DE69837565T2

DE69837565T2 - Mutationen des menschlichen mink gens, die mit arrhytmie verbunden sind

Info

Publication number: DE69837565T2
Application number: DE69837565T
Authority: DE
Inventors: Mark T. Brookline KEATING; Michael C. Salt Lake City SANGUINETTI; Igor Allston SPLAWSKI
Original assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Current assignee: University of Utah Research Foundation UURF
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1998-10-06
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-10-07
Also published as: US20050003439A1; JP2003530814A; WO2000006600A1; EP1100825A4; US7247436B2; CA2337491A1; US6274332B1; US20030054380A1; US20040235038A1; DE69837565D1; KR20010085315A; EP1100825A1; EP1100825B1; ATE359299T1; US6323026B1; US6432644B1; CA2337491C

Description

Diese Anmeldung wurde mit Unterstützung der Regierung unter den Zuwendungsnummern RO1 HL48074 und P50-HL52338-02 (SCOR), von den National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, gefördert, und der Zuwendungsnummer M01 RR00064 vom öffentlichen Gesundheitswesen der USA erstellt. Die Bundesregierung kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung haben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Gene und Genprodukte, die mit dem Long-QT-Syndrom (LQT) assoziiert sind, und ein Verfahren zur Diagnose von LQT gerichtet. LQT wird gemäß der vorliegenden Erfindung diagnostiziert, indem die DNA-Sequenz des KCNE1-Gens einer zu testenden Einzelperson analysiert und die jeweilige DNA-Sequenz mit der bekannten DNA-Sequenz eines normalen KCNE1-Gens verglichen wird. Alternativ kann das KCNE1-Gen einer zu testenden Einzelperson nach Mutationen, die LQT verursachen, gescreent werden. Die Vorhersage von LQT wird Ärzten ermöglichen, diese Erkrankung unter Anwendung existierender medizinischer Therapien zu verhindern. Diese Erfindung beschreibt weiterhin, dass die KVLQT1- und KCNE1-Proteine (auch als minK-Proteine bekannt) sich zusammenlagern, um einen kardialen I_Ks-Kaliumkanal zu bilden. Dieses Wissen kann dazu verwendet werden, diese zwei Proteine in einer Zelle zu koexprimieren, und eine solche transformierte Zelle kann zum Screenen nach Wirkstoffen verwendet werden, die beim Behandeln oder Verhindern von LQT von Nutzen sein werden. Die Erfindung ist weiterhin auf Mutationen im humanen KCNE1-Gen (wobei dieses Gen humanes minK-Protein kodiert), die in Familien mit LQT entdeckt wurden, gerichtet.
Die Veröffentlichungen und anderen Materialien, die hierin zum Erläutern des allgemeinen Stands der Technik oder zum Liefern weiterer Einzelheiten in Bezug auf die Ausübung verwendet werden, sind in der angefügten Liste der Referenzen gruppiert.
Herzrhythmusstörungen sind eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität, die ungefähr 11% aller natürlichen Tode ausmachen (Kannel, 1987; Willich et al., 1987). Im Allgemeinen ist die präsymptomatische Diagnose und Behandlung von Einzelpersonen mit lebensbedrohlichen ventrikulären Tachyarrhythmien mangelhaft und in einigen Fällen erhöht die medizinische Handhabung tatsächlich die Gefahr einer Arrhythmie und des Todes (Cardiac Arrhythmia Suppression Trial II Investigators, 1992). Diese Faktoren machen eine Früherkennung von Einzelpersonen, die ein Risiko für Herzrhythmusstörungen aufweisen, und die Arrhythmieprävention zu einer Angelegenheit hoher Dringlichkeit.
Sowohl genetische als auch erworbene Faktoren tragen zum Risiko der Entwicklung von Herzrhythmusstörungen bei. Long-QT-Syndrom (LQT) ist eine angeborene Herzrhythmusstörung, die abrupten Bewusstseinsverlust, Synkope, Anfälle und plötzlichen Tod aufgrund von ventrikulären Tachyarrhythmien, insbesondere Torsade de pointes und Kammerflimmern verursacht (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975; Moss et al., 1991). Diese Erkrankung tritt gewöhnlich in jungen, anderweitig gesunden Einzelpersonen auf (Ward, 1964; Romano, 1965; Schwartz et al., 1975). Die meisten LQT-Gen-Träger manifestieren sich in einer Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen, ein Zeichen abnormer kardialer Repolarisation (Vincent et al., 1992). Die klinischen Merkmale von LQT resultieren aus episodischen Herzrhythmusstörungen, insbesondere mit der Repolarisation zusammenhängenden ventrikulären Tachyarrhythmien wie Torsade de pointes, die nach der charakteristischen undulierenden Beschaffenheit des Elektrokardiogramms bei dieser Arrhythmie und diesem Kammerflimmern benannt wurde (Schwartz et al., 1975; Moss und McDonald, 1971). Torsade de pointes kann zu Kammerflimmern, einer besonders letalen Arrhythmie, degenerieren. Obwohl LQT keine gewöhnliche Diagnose ist, sind ventrikuläre Arrhythmien sehr verbreitet; mehr als 300.000 Bürger der Vereinigten Staaten jährlich sterben plötzlich (Kannel et al., 1987; Willich et al., 1987), und in vielen Fällen kann der zugrunde liegende Mechanismus anomale kardiale Repolarisation sein. LQT stellt daher eine einzigartige Gelegenheit bereit, lebensbedrohliche Herzrhythmusstörungen auf molekularer Ebene zu untersuchen.
Sowohl angeborene als auch erworbene Formen von LQT wurden definiert. Erworbenes LQT und sekundäre Arrhythmien können aus kardialer Ischämie, Bradykardie und Stoffwechselanomalitäten wie geringer Kalium- oder Kalziumkonzentration im Serum resultieren (Zipes, 1987). LQT kann auch aus der Behandlung mit bestimmten Medikationen resultieren, einschließlich Antibiotika, Antihistaminika, Allgemeinnarkotika und am gebräuchlichsten Antiarrhythmika (Zipes, 1987). Angeborene Formen von LQT können aus Mutationen in mindestens fünf unterschiedlichen Genen resultieren. In früheren Studien wurden LQT-Loci auf Chromosom 11p15.5 (KVLQT1 oder LQT 1) (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), 7q35–36 (HERG oder LQT2), 3p21–24 (SCNSA oder LQT3) (Jiang et al., 1994) kartiert. Von diesen ist die häufigste Ursache von LQT KVLQT11. Unsere Daten zeigen, dass Mutationen in diesem Gen für mehr als 50% des angeborenen LQT verantwortlich zeichnen. Vor kurzem wurde ein vierter LQT-Locus (LQT4) auf 4g25–27 kartiert (Schott et al., 1995). Zudem wurde KCNE1 (LQT5) mit Long-QT-Syndrom assoziiert (Splawski et al., 1997b; Duggal et al., 1998). Diese Gene kodieren Ionenkänale, die an der Erzeugung von kardialem Aktionspotential beteiligt sind. Mutationen können zu Kanaldysfunktion und verzögerter myozellulärer Repolarisation führen. Aufgrund der regionalen Heterogenität der Kanalexpression mit dem Myokardium erzeugt die anomale kardiale Repolarisation ein Substrat für Arrhythmie. KVLQT1 und KCNE1 werden außerdem im Innenohr exprimiert (Neyroud et al., 1997; Vetter et al., 1996). Wir und andere zeigten auf, dass homozygote oder zusammengesetzte heterozygote Mutationen in jedem dieser Gene Taubheit und den schwerwiegenden kardialen Phänotyp des Jervell-Lange-Nielsen-Syndroms verursachen können (Neyroud et al., 1997; Splawski et al., 1997a; Schultze-Bahr et al., 1997; Tyson et al., 1997). Der Verlust von funktionellen Kanälen im Ohr stört augenscheinlich die Produktion von Endolympha, was zu Taubheit führt.
Die präsymptomatische Diagnose von LQT basiert gegenwärtig auf der Verlängerung des QT-Intervalls in Elektrokardiogrammen. Bei einem QTc (in Bezug auf die Herzfrequenz korrigiertes QT-Intervall; Bazzett, 1920) von mehr als 0,44 Sekunden wurde eine Einzelperson traditionell als betroffen eingestuft. Die meisten LQT-Patienten sind jedoch junge, anderweitig gesunde Einzelpersonen, die keine Elektrokardiogramme machen lassen. Darüber hinaus haben genetische Studien gezeigt, dass das QTc weder empfindlich noch spezifisch ist (Vincent et al., 1992). Das Spektrum von QTc-Intervallen für Genträger und Nicht-Genträger weist Überlappungen auf, was zu Fehleinstufungen führt. Nicht-Genträger können verlängerte QTc-Intervalle aufweisen und als betroffen diagnostiziert werden. Umgekehrt zeigen manche LQT-Genträger QTc-Intervalle von ≤ 0,44 Sekunden, weisen jedoch dennoch ein erhöhtes Arrhythmierisiko auf. Eine korrekte präsymptomatische Diagnose ist für eine wirksame, genspezifische Behandlung von LQT wichtig.
Es wurde von autosomal-dominanten und autosomal-rezessiven Formen dieser Erkrankung berichtet. Autosomal-rezessives LQT (auch als Jervell-Lange-Nielsen-Syndrom bekannt) wurde mit kongenitaler retrokochleärer Schwerhörigkeit assoziiert; diese Form von LQT ist selten (Jervell und Lange-Nielsen, 1957). Autosomal-dominantes LQT (Romano-Ward-Syndrom) ist gewöhnlicher und wird nicht mit anderen phänotypischen Anomalitäten assoziiert (Romano et al., 1963; Ward, 1964). Eine Erkrankung, die dem angeborenen LQT sehr ähnliche ist, kann ebenfalls erworben werden, für gewöhnlich als Folge einer pharmakologischen Therapie (Schwartz et al., 1975; Zipes, 1987).
Die Daten bringen Schlussfolgerungen zum Mechanismus von Arrhythmien in LQT mit sich. Zwei Hypothesen wurden zuvor für LQT aufgestellt (Schwartz et al., 1994). Eine legt nahe, dass eine Dominanz von linker vegetativer Innervation eine anomale kardiale Repolarisation und Arrhythmien verursacht. Diese Hypothese wird von der Erkenntnis unterstützt, dass Arrhythmien in Hunden von der Entfernung des rechten Stellarganglions induziert wird. Darüber hinaus legen Einzelberichte nahe, dass einige LQT-Patienten wirksam mit β-Adrenorezeptorenblockern und durch Ektomie des linken Stellarganglions behandelt werden können (Schwartz et al., 1994). Die zweite Hypothese für mit LQT zusammenhängenden Arrhythmien legt nahe, dass Mutationen in herzspezifischen Ionenkanalgenen oder Genen, die kardiale Ionenkanäle modulieren, eine verzögerte myozelluläre Repolarisation bewirken. Eine verzögerte myozelluläre Repolarisation könnte eine Reaktivierung von Kalziumkanälen des L-Typs begünstigen, was in sekundären Depolarisationen resultiert (January und Riddle, 1989). Bei diesen sekundären Depolarisationen handelt es sich um den wahrscheinlichen zellulären Mechanismus von Torsade de Pointes-Arrhythmien (Surawicz, 1989). Diese Hypothese wird von der Beobachtung unterstützt, dass eine pharmakologische Blockade von Kaliumkanälen eine QT-Verlängerung und mit Repolarisation zusammenhängende Arrhythmien in Menschen und Tiermodellen induzieren kann (Antzelevitch und Sicouri, 1994). Die Entdeckung, dass eine Form von LQT aus Mutationen in einem kardialen Kaliumkanalgen resultiert, unterstützt die myozelluläre Hypothese.
Theoretisch könnten Mutationen in einem kardialen Natriumkanal-Gen LQT verursachen. Spannungsgesteuerte Natriumkanäle vermitteln eine schnelle Depolarisation in ventrikulären Myozyten und leiten zudem einen kleinen Strom während der Plateauphase des Aktionspotentials (Attwell et al., 1979). Subtile Anomalitäten der Natriumkanalfunktion (z. B. verzögerte Natriumkanal-Inaktivierung oder veränderte Spannungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung) könnten die kardiale Repolarisation verzögern, was zu einer QT-Verlängerung und Arrhythmien führt. 1992 klonierten und charakterisierten Gellens und Kollegen ein kardiales Natriumkanalgen, SCNSA (Gellens et al., 1992). Die Struktur dieses Gens war anderen, zuvor charakterisierten Natriumkanälen ähnlich, die ein großes Protein von 2016 Aminosäuren kodieren. Diese Kanalproteine enthalten vier homologe Domänen (DI–DIV), von denen jede sechs putative membrandurchdringende Segmente (S1-S6) enthält. SCNSA wurde vor kurzem auf Chromosom 3p21 kartiert, was es zu einem hervorragenden Kandidatengen für LQT3 macht (George et al., 1995), und von diesem Gen wurde dann bewiesen, das es mit LQT3 assoziiert ist (Wang et al., 1995a).
1994 identifizierten Warmke und Ganetzky eine neuartige humane cDNA, das "Human Ether a-go-go related-Gen" (HERG, Warmke und Ganetzky, 1994). HERG wurde mittels PCR-Analyse eines Körperzellhybrid-Panels zum humanen Chromosom 7 lokalisiert (Warmke und Ganetzky, 1994), was es zu einem Kandidaten für LQT2 macht. Es hat eine vorhergesagte Aminosäuresequenzhomologie zu Kaliumkanälen. HERG wurde mittels Homologie zum "Drosophila-Ether a-go-go-Gen" (eag), das einen kalziummodulierten Kaliumkanal kodiert, aus einer Hippokampus-cDNA-Bibliothek isoliert (Bruggemann et al., 1993). HERG ist jedoch nicht das humane Homolog von eag, da es nur 50% Aminosäuresequenzhomologie mit diesem teilt. Von HERG wurde gezeigt, dass es mit LQT2 assoziiert ist (Curran et al., 1995).
Von LQT1 wurde festgestellt, dass es mit dem Gen KVLQT1 verknüpft ist (Q. Wang et al., 1996). Sechzehn Familien mit Mutationen in KVLQT1 wurden identifiziert und charakterisiert und es wurde gezeigt, dass in allen sechzehn Familien eine vollständige Verknüpfung zwischen LQT1 und KVLQT1 vorlag. KVLQT1 wurde auf das Chromosom 11p15.5 kartiert, was es zu einem Kandidatengen für LQT1 macht. KVLQT1 kodiert ein Protein mit strukturellen Charakteristika von Kaliumkanälen und die Expression des Gens, wie mittels Northern-Blot-Analyse gemessen, zeigte, dass KVLQT1 im Herzen am stärksten exprimiert wird. Eine intragene Deletion und zehn verschiedene Missense-Mutationen, die LQT verursachen, wurden in KVLQT1 identifiziert. Diese Daten definieren KVLQT1 als ein neuartiges kardiales Kaliumkanal-Gen und zeigen, dass Mutationen in diesem Gen Anfälligkeit gegenüber ventrikulären Tachyarrhythmien und plötzlichem Tod verursachen.
Es war bekannt, dass eine Komponente des I_Ks Kanals minK ist, ein Protein von 130 Aminosäuren mit einer einzigen putativen Transmembrandomäne (Takumi et al., 1988; Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; K.W. Wang et al., 1996). Die Größe und Struktur dieses Proteins machte es unwahrscheinlich, dass minK für sich funktionelle Kanäle bildet (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993). Es werden Beweise vorgelegt, dass KVLQT1 und minK sich zusammenlagern, um den kardialen I_Ks-Kaliumkanal zu bilden. Dies wurde von Sanguinetti et al. (1996b) veröffentlicht. I_Ks-Dysfunktion ist eine Ursache von Herzrhythmusstörungen. Es wurde später gezeigt, dass Mutationen in KCNE1 (das minK kodiert) ebenfalls in LQT resultieren kann (Splawski et al., 1997b).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung lehrt die genomische Struktur der LQT-Gene KVLQT1 und KCNE1. Dies beinhaltet eine Lehre der Intron-Exon-Übergangsstellen. Ebenfalls offenbart sind weitere Sequenzdaten, die zuvor nicht dargelegt wurden, für beide Gene als auch Mutationen in KVLQT1 und KCNE1, die mit LQT assoziiert sind. Eine Analyse des KCNE1-Gens wird eine Frühdiagnose von Probanden mit LQT bereitstellen. Das Diagnoseverfahren umfasst das Analysieren der DNA-Sequenz des KCNE1-Gens einer zu testenden Einzelperson und das Vergleichen dieser mit der DNA-Sequenz des nativen Gens, bei dem es sich um keine Variante handelt. In einer zweiten Ausführungsform wird das KCNE1-Gen einer zu testenden Einzelperson nach Mutationen, die LQT verursachen, gescreent. Die Befähigung, LQT vorherzusagen, wird Ärzten ermöglichen, die Erkrankung mit medizinischer Therapie, wie Betablockern, zu verhindern.
Es wird weiterhin beschrieben, dass KVLQT1 und KCNE1 (minK) sich zusammenlagern, um einen kardialen I_Ks-Kaliumkanal zu bilden. I_Ks-Dysfunktion ist eine Ursache von Herzrhythmusstörungen. Das Wissen, dass sich diese zwei Proteine zusammenlagern, um den I_Ks-Kanal zu bilden, ist zum Entwickeln eines Assays zum Screenen nach Wirkstoffen nützlich, die beim Behandeln oder Verhindern von LQT von Nutzen sein werden. Durch Koexpression beider Gene in einer Zelle, wie einer Oozyte, ist es möglich, nach Wirkstoffen zu screenen, die eine Wirkung auf den I_Ks-Kanal ausüben, sowohl in dessen Wildtyp-Formen als auch in dessen mutierten Formen. Dieses Wissen ist auch zur Analyse des KCNE1-Gens für eine Frühdiagnose von Probanden mit LQT von Nutzen. Die Diagnoseverfahren werden wie oben für KCNE1 angegeben durchgeführt.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Stammbaumstruktur für einen Abschnitt des LQT-Kindred 1532. Betroffene Einzelpersonen sind als ausgefüllte Kreise (Frauen) oder Quadrate (Männer), unbetroffene Einzelpersonen als leere Symbole gezeigt und Einzelpersonen mit unspezifischen Phänotypen sind punktiert. Genotypen für Chromosom-11-Marker sind unter jedem Symbol angezeigt und als Haplotypen gezeigt. Die Markerreihenfolge (von oben nach unten) ist wie folgt: Tel-HRAS-D11S92-TH-D11S1318-D11S454-D11S860-D11S12-Den. Die Genauigkeit von Haplotypen wurde mittels Verwendung von Genotypen aus zusätzlichen Chromosom-11p15.5-Markern sichergestellt. Abgeleitete Genotypen sind in Klammern gezeigt. Krankheitschromosome sind durch Kästchen angezeigt und Rekombinationsereignisse sind mit durchgezogenen horizontalen Linien angezeigt. Rekombinationsereignisse, die sich auf Krankheitschromosome auswirken, treten in folgenden Einzelpersonen auf: IV-22, IV-25, V-6, V-17, V-24, V-34, VI-13, VI-14 und VI-16. Rekombinationsereignisse, die in Nicht-Krankheitschromosomen auftreten, sind nicht angezeigt. KVLQT1 ist ein SSCP-Konformationsisomer in KVLQT1, das mit den Primern 5 und 6 identifiziert wird; dieses Konformationsisomer wurde nur in K1532 identifiziert und stellt eine mit der Erkrankung assoziierte Mutation dar (Allel 2 ist das mutierte Allel). Haplotypanalysen zeigen, dass KVLQT1 sich zwischen den flankierenden Markern D11S922 und D11S454 befindet.
2. Physikalische Genomkarte der LQT1-Region. Das Ideogramm von Chromosom 11 zeigt die ungefähre Position von LQT1 (11p15.5). Die Position von polymorphen Markern und einiger Cosmide ist mittels vertikaler Linien auf der Karte angezeigt. Eine verfeinerte genetische Kartierung ordnet LQT1 zwischen TH und D11S454 an. Der Abstand zwischen TH und D11S454 wurde mittels Puls-Feld-Gelanalysen als < 700 kb geschätzt. Eine physikalische Genomkarte des Mindestsatzes der Überlappung von YAC und P1-Klone ist gezeigt. Die Positionen der KVLQT1-cDNA und "trapped" Exons sind angezeigt. Gestrichelte Linien in YACs zeigen Chimärismus an.
3. Alignment der S1-S6-Region von KVLQT1 mit Drosophila-Shaker-Kaliumkanal, DMSHAKE1 (SHA) (Pongs et al., 1988). Identität (|) und Ähnlichkeit (:) sind angezeigt. Die 3 separaten Fragmente von KVLQT1 sind in folgender Reihenfolge: SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108 und SEQ ID NO:109. Die 3 separaten Fragmente von DMSHAKE1 sind in folgender Reihenfolge: SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:111 und SEQ ID NO:112.
4. Northern-Analyse, die die Expression von KVLQT1 in Herz, Plazenta, Lunge, Niere und Pankreas des Menschen anzeigt.
5A–5B. Genomische Organisation der kodierenden und 5'- und 3'-untranslatierten Regionen von KVLQT1. Die Positionen der Introns sind mittels Pfeilspitzen angezeigt. Die sechs putativen Transmembransegmente (S1 bis S6) und die putative Porenregion (Pore) sind unterstrichen. Das Stoppcodon ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die Nukleotidsequenz der 5A–5B ist SEQ ID NO:1. Die Aminosäuresequenz der 5A–5B ist SEQ ID NO:2.
6. Physikalische Genomkarte und Exon-Organisation von KVLQT1. Die Genomregion von KVLQT1 umspannt ungefähr 400 Kilobasen. Die physikalische Genomkarte des minimalen Contigs von überlappenden P1-Klonen und des Cosmids, das Exon 1 enthält, ist gezeigt. Die Position der KVLQT1-Exons in Bezug auf genomische Klone ist angezeigt. Die Größen der Exons und die Abstände sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
7A–7E. Die Koexpression von KVLQT1 und hminK in CHO-Zellen induziert einen Strom, der zum kardialen I_Ks nahezu identisch ist. A) Während 1 s dauernden Depolarisationsimpulsen bis zu Membranpotentialen von –50 bis +40 mV aufgezeichnete KVLTQ1-Ströme, angelegt von einem Haltepotential von –80 mV. Schwanzströme wurden bei –70 mV gemessen. B) Normalisierte isochrone Aktivierungskurven für mit KVLQT1 (n = 6; 1 s dauernde Impulse) oder KVLQT1 und KCNE1 (n = 7; 7,5 s dauernde Impulse) transfizierte Zellen. C–E) Während 7,5 s dauernden Impulsen auf –40, –20, –10, 0, +20 und +40 mV in mit KCNE1 (C), KVLQT1 (D) oder KVLQT1 und KCNE1 (E) transfizierten Zellen aufgezeichnete Ströme. Schwanzströme wurden bei –70 mV in D und bei –50 mV in C und E gemessen. Die Amplitude des Dauerstroms von KVLQT1 bei +40 mV war 0,37 ±0,14 nA (n = 6). In mit KVLQT1 und KCNE1 kotransfizierten Zellen war der zeitabhängige Strom während eines 7,5 s dauernden Impulses auf +40 mV 1,62 ± 0,39 nA (n = 7).
8A–8C. Expression von KVLQT1 in Xenopus-Oozyten. A) In einer Oozyte, der 12,5 ng KVLQT1-cRNA injiziert wurden, aufgezeichnete Ströme. Die Impulse wurden in 10-mV-Schrittgrößen von –70 bis +40 mV angelegt. B) Isochrone (1 s) Aktivierungskurve für KVLQT1-Strom. Die V_1/2 war –14,0 ± 0,2 mV und der Steigungsfaktor war 11,2 ± 0,2 mV (n = 9). C) Die Beziehung von E_rev im Vergleich zu log[K⁺]_c wurde mit einer linearen Funktion angepasst und wies eine Steigung von 49,9 ± 0,4 mV (n = 6–7 Oozyten pro Punkt) auf. Die Schwanzströme wurden bei mehreren Spannungen nach 1,6 s dauernden Vorimpulsen auf +10 mV gemessen.
9A–9E. Die Koexpression von KVLQT1 und hminK legt die Gegenwart eines KVLQT1-Homologs in Xenopus-Oozyten nahe. Die Ströme wurden bei –40, –20, 0, +20 und +40 mV in Oozyten gemessen, denen entweder 5,8 ng KVLQT1 (9A) oder 1 ng KCNE1 (9B) injiziert oder beide cRNAs (9C) koinjiziert wurden. 9D zeigt Beziehungen von Strom zu Spannung, die unter Anwendung von 2 s dauernden Impulsen für KVLQT1 und 7,5 s dauernden Impulsen für hminK oder KVLQT1 und hminK gemessen wurden (n = 20 Zellen für jede Bedingung). Bei Oozyten, die mit 60 pg oder 1 ng KCNE1-cRNA injiziert wurden, war I_sK bei +40 mV 2,11 ± 0,12 μA und 2,20 ± 0,18 μA. 9E zeigt normalisierte isochrone Aktivierungskurven für Oozyten, die mit KCNE1 injiziert (V_1/2 = 2,4 ± 0,3 mV; Steigung = 11,4 ± 0,3 mV; n = 16) oder mit KVLQT1- und KCNE1-cRNA koinjiziert wurden (V_1/2 = 6,2 ± 0,3 mV; Steigung = 12,3 ± 0,2 mV; n = 20).
10. Vergleich einer partiellen humanen und einer partiellen Xenopus-KVLQT1-Aminosäuresequenz. Vertikale Linien zeigen identische Reste an. Die Xenopus-Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO:113 und die humane Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO:114.
11A–11D. KVLQT1-Missense-Mutationen kosegregieren mit LQT in den Kindreds K1532 (11A), K2605 (11B), K1723 (11C) und K1807 ( 11D). Die Ergebnisse von SSCP-Analysen mit dem Primerpaar 5–6 (K1532), dem Primerpaar 9–10 (K1723, K1807) und dem Primerpaar 11–12 (K2605) sind unter jedem Stammbaum gezeigt. Abweichende SSCP-Konformationsisomere (mit * gekennzeichnet) kosegregieren mit LQT in jedem Kindred. Für K1532 sind nur acht der 217 Einzelpersonen gezeigt. Da die abweichenden SSCP-Konformationsisomere, die mit LQT in K161 und K162 kosegregieren, mit dem abweichenden Konformationsisomer, das in K1807 definiert ist, identisch sind, sind Ergebnisse für diese Kindreds nicht gezeigt. Die Ergebnisse von DNA-Sequenzanalysen der normalen (links) und der abweichenden (rechts) Konformationsisomere sind unter jedem Stammbaum gezeigt.
12A–12O. Intragene Deletionen und Missense-Mutationen von KVLQT1, die mit LQT in den Kindreds K13216 (12A), K1777 (12B), K20925 (12C), K2557 (12D), K13119 (12E), K20926 (12F), K15019 (12G), K2625 (12H), K2673 (12I), K3698 (12J), K19187 (12K), K22709 (12L), K2762 (12M), K3401 (12N) und K2824 (12O) assoziiert werden. Betroffene Einzelpersonen sind durch ausgefüllte Kreise (Frauen) oder Quadrate (Männer) gekennzeichnet. Unbetroffene Einzelpersonen sind durch leere Symbole gekennzeichnet und ungewisse Einzelpersonen sind entweder grau oder punktiert. Die Ergebnisse für SSCP-Analysen mit dem Primerpaar 1–2 (K13216, K2557, K13119, K15019), dem Primerpaar 7–8 (K1777, K20926) und dem Primerpaar 9–10 (K20925) sind unter jedem Stammbaum in den 12A–12G gezeigt (siehe Tabelle 5 für Primerpaare). Da die abweichenden SSCP-Konformationsisomere, die mit LQT in K2050, K163 und K164 kosegregieren, mit den abweichenden Konformationsisomeren, die in K1723 und K1807 definiert sind, identisch sind, sind Ergebnisse für diese Kindreds nicht gezeigt. Für die 12A–12G sind die Ergebnisse von DNA-Sequenzanalysen der normalen (links) und der abweichenden (rechts) Konformationsisomere unter jedem Stammbaum gezeigt und die gezeigten Sequenzen sind auf dem Antisense-Strang. Für die 12H–12O sind die abweichenden SSCP-Konformationsisomere mit einem Pfeil gekennzeichnet.
13A–13C. Mit LQT assoziierte KCNE1-Mutationen. Stammbaumstruktur für die LQT-Kindreds 1789 (13A) und 1754 (13B). Betroffene Einzelpersonen sind durch ausgefüllte Kreise (Frauen) oder Quadrate (Männer) gekennzeichnet. Unbetroffene Einzelpersonen sind durch unausgefüllte Symbole gekennzeichnet. Abweichende SSCP-Konformationsisomere, die mit der Erkrankung kosegregieren, sind unter jedem Stammbaum gezeigt. Ein gemeinsamer Polymorphismus (G38S), der nicht mit LQT in Verbindung steht, wird ebenfalls von diesen Primern nachgewiesen. Die Auswirkung von Mutationen auf die hminK-Protein-Sequenz ist angezeigt. 13C ist eine schematische Darstellung des hminK-Proteins, die die Position von mit LQT assoziierten Mutationen zeigt.
14A–14B. Die Größe von I_Ks variiert in Abhängigkeit von injizierter KCNE1-cRNA. A) Repräsentative Stromüberwachungen, die von 7,5 Sekunden dauernden Impulsen bei +40 mV nach Injektion von Oozyten mit 6 ng KVLQT1-cRNA/Oozyt und einer variablen Menge von KCNE1-cRNA, wie angegeben, ausgelöst wurden. Man beachte die Gegenwart von KVLQT1-Strom und die Abwesenheit von I_Ks in der mit 0,01 ng KCNE1 injizierten Oozyte. B) Die Stromamplitude nach einem 7,5 Sekunden dauernden Impuls auf +40 mV wurde auf Scheitelstrom normalisiert, der mittels Injektion von 1,2 ng KCNE1 erreicht wurde. Die Werte stellen den Mittelwert ± Standardfehler. N = 8 Oozyten/Gruppe.
15A–15D. Funktionelle Effekte von D76N-KCNE1-Mutation. A) I_Ks wurde von 7,5 Sekunden dauernden Impulsen von einem Haltepotential von –80 mV bis zu Testpotentialen von –40 bis +40 mV ausgelöst. Deaktivierende Schwanzströme wurden durch Zurückkehren des Membranpotentials aus –50 mV ausgelöst. B) Isochrone Beziehung von Strom zu Spannung von I_Ks-WT (n = 14) und I_Ks-D76N (n = 14), was eine dominant-negative Unterdrückung von I_Ks durch D76N (p < 0,0001) demonstriert. C) Die Spannungsabhängigkeit der I_Ks-D76N-Aktivierung wird unter Anwendung eines 7,5 Sekunden dauernden Testimpulses um +16 mV im Vergleich zu I_Ks-WT verschoben. Glatte Kurven sind Anpassungen von normalisierten Schwanzströmen auf eine Boltzmann-Funktion (V_1/2 = 10,8 ± 0,8 mV, Steigungsfaktor = 12,1 ± 0,3 mV für I_Ks-WT; für I_Ks-D76N V_1/2 = 25,7 ± 1,0 mV [p < 0,0001, verglichen mit I_Ks-WT], Steigungsfaktor = 12,0 ± 0,2 mV; n = 14). D) I_Ks-D76N deaktiviert schneller als IKs-WT. I_Ks wurde von einem 5 Sekunden dauernden Impuls auf +20 mV aktiviert und die Schwanzströme wurden bei den angegebenen Potentialen gemessen. Die Schwanzströme wurden auf eine einzige Exponentialfunktion angepasst. Die Einfügung zeigt normalisierte deaktivierende Schwanzströme bei –50 mV nach einem Spannungsschritt von + 20 mV.
16A–16D. Funktionelle Effekte von S74L-KCNE1-Mutation. A) I_Ks-WT und I_Ks-S74L, aufgezeichnet während 7,5 Sekunden dauernden Depolarisationen auf –40, –20, 0, +20 und +40 mV. Man beachte die schnellere Geschwindigkeit des Deaktivierens von I_Ks-S74L-Schwanzströmen im Vergleich zu I_Ks-WT. B) Isochrone Beziehung von Strom zu Spannung für I_Ks-WT und I_Ks-S74L (n = 15). C) Die Spannungsabhängigkeit der I_Ks-S74L-Aktivierung wird um +19 mV im Vergleich zu I_Ks-WT verschoben. Glatte Kurven sind Ausgleiche von normalisierten Schwanzströmen auf eine Boltzmann-Funktion (V_1/2 = 13,7 ± 0,6 mV, Steigungsfaktor = 16,0 ± 0,3 mV für I_Ks-WT; für I_Ks-S74L V_1/2 = 33,6 ± 0,8 mV, Steigungsfaktor = 13,3 ± mV [beide p < 0,0001 verglichen mit I_Ks-WT]. D) I_Ks-S74L deaktiviert schneller als I_Ks-WT.
17. Physikalische Genomkarte und Exon-Organisation von KCNE1. Die zwei Cosmid-Klone, die das gesamte KCNE1-Transkript umspannen, sind gezeigt. Cosmid 1 erstreckt sich nicht bis zum Ende von Exon 3 und Cosmid 2 enthält nicht die Exons 1 und 2. Die Größen der Exons und die Abstände sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
18. Genomische Organisation der kodierenden und 5'- und 3'-untranslatierten Regionen von KCNE1. Die Positionen der Introns sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Man beachte, dass beide Introns in der 5'-untranslatierten Region liegen. Das Sternchen kennzeichnet das Stoppcodon. Die Nukleotidsequenz von 18 ist SEQ ID NO:3. Die Aminosäuresequenz von 18 ist SEQ ID NO:4.
KURZBESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
SEQ ID NO:1 ist humane KVLQT1-cDNA. SEQ ID NO:2 ist humanes KVLQT1-Protein. SEQ ID NO:3 ist humane KCNE1-cDNA. SEQ ID NO:4 ist humanes KCNE1-Protein. SEQ ID NO:5–6 sind hypothetische Nukleinsäuren, die zum Demonstrieren der Berechnung von Homologie verwendet werden. SEQ ID NO:7–8 sind Oligonukleotide, die zum Erfassen und Reparieren von humaner KVLQT1-cDNA verwendet werden (siehe Beispiel 4). SEQ ID NO:9–40 sind die Intron-Exon-Übergangsstellen von humanem KVLQT1 (Tabelle 3). SEQ ID NO:41–74 sind Primer, die zum Amplifizieren von KVLQT1-Exons verwendet werden (Tabelle 4). SEQ ID NO:75–86 sind Primer, die zum Definieren von KVLQT1-Mutationen verwendet werden (Tabelle 5). SEQ ID NO:87–92 sind Primerpaare, die zum Amplifizieren von genomischem KCNE1 verwendet werden. SEQ ID NO:93–94 sind Primer, die zum Amplifizieren von KCNE1-cNDA verwendet werden. SEQ ID NO:95–100 sind Intron-Exon-Übergangsstellen von KCNE1 (Tabelle 8).
SEQ ID NO:101–106 sind Primer zum Amplifizieren von KCNE1-Exons (Tabelle 9). SEQ ID NO:107–109 sind Fragmente von KVLQT1, die in 3 gezeigt sind. SEQ ID NO:110–112 sind Fragmente von DMSHAKE, die in 3 gezeigt sind. SEQ ID NO:113 ist ein partielles Xenopus-KVLQT1, das in 10 gezeigt ist. SEQ ID NO:114 ist ein partielles humanes KVLQT1, das in 10 gezeigt ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Ermittlung der genomischen Struktur von KCNE1 und auf molekulare Varianten dieser Gene, die die Pathogenese von LQT verursachen oder an dieser beteiligt sind, gerichtet. Es wird außerdem beschrieben, dass KVLQT1 und minK sich zusammenlagern, um kardiale I_Ks-Kaliumkanäle zu bilden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Mutationen im KCNE1-Gen und deren Verwendung bei der Diagnose von LQT. Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf Verfahren zum Screenen von Menschen nach der Gegenwart von KCNE1-Genvarianten, die LQT verursachen, gerichtet. Da LQT nun früher (d. h. bevor Symptome auftreten) und definitiver nachgewiesen werden kann, werden bei jenen Einzelpersonen, die als LQT aufweisend identifiziert wurden, bessere Behandlungsoptionen zur Verfügung stehen. Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen gerichtet, die beim Behandeln oder Verhindern von LQT von Nutzen sind.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screenen des KCNE1-Gens bereit, um Mutationen zu identifizieren. Solche Verfahren können weiterhin den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des KCNE1-Gens umfassen und können weiterhin einen Schritt zum Bereitstellen eines Satzes an Polynukleotiden beinhalten, bei denen es sich um Primer zur Amplifikation des besagten Abschnitts des KVLQT1 – oder KCNE1-Gens handelt. Das Verfahren ist entweder zur Identifizierung von Mutationen bei Verwendung in der Diagnose von LQT oder bei der Verwendung zur Prognose von LQT von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung demonstriert weiterhin, dass KCNE1 (kodierendes KCNE1, das in der Literatur auch als minK bezeichnet wird) auf Chromosom 21 auch an LQT beteiligt ist. Das minK-Protein und KVLQT1 fügen sich zusammen, um einen K⁺-Kanal zu bilden. Die vorliegende Erfindung stellt folglich Verfahren zum Screenen des KCNE1-Gens bereit, um Mutationen zu identifizieren. Solche Verfahren können weiterhin den Schritt des Amplifizierens eines Abschnitts des KCNE1-Gens umfassen und können weiterhin einen Schritt zum Bereitstellen eines Satzes an Polynukleotiden beinhalten, bei denen es sich um Primer zur Amplifikation des besagten Abschnitts des KVLQT1 – oder KCNE1-Gens handelt. Das Verfahren ist entweder zur Identifizierung von Mutationen bei Verwendung in der Diagnose von LQT oder bei der Verwendung zur Prognose von LQT von Nutzen.
Schließlich ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Screenen von Wirkstoffkandidaten gerichtet, um Wirkstoffe zu identifizieren, die zum Behandeln oder Verhindern von LQT von Nutzen sind. Das Wirkstoffscreening wird mittels Exprimierens von mutierten KCNE1-Genen in Zellen, wie Oozyten, Säugerzellen oder transgenen Tieren, und Untersuchens der Wirkung eines Wirkstoffkandiaten auf den I_Ks-Kanal durchgeführt. Die Wirkung wird mit der I_Ks-Kanal-Aktivität des Wildtyp-KCNE1-Gens verglichen.
Ein Beweis dafür, dass das KVLQT1- oder KCNE1-Gen am Verursachen von LQT beteiligt ist, wird erlangt, indem Sequenzen in DNA, die aus betroffenen Kindred-Mitgliedern extrahiert wurden, gefunden werden, die anomale KVLQT1 – oder KCNE1-Genprodukte oder anomale Spiegel der Genprodukte erzeugen. Solche LQT-Suszeptibilitätsallele werden mit der Erkrankung in großen Kindreds kosegregieren. Sie werden auch mit einer viel höheren Häufigkeit in Nicht-Kindred-Einzelpersonen mit LQT als in Einzelpersonen der Allgemeinbevölkerung vorliegen. Der Schlüssel liegt darin, Mutationen zu finden, die schwerwiegend genug sind, um eine offensichtliche Störung der normalen Funktion des Genprodukts zu bewirken. Diese Mutationen können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwerwiegendsten Formen wären Leserastermutationen oder große Deletionen, die bewirken würden, dass das Gen für ein anomales Protein oder eines, das die Proteinexpression wesentlich verändern würde, kodiert. Weniger schwerwiegende disruptive Mutationen würden kleine Deletionen innerhalb des Rasters und nicht konservative Basenpaarsubstitutionen beinhalten, die eine beträchtliche Auswirkung auf das produzierte Protein haben würden, wie Änderung zu oder von einem Cysteinrest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt oder andere Mutationen, die die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinträchtigen würden. Von stillen Mutationen oder den in konservativen Aminosäuresubstitutionen resultierenden würde im Allgemeinen nicht erwartet, dass sie die Proteinfunktion stören.
Gemäß dem Diagnose- und Prognoseverfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Veränderung des Wildtyp-KCNE1-Gens nachgewiesen. Darüber hinaus kann das Verfahren mittels Nachweisens des Wildtyp-KCNE1-Gens und Bestätigen der Abwesenheit einer LQT-Ursache als Folge dieses Locus durchgeführt werden. "Veränderung eines Wildtyp-Gens" umfasst alle Formen von Mutationen, einschließlich Deletionen, Insertionen und Punktmutationen in den kodierenden und nichtkodierenden Regionen. Deletionen können Deletionen des gesamten Gens oder nur eines Abschnitts des Gens sein. Punktmutationen können in Stoppcodons, Leserastermutationen oder Aminosäuresubstitutionen resultieren. Somatische Mutationen sind diejenigen, die nur in bestimmten Geweben auftreten und nicht über die Keimbahn weitevererbt werden. Keimbahnmutationen können in einem beliebigen der Gewebe eines Körpers vorgefunden werden und sind vererbt. Punktmutationsereignisse können in Regulationsregionen, wie im Promotor des Gens, auftreten, was zum Verlust oder zur Abnahme der Expression der mRNA führt. Punktmutationen können auch die korrekte RNA-Prozessierung aufheben, was zum Verlust der Expression des KVLQT1- oder KCNE1-Genprodukts oder zu einer Verminderung der mRNA-Stabilität oder Translationseffizienz führt.
Geeignete Diagnosetechniken beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrang-Konformationsanalyse (single-stranded conformation analysis, SSCA), RNAse-Schutzassay, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP, wie im Folgenden weiter ausführlich erörtert. Ebenfalls geeignet ist die jüngst entwickelte Technik der DNA-Mikrochip-Technologie.
Die Gegenwart von LQT kann ermittelt werden, indem ein beliebiges Gewebe eines Menschen auf Mutationen des KCNE1-Gens geprüft wird. Zum Beispiel wäre eine Person, die eine Keimbahn-KVLQT1- oder -KCNE1-Mutation geerbt hat, dafür anfällig, LQT zu entwickeln. Dies kann mittels Prüfens von DNA aus einem beliebigen Gewebe des Körpers der Person bestimmt werden. Am einfachsten kann Blut abgenommen und DNA aus den Zellen des Bluts extrahiert werden. Darüber hinaus kann eine pränatale Diagnose durchgeführt werden, indem Fötuszellen, Plazentazellen oder Amnionzellen auf Mutationen des KCNE1-Gens geprüft werden. Eine Veränderung eines Wildtyp-KCNE1-Allels, ob beispielsweise mittels Punktmutation oder Deletion, kann mit einem beliebigen der hierin erläuterten Mittel nachgewiesen werden.
Es gibt mehrere Verfahren, die zum Nachweisen einer DNA-Sequenzvariation verwendet werden können. Direkte DNA-Sequenzierung, entweder manuelle Sequenzierung oder automatisierte Fluoreszenzsequenzierung können eine Sequenzvariation nachweisen. Ein anderer Ansatz ist der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Assay (single stranded conformation polymorphism, SSCP) (Orita et al., 1989). Dieses Verfahren weist nicht alle Sequenzveränderungen nach, insbesondere wenn die DNA-Fragmentgröße größer als 200 bp ist, kann jedoch zum Nachweisen der meisten DNA-Sequenzvariationen optimiert werden. Die verminderte Nachweisempfindlichkeit ist ein Nachteil, der mit SSCP mögliche erhöhte Durchsatz macht es jedoch auf Forschungsebene zu einer reizvollen, durchführbaren Alternative zur direkten Sequenzierung zum Mutationsnachweis. Die Fragmente, die auf SSCP-Gelen eine verschobene Mobilität aufweisen, werden dann sequenziert, um die exakte Beschaffenheit der DNA-Sequenzvariation zu ermitteln. Zu weiteren Ansätzen, die auf dem Nachweis von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNA-Strängen basieren, zählen Clamped Denaturing Gelelectrophoresis (CDGE) (Sheffield et al., 1991), Heteroduplexanalyse (HA) (White et al., 1992) und chemische Spaltung von Fehlpaarungen (chemical mismatch cleavage, CMC) (Grompe et al., 1989). Keines der oben beschriebenen Verfahren wird große Deletionen, Duplikationen oder Insertionen nachweisen, noch werden sie eine Regulationsmutation nachweisen, die die Transkription oder Translation des Proteins beeinträchtigt. Andere Verfahren, die diese Klassen von Mutationen nachweisen könnten, wie ein Proteinverkürzungsassay oder der asymmetrische Assay, weisen nur spezifische Arten von Mutationen nach und würden Missense-Mutationen nicht nachweisen. Ein Überblick über gegenwärtig verfügbare Verfahren zum Nachweisen einer DNA-Sequenzvariation lässt sich in einer neueren Abhandlung von Grompe (1993) finden. Sobald eine Mutation bekannt ist, kann ein allelspezifischer Nachweisansatz, wie allelspezifische Oligonukleotidhybridisierung (ASO-Hybridisierung) eingesetzt werden, um hohe Anzahlen anderer Proben schnell nach derselben Mutation zu screenen. Eine solche Technik kann Sonden einsetzen, die mit Goldnanoteilchen markiert sind, um ein sichtbares Farbergebnis zu erzielen (Elghanian et al., 1997).
Eine schnelle Voranalyse zum Nachweisen von Polymorphismen in DNA-Sequenzen kann durchgeführt werden, indem eine Reihe von Southern-Blots von DNA, die mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, vorzugsweise mit einer hohen Anzahl von Restriktionsenzymen exzisiert wurde, zu betrachten. Jeder Blot beinhaltet eine Reihe von normalen Einzelpersonen und eine Reihe von LQT-Fällen. Southern-Blots, die hybridisierende Fragmente (die sich in Bezug auf die Länge von Kontroll-DNA unterscheiden, wenn sie mit Sequenzen in der Nähe oder einschließlich des KVLQT1-Locus sondiert werden) anzeigen, deuten auf eine mögliche Mutation hin. Wenn Restriktionsenzyme, die sehr große Restriktionsfragmente produzieren, verwendet werden, wird Puls-Feld-Gelelektrophorese (PFGE) eingesetzt.
Der Nachweis von Punktmutationen kann mittels molekularen Klonierens der KCNE1-Allele und Sequenzierens der Allele unter Anwendung von in der Technik wohl bekannter Techniken erzielt werden. Zudem können das Gen oder Abschnitte des Gens amplifiziert werden, z. B. mittels PCR oder einer anderen Amplifikationstechnik, und das amplifizierte Gen oder die amplifizierten Abschnitte des Gens kann bzw. können sequenziert werden.
Es gibt sechs wohl bekannte Verfahren für einen vollständigeren, dennoch indirekten Test zum Bestätigen der Gegenwart eines Suszeptibilitätsallels: 1) Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCP) (Orita et al., 1989); 2) denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) RNAse-Schutzassays (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) allelspezifische Oligonukleotide (ASOs) (Conner et al., 1983); 5) die Verwendung von Proteinen, die Nukleotidfehlpaarungen erkennen, wie das mutS-Protein von E. coli (Modrich, 1991); und 6) allelspezifische PCR (Ruano und Kidd, 1989). Bei allelspezifischer PCR werden Primer verwendet, die an ihren 3'-Enden an eine bestimmte KCNE1-Mutation hybridisieren. Wenn die bestimmte Mutation nicht vorliegt, wird kein Amplifikationsprodukt beobachtet. Das Amplification Refractory Mutation System (ARMS) kann gleichfalls verwendet werden, wie in der europäischen Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 0332435 und in Newton et al., 1989, offenbart. Insertionen und Deletionen von Genen können auch mittels Klonierung, Sequenzierung und Amplifikation nachgewiesen werden. Darüber hinaus können Restriktionsfragmentlängenpolymorphismussonden (RFLP-Sonden) für das Gen oder umliegende Markergene zum Beurteilen der Veränderung eines Allels oder einer Insertion in einem polymorphen Fragment verwendet werden. Ein solches Verfahren ist insbesondere zum Screenen von Verwandten einer betroffenen Einzelperson nach der Gegenwart der in dieser Einzelperson gefundenen Mutation von Nutzen. Andere Techniken zum Nachweisen von Insertionen und Deletionen, wie sie in der Technik bekannt sind, können verwendet werden.
In den ersten drei Verfahren (SSCP, DGGE und RNAse-Schutzassay) tritt eine neue Elektrophoresebande auf. SSCP weist eine Bande nach, die differentiell migriert, da die Sequenzveränderung eine Differenz bei der intramolekularen Einzelstrang-Basenpaarung bewirkt. RNAse-Schutz beinhaltet die Spaltung des mutierten Polynukleotids in zwei oder mehr kleinere Fragmente. DGGE weist unter Verwendung eines denaturierenden Gradientengels Unterschiede bei den Migrationsgeschwindigkeiten von mutierten Sequenzen im Vergleich zu Wildtyp-Sequenzen nach. In einem allelspezifischen Oligonukleotid-Assay wird ein Oligonukleotid entworfen, das eine spezifische Sequenz nachweist, und der Assay wird mittels Nachweisens der Gegenwart oder Abwesenheit eines Hybridisierungssignals durchgeführt. Im mutS-Assay bindet das Protein nur an Sequenzen, die eine Nukleotidfehlpaarung in einem Heteroduplex zwischen mutierter und Wildtyp-Sequenz enthalten.
Fehlpaarungen sind gemäß der vorliegenden Erfindung hybridisierte Nukleinsäureduplexe, bei denen die zwei Stränge nicht zu 100% komplementär sind. Ein Fehlen vollständiger Homologie kann in Deletionen, Insertionen, Inversionen und Substitutionen begründet liegen. Der Fehlpaarungsnachweis kann zum Nachweisen von Punktmutationen in dem Gen oder in dessen mRNA-Produkt verwendet werden. Obwohl diese Techniken weniger empfindlich als Sequenzierung sind, sind sie an einer hohen Anzahl von Proben einfacher durchzuführen. Ein Beispiel einer Fehlpaarungsspaltungstechnik ist das RNAse-Schutzverfahren. Bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Verfahren die Verwendung einer markierten Ribosonde, die zu der kodierenden Sequenz des humanen Wildtyp-KCNE1-Gens komplementär ist. Die Ribosonde und entweder mRNA oder DNA, die aus der Person isoliert wurde, werden aneinander angelagert (hybridisiert) und anschließend mit dem Enzym RNAse A verdaut, das einige Fehlpaarungen in einer RNA-Duplex-Struktur nachweisen kann. Wenn von RNAse A eine Fehlpaarung nachgewiesen wird, spaltet sie an der Stelle der Fehlpaarung. Wenn das aneinandergelagerte RNA-Präparat auf einer Elektrophoresegelmatrix aufgetrennt wird, und wenn eine Fehlpaarung nachgewiesen und von RNAse A gespalten wurde, wird ein RNA-Produkt zu sehen sein, das kleiner als der vollständige RNA-Duplex für die Ribosonde und die mRNA oder DNA ist. Die Ribosonde muss nicht die vollständige Länge der mRNA oder des Gens haben, sondern kann ein Segment eines der beiden sein. Wenn die Ribosonde nur ein Segment der mRNA oder des Gens umfasst, is es wünschenswert, eine Reihe dieser Sonden zu verwenden, um die ganze mRNA-Sequenz nach Fehlpaarungen zu screenen.
In ähnlicher Weise können DNA-Sonden dazu verwendet werden, Fehlpaarungen mittels enzymatischer oder chemischer Spaltung nachzuweisen. Siehe z. B. Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativ können Fehlpaarungen über Verschiebungen der elektrophoretischen Mobilität von fehlgepaarten Duplexen im Verhältnis zu übereinstimmenden Duplexen nachgewiesen werden. Siehe z. B. Cariello, 1988. Die zelluläre mRNA oder DNA, die eine Mutation enthalten könnte, kann entweder mit Ribosonden oder DNA-Sonden unter Anwendung von PCR (siehe im Folgenden) vor der Hybridisierung amplifiziert werden. Veränderungen der DNA des KCNE1 -Gens können ebenfalls unter Anwendung von Southern-Hybridisierung nachgewiesen werden, insbesondere wenn die Veränderungen Bruttoumordnungen sind, wie Deletionen und Insertionen.
DNA-Sequenzen des KCNE1-Gens, die mittels Anwendung von PCR amplifiziert wurden, können auch unter Verwendung von allelspezifischen Sonden gescreent werden. Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere, von denen jedes eine Region der Gensequenz aufweist, die eine bekannte Mutation beherbergt. Zum Beispiel kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotide lang sein, was einem Abschnitt der Gensequenz entspricht. Durch Verwendung einer Gruppe solcher allelspezifischer Sonden können die PCR-Amplifikationsprodukte gescreent werden, um die Gegenwart einer zuvor identifizierten Mutation im Gen zu identifizieren. Die Hybridisierung allelspezifischer Sonden mit amplifizierten KCNE1-Sequenzen kann zum Beispiel auf einem Nylonfilter durchgeführt werden. Die Hybridisierung einer bestimmten Sonde unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen zeigt die Gegenwart derselben Mutation in dem Gewebe wie in der allelspezifischen Sonde an.
Die neu entwickelte Nukleinsäureanalysetechnik mittels Mikrochiptechnologie ist ebenfalls auf die vorliegende Erfindung anwendbar. Bei dieser Technik werden im wahrsten Sinne des Wortes Tausende unterschiedlicher Oligonukleotidsonden in einem Array auf einem Siliziumchip aufgebaut. Zu analysierende Nukleinsäure wird fluoreszenzmarkiert und an die Sonden auf dem Chip hybridisiert. Es ist auch möglich, Interaktionen zwischen Nukleinsäure und Protein unter Verwendung dieser Nukleinsäure-Mikrochips zu untersuchen. Unter Anwendung dieser Technik kann die Gegenwart von Mutationen oder sogar der Sequenz der analysierten Nukleinsäure bestimmt werden oder es können die Expressionsniveaus eines Gens von Interesse gemessen werden. Das Verfahren ist ein Verfahren der Parallelverarbeitung vieler, sogar Tausender Sonden auf einmal und kann die Analysegeschwindigkeit enorm erhöhen. Mehrere Dokumente wurden veröffentlicht, die diese Technik anwenden. Einige dieser sind Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Chee et al., 1996; Lockhart et al., 1996; DeRisi et al., 1996; Lipshutz et al., 1995. Dieses Verfahren wurde bereits zum Screenen von Menschen nach Mutationen in dem Brustkrebsgen BRCA1 verwendet (Hacia et al., 1996). Diese neue Technologie wurde in einer Nachrichtenmeldung in Chemical and Engineering News (Borman, 1996) besprochen und war das Thema eines Leitartikels (Editorial, Nature Genetics, 1996). Siehe auch Fodor (1997).
Der maßgeblichste Test auf Mutationen in einem Kandidatenlocus besteht darin, KCNE1-Genomsequenzen von Patienten mit denen von einer Kontrollpopulation direkt zu vergleichen. Alternativ könnte Messenger-RNA nach der Amplifikation sequenziert werden, z. B. mittels PCR, wodurch das Erfordernis des Bestimmens der Exonstruktur des Kandidatengens ausgemerzt wird.
Mutationen von Patienten, die außerhalb der kodierenden Region von KCNE1 fallen, können mittels Untersuchens der nichtkodierenden Regionen, wie Introns und Regulationssequenzen in der Nähe oder innerhalb der Gene, nachgewiesen werden. Ein früher Hinweis darauf, dass Mutationen in nichtkodierenden Regionen wichtig sind, kann von Northern-Blot-Experimenten kommen, die Messenger-RNA-Moleküle von anomaler Größe oder Abundanz in Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen offenbaren.
Eine Veränderung der KCNE1-mRNA-Expression kann mittels beliebiger, in der Technik bekannter Techniken nachgewiesen werden. Zu diesen zählen Northern-Blot- Analyse, PCR-Amplifikation und RNAse-Schutz. Eine verminderte mRNA-Expression weist auf eine Veränderung des Wildtyp-Gens hin. Eine Veränderung von Wildtyp-Genen kann ebenfalls nachgewiesen werden, indem nach einer Veränderung des Wildtyp-KCNE1-Proteins gescreent wird. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die mit KCNE1 eine Immunreaktion zeigen, zum Screenen eines Gewebes verwendet werden. Das Fehlen eines zugehörigen Antigens würde auf eine Mutation hinweisen. Antikörper, die für Produkte von mutierten Allelen spezifisch sind, könnten ebenfalls zum Nachweisen eines mutierten Genprodukts verwendet werden. Solche immunologischen Assays können in einem beliebigen zweckmäßigen, in der Technik bekannten Format vorgenommen werden. Zu diesen zählen Western-Blots, immunhistochemische Assays und ELISA-Assays. Jedes Mittel zum Nachweis eines veränderten KCNE1-Proteins kann verwendet werden, um eine Veränderung des Wildtyp-KCNE1-Gens nachzuweisen. Funktionelle Assays, wie Proteinbindungsbestimmungen, können verwendet werden. Darüber hinaus können Assays verwendet werden, die die biochemische Funktion von KCNE1 nachweisen. Das Auffinden eines mutierten KCNE1-Genprodukts weist auf eine Veränderung eines Wildtyp-KCNE1-Gens hin.
Ein mutiertes KCNE1-Gen oder -Genprodukt kann auch in anderen Proben aus dem menschlichen Körper nachgewiesen werden, wie Serum, Fäzes, Urin und Sputum. Die gleichen Techniken, die oben zum Nachweis von mutierten Genen oder Genprodukten in Geweben erörtert wurden, können auf andere Körperproben angewendet werden. Durch Screenen solcher Körperproben kann eine einfache Frühdiagnose auf LQT erzielt werden.
Die Primerpaare der vorliegenden Erfindung sind zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines bestimmten KCNE1-Allels unter Anwendung von PCR von Nutzen. Die Paare einzelsträngiger DNA-Primer für KCNE1 können an Sequenzen in oder um das KCNE1-Gen herum auf Chromosom 21 angelagert werden, um die Synthese der amplifizierenden DNA des Gens selbst zu bestimmen. Ein kompletter Satz dieser Primer ermöglicht eine Synthese aller Nukleotide der genkodierenden Sequenzen, d. h. der Exons. Der Satz an Primern ermöglicht vorzugsweise die Synthese von sowohl Intron- als auch Exonsequenzen. Allelspezifische Primer können ebenfalls verwendet werden. Solche Primer lagern sich nur an bestimmte mutierte KCNE1-Allele an und werden folglich nur in Gegenwart des mutierten Allels als Matrize ein Produkt 1 amplifizieren.
Um die anschließende Klonierung amplifizierter Sequenzen zu erleichtern, können die Primer Sequenzen für Restriktionsenzymschnittstellen aufweisen, die an ihren 5'-Enden angehängt sind. Folglich werden alle Nukleotide der Primer von der KCNE1-Sequenz oder den Sequenzen, die an KCNE1 angrenzen, abgeleitet, mit Ausnahme der wenigen Nukleotide, die zum Bilden einer Restriktionsenzymschnittstelle erforderlich sind. Solche Enzyme und Schnittstellen sind in der Technik wohl bekannt. Die Primer selbst können unter Anwendung von Techniken, die in der Technik wohl bekannt sind, synthetisiert werden. Im Allgemeinen können die Primer unter Verwendung von Oligonukleotidsynthesemaschinen hergestellt werden, die im Handel erhältlich sind. Wenn die Sequenz von KCNE1 vorgegeben ist, liegt das Design bestimmter Primer sehrwohl innerhalb des Bereichs der Fachkenntnis. Die vorliegende Erfindung erweitert diese, indem sie Daten an den Intron-Exon-Übergangsstellen präsentiert, wodurch ermöglicht wird, Primer zu entwerfen, um alle Exonregionen komplett zu amplifizieren und zu sequenzieren.
Die Nukleinsäuresonden, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, sind für eine Reihe von Zwecken nützlich. Sie können bei der Southern-Hybridisierung an genomische DNA und beim RNAse-Schutzverfahren zum Nachweisen von Punktmutationen verwendet werden, die bereits oben erörtert wurden. Die Sonden können zum Nachweisen von PCR-Amplifikationsprodukten verwendet werden. Sie können auch zum Nachweisen von Fehlpaarungen mit dem KCNE1-Gen oder -mRNA unter Anwendung anderer Techniken verwendet werden.
Es wurde entdeckt, dass Einzelpersonen mit dem Wildtyp-KVLQT1-Gen oder dem Wildtyp-KCNE1-Gen kein LQT aufweisen. Mutationen, die die Funktion des KVLQT1- oder KCNE1-Genprodukts stören, sind jedoch an der Pathogenese von LQT beteiligt. Folglich verursacht die Gegenwart eines veränderten (oder eines mutierten) KVLQT1 – oder KCNE1 -Gens, das ein Protein produziert, das einen Funktionsverlust oder eine veränderte Funktion aufweist, direkt LQT, das das Risiko von Herzrhythmusstörungen erhöht. Um eine KCNE1-Gen-Mutation nachzuweisen, wird eine biologische Probe präpariert und auf einen Unterschied zwischen der Sequenz des analysierten Allels und der Sequenz des Wildtyp-Allels analysiert. Mutierte KCNE1-Allele können zunächst mittels einer beliebigen der oben beschriebenen Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation des bestimmten mutierten Allels zu identifizieren. Alternativ können mutierte KCNE1-Allele zunächst mittels Identifizierens mutierter (veränderter) Proteine unter Anwendung herkömmlicher Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation für jedes Allel zu identifizieren. Die Mutationen, insbesondere diejenigen, die zu einer veränderten Funktion des Proteins führen, werden dann für die Diagnose- und Prognoseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Es wurde ebenfalls entdeckt, dass das KVLQT1-Protein sich mit dem minK-Protein zusammenfügt. Folglich sind Mutationen in KCNE1 (das minK kodiert), die die Funktion des KCNE1-Genprodukts stören, an der Pathogenese von LQT beteiligt. Folglich verursacht die Gegenwart eines veränderten (oder eines mutierten) KCNE1 -Gens, das ein Protein produziert, das einen Funktionsverlust oder eine veränderte Funktion aufweist, direkt LQT, das das Risiko von Herzrhythmusstörungen erhöht. Um eine KCNE1-Gen-Mutation nachzuweisen, wird eine biologische Probe präpariert und auf einen Unterschied zwischen der Sequenz des analysierten Allels und der Sequenz des Wildtyp-Allels analysiert. Mutierte KCNE1-Allele können zunächst mittels einer beliebigen der oben beschriebenen Techniken identifiziert werden. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation der bestimmten mutierten (veränderten) Proteine zu identifizieren. Die mutierten Allele werden dann sequenziert, um die spezifische Mutation für jedes Allel zu identifizieren. Die Mutationen, insbesondere diejenigen, die zu einer veränderten Funktion des Proteins führen, werden dann für die Diagnose- und Prognoseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
Definitionen
Die vorliegende Erfindung verwendet die folgenden Definitionen:
Die "Amplifikation von Polynukleotiden" setzt Verfahren wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligationsamplifikation (oder Ligase-Kettenreaktion, LCR) und Amplifikationsverfahren, die auf der Verwendung von Q-beta-Replicase basieren, ein. Ebenfalls geeignet sind Strangverdrängungsamplifikation (strand displacement amplification, SDA), thermophile SDA und auf Nukleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (3SR oder NASBA). Diese Verfahren sind wohl bekannt und werden in der Technik weitgehend ausgeübt. Siehe z. B. die US-Patentschriften 4,683,195 und 4,683,202 und Innis et al., 1990 (für PCR); Wu und Wallace, 1989 (für LCR); die US-Patentschriften 5,270,184 und 5,455,166 und Walker et al., 1992 (für SDA); Spargo et al., 1996 (für thermophile SDA) und die US-Patentschrift 5,409,818, Fahy et al., 1991, und Compton, 1991, für 3SR und NASBA. Reagenzien und Hardware zum Durchführen von PCR sind im Handel erhältlich. Primer, die zum Amplifizieren von Sequenzen aus der KCNE1-Region geeignet sind, sind vorzugsweise zu Sequenzen in der KCNE1-Region oder in Regionen, die eine Zielregion darin flankieren, komplementär und hybridisieren spezifisch an diese Sequenzen. KCNE1-Sequenzen, die mittels Amplifikation erzeugt werden, können direkt sequenziert werden. Alternativ, jedoch weniger wünschenswert kann bzw. können die amplifizierte Sequenz bzw. die amplifizierten Sequenzen vor der Sequenzanalyse kloniert werden. Ein Verfahren zum direkten Klonierung und zur Sequenzanalyse von enzymatisch amplifizierten genomischen Segmenten wurde von Scharf et al., 1986, beschrieben.
"Analytpolynukleotid" und "Analytstrang" beziehen sich auf ein einzel- oder doppelsträngiges Polynukleotid, von dem vermutet wird, dass es eine Zielsequenz enthält, und das in einer Vielfalt von Arten von Proben vorliegen kann, einschließlich biologischer Proben.
"Antikörper". Die vorliegende Erfindung stellt auch polyklonale und/oder monoklonale Antikörper und Fragmente davon und immunologische Bindungsäquivalente davon bereit, die spezifisch an das KCNE1-Polypeptid und Fragmente davon oder an Polynukleotidsequenzen aus der KCNE1-Region binden können. Der Ausdruck "Antikörper" wird verwendet, um sich sowohl auf eine homogene Moleküleinheit oder ein Gemisch, wie ein Serumprodukt, das sich aus mehreren unterschiedlichen Moleküleinheiten zusammensetzt, zu beziehen. Polypeptide können synthetisch in einem Peptidsyntheseapparat hergestellt und an ein Trägermolekül (z. B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin) gekoppelt und über mehrere Monate in Kaninchen injiziert. Kaninchenseren werden auf Immunoreaktivität gegenüber dem KCNE1-Polypeptid oder -Fragment geprüft. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden, indem Mäusen die Proteinpolypeptide, Fusionsproteine oder Fragmente davon injiziert werden. Monoklonale Antikörper werden mittels ELISA gescreent und auf spezifische Immunoreaktivität mit KCNE1-Polypeptid oder Fragmenten davon geprüft. Siehe Harlow und Lane, 1988. Diese Antikörper werden in Assays als auch Pharmazeutika von Nutzen sein.
Sobald eine ausreichende Quantität des gewünschten Polypeptids erhalten wurde, kann sie für verschiedene Zwecke genutzt werden. Eine typische Verwendung ist die Produktion von Antikörpern, die für die Bindung spezifisch sind. Diese Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und können mittels in der Technik wohl bekannter In-vitro- oder In-vivo-Techniken produziert werden. Zur Produktion polyklonaler Antikörper wird ein adäquates Zielimmunsystem, in der Regel Maus oder Kaninchen, gewählt. Im Wesentlichen gereinigtes Antigen wird dem Immunsystem in einer Art und Weise dargeboten, die von Verfahren, die für das Tier und adäquat sind, und von anderen Parametern, die Immunologen wohl bekannt sind, bestimmt wird. Typische Stellen zur Injektion sind in Fußballen, intramuskulär, intraperitoneal oder intradermal. Selbstverständlich können Maus oder Kaninchen durch andere Spezies ersetzt werden. Polyklonale Antikörper werden dann unter Anwendung in der Technik bekannter Techniken gereinigt, auf die gewünschte Spezifität eingestellt.
Eine immunologische Antwort wird für gewöhnlich mit einem Immunassay untersucht. Normalerweise beinhalten solche Immunassays eine gewisse Reinigung einer Antigenquelle, beispielsweise eine die von denselben Zellen und in derselben Art und Weise wie das Antigen produziert wurde. Eine Vielfalt von Immunassayverfahren ist in der Technik wohl bekannt. Siehe z. B. Harlow und Lane, 1988, oder Goding, 1986.
Monoklonale Antikörper mit Affinitäten von 10^–8 M^–1 oder vorzugsweise 10^–9 bis 10^–10 M^–1 oder höher werden in der Regel mittels Standardvorgehensweisen hergestellt, wie z. B. in Harlow und Lane, 1988, oder Goding, 1986, beschrieben. Kurz gesagt, adäquate Tiere werden gewählt und das gewünschte Immunisierungsprotokoll befolgt. Nach einem adäquaten Zeitraum werden die Milzen solcher Tiere exzisiert und einzelne Milzzellen in der Regel zu immortalisierten Myelomzellen unter adäquaten Selektionsbedingungen fusioniert. Danach werden die Zellen klonal getrennt und die Überstände jedes Klons auf ihre Produktion eines adäquaten Antikörpers, der für die gewünschte Region des Produktion eines geeigneten Antikörpers hin getested, der für die gewünschte Region des Antigens spezifisch ist.
Zu anderen geeigneten Techniken zählen die In-vitro-Aussetzung von Lymphozyten gegenüber den antigenische Polypeptiden oder alternativ gegenüber der Auswahl von Bibliotheken von Antikörpern in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse et al., 1989. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden Polypeptide und Antikörper mittels Bindung, entweder kovalent oder nichtkovalent, einer Substanz, die für ein nachweisbares Signal sorgt, markiert. Eine große Vielfalt von Markern und Konjugationstechniken ist bekannt und wird in sowohl der wissenschaftlichen als auch der Patentliteratur umfassend dargelegt. Zu geeigneten Markern zählen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Agentien, chemilumineszierende Agentien, magnetische Teilchen und dergleichen. Zu Patenten, die die Verwendung solcher Marker lehren, zählen die US-Patentschriften 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Es können auch rekombinante Immunglobuline produziert werden (siehe US-Patentschrift 4,816,567).
"Bindungspartner" bezieht sich auf ein Molekül, das ein Ligandenmolekül mit hoher Spezifität binden kann, wie beispielsweise ein Antigen und einen antigenspezifischen Antikörper oder ein Enzym und dessen Inhibitor. Im Allgemeinen müssen die spezifischen Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um den Duplex aus Analytenkopie/komplementärem Strang (im Fall von Polynukleotidhybridisierung) unter den Isolierungsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind in der Technik bekannt und beinhalten beispielsweise Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor/Ligand-Paare und komplementäre Polynukleotidstränge. Im Fall von komplementären Polynukleotid-Bindungspartnern sind die Partner normalerweise mindestens etwa 15 Basen lang und können mindestens 40 Basen lang sein. Es wird von Fachmännern gut erkannt werden, dass Längen von weniger als 15 (z. B. 8 Basen), zwischen 15 und 40 und mehr als 40 Basen ebenfalls angewendet werden können. Die Polynukleotide können aus DNA, RNA oder synthetischen Nukleotidanaloga bestehen. Weitere Bindungspartner können unter Anwendung z. B. des Yeast Two-hybrid-Screeningassays, wie hierin beschrieben, identifiziert werden.
Eine "biologische Probe" bezieht sich auf eine Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, von der vermutet wird, dass sie ein Analytpolynukleotid oder -polypeptid enthält, von einer Einzelperson, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, z. B. Plasma, Serum, Rückenmarkflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, der äußeren Sektionen der Haut, der Atemwege, des Darmtrakts und des Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Blutzellen, Tumoren, Organen, Gewebe und Proben von In-vitro-Zellkulturbestandteilen.
"Kodieren". Von einem Polynukleotid wird gesagt, dass es ein Polypeptid "kodiert", wenn es in seinem nativen Zustand oder bei Manipulation mittels Fachmännern wohl bekannten Verfahren transkribiert und/oder translatiert werden kann, um die mRNA für das Polypeptid und/oder das Polypeptid oder ein Fragment davon zu produzieren. Der Antisense-Strang ist das Komplement einer solchen Nukleinsäure und die kodierende Sequenz kann von dieser abgeleitet werden.
"Isoliert" oder "im Wesentlichen rein". Eine "isolierte" oder "im Wesentlichen reine" Nukleinsäure (z. B. eine RNA, eine DNA oder ein Mischpolymer) ist eine Nukleinsäure, die im Wesentlichen von anderen Zellbestandteilen getrennt wurde, die naturgemäß eine native humane Sequenz oder ein natives humanes Protein begleiten, z. B. Ribosome, Polymerasen, viele andere humane Genomsequenzen und Proteine. Der Ausdruck umfasst eine Nukleinsäuresequenz oder ein Protein, die bzw. das aus deren bzw. dessen natürlich vorkommenden Umgebung entfernt wurde, und beinhaltet rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder Analoga, die von heterologen Systemen biologisch synthetisiert wurden.
"KCNE1-Allel" bezieht sich auf normale Allele des KCNE1-Locus sowie Allels von KCNE1, die Variationen tragen, die LQT verursachen.
"KCNE1-Locus", "KCNE1-Gen", "KCNE1-Nukleinsäuren" oder "KCNE1-Polynukleotid" beziehen sich jeweils auf Polynukleotide, die sich alle in der KCNE1-Region befinden, die wahrscheinlich in normalem Gewebe exprimiert werden, bestimmte Allele, die in LQT resultieren. Der KCNE1-Locus soll kodierende Sequenzen, dazwischen liegende Sequenzen und regulatorische Elemente, die die Transkription und/oder Translation kontrollieren. Der KCNE1-Locus soll alle allelischen Variationen der DNA-Sequenz beinhalten. Die Ausdrücke "KCNE1" und "minK" können austauschbar verwendet werden.
Diese Ausdrücke, wenn sie auf eine Nukleinsäure angewendet werden, beziehen sich auf eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid, ein Fragment, ein Homologes oder eine Variante von humanem KCNE1 kodiert, einschließlich z. B. Proteinfusionen oder -deletionen. Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung werden über eine Sequenz verfügen, die entweder von einem natürlichen, KCNE1 kodierenden Gen oder einem Gen mit wesentlicher Homologie mit einem natürlichen, KCNE1 kodierenden Gen oder einem Abschnitt davon abgeleitet ist oder diesem im Wesentlichen ähnlich ist.
Das KCNE1-Gen oder die KCNE1-Nukleinsäure beinhaltet normale Allele des KCNE1-Gens, einschließlich stiller Allele mit keiner Auswirkung auf die Aminosäuresequenz des KCNE1-Polypeptids sowie Allele, die zu Aminosäuresequenzvarianten des KCNE1-Polypeptids führen, die sich nicht erheblich auf dessen Funktion auswirken. Diese Ausdrücke beinhalten auch Allele mit einer oder mehreren Mutationen, die die Funktion des KCNE1-Polypeptids beeinträchtigen. Eine Mutation kann eine Veränderung der KCNE1-Nukleinsäuresequenz sein, die eine schädigende Veränderung der Aminosäuresequenz des KCNE1-Polypeptids hervorruft, was in einem teilweisen oder vollständigen Verlust der KCNE1-Funktion resultiert, oder kann eine Veränderung der Nukleinsäuresequenz sein, die im Verlust der effektiven KCNE1-Expression oder der Produktion von abweichenden Formen des KCNE1-Polypeptids resultiert.
Die KCNE1-Nukleinsäure kann die in SEQ ID NO:3 gezeigte sein oder sie kann ein wie oben beschriebenes Allel oder eine Variante oder ein Derivat sein, das bzw. die sich von der gezeigten um eine Veränderung unterscheidet, bei der es sich um eine Addition, Insertion, Deletion und/oder Substitution einer oder mehrerer Nukleotide der gezeigten Sequenz handelt. Veränderungen an der Nukleotidsequenz können in einer Aminosäurenveränderung auf Proteinebene resultieren oder auch nicht, wie durch den genetischen Kode bestimmt.
Folglich kann eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eine Sequenz beinhalten, die sich von der in SEQ ID NO:3 gezeigten unterscheidet, aber dennoch ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO:4 (KCNE1) gezeigt, kodiert. Das heißt, Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung beinhalten Sequenzen, die als Folge des genetischen Kodes degenerieren. Andererseits kann das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich um einen oder mehrere Aminosäurereste von der in SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz unterscheidet. Eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid kodiert und bei der es sich um eine Aminosäuresequenzvariante, ein Aminosäuresequenzderivat oder -allel der in SEQ ID NO:4 gezeigten Aminosäuresequenz handelt, wird ebenfalls von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Das KCNE1-Gen bezieht sich außerdem auf (a) eine beliebige DNA-Sequenz, die (i) unter hochstringenten Bedingungen an das Komplement der DNA-Sequenzen hybridisiert, die die in SEQ ID NO:4 dargelegte Aminosäuresequenz kodieren (Ausubel et al., 1992), und (ii) ein Genprodukt kodiert, das funktionell zu KCNE1 äquivalent ist, oder (b) eine beliebige DNA-Sequenz, die (i) unter weniger stringenten Bedingungen an das Komplement der DNA-Sequenzen hybridisiert, die die in SEQ ID NO:4 dargelegte Aminosäuresequenz kodieren (Ausubel et al., 1992), und (ii) ein Genprodukt kodiert, das funktionell zu KCNE1 äquivalent ist. Die Erfindung beinhaltet außerdem Nukleinsäuremoleküle, die die Komplemente der hierin beschriebenen Sequenzen sind.
Die Polynukleotidzusammensetzungen dieser Erfindung beinhalten RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, sowohl Sense- als auch Antisense-Stränge, und können chemisch oder biochemisch modifiziert werden oder können nicht natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten, wie Fachmänner leicht zu schätzen wissen werden. Zu solchen Modifikationen zählen beispielsweise Marker, Methylierung, Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nukleotide durch ein Analogon, Internukleotidmodifikationen wie ungeladene Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate usw.), geladene Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate usw.), überstehende Teile (z. B. Polypeptide), Interkalatoren (z. B. Acridin, Psoralen usw.), Chelatbildner, Alkylatoren und modifizierte Verknüpfungen (z. B. alpha-anomerische Nukleinsäuren usw.). Ebenfalls beinhaltet sind synthetische Moleküle, die Polynukleotide in ihrer Fähigkeit nachahmen, an eine designierte Sequenz mittels Wasserstoffbrückenbindung oder anderer chemischer Wechselwirkungen zu binden. Solche Moleküle sind in der Technik bekannt und beinhalten beispielsweise jene, in denen Peptidverknüpfungen Phosphatverknüpfungen in der Hauptkette des Moleküls ersetzen.
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäuren bereit, die die gesamte oder einen Teil der KCNE1-Region umfassen. Das rekombinante Konstrukt kann sich autonom in einer Wirtszelle replizieren. Alternativ kann das rekombinante Konstrukt in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert werden. Ein solches rekombinantes Polynukleotid umfasst ein Polynukleotid genomischen, cDNA-, halbsynthetischen oder synthetischen Ursprungs, das dank seines Ursprungs oder dank Manipulation 1) nicht mit dem gesamten oder einem Abschnitt eines Polynukleotids assoziiert ist, mit dem es naturgemäß assoziiert ist; 2) mit einem Polynukleotid verknüpft ist, bei dem es sich nicht um das handelt, mit dem es naturgemäß verknüpft ist; oder 3) nicht naturgemäß vorkommt. Wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure RNA enthält, sollte die Bezugnahme auf die gezeigte Sequenz als Bezugnahme auf das RNA-Äquivalent aufgefasst werden, wobei U T ersetzt.
Folglich werden rekombinante Nukleinsäuren, die Sequenzen umfassen, die anderweitig nicht natürlich vorkommen, von dieser Erfindung bereitgestellt. Obwohl die Wildtyp-Sequenz eingesetzt werden kann, wird sie oftmals verändert, z. B. durch Deletion, Substitution oder Insertion. cDNA oder genomische Bibliotheken verschiedener Arten können als natürliche Quellen der Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung gescreent werden oder solche Nukleinsäuren können mittels Amplifikation von Sequenzen, die sich in genomischer DNA oder anderen natürlichen Quellen befinden, z. B. mittels PCR bereitgestellt werden. Die Auswahl von cDNA-Bibliotheken entspricht normalerweise einer Gewebequelle, die reich an mRNA des gewünschten Proteins ist. Phagenbibliotheken werden normalerweise bevorzugt, andere Arten von Bibliotheken können jedoch verwendet werden. Klone einer Bibliothek werden auf Platten verteilt, zum Screening auf ein Substrat übertragen, denaturiert und auf die Gegenwart gewünschter Sequenzen sondiert.
Die in dieser Erfindung verwendeten DNA-Sequenzen werden für gewöhnlich mindestens etwa fünf Codons (15 Nukleotide), gewöhnlicher mindestens etwa 7–15 Codons und am meisten bevorzugte mindestens etwa 35 Codons umfassen. Ein oder mehrere Introns können ebenfalls vorhanden sein. Diese Anzahl von Nukleotiden ist für gewöhnlich etwa die Mindestlänge, die für eine erfolgreiche Sonde erforderlich ist, die spezifisch mit einer KCNE1 kodierenden Sequenz hybridisieren würde. In diesem Zusammenhang können Oligomere von nur 8 Nukleotiden, allgemeiner 8–17 Nukleotiden als Sonden verwendet werden, insbesondere in Verbindung mit Chiptechnologie.
Techniken zur Nukleinsäuremanipulation sind allgemein beispielsweise in Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992, beschrieben. Beim Anwenden solcher Techniken geeignete Reagenzien, wie Restriktionsenzyme und dergleichen, sind in der Technik weitgehend bekannt und von solchen Anbietern wie New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega, U. S. Biochemicals, New England Nuclear und einer Reihe anderer Quellen im Handel erhältlich. Die rekombinanten Nukleinsäuresequenzen, die zum Produzieren von Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können von natürlichen oder synthetischen Sequenzen abgeleitet werden. Viele natürliche Gensequenzen sind aus verschiedenen cDNA- oder aus genomischen Bibliotheken unter Verwendung adäquater Sonden erhältlich. Siehe GenBank, National Institutes of Health.
Wie hierin verwendet ist ein "Abschnitt" des KCNE1-Locus oder der KCNE1-Region oder des KCNE1-Allels als eine Mindestgröße von mindestens etwa acht Nukleotiden oder vorzugsweise etwa 15 Nukleotiden oder mehr bevorzugt mindestens etwa 25 Nukleotiden definiert und kann eine Mindestgröße von mindestens etwa 40 Nukleotiden aufweisen. Diese Definition beinhaltet alle Größen im Bereich von 8–40 Nukleotiden sowie mehr als 40 Nukleotiden. Folglich beinhaltet diese Definition Nukleinsäuren von 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 Nukleotiden oder Nukleinsäuren mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Bereiche von Werten (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotide) oder Nukleinsäuren mit mehr als 500 Nukleotiden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuartigen Nukleinsäuren mit mindestens 8 Nukleotiden, die von SEQ ID NO:3, deren Komplement oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung beinhaltet nicht Nukleinsäuren, die im Stand der Technik existieren. Das heißt, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Nukleinsäuren mit mindestens 8 Nukleotiden, die von SEQ ID NO:3 abgeleitet sind, mit der Maßgabe, dass sie nicht Nukleinsäuren beinhaltet, die im Stand der Technik existieren.
"KCNE1-Protein" oder "KCNE1-Polypeptid" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das von dem KCNE1-Locus, den Varianten oder Fragmenten davon kodiert wird. Die Ausdrücke "KCNE1" und "minK" werden austauschbar verwendet. Der Ausdruck "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren und dessen Äquivalent und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; folglich sind Peptide, Oligopeptide und Proteine von der Definition eines Polypeptids umfasst. Dieser Ausdruck bezieht sich auch nicht auf Modifikationen des Polypeptids, beispielsweise Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen, oder schließt diese aus. Von der Definition umfasst sind beispielsweise Polypeptide, die ein oder mehrere Analoga einer Aminosäure (einschließlich beispielsweise unnatürlicher Aminosäuren usw.) enthalten, Polypeptide mit substituierten Verknüpfungen sowie anderen in der Technik bekannten Modifikationen, sowohl natürlich und nicht natürlich vorkommend. Gewöhnlich werden solche Polypeptide zu mindestens etwa 50% zu der nativen KCNE1-Sequenz homolog sein, vorzugsweise zu mehr als etwa 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens etwa 95% homolog. Ebenfalls umfasst sind Proteine, die von DNA kodiert werden und unter Bedingungen hoher oder geringer Stringenz an KCNE1 kodierende Nukleinsäuren kodieren, und zu dem KCNE1-Protein bzw. den KCNE1-Proteinen eng verwandte Polypeptide oder Proteine, die mittels Antiseren erhalten werden.
Das KCNE1-Polypeptid kann das in SEQ ID NO:4 gezeigte sein, das in isolierter und/oder gereinigter Form, frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es naturgemäß assoziiert ist, sein kann. Dem Polypeptid kann es, wenn es mittels Expression in einer prokaryontischen Zelle produziert oder synthetisch produziert wird, an nativer posttranslationaler Verarbeitung wie Glykosylierung fehlen. Alternativ ist die vorliegende Erfindung auf Polypeptide gerichtet, die Sequenzvarianten, -allele oder -derivate des KCNE1-Polypeptids sind. Solche Polypeptide können eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von der in SEQ ID NO:4 dargelegten um eine Addition, Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheidet. Bevorzugte derartige Polypeptide haben eine KCNE1-Funktion.
Substitutionsvarianten beinhalten in der Regel den Austausch einer Aminosäure durch eine andere an einer oder mehreren Stellen in dem Protein und können dazu entworfen sein, eine oder mehrere Eigenschaften des Polypeptids, wie der Stabilität gegenüber proteolytischer Spaltung, ohne Verlust anderer Funktionen oder Eigenschaften zu modulieren. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit bei der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Beschaffenheit der beteiligten Reste vorgenommen werden. Bevorzugte Substitutionen sind Substitutionen, die konservativ sind, das heißt, eine Aminosäure wird durch eine Aminosäure ähnlicher Form und Ladung ersetzt. Konservative Substitutionen sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten in der Regel Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Tyrosin, Phenylalanin.
Bestimmte Aminosäuren können durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur ohne merklichen Verlust des Interaktionsbindungsvermögens mit Strukturen wie beispielsweise antigenbindenden Regionen von Antikörpern oder Bindungsstellen an Substratmolekülen oder Bindungsstellen an Proteinen, die mit dem KCNE1-Polypeptid interagieren, ersetzt werden. Da das Interaktionsvermögen und die Beschaffenheit eines Proteins die biologische funktionelle Aktivität definieren, können bestimmte Aminosäurensubstitutionen in einer Proteinsequenz und deren zugrunde liegender DNA-kodierenden Sequenz vorgenommen werden und dennoch ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften erhalten werden. Beim Vornehmen solcher Änderungen kann der Hydropathieindex von Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Bedeutung des Aminosäurenhydropathieindexes beim Verleihen biologischer Interaktionsfunktion an ein Protein wird im Allgemeinen in der Technik verstanden (Kyte und Doolittle, 1982). Alternativ kann die Substitution ähnlicher Aminosäuren wirksam auf Grundlage der Hydrophilie vorgenommen werden. Die Bedeutung der Hydrophilie beim Verleihen biologischer Interaktionsfunktion eines Proteins wird im Allgemeinen in der Technik verstanden (US-Patentschrift 4,554,101). Die Verwendung des Hydrophobieindexes oder der Hydrophilie beim Entwerfen von Polypeptiden wird in der US-Patentschrift 5,691,198 weiter erörtert.
Die Länge von Polypeptidsequenzen, die auf Homologie verglichen werden, wird im Allgemeinen mindestens etwa 16 Aminosäuren, für gewöhnlich mindestens etwa 20 Reste, gewöhnlicher mindestens etwa 24 Reste, in der Regel mindestens etwa 28 Reste und vorzugsweise mehr als etwa 35 Reste ausmachen.
"Operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, bei der die so beschriebenen Bestandteile in einer Beziehung stehen, die ihnen ermöglicht, in ihrer beabsichtigten Art und Weise zu funktionieren. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einer kodierenden Sequenz operativ verknüpft, wenn der Promotor dessen Transkription oder Expression beeinflusst.
Der Ausdruck Peptidmimetikum oder Mimetikum soll sich auf eine Substanz beziehen, die die wesentliche biologische Aktivität des KCNE1-Polypeptids aufweist. Ein Peptidmimetikum kann ein Peptid enthaltendes Molekül sein, das Elemente der Proteinsekundärstruktur nachahmt (Johnson et al., 1993). Das zugrunde liegende Grundprinzip hinter der Verwendung von Peptidmimetika besteht darin, dass die Peptidhauptkette von Proteinen hauptsächlich dazu dient, Aminosäureseitenketten in einer solchen Art und Weise auszurichten, dass molekulare Interaktionen erleichtert werden, wie z.B. die von Antikörper und Antigen, Enzym und Substrat oder Gerüstproteinen. Ein Peptidmimetikum wird so entworfen, das molekulare Interaktionen, ähnlich wie bei dem natürlichen Molekül, ermöglicht werden. Ein Mimetikum muß überhaupt kein Peptid sein, wird jedoch die wesentliche biologische Aktivität von natürlichem KCNE1-Polypeptid bewahren.
"Sonden". Polynukleotid-Polymorphismen, die mit KCNE1-Allelen assoziiert sind und eine Veranlagung für LQT schaffen, werden mittels Hybridisierung mit einer Polynukleotidsonde, die ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz bildet, unter stringenten bis moderat stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen nachgewiesen. Wenn erwartet wird, dass die Sonden zu der Zielsequenz perfekt komplementär sein werden, werden Bedingungen hoher Stringenz angewendet. Die Hybridisierungsstringenz kann vermindert werden, wenn eine gewisse Fehlpaarung erwartet wird, beispielsweise wenn Varianten erwartet werden, mit dem Resultat, dass die Sonde nicht vollständig komplementär sein wird. Es werden Bedingungen gewählt, die unspezifische/adventive Bindungen ausschließen, das heißt, die Rauschen minimieren. (Es sollte beachtet werden, dass überall in dieser Offenbarung, wenn einfach angegeben wird, dass "stringente" Bedingungen angewendet werden, dies heißen soll, dass Bedingungen "hoher Stringenz" angewendet werden). Da solche Anzeigen neutrale DNA-Polymorphismen sowie Mutationen identifizieren, erfordern diese Anzeigen eine weitere Analyse, um den Nachweis eines KCNE1-Suszeptibilitätsallels zu demonstrieren.
Sonden für KCNE1-Allele können von den Sequenzen der KCNE1-Region, deren cDNA, funktionell äquivalenten Sequenzen oder den Komplementen davon abgeleitet werden. Die Sonden können eine beliebige geeignete Länge aufweisen, die die gesamte oder einen Abschnitt der KCNE1-Region umspannen und eine spezifische Hybridisierung an die Region ermöglichen. Wenn die Zielsequenz eine Sequenz enthält, die mit der der Sonde identisch ist, können die Sonden kurz sein, z. B. im Bereich von etwa 8–30 Basenpaaren, da das Hybrid selbst unter stringenten Bedingungen verhältnismäßig stabil sein wird. Wenn bei der Sonde ein gewisses Ausmaß an Fehlpaarungen erwartet wird, d. h. wenn vermutet wird, dass die Sonde an eine Variantenregion hybridisieren wird, kann eine längere Sonde eingesetzt werden, die mit der erforderlichen Spezifität an die Zielsequenz hybridisiert.
Die Sonden werden ein isoliertes Polynukleotid enthalten, das an einen Marker oder ein Reportermolekül angebunden ist, und können zum Isolieren anderer Polynukleotidsequenzen mit einer Sequenzähnlichkeit mittels Standardverfahren verwendet werden. Zwecks Techniken zum Herstellen und Markieren von Sonden siehe z. B. Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992. Andere ähnliche Polynukleotide können mittels Verwendung homologer Polynukleotide ausgewählt werden. Alternativ können Polynukleotide, die diese oder ähnliche Polypeptide kodieren, synthetisiert oder mittels Verwendung der Redundanz im genetischen Kode ausgewählt werden. Verschiedene Codonsubstitutionen können eingeführt werden, z. B. mittels stiller Änderungen (wodurch verschiedene Restriktionsstellen produziert werden), oder um die Expression für ein bestimmtes System zu optimieren. Mutationen können eingeführt werden, um die Eigenschaften des Polypeptids zu modifizieren, vielleicht um den Polypeptidabbau oder die Polypeptidumsatzrate zu ändern.
Sonden, die Oligonukleotide oder andere Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, können von natürlich vorkommenden oder rekombinanten einzel- oder doppelsträngigen Polynukleotiden abgeleitet oder chemisch synthetisiert werden. Die Sonden können auch mittels Nick-Translation, Klenow-Auffüllreaktion oder anderer in der Technik bekannter Verfahren markiert werden.
Abschnitte der Polynukleotidsequenz mit mindestens etwa acht Nukleotiden, für gewöhnlich mindestens etwa 15 Nukleotiden, und weniger als etwa 9 kb, für gewöhnlich weniger als etwa 1,0 kb, aus einer Polynukleotidsequenz, die KCNE1 kodiert, sind als Sonden bevorzugt. Diese Definition beinhaltet folglich Sonden der Größen 8 Nukleotide bis zu 9000 Nukleotide. Folglich beinhaltet diese Definition Sonden von 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400 oder 500 Nukleotiden oder Sonden mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Bereiche von Werten (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotide) oder Sonden mit mehr als 500 Nukleotiden. Die Sonden können auch dazu verwendet werden zu bestimmen, ob mRNA kodierendes KCNE1 in einer Zelle oder einem Gewebe vorliegt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuartigen Sonden mit mindestens 8 Nukleotiden, die von SEQ ID NO:3, deren Komplement oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung beinhaltet nicht Sonden, die im Stand der Technik existieren. Das heißt, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Sonden mit mindestens 8 Nukleotiden, die von SEQ ID NO:3 abgeleitet sind, mit der Maßgabe, dass sie nicht Sonden beinhaltet, die im Stand der Technik existieren.
Ähnliche Erwägungen und Nukleotidlängen sind ebenfalls auf Primer anwendbar, die zur Amplifikation des gesamten oder eines Teils des KCNE1 -Gens verwendet werden können. Folglich beinhaltet eine Definition für Primer Primer von 8, 12, 15, 20, 25, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 Nukleotiden oder Primer mit einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden innerhalb dieser Wertebereiche (z. B. 9, 10, 11, 16, 23, 30, 38, 50, 72, 121 usw. Nukleotide) oder Primer mit mehr als 500 Nukleotiden oder einer beliebigen Anzahl von Nukleotiden zwischen 500 und 9000. Die Primer können auch dazu verwendet werden zu bestimmen, ob mRNA kodierendes KCNE1 in einer Zelle oder einem Gewebe vorliegt. Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle neuartigen Primer mit mindestens 8 Nukleotiden, die vom KCNE1-Locus zum Amplifizieren des KCNE1 -Gens, dessen Komplement oder funktionell äquivalenten Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind. Die vorliegende Erfindung beinhaltet nicht Primer, die im Stand der Technik existieren. Das heißt, die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Primer mit mindestens 8 Nukleotiden, die von SEQ ID NO:3 abgeleitet sind, mit der Maßgabe, dass sie nicht Primer beinhaltet, die im Stand der Technik existieren.
"Proteinmodifikationen oder -fragmente" werden von der vorliegenden Erfindung für KCNE1-Polypeptide oder Fragmente davon bereitgestellt, die im Wesentlichen zu der Primärstruktursequenz homolog sind, die jedoch z. B. chemische oder biochemische In-vivo- oder In-vitro-Modifikationen beinhalten oder die ungewöhnliche Aminosäuren einschließen. Zu solchen Modifikationen zählen beispielsweise Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitinierung, Markierung, z. B. mit Radionukliden, und verschiedene enzymatische Modifikationen, wie erfahrene Fachmänner leicht zu schätzen wissen werden. Eine Vielfalt von Verfahren zum Markieren von Polypeptiden und von Substituenten oder Markern, die für solche Zwecke geeignet sind, sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten radioaktive Isotope wie ³²P, Liganden, die an markierte Antiliganden (z. B. Antikörper) binden, Fluorophore, chemilumineszierende Agentien, Enzyme und Antiliganden, die als spezifische Bindungspaarmitglieder für einen markierten Liganden dienen können. Die Wahl des Markers hängt von der erforderlichen Empfindlichkeit, Einfachheit der Konjugation mit dem Primer, Stabilitätsanforderungen und verfügbaren Geräteausstattung ab. Verfahren zum Markieren von Polypeptiden sind in der Technik wohl bekannt. Siehe Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992.
Neben im Wesentlichen vollständigen Polypeptiden stellt die vorliegende Erfindung biologisch aktive Fragmente der Polypeptide bereit. Zu signifikanten biologischen Aktivitäten zählen Ligandenbindung, immunologische Aktivität und andere biologische Aktivitäten, die für KCNE1-Polypeptide charakteristisch sind. Zu immunologischen Aktivitäten zählen sowohl immunogene Funktion in einem Zielimmunsystem als auch das Teilen von immunologischen Epitopen zur Bindung, die entweder als ein Kompetitor oder Ersatzantigen für ein Epitop des KCNE1-Proteins dienen. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Epitop" auf eine antigene Determinante eines Polypeptids. Ein Epitop könnte drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, die für das Epitop einzigartig ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens fünf derartigen Aminosäuren und besteht gewöhnlicher aus mindestens 8 – 10 derartigen Aminosäuren. Verfahren zum Bestimmen der räumlichen Konformation solcher Aminosäuren sind in der Technik bekannt.
Zu immunologischen Zwecken können Tandem-Repeat-Polypeptidsegmente als Immunogene verwendet werden, wodurch stark antigenische Proteine produziert werden. Alternativ werden solche Polypeptide als sehr effiziente Kompetitoren zur spezifischen Bindung dienen. Die Produktion von Antikörpern, die für KCNE1-Polypeptide oder Fragmente davon spezifisch sind, wird im Folgenden beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Fusionspolypeptide bereit, die KCNE1-Polypeptide und -fragmente umfassen. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen zwei oder mehr KCNE1-Polypeptidsequenzen oder zwischen den Sequenzen von KCNE1 und einem verwandten Protein sein. In ähnlicher Weise können heterologe Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der abgeleiteten Proteine zeigen würden. Zum Beispiel können Ligandenbindungs- oder andere Domänen zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder -fragmenten "ausgetauscht" werden. Solche homologen oder heterologen Fusionspolypeptide können beispielsweise eine veränderte Bindungsstärke oder -spezifität aufweisen. Zu Fusionspartnern zählen Immunglobuline, bakterielle β-Galactosidase, trpE, Protein A, β-Lactamase, Alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase und Hefe-alpha-Paarungsfaktor. Siehe Godowski et al., 1988.
Fusionsproteine werden in der Regel mittels entweder rekombinanter Nukleinsäurenverfahren hergestellt, wie im Folgenden beschrieben, oder können chemisch synthetisiert werden. Techniken zur Synthese von Polypeptiden sind beispielsweise in Merrifield (1963) beschrieben.
"Proteinreinigung" bezieht sich auf verschiedene Verfahren zur Isolierung der KCNE1-Polypeptide aus anderem biologischem Material, wie aus Zellen, die mit rekombinanten Nukleinsäuren transformiert wurden, die KCNE1 kodieren, und ist in der Technik wohl bekannt. Zum Beispiel können solche Polypeptide mittels Immunaffinitätschromatographie unter Einsatz z. B. der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Antikörper gereinigt werden. Verschiedene Verfahren zur Proteinreinigung sind in der Technik wohl bekannt und beinhalten die in Deutscher, 1990, und Scopes, 1982, beschriebenen.
Die Ausdrücke "isoliert", "im Wesentlichen rein" und "im Wesentlichen homogen" werden austauschbar verwendet, um ein Protein oder Polypeptid zu beschreiben, das von Bestandteilen getrennt wurde, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten. Ein monomeres Protein ist im Wesentlichen rein, wenn mindestens etwa 60 bis 75% einer Probe eine einzige Polypeptidsequenz aufweist. Ein im Wesentlichen reines Protein wird in der Regel etwa 60 bis 90 Gew.-% einer Proteinprobe, gewöhnlicher etwa 95% umfassen und wird vorzugsweise zu mehr als etwa 99% rein sein. Proteinreinheit oder -homogenität kann mit einer Reihe von in der Technik wohl bekannter Mittel angezeigt werden, wie Polyacrylamidgelelektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt von dem Sichtbarmachen einer einzigen Polypeptidbande beim Färben des Gels. Zu bestimmten Zwecken kann eine höhere Auflösung vorgesehen werden, indem HPLC oder andere in der Technik wohl bekannte Mittel verwendet werden, die zur Reinigung genutzt werden.
Ein KCNE1-Protein ist im Wesentlichen frei von natürlich assoziierten Bestandteilen, wenn es von den nativen Kontaminanten getrennt wird, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten. Folglich wird ein Polypeptid, das chemisch synthetisiert oder in einem Zellsystem synthetisiert wird, das sich von der Zelle unterscheidet, aus der es naturgemäß stammt, im Wesentlichen frei von seinen natürlich assoziierten Bestandteilen sein. Ein Protein kann auch mittels Isolierung unter Anwendung von in der Technik wohl bekannter Proteinreinigungstechniken im Wesentlichen frei von seinen natürlich assoziierten Bestandteilen gemacht werden.
Ein Polypeptid, das als ein Expressionsprodukt einer isolierten und manipulierten genetischen Sequenz produziert wurde, ist ein "isoliertes Polypeptid", wie hierin verwendet, selbst wenn es in einem homologen Zelltyp exprimiert wird. Synthetisch hergestellte Formen oder Moleküle, die von heterologen Zellen exprimiert werden, sind inhärent isolierte Moleküle.
"Rekombinante Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure, die nicht natürlich vorkommt oder die mittels künstlicher Kombination von zwei ansonsten getrennten Sequenzsegmenten hergestellt wird. Diese künstliche Kombination wird oftmals mit entweder chemischen Synthesemitteln oder mittels der künstlichen Manipulation isolierter Segmente von Nukleinsäuren, z. B. mittels Gentechniken, durchgeführt. dies wird für gewöhnlich vorgenommen, um ein Codon durch ein redundantes Codon zu ersetzen, das dieselbe oder eine konservative Aminosäure kodiert, während in der Regel eine Sequenzerkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird sie durchgeführt, um Nukleinsäuresegmente mit gewünschten Funktionen zusammenzufügen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen.
"Regulationssequenzen" beziehen sich auf jene Sequenzen. die sich normalerweise innerhalb von 100 kb der kodierenden Region eines Locus befinden, sie können aber auch weiter entfernt von der kodierenden Region sein, die die Expression des Gens beeinflussen (einschließlich der Transkription des Gens und der Translation, des Spleißens, der Stabilität oder dergleichen der Messenger-RNA).
"Wesentliche Homologie oder Ähnlichkeit". Eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon ist zu einer anderen "im Wesentlichen homolog" (oder "im Wesentlichen ähnlich"), wenn eine Nukleotidsequenzidentität in mindestens etwa 60% der Nukleotidbasen, für gewöhnlich mindestens etwa 70%, gewöhnlicher mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und mehr bevorzugt mindestens etwa 95–98% der Nukleotidbasen vorliegt, wenn sie bzw. es mit der anderen Nukleinsäure (oder deren komplementärem Strang) optimal ausgerichtet ist (mit adäquaten Nukleotidinsertionen oder -deletionen).
Um Homologie zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuren zu bestimmen, wird die prozentuale Homologie unter Verwendung des BLASTN-Programms "BLAST 2 sequences" bestimmt. Dieses Programm ist zum öffentlichen Gebrauch vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) über das Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htm1) erhältlich (Altschul et al., 1997). Die zu verwendenden Parameter sind diejenigen, deren Kombination der folgenden die höchste berechnete prozentuale Homologie (wie unten berechnet) ergeben, wobei die Standardparameter in Klammern gezeigt sind:
Programm – blastn
Matrix – 0 BLOSUM62
Reward für eine Übereinstimmung – 0 oder 1 (1)
Penalty für eine Fehlpaarung – 0, –1, –2 oder –3 (–2)
Penalty für offene Lücke (open gap) – 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 (5)
Penalty für Erweiterungslücke (extension gap) – 0 oder 1 (1)
Gap_x dropoff – 0 oder 50 (50)
Expect – 10
Neben einer Vielfalt anderer Ergebnisse zeigt dieses Programm eine prozentuale Identität über die kompletten Stränge oder über Regionen der zwei gepaarten Nukleinsäuren. Das Programm zeigt als Teil der Ergebnisse ein Alignment und die Identität der zwei verglichenen Stränge. Wenn die Stränge dieselbe Länge aufweisen, wird die Identität über die komplette Länge der Nukleinsäuren berechnet. Wenn die Stränge ungleiche Längen aufweisen, ist die Länge der kürzeren Nukleinsäure zu verwenden. Wenn die Nukleinsäuren über einen Abschnitt ihrer Sequenzen ziemlich ähnlich sind, über den Rest ihrer Sequenzen jedoch unterschiedlich sind, wird das blastn-Programm "BLAST 2 Sequences" eine Identität nur über die ähnlichen Abschnitte zeigen und diese Abschnitte werden einzeln gemeldet. Zu Zwecken des Bestimmens der Homologie hierin bezieht sich die prozentuale Homologie auf die kürzere der zwei verglichenen Sequenzen. Wenn eine beliebige Region in unterschiedlichen Alignments mit unterschiedlichen prozentualen Identitäten gezeigt wird, sind die Alignments, die die größte Homologie ergeben, zu verwenden. Die Mittelung ist wie in diesem Beispiel von SEQ ID NO:5 und 6 durchzuführen.
Das Programm "BLAST 2 Sequences" zeigt unterschiedliche Alignments dieser zwei Nukleinsäuren in Abhängigkeit von den Parametern, die gewählt werden. Als Beispiel wurde vier Sätze an Parametern zum Vergleichen von SEQ ID NO:5 und 6 gewählt (der Gap x_dropoff war in allen Fällen 50), wobei die Ergebnisse in Tabelle 1 gezeigt sind. Es ist zu beachten, dass keiner der gewählten Sätze an Parametern, wie in Tabelle 1 gezeigt, notwendigerweise der beste Satz an Parametern zum Vergleichen dieser Sequenzen ist. Die prozentuale Homologie wird berechnet, indem für jede Region, die Identität zeigt, der Bruchteil von Basen des kürzeren Strangs in einer Region mit der prozentualen Identität für diese Region multipliziert wird und diese alle addiert werden. Zum Beispiel ist unter Anwendung des ersten Satzes an Parametern, der in Tabelle 1 gezeigt ist, SEQ ID NO:5 die kurze Sequenz (63 Basen) und zwei Identitätsregionen werden gezeigt, wobei die erste die Basen 4–29 (26 Basen) von SEQ ID NO:5 mit einer Identität von 92% zu SEQ ID NO:6 umfasst und die zweite die Basen 39–59 (21 Basen) von SEQ ID NO:5 mit einer Identität von 100% zu SEQ ID NO:6 umfasst. Die Basen 1–3, 30–38 und 60–63 (16 Basen) sind nicht als eine beliebige Identität mit SEQ ID NO:6 aufweisend gezeigt. Die prozentuale Homologie wird berechnet als: (26/63)(92) + (21/63)(100) + (16/63)(0) = 71,3% Homologie. Die Homologieprozentzahlen, die unter Anwendung jedes der vier gezeigten Sätze an Parametern berechnet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Mehrere andere Kombinationen von Parametern sind möglich, sind jedoch der Kürze halber nicht aufgeführt. Es ist zu erkennen, dass jeder Satz an Parametern in einer anderen berechneten prozentualen Homologie resultierte. Da das Ergebnis, das die höchste prozentuale Homologie ergibt, zu verwenden ist, würde ausschließlich auf Grundlage dieser vier Sätze an Parametern festgestellt werden, dass SEQ ID NO:5 und 6 eine Homologie von 87,% aufweisen. Wiederum ist zu beachten, dass die Anwendung anderer Parameter eine sogar höhere Homologie für SEQ ID NO:5 und 6 zeigen könnte, der Kürze halber sind jedoch nicht alle möglichen Ergebnisse gezeigt. TABELLE 1
Alternativ liegt wesentliche Homologie (oder Ähnlichkeit) vor, wenn eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an eine andere Nukleinsäure (oder einen komplementären Strang davon) hybridisiert, an einen Strang oder an dessen Komplement. Hybridisierungsselektivität liegt vor, wenn eine Hybridisierung, die im Wesentlichen selektiver ist als ein totales Fehlen von Selektivität, auftritt. In der Regel wird eine selektive Hybridisierung auftreten, wenn über einen Abschnitt von mindestens etwa 14 Nukleotiden mindestens etwa 55% Homologie, vorzugsweise mindestens etwa 65%, mehr bevorzugt mindestens etwa 75% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% vorliegen. Siehe Kanehisa, 1984. Die Länge des Homologievergleichs, wie beschrieben, kann über längere Abschnitte sein und wird in bestimmten Ausführungsform über einen Abschnitt von mindestens etwa neun Nukleotide, für gewöhnlich mindestens etwa 20 Nukleotide, gewöhnlicher mindestens etwa 24 Nukleotide, in der Regel mindestens etwa 28 Nukleotide, typischer mindestens etwa 32 Nukleotide und vorzugsweise mindestens etwa 36 oder mehr Nukleotide sein.
Die Nukleinsäurehybridisierung wird neben der Basenzusammensetzung, der Länge der komplementären Stränge und der Anzahl der Nukleotidbasenfehlpaarungen zwischen hybridisierenden Nukleinsäuren von solchen Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organischen Lösemitteln beeinflusst, wie Fachmänner leicht zu schätzen wissen werden. Stringente Temperaturbedingungen werden im Allgemeinen Temperaturen von mehr als 30°C, in der Regel mehr als 37°C und vorzugsweise mehr als 45°C beinhalten. Stringente Salzbedingungen werden gewöhnlich weniger als 1000 mM, in der Regel weniger als 500 mM und vorzugsweise weniger als 200 mM sein. Die Kombination von Parametern ist jedoch viel wichtiger als der Maßstab eines beliebigen einzigen Parameters. Die Stringenzbedingungen hängen von der Länge der Nukleinsäure und der Basenzusammensetzung der Nukleinsäure ab und können mittels in der Technik wohl bekannter Techniken bestimmt werden. Siehe z. B. Wetmur und Davidson, 1968.
Sondensequenzen können ebenfalls unter bestimmten Bedingungen spezifisch an Duplex-DNA hybridisieren, um Triplex- oder DNA-Komplexe höherer Ordnung zu bilden. Die Herstellung solcher Sonden und geeignete Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik wohl bekannt.
Die Ausdrücke "wesentliche Homologie" oder "wesentliche Ähnlichkeit", wenn sie sich auf Polypeptide beziehen, zeigen an, dass das betreffende Polypeptid oder Protein mindestens etwa 30% Identität mit einem ganzen natürlich vorkommenden Protein oder einem Abschnitt davon, für gewöhnlich mindestens etwa 70% Identität, gewöhnlicher mindestens etwa 80% Identität, vorzugsweise mindestens etwa 90% Identität und mehr bevorzugt mindestens etwa 95% Identität aufweist.
Homologie wird für Polypeptide in der Regel unter Verwendung von Sequenzanalysesoftware gemessen. Siehe z. B. das Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, USA. Proteinanalysesoftware vergleicht ähnliche Sequenzen unter Anwendung von Homologiemaßeinheiten, die verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen zugeordnet sind. Konservative Substitutionen beinhalten in der Regel Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
"Im Wesentlichen ähnliche Funktion" bezieht sich auf die Funktion einer modifizierten Nukleinsäure oder eines modifizierten Proteins in Bezug auf die Wildtyp-KCNE1-Nukleinsäure oder das Wildtyp-KCNE1-Polypeptid. Das modifizierte Polypeptid wird zu dem Wildtyp-KCNE1-Polypeptid im Wesentlichen homolog sein und wird im Wesentlichen dieselbe Funktion aufweisen. Das modifizierte Polypeptid kann eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen und/oder kann modifizierte Aminosäuren enthalten. Neben der Funktionsähnlichkeit kann das modifizierte Polypeptid andere nützliche Eigenschaften aufweisen, wie eine längere Halbwertzeit. Die Funktionsähnlichkeit (Aktivitätsähnlichkeit) des modifizierten Polypeptids kann im Wesentlichen mit der Aktivität des Wildtyp-KCNE1-Polypeptids identisch sein. Alternativ kann die Funktionsähnlichkeit (Aktivitätsähnlichkeit) des modifizierten Polypeptids höher als die Aktivität des Wildtyp-KCNE1-Polypeptids sein. Das modifizierte Polypeptid wird unter Anwendung herkömmlicher Techniken synthetisiert oder wird von einer modifizierten Nukleinsäure kodiert und unter Anwendung herkömmlicher Techniken produziert. Die modifizierte Nukleinsäure wird mittels herkömmlicher Techniken hergestellt. Eine Nukleinsäure mit einer Funktion, die der Wildtyp-KCNE1-Gen-Funktion im Wesentlichen ähnlich ist, produziert das oben beschriebene modifizierte Protein.
Ein Polypeptid-"Fragment", -"Abschnitt" oder -"Segment" ist ein Abschnitt von Aminosäureresten von mindestens etwa fünf bis sieben aneinander grenzenden Aminosäuren, oftmals mindestens etwa sieben bis neun aneinander grenzenden Aminosäuren, in der Regel mindestens etwa neun bis 13 aneinander grenzenden Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens etwa 20 bis 30 aneinander grenzenden Aminosäuren.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, sofern löslich, können mit einem Festphasenträger verbunden sein, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Säulenpackmaterialien (Sepharose-Kügelchen), magnetische Kügelchen, Glaswolle, Kunststoff, Metall, Polymergele, Zellen oder andere Substrate. Solche Träger können die Form von beispielsweise Kügelchen, Näpfen, Messstäben oder Membranen annehmen.
"Zielregion" bezieht sich auf eine Region der Nukleinsäure, die amplifiziert und/oder nachgewiesen wird. Der Ausdruck "Zielsequenz" bezieht sich auf eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer unter gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bilden wird.
Die Ausübung der vorliegenden Erfindung setzt, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Chemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, Genetik und Immunologie ein. Siehe z. B. Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie und Fink, 1991. Eine allgemeine Erörterung von Techniken und Materialien zur Kartierung humaner Gene, einschließlich der Kartierung des humanen Chromosoms 1, wird z. B. in White und Lalouel, 1988, bereitgestellt.
Herstellung von rekombinanten oder chemisch synthetisierten Nukleinsäuren; Vektoren, Transformation, Wirtszellen
Große Mengen der Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können mittels Replikation in einer geeigneten Wirtszelle produziert werden. Natürliche oder synthetische Polynukleotidfragmente, die für ein gewünschtes Fragment kodieren, werden in rekombinante Polynukleotidkonstrukte, für gewöhnlich DNA-Konstrukte, eingebaut, die zur Einführung in eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle und Replikation in einer solchen Zelle fähig sind. Für gewöhnlich werden die Polynukleotidkonstrukte zur Replikation in einem einzelligen Wirt, wie Hefe oder Bakterien, geeignet sein, können jedoch auch zur Einführung in (mit oder ohne Integration in dem Genom) kultivierte Säuger- oder Pflanzen- oder andere eukaryontische Zelllinien konzipiert sein. Die Reinigung von Nukleinsäuren, die mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert werden, sind z. B. in Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992, beschrieben.
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können auch mittels chemischer Synthese produziert werden, z. B. mittels des Phosphoramidit-Verfahrens, das von Beaucage und Caruthers (1981) beschrieben wird, oder des Triester-Verfahrens nach Matteucci und Caruthers (1981), und kann auf kommerziellen, automatisierten Oligonukleotidsyntheseapparaten vorgenommen werden. Ein doppelsträngiges Fragment kann aus dem einzelsträngigen Produkt der chemischen Synthese erhalten werden, indem entweder der komplementäre Strang synthetisiert und der Strang unter adäquaten Bedingungen zusammen fusioniert wird oder der komplementäre Strang unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer adäquaten Primersequenz hinzugefügt wird.
Polynukleotidkonstrukte, die zur Einführung in einen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt hergestellt werden, können ein Replikationssystem umfassen, das von dem Wirt erkannt wird, einschließlich des beabsichtigten Polynukleotidfragments, das das gewünschte Polypeptid kodiert, und wird vorzugsweise auch Transkriptions- und Translationsinitiationsregulationssequenzen enthalten, die operativ mit dem das Polypeptid kodierenden Segment verknüpft sind. Zu Expressionsvektoren können beispielsweise eine Replikationsstartpunkt- oder autonom replizierende Sequenz (ARS) und Expressionskontrollsequenzen, ein Promotor, ein Enhancer und erforderliche Verarbeitungsinformationsstellen wie Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, Transkriptionsterminatorsequenzen und mRNA-Stabilisierungssequenzen zählen. Solche Vektoren können mit Hilfe von standardmäßigen rekombinanten Techniken hergestellt werden, die in der Technik wohl bekannt sind und beispielsweise in Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992, erörtert werden.
Ein adäquater Promotor und andere erforderliche Vektorsequenzen werden gewählt, um in dem Wirt funktionell zu sein, und können, soweit angemessen, jene beinhalten, die naturgemäß mit dem KCNE1-Gen assoziiert werden. Beispiele von praktikablen Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren sind in Sambrook et al., 1989, oder Ausubel et al., 1992, beschrieben; siehe auch z. B. Metzger et al., 1988. Viele geeignete Vektoren sind in der Technik bekannt und können von solchen Anbietern wie Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech und anderen bezogen werden. Promotoren wie die trp-, lac- und Phagenpromotoren, tRNA-Promotoren und glykolytischen Enzympromotoren können in prokaryontischen Wirten verwendet werden. Zu geeigneten Hefe-Promotoren zählen Promotorregionen für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme wie Enolase oder Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Enzyme, die für Maltose- und Galactosenutzung verantwortlich zeichnen, und andere. Vektoren und Promotoren, die zur Verwendung bei der Hefeexpression geeignet sind, sind in Hitzeman et al., EP 73,675A , weiter beschrieben. Adäquate, nicht native Promotoren von Säugern könnten die Early- und Late-Promotoren von SV40 (Fiers et al., 1978) oder Promotoren, die von Maus-Moloney-Leukämie-Virus, Maus-Tumor-Virus, Vogelsarkomvirus, Adenovirus II, Rinderpapillomvirus oder Polyom abgeleitet sind, beinhalten. Promotoren von Insekten können von Baculovirus abgeleitet sein. Darüber hinaus kann das Konstrukt mit einem amplifizierbaren Gen (z. B. DHFR) verbunden werden, so dass mehrere Kopien des Gens hergestellt werden können. Zwecks adäquater Enhancer und anderer Expressionskontrollsequenzen siehe auch Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983). Siehe auch z. B. die US-Patentschriften Nr. 5,691,198; 5,735,500; 5,747,469 und 5,436,146.
Obgleich solche Expressionsvektoren autonom replizieren können, können sie auch replizieren, indem sie mittels in der Technik wohl bekannter Verfahren in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden.
Expressions- und Klonierungsvektoren werden wahrscheinlich einen selektierbaren Marker enthalten, ein Gen, das ein Protein kodiert, das für das Überleben oder Wachstum einer Wirtszelle erforderlich ist, die mit dem Vektor transformiert wird. Die Gegenwart dieses Gens stellt das Wachstum nur jener Wirtszellen sicher, die die Insertionen exprimieren. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen toxischen Substanzen verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat usw., b) auxotrophe Defizienzen komplementieren oder c) wichtige Nährstoffe liefern, die nicht aus Komplexmedien zur Verfügung stehen, z. B. das Gen, das D-Alaninracemase für Bacilli kodiert. Die Wahl des korrekten selektierbaren Markers wird von der Wirtszelle abhängen, und adäquate Marker für unterschiedliche Wirte sind in der Technik wohl bekannt.
Die Vektoren, die die Nukleinsäuren von Interesse enthalten, können in vitro transkribiert werden und die resultierende RNA kann mittels wohl bekannter Verfahren, z. B. mittels Injektion (siehe Kubo et al., 1988), in die Wirtszelle eingeführt werden oder die Vektoren können direkt in Wirtszellen mittels in der Technik wohl bekannter Verfahren eingeführt werden, die je nach der Art des Zellwirts variieren, einschließlich Elektroporation; Transfektion, die Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran oder andere Substanzen einsetzt; Mikroprojektilbeschuss; Lipofektion; Infektion (wobei der Vektor ein infektiöses Agens, wie ein Retrovirusgenom, ist) und andere Verfahren. Siehe allgemein Sambrook et al., 1989, und Ausubel et al., 1992. Die Einführung der Polynukleotide in die Wirtszelle mittels eines beliebigen in der Technik bekannten Verfahrens, einschließlich unter anderem der oben beschriebenen, wird hierin als "Transformation" bezeichnet. Die Zellen, in die oben beschriebene Nukleinsäuren eingeführt wurden, sollen auch die Nachkommenschaft solcher Zellen beinhalten.
Große Mengen der Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem die KCNE1-Nukleinsäure oder Abschnitte davon in Vektoren oder anderen Expressionshilfsmitteln in kompatiblen prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Die am häufigsten verwendeten prokaryontischen Wirte sind Stämme von Escheria coli, obwohl andere Prokaryonten, wie Bacillus subtilis oder Pseudomonas, ebenfalls verwendet werden können.
Säuger- oder andere eukaryontische Wirtszellen, wie die von Hefe, Fadenpilzen, Pflanzen, Insekten oder amphibischen oder Vogelspezies, können ebenfalls zur Produktion der Proteine der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Die Vermehrung von Säugerzellen in Kultur ist an sich wohl bekannt. Siehe Jakoby und Pastan (Hrsg.) (1979). Beispiele von allgemein verwendeten Säugerwirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinesische Hamsterovarialzellen (CHO) und WI38-, BHK- und COS-Zelllinien, obwohl der gelernte Fachmann zu schätzen wissen wird, dass andere Zelllinien adäquat sein können, z. B. um eine stärkere Expression, wünschenswerte Glykosylierungsmuster oder andere Funktionen bereitzustellen. Ein Beispiel einer allgemein verwendeten Insektenzelllinie ist SF9.
Klone werden mittels Verwendung von Markern je nach dem Modus der Vektorkonstruktion ausgewählt. Der Marker kann sich auf demselben oder einem anderen DNA-Molekül, vorzugsweise demselben DNA-Molekül befinden. In prokaryontischen Wirten kann der Transformant z. B. über die Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin oder anderen Antibiotika ausgewählt werden. Die Produktion eines bestimmten Produkts auf Basis der Temperaturempfindlichkeit kann gleichfalls als ein adäquater Marker dienen.
Prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die mit den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung transformiert werden, werden nicht nur für die Produktion der Nukleinsäuren und Polypeptide der vorliegenden Erfindung, sondern auch beispielsweise beim Untersuchen der Charakteristika von KCNE1-Polypeptiden von Nutzen sein.
Die Sonden, die auf der hierin offenbarten KCNE1-Gensequenz basieren, werden zum Identifizieren homologer KCNE1-Gensequenzen und -Proteine in anderen Spezies verwendet. Diese Gensequenzen und Proteine werden in den hierin beschriebenen Diagnose/Prognose-, therapeutischen und Wirkstoffscreeningverfahren für die Spezies verwendet, aus der sie isoliert wurden.
Gebrauchsverfahren: Wirkstoffscreening
Die Erfindung ist insbesondere zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von KCNE1-Proteinen in transformierten Zellen, transfizierten Oozyten oder transgenen Tieren geeignet. Da Mutationen in dem KCNE1-Protein die Funktion des kardialen IKs-Kaliumkanals verändern können, werden Kandidatenwirkstoffe nach Auswirkungen auf den Kanal gescreent, wobei Zellen verwendet werden, die ein normales KVLQT1-Protein und ein mutiertes KCNE1-Protein enthalten. Der Wirkstoff wird den Zellen in Kultur zugesetzt oder einem transgenen Tier verabreicht und die Auswirkung auf den induzierten Strom des IKs-Kaliumkanals wird mit dem induzierten Strom einer Zelle oder eines Tiers, die bzw. das das Wildtyp-KVLQT1 und das minK enthält, verglichen. Wirkstoffkandidaten, die den induzierten Strom auf ein normaleres Niveau verändern, sind zum Behandeln oder Verhindern von LQT geeignet.
Diese Erfindung ist insbesondere zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung des KCNE1-Polypeptids oder des Bindungsfragments davon in einer beliebigen einer Vielfalt von Wirkstoffscreeningtechniken geeignet.
Das in solch einem Test eingesetzte KCNE1-Polypeptid oder -Fragment kann entweder frei in Lösung, an einen festen Träger angebracht oder auf einer Zelloberfläche gebildet sein. Ein Wirkstoffscreeningverfahren setzt eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen ein, die stabil mit rekombinanten Polynukleotiden transformiert werden, die das Polypeptid oder Fragment exprimieren, vorzugsweise in kompetitiven Bindungsassays. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder fixierter Form, können für Standardbindungsassays verwendet werden. Eines kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen einem KCNE1-Polypeptid oder -Fragment und dem getesteten Agens messen oder das Ausmaß untersuchen, zu dem die Bildung eines Komplexes zwischen einem KCNE1-Polypeptid oder -Fragment und einem bekannten Ligand von dem getesteten Agens gestört wird.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen bereit, die das Kontaktieren eines solchen Agens mit einem KCNE1-Polypeptid oder Fragment davon und das Untersuchen (i) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Agens und dem KCNE1-Polypeptid oder -Fragment oder (ii) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem KCNE1-Polypeptid oder -Fragment und einem Liganden mittels in der Technik wohl bekannter Verfahren, umfassen. In solchen kompetitiven Bindungsassays wird das KCNE1-Polypeptid oder -Fragment in der Regel markiert. Freies KCNE1-Polypeptid oder -Fragment wird von dem in einem Protein/Protein-Komplex vorhandenen getrennt und die Menge an freiem (d. h. unkomplexiertem) Marker ist eine Maßeinheit der Bindung des getesteten Agens an KCNE1 bzw. dessen Störung der Bindung von KCNE1 und Ligand. Es kann auch die Menge an gebundenem KCNE1 anstelle des freien KCNE1 gemessen werden. Es ist auch möglich, den Liganden anstelle des KCNE1 zu markieren und das Ausmaß an Ligandenbindung an KCNE1 in Gegenwart und in Abwesenheit des getesteten Wirkstoffs zu messen.
Eine andere Technik zum Wirkstoffscreening sorgt für ein Screening mit hohem Durchsatz nach Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an die KCNE1-Polypeptide und ist in Geysen (veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 84/03564) ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, hohe Anzahlen unterschiedlicher kleiner Peptidtestverbindungen werden auf einem festen Träger, wie Kunststoffstiften oder einer beliebigen anderen Oberfläche, synthetisiert. Die Peptidtestverbindungen werden mit KCNE1-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes KCNE1-Polypeptid wird dann mittels in der Technik wohl bekannter Verfahren nachgewiesen.
Gereinigtes KCNE1 kann direkt auf Platten zur Verwendung in den oben erwähnten Wirkstoffscreeningtechniken aufgetragen werden. Nicht neutralisierende Antikörper zu dem Polypeptid können jedoch dazu verwendet werden, Antikörper zu erfassen, um das KCNE1-Polypeptid auf der festen Phase zu immobilisieren.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoffscreeningassays in Erwägung, in denen neutralisierende Antikörper, die das KCNE1-Polypeptid binden können, mit einer Testverbindung in Bezug auf die Bindung an das KCNE1-Polypeptid oder Fragmente davon kompetitert. Auf diese Art und Weise können die Antikörper zum Nachweisen der Gegenwart eines beliebigen Peptids verwendet werden, das eine oder mehrere antigene Determinanten des KCNE1-Polypeptids teilt.
Die obigen Screeningverfahren sind nicht auf Assays beschränkt, die nur KCNE1 einsetzen, sind aber auch auf das Untersuchen von KCNE1/Protein-Komplexen anwendbar. Die Auswirkung von Wirkstoffen auf die Aktivität dieses Komplexes wird analysiert.
Gemäß diesen Verfahren sind die folgenden Assays Beispiele von Assays, die zum Screening nach Wirkstoffkandidaten verwendet werden können.
Ein mutiertes KCNE1 (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins) wird mit einem Wildtyp-Protein (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins), an das Wildtyp-KCNE1 bindet, gemischt. Dieses Mischen wird sowohl in Gegenwart eines Wirkstoffs als auch in Abwesenheit des Wirkstoffs durchgeführt und das Ausmaß der Bindung des mutierten KCNE1 mit dem Wildtyp-Protein wird gemessen. Wenn das Ausmaß der Bindung in Gegenwart des Wirkstoffs höher als in Abwesenheit des Wirkstoffs ist, ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat zum Behandeln von LQT, das aus einer Mutation von KCNE1 resultiert.
Ein Wildtyp-KCNE1 (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins) wird mit einem Wildtyp-Protein (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins), an das Wildtyp-KCNE1 bindet, gemischt. Dieses Mischen wird sowohl in Gegenwart eines Wirkstoffs als auch in Abwesenheit des Wirkstoffs durchgeführt und das Ausmaß der Bindung des Wildtyp-KCNE1 mit dem Wildtyp-Protein wird gemessen. Wenn das Ausmaß der Bindung in Gegenwart des Wirkstoffs höher als in Abwesenheit des Wirkstoffs ist, ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat zum Behandeln von LQT, das aus einer Mutation von KCNE1 resultiert.
Ein mutiertes Protein, das als ein Wildtyp-Protein an KCNE1 (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins) bindet, wird mit einem Wildtyp-KCNE1 (für sich oder als Teil eines Fusionsproteins) gemischt. Dieses Mischen wird sowohl in Gegenwart eines Wirkstoffs als auch in Abwesenheit des Wirkstoffs durchgeführt und das Ausmaß der Bindung des mutierten Proteins mit dem Wildtyp-KCNE1 wird gemessen. Wenn das Ausmaß der Bindung in Gegenwart des Wirkstoffs höher als in Abwesenheit des Wirkstoffs ist, ist der Wirkstoff ein Wirkstoffkandidat zum Behandeln von LQT, das aus einer Mutation in dem Gen, das das Protein kodiert, resultiert.
Das Polypeptid der Erfindung kann auch zum Screenen von Verbindungen verwendet werden, die infolge der Verwendung der Technologie Kombinatorischer Bibliotheken entwickelt wurden. Die Technologie Kombinatorischer Bibliotheken stellt eine effiziente Methode zum Testen einer potentiellen enormen Anzahl unterschiedlicher Substanzen auf die Fähigkeit, die Aktivität eines Polypeptids zu modulieren, bereit. Solche Bibliotheken und deren Verwendung sind in der Technik bekannt. Die Verwendung von Peptidbibliotheken ist bevorzugt. Siehe beispielsweise WO 97/02048.
Kurz gesagt, ein Verfahren zum Screenen nach einer Substanz, die die Aktivität eines Polypeptids moduliert, kann das Kontaktieren einer oder mehrerer Testsubstanzen mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, das Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und das Vergleichen jener Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids in vergleichbarem Reaktionsmedium, das nicht mit der Testsubstanz bzw. den Testsubstanzen behandelt wurde, beinhalten. Ein Unterschied bei der Aktivität zwischen den behandelten und unbehandelten Polypeptiden zeigt eine modulierende Wirkung der relevanten Testsubstanz bzw. Testsubstanzen an.
Vor oder auch während des Screenens nach Aktivitätsmodulation können die Testsubstanzen nach der Fähigkeit, mit dem Polypeptid zu interagieren, z. B. in einem Yeast Two--Hybrid-System, gescreent werden (z. B. Bartel et al., 1993; Fields und Song, 1989; Chevray und Nathans, 1992; Lee et al., 1995). Dieses System kann als ein grober Screen vor dem Testen einer Substanz nach der tatsächlichen Fähigkeit, die Aktivität des Polypeptids zu modulieren, verwendet werden. Alternativ könnte der Screen dazu verwendet werden, Testsubstanzen nach Bindung an einen KCNE1-spezifischen Bindungspartner zu screenen oder Mimetika des KCNE1-Polypeptids zu finden.
Nach Identifizierung einer Substanz, die die Polypeptidaktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz weiter untersucht werden. Darüber hinaus kann sie hergestellt und/oder bei der Herstellung, d. h. Fertigung oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie eines Arzneimittels, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Wirkstoffs, verwendet werden. Diese können an Einzelpersonen verabreicht werden.
Folglich erstreckt sich die vorliegende Erfindung über verschiedene Gesichtspunkte, nicht nur auf eine Substanz, die unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls als einem Modulator der Polypeptidaktivität identifiziert wurde, gemäß dem hierin offenbarten, sondern auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Arzneimittel, ein Wirkstoff oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung umfasst, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten, z. B. zur Behandlung (die vorbeugende Behandlung beinhalten kann) von LQT, umfasst, die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung, z. B. zur Behandlung von LQT, und ein Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsmittel, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Bestandteilen umfasst.
Eine Substanz, die als ein Modulator der Polypeptidfunktion identifiziert wurde, kann von Natur aus ein Peptid oder Nicht-Peptid sein. "Kleine Moleküle" von Nicht-Peptiden werden oftmals für viele pharmazeutische In-vitro-Verwendungszwecke bevorzugt. Demgemäß kann ein Mimetikum der Substanz (insbesondere wenn es sich dabei um ein Peptid handelt) zur pharmazeutischen Verwendung entworfen werden.
Das Design von Mimetika zu einer bekannten pharmazeutisch wirksamen Verbindung ist eine bekannte Vorgehensweise zur Entwicklung von Pharmazeutika, die auf einer "Leitverbindung" basieren. Dies kann wünschenswert sein, wenn das Synthetisieren der Wirkverbindung schwierig oder teuer ist oder wenn sie für ein bestimmtes Verabreichungsverfahren ungeeignet ist, z. B. reine Peptide sind ungeeignete Wirksubstanzen für oral verabreichte Verbindungen, da sie dazu neigen, von Proteasen im Verdauungstrakt schnell abgebaut zu werden. Design, Synthese und Testen von Mimetika werden im Allgemeinen angewendet, um zu vermeiden, willkürlich hohe Anzahlen von Molekülen nach einer Zieleigenschaft zu screenen.
Es gibt mehrere Schritte, die gewöhnlich beim Design eine Mimetikums aus einer Verbindung mit einer gegebenen Zieleigenschaft vorgenommen werden. Zunächst werden die bestimmten Teile der Verbindung, die beim Bestimmen der Zieleigenschaft kritisch und/oder wichtig sind, ermittelt. Im Fall eines Peptids kann dies durchgeführt werden, indem die Aminosäurereste im Peptid systematisch variiert werden, z. B. indem abwechselnd jeder Rest substituiert wird. Alanin-Scans des Peptids werden gewöhnlich angewendet, um solche Peptidmotive zu verfeinern. Diese Teile der Reste, die die aktive Region der Verbindung ausmachen, sind als deren "pharmakophore Gruppe" bekannt.
Sobald die pharmakophore Gruppe gefunden wurde, wird deren Struktur gemäß ihren physikalischen Eigenschaften, z. B. Stereochemie, Bindung, Größe und/oder Ladung, modelliert, wobei Daten von einer Reihe von Quellen, z. B. Spektroskopietechniken, Röntgenstreuungsdaten und NMR, verwendet werden. Eine Computeranalyse, Ähnlichkeitskartierung (die anstelle der Bindung zwischen Atomen die Ladung und/oder das Volumen einer pharmakophoren Gruppe modelliert) und andere Techniken können bei diesem Modellierungsvorgang angewendet werden.
In einer Variante dieser Vorgehensweise werden die dreidimensionale Struktur des Liganden und von dessen Bindungspartner modelliert. Dies kann insbesondere von Nutzen sein, wenn der Ligand und/oder Bindungspartner die Konformation bei der Bindung ändern, was ermöglicht, dass das Modell dies beim Design des Mimetikums berücksichtigt.
Dann wird ein Matrizenmolekül gewählt, auf das chemische Gruppen, die die pharmakophore Gruppe nachahmen, gepfropft werden können. Das Matrizemnolekül und die darauf gepfropften chemischen Gruppen können zweckmäßig gewählt werden, so dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, wahrscheinlich pharmakologisch unbedenklich ist und in vivo nicht abbaut, während die biologische Aktivität der Leitverbindung bewahrt wird. Alternativ, wenn das Mimetikum auf Peptid basiert, kann eine weitere Stabilität erzielt werden, indem das Peptid zyklisiert wird, wodurch seine Steifheit gesteigert wird. Das Mimetikum oder die Mimetika, das bzw. die mittels dieser Vorgehensweise gefunden wurden, können dann gescreent werden, um zu sehen, ob sie die Zieleigenschaft aufweisen oder zu welchem Ausmaß sie diese aufzeigen. Es kann dann eine weitere Optimierung oder Modifikation vorgenommen werden, um bei einem oder mehreren endgültigen Mimetika zur In-vivo- oder klinischen Prüfung anzugelangen.
Gebrauchsverfahren: Nukleinsäurediagnose und -diagnosekits
Um die Gegenwart eines KCNE1-Allels nachzuweisen, das bei einer Einzelperson eine Veranlagung für LQT schafft, wird eine biologische Probe, wie Blut, präpariert und auf die Gegenwart oder Abwesenheit von Empfänglichkeitsallelen von KCNE1 analysiert. Um die Gegenwart von LQT nachzuweisen oder als ein prognostischer Indikator, wird eine biologische Probe präpariert und auf die Gegenwart oder Abwesenheit von mutierten Allelen von KCNE1 analysiert. Die Ergebnisse dieser Testes werden zurück an den medizinischen Versorger zur Übermittlung an die getestete Einzelperson gesendet. Solche Diagnosen können von Diagnoselaboren durchgeführt werden oder alternativ werden Diagnosekits hergestellt und an medizinische Versorger oder an Privatpersonen zur Selbstdiagnose verkauft.
Anfänglich beinhaltet das Screeningverfahren die Amplifikation der relevanten KCNE1-Sequenzen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Screeningverfahren eine nicht auf PCR basierende Strategie. Zu solchen Screeningverfahren zählen in zwei Schritten ausgeführte Markeramplifikationsmethoden, die in der Technik wohl bekannt sind. Sowohl auf PCR als auch nicht auf PCR basierende Screeningstrategien können Zielsequenzen mit einem hohen Empfindlichkeitsgrad nachweisen.
Das populärste, heutzutage verwendete Verfahren ist die Targetamplifikation. Hierbei wird die Zielnukleinsäure mit Polymerasen amplifiziert. Ein besonders bevorzugtes Verfahren, das eine von Polymerasen angetriebene Amplifikation anwendet, ist die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR). Die Polymerase-Kettenreaktion und andere, von Polymerasen angetriebene Amplifikationsassays können mittels der Verwendung von von Polymerase angetriebenen Amplifikationszyklen eine mehr als millionenfache Erhöhung der Kopienzahl erreichen. Sobald sie amplifiziert wurde, kann die resultierende Nukleinsäure sequenziert oder als ein Substrat für DNA-Sonden verwendet werden.
Wenn die Sonden zum Nachweisen der Gegenwart der Zielsequenzen verwendet werden, kann die zu analysierende biologische Probe, wie Blut oder Serum, auf Wunsch behandelt werden, um die Nukleinsäuren zu extrahieren. Die Probennukleinsäure kann auf verschiedenerlei Art und Weise präpariert werden, um den Nachweis der Zielsequenz zu erleichtern, z. B. Denaturierung, Restriktionsverdau, Elektrophorese oder Dot-Blotting. Die targetierte Region der Analytnukleinsäure muss für gewöhnlich mindestens zum Teil einzelsträngig sein, um Hybride mit der Targeting-Sequenz der Sonde zu bilden. Wenn die Sequenz naturgemäß einzelsträngig ist, wird eine Denaturierung nicht erforderlich sein. Wenn die Sequenz jedoch doppelsträngig ist, muss die Sequenz möglicherweise denaturiert werden. Die Denaturierung kann mittels verschiedener in der Technik bekannter Techniken durchgeführt werden.
Die Analytnukleinsäure und die Sonde werden unter Bedingungen inkubiert, die eine stabile Hybridbildung der Zielsequenz in der Sonde mit der putativen targetierten Sequenz in dem Analyt begünstigen. Die Region der Sonden, die zum Binden an den Analyten verwendet wird, kann zu der targetierten Region des humanen Chromosoms 21 für KCNE1 vollständig komplementär gemacht werden. Folglich sind Bedingungen hoher Stringenz wünschenswert, um falsche Positive zu verhindern. Bedingungen hoher Stringenz werden jedoch nur angewendet, wenn die Sonden zu Regionen des Chromosoms komplementär sind, die in dem Genom einzigartig sind. Die Hybridisierungsstringenz wird von einer Reihe von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschvorgangs bestimmt, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Basenzusammensetzung, Sondenlänge und Formamidkonzentration. Diese Faktoren sind in beispielsweise Maniatis et al., 1982, und Sambrook et al., 1989, umrissen. Unter bestimmten Umständen kann die Bildung von Hybriden höherer Ordnung, wie Triplexen, Quadraplexen usw., erwünscht sein, um die Mittel zum Nachweisen von Zielsequenzen bereitzustellen.
Der Nachweis, wenn überhaupt, des resultierenden Hybrids wird für gewöhnlich mittels Verwendung markierter Sonden erzielt. Alternativ kann die Sonde unmarkiert sein, kann jedoch über die spezifische Bindung mit einem Liganden, der markiert ist, entweder direkt oder indirekt, nachweisbar sein. Geeignete Marker und Verfahren zum Markieren von Sonden und Liganden sind in der Technik bekannt und beinhalten beispielsweise radioaktive Marker, die mittels bekannter Verfahren (z. B. Nick-Translation, Polypriming oder Kinasieren) integriert werden können, Biotin, fluoreszierende Gruppen, chemilumineszierende Gruppen (z. B. Dioxetane, insbesondere getriggerte Dioxetane), Enzyme, Antikörper, Goldnanoteilchen und dergleichen. Variationen dieses grundlegenden Schemas sind in der Technik bekannt und beinhalten jene Variationen, die die Trennung der nachzuweisenden Hybride aus Fremdstoffen erleichtern und/oder das Signal von dem markierten Teil verstärken. Eine Reihe dieser Variationen werden in z. B. Matthews und Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mifflin, 1989; der US-Patentschrift 4,868,105 und in der EPO-Veröffentlichung Nr. 225,807 besprochen.
Wie oben angemerkt, werden auch nicht auf PCR basierende Screeningassays in dieser Erfindung erwogen. Dieser Vorgang hybridisiert eine Nukleinsäurensonde (oder ein Analogon, wie eine Methylphosphonat-Hauptkette, die den normalen Phosphodiester ersetzt) an das Low-Level-DNA-Ziel. Diese Sonde kann ein Enzym aufweisen, das kovalent mit der Sonde verknüpft ist, so dass die kovalente Verknüpfung nicht die Spezifität der Hybridisierung stört. Dieser Komplex aus Enzym/Sonden-Konjugat und Zielnukleinsäure kann dann von dem freien Sonden/Enzym-Konjugat weg isoliert werden und es wird ein Substrat zum Enzymnachweis zugegeben. Die enzymatische Aktivität wird als eine Veränderung der Farbentwicklung oder Lumineszenzausgabe, die in einem Anstieg der Empfindlichkeit von 103–106 resultiert. Zwecks eines Beispiels, das sich auf die Herstellung von Konjugaten aus Oligodesoxynukleotid und alkalischer Phosphatase und deren Verwendung als Hybridisierungssonden bezieht, siehe Jablonski et al. (1986).
In zwei Schritten ausgeführte Markeramplifikationsmethoden sind in der Technik bekannt. Diese Assays arbeiten auf dem Prinzip, dass ein kleiner Ligand (wie Digoxigenin, Biotin oder dergleichen) an einer Nukleinsäurensonde, die KCNE1 spezifisch binden kann, angebracht wird. Allelspezifische Sonden werden ebenfalls im Umfang dieses Beispiels in Erwägung gezogen und zu beispielhaften allelspezifischen Sonden zählen Sonden, die die eine Veranlagung schaffenden Mutationen dieser Patentanmeldung umfassen.
In einem Beispiel wird der kleine Ligand, der an der Nukleinsäurensonde angebracht ist, von einem Antikörper/Enzym-Konjugat spezifisch erkannt. In einer Ausführungsform dieses Beispiels wird Digoxigenin an der Nukleinsäurensonde angebracht. Die Hybridisierung wird mittels eines Konjugats aus Antikörper und alkalischer Phosphatase nachgewiesen, das einen Umschlag eines chemilumineszierenden Substrats bewirkt. Zwecks Verfahren zum Markieren von Nukleinsäurensonden gemäß dieser Ausführungsform siehe Martin et al., 1990. In einem zweiten Beispiel wird der kleine Ligand von einem zweiten Liganden/Enzym-Konjugat erkannt, das mit dem ersten Ligand spezifisch einen Komplex bilden kann. Eine wohl bekannte Ausführungsform dieses Beispiels ist die Biotin/Avidin-Art von Interaktionen. Zwecks Verfahren zum Markieren von Nukleinsäuresonden und deren Verwendung in auf Biotin/Avidin basierenden Assays siehe Rigby et al., 1977, und Nguyen et al., 1992.
Innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung wird ebenfalls in Betracht gezogen, dass die Nukleinsäurensondenassays dieser Erfindung einen Cocktail von Nukleinsäuren einsetzen werden, der KCNE1 nachweisen kann. Folglich wird in einem Beispiel zum Nachweisen der Gegenwart von KCNE1 in einer Zellprobe mehr als eine Sonde, die zu dem Gen komplementär ist, eingesetzt und ist die Anzahl unterschiedlicher Sonden insbesondere zwei, drei oder fünf unterschiedliche Nukleinsäurensondensequenzen. In einem anderen Beispiel wird zum Nachweisen der Gegenwart von Mutationen in der KCNE1-Gensequenz in einem Patienten mehr als eine Sonde, die zu diesen Genen komplementär ist, eingesetzt, wobei der Cocktail Sonden enthält, die an die allelspezifischen Mutationen binden können, die in Populationen von Patienten mit Veränderungen des KCNE1 identifiziert wurden. In dieser Ausführungsform kann eine beliebige Anzahl von Sonden verwendet werden und wird vorzugsweise Sonden beinhalten, die den bedeutenden Genmutationen entsprechen, die als in einer Einzelperson eine Veranlagung für LQT schaffend identifiziert wurden.
Gebrauchsverfahren: Peptiddiagnose und diagnosekits
Das Vorliegen von LQT kann auch auf Grundlage der Veränderung des Wildtyp-KCNE1-Polypeptids nachgewiesen werden. Solche Veränderungen können mittels einer Sequenzanalyse gemäß herkömmlicher Techniken ermittelt werden. Mehr bevorzugt werden Antikörper (polyklonal oder monoklonal) verwendet werden, um Unterschiede in oder die Abwesenheit von KCNE1-Peptiden nachzuweisen. Techniken zum Züchten und Reinigen von Antikörpern sind in der Technik wohl bekannt und beliebige derartige Techniken können gewählt werden, um die in dieser Erfindung beanspruchten Präparate zu erzielen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Antikörper KCNE1-Proteine aus Lösung immunpräzipitieren sowie mit diesen Proteinen auf Western- oder Immun-Blots mit Polyacrylamidgelen reagieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper KCNE1-Proteine in Paraffin oder gefrorenen Gewebeschnitten unter Anwendung von immunzytochemischen Techniken nachweisen.
Zu bevorzugten Ausführungsformen, die sich auf Verfahren zum Nachweisen von KCNE1 oder deren Mutationen beziehen, zählen enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA), immunoradiometrische Assays (IRMA) und immunenzymatische Assays (IEMA), einschließlich Sandwich-Assays unter Verwendung monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper. Beispielhafte Sandwich-Assays werden von David et al., in den US-Patentschriften Nr. 4,376,110 und 4,486,530 beschrieben.
Gebrauchsverfahren: Rationales Wirkstoffdesign
Das Ziel des rationalen Wirkstoffdesigns besteht darin, strukturelle Analoga von biologisch aktiven Polypeptiden von Interesse oder von kleinen Molekülen, mit denen sie interagieren (z. B. Agonisten, Antagonisten, Inhibitoren), zu produzieren, um Wirkstoffe zu gestalten, die beispielsweise aktivere oder stabilere Formen des Polypeptids sind oder die z. B. die Funktion eines Polypeptids in vivo verstärken oder stören. Siehe z. B. Hodgson, 1991. In einem Ansatz wird zunächst die dreidimensionale Struktur eines Proteins von Interesse (z. B. ein KCNE1-Polypeptid) mittels Röntgenkristallographie, mittels Computermodellierung oder am typischsten mittels einer Kombination von Vorgehensweisen bestimmt. Weniger häufig können nützliche Informationen in Bezug auf die Struktur eines Polypeptids über die Modellierung auf Grundlage der Struktur von homologen Proteinen erhalten werden. Ein Beispiel rationalen Wirkstoffdesigns ist die Entwicklung von HIV-Protease-Inhibitoren (Erickson et al., 1990). Darüber hinaus werden Peptide (z. B. ein KCNE1-Polypeptid) mittels eines Alanin-Scans analysiert (Wells, 1991). Bei dieser Technik wird ein Aminosäurerest durch Ala ersetzt und dessen Auswirkung auf die Aktivität des Peptids wird ermittelt. Jeder der Aminosäurereste des Peptids wird in dieser Art und Weise analysiert, um die wichtigen Regionen des Peptids zu bestimmen.
Es ist auch möglich, einen zielspezifischen Antikörper, der mittels eines funktionellen Assays ausgewählt wurde, zu isolieren und dann dessen Kristallstruktur aufzulösen. Im Prinzip liefert diese Vorgehensweise eine pharmakophore Gruppe, auf der das anschließende Wirkstoffdesign aufgebaut werden kann. Es ist möglich, die Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem antiidiotypische Antikörper (Anti-Ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt werden. Als ein Spiegelbild eines Spiegelbilds würde von der Bindungsstelle der Anti-Ids erwartet, dass sie ein Analogon des ursprünglichen Rezeptors ist. Der Antiid könnte dann zum Identifizieren und Isolieren von Peptiden aus Banken chemisch oder biologisch produzierter Banken von Peptiden verwendet werden. Ausgewählte Peptide würden dann als die pharmakophore Gruppe fungieren.
Folglich können Wirkstoffe entwickelt werden, die z. B. einer verbesserte KCNE1-Polypeptid-Aktivität oder -Stabilität aufweisen oder die als Inhibitoren, Agonisten, Antagonisten usw. der KCNE1-Polypeptid-Aktivität fungieren. Dank der Verfügbarkeit klonierter KCNE1-Sequenzen können ausreichende Mengen des KCNE1-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus wird die Kenntnis der hierin bereitgestellten KCNE1-Proteinsequenzen jene leiten, die Computermodellierungstechniken anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie einzusetzen.
Gebrauchsverfahren: Gentherapie
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Versehen einer Zelle, die ein mutiertes KCNE1-Allel trägt, mit einer Wildtyp-KCNE1-Funktion bereitgestellt. Das Versehen mit einer solchen Funktion sollte ein normales Funktionieren der Empfängerzellen ermöglichen. Das Wildtyp-Gen oder ein Teil des Gens kann in einem Vektor in die Zelle eingeführt werden, so dass das Gen extrachromosomal bleibt. In einer solchen Situation wird das Gen von der Zelle aus dem extrachromosomalem Ort exprimiert. Mehr bevorzugt ist die Situation, in der das Wildtyp-Gen oder ein Teil davon derart in die mutierte Zelle eingeführt wird, dass sie sich mit dem endogenen mutierten Gen, das in der Zelle vorliegt, rekombiniert. Eine solche Rekombination bedingt ein Doppelrekombinationsereignis, das in der Korrektur der Genmutation resultiert. Vektoren zur Einführung von Genen sowohl zur Rekombination und zur extrachromosomalen Bewahrung sind in der Technik bekannt und ein beliebiger geeigneter Vektor kann verwendet werden. Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie Elektroporation, Kalziumphosphatkopräzipitation und Virustransduktion, sind in der Technik bekannt und die Wahl des Verfahrens liegt innerhalb der Kompetenz des Praktikers.
Wie im Allgemeinen oben erörtert wird, kann das KCNE1-Gen oder -Fragment, soweit anwendbar, in Gentherapieverfahren eingesetzt werden, um die Menge der Expressionsprodukte eines solchen Gens in Zellen zu erhöhen. Es kann auch von Nutzen sein, das Niveau der Expression eines gegebenen LQT-Gens sogar in jenen Herzzellen zu erhöhen, in denen das mutierte Gen in einem "normalen" Niveau exprimiert wird, das Genprodukt ist jedoch nicht vollständig funktionell.
Gentherapie würde gemäß allgemein anerkannten Verfahren durchgeführt werden, wie von Friedman (1991) oder Culver (1996) beschrieben. Zellen von einem Patienten würden zunächst mittels der oben beschriebenen Verfahren analysiert werden, um die Produktion von KCNE1-Polypeptid in den Zellen festzustellen. Ein Virus- oder Plasmidvektor (siehe weitere Einzelheiten im Folgenden), der eine Kopie des KCNE1-Gens enthält, die mit Expressionskontrollelementen verknüpft ist und in den Zellen replizieren kann, wird hergestellt. Der Vektor kann dazu in der Lage sein, in den Zellen zu replizieren. Alternativ kann der Vektor replikationsdefizient sein und wird in Helferzellen zur Verwendung in der Gentherapie repliziert. Geeignete Vektoren sind bekannt, wie in der US-Patentschrift 5,252,479 und der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 93/07282 und den US-Patentschriften Nr. 5,691,198; 5,747,469; 5,436,146 und 5,753,500 offenbart. Der Vektor wird dann in den Patienten injiziert. Falls das transfizierte Gen nicht permanent in das Genom jeder der targetierten Zellen integriert ist, muss die Behandlung möglicherweise periodisch wiederholt werden.
In der Technik bekannte Gentransfersysteme können bei der Ausübung der Gentherapieverfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein. Zu diesen zählen virale und nichtvirale Transferverfahren. Eine Reihe von Viren sind als Gentransfervektoren oder als Basis zum Reparieren von Gentransfervektoren verwendet werden, einschließlich Papovaviren (z. B. SV40, Madzak et al., 1992), Adenovirus (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia und Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson und Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998), Vakziniavirus (Moss, 1992; Moss, 1996), adenoassoziiertes Virus (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell und Hirata, 1998), Herpesviren, einschließlich HSV und EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield und Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996), Lentiviren (Naldini et al., 1996), Sindbis- und Semliki-Forest-Virus (Berglund et al., 1993) und Retroviren des Vogels (Bandyopadhyay und Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), der Maus (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann und Baltimore, 1985; Miller et al., 1988) und menschlichen Ursprungs (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher und Panganiban, 1992). Die meisten Protokolle der Gentherapie am Menschen basierten auf deaktivierten Retroviren der Maus, obgleich auch Adenovirus und adenoassoziiertes Virus verwendet werden.
Zu in der Technik bekannten nichtviralen Gentransferverfahren zählen chemische Techniken wie Kalziumphosphatpräzipitation (Graham und van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); mechanische Techniken, beispielsweise Mikroinjektion (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Costantini und Lacy, 1981); membranfusionsvermittelter Transfer mittels Liposomen (Felgner et al., 187; Wang und Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991) und direkte DNA-Aufnahme und rezeptorvermittelter DNA-Transfer (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992; Curiel et al., 1991). Virusvermittelter Gentransfer kann mit direktem In-vivo-Gentransfer unter Anwendung von Liposomabgabe kombiniert werden, was ermöglicht, die Virusvektoren zu den Tumorzellen zu leiten und nicht in die umgebenden, sich nicht teilenden Zellen. Alternativ kann die Retrovirusvektorproduzentenzelllinie in Tumore injiziert werden (Culver et al., 1992). Die Injektion von Produzentenzellen würde dann eine kontinuierliche Quelle von Vektorteilchen bereitstellen. Diese Technik wurde zur Verwendung in Menschen mit inoperablen Hirntumoren zugelassen.
In einer Vorgehensweise, die biologische und physikalische Gentransferverfahren kombiniert, wird Plasmid-DNA einer beliebigen Größe mit einem mit Polylysin konjugierten Antikörper, der für das Adenovirushexonprotein spezifisch ist, kombiniert und der resultierende Komplex wird an einen Adenovirusvektor gebunden. Der trimolekulare Komplex wird dann zum Infizieren von Zellen verwendet. Der Adenovirusvektor ermöglicht eine effiziente Bindung, eine effiziente Internalisierung und einen effizienten Abbau des Endosoms, bevor die gekoppelte DNA beschädigt wird. Zwecks anderer Techniken zur Abgabe von adenovirusbasierten Vektoren siehe Schneider et al. (1998) und die US-Patentschriften Nr. 5,691,198; 5,747,469; 5,436,146 und 5,753,500.
Von Liposom/DNA-Komplexen wurde gezeigt, dass sie einen direkten In-vivo-Gentransfer vermitteln können. Während in Standardliposompräparaten der Gentransfervorgang unspezifisch ist, wurde in Tumorablagerungen von lokalisierter In-vivo-Aufnahme und Expression berichtet, beispielsweise nach direkter In-situ-Verabreichung (Nabel, 1992).
Expressionsvektoren im Zusammenhang mit der Gentherapie sollen jene Konstrukte beinhalten, die Sequenzen enthalten, die zum Exprimieren eines Polynukleotids, das darin kloniert wurde, ausreichen. In viralen Expressionsvektoren enthält das Konstrukt Virussequenzen, die zum Unterstützen der Verpackung des Konstrukts ausreichen. Wenn das Polynukleotid KCNE1 kodiert, wird die Expression KCNE1 hervorbringen. Wenn das Polynukleotid ein Antisense-Polynukleotid oder ein Ribozym kodiert, wird die Expression das Antisense-Polynukleotid oder das Ribozym hervorbringen. Folglich erfordert die Expression in diesem Zusammenhang nicht, dass ein Proteinprodukt synthetisiert wird. Neben dem Polynukleotid, das in den Expressionsvektor kloniert wird, enthält der Vektor außerdem einen Promotor, der in eukaryontischen Zellen funktionell ist. Die klonierte Polynukleotidsequenz steht unter der Kontrolle dieses Promotors. Zu geeigneten eukaryontischen Promotoren zählen die oben beschriebenen. Der Expressionsvektor kann Sequenzen enthalten, wie selektierbare Marker und andere hierin beschriebene Sequenzen.
Gentransfertechniken, die DNA direkt zum Herzgewebe lenken, sind bevorzugt. Rezeptorvermittelter Gentransfer beispielsweise wird mittels der Konjugation von DNA (für gewöhnlich in der Form kovalent geschlossenen, superspiralisierten Plasmids) an einen Proteinliganden über Polylysin durchgeführt. Die Liganden werden auf Grundlage der Gegenwart entsprechender Ligandenrezeptoren auf der Zelloberfläche der Zielzellen-/Zielgewebeart gewählt. Diese Liganden/DNA-Konjugate können auf Wunsch direkt in das Blut injiziert werden und werden zum Zielgewebe geleitet, an dem die Rezeptorbindung und Internalisierung des Komplexes aus DNA und Protein erfolgt. Um das Problem der intrazellulären Zerstörung von DNA zu überwinden, kann die Koinfizierung mit Adenovirus eingebunden werden, um die Endosomfunktion zu stören.
Die Therapie gestaltet sich wie folgt: Patienten, die ein KCNE1-Empfänglichkeitsallel tragen, werden mit einem Genabgabehilfsmittel behandelt, so dass ein Teil oder alle ihrer Herzvorläuferzellen mindestens eine weitere Kopie eines funktionellen normalen KCNE1-Allels erhalten. In diesem Schritt weisen die behandelten Einzelpersonen ein verringertes LQT-Risiko zu dem Grad auf, dass dem Effekt des empfänglichen Allels durch die Gegenwart des normalen Allels entgegengewirkt wird.
Gebrauchsverfahren: Peptidtherapie
Peptide, die KCNE1-Aktivität aufweisen, können Zellen zugeführt werden, die ein mutiertes oder fehlendes KCNE1-Allel tragen. Protein kann mittels Expression der cDNA-Sequenz in Bakterien produziert werden, beispielsweise unter Verwendung bekannter Expressionsvektoren. Alternativ kann KCNE1-Polypeptid aus KCNE1 produzierenden Säugerzellen extrahiert werden. Darüber hinaus können die Techniken der synthetischen Chemie zum Synthetisieren von KCNE1-Protein eingesetzt werden. Eine beliebige solcher Techniken kann das Präparat der vorliegenden Erfindung bereitstellen, das das KCNE1-Protein umfasst. Das Präparat ist im Wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen. Dies wird am leichtesten mittels Synthese in einem Mikroorganismus oder in vitro erreicht.
Aktive KCNE1-Moleküle können beispielsweise mittels Mikroinjektion oder durch Verwendung von Liposomen in Zellen eingeführt werden. Alternativ können einige aktive Moleküle von Zellen aufgenommen werden, aktiv oder durch Diffusion. Das Versehen von Molekülen mit KCNE1-Aktivität sollte zu einer teilweisen Umkehr von LQT führen. Andere Moleküle mit KCNE1-Aktivität (beispielsweise Peptide, Wirkstoffe oder organische Verbindungen) können ebenfalls verwendet werden, um eine solche Umkehr zu bewirken. Modifizierte Polypeptide mit im Wesentlichen ähnlicher Funktion werden ebenfalls zur Peptidtherapie verwendet.
Gebrauchsverfahren: Transformierte Wirte
Tiere zum Testen von Therapeutika können nach der Mutagenese von ganzen Tieren oder nach Behandlung von Keimbahnzellen oder Zygoten ausgewählt werden. Zu solchen Behandlungen zählen die Insertion von mutierten KCNE1-Allelen, für gewöhnlich von einer zweiten Tierspezies, sowie die Insertion von unterbrochenen homologen Genen. Alternativ kann das endogene KCNE1-Gen der Tiere mittels Insertions- oder Deletionsmutation oder andere genetische Veränderungen unter Anwendung herkömmlicher Techniken unterbrochen werden (Capecchi, 1989; Valancius und Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992). Nachdem den Tieren Testsubstanzen verabreicht wurden, muss die Gegenwart von LQT bewertet werden. Wenn die Testsubstanz das Auftreten von LQT verhindert oder unterdrückt, ist die Testsubstanz ein Kandidatentherapeutikum zur Behandlung von LQT. Diese Tiermodelle stellen ein äußerst wichtiges Prüfmittel für potentielle therapeutische Produkte bereit.
Hierin wurden zwei Strategien genutzt, um LQT-Gene zu identifizieren, ein Kandidatengen-Ansatz und Positionsklonierung. Positionsinformationen stehen nun für drei LQT-Loci zur Verfügung, wobei LQT1 auf das Chromosom 11p15.5 (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b), LQT2 auf 7g35–36 und LQT3 auf 3p21-24 (Jiang et al., 1994) kartiert wurde. Die vorliegende Erfindung hat außerdem minK, auf dem Chromosom 21, als ein LQT-Gen identifiziert. Der Kandidatengen-Ansatz beruht auf wahrscheinlichen mechanistischen Hypothesen, die auf der Physiologie basieren. Obwohl nur wenig über die Physiologie von LQT bekannt ist, wird die Erkrankung mit der Verlängerung des QT-Intervalls auf Elektrokardiogrammen, ein Zeichen abnormer kardialer Repolarisation, assoziiert. Diese Assoziierung legt nahe, dass Gene, die Innenkanäle kodieren, oder ihre Modulatoren angemessene Kandidaten für LQT sind. Diese Hypothese wird nun von der Entdeckung unterstützt, dass mit Chromosom 7 verknüpftes LQT aus Mutationen in HERG, einem putativen kardialen Kaliumkanalgen, resultiert. Ein neuroendokrines Kalziumkanalgen (CACNL1A2; Chin et al., 1991; Seino et al., 1992) und ein Gen, das ein GTP bindendes Protein kodiert, das Kaliumkanäle moduliert (GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al., 1992), wurden auf Grundlage ihrer chromosomalen Position zu Kandidaten für LQT3. Anschließende Kopplungsanalysen haben diese Gene jedoch ausgeschlossen. Es wurde jetzt gezeigt, dass LQT3 mit SCNSA assoziiert ist (Wang et al., 1995a). Trotz erheblicher Bemühungen war ein Kandidatengen-Ansatz in Bezug auf das mit Chromosom 11 verknüpfte LQT nicht erfolgreich. Zwei Kaliumkanalgene (KCNA4 und KCNC1) wurden auf den kurzen Arm des Chromosoms 11 kartiert (Wymore et al., 1994), beide wurden jedoch mittels Kopplungsanalyse als Kandidaten für LQT1 ausgeschlossen (Russell et al., 1995; die vorliegende Studie). Alle anderen zuvor charakterisierten kardialen Kalium-, Chlorid-, Natrium- und Kalziumkanalgene wurden in ähnlicher Weise auf Grundlage ihrer chromosomalen Position ausgeschlossen. Die vorliegende Studie hat zum Identifizieren von LQT1 Positionsklonierungs- und Mutationsanalysen angewendet.
Die vorliegende Erfindung hat Genotypanalysen verwendet, um zu zeigen, dass KVLQT1 mit LQT1 in 16 nicht miteinander verwandten Familien eng verbunden ist (Einzelheiten in den Beispielen bereitgestellt). KVLQT1 ist ein putatives kardiales Kaliumkanalgen und verursacht die mit Chromosom 11 verknüpfte Form von LQT. Genetische Analysen legten nahe, dass KVLQT1 einen spannungsgesteuerten Kaliumkanal mit funktioneller Bedeutung bei der kardialen Repolarisation kodiert, und es wurde jetzt gezeigt, dass KVLQT1 sich mit KCNE1 zusammenlagert, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden. Falls dies korrekt ist, beinhaltet der Mechanismus des mit Chromosom 11 verknüpften LQT wahrscheinlich einen verringerten repolarisierenden KVLQT1-Strom. Da von Kaliumkanälen mit sechs Transmembrandomänen geglaubt wird, dass sie aus Homo- oder Heterotetrameren gebildet werden (MacKinnon, 1991; MacKinnon et al., 1993; Covarrubias et al., 1991), ist es möglich, dass mit LQT assoziierte Mutationen von KVLQT1 durch einen dominant-negativen Mechanismus agieren. Die Art und die Position von hier beschriebenen KVLQT1-Mutationen stimmen mit dieser Hypothese überein. Die resultierende Unterdrückung der Kaliumkanalfunktion würde wiederum wahrscheinlich zu einer abnormen kardialen Repolarisation und einem erhöhten Risiko für ventrikuläre Tachyarrhythmien führen. Die in HERG identifizierten Mutationen und die Biophysik von Kaliumkanal-alpha-Untereinheiten legen nahe, dass das mit Chromosom 7 verknüpfte LQT aus dominant-negativen Mutationen und einer daraus resultierenden Verringerung der funktionellen Kanäle resultiert. Im Gegensatz dazu ist es im mit Chromosom 3 verknüpften LQT wahrscheinlich, dass die mit LQT assoziierten Deletionen, die in SCNSA identifiziert wurden, in funktionellen kardialen Natriumkanälen mit veränderten Eigenschaften, wie einer verzögerten Inaktivierung oder einer veränderten Spannungsabhängigkeit der Kanalinaktivierung, resultieren. Eine verzögerte Natriumkanalinaktivierung würde den nach innen gerichteten Natriumstrom erhöhen, wodurch die Membran depolarisiert wird. Dieser Effekt ist dem veränderten Membranpotential ähnlich, das von HERG-Mutationen erwartet wird, wobei der nach außen gerichtete Kaliumstrom reduziert wird. Es ist unwahrscheinlich, dass stärker schädigende Mutationen von SCNSA LQT verursachen würden. Es würde beispielsweise von einer Verringerung der Gesamtzahl kardialer Natriumkanäle erwartet, dass diese die Aktionspotentialdauer verkürzt, ein zu dem von LQT gegenteiliger Phänotyp.
Eine präsymptomatische Diagnose von LQT hing von der Identifizierung der QT-Verlängerung auf Elektrokardiogrammen ab. Unglücklicherweise werden Elektrokardiogramme selten an jungen, gesunden Einzelpersonen vorgenommen. Darüber hinaus weisen viele LQT-Gen-Träger verhältnismäßig normale QT-Intervalle auf und das erste Krankheitsanzeichen kann eine fatale Herzrhythmusstörung sein (Vincent et al., 1992). Jetzt, da mehr LQT-Gene (KVLQT1 und KCNE1) identifiziert und mit LQT assoziiert wurden, kann eine genetische Prüfung auf diese Erkrankung in Betracht gezogen werden. Dies wird fortgesetzte Mutationsanalysen und die Identifizierung weiterer LQT-Gene erfordern. Mit stärker detaillierten Phänotypanalysen können phänotypische Unterschiede zwischen den verschiedenen Formen von LQT entdeckt werden. Diese Unterschiede können zur Diagnose und Behandlung von Nutzen sein.
Die Identifizierung der Assoziierung zwischen den KVLQT1- und KCNE1-Genmutationen und LQT ermöglicht das frühe präsymptomatische Screenen von Einzelpersonen, um jene mit einem Risiko der Entwicklung von LQT zu identifizieren. Um solche Einzelpersonen zu identifizieren, werden die KCNE1-Allele entweder direkt oder nach Klonieren der Allele nach Mutationen gescreent. Die Allele werden auf die Gegenwart von Nukleinsäuresequenzunterschieden von dem normalen Allel geprüft, wobei eine beliebige geeignete Technik angewendet wird, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, eines der folgenden Verfahren: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern-Blot-Analyse, Einzelstrang-Konformationsanalyse (single stranded conformation analysis, SSCA), Kopplungsanalyse, RNAse-Schutzassay, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse und PCR-SSCP. Ebenfalls geeignet ist die jüngst entwickelte Technik der DNA-Mikrochip-Technologie. Zum Beispiel werden entweder (1) die Nukleotidsequenz sowohl der klonierten Allele als auch des normalen KCNE1-Gens oder adäquaten Fragments (kodierende Sequenz oder genomische Sequenz) bestimmt und dann verglichen oder (2) die RNA-Transkripte des KCNE1-Gens oder -Genfragments an einzelsträngige vollständige genomische DNA von einer zu testenden Einzelperson hybridisiert und der resultierende Heteroduplex wird mit Ribonuclease A (RNase A) behandelt und auf einem denaturierenden Gel laufen gelassen, um die Position etwaiger Fehlpaarungen nachzuweisen. Zwei dieser Verfahren können gemäß den folgenden Vorgehensweisen ausgeführt werden.
Die Allele des KCNE1-Gens in einer zu testenden Einzelperson werden unter Anwendung herkömmlicher Techniken kloniert. Beispielsweise wird eine Blutprobe von einer Einzelperson genommen. Die aus den Zellen in dieser Probe isolierte genomische DNA wird zu einer durchschnittlichen Fragmentgröße von ungefähr 20 kb zum Teil verdaut. Fragmente in diesem Bereich von 18–21 kb werden isoliert. Die resultierenden Fragmente werden in einen adäquaten Vektor ligiert. Dann werden die Sequenzen der Klone bestimmt und mit dem normalen KCNE1-Gen verglichen.
Alternativ werden Polymerase-Kettenreaktionen (polymerase chain reactions, PCRs) mit Primerpaaren für die 5'-Region oder die Exons des KCNE1-Gens durchgeführt. PCRs können auch mit Primerpaaren durchgeführt werden, die auf einer beliebigen Sequenz des normalen KCNE1-Gens basieren. Beispielsweise können Primerpaare für eines der Introns hergestellt und genutzt werden. Schließlich kann auch eine RT-PCR an der mRNA durchgeführt werden. Die amplifizierten Produkte werden dann mittels Einzelstrang-Konformations-Polymorphismen (single-stranded conformation polymorphisms, SSCP) unter Anwendung herkömmlicher Techniken analysiert, um etwaige Unterschiede zu identifizieren, und diese werden anschließend sequenziert und mit der normalen Gensequenz verglichen.
Einzelpersonen können schnell auf gemeinsame KCNE1-Genvarianten gescreent werden, indem die DNA der Einzelperson unter Verwendung geeigneter Primerpaare amplifiziert und das amplifizierte Produkt analysiert wird, z. B. mittels Dot-Blot-Hybridisierung unter Verwendung allelspezifischer Oligonukleotidsonden.
Das zweite Verfahren setzt RNase A ein, um beim Nachweis von Unterschieden zwischen dem normalen KCNE1-Gen und defekten Genen zu helfen. Dieser Vergleich wird in Schritten unter Verwendung kleiner (~ 500 bp) Restriktionsfragmente des KCNE1-Gens als der Sonde durchgeführt. Zunächst wird das KCNE1-Gen mit einem Restriktionsenzym bzw. Restriktionsenzymen verdaut, das bzw. die die Gensequenz in Fragmente von ungefähr 500 bp schneidet. Diese Fragmente werden auf einem Elektrophoresegel getrennt, von dem Gel gereinigt und einzeln in beiden Ausrichtungen in einen SP6-Vektor (z. B. pSP64 oder pSP65) kloniert. Die auf SP6 basierenden Plasmide, die Inserts der KCNE1-Genfragmente enthalten, werden in vitro unter Verwendung des SP6-Transkriptionssystems, das in der Technik wohl bekannt ist, in der Gegenwart von [α-32P]GTP transkribiert, wodurch radiomarkierte RNA-Transkripte beider Stränge des Gens erzeugt werden.
Diese RNA-Transkripte werden individuell verwendet, um Heteroduplexe mit der allelischen DNA unter Anwendung herkömmlicher Techniken zu bilden. Fehlpaarungen, die in dem RNA:DNA-Heteroduplex aufgrund von Sequenzunterschieden zwischen dem KCNE1-Fragment und dem KCNE1-Allelsubklon von der Einzelperson auftreten, resultieren in der Spaltung in dem RNA-Strang, wenn er mit RNase A behandelt wird. Solche Fehlpaarungen können die Folge von Punktmutationen oder kleinen Deletionen im Allel der Einzelperson sein. Die Spaltung des RNA-Strangs ergibt zwei oder mehr kleine RNA-Fragmente, die auf dem denaturierenden Gel schneller als die RNA-Sonde selbst laufen.
Etwaige Unterschiede, die gefunden werden, werden eine Einzelperson als eine molekulare Variante des KCNE1-Gens und der daraus folgenden Gegenwart von Long-QT-Syndrom aufweisend identifizieren. Diese Varianten können eine Reihe von Formen annehmen. Die schwerwiegendsten Formen wären Rasterverschiebungsmutationen oder große Deletionen, die bewirken würden, dass das Gen für ein anomales Protein oder eines, das die Proteinexpression wesentlich verändern würde, kodiert. Weniger schwerwiegende disruptive Mutationen würden kleine Deletionen innerhalb des Rasters und nicht konservative Basenpaarsubstitutionen beinhalten, die eine beträchtliche Auswirkung auf das produzierte Protein haben würden, wie Änderung zu oder von einem Cysteinrest, von einer basischen zu einer sauren Aminosäure oder umgekehrt, von einer hydrophoben zu einer hydrophilen Aminosäure oder umgekehrt oder andere Mutationen, die die sekundäre oder tertiäre Proteinstruktur beeinträchtigen würden. Von stillen Mutationen oder den in konservativen Aminosäuresubstitutionen resultierenden würde im Allgemeinen nicht erwartet, dass sie die Proteinfunktion stören.
Eine genetische Prüfung wird Praktikern ermöglichen, Einzelpersonen mit einem LQT-Risiko bei oder sogar vor der Geburt zu identifizieren. Eine präsymptomatische Diagnose von LQT wird eine Prävention dieser Erkrankungen ermöglichen. Existierende medizinische Therapien, einschließlich beta-Adrenolytika, können das Einsetzen von Problemen, die mit der Erkrankung assoziiert sind, verhindern und verzögern. Schließlich verändert diese Erfindung unser Verständnis der Ursache und Behandlung gewöhnlicher Herzerkrankungen, wie Herzrhythmusstörungen, die 11% aller natürlichen Tode ausmachen. Existierende Diagnose hat sich auf das Messen des QT-Intervalls von Elektrokardiogrammen konzentriert. Dieses Verfahren ist kein vollkommen akkurater Indikator auf das Vorliegen von Long-Qt-Syndrom. Die vorliegende Erfindung ist ein akkuraterer Indikator auf das Vorliegen der Erkrankung. Genetische Prüfung und ein verbessertes mechanistisches Verständnis von LQT liefern mittels rationaler Therapien die Möglichkeit zur Verhinderung von lebensbedrohlichen Arrhythmien. Es ist beispielsweise möglich, dass den Kaliumkanal öffnende Agentien das Risiko von Arrhythmien in Patienten mit KCNE1-Mutationen verringern werden; den Natriumkanal blockierende Agentien können dahingegen eine wirksamere Behandlung für Patienten mit Mutationen, die die Funktion von SCNSA verändern, darstellen. Schließlich können diese Studien einen Einblick in Mechanismen gewähren, die gewöhnlichen Arrhythmien zugrunde liegen, da diese Arrhythmien oftmals mit anomaler kardialer Repolarisation assoziiert sind und aus einer Kombination von ererbten und erworbenen Faktoren resultieren.
Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichungswege
Die KCNE1-Polypeptide, -Antikörper, -Peptide und Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Mischungstechniken hergestellt werden. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA). Die Zusammensetzung kann den Wirkstoff oder pharmazeutisch unbedenkliche Salze des Wirkstoffs enthalten. Diese Zusammensetzungen können neben einer der Wirksubstanzen ein pharmazeutisch unbedenkliches Hilfsmittel, einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger, einen pharmazeutisch unbedenklichen Puffer, einen pharmazeutisch unbedenklichen Stabilisator oder andere in der Technik wohl bekannte Stoffe umfassen. Solche Stoffe sollten ungiftig sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkbestandteils nicht beeinträchtigen. Der Träger kann eine große Vielfalt von Formen annehmen, je nach der Herstellungsform, die zur Verabreichung, z. B. intravenös, oral, intrathekal, epineural oder parenteral, erwünscht ist.
Zur oralen Verabreichung können die Verbindungen in feste oder flüssige Präparate formuliert werden, wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen, Schmelzmassen, Pulver, Suspensionen oder Emulsionen. Beim Herstellen der Zusammensetzungen in oraler Dosisform kann ein beliebiges der üblichen pharmazeutischen Medien eingesetzt werden, wie beispielsweise Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Geschmackstoffe, Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Suspensionsmittel und dergleichen im Fall von oralen flüssigen Präparaten (wie beispielsweise Suspensionen, Elixieren und Lösungen); oder Träger wie Stärken, Zucker, Verdünnungsmittel, Granuliermittel, Gleitmittel, Bindemittel, Sprengmittel und dergleichen im Fall von oralen festen Präparaten (wie beispielsweise Pulvern, Kapseln und Tabletten). Aufgrund ihrer einfachen Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die vorteilhafteste orale Dosierungseinheitsform dar, wobei in diesem Fall offensichtlich feste pharmazeutische Träger eingesetzt werden. Auf Wunsch können mittels Standardtechniken Tabletten dragiert oder magensaftresistent überzogen werden. Der Wirkstoff kann eingekapselt werden, um ihn gegenüber der Passage durch den Magen-Darm-Trakt stabil zu machen, wobei gleichzeitig die Passage durch die Blut-Hirn-Schranke ermöglicht wird. Siehe beispielsweise WO 96/11698.
Zur parenteralen Verabreichung kann die Verbindung in einem pharmazeutischen Träger gelöst und als entweder eine Lösung oder eine Suspension verabreicht werden. Veranschaulichend für geeignete Träger sind Wasser, Kochsalzlösung, Dextroselösungen, Fruktoselösungen, Ethanol oder Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs. Der Träger kann auch andere Bestandteile enthalten, beispielsweise Konservierungsstoffe, Suspensionsmittel, Löslichkeitsverbesserer, Puffer und dergleichen. Wenn die Verbindungen intrathekal verabreicht werden, können sie auch in Hirnflüssigkeit gelöst werden.
Der Wirkstoff wird vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht werden. Die tatsächliche verabreichte Menge und die Häufigkeit und der Zeitablauf der Verabreichung werden von der Beschaffenheit und Schwere des behandelten Zustands abhängen. Die Verschreibung einer Behandlung, z. B. Entscheidungen in Bezug auf die Dosierung, den Zeitplan usw., liegen innerhalb der Verantwortung von allgemeinen Ärzten oder Spezialisten und berücksichtigt in der Regel die zu behandelnde Erkrankung, den Zustand des individuellen Patienten, die Stelle der Gabe, das Verabreichungsverfahren und andere Praktikern bekannte Faktoren. Beispiele von Techniken und Protokolle lassen sich in Remington's Pharmaceutical Sciences finden.
Alternativ können Targetingtherapien angewendet werden, um den Wirkstoff spezifischer an bestimmte Zelltypen abzugeben, mittels Verwendung von Targetingsystemen wie Antikörpern oder zellspezifischen Liganden. Das Targeting kann aus einer Vielfalt von Gründen wünschenswert sein, z. B. wenn der Wirkstoff unannehmbar toxisch ist oder wenn er ansonsten eine zu hohe Dosierung bedingen würde oder wenn er ansonsten nicht dazu in der Lage wäre, in die Zielzellen einzudringen.
Anstelle der direkten Verabreichung dieser Wirkstoffe könnten sie in der Zielzelle produziert werden, z. B. in einem viralen Vektor, wie oben beschrieben, oder in einem zellbasierten Abgabesystem, wie in der US-Patentschrift Nr. 5,550,050 und den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO 92/19195, WO 94/25503, WO 95/01203, WO 95/05452, WO 96/02286, WO 96/02646, WO 96/40871, WO 96/40959 und WO 97/12635 beschrieben, die zur Einpflanzung in einen Patienten konzipiert ist. Der Vektor könnte auf die zu behandelnden spezifischen Zellen gerichtet werden oder er könnte regulatorische Elemente enthalten, die für die Zielzellen gewebespezifischer sind. Das zellbasierte Abgabesystem ist darauf konzipiert, an der gewünschten Zielstelle in den Körper eines Patienten eingepflanzt zu werden, und enthält eine kodierende Sequenz für den Wirkstoff. Alternativ könnte der Wirkstoff in einer Vorläuferform zur Umwandlung in die aktive Form durch ein Aktivierungsmittel, das in den zu behandelnden Zellen produziert oder auf diese gerichtet wird, verabreicht werden. Siehe beispielsweise EP 425,731A und WO 90/07936.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter ausführlich dargestellt, die zur Veranschaulichung geboten werden und die Erfindung in keinerlei Weise einschränken sollen. In der Technik wohl bekannte Standardtechniken oder die im Folgenden spezifisch beschriebenen Techniken werden eingesetzt.
BEISPIEL 1
Verfahren zur Phänotypauswertung
Für diese Studien wurden sechs große LQT-Kindreds (K1532, K1723, K2605, K1807, K161 und K162) sowie einige kleine Kindreds und sporadische Fälle untersucht. LQT-Patienten wurden aus medizinischen Kliniken überall in Nordamerika und Europa identifiziert. Zwei Faktoren wurden für die Phänotypisierung berücksichtigt: historische Daten (das Vorliegen von Synkope, die Anzahl synkopischer Episoden, das Vorliegen von Anfällen, das Alter beim Einsetzen von Symptomen und das Auftreten plötzlichen Todes) und 2) das QT-Intervall auf Elektrokardiogrammen, die in Bezug auf die Herzfrequenz korrigiert wurden (QTc) (Bazzett, 1920). Um eine Fehleinstufung von Einzelpersonen zu vermeiden, wurde derselbe konservative Ansatz zur phänotypischen Zuordnung, der in vorherigen Studien erfolgreich war, angewendet (Keating et al., 1991 a; Keating et al., 1991b; Jiang et al., 1994). Von jeder Einzelperson oder deren Vormündern wurde gemäß den Richtlinien der örtlichen Aufsichtsbehörde eine informierte Einwilligung eingeholt. Die Phänotypdaten wurden ohne Kenntnis des Genotyps ausgelegt. Symptomatische Einzelpersonen mit einem korrigierten QT-Intervall (QTc) von 0,45 Sekunden oder mehr und asymptomatische Einzelpersonen mit einem QTc von 0,47 Sekunden oder mehr wurden als betroffen klassifiziert. Asymptomatische Einzelpersonen mit einem QTc von 0,41 Sekunden oder weniger wurden als unbetroffen klassifiziert. Asymptomatische Einzelpersonen mit einem QTc zwischen 0,41 und 0,47 Sekunden und symptomatische Einzelpersonen mit einem QTc von 0,44 Sekunden oder weniger wurden als ungewiss klassifiziert.
BEISPIEL 2
Gendiagnose und Kopplungssanalyse
Genomische DNA wurde aus Lymphozyten des peripheren Bluts oder Zelllinien, die von durch den Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphozyten abgeleitet wurden, präpariert (Anderson und Gusella, 1984). Für genotypische Analysen wurden vier kleine Tandem Repeat (STR) Polymorphismen verwendet, die zuvor auf das Chromosom 11p15.5 kartiert wurden: D11S922, TH, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994).
Die Gendiagnose von RFLP-Markern (HRAS1, D11S454 und D11S12) wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Keating et al., 1991 a).
Eine paarweise Kopplungsanalyse wurde unter Verwendung von MLINK in LINKAGE v5.1 durchgeführt (Lathrop et al., 1985). Es wurden angenommene Werte von 0,90 für die Penetranz und 0,001 für die LQT-Genfrequenz verwendet. Von der Genfrequenz wurde angenommen, dass sie zwischen Männern und Frauen gleich ist. Männliche und weibliche Rekombinationsfrequenzen wurden als gleich betrachtet. Die STR-Allelfrequenzen waren 1/n, wobei n = Anzahl beobachteter Allele. Obwohl der maximale LOD-Score für D11S454 bei einem Rekombinationswert von 0 identifiziert wurde, platziert das Vorliegen einer nicht obligatorischen Rekombinante (Einzelperson VI-14, 1) dieses LQT-Gen telomer von D11S454.
BEISPIEL 3
Physikalische Kartierung
Primer wurden auf Grundlage von Sequenzen von TH-INS-IFGII- und D11S454-Loci entworfen und zum Identifizieren und Isolieren von Klonen aus CEPH YAC-Bibliotheken unter Anwendung der auf PCR basierenden Technik verwendet (Green und Olson, 1990; Kwiatkowski et al., 1990). YAC-terminale Sequenzen wurden mittels inverser PCR bestimmt, wie beschrieben (Ochman et al., 1988), und als STSs verwendet.
P1-Klone wurden unter Verwendung von Einzelkopiesonden aus den zuvor identifizierten Cosmiden cosQW22 (diese Studie), cCI11-469 (D11S679), cCI11-385 (D11S551), cCI11-565 (D11S601), cCI11-237 (D11S454) isoliert (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991; Sternberg, 1990). Neu isolierte P1s wurden mittels FISH oder Southern-Analysen auf das Chromosom 11p15 kartiert. Endspezifische Ribosonden wurden aus neu isolierten P1s erzeugt und zum Identifizieren weiterer angrenzender Klone verwendet (Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega). DNA für P1- und Cosmid-Klone wurden unter Anwendung von Plasmidisolierung mit alkalischer Lyse präpariert und mittels Gleichgewichtszentrifugation in CsCl-Ethidiumbromid-Gradienten gereinigt, wie beschrieben (Sambrook et al., 1989). P1-Insert-Endsequenzen wurden mittels Sequenzierung mit Hilfe von Taq-Polymerase bestimmt, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994). STSs wurden auf Grundlage dieser Insert-Endsequenzen erzeugt. Die Überlappung zwischen P1s und Cosmiden wurde berechnet, indem die gemeinsamen Restriktionsfragmente summiert wurden.
BEISPIEL 4
Isolierung und Charakterisierung von KVLQT1-Klonen
Eine Bibliothek von kardialer cDNA von einem erwachsenen Menschen (Stratagene) wurde plattiert und 1 × 106 Plaques wurden unter Verwendung von einem "trapped" Exon 4181A als der Sonde gescreent. Sequenzen des "trapped" Exons 4181A wurden zum Entwickeln von Oligonukleotidsonden zum Screenen der cDNA-Bibliothek verwendet. Das GENETRAPPERTM cDNA Positive Selection System wurde zum Screenen von 1 × 1011 Klonen aus einer Bibliothek von cDNA von einem menschlichen Herzen verwendet (Life Technologies, Inc.). Die Sequenzen der Capture- und Reparaturoligonukleotide waren 5'-CAGATCCTGAGGATGCT-3' (SEQ ID NO:7) und 5'-GTACCTGGCTGAGAAGG-3' (SEQ ID NO:8).
Zusammengesetzte cDNA-Sequenzen für KVLQT1 wurden mittels Endsequenzierung von überlappenden cDNA-Klonen und mittels Primer-Walking erhalten. Die Sequenzierung wurde entweder automatisch unter Verwendung von Sequenzierungsautomaten von Pharmacia A.L.F. oder manuell unter Verwendung eines Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (United States Biochemical, Inc.). Datenbankanalysen und Sequenzanalysen wurden unter Verwendung des GCG-Softwarepakets, des IG-Softwarepakets und des BLAST-Netzdienstes vom National Center for Biotechnology Information durchgeführt.
Die partielle genomische Struktur (von Transmembrandomäne S2 bis S6) von KVLQT1 wurde mittels Sequenzierung mit Hilfe von Taq-Polymerase von P1 18B12 bestimmt, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994). Primer wurden auf Grundlage der KVLQT1-cDNA-Sequenz entwickelt und zur Sequenzierung mit Hilfe von Taq-Polymerase verwendet.
BEISPIEL 5
Mutationsanalysen
SSCP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Normale und abweichende SSCP-Produkte wurden isoliert und direkt sequenziert, wie beschrieben (Wang und Keating, 1994), oder in pBluescript (SK+; Stratagene) unter Verwendung des T-Vektor-Verfahrens subkloniert (Marchuk et al., 1991). Wenn das letztere Verfahren angewendet wurde, wurden mehrere Klone mittels des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens unter Verwendung von SequenaseTM Version 2.0 (United States Biochemicals, Inc.) sequenziert.
BEISPIEL 6
Northern-Analysen
Ein Northern-Filter für mehrere Gewebe (Human MTN blot 1, Clontech) wurde mit einer mit 32P markierten KVLQT1-cDNA-Sonde sondiert, wie zuvor beschrieben (Curran et al., 1995).
BEISPIEL 7
Verfeinerte genetische und physikalische Lokalisierung von LQT1
Die genaue Position von LQT1 wurde mittels Gendiagnose in Kindred 1532 (K1532), einer Großfamilie aus Utah nordeuropäischer Herkunft, bestimmt (1). Dieses Kindred war in der anfänglichen Studie verwendet, die das erste LQT-Gen, LQT1, mit dem Chromosom 11p15.5 verknüpfte (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b). Weitere Familienmitglieder wurden identifiziert und für eine Gesamtprobengröße von 217 Einzelpersonen phänotypisiert. Die Phänotypenbestimmung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991 b; Jiang et al., 1994). Vorläufige Gendiagnosen unter Verwendung von Markern bei HRAS, TH, D11S454 und D11S12 beinhalteten alle einwandfrei festgestellten Mitglieder von K1532. Diese Versuche identifizierten informative Zweige dieser Familie. Weitere Gendiagnosen wurden unter Verwendung von drei stark polymorphen Markern von Chromosom 11p15.5 durchgeführt: D11S922, D11S1318 und D11S860 (Gyapay et al., 1994). Genotypen und paarweise LOD- Scores für jeden Marker sind in 1 und Tabelle 2 gezeigt. Von diesen Markern wurden TH und D11S1318 vollständig verknüpft. Die Rekombination wurde mit allen anderen getesteten Markern, einschließlich HRAS, identifiziert, in jedem Fall wurde jedoch ein statistisch signifikanter positiver LOD-Score (+3 oder höher) identifiziert. Diese Daten deuten darauf hin, dass LQT 1 in diesem Kindred vollständig mit TH und D11S1318 verknüpft ist und dass das Krankheitsgen centromer von HRAS angeordnet ist. TABELLE 2
Um die Lokalisierung von LQT1 zu verfeinern, wurden Haplotyp-Analysen von K1532 durchgeführt (siehe 1). Neun Chromosome, die informative Rekombinationsereignisse tragen, wurden identifiziert. Telomere Rekombinationsereignisse wurden in der anbetroffenen Einzelperson IV-22 (zwischen D11S922 und TH), der betroffenen Einzelperson IV-25 (zwischen D11S922 und TH), der anbetroffenen Einzelperson V-6 (zwischen HRAS und D11S922) und der betroffenen Einzelperson V-24 (zwischen HRAS und D11S922) beobachtet. Centromere Rekombinationsereignisse wurden in der anbetroffenen Einzelperson V-17 (zwischen D11S860 und D11S454), der betroffenen Einzelperson V-24 (zwischen D11S860 und D11S454), der anbetroffenen Einzelperson V-34 (zwischen D11S860 und D11S454), der anbetroffenen Einzelperson VI-13 (zwischen D11S860 und D11S454), der unbetroffenen Einzelperson VI-14 (zwischen D11S454 und D11S1318) und der betroffenen Einzelperson VI-16 (zwischen D11S860 und D11S454) identifiziert. Diese Daten zeigen an, dass LQT1 sich zwischen D11S922 und D11S44 befindet. Zusammen mit jüngsten Studien, die LQT1 centromer von TH ansiedeln (Russell et al., 1995), siedeln diese Daten LQT1 im Intervall zwischen TH und D11S454 an.
Die Größe der Region, die LQT1 enthält, wurde unter Verwendung von Puls-Feld-Gel-Analysen mit genomischen Sonden von Chromosom 11P15.5 geschätzt. Sonden von TH, D11S551 und D11S454 wurden an ein 700 kb langes MluI-Restriktionsfragment hybridisiert (2). Diese Daten legten nahe, dass die Region, die LQT1 enthält, weniger als 700 kb ausmacht. Die physikalische Darstellung dieser Region wurde mittels Screenens von Bibliotheken von künstlichem Hefechromosom (yeast artificial chromosome, YAC) und P1 mit Sonden aus der Region erzielt (Tanigami et al., 1992; Tokino et al., 1991). Die Reihenfolge dieser Klone wurde unter Anwendung von FISH-Analysen (FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) bestätigt als: Telomer-TH-D11S551-D11S679-D11S601-D11S454-Centromer. Die in anfänglichen Versuchen identifizierten Klone wurden dann zur Identifizierung von angrenzenden, überlappenden Klonen verwendet. Der Mindestsatz von Klonen aus dem LQT1-Intervall ist in 2 gezeigt.
BEISPIEL 8
Identifizierung und Charakterisierung von KVLQT1
Eine Exon-Amplifikation mit Klonen aus der physikalischen Karte wurde durchgeführt, um Kandidatengene für LQT1 zu identifizieren. Exon-"Trapping" wurde unter Verwendung von pSPL3B (Burn et al., 1995) auf genomischen P1-Klonen durchgeführt, wie zuvor beschrieben (Buckler et al., 1991; Church et al., 1994). Mindestens 128 "trapped" Exons aus jedem P1-Klon wurden zunächst charakterisiert, indem die PCR-Produkte dimensioniert wurden. Aus diesen wurden 400 Klone mittels Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung eines A.L.F.-Sequenzierungsautomaten (Pharmacia) weiter analysiert. DNA-Sequenz- und Datenbankanalysen offenbarten acht mögliche Exons mit einer vorhergesagten Aminosäuresequenzähnlichkeit zu Ionenkanälen. Die höchste Ähnlichkeit wurde bei einem "trapped" Exon mit 238 Basenpaaren (4181A) mit einer Ähnlichkeit zu Kaliumkanalproteinen von mehreren Spezies von 53%, einschließlich einer Ähnlichkeit zu einem Abschnitt einer putativen Porenregion, erreicht. PCR-Analysen wurden zum Kartieren von 4181A auf den kurzen Arm von Chromosom 11 und auf zwei P1s aus der physikalischen Karte (118A10, 18B12) verwendet. Diese Daten legten nahe, dass 4181A Teil eines Kaliumkanalgens auf Chromosom 11p15.5 war.
Zwei verschiedene cDNA-Bibliothek-Screeningverfahren wurden dazu verwendet zu bestimmen, ob das "trapped" Exon 4181A Teil eines Gens war. Herkömmliche Plaquefilterhybridisierung mit einer Bibliothek von kardialer cDNA von einem erwachsenen Menschen führte zur Identifizierung eines einzigen positiven Klons. Eine Variation der cDNA-Selektion wurde zum Screenen einer zweiten Bibliothek von kardialer cDNA (dem GENETRAPPERTM cDNA Positive Selection System, Life Technologies, Inc.) verwendet und zwölf unabhängige Klone wurden wiederhergestellt. DNA-Sequenzanalysen offenbarten ein vollständiges Alignment mit Sequenzen, die von 4181A und den anderen, oben beschriebenen "trapped" Exons abgeleitet waren. Das längste offene Leseraster umspannte 1654 Basenpaare. Zwei Consensus-Polyadenylierungssignale wurden stromaufwärts des Poly(A)-Schwanzes in der 3'-untranslatierten Region identifiziert. Die vollständige cDNA wurde in dieser Phase der Studie nicht erhalten.
Die partielle cDNA sagte ein Protein mit strukturellen Charakteristika von Kaliumkanälen vorher. Hydropathie-Analysen legten eine Topologie von sechs hydrophoben Hauptregionen nahe, die membranumspannende α-Helices darstellen. Diese Regionen teilen sich Sequenzähnlichkeit mit den Kaliumkanal-Transmembrandomänen S1-S6. Ein Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die von dem identifizierten Gen abgeleitet wurde, und dem Shaker-Kaliumnkanal (SHA-Kaliumkanal) (Pongs et al., 1988) ist in 3 gezeigt. In der Region, die S1-S6 enthält, war die Aminosäuresequenzidentität 30% und die Ähnlichkeit 59%. Die Sequenz, die sich 3' von S1-S6 befindet, wies keine signifikante Ähnlichkeit zu einem beliebigen bekannten Protein auf. Da dieses Gen eine hohe Ähnlichkeit zu spannungsgesteuerten Kaliumkanalgenen aufweist und zu einem starken Kandidaten für LQT1 wurde, wurde es KVLQT1 genannt.
Northern-Blot-Analysen wurden zum Ermitteln der Gewebeverteilung von KVLQT1-mRNA verwendet. KVLQT1-cDNA-Sonden erkannten ein 3,2 kb langes Transkript in menschlicher Pankreas, menschlichem Herz, menschlicher Niere, menschlicher Lunge und menschlicher Plazenta, jedoch nicht in Skelettmuskel, Leber oder Gehirn (4). Das Herz zeigte die höchsten Spiegel von KVLQT1-mRNA. Die Northern-Analysen wurden unter Verwendung eines Northern-Filters für mehrere Gewebe (Human MTN blot 1, Clontech) durchgeführt, wie von Curran et al., 1995, beschrieben.
BEISPIEL 9
Charakterisierung der vollständigen KVLQT1-cDNA
Die oben beschriebenen Studien resultierten in der Klonierung und Charakterisierung einer unvollständigen cDNA für KVLQT1. Die Sequenz dieser unvollständigen cDNA sagte ein Protein mit sechs hydrophoben membranumspannenden α-Helices (S1-S6) und eine typische K+-Kanal-Porensignatursequenz vorher (Heginbotham et al., 1994). Dieser cDNA schien jedoch die aminoterminale Domäne zu fehlen und sie exprimierte nicht funktionell. Um die vollständige KVLQT1-Sequenz zu definieren, wurden mehrere cDNA-Bibliotheken gescreent und es wurde ein neuer Klon isoliert. Eine cDNA-Sonde, die die Exons 3 bis 6 enthielt, wurde zum Isolieren von drei vollständigen KVLQT1-cDNA-Klonen aus einer Bibliothek von cDNA aus adultem Herzen, die im Labor unter Anwendung des SuperScript Choice-Systems (GIBCO BRL) hergestellt wurde, verwendet. Die vollständige cDNA-Sequenz und das kodierte Protein sind in den 5A–5B gezeigt.
BEISPIEL 10
Genomische Struktur von KVLQT1
Die genomische DNA von KVLQT1 wurde untersucht und die Exon-Intron-Übergangsstellen für alle Exons bestimmt.
A. Isolierung von cDNA-Klonen
Eine cDNA-Sonde, die die Exons 3 bis 6 enthielt, wurde zum Isolieren von drei vollständigen KVLQT1-cDNA-Klonen aus einer Bibliothek von cDNA aus adultem Herzen, die im Labor unter Anwendung des SuperScript Choice-Systems (GIBCO BRL) hergestellt wurde, verwendet.
B. Isolierung von genomischen Klonen
KVLQT1-P1-Klone wurden wie beschrieben (Wang et al., 1996) isoliert. Das Cosmid, das das Exon 1 enthielt, wurde mittels Screenens einer Bibliothek von menschlichem genomischem Cosmid (Stratagene) mit einer cDNA-Sonde vom Exon 1 isoliert.
C. Bestimmung der Exon-Intron-Übergangsstellen
Alle genomischen Klone wurden unter Verwendung von Primern, die für die cDNA-Sequenzen entwickelt wurden, sequenziert. Die KVLQT1-P1-Klone wurden mit Hilfe von Taq-Polymerase unter Verwendung von ThermoSequenase (Amersham Life Science) sequenziert. Die KVLQT1-Cosmide wurden mittels des Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens auf einem DNA-Sequenzierungsautomat Modell 373A von Applied Biosystems sequenziert. Die exakten Exon-Intron-Übergangsstellen wurden mittels Vergleich von cDNA, genomischen Sequenzen und bekannten Spleißstellen-Consensus-Sequenzen bestimmt.
D. Design von PCR-Primern und PCR-Reaktionsbedingungen
Primer zum Amplifizieren von Exons der zwei Gene wurden empirisch oder unter Verwendung von OLIGO 4.0 (NBI) entworfen. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt:

(1) 3 Minuten bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 10 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 58°C und 20 Sekunden bei 72°C und eine Verlängerung von 5 Minuten bei 72°C.
(2) Identisch mit den Bedingungen in (1), mit der Ausnahme, dass die Reaktionsgemische Endkonzentrationen von 10% Glycerin und 4% Formamid aufwiesen und mit Mineralöl überschichtet wurden.
(3) 3 Minuten bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen von 10 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 64°C und 20 Sekunden bei 72°C und 30 Zyklen von 10 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 62°C und 20 Sekunden bei 72°C und eine Verlängerung von 5 Minuten bei 72°C.

E. Genomische Struktur von KVLQT1 und Primersätze
Vollständige cDNA-Klone wurden aus einer Bibliothek von cDNA aus adultem Herzen isoliert. Eine 5'-cDNA-Sonde, die aus einem dieser Klone erzeugt wurde, wurde zum Isolieren von cos1, einem genomischen Cosmid-Klon, der das Exon 1 enthält, erzeugt. Genomische P1-Klone, die den Rest der KVLQT1-cDNA umfassen, wurden zuvor isoliert (Wang et al., 1996). Diese genomischen Klone umspannen ungefähr 400 kb auf Chromosom 11p15.5 (6). Um die Exonstruktur und die Exon-Intron-Übergangsstellen zu bestimmen, wurden cos1 und die P1-Klone 118A10, 112E3, 46F10 und 49E5 unter Verwendung von Primern, die für die cDNA entwickelt wurden, sequenziert. Ein Vergleich der genomischen und cDNA-Sequenzen von KVLQT1 offenbarte das Vorliegen von 16 Exons (5A–5B und Tabelle 3). Die Exongröße reichte von 47 bp (Exon 14) bis 1122 bp (Exon 16). Alle Intronsequenzen enthielten die Invarianten GT und AG an der Donor- bzw. Akzeptorspleißstelle (Tabelle 3). Ein Paar von PCR-Primern wurde für jede der Intronsequenzen entwickelt, die die Exons 2 bis 16 flankierten, und zwei Paare von Primern mit überlappenden Produkten wurden aufgrund dessen großer Größe für das Exon 1 entwickelt (Tabelle 4). Diese Primer können zum Screenen aller KVLQT1-Exons verwendet werden.
BEISPIEL 11
Charakterisierung der KVLQT1-Funktion
Um die Funktion von KVLQT1 zu definieren, wurden Chinese Hamster-Ovarialzellen (CHO) mit der in Beispiel 9 oben beschriebenen vollständigen cDNA transfiziert. Die KVLQT1-cDNA wurde in pCEP4 (In Vitrogen) subkloniert. Die CHO-Zellen wurden in Ham's F-12-Medium kultiviert und vorübergehend unter Verwendung von Lipofectamine (Gibco BRL) transfiziert. Die Zellen wurden 18 Stunden in 35-mm-Schalen transfiziert, die 6 μl Lipofectamin, 0,5 μg grün fluoreszierendem Protein (pGreen Lantern-1, Gibco BRL) und 1,5 μg KVLQT1 in pCEP4 enthielten. Fluoreszierende Zellen wurden unter Verwendung eines Axopatch 200-Spannungsklemmenverstärker (Axon Instruments) 48 bis 78 Stunden nach der Transfektion spannungsgeklemmt. Die Badelösung enthielt: 142 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 11,1 mM Glukose, 5,5 mM HEPES-Puffer (pH 7,4, 22–25°C). Die Pipettenlösung enthielt: 110 mM Kaliumglutamat, 20 mM KCl, 1,0 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 5 mM K2ATP, 10 mM HEPES (pH 7,3). Die Datenerfassung und -analysen wurden unter Verwendung von pCLAMP6 (Axon Instruments) vorgenommen. Die Spannungsabhängigkeit der Stromaktivierung wurde bestimmt, indem die Beziehung zwischen Schwanzströmen (mittels Extrapolation von der deaktivierenden Phase des Stroms bis zum Ende des Testimpulses) und Testpotential mit einer Boltzmann-Funktion angepasst wurde. Die Schwanzströme wurden in Bezug auf den höchsten Wert für jeden Oozyten normalisiert. TABELLE 3
TABELLE 4
Ein spannungsabhängiger, nach außen gerichteter K+-Strom wurde nach der Membrandepolarisation bis zu Potentialen von mehr als –60 mV beobachtet (7A). Dieser Strom erreichte innerhalb 1 Sekunde bei +40 mV einen Gleichgewichtszustand. Der Aktivierung des Stroms ging eine kurze Verzögerung voraus und die Repolarisation auf –70 mV brachte einen Schwanzstrom mit einem anfänglichen Amplitudenanstieg (einem Haken) vor der Deaktivierung hervor. Ähnliche Schwanzstromhaken wurden zuvor für HERG-K+-Kanäle beobachtet und der Wiederherstellung von Kanälen von der Inaktivierung bei einer schnelleren Geschwindigkeit als bei der Deaktivierung zugeschrieben (Sanguinetti et al., 1995; Smith et al., 1996; Spector et al., 1996). Die Aktivierungskurve für den KVLQT1-Strom war die Hälfte des Maximums (V1/2) bei –11,6 ± 0,6 mV und wies einen Steigungsfaktor von 12,6 ± 0,5 mV auf (n = 6; 7B).
Die biophysikalischen Eigenschaften von KVLQT1 waren anders als andere bekannte kardiale K+-Ströme. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass KVLQT1 sich mit einer anderen Untereinheit zusammenfügen kann, um einen bekannten kardialen Kanal zu bilden. Der langsam aktivierende "Delayed-rectifier"-K+-Strom IKs moduliert die Repolarisation von kardialen Aktionspotentialen. Trotz intensiver Studien wird die molekulare Struktur des IKs-Kanals nicht verstanden. Physiologische Daten legen nahe, dass eine Komponente des IKs-Kanals minK ist (Goldstein und Miller, 1991; Hausdorff et al., 1991; Takumi et al., 1991; Busch et al., 1992; Wang und Goldstein, 1995; Wang et al., 1996), ein Protein von 130 Aminosäuren mit einer einzigen putativen Transmembrandomäne (Takumi et al., 1988). Die Größe und die Struktur dieses Proteins haben jedoch dazu geführt, dass angezweifelt wird, dass minK allein funktionelle Kanäle bildet (Attali et al., 1993; Lesage et al., 1993).
Um diese Hypothese zu testen, wurden CHO-Zellen mit KVLQT1- und humanen KCNE1-cDNAs kotransfiziert. Eine KCNE1-cDNA wurde in pCEP4 (InVitrogen) subkloniert und die Transfektion wurde wie oben für KVLQT1 allein beschrieben durchgeführt. Zur Kotransfektion von KVLQT1 und KCNE1 wurden 0,75 μg jeder cDNA verwendet. Wie zuvor berichtet (Lesage et al., 1993), induzierte die Transfektion von CHO-Zellen mit KCNE1 allein keinen nachweisbaren Strom (n = 10, 7C). Die Kotransfektion von KCNE1 mit KVLQT1 induzierte einen langsam aktivierenden "Delayed-rectifier"-Strom, der viel größer war als der Strom in Zellen, die mit KVLQT1 allein transfiziert wurden (7D und 7E). Der langsamen Aktivierung des Stroms in kotransfizierten CHO-Zellen ging eine Verzögerung voraus, die mehrere Hundert ms dauerte, was darauf hinweist, dass kein signifikanter homomerer KVLQT1-Kanalstrom vorlag. Der Strom wurde während langen depolarisierenden Impulsen nicht gesättigt und erforderte eine Drei-Exponential-Funktion, um die anfängliche Verzögerung und zwei Stromaktivierungsphasen am besten zu beschreiben. Während eines 30 s dauernden depolarisierenden Impulses auf +40 mV wurde der Strom mit Zeitkonstanten von 0,68 ± 0,18, 1,48 ± 0,16 und 8,0 ± 0,6 s (n = 4) aktiviert. Die isochrone (7,5 s) Aktivierungskurve für den Strom wies einen V1/2 von 7,5 ± 0,9 mV und einen Steigungsfaktor von 16,5 ± 0,8 mV auf (n = 7; 9B). Zum Vergleich sind der V1/2 und der Steigungsfaktor der Aktivierungskurve für humanen kardialen IKs von 9,4 mV und 11,8 mV (Li et al., 1996). Wie in CHO-Zellen koexprimiertes KVLQT1 und hminK ist die Aktivierung von kardialem IKs äußerst langsam und wurde am besten mit einer Drei-Exponential-Funktion beschrieben (Balser et al., 1990; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990). Chinidin (50 μM) blockierte Schwanzströme in kotransfizierten CHO-Zellen um 30 ± 8% (n = 5), ähnlich dessen Auswirkung (Blockierung von 40–50%) auf IKs in isolierten Myozyten (Balser et al., 1991). Folglich induzierte die Koexpression von KVLQT1 und hminK in CHO-Zellen einen K+-Strom mit biophysikalischen Eigenschaften, der zu dem von kardialem IKs nahezu identisch war.
Um die Eigenschaften von hminK und KVLQT1 weiter zu charakterisieren, wurden diese Kanäle separat und zusammen in Xenopus-Oozyten exprimiert. Xenopus laevis-Oozyten wurden isoliert und mit cRNA injiziert, wie von Sanguinetti et al. (1995) beschrieben. KVLQT1-cDNA wurde in pSP64 (Promega) subkloniert. KCNE1-cDNA war ein Geschenk von R. Swanson. Ungefähr äquimolare Konzentrationen von KVLQT1-cRNA (5,8 ng pro Oozyte) und KCNE1-cRNA (1 ng pro Oozyte) wurden für die Koinjektionsversuche verwendet. Die Badelösung enthielt: 98 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,1 mM CaC12 und 5 mM HEPES (pH 7,6, 22–25°C). Für Umkehrpotentialversuche wurde die Osmolarität bei äquimolarer Substitution von KCl durch externes NaCl beibehalten. Die Ströme wurden unter Anwendung von Standard-Zwei-Mikroelektroden-Spannungsklemmen-Techniken 3 Tage nach der Injektion der Oozyten mit cRNA aufgezeichnet (Sanguinetti et al., 1995). Die Ströme wurden bei 0,5 kHz gefiltert und bei 2 kHz digitalisiert. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt.
Mit zu KVLQT1 komplementärer RNA injizierte Oozyten exprimierten einen schnell aktivierenden, nach außen gerichteten K+-Strom mit einer Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, die zu mit KVLQT1-cDNA transfizierten CHO-Zellen nahezu identisch war (8A und 8B). Die K+-Selektivität von KVLQT1-Kanälen wurde bestimmt, indem das Umkehrpotential (Erev) von Schwanzströmen in verschiedenen Konzentrationen von extrazellulärem K ([K+]e) gemessen wurde. Die Steigung der Beziehung zwischen Erev und log[K+]e betrug 49,9 ± 0,4 mV (n = 7; 8C), wesentlich weniger als von der Nernst-Gleichung (58 mV) für einen perfekt selektiven K+-Kanal vorhergesagt. Die Koinjektion von Oozyten mit KVLQT1- und KCNE1-cRNA induzierte einen Strom, der IKs ähnlich war (9C). Die Steigung der Beziehung zwischen Erev und log[K+]e für koinjizierte Oozyten betrug 49,9 ± 4 mV (n = 6), ähnlich KVLQT1 allein und kardialem IKs vom Meerschweinchen (49 mV) (Matsuura et al., 1987). Die isochrone (7,5 s) Aktivierungskurve für koinjizierte Oozyten wies einen V1/2 von 6,2 mV und eine Steigung von 12,3 mV auf (9E), ähnlich dem kardialen IKs.
BEISPIEL 12
Identifizierung eines KVLQT1-gens in Xenopus
Im Gegensatz zu mit CHO-Zellen konnte KCNE1 in Xenopus-Oozyten eine funktionelle Expression durchleben (9B). Der induzierte Strom (IsK) war kleiner als der in koinjizierten Oozyten induzierte Strom, die Kinetik und die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung waren jedoch ähnlich (9A–9E). Zwei Beobachtungen haben zu der Hypothese geführt, dass IsK in Xenopus-Oozyten aus Kanälen resultieren, die durch das Zusammenfügen von minK mit einer unidentifizierten, konstitutiv exprimierten Untereinheit gebildet werden. Erstens sättigt die Größe von IsK nach der Injektion sehr kleiner Mengen von KCNE1-cRNA (9D), was nahe legt, dass ein endogener Bestandteil begrenzter Quantität zur funktionellen Expression erforderlich ist (Wang und Goldstein, 1995; Cui et al., 1994). Zweitens induziert die heterologe Expression von minK in Säugerzellen keinen nachweisbaren Strom (Lesage et al., 1993) (7C), was nahe legt, dass minK zum Bilden funktioneller Kanäle nicht ausreicht. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese unidentifizierte Untereinheit ein Homologon von KVLQT1 sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine Xenopus-Oozyten-cDNA-Bibliothek (Clontech) mit einem KVLQT1-cDNA-Klon gescreent, der die Domänen S3-S5 umspannte. Ein 1,6 kb langer partieller Klon (XKVLQT1, 10A) wurde isoliert. XKVLQT1 ist auf der Aminosäurenebene zu 88% mit der entsprechenden Region von KVLQT1 identisch (10A). Diese Daten legen nahe, dass IsK aus dem Zusammenfügen der Proteine XKVLQT1 und minK resultiert.
Es wurde gefolgert, dass KVLQT1 und hminK sich zusammenfügen, um den kardialen IKs-Kanal zu bilden. Zwei "Delayed-rectifier"-K+-Ströme, IKr und IKs, modulieren die Aktionspotentialdauer in kardialen Myozyten (Li et al., 1996; Sanguinetti und Jurkiewicz, 1990). Frühere Studien haben eine Dysfunktion von IKr-Kanälen in Long-QT-Syndrom impliziert (Sanguinetti et al., 1995; Curran et al., 1995; Sanguinetti et al., 1996a). Die Beobachtung, dass KVLQT1-Mutationen ebenfalls diese Störung bewirken (Wang et al., 1996), und die Entdeckung, dass KVLQT1 Teil des IKs-Kanals bildet, deuten darauf hin, dass die Dysfunktion beider kardialer "Delayed-rectifier"-K+-Kanäle zum Risiko des plötzlichen Todes aufgrund von Herzrhythmusstörungen beiträgt.
BEISPIEL 13
Kosegregation von KVLQT1-Missense-Mutationen mit LQT in sechs großen Familien
Um die Hypothese zu testen, dass KVLQT1 LQT1 ist, wurden Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analysen (single-stranded conformation polymorphism, SSCP) verwendet, um in betroffenen Mitgliedern von K1532, die größte LQT-Familie, die eine Verknüpfung mit Chromosom 11 zeigte, nach funktionellen Mutationen zu screenen. SSCP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Wang et al., 1995a; Wang et al., 1995b). Normale und abweichende SSCP-Produkte wurden isoliert und direkt wie beschrieben sequenziert (Wang und Keating, 1994) oder in pBluescript (SK+) (Stratagene) unter Anwendung des T-Vektor-Verfahrens (Marchuk et al., 1991) subkloniert. Wenn das letztere Verfahren verwendet wurde, wurden mehrere Klone mittels des Didesoxy-Kettenabbruch Verfahrens unter Verwendung von SequenaseTM Version 2.0 (United States Biochemicals, Inc.) sequenziert. Die Analysen wurden auf die Region zwischen S2 und S6 konzentriert, da diese Regionen für die KVLQT1-Funktion wichtig sein könnten. Wir entwickelten Oligonukleotidprimer auf Grundlage von cDNA-Sequenzen und verwendeten diese Primer für Sequenzierungsreaktionen mit Hilfe von Taq-Polymerase mit den KVLQT1 enthaltenen P1, 18B12 (Wang und Keating, 1994). Diese Versuche definierten Intronsequenzen, die die Exons flankieren, die S2-S6 kodieren. Weitere Primer wurden dann aus diesen Intronsequenzen erzeugt und für SSCP-Analysen verwendet (Tabelle 5).
Die SSCP-Analysen identifizierten ein anomales Konformer in den 70 betroffenen Mitgliedern von K1532 (11A). Dieses abweichende Konformer wurde nicht in den 147 unbetroffenen Mitgliedern dieses Kindred oder in genomischer DNA von mehr als 200 nicht verwandten Kontrolleinzelpersonen beobachtet. Die Zwei-Punkte-LOD-Score für die Verknüpfung zwischen dieser Anomalie und LQT war 14,19 bei einer Rekombinationsfraktion von 0 (Tabelle 2). Zwischen KVLQT1 und LQT1 wurde keine Rekombination beobachtet, die darauf hinwies, dass diese Loci vollständig verknüpft sind. DNA-Sequenzanalysen der normalen und abweichenden SSCP-Konformer offenbarten eine Substitution einer einzigen Base, eine Umwandlung von zu A, am ersten Nukleotid von Codon Val-125 (11A und Tabelle 6). Diese Mutation resultiert in einer Substitution von Valin in Methionin in der vorhergesagten intrazellulären Domäne zwischen S4 und S5.
Um die Hypothese, dass Mutationen in KVLQT1 LQT verursachen, weiter zu testen, wurden DNA-Proben von betroffenen Mitgliedern von fünf weiteren großen LQT-Kindreds untersucht. Verknüpfungsanalysen mit polymorphen Markern aus dieser Region hatten gezeigt, dass der Krankheitsphänotyp in diesen Familien mit dem Chromosom 11 verknüpft ist. Abweichende SSCP-Konformer wurden in betroffenen Mitgliedern von K2605, K1723, K1807 (11B–11D), K161 und K162 identifiziert. Die in K161 und K162 identifizierten SSCP-Anomalien waren mit den in K1807 beobachteten identisch. Das abweichende SSCP-Konformer wurde in unbetroffenen Mitgliedern dieser Kindreds oder in DNA-Proben von mehr als 200 nicht verwandten Kontrolleinzelpersonen nicht gesehen. Die normalen und abweichenden Konformer, die in jeder Familie identifiziert wurden, wurden sequenziert. Die Nukleotidänderung, der Kodierungseffekt und die Position jeder Mutation sind in Tabelle 6 zusammengefasst. TABELLE 5 Zum Definieren von KVLQT1-Mutationen verwendete PCR-Primer
TABELLE 6 Zusammenfassung von KVLQT1-Mutationen
BEISPIEL 14
Eine intragene KVLQT1-Deletion und fünfzehn Missense-Mutationen, die mit LQT in kleinen Familien und sporadischen Fällen assoziiert sind
Um weitere mit LQT assoziierte Mutationen in KVLQT1 zu identifizieren, wurden weitere SSCP-Analysen für kleine Kindreds und sporadische Fälle durchgeführt. SSCP offenbarte ein abweichendes Konformer in Kindred 13216 (12A). Analysen von mehr als 200 nicht verwandten Kontrolleinzelpersonen schlugen fehl, diese Anomalie zu zeigen. Dieses abweichende Konformer wurde kloniert und sequenziert, wobei eine Deletion von drei Basenpaaren offenbarte, die die Codons 38 und 39 umfasste. Diese Mutation resultiert in einer Substitution von Phenylalanin durch Tryptophan und einer Deletion eines Glycins in der putativen S2-Domäne (Tabelle 6).
Abweichende SSCP-Konformer wurden in betroffenen Mitgliedern von weiteren Kindreds identifiziert. Ein in K2050 identifiziertes abweichendes SSCP-Konformer war mit dem in K1723 identisch und in K161, K162, K163 und K164 identifizierte abweichende Konformer waren mit den in K1807 beobachteten identisch. Zudem wiesen die Kindreds 2625, 2673 und 3698 die gleiche Mutation auf. Keines der abweichenden Konformer wurde in DNA-Proben von mehr als 200 Kontrolleinzelpersonen identifiziert. In jedem Fall wurden die normalen und die abweichenden Konformer sequenziert. Diese Daten sind in den 12A–12O gezeigt und in Tabelle 6 zusammengefasst. Insgesamt wurden mit LQT assoziierte KVLQT1-Mutationen in 24 Familien oder sporadischen Fällen identifiziert, was einen starken molekularen genetisch Beweis dafür liefert, dass Mutationen in KVLQT1 die mit Chromosom 11 verknüpfte Form von LQT verursachen.
BEISPIEL 15
KCNE1-Variationen, die in LQT resultieren
Separate Studien an verschiedenen Einzelpersonen wurden beim Finden von Varianten von minK durchgeführt. Diese Studien wurden unter Anwendung der folgenden Verfahren durchgeführt.
A. Phänotypanalysen
Einzelpersonen wurden auf Grundlage des auf die Herzfrequenz korrigierten QT-Intervalls phänotypisch charakterisiert. Einzelpersonen wurden als betroffen charakterisiert, wenn QTc ≤ 0,46 Sekunden. Einzelpersonen wurden als unbetroffen klassifiziert, wenn QTc ≤ 0,42 Sekunden. Von allen Einzelpersonen oder deren Vormündern wurde gemäß den Richtlinien der örtlichen Aufsichtsbehörde eine informierte Einwilligung eingeholt. Die Phänotypdaten wurden ohne Kenntnis des Genotyps ausgelegt.
B. Mutationsanalysen
Genomische Proben wurden mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert:
Die PCR-Produkte wurden in einer SSCP-Analyse verwendet, wie beschrieben (K.W. Wang et al., 1996). Die PCR wurde mit 75 ng DNA in einem Volumen von 10 μl unter Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus 9600-Thermozyklers abgeschlossen. Die Amplifikationsbedingungen waren 3 Minuten bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 10 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 58°C, 20 Sekunden bei 72°C und eine Verlängerung von 5 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsgemische wurden mit 40 μl 0,1%-igem SDS/10 mM EDTA und mit 30 μl 95%-igem Formamid-"Load-Dye" verdünnt. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 94°C denaturiert und auf Eis gegeben. Drei Mikroliter jeder Probe wurden auf 5%-igem und 10%-igem nicht denaturierenden Polyacrylamidgelen (Acrylamid:Bisacrylamid 49:1) bei 4°C und auf 0,5X und 1X MDE-Gelen (MDE = mutation detection enhancement, Mutationsnachweisverstärkung) (FMC BioProducts) bei Raumtemperatur getrennt. Elektrophoresen auf den 5%-igen und 10%-igen Gelen wurden bei 40 W für 3–5 Stunden abgeschlossen; Elektrophoresen auf den 0,5X und 1X MDE-Gelen wurden über Nacht bei 350 V bzw. 600 V abgeschlossen. Die Gele wurden auf 3-MM-Filterpapier getrocknet und 18 Stunden bei –70°C auf Film belichtet.
Die SSCP-Streifen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und 30 Minuten in 100 μl doppelt destilliertem Wasser bei 65°C eluiert. Zehn Mikroliter eluierter DNA wurden unter Verwendung des ursprünglichen Primerpaars reamplifiziert. Die Produkte wurden auf 1%-igen Agarosegelen mit niedriger Schmelztemperatur (FMC) getrennt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde in beiden Richtungen mittels des Didesoxy-Kettenabschluss-Verfahrens auf einem Sequenzierungsautomat Modell 373A von Applied Biosystems sequenziert.
C. Funktionelle Expression
KCNE1-cDNA-Expressionskonstrukte wurden mittels PCR aus komplett humaner DNA amplifiziert und in pSP64-Transkriptionsvektor (Promega) unter Verwendung der folgenden Primer kloniert:
MINKF – 5'-CAGTGGAAGCTTAATGCCCAGGATGATC-3' (SEQ ID NO:93) und
MINKR – 5'-CAGGAGGATCCAGTTTAGCCAGTGGTGGGGGTTCA-3' (SEQ ID NO:94).
Fettgedruckte Nukleotide kennzeichnen die Änderungen, die zum Erzeugen von HindIII- und BamHI-Restriktionsstellen (unterstrichen) vorgenommen wurden. Ein vollständiger KVLQT1-cDNA-Klon (mit dem von Yang et al. (1997) berichteten identisch) wurde aus einer Bibliothek von humaner kardialer cDNA isoliert und in das pSP64-Plasmid-Expressionsvektor subkloniert. Alle Konstrukte wurden mittels DNA-Sequenzanalysen bestätigt. Komplementäre RNAs wurden unter Verwendung des mCAP-RNA-Capping-Kits (Stratagene) synthetisiert.
Die Isolierung von Xenopus laevis-Oozyten und die cRNA-Injektion wurden wie beschrieben (Sanguinetti et al., 1995) durchgeführt. Spannungsklemmendaten wurden unter Verwendung von PCLAMP v6.0-Software (Axon Instruments) erfasst und analysiert. Isochrone (7,5 Sekunden) anstelle von Gleichgewichtszustandsmessungen wurden zum Schätzen der Spannungsabhängigkeit der IKs-Aktivierung angewendet. Die Spannungsabhängigkeit der IKs-Aktivierung wurde durch Anpassen von Spitzenschwanzströmen auf eine Boltzmann-Funktion bestimmt. V1/2, die Spannung, bei der der Strom unter Verwendung dieses Impulsprotokolls zur Hälfte aktiviert war, und der Steigungsfaktor wurden aus diesen Daten berechnet. Der aktivierende Strom wurde auf eine Biexponentialfunktion angepasst, um langsame und schnelle Zeitkonstanten der Aktivierung zu erhalten. Deaktivierungszeitkonstanten wurden durch Anpassen von zerfallenden Schwanzströmen bei verschiedenen Testpotentialen auf eine einzige Exponentialfunktion erhalten.
Alle Daten waren Mittelwert ± Standardfehler. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer Varianzanalyse wiederholter Messungen mit dem "Least-Significance"-Post-hoc-Test nach Fisher und dem ungepaarten T-Test nach Student durchgeführt. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
D. Ergebnisse
Ionenkanal-β-Untereinheiten sind Hilfsproteine, die sich mit α-Untereinheiten zusammenfügen, um die Öffnungs-/Schließungskinetik zu modulieren und die Stabilität von multimeren Kanalproteinen zu verstärken (Rettig et al., 1994; Shi et al., 1996). Trotz ihrer funktionellen Bedeutung wurde die Dysfunktion von Kalium-β-Untereinheiten nicht mit einer Erkrankung assoziiert. Jüngste physiologische Studien legen nahe, dass KCNE1 β-Untereinheiten kodiert, die sich mit KVLQT1-α-Untereinheiten zusammenfügen, um den langsam aktivierenden "Delayed-rectifier"-K+-Kanal (IKs-Kanal) zu bilden (Sanguinetti et al., 1996b; Barhanin et al., 1996). Da KVLQT1-Mutationen Arrhythmieempfänglichkeit im Long-QT-Syndrom (LQT) verursachen (Q. Wang et al., 1996; Neyroud et al., 1997; Splawski et al., 1997a), haben wir die Hypothese aufgestellt, dass Mutationen in KCNE1 ebenfalls diese Erkrankung verursachen. Hier sind KCNE1-Missense-Mutationen in betroffenen Mitgliedern von zwei LQT-Familien definiert. Beide Mutationen (S74L, D76N) reduzierten IKs durch Verschieben der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und beschleunigenden Kanaldeaktivierung. D76N-hminK hatte außerdem einen dominantnegativen Effekt. Die funktionellen Konsequenzen dieser Mutationen wären eine verzögerte kardiale Repolarisation und ein erhöhtes Arrhythmierisiko. Diese Daten legen KCNE1 als ein LQT-Gen fest und bestätigen, dass hminK ein integrales Protein des IKs-Kanals ist.
Einzelpersonen mit LQT wurden ermittelt und phänotypisch charakterisiert (Keating et al., 1991 a; Jiang et al., 1994). Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analysen (single-strand conformation polymorphism, SSCP) unter Verwendung von Primern, die KCNE1 umspannen, führten zur Identifizierung eines anomalen Konformers in betroffenen Mitgliedern des Kindreds 1789 (13A). Dieses Konformer wurde in unbetroffenen Familienmitgliedern oder in 200 nicht verwandten Kontrolleinzelpersonen (400 Chromosome) nicht beobachtet. Eine DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen Übergang von G zu A am ersten Nukleotid des Codons 76, was eine Substitution von Asp durch Asn bewirkte (D76N) (13C). Die Sequenzen für KCNE1-cDNA und dessen Proteinprodukt sind hier als SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4. Das erste Nukleotid des Codons 76 ist die Base 418 von SEQ ID NO:3.
Weitere SSCP-Analysen definierten eine zweite Anomalie, die mit der Erkrankung in Kindred 1754 kosegregierte (13B). Diese Anomalie wurde in unbetroffenen Mitgliedern der Familie oder in 200 Kontrollen nicht beobachtet. Eine DNA-Sequenzanalyse offenbarte einen Übergang von C zu T im zweiten Nukleotid des Codons 74 (Base 413 von SEQ ID NO:3), was eine Substitution von Ser durch Leu bewirkte (S74L) (13C). Analysen weiterer DNA-Proben, die von nicht verwandten Einzelpersonen mit LQT erhalten wurden, offenbarten weitere KCNE1-Mutationen. Tabelle 7 führt die in LQT-Familien gefundenen KCNE1-Mutationen auf. TABELLE 7
Um die funktionelle Konsequenzen dieser KCNE1-Mutationen zu bestimmen, exprimierten wir mutierte und Wildtyp-Proteine (WT-Proteine) in Xenopus-Oozyten. Da die Stöchiometrie von KVLQT1- und minK-Interaktion nicht bekannt ist, wurden verschiedene Mengen von KCNE1-cRNA (0,01–2,5 ng/Oozyte) mit einer festgelegten Menge von KVLQT1-cRNA (6 ng/Oozyt) koinjiziert und die resultierenden Ströme aufgezeichnet. Die IKs-Amplitude stieg in Abhängigkeit von dem injizierten KCNE1 an und war bei KCNE1-cRNA-Spiegeln ≥ 0,6 ng/Oozyte gesättigt (14A–14B). Anschließende Koexpressionsversuche wurden unter Verwendung von 1,2 ng KCNE1/Oozyt und 6 ng KCNE1-cRNA/Oozyt durchgeführt, um sicherzustellen, dass KCNE1 kein einschränkender Faktor zur Expression von heteromultimeren Kanälen war.
Die Koinjektion von D76N-KCNE1- und -KVLQT1-cRNA schlug fehl, nachweisbare K+-Ströme zu induzieren (n = 13). Da LQT als ein autosomale-dominantes Merkmal ererbt wird, verfügen betroffene Einzelpersonen über ein normales und ein mutiertes KCNE1-Allel. Folglich wurde mutierte KCNE1-cRNA mit WT-KCNE1- und KVLQT1-cRNA koinjiziert. Der Strom (IKs-D76N), der mittels Koinjektion von D76N-KCNE1-cRNA (0,6 ng/Oozyte), WT-KCNE1-cRNA (0,6 ng/Oozyte) und KVLQT1-cRNA (6 ng/Oozyte) induziert wurde, war 91% kleiner als der Strom (IKs-WT), der mit WT-KCNE1-cRNA (1,2 ng/Oozyt) und KVLQT1-cRNA (6 ng/Oozyt) bei +40 mV induziert wurde (15A und 15B). Diese Daten weisen darauf hin, dass D76N-hminK-Untereinheiten mit WT-hminK und KVLQT1 heteromultimere Kanäle bilden und IKs mittels eines starken dominant-negativen Mechanismus reduzieren.
Um die biophysikalischen Eigenschaften von Wildtyp- und mutierten Kanälen zu vergleichen, wurden die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und die Deaktivierungskinetik für IKs-D76N und IKs-WT charakterisiert. Die Größe von IKs erreichte den Gleichgewichtszustand nicht, selbst wenn er mit Impulsen mit einer Dauer von 100 Sekunden ausgelöst wurde (Swanson et al., 1993). Folglich wurde die Schwanzstromamplitude nach 7,5 Sekunden dauernden Testimpulsen als ein empirisches Maß der Spannungsabhängigkeit von IKs verwendet. IKs-D76N-Schwanzströme waren bei +28 mV die Hälfte des Maximums, eine Verschiebung von + 16 mV im Verhältnis zu IKs-WT (15C). Eine Verschiebung der Kanalöffnung/-schließung wurde durch die Spannungsabhängigkeit der Stromdeaktivierung bestätigt. Die Geschwindigkeit der IKs-D76N-Kanalschließung (Deaktivierung) war bei Spannungen ≥ –80 mV schneller als IKs-WT (15D). Die Spannungsabhängigkeit der Zeitkonstanten der Deaktivierung wurde um ungefähr +30 mV verschoben. Somit reduziert D76N-hminK IKs mittels dreier Mechanismen: einer dominant-negativen Unterdrückung der Kanalfunktion, einer erhöhten Geschwindigkeit der Kanaldeaktivierung und einer positiven Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der Kanalaktivierung. Diese Effekte würden den nach außen gerichteten Strom während der Repolarisationsphase reduzieren und die Dauer eines kardialen Aktionspotentials verlängern.
Im Gegensatz zu D76N-hminK bildete S74L-hminK IKs-Kanäle, wenn es mit KVLQT1 koexprimiert wurde, wenn auch mit veränderter Funktion. Der mittels Injektion von S74L-KCNE1-cRNA (1,2 ng/Oozyte) und KVLQT1-cRNA (6,0 ng/Oozyte) induzierte Strom wies einen Schwellwert für die Aktivierung auf, der ungefähr 40 mV höher als IKs-WT war. Der resultierende Strom war 66% kleiner als IKs-WT nach 7,5 Sekunden dauernden Impulsen auf +60 mV (n = 15). Wenn S74L-KCNE1 (0,6 ng/Oozyte) und WT-KCNE1 (0,6 ng/Oozyte) mit KVLQT1-cRNA (6,0 ng/Oozyt) koinjiziert wurde, war der resultierende Strom (IKs-S74L) im Vergleich zu IKs-WT bei +60 mV um ungefähr 33% reduziert (16A–16B). Wie in 16C gezeigt, lag diese Reduktion vorwiegend in einer positiven Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der Stromaktivierung begründet. Die Spannungsabhängigkeit der Deaktivierung wurde um ungefähr +40 mV verschoben (16D). Diese Verschiebung bewirkte einen deutlichen Anstieg der Geschwindigkeit der IKs-S74L-Deaktivierung. Folglich bilden S74L-hminK-Untereinheiten heteromultimere Kanäle mit WT-hminK und KVLQT1 und reduzieren IKs durch eine Verschiebung der Spannungsabhängigkeit der Kanalaktivierung und einer erhöhten Geschwindigkeit der Kanaldeaktivierung. Da IKs-S74L bei +60 mV IKs-WT nicht entsprach (wie für eine einfache Verschiebung beim Öffnen/Schließen erwartet), ist es möglich, dass mutierte S74L-Untereinheiten ebenfalls die Anzahl funktioneller IKs-Kanäle und/oder die Einzelkanalleitfähigkeit reduziert.
Die Beobachtung, dass mit LQT assoziierte Mutationen von KCNE1 die Öffnungs-/Schließungskinetik verändern, liefert zwingende Beweise, dass hminK einen integralen Teil des IKs-Kanals bildet, anstatt einfach als ein Begleiter zu dienen. Frühere Studien an minK, die vor der Entdeckung von KVLQT1 durchgeführt wurden, unterstützen ebenfalls diese Schlussfolgerung (Takumi et al., 1991; Goldstein und Miller, 1991; Wang und Goldstein, 1995; K.W. Wang et al., 1996). In einer dieser Studien fügte sich eine mutierte Ratten-minK-Untereinheit (D77N), die zu D76N-hminK analog ist, mit WT-minK zusammen und unterdrückte die IKs-Funktion, ein dominant-letaler Effekt (Wang und Goldstein, 1995).
Es wird gefolgert, dass Mutationen in KCNE1, dem Gen, das β-Untereinheiten von IKs-Kanälen kodiert, Arrhythmieempfänglichkeit durch Reduzieren von IKs verursachen und dadurch die myozelluläre Repolarisation verzögern. Da in IKs innerhalb des Myokardiums regionale Heterogenie vorliegt (Liu und Antzelevitch, 1995), würden Mutationen in KCNE1 anomale regionale Ungleichheit der Aktionspotentialdauer verursachen, wodurch ein Substrat für Arrhythmie erzeugt wird. Die Entdeckung von mit LQT assoziierten Mutationen in KCNE1 wird die präsymptomatische Diagnose dieser Erkrankung erleichtern und kann für die Therapie von Bedeutung sein.
BEISPIEL 16
Genomische Struktur von KCNE1
Die genomische DNA von KCNE1 wurde untersucht und die Exon-Intron-Übergangsstellen für alle Exons bestimmt, wie es für KVLQT1 durchgeführt wurde. Einer Bibliothek von cDNA aus adultem Herzen wurde mit einem PCR-Produkt gescreent, das aus komplett humaner DNA amplifiziert wurde und die gesamte kodierende Sequenz enthielt, um zwei identische 1,7 kb lange KCNE1-Klone zu isolieren. Zwei überlappende Cosmid-Klone, die die gesamte KCNE1-cDNA umfassen, wurden ebenfalls unter Verwendung des vollständigen KCNE1 als einer Sonde isoliert (17). Die Cosmide wurden mittels eines Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahrens auf einem DNA-Sequenzierungsautomat Modell 373A von Applied Biosystems sequenziert, um die genomische Struktur des KCNE1-Gens zu definieren. Drei Exons umfassen KCNE1-cDNA (18 und Tabelle 8). Die zwei Introns wurden in der 5'-UTR lokalisiert. Die Donor- und Akzeptorspleißstellen für beide Introns waren GT bzw. AG. Drei Paare von Primern wurden zum Screenen von KCNE1 entwickelt (Tabelle 9). Das erste und das zweite Paar überlappen und decken die gesamte kodierende Sequenz ab. Das dritte Paar amplifiziert einen Teil der kodierenden Region, einschließlich der putativen Transmembrandomäne und einiger der flankierenden Sequenzen. TABELLE 8
TABELLE 9
BEISPIEL 17
Erzeugung von polyklonalem Antikörper gegen KVLQT1 oder KCNE1
Segmente von KVLQT1 oder KCNE1 kodierender Sequenz werden als Fusionsprotein in E. coli exprimiert. Das überexprimierte Protein wird mittels Gelelution gereinigt und dazu verwendet, Kaninchen und Mäuse unter Anwendung einer Vorgehensweise, die der von Harlow und Lane (1988) beschriebenen ähnlich ist, zu immunisieren. Von dieser Vorgehensweise wurde gezeigt, dass sie Antikörper gegen verschiedene andere Proteine erzeugt (siehe beispielsweise Kraemer et al., 1993).
Kurz gesagt, eine Länge von KVLQT1 oder KCNE1 kodierender Sequenz wird als ein Fusionsprotein im Plasmid PET5A (Novagen, Inc., Madison, WI, USA) kloniert. Nach der Induktion mit IPTG wird die Überexpression eines Fusionsproteins mit dem erwarteten Molekulargewicht mittels SDS/PAGE verifiziert. Das Fusionsprotein wird aus dem Gel mittels Elektroelution gereinigt. Die Identifizierung des Proteins als das KVLQT1- oder KCNE1-Fusionsprodukt wird mittels Proteinsequenzierung am N-Terminus verifiziert. Als Nächstes wird das gereinigte Protein als Immunogen in Kaninchen verwendet. Die Kaninchen werden mit 100 μg des Proteins in komplettem Freund-Adjuvans immunisiert und zweimal in Zeitabständen von 3 Wochen aufgefrischt, zunächst mit 100 μg Immunogen in inkompletten Freund-Adjuvans, gefolgt von 100 μg Immunogen in PBS. Antikörper enthaltendes Serum wird zwei Wochen später gesammelt.
Diese Vorgehensweise wird wiederholt, um Antikörper gegen die mutierten Formen des KVLQT1- oder KCNE1-Genprodukts zu erzeugen. Diese Antikörper werden in Verbindung mit Antikörpern zu Wildtyp-KVLQT1 oder -KCNE1 dazu verwendet, die Gegenwart und den relativen Spiegel der mutierten Formen in verschiedenen Geweben und biologischen Flüssigkeiten nachzuweisen.
BEISPIEL 18
Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die für KVLQT1 oder KCNE1 spezifisch sind
Monoklonale Antikörper werden gemäß dem folgenden Protokoll erzeugt. Mäuse werden mit Immunogen immunisiert, das intaktes KVLQT1, intaktes KCNE1, intakte KVLQT1-Peptide oder intakte KCNE1-Peptide (Wildtyp oder mutiert) umfasst, die unter Verwendung von Glutaraldehyd oder EDC an Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiert wurden, wie wohl bekannt ist.
Das Immunogen wird mit einem Adjuvans gemischt. Jede Maus erhält vier Injektionen von 10 bis 100 μg Immunogen und nach der vierten Injektion werden den Mäusen Blutproben entnommen, um zu ermitteln, ob das Serum Antikörper zu dem Immunogen enthält. Der Serumtiter wird mittels ELISA oder RIA bestimmt. Mäuse mit Seren, die die Gegenwart von Antikörper zu dem Immunogen aufzeigen, werden zur Hybridomproduktion ausgewählt.
Milzen werden aus immunen Mäusen entnommen und eine Einzelzellsuspension wird hergestellt (siehe Harlow und Lane, 1988). Zellfusionen werden im Wesentlichen wie von Kohler und Milstein (1975) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, P3.65.3-Myelomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) werden mit immunen Milzzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert, wie von Harlow und Lane (1988) beschrieben. Die Zellen werden mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/Well in 96-Well-Gewebekulturplatten plattiert. Einzelne Wells werden auf Wachstum untersucht und die Überstände der Wells mit Wachstum werden mittels ELISA oder RIA unter Verwendung von Wildtyp- oder mutiertem KVLQT1- oder KCNE1-Zielprotein auf die Gegenwart von für KVLQT1 oder KCNCE spezifische Antikörper geprüft. Zellen in positiven Wells werden ausgedehnt und subkloniert, um die Monoklonalität festzustellen und zu bestätigen.
Klone mit den gewünschten Spezifitäten werden ausgedehnt und als Ascites in Mäusen oder in einem Hohlfasersystem wachsen gelassen, um ausreichende Quantitäten an Antikörper zur Charakterisierung und Assayentwicklung zu produzieren.
BEISPIEL 19
Sandwich-Assay auf KVLQT1 oder KCNE1
Monoklonaler Antikörper wird an einer festen Oberfläche wie einer Platte, einem Röhrchen, einer Perle oder einem Teilchen angebracht. Vorzugsweise wird der Antikörper an der Well-Oberfläche einer 96-Well-ELISA-Platte angebracht. Eine 100-μl-Probe (z. B. Serum, Urin, Gewebecytosol), die das KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein (Wildtyp oder Mutanten) enthält, wird dem Festphasenantikörper zugesetzt. Die Probe wird 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nächstes wird die Probenflüssigkeit dekantiert und die feste Phase wird mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. 100 μl eines zweiten monoklonalen Antikörpers (zu einer anderen Determinante auf dem KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein) wird der festen Phase zugesetzt. Dieser Antikörper ist mit einem Detektormolekül (z. B. 125I, Enzym, Fluorophor oder einem Chromophor) markiert und die feste Phase mit dem zweiten Antikörper wird zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der zweite Antikörper wird dekantiert und die feste Phase wird mit Puffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Die Menge an gebundenem Marker, die zu der Menge an in der Probe vorliegendem KVLQT1- oder KCNE1-Peptid/Protein proportional ist, wird quantifiziert. Separate Assays werden unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die für das Wildtyp-KVLQT1 oder -KCNE1 spezifisch sind, sowie monoklonaler Antikörper, die für jede der in KVLQT1 oder KCNE1 identifizierten Mutationen spezifisch ist, durchgeführt.
BEISPIEL 20
Assay zum Screenen von Wirkstoffen, die den KVLQT1- und den KCNE1-K⁺-Kanal beeinflussen
Mit dem Wissen, dass KVLQT1 und KCNE1 coassemblieren, um einen kardialen IKs-Kaliumkanal zu bilden, ist es jetzt möglich, einen Assay zum Screenen nach Wirkstoffen zu entwickeln, die eine Auswirkung auf diesen Kanal ausüben werden. Die zwei Gene, KVLQT1 und KCNE1, werden in Oozyten oder Säugerzellen kotransfiziert und wie oben beschrieben koexprimiert. Die Kotransfektion wird unter Verwendung einer beliebigen Kombination von Wildtyp- oder spezifisch mutiertem KVLQT1 und KCNE1 durchgeführt. Wenn eines der zur Kotransfektion verwendeten Gene eine Mutation enthält, die LQT verursacht, wird im Vergleich zu der Kotransfektion mit nur Wildtyp-Genen eine Veränderung des induzierten Stroms erkannt. Ein Wirkstoffkandidat wird der Badelösung der transfizierten Zellen zugegeben, um die Auswirkungen der Wirkstoffkandidaten auf den induzierten Strom zu testen. Ein Wirkstoffkandidat, der den induzierten Strom derart verändert, dass er dem mit Zellen, die mit Wildtyp-KVLQT1 und -KCNE1 kotransfiziert wurden, erkannten ähnlicher ist, ist zum Behandeln von LQT von Nutzen.
Obgleich die Erfindung in dieser Patentanmeldung unter Bezugnahme auf die Einzelheiten bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung offenbart wurde, ist zu verstehen, dass die Offenbarung in einem veranschaulichenden anstatt in einem einschränkenden Sinne gedacht ist, als auch in Erwägung gezogen wird, dass Modifikationen Fachmännern innerhalb des Sinns der Erfindung und des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche leicht einfallen werden.
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Patente und Patentanmeldungen:

Europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 0332435.
EPO-Veröffentlichung Nr. 225,807.
Hitzeman et al., EP 73,675 A .
EP 425,731 A .
WO 84/03564.
WO 90/07936.
WO 92/19195.
WO 93/07282.
WO 94/25503.
WO 95/01203.
WO 95/05452.
WO 96/02286.
WO 96/02646.
WO 96/11698.
WO 96/40871.
WO 96/40959.
WO 97/02048.
WO 97/12635.
US-Patentschrift 3,817,837.
US-Patentschrift 3,850,752.
US-Patentschrift 3,939,350.
US-Patentschrift 3,996,345.
US-Patentschrift 4,275,149.
US-Patentschrift 4,277,437.
US-Patentschrift 4,366,241.
US-Patentschrift 4,376,110.
US-Patentschrift 4,486,530.
US-Patentschrift 4,554,101.
US-Patentschrift 4,683,195.
US-Patentschrift 4,863,202.
US-Patentschrift 4,816,567.
US-Patentschrift 4,868,105.
US-Patentschrift 5,252,479.
US-Patentschrift 5,270,184.
US-Patentschrift 5,409,818.
US-Patentschrift 5,436,146.
US-Patentschrift 5,455,166.
US-Patentschrift 5,550,050.
US-Patentschrift 5,691,198.
US-Patentschrift 5,735,500.
US-Patentschrift 5,747,469.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine isolierte DNA, kodierend für ein Polypeptid der SEQ ID NO:4, umfassend eine Mutation, wobei diese Mutation dazu führt, dass die isolierte DNA kodiert: a) ein Leucin am Codon 28, b) ein Histidin am Codon 32, c) ein Tryptophan am Codon 98, d) ein Alanin am Codon 127 oder e) ein Threonin am Codon 127.
Eine isolierte DNA, umfassend die Nukleinsäure der SEQ ID NO:3 oder ihr Komplement, wobei diese DNA eine Mutation umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) ein T bei Base 275 der SEQ ID NO:3, b) ein A bei Base 287 der SEQ ID NO:3, c) ein T bei Base 484 der SEQ ID NO:3, d) ein G bei Base 571 der SEQ ID NO:3 und e) ein A bei Base 571 der SEQ ID NO:3.
Eine Nukleinsäuresonde, die spezifisch mit der DNA von Anspruch 1 oder 2 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei diese stringenten Hybridisierungsbedingungen die Nukleinsäuresonde an der Hybridisierung mit DNA der SEQ ID NO:3 hindern.
Ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Polymorphismus, der das Long-QT-Syndrom verursacht, umfassend Hybridisierung einer Sonde aus Anspruch 3 mit einer DNA- oder RNA-Probe eines Patienten unter stringenten Bedingungen, die die Hybridisierung dieser Sonde mit Nukleinsäure erlauben, umfassend den Polymorphismus, aber Hybridisierung dieser Sonde mit einer Nukleinsäure der SEQ ID NO:3 verhindern, wobei die Gegenwart eines Hybridisierungssignals die Gegenwart dieses Polymorphismus anzeigt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die DNA oder RNA des Patienten amplifiziert wurde und diese amplifizierte DNA oder RNA hybridisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Hybridisierung in situ durchgeführt wird.
Ein In-vitro-Verfahren zur Diagnostizierung der Gegenwart eines Polymorphismus in humanem KCNE1, der das Long-QT-Syndrom verursacht, wobei dieses Verfahren mit Mitteln durchgeführt wird, die die Gegenwart dieses Polymorphismus identifizieren, wobei dieser Polymorphismus einer ist, der aus der Gegenwart eines KCNE1-Polypeptids der SEQ ID NO:4 mit einer geänderten Aminosäure resultiert, wobei diese geänderte Aminosäure ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: a) ein Leu bei Rest 28, b) ein His bei Rest 32, c) ein Trp bei Rest 98, d) ein Ala bei Rest 127 und e) ein Thr bei Rest 127.
Das Verfahren von Anspruch 7, wobei dieser Polymorphismus aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus: a) einem T bei Base 83 der kodierenden Region, b) einem A bei Base 95 der kodierenden Region, c) einem T bei Base 292 der kodierenden Region, d) einem G bei Base 379 der kodierenden Region, und e) einem A bei Base 379 der kodierenden Region.
Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, wobei das Mittel die Verwendung einer Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Technik umfasst, um auf diesen Polymorphismus hin zu untersuchen.
Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, wobei das Mittel die Sequenzierung von humanem KCNE1 umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 7 oder 8, wobei das Mittel die Durchführung eines RNAse-Assays umfasst.
Ein Antikörper, der an ein mutiertes KCNE1-Polypeptid bindet, aber nicht an ein Wildtyp-KCNE1-Polypeptid, wobei dieses mutierte KCNE1-Polypeptid SEQ ID NO:4 ist, umfassend: a) ein Leu bei Rest 28, b) ein His bei Rest 32, b) ein Trp bei Rest 98, d) ein Ala bei Rest 127 oder e) ein Thr bei Rest 127.
Ein Verfahren zur Diagnostizierung des Long-QT-Syndroms, wobei dieses Verfahren aus einer Untersuchung auf die Gegenwart von mutiertem KCNE1-Polypeptid in einem Patienten besteht, indem eine Patientenprobe mit einem Antikörper gemäß Anspruch 12 zur Reaktion gebracht wird, wobei die Gegenwart einer positiven Reaktion das Long-QT-Syndrom anzeigt.
Ein isoliertes KCNE1-Polypeptid der SEQ ID NO:4, umfassend eine Mutation, die das Long-QT-Syndrom verursacht, wobei diese Mutation ist: a) ein Leu bei Rest 28, b) ein His bei Rest 32, b) ein Trp bei Rest 98, d) ein Ala bei Rest 127 oder e) ein Thr bei Rest 127.
Eine Zelle, transfiziert mit der DNA von Anspruch 1 oder 2.
Ein Vektor, umfassend die isolierte DNA von Anspruch 1 oder 2.
Eine Zelle, transfiziert mit dem Vektor von Anspruch 16.
Ein nicht humanes, transgenes Tier, umfassend die DNA von Anspruch 1 oder 2.
Ein nicht humanes, transgenes Tier, umfassend den Vektor von Anspruch 16.
Ein Verfahren zum Screenen nach Wirkstoffen, die bei der Behandlung einer Person mit einer Mutation in KCNE1 von Nutzen sind, wobei dieses Verfahren umfasst: a) Setzen eines ersten Satzes an Zellen, die KCNE1 mit einer Mutation exprimieren, in eine Badelösung, um einen ersten induzierten K+-Strom zu messen; b) Messen des ersten induzierten K+-Stroms; c) Setzen eines zweiten Satzes an Zellen, die Wild-Typ-KCNE1 exprimieren, in eine Badelösung, um einen zweiten induzierten K+-Strom zu messen; d) Messen des zweiten induzierten K+-Stroms; e) Zugabe eines Wirkstoffs zu der Badelösung von Schritt (a); f) Messen eines dritten induzierten K+-Stroms der Zellen in Schritt (e); und g) Bestimmen, ob der dritte induzierte K+-Strom dem zweiten induzierten K+-Strom ähnlicher ist, als der erste induzierte K+-Strom, wobei Wirkstoffe, die zu einem dritten induzierten K+-Strom führen, der näher an dem zweiten induzierten K+-Strom liegt, als der erste induzierte K+-Strom, bei der Behandlung von diesen Personen von Nutzen sind, wobei die Mutation ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Mutation, die führt zu: a) einem Leu bei Rest 28, b) einem His bei Rest 32, c) einem Trp bei Rest 98, d) einem Ala bei Rest 127 oder e) einem Thr bei Rest 127.
Das Verfahren von Anspruch 20, wobei der erste Satz an Zellen, der zweite Satz an Zellen oder beide Sätze an Zellen von einem transgenen Tier erhalten werden oder mit humaner KCNE1-RNA transfiziert werden.
Eine Zelle, transfiziert mit einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid der SEQ ID NO:4 kodiert, wobei dieses Polypeptid umfasst: a) eher ein Leu als ein Ser bei Rest 28, b) eher ein His als ein Arg bei Rest 32, c) eher ein Trp als ein Arg bei Rest 98, d) eher ein Ala als ein Pro bei Rest 127, oder e) eher ein Thr als ein Pro bei Rest 127.