DE60128830T2

DE60128830T2 - Regulierung der expression von eer-7, ein mitglied der lysyl oxidase genfamilie, durch oestrogenrezeptoren

Info

Publication number: DE60128830T2
Application number: DE60128830T
Authority: DE
Inventors: Mark J. Radnor EVANS; Marshall S. Douglasville SCICCHITANO; Ashok R. Blue Bell BAPAT; Eric Waltham BEER; Ramesh A. King of Prussia BHAT; Elissa Saline FERRIS; Robert Plymouth Meeting MASTROENI; Jianziong Wayne ZHANG; Sotirios K. Saline KARATHANASIS
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-08-08
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2021-08-09
Also published as: US7208300B2; ATE364087T1; DE60128830D1; US7445920B2; EP1354046B1; US20020102645A1; HK1060148A1; WO2002012470A2; CA2418952A1; AU2001284769A1; IL154036A0; US20040171110A1; WO2002012470A3; BR0113257A; JP2004505631A; MXPA03001196A; EP1354046A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mitglied der Lysyloxidasefamilie, EER-7, Polypeptidfragmente des Proteins und Nukleinsäuren, die das EER-7-Protein und Fragmente codieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Assaysystem und Verfahren zum Test von östrogenrezeptorbindenden Substanzen auf ihre Fähigkeit, die EER-7-mRNA-Transkription zu regulieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Abdominalaortenaneurysmen (AAAs) sind ein wichtiges Gefäßkrankheitsbild in den Vereinigten Staaten und anderen entwickelten Nationen, wo im Laufe der letzten 30 Jahre ein zunehmender Anstieg der Häufigkeit beobachtet wurde (Mitchell et al., Vascular Surgery, 4. Auflage: 1032–1060 (1995)). Die Mehrzahl der AAAs betreffen Männer im Alter von mehr als 55 Jahren, aber auch bei Frauen wurde eine kontinuierliche Zunahme der Häufigkeit beobachtet (Cole et al., Chronic Dis. Canada, 15: S1–S64 (1994); Krupski et al., Semin. Vasc. Surg., 8: 83–167 (1995)).
Elastin und Kollagen (Typen I und III) sind die hauptsächlichen Strukturproteine der Aorta. Diese fibrillären Proteine vermitteln der Aortenwand sowohl Stärke als auch Elastizität, während sie dauernd der Belastung des pulsierenden Arteriendrucks ausgesetzt ist. Da AAAs eine Senkung der Elastinkonzentration und histopathologische Veränderungen, bei denen die elastischen Lamellen fragmentiert und abgebaut sind, zeigen, wurden der Verlust von Elastin und seinen biophysikalischen Eigenschaften als wesentliches Merkmal betrachtet (Camps et al., Artherosclerosis, 65: 13–21(1987); White et al., J. Vasc. Surg., 17: 371–381 (1993); Halloran et al., J. Surg. Res., 8: 85–92 (1995)). Der Umstand, dass die meisten Aneurysmen in der infrarenalen Aorta entstehen, wurde der Tatsache zugeschrieben, dass sowohl der Elastingehalt der Aorta als auch die Anzahl der elastischen Lamellen in diesem Bereich normalerweise geringer sind als in weiter proximal gelegenen Teilen der Aorta. Die infrarenale Aorta erscheint daher für Aneurysmen, die durch jeden Prozess, der einen beschleunigten Elastinabbau verursacht, ausgelöst werden, prädisponiert zu sein.
Lysyloxidase (LO, E.C. 1.4.3.13) vermittelt die kovalente Quervernetzung zwischen den und innerhalb der molekularen Elastin- und Kollagen-Einheiten, indem es das Peptidyllysin in diesen Proteinen zu Peptidyl-α-aminoadipat-δ-semialdehyd oxidiert. Das Peptidylaldehyd kann dann mit benachbarten Aminogruppen oder Peptidylaldehyden kondensieren und so die kovalenten Quervernetzungen bilden, die in fibrillärem Kollagen und Elastin gefunden werden (Kagan, Biology of the Extracellular Matrix, 321–398 (1986)). LO enthält ein Mol an fest gebundenem Kupfer(II)-Cofaktor pro Mol des gereinigten 32 kDa-Enzyms, was mit der maximalen Expression der Enzymaktivität korreliert. Der Kupfercofaktor ist in einem tetragonal verzerrten, oktaedrisch koordinierten Ligandenfeld gebunden (Gacheru et al., J. Biol. Chem., 265: 19022–19027 (1990)). Eine cDNA mit voller Länge, von der vorhergesagt wurde, dass sie ein Protein von 409 Aminosäuren (46 kDa) codierte, wurde erstmalig in einer neonatalen RattenaortacDNA-λgt11-Expressionsbibliothek unter Verwendung von Antiserum gegen die Rinderlysyloxidase identifiziert. LO-cDNAs aus dem Menschen (Hamalainen et al., Genomics, 17: 544–548 (1991); Mariani et al., Matrix, 12: 242–248 (1992)), dem Huhn (Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 24199–24206 (1992)) und der Maus (Kenyon et al., Science, 253: 802 (1991)) wurden inzwischen kloniert und sequenziert, was die Gegenwart sowohl von konservierten als auch von divergierenden Sequenzelementen unter den vier vorhergesagten LO-Proteinsequenzen erkennen lässt.
Eine menschliche cDNA-Spezies, die ein vorhergesagtes lysyloxidaseähnliches (lysyl oxidase-like, LOL) Protein codiert, wurde kloniert und dem Chromosom 15q24-q25 räumlich zugeordnet. Die Homologie dieses LOL-Gens mit LO beginnt an der Grenze zwischen den Exons 1 und 2 im murinen LO-Gen (Kenyon et al., J. Biol. Chem. 268: 18435–18437 (1993)). In neuerer Zeit wurde eine neuartige cDNA mit einer vorhergesagten Proteinsequenz, die 48 % Homologie mit LO und LOL besitzt, in alternden menschlichen Fibroblasten identifiziert (Saito et al., J. Biol. Chem., 272: 8157–5160 (1997)). Die Existenz dieser Serie von in hohem Maß verwandten Genen impliziert die Existenz einer Lysyloxidase-Genfamilie, von der vielleicht noch weitere Mitglieder identifiziert werden können. Jedoch wurden die Natur und die katalytische Funktion des exprimierten Proteinprodukts dieser Gene nur für das eine dokumentiert, das die bekannte Lysyloxidase-Enzymspezies der Bindegewebe codiert. Neuere Studien zeigen, dass die Lo-Aktivität möglicherweise durch Östrogenrezeptoren moduliert wird (Ozasa et al., Endocrinology, 109: 618–621 (1981); Sanada et al., Biochim. Biophys. Acta., 541: 408–413 (1978)).
Morales et al. (Circulation, American Heart Association, 91(3), 755–763 (1995)) beschreibt die Förderung der angiogenen Aktivität durch Östrogen bei HUVEC-Zellen. WO 00/37681 offenbart ein Verfahren zur Identifikation von Modulatoren von Östrogenrezeptoren im Verhältnis zu dem MT-II-Gen. Langenau et al. (J. Mol. Endochrinology, 23(2), 137–152 (1999)); Sanada et al. (Biochim. Biophys. Acta 541(3) (1978)) und Ozasa et al. (Endochrinology 109(2), 618–621 (1981)) beschreiben die Regulation von Lysyloxidasen durch Östrogen. Die EMBL-Datenbank (Zugangsnummer AL139241) beschreibt eine genomische Nukleinsäuresequenz mit etwas Überlappung und Sequenzidentität mit dem hier offenbarten EER-7-Gen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein als EER-7 bezeichnetes LO-Protein. Auch Nukleinsäuresequenzen, Proteinsequenz, Nukleinsäure- und Proteinfragmente, Oligonukleotide, Vektoren, transformierte Wirtszellen und spezifische EER-7-Antikörper werden von der vorliegenden Erfindung beschrieben. Verfahren zur Herstellung des EER-7-Proteins aus transformierten Wirtszellen und zur Detektion des EER-7-Proteins in einer Probe werden ebenfalls beschrieben. In einem bevorzugten Aspekt ist das Protein ein Säugerprotein. In einem weiteren Aspekt ist das Protein menschlich.
In einem alternativen Aspekt besteht ein Polypeptidfragment eines EER-7-Proteins aus einer bis vier Kopien von SRCR-Domänen, einer konservierten katalytischen Domäne der Lysyloxidase, wird spezifisch von einem Anti-EER-7-Antikörper erkannt, oder es gilt eine beliebige Kombination davon.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Assaysystem zur Identifikation von selektiven Östrogenrezeptorliganden bereit, in dem transformierte Zellen, die verschiedene Östrogenrezeptoren exprimieren, vorliegen, und in dem die Anzahl der Zellen ausreicht, um eine detektierbare Menge an EER-7-mRNA zu bilden. Die transformierten Zellen umfassen zwei verschiedene Populationen. Ein Verfahren zur Identifikation selektiver Östrogenrezeptorliganden unter Verwendung dieses Assaysystems wird ebenfalls beschrieben.
Ein nichtmenschliches EER-7-Knockout-Tier, bei dem die endogene EER-7-Expression supprimiert ist, wird beschrieben. Weiterhin wird ein nichtmenschliches Tier beschrieben, das mit einem Vektor transformiert ist, der eine Nukleinsäure umfasst, die ein Protein codiert, das die EER-7-Expression reguliert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Sequenzpaarabstände des Proteinalignments mit Kaninchen-EER-7-Proteinfragmenten, einem EER-7-Consensusprotein, menschlichem und murinem WS914, menschlichem und murinem LOL, menschlichem und murinem LO und menschlichem und murinem EST unter Verwendung des Clustal-Verfahrens mit der Gewichtungstabelle PAM250 für die Reste.
2 Schematische Darstellung der Sequenzähnlichkeit der SRCR- und katalytischen Domänen zwischen dem EER-7-Protein und den Proteinen WS914, LOL und LO.
3 Northern Blots, die die Spiegel von EER-7- und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-RNA nach der Aktivierung der ERα- und ERβ-Rezeptoren in HUVEC-Zellen zeigen.
4 Struktur der Verbindungen 2 und 8.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung einer cDNA (EER-7; SEQ ID NO: 1), deren Expression von Östrogen reguliert wird. Menschliche Nabelschnurvenenzellen, HUVEC, wurden mit einem menschlichen ER-Expressionsvektor transformiert. Transformierte Zellen in Mikrotiterplatten wurden mit Östrogen oder mit Testsubstanzen behandelt, und die EER-7-mRNA-Expression wurde durch Northern-Analyse und Echtzeit-PCR bestimmt. Die Modulation der EER-7-mRNA-Expression hängt sowohl von ER als auch von den Liganden ab. Die Nukleinsäuresequenz von EER-7 zeigt Homologie mit bekannten Lysyloxidasegenen. Alle bislang identifizierten katalytischen Domänen der Lysyloxidasen sind in dem EER-7-Protein vorhanden. Die katalytische Domäne des EER-7-Proteins ist im Bereich von Aminosäure 530 bis ungefähr Aminosäure 756 gelegen. Weiterhin enthält EER-7 vier Kopien von SRCR(Scavenger Receptor Cysteine Rich)-Domänen (als SRCR-1 bis SRCR-4 bezeichnet), von denen vermutet wird, dass sie bei Protein-Protein-Interaktionen eine Rolle spielen. Die die SRCR-Domänen von EER-7 definierenden Aminosäuren sind SRCR-1: von ungefähr 32 bis ungefähr 134, SRCR-2: von ungefähr 163 bis ungefähr 287, SRCR-3: von ungefähr 311 bis ungefähr 411 und SRCR-4: von ungefähr 421 bis ungefähr 529. EER-7 hat Sequenzidentitäten mit LO, LOL, WS914 (einem neuen LOL-Protein, isoliert aus Patienten, bei denen das Warner-Syndrom diagnostiziert wurde) und neuen EER-7-Proteinen aus anderen Spezies (z. B. Kaninchen). Der Sequenzvergleich zeigt eine Gesamtsequenzidentität von ungefähr 10 % bis ungefähr 51 %. Ein Vergleich der SRCR-Domänen zeigt eine Sequenzähnlichkeit mit WS914 von ungefähr 34 % bis ungefähr 64 %. Das menschliche EER-7 hat ungefähr 45 % Sequenzidentität seiner katalytischen Domäne mit den katalytischen Domänen von menschlichem LO und LOL.
Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafterweise ein Screening-Assay zur Identifikation von Substanzen bereit, die selektiv spezifische Isoformen des ER regulieren, indem es die Wirkung von Testsubstanzen auf die EER-7-Expression ermittelt. Das erfindungsgemäße Assaysystem eignet sich für ein Hochdurchsatzscreening, z. B. für ein Screening von Tausenden von Substanzen pro Assay.
Die vorliegende Erfindung beschreibt den Vergleich der EER-7-Reaktionen zweier Zellpopulationen, die mit verschiedenen ER-Isoformen transfiziert sind, wenn sie mit einer Testsubstanz in Kontakt gebracht werden. Ein Unterschied in der Reaktion der Populationen zeigt, dass die Testsubstanzen auf verschiedene ER-Isoformen auf unterschiedliche Weise agonistisch oder antagonistisch wirken. Solche Substanzen sind gute Leitstrukturen oder Kandidaten für ER-basierte Therapeutika wie z. B. nicht weiblich machende Östrogenverbindungen.
Somit werden das EER-7-Protein einschließlich von Fragmenten, Derivaten und Analoga von EER-7; EER-7-Nukleinsäuren einschließlich von Oligonukleotidprimern, Sonden- und EER-7-Regulationssequenzen; EER-7-spezifische Antikörpern; und verwandte Verfahren zur Verwendung dieser Materialien zur Detektion der Gegenwart von EER-7-Proteinen oder Nukleinsäuren, EER-7-Bindungspartnern und in Screeningverfahren auf Agonisten und Antagonisten von EER-7 beschrieben. Die nachfolgenden Teile der Anmeldung, die durch Überschriften (im Original in Fettschrift) und Unterüberschriften (im Original in kursiver Fettschrift) gegliedert sind, werden zur Klarheit bereitgestellt und beschränken die Erfindung nicht.
Allgemeine Definitionen
Hier bedeutet der Ausdruck „isoliert", dass das bezeichnete Material von der Umgebung, in der es normalerweise gefunden wird, getrennt ist. Somit kann ein isoliertes biologisches Material frei von Zeilbestandteilen, d. h., Bestandteilen der Zellen, in denen das Material gefunden oder gebildet wird, sein. Im Fall von Nukleinsäuremolekülen gehören zu einer isolierten Nukleinsäure ein PCR-Produkt, eine isolierte mRNA, eine cDNA oder ein Restriktionsfragment. In einer anderen Ausführungsform ist eine isolierte Nukleinsäure vorzugsweise aus dem Chromo som ausgeschnitten, in dem sie gefunden werden kann, und besonders bevorzugt ist sie nicht mehr mit nichtregulatorischen, nichtcodierenden Regionen oder anderen Genen, stromaufwärts oder stromabwärts des in der isolierten Nukleinsäure enthaltenden Gens gelegen, wenn dieses auf den Chromosomen gefunden wird, verbunden. In einer weiteren Ausführungsform fehlen der isolierten Nukleinsäure ein oder mehrere Introns. Zu den isolierten Nukleinsäuremolekülen gehören in Plasmide, Cosmide, künstliche Chromosomen und dergleichen eingefügte Sequenzen. Somit ist in einer spezifischen Ausführungsform eine rekombinante Nukleinsäure eine isolierte Nukleinsäure. Ein isoliertes Protein kann mit anderen Proteinen oder Nukleinsäuren oder beiden assoziiert sein, mit denen es in der Zelle vergesellschaftet ist, oder mit Zellmembranen, wenn es ein membranassoziiertes Protein ist. Ein isoliertes Organell, eine isolierte Zelle oder ein isoliertes Gewebe ist von der anatomischen Stelle, an der es in einem Organismus gefunden wird, getrennt. Ein isoliertes Material kann, aber muss nicht gereinigt sein.
Die Bezeichnung „gereinigt" bezeichnet hier Material, das unter Bedingungen isoliert worden ist, die die Gegenwart fremder Materialien, d. h. von Kontaminationen einschließlich von nativen Materialien, aus denen das Material erhalten ist, verringern oder beseitigen. Zum Beispiel ist ein gereinigtes Protein vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen Proteinen oder Nukleinsäuren, mit denen es in einer Zelle vergesellschaftet ist; ein gereinigtes Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Proteinen oder anderen fremden Nukleinsäuremolekülen, mit denen es in einer Zelle gefunden werden kann. Der Ausdruck „im Wesentlichen frei" wird hier funktional im Kontext der analytischen Untersuchung des Materials verwendet. Vorzugsweise ist von Kontaminationen im Wesentlichen freies gereinigtes Material zu wenigstens 50 % rein, bevorzugter zu wenigstens 90 % rein; und besonders bevorzugt zu mindestens 99 % rein. Die Reinheit kann durch Chromatographie, Gelelektrophorese, Immunassay, Zusammensetzungsanalyse, biologische Prüfung und andere aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden.
Reinigungsverfahren sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Zum Beispiel können Nukleinsäuren durch Präzipitation, Chromatographie (einschließlich präparativer Festphasenchromatographie, Oligonukleotidhybridisierung und Tripelhelixchromatographie), Ultrazentrifugation und andere Mittel gereinigt werden. Polypeptide und Proteine können durch verschiedene Verfahren gereinigt werden, zu denen präparative Scheibengelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, HPLC, Reversphasen-HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Partitionschromatographie, Präzipitations- und Aussalzungschromatographie, Extraktion und Gegenstromaustausch gehören, ohne darauf beschränkt zu sein. Zu einigen Zwecken ist es bevorzugt, das Polypeptid in einem rekombinanten System herzustellen, indem das Protein eine zusätzliche Sequenzmarkierung enthält, die die Reinigung erleichtert, wie z. B. eine Polyhistidinsequenz oder eine Sequenz, die spezifisch einen Antikörper bindet, wie z. B. FLAG und GST, ohne darauf beschränkt zu sein. Das Polypeptid kann dann aus einem Rohlysat der Wirtszelle durch Chromatographie auf einer geeigneten Festphasenmatrix gereinigt werden. Alternativ können gegen das Protein oder davon abgeleitete Peptide hergestellte Antikörper als Reini gungsreagenzien verwendet werden. Die Zellen können durch verschiedene Techniken gereinigt werden, darunter Zentrifugation, Matrixtrennung (z. B. Nylonwolltrennung), Panning und andere Immunoselektionstechniken, Depletion (z. B. Komplementdepletion kontaminierender Zellen) und Zellsortierung (z. B. fluoreszenzaktivierte Zellsortierung [FACS]). Andere Reinigungsverfahren sind möglich. Ein gereinigtes Material kann weniger als ungefähr 50 %, vorzugsweise weniger als ungefähr 75 % und besonders bevorzugt weniger als ungefähr 90 % der zellulären Komponenten enthalten, mit denen es ursprünglich vergesellschaftet war. „Im Wesentlichen rein" bezeichnet den höchsten Reinheitsgrad, der unter Verwendung herkömmlicher aus dem Stand der Technik bekannter Reinigungstechniken erreicht werden kann.
In einer besonderen Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „ungefähr" oder „etwa" innerhalb eines wissenschaftlichen akzeptablen Fehlerbereichs für einen bestimmten Wert relativ zu der Genauigkeit, mit der der Wert gemessen wird oder gemessen werden kann, z. B. innerhalb von 20 %, vorzugsweise innerhalb von 10 % und besonders bevorzugt innerhalb von 5 % eines bestimmten Wertes oder Bereichs. Alternativ, insbesondere bei biologischen Systemen, kann der Ausdruck innerhalb einer Größenordnung bedeuten, vorzugsweise innerhalb des 5-fachen und besonders bevorzugt innerhalb des 2-fachen eines bestimmten Wertes.
Der Begriff „Probe" bezeichnet hier ein biologisches Material, das auf die Gegenwart von EER-7-Protein oder EER-7-Nukleinsäuren getestet werden kann. Solche Proben können von Tieren, wie z. B. von Menschen und von nichtmenschlichen Tieren, erhalten werden, und zu ihnen gehören Gewebe, insbesondere Muskeln, Biopsien, Blut und Blutprodukte; Pleuraleffusionen; Liquor cerebrospinalis (CSF); Ascitesflüssigkeit; und Zellkultur.
Zu nichtmenschlichen Tieren gehören ohne Beschränkung darauf Labortiere wie z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Meerschweinchen usw.; Haustiere wie z. B. Hunde und Katzen; und landwirtschaftliche Nutztiere, wie z. B. Schafe, Ziegen, Schweine, Pferde und Kühe.
Die Verwendung der Kursivschrift bezeichnet ein Nukleinsäurenmolekül (z. B. EER-7-cDNA, Gen etc.); der normale Text bezeichnet das Polypeptid oder Protein.
Der Begriff „selektiv" bezeichnet die Fähigkeit eines ER-Liganden, verschiedene Reaktionen von verschiedenen ER-Isoformen auszulösen. Anders ausgedrückt, kann ein selektiver ER-Ligand ein starker Agonist für eine ER-Isoform wie z. B. ERα sein, während er auf eine andere ER-Isoform wie z. B. ERβ eine geringe oder gar keine agonistische Wirkung ausübt. Umgekehrt kann eine Substanz ein starker ERβ-Agonist und ein schwacher ERα-Agonist sein. In ähnlicher Weise können ER-Liganden verschiedene ER-Isoformen in verschiedenem Maß antagonisieren. Die vorliegende Erfindung erlaubt vorteilhafterweise die Zerlegung dieser Aktivitäten.
Der Begriff „Fähigkeit, eine Reaktion auszulösen" bezeichnet die Fähigkeit eines ER-Liganden, die ER-Aktivität zu agonisieren oder antagonisieren.
Der Begriff „transformierte Zelle" bezeichnet hier eine modifizierte Wirtszelle, die einen funktionalen Östrogenrezeptor exprimiert, der von einem Vektor exprimiert wird, der den Östro genrezeptor codiert und der EER-7 exprimieren kann. Es kann jede beliebige Zelle verwendet werden, vorzugsweise eine Säugerzelle und besonders bevorzugt eine Endothelzelle. In einer besonderen Ausführungsform ist die Zelle eine menschliche Nabelschnurvenenzelle.
Ein „funktionaler Östrogenrezeptor" ist ein Rezeptor, der Östrogen oder Östrogenanaloga bindet und bei einer solchen Bindung ein Signal übermittelt. Der ER ist vorzugsweise ein menschlicher ER (human ER, hER), z. B. ERα oder ERβ. Östrogenrezeptoren können aus einer Vielzahl von Quellen gewonnen sein, darunter Säuger, z. B. Mensch, Rind, Schwein und Hund; und Vögel.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind insbesondere für ein Assaysystem für Östrogenrezeptorliganden, die die EER-7-mRNA-Expression modulieren, geeignet. Ein „Assaysystem" ist eine oder mehrere Kollektionen solcher Zellen, z. B. in einer Mikrotiterplatte oder irgendeinem anderen Kultursystem. Um die Messung der Wirkungen einer Testsubstanz auf die Zellen zu ermöglichen, ist die Anzahl der Zellen in einem einzelnen Assaysystem ausreichend, um zumindest unter Bedingungen der maximalen EER-7-mRNA-Expression eine detektierbare Menge der regulierten EER-7-mRNA-Expression zu exprimieren.
Eine „Testsubstanz" ist ein beliebiges Molekül, wie z. B. eine Östrogenverbindung, die auf ihre Fähigkeit getestet werden kann, die EER-7-Expression durch den ER zu modulieren, wie hier dargestellt.
Der Begriff „Bereitstellen" bedeutet hier, die erfindungsgemäßen Substanzen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen einem Tier, vorzugsweise einem Menschen, in irgendeiner Weise zuzuführen. Zum Beispiel kann dem Patienten eine Prodrug-Form der Substanzen bereitgestellt werden, die dann im Körper zu der Substanz metabolisiert wird.
EER-7
Das EER-7-Protein bezeichnet hier definitionsgemäß ein Polypeptid mit ungefähr 756 Aminosäuren. In einer besonderen Ausführungsform hat das menschliche EER-7 740 Aminosäuren. EER-7 kann ein Molekulargewicht von ungefähr 82,6 Kilodalton (kDa), durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen, haben. Das EER-7-Gen hat eine signifikante Homologie mit anderen LO-Oxidasegenen. Somit bezeichnet EER-7 ein Protein mit mehr als 90 % und vorzugsweise mit mehr als 95 % gesamter Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2. In einer spezifischen Ausführungsform hat EER-7 die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäurensequenz. Da EER-7 eine sekretorische Leadersequenz und keine identifizierbaren Transmembranregionen besitzt, wird vorgeschlagen, dass EER-7 ein sezerniertes Protein sei. EER-7 besteht aus vier SRCR-Domänen und einer katalytischen Domäne. Die SRCR-Domänen steuern das Protein zu spezifischen extrazellulären Zielen.
Sequenzvergleiche zwischen dem menschlichen EER-7-Protein und LO, LOL, WS914 und EER-7-Proteinen aus anderen Spezies zeigen Sequenzähnlichkeiten im Bereich von 7 bis 51 % (siehe 1). Das menschliche EER-7-Protein hat insgesamt 18 % Sequenzähnlichkeit mit dem menschlichen LO-Protein. Da LO keine SRCR-Domänen enthält, ergibt ein Ver gleich nur der katalytischen Domänen von EER-7 (SEQ ID NO: 7) und LO eine Sequenzähnlichkeit von 46 % (siehe 2). Die katalytische Domäne von EER-7 hat auch 46 % bzw. 66 % Sequenzähnlichkeit mit den katalytischen Domänen von menschlichem LOL und WS914. Ein Vergleich der vier SRCR-Domänen im EER-7 mit den in WS914 vorliegenden zeigt, dass die Sequenzähnlichkeit zwischen den Domänen variiert. Die SRCR-Domänen 1, 3 und 4 (SEQ ID Nrn. 3, 4 und 6) von EER-7 haben ungefähr 60 % Sequenzähnlichkeit mit den gleichen Domänen von WS914, während SRCR-2 (SEQ ID NO: 5) ungefähr 34 % Sequenzähnlichkeit hat.
Wie andere Mitglieder der Lysyloxidase-Enzymklasse der Kupferaminooxidasen initiiert EER-7 die Quervernetzung zwischen und innerhalb von Elastin- und Kollageneinheiten. Die Stimulation der Lysyloxidase-Enzymaktivität von EER-7 kann ein Ziel für die Behandlung von AAAs und Myokardinfarkt sein. Tropoelastin ist ein Substrat für die Lysyloxidase, und eine erhöhte EER-7-Lysyloxidaseaktivität steigert die Elastin-Quervernetzung. Eine gesteigerte Elastin-Quervernetzung in der inneren elastischen Lamina verhindert die Aneurysmenentwicklung. Eine erhöhte EER-7-Lysyloxidaseaktivität würde auch die Anzahl der Kollagen-Quervernetzungen erhöhen und damit die Reißfestigkeit der Gefäßwand erhöhen, was ebenfalls ein Aneurysma verhindern kann. Myokardinfarkte können durch Verhinderung des Aufreißens der faserigen Kappe, die die Plaques in den Herzkranzgefäßen bedeckt, verhindert werden. Eine erhöhte Reißfestigkeit der Kappe, die sich aus gesteigerter Lysyloxidaseaktivität ergibt, kann helfen, die Infarkte zu verhindern. Weiterhin wurde der Inhibition der LO-Aktivität eine Rolle bei der Behandlung fibrotischer Erkrankungen zugeschrieben.
EER-7-Fragmente, Derivate und Analoga können anhand von einem oder mehreren Merkmalen des EER-7-Proteins charakterisiert werden. Zum Beispiel kann ein EER-7-Fragment, hier auch als EER-7-Peptid oder Polypeptid bezeichnet, eine Aminosäurensequenz haben, die einer Homologieregion des Lysyloxidaseproteins entspricht, insbesondere einem der Fragmente mit SEQ ID NOs: 3–7. In einer besonderen Ausführungsform können zur Entwicklung spezifischer Antikörper gegen den C-Terminus und den N-Terminus von EER-7-Antikörper gegen jede der beiden Hälften des EER-7-Proteins oder gegen antigene Peptide jeder Hälfte erzeugt werden.
EER-7-Analoga und Derivate haben die gleichen oder homologe Merkmale von EER-7, wie oben dargestellt. Zum Beispiel kann eine verkürzte Form von EER-7 bereitgestellt werden. Zu einer solchen verkürzten Form gehört EER-7 mit einer entweder N-terminalen, C-terminalen oder internen Deletion. In einer besonderen Ausführungsform ist das Derivat funktionsfähig, d. h. imstande, eine oder mehrere Funktionsaktivitäten zu zeigen, die mit einem erfindungsgemäßen Wildtyp-EER-7 voller Länge assoziiert sind. Zu solchen Funktionen gehören die Beteiligung an der Bildung kovalenter Quervernetzungen von Kollagen und/oder Elastin. Alternativ kann ein chimäres EER-7-Fusionsprotein hergestellt werden, in dem der EER-7-Teil des Fusionsproteins ein oder mehrere Merkmale von EER-7 hat. Zu solchen Fusionsproteinen gehören Fusionen des EER-7-Polypeptids mit einem Marker-Polypeptid wie z. B. FLAG, einer Histidin-Markierung, einer Myc-Markierung oder Glutathion-S-Transferase (GST). Alternativ kann EER-7 mit einem im Zusammenhang mit der Expression stehenden Peptid fusioniert werden, wie z. B. einem Hefe-α-Paarungsfaktor, einem heterogenen Signalpeptid oder einem Peptid, das EER-7 bei der Expression stabilisiert. EER-7 kann auch zur Markierung mit einer Einzelphosphorylierungsstelle fusioniert werden. In einer anderen Ausführungsform kann EER-7 als Fusion mit einem Bakterienprotein wie z. B. β-Galactosidase exprimiert werden.
EER-7-Analoga können hergestellt werden, indem man codierende Nukleinsäuresequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen verändert, die funktional ähnliche Moleküle ergeben, d. h. Moleküle, die eine oder mehrere der Funktionen von EER-7 ausführen. In einer besonderen Ausführungsform ist ein EER-7-Analogon eine sequenzkonservative Variante von EER-7. In einer anderen Ausführungsform ist ein EER-7-Analogon eine funktionskonservative Variante. In einer weiteren Ausführungsform ist ein EER-7-Analogon eine allelische Variante oder eine homologe Variante aus einer anderen Spezies. In einer besonderen Ausführungsform werden menschliche EER-7-Varianten beschrieben.
Zu den EER-7-Derivaten gehören phosphoryliertes EER-7, myristyliertes EER-7, methyliertes EER-7 und andere auf andere Weise chemisch modifizierte EER-7-Proteine, ohne in irgendeiner Weise darauf beschränkt zu sein. Zu den EER-7-Derivaten gehören auch markierte Varianten, z. B. mit Jod (oder, wie oben dargestellt, Phosphor) radiomarkierte Varianten; mit einem abtrennbaren Molekül wie z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, Biotin, mit einer mit einem Metallion komplexierten chelatbildenden Gruppe, einem Chromophor oder einem Fluorophor, einem Goldkolloid oder einem Partikel wie einem Latexkügelchen markierte Varianten; oder an ein wasserlösliches Polymer gebundene Varianten.
Die chemische Modifikation von einem oder mehreren biologisch aktiven Bestandteilen von EER-7 kann unter bestimmten Umständen weitere Vorteile bieten, wie z. B. Erhöhung der Stabilität und Zirkulationszeit des Bestandteils oder der Bestandteile und Verringerung der Immunogenität (siehe US-Patent Nr. 4,179,337 , Davis et al., veröffentlicht am 18. Dezember 1979; für einen Überblick siehe Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs, J. S. Holcerberg und J. Roberts, Hrsg., 1981, Seiten 367–383). Ein Übersichtsartikel beschreibt Proteinmodifikation und Fusionsproteine (Francis, Focus an Growth Factors 3: 4–10 (1992), Mediscript: Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK).
Die zur Derivatisierung geeigneten chemischen Reste können unter wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so dass der Bestandteil, mit dem es verbunden ist, in einer wässrigen Umgebung wie z. B. einer physiologischen Umgebung nicht ausfällt. Zur therapeutischen Verwendung des Endproduktes ist das Polymer vorzugsweise pharmazeutisch akzeptabel. Der Fachmann ist imstande, das gewünschte Polymer anhand von Überlegungen betreffend die mögliche therapeutische Verwendung des Polymer-Bestandteil-Kombinats und gegebenenfalls die gewünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Proteolysebeständigkeit und andere Erwägungsgründe auszuwählen. Für die vorliegenden Bestandteile können diese unter Verwendung der hier bereitgestellten Assays ermittelt werden.
Das wasserlösliche Polymer kann z. B. ausgewählt sein unter Polyethylenglykol (PEG), Ethylenglykol/Propylenglykol-Copolymeren, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymeren, Polyaminosäuren (entweder Homopolymeren oder Zufallscopolymeren) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propropylenglykolhomopolymeren, Prolypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung haben. Die PEGylierung von Proteinen ist eine etablierte Technik, um die in vivo-Halbwertszeit zu erhöhen und die biologische Aktivität sicherzustellen.
Klonierung und Expression von EER-7
Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Analyse und die Isolierung eines Gens, das ein funktionales oder mutiertes EER-7 codiert, darunter eine Form von EER-7 mit voller Länge oder eine natürlich vorkommende EER-7-Form, und beliebige antigene Fragmente davon aus einer beliebigen Quelle, vorzugsweise aus dem Menschen. Weiterhin beschreibt sie die Expression eines funktionalen oder mutierten EER-7-Proteins zur Evaluation, Diagnose oder Therapie.
Erfindungsgemäß können herkömmliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanten DNA-Technik innerhalb des Standes der Technik verwendet werden. Solche Techniken sind in der Literatur in vollem Maß erklärt. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, New York (nachfolgend "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II (D.N. Glover, Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, Hrsg., 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, Hrsg. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, Hrsg. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Molekularbiologie – Definitionen
Die "Amplifikation" von DNA bezeichnet hier die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Erhöhung der Konzentration in einer bestimmten DNA-Sequenz innerhalb eines Gemischs von DNA-Sequenzen. Für eine Beschreibung der PCR siehe Saiki et al., Science 239: 487 (1988).
Der Begriff „sequenzspezifische Oligonukleotide" bezeichnet hier verwandte Sätze von Oligonukleotiden, die verwendet werden können, um allelische Variationen oder Mutationen in dem EER-7-Gen zu detektieren.
Ein „Nukleinsäuremolekül" bezeichnet die Phosphatester-Polymerformen von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosi den (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle"), oder beliebige Phosphoester-Analoga davon, wie z. B. Phosphorothioate und Thioester, entweder in einzelsträngiger Form oder in doppelsträngiger Helix. Es sind doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices möglich. Der Begriff Nukleinsäuremolekül, und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, bezeichnet nur die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und beschränkt es nicht auf irgendeine Tertiärform. Somit umfasst dieser Begriff doppelsträngige DNA, u.a. in linearen (z. B. Restriktionsfragmenten) oder zirkulären DNA-Molekülen, Plasmiden und Chromosomen zu finden. Bei der Diskussion der Struktur besonderer doppelsträngiger DNA-Moleküle können Sequenzen hier gemäß der normalen Konvention, nur die Sequenzen der 5'- nach 3'-Richtung entlang dem nichttranskribierten DNA-Strang anzugeben, beschrieben werden (d. h. als der Strang mit einer mit der mRNA homologen Sequenz). Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das eine molekularbiologische Manipulation durchlaufen hat.
Ein „Polynukleotid" oder eine „Nukleotidsequenz" ist eine Abfolge von Nukleotidbasen (auch „Nukleotide" genannt) in der DNA und RNA und bezeichnet jede Kette von zwei oder mehr Nukleotiden. Eine Nukleotidsequenz trägt typischerweise genetische Information einschließlich der von der zellulären Maschinerie zur Herstellung von Proteinen und Enzymen verwendeten Information. Diese Begriffe umfassen doppel- oder einzelsträngige genomische und cDNA, RNA, beliebige synthetische und genetisch manipulierte Polynukleotide und sowohl Sinn- als auch Gegensinn-Polynukleotide (obwohl hier nur die Sinnstränge dargestellt sind). Hierzu gehören einzel- und doppelsträngige Moleküle, d. h., DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Hybriden, und ebenso auch „Proteinnukleinsäuren" (protein nucleic acids, PNAs), die durch Konjugation von Basen an ein Aminosäurenrückgrat gebildet werden. Hierzu gehören auch Nukleinsäuren, die modifizierte Basen enthalten, z. B. Thiouracil, Thioguanin und Fluoruracil.
Die Polynukleotide können hier von natürlichen regulatorischen Sequenzen (Expressionskontrollsequenzen) flankiert oder mit heterologen Sequenzen, darunter Promotoren, interne Ribosomeneintrittsstellen (internal ribosome entry sites, IRES) und andere Ribosomenbindungssequenzen, Enhancer, reaktive Elemente, Suppressoren, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nichtcodierenden Regionen und dergleichen, assoziiert sein. Die Nukleinsäuren können auch durch viele aus dem Stand der Technik bekannte Mittel modifiziert sein. Zu den nicht begrenzenden Beispielen solcher Modifikationen gehören Methylierung, „caps", Ersatz von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon und Internukleotidmodifikationen wie z. B. mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.) und mit geladenen Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.). Die Polynukleotide können einen oder mehrere zusätzliche kovalent gebundene Reste enthalten, wie z. B. Proteine (z. B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin usw.), Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), Chelatoren (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle usw.) und Al kylierungsmittel. Die Polynukleotide können durch Bildung eines Methyl- oder Ethylphosphotriesters oder einer Alkyl-Phosphoramidat-Bindung derivatisiert sein. Weiterhin können die Polynukleotide hier auch mit einem Marker modifiziert sein, der imstande ist, ein detektierbares Signal zu liefern, entweder direkt oder indirekt. Zu beispielhaften Markierungen gehören Radioisotopen, fluoreszierende Moleküle, Biotin und dergleichen.
Der Begriff „Wirtszelle" bezeichnet eine beliebige Zelle eines beliebigen Organismus, die auf irgendeine Weise zur Herstellung einer Substanz durch die Zelle, z. B. zur Expression eines Gens, einer DNA- oder RNA-Sequenz eines Proteins oder eines Enzyms durch die Zelle selektiert, modifiziert, transformiert, kultiviert oder verwendet oder manipuliert wird. Die Wirtszellen können weiterhin zum Screening oder zu anderen Assays, wie nachfolgend beschrieben, verwendet werden.
Proteine und Enzyme werden unter Verwendung von Anweisungen in der Form von DNA und RNA gemäß dem genetischen Code in der Wirtszelle hergestellt. Grundsätzlich wird eine DNA-Sequenz mit Instruktionen für ein bestimmtes Protein oder Enzym in eine korrespondierende RNA-Sequenz „transkribiert". Die RNA-Sequenz wiederum wird in die Sequenz der Aminosäuren, die das Protein oder Enzym bilden, „translatiert". Eine „Aminosäurensequenz" ist jede Kette von zwei oder mehr Aminosäuren. Jede Aminosäure wird in der DNA oder RNA durch ein oder mehrere Tripletts von Nukleotiden repräsentiert. Jedes Triplett bildet ein Codon, das einer Aminosäure entspricht. Zum Beispiel kann die Aminosäure Lysin (Lys) durch das Nukleotidtriplett oder Codon AAA oder durch das Codon AAG codiert werden. (Der genetische Code hat eine gewisse Redundanz, auch als Degeneriertheit bezeichnet, d. h., dass die meisten Aminosäuren mehr als ein entsprechendes Codon besitzen). Da die Nukleotide in den DNA- und RNA-Sequenzen zur Proteinherstellung in Dreier-Gruppen gelesen werden, ist es wichtig, das Ablesen der Sequenz an der richtigen Aminosäure zu beginnen, so dass die richtigen Tripletts abgelesen werden. Die Art, wie eine Nukleotidsequenz zu Codons gruppiert ist, wird als „Leseraster" bezeichnet.
Eine „codierende Sequenz" oder eine Sequenz, die ein Expressionsprodukt wie z. B. eine RNA, ein Polypeptid, ein Protein oder ein Enzym „codiert", ist eine Nukleotidsequenz, die, wenn sie exprimiert wird, zur Produktion dieser RNA, dieses Polypeptids, dieses Proteins oder dieses Enzyms führt, d. h., die Nukleotidsequenz codiert eine Aminosäurensequenz für dieses Polypeptid, Protein oder Enzym. Eine codierende Sequenz für ein Protein kann ein Startcodon (üblicherweise ein ATG) und ein Stoppcodon umfassen.
Der Begriff „Gen", auch „Strukturgen", bezeichnet eine DNA-Sequenz, die eine bestimmte Aminosäurensequenz codiert oder ihr entspricht, die die Gesamtheit oder einen Teil von einem oder mehreren Proteinen oder Enzymen umfasst, und kann Introns und regulatorische DNA-Sequenzen wie z. B. Promotorsequenzen, eine 5'-untranslatierte Region oder eine 3'-untranslatierte Region, die z. B. die Bedingungen, unter denen das Gen exprimiert wird, beeinflussen, umfassen oder nicht umfassen. Einige Gene, die keine Strukturgene sind, können von der DNA in RNA transkribiert werden, aber werden nicht in eine Aminosäurensequenz transla tiert. Andere Gene können als Regulatoren von Strukturgenen oder als Regulatoren der DNA-Transkription dienen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die imstande ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (in 3'-Richtung) gelegenen codierenden Sequenz zu initiieren. Zu Zwecken der Definition der vorliegenden Erfindung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus von der Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (in 5'-Richtung) so weit, dass sie die minimale Anzahl an Basen oder Elementen umfasst, die notwendig ist, um die Transkription in einem über dem Hintergrund detektierbaren Maß zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz sind eine Transkriptionsinitiationsstelle (zweckmäßigerweise z. B. durch Kartierung mit Nuklease S1 definiert) und auch Proteinbindungsdomänen (Consensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind, zu finden.
Eine codierende Sequenz „steht unter der Kontrolle von" oder „ist funktionsfähig verbunden mit" Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann trans-RNA-gespleißt wird (wenn sie Introns enthält) und, im Fall von mRNA, in das von der codierenden Sequenz codierte Protein translatiert wird.
Die Begriffe „exprimieren" und „Expression" bedeuten, dass man es ermöglicht oder bewirkt, dass die Information in einem Gen oder in einer DNA-Sequenz sich manifestiert, z. B. ein Protein bildet, indem man die zellulären Funktionen aktiviert, die an der Transkription und Translation eines korrespondierenden Gens oder einer korrespondierenden DNA-Sequenz beteiligt sind. Eine DNA-Sequenz wird in oder von einer Zelle exprimiert, um ein „Expressionsprodukt" wie z. B. ein Protein zu bilden. Das Expressionsprodukt selber, z. B. das resultierende Protein, kann auch als von der Zelle „exprimiert" bezeichnet werden. Ein Expressionsprodukt kann als intrazellulär, extrazellulär oder sezerniert charakterisiert werden. Der Begriff „intrazellulär" bedeutet, dass etwas im Inneren einer Zelle ist. Der Begriff „extrazellulär" bedeutet, dass etwas außerhalb einer Zelle ist. Eine Substanz wird von einer Zelle „sezerniert", wenn sie in signifikantem Ausmaß von irgendeinem Ort auf oder in der Zelle außerhalb der Zelle erscheint.
Der Begriff „Transfektion" bezeichnet die Einführung einer fremden Nukleinsäure in eine Zelle. Der Begriff „Transformation" bezeichnet die Einführung einer „fremden" (d. h. extrinsischen oder extrazellulären) Gen-, DNA- oder RNA-Sequenz in eine Wirtszelle, so dass die Wirtszelle das eingeführte Gen oder die eingeführte Sequenz exprimiert, um eine gewünschte Substanz herzustellen, typischerweise ein Protein oder ein Enzym, das von dem eingeführten Gen oder der eingeführten Sequenz codiert wird. Das eingeführte Gen oder die eingeführte Sequenz kann auch als „kloniertes" oder als „fremdes" Gen oder Sequenz bezeichnet werden, kann regulatorische oder Kontrollsequenzen wie z. B. Start-, Stopp-, Promotor-, Signal-, Sekretions- oder andere von der genetischen Maschinerie einer Zelle verwendete Sequenzen umfassen. Das Gen oder die Sequenz kann nichtfunktionale Sequenzen oder Sequenzen ohne bekannte Funktion umfassen. Eine Wirtszelle, die eingeführte DNA oder RNA erhält und expri miert, ist „transformiert" worden, und sie ist ein „Transformant" oder ein „Klon". Die in eine Wirtszelle eingeführte DNA oder RNA kann aus jeder beliebigen Zelle stammen, einschließlich von Zellen derselben Gattung oder Spezies wie die Wirtszelle, oder Zellen einer anderen Gattung oder Spezies.
Die Begriffe „Vektor", „Klonierungsvektor" und „Expressionsvektor" bezeichnen das Vehikel, wodurch eine DNA- oder RNA-Sequenz (z. B. ein fremdes Gen) in eine Wirtszelle eingeführt werden kann, um den Wirt zu transformieren und die Expression (z. B. die Transkription und Translation) der eingeführten Sequenz zu fördern. Zu den Vektoren gehören Plasmide, Phagen, Viren usw.; sie sind weiter unten detaillierter beschrieben.
Die Vektoren umfassen typischerweise die DNA eines übertragbaren Agens, in welche die Fremd-DNA eingefügt ist. Ein üblicher Weg der Insertion eines DNA-Segments in ein anderes DNA-Segment umfasst die Verwendung von als Restriktionsenzyme bezeichneten Enzymen, die DNA an spezifischen Stellen (spezifischen Nukleotidgruppen), die als Restriktionsschnittstellen bezeichnet werden, schneiden. Eine „Kassette" bezeichnet eine codierende DNA-Sequenz oder ein DNA-Segment, die beziehungsweise das eine Expressionsprodukt codiert, das an definierten Restriktionsschnittstellen in einen Vektor eingefügt werden kann. Die Restriktionsschnittstellen der Kassette sind so entworfen, dass sie die Einfügung der Kassette im richtigen Leseraster sicherstellen. Grundsätzlich wird die Fremd-DNA in eine oder mehrere der Restriktionsschnittstellen der Vektor-DNA eingefügt und dann zusammen mit der übertragbaren Vektor-DNA durch den Vektor in eine Wirtszelle übertragen. Ein DNA-Segment oder eine DNA-Sequenz mit eingefügter oder zusätzlicher DNA, wie z. B. ein Expressionsvektor, kann auch als „DNA-Konstrukt" bezeichnet werden. Ein gebräuchlicher Vektortyp ist ein „Plasmid", das im allgemeinen ein abgeschlossenes Molekül doppelsträngiger DNA, üblicherweise bakteriellen Ursprungs, ist, das ohne weiteres zusätzliche (fremde) DNA aufnehmen und in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden kann. Ein Plasmid-Vektor enthält oftmals codierende DNA und Promotor-DNA und hat eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen, die zur Einfügung von Fremd-DNA geeignet sind. Codierende DNA ist eine DNA-Sequenz, die eine bestimmte Aminosäurensequenz für ein bestimmtes Protein oder Enzym codiert. Promotor-DNA ist eine DNA-Sequenz, die die Expression der codierenden DNA initiiert, reguliert oder auf andere Weise vermittelt oder kontrolliert. Promotor-DNA und codierende DNA können von dem gleichen Gen oder von verschiedenen Genen stammen, und sie können vom gleichen oder von verschiedenen Organismen stammen. Eine große Anzahl von Vektoren, darunter Plasmid- und Pilz-Vektoren, wurden zur Replikation und/oder Expression in einer Vielzahl von eukaryontischen und prokaryontischen Wirten beschrieben. Zu den nicht begrenzenden Beispielen gehören die pKK-Plasmide (Clonetech), pUC-Plasmide, pET-Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI), pRSET- oder pREP-Plasmide (Invitrogen, San Diego, CA) oder pMAL-Plasmide (New England Biolabs, Beverly, MA), und viele geeignete Wirtszellen unter Verwendung von hier offenbarten oder zitierten oder ansonsten dem Fachmann bekannten Verfahren. Rekombinante Klonierungsvektoren umfassen oftmals ein oder mehrere Replikationssysteme zur Klonierung oder Expression, einen oder mehrere Marker zur Selektion im Wirt, z. B. Resistenz gegen Antibiotika, und eine oder mehrere Expressionskassetten.
Der Begriff „Expressionssystem" bezeichnet eine Wirtszelle und einen damit kompatiblen Vektor unter geeigneten Bedingungen, z. B. zur Expression eines Proteins, das von fremder DNA codiert wird, die von dem Vektor getragen und in die Wirtszelle eingeführt wird. Zu den gebräuchlichen Expressionssystemen gehören E. coli-Wirtszellen und Plasmid-Vektoren, Insektenwirtszellen und Baculovirus-Vektoren, und Säugerwirtszellen und Vektoren.
Der Begriff „heterolog" bezeichnet eine Kombination von Elementen, die in der Natur nicht vorkommt. Zum Beispiel bezeichnet heterologe DNA eine in der Natur nicht in der Zelle oder an einem chromosomalen Ort der Zelle lokalisierte DNA. Vorzugsweise umfasst die heterologe DNA ein der Zelle fremdes Gen. Ein heterologes Expressionsregulationselement ist solch ein Element, das mit einem anderen Gen funktional verbunden ist als dem, in dem es in der Natur funktional verbunden ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein EER-7-Gen heterolog gegenüber der Vektor-DNA, in die es zum Klonieren oder zur Expression eingefügt ist, und es ist heterolog gegenüber einer Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält, in der es exprimiert wird, z. B. einer HUVEC-Zelle.
Die Begriffe „Mutante" und „Mutation" bezeichnen jede detektierbare Veränderung des genetischen Materials, z. B. der DNA, oder jedes beliebige Verfahren, Mechanismus oder Ergebnis einer solchen Veränderung. Hierzu gehören Gen-Mutationen, in denen die Struktur (z. B. die DNA-Sequenz) eines Gens verändert ist, jedes aus einem Mutationsprozess entstehende Gen oder jede aus einem Mutationsprozess entstehende DNA, und jedes von einem modifizierten Gen oder einer modifizierten DNA-Sequenz exprimierte Expressionsprodukt (z. B. Protein oder Enzym). Der Begriff „Variante" kann ebenfalls verwendet werden, um ein modifiziertes oder verändertes Gen, DNA-Sequenz, Enzym, Zelle usw., d. h., jede beliebige Art von Mutante, zu bezeichnen.
„Sequenzkonservative Varianten" einer Polynukleotidsequenz sind diejenigen, in denen eine Veränderung von einem oder mehreren Nukleotiden an einer bestimmten Codon-Position zu keiner Veränderung der an dieser Stelle codierten Aminosäure führt.
„Funktionskonservative Varianten" sind diejenigen, in denen ein bestimmter Aminosäurenrest in einem Protein oder Enzym ausgetauscht wurde, ohne die Gesamtkonformation und Funktion des Polypeptids zu verändern, darunter Austausch einer Aminosäure mit einer mit ähnlichen Eigenschaften (wie z. B. Polarität, Wasserstoffbrückenbildungsfähigkeit, sauren, basischen, hydrophoben, aromatischen Eigenschaften und dergleichen), ohne darauf beschränkt zu sein. Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel sind Arginin, Histidin und Lysin hydrophil-basische Aminosäuren und können untereinander austauschbar sein. Ebenso kann Isoleucin, eine hydrophobe Aminosäure, durch Leucin, Methionin oder Valin ersetzt werden. Von solchen Veränderungen wird erwartet, dass sie wenig oder keinen Einfluss auf das scheinbare Molekulargewicht oder den isoelektrischen Punkt des Proteins oder Polypeptids haben. Andere als die als konserviert bezeichneten Ami nosäuren können in einem Protein oder Enzym verschieden sein, so dass die prozentuale Protein- oder Aminosäurensequenzähnlichkeit zwischen zwei beliebigen Proteinen mit ähnlichen Funktionen variieren und z. B. von 70 % bis 99 % sein können, bestimmt durch ein Alignment-Schema wie die Cluster-Methode, wobei die Ähnlichkeit auf dem MEGALIGN-Algorithmus basiert. Zu einer „funktionskonservativen Variante" gehört auch ein Polypeptid oder Enzym mit mindestens 60 % Aminosäurenidentität, wie durch die BLAST- oder FASIA-Algorithmen bestimmt, mit vorzugsweise mindestens 75 %, mit bevorzugter mindestens 85 % und noch bevorzugter mit mindestens 90 %, das die gleichen oder im Wesentlichen ähnliche Eigenschaften oder Funktionen wie das native Protein oder Elternprotein oder -Enzym, mit dem es verglichen wird, hat.
Der Begriff „homolog" in allen grammatikalischen Formen und Schreibvariationen bezeichnet hier das Verhältnis zwischen Proteinen, die einen „gemeinsamen evolutionären Ursprung" besitzen, darunter Proteine aus Superfamilien (z. B. der Immunglobulinsuperfamilie) und homologe Proteine aus anderen Spezies (z. B. die leichte Kette des Myosins usw.) (Reeck et al., Cell 50: 667 (1987)). Solche Proteine (und ihre codierenden Gene) besitzen Sequenzhomologie, wie von ihrer Sequenzähnlichkeit widerspiegelt, ob in prozentualer Ähnlichkeit oder in der Gegenwart spezifischer Reste oder Motive an konservierten Positionen ausgedrückt.
Demgemäß bezieht sich der Begriff „Sequenzähnlichkeit" in allen seinen grammatikalischen Formen auf den Grad der Ähnlichkeit oder Entsprechung zwischen Nukleinsäuren oder Aminosäurensequenzen von Proteinen, die einen gemeinsamen evolutionären Ursprung besitzen oder auch nicht besitzen können (siehe Reeck et al., oben). Jedoch kann der Begriff „homolog", wenn er von dem adverbialen Ausdruck „in hohem Maße" modifiziert wird, sich im gewöhnlichen Gebrauch oder in der vorliegenden Erfindung auf die Sequenzähnlichkeit beziehen, und er kann sich auf einem gemeinsamen evolutionären Ursprung beziehen oder auch nicht.
In einer spezifischen Ausführungsform sind zwei DNA-Sequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn über die definierte Länge der DNA-Sequenzen mindestens ungefähr 80 % und besonders bevorzugt mindestens ungefähr 90 oder 95 % der Nukleotide zusammenpassen, wie durch Sequenzvergleichsalgorithmen bestimmt, z. B. BLAST, FASTA, DNA-Strider usw.. Ein Beispiel einer solchen Sequenz ist eine allelische oder Spezies-Variante des erfindungsgemäßen spezifischen EER-7-Gens. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen unter Verwendung von Standardsoftware, die in Sequenzdatenbanken verfügbar ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter z. B. wie für dieses bestimmte System definierten stringenten Bedingungen identifiziert werden.
Auf ähnliche Weise sind in einer besonderen Ausführungsform zwei Aminosäurensequenzen „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen ähnlich", wenn mehr als 80 % der Aminosäuren identisch sind, oder mehr als 90 % ähnlich (funktional identisch) sind. Die ähnlichen oder homologen Sequenzen werden vorzugsweise durch Alignment identifiziert, z. B. unter Verwendung des GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)-Vergleichsprogramms oder irgendeines der oben beschriebenen Programme (BLAST, FASTA, usw.).
Ein Nukleinsäuremolekül ist mit einem anderen Nukleinsäuremolekül wie z. B. cDNA, genomischer DNA oder RNA „hybridisierbar", wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls unter passenden Temperatur- und Lösungssalzstärkebedingungen sich an das andere Nukleinsäurenmolekül anheften kann (siehe Sambrook et al., oben). Die Temperatur- und Salzstärkebedingungen legen die „Stringenz" der Hybridisierung fest. Zum Vorabscreening auf homologe Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz verwendet werden, entsprechend einer T_m (Schmelztemperatur) von 55 °C, z. B. 5 × SSC, 0,1 % SDS, 0,25 % Milch und kein Formamid; oder 30 % Formamid, 5 × SSC, 0,5 % SDS. Hybridisierungsbedingungen mäßiger Stringenz entsprechen einer höheren T_m, z. B. 40 % Formamid mit 5 × oder 6 × SSC. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen entsprechen der höchsten T_m, z. B. 50 % Formamid, 5 × oder 6 × SSC. SSC ist eine Lösung von 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumzitrat. Die Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die passende Stringenz zur Hybridisierung von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, aus dem Stand der Technik wohlbekannten Variablen. Je größer der Ähnlichkeits- oder Homologiegrad zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto höher ist der T_m-Wert für Hybriden zwischen Nukleinsäuremolekülen mit diesen Sequenzen. Die relative Stabilität (einer höheren T_m entsprechend) von Nukleinsäure-Hybridisierungen sinkt in der folgenden Reihenfolge: RNA: RNA, DNA: RNA, DNA: DNA. Für Hybriden mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden wurden Gleichungen zur Berechnung von T_m hergeleitet (siehe Sambrook et al., oben, 9.50–9.51). Zur Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position der Fehlpaarungen wichtiger, und die Oligonukleotidlänge bestimmt ihre Spezifität (siehe Sambrook et al, oben, 11.7–11.8). Eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure ist mindestens ungefähr 10 Nukleotide; vorzugsweise ungefähr mindestens 15 Nukleotide; und bevorzugter ist die Länge mindestens ungefähr 20 Nukleotide.
In einem spezifischen Aspekt bezieht sich der Begriff „standardmäßige Hybridisierungsbedingungen" auf eine T_m von 55 °C und verwendet Bedingungen wie die oben dargestellten. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60 °C; in einer bevorzugteren Ausführungsform beträgt die T_m 65 °C. In einer spezifischen Ausführungsform bezeichnet „hohe Stringenz" Hybridisierungs- und/oder Waschungsbedingungen von 68 °C in 0,2 × SSC, von 42 °C in 50 % Formamid, 4 × SSC oder unter Bedingungen, die zu Hybridisierungsniveaus führen, die mit den unter diesen Bedingungen beobachteten gleichwertig sind.
Der Begriff „Oligonukleotid" bezieht sich hier auf eine Nukleinsäure mit grundsätzlich mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 und besonders bevorzugt mindestens 20 Nukleotiden, vorzugsweise nicht mehr als 100 Nukleotiden, die mit einem genomischer DNA-Molekül, einem cDNA-Molekül oder einem mRNA-Molekül, das ein Gen, ein mRNA, eine cDNA oder anderes Nukleinsäuremolekül von Interesse codiert, hybridisierbar ist. Oligonukleotide können markiert werden, z. B. mit ³²P-Nukleotiden oder mit Nukleotiden, an die eine Markierung wie z. B. Biotin kovalent ankonjugiert ist. In einem Aspekt kann ein markiertes Oligonukleotid als Sonde verwendet werden, um die Gegenwart einer Nukleinsäure zu detektieren. In einem anderen Aspekt können Oligonukleotide (von denen eines oder beide markiert sein können) als PCR-Primer verwendet werden, um entweder die gesamte Länge oder ein Fragment von EER-7 zu klonieren oder um die Gegenwart von Nukleinsäuren, die EER-7 codieren, zu detektieren. In einer weiteren Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid mit einem EER-7-DNA-Molekül eine Tripelhelix bilden. Im Allgemeinen werden Oligonukleotide synthetisch hergestellt, vorzugsweise auf einem Nukleinsäure-Synthesizer. Dementsprechend können Oligonukleotide mit nicht in der Natur vorkommenden phosphoresteranalogen Bindungen wie z. B. Thioesterbindungen usw. hergestellt werden.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt Gegensinn-Nukleinsäuren (einschließlich von Ribozymen), die verwendet werden können, um die Expression von erfindungsgemäßem EER-7 zu inhibieren, insbesondere, um die EER-7-Wirkungen auf die Kollagen-Quervernetzung zu unterdrücken. Eine „Gegensinn-Nukleinsäure" ist ein einzelsträngiges Nukleinsäurenmolekül, das unter zytoplasmatischen Bedingungen bei Hybridisierung mit komplementären Basen in einem RNA- oder DNA-Molekül die Rolle des Letzteren inhibiert. Wenn die RNA ein Boten-RNA-Transkript ist, ist die Gegensinn-Nukleinsäure ein Gegentranskript oder ein mit der mRNA interferierendes komplementäres Nukleinsäurenmolekül. Vorliegend wird der Begriff „Gegensinn" breit verwendet, um RNA-RNA-Interaktionen, RNA-DNA-Interaktionen, Ribozyme und durch RNase-H vermittelten Stillstand abzudecken. Gegensinn-Nukleinsäuremoleküle können von einem rekombinanten Gen zur Expression in einer Zelle codiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5,814,500 , US-Patent Nr. 5,811,234 ), oder alternativ können sie synthetisch hergestellt werden (z. B. US-Patent Nr. 5,780,607 ).
Zu besonderen nichtbegrenzenden Beispielen synthetischer Oligonukleotide, die in Betracht gezogen werden, gehören Oligonukleotide, die Phosphorothioate, Phosphotriester, Methylphosphonate, kurzkettige Alkyle oder Cycloalkylbindungen zwischen den Zuckerresten oder kurzkettige heteroatomische oder heterozyklische Bindungen zwischen den Zuckerresten enthalten. Am bevorzugtesten sind diejenigen mit CH₂-NH-O-CH₂, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂, CH₂-O-N(CH₃)-CH₂, CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂ und O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-Rückgraten (wobei Phosphodiester für O-PO₂-O-CH₂ steht). US-Patent No. 5,677,437 beschreibt heteroaromatische Oligonukleosidbindungen. Stickstoff-Linker oder stickstoffhaltige Gruppen können ebenfalls verwendet werden, um Oligonukleotidmimetika herzustellen ( US-Patente Nr. 5,792,844 und No. 5,783,682 ). US-Patent No. 5,637,684 beschreibt Phosphoramidat- und Phosphorothioamidat-Oligomerverbindungen. Gleichfalls in Betracht werden Oligonukleotide mit Morpholin-Rückgratstrukturen gezogen ( US-Patent Nr. 5,034,506 ). In anderen Ausführungsformen, wie z. B. bei dem Peptidnukleinsäure(PNA)-Rückgrat, kann das Phosphodiesterrückgrat des Oligonukleotids durch ein Polyamidrückgrat ersetzt sein, wobei die Basen direkt oder indirekt an die Azastickstoffatome des Polyamidrückgrates gebunden sind (Nielsen et al., Science 254: 1497 (1991)). Andere synthetische Oligonukleotide können substituierte Zuckerreste enthalten, die einen der folgenden Reste an der 2'-Position umfassen: OH, SH, SCH₃, F, OCN, O(CH₂)_nNH₂ oder O(CH₂)_nCH₃, wobei n für einen Wert von 1 bis ungefähr 10 steht; C₁ bis C₁₀-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; OF₃; OCF₃, O-; S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamin; Polyalkylamin; substituiertes Silyl; einen Fluoreszeinrest; eine RNA spaltende Gruppe; eine Reportergruppe; einen Interkalator; eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotids, und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Oligonukleotide können auch Zuckermimetika wie Cyclobutyle oder andere Kohlenstoffzyklen anstelle der Pentofuranosylgruppe haben. Nukleotideinheiten mit anderen Nukleosiden als Adenosin, Cytidin, Guanosin, Thymidin und Uridin, wie z. B. Inosin, können in einem Oligonukleotidmolekül verwendet werden.
EER-7-Nukleinsäuren
Ein EER-7 codierendes Gen, ob genomische DNA oder cDNA, kann aus einer beliebigen Quelle, insbesondere aus einer menschlichen cDNA- oder genomischen Bibliothek, isoliert werden. Verfahren, um das EER-7-Gen zu erlangen, sind aus dem Stand der Technik wohlbekannt, wie oben beschrieben (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, oben). Die DNA kann durch aus dem Stand der Technik bekannte Standardverfahren aus klonierter DNA (z. B. einer DNA-„Bibliothek”) erhalten werden, und sie wird vorzugsweise aus einer cDNA-Bibliothek erhalten, die aus Geweben mit einem hohen Expressionsniveau des Proteins durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung genomischer DNA oder von Fragmenten davon, aus der gewünschten Zelle gereinigt (siehe, zum Beispiel, Sambrook et al., 1989, oben; Glover, D.M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Band I, II), hergestellt worden ist. Aus genomischer DNA gewonnene Klone können regulatorische und Intron-DNA-Regionen zusätzlich zu den codierenden Regionen enthalten; aus cDNA gewonnene Klone enthalten keine Intronsequenzen. Unabhängig von der Quelle sollte zur Vermehrung des Gens das Gen in einem geeigneten Vektor molekular kloniert werden. Die Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, das das gewünschte EER-7-Gen enthält, kann auf eine Anzahl von Weisen geschehen. Zum Beispiel kann ein Teil eines EER-7-Gens, nachfolgend exemplifiziert, gereinigt und markiert werden, um eine markierte Sonde herzustellen, und die erzeugte DNA kann durch Nukleinsäurehybridisierung mit der markierten Sonde gescreent werden (Benton und Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961 (1975)). Die DNA-Fragmente mit wesentlicher Homologie zu der Sonde, wie z. B. eine allelische Variante aus einem anderen Individuum, werden Hybride bilden. In einer spezifischen Ausführungsform werden Hybridisierungsbedingungen höchster Stringenz verwendet, um ein homologes EER-7-Gen zu identifizieren.
Die weitere Selektion kann auf der Basis der Eigenschaften des Gens durchgeführt werden, z. B. wenn das Gen ein Proteinprodukt codiert, das die isoelektrischen oder elektrophoretischen Eigenschaften, die Aminosäurenzusammensetzung, die teilweise oder gesamte Aminosäurensequenz, die Antikörperbindungsaktivität oder das Ligandenbindungsprofil des EER-7-Proteins, wie hier offenbart, hat. Somit kann die Gegenwart des Gens durch Assays detektiert werden, die sich auf die physikalischen, chemischen, immunologischen oder funktionalen Eigenschaften des exprimierten Produkts stützen.
Andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäurensequenz wie ein EER-7-Gen codieren, können verwendet werden. Hierzu gehören allelische Varianten, Speziesvarianten, sequenzkonservative Varianten und funktionale Varianten, ohne hierauf beschränkt zu sein.
Es können auch Aminosäuresubstitutionen eingeführt werden, um eine Aminosäure mit einer besonders bevorzugten Eigenschaft an die Stelle einer anderen zu setzen. Zum Beispiel kann ein Cystein an einer möglichen Stelle für Disulfidbrücken mit einem anderen Cystein eingeführt werden.
Die die EER-7-Derivate und Analoga codierenden Gene können durch verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Produktion führen, können auf dem genetischen oder auf dem Proteinniveau vorgenommen werden. Zum Beispiel kann die klonierte EER-7-Gensequenz durch beliebige von zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Strategien (Sambrook et al., 1989, oben) modifiziert werden. Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit einer oder mehreren Restriktionsendonuklease(n) geschnitten, gewünschtenfalls gefolgt von weiterer enzymatischer Modifikation, isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des ein Derivat oder Analogon von EER-7 codierenden Gens ist darauf zu achten, dass das modifizierte Gen im gleichen translationellen Leseraster wie das EER-7-Gen bleibt und in der Genregion, in der die gewünschte Aktivität codiert wird, von Translationsstopsignalen ununterbrochen bleibt.
Weiterhin kann die EER-7-codierende Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu schaffen und/oder zu zerstören oder um Variationen in Codierungsregionen hervorzubringen und/oder neue Restriktionsendonukleaseschnittstellen zu bilden oder zuvor existierende zu zerstören, um die weitere in vitro-Modifikation zu erleichtern. Solche Modifikationen können vorgenommen werden, um Restriktionsschnittstellen einzuführen und die Klonierung des EER-7-Gens in einen Expressionsvektor zu erleichtern. Jede beliebige Technik zur Mutagenese, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, darunter ortsgerichtete in vitro-Mutagenese (Hutchinson, C., et al., J. Biol. Chem. 253: 6551 (1978); Zoller und Smith, DNA 3: 479–488 (1984); Oliphant et al., Gene 44: 177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 710 (1986)), Verwendung von TAB-Linkern (Pharmacia), usw., ohne darauf beschränkt zu sein. Für die ortsgerichtete Mutagenese sind PCR-Techniken bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, „Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, Seiten 61–70).
Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt werden. Eine große Anzahl von aus dem Stand der Technik bekannten Vektor-Wirts-Systemen kann verwendet werden. Zu den möglichen Vektoren gehören ohne Beschränkung darauf Plasmide oder modifizierte Viren, aber das Vektorsystem muss mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Zu den Beispielen für Vektoren gehören ohne Beschränkung darauf E. coli, Bakteriophagen wie z. B. Lambda-Derivate oder Plasmide wie z. B. pBR322-Derivate oder pUC-Plasmid-Derivate, z. B. pGEX-Vektoren, pmal-c, pFLAG usw. Die Einfügung in einen Klonierungsvektor kann z. B. dadurch erreicht werden, dass man das DNA-Fragment in einen Klonierungsvektor ligiert, der komplementäre klebrige Enden hat. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsschnittstellen, die verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, in dem Klonierungsvektor nicht vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine beliebige gewünschte Schnittstelle hergestellt werden, indem man Nukleotidsquenzen (Linker) an die DNA-Enden ligiert; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide umfassen, die Restriktionsendonukleasenerkennungssequenzen codieren. Weiterhin können einfache PCR oder überlappende PCR verwendet werden, um ein Fragment in einen Klonierungsvektor einzufügen.
Rekombinante Moleküle können durch Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in Wirtszellen eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden. Vorzugsweise ist das klonierte Gen in einem Shuttle-Vektor-Plasmid enthalten, das die Expansion in einer Klonierungszelle, z. B. E. coli ermöglicht, ebenso wie die leichte Reinigung für das nachfolgende Einbringen in eine geeignete Expressionszelllinie, wenn dies erwünscht ist. Zum Beispiel kann ein Shuttle-Vektor, dies ist ein Vektor, der sich in mehr als einer Art von Organismus replizieren kann, zur Replikation sowohl in E. coli als auch in Saccharomyces cerevisiae hergestellt werden, indem man Sequenzen aus einem E. coli-Plasmid mit Sequenzen aus dem 2μ-Hefeplasmid verbindet.
EER-7-regulatorische Nukleinsäuren
Elemente des EER-7-Promotors können dadurch identifiziert werden, dass man die menschliche Genomregion stromaufwärts von der EER-7-Startstelle absucht, z. B., indem man Deletionsmutanten herstellt und sie auf die Expression hin überprüft, oder mittels des TRANS-FAC-Algorithmus. Sequenzen bis zu ungefähr 6 bis etwa 10 Kilobasen (kB) oder mehr stromaufwärts von der EER-7-Startstelle können gewebsspezifische regulatorische Elemente enthalten.
Der Begriff „EER-7-Promotor" umfasst Promotoren, die hergestellt werden können, indem man nichtessentielle dazwischen liegende Sequenzen stromaufwärts von der EER-7-Transkriptionsinitiationsstelle deletiert.
Ein EER-7-Promotor kann mit einer heterogenen codierenden Sequenz funktional verbunden sein, z. B. mit einer Sequenz für ein Reportergen (Luziferase und grünes Fluoreszenzprotein sind Beispiele für Reportergene) in einem Konstrukt. Dieses Konstrukt führt zur Expression der heterologen codierenden Sequenz unter der Kontrolle des EER-7-Promotors, z. B. kann ein Reportergen unter Bedingungen, die unter normalen Bedingungen die Expression von EER-7 verursachen, exprimiert werden. Dieses Konstrukt kann in Screeningassays für Östrogenrezeptoragonisten und -antagonisten, nachfolgend beschrieben, verwendet werden.
Expression von EER-7-Polypeptiden
Die Nukleotidsequenz, die EER-7 oder ein antigenes Fragment, Derivat oder Analogon davon oder ein funktionell aktives Derivat einschließlich eines chimären Proteins davon codiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden, d. h. in einen Vektor, der die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der eingefügten proteincodierenden Sequenz enthält. Somit kann eine EER-7 codierende Nukleinsäure funktional mit einem Promotor in einem Expressionsvektor verbunden sein. Sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen können kloniert und unter Kontrolle solcher regulatorischer Sequenzen exprimiert werden. Solche Vektoren können verwendet werden, um funktionale oder funktionell inaktivierte EER-7-Polypeptide zu exprimieren.
Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auf einem rekombinanten Expressionsvektor bereitgestellt werden, oder sie können von dem EER-7 codierenden nativen Gen und/oder seinen flankierenden Regionen geliefert werden.
Zu den potentiellen Wirts-Vektor-Systemen gehören ohne Beschränkung darauf mit Expressionsplasmiden transfizierte oder mit Viren (z. B. dem Vacciniavirus, Adenovirus, adenoassoziierten Virus, Herpesvirus, etc.) infizierte Säugerzellsysteme; mit Viren (z. B. dem Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme; Mikroorganismen wie z. B. Hefevektoren enthaltende Hefe; oder mit Bakteriophagen, DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien. Die Expressionselemente der Vektoren sind von unterschiedlicher Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirts-Vektor-System kann ein beliebiges unter einer Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden.
Die Expression des EER-7-Proteins kann durch beliebige aus dem Stand der Technik bekannte Promotor/Enhancer-Elemente kontrolliert werden, aber diese regulatorischen Elemente müssen in dem zur Expression ausgewählten Wirt funktionsfähig sein. Zu den Promotoren, die verwendet werden können, um die EER-7-Gen-Expression zu kontrollieren, gehören der Zytomegalievirus (CMV)-Promotor ( US-Patent Nrn. 5,385,839 und 5,168,062 ), die frühe Promotorregion von SV40 (Benoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310)), der in dem 3'-„long terminal repeat" des Rous-Sarkomvirus enthaltene Promotor (Yamamoto et al., Cell 22: 787– 797 (1980)), der Promotor der Herpes-Thymidinkinase (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445 (1981)), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., Nature 296: 39–42 (1982)); prokaryontische Expressionsvektorelemente wie der β-Lactamase-Promotor (Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731 (1978)) oder der tac-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25, (1983)); siehe auch „Useful Proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242: 74–94, (1980); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie der Gal-4-Promotor, der ADC(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, der PGK(Phosphoglycerolkinase)-Promotor, der Promotor für alkalische Phosphatase; und Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität zeigen, insbesondere endothelzellspezifische Promotoren, ohne hierauf beschränkt zu sein.
Alternativ kann die Proteinexpression dadurch kontrolliert werden, dass man einen Transkriptionsaktivator (siehe US-Patent 6,015,709 ) bereitstellt. Die Aktivatoren können verwendet werden, um ein hohes Maß der Transkription von natürlich vorkommenden oder ansonsten ins Genom integrierten Genen anzutreiben. Die erfindungsgemäßen chimären Aktivatoren sind besonders geeignet zur Aktivierung der Transkription von in einzelnen Kopien integrierten Genen, die in der Vergangenheit nicht in akzeptablem Maß transaktiviert wurden.
Lösliche Formen des Proteins können dadurch gewonnen werden, dass man die Kulturflüssigkeit gewinnt oder Einschlusskörper solubilisiert, z. B. durch Detergenzienbehandlung und gewünschtenfalls Beschallung oder andere mechanische Verfahren, wie oben beschrieben. Das solubilisierte oder lösliche Protein kann unter Verwendung verschiedener Techniken isoliert werden, z. B. durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), isoelektrische Fokussierung, 2-dimensionale Gelelektrophorese, Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts-, Immunoaffinitäts- und Größenausschlußsäulenchromatographie), Zentrifugation, differenzielle Löslichkeit, Immunopräzipitation oder irgendeine andere standardmäßige Technik zur Reinigung von Proteinen.
Vektoren
Eine große Vielzahl von Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen kann zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet werden. Verwendbare Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten chromosomaler, nichtchromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen bestehen. Zu den geeigneten Vektoren gehören Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z. B. die E. coli-Plasmide Col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., Gene 67: 31–40 (1988)), pM69 und ihre Derivate, Plasmide wie RP4; Phagen-DNAs, z. B. die verschiedenen Derivate des Phagen λ, z. B. NM989, und andere Phagen-DNAs, z. B. M13 und filamentöse einzelsträngige Phagen-DNA; Hefeplasmide wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon; in eukaryontischen Zellen verwendbare Vektoren, z. B. in Insekten- oder Säugerzellen verwendbare Vektoren; aus Kombinationen von Plasmid- und Phagen-DNA gewonnene Vektoren, wie z. B. Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen-DNA oder andere Expressionskontrollsequenzen zu verwenden; und dergleichen.
Virale Vektoren wie z. B. Lentiviren, Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren, Vakziniavirus, Alphavirus, Baculovirus und andere rekombinante Viren mit erwünschtem zellulärem Tropismus. Somit kann unter Verwendung eines viralen Vektors oder durch direkte Einführung der DNA ein funktionales oder mutiertes EER-7-Protein oder ein Polypeptiddomänenfragment davon in vivo, ex vivo oder in vitro eingeführt werden. Eine Expression in ausgewählten Geweben kann dadurch erreicht werden, dass man den transgenen Vektor auf spezifische Zellen lenkt, wie z. B. mit einem viralen Vektor oder einem Rezeptorliganden, oder dass man einen gewebsspezifischen Promotor verwendet, oder beides. Eine gezielte Genübertragung ist in der internationalen Patentveröffentlichung WO 95/28494 , im Oktober 1995 veröffentlicht, beschrieben.
Gewöhnlich zur in vivo- oder ex vivo-Zielsteuerung und zu therapeutischen Verfahren verwendete Vektoren sind DNA-basierte Vektoren und retrovirale Vektoren. Methoden zur Herstellung und Verwendung von viralen Vektoren sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Miller und Rosman, BioTechniques, 7: 980–990 (1992)). Die viralen Vektoren sind vorzugsweise replikationsdefektiv, d. h., sie sind außerstande, sich autonom in der Zielzelle zu replizieren. Im allgemeinen fehlt dem Genom der replikationsdefektiven viralen Vektoren, die im Bereich der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mindestens eine Region, die zur Replikation des Virus in der infizierten Zelle notwendig ist. Diese Regionen können durch eine beliebige einem Fachmann bekannte Technik entweder (ganz oder teilweise) entfernt oder außer Funktion gesetzt werden. Zu diesen Techniken gehören die vollständige Entfernung, Substitution (durch andere Sequenzen, insbesondere durch die eingefügte Nukleinsäure), teilweise Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen zu einer (zur Replikation) essentiellen Region. Unter Verwendung der Techniken der genetischen Manipulation oder durch Behandlung mit mutagenen Mitteln können solche Techniken in vitro (an der isolierten DNA) oder in situ durchgeführt werden. Vorzugsweise behält das replikationsdefektive Virus diejenigen Sequenzen seines Genoms, die notwendig sind, um die Viruspartikel zu verkapseln.
Zu den DNA-viralen Vektoren gehören attenuierte oder defektive DNA-Viren, wie z. B. Herpes-simplex-Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenovirus, adenoassoziiertes Virus (AAV) und dergleichen, ohne darauf beschränkt zu sein. Defektive Viren, denen virale Gene vollständig oder fast vollständig fehlen, sind bevorzugt. Ein defektives Virus ist nach der Einführung in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwendung defektiver viraler Vektoren erlaubt die Verabreichung an Zellen in einem spezifischen, lokalisierten Bereich ohne Sorge, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Auf diese Weise kann ein bestimmtes Gewebe spezifisch angesteuert werden. Zu Beispielen für besondere Vektoren gehören ohne Beschränkung darauf ein defektiver Herpesvirus 1 (HSV1)-Vektor (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320–330 (1991)), ein defektiver Herpesvirus-Vektor, dem ein Glycoprotein-L-Gen fehlt (Patentveröffentlichung RD 371005 A ), oder andere defektive Herpesvirus-Vektoren (Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/21807 , veröffentlicht am 29. September 1994; Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/05263 , veröffentlicht am 2. April 1994); ein attenuierter Adenovirus- Vektor, wie der von Stratford-Perricaudet et al. beschriebene Vektor (J. Clin. Invest. 90: 626–630 (1992); siehe auch La Salle et al., Science 259: 988–990 (1993)); ein defektiver Adenoassoziierter-Virus-Vektor (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096–3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63: 3822–3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3988–3996 (1988)); und ein Sinbidis-Virus-Vektor (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/06237 ; US-Patent Nr. 5,091,309 ).
Verschiedene Firmen stellen virale Vektoren kommerziell her, darunter ohne Beschränkung darauf Avigen, Inc. (Alameda, CA; AAV-Vektoren), Cell Genesys (Foster City, CA; retrovirale, adenovirale, AAV-Vektoren und lentivirale Vektoren), Clontech (retrovirale und baculovirale Vektoren), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; adenovirale und AAV-Vektoren), Genvec (adenovirale Vektoren), IntroGene (Leiden, Niederlande; adenovirale Vektoren), Molecular Medicine (retrovirale, adenovirale, AAV- und herpesvirale Vektoren), Norgen (adenovirale Vektoren), Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom; lentivirale Vektoren) und Transgene (Straßburg, Frankreich; adenovirale, Vakzinia-, retrovirale und lentivirale Vektoren).
Zur in vivo-Verabreichurig wird bevorzugt eine geeignete immunsuppressive Behandlung zusammen mit dem viralen Vektor, z. B. einem adenoviralen Vektor, verwendet, um eine Immundeaktivierung des viralen Vektors und der transfizierten Zellen zu vermeiden. Zum Beispiel können immunsuppressive Cytokine wie Interleukin-12 (IL-12), Interferon γ (IFN-γ) oder Antikörper gegen CD4 bereitgestellt werden, um humorale oder zelluläre Immunantworten auf die viralen Vektoren zu blockieren (siehe z. B. Wilson, Nature Medicine (1995)). In diesem Hinblick ist es vorteilhaft, einen viralen Vektor zu verwenden, der dahingehend konstruiert ist, dass er eine minimale Anzahl von Antigenen exprimiert.
Gemäß einem anderen Aspekt kann der Vektor in vivo durch Lipofektion, als nackte DNA, oder durch andere die Transfektion erleichternde Mittel (Peptide, Polymere usw.) eingeführt werden. Synthetische kationische Lipide können verwendet werden, um Liposomen für die in vivo-Transfektion eines einen Marker codierenden Gens herzustellen (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413–7417 (1987); Felgner und Ringold, Science 337: 387–388 (1989); siehe auch Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8027–8031 (1988); Ulmer et al., Science 259: 1745–1748 (1993)). Verwendbare Lipidverbindungen und -zusammensetzungen zum Transfer von Nukleinsäuren sind in den Internationalen Patentveröffentlichungen WO 95/18863 und WO 96/17823 und in US-Patent Nr. 5,459,127 beschrieben. Zu Zwecken der Zielsteuerung können Lipide chemisch mit anderen Molekülen gekoppelt werden (siehe Mackey et al., oben). Zielsuchende Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter, Proteine wie Antikörper, oder Nicht-Peptid-Moleküle können chemisch mit Liposomen gekoppelt werden.
Auch andere Moleküle sind nützlich zur Erleichterung der Transfektion einer Nukleinsäure in vivo, wie z. B. ein kationisches Oligopeptid (z. B. Internationale Patentveröffentlichung WO 95/21931 ), von DNA-bindenden Proteinen abgeleitete Peptide (siehe z. B. Internationale Patentveröffentlichung WO 96/25508 ), oder ein kationisches Polymer z. B. Internationale Patentveröffentlichung WO 95/21931 .
Alternativ können nichtvirale DNA-Vektoren zur Gentherapie durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren in die gewünschten Wirtszellen eingeführt werden, z. B. durch Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphat-fällung, Verwendung einer Gen-Kanone (ballistische Transfektion; siehe z. B. US-Patent Nr. 5,204,253 , US-Patent Nr. 5,853,663 , US-Patent Nr. 5,885,795 und US-Patent Nr. 5,702,384 und siehe Sanford, TIB-TECH, 6: 299–302 (1988); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11478–11482 (1993); und Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1568–9572 (1990)) oder Anwendung eines DNA-Vektor-Transporters (siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963–967 (1992); Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621–14624 (1988); Hartmut et al., Kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 eingereicht am 15. März 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 2726–2730 (1991)). Es können auch rezeptorvermittelte DNA-Übertragungsansätze verwendet werden (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147–154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987). Die US-Patente Nm. 5,580,859 und 5,589,466 offenbaren die Übertragung exogener DNA-Sequenzen, frei von transfektionserleichternden Mitteln, in einem Säuger. Unlängst wurde eine in vivo-DNA-Transfertechnik mit relativ geringer Spannung und hoher Effizienz beschrieben (Mir et al., C.P. Acad. Sci., 321: 893 (1998); WO 99/01157 ; WO 99/01158 ; WO 99/01175 ).
EER-7-Bindungspartner und Substrate
Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Identifikation physiologischer Bindungspartner und Substrate von EER-7. Die Gegenwart der vier SRCR-Domänen weist stark darauf hin, dass EER-7 ein Ziel für Protein-Protein-Interaktionen ist. Ein Verfahren zur Auswertung und Identifikation von EER-7-Bindungspartnern ist ein Hefe-Zweihybrid-Screeningsystem. Vorzugsweise wird das Hefe-Zweihybrid-Screening unter Verwendung einer endothelialen Zellbibliothek mit Hefen, die mit rekombinantem EER-7 transfiziert sind, durchgeführt. Alternativ kann EER-7 als ein Einfang- oder Affinitätsreinigungsreagens verwendet werden. In einer anderen Alternative kann markiertes EER-7 als Sonde für die Bindung verwendet werden, z. B. durch Immunopräzipitation oder Western-Analyse.
Grundsätzlich sind die bindenden Interaktionen zwischen EER-7 und beliebigen seiner Bindungspartner oder Substrate unter Bedingungen, die den in der extrazellulären Matrix gefundenen nahe kommen, d. h. unter physiologischen Salzstärke-, pH- und Temperaturbedingungen, am stärksten. Eine Störung dieser Bedingungen neigt dazu, die Stabilität einer bindenden Interaktion zu unterbrechen.
Zu den Substratkandidaten gehören Kollagen, Elastin und andere extrazelluläre Matrixproteine, ohne darauf beschränkt zu sein.
Antikörper gegen EER-7
Antikörper gegen EER-7 sind u. a. zur Diagnose und zur intrazellulären Regulation der EER-7-Aktivität, wie nachfolgend dargestellt, verwendbar. Ein rekombinant oder durch chemi sche Synthese hergestelltes EER-7-Polypeptid und Fragmente oder andere Derivate oder Analoge davon, einschließlich von Fusionsproteinen, können als Immunogen verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die das EER-7-Polypeptid erkennen. Zu solchen Antikörpern gehören ohne Beschränkung darauf polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek. Ein solcher Antikörper ist vorzugsweise spezifisch für das menschliche EER-7, und er kann entweder eine mutierte Form von EER-7 oder Wildtyp-EER-7 oder beide erkennen.
Man kann den Hydropathie-Index der Aminosäuren, wie von Kyte and Doolittle (1982) dargestellt, wo gezeigt wurde, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Hydropathie-Indizes ersetzt werden und immer noch eine ähnliche biologische Aktivität behalten können, verwenden, um Epitopregionen zu bestimmen. Ein Austausch ähnlicher Aminosäuren kann auf der Basis der Hydrophilie erfolgen, insbesondere dort, wo die erwünschte biologische Funktion des zu erzeugenden Polypeptids in der Verwendung in immunologischen Ausführungsformen bestehen soll. Siehe z. B. US-Patent 4,554,101 , das darlegt, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines „Proteins", bestimmt durch die Hydrophilie seiner zusammenhängenden Aminosäuren, mit seiner Immunogenität korreliert. Demgemäß wird festgestellt, dass Austausche anhand der jeder Aminosäure zugeordneten Hydrophilie vorgenommen werden können. Bei der Verwendung entweder des Hydrophilie-Index oder des Hydropathie-Index, die jeder Aminosäure Werte zuteilen, ist es bevorzugt, Aminosäurenaustausche so einzuführen, dass diese Werte ± 2 betragen, wobei Werte von ± 1 besonders bevorzugt und die Werte innerhalb von ± 0,5 in höchstem Maße bevorzugt sind.
Verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen das EER-7-Polypeptid oder Derivate oder Analoge davon verwendet werden. Zur Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion des EER-7-Polypeptids oder eines Derivats (z. B. eines Fragment- oder Fusionsproteins) davon immunisiert werden, darunter ohne Beschränkung darauf Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen etc.. In einer Ausführungsform kann das EER-7-Polypeptid oder Fragment davon mit einem immunogenen Träger konjugiert sein, z. B. Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) oder Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH). Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu steigern, in Abhängigkeit von der Wirtsspezies, darunter ohne Beschränkung darauf Freunds (vollständiges und unvollständiges) Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolezithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Napfschneckenhämozyanine, Dinitrophenol und potentiell verwendbare menschliche Adjuvantien wie BOG (bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Zur Herstellung von gegen das EER-7-Polypeptid oder Fragment oder Analogon oder Derivat davon gerichteten monoklonalen Antikörpern kann jede Technik, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch einheitliche Zelllinien in der Kultur bereitstellt, verwendet werden. Zu diesen gehören ohne Beschränkung darauf die ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature, 256: 495–497 (1975)) entwickelte Hybridom-Technik, ebenso die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 80: 2026–2030 (1983)); und die EBV-Hybridom-Technik zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96 (1985)). In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren hergestellt werden (Internationale Patentveröffentlichung WO 89/12690 ). In der Tat können zur Herstellung „chimärer Antikörper" (Morrison et al., J. Bacteriol., 159: 870 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604–608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452–454 (1985)) durch Zusammenspleißen der Gene eines für ein EER-7-Polypeptid spezifischen murinen Antikörpermoleküls mit Genen eines menschlichen Antikörpermoleküls geeigneter biologischer Aktivität entwickelte Techniken erfindungsgemäß verwendet werden; solche Antikörper liegen im Bereich dieser Erfindung. Solche menschlichen oder humanisierten chimären Antikörper sind zur Verwendung in der Therapie menschlicher Erkrankungen oder Störungen (nachfolgend beschrieben) bevorzugt, weil die menschlichen oder humanisierten Antikörper mit sehr viel geringerer Wahrscheinlichkeit als xenogene Antikörper eine Immunantwort, insbesondere eine allergische Antwort, auslösen.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Zu solchen Fragmenten gehören ohne Beschränkung darauf: das F(ab')₂-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel hergestellt werden können.
Zur Herstellung von Einzelkettenantikörpern beschriebene Techniken ( US-Patente Nrn. 5,476,786 , 5,132,405 und US-Patent 4,946,778 ) können angepasst werden, um für das EER-7-Polypeptid spezifische Einzelkettenantikörper herzustellen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung verwendet die zur Herstellung von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Techniken (Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989)), um die leichte und schnelle Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit erwünschter Spezifität für ein EER-7-Polypeptid oder seine Derivate oder Analoga zu erlauben.
Bei der Herstellung und Verwendung von Antikörpern kann ein Screening auf die oder ein Test mit den erwünschten Antikörpern durch aus dem Stand der Technik bekannte Techniken erreicht werden, z. B. durch Radioimmunassay, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), „Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitinreaktionen, Immunodiffusionsassays, in situ-Immunoassays (unter Verwendung z. B. von kolloidalem Gold, Enzymen oder Radioisotopenmarkierungen), Western-Blots, Fällungsreaktionen, Agglutinationsassays (z. B. Gelagglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplementbindungsassays, Immunfluoreszenzassays, Protein A-Assays, Immunelektrophoreseassays usw. In einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung dadurch detektiert, dass man eine Markierung auf dem primären Antikörper detektiert. In einer anderen Ausführungsform wird der primä re Antikörper dadurch detektiert, dass man an die Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagens an den primären Antikörper detektiert. In einem weiteren Aspekt ist der sekundäre Antikörper markiert. Aus dem Stand der Technik sind viele Mittel zur Detektion der Bindung in einem Immunassay bekannt und innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Zum Bespiel kann man zur Detektion von Antikörpern, die ein spezifisches Epitop eines EER-7-Polypeptids erkennen, die erzeugten Hybridomas auf ein Produkt hin durchmustern, das ein EER-7-Polypeptidfragment bindet, das ein solches Epitop enthält. Zur Selektion eines für ein EER-7-Polypeptid aus einer bestimmten Tierspezies spezifischen Antikörpers kann man anhand der positiven Bindung an ein von den Zellen dieser Tierspezies exprimiertes oder aus ihm isoliertes EER-7-Polypeptid selektieren.
Die zuvor genannten Antikörper können in aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden, die die Lokalisation und Aktivität des EER-7-Polypeptids betreffen, z. B. Western-Blotting, Darstellung des EER-7-Polypeptids in situ, Messung seiner Spiegel in geeigneten physiologischen Proben, usw., wobei man beliebige der oben genannten oder aus dem Stand der Technik bekannten Detektionstechniken verwendet. Solche Antikörper können auch in Assays für die Ligandenbindung verwendet werden, z. B. wie in US-Patent Nr. 5,679, 582 beschrieben. Die Antikörperbindung erfolgt im Allgemeinen am leichtesten unter physiologischen Bedingungen, z. B. bei einem pH-Wert von zwischen 7 und 8, und physiologischer Ionenstärke. Die Gegenwart eines Trägerproteins in den Pufferlösungen stabilisiert die Assays. Während es eine gewisse Toleranz gegenüber Störungen der optimalen Bedingungen, z. B. Erhöhung oder Senkung der Ionenstärke, Temperatur oder des pH-Wertes oder Zusatz von Detergenzien oder chaotropischen Salzen gibt, verringern solche Störungen die Bindungsstabilität.
Insbesondere können Antikörper, die die Aktivität des EER-7-Polypeptids agonisieren oder antagonisieren, hergestellt werden. Insbesondere können intrazelluläre Einzelketten-Fv-Antikörper verwendet werden, um EER-7 zu regulieren (zu inhibieren) (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 7884–7893 (1993); Chen., Mol. Med. Today, 3: 160–167 (1997); Spitz et al., Anticancer Res., 16: 3415–22 (1996); Indolfi et al., Nat. Med., 2: 634–635 (1996); Kijma et al., Pharmacol. Ther., 68: 247–267 (1995)). Solche Antikörper können unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen Assays zur Identifikation von Liganden verwendet werden.
Durchmusterung und Chemie
Von den EER-7-codierenden Genen abgeleitete Nukleotidsequenzen und von EER-7 abgeleitete Peptidsequenzen sind nützliche Ziele zur Identifikation von Pharmaka, die zur Behandlung von mit östrogenregulierten Prozessen assoziierten Krankheiten wirksam sind. Ohne Beschränkung darauf gehören zu Zielen der Pharmaka (I) von dem EER-7-codierenden Gen abgeleitete isolierte Nukleinsäuren; (II) von EER-7-Polypeptiden abgeleitete isolierte Peptide und Polypeptide; und, am wichtigsten, (III) verschiedene Östrogenrezeptoren, die selektiv die EER-7-Expression regulieren.
Insbesondere erlauben die Identifikation und Isolation von EER-7 die Entwicklung von Screeningverfahren, insbesondere für das Hochdurchsatzscreening von Molekülen, die die Aktivität von EER-7 hoch- oder herunterregulieren, z. B., indem sie es ermöglichen, EER-7 in größeren Mengen zu exprimieren, als aus natürlichen Quellen isoliert werden können, oder in Indikatorzellen, die spezifisch gefertigt sind, um die Aktivität von EER-7, das nach der Transfektion oder Transformation der Zellen exprimiert wird, anzuzeigen. Demgemäß beschreibt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifikation spezifischer Östrogenrezeptorliganden, die die EER-7-Expression verändern, und ebenso Moleküle, die direkt auf EER-7 wirken, wobei verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Screeningverfahren verwendet werden.
Jedes im Stand der Technik bekannte Screeningverfahren kann zur Suche nach EER-7-Agonisten oder Antagonisten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zur Suche von niedermolekularen Liganden oder Ligandenanaloga und -mimetika sowie Screeningverfahren für natürliche Liganden, die an EER-7 binden und seine Expressionsaktivität in vivo agonisieren oder antagonisieren. Zum Beispiel können Bibliotheken von Naturprodukten unter Verwendung der erfindungsgemäßen Assays auf Moleküle durchmustert werden, die die Expression oder Aktivität von EER-7 agonisieren oder antagonisieren.
Ein anderer Ansatz verwendet rekombinante Bakteriophagen, um große Bibliotheken herzustellen. Unter Verwendung des „Phagenverfahrens" (Scott und Smith, Science 1990, 249: 386–390; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1990, 87: 6378–6382; Devlin et al., Science 1990, 49: 404–406) können sehr große Bibliotheken hergestellt werden (10⁶ – 10⁸ chemische Entitäten). Ein zweiter Ansatz verwendet in erster Linie chemische Verfahren, unter denen das Geysen-Verfahren (Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709–715; Geysen et al., J. Immunologic Method 1987, 102: 259–275; und das Verfahren von Fodor et al. (Science 1991, 251: 767–773) beispielhaft genannt seien. Furka et al. (14th International Congress of Biochemistry, Band Nr. 5 1988, Abstract FR:013, Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 1991, 37: 487–493), Houghton ( US-Patent Nr. 4,631,211 ) und Rutter ( US-Patent Nr. 5,010,175 ) beschreiben Verfahren zur Herstellung eines Gemischs von Peptiden, die als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können.
Gemäß einem anderen Aspekt können synthetische Bibliotheken (Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 10700-4; Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 10922–10926; Lam et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/00252 ; Kocis et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/28028 ) und dergleichen verwendet werden, um Liganden zu suchen, die EER-7 erfindungsgemäß regulieren. Die Testsubstanzen werden aus großen Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen herausgesucht. Zur zufälligen und zur gerichteten Synthese von saccharid-, peptid- und nukleinsäurebasierten Verbindungen werden gegenwärtig zahlreiche Mittel verwendet. Bibliotheken synthetischer Substanzen sind gegenwärtig kommerziell erhältlich von Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bibliothek ist von Aldrich (Milwaukee, WI) erhältlich. Alternativ sind Naturstoffbibliotheken in der Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten z. B. von Pan Laborstories (Bothell, WA) oder MycoSearch (NC) erhältlich oder ohne weiteres herstellbar. Weiterhin lassen sich natürlich und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Substanzen ohne weiteres durch herkömmliche chemische, physische und biochemische Mittel modifizieren (Blondelle et al., Tib Tech 1996, 14: 60).
Das Wissen um die Primärsequenz von EER-7 und um die Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen mit bekannten Funktionen können einen Ausgangspunkt bezüglich der Inhibitoren oder Antagonisten des Proteins liefern. Die Identifikation und Durchmusterung von Antagonisten wird weiterhin dadurch erleichtert, dass man Strukturmerkmale des Proteins bestimmt, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie, Neutronenbeugung, nukleärer Magnetresonanzspektrometrie und anderen Techniken zur Strukturaufklärung. Diese Techniken erlauben den rationalen Entwurf oder die Identifikation von Agonisten und Antagonisten.
In vivo-Screeningmethoden
Intakte Zellen oder ganze Tiere, die ein EER-7-codierendes Gen exprimieren, können in Screeningverfahren zur Identifikation von Pharmakonkandidaten verwendet werden.
In einer Reihe von Aspekten wird eine stabile Zelllinie etabliert. Alternativ werden Zellen (darunter ohne Beschränkung darauf Säuger-, Insekten-, Hefe- oder Bakterienzellen) transient darauf programmiert, ein EER-7-Gen zu exprimieren, indem man eine geeignete DNA oder mRNA einführt. Die Identifikation von Kandidatensubstanzen kann unter Verwendung jedes beliebigen geeigneten Assays erfolgen, darunter ohne Beschränkung darauf (I) Assays, die die selektive Bindung der Testsubstanz an EER-7 messen, (II) Assays, die die Fähigkeit einer Testsubstanz messen, eine messbare Aktivität oder Funktion von EER-7 zu modifizieren (z. B. zu inhibieren oder zu steigern), und (III) Assays, die die Fähigkeit einer Substanz messen, die Transkriptionsaktivität von Sequenzen zu modifizieren (d. h. zu inhibieren oder zu steigern), die von den Promotorregionen (d. h. den regulatorischen Regionen) des EER-7-Gens abgeleitet sind.
Transgene nichtmenschliche Säuger können zur Erforschung der molekularen Mechanismen von EER-7 und insbesondere des vom menschlichen EER-7 ausgelösten Signalwegs hergestellt werden. Solche Säuger liefern hervorragende Modelle zum Screening oder Test von Pharmakonkandidaten. So können „Knockin"-Säuger für das menschliche Protein EER-7 hergestellt werden, um die Molekularbiologie dieses Systems detaillierter zu erforschen, als dies an Menschen möglich ist. Es ist auch möglich, Substanzen oder Krankheiten an „Knockout"-Tieren zu erforschen, z. B. eine Substanz zu identifizieren, die einen Defekt in der EER-7-Aktivität kompensieren kann. Beide Technologien erlauben die Manipulation einzelner Einheiten genetischer Informationen in ihrer natürlichen Position in einem zellulären Genom und die Untersuchung der Ergebnisse dieser Manipulation vor dem Hintergrund eines fertig ausdifferenzierten Organismus. Transgene nichtmenschliche Säuger können durch jedes beliebige Verfahren hergestellt werden, darunter ohne Beschränkung darauf die Modifikation embryonaler Stammzellen (ES) und die heteronukleäre Injektion in Blastenzellen.
Ein „Knockin"-Säuger ist ein nichtmenschlicher Säuger, in dem ein endogenes Gen mit einem heterologen Gen besetzt ist (Roemer et al., New Biol. 1991, 3: 331). Das heterologe Gen ist vorzugsweise an einem Ort von Interesse angebracht, entweder dem Gegenstand der Untersuchung (in welchem Fall das Gen ein Reportergen sein kann; siehe Elefanty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 11897) der Expression oder Funktion eines homologen Gens, wodurch die heterologe Genexpression mit der Transkription von dem passenden Promotor verbunden wird. Dies kann durch homologe Rekombination, ein Transposon (Westphal und Leder, Curr. Biol. 1997, 7: 530), unter Verwendung von Mutationsrekombinationsstellen (Araki et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 868) oder PCR (Zhang und Henderson, Biotechniques 1998, 25: 784) geschehen.
Nichtmenschliche EER-7-Knockout-Säuger können hergestellt werden, um die molekulare Pathologie dieses Defekts detaillierter zu erforschen, als dies mit Menschen möglich ist. Solche Tiere liefern auch hervorragende Modelle zur Suche nach Pharmakonkandidaten. Ein „Knockout-Säuger" ist ein nichtmenschlicher Säuger (z. B. eine Maus oder ein Kaninchen), der in seinem Genom ein spezifisches Gen enthält, das inaktiviert worden ist. Ein beliebiges aus dem Stand der Technik bekanntes Verfahren, das das Gen nichtfunktional oder nichtexprimiert macht, kann verwendet werden. Ein nicht begrenztes Beispiel eines solchen Verfahrens ist das Gen-Targeting (siehe z. B. US-Patente Nm. 5,777,195 und 5,616,491 ). Zu einem Knockout-Säuger gehören sowohl ein heterozygoter Knockout (d. h. ein defektives Allel und ein Wildtypallel) als auch eine homozygote Mutante (d. h. zwei defektive Allele; ein heterologes Konstrukt zur Expression eines EER-7, wie z. B. eine menschliche EER-7, könnte eingefügt werden, um dem Knockout-Säuger das Überleben zu ermöglichen, wenn das Fehlen der EER-7-Expression tödlich ist). Die Herstellung eines Knockout-Säugers erfordert es, zuerst ein Nukleinsäurekonstrukt, das verwendet wird, um die Expression eines bestimmten Gens zu unterdrücken, in einen undifferenzierten Zelltyp einzuführen, der als embryonale Stammzelle bezeichnet wird. Diese Zelle wird dann in einen Säugerembryo injiziert. Ein Säugerembryo mit einer integrierten Zelle wird dann in eine Leihmutter für die Dauer der Schwangerschaft implantiert. Zhou et al. (Genes and Development 1995, 9: 2623–34) beschreiben PPCA-Knockout-Mäuse.
Der Begriff "Knockout" bezieht sich auf die teilweise oder vollständige Unterdrückung der Expression mindestens eines Teils eines von einer endogenen DNA-Sequenz in einer Zelle codierten Proteins. Der Begriff „Knockout-Konstrukt" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die so entworfen ist, dass sie die Expression eines von endogenen DNA-Sequenzen in einer Zelle codierten Proteins verringert oder unterdrückt. Die als Knockout-Konstrukt verwendete Nukleinsäuresequenz besteht typischerweise aus (1) DNA aus einem Teil des Gens (Exonsequenz, Intronsequenz und/oder Promotorsequenz), das unterdrückt werden soll, und (2) einer Markersequenz, die verwendet wird, um die Anwesenheit des Knockout-Konstrukts in der Zelle zu de tektieren. Das Knockout-Konstrukt wird in eine Zelle eingefügt und integriert sich in die genomische DNA der Zelle an einem solchen Ort, das es die Transkription der nativen DNA-Sequenz verhindert oder unterbricht. Eine solche Einfügung erfolgt üblicherweise durch homologe Rekombination (d. h., Regionen des Knockout-Konstrukts, die homolog mit endogenen DNA-Sequenzen sind, hybridisieren sich miteinander, wenn das Knockout-Konstrukt in die Zelle eingefügt wird, und rekombinieren, so dass das Knockout-Konstrukt in die entsprechende Position der endogenen DNA inkorporiert wird). Die Nukleinsäuresequenz des Knockout-Konstrukts kann (1) eine vollständig oder teilweise Sequenz von einem oder mehreren Exons und/oder Introns des zu unterdrückenden Gens, (2) eine vollständig oder teilweise Promotorsequenz des zu unterdrückenden Gens, oder (3) Kombinationen davon umfassen. Typischerweise wird das Knockout-Konstrukt in eine embryonale Stammzelle (ES-Zelle) eingefügt und integriert sich in die genomische DNA der ES-Zelle, üblicherweise durch den Vorgang der homologen Rekombination. Diese ES-Zelle wird dann in den sich integrierenden Embryo injiziert und integriert sich in ihm.
Die Formulierungen „Unterbrechung des Gens" und „Genunterbrechung" beziehen sich auf die Einfügung einer Nukleinsäuresequenz in eine Region der nativen DNA-Sequenz (üblicherweise ein oder mehrere Exons) und/oder der Promotor-Region eines Gens, um die Expression dieses Gens in der Zelle im Vergleich zu der Wildtyp oder in der Natur vorkommenden Sequenz des Gens zu verringern oder zu verhindern. Beispielsweise kann ein Nukleinsäurekonstrukt hergestellt werden, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Antibiotikumsresistenzgen codiert, das in die DNA-Sequenz eingefügt wird, die komplementär zu der zu unterbrechenden DNA-Sequenz (Promotor und/oder codierende Region) ist. Wenn dieses Nukleinsäurekonstrukt dann in eine Zelle transfiziert wird, integriert sich das Konstrukt in die genomische DNA. Somit exprimieren viele Nachkommen der Zelle zumindest in einigen Zellen das Gen nicht mehr, oder sie exprimieren es im verringerten Maß, da die DNA jetzt von dem Antibiotikumsresistenzgen unterbrochen ist.
Im Allgemeinen hat die DNA mindestens ein Kilobasenpaar Länge (kb) und vorzugsweise 3–4 Kilobasenpaar Länge (kb), wodurch sie genügend komplementäre Sequenzen zur Rekombination bereitstellt, wenn das Knockout-Konstrukt in die genomische DNA der ES-Zelle eingeführt wird (unten diskutiert).
In den Bereich dieser Erfindung eingeschlossen ist ein nichtmenschlicher Säuger, in dem zwei oder mehr Gene ausgeknockt sind. Solche Säuger können hergestellt werden, indem man die hier dargestellten Verfahren zur Herstellung jedes einzelnen Knockout-Konstrukts wiederholt, oder indem man zwei Säuger, jeder mit einem einzelnen ausgeknockten Gen, miteinander kreuzt und nach denjenigen mit dem Doppel-Knockout-Genotyp sucht.
Regulierte Knockout-Tiere können unter Verwendung verschiedener Systeme hergestellt werden, wie z. B. des Tet-Repressorsystems (siehe US-Patent Nr. 5,654,168 ) oder des Cre-Lox-Systems (siehe US-Patent Nrn. 4,959,317 und 5,801,030 ).
In einer anderen Reihe von Aspekten werden nichtmenschliche transgene Tiere hergestellt, in denen (I) ein menschliches EER-7 stabil in das Genom des transgenen Tiers integriert ist; und/oder (II) die endogenen EER-7-Gene inaktiviert und durch menschliche EER-7-Gene ersetzt sind. Siehe z. B. Coffman, Semin. Nephrol. 1997, 17: 404; Ester et al., Lab. Invest. 1996, 74: 953; Murakami et al., Blood Press. Suppl. 1996, 2: 36.
In einem anderen Aspekt werden Sequenzen, die die endogene EER-7-Expression modulieren, stabil ins Genom des Tieres integriert. Zum Beispiel können Sequenzen, die die EER-7-Expression stimulieren (wie z. B. Transkriptionsfaktoren), oder die mit herunterregulierenden Faktoren interagieren und sie inhibieren, verwendet werden.
ER-Aktivationsassay
Jedes beliebige Zellassaysystem, das die Messung differentieller und/oder selektiver funktionaler Aktivität von Östrogenrezeptorisoformen-Agonisten und Antagonisten erlaubt, wird von der vorliegenden Erfindung definiert. In einer besonderen Ausführungsform, nachfolgend beispielhaft dargestellt, kann das Assay verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die mit spezifischen Isoformen des ER differentiell interagieren, was durch Messung der Wirkungen von mit einer Testsubstanz in Kontakt gebrachten Östrogenligandenzellen ermittelt werden kann, was die EER-7-mRNA-Transkription moduliert. Das Assaysystem kann somit verwendet werden, um Substanzen zu identifizieren, die selektiv eine funktionale Wirkung durch einen Östrogenrezeptor hervorrufen. Substanzen, die die EER-7-mRNA-Transkription steigern, können zu gesteigerter EER-7-Proteinbildung führen und können als neue Therapeutika zur Vorbeugung abdominaler Aortenaneurysmen und Myokardinfarkte verwendbar sein. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Assaysystem aus zwei verschiedenen Populationen von Zellen, die verschiedene Östrogenrezeptoren exprimieren. Vorzugsweise wird jedes Experiment bei mehrfachen verschiedenen Verdünnungen der Substanz in Triplikaten durchgeführt.
Die Suche nach einem Antagonisten umfasst die Detektion der Expression des Reportergens durch die Wirtszelle, wenn sie mit einem EER-7-regulatorischen Östrogen in Kontakt gebracht wird. Wenn die EER-7-Expression gesenkt wird, ist die Testsubstanz ein Kandidat für einen Antagonisten der Hormonrezeptorsignalübertragung im Kern. Wenn es keine Veränderung in der Expression des Reportergens gibt, ist die Testsubstanz kein wirksamer ER-Ligand.
Das beschriebene Assaysystem kann verwendet werden, um die Wirkungen einer Testsubstanz auf verschiedene Östrogenrezeptoren zu vergleichen. Die Testsubstanzwirkungen auf die EER-7-Transkription in verschiedenen Populationen transformierter Zellen, die verschiedene Östrogenrezeptoren exprimieren, werden verglichen, um zu erforschen, ob die Substanzen der Klasse der Östrogenrezeptoragonisten/-antagonisten zugehören (siehe unten).
Jedes zweckmäßige Verfahren erlaubt die Detektion des exprimierten Produkts. Zum Beispiel kann zur Detektion der EER-7-mRNA die Northern-Blot-Analyse verwendet werden. Die Verfahren umfassen die Schritte, die zelluläre Gesamt-RNA auf einem Agarosegel zu fraktionieren, die RNA auf eine feste Trägermembran zu übertragen und einen DNA-RNA-Komplex mit einer markierten DNA-Sonde zu detektieren, wobei die DNA-Sonde unter Bedingungen, bei denen sich ein stabiler Komplex zwischen der DNA-Sonde und den RNA-Bestandteilen der Probe bilden kann, für eine bestimmte Nukleinsäuresequenz von EER-7 spezifisch ist. Solche Komplexe können unter Verwendung jedes geeigneten aus dem Stand der Technik bekannten Mittels detektiert werden, wobei die Detektion eines Komplexes die Gegenwart von EER-7 in der Probe anzeigt. Alternativ kann ein Reportergen unter der Kontrolle des EER-7-Promotors in einem ER-Aktivitätsassay verwendet werden.
Typischerweise verwenden Immunoassays entweder einen markierten Antikörper oder einen markierten Antigenbestandteil (z. B. einen, der mit dem Antigen in der Probe um die Bindung an den Antikörper konkurriert). Zu geeigneten Markierungen gehören, ohne darauf begrenzt zu sein, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbstoffmoleküle. Es sind auch Assays bekannt, die das Signal der Sonde verstärken, wie z. B. diejenigen, die Biotin und Avidin verwenden, sowie Enzym-markierte Immunoassays, wie z. B. ELISA-Assays.
Das hier beschriebene Assaysystem kann auch in einem Hochdurchsatz-Primärdurchmusterung auf Agonisten und Antagonisten verwendet werden, oder es kann als sekundäres Funktionaldurchmusterung auf durch ein andere primäre Durchmusterung identifizierte Kandidatenverbindungen verwendet werden, z. B. ein Bindungsassaydurchmusterung, das Substanzen identifiziert, die mit dem Rezeptor interagieren und die EER-7-Transkription beeinflussen.
Östrogenverbindungen
Eine „Östrogenverbindung" ist als eine beliebige der in der 11. Ausgabe von „Steroids" von Steraloids Inc., Wilton N.H., beschriebenen Strukturen definiert, wobei in diese Definition nicht-steroidale Östrogene, die in der genannten Referenz beschrieben sind, eingeschlossen sind. Zu anderen in dieser Definition eingeschlossenen Östrogenverbindungen gehören Östrogenderivate, Östrogenmetabolite und Östrogenvorläufer. Östrogenselektive Rezeptoragonisten/-antagonisten (ESRAAs) sind östrogenverbindungen, die als Agonisten an ERα-Rezeptoren und als Antagonisten als ERβ-Rezeptoren fungieren. östrogenverbindungen, die Agonisten an ERβ-Rezeptoren und Antagonisten an ERα-Rezeptoren sind, können gleichfalls durch dieses Assaysystem identifiziert werden. Der Begriff schließt auch Moleküle ein, die spezifisch die hier beschriebene Östrogenwirkung der EER-7-Transkriptionsregulation auslösen. Auch Gemische aus mehr als einem Östrogen oder mehr als einer Östrogenverbindung sind eingeschlossen. Beispiele solcher Gemische sind in Tabelle II des US-Patent Nr. 5,554,601 bereitgestellt (siehe Spalte 6). Beispiele für Östrogene, die entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln verwendbar sind, sind z. B. in US-Patent Nr. 5,554,601 bereitgestellt.
β-Östrogen ist das β-Isomer von östrogenverbindungen. α-Östrogen ist das α-Isomer von Östrogenverbindungen. Der Begriff „Östradiol" steht entweder für α- oder für β-östradiol, sofern nicht spezifisch dargestellt.
Der Begriff „E2" ist synonym mit β-Östradiol, 17β-Östradiol und β-E2. αE2 und α-Östradiol ist das α-Isomer von α-Isomer von βE2-Östradiol.
Vorzugsweise wird eine nicht weiblich machende Östrogenverbindung verwendet. Eine solche Substanz hat den Vorteil, keine Uterushypertrophie und andere unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen und kann somit in einer höheren wirksamen Dosierung verwendet werden. Zu Beispielen nicht weiblich machender Östrogene gehören Raloxifene (Evista; Eli Lilly), Tamoxifen (Nolvadex; Astra Zeneca) und andere selektive Östrogenrezeptormodulatoren.
Weiterhin können bestimmte Substanzen wie das Androgen Testosteron in vivo durch Umwandlung mit dem Aromataseenzym in Östrogene umgewandelt werden. Das Aromataseenzym liegt in mehreren Regionen vor, darunter dem Gehirn, ohne darauf beschränkt zu sein. Manche Androgene sind Substrate für die Aromatase und können umgewandelt werden, und andere können kein Substrat sein. Diejenigen Androgene, die Substrate für die Aromatase sind, werden als aromatisierbare Androgene bezeichnet werden, und diejenigen, die keine Substrate für die Aromatase sind, werden als nicht aromatisierbare Androgene bezeichnet. Testosteron ist beispielsweise ein aromatisierbares Androgen, und Dihydrotestosteron ist zum Beispiel ein nicht aromatisierbares Androgen. Somit erstreckt sich die Erfindung einwandfrei auf diejenigen Substanzen (und, wie nachfolgend beschrieben, auf die Verwendung von Tieren, bei denen die Hoden entfernt oder inaktiviert sind, als Versuchstieren), die aus einem Androgen in ein Östrogen umgewandelt werden, und die die hier beschriebene Wirkung der Verringerung des Amyloidspiegels in vivo entfalten.
Hochdurchsatz-Durchmusterung
Wirkstoffe können durch Durchmusterung in Hochdurchsatzassays identifiziert werden, darunter ohne Beschränkung darauf zellbasierte oder zellfreie Assays. Der Fachmann erkennt, dass verschiedene Assaytypen verwendet werden können, um verschiedene Typen von Wirkstoffen zu detektieren. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Verfahren automatisierter Assays entwickelt, um die Durchmusterung von Zehntausenden von Verbindungen in einer kurzen Zeitspanne zu ermöglichen. Solche Hochdurchsatz-Durchmusterungsmethoden sind besonders bevorzugt. Verwendungen von Hochdurchsatz-Durchmusterungsassays zum Test auf Wirkstoffe wird durch die Verfügbarkeit großer Mengen an gereinigten Polypeptiden erheblich erleichtert.
Diagnoseverfahren
Genetische Varianten von EER-7 können zur Diagnose einer im Zusammenhang mit EER-7 stehenden Erkrankung verwendet werden, wie z. B. erhöhter Anfälligkeit für abdominale Aortenaneurismen oder Myokardinfarkt. Die verschiedenen Verfahren zur Detektion solcher Varianten sind hier beschrieben. Wo solche Varianten einen Einfluss auf die EER-7-Funktionen haben, entweder als Ergebnis einer mutierten Aminosäuresequenz oder weil die Mutation zur Expression eines verkürzten Proteins oder zu überhaupt keiner Expression führt, wird erwartet, dass sie zur Disregulation der Quervernetzung von Kollagen und Elastin führen.
Nukleinsäureassays
Die DNA kann aus einer beliebigen zellulären Quelle gewonnen werden. Die DNA wird aus der zellulären Quelle oder aus einer Körperflüssigkeit gewonnen, wobei beliebige aus den zahlreichen Methoden verwendet werden, die Standard im Stand der Technik sind. Es versteht sich, dass das individuelle Verfahren, das verwendet wird, um die DNA zu extrahieren, von der Natur der Quelle abhängt. Im Allgemeinen liegt die minimale DNA-Menge, die zur erfindungsgemäßen Verwendung extrahiert wird, bei ungefähr 25 pg (entsprechend etwa 5 Zelläquivalenten bei einer Genomgröße von 4 × 10⁹ Basenpaaren).
Alternativ wird die RNA aus Gewebsbiopsien unter Verwendung von dem Durchschnittsfachmann wohlbekannten Standardverfahren isoliert, darunter der Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion (Chomocyznski et al., Anal. Biochem., 162: 156, 1987). Die isolierte RNA wird dann einer gekoppelten reversen Transkription und Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) unterzogen, wozu spezifische Oligonukleotid-Primer verwendet werden, die spezifisch für einen ausgewählten Ort sind. Die Bedingungen für die Anheftung der Primer werden so ausgewählt, dass sie eine spezifische reverse Transkription und Amplifikation sicherstellen; somit ist das Erscheinen eines Amplifikationsproduktes von diagnostischem Wert für die Gegenwart einer bestimmten genetischen Variation. In einer anderen Ausführungsform wird die RNA revers transkribiert und amplifiziert, wonach die amplifizierten Sequenzen z. B. durch direkte Sequenzierung identifiziert werden. In noch einem anderen Aspekt kann aus der RNA erhaltene cDNA kloniert und sequenziert werden, um die Mutation zu identifizieren.
Proteinassays
Alternativ wird eine Gewebsbiopsie von einem Patienten erhalten. Antikörper, die imstande sind, an EER-7 zu binden, werden dann mit Proben des Gewebes in Kontakt gebracht, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines von dem Antikörper spezifizierten EER-7-Polypeptids zu bestimmen. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, bevorzugt monoklonal. Die Messung der spezifischen Antikörperbindung an die Zellen kann durch jedes bekannte Verfahren erfolgen, z. B. durch quantitative Durchflusszytometrie, enzymverbundene oder fluoreszenzverbundene Immunoassays, Western-Analyse usw.
Therapeutische Verwendung
Die Stimulation der EER-7-Protein-Expression kann als Behandlungsoption bei Patienten mit im Zusammenhang mit Östrogen stehenden Krankheitsbildern verwendet werden. Die Stimulation der EER-7-Protein-Expression kann durch Verfahren stimuliert werden wie z. B., ohne darauf beschränkt zu sein, (I) Bereitstellung von Nukleinsäuren, die das EER-7-Protein codieren und (II) Bereitstellung von Substanzen, die die Transkription und/oder Translation des EER-7-Gens stimulieren.
Gentherapie
Vektoren, die eine ein Protein einschließlich von EER-7 mit voller Länge, ohne darauf beschränkt zu sein, codierende Sequenz enthalten, werden bereitgestellt, um eine Krankheit oder Störung, die mit der Funktion von EER-7 bei kardiovaskulären Funktionen assoziiert ist, zu behandeln oder zu verhindern. In diesem Aspekt codiert der therapeutische Vektor eine Sequenz, die das hier beschriebene Protein herstellt.
Jedes der im Stand der Technik verfügbaren Verfahren zur Gentherapie kann erfindungsgemäß verwendet werden. Beispielhafte Verfahren sind nachfolgend beschrieben.
Für allgemeine Reviews der Gentherapieverfahren siehe Goldspiel et al., Clinical Pharmacy, 1993, 12: 488–505; Wu und Wu, Biotherapy, 1991, 3: 87–95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1993, 32: 573–596; Mulligan, Science, 1993, 260: 926–932, und Morgan und Anderson, Ann. Rev. Biochem., 1993, 62: 191–217; May, TIBTECH, 1993, 11: 155–215. Allgemein in der Wissenschaft der rekombinanten DNA-Technologie bekannte Verfahren, die verwendet werden können, sind in Ausubel et al., (Hrsg.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laborstory Manual, Stockton Press, NY; und in Kapiteln 12 und 13, Dracopoli et al., (Hrsg.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY, beschrieben. Zur Gentherapie geeignete Vektoren sind oben beschrieben.
In einem Aspekt umfasst der therapeutische Vektor eine Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Protein in einem geeigneten Wirt exprimiert. Insbesondere hat ein solcher Vektor einen Promotor, der funktional mit der codierenden Sequenz für das Protein verbunden ist. Der Promotor kann induzierbar oder konstitutiv und, optional, gewebespezifisch sein. In einem anderen Aspekt wird ein Nukleinsäuremolekül verwendet, indem die proteincodierenden Sequenzen und beliebige andere erwünschte Sequenzen von Regionen flankiert werden, die die homologe Rekombination an einem erwünschten Ort im Genom fördern, wodurch sie die intrachromosomale Expression des Proteins ermöglichen (Koller und Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86: 8932–8935; Zijlstra et al., Nature, 1989, 342: 435–438).
Die Übertragung des Vektors in einen Patienten kann entweder direkt erfolgen, in welchem Fall der Patient direkt dem Vektor oder einem Übertragungskomplex ausgesetzt wird, oder indirekt, in welchem Fall zuerst Zellen in vitro mit dem Vektor transformiert und dann in den Patienten transplantiert werden. Diese beiden Ansätze sind als in vivo- bzw. ex vivo-Gentherapie bekannt.
In einem spezifischen Aspekt wird der Vektor direkt in vivo bereitgestellt, wo er in die Zellen des Organismus eindringt und die Expression des Gens vermittelt. Dies kann durch jede beliebige von zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren geschehen, indem man ihn als Teil eines geeigneten Expressionsvektors konstruiert und verabreicht, so dass er intrazellulär wird, z. B. durch Infektion unter Verwendung eines defektiven oder verzögerten retroviralen oder anderen viralen Vektors, (siehe US-Patent Nr. 4,980,286 ), oder durch direkte Injektion nackter DNA oder durch die Verwendung von Mikropartikelbeschuss (z. B. einer Genkanone; Biolistic, Dupont); oder durch Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsmitteln, durch Verkapselung in Biopolymere (z. B. Poly-S-1-64-N-acetylglucosaminopolysaccharide; siehe US-Patent Nr. 5,635,493 ), Verkapselung in Liposomen, Mikropartikel oder Mikrokapseln; durch Verabreichung im Verbund mit einem Peptid oder anderen Liganden, von denen bekannt ist, dass er in den Kern eindringt; oder durch Verabreichung im Verbund mit einem Liganden, der der rezeptorvermittelten Endocytose unterliegt (siehe z. B. Wu und Wu, J. Biol. Chem., 1987, 62: 4429–4432) usw. In einem anderen Aspekt kann ein Nukleinsäure-Liganden-Komplex gebildet werden, in dem der Ligandenkomplex ein fusogenes virales Peptid enthält, um die Endosomen aufzubrechen, was es der Nukleinsäure ermöglicht, dem Abbau in den Lysosomen zu entkommen. In noch einem anderen Aspekt kann die Nukleinsäure in vivo für zellspezifische Aufnahme und Expression gesteuert werden, indem man einen spezifischen Rezeptor ansteuert (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nrn. WO 92/06180 , WO 92/22635 , WO 92/20316 und WO 93/14188 ). Alternativ kann die Nukleinsäure intrazellulär eingeführt und durch homologe Rekombination in die Wirtszelle-DNA zur Expression inkorporiert werden (Koller und Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 8932–8935; Zijlstra et al., Nature, 1989, 342: 435–438). Diese Verfahren ergänzen die oben beschriebenen in Verbindung mit „viralen und nichtviralen Vektoren".
Alternativ können auch Antikörpermoleküle verabreicht werden, z. B. durch Expression von Nukleotidsequenzen, die Einzelkettenantikörper innerhalb der Zielzellpopulation exprimieren, indem man z. B. Techniken wie die in Marasco et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 7889–7893) beschriebenen, verwendet.
Die Form und Menge der zur Verwendung in Betracht gezogenen therapeutischen Nukleinsäure hängt von der Art der Krankheit, der Stärke des erwünschten Effekts, dem Zustand des Patienten usw. ab und kann vom Fachmann festgelegt werden.
Stimulation der Proteinsynthese
Die Gentranskription und Proteintranslation können durch Verabreichung exogener Substanzen inhibiert oder stimuliert werden. Exogene Substanzen können mit extrazellulären und/oder intrazellulären Botensystemen interagieren, wie z. B., ohne Beschränkung darauf, Adenosintriphosphat, Stickoxid und Guanosintriphosphat, um die Proteinsynthese zu regulieren. In dieser Ausführungsform können exogene Substanzen, die die EER-7-Proteinsynthese stimulieren, zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Herz-/Kreislauferkrankungen, darunter Myokardinfarkt und Aortenaneurysma, verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform ist die exogene Substanz, die die EER-7-Proteinexpression stimuliert, ein Östrogenrezeptorligand.
Für die Therapie vorgeschlagene Substanzen können dem Patienten in Formulierungen zugeführt werden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, und können beliebige pharmazeutische akzeptable Additive umfassen, wie z. B. Hilfsstoffe, Schmiermittel, Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, Farbstoffe und zerfallsfördernde Mittel. Die Formulierungen können in verwendbaren Dosisformen wie z. B. Tabletten, Caplets, Kapseln, Flüssigkeiten oder Injektionen hergestellt werden.
Die Form und Menge der zur Verwendung in Betracht gezogenen therapeutischen Nukleinsaure hängt von der Art der Krankheit, der Stärke des erwünschten Effekts, dem Zustand des Patienten usw. ab und kann vom Fachmann festgelegt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung ist durch Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele, die zur Exemplifikation und nicht zur Beschränkung dargestellt werden, besser zu verstehen.
Beispiel 1: Entdeckung von EER-7
EER-7 wurde durch Differentialdisplay unter Verwendung von RNA aus menschlichen Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) identifiziert. Am Tag 0 wurden HUVECS in Haltungsmedium (EBM von Clonetics (San Diego, CA), ergänzt um 10 pg/ml menschliches EGF, 1 μg/ml Hydrocortison, 50 μg/ml Gentamicin, 50 ng/ml Amphotericin-B, 3 μg/ml Rinderhirnextrakt und 2 Vol.-% fötales Kälberserum) mit einer Dichte von ungefähr 3 × 10⁶ Zellen pro 150 mm²-Platte ausplattiert. Am Tag 1 wurde den Zellen phenolrotfreies EBM zugeführt, das mit 2 Vol.-% an Aktivkohle/Dextran-behandeltem fötalen Kälberserum (HyClone; Logan; UT) ergänzt war und replikationsdefektives Adenovirus, das menschliches ERβ exprimierte (Ad5ERβ), mit einer ungefähren MOI von 300 enthielt. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen zweimal gewaschen und erneut mit EBM/BSA (EBM ergänzt mit 0,25 % (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin, 10 U/ml Penicillin G, 10 μg/ml Streptomycin und 25 ng/ml Amphotericin B) gefüttert. Nach einer weiteren ungefähr 6-stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen mit neuem EBM/BSA gefüttert, das entweder 100 nM 17β-Östradiol oder DMSO als Trägerstoff enthielt. Nach ungefähr 16-stündiger Inkubation wurden die Zellen erneut mit EBM/BSA gefüttert, das 30 U/ml IL-1β und entweder 100 nM 17β-Östradiol oder DMSO als Trägerstoff enthielt. Nach 5-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen unter Verwendung von Trizol (Life Technologies) geerntet. RNA wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers gewonnen. Die gereinigte Gesamt-RNA wurde 1 Stunde lang mit 10 Einheiten Dnase 1 (Life Technologies) bei 37 °C behandelt und über Rneasy-Zentrifugationssäulen (Qiagen; Chatsworth, CA) erneut gereinigt.
Nach der DNase I-Behandlung wurden sechs Mikrogramm Gesamt-RNA mit 1 × RT-Puffer (25 mM Tris-Cl, pH 8,3, 37,6 mM KCl, 3 mM MgCl₂ und 5 mM DTT, von Genhunter, Nashville TN), 20 μM dNTP's (A, C, G und TTP 2'-Desoxynukleotid-5'-Triphosphat, Gibco/BRL), 0,2 μM HT₁₁C (Oligonukleotid: AAGCTTTTTTTTTTTC; SEQ ID NO: 8) in einem Endvolumen von 600 μL inkubiert. Dieses Reaktionsgemisch wurde fünf Minuten lang bei 65 °C inkubiert, um die Sekundärstrukturen zu denaturieren, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation bei 37 °C. Dann wurden 30 μl Superscript II-Reverse Transkriptase (200 Einheiten/μl, Gibco/BRL) der Reaktion zugesetzt, und die Inkubation wurde 1 Stunde lang bei 37 °C fortgesetzt. Das Enyzm wurde durch fünfminütiges Erhitzen auf 75 °C inaktiviert. Ein Aliquot dieser Reaktion wurde dann für die Synthese des zweiten Strangs durch PCR verwendet. 2 μl der Reaktion wurden 1 × PCR-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,4, 100 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 0,001 % Gelatin), 2 μM dNTP's, 15 nM ³³P dATP (NEN), 1 Einheit AmpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und 1 μM Zufallsprimer 5'-AAGCTTGCCATGG-3' (SEQ ID NO: 9) zugesetzt, so dass sich ein Gesamtreaktionsvolumen von 20 μl ergab. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann unter Verwendung der folgenden Parameter thermozykliert:
2 Minuten lang 92 °C, 1 Runde,
15 Sekunden lang 92 °C, 2 Minuten lang 40 °C, 30 Sekunden lang 72 °C, 40 Runden
5 Minuten lang 72 °C.
Die PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese auf einem 6 %igen denaturierenden Polyacrylamidgel (5,7 % Acrylamid, 0,3 % Bisacrylamid, 42 % Harnstoff und 51 % H₂O) in 1 × TBE-Puffer (0,1 M Tris, 0,09 M Borsäure, 1 mM EDTA) innerhalb von drei Stunden bei 2000 Volt aufgetrennt. Das Gel wurde dann auf Filterpapier (Schleicher & Schuell) übertragen, eine Stunde lang bei 80 °C unter Vakuum getrocknet und ungefähr 24 Stunden lang einem Röntgenfilm aufgelegt. Der entwickelte Film wurde dann dem getrockneten Gel aufgelegt, und die interessierenden Banden wurden identifiziert. Die Ecken der Bande wurden unter Verwendung einer Spritzennadel vom Kaliber 22 markiert, und das Gelstück innerhalb dieser Grenzen wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten und in 100 μl H₂O eingetaucht. Die Probe wurde fünfzehn Minuten lang in einem Wasserbad gekocht, zwei Minuten lang zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein neues Gefäß übertragen. Dieser Probe wurden 5 μl Glycogen (10 mg/ml), 10 μl Natriumacetat (3 M) und 450 μl Ethanol (100 %) zugesetzt. Die Probe wurde gemischt, über Nacht bei –20 °C fällen gelassen und zehn Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert. Der Lösungsüberstand wurde entfernt, das Pellet wurde mit 200 μl 85 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 10 μl H₂O resuspendiert. Ein 3 μl Aliquot hiervon wurde in eine Reamplifikations-PCR-Reaktion in Gegenwart von 1 × PCR-Puffer, 20 μM dNTPs, 0,2 μM Zufallsprimer und 0,2 μM Oligonukleotid HT₁₁C und 2 Einheiten AmpliTaq-Polymerase eingesetzt, wobei die gleichen Zyklusparameter wie bei der obigen PCR-Reaktion verwendet wurden.
Unter den identifizierten regulierten Banden zeigte eine Bande, Nr. 7, mit einer Größe von ungefähr 320 Basenpaaren (bp), eine sehr starke Induktion durch Behandlung mit 17β-Östradiol, und sie wurde als „endothelial estrogen regulated gene-7” (EER-7) bezeichnet. Das EER-7-Fragment wurde TA-Klonierung in den Vektor pCRII (InVitrogen) kloniert. Zur Northern-Blot-Analyse wurde Gesamt-RNA aus HUVEC-Zellen durch Elektrophorese auf einem 1 %igen (Gewicht/Volumen) Agarosegel innerhalb von etwa 2 Stunden bei 200 V fraktioniert. Die RNA wurde über Nacht durch Kapillarwirkung auf Nylonmembran übertragen. Die Nylonmembranen wurden mit ³²P-markierten EER-7-Fragment-cDNA-Sonden hybridisiert, unter Verwendung eines Oligonukleotid-Markierungskits (Pharmacia) aus dem gelgereinigten EER-7-320 Basenpaarfragment hergestellt. Die Northern-Ergebnisse zeigten, dass die Gesamtlänge der EER-7-mRNA ungefähr 4,0 kb betrug.
Die Analyse der 320-Basenpaar-Sequenz unter Verwendung des BLAST-Programms (NCBI; nichtredundante und EST-Datenbanken) identifizierte keine Homologie mit bekannten Genen, aber zeigte EST-Sequenzen (W42603, W44920, H25237 und AA166620) mit Homologie. Diese ESTs wurden von Research Genetics erhalten und ihrer Gesamtheit sequenziert. Die resultierende Sequenz von ungefähr 1,2 Kilobasenpaaren hatte keine Homologie mit bekannten identifizierten Genen und enthielt eine identifizierbare codierende Region.
Zur Isolation des EER-7-Gens wurde ein PCR-Durchmusterungssatz (OriGene Rapid-Screen) mit einer menschlichen Plazentabibliothek verwendet. Von der bekannten Sequenz von EER-7 abgeleitete Oligoprimer (5'-TTTGCTCAGCTGAGCTCCT-3' und 5'-TAAGATAAAGGTAAGGACACTA-3'; SEQ ID Nrn: 10 bzw. 11) wurden zuerst in einer RT-PCR-Reaktion mit Gesamt-RNA aus der menschlichen Plazenta verwendet. Die vorhergesagte 340-Basenpaar-Bande wurde nach Elektrophorese auf einem 1,2 %igen Agarosegel beobachtet. Die 96-Napf-Bibliothek der menschlichen Plazenta von Origene wurde dann durch PCR unter Verwendung dieser Oligonukleotide durchmustert. Fünf Näpfe ergaben eine 340-Basenpaar-Bande. Diesen Näpfen entsprechende Unterplatten wurden von Origene erhalten, und eine zweite PCR-Runde wurde durchgeführt, um die positiven Näpfe jeder Unterplatte zu identifizieren. Die positiven Unternäpfe wurden auf LB+Ampicillin-Platten ausplattiert, um individuelle Kolonien zu erhalten. Diese Kolonien wurden durch Koloniehybridisierung (Sambrook et al, Molecular Cloning) unter Verwendung einer ³²P-markierten EST-Sequenz von 1 Kilobasenpaar (kb) als Sonde durchmustert. Die Membranen wurden über Nacht bei 48 °C hybridisiert und dann zweimal bei Raumtemperatur mit 2 × SSC/0,5 % SDS und zweimal bei 60 °C mit 0,1 × SSC/0,1 % SDS gewaschen. Die positiven Kolonien wurden in LB+Ampicillin kultiviert, und die Plasmid-DNA wurde isoliert (Qiagen). Die Plasmide wurden mit EcoRI und SaII verdaut, um die cDNA-Inserts freizusetzen. Die Reaktionen wurden der Elektrophorese und Southern-Analyse, wie für das Koloniehybridisierungsprotokoll beschrieben, unterzogen. Der als D3E11 bezeichnete Klon lieferte ein cDNA-Insert der für einen EER-7-Klon mit voller Länge erwarteten Größe und wurde vollständig sequenziert. Die BLAST-Analyse mit dieser Sequenz identifizierte die Ähnlichkeit mit bekannten Mitgliedern der Lysyloxidase-Genfamilie (1 und 2).
Beispiel 2: Regulation der EER-7-Expression
Menschliche Nabelschnurvenenzellen (HUVECS) wurden als gefrorene Präparate (Clonetics, San Diego, CA) während der Passage 2 oder 3 erhalten. Die Zellen wurden in EBM-Medium, ergänzt mit 10 ng/ml an menschlichem EGF, 1 mg/ml Hydrocortison, 50 mg/ml Gentamicin, 50 ng/ml Amphotericin-B, 3 mg/ml Rinderhirnextrakt und 2 Vol.-% an fötalem Kälberserum, gehalten. Die Zellen wurden zwischen den Passagen 4 und 7 für Experimente verwendet.
Am Tag 0 wurden die HUVECS mit einer Dichte von ungefähr 3 × 10⁶ Zellen pro 150 mm² Platte in Erhaltungsmedium ausplattiert. Die Zellen wurden ungefähr 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Am Tag 1 wurde den Zellen phenolrotfreies EBM zugeführt, das mit 2 Vol.-% an Aktivkohle/Dextran-behandeltem fötalen Kälberserum (HyClone; Logan; UT) ergänzt war und replikationsdefektives Adenovirus, das menschliches ERα (Ad5ERα) oder ERβ (Ad5ERβ) von voller Länge exprimierte, mit einer ungefähren MOI von 300 enthielt. Nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen und erneut mit phenolrotfreiem EBM, ergänzt um 2 Vol.-% an Aktivkohle/Dextran-behandeltem fötalen Kälberserum, gefüttert. Die Zellen wurden ungefähr 20 Stunden lang bei etwa 37 °C inkubiert. Am Tag 3 wurde die Gesamt-RNA mit Silikatgelsäulen (Qiagen, Chatsworth, CA) aus den Zellen extrahiert. Die Gesamt-RNA wurde durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel innerhalb von etwa 2 Stunden bei 150 V fraktioniert. Die RNA wurde durch Kapillartransfer unter Verwendung von 20 × SSC transferiert. Die Nylonmembranen wurden mit ³²P-markierten EER-7-cDNA-Sonden (unter Verwendung von Pharmacia's Oligolabelling Kit hergestellt) hybridisiert. Die Ergebnisse sind in 3 zusammengefasst.
Die Sequenzanalyse von EER-7 zeigte, dass das Protein strukturell mit anderen Proteinen, die der LO- und LOL-Proteinfamilie angehören, ähnlich war (siehe 1). Der Vergleich der Domänen zeigt, dass EER-7 die mit den LO- und LOL-Proteinen assoziierten charakteristischen katalytischen Domänen besitzt und ebenfalls vier SRCR-Domänen umfasst, die in WS914 vorliegen. Zusammengenommen zeigt dies, dass das EER-7-Protein eine Rolle bei der zellulären Signalübertragung durch von den SRCR-Domänen vermittelte Protein-Protein-Interaktionen spielen kann.
Expressionsstudien zeigten, dass die EER-7-Expression in HUVEC-Zellen sowohl durch den ERα- als auch durch den ERβ-Rezeptor reguliert wurde. Der Prototyp eines Östrogenagonisten, 17β-Östradiol, stimulierte die EER-7-Expressionen durch Interaktionen mit beiden Rezeptoren. Weiterhin wurde diese Wirkung durch den nicht-selektiven Östrogenrezeptorantagonisten IC182780 blockiert (siehe 3, Abbildung auf der rechten Seite). Die ERα-Agonisten und ERβ-Antagonisten, Substanzen 2 und 8 (4), stimulierten beide die EER-7-Expression durch den ERα und blockierten die Wirkung von 17β-Östradiol am ERβ-Rezeptor. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Expression und Aktivität von EER7 durch beide Östrogenrezeptoren moduliert werden. Daher kann die östrogenvermittelte Modulation von EER-7 einen neuen Weg zur Entwicklung therapeutischer Strategien für AAAs und Myokardinfarkte darstellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Assaysystem zur Identifikation selektiver Östrogenrezeptorliganden, umfassend eine erste Population transformierter Zellen, die den ER-α-Rezeptor exprimiert, eine zweite Population transformierter Zellen, die den ER-β-Rezeptor exprimiert, und die erste und die zweite Population transformierter Zellen, die ein mit einem Promotor des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) operativ verbundenes Reportergen besitzen, wobei die Anzahl der Zellen ausreichend ist, um eine detektierbare Menge des Reportergens zu transkribieren, wobei das EER-7-Gen die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt; oder eine Polynukleotidsequenz besitzt, die ein EER-7-Protein codiert, das eine mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 und Lysyloxidaseaktivität habende Aminosäuresequenz besitzt.
Assaysystem nach Anspruch 1, wobei die Zellen Endothelzellen sind.
Assaysystem nach Anspruch 2, wobei die Zellen menschliche Nabelschnurvenenzellen sind.
Verfahren zur Identifikation einer Substanz, die selektiv die Östrogenrezeptorregulation der Expression des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) reguliert, wobei das EER-7-Gen die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt; oder eine Polynukleotidsequenz besitzt, die ein EER-7-Protein codiert, das eine mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 und Lysyloxidaseaktivität habende Aminosäuresequenz besitzt, welches Verfahren es umfasst, dass man einen Unterschied im Niveau der Reportergenexpression in dem mit einer Testsubstanz in Kontakt gebrachten Assaysystem nach Anspruch 1 detektiert, wobei ein Unterschied des Niveaus der Reportergenexpression zwischen der ersten und der zweiten Population transformierter Zellen anzeigt, dass die Testsubstanz selektiv die Östrogenrezeptorregulation der EER-7-Expression reguliert.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Testsubstanz ein Östrogen oder ein Östrogenanalogon ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Testsubstanz ein für den Östrogenrezeptor selektiver Agonist oder Antagonist ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, sinkt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, steigt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Zellen menschliche Nabelschnurvenenzellen sind.
Assaysystem zur Identifikation selektiver Östrogenrezeptorliganden, umfassend eine erste Population transformierter Zellen, die den ER-α-Rezeptor exprimiert, eine zweite Population transformierter Zellen, die einen funktionalen Östrogenrezeptor exprimiert, der nicht der ER-α-Rezeptor ist, und die erste und die zweite Population transformierter Zellen, die ein mit einem Promotor des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) operativ verbundenes Reportergen besitzen, wobei die Anzahl der Zellen ausreichend ist, um eine detektierbare Menge des Reportergens zu transkribieren, wobei das EER-7-Gen die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt; oder eine Polynukleotidsequenz besitzt, die ein EER-7-Protein codiert, das eine mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 und Lysyloxidaseaktivität habende Aminosäuresequenz besitzt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zellen menschliche Nabelschnurvenenzellen sind.
Verfahren zur Identifikation einer Substanz, die selektiv die Östrogenrezeptorregulation des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) reguliert, wobei das EER-7-Gen die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1; oder eine Polynukleotidsequenz, die ein EER-7-Protein codiert, das eine mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 und Lysyloxidaseaktivität habende Aminosäurensequenz besitzt, welches Verfahren es umfasst, dass man einen Unterschied im Niveau der Reportergenexpression in dem mit einer Testsubstanz in Kontakt gebrachten Assaysystem nach Anspruch 11 detektiert, wobei ein Unterschied des Niveaus der Reportergenexpression zwischen der ersten und der zweiten Population transformierter Zellen anzeigt, dass die Testsubstanz selektiv die Östrogenrezeptorregulation der EER-7-Expression reguliert.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Testsubstanz ein Östrogen oder ein Östrogenanalogon ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Testsubstanz ein für den Östrogenrezeptor selektiver Agonist oder Antagonist ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, sinkt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, steigt.
Assaysystem zur Identifikation selektiver Östrogenrezeptorliganden, umfassend eine erste Population transformierter Zellen, die den ER-β-Rezeptor exprimiert, eine zweite Population transformierter Zellen, die einen funktionalen Östrogenrezeptor exprimiert, der nicht der ER-β-Rezeptor ist, und die erste und die zweite Population transformierter Zellen, die ein mit einem Promotor des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) operativ verbundenes Reportergen besitzen, wobei die Anzahl der Zellen ausreichend ist, um eine detektierbare Menge des Reportergens zu transkribieren, wobei das EER-7-Gen die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 besitzt; oder eine Polynukleotidsequenz besitzt, die ein EER-7-Protein codiert, das eine mindestens 90 % Sequenzidentität mit SEQ ID NO: 2 und Lysyloxidaseaktivität habende Aminosäuresequenz besitzt.
Assaysystem nach Anspruch 19, wobei die Zellen Endothelzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Zellen menschliche Nabelschnurvenenzellen sind.
Verfahren zur Identifikation einer Substanz, die selektiv die Östrogenrezeptorregulation der Expression des endothelialen östrogenregulierten Gens 7 (EER-7) reguliert, welches Verfahren es umfasst, dass man einen Unterschied im Niveau der Reportergenexpression in dem mit einer Testsubstanz in Kontakt gebrachten Assaysystem nach Anspruch 19 detektiert, wobei ein Unterschied des Niveaus der Reportergenexpression zwischen der ersten und der zweiten Population transformierter Zellen anzeigt, dass die Testsubstanz selektiv die Östrogenrezeptorregulation der EER-7-Expression reguliert.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Testsubstanz ein Östrogen oder ein Östrogenanalogon ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Testsubstanz ein für den Östrogenrezeptor selektiver Agonist oder Antagonist ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, sinkt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Niveau der Reportergenexpression beim Inkontaktbringen mit einer Testsubstanz, die die Expression über den Östrogenrezeptor reguliert, steigt.