DE69936781T2

DE69936781T2 - Kvlqt1 - im zusammenhang mit 'long qt syndrom'

Info

Publication number: DE69936781T2
Application number: DE69936781T
Authority: DE
Inventors: Mark T. Brookline KEATING; Michael C. Salt Lake City SANGUINETTI; Mark E. Encinitas CURRAN; Gregory M. Northboro LANDES; Timothy D. Hopkinton CONNORS; Timothy C. Hockessin BURN; Igor Allston SPLAWSKI; Qing Wang (Cn)
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Genzyme Corp
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF; Genzyme Corp
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2019-05-13
Also published as: EP1100538B1; EP1100538A2; US20030170708A1; US6972176B2; US6420124B1; EP1100538A4; DE69936781D1; US6277978B1; CA2336263A1; WO2000006199A1; US6582913B1; AU3980099A; JP2002521045A; AU758048B2; WO2000006199A8; ATE369420T1; US6451534B1

Description

Querverweise auf andere Patentanmeldungen
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Teilweiterbehandlung der Patentanmeldung Seriennr. 08/921,068, eingereicht am 29. August 1997, welche eine Teilweiterbehandlung der Patentanmeldung Seriennr. 08/739,383, eingereicht am 29. Oktober 1996 ist, welche sich auf die vorläufige Patentanmeldung Seriennr. 60/019,014, eingereicht am 22. Dezember 1995 bezieht; und die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die vorläufige Patentanmeldung Seriennr. 60/094,477, eingereicht am 29. Juli 1998.
Diese Patentanmeldung wurde erstellt durch staatliche Unterstützung unter Grant Nr. P50-HL52338-02 (SCOR), finanziert durch die National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. Die amerikanische Bundesregierung kann gewisse Rechte an dieser Erfindung haben.
STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Gene und Genprodukte, die im Zusammenhang mit dem Long QT Syndrom (LQTS) stehen und auf ein Verfahren für die Diagnose von LQTS. Das LQTS wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Analysieren der DNA-Sequenz des KVLQT1-Gens eines zu untersuchenden Individuums und Vergleich der jeweiligen DNA-Sequenz mit der bekannten DNA-Sequenz eines normalen KVLQT1- Gens diagnostiziert. Alternativ dazu kann das KVLQT1-Gen eines zu untersuchenden Individuums auf Mutationen gescreent werden, welche LQTS auslösen. Durch die Vorhersage von LQTS wird es Medizinern möglich, diese Krankheit durch den Einsatz verfügbarer medizinischer Therapie zu verhindern. In dieser Erfindung wird des Weiteren beschrieben, dass das KVLQT1- sowie das KCNE1-(auch bekannt als minK)-Protein sich zusammenlagern um einen kardialen I_KS-Kaliumkanal zu bilden. Dieses Wissen kann dazu benutzt werden, um diese beiden Proteine in einer Zelle zu coexprimieren und eine solche transformierte Zelle kann für das Screening von Wirkstoffen, welche bei der Behandlung oder zur Prävention von LQTS hilfreich sein werden, verwendet werden.
Die Publikationen und anderen Materialien, die hierin verwendet werden, um den Stand der Technik der Erfindung zu veranschaulichen oder um aus Gründen der Zweckdienlichkeit zusätzliche Details zur Verfügung zu stellen, sind in der anhängigen Referenzliste in entsprechenden Gruppen zusammengefasst.
Herzrhythmusstörungen sind eine häufige Ursache für Morbidität und Mortalität und sind für 11% aller natürlichen Todesfälle (Kannel, 1987; Willich et al., 1987) verantwortlich. Im Allgemeinen ist die präsymptomatische Diagnose und die Behandlung von Individuen mit lebensbedrohlichen ventrikulären Tachyarrhythmien schlecht und in einigen Fällen wird durch das medizinische Management das Risiko für Arrhythmien und Tod tatsächlich erhöht (Cardiac Arrhythmia Suppression Trial II Investigators, 1992). Aufgrund dieser Faktoren haben das Erkennen von Personen mit einem Risiko für Herzrhythmusstörungen und die Prävention von Arrhythmien hohe Priorität.
Zu dem Risiko für das Entwickeln einer Herzrhythmusstörung tragen sowohl genetische als auch erworbene Faktoren bei. Das Long QT Syndrom (LQTS) ist eine angeborene Herzrhythmusstörung, die zu einer abrupten Bewusstlosigkeit, Synkope, Anfällen und plötzlichem Tod durch ventrikuläre Tachyarrhythmien, insbesondere Torsade de Pointe und Kammerflimmern (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991) führt. Diese Krankheit tritt gewöhnlich bei jungen ansonsten gesunden Personen (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975) auf. Die meisten LQT-Genträger zeigen eine Verlängerung der QT-Zeit im Elektrokardiogramm, ein Zeichen für abnorme Herzrepolarisation (Vincent et al., 1992). Die klinischen Merkmale von LQTS stammen von episodischen Herzrhythmusstörungen, insbesondere von mit der Repolarisation in Verbindung stehenden ventrikulären Tachyarrhythmien, wie Torsode-de-point-Tachykardie, die nach dem charakteristischen wellenförmigen Auftreten dieser Arrhythmien auf den Elektrokardiogrammen und des Kammerflimmerns (Schwartz et al., 1975: Moss and McDonald, 1971) benannt ist. Bei einer Torsade-de-pointe-Tachykardie kann es auch zu einer Degeneration in ein Kammerflimmern, eine besonders tödliche Arrhythmie, kommen. Obwohl LQTS nicht oft diagnostiziert wird, treten Herzrhythmusstörungen sehr häufig auf; in den USA erleiden jedes Jahr mehr als 300.000 Menschen einen plötzlichen Tod (Kannel, et al., 1987; Willich et al., 1987) und in vielen Fällen kann der dabei zugrunde liegende Mechanismus eine abnorme kardiale Repolarisation sein. Das LQTS bietet daher eine einzigartige Gelegenheit, lebensbedrohliche Herzrhythmusstörungen auf der molekularen Ebene zu studieren.
Sowohl die vererbte als auch die erworbene Form von LQTS wurden bereits definiert. Das erworbene LQTS und sekundäre Arrhythmien können aus kardialer Ischämie, Bradykardie und Stoffwechselabnormitäten, wie beispielsweise niedrigen Kalium- oder Kalziumkonzentrationen im Serum (Zipes, 1987) resultieren. Das LQTS kann auch durch eine Behandlung mit bestimmten Medikamenten, einschließlich Antibiotika, Antihistaminika, Allgemeinnarkosemitteln und am häufigsten durch Antiarrhythmika (Zipes, 1987) ausgelöst werden. Die erblichen Formen von LQTS können von Mutationen in mindestens fünf verschiedenen Genen verursacht werden. In früheren Studien wurden die LQT-Loci auf den Chromosomen 11p15.5 (KVLQT1 oder LQT1) (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), 7q35-36 (HERG oder LQT2), 3p21-24 (SCN5A oder LQT3) (Jiang et al., 1994) gemoppt. Von diesen Chromosomen ist das KVLQT1 der häufigste Verursacher des vererbten LQTS. Unsere Daten deuten darauf hin, dass Mutationen in diesem Gen für mehr als 50% des erblich bedingten LQT-Syndroms verantwortlich sind. Kürzlich wurde ein vierter LQT-Locus (LQT4) auf dem Chromosom 4q25-27 (Schott et. al., 1995) gemoppt. Auch KCNE1 (LQT5) wurde mit dem Long QT Syndrom (Splawski et al., 1997b; Duggal et al., 1998) in Verbindung gebracht. Diese Gene kodieren für Ionenkanäle, die an der Erzeugung von kardialem Aktionspotenzial beteiligt sind. Mutationen können zu Kanaldysfunktionen und verzögerter Repolarisation von Muskelzellen führen. Aufgrund der regionalen Heterogenität der Kanalexpression am Myokard bildet die abnorme kardiale Repolarisation eine Grundlage für Arrhythmien. KVLQT1 und KCNE1 werden auch im Innenohr exprimiert (Neyroud et al., 1997; Vetter et al., 1996). Wir und andere haben gezeigt, dass homozygote oder zusammengesetzte heterozygote Mutationen in jedem einzelnen dieser Gene zu Taubheit führen und den schweren kardialen Phänotyp des Jervell-und-Lange-Nielsen-Syndrom (Neyroud et al., 1997, Splawski et al., 1997a; Schultze-Bahr et al., 1997; Tyson et al., 1997) hervorrufen kann. Durch den Verlust von funktionellen Kanälen im Ohr wird offensichtlich die Produktion von Endolymphe unterbrochen und es kommt so zu Taubheit.
Die präsymptomatische Diagnose von LQTS stützt sich gegenwärtig auf die Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen. Bei einer QTc (frequenzkorrigierte QT-Zeit, Bazzett, 1920) von mehr als 0,44 Sekunden wird ein Individuum traditionell als betroffen eingestuft. Die meisten LQTS-Patienten sind allerdings junge und ansonsten gesunde Personen, bei denen noch keine Elektrokardiogramme aufgezeichnet wurden. Darüber hinaus haben genetische Studien gezeigt, dass die QTc weder sensitiv noch spezifisch (Vincent et al., 1992) ist. Das Spektrum von QTc-Intervallen bei Genträgern und Nicht-Genträgern überlappt sich und führt zu falschen Zuordnungen. Nicht-Genträger können verlängerte QTc-Intervalle aufweisen und als entsprechend betroffen diagnostiziert werden. Umgekehrt weisen einige LQT-Genträger QTc-Intervalle von ≤ 0,44 Sekunden auf und haben dennoch ein Risiko für Arrhythmie. Die korrekte präsymptomatische Diagnose ist wichtig für die effektive genspezifische Behandlung von LQTS.
Es gibt Berichte über autosomal dominante und autosomal rezessive Formen dieser Krankheit. Das autosomal rezessive LQTS (auch bekannt als Jervell-und-Lange-Nielsen-Syndrom) ist mit kongenitaler neuraler Taubheit assoziiert worden; diese Form des LQTS ist selten (Jervell und Lange-Nielsen, 1957). Häufiger ist das autosomal dominante LQTS (Romano-Ward-Syndrom) und diese Form ist nicht mit anderen phänotypischen Abnormitäten assoziiert (Romano et al., 1963; Ward, 1964). Eine Krankheit, die ähnlich dem vererbten LQTS ist, kann gewöhnlich infolge einer pharmakologischen Therapie (Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987) erworben werden.
Die Daten deuten auch auf einen Zusammenhang mit dem Mechanismus von Arrhythmien bei LQTS hin. Es wurden in jüngster Zeit zwei Hypothesen für LQTS vorgeschlagen (Schwartz et al., 1994). Ein Vorschlag beruht auf der Annahme, dass eine Prädominanz der linksseitigen autonomen Innervation abnorme kardiale Repolarisation und Arrhythmien verursacht. Gestützt wird diese Hypothese durch den Befund, dass Arrhythmien bei Hunden induziert werden können, wenn das rechte Ganglion stellatum entfernt wird. Zusätzlich lassen Einzelberichte vermuten, dass manche LQTS-Patienten effektiv mit Betablockern und durch Ektomie des linken Ganglion stellatum behandelt werden können (Schwartz et al., 1994). Die zweite Hypothese für mit LQTS in Zusammenhang stehenden Arrhythmien beruht auf der Vermutung, dass Mutationen in herzspezifischen Ionenkanalgenen oder Genen, die kardiale Ionenkanäle beeinflussen, eine verzögerte Repolarisation von Muskelzellen hervorrufen. Die verzögerte Repolarisation von Muskelzellen könnte die Reaktivierung von Kalziumkanälen vom L-Typ fördern und somit zu sekundären Depolarisationen führen (January und Riddle, 1989). Diese sekundären Depolarisationen sind der mögliche Zellmechanismus für Torsode-de-pointe-Arrhythmien (Surawicz, 1989). Diese Hypothese wird unterstützt durch die Beobachtung, dass die Blockade der Kaliumkanäle durch Pharmaka eine QT-Verlängerung und durch Repolarisation bedingte Arrhythmien beim Menschen und in Tiermodellen induzieren kann (Antzelevitch und Sicouri, 1994). Die Entdeckung, dass eine Form des LQTS durch Mutationen in einem kardialen Kaliumkanalgen verursacht wird, untermauert die Muskelzellen-Hypothese.
Theoretisch könnten Mutationen in einem kardialen Natriumkanalgen das LQTS verursachen. Spannungsgesteuerte Natriumkanäle vermitteln eine rasche Depolarisation in ventrikulären Myozyten und besitzen auch eine geringe Leitfähigkeit während der Plateau-Phase des Aktionspotenzials (Attwell et al., 1979). Leichte Abnormitäten der Natriumkanalfunktion (z. B. verzögerte Natriumkanal-Inaktivierung oder veränderte spannungsabhängige Kanalinaktivierung) könnten die kardiale Repolarisation verzögern und zu einem verlängerten QT-Intervall und Arrhythmien führen. 1992 klonten und charakterisierten Gellens und Kollegen ein Gen, SCN5A, auf dem kardiale Natriumkanäle kodiert sind, (Gellens et al., 1992). Die Struktur dieses Gens war ähnlich derjenigen anderer bereits zuvor charakterisierter Gene für Natriumkanäle und es kodiert für ein großes Protein von 2016 Aminosäuren. Diese Kanalproteine enthalten vier homologe Domänen (DI-DIV), wovon jedes sechs putative transmembrane Segmente (S1-S6) enthält. SCN5A wurde kürzlich durch Genmapping dem Chromosom 3p21 zugeordnet, was es zu einem ausgezeichneten Kandidatengen für LQT3 (George et al., 1995) macht; und es wurde anschließend nachgewiesen, dass dieses Gen mit LQT3 (Wang et al., 1995a) in Zusammenhang steht.
1994 identifizierten Warmke und Ganetzky eine neue humane cDNA, das „Human-Ether-A-Go-Go-Gen" (HERG, Warmke und Ganetzky, 1994). HERG wurde auf dem humanen Chromosom 7 durch PCR-Analyse eines somatischen Zellhybridpanels (Warmke und Ganetzky, 1994) lokalisiert, was es zu einem Kandidaten für LQT2 macht. Das Gen weist eine vorhergesagte Aminsosäuresequenz-Homologie zu Kaliumkanälen auf. HERG wurde aus einer Hippocampus-cDNA-Bibliothek anhand der Homologie zu dem Drosophila-Ether-A-Go-Go-Gen (eag) isoliert, welches für einen Kalzium-modulierten Kaliumkanal kodiert (Bruggemann et al., 1993). HERG ist jedoch nicht das Humanhomolog zu eag, da es eine nur ~50 %ige Homologie zu dessen Aminosäuresequenz aufweist. Es wurde gezeigt, dass HERG mit LQT2 assoziiert ist (Curran et al., 1995).
Es wurde herausgefunden, dass LQT1 mit dem Gen KVLQT1 (Q. Wang et al., 1996) in Verbindung steht. Identifiziert und charakterisiert wurden sechzehn Familien mit Mutationen in KVLQT1 und es wurde nachgewiesen, dass in allen sechzehn Familien eine durchgehende Verbindung zwischen LQT1 und KVLQT1 bestand. KVLQT1 wurde durch Genmapping dem Chromosom 11p15.5 zugeordnet, was es zu einem Kandidatengen für LQT1 macht. KVLQT1 kodiert für ein Protein mit Strukturcharakteristika von Kaliumkanälen und die Expression des Gens, die durch Northern-Blot-Analyse bestimmt wurde, zeigte, dass KVLQT1 am stärksten im Herz exprimiert wird. Eine intragene Deletion und zehn verschiedene Missense-Mutationen, welche LQTS verursachen, wurden in KVLQT1 identifiziert. Diese Daten definieren KVLQT1 als ein neues Gen für kardiale Kaliumkanäle und zeigen, dass Mutationen in diesem Gen eine Anfälligkeit für ventrikuläre Tachyarrhythmien und plötzlichen Tod hervorrufen.
Es war bekannt, dass eine Komponente des I_KS-Kanals minK ist, ein 130 Aminosäuren umfassendes Protein mit einer einzigen putativen transmembranen Domäne (Takumi et al., 1988; Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; KW Wang et al., 1996). Die Größe und Struktur dieses Proteins ließen es unmöglich erscheinen, dass minK allein funktionelle Kanäle bilden kann (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993). Es gibt Hinweise darauf, das KVLQT1 und minK sich zusammenlagern, um den kardialen I_KS Kaliumkanal zu bilden. Publiziert wurde dies von Sanguinetti et al (1996b) sowie in WO 97/23598 . Splawski et al. (Genomics 51, 1998, Seiten 86-97) bestimmten die Genomstruktur der Gene KVLQT1, HERG und KCNE1, die für kardiale Ionenkanäle kodieren. Eine Missense-Mutation in dem C-terminalen Bereich von KVLQT1 ruft eine „Forme fruste" (leichte klinische Präsentation) des LQT-Syndroms hervor (Donger et al., Circulation 96 (9), 1997, Seiten 2778-2781). Weitere Missense-Mutationen in KVLQT1 wurden von Russell et al. (Human Molecular Genetics 5(9), 1996, Seiten 1319-1324) gefunden. I_KS-Dysfunktion ist eine Ursache für kardiale Arrhythmie. Später wurde gezeigt, dass Mutationen in KCNE1 (welches für minK kodiert) auch zu LQTS führen können (Splawski et al., 1997b).
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gibt Informationen zur Genomstruktur von KVLQT1-Genen, welche LQTS hervorruft. Dazu gehören auch Informationen über die Intron-/Exon-Grenzen. Auch offenbart sind zusätzliche Sequenzdaten, die zuvor noch nicht für dieses Gen angegeben wurden, sowie Mutationen in KVLQT1, welche mit dem LQTS assoziiert sind. Die Analyse des KVLQT1-Gens wird eine frühzeitige Diagnose für Personen mit LQTS liefern. Das diagnostische Verfahren umfasst die Analyse der DNA-Sequenz des KVLQT1-Gens einer zu untersuchenden Person und den Vergleich dieser Sequenz mit der DNA-Sequenz des nativen Nonvariant-Gens. In einer zweiten Ausführungsform wird das KVLQT1-Gen einer zu untersuchenden Person auf Mutationen gescreent, welche das LQTS hervorrufen. Die Fähigkeit, LQTS vorherzusagen, wird es Medizinern ermöglichen, die Krankheit durch medizinische Therapie, wie beispielsweise Betablocker zu verhindern.
Es wird ferner beschrieben, dass KVLQT1 und KCNE1 (minK) sich zusammenlagern, um einen I_Ks-Kaliumkanal zu bilden. Eine I_Ks-Dysfunktion ist eine Ursache für Herzrhythmusstörungen. Das Wissen darüber, dass diese beiden Proteine sich zusammenlagern, um den I_Ks-Kanal zu bilden, ist hilfreich bei der Entwicklung eines Assays für das Screening von Wirkstoffen, die hilfreich bei der Behandlung oder Prävention des QT-Syndroms vom Typ LQT1 sind. Durch Coexpression beider Gene in einer Zelle, wie beispielsweise einer Oocyte, ist es möglich, auf Wirkstoffe zu screenen, die eine Wirkung auf den I_Ks-Kanal ausüben und zwar sowohl in der Form des Wildtyps als auch in den mutierten Formen. Dieses Wissen ist auch nützlich für die Analyse des KCNE1-Gens für eine frühe Diagnose von Personen mit LQTS. Die diagnostischen Verfahren werden durchgeführt wie oben für KVLQT1 angegeben.
KURZDARSTELLUNG DER FIGUREN
1. Pedigreestruktur für einen Teil von LQTS-Trägern, die mit K1532 verwandt sind. Betroffene Personen sind mit ausgefüllten Kreisen (Frauen) oder Quadraten (Männer) dargestellt, nicht betroffene Personen zeigen nur ein leeres Symbol und Personen mit uneindeutigen Phänotypen sind punktiert dargestellt. Gentypen für Chromosom-11-Marker sind unter jedem Symbol angegeben und als Haplotypen dargestellt. Die Reihenfolge der Marker (von oben nach unten) ist: Tel-HRAS-D11S922-TH-D11S1318-D11S454-D11S860-D11S12-Cen. Die Genauigkeit von Haplotypen wurde sichergestellt, indem Gentypen von zusätzlichen Marker für Chromosom 11p15.5 benutzt wurden. Daraus folgende Gentypen sind in Klammern dargestellt. Chromosomen für die Krankheit sind durch Kästchen angegeben und Rekombinationsereignisse sind durch durchgehende horizontale Linien dargestellt. Rekombinationsereignisse, die die Chromosomen für die Krankheit betreffen, treten bei Individuen auf: IV-22, IV-25, V-6, V-17, V-24, V-34, VI-13, VI-14 und VI-16. Rekombinationsereignisse, die in Chromosomen auftreten, die nicht für die Krankheit verantwortlich sind, sind nicht angezeigt. KVLQT1 ist ein SSCP-Konformer innerhalb von KVLQT1 , das durch die Primer 5 und 6 identifiziert wurde; dieses Konformer wurde nur in K1532 identifiziert und stellt eine mit der Krankheit in Verbindung stehende Mutation dar (Allel 2 ist das mutierte Allel). Haplotypanalysen zeigten, dass KVLQT1 zwischen den flankierenden Marker D11S922 und D11S454 lokalisiert ist.
2. Physikalische Kartierung der LQT1-Region. Das Ideogramm von Chromosom 11 deutet auf die ungefähre Lokalisation von LQT1 (11p15.5) hin. Die Lokalisation polymorpher Marker und einiger Kosmide ist durch vertikale Linien auf der Karte angedeutet. Eine verfeinerte genetische Kartierung positioniert LQT1 zwischen TH und D11S454. Der Abstand zwischen TH und D11S454 wurde durch Pulsfeldgelanalyse auf <700kb geschätzt. Eine physikalische Kartierung der minimalen Reihe an überlappenden YAC- und P1-Klonen ist dargestellt. Die Lokalisierung der KVLQT1 cDNA und der gefangenen Exons ist dargestellt. Unterbrochene Linien in YACs deuten auf einen Chimärismus hin.
3. Abgleich der S1-S6-Region von KVLQT1 mit dem Drosophila Shaker-Kaliumkanal, DMSHAKE1(SHA) (Pongs et al., 1988). Identität (I) und Ähnlichkeit (:) sind angegeben. Die 3 separaten Fragmente von KVLQT1 sind in der Reihenfolge: SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 und SEQ ID NO: 109. Die 3 separaten Fragmente von DMSHAKE1 sind in der Reihenfolge: SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 und SEQ ID NO: 112.
4. Die Northern-Blot-Analyse zeigt die Expression von KVLQT1 in Herz, Plazenta, Lunge, Nieren und Pankreas des Menschen.
5A-5B. Genomorganisation für die KVLQT1-Kodierung und 5' und 3' nicht translatierter Regionen. Positionen der Introns sind mit Pfeilköpfen angegeben. Die sechs putativen transmembranen Segmente (S1 bis S6) und die putative Porenregion (Pore) sind unterstrichen. Das Stoppkodon ist durch einen Asteriskus (ein Sternchen) markiert. Die Nukleotidsequenz von 5A-5B ist SEQ ID NO: 1. Die Aminosäuresequenz von 5A-5B ist SEQ ID NO:2.
6. Physikalische Kartierung und Exonorganisation von KVLQT1. Die Genomregion von KVLQT1 umfasst etwa 400 Kilobasen. Die physikalische Kartierung des minimalen Contigs für überlappende P1-Klone und das Kosmid, welches Exon 1 enthält, ist dargestellt. Die Lokalisation von KVLQT1 in Bezug auf die Genklone ist angegeben. Die Größe der Exons und die Abstände sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
7A-7E. Die Coexpression von KVLQT1 und hminK in CHO-Zellen induziert einen Strom, der fast identisch ist zu dem kardialen I_Ks-Strom, A) KVLQT1-Ionenkanalströme, die ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV während 1-s-Depolarisationspulse an Membranpotenzialen von –50 bis +40 mV aufgezeichnet wurden. Tailströme wurden bei –70 mV gemessen. B) normalisierte isochrone Aktivierungskurven für Zellen, die mit KVLQT1 (n = 6, 1 siehe Pulse) oder KVLQT1 und KCNE1 (n = 7; 7,5-s-Pulsen) transfiziert waren. C-E) Ströme, die während 7,5-s-Pulsen mit –40, –20, –10, 0, +20 und +40 mV in Zellen, die mit KCNE1 (C), KVLQT1 (D) oder KVLQT1 und KCNE1 (E) transfiziert waren, aufgezeichnet wurden. Tailströme wurden gemessen bei –70 mV in D und bei –50 mV in C und E. Die Amplitude von Steady-State KVLQT1-Strom bei +40 mV betrug 0,37 +/– 0,14 nA (n = 6). In Zellen, die mit KVLQT1 und KCNE1 cotransfiziert waren, betrug der zeitabhängige Strom während eines 7,5-s-Pulses bei +40 mV 1,62 +/– 0,39 nA (n = 7).
8A-8C. Expression von KVLQT1 in Xenopus-Oocyten. A) Ströme aufgezeichnet in einer Oocyte, der 12,5 ng KVLQT1 cRNA injiziert worden war. Die Pulse wurden in 10 mV Schritten von –70 bis +40 mV abgegeben. B) Isochrone (1s) Aktivierungskurve für KVLQT1-Strom. V_1/2 betrug –14,0 +/– 0,2 mV und der Steigungsfaktor lag bei 11,2 +/– 0,2 mV (n = 9). C) Die Beziehung von E_rev versus log[K⁺]_e wurde mit einer linearen Funktion ausgerichtet und wies eine Steigung von 49,9 +/– 0,4mV (n = 6-7 Oocyten pro Punkt) auf. Tailströme wurden bei verschiedenen Spannungen nach 1,6-s-Vorpulsen mit +10 mV gemessen.
9A-9E. Die Coexpression von KVLQT1 und hminK lässt auf die Anwesenheit von einem KVLQT1-Homolog in Xenopus-Oocyten schließen. Ströme wurden gemessen bei –40, –20, 0, +20 und +40 mV in Oocyten, denen entweder 5,8 ng KVLQT1 (9A), 1 ng KCNE1 (9B) oder beide cRNAs injiziert worden waren (9C). 9D zeigt Verhältnisse von Strom zu Spannung, welche mit 2-s-Pulsen für KVLQT1 und 7,5-s-Pulsen für hminK oder KVLQT1 und hminK (n = 20 Zellen für jede Bedingung) gemessen wurden. Für Oocyten, denen 60 pg oder 1 ng KCNE1 cRNA injiziert wurde, betrug I_Ks bei +40 mV 2,11 +/– 0,12 μA und 2,20 +/– 0,18 μA. 9E zeigt normalisierte isochrone Aktivierungskurven für Oocyten, denen KCNE1 (V_1/2 = 2,4 +/– 0,3 mV; Steigung = 11,4 +/– 0,3 mV; n = 16) injiziert wurde, oder denen KVLQT1 und KCNE1 cRNA (V_1/2 = 6,2 +/– 0,3 mV; Steigung = 12,3 +/– 0,2 mV; n = 20) injiziert wurde.
10. Vergleich eines Teils einer humanen KVLQT1-Aminosäuresequenz mit einem Teil einer KLVQT1-Aminosäuresequenz von Xenopus. Die vertikalen Linien deuten auf die identischen Reste hin. Die Xenopus-Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 113 und die humane Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 114.
11A-11D. KVLQT1 Missense-Mutationen cosegregieren mit LQTS bei Verwandten K1532 (11A), K2605 (11B), K1723 (11C) und K1807 (11D). Die Ergebnisse der SSCP-Analyse mit dem Primerpaar 5-6 (K1532), Primerpaar 9-10 (K1723, K1807) und Primerpaar 11-12 (K2605) sind unter jedem Pedigree dargestellt. Abnorme SSCP-Konformere (gekennzeichnet durch *) cosegregieren mit LQTS bei jedem Verwandten. Für K1532 sind nur acht der 217 Individuen dargestellt. Da abnorme SSCP-Konformere, die mit LQTS in K161 und K162 cosegregieren, identisch zu dem in K1807 definierten Konformer waren, sind die Ergebnisse für diese Verwandtschaft nicht dargestellt. Die Ergebnisse von DNA-Sequenzanalysen von dem normalen (links) und dem abnormen (rechts) Konformer sind unter jedem Pedigree dargestellt.
12A-12O. KVLQT1 intragene Deletionen und Missense-Mutationen, die mit LQT1 verwandten Formen K13216 (12A), K1777 (12B), K20925 (12C), K2557 (12D), K13119 (12E), K20926 (12F), K15019 (12G), K2625 (12H), K2673 (12I), K3698 (12J), K19187 (12K), K22709 (12L), K2762 (12M), K3401 (12N) und K2824 (12O) assoziiert sind. Betroffene Personen sind durch ausgefüllte Kreise (Frauen) und ausgefüllte Quadrate (Männer) gekennzeichnet. Nicht betroffene Personen sind mit leeren Symbolen und nicht sicher zu bestimmende Personen sind entweder grau oder getüpfelt dargestellt. Die Ergebnisse von SSCP-Analysen mit Primerpaar 1-2 (K13216, K2557, K13119, K15019), Primerpaar 7-8 (K1777, K20926) und Primerpaar 9-10 (K20925) sind unter jedem Pedigree in 12A-12G (siehe Tabelle 5 für die Primerpaare) angegeben. Da abnorme SSCP-Konformere, die mit LQTS in K2050, K163 und K164 cosegregieren, identisch zu den abnormen Konformeren waren, die in K1723 und K1807 definiert sind, sind die Ergebnisse für diese Verwandten nicht dargestellt. Für 12A-12G sind die Ergebnisse der DNA-Sequenzanalysen von dem normalen (links) und dem abnormen (rechts) Konformer unter jedem Pedigree dargestellt und die gezeigten Sequenzen befinden sich auf dem Antisense-Strang.
Für 12H-12O sind die abnormen SSCP-Konformere durch einen Pfeil gekennzeichnet.
13A-13C. KCNE1-Mutationen, die mit LQTS assoziiert sind. Pedigreestrukturen für LQTS-Verwandte 1789 (13A) und 1754 (13B). Betroffene Personen sind durch ausgefüllte Kreise (Frauen) oder ausgefüllte Quadrate (Männer) gekennzeichnet. Nicht betroffene Personen sind durch offene Symbole dargestellt. Verstorbene Personen sind durch eine diagonal durchgezogene Linie gekennzeichnet. Abnorme SSCP-Konformere, die mit der Krankheit cosegregieren sind unter jedem Pedigree dargestellt. Ein allgemeiner Polymorphismus (G38S), welcher nicht mit LQTS in Zusammenhang steht, wird auch durch diese Primer nachgewiesen. Der Effekt von Mutationen auf die hminK-Proteinsequenz ist angegeben. 13C ist eine schematische Darstellung von hminK-Protein, welches die Lokalisation von mit LQTS assoziierten Mutationen zeigt.
14A-14B. Das Ausmaß von I_KS variiert als eine Funktion der injizierten KCNE1 cRNA. A) Repräsentative Stromnachverfolgungen hervorgerufen durch 7,5-s-Pulse bei +40 mV im Anschluss an die Injektion von Oocyten mit 6 ng/Oocyte KVLQT1 und einer variablen Menge von KCNE1 cRNA, wie angegeben. Zu beachten ist das Vorhandensein von KVLQT1-Strom und das Fehlen von I_KS in den Oocyten, denen 0,01 ng KCNE1 injiziert wurde. B) Die Stromamplitude nachfolgend auf einen 7,5-s-Puls bei +40 mV wurde auf Peakstrom, erhalten durch Injektion von 1,2 ng KCNE1, normalisiert. Die Werte sind ein Mittel von +/– S.E.M. N = 8 Oocyten/Gruppe.
15A-15D. Funktionelle Effekte von D76N KCNE1-Mutation. A) I_KS wurde hervorgerufen durch 7,5-s-Pulse ausgehend von einem Haltepotenzial von –80 mV bis auf Testpotenziale von –40 bis +40 mV. Deaktivierende Tailströme wurden durch Rückkehr auf das Membranpotenzial bei –50 mV hervorgerufen. B) Das isochrone Strom-Spannungs-Verhältnis von I_KS-WT (n = 14) und I_KS-D76N (n = 14) zeigt dominant negative Suppression von I_KS durch D76N (p < 0,0001). Die Spannungsabhängigkeit der I_KS-D76N-Aktivierung mithilfe eines 7,5-Sekunden-Testpulses ist bei +16 mV verlagert im Vergleich zu I_KS-WT. Flache Kurven werden am besten von normalisierten Tailströmen mit einer Boltzmann-Funktion gefittet. (V_1/2 = 10,8 +/– 0,8 mV, Steigungsfaktor = 12,1 +/– 0,3 mV; für I_KS-WT; für I_KS-D76N V_1/2 0 25,7 +/– 1,0 mV [p < 0,0001, verglichen mit I_KS-WT], Steigungsfaktor = 12, 0 +/– 0,2 mV; n = 14). D) I_KS-D76N deaktiviert schneller als I_KS-WT. I_KS wurde durch einen 5-Sekunden-Puls auf +20 mV aktiviert und Tailströme wurden bei den angegebenen Potenzialen gemessen. Tailströme wurden mit einer einzigen exponentiellen Funktion gefittet. Der Einsatz zeigt normalisierte deaktivierte Tailströme bei –50 mV nach einem Spannungsschritt auf +20 mV.
16A-16D. Funktionelle Effekte von S74L KCNE1 Mutation. A). I_KS-WT und I_KS-S74L aufgezeichnet während 7,5-Sekunden-Depolarisationen bei –40, –20, 0, +20 und +40 mV. Zu beachten ist die schnellere Rate der Deaktivierung von I_KS-S764L-Tailströmen im Vergleich zu I_KS-WT. B) Isochrones Strom-Spannungs-Verhältnis für I_KS-WT und I_KS-S74L (n = 15). C) Die Spannungsabhängigkeit der I_KS-S74L-Aktivierung ist in Bezug zu I_KS-WT bei +19 mV verschoben. Flache Kurven werden am besten von normalisierten Tailströmen mit einer Boltzmann-Funktion gefittet (V_1/2 = 13,7 +/– 0,6 mV, Steigungsfaktor = 16,0 +/– 0,3 mV für I_KS-WT; für I_KS-S74L V_1/2 = 33,6 +/– 0,8 mV, Steigungsfaktor 13,3 +/– mV [beide p < 0,0001 in Bezug zu I_KS-WT]). D) I_KS-S74L deaktiviert schneller als I_KS-WT.
17. Physikalische Kartierung und Exon-Organisation von KCNE1. Die beiden Kosmidklone, die das gesamte KCNE1-Transkript umspannen, sind dargestellt. Kosmid 1 erstreckt sich nicht bis zu dem Ende von Exon 3 und Kosmid 2 beinhaltet nicht Exon 1 und 2. Die Größen der Exons und die Abstände sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
18. Genomorganisation der KCNE1-Kodierung und 5' und 3' nicht translatierte Regionen. Positionen der Introns sind mit Pfeilköpfen angegeben. Zu beachten ist, dass beide Introns innerhalb der 5' nicht translatierten Region liegen. Der Asteriskus kennzeichnet das Stoppkodon. Die Nukleotidsequenz von 18 ist SEQ ID NO: 3. Die Aminosäuresequenz von 18 ist SEQ ID NO: 4.
KURZBESCHREIBUNG DER SEQUENZLISTE

SEQ ID NO: 1 ist humane KVLQT1 cDNA.
SEQ ID NO: 2 ist humanes KVLQT1-Protein.
SEQ ID NO: 3 ist humane KVLQT1 cDNA.
SEQ ID NO: 4 ist humanes KCNE1-Protein.
SEQ ID NO: 5-6 sind hypothetische Nukleinsäuren, die verwendet werden, um die Berechnung einer Homologie zu zeigen.
SEQ ID NO: 7-8 sind Oligonukleotide, die verwendet werden, um humane KVLQT1 cDNA einzufangen und zu reparieren (siehe Beispiel 4).
SEQ ID NO: 9-40 sind Intron/Exon-Grenzen von humanem KVLQT1 (Tabelle3).
SEQ ID NO: 41-47 sind Primer, die verwendet werden, um KVLQT1-Exons zu amplifizieren (Tabelle 4).
SEQ ID NO: 75-86 sind Primer, die verwendet werden, um KVLQT1-Mutationen zu definieren (Tabelle 5).
SEQ ID NO: 87-92 sind Primerpaare, die verwendet werden, um das KCNE1-Gen zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 93-94 sind Primer, die verwendet werden, um KCNE1 cDNA zu amplifizieren.
SEQ ID NO: 95-100 sind Intron/Exon-Grenzen von KCNE1 (Tabelle 8).
SEQ ID NO: 101-106 sind Primer, um KCNE1-Exons zu amplifizieren (Tabelle 9).
SEQ ID NO: 107-109 sind Fragmente von KVLQT1, dargestellt in 3.
SEQ ID NO: 110-112 sind Fragmente von DMSHAKE, dargestellt in 3.
SEQ ID NO: 113 ist ein Teil von Xenopus KVLQT1, dargestellt in 10.
SEQ ID NO: 114 ist ein Teil von humanem KVLQT1, dargestellt in 10.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Genomstruktur von KVLQT1 und auf molekulare Varianten dieser Gene, welche die Pathogenese von LQTS hervorrufen oder daran beteiligt sind. Es wird auch beschrieben, dass KVLQT1 und minK sich zusammenlagern, um kardiale I_KS Kaliumkanäle zu bilden. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Mutationen in dem KVLQT1-Gen und deren Verwendung bei der Diagnose von LQTS. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren für das Screenen von Menschen auf das Vorhandensein von KVLQT1-Genvarianten, welche LQTS verursachen. Da LQTS nun früher (d. h. bevor Symptome auftreten) und definitiver nachgewiesen werden kann, werden für die Personen, die mit LQTS identifiziert werden, bessere Behandlungsoptionen verfügbar werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren für das Screenen auf Wirkstoffe, die hilfreich bei der Behandlung oder Prävention der Form LQT1 sind.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit für das Screenen des KVLQT1-Gens, um Mutationen zu identifizieren. Solche Verfahren können ferner den Schritt der Amplifizierung eines Teils des KVLQT1-Gens umfassen und sie können ferner einen Schritt für das Bereitstellen einer Reihe von Polynukleotiden beinhalten, welche Primer für die Amplifikation des Teils des KVLQT1-Gens sind. Das Verfahren ist hilfreich für das Identifizieren von Mutationen zur Verwendung entweder zur Diagnose von LQTS oder für die Prognose von LQTS.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner, dass KCNE1 (kodiertes KCNE1 , das in der Literatur auch als minK bezeichnet wird), auf Chromosom 21 ebenfalls an dem LQTS beteiligt ist. Das minK Protein und KVLQT1 lagern sich zusammen, um einen K⁺-Kanal zu bilden.
Letztendlich bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren für das Screenen von Wirkstoffkandidaten, um Wirkstoffe zu identifizieren, die hilfreich bei der Behandlung oder Prävention von LQTS sind. Das Wirkstoffscreening wird durchgeführt, indem mutierte KVLQT1-Gene in Zellen exprimiert werden, wie beispielsweise in Oocyten, Säugetierzellen oder transgenen Tieren, und die Wirkung eines Wirkstoffkandidaten auf den I_KS-Kanal in einem Assay bestimmt wird. Die Wirkung wird verglichen mit der I_KS-Kanalaktivität der Wildtyp KVLQT1-Gene.
Der Beweis dafür, dass das KVLQT1-Gen an der Verursachung von LQTS beteiligt ist, ergibt sich anhand von gefundenen Sequenzen in der DNA, die aus betroffenen miteinander verwandten Individuen extrahiert wurden und welche abnorme KVLQT1-Genprodukte oder abnorme Konzentrationen von den Genprodukten erzeugen. Solche LQTS sensiblen Allele werden bei der Erkrankung in einer großen Anzahl von verwandten Personen cosegregieren. Sie werden auch in viel größerer Häufigkeit bei nicht-verwandten Personen mit LQTS auftreten als bei Personen in der Allgemeinbevölkerung. Der Schlüssel liegt darin, Mutationen zu finden, welche schwerwiegend genug sind, um eine offensichtliche Störung der normalen Funktion des Genprodukts hervorzurufen. Diese Mutationen können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwersten Formen waren Frame-Shift-Mutationen oder große Deletionen, die das Gen dazu veranlassen würden, für ein abnormes Protein zu kodieren oder die die Proteinexpression deutlich verändern würden. Weniger schwer störende Mutationen würden Small-Frame-Deletionen und nicht konservative Basenpaarsubstitutionen beinhalten, welche einen deutlichen Effekt auf das produzierte Protein haben würden, wie beispielsweise Veränderungen an einem oder durch einen Cysteinrest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt oder andere Mutationen, welche die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinträchtigen würden. Von stillen Mutationen oder denjenigen, die zu konservativen Aminosäuresubstitutionen führen, wäre nicht allgemein zu erwarten, dass sie die Proteinfunktion unterbrechen.
Gemäß des diagnostischen und prognostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden Veränderungen des Wildtyp-KVLQT1-Gens nachgewiesen. Zusätzlich dazu kann das Verfahren durch Nachweis des Wildtyp-KVLQT1-Gens und Bestätigen der fehlenden Ursache für LQTS infolge dieses Locus durchgeführt werden. „Veränderung eines Wildtyp-Gens" umfasst alle Formen von Mutationen einschließlich Deletionen, Insertionen und Punktmutationen in den kodierenden und nicht-kodierenden Regionen. Deletionen können das Gen insgesamt oder nur einen Teil des Gens betreffen. Punktmutationen können zu Stoppkodons, Frameshift-Mutationen oder Aminosäuresubstitutionen führen. Somatische Mutationen sind solche, die nur in bestimmten Geweben auftreten und nicht über die Keimbahn vererbt werden. Keimbahnmutationen können in jedem Körpergewebe gefunden werden und sind erblich. Punktmutationsereignisse können in regulatorischen Regionen auftreten, wie beispielsweise in dem Promoter des Gens, und zu Verlust oder Verminderung der Expression der mRNA führen. Punktmutationen können auch eine ordnungsgemäße RNA-Verarbeitung verhindern und zu Verlust der Expression des KVLQT1-Genprodukts führen oder zu einer Abnahme der mRNA-Stabilität oder Translationseffizienz führen.
Hilfreiche diagnostische Techniken beinhalten Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisation (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCA = Single-Stranded-Conformation Analysis), RNase Schutzassay, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP, wie unten stehend in weiteren Einzelheiten diskutiert, und ohne auf diese beschränkt zu sein. Ebenso hilfreich ist die kürzlich entwickelte Technik des DNA-Mikrochips.
Das Vorhandensein von LQTS kann durch Testen eines beliebigen Gewebes eines Menschen auf Mutationen des KVLQT1-Gens gesichert werden. Zum Beispiel wäre eine Person, die eine über die Keimbahn vererbte KVLQT1-Mutation besitzt, anfällig LQTS zu entwickeln. Bestimmt werden kann dies, indem DNA aus einem beliebigen Gewebe der Person getestet wird. Am einfachsten ist es, Blut abzunehmen und DNA aus den Blutzellen zu extrahieren. Darüber hinaus kann die pränatale Diagnose anhand von fetalen Zellen, Plazentazellen oder Amnionzellen zur Untersuchung auf Mutationen im KVLQT1-Gen durchgeführt werden. Veränderungen eines Wildtyp-KVLQT1-Allels, ob zum Beispiel durch Punktmutation oder Deletion, kann durch jedes beliebige hierin diskutierte Mittel nachgewiesen werden.
Es gibt verschiedenen Verfahren, die benutzt werden können, um DNA-Sequenzvariationen nachzuweisen. Mittels direkter DNA-Sequenzierung, entweder durch manuelle Sequenzierung oder automatische Fluoreszenz-Sequenzierung, kann eine Abweichung von der Sequenz aufgedeckt werden. Ein weiteres Verfahren stellt der Assay für den Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) (Orita et al., 1989) dar. Mit diesem Verfahren werden nicht alle Sequenzveränderung erkannt, insbesondere dann nicht, wenn das DNA-Fragment größer als 200 bp ist; das Verfahren lässt sich aber optimieren, um die meisten DNA-Sequenzvariationen nachzuweisen. Die niedrige Nachweisempfindlichkeit ist hierbei ein Nachteil, dennoch ist der SSCP-Assay aufgrund des erhöhten Durchsatzes eine attraktive praktikable Alternative zur direkten Sequenzierung für den Nachweis von Mutationen auf wissenschaftlicher Basis. Die Fragmente, die ihre Mobilität auf den SSCP-Gelen verändert haben, werden dann sequenziert, um die DNA-Sequenzvariation genau zu bestimmen. Andere Verfahren basierend auf dem Nachweis von Mismatches (Nicht-Übereinstimmungen) zwischen den beiden komplementären DNA-Strängen beinhalten die Clamped Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplex-Analyse (HA) (White et al., 1992) und chemische Spaltung (CMC = Chemical Mismatch Cleavage) (Grompe et al., 1989). Mit keinem der oben genannten Verfahren werden große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen aufgedeckt noch wird damit eine regulatorische Mutation nachgewiesen, die die Transkription oder Translation des Proteins betrifft. Andere Verfahren, die diese Klassen von Mutationen nachweisen, wie beispielsweise ein Protein-Truncation-Assay oder der Asymmetrie-Assay, decken nur spezifische Typen von Mutationen auf und würden keine Missense-Mutationen nachweisen. Eine Übersicht über aktuell verfügbare Verfahren zum Nachweis von DNA-Sequenzvariationen findet sich in einer kürzlichen Zusammenfassung von Grompe (1993). Sobald eine Mutation bekannt ist, kann ein allelspezifisches Nachweisverfahren, wie beispielsweise die allelspezifische Oligonukleotid (ASO)-Hybridisierung dazu benutzt werden, rasch eine große Anzahl von weiteren Proben auf diese gleiche Mutation zu screenen. Bei einer solchen Technik können Sonden verwendet werden, die mit Gold-Nanopartikeln markiert sind, um ein visuell farbiges Ergebnis zu erzielen (Elghanian et al., 1997).
Eine schnelle vorläufige Analyse für den Nachweis von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann mit einer Reihe von Southern-Blots mit DNA, die durch ein oder mehrere Restriktionsenzym(e), vorzugsweise mit einer großen Anzahl von Restriktionsenzymen geschnitten wurde, durchgeführt werden. Jeder Blot umfasst eine Reihe DNA-Fragmente von normalen Individuen und eine Reihe DNA-Fragmente von LQTS-Fällen. Southern Blots, die Hybridisierungsfragmente (die sich in der Länge von der Kontroll-DNA unterscheiden, wenn sie mit Sequenzen sondiert werden, die nahe dem KVLQT1-Locus liegen oder diesen miteinschließen) aufweisen, deuten auf eine mögliche Mutation hin. Wenn Restriktionsenzyme, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, eingesetzt werden, dann wird die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) verwendet.
Der Nachweis von Punktmutationen kann durch molekulares Klonen der KVLQT1-Allele und Sequenzierung der Allele mithilfe von Techniken, die auf diesem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Auch kann das Gen oder können Teile des Gens amplifiziert werden, z. B. durch PCR oder andere Amplifikationstechniken, und das amplifizierte Gen oder die amplifizierten Teile des Gens kann/können sequenziert werden.
Es gibt sechs gut bekannte Verfahren für einen vollständigeren, jedoch indirekten Test, um das Vorhandensein eines Suszeptibilitätsallels zu bestätigen: 1) Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCP) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNase Schutzassay (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) allelspezifische Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nukleotid-Mismatches erkennen, wie beispielsweise E. coli mutS Protein (Modrich, 1991), und 6) allelspezifische PCR (Ruano und Kidd, 1989). Für allelspezifische PCR werden Primer eingesetzt, die mit ihrem 3' Ende an einer bestimmten KVLQT1-Mutation hybridisieren. Wenn die betreffende Mutation nicht vorliegt, wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Auch das Amplification Refractory Mutation System (ARMS) kann eingesetzt werden, wie es in der europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 0332435 und in Newton et al., 1889 publiziert wurde. Insertionen und Deletionen von Genen können ebenfalls durch Klonen, Sequenzieren und Amplifizieren nachgewiesen werden. Zusätzlich erfolgt mit dem Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP) eine Sondierung auf Gene oder es können umgebende Markergene eingesetzt werden, um Veränderungen eines Allels oder einer Insertion in einem polymorphen Fragment zu bewerten. Solch ein Verfahren ist insbesondere hilfreich für das Screenen von Verwandten eines betroffenen Individuums auf das Vorhandensein der Mutation, die in diesem Individuum gefunden wurde. Es können auch andere Techniken für den Nachweis von Insertionen und Deletionen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, benutzt werden.
In den ersten drei Verfahren (SSCP, DGGE und RNase Schutzassay) erscheint eine neue Elektrophoresebande. SSCP weist eine Bande nach, welche anders wandert, da die Sequenzänderung zu einem Unterschied in der intramolekularen Basenpaarung beim Einzelstrang führt. Beim RNase Schutzassay kommt es zur Spaltung des mutierten Polynukleotids in zwei oder mehrere kleinere Fragmente. DGGE weist Unterschiede in den Wanderungsraten mutierter Sequenzen im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzen nach mithilfe eines denaturierten Gradientengels. In einem allelspezifischen Oligonukleotid-Assay wird ein Oligonukleotid eingesetzt, welches eine spezifische Sequenz nachweist und der Assay wird durchgeführt anhand des Nachweises des Vorhandenseins oder Fehlens eines Hybridisierungssignals. In dem mutS-Assay bindet das Protein nur an Sequenzen, die einen Nukleotid-Mismatch in einem Heteroduplex zwischen mutierter und Wildtyp-Sequenz enthalten.
Mismatches gemäß der vorliegenden Erfindung sind hybridisierte Nukleinsäuredoppelstränge, in welchen die beiden Stränge nicht 100 % komplementär sind. Die fehlende absolute Homologie kann durch Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen bedingt sein. Der Nachweis von Mismatches kann dazu benutzt werden, um Punktmutationen in dem Gen oder in dessen mRNA-Produkt nachzuweisen. Während diese Techniken weniger sensitiv sind als Sequenzierungen, sind sie doch mit einer großen Probenanzahl einfacher durchzuführen. Ein Beispiel für eine Mismatch-Spaltungstechnik ist das RNase Schutzverfahren. Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung bezieht sich das Verfahren auf den Einsatz einer markierten Ribosonde, welche komplementär zu der humanen Wiltyp-KVLQT1-Genkodierungssequenz ist. Die Ribosonde und entweder mRNA oder DNA, isoliert aus einer Person, werden verschmolzen (hybridisiert) und nachfolgend mit dem Enzym RNase A verdaut, welches dazu in der Lage ist, einige Mismatches in einer Doppelstrang-RNA-Struktur aufzudecken.
Wenn durch die RNase A ein Mismatch entdeckt wird, schneidet die RNase A an dieser Stelle. Wenn die hybridisierte RNA-Präparation auf einer Elektrophorese-Gelmatrix aufgetrennt wird, dann ist ein RNA-Produkt zu sehen, falls ein Mismatch erkannt und durch RNase A geschnitten wurde, welches kleiner ist als die Doppelstrang-RNA in voller Länge für die Ribosonde und die mRNA oder DNA. Die Ribosonde muss nicht die volle Länge der mRNA oder des Gens haben, sondern kann ein Segment davon sein. Wenn die Ribosonde nur ein Segment der mRNA oder des Gens umfasst, ist es wünschenswert, eine Reihe dieser Sonden zu verwenden, um die gesamte mRNA-Sequenz auf Mismatches zu screenen.
Auf ähnliche Weise können DNA-Sonden eingesetzt werden, um Mismatches durch enzymatische oder chemische Spaltung nachzuweisen. Siehe z. B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ dazu können Mismatches durch Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität von nicht übereinstimmenden Doppelsträngen in Bezug zu übereinstimmenden Doppelsträngen aufgedeckt werden. Siehe z. B. Cariello, 1988. Entweder mit Ribosonden oder DNA-Sonden kann die zelluläre mRNA oder die DNA, welche eine Mutation enthalten könnte, mithilfe von PCR (siehe unten) vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Veränderungen in der DNA des KVLQT1-Gens können auch mithilfe der Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden, insbesondere wenn es sich bei den Veränderungen um umfassende Rearrangements, wie beispielsweise Deletionen und Insertionen handelt.
DNA-Sequenzen des KVLQT1-Gens, welche mithilfe von PCR amplifiziert wurden, können durch allelspezifische Sonden gescreent werden. Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere, wobei jedes Nukleinsäureoligomer eine Region der Gensequenz enthält, die eine bekannte Mutation aufweist. Zum Beispiel kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotide lang sein und einem Teil der Gensequenz entsprechen. Durch den Einsatz einer großen Menge solcher allelspezifischen Sonden können PCR-Amplifikationsprodukte gescreent werden, um das Vorhandensein einer zuvor identifizierten Mutation in dem Gen zu identifizieren. Die Hybridisierung von allelspezifischen Sonden mit amplifizierten KVLQT1-Sequenzen kann zum Beispiel auf einem Nylonfilter erfolgen. Die Hybridisierung an eine bestimmte Sonde unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen deutet auf das Vorliegen der gleichen Mutation in dem Gewebe hin wie in der allelspezifischen Sonde.
Die neu entwickelte Technik der Nukleinsäureanalyse mithilfe der Mikrochip-Technik ist auch auf die vorliegende Erfindung anwendbar. Bei dieser Technik werden praktisch tausende von unterschiedlichen Oligonukleotidsonden in einer Reihe auf einem Silikonchip aufgebaut. Die zu analysierende Nukleinsäure ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und mit den Sonden auf dem Chip hybridisiert. Es ist auch möglich, die Wechselwirkungen von Nukleinsäure und Protein mittels dieser Nukleinsäurechips zu untersuchen. Mithilfe dieser Technik kann das Vorhandensein von Mutationen bestimmt werden oder sogar die Nukleinsäure, die analysiert werden soll, sequenziert werden oder das Ausmaß der Expression eines interessierenden Gens gemessen werden. Bei dem Verfahren werden parallel viele, bis zu tausende von Sonden gleichzeitig verarbeitet, wodurch die Analyserate enorm gesteigert werden kann. Verschiedene Dokumente wurden bereits veröffentlicht, in welchen diese Technik verwendet wurde. Einige davon sind Hacia et al., 1996, Shoemaker et al., 1996; Chee et al., 1996; Lockhart et al., 1996; DeRisi et al., 1996; Lipshutz et al., 1995. Dieses Verfahren wurde bereits eingesetzt, um Personen auf Mutationen in dem Brustkrebsgen BRCA1 (Hacia et al., 1996) zu screenen. Über diese neue Technik wurde bereits in einem News-Artikel in Chemical and Engineering News (Borman, 1996) berichtet und sie war auch Thema eines Leitartikels (Editorial, Nature Genetics, 1996). Siehe auch Fodor (1997).
Der definitivste Test auf Mutationen in einem Kandidatenlocus ist es, die KVLQT1-Gensequenzen der Patienten direkt mit denjenigen aus einer Kontrollpopulation zu vergleichen. Alternativ dazu könnte die Boten-RNA nach der Amplifikation sequenziert werden, z. B. durch PCR, wodurch es nicht mehr notwendig ist, die Exon-Struktur des Kandidatengens zu bestimmen.
Mutationen bei Patienten, die außerhalb der Kodierungsregion von KVLQT1 liegen, können durch Untersuchung der nicht-kodierenden Regionen bestimmt werden, wie beispielsweise Introns, sowie regulatorische Sequenzen nahe oder innerhalb der Gene. Ein früher Hinweis darauf, dass Mutationen in nicht-kodierenden Regionen wichtig sind, kann sich aus Northern-Blot-Untersuchungen ergeben, wodurch sich in Patienten im Vergleich zu Kontrollindividuen Boten-RNA-Moleküle von abnormer Größe oder in überreicher Menge nachweisen lassen.
Eine Veränderung der Expression von KVLQT-mRNA kann durch beliebige Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, nachgewiesen werden. Dazu zählen Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifikation und RNase Schutzassay. Eine verringerte Expression von mRNA deutet auf eine Veränderung des Wildtyp-Gens hin. Veränderungen von Wildtyp-Genen können auch durch Screenen auf Abweichungen von Wildtyp-KVLQT1-Protein nachgewiesen werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die immunreaktiv mit KVLQT1 sind, verwendet werden, um ein Gewebe zu screenen. Ein Fehlen an verwandtem Antigen würde auf eine Mutation hinweisen. Antikörper, die spezifisch für Produkte von mutierten Allelen sind, könnten auch benutzt werden, um mutierte Genprodukte nachzuweisen. Solche immunologischen Assays können in jedem passenden Format durchgeführt werden, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Dazu gehören Western Blots, immunohistochemische Assays und ELISA-Assays. Jedes Mittel für den Nachweis eines veränderten KVLQT1-Proteins kann für das Aufdecken einer Veränderung des Wildtyp-KVLQT1-Gens benutzt werden. Funktionelle Assays, wie beispielsweise Proteinbindungsbestimmungen, können verwendet werden. Zusätzlich können Assays verwendet werden, welche die biochemische Funktion von KVLQT1 nachweisen. Das Auffinden einer Mutante des KVLQT1-Genprodukts deutet auf eine Veränderung eines Wildtyp-KVLQT1-Gens hin.
Ein mutiertes KVLQT1-Gen oder -Genprodukt kann auch in anderen humanen Körperproben, wie beispielsweise in Serum, Stuhl, Urin und Sputum nachgewiesen werden. Die gleichen Techniken, die oben für den Nachweis von mutierten Genen oder Genprodukten in Geweben diskutiert wurden, können auch auf andere Körperproben angewandt werden. Durch das Screenen solcher Körperproben kann eine einfache frühe Diagnose auf LQTS gestellt werden.
Die hierin beschriebenen Primerpaare sind hilfreich für die Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten KVLQT1-Allels mithilfe von PCR. Die Paare an Einzelstrang-DNA-Primern für KVLQT1 können mit Sequenzen innerhalb oder in der Umgebung des KVLQT1-Gens auf Chromosom 11 verschmolzen werden, um die amplifizierte DNA-Synthese des Gens selbst zu primen. Eine komplette Reihe dieser Primer erlaubt die Synthese aller Nukleotide der genkodierenden Sequenz, d. h. der Exons. Die Reihe der Primer ermöglicht vorzugsweise die Synthese von sowohl Intron- als auch Exonsequenzen. Allelspezifische Primer können auch eingesetzt werden. Solche Primer verschmelzen nur an bestimmten mutierten KVLQT1-Allelen und werden somit nur ein Produkt amplifizieren, wenn das mutierte Allel als Template vorliegt.
Um das nachfolgende Klonen von amplifizierten Sequenzen zu erleichtern, können die Primer Restriktionsenzymerkennungssequenzen aufweisen, die an ihrem 5' Ende angehängt sind. Somit werden alle Nukleotide der Primer von der KVLQT1-Sequenz oder -Sequenzen, die in der Nähe von KVLQT1 liegen, abgeleitet mit Ausnahme von ein paar Nukleotiden, die nötig sind, um eine Restriktionsenzymstelle zu bilden. Solche Enzyme und Stellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Primer selbst können mithilfe von Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden. Im Allgemeinen können Primer hergestellt werden mit Oligonukleotid-Synthesegeräten, die kommerziell erhältlich sind. Angesichts der Sequenz des KVLQT1 liegt das Designen von bestimmten Primer innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns auf diesem Gebiet. Die vorliegende Erfindung trägt hierzu bei durch das Präsentieren von Daten zu Intron-/Exon-Grenzen und ermöglicht somit das Designen von Primer für das vollständige Amplifizieren und Sequenzieren aller Exon-Regionen.
Die Nukleinsäuresonden, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, sind für eine Reihe von Zwecken hilfreich. Sie können in der Southern-Hybridisierung von genomischer DNA und in dem RNase Schutzverfahren für die Bestimmung von Punktmutationen, wie bereits oben diskutiert wurde, verwendet werden. Die Sonden können eingesetzt werden, um PCR-Amplifikationsprodukte nachzuweisen. Sie können mithilfe anderer Techniken auch verwendet werden, um Mismatches zu dem KVLQT1-Gen oder zur mRNA nachzuweisen.
Es wurde herausgefunden, dass Individuen mit dem Wildtyp-KVQLT1-Gen kein LQTS aufweisen. Allerdings sind Mutationen, die mit der Funktion des KVLQT1-Genprodukts interferieren, an der Pathogenese von LQTS beteiligt. Somit verursacht das Vorhandensein eines veränderten (oder eines mutierten) KVLQT1-Gens, welches ein Protein produziert, das funktionslos ist oder eine veränderte Funktion aufweist, direkt LQTS, wodurch das Risiko für Herzrhythmusstörungen steigt. Um eine KVLQT1-Genmutation zu entdecken, wird eine biologische Probe vorbereitet und auf einen Unterschied zwischen der Sequenz des zu analysierenden Allels und der Sequenz des Wildtyp-Allels analysiert. Mutierte KVLQT1-Allele können anfänglich durch eine beliebige wie oben beschriebene Technik identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation des betreffenden mutierten Allels zu identifizieren. Alternativ dazu können mutierte Allele anfänglich identifiziert werden, indem die mutierten (veränderten) Proteine mithilfe konventioneller Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden anschließend sequenziert, um die spezifische Mutation für jedes Allel zu identifizieren. Die Mutationen, insbesondere diejenigen, welche zu einer veränderten Funktion des Proteins führen, werden dann für diagnostische und prognostische Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Es wurde auch herausgefunden, dass sich das KVQLT1-Protein mit dem minK-Protein zusammenlagert. Somit sind Mutationen in KCNE1 (welches für minK kodiert), welche in die Funktionen des KCNE1-Genprodukts eingreifen, an der Pathogenese von LQTS beteiligt. Das Vorhandensein eines veränderten (oder eines mutierten) KCNE1-Gens, welches ein Protein mit Funktionsverlust oder veränderter Funktion produziert, ruft somit direkt LQTS hervor, wodurch das Risiko für Herzrhythmusstörungen steigt.
Definitionen
In der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Definitionen verwendet:
„Amplifikation von Polynukleotiden" Dazu werden Verfahren benutzt wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligationsamplifikation (Ligationskettenreaktion, LCR) sowie Amplifikationsverfahren basierend auf dem Einsatz von Q-Beta-Replikase. Auch hilfreich sind Strangverdrängungsamplifkation (SDA = Strand Displacement Amplifikation), thermophile SDA und Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (3SR oder NASBA = Nucleic Acid Sequence Based Amplification). Diese Verfahren sind gut bekannt und werden auf dem Fachgebiet breit eingesetzt. Siehe z. B. US-Patentschriften 4,683,195 und 4,683,202 und Innis et al., 1990 (für PCR); Wu und Wallace, 1989 (für LCR); US-Patentschriften 5,270,184 und 5,455,166 und Walker et al., 1992 (für SDA); Spargo et al., 1996 (für thermophile SDA) und US-Patentschrift 5,409,818 , Fahy et al., 1991 und Compton, 1991 für 3SR und NASBA. Reagenzien und Hardware zur Durchführung der PCR sind kommerziell erhältlich. Primer, die hilfreich bei der Amplifizierung von Sequenzen der KVLQT1-Region sind, sind vorzugsweise komplementär zu diesen und hybridisieren speziell mit Sequenzen in der KVLQT1-Region oder in Regionen, die eine Zielregion darin flankieren. KVLQT1-Sequenzen, die durch Amplifikation erzeugt wurden, können direkt sequenziert werden. Alternativ dazu, allerdings weniger wünschenswert, kann/können die amplifizierte(n) Sequenz(en) vor der Sequenzanalyse geklont werden. Ein Verfahren für das direkte Klonen und die Sequenzanalyse von enzymatisch amplifizierten Genomsegmenten wurde von Scharf et al., 1986 beschrieben.
„Analytpolynukleotid" und „Analytstrang" beziehen sich auf ein Einzelstrang- oder ein Doppelstrang-Polynukleotid, welches vermutlich eine Zielsequenz enthält und welches in einer Vielzahl von Probentypen vorhanden sein kann, einschließlich in biologischen Proben.
„Antikörper" Die vorliegende Erfindung stellt polyklonale Antikörper und/oder monoklonale Antikörper und Fragmente davon bereit sowie immunologische Bindungsäquivalente davon, welche dazu in der Lage sind, sich spezifisch an das KVLQT1-Polypeptid und Fragmente davon oder an Polynukleotidsequenzen aus der KVLQT1-Region zu binden. Der Begriff „Antikörper" wird sowohl verwendet in Bezug auf eine homologe molekulare Entität oder eine Mischung, wie zum Beispiel ein Serumprodukt, welches aus mehreren unterschiedlichen molekularen Entitäten besteht. Polypeptide können synthetisch in einem Peptidsynthesizer hergestellt werden und an ein Trägermolekül (z. B. Keyhole-limpet-Hämozyanin) gebunden werden und über mehrere Monate in Kaninchen injiziert werden. Das Kaninchenserum wird auf Immunreaktivität mit dem KVLQT1-Polypeptid oder einem Fragment davon getestet. Monoklonale Antikörper werden hergestellt, indem Mäusen Proteinpolypeptide, Fusionsproteine oder Fragmente davon injiziert werden. Monoklonale Antikörper werden mittels ELISA gescreent und auf spezifische Immunreaktivität mit KVLQT1-Polypeptiden oder Fragmenten davon getestet. Siehe Harlow and Lane, 1988. Diese Antikörper werden hilfreich in Assays und Pharmaka sein.
Sobald eine ausreichende Quantität an gewünschtem Polypeptid erhalten wurde, kann dieses zu zahlreichen Zwecken eingesetzt werden. Eine typische Verwendung findet sich in der Produktion von Antikörpern für spezifische Bindung. Diese Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und sie können durch Techniken in vitro oder in vivo, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Für die Produktion von polyklonalen Antikörpern wird ein geeignetes Zielimmunsystem, typischerweise Maus oder Kaninchen, ausgewählt. Dem Immunsystem wird im Wesentlichen gereinigtes Antigen präsentiert; dies erfolgt auf eine Weise, die durch Verfahren, welche für die Tier- oder anderen Parameter, welche dem Immunologen gut bekannt sind, festgelegt werden. Typischerweise erfolgt die Injektion in Pfoten, intramuskulär, intraperitoneal oder intradermal. Natürlich können andere Spezies anstelle von Maus oder Kaninchen verwendet werden. Die polyklonalen Antikörper werden dann mithilfe von Techniken; die auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt und für die gewünschte Spezifität angepasst.
Eine immunologische Reaktion wird gewöhnlich mit einem Immunoassay nachgewiesen. Normalerweise muss für solche Immunoassays die Antigenquelle gereinigt werden, zum Beispiel wenn sie durch die gleichen Zellen und auf die gleiche Weise wie das Antigen produziert wurde. Eine Reihe von Immunoassayverfahren sind auf dem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. Harlow und Lane, 1988, oder Goding, 1986.
Monoklonale Antikörper mit Affinitäten von 10^–8 M^–1 oder vorzugsweise von 10^–9 bis 10^–10 M^–1 oder stärker werden typischerweise durch Standardverfahren, wie beschrieben z. B in Harlow und Lane, 1988 oder Goding, 1986 hergestellt. Kurz gesagt, werden geeignete Tiere ausgewählt und das gewünschte Immunisierungsprotokoll befolgt. Nach der entsprechenden Zeitspanne werden die Milze der betreffenden Tiere entnommen und einzelne Milzzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert, typischerweise zu Myelomzellen, die unsterblich sind. Danach werden die Zellen klonal getrennt und die Überstände eines jeden Klons auf Produktion eines geeigneten Antikörpers spezifisch für die gewünschte Region des Antigens getestet.
Weitere geeignete Techniken betreffen die Exposition in vivo von Lymphozyten gegenüber antigenen Polypeptiden oder alternativ ausgewählten Antikörperbibliotheken in einem Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., 1989. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikationen verwendet werden. Häufig werden Polypeptide und Antikörper markiert, indem sie entweder kovalent oder nicht-kovalent an eine Substanz gebunden werden, welche ein nachweisbares Signal aussendet. Es ist eine große Vielzahl an Markern und Konjugationstechniken bekannt und über diese wird auch umfassend in der wissenschaftlichen Literatur und in Patentschriften berichtet. Zu den geeigneten Markern zählen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzfarbstoffe, Chemilumineszenzstoffe, Magnetpartikel und Ähnliches. Patente, die Auskunft über den Einsatz von solchen Markern geben beinhalten US-Patentschriften 3,817,837 ; 3,850,752 ; 3,939,350 ; 3,996,345 ; 4,277,437 ; 4,275,149 und 4,366,241 . Es können auch rekombinante Immunglobuline hergestellt werden (siehe US-Patentschrift 4,816,567 ).
„Bindungspartner" bezieht sich auf ein Molekül, welches dazu in der Lage ist, ein Ligandmolekül mit hoher Spezifität zu binden, wie zum Beispiel ein Antigen und einen antigenspezifischen Antikörper oder ein Enzym und seinen Inhibitor. Im Allgemeinen müssen die spezifischen Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um die Analytkopie/den komplementärer Duplexstrang (im Fall von Polynukleotidhybridisierung) unter den Isolationsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel Biotin, Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor-Ligand-Paare und komplementäre Polynukleotidstränge. In dem Fall von komplementären Polynukleotidbindungspartnern sind die Partner normalerweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens 40 Basen lang sein. Für den Fachmann auf dem Gebiet wird es verständlich sein, dass Längen unter 15 (z. B. 8 Basen), zwischen 15 und 40 und über 40 Basenpaare auch verwendet werden können. Die Polynukleotide können aus DNA, RNA oder synthetischen Nukleotidanaloga bestehen. Weitere Bindungspartner können identifiziert werden z. B. mithilfe des Hefe-Di-Hybrid-Screeningassays wie hierin beschrieben.
Eine „biologische Probe" bezieht sich auf eine Gewebeprobe oder Flüssigprobe aus einem Individuum, von welcher angenommen wird, dass sie ein Analytpolynukleotid oder -polypeptid enthält und welche z. B. Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, äußere Bereiche von der Haut, des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränenflüssigkeit, Speichel, Blutzellen, Tumore, Organe, Gewebe und Proben aus In-vitro-Zellkulturbestandteilen beinhalten kann, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein.
„Kodieren" Man sagt ein Polynukleotid „kodiert" ein Polypeptid; wenn es sich in seinem nativen Zustand befindet oder durch Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, manipuliert wird, kann es transkribiert und/oder translatiert werden, um die mRNA für und/oder das Polypeptid oder ein Fragment davon zu produzieren. Der Antisense-Strang ist komplementär zu solch einer Nukleinsäure und die kodierende Sequenz kann daraus abgeleitet werden.
„Isoliert" oder „im Wesentlichen rein". Eine „isolierte" oder „im Wesentlichen reine" Nukleinsäure (z. B. eine RNA, DNA oder ein Mischpolymer) ist eine Nukleinsäure, die im Wesentlichen von anderen Zellbestandteilen frei ist, die natürlicherweise eine native humane Sequenz oder ein Protein, z. B. Ribosomen, Polymerasen sowie viele andere humangenomische Sequenzen und Proteine begleiten. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz oder ein Protein, welche(s) aus der Umgebung, in der sie/es natürlicherweise vorkommt, entfernt wurde, und beinhaltet rekombinante oder geklonte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder Analoga, die durch heterologe Systeme biologisch synthetisiert wurden.
„KVLQT1-Allel" bezieht sich auf normale Allele des KVLQT1-Locus sowie auf Allele von KVLQT1, welche Veränderungen tragen, die LQTS verursachen.
„KVLQT1-Locus", „KVLQT1-Gen", „KVLQTl-Nukleinsäuren" oder „KVLQT1-Polynukleotid" beziehen sich jeweils auf Polynukleotide, die sich alle in der KVLQT1-Region befinden und möglicherweise in normalem Gewebe exprimiert werden, wobei bestimmte Allele davon zu LQTS führen. Der KVLQT1-Locus ist dazu bestimmt, kodierende Sequenzen, intervenierende Sequenzen und regulatorische Elemente zu enthalten, die die Transkription und/oder Translation kontrollieren. Der KVLQT1-Locus sollte alle Allelvariationen der DNA-Sequenz enthalten.
Diese Begriffe beziehen sich, wenn sie auf eine Nukleinsäure angewandt werden, auf eine Nukleinsäure, welche für ein humanes KVLQT1-Polypeptid, Fragment, Homolog oder Variante davon, einschließlich z. B. Proteinfusionen oder Deletionen, kodiert. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung werden eine Sequenz aufweisen, welche entweder von einem für KVLQT1 kodierenden Gen abgeleitet ist oder im Wesentlichen ähnlich zu dieser ist oder die im Wesentlichen homolog zu einem natürlichen KVLQT1 kodierenden Gen oder einem Teil davon ist.
Das KVLQT1-Gen oder die Nukleinsäure beinhaltet normale Allele des KVLQT1-Gens einschließlich stiller Allele, die keine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz des KVLQT1-Polypeptids haben, sowie Allele, die zu Aminosäuresequenzvarianten des KVLQT1-Polypeptids führen, die aber seine Funktion im Wesentlichen nicht beeinträchtigen. Diese Begriffe umfassen auch Allele mit einer oder mehreren Mutation(en), welche die Funktion des KVLQT1-Polypeptids negativ beeinflusst/beeinflussen. Eine Mutation kann eine Veränderung in der KVLQT1-Nukleinsäuresequenz sein, welche eine schädliche Veränderung in der Aminosäuresequenz des KVLQT1-Polypeptids verursacht, was zu einem teilweisen beziehungsweise vollständigen Verlust der KVLQT1-Funktion führt, oder es kann sich um eine Veränderung in der Nukleinsäuresequenz handeln, welche in dem Verlust von effektiver KVLQT1-Expression oder der Produktion abnormer Formen des KVLQT1-Polypeptids resultiert.
Die KVLQT1-Nukleinsäure kann diejenige in SEQ ID NO: 1 (KVLQT1) sein oder es kann sich dabei um ein Allel, wie oben beschrieben, handeln oder um eine Variante oder ein Derivat, welche(s) aufgrund einer Veränderung durch eine oder mehrere Addition(en), Insertion(en), Deletion(en) oder Substitution(en) eines Nukleotids oder mehrerer Nukleotide von der gezeigten Sequenz abweicht. Veränderungen in der Nukleotidsequenz können, wie durch den genetischen Code festgelegt, zur Veränderung einer Aminosäure auf Proteinebene führen oder auch nicht.
Somit kann die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung eine Sequenz beinhalten, die von der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, abweicht und dennoch für ein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz kodiert wie in SEQ ID NO: 2 (KVLQT1) dargestellt. Das bedeutet, dass die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung Sequenzen beinhalten, die infolge des genetischen Codes degeneriert sind. Andererseits kann das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich durch einen oder mehrere Aminosäurenrest(e) von der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz unterscheidet. Eine Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, welches eine Aminosäurevariante, ein Derivat oder ein Allel der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ist, wird auch durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
Das KVLQT1-Gen bezieht sich jeweils auch auf (a) eine beliebige DNA-Sequenz, welche (I) mit dem Komplement der DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 2 ausgeführt ist, unter stark stringenten Bedingungen hybridisiert (Ausubel et al., 1992) und (ii) für ein Genprodukt kodiert, welches funktionell äquivalent zu KVLQT1 ist oder (b) auf eine beliebige DNA-Sequenz, welche (i) mit dem Komplement der DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 2 ausgeführt ist, unter weniger stringenten Bedingungen, wie beispielsweise mäßig stringenten Bedingungen, hybridisiert (Ausubel et al., 1992) und (ii) für ein Genprodukt kodiert, welches funktionell äquivalent zu KVLQT1 ist. Die Erfindung beinhaltet auch Nukleinsäuremoleküle, die komplementär zu den hierin beschriebenen Sequenzen sind.
Die Polynukleotidzusammensetzungen dieser Erfindung beinhalten RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, Sense- und Antisense-Stränge und können chemisch oder biochemisch modifiziert werden oder sie können nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten wie der Fachmann auf dem Gebiet zu schätzen wissen wird. Solche Modifikationen enthalten zum Beispiel Marker, Methylierung, Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotid-Modifikationen wie beispielsweise nicht geladene Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.), geladene Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.), passende Anteile (z. B. Polypeptide), Interkalatoren (z. B. Akridin, Psoralen usw.), Chelatoren, Alkylatoren und modifizierte Bindungen (z. B. alpha anomere Nukleinsäuren usw.). Auch darin enthalten sind synthetische Moleküle, die die Polynukleotide in ihrer Fähigkeit nachahmen, an eine designierte Sequenz über eine Wasserstoffbindung oder andere chemische Interaktionen zu binden. Solche Moleküle sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel diejenigen, in denen im Grundgerüst des Moleküls Phosphatbindungen durch Peptidbindungen ersetzt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäuren bereit, die die gesamte KVLQT1-Region oder Teile davon umfassen. Das rekombinante Konstrukt kann dazu in der Lage sein, sich in einer Wirtszelle autonom zu replizieren. Alternativ kann das rekombinante Konstrukt in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert werden. Solch ein rekombinantes Polynukleotid umfasst ein Polynukleotid, dessen Ursprung genomisch, aus der cDNA, halbsynthetisch oder synthetisch ist, welches aufgrund seiner Herkunft oder durch Manipulation 1) nicht mit dem gesamten Polynukleotid oder einem Teil davon assoziiert ist, mit welchem es in der Natur assoziiert ist, 2) mit einem anderen Polynukleotid verbunden ist als es von Natur aus verbunden ist; oder 3) nicht in der Natur vorkommt. Wenn die Nukleinsäure gemäß der Erfindung RNA beinhaltet, sollte Bezug auf die gezeigte Sequenz unter Bezug auf das RNA-Äquivalent genommen werden, wobei T durch U ersetzt ist.
Daher werden rekombinante Nukleinsäuren, die Sequenzen umfassen, welche ansonsten nicht natürlich vorkommen, durch diese Erfindung bereitgestellt. Obwohl die Wildtyp-Sequenz verwendet werden kann, wird diese oft verändert werden, z. B. durch Deletion, Substitution oder Insertion. cDNA oder genomische Bibliotheken unterschiedlicher Typen können als natürliche Ressourcen der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung gescreent werden oder es können solche Nukleinsäuren durch Amplifikation von in genomischer DNA vorkommender Sequenzen oder aus anderen natürlichen Ressourcen, z. B. PCR bereitgestellt werden. Die Wahl der cDNA-Bibliotheken richtet sich normalerweise nach einem Gewebeursprung, welcher reich an mRNA für das gewünschte Protein ist. Phagen-Bibliotheken werden üblicherweise bevorzugt, es können aber auch andere Arten von Bibliotheken benutzt werden. Klone einer Bibliothek werden für das Screenen auf Platten verteilt, auf ein Substrat übertragen, denaturiert und dann auf das Vorhandensein gewünschter Sequenzen getestet.
Die in dieser Erfindung verwendeten DNA-Sequenzen werden gewöhnlich mindestens fünf Kodons (15 Nukleotide) enthalten, noch gewöhnlicher mindestens etwa 7-15 Kodons und am meisten bevorzugt mindestens etwa 35 Kodons. Es kann auch ein Intron oder es können mehrere Intron enthalten sein. Diese Anzahl an Nukleotiden entspricht üblicherweise etwa der minimal erforderlichen Länge für eine erfolgreiche Sonde, die spezifisch mit einer für KVLQT1 kodierenden Sequenz hybridisieren würde. In diesem Zusammenhang können Oligomere von nur 8 Nukleotiden, allgemeiner 8-17 Nukleotiden für Sonden benutzt werden, insbesondere in Verbindung mit Chip-Technik.
Techniken zur Manipulation von Nukleinsäuren sind allgemein beschrieben, zum Beispiel in Sambrock et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992. Reagenzien, die hilfreich bei der Anwendung solcher Techniken sind, wie beispielsweise Restriktionsenzyme und Ähnliche, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und kommerziell erhältlich von Händlern wie beispielsweise New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega, U. S. Biochemicals, New England Nuclear und einer Reihe anderer Hersteller. Die rekombinanten Nukleinsäuresequenzen, die benutzt werden, um Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung herzustellen, können aus natürlichen oder synthetischen Sequenzen abgeleitet sein. Viele natürliche Gensequenzen sind aus verschiedenen cDNA- oder aus genomischen Bibliotheken erhältlich unter Einsatz geeigneter Sonden. Siehe GenBank, National Institutes of Health.
Wie hierin verwendet ist ein „Teil" des KVLQT1-Locus oder der KVLQT1-Region oder des KVLQT1-Allels mit einer minimalen Größe von mindestens etwa acht Nukleotiden oder vorzugsweise etwa 15 Nukleotiden oder noch mehr bevorzugt mit mindestens etwa 25 Nukleotiden definiert und kann eine minimale Größe von mindestens etwa 40 Nukleotiden aufweisen. Diese Definition beinhaltet alle Größen in dem Bereich von 8-40 Nukleotiden sowie größer als 40 Nukleotide. Daher beinhaltet diese Definition Nukleinsäuren von 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 Nukleotiden oder Nukleinsäuren mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Wertebereiche (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotide) oder Nukleinsäuren mit mehr als 500 Nukleotiden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuen Nukleinsäuren mit mindestens 8 Nukleotiden abgeleitet von SEQ ID NO: 1, ihr Komplement oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen. Die vorliegende Erfindung beinhaltet keine Nukleinsäuren, welche gemäß dem Stand der Technik existieren. Das bedeutet, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Nukleinsäuren mit mindestens 8 Nukleotiden, die aus der SEQ ID NO: 1 abgeleitet sind unter dem Vorbehalt, dass sie keine Nukleinsäuren umfasst, die gemäß dem Stand der Technik existieren.
„KVLQT1-Protein" oder „KVLQT1-Polypeptid" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das durch den KVLQT1-Locus, eine Variante oder ein Fragment davon kodiert wird. Der Begriff „Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer aus Aminosäuren und seiner Äquivalente und nicht auf eine spezielle Länge des Produkts; daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine in der Definition für ein Polypeptid miteingeschlossen. Dieser Begriff bezieht sich auch nicht auf Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und Ähnliche und schließt diese nicht aus. In der Definition miteingeschlossen sind zum Beispiel Polypeptide, die ein Analogon oder mehrere Analoga einer Aminosäure (einschließlich zum Beispiel nicht natürliche Aminosäuren usw.) enthalten, Polypeptide mit Bindungssubstitutionen sowie andere Modifikationen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, sowohl natürlich als auch nicht-natürlich vorkommend. Normalerweise werden solche Polypeptide mindestens etwa zu 50 % homolog zu der nativen KVLQT1-Sequenz sein, vorzugsweise über etwa 90 % und noch mehr bevorzugt mindestens über 95 % homolog sein. Auch miteingeschlossen sind Proteine, die durch DNA kodiert werden, die unter stark oder wenig stringenten Bedingungen an die für KVLQT1 kodierenden Nukleinsäuren und nah verwandten Polypeptide oder Proteine, die aus den Antisera der/des KVLQT1-Proteins/Proteine gewonnen werden, hybridisieren.
Das KVLQT1-Polypeptid kann dasjenige sein, welches in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, welches in isolierter und/oder gereinigter Form, frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit welchem es normalerweise assoziiert ist, vorliegt. Bei dem Polypeptid kann, wenn es durch Expression in einer prokaryotischen Zelle oder synthetisch hergestellt wurde, die posttranslationale Verarbeitung fehlen, wie beispielsweise die Glykosylierung. Alternativ dazu richtet sich die vorliegende Erfindung auf Polypeptide, die Sequenzvarianten, Allele oder Derivate des KVLQT1-Polypeptids sind. Solche Polypeptide können eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche sich von derjenigen in SEQ ID NO: 2 um eine oder mehrere Additionen(en), Substitution(en), Deletion(en) oder Insertion(en) einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden. Bevorzugt haben solche Polypeptide KVLQT1-Funktion.
Substitutionsvarianten enthalten typischerweise den Austausch einer Aminosäure gegen eine andere an einer Stelle oder mehreren Stellen innerhalb des Proteins, und können so aufgebaut sein, dass sie eine oder mehrere Eigenschaft(en) des Polypeptids, wie beispielsweise Stabilität gegenüber proteolytischer Spaltung, modulieren ohne den Verlust anderer Funktionen oder Eigenschaften. Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, hydrophober Eigenschaft, hydrophiler Eigenschaft vorgenommen werden und/oder die amphiphatische Natur des Restes betreffen. Bevorzugte Substitutionen sind solche, die konservativ sind, das bedeutet, eine Aminosäure wird durch eine mit ähnlicher Form und Ladung ersetzt. Konservative Substitutionen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Tyrosin, Phenylalanin.
Bestimmte Aminosäuren können durch anderen Aminosäuren in einer Proteinstruktur ersetzt werden ohne merklichen Verlust an interaktiver Bindungskapazität für Strukturen wie zum Beispiel Antigenbindungsregionen von Antikörpern oder Bindungsstellen auf Substratmolekülen oder Bindungsstellen auf Proteinen, die mit dem KVLQT1-Polypeptid interagieren. Da es die interaktive Kapazität und Natur des Proteins ist, welche die biologisch funktionelle Aktivität eines Proteins bestimmt, können bestimmte Aminosäuresubstitutionen in einer Proteinsequenz sowie in der zugrunde liegenden DNA-Kodierungssequenz vorgenommen werden und dennoch ein Protein mit gleichen Eigenschaften erhalten werden. Bei dem Einführen solcher Veränderungen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des hydrophoben Aminosäureindex bei der Übertragung von interaktiver biologischer Funktion auf ein Protein ist auf dem Gebiet allgemein bekannt (Kyte und Doolittle, 1982). Alternativ kann die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis von hydrophilen Eigenschaften erfolgen. Die Bedeutung der hydrophilen Eigenschaften bei der Übertragung von interaktiver biologischer Funktion des Proteins ist auf dem Gebiet allgemein bekannt ( US-Patentschrift 4,554,101 ). Die Verwendung des hydrophoben Index oder der hydrophilen Eigenschaften beim Design von Polypeptiden ist ferner in der US-Patentschrift 5,691,198 diskutiert.
Die Länge von Polypeptidsequenzen, die aufgrund der Homologie verglichen werden, wird im Allgemeinen mindestens etwa 16 Aminosäuren, gewöhnlich mindestens etwa 20 Reste, noch gewöhnlicher mindestens etwa 24 Reste, typischerweise mindestens etwa 28 Reste und vorzugsweise mehr als etwa 35 Reste aufweisen.
„Funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf eine Aneinanderreihung, wobei die so beschriebenen Komponenten in einer Verbindung zueinander stehen, die es ihnen ermöglicht, in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist ein Promoter funktionsfähig mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn der Promoter die Transkription oder Expression beeinflusst.
Der Begriff „Peptidmimetikum oder Mimetikum" dient dazu Bezug auf eine Substanz zu nehmen, welche die essenzielle biologische Aktivität des KVLQT1-Polypeptids besitzt. Ein Peptidmimetikum kann ein Peptid enthaltendes Molekül sein, welches Elemente der Sekundärstruktur des Proteins nachahmt (Johnson et al., 1993). Die zugrunde liegende Ratio bei der Verwendung von Peptidmimetika ist, dass das Peptidgrundgerüst des Proteins hauptsächlich existiert, um Aminosäureseitenketten auf eine solche Weise auszurichten, um molekulare Interaktionen zu erleichtern, wie beispielsweise diejenigen von Antikörper und Antigen, Enzym und Substrat oder Gerüstproteinen. Ein Peptidmimetikum ist so aufgebaut, damit es molekulare Interaktionen ähnlich denen des natürlichen Moleküls ermöglicht. Ein Mimetikum muss kein Peptid sein, aber es wird die essenzielle biologische Aktivität des natürlichen KVLQT1-Polypeptids beibehalten.
„Sonden" Polynukleotid-Polymorphismen, die mit KVQLT1-Allelen assoziiert sind, welche für LQTS prädisponieren, werden durch Hybridisierung mit einer Polynukleotidsonde nachgewiesen, die unter stringenten bis mäßig stringenten Bedingungen und Waschbedingungen ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz bildet. Wenn erwartet wird, dass die Sonden vollständig komplementär zu der Zielsequenz sind, werden stark stringente Bedingungen angewendet. Die stringenten Hybridisierungsbedingungen können gemindert werden, wenn einige Mismatches zu erwarten sind, zum Beispiel wenn Varianten erwartet werden mit dem Ergebnis, dass die Sonde nicht vollständig komplementär sein wird. Es werden Bedingungen gewählt, die nicht spezifische/zufällige Bindungen ausschließen, das bedeutet, welche Rauschen verhindern. (Es ist zu beachten, dass in dieser gesamten Offenbarung nur angegeben ist, dass „stringente" Bedingungen verwendet werden, welche als „stark stringente” Bedingungen zu interpretieren sind.) Da durch solche Hinweise neutrale DNA-Polymorphismen sowie Mutationen identifiziert werden, müssen diese Hinweise weiter analysiert werden, um den Nachweis eines KVLQT1-Suszeptibilitätsallels zu erbringen.
Sonden für KVLQT1-Allele können von den Sequenzen der KVLQT1-Region, der cDNA, funktionell äquivalenten Sequenzen oder den Komplementen davon abgeleitet werden. Die Sonden können eine beliebig geeignete Länge aufweisen, welche die gesamte KVLQT1-Region oder einen Teil davon umfasst und welche spezifische Hybridisierung an der Region erlauben. Wenn die Zielsequenz eine Sequenz enthält, die identisch zu der Sonde ist, können die Sonden kurz sein, z. B. in dem Bereich von etwa 8-30 Basenpaaren, da das Hybrid unter selbst stringenten Bedingungen relativ stabil bleiben wird. Wenn bis zu einem gewissen Grad Mismatches mit der Sonde erwartet werden, d. h. wenn vermutet wird, dass die Sonde mit einer Variantregion hybridisieren wird, kann eine längere Sonde eingesetzt werden, welche an der Zielsequenz mit der erforderlichen Spezifität hybridisiert.
Die Sonden werden ein isoliertes Polynukleotid enthalten, welches an einem Marker oder Reportermolekül befestigt ist, und können benutzt werden, um andere Polynukleotidsequenzen mit ähnlichen Sequenzen mithilfe von Standardverfahren zu isolieren. Techniken zur Herstellung und Markierung von Sonden finden sich z. B. bei Sambrock et. al. 1989 oder Ausubel et. al., 1992. Andere ähnliche Polynukleotide können mithilfe homologer Polynukleotide ausgewählt werden. Alternativ können Polynukleotide, die für diese oder ähnliche Polypeptide kodieren, synthetisiert werden oder mithilfe der Redundanz im genetischen Code ausgewählt werden. Zahlreiche Kodonsubstitutionen können eingeführt werden, z. B. stille Änderungen (wodurch verschiedene Restriktionsstellen produziert werden) oder um die Expression für ein bestimmtes System zu optimieren. Mutationen können eingeführt werden, um die Eigenschaften des Polypeptids zu modifizieren, möglicherweise um den Polypeptidabbau oder die Turnoverrate zu verändern.
Sonden, die synthetische Oligonukleotide oder andere Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, können von natürlich vorkommenden oder rekombinanten Einzel- oder Doppelstrangpolynukleotiden abgeleitet werden oder chemisch synthetisiert werden. Die Sonden können auch durch Nick Translation, Klenow-Fill-in Reaktion oder andere Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, markiert werden.
Teile der Polynukleotidsequenz mit mindestes etwa acht Nukleotiden, gewöhnlich mit mindestens etwa 15 Nukleotiden und weniger als 9 kb, gewöhnlich weniger als etwa 1,0 kb, aus einer Polynukleotidsequenz, die für KVLQT1 kodieren, werden als Sonden bevorzugt. Diese Definition beinhaltet daher Sonden im Größenbereich mit 8 Nukleotiden bis 9000 Nukleotiden. Demnach umfasst die Definition Sonden von 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400 oder 500 Nukleotiden oder Sonden mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Wertebereiche (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotiden) oder Sonden mit mehr als 500 Nukleotiden. Die Sonden können auch dazu benutzt werden, zu bestimmen, ob mRNA, die für KVLQT1 kodiert, in einer Zelle oder in einem Gewebe vorliegt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuen Sonden mit mindestens 8 Nukleotiden, die aus SEQ ID NO: 1, ihren Komplementen oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung enthält keine Sonden, die gemäß dem Stand der Technik existieren. Das bedeutet, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Sonden mit mindestens 8 Nukleotiden, die aus SEQ ID NO: 1 abgeleitet sind unter dem Vorbehalt, dass sie keine Sonden umfasst, die gemäß dem Stand der Technik existieren.
Ähnliche Überlegungen und Nukleotidlängen sind auch auf Primer anwendbar, welche für die Amplifikation aller Teile des KVLQT1-Gens eingesetzt werden können. Daher beinhaltet eine Definition für die Primer solche mit 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 Nukleotiden oder Primer mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Wertebereiche (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotide) oder Primer mit mehr als 500 Nukleotiden oder jede beliebige Anzahl von Nukleotiden zwischen 500 und 9000. Die Primer können auch dazu benutzt werden, zu bestimmen, ob mRNA, die für KVLQT1 kodiert, in einer Zelle oder in einem Gewebe vorliegt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuen Primer mit mindestens 8 Nukleotiden, die von dem KVLQT1-Locus für das Amplifizieren des KVLQT1-Gens, seinem Komplement oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung enthält keine Primer, die gemäß dem Stand der Technik existieren. Das bedeutet, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Primer mit mindestens 8 Nukleotiden unter dem Vorbehalt, dass sie keine Primer umfasst, die gemäß dem Stand der Technik existieren.
„Proteinmodifikationen oder Fragmente" werden durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt für KVLQT1-Polypeptide oder Fragmente davon, welche im Wesentlichen homolog zur Primärstruktursequenz sind, aber welche z. B. in vivo oder in vitro chemische oder biochemische Modifikationen aufweisen oder welche ungewöhnliche Aminosäuren enthalten. Solche Modifikationen umfassen zum Beispiel Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitinylierung, Markierung, z. B. mit Radionukliden, sowie zahlreiche enzymatische Modifikationen, wie ein Fachmann auf dem Gebiet zu schätzen wissen wird. Es sind auf dem Fachgebiet eine Vielzahl von Verfahren für das Markieren von Polypeptiden und von Substituenten oder Markern, die hilfreich für solche Zwecke sind, bekannt und dazu gehören radioaktive Isotope, wie beispielsweise ³²P, Liganden, welche an markierte Antiliganden (z. B. Antikörper) binden, Fluorophore, Chemilumineszenzstoffe, Enzyme und Antiliganden, welche als Partner eines spezifischen Bindungspaares für einen markierten Liganden dienen können. Die Wahl des Markers ist abhängig von der erforderlichen Empfindlichkeit, der Einfachheit der Konjugation mit dem Primer, den Stabilitätsanforderungen und verfügbaren Gerätschaften. Verfahren für das Markieren von Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe Sambroock et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992.
Neben im Wesentlichen Polypeptiden in voller Länge stellt die vorliegende Erfindung biologisch aktive Fragmente der Polypeptide bereit. Zu den bedeutenden biologischen Aktivitäten zählen Ligand-Bindung, immunologische Aktivität und andere biologische Aktivitätsmerkmale von KVLQT1-Polypeptiden. Immunologische Aktivitäten beinhalten sowohl immunogene Funktion in einem Zielimmunsystem als auch gemeinsame Nutzung von immunologischen Epitopen für die Bindung und dienen entweder als Kompetitor- oder als Ersatzantigen für ein Epitop des KVLQT1-Proteins. Wie hierin benutzt bezieht sich „Epitop" auf eine antigene Determinante eines Polypeptids. Ein Epitop könnte drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, welche einzigartig für das Epitop ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens fünf solcher Aminosäuren und noch gewöhnlicher aus mindestens 8-10 solcher Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der räumlichen Konformation solcher Aminosäuren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Zu immunologischen Zwecken können Tandem-Wiederholungs-Polypeptidsegmente als Immungene verwendet werden, wodurch hoch antigene Proteine hergestellt werden. Alternativ werden solche Polypeptide als hoch effiziente Kompetitoren für spezifische Bindung dienen. Die Produktion von Antikörpern, die spezifisch für KVLQT1-Polypeptide oder Fragmente davon sind, ist unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die KVLQT1-Polypeptide und Fragmente umfassen. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen zwei oder mehr KVLQT1-Polypeptidsequenzen oder zwischen den Sequenzen von KVLQT1 und einem verwandten Protein sein. Ähnlich können heterologe Fusionen konstruiert werden, welche eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der Derivatproteine zeigen würden. Zum Beispiel können die Ligand-Bindung oder andere Domänen zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder Fragmenten „getauscht" werden. Solche homologen oder heterologen Fusionspolypeptide können zum Beispiel veränderte Stärke oder Spezifität der Bindung zeigen. Fusionspartner enthalten Immunglobuline, bakterielle β-Galaktosidase, trpE, Protein A, β-Laktamase, alpha-Amylase Alkoholdehydrogenase und alpha-Mating Faktor der Hefe. Siehe Godowski et al., 1988.
Fusionsproteine werden typischerweise hergestellt entweder durch rekombinante Nukleinsäureverfahren, wie unten beschrieben, oder sie können chemisch synthetisiert werden. Techniken für die Synthese von Polypeptiden sind zum Bespiel in Merrifield (1963) beschrieben.
„Proteinreinigung" bezieht sich auf verschiedene Verfahren für die Isolation der KVLQT1-Polypeptide aus anderem biologischem Material, wie zum Beispiel aus Zellen, die mit rekombinanten Nukleinsäuren, welche für KVLQT1 kodieren, transformiert sind; sie sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können solche Polypeptide durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden unter Anwendung von z. B. Antikörpern, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden. Zahlreiche Verfahren der Proteinreinigung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten die Verfahren, die in Deutscher, 1990 und Scopes, 1982 beschrieben sind.
Die Begriffe „isoliert", „im Wesentlichen rein" und „im Wesentlichen homogen" werden austauschbar benutzt, um ein Protein oder ein Polypeptid zu beschreiben, welches von den Bestandteilen, welche es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt wurde. Ein monomeres Protein ist im Wesentlichen rein, wenn mindestens 60 bis 75 % einer Probe eine einzige Polypeptidsequenz zeigen. Ein im Wesentlichen reines Protein wird typischerweise etwa 60 bis 90 % w/w einer Proteinprobe ausmachen, noch gewöhnlicher etwa 95 % und vorzugsweise zu mehr als 99 % rein sein. Die Proteinreinheit oder -homogenität kann durch eine Reihe von Mitteln, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, angegeben werden, wie zum Beispiel durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt von Visualisierung einer einzigen Polypeptidbande nach dem Färben des Gels. Für bestimmte Zwecke kann eine höhere Auflösung mithilfe von HPLC oder anderen Mitteln, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind und welche für die Reinigung eingesetzt werden, bereitgestellt werden.
Ein KVLQT1-Protein ist im Wesentlichen frei von natürlich damit assoziierten Bestandteilen, wenn es von den nativen Kontaminationen, welches es in seinem natürlichen Zustand begleiten, abgetrennt ist. Demzufolge wird ein Polypeptid, welches chemisch synthetisiert oder in einem anderen Zellsystem als demjenigen, aus dem es ursprünglich stammt, synthetisiert wird, im Wesentlichen frei von seinen natürlich mit ihm assoziierten Bestandteilen sein. Ein Protein kann auch im Wesentlichen von natürlich damit assoziierten Bestandteilen frei gemacht werden, indem es mithilfe von Proteinreinigungstechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, isoliert wird.
Ein Polypeptid, welches als ein Expressionsprodukt einer isolierten oder manipulierten gentischen Sequenz produziert wird, ist ein „isoliertes Polypeptid", wie hierin benutzt, selbst wenn es in einem homologen Zelltyp exprimiert wird. Synthetisch hergestellte Formen oder Moleküle, die durch heterologe Zellen exprimiert werden, sind inhärent isolierte Moleküle.
„Rekombinante Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure, welche nicht natürlich vorkommt oder welche durch eine künstliche Kombination von zwei ansonsten getrennten Segmenten der Sequenz hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird oftmals entweder begleitet von chemischen Synthesemitteln oder von der künstlichen Manipulation von isolierten Segmenten von Nukleinsäuren, z. B. Gentechnologie. Eine solche Technik wird gewöhnlich durchgeführt, um ein Kodon durch ein redundantes Kodon zu ersetzen, welches für die gleiche oder eine konservative Aminosäure kodiert, während typischerweise eine Sequenzerkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird dies durchgeführt, um Nukleinsäuresegmente miteinander zu verbinden, die gewünschte Funktionen aufweisen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen.
„Regulatorische Sequenzen" beziehen sich auf diejenigen Sequenzen, die normalerweise innerhalb der 100 kb Kodierungsregion eines Locus liegen; sie können aber auch weiter von der Kodierungsregion entfernt liegen, was die Expression des Gens (einschließlich Transkription des Gens und Translation, Spleißen (Splicing), Stabilität oder Ähnliches der Boten-RNA) beeinflusst.
„Im Wesentlichen homolog oder ähnlich" Eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon ist „im Wesentlichen homolog" (oder „im Wesentlichen ähnlich") zu einer anderen Nukleinsäure oder einem Fragment davon, wenn sich bei einem optimalen Abgleich (mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder -deletionen) mit der anderen Nukleinsäure (oder ihrem Komplementärstrang) eine Identität der Nukleotidsequenz in mindestens etwa 60 % der Nukleotidbasen, gewöhnlich mindestens etwa 70 %, noch gewöhnlicher mindestens etwa 80 %, vorzugsweise mindestens etwa 90 % und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 95-98 % der Nukleotidbasen ergibt.
Um die Homologie zwischen zwei unterschiedlichen Nukleinsäuren zu bestimmen, muss die prozentuale Homologie mithilfe des BLASTN-Programms „BLAST 2 Sequences" bestimmt werden. Dieses Programm ist öffentlich zugänglich von dem National Center for Biotechnology Information (NCBI) über das Internet (http://www.ncbi.nhm.nih.gov/gorf/b12.html) (Altschul et al., 1997). Die Parameter, die zu benutzen sind, sind eine beliebige Kombination der Nachfolgenden mit den Ergebnissen für die höchste berechnete prozentuale Homologie (wie unten berechnet) und mit den Standardparametern in Klammern:

Program – blastn
Matrix – 0 BLOSUM62
Reward for a match – 0 oder 1 (1)
Penalty for a mismatch – 0, –1, –2, oder –3 (–2)
Open gap penalty – 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 (5)
Extension gap penalty – 0 oder 1 (1)
Gap x_dropoff – 0 oder 50 (50)
Expect – 10

Zusammen mit einer Vielzahl anderer Ergebnisse zeigt dieses Programm eine prozentuale Identität über die kompletten Stränge oder über Bereiche der beiden Nukleinsäuren, die abgeglichen werden. Das Programm zeigt als Teil der Ergebnisse einen Abgleich und eine Identität der beiden miteinander verglichenen Stränge. Wenn die Strange von gleicher Länge sind, dann wird die Identität über die gesamte Länge der Nukleinsäuren berechnet. Wenn die Strange nicht gleich lang sind, dann wird die Länge der kürzeren Nukleinsäure eingesetzt. Wenn die Nukleinsäuren über einen Abschnitt ihrer Sequenzen ziemlich ähnlich sind, aber über den Rest ihrer Sequenzen unterschiedlich sind, wird das Programm „BLAST 2 Sequences" eine Identität nur über die ähnlichen Abschnitte zeigen und diese Abschnitte werden einzeln dargestellt. Zum Zweck der Homologiebestimmung hierin bezieht sich die prozentuale Homologie auf die kürzere der beiden Sequenzen, die miteinander verglichen werden. Wenn eine der Regionen in unterschiedlichem Abgleich mit unterschiedlichen prozentualen Identitäten dargestellt ist, werden die Abgleiche verwendet, die die größte Homologie erbringen. Die Durchschnittberechnung wird durchgeführt wie in diesem Beispiel von SEQ ID NO: 5 und 6.
Das Programm „BLAST 2 Sequences" zeigt unterschiedliche Abgleiche dieser beiden Nukleinsäuren in Abhängigkeit von den Parameter, welche ausgewählt werden. Als Beispiele wurden vier Reihen von Parametern ausgewählt, um die SEQ ID NO: 5 und 6 (gap x_dropoff betrug 50 für alle Fälle) mit den Ergebnissen, die in Tabelle 1 gezeigt sind, zu vergleichen. Es ist zu beachten, dass keine der ausgewählten, in Tabelle 1 gezeigten Parameterreihen notwendigerweise die beste Reihe an Parametern für den Vergleich dieser Sequenzen ist. Die prozentuale Homologie wird berechnet, indem für jede Region, die eine Identität aufweist, der Anteil an Basen des kürzeren Strangs innerhalb einer Region mit dem Prozentsatz an Identität in dieser Region multipliziert und alles zusammengezählt wird. Zum Beispiel ist unter Einsatz der ersten Reihe an Parametern, die in Tabelle 1 gezeigt sind, SEQ ID NO: 5 die kurze Sequenz (63 Basen) und es sind zwei Regionen mit Identität angegeben, wobei die erste die Basen 4-29 (26 Basen) von SEQ ID NO: 5 mit einer 92 %igen Identität zu SEQ ID NO: 6 und die zweite die Basen 39-59 (21 Basen) von SEQ ID NO: 5 mit einer 100 %igen Identität zu SEQ ID NO: 6 aufweist. Die Basen 1-3, 30-38 und 60-63 (16 Basen) sind nicht mit einer Identität zu SEQ ID No: 6 dargestellt. Die prozentuale Homologie wird berechnet als: (26/63)(92) + (21/63)(100) + (16/63)(0) = 71,3 % Homologie. Die Prozentsätze an Homologie, die unter Verwendung jeder einzelnen der vier Parameterreihen berechnet werden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Es sind verschiedene andere Kombinationen von Parametern möglich, diese sind aber aus Gründen der kurzen Übersichtlichkeit nicht angegeben. Es ist zu sehen, dass jede Reihe an Parameter zu einer anderen berechneten prozentualen Homologie führte. Da das Ergebnis benutzt wird, welches die höchste prozentuale Homologie zeigt, würde man allein basierend auf diesen vier Parameterreihen angeben, dass SEQ ID NO: 5 und 6 eine 87 %ige Homologie besitzen. Wieder ist zu beachten, dass der Einsatz der anderen Parameter eine noch höhere Homologie für SEQ ID NO: 5 und 6 zeigen könnte, aus Gründen der Kurzübersicht wurden allerdings nicht alle möglichen Ergebnisse dargestellt.

Alternativ existiert eine wesentliche Homologie (oder Ähnlichkeit), wenn eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon mit einer anderen Nukleinsäure (oder einem Komplementärstrang davon) unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an einem Strang oder seinem Komplement hybridisiert. Tabelle 1

Parameterwerte				Regionen der Identität (%)		Homologie
Match	Mismatch	Open Gap	Extension Gap	Regionen der Identität (%)		Homologie
1	–2	5	1	4-29 von 5 und 5-31 von 6 (92 %)	39-59 von 5 und 71-91 von 6 (100 %)	71,3
1	–2	2	1	4-29 von 5 und 5-31 von 6 (92 %)	33-63 von 5 und 64-96 von 6 (93 %)	83,7
1	–1	5	1	–	30-59 von 5 und 61-91 von 6 (93 %)	44,3
1	–1	2	1	4-29 von 5 und 5-31 von 6 (92 %)	30-63 von 5 und 61-96 von 6 (91 %)	87,1

Eine Selektivität der Hybridisierung besteht, wenn die Hybridisierung, welche im Wesentlichen selektiver ist als vollständiges Fehlen von Spezifität, auftritt. Typischerweise wird eine selektive Hybridisierung auftreten, wenn es mindestens etwa 55 % Homologie über einen Abschnitt von mindestens etwa 14 Nukleotiden gibt, vorzugsweise mindestens etwa 65 %, insbesondere mindestens etwa 75 % und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 90 %. Siehe Kanehisa, 1984. Die Länge des Homologievergleichs, wie beschrieben, kann über längere Abschnitte erfolgen und wird bei bestimmten Ausführungsformen oft einen Abschnitt von mindestens etwa neun Nukleotiden, gewöhnlich mindestens etwa 20 Nukleotiden, noch gewöhnlicher mindestens etwa 24 Nukleotiden, typischerweise mindestens etwa 28 Nukleotiden, noch typischer mindestens etwa 32 Nukleotiden und vorzugsweise mindestens etwa 36 oder mehr Nukleotiden umfassen.
Die Nukleinsäurehybridisierung wird durch solche Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel zusätzlich zu der Basenzusammensetzung, Länge der Komplementärstränge und der Anzahl an Mismatches von Nukleotidbasen zwischen den hybridisierenden Nukleinsäuren beeinflusst, wie für den Fachmann auf dem Gebiet leicht zu erkennen sein wird. Zu den stringenten Temperaturbedingungen zählen im Allgemeinen Temperaturen, die 30 °C übersteigen, typischerweise 37 °C übersteigen und vorzugsweise über 45 °C liegen. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlich weniger als 1000 mM, typischerweise weniger als 500 mM und vorzugsweise weniger als 200 mM betragen. Allerdings ist die Kombination der Parameter viel wichtiger als die Messung eines einzelnen Parameters. Die stringenten Bedingungen sind abhängig von der Länge der Nukleinsäure und der Basenzusammensetzung der Nukleinsäure und können durch Techniken bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Siehe z. B. Wetmur und Davidson, 1968.
Sondensequenzen können auch spezifisch mit Doppelstrang-DNA unter bestimmten Bedingungen hybridisieren, um Dreistrang-DNA-Komplexe oder DNA-Komplexe höherer Ordnung zu bilden. Die Herstellung solcher Sonden und geeignete Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Begriffe „im Wesentlichen homolog" oder „im Wesentlichen identisch" bedeuten, wenn sie sich auf Polypeptide beziehen, dass das Polypeptid oder das Protein, welches in Frage kommt, zu mindestens etwa 30 % mit einem vollständigen natürlich vorkommenden Protein oder einem Teil davon, gewöhnlich zu mindestens etwa 70 %, noch gewöhnlicher zu mindestens etwa 80 %, vorzugsweise zu mindestens etwa 90 % und noch mehr bevorzugt zu mindestens etwa 95 % identisch ist.
Für Polypeptide wird die Homologie typischerweise mithilfe von Software für die Sequenzanalyse bestimmt. Siehe z. B. das Sequence Analysis Software Package von Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. Die Proteinanalysesoftware gleicht ähnliche Sequenzen miteinander ab, indem sie Grade an Homologie verwendet, die verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen zugewiesen wurden. Konservative Substitutionen beinhalten typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin, Serin Threonin; Lysin, Arginin und Phenylalanin, Tyrosin.
„im Wesentlichen ähnliche Funktion" bezieht sich auf die Funktion einer modifizierten Nukleinsäure oder auf ein modifiziertes Protein mit Bezug auf die Wildtyp-KVLQT1-Nukleinsäure oder das Wildtyp-KVLQT1-Polypeptid. Das modifizierte Polypeptid wird im Wesentlichen homolog zu dem Wildtyp-KVLQT1-Polypeptid sein und wird im Wesentlichen die gleiche Funktion haben. Das modifizierte Polypeptid kann eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen und/oder modifizierte Aminosäuren enthalten. Zusätzlich zu der ähnlichen Funktion kann das modifizierte Polypeptid weiter hilfreiche Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise eine längere Halbwertszeit. Die ähnliche Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids kann im Wesentlichen gleich derjenigen Aktivität des Wildtyp-KVLQT1-Polypeptids sein. Alternativ kann die ähnliche Funktion (Aktivität) des modifizierten Polypeptids höher sein als die Aktivität des Wildtyp-KVLQT1-Polypeptids. Das modifizierte Polypeptid wird mithilfe konventioneller Techniken synthetisiert oder es wird durch eine modifizierte Nukleinsäure kodiert und mithilfe konventioneller Techniken hergestellt. Die modifizierte Nukleinsäure wird durch konventionelle Techniken hergestellt. Eine Nukleinsäure mit einer Funktion, die im Wesentlichen ähnlich zu der Funktion des Wildtyp-KVLQT1-Gens ist, produziert das oben beschriebene modifizierte Protein.
Ein Polypeptid „Fragment", „Teil" oder „Segment" ist ein Abschnitt von Aminosäureresten von mindestens etwa fünf bis sieben benachbarten Aminosäuren, oft von mindestens etwa sieben bis neun benachbarten Aminosäuren, typischerweise von mindestens etwa neun bis 13 benachbarten Aminosäuren und noch mehr bevorzugt von mindestens etwa 20 bis 30 oder mehr benachbarten Aminosäuren.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, falls löslich, können mit einem Festphasenträger, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Säulenpackmaterialien (z. B. Sepharosekügelchen) Magnetkügelchen, Glaswolle, Kunststoff, Metall, Polymergelen, Zellen oder anderen Substraten gekoppelt sein. Solche Träger können die Form von zum Beispiel Kügelchen, Wells, Dipsticks oder Membranen aufweisen.
„Zielregion" bezieht sich auf eine Region der Nukleinsäure, welche amplifiziert und/oder nachgewiesen wird. Der Begriff „Zielsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit welcher eine Sonde oder ein Primer ein stabiles Hybrid unter gewünschten Bedingungen bilden wird.
Die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet, sofern nicht anders angegeben, konventionelle Techniken aus Chemie und Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA-Technik, Genetik und Immunologie. Siehe z. B. Maniatis et al., 1982, Sambrook et al., 1989, Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand 1992, Guthrie und Fink, 1991. Eine allgemeine Diskussion von Techniken und Materialien für humanes Genmapping, einschließlich Mapping von humanem Chromosom 1 ist bereitgestellt z. B. in White und Lalouel, 1988.
Herstellung rekombinanter oder chemisch synthetisierter Nukleinsäuren: Vektoren, Transformation, Wirtszellen
Große Mengen an Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt werden. Natürliche oder synthetische Polynukleotidfragmente, die für ein gewünschtes Fragment kodieren, werden in rekombinante Polynukleotidkonstrukte, gewöhnlich DNA-Konstrukte, die in eine prokaryotische Zelle eingeführt und dort repliziert werden können, inkorporiert. Normalerweise werden die Polynukleotidkonstrukte für die Replikation in einem einzelligen Wirt, wie beispielsweise Hefe oder Bakterien, geeignet sein, können aber auch zur Einschleusung in (mit und ohne Integration in das Genom) kultivierte Säugetierzellen oder Pflanzenzellen oder andere eukaryotische Zelllinien dienen. Die Reinigung für Nukleinsäuren, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert werden, sind beschrieben, z. B. in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können auch durch chemische Synthese hergestellt werden, z. B. durch das Phosphoramidit-Verfahren, das von Beauacage und Caruthers (1981) beschrieben wurde, oder das Triester-Verfahren nach Matteucci und Caruthers (1981) und sie können mit kommerziell erhältlichen automatischen Oligonukleotidsynthesizern hergestellt werden. Ein Doppelstrangfragment kann aus dem Einzelstrangfragment aus chemischer Synthese hergestellt werden, indem entweder der Komplementärstrang synthetisiert und mit dem Strang unter geeigneten Bedingungen verschmolzen wird oder indem der Komplementärstrang mithilfe von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz hinzugefügt wird.
Polynukleotidkonstrukte, die zur Einführung in einen prokaryotischen oder einen eukaryotischen Wirt hergestellt wurden, können ein Replikationssystem umfassen, das vom Wirt erkannt wird, einschließlich des beabsichtigten Polynukleotidfragments, welches für das gewünschte Polypeptid kodiert, und sie werden vorzugsweise auch für Transkription und Translation initialregulatorische Sequenzen beinhalten, die funktionell mit dem das Polypeptid kodierenden Segment verbunden sind. Expressionsvektoren können zum Beispiel ein Original der Replikation oder eine autonome Replikationssequenz (ARS) sowie Expressionskontrollsequenzen, einen Promoter, einen Enhancer und erforderliche Informationsverabeitungsstellen, wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, transkriptionelle Terminatorsequenzen und mRNA stabilisierende Sequenzen enthalten. Solche Vektoren können durch Mittel der Standardreplikationstechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind und diskutiert werden, zum Beispiel in Sambrook et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992 hergestellt werden.
Ein geeigneter Promoter und andere notwendige Vektorsequenzen werden so ausgesucht, dass sie in dem Wirt funktionell sind und können, falls geeignet, diejenigen enthalten, die natürlicherweise mit dem KVLQT1-Gen assoziiert sind. Beispiele für brauchbare Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind in Sambroock et al., 1989 oder Ausubel et al., 1992 beschrieben; siehe auch z. B. Metzger et al., 1988. Viele hilfreiche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und können von solchen Händlern wie zum Beispiel von Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech und anderen erhalten werden. Promoter wie beispielsweise die trp-, lac- und Phagen-Promoter, tRNA-Promoter und glykolytische Enzympromoter können in prokaryotischen Wirten eingesetzt werden. Hilfreiche Hefepromoter umfassen Promoterregionen für Metallthionein, 3-Phosphoglyceratkinase und andere glykolytische Enzyme, wie beispielsweise Enolase oder Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Enzyme, die verantwortlich sind für Maltose- und Galaktoseverfügbarkeit und andere. Vektoren und Promoter, die für den Einsatz bei der Hefeexpression geeignet sind, werden ferner in Hitzeman et al., EP 73,675A beschrieben. Geeignete nicht native Promoter aus Säugetieren könnten die frühen und späten Promoter aus SV40 (Fiers et al., 1978) oder Promoter, die aus dem murinen Moloney-Leukemia-Virus stammen, dem Maus-Tumorvirus, Vogel-Sarcom-Viren, Adenvirus II, Rinder-Papillomavirus oder Polyomavirus enthalten. Promoter aus Insekten können aus dem Baculovirus abgeleitet werden. Zusätzlich kann das Konstrukt mit einem amplifizierbaren Gen (z. B. DHFR) verbunden sein, sodass mehrfache Kopien des Gens hergestellt werden können. Geeignete Enhancer und andere Expressionskontrollsequenzen finden sich auch in Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983). Siehe auch z. B. US-Patentschrift Nr. 5,691,198 ; 5,735,500 ; 5,747,469 und 5,436,146 .
Während solche Expressionsvektoren sich autonom replizieren können, können sie auch durch Einführen in das Genom der Wirtszelle mithilfe von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, repliziert werden.
Expressions- und Klonvektoren werden möglicherweise einen auswählbaren Marker enthalten, ein Gen, welches für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle nötig ist. Die Anwesenheit dieses Gens gewährleistet das Wachstum von nur denjenigen Wirtszellen, die die Inserts exprimieren. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, welche a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen toxischen Substanzen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat usw. b) auxotrophe Mängel komplementieren oder c) wichtige Nährstoffe liefern, die aus dem komplexen Medium nicht zur Verfügung stehen, z. B. das Gen, das für D-Alanin Racemase für Bacilli kodiert. Die Wahl für den geeigneten Marker wird von der Wirtszelle abhängig sein und geeignete Marker für verschiedene Wirte sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Vektoren, die die interessierenden Nukleinsäuren enthalten, können in vitro transkribiert werden und die entstehende RNA, kann in die Wirtszelle mithilfe von gut bekannten Verfahren, z. B. durch Injektion (siehe Kubo et al., 1988) eingebracht werden oder die Vektoren können direkt in die Wirtszellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren eingeschleust werden, welche in Abhängigkeit von der Wirtszelle variieren, einschließlich Elektroporation, Transfektion unter Verwendung von Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran oder andere Substanzen, Mikroprojektilbombardement, Lipofektion (wobei der Vektor ein infektiöses Agens ist, wie zum Beispiel ein retrovirales Genom) und andere Verfahren. Siehe allgemein Sambrook et al., 1989 und Ausubel et al., 1992. Das Einschleusen der Polynukleotide in die Wirtszellen durch ein beliebiges auf dem Fachgebiet bekanntes Verfahren, einschließlich inter alia, denjenigen, die oben beschrieben sind, wird hierin als „Transformation" bezeichnet. Bei den Zellen, in welche Nukleinsäuren, wie oben beschrieben, eingeschleust wurden, sind auch die Nachkommen solcher Zellen miteingeschlossen.
Große Mengen der Nukleinsäuren und der Polypeptide der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch Expression der KVLQT1-Nukleinsäure oder Teilen davon in Vektoren oder anderen Expressionsvehikeln in kompatiblen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen. Die am häufigsten verwendeten prokaryotischen Wirte sind Stämme von Escherichia coli, obwohl auch andere Prokaryonten, wie beispielsweise Bacillus subtilis oder Pseudomonas benutzt werden können.
Säugetier- oder andere eukaryotische Wirtszellen, wie zum Beispiel Zellen von Hefe-, filamentöse Pilz-, Pflanzen-, Insekten- , Amphibien- oder Vogelspezies können auch bei der Produktion der Proteine der vorliegenden Erfindung hilfreich sein. Die Vermehrung von Säugetierzellen in Kultur ist per se bekannt. Siehe Jakoby und Pastan (Hrsg.) (1979). Beispiele für häufig eingesetzte Säugetierwirtszelllinien sind VERO und HeLa-Zellen, Chinesische Hamsterovarzellen (CHO) und WI38, BHK und COS-Zelllinien, obwohl der praktisch arbeitende Fachmann auf diesem Gebiet auch zu schätzen wissen wird, dass andere Zelllinien geeignet sein können, z. B. um eine höhere Expression, gewünschte Glykosylierungsmuster oder andere Merkmale bereitzustellen. Ein Beispiel für eine häufig verwendete Insektenzelllinie ist SF9.
Klone werden ausgewählt mithilfe von Marker in Abhängigkeit von der Art der Vektorkonstruktion. Der Marker kann auf dem gleichen oder einem anderen DNA-Molekül sein, vorzugsweise auf dem gleichen DNA-Molekül. Bei eukaryotischen Wirten kann der Transformant ausgewählt werden, z. B. anhand von Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder anderen Antibiotika. Ein bestimmtes Produkt, welches basierend auf Temperaturempfindlichkeit hergestellt wird, kann auch als ein geeigneter Marker dienen.
Prokaryotische oder eukaryotische Zellen, die mit den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert wurden, werden nicht nur für die Produktion der Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung nützlich sein, sondern auch zum Beispiel für die Untersuchung der Merkmale von KVLQT1-Polypeptiden.
Die Sonden und Primer, die auf der KVLQT1-Gensequenz basieren, die hierin offenbart ist, werden benutzt, um homologe KVLQT1-Gensequenzen und Proteine in anderen Spezies zu identifizieren. Diese Gensequenzen und Proteine werden in den diagnostischen, prognostischen, therapeutischen Verfahren und Verfahren zum Wirkstoffscreening, die hierin für die Spezies, aus denen sie isoliert wurden, eingesetzt werden, benutzt.
Anwendungsverfahren: Wirkstoffscreening
Die Erfindung ist besonders geeignet für das Screenen von Verbindungen mithilfe von KVLQT1-Proteinen in transformierten Zellen, transfizierten Oocyten oder transgenen Tieren. Da Mutationen in dem KVLQT1-Protein die Funktion des kardialen I_KS-Kaliumkanals verändern können, werden die Kandidatenwirkstoffe auf Wirkung auf den Kanal gescreent mithilfe von Zellen, die ein normales KCNE1-Protein und ein mutiertes KVLQT1-Protein enthalten. Der Wirkstoff wird zu den Zellen in Kultur gegeben oder einem transgenen Tier verabreicht und die Wirkung auf den induzierten Strom des I_KS-Kaliumkanals wird mit dem induzierten Strom einer Zelle oder einem Tier verglichen, welche(s) das Wildtyp-KVLQT1 und minK aufweist. Wirkstoffkandidaten, welche den induzierten Strom auf einen normaleren Level einstellen, werden für die Behandlung oder Prävention von LQTS hilfreich sein.
Diese Erfindung ist insbesondere hilfreich für das Screenen von Verbindungen, indem das KVLQT1-Polypeptid oder das Bindungsfragment davon in einer beliebigen Technik aus einer Reihe von Techniken für das Wirkstoffscreening eingesetzt wird.
Das KVLQT1-Polypeptid oder Fragment, welches in solch einem Test eingesetzt wird, ist entweder frei in Lösung oder an einen festen Träger fixiert oder befindet sich auf einer Zelloberfläche. Ein Verfahren für das Wirkstoffscreening verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, welche mit rekombinanten Polynukleotiden, die das Polypeptid oder Fragment exprimieren, vorzugsweise in kompetitiven Bindungsassays, stabil transformiert sind. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder fixierter Form, können für Standardbindungsassays benutzt werden. Gemessen werden kann zum Beispiel die Bildung von Komplexen zwischen einem KVLQT1-Polypeptid oder Fragment und dem zu untersuchenden Agens, oder es kann das Ausmaß, bis zu welchem die Bildung eines Komplexes zwischen einem KVLQT1-Polypeptid oder Fragment und einem bekannten Liganden durch das zu untersuchende Agens beeinträchtigt wird, ermittelt werden.
Daher liefert die vorliegende Erfindung Verfahren für das Screenen auf Wirkstoffe, welche das in Kontakt treten eines solchen Agens mit einem KVLQT1-Polypeptid oder Fragment davon und das Untersuchen (I) auf Anwesenheit eines Komplexes zwischen dem Agens und dem KVLQT1-Polypeptid oder Fragment oder (ii) auf Anwesenheit eines Komplexes zwischen einem KVLQT1-Polypeptid oder Fragment und einem Liganden durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, umfassen. In solchen kompetitiven Bindungsassays wird das KVLQT1-Polypeptid oder Fragment typischerweise markiert. Freies KVLQT1-Polypeptid oder Fragment wird von dem in einem Protein-Proteinkomplex vorliegenden abgetrennt und die Menge an freiem (d. h. nicht komplexiertem) Marker ist ein Maß für die Bindung des zu testenden Agens mit KVLQT1 beziehungsweise seiner Einflussnahme auf die KVLQT1-Ligandbindung. Bestimmt werden kann auch die Menge an gebundenem statt an freiem KVLQT1. Es ist auch möglich, den Liganden zu markieren anstelle des KVLQT1 und die Menge an Ligandbindung an KVLQT1 bei vorhandenem oder fehlendem zu testendem Wirkstoff zu messen.
Eine andere Technik für Wirkstoffscreening bietet einen hohen Durchsatz für das Screenen von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität zu den KVLQT1-Polypeptiden und wird detailliert in Geysen (veröffentlichte PCT-Anmeldungen WO 84/03564 ) beschrieben. Kurz gesagt, wird eine große Anzahl von unterschiedlichen kleinen Peptidtestverbindungen auf einem festen Substrat, wie zum Beispiel Kunststoffpins, oder auf manchen anderen Oberflächen synthetisiert. Die Peptidtestverbindungen werden mit KVLQT1-Polypeptid zur Reaktion gebracht und gewaschen. Gebundenes KVLQT1-Polypeptid wird dann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, nachgewiesen.
Gereinigtes KVLQT1 kann direkt auf Platten zur Verwendung in den zuvor erwähnten Wirkstoffscreeningtechniken aufgebracht werden. Es können jedoch nicht neutralisierende Antikörper für die Polypeptide eingesetzt werden, um Antikörper abzufangen, damit die KVLQT1-Polypeptide auf der festen Phase immobilisiert werden.
Mit dieser Erfindung wird auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoffscreeningassays in Betracht gezogen, in welchen neutralisierende Antikörper, welche zu einer spezifischen Bindung an KVLQT1-Polypeptid, fähig sind, mit einer Testverbindung um die Bindung an dem KVLQT1-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper dazu benutzt werden, das Vorhandensein von einem beliebigen Peptid nachzuweisen, welches eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem KVLQT1-Polypeptid gemeinsam hat.
Die oben genannten Screeningverfahren sind nicht auf Assays beschränkt, bei denen nur KVLQT1 verwendet wird, sondern sind auch anwendbar für die Untersuchung von KVLQT1-Proteinkomplexen. Es wird die Wirkung der Wirkstoffe auf die Aktivität dieses Komplexes analysiert.
Gemäß dieser Verfahren sind die folgenden Assays Beispiele für Assays, welche für das Screenen auf Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden können.
Ein mutiertes KVLQT1 (per se oder als Teil eines Fusionsproteins) wird mit einem Wildtyp-Protein gemischt (per se oder als Teil eines Fusionsproteins), an welches das Wildtyp-KVLQT1 bindet. Diese Mischung erfolgt sowohl in Anwesenheit eines Wirkstoffs als auch beim Fehlen des Wirkstoffs und es wird die Menge an Bindungen des mutierten KVLQT1 an dem Wildtyp-Protein gemessen. Wenn es zu mehr Bindungen in Anwesenheit des Wirkstoffes kommt als wenn dieser fehlt, dann ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat für die Behandlung von LQTS aufgrund einer Mutation in KVLQT1.
Ein Wildtyp-KVLQT1 (per se oder als Teil eines Fusionsproteins) wird mit einem Wildtyp-Protein gemischt (per se oder als Teil eines Fusionsproteins), an welches das Wildtyp-KVLQT1 bindet. Diese Mischung erfolgt sowohl in Anwesenheit eines Wirkstoffs als auch beim Fehlen des Wirkstoffs und es wird die Menge an Bindungen des Wildtyp-KVLQT1 an dem Wildtyp-Protein gemessen. Wenn es zu mehr Bindungen in Anwesenheit des Wirkstoffes kommt als wenn dieser fehlt, dann ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat für die Behandlung von LQTS aufgrund einer Mutation in KVLQT1.
Ein mutiertes Protein, welches als ein Wildtyp-Protein an KVLQT1 (per se oder als Teil eines Fusionsproteins) bindet, wird mit einem Wildtyp-KVLQT1 (per se oder als Teil eines Fusionsproteins) gemischt. Diese Mischung erfolgt sowohl in Anwesenheit eines Wirkstoffs als auch beim Fehlen des Wirkstoffs und es wird die Menge an Bindungen des mutierten Proteins an dem Wildtyp-Protein gemessen. Wenn es zu mehr Bindungen in Anwesenheit des Wirkstoffes kommt als wenn dieser fehlt, dann ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat für die Behandlung von LQTS, welches durch eine Mutation in dem Gen, das für das Protein kodiert, verursacht wird.
Das Polypeptid der Erfindung kann auch für das Screenen von Verbindungen eingesetzt werden, die als ein Ergebnis von kombinatorischer Bibliothekstechnik entwickelt wurden. Die kombinatorische Bibliothekstechnik bietet einen effizienten Weg für das Testen einer potenziell großen Anzahl von unterschiedlichen Substanzen auf ihre Fähigkeit hin, die Aktivität eines Polypeptids zu modulieren. Solche Bibliotheken und ihre Nutzung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Peptid-Bibliotheken werden bevorzugt eingesetzt. Siehe zum Beispiel WO 97/02048 .
Kurz gesagt, kann ein Verfahren für das Screenen einer Substanz, welche die Aktivität eines Polypeptids moduliert, das in Kontakt treten von einer Testsubstanz oder mehreren Testsubstanzen mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, das Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids in vergleichbarem Reaktionsmedium, das nicht mit der Testsubstanz oder den Testsubstanzen behandelt wurde, beinhalten. Ein Unterschied in der Aktivität zwischen den behandelten und unbehandelten Polypeptiden ist indikativ für einen modulierenden Effekt der betreffenden Testsubstanz oder Testsubstanzen.
Vor oder während dem Screenen auf Modulation der Aktivität können die Testsubstanzen auf ihre Fähigkeit hin gescreent werden, mit dem Polypeptid zu interagieren, z. B. in einem Hefe Di-Hybrid-System (z. B. Bartel et al., 1993; Fields und Song, 1989, Chevray und Nathans, 1992; Lee et al., 1995). Dieses System kann als ein grobes Screening vor dem Testen einer Substanz auf ihre tatsächlich Fähigkeit zur Modulation der Aktivität des Polypeptids benutzt werden. Alternativ könnte das Screening verwendet werden, um Testsubstanzen auf ihre Bindung an einen KVLQT1 spezifischen Bindungspartner zu untersuchen oder um Mimetika für das KVLQT1-Polypeptid zu finden.
Folgend auf die Identifizierung einer Substanz, welche die Polypeptidaktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz weiter untersucht werden. Zudem kann sie hergestellt und/oder in einer Zubereitung benutzt werden, d. h. Herstellung oder Formulierung oder eine Zusammensetzung, wie zum Beispiel ein Medikament, eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Wirkstoff. Diese können dann an Individuen verabreicht werden.
Somit ist die vorliegende Erfindung in zahlreichen Aspekten erweiterbar nicht nur auf eine Substanz, die mithilfe eines Nukleinsäuremoleküls als einem Modulator der Polypeptidaktivität gemäß dem hierin Offenbarten identifiziert wurde, sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, einen Wirkstoff oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfassen, ein Verfahren umfassend die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung, die eine solche Substanz enthält, ein Verfahren umfassend die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten, z. B. für die Behandlung (welche eine präventive Therapie beinhalten kann) von LQTS, auf den Einsatz einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Verabreichung, z. B. für die Behandlung von LQTS und auf ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Vermischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff, einem Vehikel oder Trägerstoff und optional anderen Inhaltsstoffen umfasst.
Eine Substanz, die als ein Modulator einer Polypeptidfunktion identifiziert wurde, kann von Natur aus ein Peptid oder ein Nicht-Peptid sein. Nicht-Peptide „kleine Moleküle" werden oft für viele pharmazeutische Anwendungen in vivo bevorzugt. Dementsprechend kann ein Mimetikum oder eine ähnliche Substanz (insbesondere bei einem Peptid) für pharmazeutische Nutzung hergestellt werden.
Das Designen von Mimetika für eine bekannte pharmazeutisch aktive Verbindung ist eine bekannte Vorgehensweise bei der Entwicklung von Pharmazeutika basierend auf einer „Lead"-Verbindung. Dies könnte wünschenswert sein, wenn die aktive Verbindung schwer oder kostenintensiv zu synthetisieren ist oder wenn sie für eine bestimmte Verabreichungsart ungeeignet ist, z. B. sind reine Peptide als aktive Agenzien für orale Zusammensetzungen nicht geeignet, da sie dazu neigen, rasch durch Proteasen im Nahrungskanal abgebaut zu werden. Mimetisches Design, Synthese und Tests werden allgemein eingesetzt, um ein wahlloses Screenen einer großen Anzahl von Molekülen für eine Zieleigenschaft zu vermeiden.
Es werden normalerweise verschiedene Schritte beim Design einer mimetischen Form von einer Verbindung mit einer gegebenen Zieleigenschaft eingesetzt. Zuerst werden die jeweiligen Teile der Verbindung, die kritisch und/oder wichtig für die Bestimmung der Zieleigenschaft sind, festgelegt. Im Fall eines Peptids kann dies erfolgen durch systematisches Variieren der Aminosäurereste in dem Peptid, z. B. durch nacheinander folgendes Ersetzen eines jeden Restes. Normalerweise werden Alaninscans von dem Peptid benutzt, um solche Peptidmotive zu verbessern. Diese Teile oder Reste, die die aktive Region der Verbindung darstellen, sind bekannt als ihr „Pharmakophor".
Wenn das Pharmakophor gefunden ist, wird seine Struktur gemäß seinen physikalischen Eigenschaften modelliert, z. B. Stereochemie, Bindung, Größe und/oder Ladung unter Verwendung von Daten aus einer Reihe von Untersuchungstechniken, z. B. spektroskopische Techniken, Daten aus der Röntgendiffraktion und NMR-Spektroskopie. Computeranalyse, Ähnlichkeitsmapping (welches die Ladung und/oder das Volumen eines Pharmakophors zum Vorbild nimmt statt die Bindung zwischen den Atomen) und andere Techniken können in diesem Modellierungsverfahren eingesetzt werden.
In einer Abwandlung dieser Vorgehensweise werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und seine Bindungspartner modelliert. Dies kann besonders hilfreich sein, wo der Ligand und/oder der Bindungspartner die Konformation bei der Bindung verändern und es dem Modell ermöglichen, dies beim Design des Mimetikums zu berücksichtigen.
Dann wird ein Template-Molekül ausgewählt, an welchem chemische Gruppen, welche das Pharmakophor nachahmen, angebracht werden können. Das Template-Molekül und die chemischen Gruppen, die darauf angebracht sind, können bequem ausgesucht werden, sodass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, möglicherweise pharmakologisch akzeptabel ist und in vivo nicht zerfällt, während es die biologische Aktivität der Lead-Verbindung behält. Alternativ kann, wenn das Mimetikum auf einem Peptid basiert, weitere Stabilität erreicht werden, indem das Peptid zyklisiert wird und seine Steifigkeit damit erhöht wird. Das Mimetikum oder die Mimetika, die durch diese Vorgehensweise gefunden werden, können dann gescreent werden, um zu sehen, ob sie die Zieleigenschaften aufweisen oder bis zu welchem Maß, sie diese zeigen. Eine weitere Optimierung oder Modifizierung kann dann ausgeführt werden, um schlussendlich ein Mimetikum oder mehrere Mimetika für das Testen in vivo oder für klinische Tests zu erhalten.
Anwendungsverfahren: Nukleinsäurediagnose und diagnostische Kits
Um ein KVLQT1-Allel nachzuweisen, das ein Individuum für LQTS prädisponiert, wird eine biologische Probe, wie zum Beispiel Blut, vorbereitet und auf Anwesenheit oder Fehlen der Suszeptibilitätsallele von KVLQT1 analysiert. Um das Vorliegen eines LQTS nachzuweisen oder als ein prognostischer Faktor, wird eine biologische Probe vorbereitet und auf die Anwesenheit oder das Fehlen der mutierten Allele von KVLQT1 analysiert. Ergebnisse dieser Tests und Informationen zur Interpretation werden an den Gesundheitsdienstleister zur Weitergabe an die untersuchte Person übermittelt. Solche Diagnosen können von diagnostischen Labors durchgeführt werden oder es werden alternativ diagnostische Kits hergestellt und an die Gesundheitsdienstleister oder an Privatpersonen für die Selbstdiagnose verkauft.
Anfänglich umfasst das Screeningverfahren die Amplifikation der betreffenden KVLQT1-Sequenzen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bezieht sich das Screeningverfahren auf eine Strategie, die nicht auf PCR basiert. Solche Screeningverfahren beinhalten Zwei-Schritt-Marker-Amplifikation, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Sowohl mit PCR-basierten als auch mit nicht-PCR-basierten Strategien können Zielsequenzen mit einem hohen Maß an Empfindlichkeit nachgewiesen werden.
Das populärste Verfahren, das heutzutage eingesetzt wird, ist die Zielamplifiktion. Hierbei wird die Zielnukleinsäuresequenz mit Polymerasen amplifiziert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren mithilfe der Polymerase-basierten Amplifikation ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). Die Polymerasekettenreaktion und andere Poylmerase-basierte Amplifikationsassays können einen mehr als millionenfachen Anstieg der Anzahl der Kopien durch den Einsatz von Polymerase-basierten Amplifikationszyklen erreichen. Wenn die entstandene Nukleinsäure amplifiziert ist, kann sie sequenziert werden oder als Substrat für DNA-Sonden verwendet werden.
Wenn die Sonden benutzt werden, um die Anwesenheit der Zielsequenzen nachzuweisen, kann die zu analysierende biologische Probe, zum Beispiel Blut oder Serum, behandelt werden, falls gewünscht, um die Nukleinsäuren zu extrahieren. Die Probenukleinsäure kann auf zahlreiche Arten vorbereitet werden, um den Nachweis der Zielsequenz zu erleichtern, z. B. Denaturierung, Restriktionsverdauung, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die Zielregion der Analytnukleinsäure muss normalerweise mindestens teilweise einsträngig sein, um Hybride mit der Zielsequenz der Sonde zu bilden. Wenn die Sequenz von Natur aus einsträngig ist, ist keine Denaturierung nötig. Ist die Sequenz allerdings doppelsträngig, muss die Sequenz vermutlich denaturiert werden. Die Denaturierung kann durch verschiedene Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ausgeführt werden.
Analytnukleinsäure und Sonde werden unter Bedingungen inkubiert, welche eine stabile Hybridbildung der Zielsequenz in der Sonde mit der putativen Zielsequenz in dem Analyt fördern. Die Region der Sonden, welche benutzt wird, um den Analyten zu binden, kann vollständig komplementär zu der Zielregion des humanen Chromosoms 11 für KVLQT1 gestaltet werden. Daher sind stark stringente Bedingungen wünschenswert, um falsch positive Ergebnisse zu verhindern. Allerdings werden stark stringente Bedingungen nur benutzt, wenn die Sonden komplementär zu Regionen des Chromosoms sind, welche einzigartig in dem Genom vorkommen. Die Stringenz der Hybridisierung wird festgelegt durch eine Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschverfahrens, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Basenzusammensetzung, Sondenlänge und Konzentration von Formamid. Diese Faktoren sind ausgeführt zum Beispiel in Maniatis et al., 1982 und Sambrook et al., 1989. Unter bestimmten Umständen kann die Bildung von Hybriden höherer Ordnung, wie zum Beispiel Triplexen, Quadraplexen usw. gewünscht werden, um Mittel für den Nachweis der Zielsequenzen bereitzustellen.
Der Nachweis des entstehenden Hybrids (falls vorhanden) wird gewöhnlich durch den Einsatz von markierten Sonden geführt. Alternativ kann die Sonde unmarkiert sein, doch durch spezifische Bindung mit einem Liganden, der markiert ist, entweder direkt oder indirekt nachweisbar sein. Geeignete Marker und Verfahren für das Markieren von Sonden und Liganden sind auf dem Fachgebiet bekannt und beinhalten zum Beispiel radioaktive Marker, welche durch bekannte Verfahren eingeführt werden können (z. B. Nick Translation, Random Priming oder Kinasing), Biotin, fluoreszierende Gruppen, Chemilumineszenzgruppen (z. B. Dioxetane, insbesondere getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper, Goldnanopartikel und Ähnliche. Variationen dieses Basisschemas sind auf dem Fachgebiet bekannt und beinhalten diejenigen Variationen, die die Trennung der nachzuweisenden Hybride von den nicht relevanten Materialien erleichtern und/oder die das Signal des markierten Anteils amplifizieren. Eine Reihe dieser Variationen ist z. B. in Matthews und Kricka, 1988; Landgren et al., 1988; Mifflin, 1989; der US-Patentschrift 4,868,105 und in der EPO Publikation Nr 225,807 zusammengefasst.
Wie oben angeführt, werden auch nicht PCR-basierte Screeningassays in dieser Erfindung in Betracht gezogen. Bei diesem Verfahren wird eine Nukleinsäuresonde (oder ein Analogon wie zum Beispiel ein Methylphosphanat-Grundgerüst, das den normalen Phosphodieester ersetzt) mit dem Low-Level-DNA-Ziel hybridisiert. Diese Sonde kann ein Enzym aufweisen, das kovalent an die Sonde gebunden ist, sodass die kovalente Bindung nicht mit der Spezifität der Hybridisierung interferiert. Dieser Zielnukleinsäurekomplex aus Enzym, Sonde und Konjugat kann dann aus dem freien Sonde-Enzym-Konjugat abgetrennt werden und ein Substrat für den Enzymnachweis zugegeben werden. Die enzymatische Aktivität wird als eine Veränderung der Farbentwicklung oder der Lumineszensleistung, die zu einem 10³-10⁶fachen Anstieg in der Empfindlichkeit führt, beobachtet. Ein Beispiel in Bezug auf die Herstellung von Konjugaten aus Oligodeoxynukleotid und alkalischer Phosphatase und deren Verwendung als Hybridisierungssonden findet sich in Jablonski et al., (1986).
Die Zwei-Schritt-Verfahren für Marker und Amplifikation sind auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Assays arbeiten auf dem Prinzip, dass ein kleiner Ligand (zum Beispiel Digoxigenin, Biotin oder Ähnliche) an einer Nukleinsäuresonde befestigt wird, die dazu befähigt ist, spezifisch an KVLQT1 zu binden. Allelspezifische Sonden werden auch innerhalb des Anwendungsbereichs dieses Beispiels in Betracht gezogen und beispielhafte allelspezifische Sonden beinhalten Sonden, die die prädisponierenden Mutationen dieser Patentanmeldung umfassen.
In einem Beispiel wird der kleine Ligand, der an der Nukleinsäuresonde befestigt ist, durch ein Antikörper-Enzym-Konjugat spezifisch erkannt. In einer Ausführungsform dieses Beispiels ist Digoxigenin an der Nukleinsäuresonde befestigt. Die Hybridisierung wird durch ein Antikörper-Alkalische Phosphatase-Konjugat nachgewiesen, welches ein Chemilumineszenzsubstrat umsetzt. Verfahren für das Markieren von Nukleinsäuresonden gemäß dieser Ausführungsform finden sich in Martin et al., 1990. In einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand erkannt durch ein zweites Ligand-Enzym-Konjugat, welches dazu befähigt ist, sich spezifisch an den ersten Liganden zu komplexieren. Eine gut bekannte Ausführungsform dieses Beispiels der Interaktionen ist der Biotin-Avidin-Typ. Verfahren für das Markieren von Nukleinsäuresonden und deren Anwendung in Biotin-Avidin basierten Assays finden sich in Rigby et al., 1977 und Nguyen et al., 1992.
Innerhalb des Anwendungsbereichs dieser Erfindung wird auch in Betracht gezogen, dass die Nukleinsäuresondenassays dieser Erfindung einen Cocktail an Nukleinsäuresonden, die KVLQT1 nachweisen können, enthalten werden. Daher wird in einem Beispiel für den Nachweis des Vorhandenseins von KVLQT1 in einer Zellprobe mehr als eine Sonde, die komplementär zu dem Gen ist, eingesetzt und insbesondere liegt die Anzahl von unterschiedlichen Sonden alternativ bei zwei, drei oder fünf verschiedenen Nukleinsäuresondensequenzen. In einem anderen Beispiel wird, um das Vorliegen von Mutationen in der KVLQT1-Gensequenz in einem Patienten nachzuweisen, mehr als seine Sonde komplementär zu diesen Genen eingesetzt, wobei der Cocktail Sonden umfasst, die befähigt sind, an die allelspezifischen Mutationen zu binden, die in Patientenpopulationen mit Veränderungen in KVLQT1 identifiziert wurden. In dieser Ausführungsform kann jede beliebige Anzahl von Sonden benutzt werden und wird vorzugsweise Sonden enthalten, die zu den wichtigsten Genmutationen passen, die als präsdisponierend für LQTS in einem Individuum identifiziert wurden.
Anwendungsverfahren: Peptiddiagnose und diagnostische Kits
Der Nachweis für das Vorhandensein von LQTS kann auch auf der Basis der Veränderung des Wildtyp-KVLQT1-Polypeptids erfolgen. Solche Veränderungen können durch Sequenzanalyse gemäß konventioneller Techniken bestimmt werden. Insbesondere werden Antikörper (polyklonal oder monoklonal) eingesetzt, um Unterschiede in KVLQT1-Peptiden oder das Fehlen von KVLQT1-Peptiden nachzuweisen.
Techniken für die Anzucht und Reinigung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und jede solche Technik kann gewählt werden, um die in dieser Erfindung beanspruchten Präparationen zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden KVLQT1-Proteine aus der Lösung durch Antikörper immunpräzipitiert und reagieren mit diesen Proteinen auf Western-Blots oder Immunblots von Polyacrylamidgelen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden KVLQT1-Proteine durch Antikörper in Paraffin oder gefrorenen Gewebeschnitten mithilfe von immunozytochemischen Techniken nachgewiesen.
Bevorzugte Ausführungsformen, die sich auf Verfahren für den Nachweis von KVLQT1 oder ihrer Mutationen beziehen, beinhalten Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA), Radioimmunassays (RIA), immunradiometrische Assays (IRMA) und immunenzymatische Assays (IEMA), einschließlich Sandwichassays unter Verwendung von monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörpern. Beispiele für Sandwichassays sind von David et al., in den US-Patentschriften Nr. 4,376,110 und 4,486,530 beschrieben.
Anwendungsverfahren: Rational Drug Design
Das Ziel des Rational Drug Design ist es, Strukturanaloga von biologisch aktiven interessierenden Polypeptiden herzustellen oder kleine Moleküle herzustellen, mit denen sie interagieren (z. B. Agonisten, Antagonisten, Inhibitoren), um Wirkstoffe zu entwickeln, welche zum Beispiel aktivere oder stabilere Formen des Polypeptids sind, oder welche z. B. die Funktion eines Polypeptids in vivo verstärken oder damit interferieren. Siehe z. B. Hodgson, 1991. In einem Verfahren wird zuerst die dreidimensionale Struktur eines interessierenden Proteins (z. B. KVLQT1-Polypeptid) durch Röntgenkristallographie, durch Computermodelling oder am typischsten durch eine Kombination von Verfahren bestimmt. Weniger häufig können hilfreiche Informationen in Bezug auf die Struktur eines Polypeptids aufgrund des Modellings basierend auf der Struktur der homologen Proteine gewonnen werden. Ein Beispiel für Rational Drug Design ist die Entwicklung von HIV-Proteaseinhibitoren (Erickson et al., 1990). Zusätzlich werden Peptide (z. B. KVLQT1-Polypeptid) durch einen Alaninscan (Wells, 1991) analysiert. Bei dieser Technik wird ein Aminosäurerest durch Ala ersetzt, und dieser Effekt auf die Aktivität des Peptids bestimmt. Jeder Aminosäurerest des Peptids wird auf diese Art analysiert, um die wichtigen Regionen des Peptids zu ermitteln.
Es ist auch möglich, einen zielspezifischen Antikörper zu isolieren, der durch einen funktionellen Assay ausgewählt wird, und dann dessen Kristallstruktur aufzulösen. Im Prinzip wird mit diesem Verfahren ein Pharmakophor erzeugt, auf welchem das nachfolgende Wirkstoffdesign basieren kann. Es ist möglich, die Proteinkristallographie vollständig zu umgehen durch das Erzeugen antiidiotypischer Antikörper (Anti-ids) für einen funktionellen pharmakologisch aktiven Antikörper. Als ein Spiegelbild eines Spiegelbides wäre zu erwarten, dass die Bindungsstelle der Anti-ids analog zu dem Originalrezeptor wäre. Das Anti-id kann dann benutzt werden, um Peptide aus Banken von chemisch und biologisch produzierten Peptidbanken zu identifizieren und zu isolieren. Ausgewählte Peptide würden dann als das Pharmakophor dienen.
Somit kann man Wirkstoffe designen, welche z. B. eine verbesserte KVLQT1-Polypeptidaktivität oder -stabilität besitzen oder welche als Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten usw. der KVLQT1-Polypeptidaktivität wirken. Dank der Verfügbarkeit von geklonten KVLQT1-Sequenzen können ausreichende Mengen des KVLQT1-Polypeptids bereitgestellt werden, um solche Analysestudien wie Röntgenkristallographie durchzuführen. Zusätzlich werden die Kenntnisse über die KVLQT1-Proteinsequenzen, die hierin bereitgestellt werden, denjenigen als Führungshilfe dienen, die Computermodellingtechniken anstelle von oder zusätzlich zur Röntgenkristallographie einsetzen.
Anwendungsverfahren: Gentherapie
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um eine Zelle mit Wildtyp-KVLQT1-Funktionen auszustatten, welche ein mutiertes KVLQT1-Allel trägt. Empfängerzellen, auf die eine solche Funktion übertragen wird, sollte es möglich sein, normal zu funktionieren. Das Wildtyp-Gen oder ein Teil des Gens kann in die Zelle in einem Vektor eingeschleust werden, sodass das Gen extrachromosomal bleibt. In einer solchen Situation wird das Gen über die extrachromosomale Position durch die Zelle exprimiert. Bevorzugter ist die Situation, in welcher das Wildtyp-Gen oder ein Teil davon in die mutierte Zelle eingeschleust wird, sodass es mit dem endogen mutierten Gen, das in der Zelle vorliegt, rekombiniert. Eine solche Rekombination benötigt ein doppeltes Rekombinationsereignis, welches zu der Korrektur der Genmutation führt. Vektoren für das Einschleusen von Genen sowohl für die Rekombination als auch für die Beibehaltung der extrachromosomalen Positionierung sind auf dem Fachgebiet bekannt und es kann jeder beliebig geeignete Vektor eingesetzt werden. Verfahren für das Einbringen von DNA in Zellen, wie zum Beispiel die Elektroporation, Kalziumphosphat-Copräzipitation und virale Transduktion sind auf dem Fachgebiet bekannt und die Wahl des Verfahrens liegt im Kompetenzbereich des praktischen Anwenders.
Wie im Allgemeinen oben diskutiert, kann das KVLQT1-Gen oder ein 'Fragment davon, wenn anwendbar, in Gentherapieverfahren eingesetzt werden, um die Menge an Expressionsprodukten eines solchen Gens in den Zellen zu erhöhen. Es kann auch hilfreich sein, das Maß an Expression für ein gegebenes LQT-Gen selbst in den Herzzellen zu erhöhen, in welchen das mutierte Gen auf einem „normalen" Level exprimiert wird, das Genprodukt jedoch nicht vollständig funktionell ist.
Die Gentherapie würde gemäß allgemein anerkannter Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel wie beschrieben von Friedman (1991) oder Culver (1996). Zellen eines Patienten würden zuerst mithilfe von diagnostischen Verfahren analysiert werden, wie oben beschrieben, um die Produktion von KVLQT1-Polypeptid in den Zellen sicherzustellen. Ein Virus- oder Plasmidvektor (siehe weitere Details unten), der eine Kopie des KVLQT1-Gens enthält, das mit Expressionskontrollelementen verbunden ist und zur Replikation innerhalb der Zellen befähigt ist, wird hergestellt. Der Vektor kann dazu befähigt sein, sich in den Zellen zu replizieren. Alternativ kann der Vektor replikationsdefizient sein und in Helferzellen für den Einsatz in der Gentherapie repliziert werden. Geeignete Vektoren sind bekannt, wie in der US-Patentschrift 5,252,479 und der PCT veröffentlichten Patentanmeldung WO 93/07282 und den US-Patentschriften Nr. 5,691,198 ; 5,747,469 ; 5,436,146 und 5,753,500 . Der Vektor wird dann in den Patienten injiziert. Wenn das transfizierte Gen nicht dauerhaft in das Genom jeder einzelnen Zielzelle eingebaut wird, wird die Behandlung möglicherweise regelmäßig wiederholt werden müssen.
Gentransfersysteme, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können in der Praxis der Gentherapieverfahren der vorliegenden Erfindung hilfreich. Diese beinhalten virale und nicht virale Transferverfahren. Eine Anzahl von Viren wird als Gentransfervektoren benutzt oder als die Basis für das Reparieren von Gentransfervektoren, einschließlich Papovaviren (z. B. SV40, Madzak et al., 1992), Adenvirus (Berkner, 1992; Berkner et al.; 1988; Gorziglia und Kapikian, 1992, Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson und Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998); Vacciniavirus (Moss, 1992; Moss 1996) Adeno-assoziierte Viren (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell und Hirata, 1998) Herpesviren einschließlich HSV und EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield und Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996). Lentiviren (Naldini et al., 1996), Sindbis- und Semliki Forest-Virus (Berglund et al., 1993) und Retroviren von Vögeln (Bandyopadhyay und Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), von murinem (Miller; 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann und Baltimore, 1985; Miller et al., 1988) und humanem Ursprung (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher und Panganiban, 1992). Die meisten Gentherapieprotokolle sind auf inaktivierten murinen Retroviren basiert, obwohl Adenvirus- und Adeno-assoziiertes Virus ebenfalls eingesetzt werden.
Nichtvirale Gentransferverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, beinhalten chemische Techniken wie beispielsweise Kalziumphosphat-Copräzipitation (Graham und van der Eb, 1973; Pellcer et al.; 1980); mechanische Techniken, zum Beispiel Mikroinjektion (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Constantini und Lacy, 1981); membranfusionsvermittelter Transfer über Liposomen (Feigner et al., 1987; Wang und Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990, Lim et al., 1991) und direkte DNA-Aufnahme und rezeptorvermittelter DNA-Transfer (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990, Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992; Curiel et al., 1991). Virusvermittelter Gentransfer kann mit direktem Gentransfer in vivo mithilfe von Anlieferung durch Liposomen kombiniert werden, wodurch es möglich wird, die Virusvektoren direkt in die Tumorzellen einzubringen und nicht in die umgebenden sich nicht teilenden Zellen. Alternativ kann die Zelllinie, die die retroviralen Vektoren produziert, in Tumore injiziert werden (Culver et al., 1992). Die Injektion von produzierenden Zellen würde dann eine kontinuierliche Quelle an Vektorpartikeln darstellen. Diese Technik ist für den Einsatz am Menschen mit inoperablen Hirntumoren zugelassen.
in einem Verfahren, welches biologische und physikalische Gentransferverfahren kombiniert, wird Plasmid-DNA beliebiger Größe mit einem Polylysin-konjugierten Antikörper, welcher spezifisch für das Hexonprotein von Adenvirus ist, kombiniert und der entstehende Komplex wird an einen Adenvirus-Vektor gebunden. Der trimolekulare Komplex wird dann benutzt, um Zellen zu infizieren. Der Adenovirusvektor ermöglicht effiziente Bindung, Aufnahme und Abbau des Endosoms, bevor die gekoppelte DNA beschädigt wird. Weitere Techniken für die Anlieferung von auf Adenvirus basierten Vektoren finden sich in Schneider et al., (1998) und den US-Patentschriften Nr. 5,691,198 ; 5,747,469 ; 5,436,146 und 5,753,500 .
Es wurde gezeigt, dass Liposom/DNA-Komplexe dazu in der Lage sind, direkten Gentransfer in vivo zu vermitteln. Während bei Standardliposomenpräparationen das Gentransferverfahren nicht spezifisch ist, wurde über eine in vivo lokalisierte Aufnahme und Expression in Tumorablagerungen berichtet, zum Beispiel folgend auf die direkte Verabreichung in situ (Nabel, 1992).
Expressionsvektoren im Zusammenhang mit der Gentherapie schließen diejenigen Konstrukte mit ein, die Sequenzen enthalten, welche ausreichend sind, um ein Polynukleotid, das darin geklont wurde, zu exprimieren. In viralen Expressionsvektoren enthält das Konstrukt virale Sequenzen, die ausreichend sind, um das Verpacken des Konstrukts zu unterstützen. Wenn das Polynukleotid für KVLQT1 kodiert, wird durch die Expression KVLQT1 produziert. Wenn das Polynukleotid für ein Antisense-Polynukleotid oder ein Ribozym kodiert, wird durch die Expression das Antisense-Polynukleotid oder das Ribozym produziert. Somit muss in diesem Zusammenhang für die Expression kein Proteinprodukt synthetisiert werden. Zusätzlich zu dem Polynukleotid, das in den Expressionsvektor geklont wurde, enthält der Vektor auch einen Promoter, der in eukaryotischen Zellen funktionell ist. Die geklonte Polynukleotidsequenz steht unter der Kontrolle dieses Promoters. Geeignete eukaryotische Promoter beinhalten diejenigen, die oben beschrieben sind. Der Expressionsvektor kann auch Sequenzen umfassen, wie wählbare Marker und andere Sequenzen, wie hierin beschrieben.
Gentransfertechniken, bei welchen die DNA direkt auf das Herzgewebe ausgerichtet ist, werden bevorzugt. Rezeptor-vermittelter Gentransfer, zum Beispiel wird durch die Konjugation von DNA (gewöhnlich als kovalent geschlossenes Plasmid in der supercoiled Form) an einem Proteinliganden über Polylysin erreicht. Liganden werden auf der Basis des Vorkommens von korrespondierenden Ligandrezeptoren auf der Zelloberfläche der Zielzell-/Zielgewebetypen ausgewählt. Diese Ligand/DNA-Konjugate können, falls gewünscht, direkt in das Blut injiziert werden und sind auf das Zielgewebe gerichtet, in welchem die Rezeptorbindung und Aufnahme des DNA-Proteinkomplexes erfolgt. Um das Problem der intrazellulären Zerstörung der DNA zu vermeiden, kann eine Coinfektion mit Adenvirus miteingeschlossen werden, um die Endosomfunktion zu unterbrechen.
Die Therapie ist wie folgt: Patienten, die ein KVLQT1-Suszeptibilitätsallel tragen, werden mit einem Genanlieferungsvehikel behandelt, sodass einige oder alle ihrer Herzvorläuferzellen mindestens eine zusätzliche Kopie eines funktionell normalen KVLQT1-Allels erhalten. Bei diesem Schritt haben die behandelten Individuen ein geringeres Risiko für LQTS bis zu dem Maß, in dem die Anwesenheit des normalen Allels den Auswirkungen des Suszepzibilizätsallels entgegengewirkt.
Anwendungsverfahren: Peptidtherapie
Peptide, die KVLQT1-Aktivität besitzen, können Zellen zugeführt werden, welche ein mutiertes KVLQT1-Allel aufweisen oder denen das KVLQT1-Allel fehlt. Protein kann produziert werden durch Expression von der cDNA-Sequenz in Bakterien, zum Beispiel mithilfe bekannter Expressionsvektoren. Alternativ kann das KVLQT1-Polypeptid aus KVLQT1 produzierenden Säugetierzellen extrahiert werden. Zusätzlich können die Techniken der synthetischen Chemie angewandt werden, um das KVLQT1-Protein zu synthetisieren. Jede Technik aus einer Reihe solcher Techniken kann die Präparation der vorliegenden Erfindung bereitstellen, welche das KVLQT1-Protein umfasst. Die Präparation ist im Wesentlichen frei von anderen humanen Proteinen. Am einfachsten wird dies erreicht durch Synthese in einem Mikroorganismus oder in vitro.
Aktive KVLQT1-Moleküle können zum Beispiel in Zellen durch Mikroinjektion eingeschleust werden oder durch den Einsatz von Liposomen. Alternativ können manche aktiven Moleküle durch die Zellen aktiv oder durch Diffusion aufgenommen werden. Die Versorgung der Moleküle mit KVLQT1-Aktivität sollte zu einer teilweisen Umkehr von LQTS führen. Auch können andere Moleküle mit KVLQT1-Aktivität (zum Beispiel Peptide, Wirkstoffe oder organische Verbindungen) benutzt werden, um eine solche Umkehr zu bewirken. Modifizierte Polypeptide, die im Wesentlichen ähnliche Funktionen haben, können auch bei der Peptidtherapie eingesetzt werden.
Anwendungsverfahren: Transformierte Wirte
Tiere für das Testen von therapeutischen Agenzien können nach Mutagenese des gesamten Tieres oder nach Behandlung der Keimlinienzellen oder Zygoten ausgewählt werden. Solche Behandlungen beinhalten die Insertion von mutierten KVLQT1-Allelen, normalerweise aus einer zweiten Tierspezies sowie die Insertion von disruptierten homologen Genen. Alternativ kann das endogene KVLQT1-Gen von Tieren durch Insertion- oder Deletionsmutation oder andere genetische Veränderungen mithilfe konventioneller Techniken (Capecchi, 1989, Valancius und Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992, Donehower et al., 1992) zerstört werden. Nachdem die Testsubstanzen an die Tiere verabreicht wurden, muss die Anwesenheit von LQTS bewertet werden. Wenn die Testsubstanz das Auftreten von LQTS verhindert oder unterdrückt, dann ist die Testsubstanz ein Kandidat für ein therapeutisches Agens für die Behandlung von LQTS. Diese Tiermodelle stellen ein äußerst wichtiges Testvehikel für potenzielle therapeutische Produkte bereit.
Zwei Strategien wurden hierin angewandt, um LQT-Gene zu identifizieren, ein Verfahren mit einem Kandidatengen und ein Verfahren mit Positionsklonierung. Informationen über die Position sind nun für drei LQT-Loci verfügbar, wobei LQT1 auf Chromosom 11p15.5 (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), LQT2 auf 7q35-38 und LQT3 auf 3p21-24 (Jiang et al., 1994) gemappt wurde. In der vorliegenden Erfindung wird ebenso minK auf Chromosom 21 als ein LQT-Gen identifiziert. Das Verfahren mit dem Kandidatengen beruht auf möglicherweise mechanistischen Hypothesen auf Grundlage der Physiologie. Obwohl wenig über die Physiologie von LQTS bekannt ist, wird die Erkrankung mit der Verlängerung des QT-Intervalls auf dem Elektrokardiogramm, einem Zeichen für abnorme Herzrepolarisation assoziiert. Diese Assoziation lässt vermuten, dass Gene, die für Ionenkanäle kodieren, oder ihre Modulatoren realistische Kandidaten für LQTS sind. Gestützt wird diese Hypothese nun durch die Entdeckung, dass mit Chromosom 7 in Zusammenhang stehendes LQTS aus früheren Mutationen in HERG stammt, einem putativen kardialen Kalziumkanalgen. Ein Neuroendokrinkalziumkanalgen (CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) und ein Gen, das für ein GTP-Bindungsprotein kodiert, welches Kalziumkanäle moduliert (GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992) wurden zu Kandidaten für LQT3 aufgrund auf ihrer chromosomalen Lokalisierung. Durch nachfolgende Verbindungsanalysen wurden diese Gene allerdings ausgeschlossen. Es wurde nun gezeigt, dass LQT3 mit SCN5A (Wang et al., 1995a) assoziiert ist. Trotz beträchtlicher Anstrengungen war bislang ein Verfahren mit Kandidatengen für mit Chromosom 11 in Verbindung stehendem LQTS nicht erfolgreich. Zwei Kaliumkanalgene (KCNA4 und KCNC1) wurden auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 (Wymore et al., 1994) gemappt; beide wurden aber als Kandidaten für LQT1 durch Verbindungsanalysen (Russell et al., 1995; die aktuelle Studie) ausgeschlossen. Alle anderen zuvor charakterisierten kardialen Kalium-, Chlorid-, Natrium und Kalziumkanalgene wurden auf ähnliche Weise basierend auch ihrer chromosomalen Lokalisierung ausgeschlossen. Bei der vorliegenden Studie wurden Positionsklonierung und Mutatationsanalyse eingesetzt, um LQT1 zu identifizieren.
Bei der vorliegenden Erfindung wurden Genotypanalysen verwendet, um zu zeigen, dass KVLQT1 fest mit LQT1 in 16 nicht miteinander verwandten Familien in Zusammenhang steht (Details sind in den Beispielen bereitgestellt). KVLQT1 ist ein putatives kardiales Kaliumkanalgen und verursacht die mit Chromosom 11 in Zusammenhang stehende Form von LQTS. Genetische Analysen lassen vermuten, dass KVLQT1 für einen spannungsgesteuerten Kaliumkanal mit funktioneller Bedeutung bei der kardialen Repolarisation kodiert und es wird nun gezeigt, dass KVLQT1 sich mit KCNE1 zusammenlagert, um einen kardialen I_KS-Kaliumkanal zu bilden. Falls dies stimmt, ist der Mechanismus von mit Chromosom 11 in Zusammenhang stehendem LQTS möglicherweise an dem verringerten repolarisierenden KVLQT1-Strom beteiligt. Da angenommen wird, dass Kaliumkanäle mit sechs Transmembrandomänen, aus Homo- oder Heterotetrameren gebildet werden (MacKinnon, 1991; MacKinnon et al., 1993; Covarrubius et al., 1991), ist es möglich, dass mit LQT assoziierte Mutationen von KVLQT1 durch einen dominant negativen Mechanismus wirken. Der Typ und der Ort von KVLQT1-Mutationen, die hier beschrieben werden, stimmen mit dieser Hypothese überein. Die resultierende Suppression der Kaliumkanalfunktion wiederum würde womöglich zu abnormer Herzpolarisation und zu einem erhöhten Risiko für ventrikuläre Tachyarrhythmien führen. Die in HERG identifizierten Mutationen und die Biophysik der Kaliumkanal-alpha-Untereinheiten deuten darauf hin, dass mit Chromosom 7 in Zusammenhang stehendes LQTS aus dominant negativen Mutationen resultiert und einer daraus resultierenden Reduktion in funktionellen Kanälen. Im Gegensatz dazu führen bei mit dem Chromosom 3 in Zusammenhang stehendem LQTS die mit LQTS assoziierten Deletionen, die in SCN5A identifiziert wurden, möglicherweise zu funktionellen kardialen Natriumkanälen mit veränderten Eigenschaften, wie zum Beispiel verzögerte Inaktivierung oder veränderte Spannungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung. Verzögerte Natriumkanalinaktivierung würde den nach innen gerichteten Natriumstrom erhöhen und die Membran depolarisieren. Dieser Effekt ist ähnlich zu dem veränderten Membranpotenzial, das von HERG-Mutationen zu erwarten ist, wo der nach außen gerichtete Kaliumstrom erhöht ist. Es ist unwahrscheinlich, dass schädlichere Mutationen von SCNA5 LQTS verursachen würden. Erwartet würde zum Beispiel ein Rückgang der Gesamtanzahl der kardialen Natriumkanäle, um die Dauer von Aktionspotenzialen zu verringern, ein Phänotyp der konträr zu LQTS ist.
Die präsymptomatische Diagnose von LQTS hing bislang von der Identifikation der verlängerten QT-Zeit in Elektrokardiogrammen ab. Leider werden bei jungen gesunden Personen selten Elektrokardiogramme aufgezeichnet. Darüber hinaus haben viele LQT-Genträger relativ normale QT-Intervalle und das erste Anzeichen für die Krankheit kann eine tödliche kardiale Arrhythmie (Vincent et al., 1992) sein. Nun da mehr LQT-Gene (KVLQT1 und KCNE1) identifiziert sind und mit LQTS in Zusammenhang gebracht wurden, können genetische Untersuchungen für diese Krankheit in Betracht gezogen werden. Dazu werden kontinuierliche Mutationsanalysen und die Identifizierung zusätzlicher LQT-Gene benötigt. Mit detaillierteren Phänotypanalysen können Unterschiede in den Phänotypen zwischen den veränderten Formen von LQTS gefunden werden. Diese Unterschiede können für Diagnose und Behandlung hilfreich sein.
Die Identifizierung und Assoziation zwischen den KVLQT1- und KCNE1-Genmutationen und LQTS ermöglicht das frühe präsymptomatische Screening von Individuen, um diejenigen zu identifizieren, die ein Risiko für die Entwicklung von LQTS haben. Um solche Individuen zu identifizieren, werden die KVLQT1-Allele entweder direkt oder nach dem Klonen der Allele auf Mutationen gescreent. Die Allele werden auf das Vorhandensein von Unterschieden in den Nukleinsäuresequenzen im Vergleich zum normalen Allel getestet mithilfe einer geeigneten Technik, einschließlich eines der folgenden Verfahren, ohne dabei auf diese beschränkt zu sein: Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCP), Verbindungsanalyse, RNA Schutzassay, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP-Analyse. Auch hilfreich ist die kürzlich entwickelte DNA-Mikrochip-Technik. Zum Beispiel werden entweder (1) die Nukleotidsequenz sowohl der geklonten Allele als auch des normalen KVLQT1-Gens oder eines geeigneten Fragments (Kodierungssequenz oder Genomsequenz) bestimmt und dann verglichen oder (2) die RNA-Transkripte des KVLQT1-Gens oder Genfragmente werden an die gesamte genomische Einzelstrang-DNA eines zu testenden Individuums hybridisiert und das entstehende Heteroduplex mit Ribonuklease A (RNase A) behandelt und auf einem Denaturierungsgel aufgetrennt, um den Ort von Mismatches nachzuweisen. Zwei dieser Verfahren können nach den folgenden Vorgehensweisen ausgeführt werden.
Die Allele des KVLQT1-Gens in einem zu testenden Individuum werden mithilfe konventioneller Techniken geklont. Zum Beispiel wird eine Blutprobe von der Person genommen. Die genomische DNA, die aus den Zellen in dieser Probe isoliert wurde, wird teilweise zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße von etwa 20 kb verdaut. Fragmente in dem Bereich von 18-21 kb werden isoliert. Die entstehenden Fragmente werden in einen geeigneten Vektor ligiert. Die Sequenzen der Klone werden dann bestimmt und mit dem normalen KVLQT1-Gen verglichen.
Alternativ werden Polymerasekettenreaktionen (PCRs) mit Primerpaaren für die 5'-Region oder den Exons des KVLQT1-Gens durchgeführt. PCRs können auch mit Primerpaaren basierend auf einer Sequenz des normalen KVLQT1-Gens durchgeführt werden. Zum Beispiel können Primerpaare für eines der Introns hergestellt und verwendet werden. Schlussendlich kann auch RT-PCR an der mRNA durchgeführt werden. Die amplifizierten Produkte werden dann analysiert durch Einzelstrang-Konformationspolymorphismen (SSCP) mithilfe konventioneller Techniken, um Unterschiede zu identifizieren, und diese werden dann sequenziert und mit der normalen Gensequenz verglichen.
Individuen können rasch auf häufige KVLQT1-Genvarianten durch Amplifizieren der DNA des Individuums unter Verwendung von geeigneten Primerpaaren und Analysieren des amplifizierten Produkts, z. B. durch Dot-Blot-Hybridisierung mithilfe von allelspezifischen Oligonukleotidsonden gescreent werden.
Bei dem zweiten Verfahren wird RNase A eingesetzt, um den Nachweis von Unterschieden zwischen dem normalen KVLQT1-Gen und den defekten Genen zu unterstützen. Dieser Vergleich wird in Schritten durchgeführt unter Verwendung von kleinen (~500 bp) Restriktionsfragmenten des KVLQT1-Gens als der Sonde. Zuerst wird das KVLQT1-Gen mit einem Restriktionsenzym/Restriktionsenzymen verdaut, welche(es) die Gensequenz in Fragmente von etwa 500 bp schneidet/schneiden. Diese Fragmente werden auf einem Elektrophoresegel getrennt, aus dem Gel gereinigt und einzeln kloniert und zwar in beiden Orientierungen in einem SP6-Vektor (z. B. pSP64 oder pSP65). Die SP6-basierten Plasmide, die Inserts der KVLQT1-Genfragmente enthalten, werden in vitro transkribiert mithilfe des SP6-Transkriptionssystems, das auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, in Anwesenheit von [α^–32P]GTP, wodurch radioaktiv markierte RNA-Transkripte von beiden Strängen des Gens erzeugt werden.
Diese RNA-Transkripte werden individuell benutzt, um Heteroduplexe mit der Allel-DNA mithilfe konventioneller Techniken zu bilden. Mismatches, die in dem RNA:DNA Heteroduplex auftreten aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen dem KVLQT1-Fragment und dem KVLQT1-Allelsubklon von dem Individuum, führen zur Spaltung in dem RNA-Strang, wenn sie mit RNase behandelt werden. Solche Mismatches können das Ergebnis von Punktmutationen oder kleinen Deletionen in dem Allel des Individuums sein. Die Spaltung des RNA-Strangs ergibt zwei oder mehrere kleine RNA-Fragmente, welche auf dem denaturierenden Gel schneller laufen als die RNA-Sonde selbst.
Alle Unterschiede, die gefunden werden, werden ein Individuum identifizieren, das eine molekulare Variante des KVLQT1-Gens trägt sowie die daraus folgende Anwesenheit des Long QT Syndroms. Diese Varianten können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwersten Formen wären Frame-Shift-Mutationen oder große Deletionen, welche das Gen dazu veranlassen würden, für ein abnormes Protein zu kodieren oder welche die die Proteinexpression deutlich verändern würden. Weniger schwer störende Mutationen würden kleine In-Frame-Deletionen und nicht konservative Basenpaarsubstitutionen, welche eine bedeutende Wirkung auf das produzierte Protein haben würden, wie zum Beispiel Veränderungen an oder durch einen Cysteinrest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure und umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt oder andere Mutationen, welche die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinflussen würden, beinhalten. Von stillen Mutationen oder denjenigen, die zu konservativen Aminosäuresubstitutionen (ihren würden, wäre im Allgemeinen nicht zu erwarten, dass sie die Proteinfunktion zerstören.
Genetische Tests werden es dem Mediziner ermöglichen, Individuen zu identifizieren, die ein Risiko für LQTS tragen, und zwar bereits bei der Geburt oder sogar schon vorher. Die präsymptomatische Diagnose von LQTS wird die Prävention dieser Erkrankungen ermöglichen. Bereits existierende medizinische Therapien, einschließlich Betablockern, können das Einsetzen von Problemen, die mit dieser Erkrankung in Zusammenhang stehen, verhindern oder verzögern. Schlussendlich wird unser Verständnis der Ursache und der Behandlung von häufigen Herzkrankheiten wie Herzrhythmusstörungen, welche für 11 % aller natürlichen Todesfälle verantwortlich sind, durch diese Erfindung verändert. Die bereits vorhandene Diagnostik hat sich auf das Aufzeichnen von QT-Intervallen auf Elektrokardiogrammen fokussiert. Dieses Verfahren ist kein absolut genauer Indikator für das Vorliegen eines Long QT Syndroms. Die vorliegende Erfindung ist ein präziserer Indikator für das Vorhandensein dieser Erkrankung. Die genetischen Tests und das bessere mechanistisches Verständnis von LQTS bieten die Gelegenheit, lebensbedrohliche Arrhythmien mithilfe von vernünftigen Therapien zu verhindern. Es ist zum Beispiel möglich, dass Öffnungsmittel für den Kaliumkanal das Risiko für Arrhythmien bei Patienten mit KVLQT1-Mutationen verringern werden; Natriumkanalblocker können im Gegensatz dazu eine wirksamere Behandlung für Patienten mit Mutationen darstellen, die die Funktion von SCN5A verändern. Schließlich können diese Untersuchungen Einblicke in Mechanismen geben, die häufigen Arrhythmien zugrunde liegen, da diese Arrhythmien oftmals mit abnormer Herzrepolarisation in Zusammenhang stehen und aus einer Kombination von ererbten und erworbenen Faktoren resultieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichungswege
Die KVLQT1-Polypeptide, Antikörper, Peptide und Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert sein, welche gemäß konventioneller pharmazeutischer Mischungstechniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Die Zusammensetzung kann das aktive Agens oder pharmazeutisch akzeptable Salze des aktiven Agens enthalten. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der aktiven Substanzen einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff, einen Trägerstoff, einen Puffer, einen Stabilisator oder andere Materialien umfassen, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Solche Materialien sollten nicht toxisch sein und nicht mit der Wirkung des aktiven Inhaltsstoffs in Wechselwirkung treten. Der Trägerstoff kann eine große Vielzahl von Formen annehmen in Abhängigkeit von der Form der Zubereitung, die für die Verabreichung gewünscht wird, z. B. intravenös, oral, intrathekal, epineural oder parenteral.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen in feste oder flüssige Zubereitungen formuliert werden, wie zum Beispiel Kapseln, Pillen, Tabletten, Lutschtabletten, Schmelztabletten. Pulver, Suspensionen oder Emulsionen. Bei der Zubereitung der Zusammensetzungen in einer oralen Dosierungsform kann eines der gewöhnlichen pharmazeutischen Medien eingesetzt werden, wie zum Beispiel Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Suspendiermittel und Ähnliche in dem Fall von oralen flüssigen Zubereitungen (wie zum Beispiel Suspensionen, Elixiere und Lösungen); oder Trägerstoffe wie zum Beispiel Stärken, Zucker, Verdünner, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Zerfallsmittel und Ähnliche in dem Fall von oralen festen Zubereitungen (wie zum Beispiel Pulver, Kapseln und Tabletten). Aufgrund der einfachen Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhaftesten oralen Dosierungsformen dar, bei welchen feste pharmazeutische Trägerstoffe offensichtlich eingesetzt werden. Falls gewünscht, können Tabletten mit Zucker überzogen sein oder einen magensaftresistenten Überzug haben, wobei die Überzüge mit Standardtechniken aufgebracht werden. Das aktive Agens kann verkapselt sein, um es stabil für die Passage durch den Gastrointestinaltrakt zu machen, während es gleichzeitig für die Passage durch die Blut-Gehirn-Schranke verfügbar gemacht wird. Siehe zum Beispiel WO 96/11698 .
Für die parenterale Verabreichung kann die Verbindung in einem pharmazeutischen Trägerstoff aufgelöst werden und entweder als Lösung oder als Suspension gegeben werden. Beispiele für geeignete Trägerstoffe sind Wasser, Kochsalzlösung, Dextroselösungen, Fruktoselösungen, Ethanol oder tierische Öle sowie Öle pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs. Der Trägerstoff kann auch andere Inhaltstoffe enthalten, zum Beispiel Konservierungsmittel, Suspendiermittel, Lösungsmittel, Puffer und Ähnliche. Wenn die Verbindungen intrathekal gegeben werden, können sie auch in der Zerebrospinalflüssigkeit aufgelöst werden.
Das aktive Agens wird vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die tatsächliche Menge, die gegeben wird, und die Rate sowie der zeitliche Verlauf der Verabreichung werden von der Natur und dem Schweregrad des zu behandelnden Zustands abhängen. Die Verschreibung der Behandlung, z. B. Entscheidungen über Dosierung, zeitliche Gabe usw. liegt innerhalb des Verantwortungsbereichs des Allgemeinmediziners oder des Spezialisten und trägt typischerweise der zu behandelnden Erkrankung, dem Zustand des einzelnen Patienten, der Verabreichungsstelle, dem Weg der Verabreichung und anderen Faktoren, die dem Arzt bekannt sind, Rechnung. Beispiele für Techniken und Protokolle finden sich in Remingtons's Pharmaceutical Sciences.
Alternativ können Zieltherapien eingesetzt werden, um das aktive Agens spezifischer zu bestimmten Typen von Zellen zu liefern, indem Zielsysteme, wie zum Beispiel Antikörper oder zellspezifische Liganden verwendet werden. Diese Zielplanungen können aus verschiedenen Gründen wünschenswert sein, z. B. wenn das Agens unakzeptabel toxisch ist oder wenn andernfalls eine zu hohe Dosierung erforderlich wäre oder wenn es ansonsten nicht dazu in der Lage wäre, in die Zielzellen zu gelangen.
Statt diese Agenzien direkt zu verabreichen, könnten sie in den Zielzellen produziert werden, z. B. in einem viralen Vektor, wie oben beschrieben, oder in einem zellbasierten Anlieferungssystem, wie zum Beispiel in der US-Patentschrift Nr. 5,550,050 beschrieben und publiziert in den PCT Anmeldungen Nr. WO 92/19195 , WO 94/25503 , WO 95/01203 , WO 95/05452 , WO 96/02286 , WO 96/02646 , WO 96/40871 , WO 96/40959 und WO 97/12635 , die zur Implantation in einem Patienten gedacht sind. Der Vektor könnte auf die spezifischen Zellen, die behandelt werden sollen, ausgerichtet sein oder er könnte regulatorische Elemente enthalten, welche gewebespezifischer für die Zielzellen sind. Das zellbasierte Anlieferungssystem dient dazu, um in einem Patientenkörper an dem gewünschten Zielort implantiert zu werden, und enthält eine Kodierungssequenz für das aktive Agens. Alternativ könnte das Agens auch in einer Vorläuferform für die Umwandlung in die aktive Form durch ein aktivierendes Agens, welches in den Zellen, die behandelt werden sollen, produziert wird oder auf diese Zellen ausgerichtet ist. Siehe Beispiel EP 425,731A und WO 90/07936 .
Die vorliegende Erfindung wird in weiteren Einzelheiten in den folgenden Beispielen dargestellt, welche zum Zweck der Veranschaulichung angeboten werden und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung auf irgendeine Art einzuschränken. Verwendet werden Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, oder die Techniken, die im Speziellen unten stehend beschrieben sind.
BEISPIEL 1
Verfahren für die phänotypische Bewertung
Für diese Studien wurden sechs große LQTS-Verwandtschaften (K1532, K1723, K2605, K1807, K161 und K162) sowie einige kleine Verwandtschaften und sporadische Fälle untersucht. LQTS-Patienten wurden in Krankenhäusern in Nordamerika und Europa identifiziert. Es wurden zur Phänotypisierung zwei Faktoren erwogen: 1) Anamnesedaten (Auftreten von Synkope, Anzahl der Synkopeereignisse, Auftreten von Krampfanfällen, Alter beim Einsetzen der Symptome und das Auftreten von plötzlichem Tod) und 2) die frequenzkorrigierte QT-Zeit auf Elektrokardiogrammen (QTc) (Bazzett, 1920). Um eine falsche Klassifizierung der Personen zu vermeiden, wurde die gleiche konservative Vorgehensweise bei der Phänotypzuweisung angewandt, wie sie bereits in früheren Studien erfolgreich eingesetzt wurde (Keating et al., 1991 a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Es wurde von jeder Person oder ihrem Vormund gemäß den Richtlinien der lokalen institutionellen Überwachungskomitees eine Einverständniserklärung eingeholt. Daten zum Phänotyp wurden ohne Kenntnis des Genotyps interpretiert. Symptomatische Individuen mit einer frequenzkorrigierten QT-Zeit (QTc) von 0,45 Sekunden oder länger und asymptomatische Individuen mit einer QTc von 0,47 Sekunden oder länger wurden als betroffen klassifiziert. Asymptomatische Individuen mit einer QTc von 0,41 Sekunden oder kürzer wurden als nicht betroffen klassifiziert. Asymptomatische Personen mit QTc zwischen 0,41 und 0,47 Sekunden sowie symptomatische Individuen mit QTc von 0,44 Sekunden oder kürzer wurden als nicht eindeutig klassifiziert.
BEISPIEL 2
Genotypisierung und Verbindungsanalyse
Genomische DNA wurde aus peripheren Lymphozyten aus dem Blut oder aus Zelllinien transformierter Lymphozyten, die vom Epstein-Barr Virus abstammen, mithilfe von Standardverfahren (Anderson und Gusella, 1984) hergestellt. Für die gentypischen Analysen wurden vier kurze Tandemwiederholungen (STR = short tandem repeat), durch die Polymorphismen erzeugt werden, eingesetzt, die zuvor auf dem Chromosom 11p15.5: D11S922, TH, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994) gemappt wurden. Die Gentypisierung von RFLP-Markern (HRAS1, D11S454 und D11S12) wurde wie zuvor beschrieben (Keating et al., 1991a) durchgeführt.
Paarweise Verbindungsanalysen wurden mithilfe von MLINK in LINKAGE v5.1 (Lathrop et al., 1985) durchgeführt. Es wurden Werte von 0,90 für das Penetrieren und 0,001 für die LQT-Genhäufigkeit angenommen. Die Genhäufigkeit wurde bei Mann und Frau als gleich angesehen. Die Rekombinationshäufigkeiten bei Mann und Frau wurden als gleich eingestuft. Die Häufigkeit von STR-Allelen betrug 1/n, wobei n = Anzahl der beobachteten Allele war. Obwohl der maximale LOD-Score für D11S454 bei einem Rekombinationsanteil von 0 identifiziert wurde, positioniert das Vorhandensein von einer nicht obligaten Rekombination (Individuum VI-14, 1) dieses LQT-Gen telomerisch von D11S454.
BEISPIEL 3
Physikalisches Mapping
Es wurden Primer designed basierend auf Sequenzen von TH-INS-IGFII- und D11S454-Loci und verwendet, um Klone aus CEPH YAC-Bibliotheken mithilfe von PCR-basierter Technik zu identifizieren und zu isolieren (Green und Olson, 1990; Kwiatkowski et al., 1990). YAC-terminale Sequenzen wurden durch inverse PCR bestimmt, wie beschrieben (Ochman et al., 1988), und als STSs verwendet.
P1-Klone wurden isoliert unter Verwendung von Einzelkopiesonden aus zuvor identifizierten Kosmiden cosQW22 (diese Studie), cCI11-469 (D11S679), cCI11-385 (D11S551), cCI11-565 (D11S601), cCI11-237 (D11S454) (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991; Sternberg 1990). Neu isolierte P1s wurden auf Chromosom 11p15 mit FISH oder Southern Blot-Analysen gemappt. Endspezifische Ribosonden wurden aus neu isolierten P1s erzeugt und verwendet, um zusätzliche benachbarte Klone (Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega) zu identifizieren. DNA für P1 und Kosmidklone wurde mithilfe von alkalischer Lyseplasmidisolierung hergestellt und durch Gleichgewichtszentrifugation in CsCl-Ethidiumbromidgradienten, wie beschrieben (Sambrook et al., 1989) gereinigt. P1-Insertendsequenzen wurden durch zyklische Sequenzierung, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994), bestimmt. STSs wurden basierend auf diesen Insertendsequenzen erzeugt. Die Überlappung zwischen P1s und den Kosmiden wurde anhand der Summe der gemeinsamen Restriktionsfragmente berechnet.
BEISPIEL 4
Isolierung und Charakterisierung von KVLQT1-Klonen
Eine Herz-cDNA-Bibliothek vom erwachsenen Menschen (Stratagene) wurde ausplattiert und 1 × 10⁶ Plaques mithilfe des gefangenen Exons 4181A als der Sonde gescreent. Die Sequenzen des gefangenen Exons 4181A wurden dazu benutzt, um Oligonukleotidsonden für das Screenen der cDNA-Bibliothek zu designen. Das GENETRAPPER^TM cDNA Positive Selection System wurde benutzt, um 1 × 10¹¹ Klone aus einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek (Life Technologies, Inc.) zu screenen. Die Sequenzen der gefangenen und reparierten Oligonukleotide waren 5'-CAGATCCTGAGGATGCT-3' (SEQ ID NO: 7) und 5'-GTACCTGGCTGAGAAGG-3' (SEQ ID NO: 8).
Zusammengesetzte cDNA-Sequenzen für KVLQT1 wurden durch Endsequenzierung von überlappenden cDNA-Klonen erhalten und durch Primerwalking. Die Sequenzierung wurde entweder automatisch mithilfe des Pharmacia A.L.F.automatischen Sequenzierers oder manuell mithilfe eines Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (United States Biochemical, Inc.) durchgeführt. Datenbank- und Sequenzanalysen wurden durchgeführt unter Verwendung des GCG Softwarepakets, IG Softwarepakets und dem BLAST Netzwerkservice der National Center for Biotechnology Information.
Die teilweise genomische Struktur (aus der Transmembrandomäne S2 bis S6) von KVLQT1 wurde durch zyklische Sequenzierung von P1 18B12, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994) bestimmt. Primer wurden designed basierend auf KVLQT1 cDNA-Sequenz und für das zyklische Sequenzieren benutzt.
BEISPIEL 5
Mutationsanalysen
SSCP wurde ausgeführt, wie zuvor beschrieben (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Normale und abnorme SSCP-Produkte wurden direkt isoliert sequenziert wie beschrieben (Wang und Keating, 1994) oder subkloniert in pBluescript (SK+, Stratagene) mithilfe des T-Vektor-Verfahrens (Marchuk et al., 1991). Wenn das zuletzt genannte Verfahren benutzt wurde, wurden mehrere Klone mittels der Dideoxy Chain Termination Method (Dideoxy-Kettenabbruchverfahren) unter Verwendung von Sequenase^TM Version 2.0 (United States Biochemicals, Inc.) sequenziert.
BEISPIEL 6
Northern Blot-Analysen
Ein Multiple Tissue Northern Filter (Human MTN blot 1, Clontech) wurde mit einer ³²p-markierten KVLQT1 cDNA-Sonde, wie zuvor beschrieben (Curran et al., 1995), sondiert.
BEISPIEL 7
Genauere genetische und physikalische Lokalisierung von LQT1
Der präzise Ort von LQT1 wurde durch gentypische Analysen in Verwandtschaft 1532 (K1532), einer großen Familie aus Utah nordeuropäischer Abstammung (1) bestimmt. Diese Verwandtschaft wurde bereits in der initialen Studie verwendet, in der das erste LQT-Gen, LQT1, mit Chromosom 11p15.5 (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b) in Verbindung gebracht wurde. Es wurden zusätzliche Familienmitglieder bis auf eine Gesamtprobenzahl von 217 Individuen identifiziert und phänotypisiert. Die phänotypische Bestimmung wurde, wie zuvor beschrieben (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b, Jiang et al., 1994) durchgeführt. Vorläufige Genotypanalysen unter Verwendung von Markern bei HRAS, TH, D11S454 und D11S12 beinhalteten alle gesicherten Mitglieder von K1532. Mit diesen Untersuchungen wurden informative Zweige dieser Familie identifiziert. Zusätzliche Genotypanalysen wurden mithilfe von drei hoch polymorphen Markern aus Chromosom 11p15.5: D11S922, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994) durchgeführt. Gentypen und paarweise LOD-Scores für jeden Marker sind in 1 und Tabelle 2 dargestellt. Von diesen Markern wurden TH und D11S1318 durchgängig gefunden. Rekombination wurde jedoch mit allen anderen getesteten Markern, einschließlich HRAS identifiziert und in jedem einzelnen Fall ein statistisch signifikanter LOD-Score (+3 oder höher) identifiziert. Diese Daten deuten darauf hin, dass LQT1 durchgehend mit TH und D11S1318 in dieser Verwandtschaft in Verbindung steht und dass das Gen, das die Krankheit verursacht, centromerisch von HRAS lokalisiert ist.

Um LQT1 genauer lokalisieren zu können, wurden Haplotypanalysen von K1532 durchgeführt (siehe 1). Neun Chromosomen, die informative Rekombinationsereignisse tragen, wurden identifiziert. Telomerische Rekombinationsereignisse wurden in nicht betroffenen Individuen IV-22 (zwischen D11S922 und TH), betroffenen Individuen IV-25 (zwischen D11S922 und TH), nicht betroffenen Individuen V-6 (zwischen HRAS und D11S922) und betroffenen Individuen V-24 (zwischen HRAS und D11S922) beobachtet. Centromerische Rekombinationsereignisse wurden in nicht betroffenen Individuen V-17 (zwischen D11S860 und D11S454), betroffenen Individuen V-24 (zwischen D11S860 und D11S454), nicht betroffenen Individuen V-34 (zwischen D11S860 und D11S454), nicht betroffenen Individuen VI-13 (zwischen D11S860 und D11S454), nicht betroffenen Individuen VI-14 (zwischen D11S454 und D11S1318), und betroffenen TABELLE 2

Paarweise LOD-Scores zwischen LQT1 und 11p15.5 Markern
Rekombinationsanteil (θ)
	0,0	0,001	0,01	0,05	0,1	0,2	Z_max*	θ_max†
HRAS	9,67	9,94	10,50	10,38	9,62	7,57	10,59	0,021
D11S922	10,05	13,05	13,85	13,59	12,59	10,01	13,92	0,019
TH	11,01	10,99	10,82	10,06	9,07	6,96	11,01	0,0
D11S1318	10,30	10,29	10,13	9,40	8,47	6,50	10,30	0,0
KVLQT1	14,19	14,17	13,94	12,89	11,54	8,68	14,19	0,0
D11S454	11,06	11,05	10,89	10,16	9,17	7,01	11,06	0,0
D11S860	5,77	6,92	8,32	9,14	8,92	7,46	9,15	0,058
D11S12	1,50	2,26	3,12	3,46	3,27	2,49	3,46	0,047
LOD-Scores wurden berechnet unter der Annahme einer 90 %igen Penetrierung und einer Genhäufigkeit von 0,001 (Lathrop et al., 1985). * Z_max zeigt maximalen LOD-Score † θ_max zeigt geschätzten Rekombinationsanteil bei Z_max*

Individuen VI-16 (zwischen D11S860 und D11S454) identifiziert. Diese Daten deuten darauf hin, dass LQT1 zwischen D111S922 und D11S454 lokalisiert ist. Zusammen mit jüngsten Studien, die LQT1 centromerisch von TH (Russell et al., 1995) positionieren, wird LQT1 durch diese Daten in dem Intervall zwischen TH und D11S454 platziert.
Die Größe der Region, die LQT1 enthält, wurde mithilfe von Pulsfeldgelanalysen mit genomischen Sonden aus Chromosom 11P15.5 geschätzt. Sonden aus TH, D11S551 und D11S454 hybridisierten an ein 700 kb Mlu I Restriktionsfragment (2). Diese Daten ließen vermuten, dass die Region, die LQT1 enthält, weniger als 700 kb umfasst. Die physikalische Darstellung dieser Region wurde erreicht, indem künstliche Hefechromosom (YAC) und P1-Bibliotheken mit Sonden aus der Region (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991) gescreent wurden. Die Reihenfolge dieser Klone wurde mittels Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisations(FISH)analysen bestätigt als: Telomer-TH-D11S551-D11S679-D11S601-D11S454-Centromer. Die Klone, die in anfänglichen Untersuchungen identifiziert wurden, wurden dann für die Identifizierung von benachbarten, überlappenden Klonen verwendet. Die minimale Reihe von Klonen aus dem LQT1-Intervall ist in 2 dargestellt.
BEISPIEL 8
Identifizierung und Charakterisierung von KVLQT1
Die Exon-Amplifikation mit Klonen aus der physikalischen Kartierung wurde durchgeführt, um Kandidatengene für LQT1 zu identifizieren. Das Einfangen von Exons wurde mithilfe von pSPL3B (Bum et al., 1995) auf genomischen P1-Klonen, wie zuvor beschrieben (Buckler et al., 1991; Church et al., 1994) durchgeführt. Ein Minimum von 128 eingefangenen Exons aus jedem P1-Klon wurde anfänglich charakterisiert durch Größeneinteilung der PCR-Produkte. Von diesen wurden 400 Klone weiter analysiert durch Dideoxy-Sequenzierung mithilfe eines A.L.F. automatischen Sequenzierers (Pharmacia). DNA-Sequenzen und Datenbankanalysen zeigten acht mögliche Exons mit vorhergesagter Aminosäuresequenz ähnlich derer von Ionenkanälen. Die höchste Ähnlichkeit wurde für ein 238 Basenpaare langes gefangenes Exon (4181A) mit einer Ähnlichkeit von 53 % zu Kaliumkanalproteinen aus verschiedenen Spezies, einschließlich Ähnlichkeit zu einem Teil einer putativen Porenregion erhalten. Die PCR-Analysen wurden dazu benutzt, 4181 A auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 und den beiden P1s aus der physikalischen Kartierung (118A10, 18B12) zu mappen. Diese Daten ließen vermuten, dass 4181A Teil eines Kaliumkanalgens auf Chromosom 11p15.5 ist.
Es wurden 2 verschiedene cDNA-Screeningverfahren eingesetzt, um zu bestimmen, ob das gefangene Exon 4181A ein Teil eines Gens war. Die traditionelle Plaquefilterhybridisierung mit einer Herz-cDNA-Bibliothek vom erwachsenen Menschen führte zu der Identifizierung eines einzigen positiven Klons. Es wurde eine unterschiedliche cDNA-Auswahl benutzt, um eine zweite Herz-cDNA-Bibliothek (das GENETRAPPER^TM cDNA Positive Selection System, Life Technologies, Inc.) zu screenen und es wurden zwölf unabhängige Klone gefunden. Die DNA-Sequenzanalysen zeigten einen vollständigen Abgleich mit Sequenzen, die aus 418 A und anderen gefangenen Exons, wie oben beschrieben, abgeleitet wurden. Der längste offene Leserahmen umfasste 1654 Basenpaare. Zwei übereinstimmende Polyadenylierungssignale wurden in Aufwärtsrichtung des Poly(A)tail in der 3' nicht translatierten Region identifiziert. Die komplette cDNA wurde in diesem Stadium der Studie nicht erhalten.
Der Teil der cDNA ließ ein Protein mit Strukturcharakteristika von Kaliumkanälen vorhersagen. Hydropathieanalysen deuteten auf eine Topologie von sechs bedeutenden hydrophoben Regionen hin, die membrandurchspannende α-Helices darstellen können. Diese Regionen weisen Sequenzähnlichkeit mit den transmembranen Domänen S1-S6 von Kaliumkanälen auf. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die aus dem identifizierten Gen und dem Shaker (SHA) Kaliumkanal (Pongs et al., 1988) abgeleitet wurde, ist in 3 gezeigt. In der Region, die S1-S6 enthält, lag die Identität der Aminosäuresequenz bei 30 % und die Ähnlichkeit belief sich auf 59 %. Die Sequenz, die an 3' von S1-S6 lokalisiert war, hatte keine bedeutende Ähnlichkeit mit einem bekannten Protein. Da dieses Gen eine große Ähnlichkeit mit spannungsgesteuerten Kaliumkanalgenen aufweist und zu einem starken Kandidaten für LQT 1 wurde, wurde es KVLQT1 genannt.
Die Northern Blot-Analysen wurden benutzt, um die Verteilung von KVLQT1 mRNA im Gewebe zu bestimmen. KVLQT1 cDNA-Sonden wiesen ein Transkript mit 3,2 kb in menschlichem Pankreas, Herz, Niere, Lunge und Plazenta nach, jedoch nicht in der Skelettmuskulatur, in der Leber oder dem Gehirn (4). Das Herz zeigte die höchsten Konzentrationen von KVLQT1 mRNA. Die Northern Blot-Anaylsen wurden durchgeführt unter Verwendung von Multiple Tissue Northern Filter (Human MTN blot 1, Clontech), wie beschrieben von Curran et al., 1995.
BEISPIEL 9
Charakterisierung der kompletten KVLQT1 cDNA
Die oben beschriebenen Studien führten zu dem Klonen und der Charakterisierung einer unvollständigen cDNA für KVLQT1. Die Sequenz dieser unvollständigen cDNA ließ ein Protein vorhersagen mit sechs hydrophoben membrandurchspannenden α-Helices (S1-S6) und eine typische K⁺ Kanalporensignatursequenz (Heginbotham et al., 1994). Allerdings schien bei dieser cDNA die aminoterminale Domäne zu fehlen und sie exprimierte keine Funktionalität. Um die komplette Sequenz von KVLQT zu definieren, wurden verschiedene cDNA-Bibliotheken gescreent und ein neuer Klon isoliert. Eine cDNA-Sonde, die Exons 3-6, enthielt wurde dazu benutzt, um drei KVLQT1 cDNA-Klone in voller Länge aus einer Herz-cDNA-Bibliothek vom erwachsenen Menschen zu isolieren, die im Labor hergestellt worden war mithilfe des Systems SuperScript Choice (GIBCO BRL). Die komplette cDNA-Sequenz und das kodierte Protein sind in den 5A-5B gezeigt.
BEISPIEL 10
Genomstruktur von KVLQT1
Die genomische DNA von KVLQT1 wurde untersucht und die Exon-/Intron-Grenzen für alle Exons bestimmt.
A. Isolierung von cDNA-Klonen
Eine cDNA-Sonde, die die Exons 3 bis 6 enthält, wurde benutzt, um drei KVLQT1 cDNA-Klone in voller Länge aus einer Herz-cDNA-Bibliothek vom erwachsenen Menschen zu isolieren, die im Labor hergestellt worden war, mithilfe des Systems SuperScript Choice (GIBCO BRL).
B. Isolierung von genomischen Klonen
KVLQT1 P1-Klone wurden isoliert, wie beschrieben (Wang et al., 1996). Das Kosmid, das Exon 1 enthält, wurde isoliert, indem eine humane genomische Kosmid-Bibliothek (Stratagene) mit einer cDNA-Sonde aus Exon 1 gescreent wurde.
C. Bestimmung der Exon-/Intron-Grenzen
Alle genomischen Klone wurden sequenziert mithilfe von Primern, die für die cDNA-Sequenzen designed sind. Die KVLQT1 P1-Klone wurden zyklisch sequenziert mit ThermoSequenase (Amersham Life Science). Die KVLQT1-Kosmide wurden sequenziert unter Verwendung der Dideoxy Chain Termination Method auf einem Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierer. Die genauen Exon-/Intron-Grenzen wurden durch Vergleich von cDNA, genomischen Sequenzen und bekannten Spleißstellen übereinstimmender Sequenzen bestimmt.
D. Design von PCR-Primern und PCR-Reaktionsbedingungen
Primer, um die Exons der beiden Gene zu amplifizieren, wurden empirisch designed oder unter Verwendung von OLIGO 4.0 (NBI). Die Amplifikationsbedingungen waren:

(1) 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für 10 Sekunden, 58°C für 20 Sekunden und 72°C für 20 Sekunden und eine Verlängerung um 5 Minuten bei 72°C;
(2) gleiche Bedingungen wie in (1) außer, dass die Reaktionen Endkonzentrationen von 10 % Glycerin und 4 % Formamid aufwiesen und mit Mineralöl überschichtet waren
(3) 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 5 Zyklen von 94°C für 10 Sekunden, 64°C für 20 Sekunden und 72°C für 20 Sekunden und 30 Zyklen von 94°C für 10 Sekunden, 62°C für 20 Sekunden und 72°C für 20 Sekunden und eine Verlängerung um 5 Minuten bei 72°C.

E. KVLQT1 Genomstruktur und Primerreihen
cDNA-Klone in voller Länge wurden aus einer Herz-cDNA-Bibliothek vom erwachsenen Menschen isoliert. Eine 5'-cDNA-Sonde, die aus einem dieser Klone erzeugt wurde, wurde benutzt, um cos1, einen genomischen Kosmidklon, der Exon 1 enthält, zu isolieren. P1 genomische Klone, die den Rest der KVLQT1 cDNA umfassen, wurden zuvor isoliert (Wang et al., 1996). Diese genomischen Klone umfassen etwa 400 kb auf Chromosom 11p15.5 (6). Um die Exonstruktur und die Exon-/Intron-Grenzen zu bestimmen, wurden cos1- und P1-Klone 118A10, 112E3, 46F10 und 49E5 unter Einsatz von Primern, die für die cDNA designed waren, sequenziert. Der Vergleich der genomischen Sequenz und der cDNA-Sequenz von KVLQT1 offenbarte das Vorhandensein von 16 Exons (5A-5B und Tabelle 3). Die Exongröße lag im Bereich von 47 bp (Exon 14) bis 1122 bp (Exon 16). Alle Intronsequenzen enthielten die unveränderlichen GT und AG an den Spleißstellen (splice sites) von dem Donor beziehungsweise dem Akzeptor (Tabelle 3). Für jede Intronsequenz, die Exons 2 bis 16 flankiert, wurde ein Paar PCR-Primer designed und es wurden zwei Paare von Primern mit überlappenden Produkten für Exon 1 aufgrund seines großen Umfangs (Tabelle 4) designed. Diese Primer können verwendet werden, um alle KVLQT1 Exons zu screenen.
BEISPIEL 11
Charakterisierung der Funktion von KVLQT1
Um die Funktion von KVLQT1 zu definieren, wurden Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) mit der kompletten cDNA, wie oben in Beispiel 9 beschrieben, transfiziert. Die KVLQT1 cDNA wurde in pCEP4 (InVitrogen) subkloniert. CHO-Zellen wurden in Hams F-12 Medium kultiviert und temporär mithilfe von Lipofectamin (Gibco BRL) transfiziert. Die Zellen wurden für 18 Stunden in 35 mm Petrischalen, die 6 μl Lipofectamin, 0,5 μg grün fluoreszierendes Protein (pGreen Lantern-1, Gibco BRL) und 1,5 μg KVLQT1 in pCEP4 enthielten, transfiziert. Die fluoreszierenden Zellen wurden mithilfe eines Axopatch 200 Patch-Clamp-Verstärkers (Axon Instruments) für 48 bis 78 Stunden nach der Transfektion einem Voltage-Clamp (Messung von Strom für verschiedene Spannungen über der Memban) unterzogen. Die Badlösung enthielt in mM: 142 NaCl, 2KCl, 1,2 MgCl₂, 1,8 CaCl₂, 11,1 Glukose, 5,5 HEPES-Puffer (pH 7,4, 22-25°C). Die Lösung in der Pipette enthielt in mM: 110 Kaliumglutamat, 20 KCL,1,0 MgCl₂, 5 EGTA, 5 K₂ATP, 10 HEPES (pH 7,3). Der Datenerwerb und die Analysen erfolgten mit pCLAMP6 (Axon Instruments). Die Spannungsabhängigkeit der Stromaktivierung wurde bestimmt, indem die Beziehung zwischen Tailströmen (bestimmt durch Extrapolation der deaktivierten Phase des Stroms gegen Ende des Testpulses) und Testpotenzial mit einer Boltzmann-Funktion gefittet wurde. Tailströme wurden in Bezug auf den größten Wert für jede Oocyte normalisiert.
Tabelle 3
Tabelle 4
Ein spannungsabhängiger nach außen gerichteter K⁺-Strom wurde beobachtet nach der Membrandepolarisation auf Potenziale über –60 mV (7A). Dieser Strom erreichte innerhalb von 1 Sekunde bei +40 mV einen Steady State. Der Aktivierung des Stroms ging eine kurze Verzögerung voraus und eine Repolarisation auf –70 mV rief einen Tailstrom mit einem anfänglichen Anstieg in der Amplitude (Hook) vor der Deaktivierung hervor. Ähnliche Tailstromhooks wurden zuvor für HERG K⁺-Kanäle beobachtet und auf die Reaktivierung von Kanälen nach einer Inaktivierung mit einer schnelleren Rate als bei der Deaktivierung zurückgeführt (Sanguinetti et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). Die Aktivierungskurve für KVLQT1-Strom war halb maximal (V_1/2) bei –11,6 +/– 0,6 mV und hatte einen Steigungsfaktor von 12,6 +/– 0,5 mV (n = 6, 7B).
Die biophysikalischen Eigenschaften von KVLQT1 waren anders als die anderer bekannter kardialer K⁺-Ströme. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass KVLQT1 sich mit anderen Untereinheiten zusammenlagern könnte, um einen bekannten kardialen Kanal zu bilden. Der langsam aktivierende verzögerte Gleichrichter-K⁺-Strom, I_KS, moduliert die Repolarisation von kardialen Aktionspotenzialen. Trotz intensiver Untersuchung ist die molekulare Struktur des I_KS-Kanals noch nicht aufgeklärt. Die physiologischen Daten lassen vermuten, dass eine Komponente des I_KS-Kanals minK (Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; Wang et al., 1996) ist, ein Protein mit 130 Aminosäuren mit einer einzigen putativen transmembranen Domäne (Takumi et al., 1988). Die Größe und Struktur dieses Proteins, lässt allerdings bezweifeln, dass minK allein funktionelle Kanäle (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993) bilden kann.
Um diese Hypothese zu testen, wurden CHO-Zellen mit KVLQT1 und humanen KCNE1 cDNAs transfiziert. Eine KCNE1 cDNA wurde in pCEP4 (In Vitrogen) subkloniert und die Transfektion wurde, wie oben für KVLQT1 allein beschrieben, durchgeführt. Für die Cotransfektion von KVLQT1 und KCNE1 wurden 0,75 μg jeder cDNA verwendet. Wie bereits zuvor berichtet (Lesage et al., 1993) induzierte die Transfektion von CHO-Zellen mit KCNE1 allein keinen nachweisbaren Strom (n = 10, 7C). Die Cotransfektion von KCNE1 mit KVLQT1 induzierte einen langsam aktivierenden verzögerten Gleichrichter-Strom, welcher viel größer war als der Strom in Zellen, die mit KVLQT1 allein (7D und 7E) transfiziert waren. Der langsamen Aktivierung von Strom in cotransfizierten CHO-Zellen ging eine Verzögerung voraus, die mehrere hundert ms andauerte, und darauf hindeutete, dass kein bedeutender homomerer KVLQT1-Kanalstrom vorhanden war. Es kam während langer Depolarisationspulsen nicht zu einer Stromsättigung und es wurde eine dreiexponentielle Funktion benötigt, um die anfängliche Verzögerung und die zwei Phasen der Stromaktivierung am besten zu beschreiben. Während eines Depolarisationspulses von 30 s auf +40 mV wurde der Strom mit den Zeitkonstanten 0,68 +/– 0,18, 1,48 +/– 0,16 und 8,0 +/– 0,6 s (n = 4) aktiviert. Die isochrone (7,5 s) Aktivierungskurve für den Strom hatte V_1/2 von 7,5 +/– 0,9 mV und einen Steigungsfaktor von 16,5 +/– 0,8 mV (n = 7; 9B). Durch Vergleich von V_1/2 und der Steigung der Aktivierungskurve ergab sich für den humanen kardialen I_KS 9,4 mV und 11,8 mV (Li et al., 1996). Wie bei der Coexpression von KVLQT1 und hminK in CHO-Zellen ist die Aktivierung des kardialen I_KS äußerst langsam und wurde am besten durch eine dreiexponentielle Funktion (Balser et al., 1990; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990) beschrieben. Chinidin (50 μM) blockierte die Tailströme in cotransfizierten CHO-Zellen mit 30 +/– 8 % (n = 5) ähnlich zu seiner Wirkung (40-50 % Block) auf I_KS in isolierten Myocyten (Balser et al., 1991). Daher induzierte die Coexpression von KVLQT1 und hmink in CHO-Zellen einen K⁺-Strom mit biophysikalischen Eigenschaften, die fast identisch zu kardialem I_KS waren.
Um die Eigenschaften von hminK und KVLQT1 weiter zu charakterisieren, wurden diese Kanäle einzeln und zusammen in Xenopus Oocyten exprimiert. Oocyten von Xenopus laevis wurden isoliert und es wurde ihnen cRNA injiziert, wie von Sanguinetti et al., (1995) beschrieben. KVLQT1 cDNA wurde in pSP64 (Promega) subkloniert. KCNE1 cDNA wurde von R. Swanson zur Verfügung gestellt. Etwa äquimolare Konzentrationen von KVLQT1 cRNA (5,8 ng pro Oocyte) und KCNE1 cRNA (1 ng pro Oocyte) wurden für die Untersuchungen der Coinjektion verwendet. Die Badlösung enthielt in mM: 98 NaCl, 2KCl, 2 MgCl₂, 0,1 CaCl₂ und 5 HEPES (pH 7,6, 22-25°C). Für Untersuchungen mit Umkehrpotenzial wurde die Osmolarität aufrechterhalten, indem KCl durch externes NaCl in äquimolarem Verhältnis substituiert wurde. Die Ströme wurden mithilfe des standardmäßigen Zwei-Mikroelektroden-Voltage-Clamp-Verfahrens 3 Tage, nachdem cRNA in die Oocyten injiziert worden war (Sanguinetti et al., 1995), aufgezeichnet. Die Ströme wurden bei 0,5 kHz gefiltert und bei 2 kHz digitalisiert. Die Daten sind als Mittel +/– s.e.m. dargestellt.
Oocyten, denen zu KVLQT1 komplementäre RNA injiziert wurde, exprimierten einen rasch aktivierenden nach außen gerichteten K⁺-Strom mit einer spannungsabhängigen Aktivierung, die fast identisch zu derjenigen von CHO-Zellen ist, die mit KVLQT1 cDNA transfiziert waren (8A und 8B). Die K⁺-Selektivität von KVLQT1-Kanälen wurde durch Messen des Umkehrpotenzials (E_rev) von Tailsströmen in unterschiedlichen Konzentrationen von extrazellulärem K ([K+]_e) bestimmt. Die Steigung der Beziehung zwischen E_rev und log[K⁺]e betrug 49,9 +/– 0,4 mV (n = 7; 8C), und damit deutlich weniger als durch die Nernst-Gleichung (58 mV) für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal vorhergesagt. Die Coinjektion von Oocyten mit KVLQT1 und KCNE1 cRNA induzierte einen Strom ähnlich dem von I_KS (9C). Die Steigung der Beziehung zwischen E_rev und log[K⁺]e für coinjizierte Oocyten betrug 49,9 +/– 4 mV (n = 6), ähnlich zu KVLQT1 allein und zu dem kardialen I_KS (49 mV) (Matsuura et al., 1987) von Meerschweinchen. Die isochrone (7,5 s) Aktivierungskurve für coinjizierte Oocyten hatte V_1/2 von 6,2 mV und eine Steigung von 12,3 mV (9E), ähnlich zu kardialem I_KS.
BEISPIEL 12
Identifizierung von einem KVLQT1-Gen in Xenopus
Im Vergleich zu CHO-Zellen war KCNE1 zu einer funktionellen Expression in Xenopus Oocyten fähig (9B). Der induzierte Strom (I_KS) war kleiner als der Strom, der durch die coinjizierten Oocyten induziert wurde, jedoch waren die Kinetik und die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung ähnlich (9A-E). Zwei Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass I_KS in Xenopus Oocyten aus Kanälen resultierte, die durch Zusammenlagern von minK mit einer nicht identifizierten konstitutiv exprimierten Untereinheit gebildet wurden. Zuerst wird der größte Teil des I_KS nach der Injektion sehr kleiner Mengen von KCNE1 cRNA (9D) gesättigt, was vermuten lässt, dass eine endogene Komponente von beschränkter Quantität für die funktionelle Expression (Wang und Goldstein, 1995; Cui et al.; 1994) erforderlich ist. Zweitens induziert die heterologe Expression von minK in Säugetierzellen keinen nachweisbaren Strom (Lesage et al., 1993) (7C), was vermuten lässt, dass minK nicht ausreicht, um funktionelle Kanäle zu bilden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese nicht identifizierte Untereinheit ein Homolog von KVLQT1 sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine cDNA-Bibliothek von Xenopus Oocyten (Clontech) mit einem KVLQT1 cDNA-Klon gescreent, der die S3-S5 Domänen umfasst. Ein Teil des Klons von 1,6 kb (XKVLQT1, 10A) wurde isoliert. XKVLQT1 ist auf der Ebene der Aminosäuren zu 88 % identisch mit der entsprechenden Region von KVLQT1 (10A). Diese Daten lassen annehmen, dass I_KS aus der Zusammenlagerung von dem XKVLQT1- und dem minK-Protein resultiert.
Es wurde schlussgefolgert, dass KVLQT1 und hminK sich zusammenlagern, um den kardialen I_KS-Kanal zu bilden. Zwei verzögerte Gleichrichter K+-Ströme, I_Kr und I_KS modulieren die Dauer des Aktionspotenzials in kardialen Myocyten (Li et al., 1996; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990). Frühere Studien haben die Dysfunktion der I_Kr-Kanäle mit dem Long QT Syndrom in Verbindung gebracht (Sanguinetti et al., 1995; Curran et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996a). Die Beobachtung, dass KVLQT1-Mutationen auch diese Erkrankung (Wang et al., 1996) hervorrufen, und die Entdeckung, dass KVLQT1 einen Teil des I_KS-Kanals bildet, deuten darauf hin, dass die Dysfunktion der beiden kardialen verzögerten Gleichrichter K⁺-Kanäle zu dem Risiko eines plötzlichen Todes bedingt durch kardiale Arrhythmie beitragen.
BEISPIEL 13
Cosegregtion von KVLQT1 Missense
Mutationen mit LQTS bei sechs großen Familien
Um die Hypothese zu testen, dass KVLQT1 LQT1 ist, wurden Analysen zum Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) eingesetzt, um auf funktionelle Mutationen in betroffenen Mitgliedern von K1532, der größten LQTS-Familie, die eine Verbindung zu dem Chromosom 11 zeigte, zu screenen. SSCP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 1995a; Wang et al.; 1995b). Normale und abnorme SSCP-Produkte wurden isoliert und direkt sequenziert wie beschrieben (Wang und Keating, 1994) oder in pBluescript (SK⁺) (Stratagene) subkloniert mithilfe des T-Vektor-Verfahrens (Marchuk et al.; 1991). Wenn das zuletzt genannte Verfahren benutzt wurde, wurden verschiedene Klone mit der Dideoxy Chain Termination Method unter Verwendung von Sequenase^TM Version 2.0 (United States, Biochemicals, Inc.) sequenziert. Die Analysen richteten sich auf die Region zwischen S2 und S6, da diese Regionen für die KVLQT1-Funktion wichtig sein könnten. Wir haben Oligonukleotid-Primer auf Basis von cDNA-Sequenzen designed und diese Primer für zyklische Sequenzierungsreaktionen mit dem KVLQT1 enthaltenden P1, 18B12 (Wang und Keating, 1994) eingesetzt. Mit diesen Untersuchungen wurden die Intronsequenzen, die die Exons flankieren, welche für S2-S6 kodieren, bestimmt. Zusätzliche Primer wurden dann aus diesen Intronsequenzen erzeugt und für SSCP-Analysen (Tabelle 5) benutzt.
Die SSCP-Analysen identifizierten eine anormale Konformation in den 70 betroffenen Mitgliedern von K1532 (11A). Dieses abnorme Konformer wurde in den 147 nicht betroffenen Mitgliedern dieser Verwandtschaft oder in der genomischen DNA von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen nicht beobachtet. Der Zwei-Punkt LOD-Score für die Verbindung dieser Anomalie mit LQTS betrug 14,19 bei einem Rekombinationsanteil von 0 (Tabelle 2). Es wurde keine Rekombination zwischen KVLQT1 und LQT1 beobachtet, was darauf hinweist, dass diese Loci vollständig miteinander verbunden sind. Die DNA-Sequenzanalysen der normalen und abnormen SSCP-Konformeren offenbarten eine einzige Basensubstitution, ein G im Austausch gegen ein A, an dem ersten Nukleotid von Kodon Val-125 (11A und Tabelle 6). Diese Mutation führte zu einer Substitution von Valin durch Methionin in einer vorhergesagten intrazellulären Domäne zwischen S4 und S5.

Um die Hypothese weiter daraufhin zu testen, dass Mutationen in KVLQT1 LQTS verursachen, wurden DNA-Proben von betroffenen Mitgliedern von fünf zusätzlichen großen LQTS-Verwandtschaften untersucht. Verbindungsanalysen mit polymorphen Markern aus dieser Region hatten gezeigt, dass der Phänotyp der Erkrankung mit Chromosom 11 in diesen Familien in Verbindung steht. Abnorme SSCP-Konformere wurden in betroffenen Mitgliedern von K2605, K1723, K1807 (11B-D), K161 und K162 identifiziert. Die SSCP-Anomalien wurden in K161 und K162 als identisch zu denjenigen identifiziert, die in K1807 beobachtet wurden. Das abnorme SSCP-Konformer wurde bei nicht betroffenen Mitgliedern dieser Verwandtschaft oder in DNA-Proben von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen nicht beobachtet. Die normalen und abnormen Konformere, die in jeder Familie identifiziert wurden, wurden sequenziert. Die Nukleotidänderung, der Kodierungseffekt und die Lokalisation jeder Mutation sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 5 PCR Primer, die benutzt wurden, um die KVLQT1-Mutationen zu definieren

Tabelle 6

Zusammenfassung von KVLQT1-Mutationen
Kodon	Nukleotidänderung	Kodierungseffekt	Mutation	Region	Verwandtschaft	Anz. Betroffener
167-168	ΔTCG	Deletion	F167W/G168A	S2	K13216	1
178	GCC zu CCC	Missense	A178P	S2-S3	K13119	1
189	GGG zu AGG	Missense	G189R	S2-S3	K2557	3
190	CGG zu CAG	Missense	R190Q	S2-S3	K15019	2
254	GTG zu ATG	Missense	V254M	S4-S5	K1532	70
273	CTC zu TTC	Missense	L273F	S5	K1777	2
306	GGG zu AGG	Missense	G306R	Pore	K20926	1
312	ACC zu ATC	Missense	T312I	Pore	K20925	1
341	GCG zu GAG	Missense	A341E	S6	K1723	6
341	GCG zu GAG	Missense	A341E	S6	K2050	2
341	GCG zu GTG	Missense	A341V	S6	K1807	6
341	GCG zu GTG	Missense	A341V	S6	K161	18
341	GCG zu GTG	Missense	A341V	S6	K162	18
341	GCG zu GTG	Missense	A341V	S6	K163	3
341	GCG zu GTG	Missense	A341V	S6	K164	2
345	GGG zu GAG	Missense	G345E	S6	K2605	11
168	GGG zu AGG	Missense	G168R	S2	K2625	–
168	GGG zu AGG	Missense	G168R	S2	K2673	–
168	GGG zu AGG	Missense	G168R	S2	K3698	–
314	GGC zu AGC	Missense	G314S	Pore	K19187	–
315	TAT zu TGT	Missense	Y315C	Pore	K22709	–
318	AAG zu AAC	Missense	K318N	Pore	K2762	–
353	CTG zu CCG	Missense	L353P	S6	K3401	–
366	CGG zu TGG	Missense	R366W	C-Terminus	K2824	–

BEISPIEL 14
Eine KVLQT1 intragene Deletion und fünfzehn Missense-Mutationen, die mit LQTS in kleinen Familien und sporadischen Fällen assoziiert sind
Um zusätzliche mit LQTS assoziierte Mutationen in KVLQT1 zu identifizieren, wurden weitere SSCP-Analysen in kleinen Verwandtschaftsbeziehungen und bei sporadischen Fällen durchgeführt. SSCP offenbarte ein abnormes Konformer in Verwandtschaft 13216 (12A). Analysen von mehr als 200 nicht verwandten Kontrollindividuen zeigten diese Anomalie nicht. Dieses abnorme Konformer wurde kloniert und sequenziert, wobei sich eine Deletion von drei Basenpaaren zeigte, die die Kodons 167 und 168 umfasste. Diese Mutation führt zu einer Substitution von Phenylalanin durch Tryptophan und einer Deletion von Glycin in der putativen Domäne S2 (Tabelle 6).
Abnorme SSCP-Konformere wurden in betroffenen Mitgliedern von zusätzlichen Verwandtschaften identifiziert. Ein abnormes SSCP-Konformer, das in K2050 identifiziert wurde, war identisch mit demjenigen in K1723 und abnorme Konformere, die in K161, K162, K163 und K164 identifiziert wurden, waren identisch mit denjenigen, die in K1807 beobachtet wurden. Auch die Verwandtschaften 2625, 2673 und 3698 trugen die identische Mutation. Keines der abnormen Konformere wurde in DNA-Proben von mehr als 200 Kontrollindividuen identifiziert. In jedem einzelnen Fall wurden das normale und das abnorme Konformer sequenziert. Diese Daten sind in 12A-O dargestellt und in Tabelle 6 zusammengefasst. Insgesamt wurden KVLQT1-Mutationen, die mit LQTS in 24 Familien oder sporadischen Fällen asoziiert waren, identifiziert, was einen aussagekräftigen molekulargenetischen Hinweis liefert, dass die Mutationen in KVLQT1 , die mit dem Chromosom 11 in Verbindung stehende Form von LQTS verursachen.
BEISPIEL 15
KCNE1-Variationen, die LQTS verursachen
Separate Studien an unterschiedlichen Individuen wurden durchgeführt, um Varianten von minK zu finden. Diese Studien wurden mithilfe der folgenden Verfahren durchgeführt.
A. Analysen des Phänotyps
Individuen wurden phänotypisch charakterisiert auf Basis der frequenzkorrigierten QT-Zeit. Die Personen wurden als betroffen gekennzeichnet, wenn die QTc ≥ 0,46 Sekunden betrug. Als nicht betroffen wurden Personen eingestuft, wenn die QTc ≤ 0,42 Sekunden betrug. Es wurde von allen Personen oder ihrem Vormund eine Einverständniserklärung gemäß den Richtlinien der lokalen institutionellen Überwachungskomitees eingeholt. Daten zum Phänotyp wurden ohne Kenntnis des Genotyps interpretiert.
B. Mutationsanalysen
Genomproben wurden mit PCR amplifiziert, indem die nachfolgenden Primerpaare benutzt wurden:
PCR-Produkte wurden in der SSCP-Analyse benutzt, wie beschrieben (KW Wang et al., 1996). Die PCR wurde mit 75 ng DNA in einem Volumen von 10 μl mithilfe eines Perkin-Elmer Cetus 9600 Thermocycler durchgeführt. Die Amplifizierungsbedingungen lagen bei 94°C für 3 Minuten gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für 10 Sekunden, 58°C für 20 Sekunden und einer Verlängerung von 5 Minuten bei 72°C. Die Reaktionen wurden verdünnt mit 40 μl 0,1 %SDS/10 mM EDTA und mit 30 μl 95 % Formamid Loading Dye. Die Mischung wurde bei 94°C für 5 Minuten denaturiert und auf Eis gestellt. Drei Mikroliter jeder Probe wurden auf 5 % und 10 % nicht denaturierenden Polyacrylamidgelen (Acrylamid:Bisacrylamid 49:1) bei 4°C aufgetrennt und auf 0,5X- und 1X MDE-(Mutationsnachweisverstärkungs-)Gele (FMC BioProducts) bei Raumtemperatur aufgetragen. Elektrophorese auf dem 5 % und dem 10% Gel wurde bei 40 W für 3-5 Stunden durchgeführt; Elektrophorese auf 0,5X- und 1X MDE-Gelen wurde über Nacht und jeweils bei 350V und 600V durchgeführt. Die Gele wurden auf 3MM Filterpapier getrocknet und einem Film für 18 Stunden bei –70°C ausgesetzt.
SSCP-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und in 100 μl zweifach destilliertem Wasser bei 65°C für 30 Minuten eluiert. Zehn Mikroliter an eluierter DNA wurden reamplifiziert mithilfe des ursprünglichen Primerpaars. Die Produkte wurden auf 1 % Low-Melt-Agarosegelen (FMC) aufgetrennt, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde in beide Richtungen durch die Dideoxy Chain Termination Method auf einem Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierer sequenziert.
C. Funktionelle Expression
KCNE1 cDNA Expressionskonstrukte wurden durch PCR aus der gesamten humanen DNA amplifiziert und in einen pSP64 Transkriptionsvektor (Promega) mithilfe der folgenden Primer geklont: MINK-'5'-CAGTGGAAGCTTAATGCCCAGGATGATC-3' (SEQ ID NO: 93) und MINKR-5'-CAGGAGGATCCAGTTTAGCCAGTGGTGGGGGTTCA-3' (SEQ ID NO: 94).
Die Nukleotide, die fett markiert sind, bezeichnen die Änderungen, die gemacht wurden, um Hind III und BamH I Restriktionsstellen (unterstrichen) herzustellen. Ein KVLQT1 cDNA-Klon (identisch mit demjenigen, über welchen Yang et al. (1997) berichteten) wurde aus einer humanen Herz-cDNA-Bibliothek isoliert und in den pSP64 Plasmidexpressionsvektor subkloniert. Alle Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzanalysen bestätigt. Komplementäre RNAs wurden mithilfe des mCAP RNA Capping Kits (Stratagene) synthetisiert.
Die Isolierung von Oocyten von Xenopus laevis und die Injektion von cRNA wurde durchgeführt, wie beschrieben (Sanguinetti et al., 1995). Die Voltage-Clamp-Daten wurden mithilfe der PCLAMP v6.0 Software (Axon Instruments) erhalten. Es wurden isochrone (7,5 Sekunden) anstelle von Steady State Messungen verwendet, um die Spannungsabhängigkeit der I_KS-Aktivierung abzuschätzen. Die Spannungsabhängigkeit der I_KS-Aktivierung wurde bestimmt, indem die Peak-Tailströme mit einer Boltzmann-Funktion gefitted wurden. V_1/2, die Spannung, bei welcher der Strom bei Verwendung dieses Pulsprotokolls zur Hälfte aktiviert war, und der Steigungsfaktor wurden aus diesen Daten berechnet. Der Aktivierungsstrom wurde mit einer biexponentiellen Funktion gefittet, um Konstanten für langsame und schnelle Aktivierung zu erhalten. Zeitkonstanten für die Deaktivierung wurden erhalten, indem abfallende Tailströme bei verschiedenen Testpotenzialen mit einer einzigen exponentiellen Funktion gefittet wurden.
Alle Daten sind Mittelwerte +/– S.E.M. Statistische Analysen wurden durchgeführt mithilfe von wiederholten Messanalysen der Varianz mit dem Fisher's Least Significance Post-Hoc Test und dem unpaarigen Student's t-Test. Ein p-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
D. Ergebnisse
Ionenkanal-β-Untereinheiten sind Hilfsproteine, welche sich mit α-Untereinheiten zusammenlagern, um die Gating-Kinetik zu modulieren und die Stabilität von multimeren Kanalkomplexen (Rettig et al., 1994: Shi et al., 1996) zu stabilisieren. Trotz ihrer funktionellen Bedeutung wird die Dysfunktion von Kalium-β-Untereinheiten nicht mit der Krankheit assoziiert. Jüngste physiologische Untersuchungen lassen vermuten, dass KCNE1 für die β-Untereinheiten kodiert, die sich mit KVLQT1 α-Untereinheiten zusammenlagern, um den langsam aktivierenden verzögerten Gleichstrom K⁺ (I_KS)-Kanal zu bilden (Sanguinetti et al., 1996b; Barhanin et al., 1996). Da KVLQT1-Mutationen in Verbindung mit dem Long QT Syndrom (LQTS) zu einer Empfänglichkeit für Arrhythmie (ihren (Q. Wang et al., 1996; Neyroud et al., 1997; Splawski et al., 1997a), haben wir die Hypothese aufgestellt, dass Mutationen in KCNE1 auch diese Krankheit hervorrufen. Hierin sind KCNE1-Missense-Mutationen bei betroffenen Mitgliedern von zwei LQTS-Familien definiert. Beide Mutationen (S74L, D76N) senkten I_KS durch Verlagerung der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Beschleunigung der Kanaldeaktivierung. D76N hminK hatte auch einen dominanten negativen Effekt. Die funktionellen Konsequenzen dieser Mutationen wären verzögerte kardiale Repolarisation und ein erhöhtes Risiko für Arrhythmie. Durch diese Daten wird KCNE1 als ein LQT-Gen etabliert und diese Daten bestätigen, dass hminK ein integrales Protein des I_KS-Kanals ist.
Individuen mit LQTS wurden sicher bestimmt und phänotypisch charakterisiert (Keating et al., 1991a; Jiang et al., 1994). Analysen zum Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) mithilfe von Primern, die KCNE1 umfassen, führten zu der Identifizierung einer anormalen Konformation in betroffenen Mitgliedern von Verwandtschaft 1789 (13A). Diese Konformation wurde in nicht betroffenen Familienmitgliedern oder in 200 nicht verwandten Kontrollindividuen (400 Chromosomen) nicht beobachtet. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen Austausch von G für A an dem ersten Nukleotid von Kodon 76, was zu einer Substitution (D76N) von Asp durch Asn führt (13C). Die Sequenzen für KCNE1 cDNA und dessen Proteinprodukt sind hier als SEQ ID NO: 3 beziehungsweise SEQ ID NO: 4 gelistet. Das erste Nukleotid von Kodon 76 ist Base 418 von SEQ ID NO: 3.

Mit weiteren SSCP-Analysen wurde eine zweite Anomalie definiert, die mit der Krankheit in Verwandtschaft 1754 (13B) cosegregierte. Diese Anomalie wurde bei nicht betroffenen Familienmitgliedern oder bei 200 Kontrollpersonen nicht beobachtet. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen Austausch von C gegen T in dem zweiten Nukleotid von Kodon 74 (Base 413 von SEQ ID NO: 3), was zu einer Substitution von Ser durch Leu (S74L) (13C) führte. Analysen von weiteren DNA-Proben, die von den nicht verwandten Individuen mit LQTS erhalten wurden, zeigten zusätzliche KCNE1-Mutationen. In Tabelle 7 sind die KCNE1-Mutationen, die in LQTS-Familien gefunden wurden, aufgelistet. Tabelle 7

Zusammenfassung von KCNE1-Mutationen
Kodon	Nukleotidänderung	Kodierungseffekt	Mutation	Verwandtschaft
28	TCG zu TTG	Missense	S28L	1789
32	CGC zu CAC	Missense	R32H	2521
74	TCG zu TTG	Missense	S74L	1754
76	GAC zu AAC	Missense	D76N	1789
98	CGG zu TGG	Missense	R98W	2016
127	CCT zu GCT	Missense	P127A	2016
127	CCT zu ACT	Missense	P127T	2819

Um die funktionellen Konsequenzen dieser KCNE1-Mutationen zu bestimmen, haben wir mutiertes und Wildtyp(WT)-Protein in Xenopus Oocyten exprimiert. Da die Wechselwirkung der Stöchiometrie von KVLQT1 und minK nicht bekannt ist, wurden unterschiedliche Mengen an KCNE1 cRNA (0,01-2,5 ng/Oocyte) mit einer bestimmten Menge an KVLQT1 cRNA (6 ng/Oocyte) coinjiziert und der daraus resultierende Strom aufgezeichnet. Die I_KS-Amplitude stieg als eine Funktion von injiziertem KCNE1 und war bei Konzentrationen von KCNE1 cRNA von ≥ 0,6 ng/Oocyte gesättigt (14A-14B). Die nachfolgenden Coexpressionsuntersuchungen wurden durchgeführt mit 1,2 ng/Oocyte KCNE1 und 6 ng/Oocyte KVLQT1 cRNA, um sicherzustellen, dass KCNE1 nicht ein limitierender Faktor für die Expression von heteromultimeren Kanälen war. Die Coinjektion von D76N KCNE1 und KVLQT1 cRNA führte nicht zur Induktion von nachweisbaren K⁺-Strömen (n = 13). Da LQTS autosomal dominant vererbbar ist, besitzen betroffene Individuen ein normales und ein mutiertes KCNE1-Allel. Daher wurde mutierte KCNE1 cRNA mit WT KCNE1 und KVLQT1 cRNA coinjiziert. Der Strom (I_KS-D76N), der bei der Coinjektion von D76N KCNE1 (0,6 ng/Oocyte), WT KCNE1 (0,6 ng/Oocyte) und KVLQT1 cRNA (6 ng/Oocyte) induziert wurde, war um 91 % geringer als der Strom (I_KS-WT), der durch WT KCNE1 (1,2 ng/Oocyte) und KVLQT1 cRNA (6 ng/Oocyte) bei +40 mV (15A und 15B) induziert wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass D76N hminK-Untereinheiten heteromultimere Kanälen mit WT hminK und KVLQT1 bilden und I_KS durch einen stark dominant-negativen Mechanismus senken.
Um die biophysikalischen Eigenschaften von Wildtyp- und mutierten Kanälen zu vergleichen, wurde die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und die Kinetik der Deaktivierung für I_KS-D76N und I_KS-WT charakterisiert. Der größte Teil von I_KS erreicht keinen Steady State, selbst wenn der Strom mit Pulsen von einer Dauer von 100 Sekunden angeregt wird (Swanson et al., 1993). Daher wurde eine Tailstromamplitude gefolgt von 7,5 Sekunden Testpulsen als ein empirisches Maß für die Sapnnungsabhängigkeit von I_KS verwendet I_KS-D76N-Tailströme waren halbmaximal bei +28 mV, einer +16 mV-Verlagerung in Bezug zu I_KS-WT (15C). Eine Verlagerung im Kanalgating wurde durch die Spannungsabhängigkeit der Stromdeaktivierung bestätigt. Die Rate von I_KS-D76N-Kanalverschluss (Deaktivierung) war schneller als bei I_KS-WT bei Spannungen ≥ 80 mV (15D). Die Spannungsabhängigkeit der Zeitkonstanten der Deaktivierung wurde um etwa +30 mV verlagert. Somit senkt D76N hminK I_KS durch drei Mechanismen: eine dominant negative Suppression der Kanalfunktion, eine erhöhte Rate der Kanaldeaktivierung und eine positive Verlagerung bei der Spannungsabhängigkeit der Kanalaktivierung. Diese Effekte würden den nach außen gerichteten Strom während der Repolarisationsphase reduzieren und die Dauer eines kardialen Aktionspotenzials verlängern.
Anders als D76N hminK bildete S74L hminK I_KS-Kanäle, wenn es mit KVLQT1 coexprimiert wurde, allerdings mit veränderter Funktion. Der Strom, der durch die Injektion von S74L KCNE1 (1,2 ng/Oocyte) und KVLQT1 (6,0 ng/Oocyte) cRNA induziert wurde, wies einen Schwellenwert für die Aktivierung auf, der etwa um 40 mV höher lag als bei I_KS-WT. Der daraus resultierende Strom war 66 % kleiner als I_KS-WT nach 7,5-Sekunden-Pulsen auf +60 mV (n = 15). Wenn S74L KCNE1 (0,6 ng/Oocyte) und WT KCNE1 (0,6 ng/Oocyte) mit KVLQT1 (6,0 ng/Oocyte) cRNA coinjiziert wurden, war der daraus entstehende Strom (I_KS-S74L) um etwa 33 % reduziert bei +60 mV im Vergleich zu I_KS-WT (16A-16B). Wie in 16C gezeigt, wurde diese Reduktion hauptsächlich bedingt durch eine positive Verlagerung in der Spannungsabhängigkeit der Stromaktivierung. Die Spannungsabhängigkeit der Deaktivierung wurde um etwa +40 mV (16D) verlagert. Diese Verlagerung verursachte einen deutlichen Anstieg in der Rate der I_KS-S74L-Deaktivierung. Daher bilden S74L hminK-Untereinheiten heteromultimere Kanäle mit WT hminK und KVLQT1 und senken I_KS durch eine Verlagerung in der Spannungsabhängigkeit der Kanalaktivierung und führen zu einer verstärkten Rate der Kanaldeaktivierung. Da I_KS-S74L nicht gleich I_KS-WT bei +60 mV (wie für eine einzige Verlagerung beim Gating zu erwarten ist) war, ist es möglich, dass mutierte S74L-Untereinheiten auch die Anzahl von funktionellen I_KS-Kanälen und/oder einer einzigen Kanalleitung reduzieren.
Die Beobachtung, dass die mit LQTS assoziierten Mutationen von KCNE1 die Gating-Kinetik verändern, liefert zwingende Beweise dafür, dass hminK einen integralen Teil des I_KS-Kanals bildet statt nur als ein einfaches Chaperon zu dienen. Frühere Studien von minK, die vor der Entdeckung von KVLQT1 durchgeführt wurden, stützen auch diese Schlussfolgerung (Takumi et al., 1991; Goldstein und Miller, 1991; Wang und Goldstein, 1995; KW Wang et al., 1996). In einer dieser Studien lagerte sich eine mutierte Ratten-minK-Untereinheit (D77N), die analog zu D76N hminK war, mit WT minK zusammen und supprimierte die I_KS-Funktion, einen dominant-letalen Effekt (Wang und Golstein, 1995).
Es wird geschlussfolgert, dass Mutationen in KCNE1, dem Gen, welches die β-Untereinheiten von I_KS-Kanälen kodiert, eine Empfänglichkeit für Arrhythmien hervorruft, indem es I_KS reduziert und dadurch die Repolarisation der Muskelzellen verzögert. Da eine regionale Heterogenität bezüglich I_KS innerhalb des Myokards besteht (Liu und Antzelevitch, 1995), würden Mutationen in KCNE1 zu abnormen regionalen Unterschieden bei der Dauer von Aktionspotenzialen führen und somit eine Grundlage für Arrhythmie schaffen. Die Entdeckung von mit LQTS assoziierten Mutationen in KCNE1 wird die präsymptomatische Diagnose dieser Krankheit erleichtern und Auswirkungen auf die Therapie haben.
BEISPIEL 16
Genomstruktur von KCNE1
Die genomische DNA von KCNE1 wurde untersucht und die Exon-/Intron-Grenzen für alle Exons im Wesentlichen wie für KVLQT1 bestimmt. Eine humane Herz-cDNA-Bibliothek wurde mit einem PCR-Produkt gescreent, das aus einer gesamten humanen DNA amplifiziert wurde und die gesamte Kodierungssequenz enthielt, um zwei identische KCNE1-Klone von 1,7 kb zu isolieren. Zwei überlappende Kosmidklone, die die gesamte KCNE1 cDNA umfassen, wurden auch isoliert mithilfe von KCNE1 in voller Länge als einer Sonde (17). Die Kosmide wurden sequenziert durch eine Dideoxy Chain Termination Method auf einem Applied Biosystems Modell 373A DNA-Sequenzierer, um die Genomstruktur des KCNE1-Gens zu definieren. Drei Exons umfassen KCNE1 cDNA (18 und Tabelle 8).
Die beiden Introns waren in 5'-UTR lokalisiert. Die Donor- und Akzeptor-Spleißstellen für beide Introns waren GT beziehungsweise AG. Drei Paare von Primern wurden für das Screenen von KCNE1 (Tabelle 9) designed. Das erste und das zweite Paar überlappen und decken die gesamte Kodierungssequenz ab. Das dritte Paar amplifiziert einen Teil der Kodierungsregion einschließlich der putativen transmembranen Domäne und einige der flankierenden Sequenzen.
Tabelle 8
Tabelle 9
BEISPIEL 17
Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen KVLQT1 oder KCNE1
Segmente von KVLQT1- oder KCNE1-Kodierungssequenzen werden als Fusionsproteine in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wird durch Gelelution gereinigt und dazu benutzt, Kaninchen und Mäuse zu immunisieren unter Verwendung eines Verfahrens, welches ähnlich demjenigen ist, das von Harlow und Lane (1988) beschrieben wurde. Mit diesem Verfahren wird die Herstellung von AK gegen zahlreiche Proteine (siehe zum Beispiel Kraemer et al., 1993) gezeigt.
Kurz gesagt, wird ein Stück der KVLQT1- oder KCNE1-Kodierungssequenz als ein Fusionsprotein in Plasmid PET5A (Novagen, Inc. Madison, WI) geklont. Nach der Induktion mit IPTG wird die Überexpression eines Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht durch SDS/PAGE verifiziert. Fusionsprotein wird aus dem Gel durch Elektroelution gereinigt. Die Identifizierung des Proteins als KVLQT1 oder KCNE1-Fusionsprodukt wird durch Proteinsequenzierung an dem N-Terminus verifiziert. Als Nächstes wird das gereinigte Protein als Immunogen in Kaninchen eingesetzt. Kaninchen werden mit 100 μg des Proteins in vollständigem Freunds Adjuvans immunisiert und erhalten zwei Boosterinjektionen in Intervallen von 3 Wochen, zuerst mit 100 μg Immunogen in nicht vollständigem Freunds Adjuvans, gefolgt von 100 μg Immunogen in PBS. Das Antikörper enthaltende Serum wird 2 Wochen danach abgenommen.
Dieses Verfahren wird wiederholt, um Antikörper gegen die mutierten Formen des KVLQT1- oder KCNE-Genprodukts zu erzeugen. Diese Antikörper in Verbindung mit Antikörpern für Wildtyp-KVLQT1 oder KCNE1 werden verwendet, um das Vorhandensein und die relative Konzentration der mutierten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen.
BEISPIEL 18
Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für KVLQT1 oder KCNE1 sind
Monoklonale Antikörper werden gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt. Mäuse werden mit Immunogen, welches intaktes KVLQT1 , KCNE1, KVLQT1-Peptide oder KCNE1-Peptide (Wildtyp oder Mutante), konjugiert mit Keyhole-limpet-Hämocyanin enthält, unter Verwendung von Glutaraldehyd oder EDC, wie gut bekannt ist, immunisiert.
Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10 bis 100 μg an Immunogen und nach der vierten Injektion werden den Mäusen Blutproben abgenommen, um zu bestimmen, ob das Serum Antikörper gegen das Immunogen enthält. Der Serumtiter wird bestimmt durch ELISA oder RIA. Mäuse mit Serum, welches auf die Anwesenheit von Antikörper gegenüber dem Immunogen hindeutet, werden für die Hybridomherstellung ausgewählt.
Milze werden aus immunen Mäusen entnommen und eine Einzelzellsuspension hergestellt (siehe Harlow und Lane, 1988). Zellfusionen werden durchgeführt wie im Wesentlichen bei Kohler und Milstein (1975) beschrieben. Kurz gesagt werden P3.65.3 Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) mit immunen Milzzellen fusioniert mithilfe von Polyethylenglykol wie bei Harlow und Lane (1988) beschrieben. Die Zellen werden mit einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Well in Gewebekulturplatten mit 96 Wells ausplattiert. Einzelne Wells werden auf Wachstum untersucht und die Überstande der Wells, in denen Wachstum stattfindet, auf das Vorhandensein von für KVLQT1 oder KCNE1 spezifischen Antikörpern mit ELISA oder RIA unter Verwendung des Wildtyp- oder mutierten KVLQT1- oder KCNE1-Zielproteins getestet. Zellen in positiven Wells werden vermehrt und subkloniert, um Monoklonalität zu etablieren und zu bestätigen.
Klone mit den gewünschten Spezifitäten werden vermehrt und als Ascites-Klone in Mäusen oder in einem hohlen Fasersystem angezogen, um ausreichende Mengen an Antikörpern für die Charakterisierung und Assayentwicklung zu produzieren.
BEISPIEL 19
Sandwich Assay für KVLQT1 oder KCNE1
Der monoklonale Antikörper ist an einer festen Oberfläche befestigt, wie beispielsweise einer Platte, einem Röhrchen, einem Kügelchen oder einem Partikel. Vorzugsweise wird der Antikörper an der Weltoberfläche einer 96-Well-ELISA-Platte befestigt. 100 μl Probe (z. B. Serum, Urin, Gewebecytosol), die KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein (Wildtyp oder Mutanten) enthält, wird zu dem Festphasenantikörper zugegeben. Die Probe wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nächstes wird die Probenflüssigkeit dekantiert und die feste Phase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. 100 μl eines zweiten monoklonalen Antikörpers (für eine andere Determinante an dem KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein) wird zu der Festphase hinzugegeben. Dieser Antikörper ist mit einem Nachweismolekül (z. B. ¹²⁵I, Enzym, Fluorophor oder einem Chromophor) markiert und die Festphase wird mit dem zweiten Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird dekantiert und die feste Phase mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Die Menge an gebundenem Marker, welche proportional zu der Menge an KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein ist, die in der Probe vorliegt, wird quantifiziert. Getrennte Assays werden durchgeführt mithilfe von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für das Wildtyp- KVLQT1 oder KCNE1 sind sowie mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für jede der Mutationen sind, die in KVLQT1 oder KCNE1 identifiziert wurden.
BEISPIEL 20
Assay, um Wirkstoffe zu screenen, die den KVLQT1- und KCNE-K⁺-Kanal beeinflussen
Mit dem Wissen, dass KVLQT1 und KCNE1 sich zusammenlagern, um einen kardialen I_KS-Kaliumkanal zu bilden, ist es nun möglich, einen Assay zu erstellen, um Wirkstoffe zu screenen, welche eine Wirkung auf diesen Kanal haben werden. Die beiden Gene, KVLQT1 und KCNE1 , werden in Oocyten oder in Säugetierzellen cotransfiziert und coexprimiert, wie oben beschrieben. Die Cotransfektion wird durchgeführt unter Verwendung einer beliebigen Kombination von Wildtyp- oder spezifisch mutiertem KVLQT1 und KCNE1. Wenn eines der Gene, das für die Cotransfektion benutzt wird, eine Mutation enthält, die LQTS verursacht, wird im Vergleich zu der Cotransfektion mit den Wildtyp-Genen allein eine Veränderung in dem induzierten Strom beobachtet. Ein Wirkstoffkandidat wird zu der Badlösung der tansfizierten Zellen hinzugegeben, um die Wirkungen der Wirkstoffkandidaten auf den induzierten Strom zu testen. Ein Wirkstoffkandidat, der den induzierten Strom derart verändert, dass er näher an dem Strom liegt, der mit Wildtyp-KVLQT1 und KCNE1 cotransfizierten Zellen beobachtet wird, ist für die Behandlung von LQTS hilfreich.
Während die Erfindung in dieser Patentanmeldung durch Bezugnahme auf die Details der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung offenbart ist, ist es selbstverständlich, dass die Offenbarung nur zu Anschauungszwecken gedacht ist und nicht in einem einschränkenden Sinn, da in Betracht gezogen wird, dass Abänderungen für einen Fachmann auf dem Gebiet leicht ersichtlich sein werden und innerhalb des Erfindungsgedankens und dem Anwendungsbereich der anhängigen Ansprüche liegen.
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SEQUENZLISTE
SEQUENZLISTE

Claims

Eine isolierte DNA, umfassend die Nukleinsäure nach SEQ ID NO:1, wobei jene DNA eine Mutation umfaßt, die ausgewählt ist aus: einem A bei Base 664, einer Deletion der Basen 662-664, einem C bei Base 694, einem A bei Base 727, einem T bei Base 979, einem A bei Base 1078, einem T bei Base 1097, einem A bei Base 1184 oder einem A bei Base 1196.
Eine isolierte DNA, umfassend DNA, die für ein mutiertes KVLQT1-Polypeptid kodiert, das Long QT-Syndrom verursacht, wobei jene isolierte DNA eine Mutation umfaßt, wobei jene Mutation dazu führt, dass jene isolierte DNA für ein KVLQT1 nach SEQ ID NO:2 mit einer veränderten Aminosäure kodiert, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: einem Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, einem Pro an Position 178, einem Arg an Position 189, einem Phe an Position 273, einem Arg an Position 306, einem Ile an Position 312, einem Glu an Position 341, oder einem Glu an Position 345.
Eine Nukleinsäuresonde, die spezifisch an die DNA nach Ansprüchen 1 oder 2 hybridisiert unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wobei jene stringenten Hybridisierungsbedingungen verhindern, daß jene Nukleinsäuresonde an DNA nach SEQ ID NO:1 hybridisiert.
Ein Verfahren zur Diagnose eines Polymorphismus, der Long QT-Syndrom verursacht, umfassend das Hybridisieren einer Sonde nach Anspruch 3 an eine DNA- oder RNA-Probe eines Patienten unter stringenten Bedingungen, die die Hybridisierung jener Sonde an eine jenen Polymorphismus umfassende Nukleinsäure erlauben, aber die Hybridisierung jener Sonde an Wildtyp-KVLQT1 verhindern, wobei die Anwesenheit eines Hybridisierungssignals die Anwesenheit jenes Polymorphismus anzeigt.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei die DNA oder RNA des Patienten amplifiziert wurde und jene amplifizierte DNA oder RNA hybridisiert ist.
Ein Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Hybridisierung in situ ausgeführt wird.
Ein Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit eines Polymorphismus in humanem KVLQT1, der Long QT-Syndrom verursacht, wobei jenes Verfahren mit Mitteln durchgeführt wird, die die Anwesenheit jenes Polymorphismus identifizieren, wobei jener Polymorphismus einer ist, der zur Anwesenheit eines KVLQT1-Polypeptids nach SEQ ID NO:2 mit einer veränderten Aminosäure führt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, einem Pro an Position 178, einem Arg an Position 189, einem Phe an Position 273, einem Arg an Position 306, einem Ile an Position 312, einem Glu an Position 341, oder einem Glu an Position 345.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei jener Polymorphismus die Anwesenheit eines A bei Base 664 von SEQ ID NO:1, einer Deletion der Basen 662-664 von SEQ ID NO:1, eines C bei Base 694 von SEQ ID NO:1, eines A bei Base 727 von SEQ ID NO:1, eines T bei Base 979 von SEQ ID NO:1, eines A bei Base 1078 von SEQ ID NO:1, eines T bei Base 1097 von SEQ ID NO:1, eines A bei Base 1184 von SEQ ID NO:1 oder eines A bei Base 1196 von SEQ ID NO:1 ist.
Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei jenes Mittel die Einzelstrangkonformation-Polymorphismus-Technik zur Bestimmung jenes Polymorphismus umfaßt.
Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei jenes Mittel das Sequenzieren humanen KVLQT1 umfaßt.
Das Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei jenes Mittel die Durchführung eines RNAse-Assays umfaßt.
Ein Antikörper, der an ein mutiertes KVLQT1-Polypeptid nach SEQ ID NO:2, aber nicht an ein Wildtyp-KVLQT1-Polypeptid nach SEQ ID NO:2 bindet, wobei jenes mutierte KVLQT1-Polypeptid nach SEQ ID NO:2 ein Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, ein Pro an Position 178, ein Arg an Position 189, ein Phe an Position 273, ein Arg an Position 306, ein Ile an Position 312, ein Glu an Position 341, oder ein Glu an Position 345 umfaßt.
Ein Verfahren zur Diagnose des Long QT-Syndroms, jenes Verfahren bestehend aus der Bestimmung der Anwesenheit eines mutierten KVLQT 1-Polypeptids in einem Patienten durch das Reagieren einer Patientenprobe mit einem Antikörper nach Anspruch 12, wobei die Anwesenheit einer positiven Reaktion das Long QT-Syndrom anzeigt.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei jener Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei jene Bestimmung Immunoblotting umfaßt.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei jene Bestimmung eine immuncytochemische Technik umfaßt.
Ein isoliertes KVLQT1-Polypeptid nach SEQ ID NO:2, umfassend eine Mutation, die Long QT-Syndrom verursacht, wobei jene Mutation ein Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, ein Pro an Position 178, ein Arg an Position 189, ein Phe an Position 273, ein Arg an Position 306, ein Ile an Position 312, ein Glu an Position 341, oder ein Glu an Position 345 ist.
Ein Verfahren zur Diagnose des Long QT-Syndroms in einer Person, wobei jenes Verfahren das Sequenzieren eines KVLQT1-Polypeptids nach SEQ ID NO:2 aus jener Person oder das Sequenzieren eines KVLQT1-Polypeptids nach SEQ ID NO:2, synthetisiert aus Nukleinsäure, die von jener Person stammt, umfaßt, wobei die Anwesenheit eines Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, eines Pro an Position 178, eines Arg an Position 189, eines Phe an Position 273, eines Arg an Position 306, eines Ile an Position 312, eines Glu an Position 341, oder eines Glu an Position 345 das Long QT-Syndrom anzeigt.
Ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen, die sich zur Behandlung einer Person mit einer Mutation in KVLQT1 nach SEQ ID NO:2 eignen, wobei jene Mutation eine ist, die zu einem Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, einem Pro an Position 178, einem Arg an Position 189, einem Phe an Position 273, einem Arg an Position 306, einem Ile an Position 312, einem Glu an Position 341, oder einem Glu an Position 345 führt, wobei jenes Verfahren umfaßt: a) Einlegen einer ersten Menge Zellen, die KVLQT1 nach SEQ ID NO:2 mit einer Mutation exprimieren, wobei jene Mutation ein Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168, ein Pro an Position 178, ein Arg an Position 189, ein Phe an Position 273, ein Arg an Position 306, ein Ile an Position 312, ein Glu an Position 341, oder ein Glu an Position 345 ist, in eine Badelösung zur Messung eines ersten induzierten K⁺-Stroms; b) Messen jenes ersten induzierten K⁺-Stroms; c) Einlegen einer zweiten Menge Zellen, die Wildtyp-KVLQT1 nach SEQ ID NO:2 exprimieren, in eine Badelösung zur Messung eines zweiten induzierten K⁺-Stroms; d) Messen jenes zweiten induzierten K⁺-Stroms; e) Zugabe eines Wirkstoffs zu der Badelösung aus Schritt (a); f) Messen eines dritten induzierten K⁺-Stroms von Zellen in Schritt (e); und g) Bestimmen, ob der dritte induzierte K⁺-Strom dem zweiten induzierten K⁺-Strom ähnlicher ist als der erste induzierte K⁺-Strom, wobei Wirkstoffe, die zu einem dritten K⁺-Strom führen, der dem zweiten induzierten K⁺-Strom ähnlicher ist als der erste induzierte K⁺-Strom, sich zur Behandlung jener Personen eignen.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei jene erste Menge Zellen oder jene zweite Menge Zellen aus einem transgenen Tier gewonnen ist.
Eine mit der DNA nach Ansprüchen 1 oder 2 transfizierte Zelle.
Ein die isolierte DNA nach Ansprüchen 1 oder 2 umfassender Vektor.
Eine mit dem Vektor nach Anspruch 22 transfizierte Zelle.
Ein die DNA nach Ansprüchen 1 oder 2 umfassendes nichthumanes transgenes Tier.
Ein Verfahren zur Risikoabschätzung für Long QT-Syndrom in einem humanen Subjekt, das das Untersuchen jenes Subjekts auf eine Mutation in einem KVLQT1-Gen durch den Vergleich der Sequenz des aus einer Gewebeprobe jenes Subjekts isolierten KVLQT1-Gens oder seiner Expressionsprodukte mit einem Wildtyp-KVLQT1-Gen oder seinen Expressionsprodukten umfaßt, wobei jene Mutation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem A bei Base 664 von SEQ ID NO:1, einer Deletion der Basen 662-664 von SEQ ID NO:1, einem C bei Base 694 von SEQ ID NO:1, einem A bei Base 727 von SEQ ID NO:1, einem T bei Base 979 von SEQ ID NO:1, einem A bei Base 1078 von SEQ ID NO:1, einem T bei Base 1097 von SEQ ID NO:1, einem A bei Base 1184 von SEQ ID NO:1 oder einem A bei Base 1196 von SEQ ID NO:1, einem Trp an Position 167 zusammen mit einer Deletion des Aminosäurerests 168 von SEQ ID NO:2, einem Pro an Position 178 von SEQ ID NO:2, einem Arg an Position 189 von SEQ ID NO:2, einem Phe an Position 273 von SEQ ID NO:2, einem Arg an Position 306 von SEQ ID NO:2, einem Ile an Position 312 von SEQ ID NO:2, einem Glu an Position 341 von SEQ ID NO:2, oder einem Glu an Position 345 von SEQ ID NO:2, wobei jene Mutation in der Sequenz des Subjekts ein Risiko für Long QT-Syndrom anzeigt.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei jenes Expressionsprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus mRNA des KVLQT1-Gens und einem vom KVLQT1-Gen kodierten KVLQT1-Polypeptid.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei eine oder mehrere der folgenden Prozeduren ausgeführt wird: a. Beobachten von Verschiebungen in der elektrophoretischen Mobilität einzelsträngiger DNA aus jener Probe auf nichtdenaturierenden Polyacrylamidgelen; b. Hybridisieren einer KVLQT1-Gensonde an genomische DNA, isoliert aus jener Probe unter Bedingungen, die sich zur Hybridisierung jener Sonde an jenes Gen eignen; c. Bestimmen der Hybridisierung einer allelspezifischen Sonde an genomische DNA aus jener Probe; d. Amplifizieren des ganzen oder eines Teils des KVLQT1-Gens aus jener Probe, um eine amplifizierte Sequenz zu erzeugen, und Sequenzieren der amplifizierten Sequenz; e. Bestimmen der Anwesenheit eines spezifischen mutierten KVLQT1-Allels in jener Probe durch Nukleinsäureamplifizierung; f. molekulares Klonieren des ganzen oder eines Teils des KVLQT1-Gens aus jener Probe, um eine klonierte Sequenz zu erzeugen, und Sequenzieren der klonierten Sequenz; g. Bestimmen, ob ein Mismatch zwischen den Molekülen (1) genomischer DNA des KVLQT1-Gens oder KVLQT1-mRNA, isoliert aus jener Probe, und (2) einer Nukleinsäuresonde, die zu menschlicher Wildtyp-KVLQT1-Gen-DNA komplementär ist, besteht, wenn Moleküle (1) und (2) aneinander hybridisiert sind und damit einen Doppelstrang bilden; h. Amplifizieren von KVLQT1-Gensequenzen in jener Probe und Hybridisieren der amplifizierten Sequenzen an Nukleinsäuresonden, die Wildtyp-KVLQT1-Gensequenzen umfassen; i. Amplifizierung von KVLQT1-Gensequenzen in jenem Gewebe und Hybridisierung der amplifizierten Sequenzen an Nukleinsäuresonden, die mutierte KVLQT1-Gensequenzen umfassen; j. Untersuchen auf eine Deleionsmutation; k. Untersuchen auf eine Punktmutation; l. Untersuchen auf eine Insertionsmutation; m. Bestimmen der in-situ-Hybridisierung des KVLQT1-Gens in jener Probe mit einer oder mehreren Nukleinsäuresonden, die die KVLQT1-Gensequenz oder eine mutierte KVLQT1-Gensequenz umfassen; n. Immunoblotting; o. Immuncytochemie; p. Untersuchung auf Bindewechselwirkungen zwischen aus jenem Gewebe isoliertem KVLQT1-Gen-Protein und einem Bindepartner, der spezifisch das Polypeptid-Expressionprodukt eines mutierten Allels von KVLQT1 binden kann, und/oder einem Bindepartner für das KVLQT1-Polypeptid, das die in SEQ ID NO:2 dargestellte Aminosäuresequenz hat; und q. Untersuchen auf Inhibition der biochemischen Aktivität jenes Bindepartners.