DE69625678T3

DE69625678T3 - Chromosom 13 verbundene Brustkrebsempfindlichkeitsgen BRCA2

Info

Publication number: DE69625678T3
Application number: DE69625678T
Authority: DE
Inventors: Sean V. Salt Lake City Tavtigian; Alexander Salt Lake City Kamb; Jacques Simard; Fergus St. David Couch; Johanna M. Toronto Ontario Rommens; Barbara L. Merion Weber
Original assignee: Endorecherche Inc; HSC Research and Development LP; University of Utah Research Foundation UURF; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: ENDO RECHERCHE INC., QUEBEC, CA; HSC Research and Development LP; University of Utah Research Foundation UURF; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1996-12-17
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2016-12-18
Also published as: AU1461597A; DE69625678T2; WO1997022689A1; CA2239733A1; NO982785L; US6124104A; DE69625678D1; NZ326525A; JP3455228B2; EP0785216A1; EP0785216B2; US6033857A; EP0785216B1; ATE230759T1; IL124620A0; CA2239733C; NO982785D0

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Humangenetik. Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer isolierten Nucleinsäure, die die in SEQ ID NR.:1 dargestellte codierende Sequenz von der Nucleotidposition 229 bis zur Nucleotidposition 10482 umfasst und die ferner die mit einer Veranlagung zu Brustkrebs assoziierte Mutation umfasst, wobei T an der Nucleotidposition 6174 deletiert ist, zur Diagnose einer Veranlagung zu Brustkrebs bei Ashkenazi-jüdischen Frauen in vitro. Die Beschreibung stellt Verfahren und Materialien zum Isolieren und Nachweisen eines humanen Krebs-prädisponierenden Gens (BRCA2) bereit, von dem einige mutante Allele eine Anfälligkeit für Krebs bewirken, insbesondere für Brustkrebs bei Frauen und Männern. Die vorliegende Offenbarung betrifft außerdem somatische Mutationen im BRCA2-Gen bei humanem Brustkrebs. Die Offenbarung betrifft schließlich das Screening des BRCA2-Gens auf Mutationen, die zur Diagnose der Prädisposition für Brustkrebs ausnutzbar sind.
Die hierin zur Erhellung des Hintergrunds der Erfindung verwendeten Veröffentlichungen und weiteren Materialien, und insbesondere die Fälle zur Bereitstellung zusätzlicher Einzelheiten unter Berücksichtigung der Praxis, sind zur bequemeren Handhabung unter Nennung von Autor und Datum im folgenden Text und entsprechender Gruppierung in der Liste der Literaturstellen im Anhang angegeben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Genetik von Krebs ist kompliziert, da multiple dominante, positive Regulatoren des transformierten Stadiums (Onkogene) als auch multiple rezessive, negative Regulatoren (Tumorsuppressorgene) beteiligt sind. Über einhundert Onkogene wurden charakterisiert. Weniger als ein Dutzend Tumorsuppressorgene wurde identifiziert, doch wird ein Anstieg der Zahl auf über fünfzig erwartet (Knudson, 1993).
Die Beteiligung derart vieler Gene unterstreicht die Komplexität der Wachstums-Kontrollmechanismen, die in Zellen am Werk sind, um die Unversehrtheit des gesunden Gewebes zu erhalten. Diese Komplexität offenbart sich in anderer Weise. Bisher konnte von keinem einzelnen Gen eine Beteiligung an der Entwicklung aller, oder selbst der Mehrheit der humanen Krebsarten, nachgewiesen werden. Die häufigsten onkogenen Mutationen finden sich im H-Ras-Gen, das bei 10–15% aller festen Tumoren festgestellt wird (Anderson et al., 1992). Die am häufigsten mutierten Tumorsuppressorgene sind das TP53-Gen, das bei etwa 50% aller Tumoren homozygot deletiert ist, und CDKN2, das bei 46% aller untersuchten Tumorzelllinien homozygot deletiert war (Kamb et al., 1994a). Ohne ein Ziel, das allen transformierten Zellen gemeinsam ist, erscheint der Traum einer "Zauberkugel", die Krebszellen zerstören oder rückverwandeln kann und dabei gesundes Gewebe unversehrt lässt, unwahrscheinlich. Die Hoffnung auf eine neue Generation spezifisch gerichteter Antitumor-Wirkstoffe beruht wohl auf der Identifizierbarkeit von Tumorsuppressorgenen oder Onkogenen, die Hauptrollen bei der Kontrolle der Zellteilung spielen.
Die Tumorsuppressorgene, die bisher kloniert und charakterisiert wurden, beeinflussen die Anfälligkeit für: 1) Retinoblastom (RB1); 2) Wilms-Tumor (WT1); 3) Li-Fraumeni (TP53); 4) Hereditäre adenomatöse Polyposis (APC); 5) Neurofibromatosis Typ 1 (NF1); 6) Neurofibromatosis Typ 2 (NF2); 7) von Hippel-Lindau-Syndrom (VHL); 8) multiple endokrine Neoplasie Typ 2A (MEN2A); und 9) Melanom (CDKN2).
Die Tumorsuppressor-Loci, die genetisch kartiert, doch bisher nicht isoliert worden sind, umfassen Gene für: multiple endokrine Neoplasie Typ 1 (MEN1); familiäres Lynch-Krebs-Syndrom 2 (LCFS2); Neuroblastom (NB); Basalzellnävus-Syndrom (BCNS); Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS); klarzelliges Nierenkarzinom (RCC); Tuberöse Sklerose 1 (TSC1); und Tuberöse Sklerose 2 (TSC2). Die Tumorsuppressorgene, die bisher charakterisiert wurden, codieren für Produkte mit Ähnlichkeiten zu einer Vielzahl von Proteinarten, einschließlich DNA-bindender Proteine (WT1), ergänzende Transkriptions-Regulatoren (RB1), GTPase-aktivierende Proteine oder GAPs (NF1), zytoskelletale Komponenten (NF2), Membran-gebundene Rezeptor-Kinasen (MEN2A), Zellzyklus-Regulatoren (CDKN2), und weitere ohne erkennbare Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen (APC und VHL).
In vielen Fällen wurde gezeigt, dass die ursprünglich durch genetische Untersuchungen identifizierten Tumorsuppressorgene verlorengegangen oder bei irgendwelchen vereinzelt auftretenden Tumorformen mutiert waren. Dieses Ergebnis legt nahe, dass Regionen von chromosomaler Abweichung für die Position der wichtigen Tumorsuppressorgene, die sowohl an der genetischen Prädisposition für Krebs als auch bei vereinzelt auftretendem Krebs beteiligt sind, von Bedeutung sein können.
Eines der Kennzeichen der bis heute charakterisierten verschiedenen Tumorsuppressorgene besteht darin, dass sie bei bestimmten Tumorarten in hoher Häufigkeit deletiert sind. Die Deletionen beinhalten oftmals den Verlust eines einzelnen Allels, einen sogenannten Verlust der Heterozygotie (LOH), doch können auch eine homozygote Deletion beider Allele umfassen. Bezüglich LOH wird das verbliebene Allel entweder aufgrund einer vorbestehenden erblich bedingten Mutation oder aufgrund einer sekundären sporadischen Mutation als nicht-funktionell angenommen.
Bei Brustkrebs handelt es sich um eine der signifikantesten Erkrankungen, von denen Frauen betroffen sind. Bei der derzeitigen Rate besteht für amerikanische Frauen ein Risiko von 1 aus 8 der Entwicklung von Brustkrebs bis zu einem Alter von 95 Jahren (American Cancer Society, 1992). Die Behandlung des Brustkrebses in einem späteren Stadium erweist sich oftmals als wirkungslos und verunstaltend, was dem frühen Nachweis eine hohe Priorität in der medizinischen Handhabung dieser Krankheit zuordnet. Eierstockkrebs, obschon weniger häufig als Brustkrebs, führt oft schnell zum Tode und macht die vierthäufigste Ursache der Krebssterblichkeit bei amerikanischen Frauen aus. Genetische Faktoren tragen zu einem ungenau definierten Anteil der Häufigkeit von Brustkrebs bei, der auf etwa 5% aller Fälle, jedoch auf etwa 25% der vor einem Alter von 40 Jahren diagnostizierten Fälle geschätzt wird (Claus et al., 1991). Brustkrebs ist in zwei Typen unterteilt, nämlich den in jungen Jahren und den in späteren Jahren ausbrechenden Typus, basierend auf einer Krümmung in der altersspezifischen Inzidenzkurve um das Alter von 50 Jahren herum. Die Mutation eines Gens, BRCA1, wird als für etwa 45% des familiär gehäuft auftretenden Brustkrebses, jedoch für mindestens 80% bei den Familien sowohl mit Brust- als auch Eierstockkrebs, verantwortlich gemacht (Easton et al., 1993).
Das BRCA1-Gen wurde nach intensiven Anstrengungen im Anschluss an seine Kartierung im Jahr 1990 (Hall et al., 1990; Narod et al., 1991) isoliert (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1994). Ein zweiter Locus, BRCA2, wurde kürzlich dem Chromosom 13 zukartiert (Wooster et al., 1994) und scheint für einen Anteil am früh ausbrechenden Brustkrebs von etwa demselben wie bei BRCA1, doch einem geringeren Risiko von Eierstockkrebs verantwortlich zu sein. Die verbliebene Anfälligkeit für früh ausbrechenden Brustkrebs teilt sich zwischen bisher unkartierten Genen für den familiär bedingten Krebs und selteneren Keimbahn-Mutationen bei Genen wie TP53 auf (Malkin et al., 1990). Es wurde auch vorgeschlagen, dass heterozygote Träger von defekten Formen des Ataxia-Teleangiektasie-Gens ein höheres Risiko für Brustkrebs tragen (Swift et al., 1976; Swift et al., 1991). Der spät ausbrechende Brustkrebs ist ebenfalls häufig familiär bedingt, obschon die Risiken bei Blutsverwandten nicht so hoch sind wie bei früh ausbrechendem Brustkrebs (Cannon-Albright et al., 1994; Mettlin et al., 1990). Allerdings ist der prozentuale Anteil dieser Fälle aufgrund einer genetischen Anfälligkeit unbekannt.
Brustkrebs ist seit langem als hereditäre Erkrankung anerkannt (Anderson, 1972). Zahlreiche Forscher untersuchten die Anzeichen für eine genetische Vererbung und folgerten, dass die Daten in höchstem Maße mit der dominanten Vererbung eines Hauptanfälligkeits-Locus oder -Loci übereinstimmen (Bishop und Gardner, 1980; Go et al., 1983; Williams und Anderson, 1984; Bishop et al., 1988; Newman et al., 1988; Claus et al., 1991). Jüngste Ergebnisse zeigen, dass mindestens drei Loci existieren, die eine Anfälligkeit für Brustkrebs als auch für andere Krebsarten verleihen. Bei diesen Loci handelt es sich um den TP53-Locus auf Chromosom 17p (Malkin et al., 1990), einen 17q-gekoppelten Anfälligkeits-Locus, bekannt als BRCA1 (Hall et al., 1990) und einen oder mehrere Loci, die für den unkartierten Rest verantwortlich sind. Hall et al. (1990) geben an, dass die erbliche Brustkrebs-Anfälligkeit bei Familienstämmen mit frühem Ausbruch mit dem Chromosom 17q21 gekoppelt ist; obschon spätere Untersuchungen dieser Gruppe unter Verwendung eines geeigneteren genetischen Modells die Beschränkung auf den früh ausbrechenden Brustkrebs teilweise widerlegten (Margaritte et al., 1992).
Die meisten Strategien für das Klonieren des 13-gekoppelten Brustkrebsprädisponierenden Gens (BRCA2) erfordern präzise genetische Lokalisations-Studien. Das einfachste Modell für die funktionelle Rolle des BRCA2 geht davon aus, dass Allele des BRCA2, die für Krebs prädisponieren, rezessiv gegenüber Wildtyp-Allelen sind; das heißt, dass Zellen, die mindestens ein Wildtyp-BRCA2-Allel enthalten, nicht kanzerös sind. Zellen, die ein Wildtyp-BRCA2-Allel und ein prädisponierendes Allel enthalten, können jedoch gelegentlich das Wildtyp-Allel entweder durch Zufallsmutation oder durch Chromosomenverlust während der Zellteilung (Nondisjunktion) verlieren. Der gesamten Nachkommenschaft solcher mutierter Zellen fehlt die Wildtyp-Funktion des BRCA2 und kann sich zu Tumoren entwickeln. Gemäß dieses Modells sind prädisponierende Allele des BRCA2 rezessiv, doch wird die Anfälligkeit für Krebs in einer dominanten Weise vererbt: Frauen, die ein prädisponierendes Allel (und ein Wildtyp-Allel) besitzen, tragen das Risiko einer Entwicklung von Krebs, da ihre Brustepitelzellen das Wildtyp-BRCA2-Allel spontan verlieren können. Dieses Modell trifft auf eine Gruppe von Krebsanfälligkeits-Loci zu, die als Tumorsuppressoren oder Antionkogene bekannt sind und eine Klasse von Genen darstellen, die das Retinoblastom-Gen und das Neurofibromatosis-Gen umfasst. Durch Schlussfolgern kann dieses Modell auch die BRCA1-Funktion erklären, wie vor kürzerem vorschlagen wurde (Smith et al., 1992).
Eine zweite Möglichkeit ist die, dass die BRCA2-prädisponierenden Allele in Wirklichkeit dominant sind; das heißt, dass ein Wildtyp-Allel von BRCA2 die tumorbildende Rolle des prädisponierenden Allels nicht überwinden kann. Folglich würde eine Zelle, die sowohl das Wildtyp- als auch das mutante Allel trägt, nicht notwendigerweise die Wildtyp-Kopie des BRCA2 verlieren, bevor sie bösartige Zellen entstehen lässt. Statt dessen würden Brustzellen bei prädisponierten Individuen (eine) andere Zufallsveränderung(en) vollziehen, die zum Krebs führten.
Wenn BRCA2-prädisponierende Allele rezessiv sind, so sollte das BRCA2-Gen normalerweise in gesundem Brustgewebe, doch nicht in Brusttumoren funktionell exprimiert werden. Sind dagegen BRCA2-prädisponierende Allele dominant, so kann das Wildtyp-BRCA2-Gen in gesundem Brustgewebe exprimiert werden oder auch nicht. Allerdings ist es wahrscheinlich, dass das prädisponierende Allel in Brusttumorzellen exprimiert wird.
Die Chromosom-13-Kopplung von BRCA2 wurde unabhängig durch Untersuchen von fünfzehn Familien bestätigt, die multiple früh auftretende Brustkrebsfälle aufwies, die nicht an BRCA1 gekoppelt waren (Wooster et al., 1994). Bei diesen Untersuchungen wurde behauptet, das Gen innerhalb einer großen Region von 6 centiMorgan (cM), oder etwa 6 Millionen Basenpaaren, zwischen den Markern D13S289 und D13S267, lokalisieren zu können, wobei BRCA2 in eine durch 13q12-13 definierte physische Region plaziert wurde. Die Größe dieser Regionen und die mit ihnen verbundene Unsicherheit hat es schwierig gemacht, eine physische Karte und/oder Klonierungs-Strategien zur Isolierung des BRCA2-Gens zu entwerfen und auszuführen. Wie auch BRCA1 scheint BRCA2 ein hohes Risiko von früh auftretendem Brustkrebs für Frauen mit sich zu bringen. Allerdings scheint BRCA2 kein wesentlich erhöhtes Risiko von Eierstockkrebs zu verleihen, obschon es ein erhöhtes Risiko von Brustkrebs für Männern mit sich zu bringen scheint (Wooster et al., 1994).
WO 97/19110 betrifft auch die Identifikation des humanen BRCA2-Gens, kann aber lediglich als eine Dokumentation des Stands der Technik unter Artikel 54(3) EPC unter Bezugnahme auf seine ersten beiden Prioritätsdokumente betrachtet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer isolierten Nucleinsäure, die die in SEQ ID NR.:1 dargestellte codierende Sequenz von der Nucleotidposition 229 bis zur Nucleotidposition 10482 umfasst und die ferner die mit einer Veranlagung zu Brustkrebs assoziierte Mutation umfasst, wobei T an der Nucleotidposition 6174 deletiert ist, zur Diagnose einer Veranlagung zu Brustkrebs bei Ashkenazi-jüdischen Frauen in vitro. Die Beschreibung stellt Verfahren und Materialien zum Isolieren und Nachweisen des humanen Brustkrebs-prädisponierenden Gens (BRCA2) bereit, von dem einige Allele eine Anfälligkeit für Krebs bewirken, insbesondere Brustkrebs bei Frauen und Männern. Die Offenbarung betrifft weiter somatische Mutationen im BRCA2-Gen bei humanem Brustkrebs und deren Ausnutzung in der Diagnose und Prognose von humanem Brustkrebs. Außerdem betrifft die Offenbarung das Screening des BRCA2-Gens auf Mutationen, die zur Diagnose der Prädisposition für Brustkrebs ausnutzbar sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In 1 ist eine schematische Karte der STSs, P1s, BACs und YACs in der BRCA2-Region gezeigt.
In 2 ist das Sequenzraum-Verhältnis zwischen den cDNA-Klonen, Hybridselektierten Klonen, cDNA-PCR-Produkten und genomischen Sequenzen gezeigt, die zum Zusammenbau der BRCA2-Transkriptsequenz verwendet werden. 2-Br-:RACE ist ein Biotin-Einfang-RACE-Produkt, das sowohl von humaner Brust- als auch humaner Thymus-cDNA erhalten wird. Der cDNA-Klon 1sC713.1 wurde durch Screening eines Pools humaner Keimdrüsen und HepG2-cDNA-Bibliotheken mit Hybrid-selektiertem Klon GT 713 identifiziert. Die Sequenz 1-BR:CG026^®5kb wurde aus einem PCR-Produkt, beginnend am Exon-7/8-Übergang (innerhalb von 1sC713.1) und endend innerhalb eines Hybrid-selektierten Klons, der Teil von Exon 11 ist, erzeugt. Die Sequenz von Exon 11 wurde durch Vergleich mit Hybridselektierten Klonen, der genomischen Sequenz in der Public Domain und radioaktiven DNA-Sequenziergelen korrigiert. Die innerhalb jenes Exons lokalisierten Hybrid-selektierten Klone (Klonnamen beginnend mit nH oder GT) sind darunter platziert. Die cDNA-Klone 1wCBF1B8.1, 1wCBF1A5.1, 1wCBF1A5.12, 1wCBF1B6.2 und 1wCBF1B6.3 wurden durch Screening eines Pools humaner Brustdrüsen-, Plazenta-, Keimdrüsen- und HepG2-cDNA-Bibliotheken mit den Exon-eingefangenen Klonen wXBF1B8, wXPF1A5 und wXBF1B6 identifiziert. Der Klon 1wCBF1B6.3 ist chimär (durch die gestrichelte Linie angegeben), doch sein 5'-Ende enthielt eine wichtige Überlappung mit 1wCBF11A5.1.
→ steht für den Translationsinitiator. • steht für den Translationsterminator.
In 3A–3D ist die DNA-Sequenz des BRCA2-Gens gezeigt (die außerdem in SEQ ID NR. 1 angegeben ist).
In 4 ist die Genomorganisation des BRCA2-Gens gezeigt. Die Exons (Kästen und/oder senkrechte Linien) sind entlang der Genomsequenzen so eingeteilt, (ftp://genome.wust1.edu/pub/gscl/brca;) (horizontale Linien), dass ihre Größen und Abstände proportional sind. Der Name jeder Genomsequenz ist an der linken Seite der Figur angegeben. Die Sequenzen 92M18.00541 und 92M18.01289 überlappen tatsächlich. Die Abstände zwischen den anderen Genomsequenzen sind nicht bekannt. Weder die öffentliche Datenbank noch unsere Sequenz-Datenbank enthielt mit Exon 21 überlappende Genomsequenzen. Exons 1, 11 und 21 sind nummeriert. "*" kennzeichnet zwei benachbarte Exons, die dicht genug beabstandet sind, dass sie sich bei diesem Maßstab nicht ineinander auflösen.
In 5A–5D ist ein Verlust der Heterozygotie-(LOH)-Analyse primärer Brusttumoren gezeigt. Die Allele der STR-Marker sind unterhalb des Chromatogramms angegeben. Gezeigt sind ein Beispiel eines bei BRCA2 heterozygoten Tumors (5A und 5B) und ein Beispiel eines Tumors mit LOH bei BRCA2 (5C und 5D). Die Fluoreszenz-Einheiten finden sich auf der Ordinate; die Größe in Basenpaaren findet sich auf der Abszisse. N steht für normal (5A und 5C), und T steht für Tumor (5B und 5D).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer isolierten Nucleinsäure, die die in SEQ ID NR.:1 dargestellte codierende Sequenz von der Nucleotidposition 229 bis zur Nucleotidposition 10482 umfasst und die ferner die mit einer Veranlagung zu Brustkrebs assoziierte Mutation umfasst, wobei T an der Nucleotidposition 6174 deletiert ist, zur Diagnose einer Veranlagung zu Brustkrebs bei Ashkenazi-jüdischen Frauen in vitro. Bei einer Ausführungsform wird mit der vorliegenden Offenbarung eine isolierte DNA bereitgestellt, die eine für ein BRCA2-Polypeptid codierende cDNA, welche durch die in SEQ ID NR. 2 beschriebene Aminosäuresequenz definiert wird, oder eine entsprechende RNA aufweist. Solch eine isolierte Nucleinsäure kann die in SEQ ID NR. 1 beschriebene Codierungssequenz von Nucleotidposition 229 bis Nucleotidposition 10482 oder eine entsprechende RNA umfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird eine isolierte Nucleinsäure offenbart, welche die in SEQ ID NR. 1 beschriebene Codierungssequenz von Nucleotidposition 229 bis Nucleotidposition 10482 oder eine entsprechende RNA umfasst, welche Nucleinsäure außerdem eine Mutation umfasst, die mit einer Prädisposition für Brustkrebs einhergeht, welche Mutation ausgewählt wird aus:

(a) AC in den Nucleotidpositionen 277 und 278 deletiert; oder
(b) vier Nucleotide in den Positionen 982–985 deletiert; oder
(c) mit vier Nucleotiden in den Positionen 4706–4709 deletiert; oder
(d) C in Nucleotidposition 8525 deletiert; oder
(e) fünf Nucleotide in den Positionen 9254–9258 deletiert; oder
(f) GT in den Nucleotidpositionen 4075 und 4076 deletiert; oder
(g) fünf Nucleotide in den Positionen 999–1003 deletiert; oder
(h) T in Nucleotidposition 6174 deletiert; oder
(i) drei Nucleotide in den Positionen 4132–4134 deletiert; oder
(j) A in Position 1493 deletiert; oder
(k) einem C anstelle eines A in Position 2411.

Bei noch einer weiteren Ausführungsform wird eine isolierte Nucleinsäure offenbart, die gewählt wird aus der Gruppe, welche umfasst:

(a) eine DNA, welche die in SEQ ID NR. 1 beschriebene Codierungssequenz von Nucleotidposition 229 bis Nucleotidposition 10482 oder eine entsprechende RNA aufweist, und
(b) eine DNA, welche mit einer ganzen DNA-Codierung für ein BRCA2-Polypeptid wie oben unter (a) beschrieben oder einer entsprechenden RNA hybridisiert und zu mindestens 95% zu dieser komplementär ist, wobei diese Nucleinsäure außerdem eine mit einer Prädisposition für Brustkrebs einhergehende Mutation aufweist und diese Mutation ausgewählt wird aus: (i) AC in den Nucleotidpositionen 277 und 278 deletiert; oder (ii) vier Nucleotide in Positionen 982–985 deletiert; oder (iii) mit vier Nucleotiden in den Positionen 4706–4709 deletiert; oder (iv) C in Nucleotidposition 8525 deletiert; oder (v) fünf Nucleotide in Positionen 9254–9258 deletiert; oder (vi) GT in Nucleotidpositionen 4075 und 4076 deletiert; oder (vii) fünf Nucleotide in Positionen 999–1003 deletiert; oder (viii) drei Nucleotide in Positionen 4132–4134 deletiert; oder (ix) A in Position 1493 deletiert; oder (x) einem C anstelle eines A in Position 2411.

Bei solchen Polynucleotiden kann es sich um Antisense-Polynucleotide handeln. Mit der vorliegenden Offenbarung wird außerdem ein rekombinantes Konstrukt bereitgestellt, das solch ein isoliertes Polynucleotid umfasst, zum Beispiel ein zur Expression in einer transformierten Wirtszelle geeignetes rekombinantes Konstrukt.
Mit der vorliegenden Offenbarung wird außerdem eine isolierte Nucleinsäure bereitgestellt, die mindestens 15 benachbarte Nucleotide einer Nucleinsäure nach unmittelbar oben stehendem (a) aufweist, welche mindestens 15 benachbarten Nucleotide die mit einer Prädisposition für Brustkrebs einhergehende Mutation umfassen.
Mit der vorliegenden Offenbarung werden weiterhin Verfahren zur Bestimmung der Abweichung der Nucleotidsequenz eines mit einer Prädisposition für Brustkrebs einhergehenden, vermutlich mutierenden BRCA2-Allels von einer die Nucleotide 229–10482 von SEQ ID NR. 1 enthaltenden bekannten, nicht-mutierenden BRCA2-codierenden Nucleotidsequenz vom Wildtyp, welches Verfahren die Herstellung einer das genannte, vermutlich mutierende BRCA2-Allel enthaltenden biologischen Probe umfasst und den Vergleich der Nucleotidsequenz des vermutlich mutierenden BRCA2-Allels mit der nicht-mutierenden Sequenz und die Identifizierung des/r Unterschieds/Unterschiede zwischen den Sequenzen.
Diese Methoden können außerdem den Schritt der Amplifikation eines Abschnitts des BRCA2-Locus umfassen und können außerdem einen Schritt der Bereitstellung eines Satzes von Polynucleotiden enthalten, welche Primer für die Amplifikation des Abschnitts des BRCA2-Locus sind. Das Verfahren ist zur Identifikation von Mutationen zur Ausnutzung entweder in der Diagnose der Prädisposition für Krebs oder der Diagnose oder Prognose von Krebs nützlich.
Ausgehend von einer Region am Humanchromosom 13 des Humangenoms, das eine geschätzte Größe von etwa 6 Millionen Basenpaaren aufweist, wurde eine kleinere Region von 1 bis 1,5 Millionen Basen identifiziert, die einen genetischen Locus, BRCA2, enthält, der eine Anfälligkeit für Krebs, einschließlich Brustkrebs, bewirkt.
Die Region, die den BRCA2-Locus enthält, wurde unter Verwendung einer Vielzahl genetischer Methoden identifiziert. Mit genetischen Kartierungsmethoden wurde anfänglich die BRCA2-Region bezüglich der Rekombination mit genetischen Markern definiert. Basierend auf Untersuchungen an großen verzweigten Familien ("Familienstämmen") mit vielen Fällen von Brustkrebs wurde eine Chromosomenregion genau bestimmt, die das BRCA2-Gen enthält. Eine Region, die den BRCA2-Locus enthält, ist durch die Marker D13S289 und D13S267 physisch begrenzt.
Die Verwendung der durch diese Offenbarung bereitgestellten genetischen Marker ermöglichte die Identifikation von Klonen, die die Region einer Bank von humanen, künstlich hergestellten Hefechromosomen (yeast artificial chromosome – YAC) oder von humanen, künstlich hergestellten Bakterienchromosomen (bacterial artificial chromosome – BAC) abdeckt. Es wird auch die Identifikation und Präparation leichter manipulierbarer P1- und BAC-Klone aus dieser Region und die Konstruktion eines "Contig" aus einer Untergruppe von Klonen ermöglicht. Diese P1s, YACs und BACs stellen die Grundlage für das Klonieren des BRCA2-Locus bereit, ebenso wie die Grundlage für die Entwicklung von z.B. in der Diagnose und Behandlung von Brust- und/oder Eierstockkrebs wirksamen Reagenzien. Das BRCA2-Gen und weitere potentielle Anfälligkeits-Gene wurden aus dieser Region isoliert. Die Isolation wurde unter Anwendung von Software-Trapping (eine Computer-Methode zur Identifizierung von Sequenzen, die wahrscheinlich codierende Exons aus angrenzenden oder diskontinuierlichen genomischen DNA-Sequenzen enthalten), Hybrid-Auswahlmethoden und direktem Screening mit ganzen oder teilweisen cDNA-Inserten von P1 und BAC in der Region zum Screening von cDNA-Banken vorgenommen. Diese Methoden wurden zum Erhalt von Sequenzen von in Brust- und anderem Gewebe exprimierten Loci verwendet. Diese Kandidaten-Loci wurden zur Identifizierung von Sequenzen analysiert, die eine Krebsanfälligkeit verleihen. Wir haben entdeckt, dass Mutationen in der codierenden Sequenz des BRCA2-Locus bei Stämmen vorliegen, die für die Chromosom 13-gekoppelte Krebsanfälligkeit, bekannt als BRCA2, verantwortlich sind. Die vorliegende Erfindung erleichtert nicht nur den frühen Nachweis bestimmter Krebsarten, was für das Überleben des Patienten so entscheidend ist, sondern auch die Bestimmung anfälliger Personen, bevor sich überhaupt Krebs heranbildet.
Populationsquellen
Große, wohl dokumentierte Familienstämme aus Utah sind zur Bereitstellung guter Quellen für humangenetische Untersuchungen besonders wichtig. Jeder große Stamm bietet unabhängig die Erbringbarkeit des Nachweises dafür, ob ein BRCA2-Anfälligkeits-Allel in jener Familie auftritt. Für die Lokalisierung und Isolierung des BRCA2-Locus informative Rekombinante konnten lediglich von Stämmen erhalten werden, die groß genug waren, um das Vorhandensein eines Anfälligkeits-Allels zu bestätigen. Große Blutsverwandtschaften sind zur Untersuchung des Brustkrebses besonders wichtig, da die Penetranz des BRCA2-Anfälligkeits-Allels sowohl durch Alter als auch Geschlecht vermindert wird, was informative Blutsverwandtschaften schwer zu finden macht. Darüber hinaus sind große Verwandtschaftsgruppen für die Konstruktion von Haplotypen verstorbener Personen durch Folgerung von den Haplotypen auf ihre engen Verwandten wesentlich.
So können zwar auch andere Populationen nützliche Informationen liefern, doch erfordern solche Untersuchungen im allgemeinen viel größere Anstrengungen und sind dabei die Familien gewöhnlich viel kleiner und daher weniger informativ. Das altersangepasste Auftreten von Brustkrebs in Utah liegt um 20% niedriger als die amerikanische Durchschnittsrate. Das geringere Auftreten in Utah liegt vermutlich zum Großteil am jungen Alter bei der ersten Schwangerschaft, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass die bei Familienstämmen in Utah gefundenen Fälle eine genetische Prädisposition tragen.
Genetische Kartierung
Eine Gruppe informativer Familien vorausgesetzt, sind genetische Marker zur Kopplung einer Erkrankung mit einer Region eines Chromosoms wesentlich. Zu solchen Markern zählen Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs) (Botstein et al., 1980), Marker mit einer variablen Anzahl an Tandem-Repeats (VNTRs) (Jeffreys et al., 1985; Nakamura et al., 1987) und eine reiche Klasse an DNA-Polymorphismen auf der Basis kurzer Tandem-Repeats (STRs), besonders Repeats von CpA (Weber und May, 1989; Litt et al., 1989). Zur Schaffung einer genetischen Karte wählt man potentielle genetische Marker aus und testet sie unter Anwendung der von Mitgliedern der zu untersuchenden Familienstämme gewonnenen DNA.
Genetische Marker, die zur Suche nach einem mit einer Erkrankung gekoppelten genetischen Locus nützlich sind, können auf einer ad hoc-Basis ausgewählt werden, indem ein spezifisches Chromosom dicht abgedeckt wird oder eine spezifische Region eines Chromosoms detailliert analysiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren zur Auswahl von mit einer Erkrankung verknüpften genetischen Markern bezieht das Auswerten des Informationsgrades von Familienstämmen ein, um den idealen Abstand zwischen genetischen Markern eines gegebenen Grades an Polymorphismus zu bestimmen, dann die Auswahl jener Marker aus bekannten genetischen Karten, die ideale Abstände für eine maximale Wirksamkeit aufweisen. Der Informationsgehalt von Familienstämmen wird anhand der Wahrscheinlichkeit gemessen, dass die Marker bei nicht-verwandten Personen heterozygot sein werden. Auch die Verwendung von STR-Markern ist überaus effizient, die durch Amplifikation der Ziel-Nucleinsäuresequenz unter Anwendung der PCR nachgewiesen werden; solche Marker sind in hohem Maße informativ, leicht zu untersuchen (Weber und May, 1989) und können unter Anwendung multiplexierender Strategien gleichzeitig untersucht werden (Skolnick und Wallace, 1988), was die Anzahl der erforderlichen Experimente stark vermindert.
Wurde die Kopplung einmal festgestellt, so müssen die Marker gefunden werden, die den Krankheits-Locus flankieren, d.h. einen oder mehrere proximal zum Krankheits-Locus gelegene Marker und einen oder mehrere distal zum Krankheits-Locus gelegene Marker. Wo möglich, können Kandidaten-Marker aus einer bekannten genetischen Karte ausgewählt werden. Wo keiner bekannt ist, können neue Marker mittels der STR-Methode identifiziert werden, wie in den Beispielen gezeigt.
Bei der genetischen Kartierung handelt es sich gewöhnlich um einen sich wiederholenden Prozess. Bei der vorliegenden Offenbarung begann dieser durch Definieren flankierender genetischer Marker um den BRCA2-Locus herum, dann durch Ersetzen dieser flankierenden Marker durch andere Marker, die sukzessiv näher am BRCA2-Locus lagen. Als Anfangsschritt waren Rekombinations- Ereignisse, die durch große verzweigte Familienstämme definiert waren, spezifisch bei der Lokalisation des BRCA2-Locus als entweder distal oder proximal zu einem spezifischen genetischen Marker hilfreich (Wooster et al., 1994).
Die Region um BRCA2 war bis zur vorliegenden Offenbarung nicht gut kartiert, und es gab wenige Marker. Daher wurden kurze repetitive Sequenzen aus Cosmiden, P1s, BACs und YACs entwickelt, welche die Region physisch kartieren, und wurden zur Entwicklung neuer genetischer Marker analysiert. Es wurden neuartige STRs gefunden, die sowohl polymorph waren als auch die BRCA2-Region kartierten.
Physische Kartierung
Zur physischen Kartierung der Region wurden drei unterschiedliche Methoden angewandt. Die erste bestand in der Verwendung künstlich hergestellter Hefe-Chromosomen (YACs) zur Klonierung der BRCA2-Region. Die zweite bestand in der Schaffung eines Satzes von P1-, BAC- und Cosmid-Klonen, welche die den BRCA2-Locus enthaltende Region abdecken.
Künstlich hergestellte Hefe-Chromosomen (YACs). Sobald eine ausreichend kleine, den BRCA2-Locus enthaltende Region identifiziert war, wurde die physikalische Isolierung der DNA in der Region durch Identifizieren eines Satzes überlappender YACs, die die Region abdecken, vorgenommen. Nützliche YACs können aus bekannten Banken isoliert werden, wie etwa den St. Louis- und CEPH-YAC-Banken, die breit eingeteilt sind und jeweils etwa 50.000 YACs umfassen. Die isolierten YACs stammten aus diesen öffentlich zugänglich Banken und können von einer Vielzahl von Quellen bezogen werden, einschließlich des Michigan Genome Center. Ganz klar hätten andere, die Zugang zu diesen YACs gehabt hätten, ohne die vorliegende Offenbarung den Wert der spezifischen YACs, die wir ausgewählt haben, nicht erkannt, da sie nicht gewusst hätten, welche YACs sich innerhalb und welche YACs sich außerhalb der kleinsten, den BRCA2-Locus enthaltenden Region befunden hätten.
P1- und BAC-Klone. Bei der vorliegenden Offenbarung ist es von Vorteil, mit dem Erhalt der P1- und BAC-Klone zur Abdeckung dieser Region zu beginnen. Die kleinere Größe dieser Inserte im Vergleich zu YAC-Inserten macht diese nützlicher als spezifische Hybridisierungssonden. Außerdem lässt sich dadurch, dass die klonierte DNA in Bakterienzellen und nicht in Hefezellen vorliegt, die DNA von Interesse viel einfacher manipulieren und das Signal-Geräusch-Verhältnis der Hybridisierungs-Assays verbessern.
P1- und BAC-Klone werden durch Screening von Banken, die aus dem gesamten Humangenom konstruiert sind, mit spezifischen Sequenz-markierten Stellen (STS) erhalten, die von den wie hierin beschrieben isolierten YACs, P1s und BACs stammen.
Diese P1- und BAC-Klone können durch eingestreute repetitive Sequenz-(IRS)-PCR und/oder Restriktionsenzym-Verdaus, gefolgt von Gelelektrophorese und Vergleich der resultierenden DNA-Fragmente ("Fingerprints") verglichen werden (Maniatis et al., 1982). Die Klone können auch durch das Vorhandensein von STS bestimmt werden. Die Fingerprints werden zur Definierung eines überlappenden angrenzenden Klonsatzes verwendet, der die Region abdeckt, doch nicht übermäßig redundant ist und hierin als ein "minimal plattierter Weg" bezeichnet wird. Solch ein minimal plattierter Weg stellt die Grundlage für anschließende Experimente zur Identifizierung von cDNAs dar, die aus dem BRCA2-Locus stammen können.
Die P1-Klone (Sternberg, 1990; Sternberg et al., 1990; Pierce et al., 1992; Shizuya et al., 1992) wurden von Genome Sciences unter Verwendung von durch uns für das Screening bereitgestellten PCR-Primern isoliert. Die BACs wurden durch Hybridisationsmethoden in Dr. Mel Simon's Labor und durch Analyse von PCR-Pools in unserem Labor bereitgestellt. Die Strategie der Verwendung von P1- und BAC-Klonen gestattete auch die Abdeckung der genomischen Region mit einem unabhängigen, nicht von YAC stammenden Klonsatz. Dies bewahrt vor der Möglichkeit von Deletionen bei YACs. Diese neuen, von den P1- und BAC-Klonen stammende Sequenzen liefern das Material für ein weiteres Screening auf Kandidaten-Gene, wie nachstehend beschrieben.
Genisolierung
Es gibt viele Methoden zum Testen der genomischen Klone auf das Vorhandensein von Sequenzen, die möglicherweise Kandidaten für codierende Sequenz eines zu isolierenden Locus darstellen können, einschließlich, doch nicht beschränkt auf: (a) Zoo-Blots, (b) Identifizieren von HTF-Inseln, (c) Exon-Trapping, (d) Hybridisieren von cDNA an P1s, BACs oder YACs, und (e) Screening von cDNA-Banken.

(a) Zoo-Blots. Die erste Methode besteht in der Hybridisierung von Cosmiden an Southern-Blots, um DNA-Sequenzen zu identifizieren, die evolutionär konserviert sind und daher positive Hybridisierungs-Signale mit einer DNA von Spezies von variierenden Verwandtschaftsgraden zum Menschen ergeben (wie etwa Affe, Kuh, Huhn, Schwein, Maus und Ratte). Southern-Blots, die eine DNA von einer Vielzahl von Spezies enthalten, stehen kommerziell zur Verfügung (Clonetech, Kat. 7753-1).
(b) Identifizieren von HTF-Inseln. Die zweite Methode bezieht das Auffinden von Regionen ein, die reich an Nucleotiden C und G sind und oftmals nahe oder innerhalb der codierenden Sequenzen auftreten. Diese Sequenzen werden HTF-(HpaI-"tiny fragment") oder CpG-Inseln genannt, da Restriktionsenzyme, die für Stellen spezifisch sind, die CpG-Dimeren enthalten, häufig in diesen Regionen spalten (Lindsay et al., 1987).
(c) Exon-Trapping. Die dritte Methode besteht im Exon-Trapping, einer Methode, mit der Sequenzen in der genomischen DNA identifiziert werden, die Spleißstellen enthalten und daher mit einiger Wahrscheinlichkeit codierende Gensequenzen umfassen. Die Exon-Amplifikation (Buckler et al., 1991) wird zur Auswahl und Amplifikation von Exons aus den oben beschriebenen DNA-Klonen verwendet. Die Exon-Amplifikation basiert auf der Auswahl von RNA-Sequenzen, die von funktionellen 5'- und/oder 3'-Spleißstellen flankiert sind. Die Produkte der Exon-Amplifikation werden zum Screening der Brust-cDNA-Banken verwendet, um eine handhabbare Anzahl von Kandidaten-Genen für die weitere Untersuchung zu identifizieren. Das Exon-Trapping kann auch an kleinen Segmenten der sequenzierten DNA unter Verwendung von Computer-Programmen oder mittels Software-Trapping durchgeführt werden.
(d) Hybridisierung von cDNA an P1, BAC oder YAC. Die vierte Methode besteht in einer Modifikation der selektiven Anreicherungsmethode, die die Hybridisierung von cDNA an Cosmide, P1s, BACs oder YACs verwendet und erlaubt die Identifizierung transkribierter Sequenzen in, und die Rückgewinnung aus, klonierter genomischer DNA (Kandpal et al., 1990). Die selektive Anreicherungsmethode bezieht in ihrer Modifikation für den vorliegenden Zweck die Bindung von DNA aus der Region des in einem YAC vorhandenen BRCA2 an eine Säulen-Matrix und das Auswählen von cDNAs aus den relevanten Banken mit ein, die mit der gebundenen DNA hybridisieren, gefolgt von Amplifikation und Reinigung der gebundenen DNA, was zu einer starken Anreicherung von cDNAs in der durch die klonierte genomische DNA dargestellten Region führt.
(e) Identifikation von cDNAs. Die fünfte Methode besteht im Identifizieren von cDNAs, die dem BRCA2-Locus entsprechen. Die Hybridisierungs-Sonden, die vermutete Codierungssequenzen enthalten und mit einer der obigen Methoden ausgewählt werden, werden zum Screening verschiedener Banken, einschließlich Brustgewebe-cDNA-Banken und jegliche anderen erforderlichen Banken, verwendet.

Eine weitere Variation des Themas der direkten Auswahl von cDNA kann ebenfalls zum Auffinden von Kandidatengenen für BRCA2 angewendet werden (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993). Bei dieser Methode wird Cosmid-, P1- oder BAC-DNA als der Sonde verwendet. Die Sonden-DNA wird mit einem stumpf spaltenden Restriktionsenzym wie HaeIII verdaut. Dann werden doppelsträngige Adaptoren an die DNA ligiert, die als Bindungsstellen für Primer in anschließenden PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von biotinylierten Primern dienen. Die Ziel-cDNA wird aus von Gewebeproben wie Brustgewebe stammender mRNA durch Synthese von einem entweder zufallsgeprimten oder Oligo(dT)-geprimten ersten Strang, gefolgt von der Zweitstrangsynthese, generiert. Die cDNA-Enden werden stumpf gemacht und an doppelsträngige Adaptoren ligiert. Diese Adaptoren dienen als Amplifika-tionsstellen für die PCR. Die Ziel- und Sondensequenzen werden denaturiert und mit humaner C_ot-1-DNA zum Blockieren repetitiver Sequenzen gemischt. Die Lösungs-Hybridisierung wird auf hohe C_ot-1/2-Werte vorgenommen, um die Hybridisierung rarer Ziel-cDNA-Moleküle zu gewährleisten. Das annealte Material wird dann auf Avidinkügelchen eingefangen, bei hoher Stringenz gewaschen und die rückerhaltene cDNA eluiert und mittels PCR amplifiziert. Die ausgewählte cDNA wird weiteren Runden der Anreicherung unterzogen, bevor sie in einen Plasmid-Vektor für die Analyse kloniert wird.
Testen der cDNA auf ihr Kandidaten-Potential
Der Beweis, dass die cDNA der BRCA2-Locus ist, wird durch Auffinden von Sequenzen in einer DNA erhalten, die aus betroffenen Mitgliedern von Familienstämmen extrahiert wurde, die abnormale BRCA2-Genprodukte oder abnormale Gehalte an BRCA2-Genprodukt produzieren. Solche BRCA2-Anfälligkeits-Allele spalten sich zusammen mit der Erkrankung in großen Familienstämmen ab. Sie liegen auch in viel größerer Häufigkeit bei nicht-stammzugehörigen Personen mit Brustkrebs als bei Personen aus der Allgemeinbevölkerung vor. Da schließlich Tumoren oftmals an Loci somatisch mutieren, die in anderen Fällen in der Keimbahn mutiert sind, erwarten wir, normale Keimbahn-BRCA2-Allele vorzufinden, die zu den BRCA2-Anfälligkeits-Allelen in aus Tumorgewebe extrahierter DNA identischen oder ähnlichen Sequenzen mutiert sind.
Ob nun BRCA2-Sequenzen aus Tumorgewebe zu BRCA2-Allelen aus der Keimbahn derselben Individuen verglichen werden oder die Keimbahn-BRCA2-Allele von Krebsfällen mit denen nicht betroffener Personen verglichen werden, so liegt doch der Schlüssel in der Auffindung von Mutationen, die ernstlich genug sind, um eine offensichtliche Zerstörung der normalen Funktion des Genprodukts zu bewirken. Diese Mutationen können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwersten Formen sind Frameshift-Mutationen oder große Deletionen, die das Gen zum Codieren für ein abnormales Protein oder ein solches bringen, das die Proteinexpression signifikant verändert. Weniger schwer zerstörende Mutationen umfassen kleine In-frame-Deletionen und nicht-konservative Basenpaar-Substitutionen, die eine signifikante Auswirkung auf das produzierte Protein haben, wie etwa Alterationen an oder von einem Cystein-Rest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt, oder andere Mutationen, die die sekundäre, tertiäre oder quaternäre Proteinstruktur beeinträchtigen. Stille Mutationen oder solche, die zu konservativen Aminosäure-Substitutionen führen, sollten im allgemeinen die Proteinfunktion nicht zerstören.
Gemäß der vorliegenden Offenbarung wird eine Alteration des Wildtyp-BRCA2-Locus nachgewiesen. Darüber hinaus kann die Methode durch Nachweis des Wildtyp-BRCA2-Locus und Bestätigung des Fehlens einer Prädisposition für Krebs am BRCA2-Locus erfolgen. "Alteration eines Wildtyp-Gens" umfasst alle Formen von Mutationen, einschließlich Deletionen, Insertionen und Punktmutationen in den codierenden und nicht-codierenden Regionen. Deletionen können das gesamte Gen oder lediglich einen Abschnitt des Gens umfassen. Punktmutationen können zu Stopcodons, Frameshift-Mutationen oder Aminosäure-Substitutionen führen. Bei somatischen Mutationen handelt es sich um solche, die lediglich in gewissen Geweben, z.B. in Tumorgewebe, auftreten und nicht in der Keimbahn vererbt werden. Keimbahn-Mutationen sind in jeglichen Körpergeweben vorfindbar und sind erblich. Ist lediglich ein einzelnes Allel somatisch mutiert, so ist ein frühes neoplastisches Stadium indiziert. Sind allerdings beide Allele somatisch mutiert, so ist ein spätes neoplastisches Stadium indiziert. Das Auffinden von BRCA2-Mutationen bietet daher sowohl diagnostische als auch prognostische Information. Ein BRCA2-Allel, das nicht deletiert ist (wie etwa auf einem Schwester-Chromosom zu einem Chromosom festgestellt, das eine BRCA2-Deletion trägt) kann auf andere Mutationen wie Insertionen, kleine Deletionen und Punktmutationen gescreent werden. Es wird angenommen, dass viele, in Tumorgeweben gefundene Mutationen solche sind, die zu einer verminderten Expression des BRCA2-Genprodukts führen.
Allerdings führen Mutationen, die zu nicht-funktionellen Genprodukten führen, auch zu einem kanzerösen Zustand. Punktmutations-Ereignisse können in regulatorischen Regionen auftreten, wie etwa im Promotor des Gens, was zu Verlust oder Abnahme der Expression der mRNA führt. Punktmutationen können auch eine korrekte RNA-Prozessierung aufheben, was zu einem Verlust der Expression des BRCA2-Genprodukts oder zu einer Abnahme der mRNA-Stabilität oder der Translations-Leistung führt.
Zu nützlichen diagnostischen Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluoreszenz-in situ-Hybridisation (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, einzelsträngige Konformationsanalyse (SSCA), RNase-Schutzassay, Allel-spezifisches Oligonucleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP, wie weiter unten ausführlich erörtert.
Eine Prädisposition für Krebsarten wie Brustkrebs als auch die anderen hierin identifizierten Krebsarten kann durch Testen jeglichen Gewebes eines Menschen auf Mutationen des BRCA2-Gens bestimmt werden. Z.B. wiese eine Person, die eine Keimbahn-BRCA2-Mutation geerbt hätte, eine Anfälligkeit für die Entwicklung von Krebs auf. Dies kann durch Testen der DNA aus einem beliebigen Körpergewebe der Person bestimmt werden. Am einfachsten kann Blut entnommen und die DNA aus den Blutzellen extrahiert werden. Außerdem kann eine pränatale Diagnose durch Testen von Fötuszellen, Plazentazellen oder amniotischen Zellen auf Mutationen des BRCA2-Gens erfolgen. Eine Alteration eines Wildtyp-BRCA2-Allels, ob nun z.B. durch Punktmutation oder Deletion, kann mittels einer der hierin erörterten Methoden nachgewiesen werden.
Es gibt verschiedene Methoden, die zum Nachweis einer DNA-Sequenz-Variation eingesetzt werden können. Mit einer direkten DNA-Sequenzierung, d.h. entweder einer manuellen Sequenzierung oder automatisierten Fluoreszenz-Sequenzierung, kann eine Sequenz-Variation nachgewiesen werden. Bei einem derart großen Gen wie BRCA2 ist die manuelle Sequenzierung sehr arbeitsintensiv, doch werden unter optimalen Bedingungen Mutationen in der codierenden Sequenz eines Gens selten übersehen. Einen weiteren Ansatz stellt der einzelsträngige Konformations-Polymorphismus-Assay (SSCA) dar (Orita et al., 1989). Mit dieser Methode werden nicht alle Sequenzveränderungen nachgewiesen, besonders wenn die DNA-Fragmentgröße mehr als 200 bp beträgt, doch kann sie zum Nachweis des Großteils der DNA-Sequenz-Variation optimiert werden. Die verminderte Nachweis-Empfindlichkeit stellt einen Nachteil dar, doch macht der mit SSCA mögliche erhöhte Durchsatz es zu einer attraktiven, machbaren Alternative zur direkten Sequenzierung für den Mutationsnachweis auf einer Forschungsbasis. Die Fragmente, die die Mobilität auf SSCA-Gelen verschoben haben, werden dann zur Bestimmung der genauen Beschaffenheit der DNA-Sequenz-Variation sequenziert. Zu weiteren, auf dem Nachweis von Fehlpaarungen zwischen zwei komplementären DNA-Strängen basierenden Ansätzen zählen die "clamped" denaturierende Gelelektrophorese (CDGE) (Sheffield et al., 1991), die Heteroduplex-Analyse (HA) (White et al., 1992) und die chemische Fehlpaarungs-Spaltung (CMC) (Grompe et al., 1989). Mit keiner der oben beschriebenen Methoden werden große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen nachgewiesen, noch eine regulatorische Mutation, die die Transkription oder Translation des Proteins beeinflusst. Andere Methode, mit denen diese Klassen von Mutationen nachgewiesen werden könnten, wie etwa ein Proteinbeschneidungs-Assay oder der asymmetrische Assay, weisen lediglich spezifische Typen von Mutationen nach und würden Missense-Mutationen nicht feststellen. Einen Überblick über derzeit verfügbare Methoden zum Nachweisen einer DNA-Sequenz-Variation ist in einer kürzlich erschienen Übersicht von Grompe (1993) zu finden. Ist eine Mutation einmal bekannt, so kann ein Allel-spezifischer Nachweis-Ansatz, wie etwa eine Allel-spezifische Oligonucleotid-(ASO)-Hybridisation, zum schnellen Screening großer Zahlen an weiteren Proben auf dieselbe Mutation angewandt werden.
Um die Alteration des Wildtyp-BRCA2-Gens in einem Gewebe nachzuweisen, ist es hilfreich, das Gewebe von umgebenden gesunden Geweben frei zu isolieren. Methoden zur Anreicherung von Gewebepräparaten für Tumorzellen sind im Fachgebiet bekannt. Z.B. kann das Gewebe von Paraffin- oder Kryostat-Sektionen isoliert werden. Krebszellen können auch von gesunden Zellen mittels Durchflusszytometrie getrennt werden. Diese Methoden als auch andere Methoden zur Trennung von Tumorzellen von gesunden Zellen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Ist das Tumorgewebe in hohem Maße mit gesunden Zellen durchsetzt, so ist der Nachweis der Mutationen schwieriger.
Eine schnelle Vorab-Analyse zum Nachweis von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann vorgenommen werden, indem eine Reihe von Southern Blots von einer DNA begutachtet wird, die mit ein oder mehreren Restriktionsenzymen, vorzugsweise mit einer großen Zahl von Restriktionsenzymen, gespalten wurde. Jeder Blot enthält eine Serie von gesunden Individuen und eine Serie von Krebsfällen, Tumoren oder beidem. Southern Blots, die Hybridisierungs-Fragmente aufweisen (unterschiedlich lang zu Kontroll-DNA, wenn mit Sequenzen nahe oder einschließlich dem BRCA2-Locus sondiert), zeigen eine mögliche Mutation an.
Werden Restriktionsenzyme verwendet, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, so wird die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) angewandt.
Der Nachweis von Punktmutationen kann mittels einer molekularen Klonierung des/der BRCA2-Allele/e und Sequenzierung des/der Allels/e unter Anwendung im Fachgebiet wohlbekannter Methoden erzielt werden. Alternativ dazu können die Gensequenzen direkt aus einem genomischen DNA-Präparat des Tumorgewebes unter Anwendung bekannter Methoden amplifiziert werden. Die DNA-Sequenz der amplifizierten Sequenzen kann dann bestimmt werden.
Es gibt sechs wohlbekannte Methoden für einen umfassenderen, jedoch indirekten Test zur Bestätigung des Vorhandenseins eines Anfälligkeits-Allels: 1) einzelsträngige Konformationsanalyse (SSCA) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase-Schutzassays (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) Allel-spezifische Oligonucleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nucleotid-Fehlpaarungen erkennen, wie etwa das E. coli mutS-Protein (Modrich, 1991); und 6) Allel-spezifische PCR (Rano & Kidd, 1989). Für die Allel-spezifische PCR werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden an eine bestimmte BRCA2-Mutation hybridisieren. Ist die bestimmte BRCA2-Mutation nicht vorhanden, so wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Auch das Amplifikationsrefraktorische Mutationssystem (ARMS) kann angewandt werden, wie in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0332435 und bei Newton et al., 1989, beschrieben. Insertionen und Deletionen der Gene können auch durch Klonieren, Sequenzieren und Amplifizieren nachgewiesen werden. Außerdem können Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Sonden für die Gene oder Umgebungsmarker-Gene zur Bewertung der Alteration eines Allels oder einer Insertion in einem polymorphen Fragment verwendet werden. Ein derartiges Verfahren ist besonders nützlich für das Screening von Verwandten einer betroffenen Person auf das Vorhandensein der BRCA2-Mutation, die bei der betroffenen Person festgestellt wurde. Es können auch weitere, im Fachgebiet bekannte Methoden zum Nachweis von Insertionen und Deletionen angewandt werden.
Bei den ersten drei Methoden (SSCA, DGGE und RNase-Schutzassay) taucht eine neue elektrophoretische Bande auf. SSCA weist eine Bande nach, die differenziell wandert, da die Sequenzveränderung zu einer Differenz bei der einzelsträngigen, intramolekularen Basenpaarung führt. Der RNase-Schutz bezieht die Spaltung des mutanten Polynucleotids in zwei oder mehrere kleinere Fragmente ein. Die DGGE weist die Differenzen in den Wanderungsraten der mutanten Sequenzen im Vergleich zu den Wildtyp-Sequenzen unter Verwendung eines denaturierenden Gradientengels nach. Bei einem Allel-spezifischen Oligonucleotid-Assay wird ein Oligonucleotid entworfen, das eine spezifische Sequenz nachweist, wobei der Assay unter Nachweis der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Hybridisierungs-Signals vorgenommen wird. Beim mutS-Assay bindet das Protein lediglich an Sequenzen, die eine Nucleotid-Fehlpaarung in einem Heteroduplex zwischen einer mutanten und einer Wildtyp-Sequenz enthält.
Bei Fehlpaarungen handelt es sich gemäß der vorliegenden Offenbarung um hybridisierte Nucleinsäure-Duplexe, bei denen die beiden Stränge nicht zu 100 % komplementär sind. Das Fehlen einer vollkommenden Homologie kann auf Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen rückführbar sein. Der Fehlpaarungs-Nachweis kann zur Feststellung von Punktmutationen im Gen oder in seinem mRNA-Produkt angewandt werden. Zwar sind die Methoden weniger empfindlich als die Sequenzierung, doch sind sie leichter an einer großen Zahl von Tumorproben durchführbar. Ein Beispiel einer Fehlpaarungs-Spaltmethode stellt die RNase-Schutzmethode dar. In der Ausführung der vorliegenden Offenbarung umfasst die Methode die Verwendung einer markierten Ribosonde, die komplementär zur humanen Wildtyp-BRCA2-Gen-codierenden Sequenz ist. Die Ribosonde und entweder die aus dem Tumorgewebe isolierte mRNA oder DNA werden miteinander vereinigt (hybridisiert) und anschließend mit dem Enzym RNase A verdaut, das zum Nachweis einiger Fehlpaarungen in einer Duplex-RNA-Struktur fähig ist. Wird eine Fehlpaarung durch RNase A nachgewiesen, so spaltet sie an der Stelle der Fehlpaarung. Wird folglich das annealte RNA-Präparat auf einer elektrophoretischen Gelmatrix aufgetrennt, so wird, sofern eine Fehlpaarung nachgewiesen und durch RNase A gespalten wurde, ein RNA-Produkt zu erkennen sein, das kleiner als die Duplex-RNA der vollen Länge für die Ribosonde und die mRNA oder DNA ist. Die Ribosonde braucht nicht die volle Länge der BRCA2-mRNA oder des Gens zu umfassen, sondern kann auch in jeweils einem Segment bestehen. Umfasst die Ribosonde lediglich ein Segment der BRCA2-mRNA oder des Gens, so ist die Verwendung einer Anzahl dieser Sonden zum Screening der vollständigen mRNA-Sequenz auf Fehlpaarungen erwünscht.
In ähnlicher Weise können DNA-Sonden zum Nachweis von Fehlpaarungen durch enzymatische oder chemische Spaltung verwendet werden. Siehe z.B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ dazu können Fehlpaarungen durch Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität fehlgepaarter Duplexe relativ zu korrekt gepaarten Duplexen nachgewiesen werden. Siehe z.B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNA oder DNA, die eine Mutation enthalten könnte, kann entweder mit Ribosonden oder DNA-Sonden unter Anwendung von PCR (siehe unten) vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Alterationen der DNA des BRCA2-Gens können auch unter Anwendung der Southern-Hybridisation nachgewiesen werden, besonders wenn die Alterationen grobe Neuanordnungen darstellen wie Deletionen und Insertionen.
Die DNA-Sequenzen des BRCA2-Gens, die unter Anwendung von PCR amplifiziert wurden, können auch unter Verwendung Allel-spezifischer Sonden gescreent werden. Bei diesen Sonden handelt es sich um Nucleinsäure-Oligomere, von denen jedes eine Region der BRCA2-Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation beherbergt. Z.B. kann ein Oligomer etwa 30 Nucleotide lang sein, entsprechend einem Abschnitt der BRCA2-Gensequenz. Durch Verwenden einer Batterie solcher Allel-spezifischer Sonden können die PCR-Amplifikationsprodukte zur Identifizierung des Vorhandenseins einer zuvor identifizierten Mutation im BRCA2-Gen gescreent werden. Die Hybridisierung der Allel-spezifischen Sonden mit amplifizierten BRCA2-Sequenzen kann z.B. auf einem Nylonfilter durchgeführt werden. Die Hybridisierung einer bestimmten Sonde unter stringenten Hybridisationsbedingungen gibt das Vorhandenein derselben Mutation im Tumorgewebe wie in der Allel-spezifischen Sonde an.
Den definitivsten Test auf Mutationen in einem Kandidat-Locus stellt der direkte Vergleich genomischer BRCA2-Sequenzen von Krebspatienten mit denen von einer Kontrollpopulation dar. Alternativ könnte man Messenger-RNA nach der Amplifikation, z.B. durch PCR, sequenzieren und dabei das Erfordernis des Bestimmens der Exon-Struktur des Kandidat-Gens eliminieren.
Mutationen bei Krebspatienten, die außerhalb der codierenden Region von BRCA2 liegen, können durch Untersuchen der nicht-codierenden Regionen, wie etwa Introns und regulatorische Sequenzen nahe oder innerhalb des BRCA2-Gens, nachgewiesen werden. Ein früher Hinweis darauf, dass Mutationen in den nicht-codierenden Regionen wichtig sind, kann aus Northern-Blot-Experimenten abgelesen werden, die Messenger-RNA-Moleküle von abnormaler Größe oder Menge bei Krebspatienten im Vergleich zu Kontrollpersonen aufzeigen.
Eine Alteration der BRCA2-mRNA-Expression kann mittels jeglicher im Fachgebiet bekannter Methode nachgewiesen werden. Zu diesen zählen die Northern-Blot- Analyse, PCR-Amplifikation und der RNase-Schutz. Eine verminderte mRNA-Expression zeigt eine Alteration des Wildtyp-BRCA2-Gens an. Eine Alteration der Wildtyp-BRCA2-Gene kann auch durch Screening auf eine Alteration des Wildtyp-BRCA2-Proteins nachgewiesen werden. Z.B. können mit BRCA2 immunreaktive monoklonale Antikörper zum Screenen eines Gewebes verwendet werden. Das Fehlen eines artverwandten Antigens würde auf eine BRCA2-Mutation hinweisen. Antikörper, die für Produkte mutanter Allele spezifisch sind, könnten ebenfalls zum Nachweis des mutanten BRCA2-Genprodukts verwendet werden. Solche immunologischen Assays können in einem der im Fachgebiet bekannten, in bequemer Weise durchzuführenden Formate vorgenommen werden. Zu diesen zählen Western Blots, immunhistochemische Assays und ELISA-Assays. Jegliche Methode zum Nachweis eines veränderten BRCA2-Proteins kann zum Nachweis einer Alteration der Wildtyp-BRCA2-Gene eingesetzt werden. Funktionelle Assays, wie z.B. Bestimmungen der Proteinbindung, können angewandt werden. Darüber hinaus können Assays eingesetzt werden, die die biochemische Funktion des BRCA2 nachweisen. Das Auffinden eines mutanten BRCA2-Genprodukts weist auf eine Alteration eines Wildtyp-BRCA2-Gens hin.
Mutante BRCA2-Gene oder -Genprodukte können auch in anderen menschlichen Körperproben nachgewiesen werden, wie etwa Serum, Stuhl, Harn und Sputum. Dieselben Methoden, wie oben zum Nachweis mutanter BRCA2-Gene oder Genprodukte in Geweben erörtert, können auf andere Körperproben angewandt werden. Von den Tumoren schilfern Krebszellen ab und zeigen sich in den Körperproben. Außerdem kann das BRCA2-Genprodukt selbst in den extrazellulären Raum sekretiert und in den Körperproben sogar in Abwesenheit der Krebszellen vorgefunden werden. Durch Screenen solcher Körperproben kann in einfacher Weise eine Frühdiagnose für viele Krebsarten erhalten werden. Außerdem lässt sich der Verlauf der Chemotherapie oder Radiotherapie durch Testen solcher Körperproben auf mutante BRCA2-Gene oder -Genprodukte leichter überwachen.
Die Primer-Paare der vorliegenden Erfindung sind zur Bestimmung der Nucleotidsequenz eines bestimmten BRCA2-Allels unter Anwendung der PCR nützlich. Die Paare der einzelsträngigen DNA-Primer können an Sequenzen innerhalb oder in der Umgebung des BRCA2-Gens auf Chromosom 13 annealt werden, um die amplifizierende DNA-Synthese des BRCA2-Gens selbst zu primen. Ein vollständiger Satz dieser Primer erlaubt die Synthese aller Nucleotide der BRCA2-Gen-codierenden Sequenzen, d.h. der Exons. Der Primersatz erlaubt vorzugsweise die Synthese sowohl der Intron- als auch der Exon-Sequenzen. Auch Allel-spezifische Primer können verwendet werden. Solche Primer vereinigen sich lediglich mit bestimmten BRCA2-mutanten Allelen und amplifizieren daher ein Produkt nur in Gegenwart des mutanten Allels als einer Matrize.
Um die anschließende Klonierung der amplifizierten Sequenzen zu erleichtern, können die Primer Sequenzen von Restriktionsenzymstellen aufweisen, die an ihr 5'-Ende angehängt sind. Daher stammen alle Nucleotide der Primer von BRCA2-Sequenzen oder von an BRCA2 angrenzenden Sequenzen ab, mit Ausnahme der wenigen Nucleotide, die zur Bildung einer Restriktionsenzymstelle erforderlich sind. Solche Enzyme und Stellen sind im Fachgebiet wohlbekannt. Die Primer selbst können unter Anwendung im Fachgebiet wohlbekannter Methoden synthetisiert werden. Allgemein können die Primer unter Verwendung von Oligonucleotid-Syntheseapparaturen hergestellt werden, die kommerziell verfügbar sind. Steht die Sequenz des offenen Leserasters von BRCA2, wie in SEQ ID NR. 1 und in 3 gezeigt, zur Verfügung, so liegt das Design bestimmter Primer über die weiter unten beschriebenen hinaus durchaus im Rahmen der Möglichkeiten dieses Fachgebiets.
Nucleinsäure-Sonden können bei der Southern-Hybridisation an genomische DNA und bei der RNase-Schutzmethode zum Nachweis der oben bereits erörterten Punktmutationen verwendet werden. Die Sonden können zum Nachweis von PCR-Amplifikationsprodukten eingesetzt werden. Sie können außerdem zum Nachweis von Fehlpaarungen mit dem BRCA2-Gen oder der mRNA unter Anwendung weiterer Methoden verwendet werden.
Es wurde entdeckt, dass Individuen mit dem Wildtyp-BRCA2-Gen keinen Krebs haben, was die Folge des BRCA2-Allels ist. Allerdings sind Mutationen, die die Funktion des BRCA2-Proteins beeinflussen, bei der Pathogenese von Krebs beteiligt. Daher korreliert das Vorhandensein eines veränderten (oder eines mutierten) BRCA2-Gens, das ein Protein mit einem Funktionsverlust oder einer veränderten Funktion produziert, direkt mit einem erhöhten Krebsrisiko. Um eine BRCA2-Genmutation nachzuweisen, wird eine biologische Probe hergestellt und auf einen Unterschied zwischen der Sequenz des zu analysierenden BRCA2-Allels und der Sequenz des Wildtyp-BRCA2-Allels analysiert. Mutante BRCA2-Allele können zunächst mittels einer der oben beschriebenen Methoden identifiziert werden. Dann werden mutante Allele zur Identifizierung der spezifischen Mutation des bestimmten mutanten Allels sequenziert. Alternativ dazu können mutante BRCA2-Allele zunächst durch Identifizierung mutanter (veränderter) BRCA2-Proteine unter Anwendung herkömmlicher Methoden identifiziert werden. Die mutanten Allele werden dann zur Identifizierung der spezifischen Mutation bei jedem Allel sequenziert. Die Mutationen, besonders jene, die zu einer veränderten Funktion des BRCA2-Proteins führen, finden dann für die diagnostischen und prognostischen Methoden der vorliegenden Erfindung Anwendung.
DEFINITIONEN
In der vorliegenden Offenbarung gelten die folgenden Definitionen:
Zur "Amplifikation der Polynucleotide" werden Methoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR), Ligations-Amplifikation (oder ligase chain reaction – LCR) und Amplifikations-Methoden, die auf der Verwendung von Q-beta-Replikase basieren, eingesetzt. Diese Methoden sind wohlbekannt und werden im Fachgebiet breit praktiziert. Siehe z.B. US-Patentschriften Nrn. 4.683.195 und 4.683.202 und Innis et al., 1990 (für PCR); und Wu et al., 1989a (für LCR). Die Reagenzien und die Hardware zur Durchführung der PCR stehen kommerziell zur Verfügung. Die zur Amplifikation der Sequenzen aus der BRCA2-Region nützlichen Primer sind vorzugsweise komplementär zu, und hybridisieren spezifisch mit Sequenzen in der BRCA2-Region oder in Regionen, die eine darin gelegene Ziel-Region flankieren. Die durch Amplifikation generierten BRCA2-Sequenzen können direkt sequenziert werden. Alternativ dazu, doch weniger erwünscht, kann/können die amplifzierte/n Sequenz(en) vor der Sequenzanalyse kloniert werden. Ein Verfahren für das direkte Klonieren und die Sequenzanalyse enzymatisch amplifizierter Genomsegmente wurde beschrieben von Scharf, 1986.
"Analyt-Polynucleotid" und "Analyt-Strang" beziehen sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polynucleotid, bei dem der Gehalt einer Zielsequenz vermutet wird und welches in einer Vielzahl von Probenarten, einschließlich biologischer Proben, vorhanden sein kann.
"Antikörper". Der Begriff "Antikörper" wird sowohl zur Bezeichnung einer homogenen molekularen Entität als auch eines Gemischs, wie etwa einem Serumprodukt, bestehend aus einer Vielzahl verschiedener molekularer Entitäten, verwendet. BRCA2-Polypeptide können in einem Peptid-Synthesegerät synthetisch hergestellt und an ein Träger-Molekül (z.B. Napfschnecken-Hämocyanin) gekoppelt und über mehrere Monate hinweg Kaninchen injiziert werden. Die Kaninchen-Seren werden auf ihre Immunreaktivität mit dem BRCA2-Polypeptid oder Fragment getestet. Monoklonale Antikörper können durch Injizieren von Mäusen mit den Protein-Polypeptiden, Fusionsproteinen oder Fragmenten davon hergestellt werden. Monoklonale Antikörper werden mittels ELISA gescreent und auf ihre spezifische Immunreaktivität mit BRCA2-Polypeptid oder Fragmenten davon getestet. Siehe Harlow & Lane, 1988. Diese Antikörper sind sowohl in Assays als auch pharmazeutischen Stoffen nützlich.
Wurde einmal eine ausreichende Menge an erwünschtem Polypeptid erhalten, so kann dieses für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Eine typische Anwendung besteht in der Erzeugung von Bindungs-spezifischen Antikörpern. Diese Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und können mittels in vitro- oder in vivo-Methoden erzeugt werden, wie im Fachgebiet wohlbekannt. Zur Herstellung polyklonaler Antikörper wird ein geeignetes Ziel-Immunsystem, typischerweise das einer Maus oder eines Kaninchens, ausgewählt. Im Wesentlichen gereinigtes Antigen wird dem Immunsystem in einer Weise dargeboten, die durch für das Tier geeignete Methoden und durch andere den Immunologen wohlbekannte Parameter bestimmt wird. Typische Injektionsstellen sind in Fußsohlen, intramuskulär, intraperitonial oder intradermal. Natürlich können auch andere Spezies anstelle von Mäusen oder Kaninchen verwendet werden. Die polyklonalen Antikörper werden dann mittels im Fachgebiet bekannter und auf die gewünschte Spezifität eingestellter Methoden ausgereinigt.
Eine immunologische Reaktion wird gewöhnlich mit einem Immunoassay untersucht. Normalerweise umfassen solche Immunoassays ein gewisses Maß an Reinigung einer Antigen-Quelle, z.B. einer von denselben Zellen und in derselben Weise wie das Antigen produzierten Quelle. Eine Vielzahl von Immunoassay-Methoden ist im Fachgebiet wohlbekannt. Siehe z.B. Harlow & Lane, 1988, oder Goding, 1986.
Monoklonale Antikörper mit Affinitäten von 10^–8 M^–1 oder bevorzugt 10^–9 bis 10^–10 M^–1 oder stärker werden typischerweise mittels standardmäßiger Verfahren hergestellt, wie z.B. beschrieben bei Harlow & Lane, 1988, oder Goding, 1986. Kurz gesagt werden geeignete Tiere ausgewählt und das gewünschte Immunisierungs-Protokoll befolgt. Nach einem geeigneten Zeitraum werden die Milzen dieser Tiere ausgeschnitten und einzelne Milzzellen typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Auswahlbedingungen verschmolzen. Daraufhin werden die Zellen klonal separiert und die Überstände jedes auf seine Erzeugung eines geeigneten und für die gewünschte Region des Antigens spezifischen Antikörpers getestet.
Zu weiteren geeigneten Methoden zählen das Aussetzen in vitro von Lymphozyten den antigenen Polypeptiden oder alternativ einer Auswahl von Banken der Antikörper in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., 1989. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch entweder kovalentes oder nicht-kovalentes Binden einer Substanz, die ein nachweisbares Signal bereitstellt, markiert. Eine breite Vielfalt von Markern und Konjugations-Methoden ist bekannt und wird umfangreich sowohl in der wissenschaftlichen als auch der Patentliteratur berichtet. Zu geeigneten Markern zählen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Agenzien, chemilumineszierende Agenzien, magnetische Teilchen und ähnliches. Zu Patentschriften, die die Verwendung solcher Marker lehren, zählen US-Patentschriften Nr. 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 und 4.366.241. Auch können rekombinante Immunglobuline erzeugt werden (siehe US-Patentschrift Nr. 4.816.567).
"Bindungspartner" bezieht sich auf ein Molekül, das zur Bindung eines Ligand-Moleküls mit hoher Spezifität fähig ist, wie z.B. ein Antigen und einen Antigenspezifischen Antikörper oder ein Enzym und seinen Inhibitor. Generell müssen die spezifischen Bindungspartner bei ausreichender Affinität binden, um den Analyt-Kopie/komplementären Strang-Duplex (im Falle der Polynucleotid-Hybridisierung) unter den Isolationsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z.B. Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor-Ligand-Paare und komplementäre Polynucleotidstränge. Im Falle der komplementären Polynucleotid-Bindungspartner sind die Partner normalerweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens 40 Basen lang sein. Die Polynucleotide können sich aus DNA, RNA oder synthetischen Nucleotid-Analoga zusammensetzen.
"Biologische Probe" bezieht sich auf eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, bei der ein Gehalt an Analyt-Polynucleotid oder -Polypeptid von einem Individuum vermutet wird, einschließlich, doch nicht beschränkt auf z.B. Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, die äußeren Abschnitte der Haut, die Atemwege, die Darm- und Urogenitaltrakte, Tränen, Speichel, Blutzellen, Tumoren, Organe, Gewebe und Proben von in vitro-Zellkulturbestandteilen.
Wie hierin verwendet, werden die Begriffe "Diagnostizieren" oder "Prognostizieren", wie im Zusammenhang mit Neoplasie verwendet, zur Angabe 1) der Klassifikation von Läsionen als Neoplasie, 2) der Bestimmung des Schweregrades der Neoplasie oder 3) der Überwachung des Krankheitsverlaufs vor, während und nach der Behandlung verwendet.
"Codieren". Ein Polynucleotid wird als für ein Polypeptid "codierend" bezeichnet, wenn es in seinem nativen Zustand oder einem mittels im Fachgebiet wohlbekannten Methoden manipulierten Zustand transkribiert und/oder translatiert werden kann, um die mRNA für das Polypeptid oder ein Fragment davon zu produzieren. Der Antisense-Strang stellt das Komplement solch einer Nucleinsäure dar, und die codierende Sequenz kann davon abgeleitet werden.
"Isoliert" oder "im wesentlichen rein". Eine "isolierte" oder "im wesentlichen reine" Nucleinsäure (z.B. eine RNA, DNA oder ein Mischpolymer) ist eine solche, die im wesentlichen von anderen zellulären Komponenten befreit ist, die natürlicherweise eine native Humansequenz oder ein Protein, wie z.B. Ribosomen, Polymerasen, viele andere humane Genomsequenzen und Proteine, begleiten. Der Begriff umfasst eine Nucleinsäuresequenz oder ein Protein, das aus seiner natürlich vorhandenen Umgebung entfernt wurde und umfasst rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder mittels heterologer Systeme biologisch synthetisierte Analoga.
"BRCA2-Allel" bezieht sich auf normale Allele des BRCA2-Locus als auch auf Allele, die Varianten tragen, welche den Menschen zur Entwicklung von Krebs an vielen Stellen, einschließlich z.B. Brust-, Eierstock- und Magenkrebs, prädisponieren. Solche prädisponierenden Allele werden auch als "BRCA2-Anfälligkeits-Allele" bezeichnet.
Die Begriffe "BRCA2-Locus", "BRCA2-Gen, "BRCA2-Nucleinsäuren" oder "BRCA2-Polynucleotid" beziehen sich jeweils auf Polynucleotide, die sich alle in der BRCA2-Region befinden und die wahrscheinlich in gesundem Gewebe exprimiert werden, wobei bestimmte Allele davon ein Individuum zur Entwicklung von Brust-, Eierstock- und Magenkrebs prädisponieren. Mutationen des BRCA2-Locus können an der Auslösung und/oder dem Fortschreiten weiterer Tumorarten beteiligt sein. Der Locus ist zum Teil durch Mutationen angegeben, die Individuen zur Entwicklung von Krebs prädisponieren. Diese Mutationen fallen innerhalb die infra beschriebene BRCA2-Region. Der BRCA2-Locus soll codierende Sequenzen, intervenierende Sequenzen und regulatorische Elemente, die die Transkription und/oder Translation kontrollieren, einschließen. Der BRCA2-Locus soll alle allelen Varianten der DNA- Sequenz umfassen.
Diese Begriffe, wenn auf eine Nucleinsäure angewandt, beziehen sich auf eine Nucleinsäure, die für ein BRCA2-Polypeptid, Fragment, Homologon oder eine Variante codiert, einschließlich z.B. von Protein-Fusionen oder -Deletionen. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Offenbarung besitzen eine Sequenz, die entweder abgeleitet ist von oder im wesentlichen ähnlich ist zu einem natürlichen BRCA2-codierenden Gen oder einem solchen, das wesentliche Homologie zu einem natürlichen BRCA2-codierenden Gen oder einem Abschnitt davon aufweist. Die codierende Sequenz für ein BRCA2-Polypeptid ist in SEQ ID NR. 1 gezeigt, die Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 2.
Die Polynucleotid-Zusammensetzungen dieser Offenbarung umfassen RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge, und können chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder können nicht-natürliche oder derivatisierte Nucleotidbasen enthalten, wie für Fachleute des Gebiets leicht zu erkennen sein wird. Zu solchen Modifikationen zählen z.B. Markierungen, Methylierung, Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nucleotide durch ein Analogon, InterNucleotid-Modifikationen, wie etwa ungeladene Bindungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate etc.), geladene Bindungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate etc.), überhängende Komponenten (z.B. Polypeptide), Interkalatoren (z.B. Acridin, Psoralen etc.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Kopplungen (z.B. Alpha-anomere Nucleinsäuren etc.). Ebenfalls enthalten sind synthetische Moleküle, die Polynucleotide in ihrer Bindungsfähigkeit an eine bestimmte Sequenz über eine Wasserstoffbindung oder andere chemische Wechselwirkungen nachahmen. Solche Moleküle sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z.B. jene, bei denen Peptid-Kopplungen die Phosphat-Kopplungen im Rückgrat des Moleküls ersetzen.
Die vorliegende Offenbarung stellt rekombinante Nucleinsäuren bereit, die die gesamte oder einen Teil der BRCA2-Region umfassen. Das rekombinante Konstrukt kann zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig sein. Alternativ kann das rekombinante Konstrukt in die chromosomale DNA der Wirtszelle integrierbar sein. Solch ein rekombinantes Polynucleotid umfasst ein Polynucleotid von genomischem, cDNA-, halbsynthetischem oder synthetischem Ursprung, das Kraft seines Ursprungs oder der Manipulation 1) nicht an das gesamte oder einen Abschnitt eines Polynucleotids geknüpft ist, an das es von Natur aus geknüpft ist; 2) an ein anderes Polynucleotid geknüpft ist als das, an das es von Natur aus geknüpft ist; oder 3) nicht von Natur aus vorkommt.
Daher werden durch diese Offenbarung rekombinante Nucleinsäuren bereitgestellt, die Sequenzen umfassen, die ansonsten nicht natürlich vorkommen. Obschon die Wildtyp-Sequenz verwendet werden kann, wird diese oftmals verändert, z.B. durch Deletion, Substitution oder Insertion.
cDNA oder genomische Banken verschiedener Arten können als natürliche Quellen der Nucleinsäuren der vorliegenden Offenbarung gescreent werden, oder es können diese Nucleinsäuren durch Amplifikation der in genomischer DNA oder anderen natürlichen Quellen residenten Sequenzen bereitgestellt werden, wie z.B. mittels PCR. Die Wahl der cDNA-Banken entspricht normalerweise einer Gewebequelle, die in mRNA für die gewünschten Proteine reichlich vorhanden ist. Phagen-Banken sind normalerweise bevorzugt, doch können auch andere Arten von Banken verwendet werden. Die Klone einer Bank werden auf Platten ausgestrichen, auf ein Substrat für das Screening übertragen, denaturiert und auf das Vorhandensein der gewünschten Sequenzen hin sondiert.
Die bei dieser Offenbarung verwendeten DNA-Sequenzen umfassen gewöhnlich mindestens etwa fünf Codons (15 Nucleotide), gewöhnlicher mindestens etwa 7 bis 15 Codons, und am bevorzugtesten mindestens etwa 35 Codons. Ein oder mehrere Introns können ebenfalls vorhanden sein. Diese Anzahl von Nucleotiden macht gewöhnlich etwa die minimale Länge aus, die für eine erfolgreiche Sonde erforderlich ist, die spezifisch mit einer BRCA2-codierenden Sequenz hybridisieren würde.
Methoden für die Nucleinsäure-Manipulation sind allgemein beschrieben z.B. bei Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Die zur Anwendung dieser Methoden nützlichen Reagenzien, wie etwa Restriktionsenzyme und ähnliches, sind im Fachgebiet breit bekannt und im Handel beziehbar von Vertreibern wie New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U.S. Biochemicals, New England Nuclear und einer Reihe weiterer Quellen. Viele natürliche Gensequenzen sind aus verschiedener cDNA oder von Genombanken unter Anwendung geeigneter Sonden gewinnbar. Siehe GenBank, National Institutes of Health.
"BRCA2-Region" bezieht sich auf einen Abschnitt des Humanchromosoms 13, der von den Markern tdj3820 und YS-G-B10T umgrenzt ist. Diese Region enthält den BRCA2-Locus, einschließlich des BRCA2-Gens.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe "BRCA2-Locus", "BRCA2-Allel" und "BRCA2-Region" alle auf doppelsträngige DNA, umfassend den Locus, das Allel oder die Region, als auch jede der einzelsträngigen DNAs, die den Locus, das Allel oder die Region ausmachen.
Wie hierin verwendet, ist ein "Abschnitt" des BRCA2-Locus oder der Region oder des Allels so definiert, dass er eine minimale Größe von mindestens etwa acht Nucleotiden, oder bevorzugt etwa 15 Nucleotiden, oder noch bevorzugter mindestens etwa 25 Nucleotiden, und eine minimale Größe von mindestens etwa 40 Nucleotiden aufweist.
"BRCA2-Protein" oder "BRCA2-Polypeptid" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das durch den BRCA2-Locus, die Varianten oder Fragmente davon codiert ist. Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren und sein Äquivalent und bezieht sich nicht auf die spezifische Länge des Produkts; daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in die Definition eines Polypeptids miteinbezogen. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Modifikationen des Polypeptids oder schließt diese aus, z.B. Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosporylierungen und ähnliches. In die Definition miteinbezogen sind z.B. Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure enthalten (einschließlich z.B. nicht-natürliche Aminosäuren etc.), Polypeptide mit substituierten Kopplungen, als auch andere im Fachgebiet bekannte Modifikationen, die sowohl natürlich als auch nicht-natürlich auftreten. Gewöhnlich sind solche Polypeptide zu mindestens etwa 50% homolog zur nativen BRCA2-Sequenz, vorzugsweise zu mehr als etwa 90% und noch bevorzugter zu mindestens etwa 95% homolog. Auch sind Proteine mitein-bezogen, die durch eine DNA codiert sind, die unter hoch- oder gering stringenten Bedingungen an BRCA2-codierende Nucleinsäuren und eng verwandte, durch Antiseren zu BRCA2-Protein(en) rückgeholte Polypeptide oder Proteine hybridisiert sind.
Die Länge der auf ihre Homologie verglichenen Polypeptid-Sequenzen beträgt allgemein mindestens etwa 16 Aminosäuren, gewöhnlich mindestens etwa 20 Reste, noch gewöhnlicher mindestens etwa 24 Reste, typischerweise mindestens etwa 28 Reste und bevorzugt mehr als etwa 35 Reste.
"Funktionsfähig gekoppelt" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, wobei die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen eine Funktion in ihrer vorgesehenen Weise erlaubt. Z.B. ist ein Promotor funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz gekoppelt, wenn der Promotor ihre Transkription oder Expression beeinflusst.
"Sonden". Polynucleotid-Polymorphismen, die mit BRCA2-Allelen assoziiert sind, welche für bestimmte Krebsarten prädisponieren oder mit den meisten Krebsarten verknüpft sind, werden durch Hybridisierung mit einer Polynucleotid-Sonde nachgewiesen, die einen stabilen Hybrid mit der Zielsequenz unter stringenten bis mäßig stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen bilden. Wird erwartet, dass die Sonden perfekt komplementär zur Zielsequenz sind, so werden stringente Bedingungen angelegt. Die Hybridisierungs-Stringenz kann vermindert werden, wenn ein gewisses Maß an Fehlpaarung erwartet wird, z.B. wenn Varianten erwartet werden, mit dem Ergebnis, dass die Sonde nicht vollständig komplementär sein wird. Es werden Bedingungen gewählt, die nicht-spezifische/zufällige Bindungen ausschalten, d.h. das Geräusch minimieren. Da solche Indikationen sowohl neutrale DNA-Polymorphismen als auch Mutationen identifizieren, erfordern diese Indikationen eine weitere Analyse, um den Nachweis eines BRCA2-Anfälligkeits-Allels zu erbringen.
Die Sonden für BRCA2-Allele können aus den Sequenzen der BRCA2-Region oder ihren cDNAs abgeleitet werden. Die Sonden können von jeglicher geeigneten Länge sein, die die gesamte oder einen Abschnitt der BRCA2-Region umspannt und die eine spezifische Hybridisierung an die BRCA2-Region ermöglicht. Enthält die Zielsequenz eine Sequenz, die identisch zur Sonde ist, so können die Sonden kurz, nämlich z.B. im Gebiet von etwa 8 bis 30 Basenpaare lang sein, da der Hybrid selbst unter stringenten Bedingungen relativ stabil ist. Wird ein gewisser Grad an Fehlpaarungen bei der Sonde erwartet, d.h. wird vermutet, dass die Sonde an eine Varianten-Region hybridisiert, so kann eine längere Sonde verwendet werden, die an die Zielsequenz mit der erforderlichen Spezifität hybridisiert.
Die Sonden umfassen ein isoliertes Polynucleotid, das an einen Marker oder ein Reporter-Molekül gebunden ist und zur Isolierung anderer Polynucleotid-Sequenzen mit Sequenz-Ähnlichkeit mittels standardmäßiger Methoden verwendet werden kann. Zu Methoden zur Herstellung und Markierung von Sonden siehe z.B. Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Weitere ähnliche Polynucleotide können unter Verwendung homologer Polynucleotide ausgewählt werden. Alternativ können Polynucleotide, die für diese oder ähnliche Polypeptide codieren, synthetisiert oder unter Ausnutzung der Redundanz im genetischen Code ausgewählt werden. Verschiedene Codon-Substitutionen können eingeführt werden, z.B. durch stille Alterationen (wobei verschiedene Restriktionsstellen erzeugt werden) oder zur Optimierung der Expression für ein bestimmtes System. Mutationen können zur Modifikation der Eigenschaften des Polypeptids, eventuell zur Veränderung der Ligand-bindenden Affinitäten, Interketten-Affinitäten oder des Polypeptid-Abbaus oder der Umsatzrate eingeführt werden.
Sonden, die synthetische Oligonucleotide oder andere Polynucleotide der vorliegenden Offenbarung umfassen, können von natürlich vorkommenden oder rekombinanten einzel- oder doppelsträngigen Polynucleotiden abgeleitet oder chemisch synthetisiert sein. Die Sonden können auch durch Nick-Translation, Klenow-Einbaureaktion oder andere im Fachgebiet bekannte Methoden markiert werden.
Abschnitte der Polynucleotid-Sequenz mit mindestens etwa acht Nucleotiden, gewöhnlich mindestens etwa 15 Nucleotiden, und weniger als etwa 6 kb, gewöhnlich weniger als etwa 1,0 kb, aus einer für BRCA2 codierenden Polynucleotid-Sequenz, sind als Sonden bevorzugt. Die Sonden können auch zur Bestimmung dessen verwendet werden, ob für BRCA2 codierende mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist.
Bei "reicombinanter Nucleinsäure" handelt es sich um eine Nucleinsäure, die nicht natürlich vorkommt, oder die durch die künstliche Kombination zweier ansonsten getrennter Segmente einer Sequenz erhalten wird. Diese künstliche Kombination wird oftmals entweder durch chemische Synthesemethoden oder durch die künstliche Manipulation isolierter Segmente von Nucleinsäuren, z.B. durch gentechnische Methoden, erreicht. Dies wird gewöhnlich zur Ersetzung eines Codons durch ein redundantes Codon vorgenommen, das für dieselbe oder eine konservative Aminosäure codiert, wobei typischerweise eine Sequenz-Erkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird dies zur Kopplung von Nucleinsäure-Segmenten mit gewünschten Funktionen zum Erhalt einer gewünschten Kombination von Funktionen vorgenommen.
"Regulatorische Sequenzen" bezieht sich auf jene Sequenzen, die normalerweise innerhalb von 100 kb der codierenden Region eines Locus liegen, doch auch entfernter von der codierenden Region sein können, und welche die Exprimierung des Gens (einschließlich der Transkription des Gens, und Translation, Spleißen, Stabilität oder ähnliches der Messenger-RNA) beeinflussen.
"Wesentliche Homologie oder Ähnlichkeit". Eine Nucleinsäure oder ein Fragment davon ist "im wesentlichen homolog" (oder "im wesentlichen ähnlich") zu einem anderen, wenn, sofern mit der anderen Nucleinsäure (oder ihrem komplementären Strang) optimal angeordnet (mit geeigneten Nucleotid-Insertionen oder -Deletionen), eine Nucleotid-Sequenzidentität bei mindestens etwa 60% der Nucleotidbasen, gewöhnlich mindestens etwa 70%, noch gewöhnlicher mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90%, und noch bevorzugter mindestens etwa 95 bis 98% der Nucleotidbasen vorliegt.
Alternativ dazu liegt eine wesentliche Homologie (oder Ähnlichkeit) dann vor, wenn eine Nucleinsäure oder ein Fragment davon an eine andere Nucleinsäure (oder einen komplementären Strang davon) unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an den Strang oder sein Komplement hybridisiert. Eine Selektivität der Hybridisierung liegt vor, wenn die Hybridisierung, die wesentlich selektiver als das völlige Fehlen von Spezifität ist, eintritt. Typischerweise tritt eine selektive Hybridisierung ein, wenn eine Homologie von mindestens etwa 55% über eine Strecke von mindestens etwa 14 Nucleotiden vorliegt, bevorzugt mindestens etwa 65%, noch bevorzugter mindestens etwa 75%, und am bevorzugtesten von mindestens etwa 90%. Siehe Kanehisa, 1984. Die Länge des beschriebenen Homologie-Vergleichs kann längere Strecken betragen; bei bestimmten Ausführungsformen beträgt sie oftmals eine Strecke von mindestens etwa neun Nucleotiden, gewöhnlich mindestens etwa 20 Nucleotiden, gewöhnlicher mindestens etwa 24 Nucleotiden, typischerweise mindestens etwa 28 Nucleotiden, noch typischer mindestens etwa 32 Nucleotiden und bevorzugt mindestens etwa 36 oder mehr Nucleotiden.
Die Nucleinsäure-Hybridisation wird durch Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel, über die Basenzusammensetzung, Länge der komplementären Stränge und die Anzahl der Nucleotidbasen-Fehlpaarungen zwischen den hybridisierenden Nucleinsäuren hinaus beeinflusst, wie für Fachleute des Gebiets ohne weiteres erkennbar sein wird. Stringente Temperaturbedingungen umfassen allgemein Temperaturen von über 30°C, typischerweise über 37°C, und bevorzugt über 45°C. Stringente Salzbedingungen betragen gewöhnlich weniger als 100 mM, typischerweise weniger als 500 mM und bevorzugt weniger als 200 mM. Allerdings ist die Kombination von Parametern viel wichtiger als das Maß eines einzelnen Parameters. Siehe z.B. Wetmur & Davidson, 1968.
Auch Sonden-Sequenzen können unter bestimmten Bedingungen spezifisch an Duplex-DNA hybridisieren, um Triplex-DNA oder andere DNA-Komplexe einer höheren Ordnung zu bilden. Die Herstellung solcher Sonden und geeignete Hybridisationsbedingungen sind im Fachgebiet wohlbekannt.
Die Begriffe "wesentliche Homologie" oder "wesentliche Identität" geben, wenn auf Polypeptide bezogen, an, dass das in Frage stehende Polypeptid oder Protein zu mindestens etwa 30% mit einem vollständigen, natürlich vorkommenden Protein oder einem Abschnitt davon, gewöhnlich zu mindestens etwa 70% und bevorzugt zu mindestens etwa 95% identisch ist.
Eine "im wesentlichen ähnliche Funktion" bezieht sich auf die Funktion einer modifizierten Nucleinsäure oder eines modifizierten Proteins bezüglich der Wildtyp-BRCA2-Nucleinsäure oder des Wildtyp-BRCA2-Polypeptids. Das modifizierte Polypeptid ist im wesentlichen homolog zum Wildtyp-BRCA2-Polypeptid und weist im wesentlichen dieselbe Funktion auf. Das modifizierte Polypeptid kann eine veränderte Aminosäure-Sequenz aufweisen und/oder kann modifizierte Aminosäuren enthalten. Über die Ähnlichkeit der Funktion hinaus kann das modifizierte Polypeptid weitere nützliche Eigenschaften wie eine längere Halbwertszeit aufweisen. Die Ähnlichkeit der Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids kann im Wesentlichen dieselbe wie die Aktivität des Wildtyp-BRCA2-Polypeptids sein. Alternativ dazu kann die Ähnlichkeit der Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids höher als die Aktivität des Wildtyp-BRCA2-Polypeptids sein. Das modifizierte Polypeptid wird unter Anwendung herkömmlicher Methoden synthetisiert, oder wird durch eine modifizierte Nucleinsäure codiert und unter Anwendung herkömmlicher Methoden erzeugt. Die modifizierte Nucleinsäure wird mittels herkömmlicher Methoden hergestellt. Eine Nucleinsäure mit einer im wesentlichen ähnlichen Funktion zur Wildtyp-BRCA2-Genfunktion erzeugt das oben beschriebene modifizierte Protein.
Die Homologie für Polypeptide wird gewöhnlich unter Verwendung von Sequenzanalyse-Software gemessen. Siehe z.B. das Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Die Proteinanalyse-Software vergleicht ähnliche Sequenzen unter Anlegung eines Maßes der Homologie, das verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen zugeordnet wird. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Bei einem Polypeptid-"Fragment", -"Abschnitt" oder -"Segment" handelt es sich um eine Strecke von Aminsäure-Resten von mindestens etwa fünf bis sieben benachbarten Aminosäuren, oftmals von mindestens etwa sieben bis neun benachbarten Aminosäuren, typischerweise mindestens etwa neun bis 13 benachbarten Aminosäuren, und am bevorzugtesten mindestens etwa 20 bis 30 oder mehr benachbarten Aminosäuren.
"Zielregion" bezieht sich auf eine Region der Nucleinsäure, die amplifiziert und/oder nachgewiesen wird. Der Begriff "Zielsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer unter erwünschten Bedingungen einen stabilen Hybrid bilden wird.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wendet, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Methoden der Chemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination, Genetik und Immunologie an. Siehe z.B. Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie & Fink, 1991. Eine allgemeine Erörterung der Methoden und Materialien für die Humangen-Kartierung, einschließlich der Kartierung des Humanchromosoms 13, ist zu finden z.B. bei White and Lalouel, 1988.
Herstellung rekombinanter oder chemisch synthetisierter Nucleinsäuren; Vektoren, Transformation, Wirtszellen
Große Mengen der Polynucleotide der vorliegenden Offenbarung können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt werden. Natürliche oder synthetische Polynucleotid-Fragmente, die für ein gewünschtes Fragment codieren, werden in rekombinante Polynucleotid-Konstrukte, gewöhnlich DNA-Konstrukte, die zur Einführung und Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle fähig sind, eingebaut. Gewöhnlich eignen sich die Polynucleotid-Konstrukte zur Replikation in einem einzelligen Wirt, wie etwa Hefe oder Bakterien, doch können auch zur Einführung (mit oder ohne Integration in das Genom) in kultivierte Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryontische Zelllinien vorgesehen sein. Die Reinigung der mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugten Nucleinsäuren ist beschrieben z.B. bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992.
Die Polynucleotide der vorliegenden Offenbarung können auch mittels chemischer Synthese hergestellt werden, z.B. durch die Phosporamidit-Methode, wie beschrieben bei Beaucage & Carruthers, 1981, oder die Triester-Methode nach Matteucci und Caruthers, 1981, und kann auf handelsüblichen automatisierten Oligonucleotid-Synthesegeräten durchgeführt werden. Ein doppelsträngiges Fragment kann aus dem einzelsträngigen Produkt der chemischen Synthese entweder durch Synthetisieren des komplementären Strangs und Vereinigen der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Zugabe des komplementären Strangs unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primer-Sequenz erhalten werden.
Die zur Einführung in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt präparierten Polynucleotid-Konstrukte können ein durch den Wirt erkanntes Replikationssystem umfassen, einschließlich des angestrebten, für das gewünschte Polypeptid codierenden Polynucleotid-Fragments, welches vorzugsweise auch regulatorische Sequenzen für den Transkriptions- und Translationsstart enthält, die funktionsfähig an das Polypeptid-codierende Segment geknüpft sind. Expressionsvektoren können z.B. einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) und Expressions-Kontrollsequenzen, einen Promotor, einen Enhancer und die erforderlichen Processing-Informationsstellen, wie z.B. Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, Transkriptions-Beendigungssequenzen und mRNA-stabilisierende Sequenzen umfassen. Auch Sekretions-Signale können, wo geeignet, enthalten sein, und zwar sowohl von einem nativen BRCA2-Protein als auch von anderen Rezeptoren oder von sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies, die es dem Protein ermöglichen, Zellmembranen zu durchqueren und/oder darin deponiert zu werden, und so seine funktionelle Topologie zu erreichen, oder aber um aus der Zelle ausgeschieden zu werden. Solche Vektoren können mittels standardmäßiger rekombinanter Methoden hergestellt werden, wie im Fachgebiet wohlbekannt und erörtert z.B. bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992.
Ein geeigneter Promotor und weitere erforderliche Vektor-Sequenzen werden so ausgewählt, dass sie im Wirt funktionell sind, und können, wenn geeignet, solche umfassen, die natürlicherweise mit BRCA2-Genen verbunden sind. Beispiele zweckdienlicher Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind beschrieben bei Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992; siehe auch z.B. Metzger et al., 1988. Im Fachgebiet sind viele nützliche Vektoren bekannt und im Handel beziehbar, z.B. von Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech und anderen. Promotoren, wie die trp-, lac- und Phagen-Promotoren, tRNA-Promotoren und glycolytischen Enzym-Promotoren können bei prokaryontischen Wirten verwendet werden. Zu nützlichen Hefe-Promotoren zählen Promotor-Regionen für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase oder andere glycolytische Enzyme, wie z.B. Enolase oder Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, für die Verwertung von Maltose und Galactose verantwortliche Enzyme und weitere. Zur Verwendung in der Hefe-Expression geeignete Vektoren und Promotoren sind weiterhin beschrieben bei Hitzemann et al., EP-Schrift Nr. 73.675 A. Geeignete nicht-native Säuger-Promotoren können die frühen und späten Promotoren von SV40 (Fiers et al., 1978) oder Promotoren, die vom murinen Moloney-Leukämievirus, Mäusetumorvirus, Vogelsarkomviren, Adenovirus II, Rinder-Papillomavirus oder Polyomavirus hergeleitet sind, umfassen. Außerdem kann das Konstrukt an ein amplifizierbares Gen (z.B. DHFR) gebunden werden, so dass multiple Kopien des Gens herstellbar sind. Für geeignete Enhancer und andere Expressions-Kontrollsequenzen siehe auch Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).
Solche Expressionsvektoren können sich zwar autonom replizieren, können aber auch durch Einführung in das Genom der Wirtszelle mittels im Fachgebiet wohlbekannter Methoden repliziert werden.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten geeigneterweise einen selektierbaren Marker, d.h. ein für ein Protein codierendes Gen, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Das Vorhandensein dieses Gens stellt das Wachstum lediglich jener Wirtszellen sicher, die die Inserte exprimieren. Typische Selektionsgene codieren für Proteine, die a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen toxischen Substanzen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat etc. verleihen; b) auxotrophe Defizite ergänzen oder c) entscheidende Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien, z.B. das für D-Alanin-Racemase von Bacilli codierende Gen nicht verfügbar sind. Die Wahl des geeigneten selektierbaren Markers hängt von der Wirtszelle ab, wobei geeignete Marker für verschiedene Wirte im Fachgebiet wohlbekannt sind.
Die die Nucleinsäuren von Interesse enthaltenden Vektoren können in vitro transkribiert und die resultierende RNA in die Wirtszelle mittels wohlbekannter Methoden eingeführt werden, z.B. durch Injektion (siehe Kubo et al., 1988); alternativ können die Vektoren direkt in die Wirtszellen mittels im Fachgebiet wohlbekannter Methoden in Abhängigkeit von der Art des zellulären Wirts, einschließlich der Elektroporation; der Transfektion unter Verwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calcium-phosphat, DEAE-Dextran oder anderen Substanzen; dem Mikroprojektil-Beschuss; der Lipofektion; der Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Agens ist, wie etwa ein retrovirales Genom), und weiteren Methoden eingebracht werden. Siehe allgemein Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1992. Die Einführung der Polynucleotide in die Wirtszelle mittels einer im Fachgebiet bekannten Methode, einschließlich unter anderem der oben beschriebenen, wird hierin als „Transformation" bezeichnet. Bei den Zellen, in die die oben beschriebenen Nucleinsäuren eingeführt wurden, soll auch die Nachkommenschaft dieser Zellen umfasst sein.
Große Mengen der Nucleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Offenbarung sind präparierbar, indem die BRCA2-Nucleinsäure oder Abschnitte davon in Vektoren oder anderen Expressions-Vehikeln in kompatiblen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Bei den am häufigsten verwendeten prokaryontischen Wirten handelt es sich um Stämme von Escherichia coli, obschon auch andere Prokaryonten wie Bacillus subtilis oder Pseudomonas verwendet werden können.
Die Klone werden unter Verwendung von Markern ausgewählt, die von der Art der Vektorkonstruktion abhängen. Die Marker können auf demselben oder einem unterschiedlichen DNA-Molekül, vorzugsweise aber auf demselben DNA-Molekül vorhanden sein. Bei prokaryontischen Wirten kann der Transformant z.B. anhand von Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder anderen Antibiotika, ausgewählt werden. Die Herstellung eines bestimmten Produkts auf der Grundlage der Temperaturempfindlichkeit kann ebenfalls als ein geeigneter Marker dienen.
Mit den Polynucleotiden der vorliegenden Offenbarung transformierte prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind nicht nur zur Herstellung der Nucleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Offenbarung nützlich, sondern auch z.B. zur Untersuchung der Eigenschaften der BRCA2-Polypeptide.
Die Sonden und Primer, die auf den hierin beschriebenen BRCA2-Gensequenzen basieren, werden zur Identifizierung homologer BRCA2-Gensequenzen und -Proteine in anderen Spezies verwendet. Diese BRCA2-Gensequenzen und -Proteine können bei diagnostischen/prognostischen, therapeutischen und Wirkstoff-Screening-Methoden verwendet werden.
Analyse eines vermutlich mutierenden BRCA2-Allels
Um die Abweichung der Nucleotidsequenz eines mit einer Prädisposition für Brustkrebs einhergehenden, vermutlich mutierenden BRCA2-Allels von einer die Nucleotide 229-10482 von SEQ. ID. Nr. 1 gemäß der vorliegenden Offenbarung enthaltenden bekannten, nicht-mutierenden BRCA2-codierenden Nucleotidsequenz vom Wildtyp zu bestimmen, wird eine biologische Probe wie Blut, die das vermutlich mutierende BRCA2-Allel enthält vorbereitet.
Am Anfang steht bei der Screening-Methode die Amplifikation der relevanten BRCA2-Sequenzen. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Screening-Methode eine nicht auf der PCR basierende Strategie. Derartige Screening-Methoden wenden eine zweistufige Markierungs-Amplifikations-Methode an, die im Fachgebiet wohlbekannt ist. Sowohl auf PCR als auch nicht auf PCR basierende Screening-Strategien sind in der Lage, Zielsequenzen bei einem hohen Grad der Empfindlichkeit nachzuweisen.
Die verbreitetste der heutzutage angewandten Methoden ist die Ziel-Amplifikation. Hierbei wird die Ziel-Nucleinsäure-Sequenz mit Polymerasen amplifiziert. Eine besonders bevorzugte Methode unter Verwendung der Polymerase-angetriebenen Amplifikation ist die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR). Die Polymerase-Kettenreaktion und andere Polymerase-angetriebene Amplifikations-Assays können eine über eine millionfache Vermehrung der Kopienzahl durch Ausnutzung der Polymerase-angeregten Amplifikations-Zyklen erreichen. Einmal amplifiziert, kann die resultierende Nucleinsäure sequenziert oder als ein Substrat für DNA-Sonden verwendet werden.
Werden die Sonden zum Nachweis des Vorhandenseins der Zielsequenzen verwendet (z.B. beim Screening auf Krebs-Anfälligkeit), so kann die zu analysierende biologische Probe, z.B. Blut oder Serum, zur Extrahierung der Nucleinsäuren behandelt werden, wenn erwünscht. Die Nucleinsäure der Probe kann auf unterschiedliche Weise zur Vereinfachung des Nachweises der Zielsequenz präpariert werden; z.B. durch Denaturierung, Restriktionsverdau, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die angezielte Region der Nucleinsäure des Analyts muss gewöhnlich zumindest teilweise einzelsträngig sein, um Hybride mit der Zielsequenz der Sonde bilden zu können. Ist die Sequenz von Natur aus einzelsträngig, so ist keine Denaturierung erforderlich. Ist die Sequenz jedoch doppelsträngig, so macht die Sequenz möglicherweise eine Denaturierung erforderlich. Die Denaturierung kann mittels verschiedener, im Fachgebiet bekannter Methoden vorgenommen werden.
Die Nucleinsäure des Analyts und die Sonde werden unter Bedingungen inkubiert, die die Bildung eines stabilen Hybrids aus der Zielsequenz in der Sonde mit der vermuteten angezielten Sequenz im Analyt fördert. Die Region der Sonden, die zur Bindung an das Analyt dienen soll, kann vollkommen komplementär zur angezielten Region des Humanchromosoms 13 gemacht werden. Daher sind hochstringente Bedingungen erwünscht, um falsch-positive Bindungen zu vermeiden. Allerdings werden Bedingungen von hoher Stringenz lediglich dann angelegt, wenn die Sonden komplementär zu Regionen des Chromosoms sind, die im Genom einzigartig sind. Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschvorgangs bestimmt, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Basen-Zusammensetzung, der Sondenlänge und der Konzentration an Formamid. Diese Faktoren sind z.B. bei Maniatis et al., 1982, und Sambrook et al., 1989, in groben Zügen dargestellt. Unter bestimmten Umständen kann die Bildung von Hybriden einer höheren Ordnung, z.B. Triplexen, Quadruplexen etc. zur Bereitstellung der Mittel zum Nachweis der Zielsequenzen erwünscht sein.
Die Detektion des resultierenden Hybrids, sofern vorhanden, wird gewöhnlich durch die Verwendung markierter Sonden erreicht: Alternativ dazu kann die Sonde unmarkiert sein, doch kann sie durch spezifische Bindung mit einem Liganden, der entweder direkt oder indirekt markiert ist, nachweisbar sein. Geeignete Marker und Methoden zur Markierung von Sonden und Liganden sind im Fachgebiet bekannt und umfassen z.B. radioaktive Marker, die mittels bekannter Methoden eingebaut werden können (z.B. Nick-Translation, Zufallspriming oder Kinasieren), Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z.B. Dioxetane, speziell getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper und ähnliches. Variationen dieses Grundschemas sind im Fachgebiet bekannt und umfassen jene Abwandlungen, die die Abtrennung der nachzuweisenden Hybride von Fremdstoffen erleichtern und/oder das Signal aus der markierten Komponente amplifizieren. Eine Übersicht über eine Reihe dieser Variationen ist wiedergegeben z.B. bei Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mittlin, 1989; US-Patentschrift Nr. 4.868.105 und in der EPA-Veröffentlichung Nr. 225.807.
Wie oben angemerkt, werden auch nicht auf PCR basierende Screening-Assays bei dieser Erfindung in Betracht gezogen. Eine veranschaulichende Darstellung einer nicht auf PCR basierenden Verfahrensweise ist in Beispiel 11 wiedergegeben. Bei diesem Verfahren wird eine Nucleinsäure-Sonde (oder ein Analogon, wie z.B. ein Methylphosphonat-Rückgrat als Ersatz für den normalen Phosphordiester) an ein geringfügig vorhandenes DNA-Ziel hybridisiert. Diese Sonde kann ein kovalent an die Sonde geknüpftes Enzym aufweisen, so dass die kovalente Bindung die Spezifität der Hybridisierung nicht beeinflusst. Dieser Enzym-Sonde-Konjugat-Ziel-Nucleinsäure-Komplex kann dann aus dem freien Sonde-Enzym-Konjugat wegisoliert und ein Substrat zum Enzymnachweis zugefügt werden. Die enzymatische Aktivität wird als eine Veränderung bei der Farbentwicklung oder der Lumineszenz-Abgabe beobachtet, der zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit von 10³–10⁶ führt. Für ein Beispiel bezüglich der Herstellung von OligodesoxyNucleotid-alkalische Phosphatase-Konjugaten und deren Verwendung als Hybridisations-Sonden, siehe Jablonski et al., 1986.
Im Fachgebiet sind zweistufige Markierungs-Amplifikations-Methoden bekannt. Diese Assays gehen von dem Prinzip aus, dass ein kleiner Ligand (wie z.B. Digoxigenin, Biotin oder ähnliches) an eine Nucleinsäure-Sonde gebunden wird, die zur spezifischen Bindung von BRCA2 fähig ist. Beispiele der Sonden können auf der Grundlage der in SEQ. ID. Nr. 1 und 3 dieser Patentanmeldung wiedergegebenen Sequenz entwickelt werden. Auch Allel-spezifische Sonden werden als im Rahmen dieser Beispiele befindlich erachtet, wobei zu den Beispielen der Allel-spezifischen Sonden solche zählen, die die unten als auch in Tabelle 2 beschriebenen prädisponierenden Mutationen umfassen.
Bei einem Beispiel wird der an die Nucleinsäure-Sonde gebundene kleine Ligand spezifisch durch ein Antikörper-Enzym-Konjugat erkannt. Bei einer Ausführungsform dieses Beispiels ist Digoxigenin an die Nucleinsäure-Sonde gebunden. Die Hybridisierung wird mittels eines Antikörper-alkalische Phosphatase-Konjugats nachgewiesen, welches ein chemiluminszierendes Substrat umsetzt. Methoden zur Markierung von Nucleinsäure-Sonden gemäß dieser Ausführungsform siehe Martin et al., 1990. Bei einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand durch ein zweites Ligand-Enzym-Konjugat erkannt, das zur spezifischen Komplexbildung mit dem ersten Liganden fähig ist. Eine wohlbekannte Ausführung dieses Beispiels involviert die Biotin-Avidin artigen Wechselwirkungen. Methoden zur Markierung von Nucleinsäure-Sonden und ihre Verwendung in auf Biotin-Avidin basierenden Assays siehe Rigby et al., 1977, und Nguyen et al., 1992.
Es wird auch als im Rahmen dieser Erfindung befindlich erachtet, dass die Nucleinsäure-Sonden-Assays dieser Erfindung einen Cocktail von Nucleinsäure-Sonden verwenden, die zum Nachweis von BRCA2 fähig sind. Daher wird bei einem Beispiel zum Nachweis des Vorhandenseins von BRCA2 in einer Zellprobe mehr als eine zu BRCA2 komplementäre Sonde verwendet; insbesondere beträgt die Zahl der verschiedenen Sonden alternativ 2, 3 oder 5 unterschiedliche Nucleinsäure-Sondensequenzen. Bei einem anderen Beispiel wird zum Nachweis des Vorhandensein von Mutationen in der BRCA2-Gensequenz eines Patienten mehr als eine zu BRCA2 komplementäre Sonde verwendet, wobei der Cocktail Sonden umfasst, die zur Bindung an die Allel-spezifischen Mutationen fähig sind, die in Patienten-Populationen mit Alterationen bei BRCA2 identifiziert wurden. Bei dieser Ausführungsform kann eine beliebige Zahl von Sonden verwendet werden, wobei vorzugsweise Sonden entsprechend den wichtigsten Genmutationen umfasst sind, die als ein Individuum für Brustkrebs prädisponierend identifiziert wurden. Zu einigen Kandidaten-Sonden, die als in den Rahmen der Erfindung fallend betrachtet werden, zählen Sonden, die die unten beschriebenen Allel-spezifischen Mutationen als auch jene umfassen, die die BRCA2-Regionen entsprechend der SEQ. ID. Nr. 1 und der 3 sowohl 5' als auch 3' zur Mutationsstelle aufweisen.
Das BRCA2-Polypeptid, das durch das vermutlich mutierende BRCA2-Allel codiert wird, kann nachgewiesen werden. Alterationen in einem derartigen Polypeptid können mittels Sequenzanalyse gemäß herkömmlicher Methoden bestimmt werden. Bevorzugter werden Antikörper (polyklonal oder monoklonal) zum Nachweis der Unterschiede bei oder der Abwesenheit von BRCA2-Peptiden verwendet. Die Antikörper können wie oben unter der Überschrift „Antikörper" erörtert und wie außerdem in Beispielen 9 und 10 gezeigt präpariert werden. Weitere Methoden zum Züchten und Reinigen von Antikörpern sind im Fachgebiet wohlbekannt, wobei eine beliebige dieser Methoden gewählt werden kann. BRCA2-Proteine können mittels Antikörpern aus Lösung immunpräzipitiert werden; ebenso können die Antikörper mit BRCA2-Protein auf Western- oder Immunoblots von Polyacrylamidgelen umgesetzt werden. Die Antikörper können auch zum Nachweis der BRCA2-Proteine in Paraffin oder Gefriergewebeschnitten unter Anwendung immunozytochemischer Methoden eingesetzt werden.
Bevorzugte Methoden zum Nachweis von BRCA2 oder seiner Mutationen umfassen die „enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA), Radioimmunoassays (RIA), immunradiometrischen Assays (IRMA) und immunenzymatischen Assays (IEMA), einschließlich Sandwich-Assays unter Verwendung monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper. Beispiele des Sandwich-Assays sind beschrieben bei David et al., in US-Patentschriften Nr. 4.376.110 und 4.486.530, und in Beispiel 9 veranschaulicht.
Bezug genommen wird auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung und in keinster Weise zur Einschränkung der Erfindung dienen sollen. Es wurden im Fachgebiet wohlbekannte standardmäßige Methoden oder die nachstehend spezifisch beschriebenen Methoden angewandt.
BEISPIEL 1
Ermittlung und Untersuchung von Stämmen, die vermutlich einen Chromosom-13-gekoppelten Anfälligkeits-Locus für Brustkrebs aufweisen
Ausgedehnte, zu Krebs neigende Familienstämme wurden aus einer definierten Population ermittelt, wodurch eine große Gruppe ausgedehnter Stämme mit multiplen Fällen von Brustkrebs und vielen, zur Untersuchung zur Verfügung stehenden Verwandten erhalten wurde. Die große Zahl der bei diesen umfangreichen Stämmen vorliegenden Meiosen bot die Möglichkeit nachzuweisen, ob sich der BRCA2-Locus aufspaltete, und erhöhte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens informativer Rekombinanter innerhalb der untersuchten kleinen Region. Dies erhöhte die Chancen, eine Kopplung an die BRCA2-Region herzustellen, enorm und erleichterte die Verminderung der BRCA2-Region auf eine handhabbare Größe, die die Identifikation des BRCA2-Locus selbst erlaubt, in starkem Maße.
Jeder Stamm wurde durch alle verfügbaren Verwandtschafts-Bindeglieder ausgedehnt und um alle informativen Verwandten ersten Grades jedes Probanden oder Krebsfalles erweitert. Bei diesen Familienstämmen wurden weitere Fälle von Brustkrebs und Individuen mit Krebs an anderen interessierenden Stellen, die ebenfalls in den Stämmen auftraten, durch die Tumorregistrierungsakten identifiziert. Alle im Familienstamm berichteten Fälle von Brustkrebs, die nicht im Krebsregister von Utah bestätigt waren, wurden untersucht. Die medizinischen Berichte oder Totenscheine wurden zur Bestätigung aller Krebsfälle angefordert. Alle Schlüsselpersonen und alle informativen Individuen wurden zur Teilnahme durch Bereitstellung einer Blutprobe, aus der die DNA extrahiert wurde, eingeladen. Außerdem wurden Proben der Ehegatten und Verwandten der Todesfälle genommen, so dass auf den Genotyp der Todesfälle von den Genotypen ihrer Verwandten geschlossen werden konnte.
Familienstämme, bei denen drei oder mehr Krebsfälle mit folgerbaren Genotypen vorlagen, wurden für Studien der Kopplung an Chromosom-13-Marker ausgewählt. Hierzu zählten Familienstämme, die ursprünglich aus den verbundenen Datenbanken für eine Studie von prolifervativen Mastopathien und Brustkrebs ermittelt worden waren (Skolknick et al., 1990). Das Kriterium für die Auswahl dieser Stämme bestand im Vorhandensein zweier Schwestern oder einer Mutter und ihrer Tochter mit Brustkrebs. Außerdem wurden Familienstämme, die seit 1980 als Teil unserer Brustkrebs-Kopplungsstudien untersucht worden waren, und Stämme, die aus den verbundenen Datenbanken für das Vorhandensein von Anhäufungen von männlichem und weiblichem Brustkrebs ermittelt wurden, ebenso wie ein selbst zugewiesener Familienstamm mit Brustkrebs im Frühstadium aufgenommen. Diese Familienstämme wurden untersucht und in unserer Klinik in oben beschriebener Weise erweitert.
Aus jeder bei diesen Familienstämmen entnommenen Probe wurde die DNA unter Anwendung standardmäßiger Laborprotokolle aus Blut oder in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken extrahiert. Die Genotypisierung in dieser Studie war auf kurze Tandem-Repeat-(STR)-Marker beschränkt, da sie im allgemeinen eine hohe Heterozygotie aufweisen und die PCR-Methoden einen schnellen Umsatz mit lediglich sehr geringen Mengen an DNA bieten. Zur Unterstützung dieser Bemühungen wurden STR-Marker auf Chromosom 13 durch Screening einer Chromosom-spezifischen Cosmidbank für Klone entwickelt, die kurze Tandem- Repeats von 2, 3 oder 4 enthielten, die am kurzen Arm in der Region des Rb-Tumorsuppressor-Locus lokalisiert waren. Oligonucleotid-Sequenzen für Marker, die nicht in unserem Labor entwickelt worden waren, wurden aus veröffentlichten Berichten oder als Teil des Breast Cancer Linkage Consortium oder von anderen Forschern erhalten. Alle genotypisierten Filme wurden mit einem standardmäßigen Bahnmarker, der zur Aufrechterhaltung einer konsequenten Codierung der Allele diente, blind ausgewertet. Schlüsselproben wurden einer doppelten Typisierung für alle relevanten Marker unterzogen.
Die LOD-Scores für jeden Familienstamm wurden für zwei Werte der Rekombinationsfraktion, 0,001 und 0,1, berechnet. (Zur Berechnung der LOD-Scores siehe Ott 1985). Die Wahrscheinlichkeiten wurden mit dem von Claus et al., 1991, abgeleiteten Modell berechnet, das eine geschätzte Genhäufigkeit von 0,003, ein lebens-langes Risiko bei weiblichen Genträgern von etwa 0,80 und populationsbezogene, altersspezifische Risiken von Brustkrebs bei Nicht-Genträgern zugrundelegt. Die Allel-Häufigkeiten für die zur LOD-Score-Berechnung verwendeten Marker wurden aus unseren eigenen Labor-Typisierungen nicht-verwandter Individuen im CEPH-Panel berechnet (White und Lalouel, 1988).
Bei Stamm 107 handelt es sich um die größte, bisher von irgendeiner Gruppe berichtete Chromosom-13-gekoppelte Brustkrebsfamilie. Der Beweis einer Kopplung mit Chromosom 13 ist bei dieser Familie überwältigend. Bei kleineren Stämmen verwirren sporadische Krebsarten die Kopplungsanalyse und die korrekte Identifikation der Schlüssel-Rekombinanten in starkem Maße.
Um die Charakterisierung unserer Rekombinanten zu verbessern und enger flankierende Marker zu definieren, war eine verdichtete Karte dieser relativ kleinen Region auf Chromosom 13 erforderlich. Unser Ansatz bestand in der Analyse existierender STR-Marker, wie durch andere Forscher bereitgestellt, und jeglicher neu entwickelter Marker aus unserem Labor, in unseren Chromosom-gekoppelten Familienstämmen. In 1 ist die Lokalisation von zehn bei der Genanalyse verwendeten Marken gezeigt. In Tabelle 1 sind die LOD-Scores für die Kopplung für jeden der 19 Familienstämme in unserer Untersuchung angegeben, was die Region auf etwa 1,5 Mb verminderte.
In Tabelle 1 ist auch die A-posteriori-Wahrscheinlichkeit eines Familienstamms mit einer BRCA2-Mutation ausgehend von den LOD-Scores und den A-priori-Wahrscheinlichkeiten angegeben. Vier dieser Marker (D13S171, D13S260, D13S310 und D13S267) waren zuvor bekannt. Die anderen sechs Marker wurden als Teil unserer Forschung für BRCA2 gefunden. Wir waren in der Lage, die Region auf 1,5 Megabasen auf der Grundlage einer Rekombinante bei Stamm 107 mit Marker tdj3820 an der linken Begrenzung und einer zweiten Rekombinante bei Stamm 2043 mit Marker YS-G-BIOT an der rechten Begrenzung zu vermindern (siehe 1), was an etwa derselben Lokalisation wie AC6 und D13S310 liegt. Weiterhin wurde eine homozygote Deletion in einer pankreatischen Tumorzelllinie in der BRCA2-Region fest-gestellt, die von BRCA2 selbst bewirkt worden sein kann; diese Deletion wird in 1 als Schutte/Kern-Deletion bezeichnet (Schufte et al., 1995). Das Schutte/Kern-Contig in 1 bezieht sich auf die physische Karte dieser Autoren, die diese Deletion abdeckt.
BEISPIEL 2
Entwicklung der genetischen und physischen Ressourcen in der Region von Interesse
Um die Zahl der hochgradig polymorphen Loci in der BRCA2-Region zu erhöhen, entwickelten wird in unserem Labor eine Reihe von STR-Markern aus P1, BACs und YACs, die die Region physisch kartieren. Diese Marker ermöglichten uns eine weitere Verfeinerung der Region (siehe Tabelle 1 und die obige Erörterung).
Die STSs in der gewünschten Region wurden zum Identifizieren von YACs verwendet, die sie enthielten. Diese YACs wurden dann zum Identifizieren von Subklonen in P1s oder BACs verwendet. Diese Subklone wurden dann auf das Vorhandensein eines kurzen Tandem-Repeats gescreent. Die Klone mit einem starken Signal wurden bevorzugt ausgewählt, da sie mit größerer Wahrscheinlichkeit Repeats repräsen-tierten, die eine große Anzahl an Repeats aufweisen und/oder dem Muster in nahezu perfekter Weise getreu sind. Von diesen beiden Eigenschaften ist bekannt, dass sie die Wahrscheinlichkeit von Polymorphismus erhöhen (Weber et al., 1990). Diese Klone wurden direkt aus dem Vektor sequenziert, um den Repeat zu lokalisieren. Wir erhielten eine einzigartige Sequenz auf einer Seite des kurzen Tandem-Repeats, indem wir einen aus einem Satz möglicher Primer verwendeten, der komplementär zum Ende des Repeats war. Basierend auf dieser einzigartigen Sequenz wurde ein Primer zur Rücksequenzierung über den Repeat hinaus in die andere Richtung hergestellt, was eine einzigartige Sequenz zum Design eines zweiten, ihn flankierenden Primers ergab. Dann wurden die STRs auf Polymorphismus an einer kleinen Gruppe nichtverwandter Individuen gescreent und gegen das Hybrid-Panel getestet, um deren physische Lokalisation zu bestätigen. Neue Marker, die diese Kriterien erfüllten, wurden dann in einer Gruppe nicht miteinander verwandter Individuen aus Utah typisiert, um für die Studie dieser Population geeignete Allel-Häufigkeiten zu erhalten. Viele der anderen, in dieser Studie berichteten Marker wurden ebenfalls bei nicht miteinander verwandten Individuen getestet, um ähnlich geeignete Allel-Häufigkeiten zu erhalten.
Unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahrensweise wurden neuartige STRs von diesen YACs gefunden, die sowohl polymorph als auch an der BRCA2-Region lokalisiert waren. In 1 ist eine Schemakarte der STSs, P1s, BACs und YACs in der BRCA2-Region gezeigt.
BEISPIEL 3
Identifikation der Kandidaten-cDNA-Klone für den BRCA2-Locus durch Genomanalyse der Contig-Region
1. Allgemeine Methoden
Vollständiges Screening der plausiblen Region. Die erste Methode zur Identifizierung der Kandidaten-cDNAs war zwar arbeitsintensiv, doch wendete bekannte Techniken an. Das Verfahren umfasste das Screening von P1- und BAC-Klonen im Contig zur Identifizierung vermutlicher Codierungssequenzen. Die Klone, die vermutliche Codierungssequenzen enthielten, wurden dann als Sonden auf Filtern von cDNA-Banken verwendet, um Kandidaten-cDNA-Klone für die weitere Analyse zu identifizieren. Die Klone wurden auf vermutliche Codierungssequenzen mittels einer von zwei Methoden gescreent.
Die zu analysierenden P1-Klone wurden mit einem Restriktionsenzym verdaut, um humane DNA aus der Vektor-DNA freizusetzen. Die DNA wurde auf einer 14-cm-Säule mit 0,5% Agarosegel über 16 Stunden hinweg über Nacht bei 20 Volt aufgetrennt. Die humanen DNA-Bande wurden aus dem Gel ausgeschnitten und aus der Gelmasse bei 100 Volt für mindestens zwei Stunden in 0,5 × Tris-Acetat-Puffer elektroeluiert (Maniatis et al., 1982). Die eluierte Not-1-verdaute DNA (~ 15 kb bis 25 kb) wurde dann mit EcoRI-Restriktionsenzym zum Erhalt kleinerer Fragmente (~ 0,5 kb bis 5,0 kb) verdaut, die für den nächsten Schritt der Markierung der DNA mit RadioNucleotiden leichter auseinander schmelzen. Die DNA-Fragmente wurden mittels der Hexamer-zufallsgeprimten Markierungsmethode markiert (Boehringer-Mannheim, Kat. #1004760). Die markierte DNA wurde aus Spermin ausgefällt (unter Zugabe von 100 μl TE, 5 μl 0,1 M Spermin und 5 μl an 10 mg/ml Lachssperma-DNA), um nicht-eingebaute RadioNucleotide zu entfernen. Die markierte DNA wurde dann in 100 μl TE, 0,5 M NaCl bei 65°C über 5 Minuten hinweg resuspendiert und dann mit humaner C_ot-1-DNA für 2–4 Stunden gemäß den Anleitungen des Herstellers (Gibco/BRL, Kat. #5279SA) blockiert. Die C_ot-1-blockierte Sonde wurde auf den Filtern in der Blockierungslösung bei 42°C über Nacht inkubiert. Die Filter wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS, und dann im gleichen Puffer 30 Minuten lang bei 55°C gewaschen. Die Filter wurden dann 1 bis 3 Tage lang bei –70°C mit einem Kodak-XAR-5-Film mit einem Verstärkerschirm belichtet. Folglich wurden die Blots entweder mit dem PooI der EcoRI-Fragmente aus dem Insert oder jedem der Fragmente einzeln hybridisiert.
Die humane DNA aus Klonen in der Region wurde als Gesamtinsert oder als EcoRI-Fragmente isoliert und wie oben beschrieben markiert. Die markierte DNA wurde zum Screening von Filtern verschiedener cDNA-Banken unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben verwendet, außer dass die cDNA-Filter stringenteren zweimaligen Waschgängen mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65° über 30 Minuten hinweg unterzogen wurden.
Der Großteil der bis heute in unseren Untersuchungen verwendeten cDNA-Banken (Banken von gesundem Brustgewebe, Brustgewebe von einer Frau im achten Schwangerschaftsmonat und einer Brustmalignität) wurden bei Clonetech, Inc., präpariert. Die aus dem Brustgewebe der im 8. Monat schwangeren Frau generierte cDNA-Bank ist beziehbar von Clonetech (Kat. #HL1037a) im Lambda-gt-10-Vektor, und wird in der C600HfI-Bakterienwirtszelle gezüchtet. Proben von gesundem Brustgewebe und von bösartigem Brustgewebe wurden aus einer 37 Jahre alten Kaukasierin isoliert, und ein Gramm jedes Gewebes wurde an Clonetech zur mRNA-Aufarbeitung und Konstruktion der cDNA-Bank gesendet. Die letzteren beiden Banken wurden unter Anwendung sowohl von Zufalls- als auch Oligo-dT-Priming bei einer Größenauswahl der Endprodukte erzeugt, die dann in den Lambda-Zap-II-Vektor kloniert und im XL1-blue-Bakterienstamm gezüchtet wurden, wie vom Hersteller beschrieben. Zu weiteren gewebespezifischen cDNA-Banken zählen humanes Fötushirn (Stratagene, Kat. 936206), humane Hoden (Clonetech Kat. HL3024), humaner Thymus (Clonetech Kat. HL1127n), humanes Hirn (Clonetech Kat. HL11810), humane Plazenta (Clonetech Kat. 1075b) und humaner Skelettmuskel (Clonetech Kat. HL1124b).
Die cDNA-Banken wurden mit ihren Wirtszellen auf NZCYM-Platten ausplattiert und Filterhebungen von jeder Platte im Duplikat wie nach Maniatis et al., (1982) vorgenommen. Insert-(humane)-DNA von den genomischen Kandidaten-Klonen wurde ausgereinigt und zu hoher spezifischer Aktivität radioaktiv markiert. Die radioaktive DNA wurde dann an die cDNA-Filter hybridisiert, um jene cDNAs zu identifizieren, die den innerhalb des Kandidaten-Cosmid-Klons lokalisierten Genen entsprechen. Die mittels dieser Methode identifizierten cDNAs wurden herausgenommen, nochmals ausplattiert und mit dem markierten Klon-Insert oder seiner abgeleiteten EcoRI-Fragment-DNA gescreent, um ihren positiven Status zu verifizieren. Die Klone, die nach dieser zweiten Screening-Runde positiv waren, wurden dann gezüchtet und ihre DNA für die Southern-Blot-Analyse und die Sequenzierung ausgereinigt. Die Klone wurden entweder aus Plasmid durch in vivo-Exzision des Plasmids aus dem Lambda-Vektor ausgereinigt, wie in den Protokollen der Hersteller beschrieben, oder aus dem Lambda-Vektor als ein Restriktionsfragment isoliert und in Plasmid-Vektor subkloniert.
Die Southern-Blot-Analyse wurde im Duplikat vorgenommen, d.h. eine unter Verwendung der ursprünglichen genomischen Insert-DNA als einer Sonde, um zu verifizieren, dass das cDNA-Insert hybridisierende Sequenzen enthält. Der zweite Blot wurde mit cDNA-Insert-DNA aus dem größten cDNA-Klon hybridisiert, um zu identifizieren, welche Klone dasselbe Gen repräsentieren. Alle cDNAs, die mit dem genomischen Klon hybridisieren und einzigartig sind, wurden sequenziert und die DNA analysiert, um zu bestimmen, ob die Sequenzen bekannte oder einzigartige Gene repräsentieren. Alle cDNA-Klone, die einzigartig zu sein scheinen, wurden als Kandidaten-BRCA2-Loci weiter analysiert. Spezifisch werden die Klone an Northern-Blots hybridisiert, um sie auf eine Brust-spezifische Expression und differentielle Expression in gesunden gegenüber Brusttumor-RNAs zu untersuchen. Sie werden auch mittels PCR auf Klonen in der BRCA2-Region analysiert, um ihre Lokalisation zu verifizieren. Um den Umfang des Locus zu kartieren, wurden cDNAs der vollen Länge isoliert und ihre Sequenzen als PCR-Sonden auf den YACs und den Klonen, die die ursprünglich identifizierenden Klone umgeben und enthalten, verwendet. Die Intron-Exon-Begrenzungen werden dann durch Sequenzanalyse weiter definiert.
Wir haben die cDNA-Banken von gesundem Brustgewebe, einem Brustgewebe nach achtmonatiger Schwangerschaft und Fötushirngewebe mit EcoRI-Fragmenten aus Cosmid-, BAC- und P1-Klonen in der Region gescreent. Innerhalb der drei Banken wurden potentielle BRCA2-cDNA-Klone identifiziert. Die Klone wurden herausgenommen, nochmals ausplattiert und mit der ursprünglichen Sonde nochmals gescreent, um zu verifizieren, dass sie positiv waren.
Analyse der Hybrid-selektierten cDNA. Die aus einer Direktauswahl erhaltenen cDNA-Fragmente wurden mittels Southern-Blot-Hybridisation gegen die Sonden-DNA geprüft, um zu verifizieren, dass sie aus dem Contig stammten. Jene, die diesen Test bestanden, wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert. Die in dieser Weise erhaltene Gruppe von DNA-Sequenzen wurde dann gegeneinander geprüft, um unabhängige Klone zu finden, die sich überlappten.
Die Direktauswahl der cDNA-Methode (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993) wird mit P1- und BAC-DNA als der Sonde vorgenommen. Die Sonden-DNA wird mit einem stumpf schneidenden Restriktionsenzym wie HaeIII verdaut. Doppelsträngige Adaptoren werden dann an die DNA ligiert und dienen als Bindungsstellen für Primer bei anschließenden PCR-Amplifikationsreaktionen unter Verwendung biotinylierter Primer. Die Ziel-cDNA wird aus von Gewebeproben, z.B. Brustgewebeproben, stammender mRNA durch Synthese entweder zufallsgeprimter oder Oligo-dT-geprimter Erststrang-, dann Zweitstrang-Synthese generiert. Die cDNA-Enden werden stumpf gemacht und an doppelsträngige Adaptoren ligiert. Diese Adaptoren dienen als Amplifiktionsstellen für die PCR. Die Ziel- und Sondensequenzen werden denaturiert und mit humaner C_ot-1-DNA zum Blockieren repetitiver Sequenzen gemischt. Die Lösungshybridisation wird auf hohe C_ot-1/2-Werte vorgenommen, um die Hybridisation rarer Ziel-cDNA-Moleküle zu gewährleisten. Das vereinigte Material wird dann an Avidin-Kügelchen eingefangen, bei hoher Stringenz gewaschen und die zurückgehaltene cDNA eluiert und mittels PCR amplifiziert. Die ausgewählte cDNA wird weiteren Zyklen zur Anreicherung unterzogen, bevor sie zur Analyse in einen Plasmidvektor kloniert wird.
HTF-Insel-Analyse. Die Methode zur Identifizierung von Cosmiden zur Verwendung als Sonden an den cDNA-Banken bestand in der HTF-Insel-Analyse. Bei HTF-Inseln handelt es sich um Segmente von DNA, die in sehr hoher Häufigkeit unmethylierte CpG-DiNucleotide enthalten (Tonolio et al., 1990) und durch die Anhäufung von Restriktionsstellen der Enzyme, deren Erkennungssequenzen CpG-DiNucleotide enthalten, offenbar werden. Zu den Enyzmen, die als nützlich bei der HTF-Insel-Analyse bekannt sind, zählen AscI, NotI, BssHII, EagI, SacII, NaeI, NarI, SmaI und MluI (Anand, 1992).
Analyse der Kandidaten-Klone. Ein oder mehrere der oben erzeugten Kandidaten-Gene wurden sequenziert und die Information zur Identifikation und Klassifikation jedes exprimierten Gens verwendet. Die DNA-Sequenzen wurden mit bekannten Genen durch Vergleiche der Nucleotidsequenzen und durch Translation in alle Raster, gefolgt von einem Vergleich mit bekannten Aminosäuresequenzen, verglichen. Dies erfolgte unter Verwendung der Genetic Data Environment (GDE) Software-Version 2.2 und der Basic Local Alignment Search Tool-(Blast)-Reihe der Client/Server-Software-Packages (z.B. BLASTN 1.3.13MP) zum Sequenzvergleich sowohl gegen lokale als auch entfernte Sequenz-Datenbanken (z.B. GenBank), vorgenommen auf Sun SPARC-Workstations. Es wurden Sequenzen, die aus Sammlungen von mit den Cosmiden und P1 identifizierten cDNA-Klonen rekonstruiert wurden, generiert. Alle Kandidaten-Gene, die neue Sequenzen repräsentierten, wurden zum Testen ihrer Kandidatur für den vermuteten BRCA2-Locus weiter analysiert.
Mutations-Screening. Zum Screening auf die Mutationen in den betroffenen Stammbäumen wurden zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Erstens wurde eine aus Familienmitgliedern, die als Träger des Anfällligkeits-Allels von BRCA2 bekannt waren, isolierte genomische DNA als eine Template zur Amplifikation der Kandidaten-Gensequenzen mittels PCR verwendet. Flankieren oder überlappen die PCR-Primer eine Intron/Exon-Begrenzung, so ist das amplifizierte Fragment größer als aus der cDNA-Sequenz vorausgesagt oder liegt nicht im amplifizierten Gemisch vor. Durch eine Kombination solcher Amplifikations-Experimente und der Sequenzierung von P1- oder BAC-Klonen unter Verwendung des Satzes designter Primer ist es möglich, die Intron/Exon-Struktur zu ermitteln und schließlich die DNA-Sequenzen der genomischen DNA aus den Stammbäumen zu erhalten.
Ein zweiter Ansatz, der viel schneller ist, wenn die Intron/Exon-Struktur des Kandidat-Gens komplex ist, umfasst die Sequenzierung von aus cDNA amplifizierten Fragmenten, die aus aus Stammbaumblut extrahierter Lymphozyten-mRNA synthetisiert worden waren und als ein Substrat für die PCR-Amplifikation unter Verwendung des Satzes der designten Primer verwendet wurden. Wird das Kandidat-Gen in signifikantem Umfang in Lymphozyten exprimiert, so führen solche Experimente gewöhnlich zu amplifizierten Fragmenten, die direkt ohne Kenntnis der Intron/Exon-Übergänge sequenziert werden können.
Die Produkte solcher Sequenzierungsreaktionen wurden mittels Gelelektrophorese analysiert, um Positionen in der Sequenz zu bestimmen, die entweder Mutationen wie Deletionen oder Insertionen, oder Basenpaar-Substitutionen enthalten, die zu Aminosäure-Austäuschen oder anderen nachteiligen Wirkungen führen.
Jegliche Sequenz innerhalb der BRCA2-Region, die in Brustgewebe exprimiert wird, wird als Kandidat-Gen für BRCA2 erachtet. Der überzeugende Beweis, dass ein gegebenes Kandidat-Gen dem BRCA2 entspricht, folgt aus einem Nachweis, dass Stammbaum-Familien defekte Allele des Kandidaten enthalten.
2. Spezifische Methoden
Hybrid-Selektion. Für diese Arbeit wurden zwei unterschiedliche Methoden der Hybrid-Selektion angewandt.
Methode 1: cDNA-Präparierung und -Auswahl. Zufallsgeprimte cDNA wurde aus Poly-A⁺-RNA des Brustdrüsen-, Eierstock-, Fötushirn- und Plazentagewebes und aus der Gesamt-RNA der Zelllinie Caco-2 (ATCC HTB 37) präpariert. Die cDNAs wurden homopolymer mit Schwanz versehen und dann in zwei aufeinanderfolgenden Runden der Hybridisation an immobilisierte P1- oder BAC-DNA wie zuvor beschrieben Hybrid-selektiert. (Parimoo et al., 1991; Rommens et al., 1994). Gruppen von zwei bis vier überlappenden P1- und/oder BAC-Klonen wurden in einzelnen Selektionsexperimenten verwendet. Hybridisierende cDNA wurde eingesammelt, durch eine G50-Fine Sephadex-Säule geleitet und unter Verwendung von mit Schwanz versehenen Primern amplifiziert. Die Produkte wurden dann mit EcoRI verdaut, auf Agarosegelen größenselektiert und in pBluescript (Stratagene) ligiert, das mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Kälberphosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt worden war. Die Ligationsprodukte wurden in kompetente DH5a E. coli-Zellen (Life Technologies, Inc.) transformiert.
Charakterisierung der rückgewonnenen cDNAs. 200 bis 300 einzelne Kolonien aus jeder Ligation (aus jeweils 250 Kilobasen der genomischen DNA) wurden entnommen und in Mikrotiterplatten zur Ordnung und Lagerung eingebracht. Bei den Kulturen handelte es sich um Replika, die auf Hybond N-Membranen (Amersham), getragen von LB-Agar mit Ampicillin, übertragen wurden. Die Kolonien durften sich vermehren und wurden anschließend mit standardmäßigen Verfahrensweisen lysiert. Die anfängliche Analyse der cDNA-Klone umfasste ein Vorab-Screening auf ribosomale Sequenzen und anschließende Kreuz-Screenings zum Nachweis der Überlappung und Redundanz.
Etwa 10 bis 25% der Klone wurden eliminiert, da sie mit der aus Gesamt-RNA erhaltenen radiomarkierten cDNA stark hybridisierten. Plasmide aus 25 bis 50 Klonen aus jedem Selektionsexperiment, die beim Vorab-Screening nicht hybridisierten, wurden zur weiteren Analyse isoliert. Die rückgewonnenen cDNA-Fragmente wurden als von einzelnen Ausgangsgenom-Klonen stammend durch Hybridisation an Restriktionsverdaus der DNAs der Ausgangsklone einer Hamster-Hybridzelllinie (GM10898A), die Chromosom 13 als ihr einziges humanes Material enthält, und an humane Genom-DNA verifiziert. Die Klone wurden, ausgehend von den überlappenden oder nicht-überlappenden Intervallen der genomischen Klone, versuchsweise Gruppen zugeordnet. Von den getesteten Klonen konnten etwa 85% richtigerweise den Ausgangsklonen zukartiert werden.
Methode 2 (Lovett et al., 1991): cDNA-Präparation. Poly-A-angereicherte RNA aus humanem Brustdrüsen-, Hirn-, Lymphozyten- und Magengewebe wurde unter Verwendung des mit Schwanz versehenen Zufallsprimers XN₁₂
[5'-(NH₂)-GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNNN] (SEQ ID NR. 3)
und Superscript II-reverse Transkriptase (Gibco BRL) revers transkribiert. Nach der Zweitstrang-Synthese und Endpolitur wurde die ds-cDNA auf Sepharose CL-4B-Säulen (Pharmacia) gereinigt. Die cDNAs wurden durch Ligation eines doppelsträngigen Oligo-RP
[5'-(NH₂)-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTGTTC] (SEQ ID NR. 4),
vereinigt mit
5'-GAACAATGACGGCCGTTAGAATTCTACTCA-(NH₂) (SEQ ID NR. 5)]
an ihren 5'-Enden (5' relativ zu mRNA) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase "verankert". Die verankerte ds-cDNA wurde dann auf Sepharose CL-4B-Säulen nochmals gereinigt.
Selektion. Die cDNAs aus Brustdrüsen-, Hirn-, Lymphozyten- und Magengeweben wurden zunächst unter Verwendung einer nested Version von RP
(RP.A: 5'-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCAT) (SEQ ID NR. 6) und
XPCR [5'-(PO₄)-GTAGTGCAAGGCTCGAGAAC (SEQ ID NR. 7)]
amplifiziert und durch Fraktionierung auf Sepharose CL-4B gereinigt. Selektions-Sonden wurden aus gereinigten P1, BACs und PACs durch Verdau mit HinfI und Exonuklease III hergestellt. Die einzelsträngige Sonde wurde mit Photobiotin (Gibco BRL) gemäß den Empfehlungen des Herstellers photomarkiert. Sonde, cDNA und Cot-1-DNA wurden in 2,4 M TEA-CL, 10 mM NaPO₄, 1 mM EDTA hybridisiert. Die hybridisierten cDNAs wurden auf Streptavidin-paramagnetischen Partikeln (Dynal) eingefangen, eluiert, mit einer weiteren nested Version von RP
[RP.B: 5'-(PO₄)-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG (SEQ ID NR. 8)]
und XPCR reamplifiziert und auf Sepharose CL-6B größenselektiert. Die selektierte, amplifizierte cDNA wurde mit einer weiteren Teilmenge der Sonde und C_ot-1-DNA hybridisiert. Die eingefangenen und eluierten Produkte wurden nochmals mit RP.B und XPCR amplifiziert, mittels Gelelektrophorese größenselektiert und in mit dephosphoryliertem HincII geschnittenen pUC18 kloniert. Die Ligationsprodukte wurden in XL2-Blue-ultrakompetenten Zellen (Stratagene) transformiert.
Analyse. Etwa 192 Kolonien pro Einzelsonden-Selektionsexperiment wurden mittels Kolonie-PCR unter Verwendung von Vektor-Primern amplifiziert und im Duplikat auf Zeta Probe-Nylonfilter (Bio-Rad) aufgetupft. Die Filter wurden unter Anwendung standardmäßiger Verfahrensweisen entweder mit zufallsgeprimter C_ot-1-DNA oder Sonden-DNA (P1, BAC oder PAC) hybridisiert. Sonden-positive, C_ot-1-negative Klone wurden in beide Richtungen unter Verwendung von Vektor-Primern auf einem ABI 377-Sequenziergerät sequenziert.
Exon-Trapping. Die Exon-Amplifikation wurde unter Verwendung eines minimal überlappenden Satzes von BACs, P1 und PACs durchgeführt, um eine Reihe von Gensequenzen aus der BRCA2-Kandidat-Region zu isolieren. Es wurden Pools von genomischen Klonen zusammengestellt, die 100 – 300 kb DNA in Form von 1–3 überlappenden genomischen Klonen enthielten. Die genomischen Klone wurden mit PstI oder BamHI + BglII verdaut und in PstI- oder BamHI-Stellen des pSPL3-Spleißvektors ligiert. Die Exon-Amplifikationsmethode wurde vorgenommen (Church et al., 1993), und die Endprodukte wurden in das pAMP1-Plasmid vom Uracil-DNA-Glycosylase-Kloniersystem (BRL) kloniert. Etwa 6000 Klone wurden herausgesucht, in 96-Well-Platten vermehrt, auf Filter gedrückt und auf das Vorhandensein von Vektor- und Repeat-Sequenzen durch Hybridisation analysiert. Jedes Klon-Insert wurde PCR-amplifiziert und auf die Redundanz, Lokalisation und Humanspezifität durch Hybridisation an Exonraster und Dot-Blots der parentalen genomischen DNA getestet. Einzigartige Kandidaten-Exons wurden sequenziert, gegen die Datenbanken durchsucht und zur Hybridisation an cDNA-Banken verwendet.
5'-RACE. Das 5'-Ende von BRCA2 wurde mittels eines modifizierten RACE-Protokolls, genannt Biotin-Einfang-RACE, identifiziert. Poly-A-angereicherte RNA aus humanem Brustdrüsen- und Thymusgewebe wurde unter Verwendung des mit Schwanz versehenen Zufallsprimers
XN₁₂ [5'-(NH₂)-GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NR. 3)]
und Superscript II-reverse Transkriptase (Gibco BRL) revers transkribiert. Der RNA-Strang wurde in NaOH hydrolysiert und die Erststrang-cDNA durch Fraktionierung auf Sepharose CL-4B (Pharmacia) gereinigt. Die Erststrang-cDNAs wurden durch Ligation eines doppelsträngigen Oligo mit einem 7-bp-Zufalls-5'-Überhang [ds UCA: 5'-CCTTCACACGCGTATCGATTAGTCACNNNNNNN-(NH₂) (SEQ ID NR. 9), vereinigt mit 5'-(PO₄)-GTGACTAATCGATACGCGTGTGAAGGTGC (SEQ ID NR. 10)], an ihren 3'-Enden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase "verankert". Nach der Ligation wurde die verankerte cDNA durch Fraktionierung auf Sepharose CL-4B nochmals gereinigt. Das 5'-Ende von BRCA2 wurde unter Verwendung eines biotinylierten reversen Primers [5'-(B)-TTGAAGAACAACAGGACTTTCACTA] (SEQ ID NR. 11) und einer nested Version von UCA [UCP.A: 5'-CACCTTCACACGCGTATCG (SEQ ID NR. 12)] amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarosegel fraktioniert, gelgereinigt und auf Streptavidinparamagnetischen Partikeln (Dynal) eingefangen. Die eingefangene cDNA wurde unter Verwendung eines nested reversen Primers
[5'-GTTCGTAATTGTTGTTTTTATGTTCAG] (SEQ ID NR. 13)
und einer weiteren nested Version von UCA
[UCP.B: 5'-CCTTCACACGCGTATCGATTAG] (SEQ ID NR. 14)]
nochmals amplifiziert. Diese PCR-Reaktion ergab eine einzelne scharfe Bande auf einem Agarosegel; die DNA wurde gelgereinigt und in beiden Richtungen auf einem ABI 377-Sequenziergerät sequenziert.
cDNA-Klone. Humane cDNA-Banken wurden mit ³²P-markierten Hybrid-selektierten oder Exon-eingefangenen Klonen gescreent. Aus tertiären Plaques eluierter Phage wurde mit Vektor-spezifischen Primern PCR-amplifiziert und dann auf einem ABI 377-Sequenziergerät sequenziert.
Northern Blots. Multiple Tissue Northern-(MTN)-Filter, die mit 2 μg pro Bahn an aus einer Reihe von Humangeweben stammender Poly-A⁺-RNA beladen waren, wurden von Clonetech bezogen. ³²P-zufallsgeprimte markierte Sonden entsprechend den rückgewonnenen cDNAs GT 713 (BRCA2 Exons 3–7), λ wCPF1B8.1 (3'-Ende von Exon 11 in Exon 20) und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) wurden zum Sondieren der Filter verwendet. Die Vorhybridisationen wurden bei 42°C in 50% Formamid, 5X SSPE, 1% SDS, 5X Denhardtsches Gemisch, 0,2 mg/ml denaturierte Lachskeimdrüsen-DNA und 2 μg/ml Poly-A vorgenommen. Die Hybridisationen fanden in derselben Lösung unter Zugabe von Dextransulfat auf 4% und Sonde statt. Stringente Waschgänge erfolgten bei 0,1X SSC/0,1% SDS bei 50°C.
RT-PCR-Analase. Aus fünf humanen Brustkrebs-Zelllinien (ZR-75-1, T-47D, MDA-MB-231, MDA-MB468 und BT-20) und drei humanen Prostatakrebs-Zelllinien (LNCaP, DU145 und PC-3) extrahierte 10 μg Gesamt-RNA (RNA zur Verfügung gestellt von Dr. Claude Labrie, CHUL Research Center) wurden unter Verwendung des Primers mH20-1D05#RA
[5'-TTTGGATCATTTTCACACTGTC] (SEQ ID NR. 15)]
und Superscript II-reverse Transkriptase (Gibco BRL) revers transkribiert. Daraufhin wurden die Einzelstrang-cDNAs unter Verwendung der Primer CG026#FB:
[5'-GTGCTCATAGTCAGAAATGAAG] (SEQ ID NR. 16])
und mH20-1D05#RA amplifiziert (hierbei handelt es sich um das Primerpaar, das zum Inselhüpfen vom Exon-7/8-Übergang in Exon 11 verwendet wurde; das PCR-Produkt beträgt etwa 1,55 kb). Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,2% Agarosegel fraktioniert.
PCR-Amplifikation und Mutations-Screening. Alle 26 codierenden Exons von BRCA2 und ihre assoziierten Spleißstellen wurden von genomischer DNA wie beschrieben amplifiziert (Kamb et al., 1994b). Die DNA-Sequenzen der Primer, von denen einige in der flankierenden Intron-Sequenz liegen und wie zur Amplifikation und Sequenzierung verwendet, erscheinen in Tabelle 2. Ein Teil der Exons (2 bis 10, 11-5, 11-6, 11-7 und 23 bis 27) wurde mittels eines einfachen einstufigen Verfahrens amplifiziert. Die PCR-Bedingungen für diese Exons waren: einzelner Denaturierungschritt bei 95°C (1 Min.); 40 Zyklen bei 96°C (6 Sek.), T_ann. = 55°C (15 Sek.), 72°C (1 Min.). Weitere Exons (11–22) erforderten eine nested Reamplifikation nach der primären PCR-Reaktion. In diesen Fällen wurde die Anfangs-Amplifikation mit den Primern in den ersten beiden Spalten der Tabelle 2 über 19 Zyklen hinweg wie oben beschrieben durchgeführt. Die nested Reamplifikation für diese Exons wurde für 28 oder 32 Zyklen bei denselben Bedingungen mit den in der dritten Spalte der Tabelle 2 aufgeführten Primern vorgenommen. Die Puffer-Bedingungen waren wie beschrieben (Kamb et al., 1994b). Die Produkte wurden aus 0,8% Agarosegelen unter Verwendung von Qiaex-Kügelchen (Qiagen) gereinigt. Die gereinigten Produkte wurden mittels Zyklus-Sequenzierung mit α-P³²dATP mit Ampli-Cycle^TM Sequencing Kit (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) analysiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf 6% Polyacrylamidgelen fraktioniert. Alle (A) Reaktionen wurden nebeneinander aufgebracht, gefolgt von den (C) Reaktionen etc. Der Nachweis von Polymorphismen wurde visuell vorgenommen und am anderen Strang bestätigt.
BEISPIEL 4
Identifikation von BRCA2
Zusammenfügung der BRCA2-Sequenz der vollen Länge. Die BRCA2-Sequenz der vollen Länge wurde durch Kombination mehrerer kleiner, aus der Hybrid-Selektion erhaltener Sequenzen, Exon-Trapping, cDNA-Bank-Screening, Genomsequenzierung und PCR-Experimenten unter Venrwendung von cDNA als Template für die Amplifikation (d.h. "Inselhüpfen") zusammengefügt (2). Das extreme 5'-Ende der mRNA, die die vorhergesagte Translations-Startstelle enthielt, wurde durch ein modifiziertes 5'-RACE-Protokoll identifiziert (Stone et al., 1995). Das erste Nucleotid in der Sequenz (Nucleotid 1) ist eine Nicht-Template G, ein Hinweis darauf, dass die mRNA-Kappe in der Sequenz enthalten ist. Eines der Exons (Exon 11), das intern im BRCA2-cDNa lokalisiert ist, ist nahezu 5 kb lang. Ein Abschnitt von Exon 11 wurde durch Analyse von etwa 900 kb der Genomsequenz in der Public Domain (ftp://genome.wust1.edu/pub/gscl/brca) identifiziert. Diese Genomsequenz wurde mit einer durch uns bestimmten Genomsequenz zu einem Satz von 160 Sequenz-Contigs verdichtet. Als die verdichtete Genomsequenz auf offene Leseraster (ORFs) durchsucht wurde, wurde eine kontinuierliche Strecke von nahezu 5 kb identifiziert, die durch lange ORFs überspannt wurde. Diese Sequenz wurde durch Inselhüpf-Experimente mit zwei früher identifizierten Kandidaten-Genfragmenten gekoppelt. Die derzeitige zusammengesetzte BRCA2-cDNA-Sequenz besteht aus 11.385 bp, doch enthält nicht das Polyadenylierungssignal oder den Poly-A-Schwanz. Diese cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NR. 1 und 3 beschrieben.
Struktur des BRCA2-Gens und BRCA2-Polypeptids. Die konzeptionelle Translation der cDNA ergab ein ORF, das bei Nucleotid 229 begann und ein vorhergesagtes Protein von 3418 Aminosäuren codierte. Das Peptid weist, von der Sequenz-Zusammensetzung abgesehen, keine wahrnehmbare Ähnlichkeit zu anderen Proteinen auf. Es liegt keine Signalsequenz am Amino-Terminus und keine erkennbaren Membran-durchspannenden Regionen vor. Wie BRCA1 ist auch das BRCA2-Protein hochgradig geladen. Grob ein Viertel der Reste sind sauer oder basisch.
Die BRCA2-Genstruktur wurde durch Vergleich der cDNA und genomischen Sequenzen bestimmt. BRCA2 setzt sich aus 27 Exons zusammen, die über etwa 70 kb der genomischen DNA verteilt sind. Eine CpG-reiche Region am 5'-Ende von BRCA2, die sich flussaufwärts erstreckt, legt nahe, dass das Vorhandensein von regulatorischen Signalen oftmals mit CpG-"Inseln" verbunden ist. Basierend auf Southern-Blot-Experimenten scheint BRCA2 einzigartig und ohne enge Homologa im Humangenom zu sein.
Expressionsstudien von BRCA2. Die Hybridisation von markierter cDNA an humane Multiple-Tissue-Northern-Filter ergab ein 11–12 kb-Transkript, das lediglich in Keimdrüsen nachweisbar war. Die Größe dieses Transkripts legt nahe, dass nur ein geringer Teil der BRCA2-mRNA-Sequenz aus unserer zusammengesetzten cDNA fehlt. Da die Nothern-Filter keine Brustdrüsen-RNA enthielten, wurden RT-PCR-Experimente unter Verwendung eines BRCA2-cDNA-Amplicons an fünf Brustkrebs- und drei Prostatakrebs-Zelllinien-RNAs durchgeführt. Alle Linien erzeugten positive Signale. Außerdem wurde die PCR eines BRCA2-Amplicons (1-BrCG026 → 5 kb) und 5'-RACE zum Vergleich von Brustdrüsen- und Thymus-cDNA als Templaten für die Amplifikation verwendet. In beiden Fällen amplifizierte das Produkt effizienter aus Brust- als aus Thymus-cDNA.
Keimbahn-Mutationen in BRCA2. Individuen aus achtzehn vermuteten BRCA2-Familienstämmen wurden auf BRCA2-Keimbahn-Mutationen mittels DNA-Sequenzanalyse gescreent (Wooster et al., 1994). Bei zwölf Familienstämmen liegt zumindest ein Fall von männlichem Brustkrebs vor, bei vier sogar zwei oder mehr Fälle; außerdem umfassen vier mindestens ein Individuum, das von Eierstockkrebs betroffen ist und den gekoppelten BRCA2-Haplotyp aufweist. Jeder der 18 Familienstämme weist eine A-posteriori-Wahrscheinlichkeit der Beherbergung einer BRCA2-Mutation von mindestens 69% auf, wobei neun Familienstämme eine Aposteriori-Wahrscheinlichkeit von mehr als 90% aufweisen. Auf der Grundlage dieser kombinierten Wahrscheinlichkeiten ist bei 16 von 18 Familienstämmen das Aufspalten der BRCA2-Mutationen zu erwarten. Die gesamte codierende Sequenz und die assoziierten Spleißstellen wurden auf Mutationen bei vielen Individuen aus neun Familienstämmen entweder unter Verwendung von cDNA oder genomischer DNA gescreent (Tabelle 3). Individuen aus den verbliebenen neun Familienstämmen wurden auf Mutationen lediglich anhand der genomischen DNA gescreent. Diese letzteren Screening-Experimente umfassten 99% der codierenden Sequenz (alle Exons ausschließlich Exon 15) und alle bis auf zwei der Spleißstellen.
Sequenzalterationen wurden bei 9 von 18 Familienstämmen identifiziert. Bei allen bis auf eine waren Nucleotid-Deletionen beteiligt, die das Leseraster veränderten, was zu einer Verkürzung des vorhergesagten BRCA2-Proteins führte. Die einzige Ausnahme enthielt eine Deletion von drei Nucleotiden (Stamm 1019). Alle neun Mutationen wichen voneinander ab.
Ein Subset von Familienstämmen wurde auf einen Transkriptverlust getestet. cDNA-Proben standen für eine Gruppe von neun Stämmen zur Verfügung, doch enthielten drei der neun Stämme in der Gruppe Frameshift-Mutationen. Spezifische polymorphe Stellen, die in genomischer DNA als heterozygot bekannt sind, wurden in cDNA von Individuen der Stämme untersucht. Das Auftreten von Hemizygotie an diesen polymorphen Stellen wurde als Beweis für eine Mutation interpretiert, die zu einer Verminderung der mRNA-Mengen führt. Bei lediglich einem der sechs Fälle ohne nachweisbare Sequenzalteration (Stamm 2367) konnte solch eine regulatorische Mutation gefolgert werden. Außerdem zeigte einer der drei Familienstämme mit einer Frameshift-Mutation (Stamm 2044) Anzeichen eines Transkriptverlusts. Dies impliziert, dass einige Mutationen in der BRCA2-Codierungssequenz das Transkript destabilisieren und außerdem die Proteinsequenz zerstören können. Solche Mutationen wurden bei BRCA1 beobachtet (Friedman et al., 1995). Daher enthielten 56% der Stämme (10 von 18) ein verändertes BRCA2-Gen.
Rolle von BRCA2 bei Krebs. Die meisten der bisher identifizierten Tumorsuppressorgene lassen Proteinprodukte entstehen, die abwesend, nicht funktionsfähig oder eingeschränkt funktionsfähig sind. Der Großteil der TP53-Mutationen besteht in Missense-Mutationen; von einigen davon wurde gezeigt, dass sie abnormale p53-Moleküle erzeugen, die die Funktion des Wildtyp-Produkts beeinträchtigen (Shaulian et al., 1992; Srivastava et al. 1993). Ein ähnlich dominanter negativer Wirkmechanismus wurde für einige adenomatöse Polyposis coli-(APC)-Allele vorgeschlagen, die verkürzte Moleküle erzeugen (Su et al., 1993), und für Punktmutationen im Wilms-Tumorgen (WT1), die die DNA-Bindung an das Protein verändern (Little et al., 1993). Die Natur der in der BRCA2-Codierungssequenz beobachteten Mutationen stimmt mit der Erzeugung entweder dominant negativer Proteine oder nicht-funktionsfähiger Proteine überein.
BEISPIEL 5
Analyse des BRCA2-Gens
Die Struktur und Funktion des BRCA2-Gens wird gemäß der folgenden Methoden bestimmt.
Biologische Studien. Säuger-Expressionsvektoren, die BRCA2-cDNA enthalten, werden konstruiert und in geeignete Brustkarzinomzellen mit Läsionen im Gen transfiziert. Es wird sowohl Wildtyp-BRCA2-cDNA als auch veränderte BRCA2-cDNA verwendet. Die veränderte BRCA2-cDNA kann aus veränderten BRCA2-Allelen erhalten oder wie unten beschrieben erzeugt werden. Die phänotypische Reversion in Kulturen (z.B. Zellmorphologie, Verdopplungszeit, Verankerungs-unabhängiges Wachstum) und in Tieren (z.B. Tumorgenität) wird untersucht. Die Studien verwenden sowohl Wildtyp- als auch mutante Formen (Sektion B) des Gens.
Molekulargenetische Studien. Eine in vitro-Mutagenese wird zur Konstruktion von Deletions-Mutanten und Missense-Mutanten (durch einzelne Basenpaar-Substitutionen in individuellen Codons und → Alanin geladener Cluster-Scanning-Mutagenese) vorgenommen. Die Mutanten werden in biologischen, biochemischen und biophysikalischen Studien angewandt.
Mechanismus-Studien. Die Bindungsfähigkeit von BRCA2-Protein an bekannte und unbekannte DNA-Sequenzen wird untersucht. Seine Fähigkeit zur Transaktivierung von Promotoren wird mittels vorübergehender Reporter-Expressionssysteme in Säugerzellen analysiert. Herkömmliche Verfahrensweisen wie das Einfangen von Partikeln und das Hefe-Doppelhybrid-System werden zur Entdeckung und Identifizierung jeglicher funktioneller Partner angewandt. Die Beschaffenheit und Funktionen der Partner werden charakterisiert. Diese Partner wiederum sind Ziele für die Findung von Wirkstoffen.
Strukturelle Studien. Rekombinante Proteine werden in E. coli, Hefe, Insekten- und/oder Säugerzellen erzeugt und in kristallographischen und NMR-Studien verwendet. Auch eine Molekular-Modellerstellung der Proteine wird angewandt. Diese Studien erleichtern das Struktur-bezogene Wirkstoff-Design.
BEISPIEL 6
Zweistufiger Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von BRCA2 in einer Probe
Eine Patientenprobe wird gemäß dem von Antonarakis et al. (1985) beschriebenen Verfahren aufgearbeitet, durch ein 1% Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran für die Southern-Blot-Analyse übertragen. Die Membranen werden bei 150 mJ unter Verwendung eines GS-Gen-Linkers (Bio-Rad) UV-vernetzt. Eine BRCA2-Sonde, gewählt aus der in 3 gezeigten Sequenz, wird in pTZ18U subkloniert. Die Phagemiden werden in E. coli MV1190, infiziert mit M13KO7-Helfer-Phage (Bio-Rad, Richmond, CA) transformiert. Einzelsträngige DNA wird gemäß standardmäßiger Verfahrensweisen isoliert (siehe Sambrook et al., 1989).
Die Blots werden für 15–30 Minuten bei 65°C in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS) in 0,5 M NaPO₄ vorhybridisiert. Die Methoden folgen den von Nguyen et al., 1992, beschriebenen Methoden. Die Blots werden über Nacht bei 65°C in 7% SDS, 0,5 M NaPO₄ mit 25–50 ng/ml einzelsträngiger Sonden-DNA hybridisiert. Die Waschgänge nach der Hybridisierung bestehen in zwei 30-minütigen Spülungen in 5% SDS, 40 mM NaPO₄ bei 65°C, gefolgt von zwei 30-minütigen Spülungen in 1% SDS, 40 mM NaPO₄ bei 65°C.
Als nächstes werden die Blots mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 6,8) für 5 Minuten bei Raumtemperatur gespült und mit 0,2% Casein in PBS für 30–60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und in PBS 5 Minuten lang gespült. Die Blots werden dann 5–10 Minuten lang in einem Schüttelwasserbad bei 45°C mit Hybridisierungspufter, bestehend aus 6 M Harnstoff, 0,3 M NaCl und 5X Denhardt'scher Lösung, vorinkubiert (siehe Sambrook et al., 1989). Der Puffer wird entfernt und durch 50–75 μl/cm² frischen Hybridisierungspufter plus 2,5 nM des kovalent vernetzten Oligonucleotid/alkalische Phosphatase-Konjugats mit der zur universalen Primerstelle (UP-AP, Bio-Rad) komplementären Nucleotidsequenz ersetzt. Die Blots werden 20–30 Minuten lang bei 45°C hybridisiert und die Waschgänge nach der Hybridisierung als zwei 10-minütige Spülungen in 6 M Harnstoff, 1 × standardmäßiges Kochsalzzitrat (SSC), 0,1% SDS und einer 10-minütigen Spülung in 1 × SSC, 0,1% Triton^®X-100 bei 45°C inkubiert. Die Blots werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 × SSC gespült.
Die Blots werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln im Substrat-Puffer, bestehend aus 0,1 M Diethanolamin, 1 mM MgCl₂, 0,02% Natriumazid, pH 10,0, inkubiert. Einzelne Blots werden in heißversiegelbare Beutel mit Substrat-Puffer und 0,2 mM AMPPD (3-(2'-Spirodamantan)-4-methoxy-4-(3'-phosphoryl-oxy)phenyl-1,2-dioxethan, Dinatriumsalz, Bio-Rad) eingebracht. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wird die überschüssige AMPPD-Lösung entfernt. Der Blot wird über Nacht unter Röntgen-Belichtung gefilmt. Positive Bande weisen auf das Vorhandensein von BRCA2 hin.
BEISPIEL 7
Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen BRCA2
Segmente der BRCA2-codierenden Sequenz werden als Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wird mittels Gelelution gereinigt und zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen unter Anwendung einer ähnlichen Verfahrensweise wie bei Harlow und Lane, 1988, beschrieben, verwendet. Von dieser Verfahrensweise wurde gezeigt, dass sie Antikörper gegen verschiedene andere Proteine erzeugt (siehe z.B. Kraemer et al., 1993).
Kurz gesagt wird eine Strecke der BRCA2-codierenden Sequenz, die aus der in 3 gezeigten Sequenz gewählt wird, als ein Fusionsprotein in Plasmid-PET5A kloniert (Novagen, Inc., Madison, WI). Nach Induktion mit IPTG wird die Überexpression eines Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht mittels SDS/PAGE verifiziert. Das Fusionsprotein wird aus dem Gel mittels Elektroelution ausgereinigt. Die Identifikation des Proteins als das BRCA2-Fusionsprodukt wird mittels Protein-Sequenzierung am N-Terminus verifiziert. Als nächstes wird das gereinigte Protein als Immunogen bei Kaninchen verwendet. Die Kaninchen werden mit 100 μg des Proteins in kompletter Freund-Adjuvans immunisiert, wobei sie zweimal in 3-wöchigen Intervallen Auffrischungen zunächst mit 100 μg Immunogen in inkomplettem Freund-Adjuvans, gefolgt von 100 μg Immunogen in PBS, erhalten. Das Antikörper-haltige Serum wird zwei Wochen später entnommen.
Diese Verfahrensweise wird zur Erzeugung von Antikörpern gegen die mutanten Formen des BRCA2-Gens wiederholt. Diese Antikörper, in Verbindung mit Antikörpern zum Wildtyp-BRCA2, werden zum Nachweis des Vorhandenseins und der relativen Menge der mutanten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Flüssigkeiten verwendet.
BEISPIEL 8
Erzeugung von BRCA2-spezifischen monoklonalen Antikörpern
Monoklonale Antikörper werden gemäß dem folgenden Protokoll erzeugt. Mäuse werden mit einem Immunogen, umfassend intakte BRCA2 oder BRCA2-Peptide (Wildtyp oder Mutante) in Konjugation an Napfschnecken-Hämocyanin unter Verwendung von Gluaraldehyd oder EDC immunisiert, wie wohlbekannt.
Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10–100 μg Immunogen, woraufhin nach der vierten Injektion Blutproben von den Mäusen genommen werden, um zu bestimmen, ob das Serum Antikörper gegen das Immunogen enthält. Der Serumtiter wird mittels ELISA oder RIA bestimmt. Mäuse mit Seren, die auf das Vorhandensein von Antikörper gegen das Immunogen hinweisen, werden für die Hybridom-Erzeugung ausgewählt.
Immunen Mäusen werden die Milzen entnommen, und es wird eine Einzelzell-Suspension zubereitet (siehe Harlow und Lane, 1988). Es werden Zellfusionen vorgenommen, wie im wesentlichen beschrieben bei Kohler und Milstein, 1975. Kurz gesagt werden P3.65.3-Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) mit immunen Milzzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol vereinigt, wie beschrieben bei Harlow und Lane, 1988. Die Zellen werden bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well in 96-Well-Gewebekulturplatten ausplattiert. Einzelne Wells werden auf das Wachstum untersucht und die Überstände der Wells mit Wachstum auf das Vorhandensein von BRCA2-spezifischen Antikörpern mittels ELISA oder RIA unter Verwendung von Wildtyp- oder mutantem BRCA2-Zielprotein getestet. Die Zellen in positiven Wells werden zur Feststellung und Bestätigung der Monoklonalität expandiert und subkloniert.
Die Klone mit den gewünschten Spezifitäten werden als Aszites in Mäusen oder in einem Hohlfasersystem expandiert und gezüchtet, um ausreichende Mengen an Antikörpern für die Charakterisierung und Assay-Entwicklung zu erzeugen.
BEISPIEL 9
Sandwich-Assay für BRCA2
Monoklonaler Antikörper wird an eine feste Oberfläche, z.B. eine Platte, ein Röhrchen, ein Kügelchen oder einen Partikel, gebunden. Vorzugsweise wird der Antikörper an die Well-Oberfläche einer 96-Well-ELISA-Platte gebunden. Eine 100-μl-Probe (z.B. Serum, Urin, Gewebezytosol), enthaltend das BRCA2-Peptid/Protein (Wildtyp oder Mutante) wird dem Festphasen-Antikörper zugegeben. Die Probe wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wird die Probenflüssigkeit abgeschöpft und die Festphase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. 100 μl eines zweiten monoklonalen Antikörpers (gegen eine unterschiedliche Determinante auf dem BRCA2-Peptid/Protein) wird der Festphase zugegeben. Dieser Antikörper wird mit einem Detektor-Molekül (z.B. ¹²⁵I, Enzym, Fluorophor oder einem Chromophor) markiert und die Festphase mit dem zweiten Antikörper zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird abgeschöpft und die Festphase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Die Menge an gebundener Markierung, die proportional zur Menge an in der Probe vorhandenem BRCA2-Peptid/Protein ist, wird quantifiziert. Separate Assays werden unter Verwendung monoklonaler Antikörper vorgenommen, die spezifisch für das Wildtyp-BRCA2 sind, als auch monoklonaler Antikörper, die spezifisch für jede der in BRCA2 identifizierten Mutationen sind.
BEISPIEL 10
Die 6174delT-Mutation ist bei von Brustkrebs betroffenen Ashkenazi-jüdischen Frauen häufig vorzufinden
Es wurde festgestellt, dass die 6174delT-Mutation (siehe Tabelle 3) in vielen Fällen von an Brustkrebs erkrankten Ashkenazi-jüdischen Frauen vorliegt (Neuhausen et al., 1996). Die Ermittlung für diese Studie umfasste zwei Gruppen von Probanden. Die erste Gruppe wurde ausgehend sowohl vom Alter beim Auftreten als auch einer positiven Familiengeschichte ermittelt. Diese erste Gruppe bestand in Probanden, bei denen Brustkrebs im Alter von mit oder vor 41 Jahren mit oder ohne einer Familiengeschichte von Brustkrebs auftrat. Die Einschlusskriterien für die zweite Gruppe waren, dass der Proband in einem Alter von zwischen 41 und 51 von Brustkrebs betroffen war, bei einem oder mehreren von Brust- oder Eierstockkrebs betroffenen Verwandten ersten Grades im oder vor dem Alter von 50; oder der Proband in einem Alter von zwischen 41 und 51 von Brustkrebs betroffen war, bei zwei oder mehreren von Brust- oder Eierstockkrebs betroffenen Verwandten zweiten Grades, davon einer im oder vor einem Alter von 50 Jahren; oder der Proband im Alter von zwischen 41 und 51 sowohl von primärem Brust- als auch primärem Eierstockkrebs betroffen war. Die Probanden wurden durch medizinische Onkologie und genetische Beratungskliniken ermittelt, wobei man sich bemühte, allen teilnahmeberechtigten Patienten die Studienteilnahme anzubieten. Die Familiengeschichte wurde durch einen Selbstbericht-Fragebogen erhalten. Die histologische Bestätigung der Diagnose wurde für die Probanden in allen Fällen erhalten. Der religiöse Hintergrund wurde bei allen Probanden durch Selbstbericht oder Interview bestätigt.
Mutations-Nachweis
Die BRCA2-6174delT-Mutation wurde durch Amplifizieren der genomischen DNA von jedem Patienten gemäß standardmäßiger Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Verfahrensweisen nachgewiesen (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986; Weber und May, 1989). Die für die PCR verwendeten Primer sind:
BC11-RP: GGGAAGCTTCATAAGTCAGTC (SEQ ID NR. 115) (Forward Primer) und
BC11-LP: TTTGTAATGAAGCATCTGATACC (SEQ ID NR. 116) (Reverse Primer).
Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 10,0 μl, enthaltend 20 ng DNA, unter Annealing bei 55°C durchgeführt. Dies ergibt ein PCR-Produkt von 97 bp Länge in Wildtyp-Proben und 96 bp Länge, wenn die 6174delT-Mutation vorhanden ist. Die radiomarkierten PCR-Produkte wurden auf standardmäßigen 6% denaturierenden Polyacrylamid-Sequenziergelen bei 65 W für 2 Stunden elektrophoretisch behandelt. Die Gele wurden dann getrocknet und autoradiographiert. Alle Fälle, die die Deletion von 1 bp zeigten, wurden zur Bestätigung der 6174delT-Mutation sequenziert. Für diese Sequenzierung wurde die Hälfte der Proben mit einem Satz von PCR-Primern amplifiziert und der codierende Strang sequenziert, wohingegen die andere Hälfte der Proben wurde mit einem zweiten Satz von PCR-Primern amplifiziert und der nicht-codierende Strang sequenziert wurde. Bei einem Satz waren die PCR-Primer:
TD-SFB: AATGATGAATGTAGCACGC (SEQ ID NR. 117) (Forward Primer) und
CGORF-RH: GTCTGAATGTTCGTTACT (SEQ ID NR. 118) (Reverse Primer).
Dies ergibt ein amplifiziertes Produkt von 342 bp beim Wildtyp und 341 bp bei die 6174delT-Mutation enthaltenden Proben. Bei diesem Satz von Proben wurde die amplifizierte DNA unter Verwendung des CGORF-RH-Primers für den Sequenzier-Primer sequenziert. Die andere Hälfte der Proben wurde unter Verwendung des BC11-RP-Forward Primer und des CGORF-RH-Reverse Primer amplifiziert, was zu einem Fragment von 183 bp bei den Wildtyp-Proben und 182 bp bei den die 6174delT-Mutation enthaltenden Proben führte. Dieses wurde unter Verwendung von BC11-RP als dem Sequenzier-Primer sequenziert.
Ergebnisse
Sechs von acht Frauen mit Ashkenazi-jüdischer Abstammung mit Brustkrebs vor dem Alter von 42 Jahren wiesen die 6174delT-Mutation auf. Dies steht null Fällen der Mutation in einer Kontrollgruppe nicht jüdischer Frauen gegenüber, die Brustkrebs vor einem Alter von 42 Jahren aufwiesen. Diese Fälle wurden ohne Berücksichtigung der Familiengeschichte ermittelt. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 4 gezeigt. Vier der sechs Fälle mit der 6174delT-Mutation wiesen eine Familiengeschichte mit Brust- oder Eierstockkrebs bei einem Verwandten ersten oder zweiten Grades auf. Bei jedem der beiden Familienstämme, für die vielfache Proben zur Analyse zur Verfügung standen, cosegregierte die 6174delT-Mutation mit zwei oder mehreren Fällen von Brust- oder Eierstockkrebs. Eine zweite Kohorte von 27 Ashkenazim mit Brustkrebs im Alter von 42 bis 50 Jahren und einer Geschichte von mindestens einem weiteren, von Brust- oder Eierstockkrebs betroffenen Verwandten bot eine zusätzliche Einschätzung der Häufigkeit der 6174delT-Mutation. In dieser Gruppe von 27 Frauen waren zwei für die BRCA2-6174delT-Mutation heterozygot. Eines dieser Individuen wies Verwandte ersten Grades sowohl mit Eierstock- als auch Brustkrebs auf. Aus den vorgestellten Daten und unter Zugrundelegung einer Penetranz ähnlich den BRCA1-Mutationen (Offit et al., 1996; Langston et al., 1996), kann die Häufigkeit der 6174delT-Mutation bei Ashkenazim auf etwa 3 pro Tausend geschätzt werden. Ist die Penetranz dieser Mutation allerdings geringer als bei BRCA1, so wird die Häufigkeit dieser Mutation höher sein. Eine präzisere Schätzung der Trägerhäufigkeit der 6174delT-Mutation bei Individuen von Ashkenazi-jüdischer Abstammung wird sich aus groß angelegten Populationsstudien gewinnen lassen.
TABELLE 4
Schlüssel:

a – Ermittelt unabhängig von Familiengeschichte
b – Die Familiengeschichte für diese Gruppe war definiert als einen Verwandten ersten Grades oder zwei Verwandte zweiten Grades mit Brust- oder Eierstockkrebs-Diagnose, einer davon vor dem Alter von 50 Jahren.

BEISPIEL 11
BRCA2 zeigt eine niedrige somatische Mutationsrate bei Brustkarzinom und anderen Krebsarten einschließlich Eierstock- und Pankreaskrebs Bei BRCA2 handelt es sich um ein Tumorsuppressorgen. Eine homozygote Deletion dieses Gens kann zu Brustkrebs als auch anderen Krebsarten führen. Eine homozygote Deletion in einem Pankreas-Xenotransplantat war bei der Bemühung förderlich, BRCA2 durch Positionsklonierung zu isolieren. Krebs kann auch entstehen, wenn ein Verlust eines BRCA2-Allels und eine Mutation im verbliebenen Allel vorliegt (Verlust der Heterozygotie oder LOH). Mutationen in beiden Allelen können ebenfalls zur Entwicklung von Krebs führen. Für die vorliegenden Studien ergab eine Analyse von 150 Zelllinien, die von verschiedenen Krebsarten stammten, keine Fälle, in denen ein homozygoter Verlust des BRCA2-Gens vorlag. Da ein homozygoter Verlust offensichtlich selten ist, wurden Untersuchungen vorgenommen, um kleinere Läsionen wie Punktmutationen in BRCA2 zu untersuchen. Da kombinierte heterozygote Mutationen und homozygote Mutationen selten auftreten, involviert die Tumorsuppressorgen-Inaktivierung nahezu immer LOH. Das verbliebene Allel enthält, wenn inaktiv, typischerweise disruptive Mutationen. Um diese zu identifizieren, ist die Vorauswahl von Tumoren oder Zelllinien nützlich, die LOH am interessierenden Locus zeigen.
Identifikation von Tumoren und Zelllinien, die LOH zeigen
Eine Gruppe von 104 primären Brusttumor-Proben und ein Satz von 269 Zelllinien wurde auf LOH in der BRCA2-Region getestet. Für die Primärtumoren wurden Amplifikationen dreier kurzer Tandem-Repeat-Marker (STRs) unter Anwendung von Fluoreszenz quantitativ verglichen. Etwa 10 ng der genomischen DNA wurden mittels PCR mit den folgenden drei Sätzen fuoreszent markierter STRs amplifiziert:
Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines ABI 377-Sequenziergeräts zerlegt und mit Genescan-Software (ABI) quantifiziert. Für die Tumoren wurden klare Peak-Höhendifferenzen zwischen den von normalen und Tumor-Proben amplifizierten Allelen als LOH zeigend bewertet. Für die Zelllinien wurde, wenn ein STR heterozygot war, die Probe als nicht-LOH bewertet. In lediglich einem Fall lag ausgehend von der späteren Analyse der Einzelbasen-Polymorphismen eine falsch erkannte Zelllinie oder Tumor vor. Die Heterozygotie-Indizes für die Marker sind: STR4247 = 0,89; STR257 = 0,72; STR561A = 0,88 (S. Neuhausen, persönliche Mitteilung: B. Swedlund, unveröffentlichte Daten). Ausgehend von ihren kombinierten Heterozygotie-Indizes beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass die Marker in einem bestimmten Individuum alle homozygot sind (unter der Annahme eines Koppplungsgleichgewichts) lediglich 1 aus 250. Aufgrund des Vorhandenseins normaler Zellen in der Primärtumorprobe, eliminiert LOH das Signal aus dem im Tumor verloren gegangenen Allel selten vollständig. Eher sind die relativen Intensitäten der beiden Allele verändert. Dies lässt sich durch Vergleich der allelen Peakhöhen von normalem Gewebe mit Peakhöhen aus dem Tumor deutlich erkennen (5A–5D). Ausgehend von dieser Analyse wurden 30 Tumoren (29%) als mit LOH am BRCA2-Locus klassifiziert (Tabelle 5), eine Zahl, die früheren Schätzungen ähnlich ist (Collins et al., 1995; Cleton-Jansen et al., 1995).
LOH wurde im Satz der Zelllinien in unterschiedlicher Weise ausgewertet. Da eine Homozygotie aller dreier SDRs unwahrscheinlich war und da keine normalen Zellen vorhanden waren, wurde die offensichtliche Homozygotie bei allen STRs als LOH in der BRCA2-Region interpretiert. Unter Anlegen dieses Kriteriums zeigten 85/269 der Zelllinien LOH (siehe Tabelle 5). Die Häufigkeiten variierten entsprechend dem bestimmten Typ von in Betracht gezogener Tumorzelle. Zum Beispiel zeigten 4/6 Eierstock-Zelllinien und 31/62 Lungenkrebslinien LOH, im Vergleich zu 17/81 Melanomlinien und 2/11 Brustkrebslinien.
Sequenzanalyse von LOH-Primärbrusttumoren und Zelllinien
Die oben identifizierten 30 Primärbrustkrebsarten, die LOH in der BRCA2-Region zeigten, wurden mittels DNA-Sequenzanalyse auf Sequenz-Varianten gescreent. Mehr als 95% der Codierungssequenz und Spleißstellen wurden untersucht. Die DNA-Sequenzierung wurde entweder auf dem ABI 377 (Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer) oder manuell vorgenommen. Für das radioaktive Mutations-Screening wurden die amplifizierten Produkte mittels Qiagen-Kügelchen (Qiagen, Inc.) gereinigt. Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Cyclist Sequenzier-Kits (Stratagene) generiert und auf 6% Polyacrylamidgelen zerlegt. Parallel dazu wurde eine nicht-radioaktive Sequenzierung unter Verwendung fluoreszierender Marker-Farbstoffe mittels des TaqFS-Sequenzier-Kits, gefolgt von der Elektrophorese auf ABI 377-Sequenzierern, vorgenommen. Die Proben wurden in 96-Well-Schalen zur Erleichterung von PCR und Sequenzierung eingebracht. Ausfälle bestimmter PCR- und Sequenzier-Reaktionen wurden wiederholt, bis eine > 95% Abdeckung für jede Probe erreicht war. Die Sequenz-Information wurde mit der Sequencer-Software (Gene Codes Corporation) analysiert. Alle detektierten Mutationen wurden durch Sequenzierung eines neu amplifizierten PCR-Produkts bestätigt, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Sequenz-Alteration auf einen PCR-Artefakt zurückzuführen war.
TABELLE 5
LOH-Analyse der Zelllinien und Primärbrusttumoren. Der prozentuale Anteil LOH wurde auf zweierlei Weise errechnet: als Gesamtwert und als Mittelwert der prozentualen Anteile (mittl.).
Von den 30 Proben enthielten zwei Exemplare Frameshift-Mutationen, davon eine eine Nonsense-Mutation und zwei Missense-Veränderungen (obschon einer dieser Tumoren außerdem einen Frameshift enthielt). Die Nonsense-Mutation deletierte 156 Codons am C-Terminus, was nahe legt, dass das C-terminale Ende von BRCA2 für die Tumorsuppressor-Aktivität wichtig ist. Alle Sequenz-Varianten waren auch in der entsprechenden normalen DNA von diesen Krebspatienten vorhanden. Um die unwahrscheinliche Möglichkeit auszuschließen, dass die Vorauswahl auf LOH einen systematischen ungünstigen Einfluss gegenüber dem Nachweis von Mutationen mit sich brachte (z.B. dominantes Verhalten von Mutationen, kombinierte Heterozygote), wurden außerdem 12 als bei BRCA2 heterozygot nachgewiesene Proben gescreent. Drei von diesen ergaben Missense-Veränderungen, die auch in den normalen Proben festgestellt wurden. Daher wurden bei einem Satz von 42 Brustkarzinom-Proben, von denen 30 LOH am BRCA2-Locus zeigten, keine somatischen Mutationen identifiziert. Die Frameshift- und Nonsense-Veränderungen sind wahrscheinlich prädisponierende Mutationen, die die Entwicklung von Brustkrebs bei diesen Patienten beeinflussten. Die Missense-Varianten sind selten; sie wurden jeweils lediglich einmal während der Analyse von 115 Chromosomen beobachtet.
Aus diesen Daten ist die Unterscheidung zwischen seltenen neutralen Polymorphismen und prädisponierenden Mutationen nicht möglich.
Von den 85 Zelllinien, die LOH zeigten (siehe Tabelle 5), wurden 58 außerdem auf Sequenzveränderungen gescreent. Mehr als 95% der codierenden Sequenz jeder Probe wurde gescreent. Lediglich eine einzige Frameshift-Mutation wurde anhand dieser DNA-Sequenzanalyse identifiziert. Diese Mutation (6174delT) lag in einer Pankreaskrebslinie vor und ist identisch zu einer in der BT111-Primärtumorprobe festgestellten Mutation und zu einem zuvor detektierten Keimbahn-Frameshift (Tavtigian et al., 1996). Dies legt nahe, dass dieser spezielle Frameshift eine relativ häufige Keimbahn-BRCA2-Mutation sein könnte. Außerdem wurde eine Reihe von Missense-Sequenz-Varianten detektiert (Tabellen 6A und 6B).
Der Nachweis einer möglichen Keimbahn-BRCA2-Mutation in einer Pankreas-Tumorzelllinie legt nahe, dass BRCA2-Mutationen für Pankreaskrebs prädisponieren können, eine Möglichkeit, die nicht gründlich untersucht wurde. Diese Mutation verleiht der Beteiligung von BRCA2 an sporadischem Pankreaskrebs ebenfalls Gewicht, wie bereits zuvor durch die bei einem Pankreas-Xenotransplantat beobachtete homozygote Deletion impliziert (Schutte of al., 1995). Da lediglich drei Pankreas-Zelllinien in unserer Studie untersucht wurden, ist eine weitere Erforschung der BRCA2-Mutationen bei Pankreaskrebsarten gerechtfertigt.
TABELLE 6A
In BRCA2 identifizierte Keimbahn-Mutationen. Aufgelistet sind die Mutations-Positionen auf der Grundlage des Genbank-Eintrags von BRCA2 (Schutte et al., 1995).
TABELLE 6B
Häufige Polymorphismen und stille Substitutionen, wie in BRCA2 durch DNA-Sequenzierung nachgewiesen. Da einige rare stille Varianten die Genfunktion beeinflussen können (z.B. Spleißen (Richard und Beckmann, 1995)), ist diesen kein "PM" vorangestellt. Die Häufigkeiten der gezeigten Polymorphismen beziehen das zweite des Nucleotid-Paars ein. Die in einer früher Studie berichteten Häufigkeiten sind in Klammern gezeigt (Tavtigian et al., 1996). Die Numerierung ist dieselbe wie in Tabelle 6A.
Wie oben schon beschrieben, stellt die vorliegende Offenbarung die Materialien und Methoden zur Verwendung beim Analysieren von BRCA2-Allelen eines Individuums bereit. Als mit einem höheren als normalen Risiko von BRCA2-Gen-assoziiertem Brustkrebs erkannte Individuen wären dadurch in der Lage, ihren Lebensstil entsprechend zu verändern. Der signifikanteste nicht-genetische Risikofaktor für diese Krebsart betrifft die schützende Wirkung einer frühen Terminschwangerschaft. Folglich könnten Risikoträgerinnen eine frühe Kindsgeburt oder eine auf die Simulierung der hormonellen Wirkungen einer frühen Terminschwangerschaft hin ausgerichtete Therapie in Betracht ziehen. Frauen mit einem hohen Risiko würden ebenfalls den frühen Nachweis anstreben und wären höher motiviert, die Selbstuntersuchung der Brust zu erlernen und zu praktizieren. Diese Frauen wären auch hochgradig motiviert, sich einer regelmäßigen Mammographie zu unterziehen, und zwar möglicherweise von einem früheren Alter an als die Allgemeinbevölkerung. Auch ein Eierstock-Screening könnte häufiger vorgenommen werden.
Frauen mit Brustkrebs können sich verschiedenen operativen Prozeduren unterziehen, wenn sie prädisponiert sind und dadurch die Wahrscheinlichkeit, weitere Krebsarten zu entwickeln im Vergleich zu nicht vorliegender Prädisposition zunimmt. Weitere Therapieformen können entweder unter Verwendung von Peptiden oder von kleinen Molekülen (rationelles Wirkstoff-Design) entwickelt werden. Bei den Peptiden könnte es sich um das fehlende Genprodukt selbst oder um einen Abschnitt des fehlenden Genprodukts handeln. Alternativ könnte das therapeutische Mittel ein anderes Molekül sein, das die Funktion des deletären Gens nachahmt, nämlich entweder ein Peptid- oder ein Nicht-Peptid-Molekül, das der gesundheitsschädigenden Wirkung des ererbten Locus eine Gegenwirkung entgegensetzt. Die Therapie könnte auch auf Gentechnik basieren, indem ein normales BRCA2-Allel in Individuen zum Erhalt eines Proteins eingeführt wird, das der Wirkung des deletären Allels entgegenwirkt. Diese Gentherapien können viele Formen annehmen und können entweder auf die Prävention der Tumorentwicklung, auf die Heilung eines bereits ausgebrochenen Krebses oder auf das Aufhalten der Metastasenbildung eines Krebses gerichtet sein.
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Liste der Patente und Patentanmeldungen

US-Patent Nr. 3,817,837
US-Patent Nr. 3,850,752
US-Patent Nr. 3,939,350
US-Patent Nr. 3,996,345
US-Patent Nr. 4,275,149
US-Patent Nr. 4,277,437
US-Patent Nr. 4,366,241
US-Patent Nr. 4,376,110
US-Patent Nr. 4,486,530
US-Patent Nr. 4,683,195
US-Patent Nr. 4,683,202
US-Patent Nr. 4,816,567
US-Patent Nr. 4,868,105
US-Patent Nr. 5,252,479
EPA-Veröffentlichung Nr. 225,807
Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 0332435
Geysen, H., veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 84/03564, veröffentlicht am 13. Sept. 1984 Hitzeman et al., EP 73.674A
Veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 93/07282

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer isolierten Nucleinsäure, die die in SEQ ID NO:1 dargestellte codierende Sequenz von der Nucleotidposition 229 bis zur Nucleotidposition 10482 umfasst und die ferner die mit einer Veranlagung zu Brustkrebs assoziierte Mutation umfasst, wobei T an der Nucleotidposition 6174 deletiert ist, zur Diagnose einer Veranlagung zu Brustkrebs bei Ashkenazi-jüdischen Frauen in vitro.