DE69521002T3

DE69521002T3 - Mutationen des mit 17q verbundenen Ovarial- und Brustkrebs Empfindlichkeitsgens

Info

Publication number: DE69521002T3
Application number: DE69521002T
Authority: DE
Inventors: Donna M. Salt Lake City Shattuck-Eidens; Jacques Quebec Simard; Mitsuru Emi; Yusuke Yokohama-shi Nakamura; Francine Ste-foy Quebec Durocher
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 2010-02-25
Anticipated expiration: 2015-08-12
Also published as: WO1996005306A2; NO970624D0; EP0705903B2; AU686004B2; CN1172502A; WO1996005306A3; CA2196797A1; ES2158048T5; CA2196797C; NZ291621A; DK0705903T3; JP2002503943A; MX9701075A; NO970624L; FI970513A; GR3036322T3; PT705903E; DE69521002T2; DE69521002D1; ES2158048T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Bereich der Humangenetik. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für Brust- und Eierstockkrebs bei einem menschlichen Individuum, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Keimbahn-Veränderung im BRCA1-Gen in einer Gewebeprobe des Individuums gibt, wobei die Veränderung eine Prädisposition für den Krebs anzeigt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Brust- oder Eierstockläsion bei einem menschlichen Individuum auf Neoplasie, assoziiert mit dem BRCA1-Gen-Locus, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Mutation im BRCA1-Gen in einer Probe der Läsion gibt. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nucleinsäuresonde bereit, die 15 bis 30 Nucleotide der SEQ ID NO: 1 aufweist und die 185delAG → ter39-Mutation enthält, sowie Vektoren und Wirtszellen wie in den Ansprüchen definiert.
Die hierin zur Erhellung des Hintergrunds der Erfindung verwendeten Veröffentlichungen und weiteren Materialien, und insbesondere die Fälle zur Bereitstellung zusätzlicher Einzelheiten unter Berücksichtigung der Praxis, sind hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen, wobei darauf zur bequemeren Handhabung unter Nennung von Autor und Datum im folgenden Text und entsprechender Gruppierung in der Liste der Literaturstellen im Anhang Bezug genommen wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Genetik von Krebs ist kompliziert, da multiple dominante, positive Regulatoren des transformierten Stadiums (Onkogene) als auch multiple rezessive, negative Regulatoren (Tumorsuppressor-Gene) beteiligt sind. Über 100 Onkogene wurden beschrieben. Weniger als ein Dutzend Tumorsuppressor-Gene wurden identifiziert, doch wird ein Anstieg der Zahl auf über 50 erwartet (Knudson, 1993).
Die Beteiligung derart vieler Gene unterstreicht die Komplexität der Wachstums-Kontrollmechanismen, die in Zellen am Werk sind, um die Unversehrtheit des gesunden Gewebes zu erhalten. Diese Komplexität offenbart sich in anderer Weise. Bisher konnte von keinem einzelnen Gen eine Beteiligung an der Entwicklung aller, oder selbst der Mehrheit der humanen Krebsformen nachgewiesen werden. Die häufigsten onkogenen Mutationen finden sich im H-ras-Gen, das bei 10 bis 15% aller festen Tumoren festgestellt wird (Anderson et al., 1992). Die am häufigsten mutierten Tumorsuppressor-Gene sind das TP53-Gen, das bei etwa 50% aller Tumoren homozygot deletiert ist, und CDKN2, das bei 46% aller untersuchten Tumor-Zelllinien homozygot deletiert war (Kamb et al., 1994). Ohne ein Ziel, das allen transformierten Zellen gemeinsam ist, erscheint der Traum einer „Zauberkugel”, die Krebszellen zerstören oder rückverwandeln kann und dabei gesundes Gewebe unversehrt lässt, unwahrscheinlich. Die Hoffnung auf eine neue Generation spezifisch gerichteter Antitumor-Wirkstoffe beruht wohl auf der Identifizierbarkeit von Tumorsuppressor-Genen oder Onkogenen, die Hauptrollen in der Kontrolle der Zellteilung spielen.
Die Tumorsuppressor-Gene, die bisher kloniert und charakterisiert wurden, beeinflussen die Anfälligkeit für: 1) Retinoblastoma (RB1); 2) Wilms-Tumor (WT1); 3) Li-Fraumeni (TP53); 4) Hereditäre adenomatöse Polyposis (APC); 5) Neurofibromatose Typ 1 (NF1); 6) Neurofibromatose Typ 2 (NF2); 7) von Hippel-Lindau-Syndrom (VHL); 8) Multiple endokrine Neoplasie Typ 2A (MEN2A); und 9) Melanom (CDKN2).
Die Tumorsuppressor-Loci, die genetisch kartiert, doch bisher nicht isoliert worden sind, umfassen Gene für: Multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1); Familiäres Lynch-Krebs-Syndrom 2 (LCFS2); Neuroblastom (NB); Basalzellkarzinom-Syndrom (BCNS); Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS); Klarzelliges Nierenkarzinom (RCC); Tuberöse Sklerose 1 (TSC1); und tuberöse Sklerose 2 (TSC2). Die Tumorsuppressor-Gene, die bisher bestimmt wurden, kodieren für Produkte mit Ähnlichkeiten zu einer Vielzahl von Proteinarten, einschließlich DNA-bindender Proteine (WT1), ergänzende Transkriptions-Regulatoren (RB1), GTPase-aktivierende Proteine oder GAPs (NF1), zytoskelettale Komponenten (NF2), Membran-gebundene Rezeptor-Kinasen (MEN2A), Zellzyklus-Regulatoren (CDKN2), nebst weiteren ohne erkennbare Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen (APC und VHL).
In vielen Fällen wurde gezeigt, dass die ursprünglich durch genetische Untersuchungen identifizierten Tumorsuppressor-Gene verloren gegangen oder bei irgendwelchen vereinzelt auftretenden Tumorformen mutiert waren. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Regionen von chromosomaler Abweichung für die Position der wichtigen Tumorsuppressor-Gene, die sowohl bei der genetischen Prädisposition für Krebs als auch bei vereinzelt auftretendem Krebs involviert sind, von Bedeutung sein können.
Eines der Kennzeichen der bis heute bestimmten verschiedenen Tumorsuppressor-Gene besteht darin, dass sie bei bestimmten Tumorarten in großer Häufigkeit deletiert sind. Die Deletionen beinhalten oftmals den Verlust eines einzelnen Allels, einen sogenannten Verlust der Heterozygotie (LOH), doch können auch eine homozygote Deletion beider Allele umfassen. Bezüglich LOH wird das verbliebene Allel entweder auf Grund einer vorbestehenden erblich bedingten Mutation oder auf Grund einer sekundären sporadischen Mutation als nicht-funktionell angenommen.
Bei Brustkrebs handelt es sich um eine der signifikantesten Erkrankungen, von denen Frauen betroffen sind. Bei der derzeitigen Rate besteht für amerikanische Frauen ein Risiko von 1 aus 8 der Ausbildung von Brustkrebs bis zum Alter von 95 Jahren (American Cancer Society, 1992). Die Behandlung des Brustkrebses in einem späteren Stadium erweist sich oftmals als wirkungslos und verunstaltend, was dem frühen Nachweis eine hohe Priorität in der medizinischen Handhabung dieser Krankheit zuordnet. Eierstockkrebs, obschon weniger häufig als Brustkrebs, führt oft schnell zum Tod und macht die vierthäufigste Ursache der Krebssterblichkeit bei amerikanischen Frauen aus. Genetische Faktoren tragen zu einem ungenau definierten Anteil der Häufigkeit von Brustkrebs bei, der auf etwa 5% aller Fälle, doch auf etwa 25% der vor dem Alter 40 Jahre diagnostizierten Fälle geschätzt wird (Claus et al., 1991). Brustkrebs ist in zwei Typen unterteilt, nämlich den in jungen Jahren und den in späteren Jahren ausbrechenden Typus, basierend auf einer Krümmung in der alterspezifischen Inzidenzkurve um das Alter 50 Jahre. Die Mutation eines Gens, BRCA1, wird als für etwa 45% des familiär gehäuft auftretenden Brustkrebses, doch für mindestens 80% bei den Familien sowohl mit Brust- als auch Eierstockkrebs verantwortlich erachtet (Esston et al., 1993).
Es wurden intensive Anstrengungen unternommen, um das BRCA1-Gen zu isolieren, seit es im Jahr 1990 erstmals kartiert wurde (Hall et al., 1990; Narod et al., 1991). Ein zweiter Locus, BRCA2, wurde kürzlich dem Chromosom 13q zukartiert (Wooster et al., 1994) und scheint für einen Anteil am früh ausbrechenden Brustkrebs von etwa demselben wie bei BRCA1, doch einem geringeren Risiko von Eierstockkrebs verantwortlich zu sein. Die verbliebene Anfälligkeit für früh ausbrechenden Brustkrebs teilt sich zwischen bisher unkartierten Genen für den familiär bedingten Krebs und selteneren Keimbahn-Mutationen bei Genen wie TP53 auf (Malkin et al., 1990). Es wurde auch vorgeschlagen, dass heterozygote Träger von defekten Formen des Ataxia-Teleangectasia-Gens ein höheres Risiko für Brustkrebs tragen (Swift et al., 1976; Swift et al., 1991). Der spät ausbrechende Brustkrebs ist ebenfalls häufig familiär bedingt, obschon die Risiken bei Blutsverwandten nicht so hoch sind wie bei früh ausbrechendem Brustkrebs (Cannon-Albright et al., 1994; Mettlin et al., 1990). Allerdings ist der prozentuale Anteil dieser Fälle auf Grund einer genetischen Anfälligkeit unbekannt.
Brustkrebs ist seit langem als hereditäre Erkrankung anerkannt (Anderson, 1972). Zahlreiche Forscher untersuchten die Anzeichen für eine genetische Vererbung und folgerten, dass die Daten in höchstem Maße mit der dominanten Vererbung eines Hauptanfälligkeits-Locus oder -Loci übereinstimmen (Bishop und Gardner, 1980; Go et al., 1983; Willams und Anderson, 1984; Bishop et al., 1988; Newman et al., 1988; Claus et al., 1991). Jüngste Ergebnisse zeigen, dass mindestens drei Loci existieren, die eine Anfälligkeit für Brustkrebs als auch für andere Krebsarten verleihen. Bei diesen Loci handelt es sich um den TP53-Locus auf Chromosom 17p (Malkin et al., 1990), einen 17q-gekoppelten Anfälligkeits-Locus, bekannt als BRCA1 (Hall et al., 1990) und einen oder mehrere Loci, die für den unkartierten Rest verantwortlich sind. Hall et al. (1990) geben an, dass die erbliche Brustkrebs-Anfälligkeit bei Familienstämmen mit frühem Ausbruch mit dem Chromosom 17q21 verknüpft ist; obschon spätere Untersuchungen dieser Gruppe unter Verwendung eines geeigneteren genetischen Modells die Beschränkung auf den früh ausbrechenden Brustkrebs teilweise widerlegten (Margaritte et al., 1992).
Die meisten Strategien für das Klonieren des 17q-gekoppelten Brustkrebsprädisponierenden Gens (BRCA1) erfordern präzise genetische Lokalisations-Studien. Das einfachste Modell für die funktionelle Rolle des BRCA1 geht davon aus, dass Allele des BRCA1, die für Krebs prädisponieren, rezessiv gegenüber Wildtyp-Allelen sind; das heißt, dass Zellen, die mindestens ein Wildtyp-BRCA1-Allel enthalten, nicht kanzerös sind. Zellen, die ein Wildtyp-BRCA1-Allel und ein prädisponierendes Allel enthalten, können jedoch gelegentlich das Wildtyp-Allel entweder durch Zufallsmutation oder durch Chromosomenverlust während der Zellteilung (Non-Disjunktion) verlieren. Der gesamten Nachkommenschaft solcher mutierter Zellen fehlt die Wildtyp-Funktion des BRCA1 und kann sich zu Tumoren entwickeln. Gemäß diesem Modell sind prädisponierende Allele des BRCA1 rezessiv, doch wird die Anfälligkeit für Krebs in einer dominanten Weise vererbt: Frauen, die ein prädisponierendes Allel (und ein Wildtyp-Allel) besitzen, tragen das Risiko einer Ausbildung von Krebs, da ihre Brustepithelzellen das Wildtyp-BRCA1-Allel spontan verlieren können. Dieses Modell trifft auf eine Gruppe von Krebsanfälligkeits-Loci zu, die als Tumorsuppressoren oder Antionkogene bekannt und eine Klasse von Genen sind, die das Retinoblastoma-Gen und das Neurofibromatosis-Gen umfasst. Durch Schlussfolgern kann dieses Modell auch die BRCA1-Funktion erklären, wie kürzlich vorgeschlagen wurde (Smith et al., 1992).
Eine zweite Möglichkeit ist die, dass die BRCA1-prädisponierenden Allele in Wirklichkeit dominant sind; das heißt, dass ein Wildtyp-Allel von BRCA1 die Tumorbildende Rolle des prädisponierenden Allels nicht überwinden kann. Folglich würde eine Zelle, die sowohl das Wildtyp- als auch das mutante Allel trägt, nicht notwendigerweise die Wildtyp-Kopie des BRCA1 verlieren, bevor sie bösartige Zellen entstehen lässt. Stattdessen würden Brustzellen bei prädisponierten Individuen (eine) andere Zufallsveränderung(en) vollziehen, die zum Krebs führt/en.
Wenn BRCA1-prädisponierende Allele rezessiv sind, so sollte das BRCA1-Gen normalerweise in gesundem Brustgewebe, doch nicht in Brusttumoren funktionell exprimiert werden. Sind dagegen BRCA1-prädisponierende Allele dominant, so kann das Wildtyp-BRCA1-Gen in gesundem Brustgewebe exprimiert werden oder auch nicht. Allerdings ist es wahrscheinlich, dass das prädisponierende Allel in Brusttumorzellen exprimiert wird.
Die 17q-Verknüpfung von BRCA1 wurde unabhängig bei drei von fünf Familienstämmen sowohl mit Brustkrebs als auch Eierstockkrebs bestätigt (Narod et al., 1991). Bei diesen Untersuchungen wurde behauptet, das Gen innerhalb einer sehr großen Region von 15 centiMorgan (cM), oder etwa 15 Millionen Basenpaaren, auf jeder Seite des gekoppelten Markers pCMM86 (D17S74) lokalisieren zu können. Allerdings verliefen die Versuche, die Region durch genetische Studien unter Verwendung von pCMMS6 umgebenden Markern weiter zu definieren, erfolglos. Spätere Studien ergaben, dass das Gen beträchtlich näher lag (Esston et al., 1993) und dass die ursprüngliche Analyse fehlerhaft war (Margaritte et al., 1992). Hall et al., (1992) lokalisierten das BRCA1-Gen kürzlich auf einem Intervall von etwa 8 cM (etwa 8 Millionen Basenpaare), begrenzt durch Mfd15 (D17S250) an der proximalen Seite und das humane GIP-Gen an der distalen Seite. Ein etwas näheres Intervall für den BRCA1-Locus, basierend auf öffentlich zugänglichen Daten, wurde per Übereinkunft beim Chromosom-17-Workshop im März 1992 festgelegt (Fair, 1992). Die Größe dieser Regionen und die mit ihnen verbundene Unsicherheit hat es überaus schwierig gemacht, eine physische Karte und/oder Klonierungs-Strategien zur Isolierung des BRCA1-Gens zu entwerfen und auszuführen.
Die Identifikation eines Locus für die Brustkrebs-Anfälligkeit würde den frühen Nachweis anfälliger Personen ermöglichen und unser Verständnis der einleitenden Schritte, die zu Krebs führen, in starkem Maße erhöhen. Da sich Anfälligkeits-Loci oftmals während des Fortschreitens des Tumors verändern, könnte auch das Klonieren dieser Gene für die Entwicklung besserer diagnostischer und prognostischer Produkte als auch besserer Krebstherapien wichtig sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Bei einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für Brust- und Eierstockkrebs bei einem menschlichen Individuum bereit, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Keimbahn-Veränderung im BRCA1-Gen in einer Gewebeprobe des Individuums gibt, wobei die Veränderung eine Prädisposition für den Krebs anzeigt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Brust- oder Eierstockläsion bei einem menschlichen Individuum auf Neoplasie, assoziiert mit dem BRCA1-Gen-Locus, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Mutation im BRCA1-Gen in einer Probe der Läsion gibt. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nucleinsäuresonde bereit, die 15 bis 30 Nucleotide der SEQ ID NO: 1 aufweist und die 185delAG → ter39-Mutation enthält, sowie Vektoren und Wirtszellen wie in den Ansprüchen definiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 ist ein Diagramm gezeigt, in dem die Reihenfolge der an BRCA1 angrenzenden Loci dargestellt ist, wie durch den Chromosom-17-Workshop festgelegt. 1 ist aus Fain, 1992, übernommen.
In 2 ist eine schematische Karte der YACs gezeigt, die einen Teil der Mfd15 bis Mfd188-Region definieren.
In 3 ist eine schematische Karte der STS, P1 und BAC in der BRCA1-Region gezeigt.
In 4 ist eine schematische Karte des humanen Chromosoms 17 gezeigt. Die relevante Region, enthaltend BRCA1, ist aufgeweitet, um die relativen Positionen der beiden früher identifizierten Gene CA125 und RNU2 aufzuzeigen, wobei BRCA1 den Marker D17S855 umspannt.
In 5 ist die Ausrichtung der BRCA1 Zinkfinger-Domäne mit drei weiteren Zinkfinger-Domänen gezeigt, die bei einer Smith-Waterman-Ausrichtung am höchsten bewertet wurden. RPT1 kodiert für ein Protein, das ein negativer Regulator des IL-2-Rezeptors bei Mäusen zu sein scheint. RIN1 kodiert für ein DNA-bindendes Protein, das ein RING-Finger-Motiv bezüglich des Zinkfingers umfasst. RFP1 kodiert für einen vermuteten Transkriptionsfaktor, der die N-terminale Domäne des RET-Onkogenprodukts ist. Die untere Linie enthält die C3HC4-Konsensus-Zinkfinger-Sequenz, wobei die Positionen der Cysteine und eines Histidins gezeigt sind, welche die Zinkion-bindende Tasche bilden.
In 6 ist ein Diagramm der BRCA1-mRNA gezeigt, das die Lokalisationen der Introns und die durch alternatives Spleißen erhaltenen Varianten der BRCA1-mRNA zeigt. Die Intron-Stellen sind durch dunkle Dreiecke angezeigt und die Exons sind unter der die cDNA darstellenden Linie mit Nummern versehen. Die obere cDNA stellt das zur Erzeugung der Peptidsequenz von BRCA1 verwendete Kompositum dar. Alternative, als cDNA-Klone oder Hybrid-Auswahlklone identifizierte Formen sind darunter gezeigt.
In 7 ist das Gewebeexpressionsmuster von BRCA1 gezeigt. Der Blot wurde von Clontech bezogen und enthält RNA aus den angegebenen Geweben. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie durch den Hersteller empfohlen, unter Verwendung einer Sonde, bestehend aus den Nukleotid-Positionen 3631 bis 3930 von BRCA1. Zu beachten ist, dass sowohl Brust- als auch Eierstockgewebe heterogene Gewebe sind und der prozentuale Anteil der relevanten Epithelzellen variabel sein kann. Die Molekulargewicht-Standardwerte sind in Kilobasen angegeben.
In 8 ist ein Diagramm der 5'-untranslatierten Region plus dem Anfang der translatierten Region von BRCA1 gezeigt und dabei die Lokalisationen der Introns und die Varianten von BRCA1-mRNA, wie durch alternatives Spleißen erzeugt, veranschaulicht. Die Intron-Stellen sind durch gestrichelte Linien verdeutlicht. Sechs alternative Spleißformen sind gezeigt.
In 9A ist eine Nonsense-Mutation bei Stamm 2082 gezeigt. P steht für die ursprünglich gescreente Person, b und c sind Haplotyp-Träger, a, d, e, f und g tragen den BRCA1-Haplotyp nicht. Die C- zu T-Mutation ergibt einen Stopcodon und schafft eine Stelle für das Restriktionsenzym AvrII. Die PCR-Amplifikationsprodukte werden mit diesem Enzym gespalten. Die Träger sind für die Stelle heterozygot und zeigen daher drei Bande. Nicht-Träger bleiben ungespalten.
In 9B ist eine Mutations- und Kosegregations-Analyse bei BRCA1-Stämmen gezeigt. Die Träger-Individuen sind als ausgefüllte Kreise und Quadrate in den Stammbaum-Diagrammen dargestellt. Bei Stamm 1910 liegt eine Frameshift- Mutation vor. Die ersten drei Bahnen sind Kontrollen, nämlich Nichtträger-Proben. Die mit 1–3 bezeichneten Bahnen enthalten Sequenzen von Träger-Individuen. Die Bahn 4 enthält DNA von einem Stammmitglied, das die BRCA1-Mutation nicht trägt. Die Raute dient der Verschleierung der Identität des Stamms. Der aus dem zusätzlichen C resultierende Frameshift ist in den mit 1, 2 und 3 bezeichneten Bahnen erkennbar.
In 9C ist eine Mutations- und Kosegregationsanalyse bei BRCA1-Stämmen gezeigt. Die Träger-Individuen sind als ausgefüllte Kreise und Quadrate in den Stammbaum-Diagrammen dargestellt. Bei Stamm 2035 liegt eine abgeleitete regulatorische Mutation vor. Gezeigt ist die ASO-Analyse der Träger und Nicht-Träger zweier verschiedener Polymorphismen (PM1 und PM7), die auf ihre Heterozygotie in der Keimbahn untersucht und zur Heterozygotie der Lymphozyten-mRNA verglichen wurden. Die oberen beiden Reihen jeder Tafel enthalten aus genomischer DNA amplifizierte PCR-Produkte, und die unteren beiden Reihen enthalten aus cDNA amplifizierte PCR-Produkte. „A” und „G” stellen die beiden durch die ASO-Analyse nachgewiesenen Allele dar. Die dunklen Flecken zeigen an, dass ein bestimmtes Allei in der Probe vorhanden ist. Die ersten drei Bahnen von PM7 stehen für die drei Genotypen in der Allgemeinpopulation.
In 10A–10H ist die genomische Sequenz von BRCA1 gezeigt. Die Kleinbuchstaben stehen für eine Intronsequenz, die Großbuchstaben für eine Exonsequenz. Unbestimmte Intervalle innherhalb der Introns sind mit vvvvvvvvvvvvv bezeichnet. Bekannte polymorphe Stellen sind mit Unterstreichung und halbfetter Schriftart gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Bereich der Humangenetik. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für Brust- und Eierstockkrebs bei einem menschlichen Individuum, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Keimbahn-Veränderung im BRCA1-Gen in einer Gewebeprobe des Individuums gibt, wobei die Veränderung eine Prädisposition für den Krebs anzeigt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Brust- oder Eierstockläsion bei einem menschlichen Individuum auf Neoplasie, assoziiert mit dem BRCA1-Gen-Locus, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Mutation im BRCA1-Gen in einer Probe der Läsion gibt. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nucleinsäuresonde bereit, die 15 bis 30 Nucleotide der SEQ ID NO: 1 aufweist und die 185delAG → ter39-Mutation enthält, sowie Vektoren und Wirtszellen wie in den Ansprüchen definiert.
Die vorliegende Offenbarung stellt ein isoliertes Polynukleotid bereit, das den gesamten oder einen Teil des BRCA1-Locus oder eines mutierten BRCA1-Locus, vorzugsweise mindestens acht Basen und nicht mehr als etwa 100 kb Länge, umfasst. Solche Polynukleotide können Antisense-Polynukleotide sein. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein rekombinantes Konstrukt bereit, umfassend solch ein isoliertes Polynukleotid, z. B. ein zur Exprimierung in einer transformierten Wirtszelle geeignetes rekombinantes Konstrukt.
Die vorliegende Offenbarung stellt darüber hinaus Verfahren zur Herstellung eines Polynukleotids bereit, umfassend das Polymerisieren von Nukleotiden zum Erhalt einer Sequenz, die aus mindestens acht aufeinanderfolgenden Nukleotiden des BRCA1-Locus zusammengesetzt ist; und Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Polymerisieren von Aminosäuren zum Erhalt einer Sequenz, die mindestens fünf innerhalb des BRCA1-Locus kodierte Aminosäuren umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem den Schritt der Amplifikation eines Abschnitts des BRCA1-Locus umfassen und kann darüber hinaus einen Schritt der Bereitstellung einer Gruppe von Polynukleotiden beinhalten, die Primer für die Amplifikation dieses Abschnitts des BRCA1-Locus sind. Das Verfahren ist zur Identifizierung einer 185delAG-Mutation zur Anwendung entweder bei der Diagnose einer Prädisposition für Krebs oder der Diagnose oder Prognose von Krebs nützlich.
Der BRCA1-Locus prädisponiert Menschen für Brustkrebs oder Eierstockkrebs, ist ein für ein BRCA1-Protein kodierendes Gen, bei dem keine signifikante Homologie mit bekannten Proteinen oder DNA-Sequenzen festgestellt wurde. Dieses Gen wird hierin als BRCA1 bezeichnet. Mutationen im BRCA1-Locus in der Keimbahn sind indikativ für eine Prädisposition für Brustkrebs und Eierstockkrebs. Schließlich sind somatische Mutationen im BRCA1-Locus auch mit Brustkrebs, Eierstockkrebs und weiteren Krebsformen verknüpft, die einen Indikator dieser Krebsformen oder der Prognose dieser Krebsformen darstellen. Die Mutations-Ereignisse des BRCA1-Locus können Deletionen, Insertionen und Punktmutationen innerhalb der kodierenden Sequenz und der nicht-kodierenden Sequenz umfassen.
Ausgehend von einer Region am langen Arm des Humanchromosoms 17 des Humangenoms, 17q, das eine geschätzte Größe von etwa acht Millionen Basenpaaren aufweist, wurde eine Region identifiziert, die einen genetischen Locus, BRCA1, enthält, der eine Anfälligkeit für Krebs, einschließlich Brust- und Eierstockkrebs, bewirkt.
Die Region, die den BRCA1-Locus enthält, wurde unter Verwendung einer Vielzahl genetischer Methoden identifiziert. Mit genetischen Kartierungs-Methoden wurde ursprünglich die BRCA1-Region bezüglich der Rekombination mit genetischen Markern definiert. Basierend auf Untersuchungen an großen ausgedehnten Familien („Stämmen”) mit vielen Fällen von Brustkrebs (und Fällen von Eierstockkrebs bei einigen Stämmen) wurde eine Chromosomenregion genau bestimmt, die das BRCA1-Gen als auch weitere vermutete Anfälligkeits-Allele im BRCA1-Locus enthält. Zwei meiotische Bruchstellen wurden an der distalen Seite des BRCA1-Locus entdeckt, die als Rekombinanten zwischen genetischen Markern und der Erkrankung exprimiert werden, und eine Rekombinante an der proximalen Seite des BRCA1-Locus. Folglich ist eine Region, die den BRCA1-Locus enthält, durch diese Marker physisch begrenzt.
Die Verwendung der bereitgestellten genetischen Marker ermöglichte die Identifikation von Klonen, die den Bereich einer Bank von humanen, künstlich hergestellten Chromosomen der Hefe (yeast artificial chromosome – YAC) oder von humanen, künstlich hergestellten Chromosomen der Bakterien (bacterial artificial chromosome – BAC) abdeckt. Es wird auch die Identifikation und Präparation leichter manipulierbarer Cosmid-, P1 und BAC-Klone aus dieser Region und die Konstruktion eines „Contig” aus einer Untergruppe von Klonen ermöglicht. Diese Cosmide, P1, YAC und BAC stellen die Grundlage für das Klonieren des BRCA1-Locus bereit, ebenso wie die Grundlage für die Entwicklung von z. B. in der Diagnose und Behandlung von Brust- und/oder Eierstockkrebs wirksamer Reagenzien bereit. Das BRCA1-Gen und weitere potentielle Anfälligkeits-Gene wurden aus dieser Region isoliert. Die Isolation wurde unter Anwendung von Software-Trapping (eine Computer-Methode zur Identifizierung von Sequenzen, die wahrscheinlich kodierende Exons aus angrenzenden oder diskontinuierlichen genomischen DNA-Sequenzen enthalten), Hybrid-Auswahlmethoden und direktem Screening mit ganzen oder teilweisen cDNA-Inserten von Cosmiden, P1 und BAC in der Region zum Screening von cDNA-Banken vorgenommen. Diese Methoden wurden zum Erhalt von Sequenzen von in Brust- und anderem Gewebe exprimierten Loci verwendet. Diese Kandidat-Loci wurden zur Identifizierung von Sequenzen analysiert, die eine Krebsanfälligkeit verleihen. Wir haben entdeckt, dass Mutationen in der kodierenden Sequenz des BRCA1-Locus bei Stämmen vorliegen, die für die 17q-gekoppelte Krebsanfälligkeit, bekannt als BRCA1, verantwortlich sind. Von diesem Gen war nicht bekannt, dass es sich in dieser Region befindet. Die vorliegende Erfindung erleichtert nicht nur den frühen Nachweis bestimmter Krebsformen, was für das Überleben des Patienten so entscheidend ist, sondern auch die Bestimmung anfälliger Personen, bevor überhaupt Krebs entsteht.
Populationsquellen
Große, wohldokumentierte Familienstämme aus Utah sind zur Bereitstellung guter Quellen für humangenetische Untersuchungen besonders wichtig. Jeder große Stamm bietet unabhängig die Erbringbarkeit des Nachweises dessen, ob ein BRCA1-Anfälligkeits-Allel in jener Familie auftritt. Für die Lokalisierung und Isolierung des BRCA1-Locus informative Rekombinante konnten lediglich von Stämmen erhalten werden, die groß genug sind, um das Vorhandensein eines Anfälligkeits-Allels zu bestätigen. Große Blutsverwandschaften sind zur Untersuchung des Brustkrebses besonders wichtig, da die Penetranz des BRCA1-Anfälligkeits-Allels sowohl durch Alter als auch Geschlecht vermindert wird, was informative Blutsverwandschaften schwer zu finden macht. Darüber hinaus sind große Verwandschaftsgruppen für die Konstruktion von Haplotypen verstorbener Personen durch Folgerung von den Haplotypen auf ihre engen Verwandten wesentlich.
So können zwar auch andere Populationen nützliche Informationen liefern, doch erfordern solche Untersuchungen im allgemeinen viel größere Anstrengungen und sind dabei die Familien gewöhnlich viel kleiner und daher weniger informativ. Das altersangepasste Auftreten von Brustkrebs in Utah liegt um 20% niedriger als die amerikanische Durchschnittsrate. Das geringere Auftreten in Utah liegt vermutlich zum Großteil am jungen Alter bei der ersten Schwangerschaft, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die bei Familienstämmen in Utah gefundenen Fälle eine genetische Prädisposition tragen.
Genetische Kartierung
Eine Gruppe informativer Familien vorausgesetzt, sind genetische Marker zur Verknüpfung einer Erkrankung mit einer Region eines Chromosoms wesentlich. Zu solchen Markern zählen Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen (RFLPs) (Botstein et al., 1980), Marker mit einer variablen Anzahl an Tandem-Repeats (VNTRs) (Jeffreys et al., 1985; Nakamura et al., 1987) und eine reiche Klasse an DNA-Polymorphismen auf der Basis kurzer Tandem-Repeats (STRs), besonders Repeats von CpA (Weber und May, 1989; Litt et al., 1989). Zur Erzeugung einer genetischen Karte wählt man potentielle genetische Marker aus und testet sie unter Anwendung von aus Mitgliedern der zu untersuchenden Familienstämme extrahierten DNA.
Genetische Marker, die zur Suche nach einem mit einer Erkrankung verknüpften genetischen Locus nützlich sind, können auf einer ad hoc-Basis ausgewählt werden, indem ein spezifisches Chromosom dicht abgedeckt wird oder eine spezifische Region eines Chromosoms detailiert analysiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren zur Auswahl von mit einer Erkrankung verknüpften genetischen Marker bezieht das Auswerten des Informationsgrades von Familienstämmen ein, um den idealen Abstand zwischen genetischen Markern eines gegebenen Polymorphismusgrades zu bestimmen, dann die Auswahl jener Marker aus bekannten genetischen Karten, die ideale Abstände für eine maximale Wirksamkeit aufweisen. Der informative Gehalt von Familienstämmen wird anhand der Wahrscheinlichkeit gemessen, dass die Marker bei nicht verwandten Personen heterozygot sein werden. Auch die Verwendung von STR-Markern ist überaus wirksam, die durch Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure-Sequenz unter Anwendung von PCR nachgewiesen werden; solche Marker sind in hohem Maße informativ, leicht zu untersuchen (Weber und May, 1989) und können unter Anwendung multiplexierender Strategien gleichzeitig untersucht werden (Skolnick und Wallace, 1988), was die Anzahl der erforderlichen Experimente stark vermindert.
Wurde die Verknüpfung einmal hergestellt, so müssen die Marker gefunden werden, die den Krankheits-Locus flankieren, d. h. einen oder mehrere proximal zum Krankheits-Locus gelegene Marker und einen oder mehrere distal zum Krankheits-Locus gelegene Marker. Wo möglich, können Kandidat-Marker aus einer bekannten genetischen Karte ausgewählt werden. Wo keiner bekannt ist, können neue Marker mittels der STR-Methode identifiziert werden, wie in den Beispielen gezeigt.
Bei der genetischen Kartierung handelt es sich gewöhnlich um einen sich wiederholenden Prozess. Dieser begann durch Definieren flankierender genetischer Marker um den BRCA1-Locus herum, dann durch Ersetzen dieser flankierenden Marker durch andere Marker, die sukzessiv näher am BRCA1-Locus lagen. Als Anfangsschritt waren Rekombinations-Ereignisse, die durch große ausgedehnte Familienstämme definiert waren, spezifisch bei der Lokalisation des BRCA1-Locus als entweder distal oder proximal zu einem spezifischen genetischen Marker hilfreich (Goldgar et al., 1994).
Die Region um BRCA1 war nicht gut kartiert und es gab wenige Marker. Daher wurden kurze repetitive Sequenzen von aus YACs subklonierten Cosmiden, die physisch kartiert worden waren, analysiert, um neue genetische Marker zu entwickeln. Unter Anwendung dieses Ansatzes wurde ein Marker, 42D6, entdeckt, der pCMM86 als den distal flankierenden Marker für die BRCA1-Region ersetzte. Da 42D6 etwa 14 cM von pCMM86 ist, war die BRCA1-Region daher um etwa 14 centiMorgan reduziert (Esston et al., 1993) und begann daher mit dem Auffinden eines viel enger gekoppelten distal flankierenden Markers der BRCA1-Region, dann wurde BRCA1 als distal zum genetischen Marker Mfd15 entdeckt. Daher wurde gezeigt, dass BRCA1 in einer Region von 6 bis 10 Millionen Basen, begrenzt durch Mfd15 und 42D6, lag. Vom Marker Mfd191 wurde anschließend entdeckt, dass er distal zu Mfd15 und proximal zu BRCA1 lag. Daher wurde Mfd15 durch Mfd191 als der dichtest proximale genetische Marker ersetzt. Entsprechend wurde entdeckt, dass der genetische Marker Mfd188 den genetischen Marker 4206 ersetzen konnte, was die Region, die den BRCA1-Locus enthielt, auf etwa 1,5 Millionen Basen eingrenzte. Dann wurde der Marker Mfd191 durch tdj1474 als der proximale Marker und Mfd188 durch U5R als der distale Marker ersetzt, was die BRCA1-Region weiter auf eine Region eingrenzte, die klein genug war, um die Isolierung und Charakterisierung des BRCA1-Locus (siehe 3) unter Anwendung von im Fachbereich bekannten und hierin beschriebenen Methoden zu ermöglichen.
Physische Kartierung
Zur physischen Kartierung der Region wurden drei unterschiedliche Methoden angewandt. Die Erste bestand in der Verwendung künstlich hergestellter Hefe-Vektoren (YACs) zur Klonierung der Region, die durch tdj1474 und U5R flankiert ist. Die Zweite bestand in der Schaffung eines Satzes von PI-, BAC- und Cosmid-Klonen, welche die den BRCA1-Locus enthaltende Region abdecken.
Künstliche hergestellte Chromosomen der Hefe (YACs). Sobald eine ausreichend kleine, den BRCA1-Locus enthaltende Region identifiziert war, wurde die physikalische Isolierung der DNA in der Region durch Identifizieren eines Satzes überlappender YACs, die die Region abdecken, vorgenommen. Nützliche YACs können aus bekannten Banken isoliert werden, wie etwa den St. Louis- und CEPH YAC-Banken, die weit verteilt sind und jeweils etwa 50.000 YACs umfassen. Die isolierten YACs stammten aus diesen öffentlich zugänglichen Banken und können von einer Vielzahl von Quellen bezogen werden, einschließlich des Michigan Genome Center. Ganz klar hätten andere, die Zugang zu diesen YACs gehabt hätten, ohne die vorliegende Offenbarung den Wert der spezifischen YACs, die wir ausgewählt haben, nicht erkannt, da sie nicht gewusst hätten, welche YACs sich innerhalb und welche YACs sich außerhalb der kleinsten, den BRCA1- Locus enthaltenden Region befunden hätten.
Cosmid-, P1- und BAC-Klone. Bei der vorliegenden Offenbarung ist es von Vorteil, mit dem Erhalt der Cosmid-, P1- und BAC-Klone zur Abdeckung dieser Region zu beginnen. Die kleinere Größe dieser Inserte im Vergleich zu YAC-Inserten macht diese nützlicher als spezifische Hybridisierungssonden. Außerdem lässt sich dadurch, dass die klonierte DNA in Bakterienzellen und nicht in Hefezellen vorliegt, die DNA von Interesse viel einfacher manipulieren und wird das Signal-Geräusch-Verhältnis der Hybridisierungs-Assays verbessern. Bei den Cosmid-Subklonen der YACs wird die DNA mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilweise verdaut und in die BamHI-Stelle des pWE15-Cosmid-Vektors (Stratagene, Kat. #1251201) kloniert. Die Humansequenzen enthaltenden Cosmide werden durch Hybridisierung mit humaner repetitiver DNA (z. B. Gibco/BRL, Humane C_ot-1 DNA, Kat. 5279SA) gescreent und dann mittels einer Vielfalt von Methoden ein Fingerprint angefertigt, wie in den Beispielen ausgeführt.
Es werden P1- und BAC-Klone durch Screenen von Banken erhalten, die konstruiert sind aus dem gesamten Humangenom mit spezifischen Sequenz-markierten Stellen (STS), hergeleitet von den wie hierin beschrieben isolierten YACs, Cosmiden oder P1s und BACs.
Diese P1-, BAC- und Cosmid-Klone können durch eingestreute repetitive Sequenz-(IRS)-PCR und/oder Restriktionsenzym-Verdauungen, gefolgt von Gel-Elektrophorese und Vergleich der resultierenden DNA-Fragmente („Fingerprints”) verglichen werden (Maniatis et al., 1982). Die Klone können auch durch das Vorhandensein von STS bestimmt werden. Die Fingerprints werden zur Definierung eines überlappenden angrenzenden Klonsatzes verwendet, der die Region abdeckt, doch nicht übermäßig redundant ist und hierin als ein „minimal plattierter Weg” bezeichnet wird. Solch ein minimal plattierter Weg stellt die Grundlage für anschließende Experimente zur Identifizierung von cDNAs dar, die aus dem BRCA1-Locus stammen können.
Abdeckung der Lücke mit P1- und BAC-Klonen. Zur Abdeckung jeglicher Lücken im BRCA-1-Contig zwischen den identifizierten Cosmiden mit genomischen Klonen wurden Klone in PI- und BAC-Vektoren, die Inserte aus genomischer DNA von etwa der doppelten Größe der Cosmide für P1 und sogar noch größer für BAC (Sternberg, 1990; Sternberg et al., 1990; Pierce et al., 1992; Shizuya et al., 1992) verwendet. Die P1-Klone wurden von Genome Sciences unter Verwendung von durch uns für das Screening bereitgestellten PCR-Primern isoliert. Die BACs wurden durch Hybridisierungs-Methoden in Dr. Mel Simons Labor bereitgestellt. Die Strategie der Verwendung von P1-Klonen gestattete auch die Abdeckung der genomischen Region mit einem unabhängigen, nicht von YAC stammenden Klonsatz. Dies bewahrt vor der Möglichkeit weiterer Deletionen bei YACs, die bisher nicht nachgewiesen wurden. Diese neuen, von den P1-Klonen stammenden Sequenzen liefern das Material für ein weiteres Screening auf Kandidat-Gene, wie nachstehend beschrieben.
Genisolierung
Es gibt viele Methoden zum Testen der genomischen Klone auf das Vorhandensein von Sequenzen, die möglicherweise Kandidaten für die kodierende Sequenz eines zu isolierenden Locus darstellen können, einschließlich doch nicht beschränkt auf:

a. Zoo-Blots
b. Identifizieren von HTF-Inseln
c. Exon-Trapping
d. Hybridisieren von cDNA an Cosmide oder YACs.
e. Screening von cDNA-Banken.

(a) Zoo-Blots. Die erste Methode besteht in der Hybridisierung von Cosmiden an Southern-Blots, um DNA-Sequenzen zu identifizieren, die evolutionär konserviert sind und daher positive Hybridisierungs-Signale mit einer DNA von Spezies von variierenden Verwandschaftsgraden zum Menschen ergeben (wie etwa Affe, Kuh, Huhn, Schwein, Maus und Ratte). Southern Blots, die eine DNA von einer Vielzahl von Spezies enthalten, stehen kommerziell zur Verfügung (Clonetech, Kat. 7753-1).
(b) Identifizieren von HTF-Inseln. Die zweite Methode bezieht das Auffinden von Regionen ein, die reich an Nukleotiden C und G sind und oftmals nahe oder innerhalb der kodierenden Sequenzen auftreten. Diese Sequenzen werden HTF-(HpaI-”tiny fragment”) oder CpG-Inseln genannt, da Restriktionsenzyme, die für Stellen spezifisch sind, die CpG-Dimeren enthalten, häufig in diesen Regionen spalten (Lindsay et al., 1987).
(c) Exon-Trapping. Die dritte Methode besteht im Exon-Trapping, einer Methode, mit der Sequenzen in der genomischen DNA identifiziert werden, die Spleißstellen enthalten und daher mit einiger Wahrscheinlichkeit kodierende Gensequenzen umfassen. Die Exon-Amplifikation (Buckler et al., 1991) wird zur Auswahl und Amplifikation von Exons aus den oben beschriebenen DNA-Klonen verwendet. Die Exon-Amplifikation basiert auf der Auswahl von RNA-Sequenzen, die von funktionellen 5'- und/oder 3'-Spleißstellen flankiert sind. Die Produkte der Exon-Amplifikation werden zum Screening der Brust-cDNA-Banken verwendet, um eine handhabbare Anzahl von Kandidat-Genen für die weitere Untersuchung zu identifizieren. Das Exon-Trapping kann auch an kleinen Segmenten der sequenzierten DNA unter Verwendung von Computer-Programmen oder mittels Software-Trapping durchgeführt werden.
(d) Hybridisierung von cDNA an Cosmide, PI, BAC oder YAC. Die vierte Methode besteht in einer Modifikation der selektiven Anreicherungsmethode, die die Hybridisierung von cDNA an Cosmide, P1, BAC oder YAC verwendet und erlaubt die Identifikation transkribierter Sequenzen in, und rückgewonnen aus, klonierter genomischer DNA (Kandpal et al., 1990). Die selektive Anreicherungsmethode, bezieht in ihrer Modifikation für den vorliegenden Zweck die Bindung von DNA aus der Region des in einem YAC vorhandenen BRCA1 an eine Säulen-Matrix und das Auswählen von cDNAs aus den relevanten Banken mitein, die mit der gebundenen DNA hybridisieren, gefolgt von Amplifikation und Reinigung der gebundenen DNA, was zu einer starken Anreicherung von cDNAs in der durch die klonierte genomische DNA dargestellten Region führt.
(e) Identifikation von cDNAs. Die fünfte Methode besteht im Identifizieren von cDNAs, die dem BRCA1-Locus entsprechen. Die vermuteten kodierenden Sequenzen enthaltenden Hybridisierungs-Sonden, die mit einer der obigen Methoden ausgewählt werden, werden zum Screening verschiedener Banken, einschließlich Brustgewebe-cDNA-Banken, Eierstock-cDNA-Banken und beliebiger anderer erforderlicher Banken verwendet.
Eine weitere Variation des Themas der direkten Auswahl von cDNA wurde ebenfalls zum Auffinden von Kandidat-Genen für BRCA1 angewandt (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993). Bei dieser Methode wird Cosmid-, P1- oder BAC-DNA als Sonde verwendet. Die Sonden-DNA wird mit einem stumpfspaltenden Restriktionsenzym wie HaeIII verdaut. Dann werden doppelsträngige Adaptoren an die DNA ligiert, die als Bindungsstellen für Primer in anschließenden PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von biotinylierten Primern dienen. Die Ziel-cDNA wird aus von Gewebeproben wie Brustgewebe stammender mRNA durch Synthese von einem entweder zufallsgeprimten oder Oligo(dT)-geprimten ersten Strang, gefolgt von der Zweistrangsynthese, generiert. Die cDNA-Enden werden stumpf gemacht und an doppelsträngige Adaptoren ligiert. Diese Adaptoren dienen als Amplifikationsstellen für die PCR. Die Ziel- und Sondensequenzen werden denaturiert und mit humaner C_ot-1-DNA zum Blockieren repetitiver Sequenzen gemischt. Die Lösungs-Hybridisierung wird auf hohe C_ot-1/2-Werte vorgenommen, um die Hybridisierung rarer Ziel-cDNA-Moleküle zu gewährleisten. Das annealte Material wird dann auf Avidinkügelchen eingefangen, bei hoher Stringenz gewaschen und die rückerhaltene cDNA eluiert und mittels PCR amplifiziert. Die ausgewählte cDNA wird weiteren Runden der Anreicherung unterzogen, bevor sie in einen Plasmid-Vektor für die Analyse kloniert wird.
Testen der cDNA auf ihr Kandidat-Potential
Der Beweis, dass die cDNA der BRCA1-Locus ist, wird durch Auffinden von Sequenzen in einer DNA erhalten, die aus betroffenen Mitgliedern von Familienstämmen extrahiert wurde, die abnormale BRCA1-Genprodukte oder abnormale Gehalte an BRCA1-Genprodukt produzieren. Solche BRCA1-Anfälligkeits-Allele spalten sich zusammen mit der Erkrankung in großen Familienstämmen ab. Sie liegen auch in viel größerer Häufigkeit bei nicht-stammzugehörigen Personen mit Brust- und Eierstockkrebs als bei Personen aus der Allgemeinbevölkerung vor. Da schließlich Tumoren oftmals an Loci somatisch mutieren, die in anderen Fällen in der Keimbahn mutiert sind, erwarten wir, normale Keimbahn-BRCA1-Allele vorzufinden, die zu den BRCA1-Anfälligkeits-Allelen in aus Tumorgewebe extrahierter DNA identischen oder ähnlichen Sequenzen mutiert sind. Ob nun BRCA1-Sequenzen aus Tumorgewebe zu BRCA1-Allelen aus der Keimbahn derselben Individuen verglichen werden oder die Keimbahn-BRCA1-Allele von Krebsfällen mit denen nicht betroffener Personen verglichen werden, so liegt doch der Schlüssel in der Auffindung von Mutationen, die ernstlich genug sind, um eine offensichtliche Zerstörung der normalen Funktion des Genprodukts zu bewirken. Diese Mutationen können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwersten Formen sind Frameshift-Mutationen oder große Deletionen, die das Gen zum Kodieren für ein abnormales Protein oder ein solches bringen, das die Proteinexpression signifikant verändert. Weniger schwer zerstörende Mutationen umfassen kleine In-frame-Deletionen und nicht-konservative Basenpaar-Substitutionen, die eine signifikante Auswirkung auf das produzierte Protein haben, wie etwa Veränderungen an oder von einem Cystein-Rest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt, oder andere Mutationen, die die sekundäre, tertiäre oder quaternäre Proteinstruktur beeinträchtigen. Stille Mutationen oder solche, die zu konservativen Aminosäure-Substitutionen führen, sollten im allgemeinen die Proteinfunktion nicht zerstören.
Gemäß der diagnostischen und prognostischen Methode der vorliegenden Erfindung wird die 185delAG-Veränderung des Wildtyp-BRCA1-Locus nachgewiesen. Darüber hinaus kann die Methode durch Nachweis des Wildtyp-BRCM-Locus und Bestätigung des Fehlens einer Prädisposition für Krebs am BRCM-Locus erfolgen. „Veränderung des Wildtyp-Gens” umfasst allgemein alle Formen von Mutationen, einschließlich Deletionen, Insertionen und Punktmutationen in den kodierenden und nicht-kodierenden Regionen. Deletionen können das gesamte Gen oder lediglich einen Abschnitt des Gens umfassen. Punktmutationen können zu Stopcodons, Frameshift-Mutationen oder Aminosäure-Substitutionen führen. Bei somatischen Mutationen handelt es sich um solche, die lediglich in gewissen Geweben, z. B. in Tumorgewebe, auftreten und nicht in der Keimbahn vererbt werden. Keimbahn-Mutationen sind in jeglichen Körpergeweben vorfindbar und sind erblich. Ist lediglich ein einzelnes Allel somatisch mutiert, so ist ein frühes neoplastisches Stadium indiziert. Sind allerdings beide Allele somatisch mutiert, so ist ein spätes neoplastisches Stadium indiziert. Das Auffinden von BRCA1-Mutationen bietet daher sowohl diagnostische als auch prognostische Information. Ein BRCA1-Allel, das nicht deletiert ist (wie etwa auf einem Schwester-Chromosom zu einem Chromosom festgestellt, das eine BRCA1-Deletion trägt) kann auf andere Mutationen wie Insertionen, kleine Deletionen und Punktmutationen gescreent werden. Es wird angenommen, dass viele, in Tumorgeweben gefundene Mutationen jene sind, die zu einer verminderten Expression des BRCM-Genprodukts führen. Allerdings führen Mutationen, die zu nicht-funktionellen Genprodukten führen, auch zu einem kanzerösen Zustand. Punktmutations-Ereignisse können in regulatorischen Regionen auftreten, wie etwa im Promotor des Gens, was zu Verlust oder Abnahme der Expression der mRNA führt. Punktmutationen können auch eine korrekte RNA-Prozessierung aufheben, was zu einem Verlust der Expression des BRCA1-Genprodukts oder zu einer Abnahme der mRNA-Stabilität oder der Translations-Leistung führt.
Zu nützlichen diagnostischen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, einzelsträngige Konformationsanalyse (SSCA), RNase-Schutzassay, Allel-spezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP, wie weiter unten ausführlich erörtert.
Eine Prädisposition für Krebsformen wie Brust- und Eierstockkrebs als auch die anderen hierin identifizierten Krebsformen kann durch Testen jeglichen Gewebes eines Menschen auf Mutationen des BRCA1-Gens bestimmt werden. Z. B. wiese eine Person, die eine Keimbahn-BRCA1-Mutation geerbt hätte, eine Anfälligkeit zur Ausbildung von Krebs auf. Dies kann durch Testen der DNA aus einem beliebigen Körpergewebe der Person bestimmt werden. Am einfachsten kann Blut entnommen und die DNA aus den Blutzellen extrahiert werden. Außerdem kann eine pränatale Diagnose durch Testen von Fötuszellen, Plazentazellen oder amniotischen Zellen auf Mutationen des BRCA1-Gens erfolgen. Eine Veränderung eines Wildtyp-BRCA1-Allels, ob nun z. B. durch Punktmutation oder Deletion, kann mittels einer der hierin erörterten Methoden nachgewiesen werden.
Es gibt verschiedene Methoden, die zum Nachweis einer DNA-Sequenz-Variation eingesetzt werden können. Mit einer direkten DNA-Sequenzierung, d. h. entweder einer manuellen Sequenzierung oder automatisierten Fluoreszenz-Sequenzierung, kann eine Sequenz-Variation nachgewiesen werden. Bei einem derart großen Gen wie BRCA1 ist die manuelle Sequenzierung sehr arbeitsintensiv, doch werden unter optimalen Bedingungen Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens selten übersehen. Einen weiteren Ansatz stellt der einzelsträngige Konformations-Polymorphismus-Assay (SSCA) dar (Orita et al., 1989). Mit dieser Methode werden nicht alle Sequenzveränderungen nachgewiesen, besonders wenn die DNA-Fragmentgröße mehr als 200 bp beträgt, doch kann sie zum Nachweis des Großteils der DNA-Sequenz-Variation optimiert werden. Die verminderte Nachweis-Empfindlichkeit stellt einen Nachteil dar, doch macht der mit SSCA mögliche erhöhte Durchsatz ihn zu einer attraktiven, machbaren Alternative zur direkten Sequenzierung für den Mutationsnachweis auf einer Forschungsbasis. Die Fragmente, die die Mobilität auf SSCA-Gelen verschoben haben, werden dann zur Bestimmung der genauen Beschaffenheit der DNA-Sequenz-Variation sequenziert. Zu weiteren, auf dem Nachweis von Fehlpaarungen zwischen zwei komplementären DNA-Strängen basierenden Ansätzen zählen die „clamped denaturating”-Gel-Elektrophorese (CDGE) (Sheffield et al., 1991), die Heteroduplex-Analyse (HA) (White et al., 1992) und die chemische Fehlpaarungs-Spaltung (CMC) (Grompe et al., 1989). Mit keiner der oben beschriebenen Methoden werden große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen nachgewiesen, noch eine regulatorische Mutation, die die Transkription oder Translation des Proteins beeinflusst. Andere Methoden, mit denen diese Klassen von Mutationen nachgewiesen werden könnten, wie etwa ein Proteinverkürzungs-Assay oder der asymmetrische Assay, weisen lediglich spezifische Typen von Mutationen nach und würden Missense-Mutationen nicht feststellen. Einen Überblick über derzeit verfügbare Methoden zum Nachweisen einer DNA-Sequenz-Variation ist in einer kürzlich erschienen Übersicht von Grompe (1993) zu finden. Ist eine Mutation einmal bekannt, so kann ein Allel-spezifischer Nachweis-Ansatz, wie etwa eine Allel-spezifische Oligonukleotid-(ASO)-Hybridisierung, zum schnellen Screening großer Zahlen an weiteren Proben auf dieselbe Mutation angewandt werden.
Um die Veränderung des Wildtyp-BRCA1-Gels in einem Gewebe nachzuweisen, ist es hilfreich, das Gewebe frei von umgebenden gesunden Geweben zu isolieren. Methoden zur Anreicherung von Gewebepräparationen für Tumorzellen sind im Fachbereich bekannt. Z. B. kann das Gewebe von Paraffin- oder Kryostatschnitten isoliert werden. Krebszellen können auch von gesunden Zellen mittels Durchflusszytometrie getrennt werden. Diese Methoden als auch andere Methoden zur Trennung von Tumorzellen von gesunden Zellen sind im Fachbereich wohlbekannt. Ist das Tumorgewebe in hohem Maße mit gesunden Zellen durchsetzt, so ist der Nachweis der Mutationen schwieriger.
Eine schnelle Vorab-Analyse zum Nachweis von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann vorgenommen werden, indem eine Reihe von Southern Blots von einer DNA begutachtet wird, die mit ein oder mehreren Restriktionsenzymen, vorzugsweise mit einer großen Zahl von Restriktionsenzymen, gespalten wurde. Jeder Blot enthält eine Serie von gesunden Individuen und eine Serie von Krebsfällen, Tumoren oder beidem. Southern Blots, die Hybridisierungs-Fragmente aufweisen (unterschiedlich lang zu Kontroll-DNA, wenn mit Sequenzen nahe oder einschließlich dem BRCA1-Locus sondiert), zeigen eine mögliche Mutation an. Werden Restriktionsenzyme verwendet, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, so wird die Pulsfeld-Gel-Elektrophorese (PFGE) angewandt.
Der Nachweis von Punktmutationen kann mittels einer molekularen Klonierung des/der BRCA1-Allels/e und Sequenzierung des/der Allels/e unter Anwendung im Fachbereich wohlbekannter Methoden erzielt werden. Alternativ dazu können die Gensequenzen direkt aus einer genomischen DNA-Präparation des Tumorgewebes unter Anwendung bekannter Methoden amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz der amplifizierten Sequenzen kann dann bestimmt werden.
Es gibt sechs wohlbekannte Methoden für einen umfassenderen, jedoch indirekten Test zur Bestätigung des Vorhandenseins eines Anfälligkeits-Allels: 1) einzelsträngige Konformationsanalyse (SSCA) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase-Schutzassays (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) Allel-spezifische Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nukleotid-Fehlpaarungen erkennen, wie etwa das E. coli mutS-Protein (Modrich, 1991); und 6) Allel-spezifische PCR (Rann & Kidd, 1989). Für die Allel-spezifische PCR werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden an eine bestimmte BRCA1-Mutation hybridisieren. Ist die bestimmte BRCA1-Mutation nicht vorhanden, so wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Auch das Amplifikationsrefraktorische Mutationssystem (ARMS) kann angewandt werden, wie in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0332435 und bei Newton et al., 1989, beschrieben. Insertionen und Deletionen der Gene können auch durch Klonieren, Sequenzieren und Amplifizieren nachgewiesen werden. Außerdem können Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-(RFLP)-Sonden für die Gene oder Umgebungsmarker-Gene zur Bewertung der Veränderung eines Allels oder einer Insertion in einem polymorphen Fragment verwendet werden. Ein derartiges Verfahren ist besonders nützlich für das Screening von Verwandten einer betroffenen Person auf das Vorhandensein der BRCA1-Mutation, die bei der betroffenen Person festgestellt wurde. Es können auch weitere, im Fachbereich bekannte Methoden zum Nachweis von Insertionen und Deletionen angewandt werden.
Bei den ersten drei Methoden (SSCA, DGGE und RNase-Schutzassay) taucht eine neue elektrophoretische Bande auf. SSCA weist eine Bande nach, die differenziell wandert, da die Sequenzveränderung zu einer Differenz bei der einzelsträngigen, intramolekularen Basenpaarung führt. Der RNase-Schutz bezieht die Spaltung des mutanten Polynukleotids in zwei oder mehr kleinere Fragmente ein. Die DGGE weist die Differenzen in den Wanderungsraten der mutanten Sequenzen im Vergleich zu den Wildtyp-Sequenzen unter Verwendung eines denaturierenden Gradientengels auf. Bei einem Allel-spezifischen Oligonukleotid-Assay wird ein Oligonukleotid entworfen, das eine spezifische Sequenz nachweist, wobei der Assay unter Nachweis der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Hybridisierungs-Signals vorgenommen wird. Beim mutS-Assay bindet das Protein lediglich an Sequenzen, die eine Nukleotid-Fehlpaarung in einem Heteroduplex zwischen einer mutanten und einer Wildtyp-Sequenz enthalten.
Bei Fehlpaarungen handelt es sich um hybridisierte Nukleinsäure-Duplexe, bei denen die beiden Stränge nicht 100%ig komplementär sind. Das Fehlen einer vollkommenden Homologie kann auf Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen rückführbar sein. Der Fehlpaarungs-Nachweis kann zur Feststellung von Punktmutationen im Gen oder in seinem mRNA-Produkt angewandt werden. Zwar sind die Methoden weniger empfindlich als die Sequenzierung, doch sind sie leichter an einer großen Zahl von Tumorproben durchführbar. Ein Beispiel einer Fehlpaarungs-Spaltmethode stellt die RNase-Schutzmethode dar. In der Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst die Methode die Verwendung einer markierten Ribosonde, die komplementär zur humanen Wildtyp-BRCA1-Gen-kodierenden Sequenz ist. Die Ribosonde und entweder die aus dem Tumorgewebe isolierte mRNA oder DNA werden miteinander vereinigt (hybridisiert) und anschließend mit dem Enzym RNase A verdaut, das zum Nachweis einiger Fehlpaarungen in einer Duplex-RNA-Struktur fähig ist. Wird eine Fehlpaarung durch RNase A nachgewiesen, so spaltet sie an der Stelle der Fehlpaarung. Wird folglich die annealte RNA-Präparation auf einer elektrophoretischen Gelmatrix aufgetrennt, so wird, sofern eine Fehlpaarung nachgewiesen und durch RNase A gespalten wurde, ein RNA-Produkt zu erkennen sein, das kleiner als die Duplex-RNA der vollen Länge für die Ribosonde und die mRNA oder DNA ist. Die Ribosonde braucht nicht die volle Länge der BRCA1-mRNA oder des Gens zu umfassen, sondern kann auch jeweils ein Segment sein. Umfasst die Ribosonde lediglich ein Segment der BRCA1-mRNA oder des Gens, so ist die Verwendung einer Anzahl dieser Sonden zum Screening der vollständigen mRNA-Sequenz auf Fehlpaarungen erwünscht.
In ähnlicher Weise können DNA-Sonden zum Nachweis von Fehlpaarungen durch enzymatische oder chemische Spaltung verwendet werden. Siehe z. B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ dazu können Fehlpaarungen durch Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität fehlgepaarter Duplexe relativ zu korrekt gepaarten Duplexen nachgewiesen werden. Siehe z. B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNA oder DNA, die eine Mutation enthalten könnte, kann entweder mit Ribosonden oder DNA-Sonden unter Anwendung von PCR (siehe unten) vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Veränderungen bei der DNA des BRCAI-Gens können auch unter Anwendung der Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden, besonders wenn die Veränderungen grobe Neuanordnungen darstellen wie Deletionen und Insertionen.
Die DNA-Sequenzen des BRCA1-Gens, die unter Anwendung von PCR amplifiziert wurden, können auch unter Verwendung Allel-spezifischer Sonden gescreent werden. Bei diesen Sonden handelt es sich um Nukleinsäure-Oligomere, von denen jedes eine Region der BRCA1-Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation beherbergt. Z. B. kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotide lang sein, entsprechend einem Abschnitt der BRCA1-Gensequenz. Durch Verwenden einer Batterie solcher Allel-spezifischer Sonden können die PCR-Amplifikationsprodukte zur Identifizierung des Vorhandenseins einer zuvor identifizierten Mutation im BRCA1-Gen gescreent werden. Die Hybridisierung der Allel-spezifischen Sonden mit amplifizierten BRCA1-Sequenzen kann z. B. auf einem Nylonfilter durchgeführt werden. Die Hybridisierung einer bestimmten Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen gibt das Vorhandensein derselben Mutation im Tumorgewebe wie in der Allel-spezifischen Sonde an.
Den definitivsten Test auf Mutationen in einem Kandidat-Locus stellt der direkte Vergleich genomischer BRCA1-Sequenzen von Krebspatienten mit denen von einer Kontrollpopulation dar. Alternativ dazu könnte man Messenger-RNA nach der Amplifikation, z. B. durch PCR, sequenzieren und dabei das Erfordernis des Bestimmens der Exon-Struktur des Kandidat-Gens eliminieren.
Mutationen bei Krebspatienten, die außerhalb der kodierenden Region von BRCA1 liegen, können durch Untersuchen der nicht-kodierenden Regionen, wie etwa Introns und regulatorische Sequenzen nahe oder innerhalb des BRCA1-Gens, nachgewiesen werden. Ein früher Hinweis darauf, dass Mutationen in den nicht-kodierenden Regionen wichtig sind, kann aus Northern-Blot-Experimenten abgelesen werden, die Messenger-RNA-Moleküle von abnormaler Größe oder Menge bei Krebspatienten im Vergleich zu Kontrollpersonen aufzeigen.
Eine Veränderung der BRCA1-mRNA-Expression kann mittels jeglicher im Fachbereich bekannten Methoden nachgewiesen werden. Zu diesen zählen Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifikation und der RNase-Schutz. Eine verminderte mRNA-Expression zeigt eine Veränderung des Wildtyp-BRCA1-Gens an. Eine Veränderung der Wildtyp-BRCA1-Gene kann auch durch Screening auf eine Veränderung des Wildtyp-BRCA1-Proteins nachgewiesen werden. Z. B. können mit BRCA1 immunreaktive monoklonale Antikörper zum Screenen eines Gewebes verwendet werden. Das Fehlen eines artverwandten Antigens wiese auf eine BRCA1-Mutation hin. Antikörper, die für Produkte mutanter Allese spezifisch sind, könnten ebenfalls zum Nachweis des mutanten BRCA1-Genprodukts verwendet werden. Solche immunologischen Assays können in einem der im Fachbereich bekannten, in bequemer Weise durchzuführenden Formate vorgenommen werden. Zu diesen zählen Western Blots, immunhistochemische Assays und ELISA-Assays. Jegliche Methode zum Nachweis eines veränderten BRCA1-Proteins kann zum Nachweis einer Veränderung der Wildtyp-BRCA1-Gene eingesetzt werden. Funktionelle Assays, wie z. B. Bestimmungen der Proteinbindung, können angewandt werden. Darüber hinaus können Assays eingesetzt werden, die die biochemische Funktion des BRCA1 nachweisen. Das Auffinden eines mutanten BRCA1-Genprodukts weist auf eine Veränderung eines Wildtyp-BRCA1-Gens hin.
Mutante BRCA1-Gene oder -Genprodukte können auch in anderen menschlichen Körperproben nachgewiesen werden, wie etwa Serum, Stuhl, Harn und Sputum. Dieselben Methoden, wie oben zum Nachweis mutanter BRCA1-Gene oder Genprodukte in Geweben erörtert, können auf andere Körperproben angewandt werden. Von den Tumoren schilfern Krebszellen ab und zeigen sich in den Körperproben. Außerdem kann das BRCA1-Genprodukt selbst in den extrazellulären Raum sekretiert und in den Körperproben sogar in Abwesenheit der Krebszellen vorgefunden werden. Durch Screenen solcher Körperproben kann in einfacher Weise eine Frühdiagnose für viele Krebsarten erhalten werden. Außerdem läßt sich der Verlauf der Chemotherapie oder Radiotherapie durch Testen solcher Körperproben auf mutante BRCA1-Gene oder -Genprodukte leichter überwachen.
Die Diagnoseverfahren der vorliegenden Erfindung sind auf jeglichen Tumor anwendbar, bei dem die 185delAG-Mutation in BRCA1 eine Rolle bei der Tumorentstehung spielt. Das diagnostische Verfahren der vorliegenden Erfindung ist für Kliniker nützlich, da sie anhand dessen über eine geeignete Behandlung entscheiden können.
Die Primer-Paare der vorliegenden Offenbarung sind zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten BRCA1-Allels unter Anwendung der PCR nützlich. Die Paare der einzelsträngigen DNA-Primer können an Sequenzen innerhalb oder in der Umgebung des BRCA1-Gens auf Chromosom 17q21 annealt werden, um die amplifizierende DNA-Synthese des BRCA1-Gens selbst zu primen. Ein vollständiger Satz dieser Primer erlaubt die Synthese aller Nukleotide der BRCA1-Gen-kodierenden Sequenzen, d. h. der Exons. Der Primersatz erlaubt vorzugsweise die Synthese sowohl der Intron- als auch der Exon-Sequenzen. Auch Allel-spezifische Primer können verwendet werden. Solche Primer lagern sich lediglich an bestimmte BRCA1-mutante Allele an und amplifizieren daher ein Produkt nur in Gegenwart des mutanten Allels als einer Matrize.
Um die anschließende Klonierung der amplifizierten Sequenzen zu erleichtern, können die Primer Sequenzen von Restriktionsenzymstellen aufweisen, die an ihr 51 Ende angehängt sind. Daher stammen alle Nukleotide der Primer von BRCA1-Sequenzen oder von an BRCA1 angrenzenden Sequenzen ab, mit Ausnahme der wenigen Nukleotide, die zur Bildung einer Restriktionsenzym-Stelle erforderlich sind. Solche Enzyme und Stellen sind im Fachbereich wohlbekannt. Die Primer selbst können unter Anwendung im Fachbereich wohlbekannter Methoden synthetisiert werden. Allgemein können die Primer unter Verwendung von Oligonukleotid-Syntheseapparaturen hergestellt werden, die kommerziell verfügbar sind. Steht die Sequenz des offenen Leserasters von BRCA1, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, zur Verfügung, so liegt das Design bestimmter Primer durchaus im Rahmen der Möglichkeiten dieses Fachbereichs.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Nukleinsäure-Sonden sind für eine Reihe von Zwecken nützlich. Sie können bei der Southern-Hybridisierung an genomische DNA und bei der RNase-Schutzmethode zum Nachweis der oben bereits erörterten Punktmutationen verwendet werden. Die Sonden können zum Nachweis von PCR-Amplifikationsprodukten eingesetzt werden. Sie können außerdem zum Nachweis von Fehlpaarungen mit dem BRCA-1-Gen oder der mRNA unter Anwendung weiterer Methoden verwendet werden.
Es wurde entdeckt, dass Individuen mit dem Wildtyp-BRCA1-Gen keinen Krebs haben, was die Folge des BRCA1-Allels ist. Allerdings sind Mutationen, die die Funktion des BRCA1-Proteins beeinflussen, bei der Pathogenese von Krebs beteiligt. Daher korreliert das Vorhandensein eines veränderten (oder eines mutierten) BRCA1-Gens, das ein Protein mit einem Funktionsverlust oder einer veränderten Funktion produziert, direkt mit einem erhöhten Krebsrisiko. Um eine BRCA1-Genmutation nachzuweisen, wird eine biologische Probe hergestellt und auf einen Unterschied zwischen der Sequenz des zu analysierenden BRCA1-Allels und der Sequenz des Wildtyp-BRCA1-Allels analysiert. Mutante BRCA1-Allele können zunächst mittels einer der oben beschriebenen Methoden identifiziert werden. Dann werden mutante Allele zur Identifizierung der spezifischen Mutation des bestimmten mutanten Allels sequenziert. Alternativ dazu können mutante BRCA1-Allele zunächst durch Identifizierung mutanter (veränderter) BRCA1-Proteine unter Anwendung herkömmlicher Methoden identifiziert werden. Die mutanten Allele werden dann zur Identifizierung der spezifischen Mutation bei jedem Allel sequenziert. Die 185delAG-Mutation, die zu einer veränderten Funktion des BRCA1-Proteins führt, findet dann für die diagnostischen und prognostischen Methoden der vorliegenden Erfindung Verwendung.
Definitionen
In der vorliegenden Erfindung gelten die folgenden Definitionen:
Zur „Amplifikation der Polynukleotide” werden Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR), Ligations-Amplifikation (oder ligase chain reaction – LCR) und Amplifikations-Methoden, die auf der Verwendung von Q-beta-Replikase basieren, eingesetzt. Diese Methoden sind wohlbekannt und werden im Fachbereich breit praktiziert. Siehe z. B. US-Patentschriften Nr. 4.683.195 und 4.683.202 und Innis et al., 1990 (für PCR); und Wu et al., 1989a (für LCR). Die Reagenzien und die Hardware zur Durchführung der PCR stehen kommerziell zur Verfügung. Die zur Amplifikation der Sequenzen aus der BRCA1-Region nützlichen Primer sind vorzugsweise komplementär zu, und hybridisieren spezifisch mit Sequenzen in der BRCA1-Region oder in Regionen, die eine darin gelegene Ziel-Region flankieren. Die durch Amplifikation generierten BRCA1-Sequenzen können direkt sequenziert werden. Alternativ dazu, doch weniger erwünscht, kann/können die amplifzierte/n Sequenz(en) vor der Sequenzanalyse kloniert werden. Ein Verfahren für das direkte Klonieren und die Sequenzanalyse enzymatisch amplifizierter Genomsegmente wurde beschrieben von Scharf, 1986.
„Analyt-Polynukleotid” und „Analyt-Strang” beziehen sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polynukleotid, bei dem das Vorliegen einer Zielsequenz vermutet wird, und das in einer Vielzahl von Probenarten, einschließlich biologischer Proben, vorhanden sein kann.
„Bindungspartner” bezieht sich auf ein Molekül, das zur Bindung eines Ligand-Moleküls mit hoher Spezifität fähig ist, wie z. B. ein Antigen und einen Antigenspezifischen Antikörper oder ein Enzym und seinen Inhibitor. Generell müssen die spezifischen Bindungspartner bei ausreichender Affinität binden, um den Analytkopie/komplementären Strang-Duplex (im Falle der Polynukleotid-Hybridisierung) unter den Isolationsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind im Fachbereich bekannt und umfassen z. B. Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor-Ligand-Paare und komplementäre Polynukleotidstränge. Im Falle der komplementären Polynukleotid-Bindungspartner sind die Partner normalerweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens 40 Basen lang sein. Die Polynukleotide können sich aus DNA, RNA oder synthetischen Nukleotid-Analoga zusammensetzen.
„Biologische Probe” bezieht sich auf eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, bei der ein Gehalt an Analyt-Polynukleotid oder -Polypeptid von einem Individuum vermutet wird, einschließlich, doch nicht beschränkt auf z. B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, die äußeren Abschnitte der Haut, die Atemwege, die Darm- und Urogenitaltrakte, Tränen, Speichel, Blutzellen, Tumoren, Organe, Gewebe und Proben von in vitro-Zelikulturbestandteilen.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Diagnostizieren” oder „Prognostizieren”, wie im Zusammenhang mit Neoplasie verwendet, zur Angabe 1) der Klassifikation von Läsionen als Neoplasie, 2) der Bestimmung des Schweregrades der Neoplasie oder 3) der Überwachung des Krankheitsverlaufs vor, während und nach der Behandlung verwendet.
„Kodieren”. Ein Polynukleotid wird als für ein Polypeptid „kodierend” bezeichnet, wenn es in seinem nativen Zustand oder einem mittels im Fachbereich wohlbekannten Methoden manipulierten Zustand transkribiert und/oder translatiert werden kann, um die mRNA für das Polypeptid oder ein Fragment davon zu produzieren. Der Antisense-Strang stellt das Komplement solch einer Nukleinsäure dar, und die kodierende Sequenz kann davon abgeleitet werden.
„Isoliert” oder „im Wesentlichen rein”. Eine „isolierte” oder „im Wesentlichen reine” Nukleinsäure (z. B. eine RNA, DNA oder ein Mischpolymer) ist eine solche, die im Wesentlichen von anderen zellulären Komponenten befreit ist, die natürlicherweise eine native Humansequenz oder ein Protein, wie z. B. Ribosomen, Polymerasen, viele andere humane Genomsequenzen und Proteine, begleiten. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz oder ein Protein, das aus seiner natürlich vorhandenen Umgebung entfernt wurde und umfasst rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder mittels heterologer Systeme biologisch synthetisierte Analoga.
„BRCA1-Allel” bezieht sich auf normale Allele des BRCA1-Locus als auch auf Allele, die Varianten tragen, welche den Menschen zur Ausbildung von Krebs an vielen Stellen, einschließlich z. B. Brust-, Eierstock-, Kolorektal- und Prostatakrebs, prädisponieren. Solche prädisponierenden Allele werden auch als „BRCA1-Anfälligkeits-Allele” bezeichnet.
Die Begriffe „BRCA1-Locus”, BRCA1-Gen, „BRCA1-Nukleinsäuren” oder „BRCA1-Polynukleotid” beziehen sich jeweils auf Polynukleotide, die sich alle in der BRCA1-Region befinden und die wahrscheinlich in gesundem Gewebe exprimiert werden, wobei bestimmte Allele davon ein Individuum zur Ausbildung von Brust-, Eierstock-, Dickdarm- und Prostatakrebs prädisponieren. Mutationen des BRCA1-Locus können an der Auslösung und/oder dem Fortschreiten weiterer Tumorarten beteiligt sein. Der Locus ist zum Teil durch Mutationen angegeben, die Individuen zur Ausbildung von Krebs prädisponieren. Diese Mutationen fallen innerhalb die nachstehend beschriebene BRCA1-Region. Der BRCA1-Locus soll kodierende Sequenzen, intervenierende Sequenzen und regulatorische Elemente, die die Transkription und/oder Translation kontrollieren, einschließen. Der BRCA1-Locus soll alle allelen Varianten der DNA-Sequenzen umfassen.
Diese Begriffe, wenn auf eine Nukleinsäure angewandt, beziehen sich auf eine solche Nukleinsäure, die für ein BRCA1-Polypeptid, Fragment, Homologon oder eine Variante kodiert, einschließlich z. B. von Protein-Fusionen oder -Deletionen. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Offenbarung besitzen eine Sequenz, die entweder abgeleitet ist von oder im Wesentlichen ähnlich ist zu einem natürlichen BRCA1-kodierenden Gen oder einem solchen, das wesentliche Homologie zu einem natürlichen BRCA1-kodierenden Gen oder einem Abschnitt davon aufweist. Die kodierende Sequenz für ein BRCA1-Polypeptid ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt, die Aminosäuresequenz dagegen in SEQ ID NO: 2.
Die Polynukleotid-Zusammensetzungen dieser Offenbarung umfassen RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge, und können chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder können nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten, wie für Fachleute des Bereichs leicht zu erkennen sein wird. Zu solchen Modifikationen zählen z. B. Markierungen, Methylierung, Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide durch ein Analogon, Internukleotid-Modifikationen, wie etwa ungeladene Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate etc.), geladene Bindungen (z. B. Phosphorthioate, Phosphordithioate etc.) überhängende Komponenten (z. B. Polypeptide), Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen etc.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Verknüpfungen (z. B. Alpha-anomere Nukleinsäuren etc.). Ebenfalls enthalten sind synthetische Moleküle, die Polynukleotide in ihrer Bindungsfähigkeit an eine bestimmte Sequenz über eine Wasserstoffbindung oder andere chemische Wechselwirkungen nachahmen. Solche Moleküle sind im Fachbereich bekannt und umfassen z. B. jene, bei denen Peptidverknüpfungen die Phosphatverknüpfungen im Rückgrat des Moleküls ersetzen.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäuren bereit, die replikative Klonierungsvektoren sind, die die Nukleinsäuresonden der BRCA1-Region umfassen. Das rekombinante Konstrukt kann zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig sein. Alternativ dazu kann das rekombinante Konstrukt in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrierbar sein. Solch ein rekombinantes Polynukleotid umfasst ein Polynukleotid von genomischem, cDNA-, halbsynthetischem oder synthetischem Ursprung, das Kraft seines Ursprungs oder der Manipulation 1) nicht an das gesamte oder einen Abschnitt eines Polynukleotids geknüpft ist, an das es von Natur aus geknüpft ist; 2) an ein anderes Polynukleotid geknüpft ist als das, an das es von Natur aus geknüpft ist; oder 3) nicht von Natur aus vorkommt.
Daher werden durch diese Erfindung rekombinante Nukleinsäuren bereitgestellt, die Sequenzen umfassen, die ansonsten nicht natürlich vorkommen. Obschon die Wildtyp-Sequenz verwendet werden kann, wird diese oftmals verändert, z. B. durch Deletion, Substitution oder Insertion.
cDNA oder genomische Banken verschiedener Arten können als natürliche Quellen der Nukleinsäuren der vorliegenden Offenbarung gescreent werden, oder es können diese Nukleinsäuren durch Amplifikation der in genomischer DNA oder anderen natürlichen Quellen vorliegenden Sequenzen bereitgestellt werden, wie z. B. mittels PCR. Die Wahl der cDNA-Banken entspricht normalerweise einer Gewebequelle, die in mRNA für die gewünschten Proteine reichlich vorhanden ist. Phagen-Banken sind normalerweise bevorzugt, doch können auch andere Arten von Banken verwendet werden. Die Klone einer Bank werden auf Platten ausgestrichen, auf ein Substrat für das Screening übertragen, denaturiert und auf das Vorhandensein der gewünschten Sequenzen hin sondiert.
Die bei dieser Erfindung verwendeten DNA-Sequenzen umfassen gewöhnlich mindestens etwa fünf Codons (15 Nukleotide), gewöhnlicher mindestens etwa 7 bis 15 Codons, und am bevorzugtesten mindestens etwa 35 Codons. Ein oder mehrere Introns können ebenfalls vorhanden sein. Diese Anzahl von Nukleotiden macht gewöhnlich etwa die minimale Länge aus, die für eine erfolgreiche Sonde erforderlich ist, die spezifisch mit einer BRCA1-kodierenden Sequenz hybridisieren würde.
Methoden für die Nukleinsäure-Manipulation sind allgemein beschrieben z. B. bei Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Die zur Anwendung dieser Methoden nützlichen Reagenzien, wie etwa Restriktionsenzyme und ähnliches, sind im Fachbereich weit bekannt und im Handel beziehbar von Vertreibern wie New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S. Biochemicals, New England Nuclear und einer Reihe weiterer Quellen.
”BRCA1-Region” bezieht sich auf einen Abschnitt des Humanchromosoms 17q21, der von den Markern tdj1474 und U5R umgrenzt ist. Diese Region enthält den BRCA1-Locus, einschließlich des BRCA1-Gens.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „BRCA1-Locus”, „BRCA1-Allel” und „BRCA1-Region” alle auf doppelsträngige DNA, umfassend den Locus, das Allel oder die Region, als auch jede der einzelsträngigen DNAs, die den Locus, das Allel oder die Region ausmachen.
Wie hierin verwendet, ist ein „Abschnitt” des BRCA1-Locus oder der Region oder des Allels so definiert, dass er eine minimale Größe von mindestens etwa acht Nukleotiden, oder bevorzugt etwa 15 Nukleotiden, oder noch bevorzugter mindestens etwa 25 Nukleotiden, und kann eine minimale Größe von mindestens etwa 40 Nukleotiden aufweisen.
„Funktionsfähig gekoppelt” bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, wobei die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen eine Funktion in ihrer vorgesehenen Weise erlaubt. Z. B. ist ein Promotor funktionsfähig mit einer kodierenden Sequenz gekoppelt, wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst.
„Sonden”. Polynukleotid-Polymorphismen, die mit BRCA1-Allelen assoziiert sind, welche für bestimmte Krebsarten prädisponieren oder mit den meisten Krebsarten verknüpft sind, werden durch Hybridisierung mit einer Polynukleotid-Sonde nachgewiesen, die ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz unter stringenten bis mäßig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen bilden. Wird erwartet, dass die Sonden perfekt komplementär zur Zielsequenz sind, so werden stringente Bedingungen angelegt. Die Hybridisierungs-Stringenz kann vermindert werden, wenn ein gewisses Maß an Fehlpaarung erwartet wird, z. B. wenn Varianten erwartet werden, mit dem Ergebnis, dass die Sonde nicht vollständig komplementär sein wird. Es werden Bedingungen gewählt, die nicht-spezifische/zufällige Bindungen aussschalten, d. h. die Störung minimieren. Da solche Indikationen sowohl neutrale DNA-Polymorphismen als auch Mutationen identifizieren, erfordern diese Indikationen eine weitere Analyse, um den Nachweis eines BRCA1-Anfälligkeits-Allels zu erbringen.
Die Sonden für BRCA1-Allele können aus den Sequenzen der BRCA1-Region oder ihren cDNAs abgeleitet werden. Die 185delAG-Sonden weisen 15 bis 30 Nukleotide auf, die einen Abschnitt der BRCA1-Region umspannen und die eine spezifische Hybridisierung an die BRCA1-Region ermöglichen. Enthält die Zielsequenz eine Sequenz, die identisch zur Sonde ist, ist das Hybrid selbst unter stringenten Bedingungen relativ stabil. Wird ein gewisser Grad an Fehlpaarungen bei der Sonde erwartet, d. h. wird vermutet, dass die Sonde an eine Varianten-Region hybridisiert, so kann eine längere Sonde verwendet werden, die an die Zielsequenz mit der erforderlichen Spezifität hybridisiert.
Die Sonden umfassen ein isoliertes Polynukleotid, das an einen Marker oder ein Reporter-Molekül gebunden ist und zur Isolierung anderer Polynukleotid-Sequenzen mit Sequenz-Ähnlichkeit mittels standardmäßiger Methoden verwendet werden kann. Zu Methoden zur Herstellung und Markierung von Sonden siehe z. B. Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Weitere ähnliche Polynukleotide können unter Verwendung homologer Polynukleotide ausgewählt werden. Alternativ dazu können Polynukleotide, die für diese oder ähnliche Polypeptide kodieren, synthetisiert oder unter Ausnutzung der Redundanz im genetischen Code ausgewählt werden. Verschiedene Codon-Substitutionen können eingeführt werden, z. B. durch stille Veränderungen (wobei verschiedene Restriktionsstellen erzeugt werden) oder zur Optimierung der Expression für ein bestimmtes System. Mutationen können zur Modifikation der Eigenschaften des Polypeptids, eventuell zur Veränderung der Ligand-bindenden Affinitäten, Interketten-Affinitäten oder des Polypeptid-Abbaus oder der Umsatzrate eingeführt werden.
Sonden der vorliegenden Erfindung, die synthetische Oligonukleotide oder andere Polynukleotide umfassen, können von natürlich vorkommenden oder rekombinanten einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotiden abgeleitet oder chemisch synthetisiert sein. Die Sonden können auch durch Nick-Translation, Klenow-Einbaureaktion oder andere im Fachbereich bekannte Methoden markiert werden.
Abschnitte der Polynukleotid-Sequenz mit 15 bis 30 Nukleotiden aus einer für BRCA1 kodierenden Polynukleotid-Sequenz sind als 185delAG-Sonden bevorzugt. Die Sonden können auch zur Bestimmung dessen verwendet werden, ob für BRCA1 kodierende mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist.
Bei „rekombinanter Nukleinsäure” handelt es sich um eine Nukleinsäure, die nicht natürlich vorkommt, oder die durch die künstliche Kombination zweier ansonsten getrennter Segmente einer Sequenz erhalten wird. Diese künstliche Kombination wird oftmals entweder durch chemische Synthesemethoden oder durch die künstliche Manipulation isolierter Segmente von Nukleinsäuren, z. B. durch gentechnische Methoden, erreicht. Dies wird gewöhnlich zur Ersetzung eines Codons durch ein redundantes Codon vorgenommen, das für dieselbe oder eine konservative Aminosäure kodiert, wobei typischerweise eine Sequenz-Erkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ dazu wird dies zur Koppelung von Nukleinsäure-Segmenten mit gewünschten Funktionen zum Erhalt einer gewünschten Kombination von Funktionen vorgenommen.
„Regulatorische Sequenzen” bezieht sich auf jene Sequenzen, die normalerweise innerhalb von 100 kb der kodierenden Region eines Locus liegen, doch auch entfernter von der kodierenden Region sein können und welche die Exprimierung des Gens (einschließlich der Transkription des Gens, und Translation, Spleißen, Stabilität oder ähnliches der Messenger-RNA) beeinflusst.
„Wesentliche Homologie oder Ähnlichkeit”. Eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon ist „im Wesentlichen homolog” (oder „im Wesentlichen ähnlich”) zu einem anderen, wenn, sofern mit der anderen Nukleinsäure (oder ihrem komplementären Strang) optimal angeordnet (mit geeigneten Nukleotid-Insertionen oder -Deletionen), eine Nukleotid-Sequenzidentität bei mindestens etwa 60% der Nukleotidbasen, gewöhnlich mindestens etwa 70%, noch gewöhnlicher mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90%, und noch bevorzugter mindestens etwa 95 bis 98% der Nukleotidbasen, vorliegt.
Alternativ dazu liegt eine wesentliche Homologie (oder Ähnlichkeit) dann vor, wenn eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon an eine andere Nukleinsäure (oder einen komplementären Strang davon) unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an den Strang oder sein Komplement hybridisiert. Eine Selektivität der Hybridisierung liegt vor, wenn die Hybridisierung, die wesentlich selektiver als das völlige Fehlen von Spezifität ist, eintritt. Typischerweise tritt eine selektive Hybridisierung ein, wenn eine Homologie von mindestens etwa 55% über eine Strecke von mindestens etwa 14 Nukleotiden vorliegt, bevorzugt von mindestens etwa 65%, noch bevorzugter mindestens etwa 75%, und am bevorzugtesten von mindestens etwa 90%. Siehe Kanehisa, 1984. Die Länge des beschriebenen Homologie-Vergleichs kann längere Strecken betragen; bei bestimmten Ausführungsformen beträgt sie oftmals eine Strecke von mindestens etwa neun Nukleotiden, gewöhnlich mindestens etwa 20 Nukleotiden, gewöhnlicher mindestens etwa 24 Nukleotiden, typischerweise mindestens etwa 28 Nukleotiden, noch typischer mindestens etwa 32 Nukleotiden und bevorzugt mindestens etwa 36 oder mehr Nukleotiden.
Die Nukleinsäure-Hybridisierung wird durch Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel, über die Basenzusammensetzung, Länge der komplementären Stränge und der Anzahl der Nukleotidbasen-Fehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nukleinsäuren hinaus beeinflusst, wie für Fachleute des Bereichs ohne weiteres erkennbar sein wird. Stringente Temperaturbedingungen umfassen allgemein Temperaturen von über 30°C, typischerweise über 37°C, und bevorzugt über 45°C. Stringente Salzbedingungen betragen gewöhnlich weniger als 100 mM, typischerweise weniger als 500 mM und bevorzugt weniger als 200 mM. Allerdings ist die Kombination von Parametern viel wichtiger als das Maß eines einzelnen Parameters. Siehe z. B. Wetmur & Davidson, 1968.
Auch Sonden-Sequenzen können unter bestimmten Bedingungen spezifisch an Duplex-DNA hybridisieren, um Triplex-DNA oder andere DNA-Komplexe einer höheren Ordnung zu bilden. Die Herstellung solcher Sonden und geeignete Hybridisierungs-Bedingungen sind im Fachbereich wohlbekannt.
Die Begriffe „wesentliche Homologle” oder „wesentliche Identität” geben, wenn auf Polypeptide bezogen, an, dass das in Frage stehende Polypeptid oder Protein zu mindestens etwa 30% mit einem vollständigen, natürlich vorkommenden Protein oder einem Abschnitt davon, gewöhnlich zu mindestens etwa 70% und bevorzugt zu mindestens etwa 95% identisch ist.
Eine „im Wesentlichen ähnliche Funktion” bezieht sich auf die Funktion einer modifizierten Nukleinsäure oder eines modifizierten Proteins bezüglich der Wildtyp-BRCA1-Nukleinsäure oder des Wildtyp-BRCA1-Polypeptids. Das modifizierte Polypeptid ist im Wesentlichen homolog zum Wildtyp-BRCA1-Polypeptid und weist im Wesentlichen dieselbe Funktion auf. Das modifizierte Polypeptid kann eine veränderte Aminosäure-Sequenz aufweisen und/oder kann modifizierte Aminosäuren enthalten. Über die Ähnlichkeit der Funktion hinaus kann das modifizierte Polypeptid weitere nützliche Eigenschaften wie eine längere Halbwertszeit aufweisen. Die Ähnlichkeit der Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids kann im Wesentlichen dieselbe wie die Aktivität des Wildtyp-BRCA1-Polypeptids sein. Alternativ dazu kann die Ähnlichkeit der Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids höher als die Aktivität des Wildtyp-BRCA1-Polypeptids sein. Das modifizierte Polypeptid wird unter Anwendung herkömmlicher Methoden synthetisiert, oder wird durch eine modifizierte Nukleinsäure kodiert und unter Anwendung herkömmlicher Methoden erzeugt. Die modifizierte Nukleinsäure wird mittels herkömmlicher Methoden hergestellt. Eine Nukleinsäure mit einer im Wesentlichen ähnlichen Funktion zur Wildtyp-BRCA1-Genfunktion erzeugt das oben beschriebene modifizierte Protein.
Die Homologle für Polypeptide wird gewöhnlich unter Verwendung von Sequenzanalyse-Software gemessen. Siehe z. B. das Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Die Proteinanalyse-Software vergleicht ähnliche Sequenzen unter Anlegung eines Maßes der Homologie, das verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen zugeordnet wird. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Bei einem Polypeptid-„Fragment”, -„Abschnitt” oder -„Segment” handelt es sich um eine Strecke von Aminosäure-Resten von mindestens etwa fünf bis sieben benachbarten Aminosäuren, oftmals von mindestens etwa sieben bis neun benachbarten Aminosäuren, typischerweise mindestens etwa neun bis 13 benachbarten Aminosäuren, und am bevorzugtesten mindestens etwa 20 bis 30 oder mehr benachbarten Aminosäuren.
Die Polypeptide können, sofern löslich, an einen Festphasen-Träger gekoppelt werden, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Säulen-Füllstoffen (z. B. Sepharose-Kügelchen), Magnetkügelchen, Glaswolle, Kunststoff, Metall, Polymergele, Zellen oder andere Substrate. Solche Träger können z. B. die Form von Kügelchen, Wells, Röhrchen oder Membranen aufweisen.
„Zielregion” bezieht sich auf eine Region der Nukleinsäure, die amplifiziert und/oder nachgewiesen wird. Der Begriff „Zielsequenz” bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer unter erwünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bilden wird.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wendet, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Methoden der Chemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, Genetik und Immunologie an. Siehe z. B. Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie & Fink, 1991. Eine allgemeine Erörterung der Methoden und Materialien für die Humangen-Kartierung, einschließlich der Kartierung des Humanchromosoms 17q, ist zu finden z. B. bei White and Lalouel, 1988.
Herstellung rekombinanter oder chemisch synthetisierter Nukleinsäuren; Vektoren, Transformation, Wirtszellen
Große Menge der Sonden der vorliegenden Erfindung können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt werden. Natürliche oder synthetische Polynukleotid-Fragmente werden in rekombinante Polynukleotid-Konstrukte, gewöhnlich DNA-Konstrukte, die zur Einführung und Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle fähig sind, eingebaut. Gewöhnlich eignen sich die Polynukleotid-Konstrukte zur Replikation in einem einzelligen Wirt, wie etwa Hefe oder Bakterien, doch können auch zur Einführung (mit oder ohne Integration in das Genom) in kultivierte Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryontische Zelllinien vorgesehen sein. Die Reinigung der mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugten Nukleinsäuren ist beschrieben z. B. bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung können auch mittels chemischer Synthese hergestellt werden, z. B. durch die Phosporamidit-Methode, wie beschrieben bei Beaucage & Carruthers, 1981, oder die Triester-Methode nach Matteucci und Caruthers, 1981, und kann auf handelsüblichen automatisierten Oligonukleotid-Synthesegeräten durchgeführt werden. Ein doppelsträngiges Fragment kann aus dem einzelsträngigen Produkt der chemischen Synthese entweder durch Synthetisieren des komplementären Strangs und Vereinigen der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Zugabe des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten werden.
Die zur Einführung in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt präparierten Polynukleotid-Konstrukte können ein durch den Wirt erkanntes Replikationssystem umfassen, einschließlich des angestrebten, für das gewünschte Polypeptid kodierenden Polynukleotid-Fragments, welches vorzugsweise auch regulatorische Sequenzen für den Transkriptions- und Translationsstart enthalten wird, die funktionsfähig an das Polypeptid-kodierende Segment geknüpft sind. Expressionsvektoren können z. B. einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) und Expressions-Kontrollsequenzen, einen Promotor, einen Enhancer und die erforderlichen Processing-Informationsstellen, wie z. B. Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, Transkriptions-Beendigungssequenzen und mRNA-stabilisierende Sequenzen umfassen. Auch Sekretions-Signale können, wo geeignet, enthalten sein, und zwar sowohl von einem nativen BRCA1-Protein als auch von anderen Rezeptoren oder von sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies, die es dem Protein ermöglichen, Zellmembranen zu durchqueren und/oder darin deponiert zu werden, und so seine funktionelle Topologie zu erreichen, oder aber um aus der Zelle ausgeschieden zu werden. Solche Vektoren können mittels standardmäßiger rekombinanter Methoden hergestellt werden, wie im Fachbereich wohlbekannt und erörtert z. B. bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992.
Ein geeigneter Promotor und weitere erforderliche Vektor-Sequenzen werden so ausgewählt, dass sie im Wirt funktionell sind, und können, wenn geeignet, solche umfassen, die natürlicherweise mit BRCA1-Genen verbunden sind. Beispiele zweckdienlicher Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind beschrieben bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992; siehe auch z. B. Metzger et al., 1988. Im Fachbereich sind viele nützliche Vektoren bekannt, die im Handel bezogen werden können z. B. von Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech und anderen. Promotoren, wie die trp-, lac- und Phagen-Promotoren, tRNA-Promotoren und glycolytischen Enzym-Promotoren können bei prokaryontischen Wirten verwendet werden. Zu nützlichen Hefe-Promotoren zählen Promotor-Regionen für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme, wie z. B. Enolase oder Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortliche Enzyme und weitere. Zur Verwendung in der Hefe-Expression geeignete Vektoren und Promotoren sind weiterhin beschrieben bei Hitzemann et al., EP-Schrift Nr. 73.675 A. Geeignete nicht-native Säuger-Promotoren können die frühen und späten Promotoren von SV40 (Fiers et al., 1978) oder Promotoren, die vom murinen Moloney-Leukämievirus, Mäusetumorvirus, Vogelsarkomviren, Adenovirus II, Rinder-Papillomavirus oder Polyomavirus hergeleitet sind, umfassen. Außerdem kann das Konstrukt an ein amplifizierbares Gen (z. B. DHFR) gebunden werden, so dass multiple Kopien des Gens herstellbar sind. Für geeignete Enhancer und andere Expressions-Kontrollsequenzen siehe auch Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).
Solche Expressionsvektoren können sich zwar autonom replizieren, können aber auch durch Einführung in das Genom der Wirtszelle mittels im Fachbereich wohlbekannter Methoden repliziert werden.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten geeigneterweise einen selektierbaren Marker, d. h. ein für ein Protein kodierendes Gen, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Das Vorhandensein dieses Gens stellt das Wachstum lediglich jener Wirtszellen sicher, die die Inserte exprimieren. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen toxischen Substanzen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat etc. verleihen; b) auxotrophe Defizite ergänzen oder c) entscheidende Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien, z. B. das für D-Alanin-Racemase von Bacilli kodierende Gen nicht verfügbar sind. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers hängt von der Wirtszelle ab, wobei geeignete Marker für verschiedene Wirte im Fachbereich wohlbekannt sind.
Die die Nukleinsäuren von Interesse enthaltenden Vektoren können in vitro transkribiert und die resultierende RNA in die Wirtszelle mittels wohlbekannter Methoden eingeführt werden, z. B. durch Injektion (siehe Kubo et al., 1988); alternativ können die Vektoren mittels im Fachbereich wohlbekannter Methoden in Abhängigkeit von der Art des zellulären Wirts, einschließlich der Elektroporation; der Transfektion unter Verwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEA-Dextran oder anderen Substanzen; dem Mikroprojektil-Beschuss; der Lipofektion; der Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Agens ist, wie etwa ein retrovirales Genom), und weiteren Methoden, eingebracht werden. Siehe allgemein Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1992. Die Einführung der Polynukleotide in die Wirtszelle mittels einer im Fachbereich bekannten Methode, einschließlich unter anderem der oben beschriebenen, wird hierin als „Transformation” bezeichnet. Bei den Zellen, in die die oben beschriebenen Nukleinsäuren eingeführt wurden, soll auch die Nachkommenschaft dieser Zellen umfasst sein.
Große Mengen der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind präparierbar, indem die BRCA1-Nukleinsäure-Abschnitte in Vektoren oder anderen Expressions-Trägern in kompatiblen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Bei den am häufigsten verwendeten prokaryontischen Wirten handelt es sich um Stämme von Escherichia coli, obschon auch andere Prokaryonten wie Bacillus subtilis oder Pseudomonas verwendet werden können.
Die Klone werden unter Verwendung von Markern ausgewählt, die von der Art der Vektorkonstruktion abhängen. Die Marker können auf demselben oder einem unterschiedlichen DNA-Molekül, vorzugsweise aber auf demselben DNA-Molekül, vorhanden sein. Bei prokaryontischen Wirten kann der Transformant z. B. mittels Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder anderen Antibiotika, ausgewählt werden. Die Herstellung eines bestimmten Produkts auf der Grundlage der Temperaturempfindlichkeit kann ebenfalls als ein geeigneter Marker dienen.
Mit den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformierte prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind nicht nur zur Herstellung der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung nützlich, sondern auch z. B. zur Untersuchung der Eigenschaften der BRCA1-Polypeptide.
Antisense-Polynukleotid-Sequenzen sind zur Verhinderung oder Verminderung der Expression des BRCA1-Locus nützlich, wie für Fachleute des Bereichs erkennbar sein wird. Z. B. können Polynukleotid-Vektoren, die den gesamten oder einen Teil des BRCA1-Locus oder andere Sequenzen aus der BRCA1-Region enthalten (besonders jene, die den BRCA1-Locus flankieren), unter die Kontrolle eines Promotors in einer Antisense-Orientierung platziert und in eine Zelle eingeführt werden. Die Expression solch eines Antisense-Konstrukts innerhalb einer Zelle beeinflusst die BRCA1-Transkription und/oder -Translation und/oder -Replikation.
Die Sonden und Primer, die auf den hierin beschriebenen BRCA1-Gensequenzen basieren, werden zur Identifizierung homologer BRCA1-Gensequenzen und -Proteine in anderen Spezies verwendet. Diese hierin beschriebenen BRCA1-Gensequenzen und -Proteine werden bei den hierin beschriebenen diagnostischen/prognostischen, therapeutischen und Wirkstoff-Screening-Methoden für die Spezies, aus der sie isoliert wurden, verwendet.
Anwendungsmethoden: Nukleinsäure-Diagnose und diagnostische Kits
Um das Vorhandensein eines BRCA1-Allels nachzuweisen, das ein Individuum für Krebs prädisponiert, wird eine biologische Probe, z. B. Blut, präpariert und auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Anfälligkeits-Allele von BRCA1 analysiert. Um das Vorhandensein einer Neoplasie und die Weiterentwicklung einer Läsions-Vorstufe zur Malignität nachzuweisen oder als ein prognostischer Indikator wird eine biologische Probe der Läsion präpariert und auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit mutanter Allele von BRCA1 hin analysiert. Die Ergebnisse dieser Tests und interpretative Informationen werden dem Gesundheitsvorsorge leistenden Arzt zur Mitteilung an die getestete Person rückgemeldet. Diese Diagnosen können durch diagnostische Laboratorien vorgenommen werden, oder alternativ dazu können diagnostische Kits hergestellt und an die Gesundheitsvorsorge leistenden Stellen oder an Privatpersonen für die Selbstdiagnose vertrieben werden.
Am Anfang steht bei der Screening-Methode die Amplifikation der relevanten BRCA1-Sequenzen. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Screening-Methode eine nicht auf der PCR basierende Strategie. Derartige Screening-Methoden wenden eine zweistufige Markierungs-Amplifikations-Methode an, die im Fachbereich wohlbekannt ist. Sowohl auf PCR als auch nicht auf PCR basierende Screening-Strategien sind in der Lage, Zielsequenzen bei einem hohen Grad der Empfindlichkeit nachzuweisen.
Die verbreitetste der heutzutage angewandten Methoden ist die Ziel-Amplifikation. Hierbei wird die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz mit Polymerasen amplifiziert. Eine besonders bevorzugte Methode unter Verwendung der Polymerase-angetriebenen Amplifikation ist die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR). Die Polymerase-Kettenreaktion und andere Polymerase-angetriebene Amplifikations-Assays können eine über eine millionfache Vermehrung der Kopienzahl durch Ausnutzung der Polymerase-angeregten Amplifikations-Zyklen erreichen. Einmal amplifiziert, kann die resultierende Nukleinsäure sequenziert oder als ein Substrat für DNA-Sonden verwendet werden.
Werden die Sonden zum Nachweis des Vorhandenseins der Zielsequenzen verwendet, (z. B. beim Screening auf Krebs-Anfälligkeit), so kann die zu analysierende biologische Probe, z. B. Blut oder Serum, zur Extrahierung der Nukleinsäuren behandelt werden, wenn erwünscht. Die Nukleinsäure der Probe kann auf unterschiedliche Weise zur Vereinfachung des Nachweises der Zielsequenz präpariert werden; z. B. durch Denaturierung, Restriktionsverdau, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die angezielte Region der Nukleinsäure des Analyts muss gewöhnlich zumindest teilweise einzelsträngig sein, um Hybride mit der Zielsequenz der Sonde bilden zu können. Ist die Sequenz von Natur aus einzelsträngig, so ist keine Denaturierung erforderlich. Ist die Sequenz jedoch doppelsträngig, so macht die Sequenz möglicherweise eine Denaturierung erforderlich. Die Denaturierung kann mittels verschiedener, im Fachbereich bekannter Methoden vorgenommen werden.
Die Nukleinsäure des Analyts und die Sonde werden unter Bedingungen inkubiert, die die Bildung eines stabilen Hybrids aus der Zielsequenz in der Sonde mit der vermuteten angezielten Sequenz im Analyt fördert. Die Region der Sonden, die zur Bindung an das Analyt dienen soll, kann vollkommen komplementär zur angezielten Region des Humanchromosoms 17q gemacht werden. Daher sind hochstringente Bedingungen erwünscht, um falsch-positive Bindungen zu vermeiden. Allerdings werden Bedingungen von hoher Stringenz lediglich dann angelegt, wenn die Sonden komplementär zu Regionen des Chromosoms sind, die im Genom einzigartig sind. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschvorgangs bestimmt, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Basen-Zusammensetzung, der Sondenlänge und der Konzentration an Formamid. Diese Faktoren sind z. B. bei Maniatis et al., 1982, und Sambrook et al., 1989, in groben Zügen dargestellt. Unter bestimmten Umständen kann die Bildung von Hybriden einer höheren Ordnung, z. B. Triplexen, Quadruplexen etc. zur Bereitstellung der Mittel zum Nachweis der Zielsequenzen erwünscht sein.
Die Detektion des resultierenden Hybrids, sofern vorhanden, wird gewöhnlich durch die Verwendung markierter Sonden erreicht. Alternativ dazu kann die Sonde unmarkiert sein, kann jedoch durch spezifische Bindung mit einem Liganden, der entweder direkt oder indirekt markiert ist, nachweisbar sein. Bekannte Marker und Methoden zur Markierung von Sonden und Liganden sind im Fachbereich bekannt und umfassen z. B. radioaktive Marker, die mittels bekannter Methoden eingebaut werden können (z. B. Nick-Translation, Zufallspriming oder Kinasieren), Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z. B. Dioxetane, speziell getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper und Ähnliches. Variationen dieses Grundschemas sind im Fachbereich bekannt und umfassen jene Abwandlungen, die die Abtrennung der nachzuweisenden Hybride von Fremdstoffen erleichtern und/oder die das Signal aus der markierten Komponente amplifizieren. Eine Übersicht über eine Reihe dieser Variationen ist wiedergegeben z. B. bei Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mittlin, 1989; US-Patentschrift Nr. 4,868,105 und in der EPO-Veröffentlichung Nr. 225.807 .
Wie oben angemerkt, werden auch nicht auf PCR basierende Screening-Assays bei dieser Erfindung in Betracht gezogen. Eine veranschaulichende Darstellung einer nicht auf PCR basierenden Verfahrensweise ist in Beispiel 11 wiedergegeben. Bei diesem Verfahren wird eine Nukleinsäure-Sonde (oder ein Analogon, wie z. B. ein Methylphosphonat-Rückgrat als Ersatz für den normalen Phosphordiester) an ein geringfügig vorhandenes DNA-Ziel hybridisiert. Diese Sonde kann ein kovalent an die Sonde geknüpftes Enzym aufweisen, so dass die kovalente Bindung die Spezifität der Hybridisierung nicht beeinflusst. Dieser Enzym-Sonde-Konjugat-Ziel-Nukleinsäure-Komplex kann dann aus dem freien Sonde-Enzym-Konjugat wegisoliert und ein Substrat zum Enzymnachweis zugefügt werden. Die enzymatische Aktivität wird als eine Veränderung bei der Farbentwicklung oder der Lumineszenz-Abgabe beobachtet, was zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit von 10³–10⁶ führt. Für ein Beispiel bezüglich der Präparation von Oligodesoxynukleotid-alkalische Phosphatase-Konjugaten und deren Verwendung als Hybridisierungs-Sonden siehe Jablonski et al., 1986.
Im Fachbereich sind zweistufige Markierungs-Amplifikations-Methoden bekannt. Diese Assays gehen von dem Prinzip aus, dass ein kleiner Ligand (wie z. B. Digoxigenin, Biotin oder Ähnliches) an eine Nukleinsäure-Sonde gebunden wird, die zur spezifischen Bindung von BRCA1 fähig ist. In Tabelle 9 dieser Patentanmeldung sind Beispiele der Sonden wiedergegeben, die außerdem die Nukleinsäure-Sonde entsprechend der Nukleotid-Positionen 3631 bis 3930 der SEQ ID NO: 1 umfassen. Auch Allel-spezifische Sonden werden als im Rahmen dieser Beispiele befindlich erachtet, wobei zu den Beispielen der Allel-spezifischen Sonden solche zählen, die die in Tabellen 11 und 12 dieser Patentanmeldung zusammengefassten prädisponierenden Mutationen umfassen.
Bei einem Beispiel wird der an die Nukleinsäure-Sonde gebundene kleine Ligand spezifisch durch ein Antikörper-Enzym-Konjugat erkannt. Bei einer Ausführungsform dieses Beispiels ist Digoxigenin an die Nukleinsäure-Sonde gebunden. Die Hybridisierung wird mittels eines Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugats nachgewiesen, welches ein chemilumineszierendes Substrat umsetzt. Methoden zur Markierung von Nukleinsäure-Sonden gemäß dieser Ausführungsform siehe Martin et al., 1990. Bei einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand durch ein zweites Ligand-Enzym-Konjugat erkannt, das zur spezifischen Komplexbildung mit dem ersten Liganden fähig ist. Eine wohlbekannte Ausführung dieses Beispiels involviert die Biotin-Avidin-artigen Wechselwirkungen. Methoden zur Markierung von Nukleinsäure-Sonden und ihre Verwendung in auf Biotin-Avidin basierenden Assays siehe Rigby et al., 1977, und Nguyen et al., 1992.
Es wird auch als im Rahmen dieser Erfindung befindlich erachtet, dass die Nukleinsäure-Sonde dieser Erfindung in einem Cocktail von Nukleinsäuresonden verwendet wird, die zum Nachweis von BRCA1 fähig sind. Daher wird bei einem Beispiel zum Nachweis des Vorhandenseins von BRCA1 in einer Zellprobe mehr als eine, zu BRCA1 komplementäre Sonde verwendet; insbesondere beträgt die Zahl der verschiedenen Sonden alternativ 2, 3 oder 5 unterschiedliche Nukleinsäure-Sonden-Sequenzen. Bei einem anderen Beispiel wird zum Nachweis des Vorhandensein von Mutationen in der BRCA1-Gensequenz eines Patienten mehr als eine zu BRCA1 komplementäre Sonde verwendet, wobei der Cocktail Sonden umfasst, die zur Bindung an die Allel-spezifischen Mutationen fähig sind, die in Patienten-Populationen mit Veränderungen bei BRCA1 identifiziert wurden. Bei dieser Ausführungsform kann eine beliebige Zahl von Sonden verwendet werden, wobei vorzugsweise Sonden entsprechend den wichtigsten Genmutationen umfasst sind, die als ein Individuum für Brustkrebs prädisponierend identifiziert wurden. Zu einigen Kandidat-Sonden, die als in den Rahmen der vorliegenden Offenbarung fallend betrachtet werden, zählen Sonden, die die in Tabelle 11 und 12 identifizierten Allel-spezifischen Mutationen sowie jene umfassen, die die BRCA1-Regionen entsprechend der SEQ ID NO: 1 sowohl 5' als auch 3' zur Mutationsstelle aufweisen.
Die Offenbarung wird von den folgenden Beispielen gestützt. Es wurden die im Fachbereich wohlbekannten standardmäßigen Methoden oder die nachfolgend spezifisch beschriebenen Methoden angewandt.
BEISPIEL 1
Ermittlung und Untersuchung von Stämmen, die voraussichtlich einen 17g-gekoppelten Anfälligkeits-Locus für Brustkrebs aufweisen
Ausgedehnte, zu Krebs neigende Familienstämme wurden aus einer definierten Population ermittelt, wodurch eine große Gruppe ausgedehnter Stämme mit multiplen Fällen von Brustkrebs und vielen, zur Untersuchung zur Verfügung stehenden Verwandten erhalten wurde. Die große Zahl der bei diesen umfangreichen Stämmen vorliegenden Meiosen bot die Möglichkeit nachzuweisen, ob der BRCA1-Locus sich aufspaltete, und erhöhten die Wahrscheinlichkeit des Auftretens informativer Rekombinanter innerhalb der untersuchten kleinen Region. Dies steigerte die Chancen enorm, eine Verknüpfung zur BRCA1-Region herzustellen, und erleichterte die Verminderung der BRCA1-Region auf eine handhabbare Größe, die die Identifikation des BRCA1-Locus selbst erlaubt, in starkem Maße.
Jeder Stamm wurde durch alle verfügbaren Verwandtschafts-Bindeglieder ausgedehnt und um alle informativen Verwandten ersten Grades jedes Probanden oder Krebsfalles erweitert. Bei diesen Familienstämmen wurden weitere Fälle von Brustkrebs und Individuen mit Krebs an anderen Stellen von Interesse (z. B. Eierstöcke), die ebenfalls in den Stämmen auftraten, durch die Tumorregistrierungssakten identifiziert. Alle im Familienstamm berichteten Fälle von Brustkrebs, die nicht im Krebsregister von Utah bestätigt waren, wurden untersucht. Die medizinischen Berichte oder Totenscheine wurden zur Bestätigung aller Krebsfälle angefordert. Alle Schlüsselpersonen und alle informativen Individuen wurden zur Teilnahme durch Bereitstellung einer Blutprobe, aus der DNA extrahiert wurde, eingeladen. Ebenfalls wurden Proben der Ehegatten und Verwandten der Todesfälle genommen, so dass auf den Genotyp der Todesfälle von den Genotypen ihrer Verwandten geschlossen werden konnte.
Zehn Familienstämme, bei denen drei oder mehr Krebsfälle mit ableitbaren Genotypen vorlagen, wurden für Studien der Koppelung an 17q-Marker aus einer Gruppe von 29 Stämmen ausgewählt, die ursprünglich aus den verbundenen Datenbanken für eine Studie von proliferativen Mastopathien und Brustkrebs ermittelt worden waren (Skolnick et al., 1990). Das Kriterium für die Auswahl dieser Stämme bestand im Vorhandensein zweier Schwestern oder einer Mutter und ihrer Tochter mit Brustkrebs. Außerdem wurden zwei Familienstämme, die seit 1980 als Teil unserer Brustkrebs-Kopplungsstudien (K1001, K9018) untersucht worden waren, sechs Familienstämme, die aus den verbundenen Datenbanken für das Vorhandensein von Anhäufungen von Brust- und/oder Eierstockkrebs ermittelt wurden (K2019, K2073, K2079, K2080, K2039, K2082) und ein selbst zugewiesener Familienstamm mit Brustkrebs im Frühstadium (K2035) aufgenommen. Diese Familienstämme wurden untersucht und in unserer Klinik in oben beschriebener Weise ausgedehnt. In Tabelle 1 sind die Charakteristika dieser 19 Stämme gezeigt, die die Objekte der anschließenden Beispiele sind. In Tabelle 1 ist für jeden Familienstamm die Gesamtzahl der Individuen in unserer Datenbank gezeigt, die Zahl der typisierten Individuen und das minimale, mittlere und maximale Alter bei Diagnose von Brust/Eierstockkrebs. Die Familienstämme sind in aufsteigender Ordnung des mittleren Alters bei Diagnose des Brustkrebses sortiert. Vier sowohl mit Eierstock- als auch Brustkrebs diagnostizierte Frauen sind in beiden Kategorien aufgeführt.
BEISPIEL 2
Auswahl der mit Chromosom 17q verknüpften Familienstämme und Lokalisation des BRCA1 auf dem Intervall Mfd15–Mfd188
Aus jeder bei diesen 19 Familienstämmen entnommenen Probe wurde die DNA unter Anwendung standardmäßiger Laborprotokolle aus Blut extrahiert (oder in zwei Fällen aus in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken). Die Genotypisierung in dieser Studie war auf kurze Tandem-Repeat-(STR)-Marker beschränkt, da sie im Allgemeinen eine hohe Heterozygotie aufweisen und die PCR-Methoden einen schnellen Umsatz bei Verwendung sehr geringer Mengen an DNA bieten. Zur Unterstützung dieser Bemühungen wurden vier solcher STR-Marker auf Chromosom 17 durch Screening einer Chromosom-spezifischen Cosmidbank für CA-positive Klone entwickelt. Drei dieser Marker lokalisierten sich am langen Arm: (46E6, Esston et al., 1993); (42D6, Esston et al., 1993); 26C2 (D17S514, Oliphant et al., 1991), während sich der andere, 12G6 (D17S513, Oliphant et al., 1991) am kurzen Arm nahe des p53-Tumor-Suppressor-Locus lokalisierte. Zwei davon, 42D6 und 46E6, wurden dem Breast Cancer Linkage Consortium zur Typisierung der Brustkrebs-Familien durch weltweite Untersuchungen vorgelegt. Oligonukleotid-Sequenzen für Marker, die nicht in unserem Labor entwickelt worden waren, wurden aus veröffentlichten Berichten oder als Teil des Breast Cancer Linkage Consortium oder von anderen Forschern erhalten. Alle genotypisierten Filme wurden mit einem standardmäßigen Bahnmarker, der zur Aufrechterhaltung einer konsequenten Kodierung der Allele diente, blind ausgewertet. Schlüsselproben der vier hierin vorgestellten Familienstämme wurden einer doppelten Typisierung für alle relevanten Marker unterzogen. Alle 19 Stämme wurden für zwei polymorphe CA-Repeat-Marker typisiert: 42D6 (D17S588), ein in unserem Labor isolierter CA-Repeat, und Mfd15 (D17S250), ein von J. Weber (Weber et al., 1990) verfügbar gemachter CA-Repeat. Es wurden verschiedene Quellen von Sonden verwendet, um genetische Marker auf Chromosom 17 zu schaffen, spezifisch Chromosom-17-Cosmid und Lambda-Phagen-Banken, die aus geordneten Chromosomen durch die Los Alamos National Laboratories (van Dills et al., 1986) angelegt wurden.
Die LOD-Scores für jeden Familienstamm mit diesen beiden Markern (42D6, Mfd15) und einem dritten Marker, Mfd188 (D17S579, Hall et al., 1992), der etwa auf halbem Weg zwischen diesen beiden Markern lokalisiert ist, wurden für zwei Werte der Rekombinationsfraktion, 0,001 und 0,1 berechnet. (Zur Berechnung der LOD-Scores siehe Oh, 1985). Die Wahrscheinlichkeiten wurden mit dem von Claus et al., 1991, abgeleiteten Modell berechnet, das eine geschätzte Genhäufigkeit von 0,003, ein lebenslanges Risiko bei Genträgern von etwa 0,80 und populationsbezogene, altersspezifische Risiken von Brustkrebs bei Nicht-Genträgern zugrundelegt. Die Allelhäufigkeiten für die drei für LOD-Score-Berechnungen verwendeten Marker wurden aus unseren eigenen Labor-Typisierungen nicht-verwandter Individuen im CEPH-Panel berechnet (White und Lalouel, 1988). In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der paarweisen Kopplungsanalyse jedes Familienstammes mit den drei Markern 42D6, Mfd188 und Mfd15 gezeigt.
Unter Anwendung eines Kriteriums für die Kopplung mit 17q von einem LCD-Score > 1,0 für mindestens einen Locus unter dem CASH-Modell (Claus et al., 1991) schienen vier der 19 Familienstämme mit 17q verknüpft zu sein (K1901, K1925, K2035, K2082). Eine Reihe weiterer Familienstämme zeigte gewisse Hinweise auf eine Verknüpfung, konnten aber zu diesem Zeitpunkt nicht definitiv der Kopplungskategorie zugeordnet werden. Zu diesen zählten Familienstämme K1911, K2073, K2039 und K2080. Drei der 17q-gekoppelten Familienstämme wiesen informative Rekombinanten in dieser Region auf, wobei diese nachfolgend ausführlich beschrieben sind.
Bei Stamm 2082 handelt es sich um die größte, bisher von irgendeiner Gruppe berichtete 17q-verknüpfte Brustkrebsfamilie. Der Stamm umfasst 20 Fälle von Brustkrebs und 10 Fälle von Eierstockkrebs. Zwei Fälle weisen sowohl Eierstock- als auch Brustkrebs auf. Der Beweis einer Kopplung mit 17q ist bei dieser Familie überwältigend; der LCD-Score mit dem gekoppelten Haplotyp beträgt über 6,0, trotz der Existenz dreier Fälle von Brustkrebs, die sporadisch zu sein scheinen, d. h. diese Fälle teilen sich den gekoppelten Haplotyp zu keinem Teil zwischen Mfd15 und 42D6 auf. Diese drei sporadischen Fälle wurden mit Brustkrebs im Alter von 46, 47 und 54 Jahren diagnostiziert. Bei kleineren Stämmen verwirrt das sporadische Auftreten von Krebs dieser Art die Kopplungsanalyse und die korrekte Identifikation der Schlüssel-Rekombinanten hochgradig. Die Schlüssel-Rekombinante in Stamm 2082 ist eine Frau, die im Alter von 45 Jahren Eierstockkrebs ausbildete und deren Mutter und Tante im Alter von 58 bzw. 66 Jahren Eierstockkrebs hatten. Sie erbte den gekoppelten Abschnitt des Haplotyps sowohl für Mfd188 als auch 42D6 und zugleich die ungekoppelten Allele bei Mfd15; dieses rekombinante Ereignis platzierte BRCA1 distal zu Mfd15.
K1901 ist ein typisches Beispiel eines Familienstamms mit früh auftretendem Brustkrebs. Der Stamm enthält zehn Fälle von Brustkrebs im mittleren Alter bei einer Diagnose mit 43,5 Jahren; vier Fälle wurden unter dem Alter 40 Jahre diagnostiziert. Der LOD-Score für diesen Stamm mit dem Marker 42D6 beträgt 1,5, was eine A-posteriori-Wahrscheinlichkeit der 17q-Kopplung von 0,96 ergibt. Die Untersuchung der Haplotypen in diesem Familienstamm identifizierte einen rekombinanten Haplotyp bei einem obligaten männlichen Träger und seiner betroffenen Tochter, bei der im Alter von 45 Jahren Brustkrebs diagnostiziert worden war. Ihr gekoppeltes Allel für Marker Mfd15 unterscheidet sich von dem in allen anderen Fällen im Familienstamm gefundenen Allel (außer einem Fall, der nicht gänzlich aus ihren Kindern gefolgert werden konnte). Die beiden Haplotypen sind für Mfd188 und 42D6 identisch. Demgemäß würden auch die Daten aus Stamm 1901 den BRCA1-Locus distal zu Mfd15 platzieren.
Stamm 2035 ist K1901 im Krankheits-Phänotyp ähnlich. Das mittlere Alter der Diagnose bei acht Fällen von Brustkrebs in diesem Stamm beträgt 37 Jahre. Ein Fall wies im Alter von 60 Jahren auch Eierstockkrebs auf. Die Fälle von Brustkrebs in dieser Familie stammten von zwei Schwestern ab, die beide bis zu ihrem Tod in der achten Dekade nicht von Brustkrebs betroffen waren. Jeder Zweig enthält vier Fälle von Brustkrebs, wobei dieser bei mindestens einem Fall in jedem Zweig deutlich früh ausbrach. Dieser Stamm weist einen LOD-Score von 2,34 bei Mfd15 auf. Die Haplotypen, die sich in den beiden Zweigen mit Brustkrebs aufspalten, teilen ein identisches Allel bei Mfd15, doch unterscheiden sich bei den distalen Loci Mfd188 und NM23 (ein vom Konsortium typisierter Marker, der direkt distal zu 42D6 lokalisiert ist (Hall et al., 1992)). Obschon die beiden Haplotypen für Marker 42D6 übereinstimmend sind, ist es wahrscheinlich, dass die Allele identisch durch Lage (dasselbe Allel, doch von unterschiedlichen Vorfahren stammend) und nicht identisch durch Abkunft (von einem gemeinsamen Vorfahr stammend) sind, da es sich bei dem geteilten Allel um das zweithäufigste, an diesem Locus beobachtete Allel handelt. Im Gegensatz dazu weist das verkoppelte, bei Mfd15 gemeinsame Allel eine Häufigkeit von 0,04 auf. Es handelt sich hierbei um eine Schlüssel-Rekombinante in unserer Datenbank, da es die einzige Rekombinante ist, bei der sich BRCA1 mit dem proximalen Abschnitt des Haplotyps aufspaltet und damit die distale Grenze für die BRCA1-Region setzt. Damit dieses Ereignis nicht eine Schlüssel-Rekombinante darstellt, ist es erforderlich, dass ein zweites mutantes BRCA1-Gen bei einem in die Familie eingeheirateten Ehepartner vorhanden ist, der ebenfalls das seltene Mfd15-Allel teilt, das sich in beiden Zweigen des Familienstamms mit Brustkrebs aufspaltet. Dieses Ereignis weist eine Wahrscheinlichkeit von weniger als eins zu tausend auf. Der Nachweis aus diesem Familienstamm platzierte daher den BRCA1-Locus proximal zu Mfd188.
BEISPIEL 3
Schaffung einer Feinstrukturkarte und Verfeinerung der BRCA1-Region auf Mfd191–Mfd188 unter Anwendung weiterer STR-Polvmorphismen
Um die Charakterisierung unserer Rekombinanten zu verbessern und enger flankierende Marker zu definieren, war eine verdichtete Karte dieser relativ kleinen Region auf Chromosom 17q erforderlich. Der Chromosom-17-Workshop hat eine Konsensus-Karte dieser Region (1) auf der Grundlage einer Kombination genetischer und physischer Kartierungsstudien entwickelt (Fein, 1992). Diese Karte enthält sowohl hochgradig polymorphe STR-Polymorphismen als auch eine Reihe nicht polymorph exprimierter Gene. Da diese Karte keine Einzelheiten bezüglich des Nachweises dieser Ordnung noch in irgendeinem Umfang eine lokale Belege für Inversionen in der Ordnung der benachbarten Loci angab, betrachteten wir sie als einen groben Leitfaden zum Erhalt von Ressourcen, die zur Entwicklung neuer Marker und zur Konstruktion unserer eigenen detaillierten genetischen und physischen Karte einer kleinen Region, umfassend BRCA1, verwendet werden konnten. Unser Ansatz bestand in der Analyse existierender STR-Marker, wie durch andere Forscher bereitgestellt, und jeglicher neu entwickelter Marker aus unserem Labor bezüglich sowohl eines Panels meiotischer (genetischer) Bruchstellen, wie unter Verwendung von DNA aus den CEPH-Bezugsfamilien identifiziert, als auch eines für diese Region konstruierten Panels somatischer Zellhybride (physische Bruchstelle). Diese Marker umfassten den in unserem Labor entwickelten 26C2, der proximal zu Mfd15, Mfd191 (bereitgestellt von James Weber) kartiert, THRA1 (Futreal et al., 1992a) und drei Polymorphismen, die uns freundlicherweise von Dr. Donald Bleck zur Verfügung gestellt wurden, nämlich NM23 (Hall et al., 1992), SCG40 (D17S181) und 6C1 (D17S293).
Genetische Lokalisation der Marker. Um neue Marker innerhalb der Region von Interesse genetisch zu lokalisieren, haben wir eine Reihe von meiotischen Schlüssel-Bruchstellen innerhalb der Region sowohl im CEPH-Bezugspanel als auch in unserem großen Brustkrebs-Familienstamm (K2082) identifiziert. Auf Grund des geringen genetischen Abstands in dieser Region handelt es sich wahrscheinlich um einen lediglich relativ kleinen Satz von Rekombinanten, der für diesen Zweck verwendet werden kann und durch die die Marker wahrscheinlich in Sätze gruppiert werden. Die Ordnungen der Marker innerhalb jedes Satzes können nur durch physische Kartierung bestimmt werden. Die Anzahl der Genotypisierungen allerdings, die zur Positionierung eines neuen Markers erforderlich ist, wird minimiert. Diese Bruchstellen sind in Tabellen 3 und 4 veranschaulicht. Unter Anwendung dieses Ansatzes waren wir in der Lage, die Marker THRA1, 6C1, SCG40 und Mfd191 genetisch zu ordnen. Wie aus Tabellen 3 und 4 ersichtlich, kartieren sowohl THRA1 als auch Mfd191 innerhalb der Mfd15–Mfd188-Region, die wir zuvor als den BRCA1-Locus enthaltend identifiziert hatten. In Tabellen 3 und 4 steht M/V für eine mütterliche oder väterliche Rekombinante. Ein „1” steht dafür, dass das ererbte Allel großväterlichen Ursprungs ist, während eine „0” für einen großmütterlichen Ursprung steht, und „–” steht dafür, dass der Locus untypisiert oder uninformativ war.
Analyse der Marker Mfd15, Mfd188, Mfd191 und THRA1 in unseren rekombinanten Familien. Mfd15, Mfd188, Mfd191 und THRA1 wurden in unseren rekombinanten Familien typisiert und auf zusätzliche Information zur Lokalisation des BRCA1-Locus untersucht. Bei Stamm 1901 war die Mfd15-Rekombinante für THRA1 rekombinant, doch für Mfd191 uninformativ, was BRCA1 distal zu THRA1 platzierte. In K2082 war die Rekombinante mit Mfd15 auch mit Mfd191 rekombinant, was den BRCA1-Locus distal zu Mfd191 platzierte (Goldgar et et., 1994). Die Untersuchung von THRA1 und Mfd191 bei Stamm K2035 ergab keine weitere Lokalisations-Information, da die beiden Zweige für beide Marker übereinstimmend waren. Allerdings zeigten SCG40 und 6C1 beide dasselbe Muster wie Mfd188, was unser Vertrauen in die Lokalisations-Information durch die Mfd188-Rekombinante in dieser Familie bestärkte. Der BRCA1-Locus, oder zumindest ein Teil davon, liegt daher innerhalb eines durch Mfd191 an der proximalen Seite und Mfd188 an der distalen Seite begrenzten Intervalls.
BEISPIEL 4
Entwicklung der genetischen und physischen Ressourcen in der Region von Interesse
Um die Zahl der hochgradig polymorphen Loci in der Mfd191–Mfd188-Region zu erhöhen, entwickelten wir in unserem Labor eine Reihe von STR-Markern aus Cosmiden und YACs, die die Region physisch kartieren. Diese Marker ermöglichten uns eine weitere Verfeinerung der Region.
Die STS wurden von Genen identifiziert, die als in der gewünschten Region befindlich bekannt waren, um YACs zu identifizieren, die diese Loci enthielten, welche dann wiederum zur Identifizierung von Subklonen in Cosmiden, P1 oder BAC verwendet wurden. Diese Subklone wurden dann auf das Vorhandensein eines CA-Tandem-Repeats unter Verwendung eines (CA)_n-Oligonukleotids (Pharmacia) gescreent. Die Klone mit einem starken Signal wurden bevorzugt ausgewählt, da sie mit größerer Wahrscheinlichkeit die CA-Repeats repräsentierten, die eine größere Anzahl an Repeats aufweisen und/oder dem (CA)_n-Muster in nahezu perfekter Weise getreu sind. Von beiden dieser Eigenschaften ist bekannt, dass sie die Wahrscheinlichkeit von Polymorphismus erhöhen (Weber, 1990). Diese Klone wurden direkt aus dem Vektor sequenziert, um den Repeat zu lokalisieren. Wir erhielten eine einzigartige Sequenz auf einer Seite des CA-Repeats, indem wir einen aus einem Satz möglicher Primer verwendeten, der komplementär zum Ende eines CA-Repeats war, wie etwa (GT)₁₀T. Basierend auf dieser einzigartigen Sequenz wurde ein Primer zur Rücksequenzierung über den Repeat hinweg in die andere Richtung hergestellt, was eine einzigartige Sequenz zum Design eines zweiten, den CA-Repeat flankierenden Primers ergab. Dann wurden die STRs auf Polymorphismus an einer kleinen Gruppe nicht-verwandter Individuen gescreent und gegen das Hybridpanel getestet, um deren physische Lokalisation zu bestätigen. Neue Marker, die diese Kriterien erfüllten, wurden dann in einer Gruppe von 40 nicht miteinander verwandten Individuen aus den Utah- und CEPH-Familien typisiert, um für die Studienpopulation geeignete Allel-Häufigkeiten zu erhalten. Viele der anderen, in dieser Studie berichteten Marker wurden in einer kleinen Gruppe von nicht verwandten CEPH-Personen getestet, um ähnlich geeignete Allel-Häufigkeiten zu erhalten.
Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahrensweise wurden insgesamt acht polymorphe STRs von diesen YACs gefunden. Von den in dieser Weise identifizierten Loci waren vier sowohl polymorph als auch in der BRCA1-Region lokalisiert. Vier Marker lokalisierten nicht auf Chromosom 17, was die chimäre Natur der verwendeten YACs wiederspiegelte. Die vier Marker, die in der Region lagen, wurden mit AA1, ED2, 4-7 und YM29 benannt. AA1 und ED2 wurden aus für das RNU2-Gen positiven YACs entwickelt, 4-7 aus einem EPB3-YAC und YM29 aus einem Cosmid, das sich mittels des Hybridpanels in der Region lokalisierte. Eine Beschreibung der Anzahl der Allele, der Heterozygotie und der Quelle dieser vier und aller anderen STR-Polymorphismen, wie bei den Familienstämmen mit Brustkrebs analysiert, ist nachstehend in Tabelle 5 wiedergegeben.
Die vier STR-Polymorphismen, die physisch zur Region (4-7, ED2, AA1, YM29) kartierten, wurden im meiotischen Bruchstellen-Panel analysiert, das ursprünglich in Tabellen 3 und 4 gezeigt ist. Tabellen 6 und 7 enthalten die relevanten CEPH-Daten und Stamm-2082-Daten für die Lokalisation dieser vier Marker. In den Tabellen gibt M/V eine mütterliche oder väterliche Rekombinante an. Eine „1” gibt an, dass das ererbte Allel großväterlichen Ursprungs ist, während eine „0” für einen großmütterlichen Ursprung steht und „–” anzeigt, dass der Locus untypisiert oder uninformiert war.
Aus CEPH 1333-04 ist zu erkennen, dass AA1 und YM29 distal zu Mfd191 liegen müssen. Aus 13292 ist folgerbar, dass sowohl AA1 als auch ED2 proximal zu 4-7, YM29 und Mfd188 liegen. Die bei K2082 gefundenen Rekombinanten bieten einige zusätzliche Anordnungs-Information. Drei unabhängige Beobachtungen (individuelle Zahlen 22, 40 & 63) platzieren AA1, ED2, 4-7, YM29 und Mfd188 distal zu Mfd191; ID 125 hingegen platziert 4-7, YM29 und Mfd188 proximal zu SCG40. Keine genetische Information zur relativen Ordnung innerhalb der beiden Cluster der Marker AA1/ED2 und 4-7/YM29/Mfd188 wurde aus der genetischen Rekombinationsanalyse erhalten. Obschon eine Anordnung der Loci bezüglich Hybriden, die dafür bekannt sind, dass sie „Löcher” enthalten, in denen kleine Stücke von interstitieller humaner DNA fehlen können, problematisch ist, weist das Hybridmuster darauf hin, dass 4-7 oberhalb sowohl YM29 als auch Mfd188 liegt.
BEISPIEL 5
Genetische Analysen der Brustkrebs-Stämme mit Markern AA1, 4-7, ED2 und YM29
Zusätzlich zu den drei die Schlüssel-Rekombinanten enthaltenden Stämmen, die bereits zuvor erörtert worden sind, wurde von Stamm K2039 durch Analyse der neu entwickelten STR-Marker gezeigt, dass er an die Region gekoppelt ist und eine nützliche Rekombinante enthält.
In Tabelle 8 sind die Haplotypen (gezeigt in kodierter Form) der Stämme bezüglich spezifischer Marker-Allele an jedem Locus und ihre jeweiligen Häufigkeiten definiert. In Tabelle 8 sind die Allele in abnehmender Ordnung der Häufigkeit aufgelistet; die Häufigkeiten der Allele 1–5 für jeden Locus sind in Tabelle 5 angegeben. Die mit H kodierten Haplotypen sind BRCA1-assoziierte Haplotypen, P bezeichnet einen Teil-H-Haplotyp und ein R gibt einen beobachtbaren rekombinanten Haplotyp an. Wie aus Tabelle 8 ersichtlich, wurden nicht alle Stämme für alle Marker typisiert; darüber hinaus wurden nicht alle Individuen innerhalb eines Stamms für einen identischen Satz von Markern typisiert, speziell nicht in K2082. Mit einer Ausnahme sind lediglich Haplotypen, die von betroffenen oder Risiko-Familienstamm-Mitgliedern ererbt sind, gezeigt; die Haplotypen der Ehepartner, die in den Stamm eingeheiratet haben, sind nicht beschrieben. Daher gibt in einer gegebenen Verwandtschaftsgruppe das Auftauchen der Haplotypen X und Y an, dass beide Haplotypen aus dem betroffenen/Risiko-Individuum gefunden wurden und keines davon ein Brustkrebsassoziierter Haplotyp war.
Bei Stamm K1901 zeigten die neuen Marker keine beobachtbare Rekombination mit der Brustkrebs-Anfälligkeit, was darauf hinwies, dass das Rekombinations-Ereignis bei diesem Stamm mit größter Wahrscheinlichkeit zwischen THRA1 und ED2 stattfand. Daher wurde keine neue BRCA1-Lokalisations-Information auf der Grundlage der Untersuchung der vier neuen Marker in diesem Stamm erhalten. Bei Stamm 2082 hat das Individuum mit der Schlüssel-Rekombinante die gekoppelten Allele für ED2, 4-7, AA1 und YM29 geerbt und war für tdj1474 rekombinant, was darauf hinwies, dass das Rekombinations-Ereignis bei diesem Individuum zwischen tdj1474 und ED2/AA1 auftrat.
Bei Stamm K2035 gibt es drei Haplotypen von Interesse, nämlich die in Tabelle 8 gezeigten H1, H2 und R2. H1 liegt in vier Fällen und einem obligaten männlichen Träger, der von Individuum 17 abstammt, vor, während H2 in zwei Fällen und zwei obligaten männlichen Trägern bei den Nachkommen von Individuum 10 vorliegt oder gefolgert ist. R2 ist identisch zu H2 bei Loci zwischen und einschließlich Mfd15 und SCG40, hat sich aber zwischen SCG40 und 42D6 rekombiniert. Da wir festgestellt haben, dass BRCA1 proximal zu 42D6 ist, ergibt diese H2/R2-Differenz keine weitere Lokalisations-Information. H1 und R2 teilen ein identisches Allel bei Mfd15, THRA1, AA1 und ED2, doch unterscheiden sich bei Loci, die als distal zu ED2 angenommen werden, d. h. 4-7, Mfd188, SCG40 und 6C1. Obschon die beiden Haplotypen beim fünften Allel für Marker YM29 übereinstimmen, einem Marker, der physisch zwischen 4-7 und Mfd188 kartiert, ist es wahrscheinlich, dass die Allele identisch durch Lage und nicht identisch durch Abstammung geteilt werden, da dieses Allel das häufigste Allel an diesem Locus bei einer bei CEPH-Eltern auf 0,42 geschätzten Frequenz ist. Im Gegensatz dazu weisen die an den Mfd15- und ED2-Loci geteilten gekoppelten Allele Häufigkeiten von 0,04 bzw. 0,09 auf. Sie teilen auch häufigere Allele bei Mfd191 (Häufigkeit = 0,52), THRA1 und AA1 (Häufigkeit = 0,28). Dies ist die Schlüssel-Rekombinante im Satz, wie es auch die einzige Rekombinante ist, bei der Brustkrebs mit dem proximalen Abschnitt des Haplotyps aufspaltete und damit die distale Begrenzung festlegte. Der Nachweis aus diesem Stamm platziert daher den BRCA1-Locus proximal zu 4-7.
Das Rekombinations-Ereignis bei Stamm 2082, das BRCA1 distal zu tdj1474 platziert, ist das einzige der vier beschriebenen Ereignisse, das direkt gefolgert werden kann; d. h. der Genotyp der betroffenen Mutter kann von ihrem Ehegatten und ihren Nachkommen gefolgert werden und der rekombinante Haplotyp ist in ihrer betroffenen Tochter feststellbar. Bei dieser Familie stehen die Chancen zugunsten der betroffenen Personen, die BRCA1-Anfälligkeits-Allele tragen, extrem hoch; die einzig möglichen Interpretationen der Daten sind die, dass BRCA1 distal zu Mfd191 liegt oder alternativ, dass die gegebene Rekombinante ein sporadischer Fall von Eierstockkrebs im Alter von 44 Jahren ist. Die Interpretation des Stamms 2035 hängt nicht so sehr von einer direkt beobachtbaren oder folgerbaren Rekombinante ab, sondern vielmehr von der Beobachtung unterschiedlicher 17q-Haplotypen, die sich in verschiedenen und manchmal entfernt verwandten Zweigen des Stamms aufspalten. Die Beobachtung, dass Abschnitte dieser Haplotypen Allele für einige Marker gemeinsam haben, während sie bei anderen Markern abweichen, platziert den BRCA1-Locus in die geteilte Region. Das Vertrauen in diese Platzierung hängt von verschiedenen Faktoren ab: der Beziehung zwischen den die jeweiligen Haplotypen tragenden Individuen, der Häufigkeit des geteilten Allels, der Gewissheit, mit der von den Haplotypen gezeigt werden kann, dass sie mit dem BRCA1-Locus aufspalten, und der Dichte der Marker in der Region, die den Haplotyp definieren. Im Falle des Stamms 2035 sind die beiden Zweige eng verwandt, wobei jeder Zweig eine Anzahl früh auftretender Fälle aufweist, die den jeweiligen Haplotyp tragen. Während zwei der geteilten Allele häufig sind (Mfd191, THRA1), betragen die geschätzten Häufigkeiten der geteilten Allele bei Mfd15, AA1 und Ed2 0,04, 0,28 bzw. 0,09. Es ist daher in hohem Maße wahrscheinlich, dass diese Allele identisch durch Abstammung (von einem gemeinsamen Vorfahr stammend) und nicht identisch durch Lage (dasselbe Allel, doch aus der Allgemeinbevölkerung stammend) sind.
BEISPIEL 6
Verfeinerte physische Kartierungsstudien platzieren das BRCA1-Gen in einer durch tdj1474 und U5R flankierten Region
Seit seiner Erstlokalisation auf Chromosom 17q im Jahre 1990 (Hall et al., 1990) wurden umfangreiche Bemühungen in die Lokalisierung des BRCA1-Gens auf eine Region gerichtet, die klein genug war, um die Implementierung wirksamer positioneller Klonierstrategien zur Isolierung des Gens zu ermöglichen. Der BRCA1-Locus wurde zunächst auf dem Intervall Mfd15 (D17S250) 42D6 (D17S588) durch eine Multipunkt-Kopplungsanalyse (Esston et al., 1993) in der kollaborativen Breast Cancer Linkage Consortium Datenbank, bestehend aus 214 weltweit erhobenen Familien, lokalisiert. Anschließende Verfeinerungen der Lokalisation basierten auf individuellen Rekombinations-Ereignissen in spezifischen Familien. Die Region THRA1-D17S183 wurde durch Bowcock et al., 1993, definiert; und die Region THRA1-D17S78 wurde durch Simard et al., 1993, definiert.
Ferner haben wir gezeigt, dass der BRCA1-Locus distal zum Marker Mfd191 (D17S776) liegen muss (Goldgar et al., 1994). Von diesem Marker ist bekannt, dass er distal zu THRA1 und RARA liegt. Die kleinste veröffentlichte Region für den BRCA1-Locus liegt daher zwischen D17S776 und D17S78. Diese Region enthält immer noch etwa 1,5 Millionen Basen der DNA, was die Isolierung und den Test aller Gene in der Region zu einer sehr schwierigen Aufgabe macht. Wir haben daher die Aufgabe der Konstruktion einer physischen Karte dieser Region übernommen, wobei wir einen Satz polymorpher, in der Region lokalisierter STR-Marker isolierten und diese neuen Marker in einer Gruppe informativer Familien analysierten, um die Lokalisation des BRCA1-Gens auf ein handhabbares Intervall zu verfeinern.
Vier Familien liefern einen wichtigen genetischen Nachweis für die Lokalisation des BRCA1 auf einer ausreichend kleinen Region für die Anwendung der positionellen Klonierstrategien. Zwei Familien (K2082, K1901) liefern die Daten bezüglich der proximalen Begrenzungen für BRCA1 und die anderen beiden (K2035, K1813) fixieren die distale Begrenzung. Diese Familien sind nachstehend ausführlich erörtert.
Insgesamt 15 Short-Tandem-Repeat-Marker, die mittels PCR untersuchbar waren, wurden zur Verfeinerung dieser Lokalisation in den untersuchten Familien verwendet. Diese Marker umfassen DS17S7654, DS17S975, tdj474 und tdj1239. Die Primer-Sequenzen für diese Marker sind in SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 für DS17S754; in SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 für DS17S975; in SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 für tdj1474; und in SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 für tdj1239 wiedergegeben.
Familienstamm 2082
Bei Stamm 2082 handelt es sich um die größte, bis heute untersuchte Familie mit BRCA1-gekoppeltem Brust/Eierstockkrebs. Sie weist einen LOD-Score von 8,6 auf und liefert damit einen eindeutigen Nachweis der 17q-Koppelung. Diese Familie wurde zuvor beschrieben und es wurde gezeigt, dass sie eine entscheidende Rekombinante enthält, die BRCA1 distal zu MFD191 (D17S776) platziert. Diese Rekombinante trat bei einer im Alter von 45 Jahren mit Eierstockkrebs diagnostizierten Frau auf, deren Mutter im Alter von 63 Jahren an Eierstockkrebs erkrankt war. Die betroffene Mutter war verstorben; allerdings konnte aus ihren Kindern gefolgert werden, dass sie den bei 30 anderen in der Familie vorhandenen Fällen von gekoppeltem Haplotyp in der Region zwischen Mfd15 und Mfd188 ebenfalls aufwies. Ihre betroffene Tochter erhielt das gekoppelte Allel an den Loci ED2, 4-7 und Mfd188, doch außerdem das Allel auf dem Nicht-BRCA1-Chromosom bei Mfd15 und Mfd191. Um diese Rekombinations-Bruchstelle weiter zu lokalisieren, testeten wir die Schlüsselmitglieder dieser Familie auf die folgenden, aus physischen Kartierungs-Quellen hergeleiteten Marker: tdj1474, tdj1239, CF4, D17S855. Bei Markern tdj1474 und CF4 zeigte sich, dass die betroffene Tochter das gekoppelte Allel nicht erhalten hatte. Bei dem STR-Locus tdj1239 allerdings konnte bezüglich der Mutter gefolgert werden, dass sie informativ war und ihre Tochter das BRCA1-assoziierte Allel erhalten hatte. D17S855 war in dieser Familie nicht informativ. Basierend auf dieser Analyse ist die Reihenfolge 17q-Centromer – Mfd191 – 17HSD – CF4 – tdj1474 – tdj1239 – D17S855 – ED2 – 4-7 – Mfd188 – 17q-Telomer. Die oben beschriebene Rekombinante platziert BRCA1 daher distal zu tdj1474, und die Bruchstelle ist auf dem Intervall zwischen tdj1474 und tdj1239 lokalisiert. Die einzige alternative Erklärung für die Daten in dieser Familie über die hinaus, dass BRCA1 distal zu tdj1474 lokalisiert ist, besteht darin, dass der im rekombinanten Individuum vorhandene Eierstockkrebs durch vom BRCA1-Gen unabhängige Gründe verursacht ist. In Anbetracht dessen, dass vor einem Alter von 50 Jahren diagnostizierter Eierstockkrebs selten ist, ist diese alternative Erklärung überaus unwahrscheinlich.
Stamm 1901
Bei Stamm 1901 handelt es sich um eine Familie mit früh auftretendem Brustkrebs, in der sieben der Brustkrebs-Fälle vor dem Alter 50 Jahre diagnostiziert wurden, davon vier vor dem Alter 40 Jahre. Außerdem lagen drei Fälle von Brustkrebs im Alter 50 bis 70 Jahre vor. Bei einem Fall von Brustkrebs trat außerdem ein Eierstockkrebs im Alter 61 Jahre auf. Diese Familie weist derzeit einen LOD-Score von 1,5 bei D17S855 auf. In Anbetracht dieses Kopplungsnachweises und des Vorhandenseins von mindestens einem Fall von Eierstockkrebs ist die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit des Zugrundeliegens von BRCA1 bei dieser Familie höher als 0,99. Bei dieser Familie resultiert die Rekombination aus der Tatsache, dass ein Individuum, das der Bruder des Falles von Eierstockkrebs ist, von dem der Großteil der anderen Fälle abstammen, lediglich einen Abschnitt des Haplotyps teilt, der bei den anderen Fällen in der Familie kosegregierte. Allerdings gab er diesen Teil-Haplotyp an seine Tochter weiter, bei der im Alter von 44 Jahren Brustkrebs auftrat. Sollte dieser Fall auf das BRCA1-Gen zurückzuführen sein, so kann nur der zwischen seinem Bruder und seiner Schwester geteilte Teil des Haplotyps das BRCA1-Gen enthalten. Die Schwierigkeit bei der Interpretation dieser Art von Information ist die, dass man sich zwar der Marker sicher sein kann, die nicht geteilt werden und daher rekombinant sind, doch dass übereinstimmende Marker entweder geteilt werden können, da sie nicht-rekombinant sind oder da sein Elter homozygot war. Ohne die parenteralen Genotyp-Daten ist die Unterscheidung zwischen diesen Alternativen unmöglich. Eine Untersuchung des Haplotyps bei K1901 zeigt, dass er das gekoppelte Allel bei Mfd15 (D17S250), THRA1, CF4 (D17S1320) und tdj1474 (D17S1321) nicht teilt. Er teilt das gekoppelte Allel bei Mfd191 (D17S776), ED2 (D17S1327), tdj1239 (D17S1328) und Mfd188 (D17S579). Obschon das bei Mfd191 geteilte Allel relativ seiten ist (0,07), würden wir annehmen, dass der Elter homozygot war, da sie mit auf beiden Seiten eng benachbart lokalisierten Markern rekombinant sind, und ein doppeltes Rekombinations-Ereignis in dieser Region extrem unwahrscheinlich wäre. Daher würde der Nachweis in dieser Familie den BRCA1-Locus ebenfalls distal zu tdj1474 platzieren. Allerdings ist die Untergrenze dieser Bruchstelle unmöglich ohne Information über den Eltern-Genotyp bestimmbar. Es ist interessant, dass die Schlüssel-Rekombinations-Bruchstelle bei dieser Familie das Ergebnis bei Stamm 2082 bestätigt. Wie auch zuvor, ist die Lokalisations-Information in dieser Familie nur dann von Bedeutung, wenn der Brustkrebs auf das BRCA1-Gen rückführbar war. Das relativ frühe Alter bei Diagnose (44) lässt dies allerdings als sehr wahrscheinlich erscheinen, da das Risiko von Brustkrebs vor dem Alter 45 Jahre in der Allgemeinbevölkerung gering ist (etwa 1%).
Stamm 2035
Diese Familie ist K1901 darin ähnlich, dass die Information zu den entscheidenden Rekombinations-Ereignissen nicht direkt beobachtbar ist, sondern aus der Beobachtung gefolgert wird, dass die beiden Haplotypen, die bei dem früh auftretendem Brustkrebs in den beiden Familienzweigen kosegregieren, für Marker identisch zu sein scheinen, die im proximalen Abschnitt der 17q-BRCA1-Region lokalisiert sind, doch an distaleren Loci unterschiedlich sind. Jeder der beiden Haplotypen tritt bei mindestens vier Fällen von früh auftretendem oder bilateralem Brustkrebs auf. Der Gesamt-LOD-Score bei ED2 in dieser Familie beträgt 2,2, und unter Berücksichtigung der Tatsache, dass ein Fall von Eierstockkrebs in der Familie vorliegt (was auf eine A-priori-Wahrscheinlichkeit einer BRCA1-Verknüpfung von 80% hinweist), beträgt die resultierende A-posteriori-Wahrscheinlichkeit, dass diese Familie an BRCA1 gekoppelt ist, 0,0998. Die Haplotypen sind für die Marker Mfd15, THRA1, Mfd191, ED2, AA1, D17S858 und D17S902 identisch. Die gemeinsamen Allele bei Mfd15 und ED2 sind beide recht selten, was darauf hinweist, dass dieser Haplotyp identisch durch Abstammung geteilt wird. Die Haplotypen sind für CA375, 4-7 und Mfd188 und verschiedene distalere Marker jedoch nicht übereinstimmend. Dies weist darauf hin, dass der BRCA1-Locus über dem Marker CA-375 liegen muss. Dieser Marker ist etwa 50 kb unterhalb von D17S78 lokalisiert, so dass er in erster Linie als zusätzliche Bestätigung der vorherigen unteren Grenze dient, wie berichtet bei Simard et al., (1993).
Stamm 1813
Bei Stamm 1813 handelt es sich um eine kleine Familie mit vier Fällen von vor dem Alter 40 Jahre diagnostiziertem Brustkrebs, bei deren Mutter eine Brustkrebs-Diagnose im Alter von 45 Jahren und eine Eierstockkrebs-Diagnose im Alter von 61 Jahren vorlag. Diese Situation ist durch die Tatsache etwas verkompliziert, dass die vier Fälle offensichtlich drei verschiedene Väter besitzen, von denen lediglich einer genotypisiert worden ist. Durch Typisierung einer Reihe unterschiedlicher Marker in der BRCA1-Region als auch hochgradig polymorpher Marker an anderen Stellen im Genom wurde jedoch die Vaterschaft bei allen Kindern der Familie mit einem hohen Grad an Sicherheit nachgewiesen. Diese Familie erbringt einen maximalen Multipunkt-LOD-Score von 0,60 mit 17q-Markern, was in Anbetracht dessen, dass zumindest ein Fall von Eierstockkrebs vorliegt, zu einer A-posteriori-Wahrscheinlichkeit, eine BRCA1-gekoppelte Familie zu sein, von 0,93 führt. Diese Familie enthält ein direkt beobachtbares Rekombinations-Ereignis bei Individuum 18 (siehe 5 in Simard et al., Human Mol. Genet 2: 1193-1199 (1993)), das im Alter von 34 Jahren Brustkrebs entwickelte. Der Genotyp ihrer betroffenen Mutter an den relevanten 17q-Loci kann aus ihren Genotypen, den Genotypen ihrer betroffenen Schwester und den Genotypen dreier weiterer nicht betroffener Geschwister gefolgert werden. Individuum 18 erbte die BRCA1-gekoppelten Allele für die folgenden Loci: Mfd15, THRA1, D17S800, D17S855, AA1 und D17S931. Bei den Markern unter D17S931, d. h. U5R, vrs31, D17S858 und D17S579 hat sie allerdings die Allele geerbt, die auf dem nicht die Krankheit tragenden Chromosom lokalisiert sind. Der Nachweis aus dieser Familie würde daher den BRCA1-Locus proximal zu Marker U5R platzieren. Aufgrund ihres frühen Alters bei der Diagnose (34) ist es extrem unwahrscheinlich, dass der Krebs des rekombinanten Individuums nicht auf das für die anderen Fälle von Brust/Eierstockkrebs in dieser Familie verantwortliche Gen zurückführbar ist; die Unsicherheit in dieser Familie resultiert aus unserer etwas geringeren Menge an Belegen dafür, dass Brustkrebs in dieser Familie auf BRCA1 und nicht auf einen zweiten, bisher unkartierten, Brustkrebs-Anfälligkeitslocus rückzuführen ist.
Größe der BRCA1-enthaltenden Region
Basierend auf den oben ausführlich beschriebenen genetischen Daten muss der BRCA1-Locus im Intervall zwischen den Markern tdj1474 und U5R liegen, die beide in unserem Labor isoliert wurden. Ausgehend von den in 2 und 3 gezeigten physischen Karten können wir den Versuch einer Schätzung des physischen Abstands zwischen diesen beiden Loci unternehmen. Es sind etwa 14 P1-Klone mit einer mittleren Insertgröße von etwa 80 kb zur Umspannung dieser Region erforderlich. Da sich alle diese P1 in einem gewissen unbekannten Grad überlappen, ist die physische Region jedoch mit größter Wahrscheinlichkeit viel kleiner als 14 mal 80 kb. Basierend auf Restriktionskarten der die Region abdeckenden Klone schätzen wir die Größe der BRCA1-enthaltenden Region auf etwa 650 kb.
BEISPIEL 7
Identifikation der Kandidat-cDNA-Klone für den BRCA1-Locus durch Genomanalyse der Contig-Region
Vollständiges Screening der plausiblen Region. Die erste Methode zur Identifizierung der Kandidat-cDNAs war zwar arbeitsintensiv, doch verwendete bekannte Techniken. Das Verfahren umfasste das Screening von Cosmiden und P1- und BAC-Klonen im Contig zur Identifizierung vermuteter kodierender Sequenzen. Die Klone, die vermutete kodierende Sequenzen enthielten, wurden dann als Sonden auf Filtern von cDNA-Banken verwendet, um Kandidat-cDNA-Klone für die weitere Analyse zu identifizieren. Die Klone wurden auf vermutete kodierende Sequenzen mittels beider Methoden gescreent.
Zoo-Blots. Die erste Methode zur Identifizierung vermuteter kodierender Sequenzen erfolgte durch Screening der Cosmid- und P1-Klone auf Sequenzen, die durch die Evolution quer durch verschiedene Spezies konserviert worden waren. Diese Methode wird als „Zoo-Blot-Analyse” bezeichnet und ist beschrieben bei Monaco, 1986. Spezifisch wurde die DNA von Kühen, Hühnern, Schweinen, Mäusen und Ratten mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (8 μg der DNA pro Enzym) verdaut. Die verdaute DNA wurde über Nacht auf einem 0,7%igen Gel bei 20 Volt über 16 Stunden hinweg (14 cm Gel) aufgetrennt und die DNA dann auf Nylonmembranen unter Anwendung von Southern-Blot-Techniken übertragen. Zum Beispiel wurde der Zoo-Blot-Filter bei 65°C in 0,1 × SSC, 0,5% SDS und 0,2 M Tris, bei pH-Wert 8,0 über 30 Minuten hinweg behandelt und dann über Nacht bei 42°C in 5 × SSC, 10% PEG 8000, 20 mM NaPO₄, bei pH 6,8, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 1 × Denhardtsche Lösung, 50% Formamid, 0,1% SDS und 2 μg/ml C_ot-1-DNA blockiert.
Die zu analysierenden Cosmid- und P1-Klone wurden mit einem Restriktionsenzym verdaut, um humane DNA aus der Vektor-DNA freizusetzen. Die DNA wurde auf 14 cm an 0,5% Agarose-Gel über 16 Stunden hinweg über Nacht bei 20 Volt aufgetrennt. Die humanen DNA-Bande wurden aus dem Gel ausgeschnitten und aus der Gelmasse bei 100 Volt über mindestens zwei Stunden hinweg in 0,5 × Tris-Acetat-Puffer elektroeluiert (Maniatis et al., 1982). Die eluierte Not-I-verdaute DNA (~15 kb bis 25 kb) wurde dann mit EcoRI-Restriktionsenzym zum Erhalt kleinerer Fragmente (~0,5 kb bis 5,06 kb) verdaut, die für den nächsten Schritt der Markierung der DNA mit Radionukleotiden leichter auseinander schmelzen. Die DNA-Fragmente wurden mittels der Hexamer-zufallsgeprimten Markierungsmethode markiert (Boehringer-Mannheim, Kat. #1004760). Die markierte DNA wurde aus Spermin ausgefällt (unter Zugabe von 100 μl TE, 5 μl an 0,1 M-Spermin und 5 μl an 10 mg/ml Lachssperma-DNA), um nicht-eingebaute Radionukleotide zu entfernen. Die markierte DNA wurde dann in 100 μl TE, 0,5 M NaCl bei 65°C über 5 Minuten hinweg resuspendiert und dann mit humaner C_ot-1-DNA über 2 bis 4 Stunden hinweg gemäß den Anleitungen des Herstellers (Gibco/BRL, Kat. #5279SA) blockiert. Die C_ot-1 blockierte Sonde wurde auf den Zoo-Blot-Filtern in der Blockierungslösung bei 42°C über Nacht inkubiert. Die Filter wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und dann im gleichen Puffer 30 Minuten lang bei 55°C gewaschen. Die Filter wurden dann 1 bis 3 Tage lang bei –70°C mit einem Kodak-XAR-5-Film mit einem Verstärkerschirm belichtet. Folglich wurden die Zoo-Blots entweder mit dem Pool der Eco-RI-Fragmente aus dem Insert oder jedem einzelnen der Fragmente hybridisiert.
HTF-Insel-Analyse. Die zweite Methode zur Identifizierung von Cosmiden zur Verwendung als Sonden an den cDNA-Banken bestand in der HTF-Insel-Analyse. Da die Pulsfeld-Karte HTF-Inseln aufzeigen kann, wurden Cosmide, die an diese HTF-Insel-Regionen kartieren, vorrangig analysiert. Bei HTF-Inseln handelt es sich um Segmente von DNA, die eine sehr hohe Häufigkeit unmethylierter CpG-Dinukleotide enthalten (Tonolio et al., 1990) und durch eine Anhäufung von Restriktionsstellen der Enzyme, deren Erkennungssequenzen CpG-Dinukleotide enthalten, offenbar werden. Zu Enzymen, die als nützlich bei der HTF-Insel-Analyse bekannt sind, zählen AscI, NotI, BssHII, EagI, SacII, NaeI, NarI, SmaI und M1uI (Anand, 1992). Eine Pulsfeld-Karte wurde unter Verwendung der Enzyme NotI, NruI, EagI, SacII und SalI erstellt und die beiden HTF-Inseln festgestellt. Diese Inseln sind am distalen Ende der Region lokalisiert, wobei eine distal zum GP2B-Locus und die andere proximal zu diesem Locus, doch beide außerhalb der BRCA1-Region lokalisiert sind. Die von den YACs abstammenden Cosmide, die diese beiden Lokalisationen abdecken, wurden zur Identifizierung jener analysiert, die diese Restriktionsstellen und folglich die HTF-Inseln enthalten.
cDNA-Screening. Jene Klone, die HTF-Inseln enthalten oder eine Hybridisierung an die DNA anderer Spezies als des Menschen zeigen, enthalten wahrscheinlich kodierende Sequenzen. Die humane DNA aus diesen Klonen wurde als Gesamtinsert oder als EcoRI-Fragmente isoliert und wie oben beschrieben markiert. Die markierte DNA wurde zum Screening von Filtern verschiedener cDNA-Banken unter denselben Bedingungen wie die Zoo-Blots verwendet, außer dass die cDNA-Filter stringenteren zweimaligen Waschgängen mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C über 30 Minuten hinweg unterzogen wurden.
Der Großteil der bis heute in unseren Untersuchungen verwendeten cDNA-Banken (Banken von gesundem Brustgewebe, Brustgewebe von einer Frau im achten Schwangerschaftsmonat und einer Brustmalignität) wurden bei Clonetech, Inc., präpariert. Die aus dem Brustgewebe der im achten Monat schwangeren Frau generierte cDNA-Bank ist beziehbar von Clonetech (Kat. #HL1037a) im Lambda-gt-10-Vektor, und wird in der C600Hfl-Bakterien-Wirtszelle gezüchtet. Proben des gesunden Brustgewebes und des bösartigen Brustgewebes wurden aus einer 37 Jahre alten Kaukasierin isoliert und ein Gramm jedes Gewebes an Clonetech zur mRNA-Aufarbeitung und Konstruktion der cDNA-Bank gesandt. Die letzteren beiden Banken wurden unter Verwendung sowohl von Zufalls- als auch Oligo-dT-Priming bei einer Größenauswahl der Endprodukte erzeugt, die dann in den Lambda-Zap-II-Vektor kloniert und im XL1-blau-Bakterienstamm gezüchtet wurden, wie vom Hersteller beschrieben. Zu weiteren gewebespezifischen cDNA-Banken zählen humanes fötales Hirn (Stratagene, Kat. 936206), humane Hoden (Clonetech Kat. HL3024), humaner Thymus (Clonetech Kat. HL1127n), humanes Hirn (Clonetech Kat. HL11810), humane Plazenta (Clonetech Kat. 1075b) und humaner Skelettmuskel (Clonetech Kat. HL1124b).
Die cDNA-Banken wurden mit ihren Wirtszellen auf NZCYM-Platten ausplattiert und Filterhebungen von jeder Platte im Duplikat wie nach Maniatis et al., (1982) vorgenommen. Insert-(humane)-DNA von den genomischen Kandidat-Klonen wurden gereinigt und zu hoher spezifischer Aktivität radioaktiv markiert. Die radioaktive DNA wurde dann an die cDNA-Filter hybridisiert, um jene cDNAs zu identifizieren, die den innerhalb des Kandidat-Cosmid-Klons lokalisierten Genen entsprechen. Die mittels dieser Methode identifizierten cDNAs wurden herausgenommen, nochmals aufplattiert und mit dem markierten Klon-Insert oder seiner abgeleiteten EcoRI-Fragment-DNA gescreent, um ihren positiven Status zu verifizieren. Die Klone, die nach dieser zweiten Screening-Runde positiv waren, wurden dann gezüchtet und ihre DNA für die Southern-Blot-Analyse und die Sequenzierung aufgereinigt. Die Klone wurden entweder als Plasmid durch in vivo-Exzision des Plasmids aus dem Lambda-Vektor aufgereinigt, wie in den Protokollen der Hersteller beschrieben, oder aus dem Lambda-Vektor als ein Restriktions-Fragment isoliert und in einem Plasmid- Vektor subkloniert.
Die Southern-Blot-Analyse wurde im Duplikat vorgenommen, d. h. eine unter Verwendung der ursprünglichen genomischen Insert-DNA als eine Sonde zur Verifizierung dessen, dass das cDNA-Insert hybridisierende Sequenzen enthält. Der zweite Blot wurde mit cDNA-Insert-DNA aus dem größten cDNA-Klon hybridisiert, um zu identifizieren, welche Klone dasselbe Gen repräsentieren. Alle cDNAs, die mit dem genomischen Klon hybridisieren und einzigartig sind, wurden sequenziert und die DNA analysiert, um zu bestimmen, wann die Sequenzen bekannte oder einzigartige Gene repräsentieren. Alle cDNA-Klone, die einzigartig zu sein scheinen, wurden als Kandidat-BRCA1-Loci weiter analysiert. Spezifisch werden die Klone an Northern-Blots hybridisiert, um sie auf eine Brust-spezifische Expression und differenzielle Expression in gesunden versus Brusttumor-RNAs zu untersuchen. Sie werden auch mittels PCR auf Klonen in der BRCA1-Region zur Verifizierung ihrer Lokalisation analysiert. Um den Umfang des Locus zu kartieren, wurden cDNAs der vollen Länge isoliert und ihre Sequenzen als PCR-Sonden auf den YACs und den Klonen, die die ursprünglich identifizierenden Klone umgeben und enthalten, verwendet. Die Intron-Exon-Begrenzungen werden dann durch Sequenzanalyse weiter definiert.
Wir haben die cDNA-Banken von gesundem Brustgewebe, einem Brustgewebe nach achtmonatiger Schwangerschaft und Fötushirngewebe mit Zoo-Blot-positiven EcoRI-Fragmenten aus Cosmid-, BAC- und P1-Klonen in der Region gescreent. Innerhalb der drei Banken wurden potentielle BRCA1-cDNA-Klone identifiziert. Die Klone wurden herausgenommen, nochmals ausplattiert und mit der ursprünglichen Sonde gescreent, um zu verifizieren, dass sie positiv waren.
Analyse der Hybrid-selektierten cDNA. Die aus der Direktauswahl erhaltenen cDNA-Fragmente wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung gegen die Sonden-DNA geprüft, um zu verifizieren, dass sie aus dem Contig stammten. Jene, die diesen Test bestanden, wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert. Die in dieser Weise erhaltene Gruppe von DNA-Sequenzen wurde dann gegeneinander geprüft, um unabhängige Klone zu finden, die sich überlappten. Z. B. wurden die Klone 694-65, 1240-1 und 1240-33 unabhängig voneinander erhalten und dann gezeigt, dass sie aus derselben benachbarten cDNA-Sequenz stammten, die mit EST:489:1 bezeichnet wurde.
Analyse der Kandidat-Klone. Ein oder mehrere der oben erzeugten Kandidat-Gene wurden sequenziert und die Information zur Identifikation und Klassifikation jedes exprimierten Gens verwendet. Die DNA-Sequenzen wurden mit bekannten Genen durch Vergleiche der Nukleotid-Sequenzen und durch Translation in alle Raster, gefolgt von einem Vergleich mit bekannten Aminosäure-Sequenzen, verglichen. Dies wurde unter Verwendung der Genetic Data Environment (GDE) Software Version 2.2 und der Basic Local Alignment Search Tool-(Blast)-Reihe der Client/Server-Software-Packages vorgenommen (z. B. BLASTN 1.3.13MP) zum Sequenzvergleich sowohl gegen lokale als auch entfernte Sequenz-Datenbanken (z. B. GenBank) vorgenommen auf Sun SPARC-Workstations, vorgenommen. Es wurden Sequenzen, die aus Sammlungen von mit den Cosmiden und P1 identifizierten cDNA-Klonen rekonstruiert wurden, erzeugt. Alle Kandidat-Gene, die neue Sequenzen repräsentierten, wurden zum Testen ihrer Kandidatur für den vermuteten BRCA1-Locus weiter analysiert.
Mutations-Screening. Zum Screening auf die Mutationen in den betroffenen Stammbäumen wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Erstens wurde eine aus Familienmitgliedern isolierte genomische DNA, die als Träger des Anfälligkeits-Allels von BRCA1 bekannt waren, als ein Template zur Amplifikation der Kandidat-Gensequenzen mittels PCR verwendet. Flankieren oder Überlappen die PCR-Primer eine Intron/Exon-Begrenzung, so ist das amplifizierte Fragment größer als aus der cDNA-Sequenz vorausgesagt oder liegt nicht im amplifizierten Gemisch vor. Durch eine Kombination solcher Amplifikations-Experimente und der Sequenzierung von P1-, BAC- oder Cosmid-Klonen unter Verwendung des Satzes designter Primer ist es möglich, die Intron/Exon-Struktur aufzustellen und schließlich die DNA-Sequenzen der genomischen DNA aus den Stammbäumen zu erhalten.
Ein zweiter Ansatz, der viel schneller ist, wenn die Intron/Exon-Struktur des Kandidat-Gens komplex ist, umfasst die Sequenzierung von Fragmenten, die aus Stammbaum-Lymphozyt-cDNA amplifiziert wurden. cDNA, die aus aus Stammbaum-Blut extrahierter Lymphozyten-mRNA synthetisiert worden war, wurde als ein Substrat für die PCR-Amplifikation unter Verwendung des Satzes der designten Primer verwendet. Wird das Kandidat-Gen in signifikantem Umfang in Lymphozyten exprimiert, so führen solche Experimente gewöhnlich zu amplifizierten Fragmenten, die direkt ohne Kenntnis der Intron/Exon-Verbindungsstelle sequenziert werden können.
Die Produkte solcher Sequenzierungs-Reaktionen wurden mittels Gelelektrophorese analysiert, um Positionen in der Sequenz zu bestimmen, die entweder Mutationen wie Deletionen oder Insertionen oder Basenpaar-Substitutionen enthalten, die zu Aminosäure-Umlagerungen oder anderen nachteiligen Wirkungen führen.
Jegliche Sequenz innerhalb der BRCA1-Region, die in Brustgewebe exprimiert wird, wird als Kandidat-Gen für BRCA1 erachtet. Der überzeugende Beweis, dass ein gegebenes Kandidat-Gen dem BRCA1 entspricht, folgt aus einem Nachweis, dass Stammbaum-Familien defekte Allele des Kandidats enthalten.
BEISPIEL 8
Identifikation von BRCA1
Identifikation von BRCA1. Unter Anwendung verschiedener Strategien wurde eine detaillierte Karte von Transkripten für die 600-kb-Region von 17q21 zwischen D17S1321 und D17S1324 entwickelt. Kandidat-exprimierte Sequenzen wurden als DNA-Sequenzen definiert, wie erhalten aus: 1) direktem Screening von Brust-, Fötushirn- oder Lymphozyten-cDNA-Banken, 2) Hybridselektion von Brust-, Lymphozyten- oder Eierstock-cDNAs oder 3) Zufallssequenzierung von genomischer DNA und Voraussage der kodierenden Exons mittels XPOUND (Thomas und Skolnick, 1994). Diese exprimierten Sequenzen wurden in vielen Fällen in Contigs angeordnet, die sich aus verschiedenen, unabhängig voneinander identifizierten Sequenzen zusammensetzten. Die Kandidat-Gene können mehr als eine dieser Kandidat-exprimierten Sequenzen enthalten. 65 Kandidat-exprimierte Sequenzen innerhalb dieser Region wurden mittels Hybridselektion, durch direktes Screening von cDNA-Banken und mittels Zufallssequenzierung von P1-Subklonen identifiziert. Die exprimierten Sequenzen wurden durch Transkriptgröße, DNA-Sequenz, Datenbank-Vergleich, Expressionsmuster, Genomstruktur und, am wichtigsten, DNA-Sequenz-Analyse bei Individuen aus Stämmen charakterisiert, bei denen sich eine 17q-gekoppelte Brust- und Eierstockkrebs-Anfälligkeit aufspaltete.
Drei unabhängige Contigs von exprimierter Sequenz, 114:1 (649 bp), 694:5 (213 bp) und 754:2 (1079 bp) wurden isoliert und schließlich der Nachweis erbracht, dass sie Abschnitte von BRCA1 repräsentierten. Wurden ESTs für diese Contigs als Hybridisierungs-Sonden für die Northern-Analyse verwendet, so wurde ein einzelnes Transkript von etwa 7,8 kb in gesunder Brust-mRNA beobachtet, was annehmen lässt, dass sie für verschiedene Abschnitte eines einzigen Gens kodieren. Screens von Brust-, Fötushirn-, Thymus-, Hoden-, Lymphozyten- und Plazenta-DNA-Banken und PCR-Experimente mit Brust-mRNA verknüpften die 1141:1, 694:5 und 754:2-Contigs. 5'-RACE-Experimente mit Thymus-, Hoden- und Brust-mRNA erweiterten das Contig auf das vermutete 5'-Ende, was eine zusammengesetzte Sequenz der vollen Länge ergab. Die PCR und Direktsequenzierung von P1s und BACs in der Region wurde zur Identifizierung der Lokalisation von Introns angewandt und ermöglichten die Bestimmung von Spleiß-Donor und -Akzeptor-Stellen. Diese drei exprimierten Sequenzen wurden in eine einzige Transkriptionseinheit eingebracht, die in der abschließenden Analyse als BRCA1 nachweisbar war. Diese Transkriptionseinheit ist angrenzend an D17S855 im Zentrum der 600-kb-Region lokalisiert (4).
Die Kombination der aus cDNA-Klonen, Hybridselektions-Sequenzen und amplifizierten PCR-Produkten erhaltenen Sequenzen ermöglichte die Konstruktion einer zusammengesetzten BRCA1-cDNA der vollen Länge (SEQ ID NO: 1). Die Sequenz der BRCA1-cDNA (aufwärts durch das Stopcodon) wurde ebenfalls bei GenBank hinterlegt und mit der Zugriffsnummer U-14680 bezeichnet. Diese hinterlegte Sequenz ist hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen. Der sich am weitesten in die 3'-Richtung erstreckende cDNA-Klon enthält einen Poly(A)-Trakt, dem ein Polyadenylierungs-Signal vorausgeht. Eine konzeptuale Translation der cDNA ergab einen einzigen langen offenen Leseraster von 208 Kilodalton (Aminosäure-Sequenz: SEQ ID NO: 2) mit einem potentiellen Startcodon, flankiert durch Sequenzen, die der Kozak-Konsensus-Sequenz ähneln (Kozak, 1987). Nachforschungen von Smith-Waterman (Smith and Waterman, 1981) und BLAST (Altschul et al., 1990) identifizierten eine Sequenz nahe dem Amino-Terminus mit beträchtlicher Homologie zu Zinkfinger-Domänen (5). Diese Sequenz enthält im Konsensus-C3HC4-Zinkfinger-Motiv vorhandene Cystein- und Histidin-Reste und teilt multiple andere Reste mit Zinkfinger-Proteinen in den Datenbanken. Das BRCA1-Gen setzt sich aus 23 kodierenden Exons zusammen, die über mehr als 100 kb der genomischen DNA angeordnet sind (6). Northern-Blots unter Verwendung von Fragmenten der BRCA1-cDNA als Sonden identifizierten ein einzelnes Transkript von etwa 7,8 kb, das am reichlichsten in Brust, Thymus und Hoden, aber auch in Eierstöcken vorhanden ist (7). Vier alternativ gespleißte Produkte wurden als unabhängige cDNA-Klone beobachtet; drei davon wurden in Brust- und zwei in Eierstock-mRNA nachgewiesen (6). Eine PCR-Untersuchung von Gewebe-cDNAs untermauert die Idee weiter, dass eine beträchtliche Heterogenität nahe dem 5'-Ende der Transkripte von diesem Gen vorliegt; die molekulare Basis für die Heterogenität involviert eine differenzielle Wahl der ersten Spleiß-Donor-Stelle, wobei die nachgewiesenen Umlagerungen alle das Transkript in der Region 5' des identifizierten Startcodons verändern. Wir haben sechs potentielle alternierende Spleiß-Donors in dieser 5'-untranslatierten Region nachgewiesen, wobei die längste Deletion 1,155 bp betrug. Der vorherrschenden Form des BRCA1-Proteins in Brust und Eierstock fehlt Exon 4. Die Nukleotid-Sequenz für BRCA1-Exon 4 ist in SEQ ID NO: 11 gezeigt, und die vorausgesagte Aminosäure-Sequenz ist in SEQ ID NO: 12 gezeigt.
Die weitere 5'-Sequenz der BRCA1-genomischen DNA ist in SEQ ID NO: 13 gezeigt. Das G bei Position 1 steht für die potentielle Startstelle bei Hoden. Das A in Position 140 steht für die potentielle Startstelle bei somatischem Gewebe. Es gibt sechs alternative Spleiß-Formen dieser 5'-Sequenz, wie in 8 gezeigt. Das G bei Position 356 steht für die kanonische erste Spleiß-Donor-Stelle. Das G bei Position 444 steht für die erste Spleiß-Donor-Stelle in zwei Klonen (Hoden 1 und Hoden 2). Das G bei Position 889 steht für die erste Spleiß-Donor-Stelle in Thymus 3. Eine vierte Spleiß-Donor-Stelle ist das G bei Position 1230. Das T bei Position 1513 steht für die Spleiß-Akzeptor-Stelle für alle der oben genannten Spleiß-Donors. Eine fünfte alternative Spleißform besitzt eine erste Spleiß-Donor-Stelle bei Position 349 mit einer ersten Akzeptor-Stelle an Position 591 und einer zweiten Spleiß-Donor-Stelle bei Position 889 und einer zweiten Akzeptor-Stelle an Position 1513. Eine sechste alternative Form ist in dieser 5'-Region ungespleißt. Das A an Position 1532 ist die kanonische Startstelle, die bei Position 120 der SEQ ID NO: 1 auftaucht. Für BRCA1 bestimmte partielle genomische DNA-Sequenzen sind in 10A–10H und SEQ ID NO: 14–34 gezeigt. Die Kleinbuchstaben (in 10A–10H) kennzeichnen eine Intron-Sequenz, während die Großbuchstaben eine ExonSequenz kennzeichnen. Unbestimmte Intervalle innerhalb der Introns sind mit vvvvvvvvvvvvv in 10A–10H gekennzeichnet. Die Intron/Exon-Verbindungsstellen sind in Tabelle 9 gezeigt. Das am 5'-Ende der Exons 8 und 14 gefundene CAG ist in einigen cDNAs feststellbar, in anderen jedoch nicht. Bekannte polymorphe Stellen sind in 10A–10H in fetter Schriftart und mit Unterstreichung gezeigt. Die bekannten Polymorphismen sind in Tabellen 18 und 19 aufgelistet.
Gering stringente Blots, bei denen genomische DNA aus Organismen von diversem phylogenetischem Hintergrund mit BRCA1-Sequenzen, denen die Zinkfinger-Region fehlte, sondiert wurden, zeigten stark hybridisierende Fragmente beim Menschen, Affen, Schaf und Schwein auf, und sehr schwache Hybridisierungs-Signale bei Nagern. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass, abgesehen von der Zinkfinger-Domäne, BRCA1 lediglich in mäßigem Grade durch die Evolution konserviert ist.

Keimbahn-BRCA1-Mutationen bei 17q-gekoppelten Stämmen. Der rigoroseste Test für BRCA1-Kandidat-Gene besteht in der Suche nach potentiell aufbrechenden Mutationen bei Träger-Individuen aus Stämmen, bei denen sich die 17q-gekoppelte Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs aufspaltet. Solche Individuen müssen BRCA1-Allele enthalten, die von der Wildtyp-Sequenz abweichen. Der bei dieser Analyse verwendete Satz an DNA-Proben bestand in einer DNA von Individuen, die acht verschiedene BRCA1-Stämme repräsentierten (Tabelle 10). TABELLE 10 FAMILIENSTAMM-BESCHREIBUNGEN UND ASSOZIIERTE LOD-SCORES

Stamm	Fälle (n)					Sporadische Fälle¹ (n)	LOD-Score	Marker
Stamm	Br	Br < 50	Ei.			Sporadische Fälle¹ (n)	LOD-Score	Marker
2082	31	20	22	7	9,49	D17S1327
2099	22	14	2*	0	2,36	D17S800/D17S855
2035	10	8	1*	0	2,25	D17S1327
1901	10	7	1*	0	1,50	D17S855
1925	4	3	0	0	0,55	D17S579
1910	5	4	0	0	0,36	D17S579/D17S250²
1927	5	4	0	1	–0,44	D17S250
1911	8	5	0	2	–0,20	D17S250

¹Anzahl der Frauen mit Brustkrebs (diagnostiziert unter Alter 50 Jahre) oder Eierstockkrebs (diagnostiziert in jedem Alter), die den BRCAI-gekoppelten Haplotyp nicht teilen, der sich in den verbleibenden Fällen der Familie aufspaltet.
²Multipunkt-LOD-Score, wie unter Anlegung beider Marker errechnet
*Stamm enthält ein Individuum, das sowohl Brust- als auch Eierstockkrebs hatte; dieses Individuum ist als ein Fall von Brustkrebs und ein Fall von Eierstockkrebs gezählt.

Die Logarithmus der Chancen-(logarithm of the odds – LOD)-Scores bei diesen Stämmen rangierten im Bereich von 9,49 bis –0,44 für einen Satz von Markern in 17q21. Vier der Familien weisen überzeugende LOD-Scores für die Verknüpfung auf, und vier weisen gering positive oder negative LCD-Scores auf. Die letzteren Stämme wurden aufgenommen, da sie bei zumindest drei betroffenen Mitgliedern einen geteilten Haplotyp bei Chromosom 17q21 zeigen. Darüber hinaus zeigen alle Stämme in der Gruppe einen früh auftretenden Brustkrebs, und vier der Stämme umfassen mindestens einen Fall von Eierstockkrebs, beides Kennzeichen der BRCA1-Stämme. Ein Stamm, 2082, weist ein nahezu gleiches Vorkommen von Brust- und Eierstockkrebs auf, was in Anbetracht der relativen Seltenheit von Eierstockkrebs in der Bevölkerung ungewöhnlich ist. Alle Stämme außer zweien wurden in Utah ermittelt. K2035 stammt aus dem mittleren Westen. K2099 ist ein afroamerikanischer Stamm aus dem Süden der USA.

Beim Ausgangs-Screening auf prädisponierende Mutationen in BRCA1 wurde DNA von einem Individuum, das den prädisponierenden Haplotyp trägt, in jedem Stamm getestet. Die 23 kodierenden Exons und assoziierten Spleiß-Verbindungsstellen wurden entweder aus genomischen DNA-Proben oder aus von Lymphozyt-mRNA präparierter cDNA amplifiziert. Wurden die amplifizierten DNA-Sequenzen zur Wildtyp-Sequenz verglichen, so wurde bei vier der acht Familienstamm-Proben ein Gehalt an Sequenz-Varianten gefunden (Tabelle 11). TABELLE 11 PRÄDISPONIERENDE MUTATIONEN

Stamm Nr.	Mutation	Kodierende Wirkung	Lokalisation*
2082	C → J	Gln → Stop	4056
1910	extra C	Frameshift	5385
2099	T → G	Met → Arg	5443
2035	?	Verlust von Transkript
1901	11 bp Deletion	Frameshift	189

*In Sequenz ID. Nr. 1

Alle vier Sequenz-Varianten sind heterozygot, wobei jede bei lediglich einem der Stämme auftaucht. Stamm 2082 enthält eine Nonsense-Mutation in Exon 11 (9A), Stamm 1910 enthält eine einzelne Nukleotid-Insertion in Exon 20 (9B) und Stamm 2099 enthält eine Missense-Mutation in Exon 21, was zu einer Met → Arg-Substitution führt. Die Frameshift- und Nonsense-Mutationen wirken sich wahrscheinlich zerstörend auf die Funktion des BRCA1-Produkts aus. Das durch das Frameshift-Allel in Stamm 1910 kodierte Peptid enthält eine veränderte Aminosäure-Sequenz, beginnend 108 Reste vom Wildtyp-C-Terminus entfernt. Das durch das Frameshift-Allel in Stamm 1901 kodierte Peptid enthält eine veränderte Aminosäure-Sequenz, beginnend mit dem 24sten Rest vom Wildtyp-N-Terminus entfernt. Das mutante Allel in Stamm 2082 kodiert für ein Protein, dem 551 Reste von C-Terminus fehlen. Die bei Stamm 2099 beobachtete Missense-Substitution ist potentiell zerstörend, da sie die Ersetzung einer kleinen hydrophoben Aminosäure (Met) durch einen großen geladenen Rest (Arg) bewirkt. Elf häufige Polymorphismen wurden ebenfalls identifiziert, davon acht in kodierender Sequenz und drei in Introns.
Das in Stamm 2035 untersuchte Individuum enthält offensichtlich eine regulatorische Mutation in BRCA1. In ihrer cDNA erschien eine polymorphe Stelle (A → G bei Base 3667) als homozygot, wohingegen ihre genomische DNA eine Heterozygotie an dieser Position aufzeigte (9C). Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist die, dass mRNA aus ihrem mutieren BRCA1-Allel aufgrund einer Mutation, die ihre Produktion oder Stabilität beeinflusst, abwesend ist. Diese Möglichkeit wurde durch Untersuchung fünf polymorpher Stellen in der BRCA1-kodierenden Region, die durch bis zu 3,5 kb im BRCA1-Transkript voneinander getrennt sind, weiter erforscht. In allen Fällen erschien dort, wo ihre genomische DNA für einen Polymorphismus heterozygot zu sein schien, die cDNA homozygot. Bei Individuen aus anderen Stämmen und bei Nicht-Haplotyp-Trägern in Stamm 2035 konnten diese polymorphen Stellen als heterozygot in der cDNA beobachtet werden, was bedeutet, dass die Amplifikation aus cDNA nicht zugunsten eines Allels beeinflusst war. Diese Analyse zeigt auf, dass eine BRCA1-Mutation bei Stamm 2035 entweder die Transkription verhindert oder zu Instabilität oder abweichendem Spleißen des BRCA1-Transkripts führt.
Kosegregation von BRCA1-Mutationen mit BRCA1-Haplotypen und Populations-Häufigkeitsanalyse. Über die potentiell zerstörende Proteinfunktion hinaus müssen zwei Kriterien erfüllt sein, damit sich eine Sequenz-Variante als Kandidat einer prädisponierenden Mutation qualifiziert. Die Variante muss: 1) bei Individuen aus dem Stamm vorhanden sein, die den prädisponierenden BRCA1-Haplotyp tragen, wobei er bei anderen Mitgliedern des Stamms abwesend ist, und 2) in der Allgemeinbevölkerung selten sein.
Jede Mutation wurde auf die Kosegregation mit BRCA1 getestet. Für die Frameshift-Mutation bei Stamm 1910 wurden zwei andere Haplotyp-Träger und ein Nicht-Träger sequenziert (9B). Nur die Träger wiesen die Frameshift-Mutation auf. Der C gegen T-Austausch bei Stamm 2082 schuf eine neue AvrII-Restriktionsstelle. Weitere Träger und Nicht-Träger im Stamm wurden auf das Vorhandensein der Restriktionsstelle getestet (9A). Ein Allel-spezifisches Oligonukleotid (ASO) wurde zum Nachweis des Vorhandenseins der Sequenz-Variante bei Stamm 2099 entworfen. Verschiedene Individuen aus dem Stamm, von denen einige als Träger des mit dem prädisponierenden Allel verknüpften Haplotyps und andere als Nicht-Träger des assoziierten Haplotyps bekannt sind, wurden mittels ASO auf die zuvor im Stamm nachgewiesene Mutation gescreent. In jedem Stamm wurde das entsprechende mutante Allel bei Individuen nachgewiesen, die den BRCA1-assoziierten Haplotyp trugen, und war bei Nicht-Trägern nicht nachweisbar. Im Falle der potentiellen regulatorischen Mutation, die bei dem Individuum aus Stamm 2035 beobachtet wurde, wurde die cDNA und genomische DNA aus Trägern im Stamm auf die Heterozygotie an polymorphen Stellen verglichen. In jedem Fall wurde gezeigt, dass das zerstörte Allel in der cDNA-Probe auf dem Chromosom liegt, das das BRCA1-prädisponierende Allel trägt (9C).
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass es sich bei den Mutationen einfach um herkömmliche Polymorphismen in der Population handelte, wurden die ASOs für jede Mutation zum Screening eines Satzes normaler DNA-Proben verwendet. Schätzungen der Gen-Häufigkeit bei Kaukasiern basierten auf Zufallsproben aus der Bevölkerung von Utah. Schätzungen der Gen-Häufigkeit bei Afroamerikanern basierten auf Proben von 39 Afroamerikanern, die von M. Peracek-Vance bereitgestellt und von ihr in ihren Kopplungsstudien verwendet worden waren, und von 20 neugeborenen Afroamerikanern aus Utah. Keine der vier potentiellen prädisponierenden Mutationen wurde in der entsprechenden Kontrollpopulation festgestellt, was aufzeigt, dass sie in der Allgemeinbevölkerung selten sind. Folglich waren zwei wichtige Anforderungen an die BRCA1-Anfälligkeits-Allele durch die Kandidat-prädisponierenden Mutationen erfüllt: 1) die Kosegregation des mutanten Allels mit der Erkrankung und 2) die Abwesenheit des mutanten Allels in den Kontrollen, was auf eine geringe Gen-Häufigkeit in der Allgemeinbevölkerung hinweist.
Phänotypische Exprimierung von BRCA1-Mutationen. Die Auswirkung der Mutationen auf das BRCA1-Protein korrelierten mit Unterschieden bei der beobachteten phänotypischen Expression bei den BRCA1-Stämmen. Die meisten BRCA1-Stämme weisen ein mäßig erhöhtes Risiko für Eierstockkrebs auf, und lediglich eine kleinere Untergruppe weist ein hohes Risiko für Eierstockkrebs vergleichbar dem für Brustkrebs (Esston et al., 1993) auf. Drei der vier Stämme, bei denen BRCA1-Mutationen nachgewiesen wurden, fallen in die erstere Kategorie, während die vierte (K2082) in die Gruppe mit hohem Risiko für Eierstockkrebs fällt. Da die bei K2082 gefundene BRCA1-Nonsense-Mutation näher am Amino-Terminus liegt als die anderen nachgewiesenen Mutationen, könnte erwartet werden, dass sie einen unterschiedlichen Phänotyp aufweist. Tatsächlich erzeugt die Stamm-K2082-Mutation ein hohes Vorkommen von Eierstockkrebs und ein späteres Durchschnittsalter bei der Diagnose von Brustkrebsfällen als die anderen Stämme (Goldgar et al., 1994). Dieser Altersunterschied beim Auftreten könnte auf einen Ermittlungsfehler bei den kleineren, höher penetrierten Familien rückführbar sein oder könnte Gewebe-spezifische Unterschiede im Verhalten der BRCA1-Mutationen Wiederspiegeln. Die anderen drei Stämme, bei denen sich bekannte BRCA1-Mutationen aufspalten, weisen im Durchschnitt einen Fall von Eierstockkrebs pro 10 Fällen von Brustkrebs auf, doch zeigen einen hohen Anteil an im Alter von Ende 20 oder Anfang 30 diagnostizierten Fällen von Brustkrebs. Stamm 1910, der eine Frameshift-Mutation aufweist, ist bemerkenswert, da drei der vier betroffenen Individuen beidseitigen Brustkrebs hatten, wobei in jedem Fall der zweite Tumor innerhalb eines Jahres nach Auftreten des ersten diagnostiziert worden waren. Bei Stamm 2035, bei dem sich eine potentielle regulatorische BRCA1-Mutation aufspaltet, wäre ebenfalls das Vorhandensein eines dramatischen Phänotyps zu erwarten. Achtzig Prozent der Fälle von Brustkrebs in diesem Stamm treten unter 50 Jahre auf. Diese Zahl ist ebenso hoch wie jede andere in der Gruppe, was ein BRCA1-mutantes Allel von hoher Penetranz nahe legt (Tabelle 10).
Obschon die oben beschriebenen Mutationen eindeutig zerstörerisch sind, indem sie Brustkrebs bei Frauen in sehr jungen Jahren bewirken, umfasst jeder der vier Stämme mit Mutationen mindestens eine Frau, die die Mutation trägt, doch bis zum Alter von 80 Jahren lebte, ohne eine Malignität entwickelt zu haben. Für künftige Studien wird es von äußerster Wichtigkeit sein, weitere genetische oder umweltbedingte Faktoren zu identifizieren, die die Auswirkungen der BRCA1-Mutationen verbessern können.
Bei vier der acht vermuteten BRCA1-gekoppelten Stämme wurden keine potentiellen prädisponierenden Mutationen festgestellt. Drei dieser vier weisen LOD-Scores für BRCA1-gekoppelte Marker von weniger als 0,55 auf. Folglich mag es sein, dass sich bei diesen Stämmen die BRCA1-prädisponierenden Allele tatsächlich nicht aufspalten. Alternativ dazu mag es sein, dass die Mutationen bei diesen vier Stämmen in Regionen des BRCA1 liegen, die z. B. den Umfang an Transkripten beeinflussen und daher bis jetzt dem Nachweis entgangen sind.
Rolle des BRCA1 bei Krebs. Die meisten bis heute identifizierten Tumor-Suppressorgene lassen Proteinprodukte entstehen, die nicht vorhanden, nicht-funktionell oder funktionsreduziert sind. Bei der Mehrzahl der TP53-Mutationen handelt es sich um Missense-Mutationen; von einigen davon wurde gezeigt, dass sie abnormale p53-Moleküle produzieren, die in die Funktion des Wildtyp-Produkts eingreifen (Shaulian et al., 1992; Srivastava et al., 1993). Ein ähnlich dominanter negativer Wirkmechanismus wurde für einige adenomatöse Polyposis coli-(APC)-Allele, die beschnittene Moleküle erzeugen (Su et al., 1993), und für Punktmutationen im Wilms-Tumorgen (WT1) vorgeschlagen, die die DNA-Bindung an das Protein verändern (Little et al., 1993). Die Natur der Mutationen, die in der BRCA1-kodierenden Sequenz beobachtet wurden, stimmt mit der Produktion entweder dominant negativer Proteine oder nicht-funktioneller Proteine überein. Die in Stamm 2035 gefolgerte regulatorische Mutation kann nicht eine dominant negative sein; wahrscheinlicher ist es, dass diese Mutation eine Verminderung oder den vollständigen Verlust der BRCA1-Expression vom betroffenen Allel bewirkt.
Das BRCA1-Protein enthält eine C₃HC₄-Zinkfinger-Domäne ähnlich der, wie sie in zahlreichen DNA-bindenden Proteinen anzutreffen und mit der Zink-abhängigen Bindung an Nukleinsäuren verwickelt ist. Die ersten 180 Aminosäuren von BRCA1 enthalten fünf basische Reste mehr als saure Reste. Im Gegensatz dazu ist der Rest des Moleküls bei einem Nettoüberschuss von 70 sauren Resten sehr sauer. Die überschüssige negative Ladung konzentriert sich besonders nahe dem C-Terminus. Daher besteht eine Möglichkeit darin, dass BRCA1 für einen Transkriptionsfaktor mit einer N-terminalen DNA-Bindungsdomäne und einer C-teminalen transaktivierenden „sauren Blob”-Domäne kodiert. Interessanterweise enthält ein anderes hereditär bedingtes Tumor-Suppressorgen, WT1, ebenfalls ein Zinkfinger-Motiv (Haber et al., 1990). Viele Krebs-prädisponierenden Mutationen in WT1 verändern die Zinkfinger-Domänen (Little et al., 1993; Haber et al., 1990; Little et al., 1992). WT1 kodiert für einen Transkriptionsfaktor, und alternatives Spleißen der Exons, die für Teile der Zinkfinger-Domänen kodieren, verändern die DNA-bindenden Eigenschaften der WT1 (Bickmore et al., 1992). Einige alternativ gespleißte Formen von WT1-mRNA erzeugen Moleküle, die als Transkriptions-Repressoren wirken (Drummond et al., 1994). Einige BRCA1-spleißten Varianten können das Zinkfinger-Motiv verändern und dabei die Möglichkeit entstehen lassen, dass ein regulatorischer Mechanismus ähnlich dem, der bei WT1 vorkommt, auf BRCA1 zutreffen kann.
BEISPIEL 9
Analyse von Tumoren auf BRCA1-Mutationen
Um die Analyse auf Tumoren zu fokussieren, die mit größter Wahrscheinlichkeit BRCA1-Mutationen enthalten, wurden Brust- und Eierstock-Primärkarzinome für LOH in der BRCA1-Region typisiert. Drei hochgradig polymorphe, einfache Tandem-Repeat-Marker wurden zur Beurteilung des LOH verwendet: D17S1323 und D17S855, die intragen bei BRCA1 sind, und D17S1327, das etwa 100 kb distal zu BRCA1 liegt. Die kombinierte LOH-Häufigkeit in informativen Fällen (d. h. dort, wo die Keimbahn heterozygot war) betrug 32/72 (44%) bei den Brustkarzinomen und 12/21 (57%) bei den Eierstockkarzinomen, was mit früheren Messungen des LOH in der Region übereinstimmt (Futreal et al., 1992b; Jacobs et al., 1993; Sato et al., 1990; Eccles et al., 1990; Cropp et al., 1994). Die Analyse definierte in dieser Weise ein Panel von 32 Brusttumoren und 12 Eierstocktumoren von gemischtem Rassen- und Alters-Ursprung des Auftretens für die Untersuchung auf die BRCA-Mutationen. Die vollständige kodierende Region von 5.589 bp und die Intron/Exon-Begrenzungs-Sequenzen des Gens wurden in diesem Tumorsatz durch direkte Sequenzierung allein oder durch eine Kombination von Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCA) und direkter Sequenzierung gescreent.

Insgesamt sechs Mutationen wurden festgestellt, eine bei einem Eierstocktumor, vier bei Brusttumoren und eine bei einem männlichen unbetroffenen Haplotyp-Träger (Tabelle 12). Eine Mutation, Glu1541Ter, führte ein Stopcodon ein, das ein beschnittenes Protein schuf, dem 273 Aminosäuren am Carboxy-Terminus fehlten. Darüber hinaus wurden zwei Missense-Mutationen identifiziert. Bei diesen handelt es sich um Ala1708Glu und Met1775Arg, die Substitutionen kleiner, hydrophober Reste durch geladene Reste umfassen. Patienten 17764 und 19964 stammen von derselben Familie. Bei Patient OV24 ist Nukleotid 2575 deletiert, und bei Patienten 17764 und 19964 sind Nukleotide 2993–2996 deletiert. TABELLE 12 Prädisponierende Mutationen

Patient	Codon	Nukleotid-Austausch	Aminosäure-Austausch	Alter bei Ausbruch	Familiengeschichte
BT098	1541	GAG → TAG	Glu → Stop	39	-
OV24	819	1 bp Deletion	Frameshift	44	-
BT106	1708	GCG → GAG	Ala → Glu	24	+
MC44	1775	ATG → AGG	Met → Arg	42	+
17764	958	4 bp Deletion	Frameshift	31	+
19964	958	4 bp Deletion	Frameshift		+*

*Nicht-betroffener Haplotyp-Träger, männlich

Verschiedene Beweisstränge legen nahe, dass alle fünf Mutationen BRCA1-Anfälligkeits-Allele repräsentieren:

(i) alle Mutationen liegen in der Keimbahn vor;
(ii) alle sind in geeigneten Kontrollpopulationen abwesend, was vermuten lässt, dass sie keine häufig anzutreffenden Polymorphismen sind;
(iii) jedes mutante Allel ist im Tumor erhalten, wie bei Tumoren aus Patienten der Fall, die zu Stämmen gehören, bei denen sich die BRCA1-Anfälligkeits-Allele aufspalten (Smith et al., 1992; Kelsell et al., 1993) (stünden die Mutationen für neutrale Polymorphismen, so sollten sie in lediglich 50% der Fälle erhalten bleiben);
(iv) das Alter des Ausbruchs bei den vier Fällen von Brustkrebs mit Mutationen variierte zwischen 24 und 42 Jahren, was mit dem frühen Alter des Ausbruchs von Brustkrebs bei Individuen mit BRCA1-Anfälligkeit übereinstimmt; entsprechend erfolgte die Diagnose des Falls von Eierstockkrebs mit 44 Jahren, einem Alter, das unter die jüngsten 13% aller Fälle von Eierstockkrebs fällt; und schließlich
(v) drei der fünf Fälle weisen Brust- oder Eierstockkrebs-positive Familiengeschichten auf, wie rückblickend in ihren Krankenberichten festgestellt, obschon die Tumorgruppe nicht bezüglich dieses Kriteriums ausgewählt wurde.

Bei BT106 wurde im Alter von 24 Jahren Brustkrebs diagnostiziert. Ihre Mutter hatte Eierstockkrebs, ihr Vater ein Melanom und ihre Großmutter väterlicherseits ebenfalls Brustkrebs. Patientin MC44, eine Afroamerikanerin, hatte beidseitigen Brustkrebs im Alter von 42 Jahren. Diese Patientin hatte eine Schwester, die im Alter von 34 Jahren an Brustkrebs starb, eine andere Schwester, die an einem Lymphom starb, und einen Bruder, der an Lungenkrebs starb. Ihre Mutation (Met1775Arg) war zuvor bei Stamm 2099 nachgewiesen worden, einer afroamerikanischen Familie, bei der sich ein BRCA1-Anfälligkeits-Allel aufspaltete, was bei afroamerikanischen und kaukasischen Kontrollen abwesend war. Patientin MC44 ist nach unserer Kenntnis nicht mit Stamm 2099 verwandt. Der Nachweis eines seltenen mutanten Allels, einmal bei einem BRCA1-Stamm und einmal in der Keimbahn eines offensichtlich nicht verwandten Falles von früh auftretendem Brustkrebs, legt nahe, dass die Met1775 Arg-Veränderung eine häufig auftretende prädisponierende Mutation bei Afroamerikanern sein kann. Kollektiv gesprochen zeigen diese Beobachtungen auf, dass alle vier BRCA1-Mutationen in Tumoren Anfälligkeits-Allele repräsentieren; in den analysierten Proben wurden keine somatischen Mutationen nachgewiesen.
Die geringe Zahl der somatischen BRCA1-Mutationen ist in Anbetracht der Häufigkeit von LOH auf 17q und der üblichen Rolle der Anfälligkeits-Gene als Tumorsuppressoren in der Krebsentwicklung unerwartet. Dies sind drei mögliche Erklärung für dieses Ergebnis: (i) Einige BRCA1-Mutationen in kodierenden Sequenzen wurden mit unserem Screening-Verfahren übersehen; (ii) somatische BRCA1-Mutationen liegen primär außerhalb der kodierenden Exons; und (iii) LOH-Ereignisse bei 17q spiegeln nicht somatische BRCA1-Mutationen wieder.
Wären somatische BRCA1-Mutationen tatsächlich bei Brust- und Eierstockkarzinomen selten, so hätte dies in hohem Maße Folgen für die Biologie der BRCA1. Das offensichtliche Fehlen somatischer BRCA1-Mutationen lässt folgern, dass es einen grundlegenden Unterschied bei der Entstehung von Tumoren bei genetisch prädisponierten BRCA1-Trägern im Vergleich zu Tumoren bei der Allgemeinbevölkerung geben kann. Z. B. können Mutationen bei BRCA1 eine Wirkung lediglich auf die Tumorbildung in einem spezifischen frühen Stadium der Brust- und Eierstockentwicklung haben. Diese Möglichkeit stimmt mit einer Primärfunktion von BRCA1 bei prämenopausalem Brustkrebs überein. Solch ein Modell für die Rolle des BRCA1 bei Brust- und Eierstockkrebs sagt eine Wechselwirkung zwischen Reproduktionshormonen und der BRCA1-Funktion voraus. Allerdings wurden keine klinischen oder pathologischen Unterschiede bei familiären versus sporadischen Brust- und Eierstocktumoren außer dem Alter des Auftretens beschrieben (Lynch et al., 1990). Andererseits mag der kürzlich erfolgte Befund einer verstärkten TP53-Mutation und Mikrosatelliten-Instabilität bei Brusttumoren von Patienten mit einer Familiengeschichte mit Brustkrebs (Glebov et al., 1994) einen gewissen Unterschied bei den Tumoren widerspiegeln, die bei genetisch prädisponierten Personen auftreten. Die Beteiligung von BRCA1 an diesem Phänomen kann jetzt direkt angesprochen werden. Alternativ dazu kann das Fehlen somatischer BRCA1-Mutationen die Folge des Vorhandenseins multipler Gene sein, die auf derselben Bahn der Tumorsuppression wie BRCA1 wirken, doch die insgesamt ein bevorzugteres Ziel für eine Mutation bei sporadischen Tumoren darstellen. Da die Mutation eines einzelnen Elements in einer genetischen Bahn allgemein ausreicht, um die Bahn zu spalten, könnte BRCA1 bei einer Rate mutieren, die viel geringer ist als die Summe der Mutationsraten der anderen Elemente.

Eine separate Studie zur Analyse von Tumoren auf BRCA1-Mutationen wurde in Japan vorgenommen. Ein Panel von 103 Patienten, zusammengesetzt aus früh aufgetretenen Fällen (im Alter von < 35 Jahren) (46 Patienten), Mitgliedern vielfach betroffener Familien (12 Patienten) und/oder Personen mit beidseitig entstandenem Brustkrebs (59 Patienten) wurden auf Mutationen im BRCA1 gescreent. Primäre Brusttumoren dieser Patienten wurden auf Mutationen in kodierenden Exons des BRCA1 unter Anwendung einer Analyse mit einem einzelsträngigen Konformations-Polymorphismus (SSCP) gescreent. Für Exon 11, das 3425 bp lang ist, wurden PCR-Primer zur separaten Amplifizierung von elf überlappenden Segmenten dieses Exons entworfen. Jedes der anderen 22 Exons wurde individuell in einer einzelnen PCR amplifiziert. So wurden 33 PCR-SSCP-Analysen für jeden Fall vorgenommen. Mutationen wurden in den Tumoren von vier Patienten nachgewiesen, die alle beidseitig Brustkrebs entwickelt hatten (Tabelle 12A). Eine Mutation führte zu einem Frameshift aufgrund einer 2-bp-Deletion (Deletion von AA) bei Codon 797. Dies ergibt ein beschnittenes Protein, dem 1065 Aminosäuren am COOH-Terminus fehlen. Eine zweite Mutation bestand in einer Nonsense-Mutation bei Codon 1214 aufgrund einer G → T-Transversion des ersten Nukleotids des Codons. Dies ergibt ein verfrühtes Stopcodon anstelle der Glutaminsäure an dieser Stelle und führt zu einem beschnittenen Protein, dem 649 Aminosäuren am COOH-Terminus fehlen. Es lagen außerdem zwei Missense-Mutationen vor. Eine bestand in einer G → A-Transition am ersten Nukleotid des Codons 271, was zu einer Val → Met-Substitution führte. Die zweite lag bei Codon 1150 vor (eine C → T-Transition im ersten Nukleotid des Codons), was zu einer Pro → Ser-Substitution führte, einer Ersetzung einer hydrophoben nichtpolaren Aminosäure durch eine polare ungeladene Aminosäure. Diese Mutationen wurden alle als Keimbahn-Mutationen befunden. Das durchschnittliche Alter des Auftretens betrug bei diesen vier Patienten 49 Jahre. Bei dieser Studie wurde auch ein gemeinsamer neutraler Polymorphismus von entweder C oder T am ersten Nukleotid des Codons 771 festgestellt. TABELLE 12A Prädisponierende Mutationen

Patient	Codon	Nukleotidaustausch	Aminosäureaustausch	Alter des Auftretens
23	1150	CCT → TCT	Pro → Ser	49 & 64
44	1214	GAG → TAG	Glu → Stop	51 & 51
98	271	GTG → ATG	Val → Met	45 & 45
100	797	2 bp Deletion	Frameshift	50 & 71
5	482–483	4 bp Deletion	Frameshift	45
6	856	TAT → CAT	Tyr → His	54
7	271	GTG → ATG	Val → Met	49 & 49
8	852	1 bp Deletion	Frameshift	62

Zwar weisen Patienten 98 und 7 dieselbe Mutation auf, doch sind sie nicht miteinander verwandt.
BEISPIEL 10
Analyse des BRCA1-Gens
Die Struktur und Funktion des BRCA1-Gens wird gemäß der folgenden Methoden bestimmt.
Biologische Studien. Säuger-Expressionsvektoren, die BRCA1-cDNA enthalten, werden konstruiert und in geeignete Brustkarzinomzellen mit Läsionen im Gen transfiziert. Es wird sowohl Wildtyp-BRCA1-cDNA als auch veränderte BRCA1-cDNA verwendet. Die veränderte BRCA1-cDNA kann aus veränderten BRCA1-Allelen erhalten oder wie unten beschrieben erzeugt werden. Die phänotypische Reversion in Kulturen (z. B. Zeltmorphologie, Verdopplungszeit, Verankerungs-unabhängiges Wachstum) und in Tieren (z. B. Tumorgenität) wird untersucht. Die Studien verwenden sowohl Wildtyp- als auch mutante Formen (Sektion B) des Gens.
Molekulargenetische Studien. Eine in vitro-Mutagenese wird zur Konstruktion von Deletions-Mutanten und Missense-Mutanten (durch einzelne Basenpaar-Substitutionen in individuellen Codons und → Alanin geladener Cluster-Scanning-Mutagenese) vorgenommen. Die Mutanten werden in biologischen, biochemischen und biophysikalischen Studien angewandt.
Mechanismusstudien. Die Bindungsfähigkeit von BRCA1-Protein an bekannte und unbekannte DNA-Sequenzen wird untersucht. Seine Fähigkeit zur Transaktivierung von Promotoren wird mittels vorübergehender Reporter-Expressionssysteme in Säugerzellen analysiert. Herkömmliche Verfahrensweisen wie das Einfangen von Partikeln und Hefe-Doppelhybrid-System werden zur Entdeckung und Identifizierung jeglicher funktioneller Partner angewandt. Die Beschaffenheit und Funktionen der Partner werden charakterisiert. Diese Partner wiederum sind Ziele für die Findung von Wirkstoffen.
Strukturelle Studien. Rekombinante Proteine werden in E. coli, Hefe, Insekten und/oder Säugerzellen erzeugt und in kristallographischen und NMR-Studien verwendet. Auch eine Molekular-Modellerstellung der Proteine wird angewandt. Diese Studien erleichtern das Struktur-bezogene Wirkstoff-Design.
BEISPIEL 11
Zweistufiger Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von BRCA1 in einer Probe
Eine Patientenprobe wird gemäß dem von Antonarakis et al. (1985) beschriebenen Verfahren aufgearbeitet, durch ein 1%iges Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran für die Southern-Blot-Analyse übertragen. Die Membranen werden bei 150 mJ unter Verwendung eines GS-Gen-Linkers (Bio-Rad) UV-vernetzt. Eine BRCA1-Sonde entsprechend den Nukleotid-Positionen 3631–3930 der SEQ ID NO: 1 wird in pTZ18U subkloniert. Die Phagemiden werden in E. coli MV1190, infiziert mit M13KO7-Helfer-Phage (Bio-Rad, Richmond, CA) transformiert. Einzelsträngige DNA wird gemäß standardmäßiger Verfahrensweisen isoliert (siehe Sambrook et al. 1989).
Die Blots werden über 15 bis 30 Minuten hinweg bei 65°C in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS) in 0,5 M NaPO₄ vorhybridisiert. Die Methoden folgen den von Nguyen et al., 1992 beschriebenen Methoden. Die Blots werden über Nacht bei 65°C in 7% SDS, 0,5 M NaPO₄ mit 25 bis 50 ng/ml einzelsträngiger Sonden-DNA hybridisiert. Die Waschgänge nach der Hybridisierung bestehen in zwei 30minütigen Spülungen in 5% SDS, 40 mM NaPO₄ bei 65°C, gefolgt von zwei 30minütigen Spülungen in 1% SDS, 40 mM NaPO₄ bei 65°C.
Als Nächstes werden die Blots mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 6,8) über 5 Minuten hinweg bei Raumtemperatur gespült und mit 0,2% Casein in PBS über 30 bis 60 Minuten hinweg bei Raumtemperatur inkubiert und in PBS 5 Minuten lang gespült. Die Blots werden dann 5 bis 10 Minuten lang in einem Schüttelwasserbad bei 45°C mit Hybridisierungs-Puffer, bestehend aus 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl und 5 × Denhardtsche Lösung, vorinkubiert (siehe Sambrook et al., 1989). Der Puffer wird entfernt und durch 50 bis 75 μl/cm² frischen Hybridisierungs-Puffer, plus 2,5 nM des kovalent vernetzten Oligonukleotid/alkalische Phosphatase-Konjugats mit der zur universalen Primerstelle (UP-AP, Bio-Rad) komplementären Nukleotid-Sequenz, ersetzt. Die Blots werden 20 bis 30 Minuten lang bei 45°C hybridisiert und die Waschvorgänge nach der Hybridisierung als zwei zehnminütige Spülungen in 6 M Harnstoff, 1 × standardmäßiges Kochsalzcitrat (SSC), 0,1% SDS, und eine 10minütige Spülung in 1 × SSC, 0,1% Triton^® X-100 bei 45°C inkubiert. Die Blots werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 × SSC gespült.
Die Blots werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln im Substrat-Puffer, bestehend aus 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl₂, 0,02% Natriumazid, pH 10,0, inkubiert. Einzelne Blots werden in hitzeversiegelbare Beutel mit Substrat-Puffer und 0,2 mM AMPPD (3-(2'-Spirodamantan)-4-methoxy-4-(3'- phophoryloxy)phenyl-1,2-dioxetan, Dinatriumsalz, Bio-Rad) eingebracht. Nach einer 20minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wird die überschüssige AMPPD-Lösung entfernt. Der Blot wird über Nacht Röntgen-Bestrahlung ausgesetzt. Positive Banden weisen auf das Vorhandensein von BRCA1 hin.
BEISPIEL 12
Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen BRCA1
Segmente der BRCA1-kodierenden Sequenz wurden als Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wurde mittels Gelelution gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen unter Anwendung einer ähnlichen Verfahrensweise wie bei Harlow und Lane, 1988, beschrieben, verwendet. Von dieser Verfahrensweise wurde gezeigt, dass sie Antikörper gegen verschiedene andere Proteine erzeugt (siehe z. B. Kraemer et al., 1993).
Kurz gesagt wurde eine Strecke der BRCA1-kodierenden Sequenz als ein Fusionsprotein in Plasmid-PET5A kloniert (Novagen, Inc., Madison, WI). Die Sequenz mit eingebautem BRCA1 umfasst die Aminosäuren entsprechend #1361–1554 der SEQ ID NO: 2. Nach Induktion mit IPTG wurde die Überexpression eines Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht mittels SDS/PAGE verifiziert. Das Fusionsprotein wurde aus dem Gel mittels Elektroelution ausgereinigt. Die Identifikation des Proteins als das BRCA1-Fusionsprodukt wurde mittels Protein-Sequenzierung am N-Terminus verifiziert. Als Nächstes wurde das gereinigte Protein als Immunogen bei Kaninchen verwendet. Die Kaninchen wurden mit 100 μg des Proteins in kompletter Freund-Adjuvans immunisiert, wobei sie zweimal in dreiwöchigen Intervallen Auffrischungen zunächst mit 100 μg Immunogen in inkomplettem Freund-Adjuvans, gefolgt von 100 μg Immunogen in PBS, erhielten. Das Antikörper-haltige Serum wurde zwei Wochen später entnommen.
Diese Verfahrensweise wird zur Erzeugung von Antikörpern gegen die mutanten Formen des BRCA1-Gens wiederholt. Diese Antikörper, in Verbindung mit Antikörpern zum Wildtyp-BRCA1, werden zum Nachweis des Vorhandenseins und der relativen Menge der mutanten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Flüssigkeiten verwendet.
BEISPIEL 13
Erzeugung von BRCA1-spezifischen monoklonalen Antikörpern
Monoklonale Antikörper werden gemäß dem folgenden Protokoll erzeugt. Mäuse werden mit Immunogen, umfassend intakte BRCA1 oder BRCA1-Peptide (Wildtyp oder mutant) in Konjugation an Napfschnecken-Hämocyanin unter Verwendung von Glutaraldehyd oder EDC immunisiert, wie wohlbekannt.
Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10 bis 100 μg Immunogen, woraufhin nach der vierten Injektion Blutproben von den Mäusen genommen werden, um zu bestimmen, ob das Serum Antikörper gegen das Immunogen enthält. Der Serumtiter wird mittels ELISA oder RIA bestimmt. Mäuse mit Seren, die auf das Vorhandensein von Antikörper gegen das Immunogen hinweisen, werden für die Hybridom-Erzeugung ausgewählt.
Immunen Mäusen werden die Milzen entnommen und es wird eine Einzelzell-Suspension zubereitet (siehe Harlow und Lane, 1988). Es werden Zellfusionen vorgenommen, wie im Wesentlichen beschrieben bei Kohler und Milstein, 1975. Kurz gesagt werden P3.63.3-Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) mit immunen Milzzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol vereinigt, wie beschrieben bei Harlow und Lane, 1988. Die Zellen werden bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well in 96-Well-Gewebekulturplatten ausplattiert. Einzelne Wells werden auf das Wachstum untersucht und die Überstände der Wells mit Wachstum auf das Vorhandensein von BRCA1-spezifischen Antikörpern mittels ELISA oder RIA unter Verwendung von Wildtyp- oder mutantem BRCA1-Zielprotein getestet. Die Zellen in positiven Wells werden zur Feststellung und Bestätigung der Monoklonalität expandiert und subkloniert.
Die Klone mit den gewünschten Spezifitäten werden als Aszites in Mäusen oder in einem Hohlfasersystem expandiert und gezüchtet, um ausreichende Mengen an Antikörpern für die Charakterisierung und Assay-Entwicklung zu erzeugen.
BEISPIEL 14
Sandwich-Assay für BRCA1
Monoklonaler Antikörper wird an eine feste Oberfläche, wie z. B. eine Platte, ein Röhrchen, ein Kügelchen oder einen Partikel, gebunden. Vorzugsweise wird der Antikörper an die Well-Oberfläche einer 96-Well-ELISA-Platte gebunden. Eine 100-μl-Probe (z. B. Serum, Urin, Gewebecytosol), enthaltend das BRCA1-Peptid/Protein (Wildtyp oder mutant) wird dem Festphasen-Antikörper zugegeben. Die Probe wird zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wird die Probenflüssigkeit abgeschöpft und die Festphase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. 100 μl eines zweiten monoklonalen Antikörpers (gegen eine unterschiedliche Determinante auf dem BRCA1-Peptid/Protein) wird der Festphase zugegeben. Dieser Antikörper wird mit einem Detektor-Molekül (z. B. ¹²⁵I, Enzym, Fluorophor oder ein Chromophor) markiert und die Festphase mit dem zweiten Antikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird abgeschöpft und die Festphase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Die Menge an gebundener Markierung, die proportional zur Menge an in der Probe vorhandenem BRCA1-Peptid/Protein ist, wird quantifiziert. Separate Assays werden unter Verwendung monoklonaler Antikörper vorgenommen, die spezifisch für das Wildtyp-BRCA1 sind, als auch monoklonaler Antikörper, die spezifisch für jede der in BRCA1 identifizierten Mutationen sind, vorgenommen.
BEISPIEL 15
Analyse der BRCA1-Mutationen
Die DNA-Proben, die auf BRCA1-Mutationen gescreent wurden, wurden aus Blut- oder Tumorproben von Patienten mit Brust- oder Eierstockkrebs (oder bekannten Trägern mittels Haplotyp-Analyse) extrahiert, die an Forschungsstudien zur Genetik von Brustkrebs teilnahmen. Alle Patienten unterschrieben die entsprechende Einverständniserklärung des Patienten. In Tabelle 13 sind die Anzahl der Proben, die Auswertungskriterien und die Screeningmethoden für jeden gescreenten Probensatz aufgelistet.
Obschon die bei Miki et al., 1994, beschriebenen ursprünglichen Mutationen durch Screening der cDNA nachgewiesen wurden, wurden 25 Paare intronischer PCR-Primer zur Amplifikation der gesamten kodierenden Sequenz und der Spleißstellen aus genomischer DNA für den Großteil der verbliebenen Proben verwendet. Eine auf den neuesten Stand gebrachte Primer-Information steht öffentlich zur Verfügung über anonymen ftp von morgan.med.utah.edu im Verzeichnis pub/BRCA1. Wo möglich, wurden DNA-Sequenz-Variationen auf eine Kosegregation mit Brust- oder Eierstockkrebs in der Familie getestet. Ein weiterer Nachweis einer kausalen Rolle einer Sequenz-Variante bei Krebs wurde dadurch erbracht, dass für das Nichtvorhandensein einer mutmaßlichen Mutation bei einer Gruppe von Kontrollpersonen gesorgt wurde. Das Screening auf spezifische, zuvor identifizierte Mutationen bei großen Sätzen ausgewählter Proben wurde unter Anwendung der ASO-Hybridisierung vorgenommen.

In Tabelle 14 sind viele der beim Screening der gesamten BRCA1-kodierenden Sequenz als auch der Exon/Intron-Grenzen und durch Auffinden der polymorphen Stellen in der genomischen DNA, reduziert zu monomorphen Stellen in cDNA, aufgefundenen Mutationen beschrieben. Zwei häufige Mutationen wurden festgestellt, wobei ihre Häufigkeit in anderen Proben mittels ASO-Analyse untersucht wurde (Tabelle 15). In Tabellen 16 und 17 ist die Verteilung der Mutationen nach Art bzw. Lokation innerhalb der BRCA1-kodierenden Sequenz beschrieben. Bei weitem die meisten der identifizierten Mutationen waren Frameshift-Mutationen. Pauschal gesagt wurde keine statistisch signifikante Abweichung von der Zufallsverteilung über die gesamte kodierende Sequenz des BRCA1 (χ² = 2,00, 2 df, p = 0,37) unter den verschiedenen, bisher in der kodierenden Sequenz von BRCA1 gefundenen Mutationen festgestellt.

TABELLE 15 Häufigkeit zweier häufiger BRCA1-Mutationen

	Untersuchte	Zahl der festgestellten Mutationen
Satz	Anzahl	185 del Ag	5382 ins C
USC-1	59	4	1
MSK/UT-2	109	3	0
GLASGOW-2	100	nicht getestet	3
GLASGOW-3	100	nicht getestet	2
CRV-OV	250	nicht getestet	1

TABELLE 16 Beobachtete Häufigkeit der verschiedenen Mutationsarten

	Anzahl (Prozent)
Mutationsart	Verschiedene Mutationen¹	Alle Mutationen²
Frameshift	42(65)	81(72)
Nonsense	10(16)	13(12)
Missense	9(14)	14(12)
andere	3(5)	5(4)

¹Identische Mutationen wurden für diese Spalte jeweils nur einmal gezählt.
²Für diese Spalte wurde jede Probe, in der eine Mutation identifiziert wurde, gezählt.

	Aminosäuren
Mutationen	1–621	622–1242	1243–1863
verschiedene	18	23	21
alle	44	28	39

In vielen verschiedenen Regionen des Gens wurden Mutationen festgestellt, wobei phänotypisch schwerwiegende Mutationen sowohl am extremen 5'-Ende des BRCA1 als auch im extremen 3'-Abschnitt des Gens gefunden wurden. Bei einer solchen Mutation, die bei einer Familie mit sieben früh aufgetretenen Fällen von Brustkrebs festgestellt wurde, wird ein Protein erzeugt, dem lediglich die 10 endständigen Aminosäuren fehlen, was darauf hinweist, dass diese Region des BRCA1 eine Rolle bei der normalen Genfunktion spielt. Bemerkenswert ist, dass die überwältigende Mehrheit der Veränderungen im BRCA1 entweder Frameshift- oder Nonsense-Mutationen waren, was zu einem instabilen oder beschnittenen Proteinprodukt führt.
Beim BRCA1 scheinen bis dato zwei Mutationen relativ häufig vorzuliegen. Die 5382 ins C BRCA1-Mutation in Codon 1756 und die 185 del AG-Mutation in Codon 23 wurden zunächst durch direkte Sequenzierung bei sieben (10%) bzw. acht (12%) der 68 Probanden identifiziert, die in den anfänglichen Studien zur Identifikation von Mutationen untersucht wurden. Über diese häufigen Mutationen hinaus wurden weitere Mutationen bei mehr als einer Familie mittels eines vollständigen Screenings der cDNA gefunden. Viele der bis dato auf BRCA1-Mutationen gescreenten Probanden wurden aufgrund einer hohen a priori-Wahrscheinlichkeit, mit der sie solche Mutationen aufweisen würden, ausgewählt. Folglich mögen diese bei diesem Set vorgefundenen Mutationen nicht repräsentativ für jene sein, die bei einem anderen Set von Patienten identifizierbar wären. Die beiden häufigsten BRCA1-Mutationen (5382 ins C und 185 del AG) wurden jedoch bei gezieltem Screening in Probanden-Sets vielfach vorgefunden, die entweder nicht nach Familiengeschichte ausgewählt oder bei mininaler Familiengeschichte bestimmt wurden.
Neben den oben gezeigten Mutationen wurden auch viele Polymorphismen während des Proben-Screenings gefunden. Diese Polymorphismen sind in Tabellen 18 und 19 aufgelistet.
Industrielle Nutzung
Wie oben bereits beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung die Materialien und Methoden zur Verwendung beim Testen von BRCA1-Allelen eines Individuums und eine Interpretation der gesunden oder prädisponierenden Beschaffenheit der Allele bereit. Individuen mit einem höheren als normalen Risiko wären dadurch in der Lage, ihren Lebensstil entsprechend zu verändern. Im Falle des BRCA1 kann der signifikanteste nicht-genetische Risikofaktor durch die schützende Wirkung einer frühen Terminschwangerschaft eingedämmt werden. Folglich könnten Risikoträgerinnen eine frühe Kindsgeburt oder eine auf die Simulierung der hormonellen Wirkungen einer frühen Terminschwangerschaft hin ausgerichtete Therapie in Betracht ziehen. Frauen mit einem hohen Risiko würden ebenfalls den frühen Nachweis anstreben und wären höher motiviert, die Selbstuntersuchung der Brust zu erlernen und zu praktizieren. Diese Frauen wären auch hochgradig motiviert, sich einer regelmäßigen Mammographie zu unterziehen, und zwar möglicherweise von einem früheren Alter an als die Allgemeinbevölkerung. Auch ein Eierstock-Screening könnte häufiger vorgenommen werden. Auf einer Sequenzanalyse des BRCA1-Locus basierende diagnostische Methoden könnten auch zum Tumor-Nachweis und seiner Klassifikation angewandt werden, ebenso wie die Sequenzanalyse zur Diagnose von Vorläufer-Läsionen angewandt werden könnte.
Mit der Entstehung der Methode und der Anhäufung von Information über BRCA1 und andere ursächliche Loci könnte es möglich werden, Krebsformen in gutartige und bösartige zu unterscheiden.
Frauen mit Brustkrebs können sich verschiedenen operativen Prozeduren unterziehen, wenn sie prädisponiert sind und dadurch die Wahrscheinlichkeit, weitere Krebsarten zu entwickeln im Vergleich dazu zunimmt, wenn sie nicht prädisponiert sind. Weitere Therapieformen können entweder unter Verwendung von Peptiden oder von kleinen Molekülen (rationelles Wirkstoff-Design) entwickelt werden. Bei den Peptiden könnte es sich um das fehlende Genprodukt selbst oder um einen Abschnitt des fehlenden Genprodukts handeln. Alternativ dazu könnte das therapeutische Mittel ein anderes Molekül sein, das die Funktion des deletären Gens nachahmt, nämlich entweder ein Peptid- oder ein Nicht-Peptid-Molekül, das der gesundheitsschädlichen Wirkung des ererbten Locus eine Gegenwirkung entgegensetzt. Die Therapie könnte auch auf Gentechnik basieren, indem ein normales BRCA1-Allel in Individuen zum Erhalt eines Proteins eingeführt wird, das der Wirkung des deletären Alleis entgegenwirkt. Diese Gentherapien können viele Formen annehmen und können entweder auf die Prävention der Tumorausbildung, auf die Heilung eines bereits ausgebrochenen Krebses oder auf das Aufhalten der Metastasenbildung eines Krebses gerichtet sein.
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Liste der Patente und Patentanmeldungen:

U.S. Patent No. 3,817,837
U.S. Patent No. 3,850,752
U.S. Patent No. 3,939,350
U.S. Patent No. 3,996,345
U.S. Patent No. 4,275,149
U.S. Patent No. 4,277,437
U.S. Patent No. 4,366,241
U.S. Patent No. 4,376,110
U.S. Patent No. 4,486,530
U.S. Patent Na. 4,683,195
U.S. Patent No. 4,683,202
U.S. Patent No. 4,816,567
U.S. Patent No. 4,868,105
U.S. Patent No. 5,252,479
EPO Publication Nr. 225,807
Europäische Patentanmeldung Nr. 0332435
Geysen, H., PCT Offenlegungsschrift WO 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984
Hitzeman et al., EP 73,675A
PCT Offenlegungsschrift WO 93/07282

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für Brust- und Eierstockkrebs bei einem menschlichen Individuum, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Keimbahn-Veränderung im BRCA1-Gen in einer Gewebeprobe des Individuums gibt, wobei die Veränderung eine Prädisposition für den Krebs anzeigt.
Verfahren zur Diagnose einer Brust- oder Eierstockläsion bei einem menschlichen Individuum auf Neoplasie, assoziiert mit dem BRCA1-Gen-Locus, welches das Bestimmen umfasst, ob es eine 185delAG → ter39-Mutation im BRCA1-Gen in einer Probe der Läsion gibt.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, welches das Analysieren von mRNA in der Probe umfasst, um zu bestimmen, ob ein Expressionsprodukt vorliegt, das die Expression einer BRCA1-Allel-Mutante anzeigt, wobei die mRNA von der Probe unter Bedingungen, die zur Hybridisierung der Sonde an eine dem BRCA1-Gen entsprechende RNA geeignet sind, mit einer BRCA1-Oligonucleotid-Gensonde in Kontakt gebracht wird, die für die Veränderung/Mutation allelspezifisch ist, und wobei die Hybridisierung der Sonde bestimmt wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei eine BRCA1-Oligonucleotid-Gensonde, die für die Veränderung/Mutation allelspezifisch ist, mit aus der Probe isolierter genomischer DNA in Kontakt gebracht wird, unter Bedingungen, die für die Hybridisierung der Sonde an das Gen geeignet sind, und wobei die Hybridisierung der Sonde bestimmt wird.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei Oligonucleotidprimer eingesetzt werden, welche spezifisch für die BRCA1-Allel-Mutante gemäß der Definition in Anspruch 1 sind, um durch Nucleinsäureamplifikation zu bestimmen, ob das Allel in der Probe vorliegt.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei das ganze oder ein Teil des BRCA1-Gens in der Probe amplifiziert wird.
Nucleinsäuresonde, die 15 bis 30 Nucleotide von SEQ ID NO: 1 aufweist und die Mutation 185delAG → ter39 enthält.
Replikativer Clonierungsvektor, welcher eine isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 7 und ein Replikon umfasst, das in einer Wirtszelle für den Vektor funktionsfähig ist.
Wirtszellen, die in vitro mit einem Vektor wie in Anspruch 8 beansprucht transformiert wurden.