthetisch erzeugte Moleküle oder Verbindungen sowie rekombinant produzierte Genprodukte) sowie natürlich auftretende Verbindungen (z.B. Polypeptide, endogene Faktoren, die in insulinproduzierenden gegenwärtig sind, Hormone, Pflanzenextrakte und dergleichen).
Arzneimittelscreeningtests
Von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung ist die Identifikation von Mitteln, die Aktivität in der Beeinflussung von Ngn3-Expression und/oder -Funktion zeigen. Solche Mittel sind Kandidaten für die Entwicklung von Behandlungen für z.B. Diabetes oder ein anderes Leiden, das mit geänderter Ngn3-Aktivität assoziiert sein kann. Arzneimittelscreening identifiziert Mittel, die einen Ersatz oder eine Verstärkung der Ngn3-Funktion in betroffenen Zellen bereitstellt. Hingegen können Mittel, die Ngn3-Funktion umkehren oder hemmen, ein Mittel zur Regulation von Insulinproduktion bereitstellen. Von besonderem Interesse sind Screeningtests auf Mittel, die eine geringe Toxizität für menschliche Zellen aufweisen.
Der Begriff „Mittel" beschreibt wie hierin verwendet ein beliebiges Molekül, z.B. Protein oder Pharmazeutikum, mit der Fähigkeit, die Expression oder physiologische Funktion von Ngn3 zu ändern oder nachzuahmen. Im Allgemeinen wird eine Vielzahl von Testgemischen parallel mit verschiedenen Mittelkonzentrationen laufen gelassen, um eine differenzielle Antwort auf verschiedene Konzentrationen zu erhalten. Typischerweise dient eine dieser Konzentrationen als negative Kontrolle, d.h. bei Konzentration von Null oder unter der Nachweisgrenze.
Kandidatenmittel umfassen verschiedene chemische Klassen, obwohl diese typischerweise organische Moleküle, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2.500 Dalton, sind.
Kandidatenmittel umfassen funktionelle Gruppen, die für strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig sind, insbesondere Wasserstoffbindung, und umfassen typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidatenmittel umfassen oft zyklischen Kohlenstoff oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidatenmittel sind auch unter Biomolekülen festzustellen, einschließlich unter anderem: Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, strukturelle Analoga oder Kombinationen davon.
Kandidatenmittel werden aus einer großen Vielzahl von Quellen, einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen, erhalten. Zum Beispiel sind verschiedene Mittel für zufällige und gerichtete Synthese einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen verfügbar, einschließlich Expression von randomisierten Oligonucleotiden und Oligopeptiden. Alternativ dazu sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in der Form von bakteriellen, fungalen, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder werden einfach erzeugt. Zusätzlich werden natürlich oder synthetisch produzierte Bibliotheken und Verbindungen durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel einfach modifiziert und können zur Erzeugung von Kombinationsbibliotheken verwendet werden. Bekannte pharmakologische Mittel können gesteuerten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterworfen werden, wie z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung etc., um strukturelle Analoga zu produzieren.
In-vivo-Screening von Kandidatenmitteln
Mittel können auf ihre Fähigkeit gescreent werden, die Ngn3-Expression oder -Funktion zu beeinflussen oder einen unerwünschten Phänotyp (z.B. ein Symptom), der mit einer Änderung der Ngn3-Expression oder -Funktion assoziiert ist, zu lindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Screening in vivo in einem hierin beschriebenen transgenen Tier durchgeführt. Transgene Tiere, die zur Verwendung in Screeningtests geeignet sind, umfassen beliebige transgene Tiere mit einer Änderung der Ngn3-Expression und können transgene Tiere mit z.B. einer exogenen und stabil übertragenen menschlichen Ngn3-Gensequenz, einem Reportergen bestehend aus einer (entfernten menschlichen) Ngn3-Promotorsequenz, die operabel an ein Reportergen gebunden ist (z.B. β-Galactosidase, CAT oder ein anderes Gen, das einfach auf Expression getestet werden kann), oder einem homozygoten oder heterozygoten Knockout eines Ngn3-Gens umfassen. Die transgenen Tiere können entweder homozygot oder heterozygot für die genetische Änderung sein, und wo eine Sequenz in das Genom eines Tiers zur Expression eingeführt wird, können die transgenen Tiere mehrere Kopien der eingeführten Sequenz umfassen. Wo der In-vivo-Screeningtest dazu dient, Mittel zu identifizieren, welche die Aktivität des Ngn3-Promotors beeinflussen können, kann der Ngn3-Promotor operabel an ein Reportergen gebunden sein (z.B. Luciferase) und in das nicht-menschliche Wirtstiergenom oder in das Genom einer kultivierten Säugetierzelllinie integriert sein.
Das Kandidatenmittel wird an ein nicht-menschliches transgenes Tier verabreicht, das über geänderte Ngn3-Expression verfügt, und es werden die Wirkungen des Kandidatenmittels bestimmt. Das Kandidatenmittel kann auf beliebige und/oder geeignete Art und Weise zur Verabreichung des Mittels verabreicht werden, um ein gewünschtes Ergebnis zu bewirken. Zum Beispiel kann das Kandidatenmittel durch Injektion (z.B. durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder direkte Injektion in das Gewebe, in welchem die gewünschte Wirkung erreicht werden soll), oral oder durch beliebige andere Mittel verabreicht werden. Normalerweise umfasst das In-vivo-Screening eine Reihe von Tieren, die verschiedene Mengen und Konzentrationen des Kandidatenmittels (von keinem Mittel bis zu einer Menge eines Mittels, die sich einer oberen Grenze der Menge nähert, die erfolgreich an das Tier verabreicht werden kann) erhalten, und kann die Verabreichung des Mittels in verschiedenen Formulierungen umfassen. Die Mittel können alleine oder in Kombinationen von zwei oder mehreren verabreicht werden, insbesondere wo die Verabreichung einer Kombination von Mitteln zu einer synergistischen Wirkung führen kann.
Die Wirkung der Verabreichung des Mittels an das transgene Tier kann durch Beurteilung der Ngn3-Funktion in geeigneter Wiese überwacht werden (z.B. durch Untersuchung der Expression eines Reporter- oder Fusionsgens) oder durch Beurteilung eines Phänotyps, der mit der Ngn3-Expression assoziiert ist. Zum Beispiel kann dort, wo das im Screen verwendete transgene Tier einen Defekt der Ngn3-Expression (z.B. aufgrund eines Knock-outs des Gens) aufweist, die Wirkung des Kandidatenmittels durch Bestimmung der Hormonspiegel, die in der Maus produziert werden, im Vergleich zu den Spiegeln, die in transgenen Mäusen mit Ngn3-Defekt und/oder in Wildtypmäusen produziert werden, beurteilt werden (z.B. durch Beurteilung der Insulinspiegel). Verfahren zum Testen auf Insulin sind fachbekannt. Wo das In-vivo-Screening darin besteht, Mittel zu identifizieren, welche die Aktivität des Ngn3-Promotors beeinflussen, und das nicht-menschliche transgene Tier (oder kultivierte Säugetierzelllinien) einen Ngn3-Promotor, der operabel an ein Reportergen gebunden ist, umfasst, können die Wirkungen der Kandidatenmittel auf Ngn3-Promotoraktivität gescreent werden, zum Beispiel durch Überwachung der Expression aus dem Ngn3-Promotor (durch Detektion des Reportergens) und Korrelation geänderter Ngn3-Promotoraktivität mit Inselzellbildung. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Ngn3-Promotoraktivität durch Detektion (qualitativ oder quantitativ) von Ngn3-mRNA- oder -Proteinspiegel beurteilt werden. Wo das Kandidatenmittel Ngn3-Expression und/oder einen Ngn3-assoziierten Phänotyp auf gewünschte Art und Weise beeinflusst, wird das Kandidatenmittel als Mittel identifiziert, das zur Verwendung in der Therapie einer mit Ngn3 assoziierten Erkrankung geeignet ist, und/oder, um die Entwicklung von Inselvorläuferzellen zu reifen β-Zellen entweder in vivo oder in vitro zu erleichtern.
In-vitro-Screening von Kandidatenmitteln
Zusätzlich zum Screening von Mitteln in Ngn3-transgenen Tieren kann eine Vielzahl von In-vitro-Tests für diesen Zweck verwendet werden, einschließlich markierte In-vitro-Protein-Protein-Bindungstest, Protein-DNA-Bindungstests, elektrophoretischer Gel-Retentionsanalysen, Immuntests auf Proteinbindung und dergleichen. Zum Beispiel können durch die Bereitstellung der Erzeugung großer Mengen von Ngn3- Protein Liganden oder Substrate identifiziert werden, die sich an Proteine binden, die Wirkung der Proteine modulieren oder nachahmen. Das gereinigte Protein kann auch zur Bestimmung von dreidimensionaler Kristallstruktur verwendet werden, die zum Modellieren der intermolekularen Wechselwirkungen, Transkriptionsregulation etc. verwendet werden kann.
Der Screeningtest kann ein Bindungstest sein, worin ein oder mehrere Moleküle an eine Markierung gebunden werden können und die Markierung direkt oder indirekt ein detektierbares Signal bereitstellt. Verschiedene Markierungen umfassen Radioisotope, Fluoreszenzmittel, Chemilumineszenzmittel, Enzyme, spezifische Bindungsmoleküle, Teilchen, z.B. Magnetteilchen, und dergleichen. Spezifische Bindungsmoleküle umfassen Paare, wie z.B. Biotin und Streptavidin, Digoxin und Antidigoxin etc. Für diese spezifischen Bindungsmitglieder würde das komplementäre Mitglied normalerweise mit einem Molekül markiert werden, das die Detektion gemäß bekannter Verfahren bereitstellt.
Eine Reihe anderer Reagenzien kann in den hierin beschriebenen Screeningtests enthalten sein. Wo der Test ein Bindungstest ist, umfasst dieser Reagenzien wie Salze, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergens etc., die dazu verwendet werden, optimale Protein-Protein-Bindung, Protein-DNA-Bindung zu erleichtern und/oder nichtspezifische oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Es können Reagenzien, welche die Wirksamkeit des Test verbessern, wie z.B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel etc., verwendet werden. Das Gemisch von Komponenten wird in einer beliebigen Reihenfolge zugegeben, welche die erforderliche Bindung bereitstellt. Inkubationen werden bei jeder beliebigen geeigneten Temperatur durchgeführt, typischerweise zwischen 4 und 40°C. Inkubationsperioden werden für optimale Aktivität ausgewählt, können aber auch optimiert werden, um rasches Hochdurchsatzscreening zu erleichtern. Typischerweise werden zwischen 0,1 und 1 Stunde ausreichend sein.
Andere Tests von Interesse detektieren Mittel, die Ngn3-Funktion nachahmen. Zum Beispiel werden Kandidatenmittel zu einer Zelle zugegeben, der funktionelles Ngn3 fehlt, und auf die Fähigkeit gescreent, Ngn3-Aktivität in einem funktionellen Test zu reproduzieren.
Viele Säugetiergene haben Homologe in Hefe und niedrigen Tieren. Die Studie der physiologischen Rolle solcher Homologe und Wechselwirkungen mit anderen Proteinen in vivo oder in vitro kann das Verständnis der biologischen Funktion erleichtern. Zusätzlich zu Modellsystemen basierend auf genetischer Komplementation hat sich Hefe durch das Zweihybridsystem, das von Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991), beschrieben wurde, als wirkungsvolles Werkzeug zum Studium der Protein-Protein-Wechselwirkungen erwiesen. Die Zwei-Hybridsystemanalyse ist von besonderem Interesse zur Untersuchung der Transkriptionsaktivierung durch Ngn3-Proteine und zur Identifikation von cDNAs, die für Polypeptide kodieren, die mit Ngn3 Wechselwirken.
Identifizierte Kandidatenmittel
Die Verbindungen, die über die gewünschte pharmakologische Aktivität verfügen, können in einem physiologisch annehmbaren Träger zur Behandlung eines Leidens, das auf einen Defekt der Ngn3-Funktion zurückzuführen ist (z.B. eine Erkrankung, die mit reduzierten Insulinspiegeln assoziiert ist (z.B. Diabetes Typ 1 oder Typ 2, insbesondere Typ-1-Diabetes)), an einen Wirt verabreicht werden. Die Verbindungen können auch dazu verwendet werden, die Ngn3-Funktion zu verstärken. Die therapeutischen Mittel können auf eine Reihe verschiedener Wege verabreicht werden, oral, topisch, parenteral, z.B. subkutan, intraperitoneal, durch Virusinfektion, intravaskulär etc. Inhalierte Behandlungen sind von besonderem Interesse. Abhängig von der Art der Einführung können die Verbindungen auf eine Reihe verschiedener Wege formuliert werden. Die Konzentration therapeutisch aktiver Verbindung in der Formulierung kann von etwa 0,1–100 Gew.-% variieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in verschiedenen Formen hergestellt werden, als Granulate, Tabletten, Pillen, Zäpfchen, Kapseln, Suspensionen, Salben, Lotionen und dergleichen. Es können organische oder anorganische Träger und/oder Verdünnungsmittel pharmazeutischer Reinheit, die zur oralen und topischen Verwendung geeignet sind, dazu verwendet werden, Zusammensetzungen zu schaffen, welche die therapeutisch aktiven Verbindungen enthalten. Fachbekannte Verdünnunngsmittel umfassen wässriges Medium, pflanzliche und tierische Öle und Fette. Stabilisatoren, Benetzungsmittel und Emulgatoren, Salze zur Variation des osmotischen Drucks oder Puffer zur Sicherung eines adäquaten pH-Werts und Hautdurchlässigkeitsenhancer können als Hilfsmittel eingesetzt werden.
Pharmakogenetik
Pharmakogenetik ist die Verbindung zwischen einem Genotyp einer Person und der Fähigkeit dieser Person, ein therapeutisches Mittel zu metabolisieren oder darauf zu reagieren. Unterschiede im Metabolismus oder der Targetempfindlichkeit können zu schwerer Toxizität oder therapeutischem Versagen durch Änderung der Beziehung zwischen bioaktiver Dosis und Blutkonzentration des Arzneimittels führen. In den letzten Jahren haben zahlreiche Studien gute Beziehungen zwischen Polymorphismen in Stoffwechselenzymen oder Arzneimitteltargets und sowohl Antwort als auch Toxizität gezeigt. Diese Beziehungen können dazu verwendet werden, die Verabreichung einer therapeutischen Dosis zu individualisieren.
Die Genotypisierung von polymorphen Allelen wird zur Beurteilung verwendet, ob eine Person gut auf einen speziellen Behandlungsplan reagiert. Die polymorphen Sequenzen werden auch in Arzneimittelscreeningtests verwendet, um die Dosis und Spezifität eines therapeutischen Kandidatenmittels zu bestimmen. Ein Kandidaten-Ngn3-Polymorphismus wird mit einer Targettherapie gescreent, um zu bestimmen, ob Einfluss auf die Wirksamkeit der Behandlung von z.B. Diabetes besteht. Arzneimittelscreeningtests werden wie oben beschrieben durchgeführt. Typischerweise werden zwei oder mehrere verschiedene Sequenzpolymorphismen auf die Reaktion auf eine Therapie getestet. Therapien für Diabetes umfassen derzeit Ersatztherapie durch die Verabreichung von Insulin und Verabreichung von Arzneimitteln, welche die Insulinsekretion erhöhen (Sulfonylharnstoffe), und Arzneimitteln, die Insulinresistenz verringern (wie z.B. Troglitazon).
Wo ein besonderer Sequenzpolymorphismus mit differentieller Arzneimittelwirksamkeit korreliert, kann diagnostisches Screening durchgeführt werden. Diagnostische Verfahren sind im vorangegangenen Abschnitt detailliert beschrieben worden. Die Gegenwart eines speziellen Polymorphismus wird detektiert und dazu verwendet, eine wirksame therapeutische Strategie für die betroffene Person zu entwickeln.
Detektion von Nqn3-assozierten Erkrankungen
Diagnose von Ngn3-assoziierten Erkrankungen wurde durch Protein-, DNA- oder RNA-Sequenz- und/oder Hybridisierungsanalyse einer beliebigen geeigneten Probe eines Patienten, z.B. Biopsiematerial, Blutprobe, Wangenabstriche etc., durchgeführt. Eine Nucleinsäureprobe eines Patienten mit einer Erkrankung, die mit Ngn3 assoziiert sein kann, wird auf die Gegenwart eines prädisponierenden Polymorphismus in Ngn3 analysiert. Ein typischer Patientengenotyp hat zumindest eine prädisponierende Mutation auf zumindest einem Chromosom. Die Gegenwart einer polymorphen Ngn3-Sequenz, welche die Aktivität oder Expression des Genprodukts beeinflusst und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber einer Ngn3-assoziierten Erkrankung (z.B. Hyperglykämie, Diabetes und dergleichen) verleiht, wird als prädisponierender Polymorphismus angesehen. Personen werden durch Analyse ihrer DNA oder mRNA auf die Gegenwart eines prädisponierenden Polymorphismus gescreent, im Vergleich zur Sequenz von nicht-betroffenen Personen. Spezifische Sequenzen von Interesse umfassen zum Beispiel einen beliebigen Polymorphismus, der mit einem diabetischen Syndrom assoziiert ist, insbesondere mit Typ-2-Diabetes, oder auf andere Weise mit Diabetes assoziiert ist, einschließlich unter anderem Insertionen, Substitutionen und Deletionen in der kodierenden Regionsequenz, Intronsequenzen, die Spleißen beeinflussen, oder Promotor- oder Enhancersequenzen, welche die Aktivität und Expression des Proteins beeinflussen.
Das Screening kann auch auf den funktionellen oder Antigeneigenschaften des Proteins basieren. Immuntests, die dazu entworfen worden sind, prädisponierende Polymorphismen in Ngn3-Proteinen zu detektieren, können im Screening verwendet werden. Wo viele verschiedene Mutationen zu einem besonderen Krankheitsphänotyp führen, können funktionelle Proteintests wirksame Screeningwerkzeuge sein.
Es können biochemische Studien durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob ein Kandidatensequenzpolymorphismus in der für Ngn3 kodierenden Region oder Kontrollregionen mit Erkrankung assoziiert ist. Zum Beispiel kann eine Veränderung in der Promotor- oder Enhancersequenz, welche die Expression von Ngn3 beeinflusst, zu einer Prädisposition gegenüber Diabetes führen. Expressionsausmaße eines Kandidatenvariantenallels werden durch verschiedene fachbekannte Verfahren mit dem Expressionsausmaß des normalen Allels verglichen. Verfahren zur Bestimmung von Promotor- oder Enhancerstärke umfassen die Quantifizierung des exprimierten natürlichen Proteins, Insertion des Variantenkontrollelements in einem Vektor mit einem Reportergen, wie z.B. β-Galactosidase, Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase etc., die geeignete Quantifizierung bereitstellt, und dergleichen. Die Aktivität des Ngn3-Proteins, für welches kodiert wird, kann durch Vergleich mit dem Wildtypprotein bestimmt werden.
Eine Reihe von Verfahren sind zur Analyse von Nucleinsäuren auf die Gegenwart einer spezifischen Sequenz geeignet. Wo große Mengen von DNA verfügbar sind, wird die genomische DNA direkt verwendet. Alternativ dazu wird die Region von Interesse in einen geeigneten Vektor kloniert und in ausreichender Menge zur Analyse gezüchtet. Zellen, die Ngn3-Gene exprimieren, wie z.B. Pankreaszellen, können als Quelle von mRNA verwendet werden, die direkt getestet oder zur Analyse revers in cDNA transkribiert werden kann. Die Nucleinsäure kann durch herkömmliche Verfahren amplifiziert werden, wie z.B. durch die Polymerasekettenreaktion (PCR), um ausreichende Mengen zur Analyse bereitzustellen. Die Verwendung der Polymerasekettenreaktion ist in Saiki et al., Science 239, 487 (1985), beschrieben, ein Bericht über die derzeit verwendeten Verfahren ist in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 14.2–14.33 (1989), beschrieben. Amplifikation kann auch verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Polymorphismus gegenwärtig ist, und zwar durch Verwendung eines Primers, der für den Polymorphismus spezifisch ist. Alternativ dazu sind verschiedene Verfahren fachbekannt, die Oligonucleotidligation als Mittel zur Detektion von Polymorphismen verwenden, siehe zum Beispiel Riley et al., Nucl. Acid Res. 18, 2887–2890 (1990), und Delahunty et al., Am. J. Hum. Genet. 58, 1239–1246 (1996).
Eine detektierbare Markierung kann in einer Amplifikationsreaktion enthalten sein. Geeignete Markierungen umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texasrot, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) oder N,N,N',N'-Tetramethyl-o-carboxyrhodamin (TAMRA), radioaktive Markierungen, z.B. 32P, 35S, 3H etc. Die Markierung kann ein Zweiphasensystem sein, wo die amplifizierte DNA an Biotin, Haptene etc. konjugiert ist, die über einen Hochaffinitätsbindungspartner verfügen, z.B. Avidin, spezifische Antikörper, etc., wo der Bindungspartner an eine detektierbare Markierung konjugiert ist. Die Markierung kann an eine oder beide Primer konjugiert werden. Alternativ dazu wird der Pool von Nucleotiden, die in der Amplifikation verwendet werden, markiert, um die Markierung in das Amplifikationsprodukt zu inkorporieren.
Die Probennucleinsäure, z.B. ein amplifiziertes oder kloniertes Fragment, wird durch eines einer Reihe von fachbekannten Verfahren analysiert. Die Nucleinsäure kann durch Didesoxy- oder andere Verfahren sequenziert werden und die Basensequenzen mit einer neutralen Ngn3-Sequenz (z.B. einer Ngn3-Sequenz einer nicht betroffenen Person) verglichen werden. Hybridisierung mit der Variantensequenz kann auch verwendet werden, um ihre Gegenwart zu bestimmen, durch Southern Blots, Dot-Blots etc. Die Hybridisierungsmuster einer Kontroll- und Variantensequenz zu einer Anordnung von Oligonucleotidsonden, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wie in US 5.445.934 oder in WO 95/35505 beschrieben, können auch als Mittel zur Detektion der Gegenwart von Variantensequenzen dienen. Analyse des einzelsträngigen Konformationspolymorphismus (SCP), denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE), Fehlpaarungsspaltungsdetektion und Heteroduplexanalyse in Gelmatrizen werden zur Detektion von Konformationsänderungen verwendet, die durch DNA-Sequenzvariation als Änderung der elektrophoretischen Mobilität ge schaffen wurden. Alternativ dazu wird dort, wo ein Polymorphismus eine Erkennnungsstelle für eine Restriktionsendonuclease schafft oder zerstört (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismua, RFLP), die Probe mit dieser Endonuclease verdaut und die Produkte nach Größe fraktioniert, um zu bestimmen, ob das Fragment verdaut wurde. Fraktionierung wird durch Gel- oder Kapillarelektrophorese, insbesondere Acrylamid- oder Agarose-Gele, durchgeführt.
Das Hybridisierungsmuster einer Kontroll- und Varianten-Sequenz zu einer Anordnung von Oligonucleotidsonden, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wie in US 5.445.934 oder in WO 95/35505 beschrieben, kann als Mittel zur Detektion der Gegenwart von Variantensequenzen verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine Anordnung von Oligonucleotiden bereitgestellt, wo einzelne Positionen auf der Anordnung komplementär zu zumindest einem Abschnitt von mRNA oder genomischer DNA des Ngn3-Lokus sind. Eine solche Anordnung kann eine Reihe von Oligonucleotiden umfassen, wovon jede sich spezifisch an eine Nucleinsäuresequenz, z.B. mRNA, cDNA, genomische DNA etc., vom Ngn3-Lokus hybridisieren kann. Für gewöhnlich umfasst eine solche Anordnung zumindest zwei verschiedene polymorphe Sequenzen, d.h. Polymorphismen, die sich an einzigartigen Positionen innerhalb des Lokus befinden, für gewöhnlich zumindest etwa 5, noch üblicher zumindest etwa 10, und kann 50 bis 100 verschiedene Polymorphismen umfassen. Die Oligonucleotidsequenz auf der Anordnung wird für gewöhnlich zumindest etwa 12 nt lang sein, die Länge der bereitgestellten polymorphen Sequenzen sein oder sich in die flankierenden Regionen erstrecken, um Fragmente mit einer Länge von 100 bis 200 nt zu erzeugen. Für Beispiele von Anordnungen siehe Hacia et al., Nature Genetics 14, 441–447 (1996); Lockhart et al., Nature Biotechnol. 14, 1675–1680 (1996), und De Risi et al., Nature Genetics 14, 457–460 (1996).
Antikörper, die für Ngn3-Polymorphismen spezifisch sind, können im Screening auf Immuntests verwendet werden. Eine Reduktion oder ein Anstieg von Ngn3 und/oder Gegenwart eines mit Ngn3-Erkrankung assoziiertes Polymorphismus zeigt an, dass die vermutete Erkrankung Ngn3-assoziiert ist. Eine Probe wird aus einem Patienten entnommen, von dem vermutet wird, dass er über eine Ngn3-assozierte Erkrankung verfügt. Proben umfassen wie hierin verwendet Gewebsbiopsien, biologische Fluide, von Organ- oder Gewebskultur abstammende Fluide und Fluide, die aus physiologischen Geweben extrahiert werden, sowie Derivate und Fraktionen solcher Fluide. Die Zahl von Zellen in einer Probe ist im Allgemeinen zumindest etwa 10³, für gewöhnlich zumindest 10⁴, noch üblicher zumindest etwa 10⁵. Die Zellen können im Fall von festen Geweben dissoziiert werden, oder Gewebssektionen können analysiert werden. Alternativ dazu kann ein Lysat der Zellen hergestellt werden.
Diagnose kann durch eine Reihe von Verfahren durchgeführt werden. Die verschiedenen Verfahren bestimmen alle die Abwesenheit oder Gegenwart oder geänderten Mengen von normalen oder abnormen Ngn3 in Patientenzellen, von denen vermutet wird, dass sie Ober einen prädisponierenden Polymorphismus in Ngn3 verfügen. Zum Beispiel kann die Detektion die Färbung von Zellen oder histologischen Schnitte umfassen, die gemäß herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden. Die Antikörper von Interesse werden zur Zellprobe zugegeben und über einen Zeitraum inkubiert, der ausreichend ist, um eine Bindung an das Epitop zu ermöglichen, für gewöhnlich zumindest etwa 10 Minuten. Der Antikörper kann mit Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenzmitteln, Chemilumineszenzmitteln oder anderen Markierungen zur direkten Detektion markiert werden. Alternativ dazu wird ein Antikörper oder Reagens des zweiten Stadiums dazu verwendet, das Signal zu amplifizieren. Solche Reagenzien sind fachbekannt. Zum Beispiel kann der primäre Antikörper an Biotin konjugiert werden, wobei Meerrettichperoxidasekonjugiertes Avidin als Reagens des zweiten Stadiums zugegeben wird. Die Enddetektion verwendet ein Substrat, das einer Farbänderung in Gegenwart der Peroxidase unterworfen ist. Das Fehlen oder die Gegenwart einer Antikörperbindung kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, einschließlich Durchflusszytometrie dissoziierter Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillationszählung etc.
Ein alternatives Verfahren zur Diagnose hängt von der In-vitro-Detektion der Bindung zwischen Antikörpern und Ngn3 in einem Lysat ab. Die Messung der Konzentration von Ngn3-Bindung in einer Probe oder Fraktion davon kann durch eine Reihe spezifischer Tests erreicht werden Es kann ein herkömmlicher Test vom Sandwichtyp verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Sandwichtest zuerst Ngn3-spezifische Antikörper an eine unlösliche Oberfläche oder einen Träger anheften. Die spezielle Bindungsart ist nicht entscheidend, solange sie mit den Reagenzien und allgemeinen Verfahren der Erfindung kompatibel ist. Sie können kovalent oder nicht-kovalent, vorzugsweise nicht-kovalent, an die Platten gebunden werden.
Die unlöslichen Träger können beliebige Zusammensetzungen sein, an welche Polypeptide gebunden werden können, die einfach aus löslichem Material getrennt werden können und andererseits mit dem gesamten Verfahren kompatibel sind. Die Oberfläche solcher Träger kann fest oder porös sein und aus einer beliebigen geeigneten Form sein. Beispiele für geeignete unlösliche Träger, an welche der Rezeptor gebunden ist, umfassen Kügelchen, magnetische Kügelchen, Membranen und Mikrotiterplatten. Diese werden typischerweise aus Glas, Kunststoff (z.B. Polystyrol), Polysacchariden, Nylon oder Nitrocellulose hergestellt. Mikrotiterplatten sind besonders geeignet, weil eine große Zahl von Tests gleichzeitig durchgeführt werden kann, wobei kleine Mengen von Reagenzien und Proben verwendet werden.
Patientenprobenlysate werden zu separat testbaren Trägern zugegeben (zum Beispiel separate Wells einer Mikrotiterplatte), die Antikörper enthalten. Vorzugsweise wird eine Reihe von Standards, die bekannte Konzentrationen von normalem und/oder abnormem Ngn3 enthalten, parallel zu den Proben oder Aliquoten davon beurteilt, um als Kontrollen zu dienen. Vorzugsweise wird jede Probe und jeder Standard zu mehreren Wells zugegeben, sodass Mittelwerte für jeden erhalten werden können. Die Inkubationszeit sollte für Bindung ausreichend sein, im Allgemeinen ist von etwa 0,1 bis 3 h ausreichend. Nach Inkubation wird der unlösliche Träger im Allgemeinen aus nicht-gebundenen Komponenten gewaschen. Im Allgemeinen wird ein verdünntes nicht-ionisches Detergensmedium bei einem geeigneten pH, im Algemeinen 7–8, als Waschmedium verwendet. Ein bis sechs Waschungen können mit ausreichendem Volumen verwendet werden, um nichtspezifisch gebundene Proteine, die in der Probe gegenwärtig sind, ausgiebig zu waschen.
Nach Waschung wird eine Lösung, die einen zweiten Antikörper enthält, angewendet. Der Antikörper wird Ngn3 mit ausreichender Spezifität binden, sodass er von anderen vorhandenen Komponenten unterschieden werden kann. Die zweiten Antikörper können markiert werden, um direkte oder indirekte Quantifizierung von Bindung zu erleichtern. Beispiele für Markierungen, die direkte Messung von zweiten Rezeptorbindungen ermöglichen, umfassen Radiomarkierungen, wie z.B. ³H oder ¹²⁵I, Fluoreszenzmittel, Farbstoffe, Kügelchen, Chemilumineszenzmittel, kolloidale Teilchen und dergleichen. Beispiele für Markierungen, die indirekte Messung von Bindung ermöglichen, umfassen Enzyme, wo das Substrat für ein gefärbtes oder Fluoreszenzprodukt sorgen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper mit einem kovalent gebundenen Enzym markiert, das in der Lage ist, ein detektierbares Produktsignal nach Hinzufügung eines geeigneten Substrats bereitzustellen. Beispiele für geeignete Enzyme zur Verwendung in Konjugaten umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Malatdehydrogenase und dergleichen. Wo sie nicht im Handel verfügbar sind, werden solche Antikörper-Enzymkonjugate einfach durch fachbekannte Verfahren produziert. Die Inkubationszeit soll für den markierten Liganden ausreichend sein, um verfügbare Moleküle zu binden. Im Allgemeinen sind etwa 0,1 bis 3 h ausreichend, für gewöhnlich ist 1 h ausreichend.
Nach dem zweiten Bindungsschritt wird der unlösliche Träger wieder frei von nichtspezifisch gebundenem Material gewaschen. Das vom gebundenen Konjugat produzierte Signal wird durch herkömmliche Mittel detektiert. Wo ein Enzymkonjugat verwendet wird, wird ein geeignetes Enzymsubstrat bereitgestellt, sodass ein detektierbares Produkt gebildet wird.
Andere Immuntests sind fachbekannt und können als Diagnostika Anwendung finden. Ouchterlony-Platten stellen eine einfache Bestimmung der Antikörperbindung bereit. Western-Blots können auf Proteingelen oder Proteinflecken auf Filtern durchgeführt werden, wobei wie gewünscht ein Detektionssystem verwendet wird, das für Ngn3 spezifisch ist, wobei in geeigneter Weise ein Markierungsverfahren wie für den Sandwichtest beschrieben verwendet wird.
Andere diagnostische Tests von Interesse basieren auf den funktionellen Eigenschaften von Ngn3-Proteinen. Solche Tests sind besonders dort nützlich, wo eine große Zahl verschiedener Sequenzänderungen zu einem gemeinsamen Phänotyp führt. Zum Beispiel kann ein funktioneller Test auf den Transkriptionsänderungen basieren, die von Ngn3-Genprodukten vermittelt werden. Andere Tests können zum Beispiel Konformationsänderungen, Größenänderungen, die aus Insertionen, Deletionen oder Trunkierungen resultieren, oder Veränderungen der subzellulären Lokalisation von Ngn3-Proteinen detektieren.
In einem Proteintrunkierungstest werden PCR-Fragmente, die aus dem Ngn3-Gen oder seinem Transkript amplifiziert werden, als Matrizen für In-vivo-Transkription/Tanslationsreaktionen verwendet, um Proteinprodukte zu erzeugen. Es wird Trennung durch Gel-Elektrophorese durchgeführt, um zu bestimmen, ob das polymorphe Gen für ein trunkiertes Protein kodiert, wo Trunkierungen mit einem Verlust von Funktion assoziiert sind.
Diagnostisches Screening kann auch für Polymorphismen durchgeführt werden, die genetisch mit einer Prädisposition für Diabetes verbunden sind, insbesondere durch die Verwendung von Mikrosatellitenmarker oder Einzelnucleotidpolymorphismen. Häufig wird der Mikrosatellitenpolymorphismus selbst nicht phänotypisch exprimiert, ist aber mit Sequenzen verbunden, die zu einer Krankheitsprädisposition führen. Jedoch kann in manchen Fällen die Mikrosatellitensequenz selbst Genexpression beeinflussen. Mikrosatellitenbindungsanalyse kann alleine oder in Kombination mit direkter Detektion von Polymorphismen wie oben beschrieben durchgeführt werden. Die Verwendung von Mikrosatellitenmarkern für Genotypisierung ist gut dokumentiert. Für Beispiele siehe Mansfield et al., Genomics 24, 225–233 (1994), Ziegle et al., Genomics 14, 1026–1031 (1992); Dib et al. siehe oben.
Mikrosatellitenloki, die in den vorliegenden Verfahren nützlich sind, haben die allgemeine Formel: U(R)nU', wo U und U' sich nicht-wiederholende flankierende Sequenzen sind, die den besonderen Lokus auf einzigartige Weise identifizieren, R ein Wiederholungsmotiv ist und n die Anzahl der Wiederholungen ist. Das Wiederholungsmotiv ist zumindest 2 Nucleotide lang, bis zu 7, für gewöhnlich 2-4 Nucleotide lang. Wiederholungen können einfach oder komplex sein. Die flankierenden Sequenzen U und U' identifizieren den Mikrosatellitenlokus auf einzigartige Weise innerhalb des menschlichen Genoms. U und U' sind zumindest etwa 18 Nucleotide lang und können sich über mehrere Hunderte Basen bis zu etwa 1 kb auf jeder Seite der Wiederholung erstrecken. Innerhalb von U und U' werden Sequenzen für Amplifikationsprimer ausgewählt. Die exakte Zusammensetzung der Primersequenzen ist für die Erfindung nicht entscheidend, aber sie müssen unter stringenten Bedingungen an die flankierenden Sequenzen U bzw. U' hybridisieren. Kriterien zur Selektion von Amplifikationsprimern sind wie zuvor diskutiert. Um die Auflösung von Größendifferenzen am Lokus zu maximieren, ist es bevorzugt, eine Primersequenz auszuwählen, die sich nahe der Wiederholungssequenz befindet, sodass das gesamte Amplifikationsprodukt zwischen 100 und 500 Nucleotiden lang ist.
Die Zahl der Wiederholungen an einem spezifischen Lokus, n, ist in einer Population polymorph, wodurch individuelle Unterschiede in der Länge von DNA erzeugt werden, die sich zwischen den Amplifikationsprimern befindet. Die Zahl variiert von zumindest 1 Wiederholung bis etwa 100 Wiederholungen oder mehr.
Die Primer werden zur Amplifikation der Region der genomischen DNA verwendet, welche die Wiederholungen enthält. In geeigneter Weise ist eine detektierbare Markierung wie zuvor beschrieben in der Amplifikationsreaktion enthalten. Multiplexamplifikation kann durchgeführt werden, in welcher mehrere Reihen von Primern in demselben Reaktionsröhrchen kombiniert werden. Dies ist besonders von Vorteil, wenn eingeschränkte Mengen von Proben-DNA zur Analyse verfügbar sind. In geeigneter Weise wird jede dieser Reihen von Primern mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff markiert.
Nach Amplifikation werden die Produkte in ihrer Größe fraktioniert. Fraktionierung kann durch Gelelektrophorese durchgeführt werden, insbesondere denaturierende Acrylamid- oder Agarose-Gele. Ein geeignetes System verwendet denaturierende Polyacrylamidgele in Kombination mit einem automatisierten DNA-Sequenzierer, siehe Hunkapillar et al., Science 254, 59–74 (1991). Der automatisierte Sequenzierer ist besonders mit Multiplexamplifikation oder gepoolten Produkten von separaten PCR-Reaktionen nützlich. Kapillarelektrophorese kann auch zur Fraktionierung verwendet werden. Ein Bericht einer Kapillarelektrophorese ist in Landers et al., Biotechniques 14, 98–111 (1993), zu finden. Die Größe des Amplifikationsprodukts ist proportional zur Zahl der Widerholungen (n), die am Lokus gegenwärtig sind, der von den Primern spezifiziert wird. Die Größe ist in der Population polymorph und daher ein Allelmarker für diesen Lokus.
Therapeutische Anwendungen von für Ngn3 kodierender Nucleinsäure
Für Ngn3 kodierende Nucleinsäure kann in eine Zelle eingeführt werden, um eine Transformation der Zelle zu erreichen, vorzugsweise stabile Transformation, und die transformierte Zelle wird in der Folge in ein Subjekt implantiert, das eine Erkrankung aufweist, die durch einen Insulinmangel charakterisiert ist (z.B. eine Ngn3-assoziierte Erkrankung), abhängig vom Gewebe, in welches die transformierte Zelle implantiert wird. Vorzugsweise stammt die zu transformierende und in das Subjekt zu implantierende Wirtszelle von der Person ab, die das Transplantat erhält (z.B. um ein autologes Transplantat bereitzustellen). Wo die transformierten Zellen in eine Person insertiert werden sollen (z.B. in den Pankreas, die Leber, Bauchhöhle, etc.), sind die Zellen, in welche die Nucleinsäure insertiert wird, vorzugsweise Stammzellen, die in der Lage sind, sich im Umfeld des Pankreasgewebes zu β-Zellen zu entwickeln, z.B. Stammzellen, die von Pankreasgewebe, Gastrointestinalgewebe oder Zellen abstammen, die in der Lage sind, nach Expression der für Ngn3 kodierenden Nucleinsäure Insulin zu exprimieren.
Zum Beispiel können in einem Subjekt, das Typ-1-Diabetes hat, gastrointestinale Stammzellen aus dem betroffenen Subjekt isoliert werden, wobei die Zellen mit für Ngn3 kodierender DNA transformiert sind, und die transformierten Zellen können in das betroffene Subjekt implantiert werden, um Insulinproduktion bereitzustellen, oder die transformierten Zellen können kultiviert werden, um die Entwicklung von Zellen zu insulinproduzierenden β-Zellen zu erleichtern.
Einführung von für Ngn3 kodierender Nucleinsäure in die Zelle kann nach den fachbekannten Verfahren erreicht werden (z.B. durch Verwendung von Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektionsinfektion mit einem rekombinanten (vorzugsweise replikationsdefekten) Virus und anderen fachbekannten Mitteln). Vorzugsweise wird die für Ngn3 kodierende Nucleinsäure operabel mit einem Promotor verbunden, der ein gewünschtes Ausmaß von Ngn3-Polypeptidexpression erleichtert (z.B. ein Promotor, der von CMV, SV40, Adenovirus oder einem gewebsspezifischen oder zelltypspezifischen Promotor abstammt). Transformierte Zellen, welche die für Ngn3 kodierende Nucleinsäure enthalten, können ausgewählt werden und/oder angereichert werden, z.B. über Expression eines selektierbaren Markergens, das im für Ngn3 kodierenden Konstrukt gegenwärtig ist oder das auf einem Plasmid gegenwärtig ist, das mit dem für Ngn3 kodierenden Konstrukt co-transfiziert wird. Typischerweise stellen selektierbare Marker Resistenz gegenüber Antibiotika, wie z.B. Tetracyclin, Hygromycin, Neomycin und dergleichen, bereit. Andere Marker können Thymidinkinase und dergleichen umfassen.
Die Fähigkeit der transformierten Zellen, die für Ngn3 kodierende Nucleinsäure zu exprimieren, kann durch verschiedene fachbekannte Verfahren beurteilt werden. Zum Beispiel kann die Ngn3-Expression durch Northern-Blot untersucht werden, um mRNA zu detektieren, die mit einer DNA-Sonde hybridisiert, die vom relevanten Gen abstammt. Diese Zellen, die das gewünschte Gen exprimieren, können weiters unter Einsatz fachbekannter Verfahren isoliert und in In-vitro-Kultur vermehrt werden. Die für Transformation mit für Ngn3 kodierender DNA ausgewählten Wirtszellen variieren mit dem Zweck der Ex-vivo-Therapie (z.B. Insulinproduktion), der Stelle der Implantation der Zellen und anderen Faktoren, die mit einer Reihe von Faktoren variieren, die dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind.
Verfahren zur gentechnischen Erzeugung einer Wirtszelle zur Expression von (eifern) gewünschten Genprodukt(en) und Implantation oder Transplantation der erzeugten Zellen (z.B. Ex-vivo-Therapie) sind fachbekannt (siehe z.B. Gilbert et al., „Cell Transplantation of genetically altered cells an biodegradable polymer scaffolds in syngeneic rats", Transplantation 56, 423–427 (1993)). Zur Expression eines gewünschten Gens in exogenen oder autologen Zellen und Implantation der Zellen (z.B. Inselzellen) in den Pankreas siehe z.B. Docherty, „Gene Therapy for diabetes mellitus", Clin. Sci. (Colch) 92, 321–330 (1997), Hegre et al., „Transplantation of islet tissue in the rat", Acta Endocrinol. Suppl. (Kopenhagen) 205, 257–281 (1976); Sandler et al., „Assessment of insulin secretion in vitro from microencapsulated fetal porcine islet-like cell clusters and rat, mouse and human pancreatic islets", Transplantation 63, 1712–1718 (1997); Calafiore, „Perspectives in pancreatic and islet cell transplantation for the therapy of IDDM", Diabetes Care 20, 889–896 (1997); Kenyon et al., „Islet cell Transplantation: beyond the paradigms", Diabetes Metab. Rev. 12, 361–371 (1997); Sandler, Chick et al., „Artificial pancreas using living beta cells: effects an glucose homeostasis in diabetic rats", Science 197, 780–782 (1977).
Nach In-vitro-Vermehrung der transformierten Zellen werden die Zellen durch fachbekannte Verfahren in das Säugetiersubjekt implantiert, vorzugsweise in das Gewebe, aus welchem die Zellen ursprünglich stammten. Die Zahl der implantierten Zellen ist eine Zahl von Zellen, die ausreichend ist, um die Expression von Ngn3-Ausmaßen bereitzustellen, die ausreichend sind, um erhöhte Insulinspiegel bereitzustellen. Die Zahl von Zellen, die transplantiert werden soll, kann basierend auf solchen Faktoren wie den Ausmaßen der Polypeptidexpression, die in vitro erreicht werden, und/oder der Zahl von Zellen, die Implantation überleben, bestimmt werden. Vorzugsweise werden die Zellen in einen Bereich dichter Vaskularisation implantiert, auf eine Art und Weise, die das Anzeichen von Chirurgie im Subjekt minimiert. Die Transplantatakzeptanz transformierter Zellen wird durch Untersuchung des Säugetiersubjekts auf klassische Anzeichen von Transplantatabstoßung, d.h. Entzündung und/oder Exfoliation an der Stelle der Implantation und Fieber, untersucht.
Alternativ dazu kann für Ngn3 kodierende Nucleinsäure direkt an das betroffene Subjekt verabreicht werden, um Ngn3-Expression in einer Targetzelle bereitzustellen (z.B. einer Pankreaszelle, einer Darmzelle, Leberzelle oder einer anderen Organzelle, die in der Lage ist, Ngn3 zu exprimieren und Insulinproduktion bereitzustellen), wodurch die Entwicklung der Zelle zu einer insulinproduzierenden Zelle (z.B. im Pankreas) gefördert wird oder ein Defekt in der Ngn3-Expression im Subjekt geheilt wird. Verfahren zur In-vivo-Verabreichung einer Nucleinsäure von Interesse zur Expression in einer Targetzelle sind fachbekannt. Zum Beispiel verwenden In-vivo-Verfahren zur Genverabreichung normalerweise entweder ein biologisches Mittel zur Einführung der DNA in die Targetzellen (z.B. ein Virus, das die DNA von Interesse enthält) oder ein mechanisches Mittel, um die DNA in die Targetzellen einzuführen (z.B. direkte Injektion von DNA in die Zellen, Liposomenfusion, pneumatische Injektion unter Einsatz einer „Genkanone" oder Einführung der DNA über einen Kanal des Pankreas). Für andere Verfahren zur In-vivo-Einführung von DNA von Interesse in eine Zelle siehe auch Bartlett et al., „Use of biolistic particle accelerator to introduce genes into isolated islets of Langerhans", Transplant. Proc. 29, 2201–2202 (1997), Furth, „Gene Transfer by biolistic process", Mol. Biotechnol. 7, 139–143 (1997), Gainer et al., „Successful biolistic transformation of mouse pancreatic islets while preserving cellular function", Transplantation 61, 1567–1571 (1996), Docherty, „Gene Therapy for diabetes mellitus", Clin. Sci. (Colch) 92, 321–330 (1997), Maeda et al., "Adenovirus-mediated tansfer of human lipase complementary DNA to the gallbladder", Gastroenterology 106, 1638–1644 (1994).
Die Menge von DNA und/oder die Zahl von infektiösen Viruspartikeln, die wirksam sind, um das Gewebe zu infizieren, auf das abgezielt wird, eine ausreichende Zahl von Zellen zu transformieren und die Produktion eines gewünschten Insulinspiegels bereitzustellen, können basierend auf solchen Faktoren wie der Wirksamkeit der Invivo-Transformation und der Empfindlichkeit der sekretorischen Drüsenzellen, auf die abgezielt wird, auf Transformation einfach bestimmt werden. Zum Beispiel ist die Menge von DNA, die in das Pankreas eines Menschen injiziert wird, im Allgemeinen von etwa 1 μg bis 750 mg, vorzugsweise von etwa 500 μg bis 500 mg, noch bevorzugter von 10 mg bis 200 mg, am meisten bevorzugt etwa 100 mg. Im Allgemeinen können die Mengen von DNA aus den Mengen von DNA extrapoliert werden, die zur Versbrechung und Expression des gewünschten Gens in einem Tierversuch wirksam sind. Zum Beispiel ist die Menge von DNA zur Verabreichung in einem Menschen etwa 100-mal die Menge von DNA, die in einer Ratte wirkungsvoll ist.
Unabhängig davon, ob die für Ngn3 kodierende NDA in vivo oder ex vivo eingeführt wird, kann die DNA (oder Zellen, welche die DNA exprimieren) in Kombination mit anderen Genen und anderen Mitteln verabreicht werden. Zusätzlich dazu kann für Ngn3 kodierende DNA (oder rekombinante Zellen, die Ngn3-DNA exprimieren) therapeutisch für Erkrankungen verwendet werden, die z.B. mit einem Rückgang der Insulinproduktion assoziiert sind, aber die nicht mit einer Änderung der Ngn3-Funktion per se assoziiert sind. Zum Beispiel kann ein Anstieg von Ngn3 einen Anstieg der Zahl von reifen β-Zellen verursachen und daher einen Anstieg der Insulinproduktion in einer Person verursachen, die über verringerte Insulinproduktion aus einem anderen Grund verfügt, der nicht mit der Funktion von Ngn3 assoziiert ist.
Identifikation von Inselzellvorläufern und Entwicklung von β-Zellen unter Einsatz von Ngn3
Wie in den nachstehenden Beispielen detaillierter beschrieben gibt das zeitliche und räumliche Muster von Ngn3-Exression an, dass Ngn3 als Marker für Inselzellvorläufer verwendet werden kann. Diese Eigenschaft von Ngn3-Expression kann genutzt werden, um Zusammensetzungen und Verfahren bereitzustellen, um Inselzellvorläufer zu identifizieren und zu isolieren. Zum Beispiel kann Pankreasgewebe aus einem Subjekt erhalten werden und eine Einzelzellsuspension aus dem Gewebe erhalten werden. Die Einzelzellkulturen können dann in Kultur vermehrt werden, und repräsentative Zellen aus Einzelzellkulturen können auf Ngn3-Expression analysiert werden. Ngn3-Expression kann zum Beispiel durch Detektion von für Ngn3 kodierender mRNA (z.B. durch PCR-Amplifikation unter Einsatz einer Sonde, die von einer für Ngn3 kodierenden Sequenz abstammt) oder durch Detektion des Ngn3-Polypeptids in Zelllysaten unter Einsatz eines Anti-Ngn3-Antikörpers analysiert werden. Zellen, die Ngn3 exprimieren, werden als Inselzellvorläufer identifiziert. Die Zellen der entsprechenden Kultur konnten dann vermehrt werden und/oder dazu verwendet werden, reife β-Zellen in Kultur abzuleiten, und die reifen β-Zellen konnten in das Subjekt implantiert werden, z.B. entweder in dasselbe Subjekt, von welchem die Zellen ursprünglich erhalten wurden, oder in ein anderes Subjekt.
Ngn3 dient auch der Überwachung der Entwicklung von Inselzellvorläufern zu reifen β-Zellen. Kurz gesagt, Ngn3-Expression kann in einer In-vitro-Kultur überwacht werden, um zu bestimmen, wann die Zellen reife β-Zellen werden. Zum Beispiel sind Zellen, die Ngn3 exprimieren, in einem früheren Stadium von β-Zellentwicklung. Sobald Ngn3-Expression abnimmt oder im Wesentlichen nicht detektierbar wird, kann die Zelle als eine Zelle identifiziert werden, die sich zu einer reifen β-Zelle entwickelt hat. Die Zellen können auf andere Marker von Inselzellentwicklung sowie auf Insulinproduktion gescreent werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sollen Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung davon bereitstellen, wie die Erfindung auszuführen ist, und sollen den Schutzumfang dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen, in keinster Weise einschränken. Es sind Bemühungen angestellt worden, um Genauigkeit hinsichtlich der verwendeten Zahlen zu sichern (z.B. Mengen, Temperatur etc.), aber es sollten etwaige Versuchsfehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, Molekulargewicht gewichtsmittleres Molekulargewicht, Temperatur in Grad Celsius und Druck völlig oder nahezu atmosphärisch.
Beispiel 1: Detektion von Ngn3-Expression in murinem Pankreas
Mitglieder der basischen Helix-Schleifen-Helix-(bHLH-) Familie von Transkriptionsfaktoren regulieren das Wachstum und die Differenzierung von mehreren Zelltypen.
Insulingenexpression wird durch einen heterodimeren Komplex von zwei bHLH-Proteinen aktiviert: ein ubiquitär exprimiertes (Klasse-A-) Protein und ein zelltypspezifischer (Klasse-B-) Partner, BETA2/neuroD1. BETA2/neuroD1 ist ebenfalls für β-Zellentwicklung wichtig. Die Unterbrechung des BETA2/neuroD1-Gens bei Mäusen, auf die abgezielt wird, führt zu einer beträchtlichen Reduktion der β-Zellmasse bei der Geburt aufgrund von erhöhter Apoptose von Inselzellen zu einem späten Zeitpunkt in der Entwicklung des Fötus. Es gibt jedoch keinen offensichtlichen Defekt in der β-Zellbildung oder Insulingenexpression, trotz der postulierten Bedeutung dieses Faktors für die β-Zelldifferenzierung.
Unter der Voraussetzung, dass dieser moderate Phänotyp die wiederholte Expression von eng verwandten Klasse-B-bHLH-Proteinen im endokrinen Pankreas reflektierte, suchten die Erfinder mithilfe von Polymerase-Kettenreaktion mit reverser Transkriptase (RT-PCR) unter Einsatz von degenerierten Oligonucleotidprimern, die auf konservierter Aminosäuresequenz in der bHLH-Domäne der Klasse-B-bHLH-Proteine basieren, nach zusätzlichen Familienmitgliedern (Sommer et al., Mol. Cell. Neurosci. 8, 221 (1996)). PCR-Analyse zeigte, dass die endokrinen Pankreas-Zelllinien und isolierten erwachsenen Inseln nicht nur neuroD1 exprimierten, sondern auch verschiedene andere Familienmitglieder der neuralen Klasse-B-bHLH-Gene, einschließlich mash1, neuroD2 und 4 und Neurogenine (ngn) 1, 2 und 3 exprimierten. Dieser bemerkenswerte Grad von Redundanz konnte für den Verlust von BETA2/neuroD1 bei Mäusen kompensieren. Die zwei häufigsten amplifizierten Sequenzen kodierten für NeuroD4 und Ngn3, aber In-situ-Hybridisierungsstudien am Mauspankreas zeigten höchste Expression von neuroD1 und Ngn3. Diese Ergebnisse wurden durch Immunhistochemie bestätigt.
Ngn3 wird am frühesten am Tag 11,5 (e11,5) des Mausembryos detektiert, steigt auf ein Maximum an e15,5 und sinkt an e18,5, wobei keine Färbung im Pankreas des Erwachsenen zu sehen ist. Ngn3 wird in den Kernen von verstreuten Kanalzellen und periduktalen Zellen detektiert, und es gab keine Co-Färbung mit einem beliebigen der vier Inselhormone (Insulin, Glukagon, Somatostatin und Pankreaspolypep tid). Dieses zeitliche und räumlich Expressionsmuster implizierte Ngn3 als Marker für Inselzellvorläufer. Nkx6.1, ein spezifischer Marker für zukünftige β-Zellen, wurde in 10–20 % der Ngn3-positiven Zellen exprimiert, wodurch die Verwendung von Ngn3 als Marker für Inselzellvorläufer unterstützt wurde. Die Spitze von Ngn3-Expression bei e15,5 entspricht auch der Spitze einer neuen β-Zellbildung im Fötus. Die Daten der Erfinder unterstützen ein Modell, in welchem Ngn3 stromauf von BETA2/neuroD1 und anderen Inselzelldifferenzierungsfaktoren wirkt, die Inselzellvorläufer markieren, aber vor der letzten Differenzierung abschalten.
Beispiel 2: Isolation und Sequenzierung eines für menschliches Nqn3-Polypeptid kodierenden Polynucleotids
Eine Sonde, die von einem klonierten Fragment des murinen Ngn3-Gens stammte (Sommer et al., siehe oben), wurde zum Screenen einer menschlichen Genombibliothek verwendet. Dieser Screen führte zur Isolation der Genomsequenz, die im Sequenzprotokoll als Seq.-ID Nr. 1 angeführt ist. Basierend auf der Kartierung der murinen Startstelle unter Einsatz von 5'-RACE von RNA eines Mausfötuspankreas befindet sich die Transkriptionsstartstelle in der für menschliches Ngn3 kodierenden Sequenz an Nucleotidrest 2643. Die kodierende Sequenz befindet sich zwischen den Nucleotidresten 3022–3663, mit einer Stoppstelle an 3664–3666. Es befinden sich keine Introns innerhalb der nichttranslatierten 5'-Region (UTR) oder der kodierenden Sequenz von Seq.-ID Nr. 1.
Der Promotor von Ngn3 ist von Interesse, insbesondere angesichts der Tatsache, dass er außerordentlich gut zwischen Maus, Ratte und Mensch konserviert ist. Angesichts der Rolle von Ngn3 in der Pankreas- und Inselzellentwicklung ist der Ngn3-Promotor wahrscheinlich ein Schlüssel zur Bestimmung der Zahl der Inselzellen im reifen Pankreas. Die Regulationsregion, die dem menschlichen Ngn3-Promotor entspricht, umfasst Sequenzen von bis zu etwa 500 bp stromauf der Transkriptionsstartstelle innerhalb des menschlichen Ngn3-Promotors (z.B. von etwa 2144 bis zur Transkriptionsstartstelle bei 2643).
FISH wurde dazu verwendet, die Stelle von Ngn3 auf dem menschlichen Chromosom bei 10q22.1-22.2 zu identifizieren.
Beispiel 3: Isolation und Sequenzieren eines für murines Nqn3-Polypeptid kodierenden Polynucleotids und Promotors
Die murine Volllängen-Ngn3-Sequenz und ihre flankierenden 5'-Sequenzen, die den murinen Ngn3-Promotor umfassen, wurden durch Sequenzieren eines zuvor erhaltenen genomischen Maus-DNA-Fragments erhalten (Sommer et al., siehe oben). Die murine Ngn3-Sequenz wird im Sequenzprotokoll als Seq.-ID Nr. 3 angeführt, wobei das Polypeptid, für das kodiert wird, als Seq-ID Nr. 4 bereitgestellt wird. Die Transkriptionsstartstelle wurde unter Einsatz des 5'-RACE-Verfahrens bestimmt und unter Einsatz von Rnase-Schutz mit RNA aus fötalem Mauspankreas bestätigt und ist an Nucleotidrest 719; die für murines Ngn3 kodierende Sequenz beginnt an Rest 1093. Der Promotor umfasst eine Region etwa 500 bp stromauf der Transkriptionsstartstelle.

Claims

In-Vitro-Verfahren zur Erzeugung einer insulinproduzierenden β-Zelle, das Folgendes umfasst: Einführen eines Ngn3-Polypeptids oder eines für Ngn3 kodierenden Vektors, der in der Lage ist, Ngn3 zu exprimieren, in Zellen einer Zellkultur; und Züchten dieser Zellkultur zur Erzeugung einer insulinproduzierenden β-Zelle.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zellkultur eine Stammzelle umfasst, die aus Pankreasgewebe oder Gastrointestinalgewebe stammt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die für Ngn3 kodierende DNA mit einem gewebespezifischen Promotor operabel verbunden ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Ngn3 die Sequenz von Seq.-ID Nr. 2 oder eine biologisch aktive Variante umfasst, die zumindest 90 % Aminosäureidentität aufweist.
Verwendung einer für Ngn3 kodierenden Nucleinsäure oder eines ngn3-Polypeptids zur Erzeugung einer insulinproduzierende β-Zelle in einer In-vitro-Zellkultur.
Verwendung einer für Ngn3 kodierenden Nucleinsäure oder eines ngn3-Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Entwicklung einer insulinproduzierenden Zelle in einem Individuum.
Verwendung einer fast entwickelten oder reifen β-Zelle, die aus Zellen kultiviert wird, in die eine für Ngn3 kodierende Nucleinsäure oder ein ngn3-Polypetid eingeführt worden ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer mit Ngn3 in Verbindung stehenden Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, worin das Individuum Diabetes hat.
Verwendung nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin die Nucleinsäure einer Pankreaszelle zugeführt wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin die Nucleinsäure in einem Virus enthalten ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin die für Ngn3 kodierende Nucleinsäure für ein Polypeptid von Seq.-ID Nr. 2 oder eine biologisch aktive Variante mit zumindest 90 % Aminosäureidentität kodiert.
Wirtszelle, umfassend: einen rekombinanten Vektor, der für Ngn3 kodiert; worin die Wirtszelle in der Lage ist, eine insulinproduzierende Zelle zu erzeugen.
Wirtszelle, umfassend: ein rekombinantes Ngn3-Polypeptid; worin die Wirtszelle in der Lage ist, eine insulinproduzierende Zelle zu erzeugen.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 13, worin die Wirtszelle eine Stammzelle, die aus Pankreasgewebe oder Gastrointestinalgewebe stammt, eine Leber- oder eine Darmzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12 oder 14, worin der rekombinante Vektor weiters einen Promotor umfasst, der ein CMV-, SV40- oder Adenoviruspromotor oder ein zellspezifischer oder zelltypspezifischer Promotor ist, der mit der für Ngn3 kodierenden Sequenz operabel verbunden ist.
Wirtszelle nach Anspruch 12, 13, 14, oder 15, worin Ngn3 mit Seq.-ID Nr. 2 zu 90 % identisch ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 und 14 bis 15, worin der Vektor ein Plasmid- oder retroviraler Vektor ist.