JP2003530814A - 不整脈に関連するヒトｍｉｎｋ遺伝子突然変異 - Google Patents

不整脈に関連するヒトｍｉｎｋ遺伝子突然変異

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Abstract

(57)【要約】 イントロン／エキソンジャンクションの配列を含むゲノム構造をＱＴ延長症候群に関連する遺伝子であるＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１につき開示する。該２つの遺伝子に関するさらなるデータも開示する。また、ＫＶＬＱＴ１において新たに見出された突然変異も開示し、それがＱＴ延長症候群を引起す。該イントロン／エキソンジャンクション配列データは増幅のためのプライマー対および該２つの遺伝子の全てのエキソンを横切る配列のデザインを可能とする。これはＱＴ延長症候群を生じる突然変異の存在につきヒトをスクリーンし得る。アッセイを行って、該ＤＮＡまたはタンパク質のいずれかにおける突然変異につきヒトをスクリーンし得る。該ＤＮＡまたはタンパク質をアッセイに用いて、ＱＴ延長症候群の発症の治療または予防に有用であろう薬剤につきスクリーンすることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、メリーランド州ベセスダのナショナル・インスティチュート・オブ
・ヘルス（National Institute of Health）によって投資された助成金番号ＲＯ
１ ＨＬ４８０７４およびＰ５０−ＨＬ５２３３８−０２（ＳＣＯＲ）、および
米国パブリック・ヘルス・サービス（U.S. Public Health Service）の下で政府
援助によりなされた。連邦政府は本発明において特定の権利を有する可能性があ
る。
【０００２】 （背景技術） 本発明は、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）と関連する遺伝子および遺伝子産物に、
およびＬＱＴの診断方法に関する。 ＬＱＴは、本発明によれば、試験すべき個体のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ 遺伝子のＤＮＡ配列を分析し、各々のＤＮＡ配列を正常なＫＬＶＱＴ１またはＫ ＣＮＥ１ 遺伝子の既知のＤＮＡ配列と比較することにより診断される。また、試
験すべき個体のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子をＬＱＴをもたらす変異に
ついてスクリーニングすることもできる。ＬＱＴが予測できれば、開業医が現存
する医学的療法を用いてこの疾患を予防することも可能となるであろう。本発明
は、さらには、ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１（ｍｉｎＫとしても知られている
）タンパク質が集合して心臓のＩＫＳカリウムチャネルを形成するという知見に
も関する。この知識を用いれば、１個の細胞中でこれら２種のタンパク質を同時
発現させることができ、そのような形質転換された細胞を用いてＬＱＴの治療ま
たは予防に有用であろう薬物をスクリーニングすることもできる。本発明はさら
にはＬＱＴの家系で見つけられたヒトＫＣＮＥ１遺伝子（ヒトｍｉｎＫタンパク
質をコードする遺伝子）中の変異にも関する。 本発明の背景を説明するのに、または実施に関するさらなる詳細な説明を提供
するのに、本明細書にて用いる刊行物および他の文献を、出典を明示することに
より本明細書の一部とし、便宜上、その各々を添付した引用文献の一覧表に示す
。
【０００３】 心臓不整脈が罹患および死亡の一般的原因であり、自然死全体の約１１％を占
める（Kannel、１９８７；Willichら、１９８７）。一般に、生命を脅かす心室
性不整頻摶の個体の前兆診断および治療は粗末であり、ある場合には、医学的管
理が実質的に不整脈および死亡の危険性を増大させる（Cardiac Arrhythmia Sup
presion Trial II Investigators、１９９２）。これらの因子が心臓不整脈の危
険性のある個体の早期検出を可能とし、不整脈の予防に高い優先性を示す。
【０００４】 遺伝子および後天的因子の両方が心臓不整脈を発病する原因である。ＱＴ延長
症候群（ＬＱＴ）は、心室性不整頻摶、特にトルサード・ド・ポアンおよび心室
細動より由来の不意の意識喪失、失神、発作および突然死の原因となる遺伝性心
臓不整脈である（Ward、１９６４；Romano、１９６５；Schwartzら、１９７５；
Mossら、１９９１）。この障害は、一般に、若い、どちらかと言えば、健康な個
体で起こる（Ward、１９６４；Romano、１９６５；Schwartzら、１９７５）。Ｌ
ＱＴ遺伝子キャリアは、大抵、心電図にてＱＴ間隔の延長、異常な心臓性再分極
を明示する（Vincentら、１９９２）。ＬＱＴの臨床的特徴は、一時的な心臓不
整脈、特に再分極に関連する心室性不整頻摶などの、不整脈および心室細動にお
ける心電図の特徴的な波形特性で命名された、トルサード・ド・ポアンに由来す
るものである（Schwartzら、１９７５；MossおよびMcDonald、１９７１）。トル
サード・ド・ポアンは心室細動、特に致死不整脈に変質する可能性がある。ＬＱ
Ｔは一般的な診断疾患ではないが、心室性不整脈は極一般的であり；毎年合衆国
で３０００００以上の市民が突然に死亡しており（Kannelら、１９８７；Willic
hら、１９８７）、多くの場合、その基礎となる機構は異常な心臓の再分極にあ
る。したがって、ＬＱＴは生命を脅かす心臓不整脈を分子レベルで研究する独特
な機会を提供するものである。
【０００５】 遺伝的および後天的形態の両方のＬＱＴが定義されている。後天性ＬＱＴおよ
び二次的不整脈は心臓虚血症、徐脈および低血清中カリウムまたはカルシウム濃
度などの代謝性異常に由来させることができる（Zipes、１９８７）。ＬＱＴは
また、抗生物質、抗ヒスタミン剤、汎用性麻酔剤を含む、最も一般的には、抗不
整脈薬を含む、特定の医薬を用いる治療に由来させることもできる（Zipes、１
９８７）。遺伝的形態のＬＱＴは少なくとも５個の異なる遺伝子が変異したこと
に由来させることができる。従来の研究においては、ＬＱＴ遺伝子座が染色体１
１ｐ１５．５（ＫＶＬＱＴ１またはＬＱＴ１）（Keatingら、１９９１ａ；Keati
ngら、１９９１ｂ）、７ｑ３５−３６（ＨＥＲＧまたはＬＱＴ２）、３ｐ２１−
２４（ＳＣＮ５ＡまたはＬＱＴ３）（Jiangら、１９９４）に地図作成された。
これらのうち、遺伝的ＬＱＴの最も一般的な原因がＫＶＬＱＴ１である。本発明
者らの研究データはこの遺伝子の変異が５０％より多くの遺伝的ＬＱＴに関与し
ているとしている。最近になって、第４のＬＱＴ遺伝子座（ＬＱＴ４）が４ｑ２
５−２７に地図作成された（Schottら、１９９５）。ＫＣＮＥ１（ＬＱＴ５）も
また、ＱＴ延長症候群に関係している（Splawskiら、１９９７ｂ；Duggalら、１
９９８）。これらの遺伝子は心臓作用電位の形成と関連するイオンチャネルをコ
ードする。変異はチャネル機能不全および筋細胞再分極をもたらし得る。心筋で
のチャネル発現が局所的に不均一であるため、心臓再分極が異常であると不整脈
に関する基体が創製される。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１はまた内耳にて発現
される（Neyroudら、１９９７；Vetterら、１９９６）。本発明者および第三者
らは、これらの遺伝子の各々における同型接合体または異型接合体化合物の変異
が難聴および重度の心臓表現型のジャーウェルおよびランゲ−ニールセン（Jerv
ellおよびLange-Nielsen）症候群を惹起し得ることを明らかにした（Neyroudら
、１９９７；Splawskiら、１９９７ａ；Schultze-Bahrら、１９９７；Tysonら、
１９９７）。耳での機能的チャネルの喪失が、難聴に至る、内リンパの生成を破
壊するのは明らかである。
【０００６】 ＬＱＴの前兆診断は、現在のところ、心電図におけるＱＴ間隔の長さを基礎と
している。ＱＴｃ（心拍数について矯正されたＱＴ；Bazzett、１９２０）が０.
４４秒より長いと、伝統的に、罹患している個体と分類される。しかし、大部分
のＬＱＴ患者は、心電図を取っていない、若い、どちらかと言えば、健康な個体
である。その上、遺伝的研究は、ＱＴｃが感受的でも特異的でもないことを明ら
かにした（Vincentら、１９９２）。遺伝子キャリアおよびノンキャリアのＱＴ
ｃ間隔のスペクトルは重複しており、そのため分類を誤る。ノンキャリアが長期
ＱＴｃ間隔を有することもでき、罹患していると診断され得る。逆に、あるＬＱ
Ｔ遺伝子キャリアでは、そのＱＴｃ間隔は０.４４秒以下であるが、不整脈に関
する危険性は高い状態にある。ＬＱＴを効果的かつ遺伝子特異的に治療するため
の正確な前兆診断が重要である。
【０００７】 この障害の常染色体優性形態および常染色体劣性形態が報告されている。常染
色体劣性ＬＱＴ（ジャーウェルおよびランゲ−ニールセン症候群としても知られ
ている）は先天的な神経性難聴と関連しており；この形態のＬＱＴが稀に存在す
る（ジャーウェルおよびランゲ−ニールセン、１９５７）。常染色体優性ＬＱＴ
（ロマノ−ワード（Romano-Ward）症候群）はより一般的であり、他の表現型異
常性に関連していない（Romanoら、１９６３；Ward、１９６４）。遺伝的ＬＱＴ
に極めて類似する障害もまた、通常、薬理学的療法の結果として獲得することが
できる（Schwartzら、１９７５；Zipes、１９８７）。
【０００８】 ＬＴＱに不整脈の機構を暗示するデータがある。以前に、ＬＱＴに関して２つ
の仮定が提案された（Schwartzら、１９９４）。１の仮定は左側自律神経の優勢
が異常な心臓性再分極および不整脈を引き起こすと示唆する。この仮定は右側星
状神経節を除去することで、不整脈がイヌで誘発され得るという知見により支持
されている。加えて、逸話的証拠によれば、β−アドレナリン作動性遮断剤によ
り、および左側星状神経節摘出術により、数人のＬＱＴ患者が効果的に治療され
ている（Schwartzら、１９９４）。ＬＱＴの関連する不整脈に関する第２の仮説
は、心臓イオンチャネルを調節する、心臓特異的イオンチャネル遺伝子（複数で
も可）の変異が筋細胞の再分極の遅れを引き起こすことを示唆する。筋細胞再分
極の遅れはＬ−型カルシウムチャネルの反応性を促進し、第２の脱分極をもたら
し得る（JanuaryおよびRiddle、１９８９）。これらの第２の脱分極はトルサー
ド・ド・ポアン不整脈で起こりそうな細胞機構である（Suwawicz、１９８９）。
この仮定はカルシウムチャネルの薬理学的遮断がＱＴ延長および再分極関連の不
整脈をヒトおよび動物実験で誘発し得るという観察により支持されている（Antz
elevitchおよびSicouri、１９９４）。１の形態のＬＱＴが心臓カルシウムチャ
ネル遺伝子を変異させることで得られるという知見が筋細胞性仮定を支持してい
る。
【０００９】 理論上、心臓性ナトリウムチャネル遺伝子の変異はＬＱＴを引き起こす。電圧
ゲート式ナトリウムチャネルは心室性筋細胞における速やかな脱分極を媒介し、
さらに作用電位が安定期にある間の小さな電流を伝導する（Attwellら、１９７
９）。ナトリウムチャネル機能の僅かな異常性（例えば、ナトリウムチャネル不
活化の遅れおよびチャネル不活化の電位依存性の変化）は、ＱＴ延長および不整
脈に至る、心臓再分極を遅れさせることができる。１９９２年に、Gellensらは
心臓ナトリウムチャネル遺伝子、ＳＣＮ５Ａをクローンして特徴付けた（Gellen
sら、１９９２）。この遺伝子の構造は、２０１６個のアミノ酸のラージタンパ
ク質をコードする、他の、以前に特徴付けられたナトリウムチャネルの構造と同
じであった。これらのチャネルタンパク質は４つの同型ドメイン（ＤＩ−ＤＩＶ
）を含有し、その各々が６個の推定膜スパンニングセグメント（Ｓ１−Ｓ６）を
含有する。最近になって、ＳＣＮ５Ａが染色体３ｐ２１に地図作成されており、
それはＬＱＴ３に対する優れた候補遺伝子とされており（Georgeら、１９９５）
、この遺伝子はＬＱＴ３と関連することが明らかにされた（Wangら、１９９５ａ
）。
【００１０】 １９９４年に、WarmksおよびGanetzkyは新規なヒトｃＤＮＡ、ヒトエーテルａ
-ｇｏ-ｇｏ関連遺伝子を同定した（ＨＥＲＧ、WarmkeおよびGanetzky、１９９４
）。ＨＥＲＧは、体細胞ハイブリッドパネルをＰＣＲ分析に付すことにより、ヒ
ト染色体７にその起源が突きとめられ（WarmkeおよびGanetzky、１９９４）、Ｌ
ＱＴ２の候補とされた。それはカルシウムチャネルと推定アミノ酸配列相同性を
有する。ＨＥＲＧを、カルシウム調節カリウムチャネルをコードする、ドロソフ
ィラエーテルａ−ｇｏ−ｇｏ遺伝子（ｅａｇ）との相同性により海馬ｃＤＮＡラ
イブラリーより単離した（Bruggemannら、１９９３）。ＨＥＲＧはｅａｇのヒト
相同体ではなく、約５０％のアミノ酸配列相同性を有するにすぎない。
【００１１】 ＬＱＴ１がＫＶＬＱＴ１遺伝子と関連することが見出された（Q.Wangら、１９
９６）。ＫＶＬＱＴ１が変異した１６組の家族を同定して特徴付け、１６組の家
族すべてにおいて、ＬＱＴ１とＫＬＶＱＴ１の間に明確な関連のあることが明ら
かにされた。ＫＶＬＱＴ１を染色体１１ｐ１５.５に地図作成し、それをＬＱＴ
１の候補遺伝子とした。ＫＶＬＱＴ１はカリウムチャネルの構造的特徴を有する
タンパク質をコードし、ノーザンブロット分析により測定されるような遺伝子の
発現はＫＶＬＱＴ１が心臓で最も強く発現されることを明らかにした。ＬＱＴを
引き起こす１つの遺伝子内欠失および１０種の異なるミスセンス変異がＫＶＬＱ Ｔ１ で同定された。これらのデータはＫＶＬＱＴ１が新規な心臓カリウムチャネ
ル遺伝子であると定め、この遺伝子における変異が心室性不整頻摶および突然死
に対する罹病性を惹起することを明らかにした。
【００１２】 ＩＫＳの一成分がｍｉｎＫ、すなわち、単一の推定膜スパニングドメインを有
する１３０アミノ酸タンパク質であることは知られていた（Takumiら、１９８８
；GoldsteinおよびMiller、１９９１；Hausdorffら、１９９１；Takumiら、１９
９１；Buschら、１９９２；WangおよびGoldstein、１９９５；KW Wangら、１９
９６）。このタンパク質の大きさおよび構造から、ｍｉｎＫが単独で機能的チャ
ネルを形成することはないようにあった（Attaliら、１９９３；Lesageら、１９
９３）。ＫＶＬＱＴ１とｍｉｎＫを集合させ、心臓ＩＫＳカリウムチャネルを形
成するという証拠が示されている。このことがSanguinettiら（１９９６ｂ）に
より公開された。ＩＫＳ機能不全は心臓不整脈の原因の一である。後にＫＣＮＥ
１（ｍｉｎＫをコードする）における変異もまた、ＬＱＴにて起こり得ることが
明らかにされた（Splawaskiら、１９９７ｂ）。
【００１３】 （発明の概要） 本発明はＬＱＴ遺伝子ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１のゲノム構造を教示する
。この教示はイントロン／エキソン境界の教示を包含する。また、ＬＱＴに関連
する両方の遺伝子、ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１ならびにその変異について今
までに報告されたことのない配列データを開示する。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮ Ｅ１ 遺伝子の分析は、ＬＱＴの対象の早期診断方法を提供する。この診断方法は
、試験すべき個体のＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮＥ１遺伝子のＤＮＡ配列
を分析し、本来の非変種遺伝子のＤＮＡ配列と比較することを特徴とする。第２
の具体例において、試験すべき個体のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子をＬ
ＱＴを引き起こす変異についてスクリーニングする。ＬＱＴを予測することがで
きれば、内科医はベータ遮断薬などの医薬を用いて疾患を予防することができる
であろう。 さらには、ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１（ｍｉｎＫ）を集合させて心臓性ＩＫＳ カリウムチャネルを形成することも示されている。ＩＫＳ機能不全は心臓不
整脈の原因の一つである。これら２つのタンパク質を集合させてＩＫＳチャネル
を形成するという知識は、ＬＱＴ１の治療または予防に有用である薬物について
スクリーニングするアッセイを開発するのに有用である。両方の遺伝子を卵母細
胞などの細胞に同時に発現させることで、野生型およびその変異形態の両方にお
ける、ＩＫＳチャネルに対して一の作用を有する薬物についてスクリーニングす
ることができる。この知識はまた、ＬＱＴの対象を早期診断する場合のＫＣＮＥ １ 遺伝子の分析にも有用である。診断方法はＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮ Ｅ１ について上記したように行う。
【００１４】 （図面の簡単な記載） 図１はＬＱＴ血族１５３２の一部についての家系構造を示す。罹患した個体を
黒塗り丸（女性）または黒塗り四角（男性）で、罹患していない個体を中抜き記
号で示し、一義的でない表現型の個体に斑点を付けた。染色体１１マーカーの遺
伝子型を各記号の真下に示し、単模式種として示す。マーカーの順序（上から下
）は：Ｔｅｌ−ＨＲＡＳ−Ｄ１１Ｓ９２２−ＴＨ−Ｄ１１Ｓ１３１８−Ｄ１１Ｓ ４５４ −Ｄ１１Ｓ８６０−Ｄ１１Ｓ１２−Ｃｅｎである。単模式種の精度を付加
的な染色体１１ｐ１５.５マーカーから由来の遺伝子型を用いて確実にした。推
論した遺伝子型を括弧で示す。疾患となる染色体をボックスで囲み、組み合わせ
事象を水平な実線で示す。疾患染色体に影響を及ぼす組み合わせ事象が個体：Ｉ
Ｖ−２２、ＩＶ−２５、Ｖ−６、Ｖ−１７、Ｖ−２４、Ｖ−３４、ＶＩ−１３、
ＶＩ−１４およびＶＩ−１６で起こる。非疾患染色体で起こる組み合わせ事象は
図示せず。ＫＶＬＱＴ１はプライマー５および６で同定されたＫＶＬＡＴ１内に
あるＳＳＣＰ配座異性体である；この配座異性体はＫ１５３２だけで同定され、
疾患関連変異を示す（対立遺伝子２は変異体対立遺伝子である）。単模式種分析
は、ＫＶＬＱＴ１が隣接するマーカーＤ１１Ｓ９２２とＤ１１Ｓ４５４の間にあ
ることを示す。
【００１５】 図２はＬＱＴ１領域の物理的地図を示す。染色体１１の記号はＬＱＴ１（１１
ｐ１５.５）のおよその位置を示す。多形態マーカーおよび数個のコスミドの位
置を地図上に縦線で示す。ＴＨとＤ１１Ｓ４５４の間のＬＱＴ１についての細か
い遺伝的地図を示す。ＴＨとＤ１１Ｓ４５４の間の距離をパルスフィールドゲル
電気泳動分析により＜７００ｋｂであると推定した。オーバーラップＹＡＣとＰ
１クローンの最小のセットの物理的地図を示す。ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡとトラ
ップされたエキソンの位置を示す。ＹＡＣにある点線はキメラ現象を示す。 図３は、ＫＶＬＱＴ１のＳ１−Ｓ６領域の、ドロソフィラ・シェイカー（Dros
ophila Shaker）カリウムチャネル、ＤＭＳＨＡＫＥ１（ＳＨＡ）（Pongsら、１
９８８）との位置関係を示す。同一（|）および類似（：）を示す。ＫＶＬＱＴ
１の３つの分離したフラグメントは、順次、配列番号：１０７、配列番号：１０
８および配列番号：１０９である。ＤＭＳＨＡＫＥ１の３つの分離したフラグメ
ントは、順次、配列番号：１１０、配列番号：１１１および配列番号：１１２で
ある。 図４はヒトの心臓、胎盤、肺、腎臓および膵臓にてＫＶＬＱＴ１が発現したこ
とを示すノーザンブロット分析を示す。
【００１６】 図５Ａ−５Ｂは、ＫＬＶＱＴ１コーディング領域と５’および３’非翻訳領域
のゲノムオルガニゼーションを示す。イントロンの位置を矢印で示す。６個の推
定膜スパニングセグメント（Ｓ１ないしＳ６）および推定ポア領域（Pore）に下
線を付す。停止コドンに星印を付す。図５Ａ−５Ｂのヌクレオチド配列を配列番
号：１に示す。図５Ａ−５Ｂのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。 図６は、ＫＶＬＱＴ１の物理的地図およびエキソンオルガニゼーションを示す
。ＫＶＬＱＴ１のゲノム領域は約４００ｋｂからなる。オーバーラップＰ１クロ
ーンの最小コンチグとエキソン１含有のコスミドの物理的地図を示す。ＫＶＬＱ
Ｔ１エキソンのゲノムクローンとの相対的な位置を示す。エキソンの大きさおよ
び距離はスケールに対応して図示するものではない。 図７Ａ−７Ｅは、ＣＨＯ細胞にてＫＶＬＱＴ１とｈｍｉｎＫを一緒に発現させ
ると、心臓性ＩＫＳと略同じ電流を誘発することを示す。Ａ）−８０ｍＶの保持
電位より作動させ、−５０ないし＋４０ｍＶの膜電位に対する１秒間の脱分極パ
ルスの間に記録したＫＶＬＱＴ１電流を示す。尾部電流は−７０ｍＶで測定した
。Ｂ）ＫＶＬＱＴ１（ｎ＝６;１秒パルス）またはＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ
１（ｎ＝７；７.５秒パルス）でトランスフェクトした細胞についての、標準化
した等時性活性化曲線を示す。Ｃ−Ｅ）ＫＣＮＥ１（Ｃ）、ＫＶＬＱＴ１（Ｄ）
またはＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１（Ｅ）でトランスフェクトした細胞にて、
−４０、−２０、−１０、０、＋２０および＋４０ｍＶに対する７.５秒のパル
スの間に記録した電流を示す。尾部電流はＤでは−７０ｍＶで、ＣおよびＥでは
−５０ｍＶで測定した。＋４０ｍＶで定常状態にあるＫＶＬＱＴ１電流の強度は
０.３７±０.１４ｎＡ（ｎ＝６）であった。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１で一
緒にトランスフェクトした細胞においては、＋４０ｍＶに対する７.５秒のパル
スの間の時間依存性電流は１.６２±０.３９ｎＡ（ｎ＝７）であった。
【００１７】 図８Ａ−８Ｃは、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞におけるＫＶＬＱ
Ｔ１の発現を示す。Ａ）１２.５ｎｇのＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡを注入した卵母細
胞にて記録した電流を示す。−７０から＋４０ｍＶまで１０ｍＶずつ増加させて
パルスを加えた。Ｂ）ＫＶＬＱＴ１電流についての等時性（１秒）活性化曲線を
示す。そのＶ１／２は−１４.０±０.２ｍＶであり、勾配因子は１１.２±０.２
ｍＶ（ｎ＝９）であった。Ｃ）Ｅｒｅｖ対ｌｏｇ［Ｋ＋］ｅの関係は一次関数に
なり、その勾配は４９.９±０.４ｍＶであった（ｎ＝６−７卵母細胞／点）。尾
部電流は＋１０ｍＶに対する１.６秒のプレパルスの後に数ボルトで測定した。 図９Ａ−９Ｅは、ＫＶＬＱＴ１およびｈｍｉｎＫの同時発現がアフリカツメガ
エル卵母細胞でのＫＶＬＱＴ１相同体の存在の示唆を示す。５.８ｎｇのＫＶＬ
ＱＴ１（図９Ａ）、１ｎｇのＫＣＮＥ１（図９Ｂ）のいずれかを注入した、また
は両方のｃＲＮＡ（図９Ｃ）を注入した卵母細胞における−４０、−２０、０、
＋２０および＋４０ｍＶでの電流を記録した。図９Ｄは、ＫＶＬＱＴ１では２秒
パルスを、ｈｍｉｎＫまたはＫＶＬＱＴ１およびｈｍｉｎＫでは７.５秒パルス
を用いて測定した電流−電圧の関係を示す（各条件について、ｎ＝２０細胞）。
６０ｐｇまたは１ｎｇのＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞の場合、＋４
０ｍＶでのＩＳＫは２.１１±０.１２μＡおよび２.２０±０.１８μＡであった
。図９ＥはＫＣＮＥ１を注入した卵母細胞での（Ｖ１／２＝２.４±０.３ｍＶ；
勾配＝１１.４±０.３ｍＶ；ｎ＝１６）またはＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡを一緒に注入した卵母細胞での（Ｖ１／２＝６.２±０.３ｍＶ；勾配＝
１２.３±０.２ｍＶ；ｎ＝２０）標準化した等時性活性化曲線を示す。
【００１８】 図１０は、ヒトＫＶＬＱＴ１アミノ酸配列の一部とアフリカツメガエルＫＶＬ
ＱＴ１アミノ酸配列の一部の比較を示す。縦線は同じ残基を示す。アフリカツメ
ガエルのアミノ酸配列を配列番号：１１３に示し、ヒトのアミノ酸配列を配列番
号：１１４に示す。 図１１Ａ−１１Ｄは、血族Ｋ１５３２（図１１Ａ）、Ｋ２６０５（図１１Ｂ）
、Ｋ１７２３（図１１Ｃ）およびＫ１８０７（図１１Ｄ）において、ＫＶＬＱＴ
１ミスセンス変異がＬＱＴと一緒に分離したことを示す。プライマー対５−６（
Ｋ１５３２）、プライマー対９−１０（Ｋ１７２３，Ｋ１８０７）およびプライ
マー対１１−１２（Ｋ２６０５）を用いるＳＳＣＰ分析の結果を各家系について
示す。各血族中の異常なＳＳＣＰコンフォマー（＊で特定する）はＬＱＴと共に
分離する。Ｋ１５３２では、２１７人の個体のうちわずか８人について示す。Ｋ
１６１およびＫ１６２でＬＱＴと一緒に分離した異常なＳＳＣＰコンフォマーは
Ｋ１８０７で特定された異常なコンフォマーと同じであったため、これらの血族
での結果は図示しない。正常な（左）および異常な（右）コンフォマーのＤＮＡ
配列分析の結果を各家系について示す。
【００１９】 図１２Ａ−１２Ｏは、血族Ｋ１３２１６（図１２Ａ）、Ｋ１７７７（図１２Ｂ
）、Ｋ２０９２５（図１２Ｃ）、Ｋ２５５７（図１２Ｄ）、Ｋ１３１１９（図１
２Ｅ）、Ｋ２０９２６（図１２Ｆ）、Ｋ１５０１９（図１２Ｇ）、Ｋ２６２５（
図１２Ｈ）、Ｋ２６７３（図１２Ｉ）、Ｋ３６９８（図１２Ｊ）、Ｋ１９１８７
（図１２Ｋ）、Ｋ２２７０９（図１２Ｌ）、Ｋ２７６２（図１２Ｍ）、Ｋ３４０
１（図１２Ｎ）およびＫ２８２４（図１２Ｏ）にて、ＬＱＴに伴うＫＶＬＱＴ１
の遺伝子内欠失およびミスセンス変異を示す。罹患した個体を黒塗り丸（女性）
および四角（男性）で示す。罹患していない個体を中抜き記号で示し、特定され
ない個体を灰色または斑点を付して示す。プライマー対１−２（Ｋ１３２１６、
Ｋ２５５７、Ｋ１３１１９、Ｋ１５０１９）、プライマー対７−８（Ｋ１７７７
、Ｋ２０９２６）およびプライマー対９−１０（Ｋ２０９２５）を用いたＳＳＣ
Ｐ分析の結果を、図１２Ａ−１２Ｇで各家系について示す（プライマー対に関す
る表５を参照のこと）。Ｋ２０５０、Ｋ１６３およびＫ１６４にてＬＱＴと一緒
に分離した異常なＳＳＣＰコンフォマーは、Ｋ１７２３およびＫ１８０７にて特
定された異常なコンフォマーと同じであるため、これらの家系に関する結果を図
示しない。図１２Ａ−１２Ｇでは、正常な（左）および異常な（右）コンフォマ
ーのＤＮＡ配列分析の結果を各家系について記載する。図示した配列はアンチセ
ンス鎖上にある。図１２Ｈ−１２Ｏでは、異常なＳＳＣＰコンフォマーを矢印で
示す。
【００２０】 図１３Ａ−１３Ｃは、ＬＱＴに関係するＫＣＮＥ１変異を示す。血族１７８９
（図１３Ａ）および１７５４（図１３Ｂ）のＬＱＴに関する家系構造を示す。罹
患した個体を黒塗り丸（女性）および四角（男性）で示す。罹患していない個体
を中抜き記号で示す。死亡した個体を斜線を付して同定する。疾患を伴って分離
した異常なＳＳＣＰコンフォマーを各家系について示す。ＬＱＴに関係しない通
常の多形性（Ｇ３８Ｓ）もまたこれらのプライマーで検出される。ｈｍｉｎＫタ
ンパク質配列に対する変異の効果を示す。図１３ＣはＬＱＴ関連の変異の位置を
示すｈｍｉｎＫタンパク質の模式図である。 図１４Ａ−１４Ｂは、ＩＫＳの大きさが注入したＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡの関数
として変化することを示す。Ａ）卵母細胞に６ｎｇ／卵母細胞のＫＶＬＱＴ１お
よび特定されるように可変量のＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡを注入した後の、＋４０ｍ
Ｖに対する７.５秒のパルスで惹起される代表的な電流トレーシングを示す。０.
０１ｎｇのＫＣＮＥ１を注入した卵母細胞にて、ＫＶＬＱＴ１電流が存在するこ
と、およびＩＫＳの存在しないことに注意すること。Ｂ）＋４０ｍＶに対する７
.５秒のパルスに付した後の電流の大きさを標準化し、１.２ｎｇのＫＣＮＥ１を
注入することで得られる電流を最大とした。その値を平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.で示す。
ｎは一群当たり卵母細胞を８個とする。
【００２１】 図１５Ａ−１５Ｂは、Ｄ７６ＮＫＣＮ１変異の機能的効果を示す。Ａ）ＩＫＳ は−８０ｍＶの保持電位から−４０ないし＋４０ｍＶの試験電位まで７.５秒の
パルスに付すことで惹起された。非活性化している尾部電流は膜電位を−５０ｍ
Ｖに戻すことで惹起された。Ｂ）ＩＫＳ−ＷＴ（ｎ＝１４）とＩＫＳ−Ｄ７６Ｎ （ｎ＝１４）との等時性電流−電圧の関係はＤ７６ＮでＩＫＳの顕著なネガティ
ブな抑制を示した（ｐ＜０.０００１）。Ｃ）７.５秒試験パルスを用いる、ＩＫ Ｓ−Ｄ７６ Ｎ活性化の電位依存性は、ＩＫＳ−ＷＴと比べて、＋１６ｍＶシフト
した。標準化された尾部電流の滑らかな曲線がボルツマン関数と最もよく適合す
る（ＩＫＳ−ＷＴでは、Ｖ１／２＝１０.８±０.８ｍＶ、勾配因子＝１２.１±
０.３ｍＶ；ＩＫＳ−Ｄ７６Ｎでは、Ｖ１／２＝２５.７±１.０ｍＶ［ｐ＜０.０
００１、ＩＫＳ−ＷＴとの比較］、勾配因子＝１２.０±０.２ｍＶ；ｎ＝１４）
。Ｄ）ＩＫＳ−Ｄ７６ＮはＩＫＳ−ＷＴよりも速く非活性化する。ＩＫＳは＋２
０ｍＶまでの５秒パルスにより活性化され、尾部電流を指示された電位で測定し
た。尾部電流は指数関数に適合した。挿入図は、＋２０ｍＶに対する電圧工程に
付した後の、−５０ｍＶでの標準化非活性化尾部電流を示す。
【００２２】 図１６Ａ−１６Ｄは、Ｓ７４Ｌ ＫＣＮＥ１変異の機能的効果を示す。Ａ）−
４０、−２０、０＋２０および＋４０ｍＶに対する７.５秒の脱分極の間に記録
されたＩＫＳ−ＷＴおよびＩＫＳ−Ｓ７４Ｌを示す。ＩＫＳ−ＷＴと比べて、ＩＫＳ−Ｓ７４Ｌ 尾部電流の非活性化速度が速いことに注意する。Ｂ）ＩＫＳ−Ｗ Ｔ とＩＫＳ−７４Ｌ（ｎ＝１５）の等時性電流―電圧関係を示す。Ｃ）ＩＫＳ− Ｓ７４Ｌ 活性化の電位依存性がＩＫＳ−ＷＴと比べて＋１９ｍＶシフトしている
。標準化された尾部電流の滑らかな曲線がボルツマン関数と最もよく適合する（
ＩＫＳ−ＷＴでは、Ｖ１／２＝１３.７±０.６ｍＶ、勾配因子＝１６.０±０.３
ｍＶ；ＩＫＳ−Ｓ７４Ｌでは、Ｖ１／２＝３３.６±０.８ｍＶ、勾配因子＝１３
.３±ｍＶ［共にＩＫＳ−ＷＴに対してｐ＜０.０００１］）。Ｄ）ＩＫＳ−Ｓ７ ４Ｌ はＩＫＳ−ＷＴよりも速く非活性化する。
【００２３】 図１７はＫＣＮＥ１の物理的地図およびエキソンオルガニゼーションを示す。 ＫＣＮＥ１ 転写物全体に広がる２つのコスミドクローンを図示する。コスミド１
はエキソン３の末端にまで伸びておらず、コスミド２はエキソン１および２を含
まない。エキソンの大きさおよび距離はスケールに合うように図示していない。 図１８は、ＫＣＮＥ１コーディングのゲノムオルガニゼーションならびに５’
および３’非翻訳領域を示す。イントロンの位置を矢印で示す。両方のイントロ
ンも５’非翻訳領域内にあることに注意する。星印は停止コドンを示す。図１８
のヌクレオチド配列を配列番号：３に示す。図１８のアミノ酸配列を配列番号：
４に示す。
【００２４】 （配列表の簡単な記載） 配列番号：１はヒトＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡである。配列番号：２はヒトＫＶ
ＬＱＴ１タンパク質である。配列番号：３はヒトＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡである。
配列番号：４はヒトＫＣＮＥ１タンパク質である。配列番号：５−６は相同性を
計算するのに用いる仮定上の核酸である。配列番号：７−８はヒトＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡを捕獲し、修復するのに用いるオリゴヌクレオチドである（実施例４
を参照のこと）。配列番号：９−４０はヒトＫＶＬＱＴ１のイントロン／エキソ
ン境界を示す（表３）。配列番号：４１−７４はＫＶＬＱＴ１エキソンを増幅す
るのに用いるプライマーである（表４）。配列番号：７５−８６はＫＶＬＱＴ１ 変異を限定するのに用いるプライマーである（表５）。配列番号：８７−９２は
ゲノムＫＣＮＥ１を増幅するのに用いるプライマー対である。配列番号：９３−
９４はＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡを増幅するのに用いるプライマーである。配列番号
：９５−１００はＫＣＮＥ１のイントロンおよびエキソン境界である（表８）。
配列番号：１０１−１０６はＫＣＮＥ１エキソンを増幅するためのプライマーで
ある（表９）。配列番号：１０７−１０９は図３に示すＫＶＬＱＴ１のフラグメ
ントである。配列番号：１１０−１１２は図３に示すＤＭＳＨＡＫＥのフラグメ
ントである。配列番号：１１３は図１０に示すアフリカツメガエルＫＶＬＱＴ１
の一部である。配列番号：１１４は図１０にヒトＫＶＬＱＴ１の一部である。
【００２５】 発明の詳細な説明 本発明はＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１のゲノム構造ならびにＬＱＴの発病を
引き起こす、あるいは発病に関与しているこれらの遺伝子の分子変種に関する。
また本発明は、ＫＶＬＱＴ１およびｍｉｎＫが集合して心臓Ｉｋｓカリウムチャ
ネルを形成することを調べることにも関する。より詳細には、本発明は、ＫＶＬ ＱＴ１ 遺伝子における変異、さらにはＫＣＮＥ１遺伝子における変異、ならびに
ＬＱＴの診断におけるそれらの使用に関する。さらに本発明は、ＬＱＴを引き起
こすＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮＥ１遺伝子変種の存在についてヒトをス
クリーニングする方法に指向される。現在、ＬＱＴはより早期に（すなわち、徴
候出現前に）かつ明確に検出できるので、ＬＱＴを有すると同定された個体にお
いてより良い治療の選択が可能である。また本発明は、ＬＱＴ１の治療または予
防に有用な薬剤のスクリーニング方法にも指向される。
【００２６】 本発明は、ＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮＥ１遺伝子をスクリーニングし
て変異を同定する方法を提供する。かかる方法は、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ １ 遺伝子の一部を増幅する工程をさらに含んでいてもよく、さらにＫＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１遺伝子の該一部を増幅するためのプライマーである１セットの
ポリヌクレオチドを用意する工程を含んでいてもよい。該方法は、ＬＱＴの診断
またはＬＱＴの予後のいずれかに使用する変異の同定に有用である。
【００２７】 さらに本発明は、染色体２１上のＫＣＮＥ１（文献ではｍｉｎＫとも称される
ＫＣＮＥ１をコードしている）もまたＬＱＴに関与していることを示す。ｍｉｎ
Ｋタンパク質およびＫＶＬＱＴ１は集合してＫ＋チャネルを形成する。よって、
本発明は、ＫＣＮＥ１遺伝子をスクリーニングして変異を同定する方法を提供す
る。さらに、かかる方法はＫＣＮＥ１遺伝子の一部を増幅する工程を含んでいて
もよく、さらにＫＣＮＥ１遺伝子の該一部の増幅を行うためのプライマーである
１セットのポリヌクレオチドを用意する工程を含んでいてもよい。該方法は、Ｌ
ＱＴの診断またはＬＱＴの予後に使用する変異の同定に有用である。
【００２８】 最後に、本発明は、薬剤候補をスクリーニングしてＬＱＴの治療または予防に
有用な薬剤を同定する方法に指向される。卵母細胞、哺乳動物細胞またはトラン
スジェニック動物のごとき細胞中で変異ＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮＥ１ 遺伝子を同時発現させ、次いで、ＩＫｓチャネルに対する薬剤候補の影響をアッ
セイすることにより薬剤スクリーニングを行う。該影響を、野生型ＫＶＬＱＴ１ およびＫＣＮＥ１遺伝子のＩＫｓチャネル活性と比較する。
【００２９】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子がＬＱＴの発症に関与していることの証
明は、異常なＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子産物あるいは異常なレベルの
該遺伝子産物を生じさせる配列を罹患した血族メンバーから抽出したＤＮＡ中で
見出すことにより得られる。かかるＬＱＴの疑いのある対立遺伝子は多数の血縁
者において疾病と共分離するであろう。それらは、一般人の集団中の個体よりも
ＬＱＴ罹患した非血族個体においてずっと高頻度に存在するであろう。これらの
変異は多くの形態であり得る。最も重大な形態は、遺伝子が異常なタンパク質を
コードすることとなる、あるいはタンパク質発現を有意に変化させることとなる
フレームシフト変異または大規模欠失であろう。あまり重大でない崩壊的変異は
、システインへのまたはシステインからの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ
酸への変化またはその逆、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化またはそ
の逆、あるいは２次または３次タンパク質構造に影響する他の変異のごとき、生
成タンパク質に有意な影響を与える小規模なイン−フレーム欠失および非保存的
塩基対の置換を包含するであろう。サイレント変異または保存的アミノ酸の置換
を生じさせる変異は、一般的にはタンパク質機能を崩壊させないと考えられる。
【００３０】 本発明の診断および予後方法によれば、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ 遺伝子の変化が検出される。さらに、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝
子を検出し、この遺伝子座の結果としてのＬＱＴの原因の欠如を確認することに
より本発明方法を行うことができる。「野生型遺伝子の変化」は、コーディング
および非コーディング領域における欠失、挿入および点突然変異を包含するすべ
ての形態の変異を含む。欠失は遺伝子全体であってもよく、遺伝子の一部だけで
あってもよい。点突然変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置
換を引き起こすものであってもよい。体細胞変異は、特定組織においてのみ生じ
、生殖系においては遺伝されないものである。生殖系変異はいすれの体組織にお
いても見ることができ、遺伝される。点突然変異は遺伝子のプロモーターのごと
き調節領域において生じることもあり、ｍＲＮＡ発現の消失または減少を導く。
また点突然変異は正しいＲＮＡプロセッシングを停止させ、ＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 遺伝子産物の発現の消失、あるいはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率
の低下を導く。
【００３１】 有用な診断方法は、後でさらに詳細に説明するが、蛍光イン・サイチュ（in s
itu）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分
析、サザンブロット分析、１本鎖コンホーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮａ
ｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブ
ロット分析ならびにＰＣＲ−ＳＳＣＰを包含するが、これらに限らない。
【００３２】 ＫＶＬＱＴ１遺伝子またはＫＣＮＥ１遺伝子の変異に関してヒトのいずれの組
織を試験することによってもＬＱＴの存在を確認することができる。例えば、生
殖系ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１変異を遺伝している人はＬＱＴを発症する傾
向がある。このことを、その人の身体のいずれの組織から得たＤＮＡを試験する
ことによっても調べることができる。最も簡単には、採血し、血液細胞からＤＮ
Ａを抽出する。さらに、胎児細胞、胎盤細胞または羊水細胞をＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１の変異について調べることにより出生前診断を行うことができる。
野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子の変化は、点突然変異または欠
失によるものであっても、本明細書で議論するいずれかの手段により検出するこ
とができる。
【００３３】 ＤＮＡ配列の変化を検出するために使用されるいくつかの方法がある。直接Ｄ
ＮＡ配列決定は、手動配列決定または自動蛍光配列決定法であり、配列の変化を
検出できる。別のアプローチは１本鎖コンホーメーション多型性アッセイ（ＳＳ
ＣＰ）（Orita et al., 1989）である。この方法は、特にＤＮＡフラグメントサ
イズが２００ｂｐ以上である場合にはすべての配列変化を検出するものではない
が、大部分のＤＮＡ配列の変化を検出するように最適化できる。低下した検出感
度は不利であるが、ＳＳＣＰを用いた場合の高処理量は研究による変異の検出の
ための直接配列決定にとり魅力的かつ実行可能な別法である。次いで、ＳＳＣＰ
ゲル上で変化した移動度を有するフラグメントを配列決定して、ＤＮＡ配列変化
の正確な性質を調べる。２つの相補的ＤＮＡ鎖間のミスマッチの検出に基づく他
のアプローチはクランプされた変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel ele
ctrophoresis (CDGE)）（Sheffield et al., 1991）、ヘテロ２本鎖分析（ＨＡ
）（White et al., 1992）および化学的ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）（Grompe et
al., 1989）を包含する。上記方法は大きな欠失、重複または挿入を検出するも
のではなく、さらに転写またはタンパク質への翻訳に影響する調節的変異を検出
するものでもない。タンパク質末端切断アッセイまたは非対称アッセイのごとき
、これらのクラスの変異を検出できる他の方法は、特定タイプの変異のみを検出
し、ミスセンス変異を検出しないものである。現在利用可能なＤＮＡ配列変化検
出方法のレビューはGrompe(1993)の最近のレビューに見られる。変異が知られた
ものである場合には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリ
ダイゼーションのごとき対立遺伝子に特異的な検出アプローチを用いて同じ変異
に関して多数の他の試料を迅速にスクリーニングすることができる。かかる方法
には、可視的な結果が得られるように金微粒子で標識したプローブを使用できる
（Elghanian et al., 1997）。
【００３４】 １種またはそれ以上の制限酵素、好ましくは多種の制限酵素で切断したＤＮＡ
の一連のサザンブロットを観察することにより、ＤＮＡ配列中の多型性を検出す
るための迅速な予備分析を行うことができる。各ブロットは一連の正常個体およ
び一連のＬＱＴ症例のものを含む。ハイブリダイゼーションしているフラグメン
トを示すサザンブロット（ＫＶＬＱＴ１遺伝子座付近またはこれを含む配列でプ
ローブした場合には対照ＤＮＡとは長さが異なる）は変異の可能性を示す。非常
に大きな制限フラグメントを生じる制限酵素を使用した場合には、パルスフィー
ルドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いる。
【００３５】 当該分野においてよく知られた方法を用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対
立遺伝子を分子クローニングし、次いで対立遺伝子の配列決定を行うことにより
点突然変異の検出を行ってもよい。また、例えば、ＰＣＲまたは他の増幅方法を
用いて遺伝子またはその遺伝子の一部を増幅してもよく、増幅された遺伝子また
はその遺伝子の一部を配列決定してもよい。
【００３６】 可能な対立遺伝子の存在を確認するための、より完全であるが、やはり間接的
な試験方法が６つ知られている：１）１本鎖コンホーメーション分析（ＳＳＣＰ
）（Orita et al., 1989）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（
Wartell et al., 1990; Shefield et al., 1989）；３）ＲＮａｓｅ保護アッセ
イ（Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991）；４）対立遺伝子特
異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）（Conner et al., 1983）；５）E. coli m
utSタンパク質のごとき、ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用
（Modrich, 1991）；ならびに６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ruano and Kidd, 1
989）。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関しては、３’末端において特定のＫＶＬＱ
Ｔ１またはＫＣＮＥ１変異にハイブリダイゼーションするプライマーを使用する
。特定の変異が存在しない場合には、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公
開第０３３２４３５号およびNewton et al., 1989に開示された増幅困難変異系
（Amplification Refractory Mutation System(ARMS)）を用いてもよい。クロー
ニング、配列決定および増幅により遺伝子の挿入および欠失を検出することもで
きる。さらに、遺伝子または周辺マーカー遺伝子用の制限フラグメント長多型性
（ＲＦＬＰ）プローブを用いて、対立遺伝子の変化または多型性フラグメント中
の挿入を評価することができる。かかる方法は、罹病個体において見出される変
異の存在に関して罹病個体の親類をスクリーニングする際に特に有用である。当
該分野において知られた挿入および欠失を検出するための他の方法を用いること
もできる。
【００３７】 最初の３つの方法（ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ）にお
いて、新たな電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＰは異なって移動するバンドを
検出するものである。なぜなら配列の変化は１本鎖の分子内塩基対形成において
相違を生じさせるからである。ＲＮａｓｅ保護は、変異ポリヌクレオチドを開裂
して２個またはそれ以上の小さなフラグメントにすることを含む。ＤＧＧＥは、
変性グラジエントゲルを用いて、野生型配列と比較した場合の変異配列の移動速
度の相違を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては
、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、ハイブリダイゼーション
シグナルの存在または不存在を検出することによりアッセイを行う。mutSアッセ
イにおいては、変異配列および野生型配列間のヘテロ２本鎖中のヌクレオチドミ
スマッチを含む配列にのみタンパク質が結合する。
【００３８】 本発明によれば、ミスマッチとは、２つの鎖が１００％の相補性を有しない場
合にハイブリダイゼーションした核酸２本鎖である。全体的な相同性の欠如は欠
失、挿入、逆位または置換による可能性がある。ミスマッチの検出を用いて遺伝
子またはそのｍＲＮＡ生成物中の点突然変異を検出することができる。これらの
方法は配列決定法よりも感度が低いが、多数の試料について実行することが簡単
である。ミスマッチ開裂法の例はＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実施に際し
て、本発明方法は、ヒト野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子コーディン
グ配列に対して相補的な標的リボプローブの使用を含む。リボプローブおよびヒ
トから単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかをアニーリング（ハイブリダ
イゼーション）させ、次いで、２本鎖ＲＮＡ構造中のいくつかのミスマッチを検
出できる酵素ＲＮａｓｅＡで消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅＡにより検出さ
れる場合、それはミスマッチ部位で開裂を引き起こす。よって、アニーリングし
たＲＮＡ調合物を電気泳動ゲルマトリックスで分離する場合において、ミスマッ
チが検出されて、ＲＮａｓｅにより開裂されるならば、リボプローブおよびｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡに関して全長２本鎖ＲＮＡよりも小型のＲＮＡ生成物が見られ
るであろう。リボプローブは全長のｍＲＮＡまたは遺伝子である必要はないが、
いずれかのセグメントであってもよい。リボプローブがｍＲＮＡまたは遺伝子の
セグメントのみを含む場合、これらのプローブを多種使用して、ミスマッチに関
してｍＲＮＡ配列全体をスクリーニングすることが望ましい。
【００３９】 類似のやり方で、酵素的または化学的開裂を用いて、ミスマッチを検出するた
めにＤＮＡプローブを用いることができる。例えば、Cotton et al., 1988; She
nk et al., 1975; Novak et al., 1986参照。別法として、マッチした２本鎖と
比較した場合のミスマッチ２本鎖の電気泳動度の変化によりミスマッチを検出す
ることもできる。例えば、Cariello, 1988参照。リボプローブまたはＤＮＡプロ
ーブのいすれかを用い、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲ（下記参照）を用
いて、変異を含む可能性のある細胞のｍＲＮＡまたはＤＮＡを増幅することがで
きる。特に、変化が欠失および挿入のごとき大きな転位である場合には、サザン
ハイブリダイゼーションを用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子のＤＮＡ
における変化を検出することもできる。
【００４０】 ＰＣＲを用いることにより増幅され得るＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子
のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを用いてスクリーニングしてもよい
。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、各オリゴマーは既知変異を有する
遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１のオリゴマーは、遺伝子配列の一部
に対応した約３０ヌクレオチドの長さであってもよい。かかる一式の対立遺伝子
特異的プローブを用いることにより、ＰＣＲ増幅生成物をスクリーニングして、
すでに同定されている遺伝子中の変異の存在を同定することができる。例えば、
ナイロン膜上で、対立遺伝子特異的プローブと増幅されたＫＶＬＱＴ１またはＫ ＣＮＥ１ 配列とのハイブリダイゼーションを行うことができる。高ストリンンジ
ェンシー条件下での特定プローブとのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特
異的プローブの場合と同じ組織中の変異の存在を示す。
【００４１】 新たに開発されたマイクロチップ技術による核酸分析方法も本発明に適用可能
である。この方法において、文字通り数千の異なったオリゴヌクレオチドプロー
ブがシリコンチップ上に隊列として構成される。分析すべき核酸を蛍光標識し、
チップ上のプローブとハイブリダイゼーションさせる。これらの核酸マイクロチ
ップを用いて核酸−タンパク質相互作用を研究することも可能である。この方法
を用いて、分析すべき核酸中の変異の存在を検出でき、あるいは目的遺伝子の発
現レベルを測定することができる。該方法は、数千もの多くのプローブを一度に
平行処理する方法であり、分析速度を驚くほど速めることができる。この方法を
使用したいくつかの論文が公表されている。これらのうちいくつかはHacia et a
l., 1996; Shoemaker et al., 1996; Chee et al., 1996; Lockhart et al., 19
96; DeRisi et al., 1996; Lipshutz et al., 1995である。乳癌遺伝子ＢＲＣＡ １ 中の変異に関して人々をスクリーニングするためにこの方法がすでに使用され
ている（Hacia et al., 1996）。この新しい方法はChemical and Engineering N
ewsのニュース論文（Borman, 1996）にレビューされており、論説の主題であっ
た（Editorial, Nature Genetics, 1996）。Fodor(1997)も参照。
【００４２】 候補遺伝子座における変異に関する最も明確な試験は、患者由来のゲノムＫＶ ＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１配列を対照集団由来のものと直接比較することである
。別法として、例えばＰＣＲによる増幅後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定す
ることができ、それにより候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要がなくなる
。
【００４３】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１のコーディング領域の外側にある患者由来の変
異を、それらの遺伝子付近または遺伝子中のイントロンおよび調節配列のごとき
非コーディング配列を調べることにより検出することができる。非コーディング
領域中の変異が重要であるという初期の証拠は、対照個体と比較した場合の患者
中の異常なサイズあるいは多量のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノー
ザンブロット実験から得られたものといえる。
【００４４】 当該分野において知られたいずれかの方法を用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮ Ｅ１ ｍＲＮＡ発現の変化を検出することができる。これらの方法はノーザンブ
ロット分析、ＰＣＲ増幅、およびＲＮａｓｅ保護を包含する。減少したｍＲＮＡ
発現は野生型遺伝子の変化を示す。野生型遺伝子の変化は、野生型ＫＶＬＱＴ１
またはＫＣＮＥ１タンパク質の変化についてスクリーニングすることによっても
検出され得る。例えば、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１と免疫反応するモノクロ
ーナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。同族抗原の欠如は
変異を示す。変異対立遺伝子産物に特異的な抗体を用いて変異遺伝子産物を検出
することもできる。当該分野において知られたいずれかの便利なフォーマットを
用いてかかる免疫学的アッセイを行うことができる。これらのフォーマットはウ
ェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを包含す
る。変化したＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１タンパク質を検出するためのいずれ
かの手段を用いて野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の変化を検出する
ことができる。タンパク質結合決定試験のごとき機能アッセイを用いることがで
きる。さらに、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の生物学的機能を検出するアッセ
イを使用することもできる。変異したＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子産物
を見出すことは、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の変化を示すもの
である。
【００４５】 変異ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子または遺伝子産物を、血清、便、尿
および痰のごとき他の人体試料において検出することもできる。組織中の変異し
た遺伝子または遺伝子産物の検出に関して上で述べたのと同じ方法を他の身体試
料に適用することができる。かかる身体試料をスクリーニングすることにより、
ＬＱＴに関して単純かつ早期の診断を行うことができる。
【００４６】 本発明のプライマーペアーは、ＰＣＲを用いる特定のＫＶＬＱＴ１またはＫＣ ＮＥ１ 対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。ＫＶＬＱＴ１に関す
る１本鎖ＤＮＡプライマーのペアーを染色体１１上のＫＶＬＱＴ１遺伝子中また
はその周辺の配列にアニーリングさせて、当該遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を
開始させることができる。ＫＣＮＥ１に関する１本鎖ＤＮＡプライマーのペアー
を染色体２１上のＫＣＮＥ１遺伝子中またはその周辺の配列にアニーリングさせ
て、当該遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を開始させることができる。これらのプ
ライマーの完全なセットは遺伝子コーディング配列、すなわちエキソンのすべて
のヌクレオチドの合成を可能にする。好ましくは、プライマーのセットはイント
ロン配列およびエキソン配列の両方の増幅を可能にするものである。対立遺伝子
特異的プライマーを用いることもできる。かかるプライマーは特定のＫＶＬＱＴ １ またはＫＣＮＥ１変異対立遺伝子にのみアニーリングし、かくして、変異対立
遺伝子が鋳型として存在する場合にのみ生成物を増幅するであろう。
【００４７】 増幅配列のその後のクローニングを容易化するために、プライマーはその５’
末端に制限酵素部位配列が付いたものであってもよい。よって、制限酵素部位を
形成するに必要なわずかのヌクレオチドを除いて、プライマーのすべてのヌクレ
オチドはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１配列あるいはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮ Ｅ１ に隣接した配列に由来するものである。かかる酵素および部位は当該分野に
おいてよく知られている。当該分野においてよく知られた方法を用いてプライマ
ー自体を合成してもよい。一般的には、市販オリゴヌクレオチド合成装置を用い
てプライマーを作成することができる。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１の配列が
得られたならば、個々のプライマーの設計は当業者のよく為すところである。本
発明は、イントロン／エキソン境界のデータをさらに提供するものであり、その
ことによりすべてのエキソン領域を完全に増幅し配列決定するためのプライマー
を設計することを可能にする。
【００４８】 本発明により提供される核酸プローブは多くの目的に有用である。それらをゲ
ノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションに使用することができ、すで
に上で述べた点突然変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用することもで
きる。それらのプローブを用いてＰＣＲ増幅生成物を検出することができる。他
の方法を用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子またはｍＲＮＡをのミスマ
ッチを検出するためにそれらのプローブを用いてもよい。
【００４９】 野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子を有する個体はＬＱＴを有しない
ことが見出されている。しかしながら、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子産
物の機能を妨害する変異がＬＱＴの発病に関与している。よって、機能を失った
、あるいは機能が変化したタンパク質を生じさせる変化した（あるいは変異した
）ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の存在は、心臓不整脈の危険性を増大さ
せるＬＱＴを直接引き起こす。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子変異を検出
するために、生物学的試料を調製し、分析すべき対立遺伝子と野生型対立遺伝子
との間の相違に関して分析する。上記のいずれかの方法により変異ＫＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１対立遺伝子を先ず同定することができる。次いで、変異対立遺
伝子を配列決定して特定の変異対立遺伝子の特定の変異を同定する。別法として
、変異した（変化した）タンパク質を同定することにより変異対立遺伝子を先ず
同定することができる。次いで、変異対立遺伝子を配列決定して各対立遺伝子に
関して特定の変異を同定する。そして、特に、タンパク質の変化した機能を生じ
させる変異を本発明の診断および予後方法に使用する。
【００５０】 ＫＶＬＱＴ１タンパク質がｍｉｎＫタンパク質と集合することも見出されてい
る。よって、ＫＣＮＥ１遺伝子産物の機能を妨害するＫＣＮＥ１（ｍｉｎＫをコ
ードする）中の変異がＬＱＴの発病に関与している。よって、機能を消失した、
あるいは機能が変化したタンパク質を生じさせる変化した（あるいは変異した） ＫＣＮＥ１ 遺伝子の存在は、心臓不整脈の危険性を増大させるＬＱＴを直接引き
起こす。ＫＣＮＥ１遺伝子変異を検出するために、生物学的試料を調製し、分析
すべき対立遺伝子と野生型対立遺伝子との間の相違に関して分析する。上記のい
ずれかの方法により変異ＫＣＮＥ１対立遺伝子を先ず同定することができる。そ
して慣用的な方法を用いて変異対立遺伝子を配列決定して特定の変異した（変化
した）タンパク質の特定の変異を同定する。次いで、変異対立遺伝子を配列決定
して各対立遺伝子に関して特定の変異を同定する。そして、特に、タンパク質の
変化した機能を生じさせる変異を本発明の診断および予後方法に使用する。
【００５１】定義 本発明は以下の定義を採用する： 「ポリヌクレオチドの増幅」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲ
ーションアンプリフィケーション（すなわちリガーゼ連鎖反応，ＬＣＲ）および
Ｑ−βレプリカーゼの使用に基く増幅方法のごとき方法を利用する。また、スト
ランドディスプレースメント増幅（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ、および核酸配列に
基いた増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）も有用である。これらの方法は当業者に
周知であり、本分野で広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１
９５号および第４，６８３，２０２号ならびにInnisら，１９９０年（ＰＣＲに
ついて）；WuおよびWallace，１９８９年（ＬＣＲについて）；米国特許第５，
２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号ならびにWalkerら，１９９２年
（ＳＤＡについて）；Spargoら，１９９６年（好熱性ＳＤＡについて）；Spargo
ら，１９９６年（好熱性ＳＤＡ）および米国特許第５，４０９，８１８号，Fahy
ら，１９９１年およびCompton，１９９１年（３ＳＲおよびＮＡＳＢＡについて
）を参照。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは商業的に入手可能であ
る。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１領域由来の配列を増幅するために有用なプラ
イマーは、好ましくはＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１領域内の配列またはその
中の標的配列に隣接する領域内の配列に相補的であり、および特異的にこれらに
ハイブリダイズする。増幅によって生じたＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１配列は
直接配列決定できる。別法として、ただしあまり好ましくないが、増幅配列を配
列分析前にクローニングしてもよい。酵素的に増幅したゲノム断片の直接クロー
ニングおよび配列分析の方法はScharfら，１９８６年によって開示されている。
【００５２】 「検体ポリヌクレオチド」および「検体鎖」とは、標的配列を含むと推測され
る１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドをいい、それらは生物学的試料を包含
する様々なタイプの試料に存在していてもよい。 「抗体」。本発明はまた、ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドおよ
びそれらの断片またはＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１領域由来のポリヌクレオ
チド配列に特異的に結合できるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗
体およびそれらの断片、ならびにそれらの免疫学的に結合する同等物も提供する
。「抗体」なる用語は、均一の分子実体、または抗体生産物のように大多数が異
なる分子実体からなる混合物をいうのに共に用いられる。ポリヌクレオチドを、
ペプチドシンセサイザーにおいて合成的に調製し、キャリヤー分子（例、キーホ
ール・リンペット・ヘモシアニン）に結合させ、および数ヶ月にわたってウサギ
に注入できる。ウサギ血清をＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたは
それらの断片に対する免疫反応性について試験する。タンパク質ポリペプチド、
融合タンパク質またはそれらの断片をマウスに注入することにより、モノクロー
ナル抗体を作成できる。モノクローナル抗体はＥＬＩＳＡによってスクリーニン
グされ、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはそれらの断片との特
異的な免疫反応性について試験される。HarlowおよびLane，１９８８年を参照。
これらの抗体はアッセイおよび医薬において有用である。
【００５３】 十分量の目的のポリペプチドが得られれば、それを様々な目的に用いることが
できる。典型的な使用は、結合について特異的な抗体の生産である。これらの抗
体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、当業者に周知のイン・ビトロ
またはイン・ビボのどちらの技術で生産されてもよい。ポリクローナル抗体の生
産のため、適当な標的免疫系（典型的にはマウスまたはウサギ）を選択する。動
物について適当な方法および免疫学者に周知の他のパラメーターによって決定さ
れた形式で、実質的に精製された抗原が免疫系に与えられる。注入のための典型
的な部位は足蹠中、筋肉内、腹腔内、または皮内である。当然、他の種をマウス
またはウサギに代えてもよい。ついで、目的の特異性のために適合させて、当業
者に既知の技術を用いてポリクローナル抗体を精製する。
【００５４】 通常、免疫アッセイにより免疫学的応答を検定する。通常、かかる免疫アッセ
イは、例えば抗原と同じ細胞および同じ形式で生産された抗原のソースの何らか
の精製を含む。様々な免疫アッセイ方法が当業者に周知である。HarlowおよびLa
ne，１９８８年、またはGoding，１９８６年を参照。
【００５５】 典型的には、例えばHarlowおよびLane，１９８８年、またはGoding，１９８６
年に記載のごとき標準的方法により、親和性１０−８Ｍ−１、または好ましくは
１０−９〜１０−１０Ｍ−１またはそれ以上のモノクローナル抗体が作成される
。要するに、適当な動物が選択され、望ましい免疫化プロトコールに従う。適当
な期間の後、適当な選択条件下で、かかる動物の脾臓を摘出し、個々の脾臓細胞
を溶かし、典型的には、ミエローマ細胞を不死化する。その後、細胞をクローン
分離し、抗原の目的の領域に特異的な適当な抗体の生産について各クローンの上
清を試験する。
【００５６】 他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のイン・ビトロ曝露、ま
たは別法として、ファージもしくは類似のベクター中の抗体ライブラリーの選択
物へのリンパ球のイン・ビトロ曝露を含む。Huseら，１９８９年を参照。本発明
のポリペプチドおよび抗体は、修飾して、または修飾せずに使用できる。多くの
場合、ポリペプチドおよび抗体を、検出可能なシグナルを与える基質を共有結合
的または非共有結合的に結合させることにより標識する。広範な標識および結合
技術が知られており、科学文献と特許文献の両方で広く報告されている。適当な
標識は放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤
、磁性粒子などである。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，
８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，
９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号および第
４，３６６，２４１号がある。また、組換え免疫グロブリンを生産することもで
きる（米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【００５７】 「結合パートナー」とは、例えば抗原と抗原特異的抗体または酵素とその阻害
剤のように、高い特異性でリガンド分子を結合できる分子をいう。通常、特異的
結合パートナーは単離条件下で、十分な親和性で検体コピー／相補２重鎖（ポリ
ヌクレオチドハイブリダイゼーションの場合）に結合して固定しなければならな
い。特異的結合パートナーは当業者に既知であり、例えば、ビオチンとアビジン
またはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、多くの受容体−リガンドの
組、および相補的ポリヌクレオチド鎖を含む。相補的ポリヌクレオチド結合パー
トナーの場合、パートナーは通常少なくとも１５塩基の長さであり、および少な
くとも４０塩基の長さであってもよい。１５未満の長さ（例、８塩基）、１５〜
４０の間、および４０より多い塩基もまた用いることができることは当業者に理
解されよう。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチドアナ
ログを含む。さらに、結合パートナーは本明細書に記載のごとく例えば２−ハイ
ブリッド酵母スクリーニングアッセイを用いて同定できる。
【００５８】 「生物学的試料」とは、個体由来の検体ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
を含むことが推測される組織または流体の試料（特に限定されるものではないが
、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の表面切片、呼吸器、腸および尿生
殖器の管、涙、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織およびイン・ビトロ細胞培養
構成物を含む）をいう。
【００５９】 「コードする（Encode）」。ポリヌクレオチドが、本来の状態で、または当業
者に周知の方法で操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリヌクレ
オチドのｍＲＮＡおよび／もしくはポリペプチドまたはそれらの断片を生産する
場合、ポリヌクレオチドはポリペプチドを「コードする」という。アンチセンス
鎖はかかる核酸の相補体であり、コード配列はそれらから推測できる。
【００６０】 「単離された」または「実質的に純粋な」。「単離された」または「実質的に
純粋な」核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、天然では本来のヒ
ト配列またはタンパク質に付随している他の細胞成分（例、リボソーム、ポリメ
ラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列およびタンパク質）から実質的に分離されて
いるものである。当該用語は、天然に存在する環境から移動させられた核酸配列
またはタンパク質を包含し、および組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物および
化学合成アナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。
【００６１】 「ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子」とは、各々ＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 遺伝子座の正常な対立遺伝子およびＬＱＴを生じる変種を担うＫＶＬ ＱＴ１ またはＫＣＮＥ１対立遺伝子をいう。
【００６２】 「ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子座」、「ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ １ 遺伝子」、「ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１核酸」または「ＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１ポリヌクレオチド」とは、各々正常な組織で発現すると考えられる
ポリヌクレオチド（それらは全てＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１領域内である）
をいい、その対立遺伝子にはＬＱＴを生じるものがある。ＫＶＬＱＴ１またはＫ ＣＮＥ１ 遺伝子座はコード配列、介在配列ならびに転写および／または翻訳を調
節する翻訳制御因子を包含することを意図する。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ 遺伝子座は当該ＤＮＡ配列の全ての対立性変種を包含することを意図する。「Ｋ ＣＮＥ１ 」および「ｍｉｎＫ」なる用語は相互に交換して用いることができる。
【００６３】 これらの用語は、核酸に適用された場合、ヒトＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１
ポリペプチド、断片、相同体または変種（例えばタンパク質融合体または欠失体
を包含する）をコードする核酸をいう。本発明の核酸は天然のＫＶＬＱＴ１もし
くはＫＣＮＥ１コード遺伝子または天然のＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１コー
ド遺伝子と実質的に相同性を有するものあるいはそれらの一部に由来の配列また
は実質的に類似する配列を有する。
【００６４】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の遺伝子または核酸は各々ＫＶＬＱＴ１もしく
はＫＣＮＥ１遺伝子の正常な対立遺伝子（ＫＶＬＱＴ１ポリペプチドもしくはＫ
ＣＮＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えないサイレント対立遺伝子お
よび実質的に機能に影響を与えないＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチ
ドのアミノ酸配列変種を導く対立遺伝子を包含する）を包含する。またこれらの
用語は、ＫＶＬＱＴ１ポリペプチドもしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドの機能に悪
影響を及ぼす１以上の変異を有する対立遺伝子も包含する。変異は、ＫＶＬＱＴ
１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列における有害な変化を生じ、
ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の機能の部分的または完全な欠失の結果を与える
、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１核酸配列における変化であってもよい。あるい
は、有効なＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１の発現の損失またはＫＶＬＱＴ１も
しくはＫＣＮＥ１ポリペプチドの異常型の生産の結果をあたえる、核酸配列の変
化であってもよい。
【００６５】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１核酸は配列番号：１（ＫＶＬＱＴ１）または配
列番号：３（ＫＣＮＥ１）に示されるものであってもよく、上記のような対立遺
伝子、または示した配列の１以上の核酸の１以上の付加、挿入、欠失および置換
である変化により、示したものとは異なる変種もしくは誘導体であってもよい。
ヌクレオチド配列に対する変化がタンパク質レベルでのアミノ酸変化の結果を生
じるか否かは遺伝子コードによって決定される。
【００６６】 したがって、本発明の核酸は配列番号：１および３に示す配列とは異なり、さ
らに配列番号：２（ＫＶＬＱＴ１）および４（ＫＣＮＥ１）に示したものと同じ
アミノ酸配列のポリペプチドをコードする配列を包含し得る。すなわち、本発明
の核酸は遺伝子コードの縮重の結果として生じる配列を包含する。一方、コード
されたポリペプチドは配列番号：２および４に示すアミノ酸配列とは１以上のア
ミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含んでもよい。本発明は、配列番号：２およ
び４に示すアミノ酸配列のアミノ酸配列変種、誘導体または対立形質もまた提供
する。
【００６７】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子はまた、各々（ａ）（ｉ）配列番号：２
または配列番号：４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補鎖に、高
度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし（Ausubelら，１９９２年）
、および（ｉｉ）ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１に対して機能的に同等の遺伝子
産物をコードする、あらゆるＤＮＡ配列、あるいは（ｂ）（ｉ）配列番号：２ま
たは配列番号：４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補鎖に、より
ストリンジェントではない条件下でハイブリダイズし（Ausubelら，１９９２年
）、および（ｉｉ）ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１に対して機能的に同等の遺伝
子産物をコードする、あらゆるＤＮＡ配列もいう。本発明はまた本明細書に記載
の配列の相補鎖である核酸分子も包含する。
【００６８】 本発明のポリヌクレオチド組成物は、当業者に容易に理解されるように、ＲＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、および混合ポリマー、センス鎖およびア
ンチセンス鎖の両方を包含し、化学的または生化学的に修飾されていてもよく、
非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有していてもよい。かかる修飾は、
例えば、標識、メチル化、アナログにより天然に生じるヌクレオチドの１以上の
置換、非電荷結合（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミ
デート、カルバミデート、等）、電荷結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロ
ジチオエート、等）、未決定の（pendent）分子（例、ポリペプチド）、インタ
ーカレーター（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレーター、アルキレータ
ー、および修飾結合（例、αアノマー核酸、等）のごときヌクレオチド間修飾を
含む。水素結合および他の化学的相互作用を介して目的の配列に結合する能力に
おいてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた包含される。かかる分子は当
業者に既知であり、例えばペプチド結合が分子骨格においてリン酸結合に置き換
わったものを包含する。
【００６９】 本発明は、ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１領域の全部または一部を含む組換え
核酸を提供する。組換え構築物は宿主細胞中で自律複製可能であってもよい。別
法として、組換え構築物は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。かか
る組換えポリヌクレオチドは、そのオリジンまたは操作の効力により、１）天然
では会合するポリヌクレオチドの全部または一部と会合しない；２）天然で結合
するもの以外のポリヌクレオチドに結合する；または３）天然に存在しない、ゲ
ノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成オリジンのポリヌクレオチドを含有する。
本発明の核酸がＲＮＡを包含する場合、示した配列のリファレンスはＲＮＡ同等
物と比較してＵによってＴが置き換えられて解釈される。
【００７０】 したがって、他で天然に存在しない配列を含む組換え核酸は本発明によって提
供される。野生型の配列を用いても良いが、それは、例えば欠失、置換または挿
入によって頻繁に変化する。様々なタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー
を本発明の核酸の天然のソースとしてスクリーニングできる。またはかかる核酸
はゲノムＤＮＡまたはその他の天然のソース中に常在性の配列の増幅により得る
ことができる。ｃＤＮＡライブラリーの選択は通常目的のタンパク質についての
ｍＲＮＡに富んだ組織ソースに対応する。通常ファージライブラリーが好ましい
が、他のタイプのライブラリーを用いても良い。ライブラリーのクローンをプレ
ート上に広げ、スクリーニング用の培養基に移し、変成させ、および目的の配列
について探索する。
【００７１】 本発明において用いられるＤＮＡ配列は、一般に少なくとも約５コドン（１５
ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約７〜１５コドン、もっとも好ましく
は少なくとも３５コドンを有する。１以上のイントロンが存在しても良い。この
ヌクレオチドの数は通常、ＫＶＬＱＴ１コード配列およびＫＣＮＥ１コード配列
に特異的にうまくハイブリダイズするプローブに必要な、ほぼ最小の長さである
。本明細書中、特にチップ技術に関して、８ヌクレオチドの低さ、より一般的に
は８〜１７ヌクレオチドのオリゴマーをプローブとして用いることができる。
【００７２】 核酸操作のための技術は一般的に、例えば、Sambrookら，１９８９年またはAu
subalら，１９９２年に記載されている。制限酵素等のような、かかる技術の適
用に有用な試薬は当業者に周知であり、New England BioLabs, Boehringer Mann
heim, Amersham, Promega, U. S. Biochemicals, New England Nuclearのような
ベンダーおよび多数のソースから商業的に入手可能である。本発明の融合タンパ
ク質を生産するために用いられる組換え核酸配列は天然または合成配列から得て
もよい。多くの天然の遺伝子配列が、適当なプローブを用い、様々なｃＤＮＡま
たはゲノムライブラリーから入手可能である。GenBank, National Institutes o
f Healthを参照。
【００７３】 本明細書中、ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１遺伝子座または領域または対立
遺伝子の「一部」とは、少なくとも８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌ
クレオチド、またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズ
を有するものとして定義され、および少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイ
ズを有していてもよい。この定義は８〜４０ヌクレオチドの範囲内の全てのサイ
ズおよび４０ヌクレオチド以上の全てもサイズを包含する。したがって、この定
義は８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００
、４００、５００ヌクレオチドの核酸、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数
のヌクレオチドを有する核酸（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，
５０，７２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上を有する
核酸を含む。本発明は、配列番号：１または配列番号：３、その相補鎖または機
能的に同等の核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規な核
酸を包含する。本発明は従来技術において存在する核酸は包含しない。すなわち
、本発明は、従来技術に存在する核酸をしない限りにおいて、配列番号：１また
は配列番号：３由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を包含する
。
【００７４】 「ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１タンパク質」または「ＫＶＬＱＴ１およびＫ
ＣＮＥ１ポリペプチド」とは、ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１遺伝子座、それら
の変種または断片によってコードされるタンパク質またはポリペプチドをいう。
「ＫＣＮＥ１」および「ｍｉｎＫ」なる用語は相互に交換して用いられる。「ポ
リペプチド」なる用語はアミノ酸のポリマーおよびその同等物をいい、特定の長
さの生産物；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質をいうも
のではない。この用語はポリペプチドの修飾（例えば、グリコシル化、アセチル
化、リン酸化等）をいうものではなく、これらは除かれる。この定義に含まれる
のは例えば１以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸等を包含す
る）を含有するポリペプチド、置換結合および当業者に既知の他の修飾を有する
ポリペプチドであり、これらは天然に生じるものと非天然に生じるものの両方を
含む。通常、かかるポリペプチドは天然のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１配列に
対して少なくとも約５０％、好ましくは９０％を超える相同性を有し、さらに好
ましくは少なくとも約９５％の同一である。また、高度または低度にストリンジ
ェントな条件下でＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１コード核酸にハイブリダイズす
るＤＮＡによってコードされるタンパク質およびＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１
タンパク質に対する抗血清によって回収される密接に関連するポリペプチドまた
はタンパク質も含まれる。
【００７５】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドは配列番号：２または配列番号：
４に示すものであってもよく、それらは単離および／または精製型であってもよ
く、天然に会合する物質が無く、または実質的に無いものであってもよい。該ポ
リペプチドは、原核細胞での発現により生産される場合または合成的に生産され
る場合、グリコシル化のような本来の翻訳後プロセッシングを欠いていてもよい
。別法として、本発明はまたＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの配列
変異体、対立形質または誘導体であるポリペプチドも導く。かかるポリペプチド
は、１以上のアミノ酸の１以上の付加、置換、欠失または挿入によって、配列番
号：２または配列番号：４に示すものとは異なるアミノ酸配列を有していてもよ
い。好ましくは、かかるポリペプチドはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の機能を
有する。
【００７６】 置換変種は典型的にはタンパク質内の１以上の部位において１アミノ酸の他へ
の交換を含み、他の機能や性質を損なうことなく、タンパク質溶解開裂に対する
安定性のようなポリペプチドの１以上の性質を調節するためにデザインされても
よい。アミノ酸置換は残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／ま
たは両親媒性に基いてなすことができる。好ましい置換は保存的なもの、すなわ
ち、１アミノ酸が類似の形および電荷のものに置換されたものである。保存的置
換は当業者に周知であり典型的には以下のグループ内の置換を含む：グリシン、
アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；および
チロシン、フェニルアラニン。
【００７７】 例えば、抗体の抗原−結合領域または基質分子上の結合部位またはＫＶＬＱＴ
１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドと相互作用するタンパク質上の結合部位のよ
うな構造との相互作用結合能力を認識可能な程度に損なうことなく、タンパク質
構造中の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもよい。タンパク質の生物学
的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、タ
ンパク質配列、およびその基礎をなすＤＮＡコード配列において特定のアミノ酸
置換をなすことができ、それにも関わらず類似の性質のタンパク質が得られる。
かかる変化をなすことにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい
。タンパク質における相互作用的な生物学的機能の供与において疎水性アミノ酸
指標の重要性は一般的に当業者に理解される（KyteおよびDoolittle、1982年）
。別法として、親水性に基き効果的に類似アミノ酸の置換をなすことができる。
タンパク質における相互作用的な生物学的機能の供与において親水性の重要性は
一般的に当業者に理解される（米国特許第４，５５４，１０１号）。ポリペプチ
ドのデザインにおける疎水性指標または親水性の使用は米国特許第５，６９１，
１９８号においてさらに検討されている。
【００７８】 相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも１
６アミノ酸、通常少なくとも約２０残基、より通常では少なくとも約２４残基、
典型的には少なくとも約２８残基、および好ましくは約３５残基以上である。
【００７９】 「作動可能に結合された」とは、記載した成分が意図した方法で機能できる関
係である並置をいう。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影
響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に結合されている。
【００８０】 「ペプチド模倣」または「模倣」なる用語は、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１
ポリペプチドの必須の生物学的活性を有する物質をいうことを意図する。ペプチ
ド模倣は、タンパク質２次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってもよ
い（Johnsonら，１９９３年）。ペプチド模倣の背後の基礎となる原理は、抗体
と抗原の相互作用、酵素と基質または骨格タンパク質のような分子相互作用を促
進するように、タンパク質のペプチド骨格が主にアミノ酸側鎖に向かって存在す
ることである。ペプチド模倣は天然分子と類似の分子相互作用を可能にするよう
にデザインされる。模倣は全くペプチドでなくてもよいが、天然のＫＶＬＱＴ１
またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの必須の生物学的活性は保有する。
【００８１】 「プローブ」。ＬＱＴの素因となるＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子
に関するポリヌクレオチドの多型性は、ストリンジェント〜中ぐらいのストリン
ジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列のポリヌクレ
オチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドプローブとのハイブリ
ダイゼーションによって検出される。プローブが標的配列と完全に相補的である
ことが推測される場合、高度にストリンジェントな条件が用いられる。ある程度
の不一致が予想される場合、例えば、変種が、プローブが完全に相補的でない結
果を予期される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェントさを弱めても
よい。非特異的／不定の結合を制御する、すなわちノイズを最小にする条件が選
択される（本明細書中、単に「ストリンジェントな」条件を用いるという場合、
「高度にストリンジェントな」条件が用いられると読まれることを意図している
。）。かかる指示はニュートラルなＤＮＡ多型性と変異を同一視するので、これ
らの指示はさらにＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１感受性対立遺伝子の検出を示す
ためのさらなる分析が必要である。
【００８２】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子用のプローブは、ＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１領域、そのｃＤＮＡ、機能的に同等の配列、またはそれらの相補鎖
から得ることができる。プローブは、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１領域の全部
または一部にわたり、該領域への特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、
任意の適当な長さであってよい。標的配列がプローブの配列と同一の配列を含む
場合、ハイブリッドはストリンジェントな条件下でも比較的安定なのでプローブ
は短くてもよい（例、約８〜３０塩基対の範囲内）。ある程度のプローブとの不
一致が予想される場合、すなわちプローブが変種領域へハイブリダイズするであ
ろう場合、必要な特異性を有し標的配列にハイブリダイズする、より長いプロー
ブを用いることができる。
【００８３】 プローブは標識またはリポーター分子に結合している単離ポリヌクレオチドを
包含し、標準的な方法により、配列類似性を有する他のポリヌクレオチド配列を
単離するために用いることができる。プローブを調製および標識する技術につい
ては、Sambrookら，１９８９年またはAusubalら，１９９２年を参照。他の類似
ポリヌクレオチドは同一性ポリヌクレオチドを用いることにより選択できる。別
法として遺伝子コードの重複性の使用により、これらの、または類似のポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを、合成または選択してもよい。例えば、サ
イレント変化（それにより様々な制限部位を生じる）により、様々なコドン置換
を導入し、または特定の系について発現を最適化できる。変異を導入して、ポリ
ペプチドの性質を修飾し、あるいはポリペプチド分解またはターンオーバー率を
変化させることができる。
【００８４】 本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含有するプロ
ーブは、天然に発生するかもしくは組換えの１本もしくは２本鎖ポリヌクレオチ
ド、または化学合成から得ることができる。またプローブをニックトランスレー
ション、クレノウフィルインリアクション、その他の当業者に既知の方法により
標識することもできる。
【００８５】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１をコードするポリヌクレオチド配列由来の、少
なくとも約８ヌクレオチド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドで、および約９
ｋｂ未満、通常約１．０ｋｂ未満を有するポリヌクレオチド配列の部分が、プロ
ーブとして好適である。したがって、この定義は８ヌクレオチド〜９０００ヌク
レオチドのサイズのプローブを包含する。したがって、この定義は８、１２、１
５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００
ヌクレオチドのプローブ、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数のヌクレオチ
ドを有するプローブ（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，５０，７
２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上を有するプローブ
を含む。また、当該プローブを用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１をコードす
るｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するかどうかを決定することもできる。本
発明は、配列番号：１もしくは配列番号：３、その相補鎖または機能的に同等の
核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規なプローブを包含
する。本発明は従来技術において存在するプローブは包含しない。すなわち、本
発明は、従来技術に存在するプローブを包含しない限りにおいて、配列番号：１
または配列番号：３由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を包含
する。
【００８６】 類似の考察およびヌクレオチド長をＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の全
部または一部の増幅にも適用できる。したがって、プライマーの定義は８、１２
、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５
００ヌクレオチドのプライマー、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数のヌク
レオチドを有するプライマー（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，
５０，７２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上もしくは
５００〜９０００の間の任意の数のヌクレオチドを有するプローブを包含する。
また、当該プライマーを用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１をコードするｍＲ
ＮＡが細胞または組織中に存在するかどうかを決定することもできる。本発明は
、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子増幅についてのＫＶＬＱＴ１またはＫＣ ＮＥ１ 遺伝子座、その相補鎖または機能的に等価な核酸配列由来の少なくとも８
ヌクレオチドを有する全ての新規なプライマーを包含する。本発明は従来技術に
おいて存在するプライマーは包含しない。すなわち、本発明は、従来技術に存在
するプライマーを包含しない限りにおいて、少なくとも８ヌクレオチドを有する
全ての核酸を包含する。
【００８７】 「タンパク質修飾または断片」は、本発明により、１次構造配列と実質的に同
一であるが、イン・ビボもしくはイン・ビトロの化学的および生化学的修飾を含
み、または異常なアミノ酸を取り込んでいるＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポ
リペプチドまたはそれらの断片を規定する。かかる修飾は、例えばアセチル化、
カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、放射性核種等に
よる標識、および様々な酵素的修飾を包含し、当業者に容易に理解されよう。か
かる目的に有用な、様々なポリペプチド標識方法および置換基または標識は当業
者に周知であり、３２Ｐのような放射活性アイソトープ、標識抗リガンド（例、
抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学ルミネッセンス剤、酵素、お
よび標識リガンドについての特異的結合ペアとして使用できる抗リガンドを包含
する。標識の選択は、必要な感受性、プライマーとの結合の容易さ、安定性の要
求、および利用可能な機器による。ポリペプチド標識方法は当業者に周知である
。Sambrookら，１９８９年またはAusubalら，１９９２年を参照。
【００８８】 実質的に完全長のポリペプチドのほかに、本発明は、ポリペプチドの生化学的
に活性な断片を提供する。重要な生化学的活性は、リガンド結合、免疫学的活性
およびその他のＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドに特有な生化学的
活性を包含する。免疫学的活性は、標的免疫系における免疫学的機能、ＫＶＬＱ
Ｔ１もしくはＫＣＮＥ１タンパク質のエピトープについての拮抗剤または代用抗
原として供される結合に関する免疫学的エピトープの分配、の両方を包含する。
本明細書で用いられる場合、「エピトープ」とはポリペプチドの抗原決定基をい
う。エピトープは、当該エピトープに特有の空間的コンホメーションにおいて３
つのアミノ酸を含むことができる。通常、エピトープは、少なくとも５つのかか
るアミノ酸、およびより通常では少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からな
る。かかるアミノ酸の空間的コンフォメーションの決定方法は当業者に既知であ
る。
【００８９】 免疫学的目的のため、タンデム−リピートポリペプチド断片を抗原として用い
て、高抗原性タンパク質を生産することができる。別法として、かかるポリペプ
チドは特異的結合についての高効率拮抗剤として供される。ＫＶＬＱＴ１もしく
はＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはそれらの断片に特異的な抗体生産は下記に記載
する。
【００９０】 本発明はまた、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドおよびそれらの断
片を含有する融合ポリペプチドも提供する。相同ポリペプチドは、２以上のＫＶ
ＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチド配列間、またはＫＶＬＱＴ１もしくは
ＫＣＮＥ１ポリペプチドおよび関連タンパク質間の融合体であってもよい。同様
に、誘導タンパク質の性質または活性の組み合わせを示す異種性融合体を構築す
ることができる。例えば、リガンド結合または他のドメインを異なる融合ポリペ
プチドまたは断片間で「交換」してもよい。かかる相同または異種融合ポリペプ
チドは、例えば、結合の長さまたは特異性を変化させ得る。融合パートナーは免
疫グロブリン、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラク
タマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母α接合因子を
包含する。Godowskiら，１９８８年を参照。
【００９１】 融合タンパク質は、典型的には下記のような組換え核酸法、または化学合成の
いずれかによってなされる。ポリペプチド合成技術は、例えば、Merrifield（１
９６３年）に記載されている。
【００９２】 「タンパク質精製」とは、ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドまた
はそれらを、ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１をコードする組換え核酸で形質転
換した細胞に由来するような他の生物学的物質から単離する様々な方法をいい、
当業者に周知である。例えば、本発明によって与えられる抗体等を用いる免疫親
和性クロマトグラフィーによって、かかるポリペプチドを精製できる。様々なタ
ンパク質精製方法が当業者に周知であり、Deutscer，１９９０年およびScopes，
１９８２年に記載の方法を包含する。
【００９３】 「単離」、「実質的に純粋」および「実質的に均一」なる用語は、天然状態で
は付随している成分から分離されているタンパク質またはポリペプチドをいい、
相互に交換して用いるられる。モノマータンパク質は、少なくとも試料の約６０
〜７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合に、実質的に純粋である。実質的
に純粋なタンパク質は、典型的には約６０〜９０％Ｗ／Ｗのタンパク質試料を含
み、より通常では約９５％、および好適には約９９％純粋である。タンパク質純
度および均一性は、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く
ゲルの染色に基く単一ポリペプチドバンドの可視化のような当業者に周知の多数
の方法によって示すことができる。特定の目的のため、より高い分離はＨＰＬＣ
または精製に用いられる当業者に周知のその他の手段の使用によって与えられる
。
【００９４】 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１タンパク質は、天然状態では付随している天然
汚染物質から分離された場合、天然の付随成分を実質的に含まない。したがって
、化学的に合成したか、または天然でそれを生じる細胞とは異なる細胞系で合成
したポリペプチドは、それが天然に会合する成分を実質的に含まない。当業者に
周知の精製技術を用いる単離により、タンパク質が天然で会合する成分を実質的
に含まないようにできる。
【００９５】 異種細胞型で発現された場合でも、単離および操作された遺伝配列の発現生産
物として生産されたポリペプチドは、本明細書でいう「単離されたポリペプチド
」である。合成的に作成した型または異種細胞によって発現された分子は、本質
的に単離された分子である。
【００９６】 「組換え核酸」とは、天然には生じない核酸、または２つの別々に分離された
配列断片の人工的な組合わせにより作成された核酸である。この人工的な組合せ
は、多くの場合、化学合成手段または核酸の単離断片の人工的操作（例、遺伝子
工学技術）によってなされる。これは、通常コドンを同一または保存アミノ酸を
コードする重複コドンに置き換えるために行い、典型的にはこれと同時に配列認
識部位を導入または除去する。別法として、目的の機能を有する複数の核酸断片
を一緒にして、目的の機能の組み合わせを生じさせることを行う。
【００９７】 「制御配列」とは、通常、遺伝子座のコード領域から１００ｋｂ以内の配列を
いうが、それらはコード領域から離れていてもよく、遺伝子発現（遺伝子転写、
翻訳、スプライシング、メッセンジャーＲＮＡ安定性等を含む）に影響を与える
。
【００９８】 「実質的相同性または類似性」。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（
またはその相補鎖）と至適に並置された場合に（適切なヌクレオチドの挿入また
は欠失を伴って）ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常には少なくとも
約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、
より好ましくは少なくとも約９５〜９８％においてヌクレオチド配列同一性が存
在すれば、他に対して「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。
【００９９】 ２つの異なる核酸間の相同性を決定するためには、BLASTNプログラム「BLAST
2 Sequences」を使用して％相同性を決定する。このプログラムはNational Cente
r for Biotechnology Information（NCBI）からインターネットを通じて（http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html）公共利用のために入手可能である（Al
tschul et al., 1997）。使用するパラメーターは、括弧内に示す省略時解釈パ
ラメーターを用いて、最高の％相同性（下記のように算出される）が算出される
以下の組合せのいずれかである： program：blastn matrix：0 BLOSUM62 reward for a match − 0または1 (1) penalty for a mismatch − 0、-1、-2または-3 (-2) open gap penalty − 0、1、2、3、4または5 (5) extension gap penalty − 0または1 (1) gap x_dropoff − 0または50 (50) expect − １０
【０１００】 種々の他の結果とともに、このプログラムは、相補鎖にわたるか、または適合
された２つの核酸の領域にわたる％同一性を示す。プログラムは、結果の一部と
して、比較された２つの鎖のアラインメントおよび同一性を示す。鎖長が同じで
ある場合は、同一性は核酸の完全長にわたって算出される。鎖長が異なる場合は
、より短い核酸の長さが使用される。核酸がその配列の一部では非常に類似して
いるが、配列の残りでは異なる場合は、blastnプログラム「BLAST 2 Sequences
」は類似部分のみの同一性を示し、この部分は独立して報告される。本明細書に
おける相同性決定の目的のためには、％相同性は、比較される２つの配列の短い
方に言及する。いずれかの領域が異なるアラインメントにおいて異なる％相同性
を有して示される場合は、最大の相同性を生じるアラインメントが使用される。
平均化は、配列番号：５および６の例のように実行される。 5'-ACCGTAGCTACGTACGTATATAGAAAGGGCGCGATCGTCGTCGCGTATGACGACTTAGCATGC-3'（
配列番号：５） 5'-ACCGGTAGCTACGTACGTTATTTAGAAAGGGGTGTGTGTGTGTGTGTAAACCGGGGTTTTCGGGATCGT
CCGTCGCGTATGACGACTTAGCCATGCACGGTATATCGTATTAGGACTAGCGATTGACTAG-3'（配列番
号：６）
【０１０１】 プログラム「BLAST 2 Sequences」は、選択されたパラメーターに依存してこ
れら２つの核酸の異なるアラインメントを示す。例として、配列番号：５および
６を比較するために４組のパラメーターを選択し（全ての場合についてgap x_dr
opoffは５０であった）、表１に示す結果を得た。表１に示す選択したどの組の
パラメーターも、必ずしもこれらの配列を比較するための最良の組のパラメータ
ーではないことに留意すべきである。％相同性は、同一性を示す各領域に領域内
のより短い鎖の塩基の分数掛けるその領域についての％相同性を掛け、これらを
全て足すことによって算出される。例えば、表１に示す第１組のパラメーターを
使用すれば、配列番号：５がより短い配列であり（６３塩基）、２つの同一性領
域が示され、第１のものは配列番号：５の塩基４〜２９（２６塩基）を含み、配
列番号：６に対する９２％の同一性を有し、第２のものは配列番号：５の塩基３
９〜５９（２１塩基）を含み、配列番号：６に対する１００％の同一性を有する
。塩基１〜３、３０〜３８および６０〜６３（１６塩基）は配列番号：６との同
一性を有するとは示されていない。％相同性は以下のように算出される：(26/63
)(92) + (21/63)(100) + (16/63)(0) = 71.3%相同性。示した４組のパラメータ
ーの各々を使用して算出された％相同性を表１に列挙する。いくつかの他のパラ
メーターの組合せが可能であるが、それらは簡略化のために列挙していない。各
組のパラメーターによって異なる％相同性が算出されていることがわかる。最高
の％相同性を生じる結果を使用するので、これら４組のパラメーターのみに基け
ば、配列番号：５および６は８７．１％相同であることになる。他のパラメータ
ーを使用すれば配列番号：５および６についてより高い相同性を示し得るが、簡
略化のために全ての可能な結果は示していないことに留意すべきである。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】 あるいは、核酸またはそのフラグメントが別の核酸（またはその相補鎖）に選
択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に、鎖またはその
相補物に対して実質的相同性（または類似性）が存在する。ハイブリダイゼーシ
ョンの選択性は、特異性の全体的な欠如よりも実質的に選択的なハイブリダイゼ
ーションが生じる場合に存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーション
は、少なくとも約１４ヌクレオチドにわたる少なくとも約５５％、好ましくは少
なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なく
とも約９０％の相同性が存在する場合に生じる（Kanehisa, 1984参照）。上記の
相同性比較の長さはより長くにわたってもよく、特定の実施態様においてはしば
しば少なくとも約９ヌクレオチド、通常には少なくとも約２０ヌクレオチド、よ
り通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレ
オチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも
約３６ヌクレオチドまたはそれ以上にわたる。
【０１０４】 当業者には容易に理解されるように、核酸ハイブリダイゼーションは、塩基組
成、相補鎖の長さおよびハイブリダイズする核酸間でのヌクレオチド塩基のミス
マッチ数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒のような条件によって影響され
る。ストリンジェントな温度条件は一般に３０℃以上、代表的には３７℃以上、
好ましくは４５℃以上の温度を包含する。ストリンジェントな塩条件は通常１０
００ｍＭ未満、代表的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。
しかし、いずれかの単一のパラメーターの程度よりも、パラメーターの組合せが
ずっと重要である。ストリンジェンシー条件は核酸の長さおよび核酸の塩基組成
に依存し、当該分野において周知の技術によって決定することができる（例えば
、Wetmur and Davidson, 1968参照）。
【０１０５】 プローブ配列はまた、特定の条件下で二重鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズ
して、三重鎖または他のより高次のＤＮＡ複合体を形成し得る。そのようなプロ
ーブの調製および適切なハイブリダイゼーション条件は当該分野において周知で
ある。
【０１０６】 ポリペプチドに言及する場合、用語「実質的相同性」または「実質的同一性」
は、問題のポリペプチドまたはタンパク質が天然のタンパク質全体またはその部
分と少なくとも約３０％の同一性、通常には少なくとも約７０％の同一性、より
通常には少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の同一性
、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示すことを示す。
【０１０７】 ポリペプチドに関して、相同性は、代表的には配列解析ソフトウェアを使用し
て測定される（例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Gene
tics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 U
niversity Avenue, Madison, Wisconsin 53705参照）。タンパク質解析ソフトウ
ェアは、種々の置換、欠失および他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用
して類似配列を適合させる。保存的置換は、代表的には、以下の群内での置換を
包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギ
ン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン
、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０８】 「実質的に類似した機能」は、野生型ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１核酸ま
たは野生型ＫＶＬＱＴ１もしくはＫＣＮＥ１ポリペプチドとの関連で改変された
核酸または改変されたタンパク質の機能をいう。改変ポリペプチドは野生型ＫＶ
ＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドに実質的に相同であり、実質的に同じ機
能を有する。改変ポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有してもよく、そして
／または修飾アミノ酸を含んでもよい。機能の類似性に加えて、改変ポリペプチ
ドは、より長い半減期のような他の有用な特性を有してもよい。改変ポリペプチ
ドの機能（活性）の類似性は、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチ
ドの活性と実質的に同じであってもよい。あるいは、改変ポリペプチドの機能（
活性）の類似性は、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの活性よ
り高くてもよい。改変ポリペプチドは、従来の技術を使用して合成されるか、ま
たは改変核酸によってコードされ、従来の技術を使用して生産される。改変核酸
は従来の技術によって調製される。野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子
機能に実質的に類似の機能を有する核酸は、上記の改変タンパク質を生産する。
【０１０９】 ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」または「セグメント」は、少なく
とも約５〜７個の連続したアミノ酸の、しばしば少なくとも約７〜９個の連続し
たアミノ酸の、代表的には少なくとも約９〜１３個の連続したアミノ酸の、最も
好ましくは少なくとも約２０〜３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸の、一
続きのアミノ酸残基である。
【０１１０】 本発明のポリペプチド（可溶性である場合）を、固相支持体（例えば、ニトロ
セルロース、ナイロン、カラム充填材料（例えば、Sepharoseビーズ）、磁性ビ
ーズ、グラスウール、プラスティック、金属、ポリマーゲル、セルまたは他の基
材）に結合させてもよい。そのような支持体は、例えばビーズ、ウェル、ディッ
プスティックまたは膜の形態を取ってもよい。
【０１１１】 「標的領域」は、増幅および／または検出される核酸の領域をいう。用語「標
的配列」は、プローブまたはプローブが所望の条件下でそれとともに安定なハイ
ブリッド形成する配列をいう。
【０１１２】 本発明の実施には、特に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換え
ＤＮＡ、遺伝学および免疫学の従来の技術を用いる（例えば、Maniatis et al.,
1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand,
1992; Guthrie and Fink, 1991参照）。ヒト遺伝子マッピング（ヒト第１染色
体のマッピングを含む）のための技術および材料の一般的議論は、例えばWhite
and Lalouel, 1988に提供される。
【０１１３】組換えまたは化学合成核酸の調製：ベクター、形質転換、宿主細胞 多量の本発明のポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞中での複製によって生産
してもよい。所望のフラグメントをコードする天然または合成ポリヌクレオチド
フラグメントを、原核または真核生物細胞中への導入およびその中での複製が可
能な組換えポリヌクレオチド構築物（通常はＤＮＡ構築物）に組込む。通常、ポ
リヌクレオチド構築物は単細胞宿主（例えば、酵母または細菌）中での複製に適
切であるが、培養哺乳動物または植物または他の真核生物細胞株への導入（ゲノ
ム内の組み込みを伴うかまたは伴わない）を意図してもよい。本発明の方法によ
って生産された核酸の精製は、例えば、Sambrook et al., 1989またはAusubel e
t al., 1992に記載されている。
【０１１４】 本発明のポリヌクレオチドを、例えばBeaucage and Caruthers (1981)に記載
のホスホルアミダイト法またはMatteucci and Caruthers (1981)に記載のトリエ
ステル法による化学合成によって生産してもよく、市販の自動化オリゴヌクレオ
チド合成機で実施してもよい。相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニールさ
せること、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して
相補鎖を付加することのいずれかによって、化学合成の１本鎖生成物から２本鎖
フラグメントを得てもよい。
【０１１５】 原核または真核生物宿主中への導入用に調製したポリヌクレオチド構築物は、
宿主によって認識される複製システム（所望のポリペプチドをコードする意図さ
れるポリヌクレオチドフラグメントを含む）を含んでもよく、好ましくはセグメ
ントをコードするポリペプチドに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節
配列も含む。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）
、発現制御配列、プロモーター、エンハンサーならびに必要なプロセシング情報
部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部
位、転写終結配列およびｍＲＮＡ安定化配列）を含んでもよい。そのようなベク
ターを当該分野で周知の、例えばSambrook et al., 1989またはAusubel et al.,
1992に論じられる標準的な組換え技術によって調製してもよい。
【０１１６】 適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能するよう
に選択され、適切であれば、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子に天然に結合
したものを含んでもよい。細胞株と発現ベクターとの作業可能な組合せの例は、
Sambrook et al., 1989またはAusubel et al., 1992に記載されている（Metzger
et al., 1988も参照）。多数の有用なベクターが当該分野において公知であり
、Stratagene、New England Biolabs、Promega Biotechおよびその他のような販
売業者から入手可能である。ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、ｔＲＮＡ
プロモーターおよび解糖系酵素プロモーターのようなプロモーターを原核生物宿
主において使用してもよい。有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、３
−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼまた
はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラ
クトースの利用を担う酵素およびその他のプロモーター領域を包含する。酵母発
現に使用するために適切なベクターおよびプロモーターはさらにHitzeman et al
., EP 73,675Aに記載されている。適切な非天然哺乳動物プロモーターは、ＳＶ
４０の初期および後期プロモーター（Fiers et al., 1978）またはマウスモロニ
ー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩ
Ｉ、ウシパピローマウイルスもしくはポリオーマに由来するプロモーターを包含
し得る。昆虫プロモーターはバキュロウイルスに由来し得る。さらに、、多コピ
ーの遺伝子を作製するように、構築物を増幅可能遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に
連結してもよい。適切なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、Enha ncers and Eukaryotic Gene Expression , Cold Spring Harbor Press, Cold Spr
ing Harbor, New York (1982)も参照のこと。例えば、米国特許第5,691,198号；
同第5,735,500号；同第5,747,469号；および同第5,436,146号も参照のこと。
【０１１７】 そのような発現ベクターは自律複製してもよいが、それらはまた当該分野にお
いて周知の方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入されて複製してもよい。
【０１１８】 発現およびクローニングベクターはおそらく、ベクターで形質転換された宿主
細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である選択マーカ
ーを含む。この遺伝子の存在によって、インサートを発現する宿主細胞のみの増
殖が保証される。代表的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質（例
えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を付
与する、ｂ）栄養要求欠損を相補する、またはｃ）複合培地からは利用可能でな
い重要な栄養素を供給する（例えば、バチルス用のＤ−アラニンラセマーゼをコ
ードする遺伝子）タンパク質をコードする。適切な選択マーカーの選択は宿主細
胞に依存し、異なる宿主に適切なマーカーは当該分野において周知である。
【０１１９】 目的の核酸を含むベクターをイン・ビトロで転写し、生じたＲＮＡを宿主細胞
に周知の方法（例えば、注入）（Kubo et al., 1988参照）によって導入するこ
とができる。あるいはベクターを宿主細胞に当該分野において周知の方法によっ
て直接導入することができる。方法は細胞性宿主の種類に依存して変動し、エレ
クトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、Ｄ
ＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロ
プロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ベクターがレト
ロウイルスゲノムのような感染性因子である場合）；および他の方法を包含する
（一般に、Sambrook et al., 1989およびAusubel et al., 1992参照）。当該分
野において公知のいずれかの方法（とりわけ、上記の方法を包含する）による宿
主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、本明細書において「形質転換」という
。上記の核酸が導入された細胞は、その細胞の子孫も包含することを意味する。
【０１２０】 多量の本発明の核酸およびポリペプチドを、ベクターまたは他の発現ビヒクル
中のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１核酸またはその部分を、適合する原核または
真核生物宿主細胞において発現させることによって調製してもよい。最も一般的
に使用される原核生物宿主はエシェリキア・コリ（Escherichi coli）であるが
、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtlis）またはシュードモナス（Pseudomo
nas）のような他の原核生物を使用してもよい。
【０１２１】 哺乳動物あるいは他の真核生物宿主細胞（例えば、酵母、糸状菌、植物、昆虫
または両生類もしくは鳥類種）も本発明のタンパク質の生産に有用であり得る。
培養哺乳動物細胞の増殖自体は周知である（Jakoby and Pastan (eds.) (1979)
参照）。一般に使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、
およびＣＯＳ細胞株であるが、他の細胞株が、例えばより高い発現、所望のグリ
コシル化パターンまたは他の特徴を提供するために適切であり得ることは当業者
によって理解される。一般に使用される昆虫細胞株の例はＳＦ９である。
【０１２２】 クローンは、ベクター構築の様式に依存してマーカーを使用することによって
選択される。マーカーは同じかまたは異なるＤＮＡ分子（好ましくは同じＤＮＡ
分子）上に存在してもよい。原核生物宿主においては、形質転換体を、例えばア
ンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって選択し
てもよい。温度感受性に基く特定産物の生産も適切なマーカーとして作用し得る
。
【０１２３】 本発明のポリヌクレオチドで形質転換された原核または真核生物細胞は、本発
明の核酸およびポリペプチドの生産のみならず、例えばＫＶＬＱＴ１またはＫＣ
ＮＥ１ポリペプチドの特徴の研究のためにも有用である。
【０１２４】 本明細書中に開示するＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子配列に基くプロー
ブおよびプライマーは、他の種において相同なＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺
伝子配列およびタンパク質を同定するために使用される。これらの遺伝子配列お
よびタンパク質は、それが単離された種についての、本明細書に記載の診断／予
後、治療および薬物スクリーニング法において使用される。
【０１２５】使用法：薬物スクリーニング 本発明は、形質転換された細胞、トランスフェクトされた卵母細胞またはトラ
ンスジェニック動物においてＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１タンパク質を使用す
ることによる化合物のスクリーニングに特に有用である。ＫＶＬＱＴ１またはＫ
ＣＮＥ１タンパク質のいずれかにおける変異は心臓ＩＫｓカリウムチャネルの機
能を変化させる可能性があるので、候補薬物は、それぞれ正常ＫＶＬＱＴ１もし
くはＫＣＮＥ１タンパク質および変異ＫＣＮＥ１もしくはＫＶＬＱＴ１タンパク
質、または変異ＫＶＬＱＴ１および変異ＫＣＮＥ１タンパク質のいずれかを含む
細胞を使用して、チャネルに対する影響についてスクリーニングされる。薬物を
培養細胞に添加するかまたはトランスジェニック動物に投与し、ＩＫｓカリウム
チャネルの誘導電流に対する影響を、野生型ＫＶＬＱＴ１およびｍｉｎＫを含む
細胞または動物の誘導電流に対して比較する。より正常なレベルまで誘導電流を
変化させる薬物候補はＬＱＴの治療または予防に有用である。
【０１２６】 本発明は種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいてＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはその結合フラグメントを使用することによる化
合物のスクリーニングに特に有用である。
【０１２７】 そのような試験において用いられるＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチ
ドまたはフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定されてい
るか、または細胞表面上に保持されているかのいずれかであってもよい。薬物ス
クリーニング法の１つは、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポ
リヌクレオチドで安定に形質転換された真核または原核生物宿主細胞を、好まし
くは競合的結合アッセイにおいて利用する。そのような細胞（生存または固定形
態のいずれか）を、標準的結合アッセイに使用することができる。例えば、ＫＶ
ＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはフラグメントと試験薬剤との間の
複合体の形成について測定してもよく、またはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポ
リペプチドまたはフラグメントと既知のリガンドとの間の複合体の形成が試験薬
剤によって妨害される程度を検討してもよい。
【０１２８】 従って、本発明は、薬剤をＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたは
そのフラグメントと接触させる工程、および（ｉ）、薬剤とＫＶＬＱＴ１または
ＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在、または（ｉ
ｉ）ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはフラグメントとリガンド
との間の複合体の存在について当該分野において周知の方法によってアッセイす
る工程を包含する薬物のスクリーニング法を提供する。そのような競合的結合ア
ッセイにおいて、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはフラグメン
トは代表的には標識されている。遊離のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプ
チドまたはフラグメントは、タンパク質：タンパク質複合体中に存在するものか
ら分離され、遊離の（すなわち複合体化されていない）標識の量が、それぞれ試
験薬剤のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１への結合の尺度、あるいはＫＶＬＱＴ１
またはＫＣＮＥ１：リガンド結合の妨害の尺度となる。遊離ではなく結合ＫＶＬ
ＱＴ１またはＫＣＮＥ１の量を測定してもよい。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１
ではなくリガンドを標識して、試験薬物の存在下または非存在下におけるリガン
ドのＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１への結合量を測定することも可能である。
【０１２９】 別の薬物スクリーニング用技術は、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチ
ドに対する適切な結合親和性を有する化合物についての高処理量スクリーニング
を提供し、これはGeysen（PCT公開公報WO 84/03564）に詳細に記載されている。
簡潔に記載すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を固体基材（例えば、プ
ラスティックピンまたは何らかの他の表面）上で合成する。ペプチド試験化合物
をＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次いで、
結合したＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドを当該分野において周知の
方法によって検出する。
【０１３０】 上記の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＫＶＬＱＴ１ま
たはＫＣＮＥ１を直接プレート上にコートすることができる。しかし、このポリ
ペプチドに対する非中和抗体を抗体の捕獲のために使用して、ＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１ポリペプチドを固相上に固定化することができる。
【０１３１】 本発明はまた、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドまたはそのフラグ
メントへの結合について、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドに特異的
に結合する能力を有する中和抗体を試験化合物と競合させる競合的薬物スクリー
ニングアッセイの使用を意図する。この方法において、抗体を使用して、ＫＶＬ
ＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの抗原決定基の１つ以上を共有するいずれ
かのペプチドの存在を検出することができる。
【０１３２】 上記のスクリーニング法は、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１のみを用いるアッ
セイに限定されるものではなく、ＫＶＬＱＴ１−またはＫＣＮＥ１−タンパク質
複合体の研究にも適用可能である。この複合体の活性に対する薬物の影響を分析
する。
【０１３３】 以下のアッセイがこれらの方法に従って薬物候補のスクリーニングに使用でき
るアッセイの例である。
【０１３４】 変異ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１（それ自体または融合タンパク質の一部と
して）を、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１が結合する野生型タンパク質（
それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。この混合を、薬物の
存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、変異ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ
１と野生型タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の非存在下よりも薬
物の存在下において多い場合は、この薬物はＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１にお
ける変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補である。
【０１３５】 野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１（それ自体または融合タンパク質の一部
として）を、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１が結合する野生型タンパク質
（それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。この混合を、薬物
の存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣ
ＮＥ１と野生型タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の非存在下より
も薬物の存在下において多い場合は、この薬物はＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ における変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補である。
【０１３６】 野生型タンパク質のようにＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１（それ自体または融
合タンパク質の一部として）に結合する変異タンパク質を野生型ＫＶＬＱＴ１ま
たはＫＣＮＥ１（それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。こ
の混合を、薬物の存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、野生型ＫＶＬＱ
Ｔ１またはＫＣＮＥ１と変異タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の
非存在下よりも薬物の存在下において多い場合は、この薬物はこのタンパク質を
コードする遺伝子における変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補であ
る。
【０１３７】 本発明のポリペプチドをコンビナトリアルライブラリー技術の結果として開発
された化合物をスクリーニングするために使用してもよい。コンビナトリアルラ
イブラリー技術は、ポリペプチドの活性を調節する能力について潜在的な膨大な
数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。そのようなライブラリーお
よびその使用は当該分野において公知である。ペプチドライブライーの使用が好
ましい（例えば、WO 97/02048参照）。
【０１３８】 簡潔に記載すると、ポリペプチドの活性を調節する物質についてのスクリーニ
ング法は、適切な反応媒質中での１個以上の試験物質のポリペプチドとの接触、
処理されたポリペプチドの活性の試験、およびその活性の試験物質（単数または
複数）で処理していない匹敵する反応媒質中のポリペプチドの活性との比較を包
含し得る。処理ポリペプチドと未処理ポリペプチドとの間の活性の差異が、関連
する試験物質（単数または複数）の調節効果の指標となる。
【０１３９】 活性の調節についてのスクリーニングの前にまたはそれとともに、試験物質を
ポリペプチドと相互作用する能力について、例えば、酵母ツーハイブリッドシス
テム（例えば、Bartel et al., 1993; Fields and Song, 1989; Chevray and Na
thans, 1992; Lee et al., 1995）においてスクリーニングしてもよい。このシ
ステムを、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前
の粗スクリーニングとして使用してもよい。あるいは、スクリーニングを、試験
物質をＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１特異的結合パートナーへの結合についてス
クリーニングするために、またはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの
模倣物を見出すために使用し得る。
【０１４０】 ポリペプチド活性を調節するかまたはそれに影響を及ぼす物質の同定の後に、
この物質をさらに研究してもよい。さらに、これを調製物（すなわち、製品もし
くは処方物）または医薬、医薬組成物もしくは薬物のような組成物中で製造およ
び／または使用してもよい。
【０１４１】 従って、本発明は、種々の態様において、本明細書の開示に従って核酸分子を
使用してポリペプチド活性のモジュレーターとして同定された物質のみならず、
その物質を含有する医薬組成物、医薬、薬物または他の組成物、その物質を含有
するその組成物の投与を包含する方法、例えばＬＱＴの治療（予防的処置を含み
得る）のためのその組成物の患者への投与を包含する方法、例えばＬＱＴの治療
のための投与用組成物の製造におけるその物質の使用、および医薬上許容される
賦形剤、ビヒクルまたは担体および所望により他の成分とその物質とを混合する
工程を包含する医薬組成物の製造方法にも拡張される。
【０１４２】 ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定された物質はペプチド性または
非ペプチド性であってもよい。非ペプチド「低分子」が、多くのイン・ビトロに
おける医薬用途にしばしば好ましい。従って、物質の模倣物（特にペプチドの場
合）を医薬用途のために設計してもよい。
【０１４３】 公知の医薬上活性な化合物に対する模倣物の設計は、「リード」化合物に基い
た医薬品の開発への公知のアプローチである。活性化合物の合成が困難であるか
もしくは高価である場合、または特定の投与方法に不適切である場合（例えば、
純粋なペプチドは、消化管中のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があ
るので経口組成物に不適切な活性薬剤である）に、これが所望され得る。一般に
、模倣物の設計、合成および試験は、標的特性について多数の分子をランダムに
スクリーニングすることを回避するために使用される。
【０１４４】 所定の標的特性を有する化合物からの模倣物の設計においていくつかの工程が
一般にとられる。第１に、標的特性の決定において重大および／または重要な化
合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド中のアミノ酸残
基を系統的に変動させることによって（例えば、各残基を順に置換することによ
って）行うことができる。ペプチドのアラニンスキャンがそのようなペプチドモ
チーフを精錬するために一般に使用されている。化合物の活性領域を構成するこ
れらの部分または残基はその「ファルマコフォア」として知られている。
【０１４５】 一旦ファルマコフォアが見出されれば、その構造はその物理的特性（例えば、
立体化学、結合、大きさおよび／または電荷）に従って、一連の供給源（例えば
、分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）からのデータを使用してモデリング
される。コンピューター解析、類似性マッピング（これは、原子間の結合ではな
く、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデリングする）ならびに他
の技術をこのモデリングプロセスにおいて使用することができる。
【０１４６】 このアプローチの変形において、リガンドの三次元構造およびその結合パート
ナーをモデリングする。リガンドおよび／または結合パートナーが結合に際して
コンホメーションを変化させる場合に、これは特に有用であり得、模倣物の設計
においてこれを考慮にいれたモデリングが可能となる。
【０１４７】 次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基をグラフトできる鋳型分子を選択
する。鋳型分子およびそれにグラフトされる化学基は、模倣物の合成が容易にな
るように簡便に選択することができ、薬理学上許容されそうであり、イン・ビボ
において分解せず、リード化合物の生物活性を保持している。あるいは、模倣物
がペプチドに基く場合、ペプチドを環化させてその剛性を増加させることによっ
て、さらなる安定性を達成することができる。次いで、このアプローチによって
見出された模倣物を、それが標的特性を有しているかどうか、またはどの程度そ
れを示すかを見るためにスクリーニングすることができる。次いで、さらなる至
適化または改変を実施して、イン・ビボまたは臨床試験用の１個以上の最終模倣
物に到達することができる。
【０１４８】使用法:核酸診断および診断キット 個体をＬＱＴに罹患し易くしているＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子
の存在を検出するために、血液のような生物試料を調製し、ＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 感染性対立遺伝子の存在または不在を分析する。ＬＱＴの存在を検出
するために、または予後の指標として、生物試料を調製し、ＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ の変異対立遺伝子の存在または不在を分析する。これらの試験の結果
と解釈情報は、試験した個体へ連絡するためにヘルスケアプロバイダーに返す。
そのような診断は、診断試験所により行われ得、またはこれとは別に、診断キッ
トを作成し、ヘルスケアプロバイダーまたは自己診断のための民間の個人に販売
する。 初めに、スクリーニング法は関連するＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１配列の増
幅を含む。発明のもう一つの好ましい態様においては、スクリーニング法は非Ｐ
ＣＲ準拠法を含む。そのようなスクリーニング法は、当該分野で周知の２段階の
標識増幅法を含む。ＰＣＲ準拠スクリーニング法も非ＰＣＲ準拠スクリーニング
法も、高レベルの感度で標的配列を検出することができる。
【０１４９】 今日使用されている最もポピュラーな方法は、ターゲット増幅である。ここで
ターゲット核酸配列は、ポリメラーゼを用いて増幅する。ポリメラーゼ駆動増幅
を用いる一つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）である。ポ
リメラーゼ鎖反応および他のポリメラーゼ駆動増幅アッセイにより、ポリメラー
ゼ駆動増幅サイクルの使用によるコピー数の百万倍以上の増加を達成することが
可能となる。一旦増幅されれば、生じた核酸を配列決定し、ＤＮＡプローブのた
めの基体として用いることができる。 プローブをターゲット配列の存在を検出するために用いる場合、血液または血
清のような分析されるべき生物試料を処理して、所望により核酸を抽出すること
ができる。試料核酸は、ターゲット配列の検出を促進するために種々の方法、例
えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製することがで
きる。プローブの標的配列とでハイブリッドを形成するために、分析物核酸の標
的領域は通常、少なくとも部分的に一本鎖でなければならない。配列が本来一本
鎖である場合、変性は必要とされない。しかしながら、配列が二本鎖である場合
、配列は好ましくは変性される必要がある。変性は当該分野で公知の種々の方法
により行うことができる。
【０１５０】 分析物核酸およびプローブは、プローブ中の標的配列の、分析物中の推定標的
配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートする。分析
物に結合させるために用いるプローブの領域は、ＫＶＬＱＴ１に関してはヒト染
色体１１またはＫＣＮＥ１に関しては染色体２１の標的領域に完全に相補的であ
るようにすることができる。それゆえ、偽陽性を防ぐために、高ストリンジェン
シー条件が望ましい。しかし、プローブが該ゲノムにユニークな染色体の領域に
相補的である場合にのみ、高ストリンジェンシー条件を用いる。ハイブリダイゼ
ーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長
さおよびホルムアミドの濃度を含めた、ハイブリダイゼーション中および洗浄工
程中の多くの要因により決定する。これらの要因は、例えばManiatis et al., 1
982およびSambrook et al., 1989に概説されている。ある条件下では、三重体、
四重体などのような高次のハイブリッドの形成が、ターゲット配列を検出する手
段を提供するために所望される可能性がある。
【０１５１】 生じたハイブリッドの検出は、もし存在すれば、通常、標識プローブの使用に
より成し遂げられる。これとは別に、プローブは標識されなくてもよいが、直接
的にまたは間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することもでき
る。適当な標識および、プローブとリガンドを標識するための方法は当該分野で
公知であり、例えば公知方法（例えばニックトランスレーション、ランダムプラ
イムプライミングまたはキナージング）により取り込まれることができる放射性
標識、ビオチン、蛍光基、ケミルミネセンス基（例えばジオキシエタン、特にト
リガーされたジオキシエタン）、酵素、抗体、金ナノ粒子などが含まれる。この
基本スキームのバリエーションは当該分野で公知であり、外来物質からの検出す
べきハイブリッドの分離を促進するバリエーション、および／または標識部分か
らのシグナルを増幅するバリエーションが含まれる。多くのこれらのバリエーシ
ョンは、例えばMatthews and Kricka, 1988;Landegren et al., 1988; Mifflin,
1989; U.S.Patent 4,868,105;および、EPO Publication No. 225,807に概説さ
れている。
【０１５２】 前記のように、非ＰＣＲ準拠スクリーニングアッセイが、本発明においても企
図される。この方法により、核酸プローブ（または、通常のホスホジエステルを
置換しているメチルホスホネートバックボーンのようなアナログ）が低レベルの
ＤＮＴターゲットにハイブリダイズする。このプローブは、プローブに共有結合
している酵素を持ち、該共有結合はハイブリダイゼーションの特異性を妨害しな
い。この酵素-プローブ-コンジュゲート-標的核酸複合体を、次いで遊離プロー
ブ酵素コンジュゲートから単離することができ、基質を酵素検出のために添加す
る。酵素活性は、発色または発光出力の変化として観察され、１０３-１０６の
感度増加となる。オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリ性ホスファターゼコン
ジュゲートの調製およびそのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に関
する例としては、Jablonski et al. (1986)を参照されたい。
【０１５３】 ２段階の標識増幅法が当該分野で公知である。これらのアッセイは、小さいリ
ガンド（ジゴキシゲニン、ビオチンなど）を、ＫＶＬＱＴ１に特異的に結合する
ことができる核酸プローブに結合させるという原則に基づいて機能する。対立遺
伝子特異的プローブも本実施例の範囲内に意図され、例示的な対立遺伝子特異的
プローブには、本特許出願の素因変異を包含しているプローブが含まれる。 一例では、核酸プローブに結合させた小リガンドが抗体-酵素コンジュゲート
により特異的に認識される。本実施例の一態様において、ジゴキシゲニンを核酸
プローブに結合させる。ハイブリダイゼーションを、ケミルミネセンス基質に代
わる抗体-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートにより検出する。本具体例
による核酸プローブを標識するための方法に関しては、Martin et al., 1990を
参照されたい。第二の例においては、小リガンドが第一リガンドに特異的に複合
させることができる第二リガンド-酵素コンジュゲートにより認識される。本例
の周知の具体例はビオチン-アビジンタイプの相互作用である。核酸プローブを
標識するための方法およびビオチン-アビジン準拠アッセイにおけるその使用に
関しては、Rigby et al., 1977およびNguyen et al., 1992を参照されたい。
【０１５４】 本発明の核酸プローブアッセイが、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１を検出する
ことができる核酸プローブのカクテルを用いるということも本発明の範囲内に意
図される。つまり、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の細胞試料中での存在を検出
するための一例においては、遺伝子に相補的な１を超えるプローブを用い、およ
び特に、異なるプローブの数は、これとは別に、２、３、または５の異なる核酸
プローブ配列である。もう一つの例において、患者におけるＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 遺伝子配列の変異の存在を検出するために、これらの遺伝子に相補的
な１を超えるプローブを使用し、ここでカクテルには、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣ ＮＥ１ に関して改変を有する多くの患者において同定される対立遺伝子特異的変
異に対して結合することができるプローブが含まれる。この態様においてはいず
れの数のプローブも使用することができ、好ましくは、個体をＬＱＴにかかりや
すくしているとみなされる主要遺伝子変異に対応するプローブが含まれる。
【０１５５】使用法:ペプチド診断および診断キット ＬＱＴの存在は、野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの改変に
基づいて検出することもできる。そのような変更は、常法に従う配列分析により
決定することができる。より好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクロ
ーナル）を用い、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ペプチドの差、またはその不存
在を検出する。抗体を生起させ、かつ精製する方法は当該分野で周知であり、そ
のような方法のいずれも、本発明中にクレームする調製を達成するために選択す
ることができる。本発明の好ましい態様において、抗体は溶液からＫＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１タンパク質を免疫沈降させ、ならびにウエスタンまたは、ポリ
アクリルアミドゲルの免疫ブロット上でこれらのタンパク質と反応する。もう一
つの好ましい態様において、抗体はパラフィンまたは凍結組織セクションにおい
て、免疫細胞化学法を用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１を検出する。 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１またはその変異を検出するための方法に関する
好ましい態様には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射分析アッセイ（ＩＲＭＡ）および、モノクローナル
および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む免疫酵
素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。典型的なサンドイッチアッセイは、David
et al., in U.S.Patent Nos.4,376,110および4,486,530に記載されており、出典
明示して本明細書にの一部とみなす。
【０１５６】使用法:合理的な薬物設計 合理的薬物設計の目的は、例えば、ポリペプチドのより活性なまたは安定な形
態である薬物であって、例えばイン・ビボでポリペプチドの機能を高める、また
は、それに妨害する薬物を形成するために、目的の生物活性ポリペプチドまたは
それらが相互作用する小分子（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、インヒビタ
ー）の構造類似体を製造することである。例えばHodgson,1991を参照されたい。
一つのアプローチにおいては、まず目的のタンパク質（例えばＫＶＬＱＴ１また
はＫＣＮＥ１ポリペプチド）の三次元構造をＸ線結晶学により、コンピューター
モデリングにより、または最も典型的には、アプローチの組み合わせにより決定
する。あまり頻繁ではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同
タンパク質の構造に基づくモデリングにより得ることができる。合理的な薬物設
計の例としては、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター(Erickson et al., 1990)の
開発である。加えて、ペプチド（例えば、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペ
プチド）はアラニンスキャン(Wells, 1991)により分析する。この方法において
、アミノ酸残基をＡｌａにより置換し、そのペプチド活性への効果を決定する。
ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれは、ペプチドの重要な領域を決定するための
方法において分析する。
【０１５７】 機能アッセイにより選択される標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造
を解析することも可能である。原則として、このアプローチによりファルマコア
が生じ、次の薬物設計はこれに基づくことができる。機能的、薬理学的に活性な
抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗-ids)を発生させることにより、タンパ
ク質結晶学を全く回避することができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位
は、オリジナルレセプターのアナログであることが期待される。抗-idsを次いで
用いて、化学的または生物的に製造されるペプチドのバンクのバンクからペプチ
ドを同定および単離することができた。選択されたペプチドは次いでファルマコ
アとして作用する。 こうして、例えば改良されたＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチド活性
または安定性を改良する、またはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチド活
性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物を設計
することができる。クローン化したＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１配列の入手可
能性により、十分量のＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドを、Ｘ線結晶
学のような分析研究を行うために利用することができる。加えて、本明細書中に
提供されるＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１タンパク質配列に関する知識は、Ｘ線
結晶学に代わる、またはそれに加えるコンピューターモデリング法を用いている
ものをガイドする。
【０１５８】使用法:遺伝子治療 本発明により、それぞれ変異ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子を担う
細胞に野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１機能を供給する方法も提供される。
そのような機能を供給することにより、受容細胞の正常な機能化がが可能となる
。野生型遺伝子または該遺伝子の部分は、遺伝子が染色体外に留まるようにベク
ターにて細胞に導入することができる。そのような場合に、遺伝子は、染色体外
の場所から細胞により発現される。より好ましいのは、野生型遺伝子またはその
部分を、それが細胞中に存在する内在性変異遺伝子と組み換えられるように、変
異細胞に導入する場合である。そのような組換えは、遺伝子変異の修正に帰着す
る二重組換え現象を必要とする。組換えおよび染色体外での維持両方のための遺
伝子の導入のためのベクターは当該分野で公知であり、いずれの適当なベクター
を用いてもよい。電気泳動、リン酸カルシウム共沈殿およびウイルス形質導入の
ような、ＤＮＡを細胞に導入するための方法は、当該分野で公知であり、方法の
選択は医師の能力内にある。 前に広く論じたように、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子またはフラグメ
ントは、適切な場合に、細胞中でのそのような遺伝子の発現生成物の量を増すた
めに、遺伝子治療法において用いることができる。「正常」レベルで変種遺伝子
が発現されるが、遺伝子産物が充分には機能的ではない心臓細胞においてすら所
定ＬＱＴ遺伝子の発現のレベルを増すのに有用でもあり得る。
【０１５９】 遺伝子治療は、例えばFriedman(1991)またはCulver(1996)により記載されるよ
うに、一般に許容される方法に従い行う。患者からの細胞を、まず前記の診断法
により、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリペプチドの細胞中での産生を確認す
るために分析する。発現コントロールエレメントに結合したＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 遺伝子のコピーを含み、細胞内で複製することができるウイルスまた
はプラスミドベクター（次のさらなる説明を参照されたい）を調製する。該ベク
ターは細胞内で複製することもできる。これとは別に、ベクターは複製欠乏性で
あってもよく、遺伝子治療で用いるためにヘルパー細胞中で複製される。適当な
ベクターは、U.S.Patent 5,252,479およびPCT公開出願WO93/07282およびU.S.Pat
ent Nos.5,691.198;5,747,469;5,436,146および5,753,500に開示されるように公
知である。ベクターを次いで患者に注射する。感染遺伝子が標的細胞のそれぞれ
のゲノムに永続的に導入されない場合は、該治療は周期的に繰り返えさなければ
ならないであろう。
【０１６０】 当該分野で公知の遺伝子導入系は、本発明の遺伝子治療法の実施に有用であろ
う。これらには、ウイルスおよび非ウイルス導入法が含まれる。パポバウイルス
（例えばSV40、Madzak et al., 1992)、アデノウイルス(Berkner, 1992; Berkne
r et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992;Rosen
feld et al., 1992; Wilkinson and Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et
al., 1990; Schneider et al., 1998)、ワクシニアウイスル(Moss, 1992; Moss,
1996)、アデノ関連ウイルス(Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell and
Hirata, 1998)、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス(Margolskee, 199
2; Johonson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield and Geller, 198
7; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996)、レンチウイルス(Naldini et al
., 1996)、シンドビスおよびセムリキ・フォレスト・ウイルス(Berglund et al.
, 1993)およびトリのレトロウイルス(Bandyopadhyay and Temin, 1984; Petropo
ulos et al, 1992)、ネズミ(Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al
., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988)およびヒト起源(Sh
imada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchshacher
and Panganiban, 1992)を含む多数のウイルスを遺伝子導入ベクターとして、ま
たは遺伝子導入ベクターを修復するための基礎として用いることが出来た。ほと
んどのヒト遺伝子治療プロトコルは、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス
もまた用いられるが、無能力化したネズミのレトロウイルスに基くものであった
。
【０１６１】 当該分野で公知の非ウイルス遺伝子導入法には、リン酸カルシウム共沈殿（Gr
aham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980);機械的方法、例えばマイ
クロインジェクション(Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinste
r et al., 1981; Costantini and Lacy, 1981);リポソームを介する膜融合媒介
導入(Felgner et al., 1987; Wang and Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; St
ewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991);および直接ＤＮ
Ａ摂取およびレセプター媒介ＤＮＡ導入（Wolff et al., 1990; Wu et al., 199
1; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al
., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992;
Curiel et al., 1991)のような化学法が含まれる。ウイルス媒介遺伝子導入は、
リポソーム送達を用いる直接イン・ビボ遺伝子導入と組み合わせることができ、
ウイルスベクターを腫瘍細胞へ指し向け、周りの非分裂細胞には指し向けないこ
とを可能にする。これとは別に、レトロウイルスベクター産生細胞系統を腫瘍に
注射することができる（Culver et al., 1992)。次いで、産生細胞の注射により
、ベクター粒子の継続的供給源が提供される。この技術は手術不能の脳腫瘍を有
するヒトにおける使用で認可されている。
【０１６２】 生物学的および物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチにおいては、い
ずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルスヘキソンタンパク質に特
異的なポリリジンコンジュゲーテッド抗体と結合させ、生じた複合体をアデノウ
イルスベクターに結合させる。３分子複合体を次いで使用して、細胞を感染させ
る。アデノウイルスベクターは、連結されたＤＮＡが損なわれる前に効果的な結
合、内部化およびエンドソームの分解を可能にする。アデノウイルス準拠ベクタ
ーの送達のための他の方法に関しては、Schneider et al.(1998)およびU.S.Pate
nt Nos.5,691,198;5,747,469;5,436,146および5,753,500を参照されたい。 リポソーム／ＤＮＡ複合体が直接イン・ビボ遺伝子導入を媒介することができ
ることはすでに示されている。標準的なリポソーム調製物においては、遺伝子プ
ロセスは非特異的であるが、局在化されたイン・ビボ摂取および発現が、例えば
直接イン・サイチュ投与後の腫瘍沈積物において、報告されている(Nabel, 1992
)。
【０１６３】 遺伝子治療の文脈において発現ベクターは、その中にクローン化されたポリヌ
クレオチドを発現するのに十分な配列を含む構築物を含むことを意味する。ウイ
ルス発現ベクターにおいては、該構築物は、該構築物のパッケージングを支持す
るのに十分なウイルス配列を含む。ポリヌクレオチドがＫＶＬＱＴ１またはＫＣ ＮＥ１ をコードする場合、発現によりＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１が生じる。
ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムをコードす
る場合、発現によりアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムが生じる。
つまりこの文脈においては、発現は、タンパク質産物が合成されることを必要と
しない。発現ベクターにクローン化されたポリヌクレオチドに加えて、ベクター
は真核細胞において機能し得るプロモーターをも含む。クローン化したポリヌク
レオチド配列は、このプロモーターの制御下にある。適当な真核プロモーターに
は、前記のものが含まれる。発現ベクターは前記の選択マーカーおよび他の配列
のような配列をも含むことができる。
【０１６４】 ＤＮＡを直接心臓組織にターゲットする遺伝子導入法が好ましい。レセプター
媒介遺伝子導入は、例えば、（通常、共有結合閉鎖したスーパーコイル化したプ
ラスミドの形態の）ＤＮＡの、たんぱく質リガンドへのポリリジンを媒介とする
結合により成し遂げられる。リガンドは、標的細胞／組織型の細胞表面上の対応
するリガンドレセプターの存在に基いて選択する。これらのリガンド-ＤＮＡコ
ンジュゲートは所望により血液に直接注入することができ、レセプター結合およ
び、ＤＮＡ-タンパク質複合体の内部化が起こる標的組織へ指向される。ＤＮＡ
の細胞内破壊の問題を克服するために、アデノウイルスとの共感染が、エンドソ
ーム機能を壊すために含まれ得る。 治療は次のようである：ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１感染性対立遺伝子を担
う患者を、その心臓プレカーサー細胞のいくらかまたは全てが機能的に正常なＫ ＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１対立遺伝子の少なくとも一つの追加コピーを受容す
るように、遺伝子送達ビヒクルを用いて処理する。このステップにおいて、治療
した個体は、感染性対立遺伝子の効果が、正常な対立遺伝子の存在により打ち消
される程度まで、ＬＱＴのリスクが低下した。
【０１６５】使用法:ペプチド治療 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１活性を有するペプチドを、変異または欠失ＫＶ
ＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子を有する細胞に供給することができる。タ
ンパク質は細菌中で、例えば公知の発現ベクターを用いてｃＤＮＡ配列の発現に
より製造することができる。これとは別に、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ポリ
ペプチドは、ＫＶＬＱＴ１-またはＫＣＮＥ１産生哺乳類細胞から抽出すること
ができる。加えて、該合成化学法を用いてＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１タンパ
ク質を合成することができる。そのような方法のいずれも、ＫＶＬＱＴ１または
ＫＣＮＥ１タンパク質を含む本発明の調製物を提供することができる。該調製物
は、他のヒトタンパク質とは実質的に異なる。これは微生物中またはイン・ビボ
での合成により非常に容易に達成される。
【０１６６】 活性ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１分子は、例えばマイクロインジェクション
により、またはリポソームの使用により細胞に導入することができる。これとは
別に、いくらかの活性分子が細胞により能動的に、または拡散により取りこまれ
ることができる。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１活性を有する分子の提供により
、ＬＱＴの部分的逆転が導かれる。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１活性を有する
他の分子（例えばペプチド、薬物または有機化合物）を、そのような逆転をもた
らすために使用することもできる。実質上類似する機能を有する修飾ポリペプチ
ドも、ペプチド治療のために用いる。
【０１６７】使用法:形質転換宿主 治療薬を試験するための動物は、全動物の突然変異誘発後または生殖細胞また
は接合子の処理後に選択することができる。そのような処理には、通常第二動物
種由来の変異ＫＶＬＱＴ１および／またはＫＣＮＥ１対立遺伝子の挿入ならびに
破壊された相同遺伝子の挿入が含まれる。これとは別に、動物の内在性ＫＶＬＱ Ｔ１ またはＫＣＮＥ１遺伝子を、常法(Capecchi, 1989; Valancius and Smithie
s, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 199
2; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992
)を用いる挿入または欠失変異または他の遺伝子改変により破壊してもよい。試
験物質を動物に投与した後に、ＬＱＴの存在を評価しなければならない。試験物
質がＬＱＴの出現を予防または抑制する場合、該試験物質はＬＱＴの治療のため
の候補治療薬である。これらの動物モデルにより、潜在的な治療生成物のための
非常に重要な試験ビヒクルが提供される。
【０１６８】 ＬＱＴ遺伝子を同定するために、２つの方法、候補遺伝子アプローチとポジシ
ョナルクローニングが利用されてきた。染色体１１ｐ１５．５にマップされたＬ
ＱＴ１(Keating et al., 1991a; Keating et al., 1991b)、７ｑ３５-３６にマ
ップされたＬＱＴ２および、３ｐ２１-２４にマップされたＬＱＴ３(Jiand et a
l., 1994)を有する３つのＬＱＴ遺伝子座に関する位置情報が利用できる。本発
明により、染色体２１上にＬＱＴ遺伝子としてｍｉｎＫも同定された。候補遺伝
子アプローチは、生理学に基く適当なメカニズム仮定による。ＬＱＴの生理学に
ついてはほとんど知られていないが、疾患は、異常な心臓再分極のサインである
心電図のＱＴ間隔の長期化と関連付けられている。この関連性により、チャネル
に関してコードしている遺伝子またはそのモジュレーターが、ＬＱＴの妥当な候
補であることが示唆される。この仮定は、染色体７-連鎖ＬＱＴが推定心臓カリ
ウムチャネル遺伝子であるＨＥＲＧの変異から生じるという発見により今日支持
される。神経内分泌カルシウムチャネル遺伝子（CACNL1A2; Chin et al., 1991;
Seino et al., 1992)および、カリウムチャネルを調節するＧＴＰ結合タンパク
質をコードしている遺伝子(GNAI2; Weinstein et al., 1988; Magovcevic et al
., 1992)は、その染色体位置に基き、ＬＱＴ３の候補となった。しかし、次なる
連鎖解析により、これらの遺伝子は除外された。ＬＱＴ３がＳＣＮ５Ａと関連す
ることが今日示されている(Wang et al., 1995a)。しかし、かなりの努力にも関
わらず、染色体１１-連鎖ＬＱＴへの候補遺伝子アプローチはうまくいかなかっ
た。２つのカリウムチャネル遺伝子(KCNA4およびKCNC1)が染色体１１の短腕にマ
ップされたが（Wymore et al., 1994)、両方とも連鎖解析によりＬＱＴ１のため
の候補としては除外された(Russell et al., 1995; 本研究）。全ての他の前に
特徴付けた心臓カリウム、塩化物、ナトリウムおよびカルシウムチャネル遺伝子
は同様に、その染色体位に基き除外された。本研究はＬＱＴ１を同定するために
位置クローニングおよび変異分析を用いた。
【０１６９】 本発明は、１６の関連のない家族において、遺伝子型分析を用いてＫＶＬＱＴ １ がＬＱＴ１に密接に関連していることを示した（詳細は実施例に示す）。ＫＶ ＬＱＴ１ は推定心臓カリウムチャネル遺伝子であり、ＬＱＴの染色体１１-連鎖
型を引き起こす。遺伝子分析により、ＫＶＬＱＴ１が心臓再分極において機能的
な重要性を有する電位依存性カリウムチャネルをコードすることが示唆され、Ｋ
ＶＬＱＴ１がＫＣＮＥ１と共集合して心臓ＩＫｓカリウムチャネルを形成するこ
とが示される。これが正しければ、染色体１１-連鎖ＬＱＴのメカニズムは、低
下した再分極ＫＶＬＱＴ１電流におそらく関与する。６つの膜スパニングドメイ
ン（spanning domain）を有するカリウムチャネルはホモ-またはヘテロ-四量体
から形成されると考えられるので(MacKinnon,1991; MacKinnon et al., 1993; C
ovarrubias et al., 1991)、ＫＶＬＱＴ１のＬＱＴ関連変異が優性-ネガティブ
メカニズムにより作用する可能性がある。本明細書に開示するＫＶＬＱＴ１変異
の型と位置は、この仮定と一致する。カリウムチャネル機能の結果的な抑制は、
異常な心臓の再分極および心室の不整頓博の増加したリスクを導くようである。
ＨＥＲＧ中に同定される変異およびカリウムチャネルαサブユニットの生物物理
により、染色体７-連鎖ＬＱＴがドミナント-ネガティブ変異および機能チャネル
の結果的な減少から生じることが示唆される。染色体３-連鎖ＬＱＴにおいて、
対照してみると、ＳＣＮ５Ａにおいて同定されるＬＱＴ関連欠失は、遅延不活性
化またはチャネル不活性化の改変された電位依存性のような改変された特性を有
する機能的心臓ナトリウムチャネルを生じるようである。遅延ナトリウムチャネ
ルの不活性化は、内向きナトリウム電流を増加させ、膜を脱分極させる。この効
果は、外向きのカリウム電流を減じる、ＨＥＲＧ変異から期待される改変膜電位
に類似する。ＳＣＮ５Ａのより有害な変異がＬＱＴを引き起こすのではないよう
である。心臓ナトリウムチャネルの総数の低下は、例えばＬＱＴのものと反対の
表現型である活動電位持続を減じることが期待される。
【０１７０】 ＬＱＴの前兆診断は、心電図上のＱＴ長期化の同定に依存してきた。不幸にも
、心電図は、若く健康な個体においてはめったに行われない。加えて、多くのＬ
ＱＴ遺伝子キャリアは比較的正常なＱＴ間隔を有し、疾患の第一のサインは致命
的な心臓不整脈である可能性がある(Vincent et al., 1992)。今回、多くのＬＱ
Ｔ遺伝子(ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１）が同定され、ＬＱＴと関連付けられ
、この疾患に関する遺伝子試験を企図することが可能となる。これは継続変異解
析およびさらなるＬＱＴ遺伝子の同定を必要とする。より詳細な表現型分析を用
いて、ＬＱＴの変異型の間の表現型の違いが発見される可能性がある。これらの
違いは診断および治療に有用となる可能性がある。
【０１７１】 ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１遺伝子変異とＬＱＴの間の関連性の同定により
、ＬＱＴを発症する危険にある人を同定するための、個体の早期前兆スクリーニ
ングが可能となる。そのような個体を同定するために、ＫＶＬＱＴ１および／ま
たはＫＣＮＥ１対立遺伝子を、直接に、または対立遺伝子のクローニングの後に
変異に関してスクリーニングする。対立遺伝子を、正常対立遺伝子からの核酸配
列の違いの存在に関して、以下の方法を含むがそれには限られないいずれかの適
当な方法を用いて試験する。：蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（Ｆ
ＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖コ
ンホメーション解析（ＳＳＣＰ）、連鎖解析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺
伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびＰＣＲ-
ＳＳＣＰ分析。ＤＮＡマイクロチップ法に関する最近開発された方法も有用であ
る。例えば、（１）クローン化した対立遺伝子および正常なＫＶＬＱＴ１または ＫＣＮＥ１ 遺伝子両方のヌクレオチド配列または適当なフラグメント（コーディ
ング配列またはゲノム配列）を決定し、および次いで比較するか、または、（２
）ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子または遺伝子フラグメントのＲＮＡの転
写産物を、試験される個体からの一本鎖全ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、
生じたヘテロ二本鎖をリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）で処理し、いずれか
のミスマッチの位置を検出するために変性ゲル上に流す；かのいずれかである。
これらの方法の２つは、以下の方法に従って行うことができる。
【０１７２】 試験すべき個体におけるＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の対立遺伝子を
常法を用いてクローン化する。例えば、血液試料を個体から採取する。この試料
中の細胞から単離したゲノムＤＮＡを部分的に約２０ｋｂの平均フラグメントサ
イズに部分消化する。１８-２１ｋｂの範囲のフラグメントを単離する。生じた
フラグメントを適当なベクターに連結する。クローンの配列を次いで決定し、正
常なＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子と比較する これとは別に、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲｓ）を５’領域のためのプライマ
ー対またはＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子のエキソンのためのプライマー
対を用いて行う。ＰＣＲを次いで正常ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子のい
ずれかの配列に基くプライマー対を用いて行うこともできる。例えば、イントロ
ンの一つのためのプライマー対を調製し、利用することができる。最終的に、Ｒ
Ｔ-ＰＣＲをｍＲＮＡに関して行うこともできる。次いで、増幅産物を一本鎖コ
ンホメーション多型（ＳＳＣＰ）により常法を用いて解析し、いずれかの違いを
同定し、次いで、これらを配列決定し、正常な遺伝子配列と比較する。
【０１７３】 個体は、適当なプライマー対を用いて個体のＤＮＡを増幅することにより、お
よび、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるドット-ブロット
ハイブリダイゼーションにより増幅された産物を分析することにより、共通のＫ ＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１遺伝子変種を迅速にスクリーニングすることができ
る。 第二の方法は、正常なＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子と欠損遺伝子の間
の違いの検出を支援するためにＲＮａｓｅＡを用いる。この比較は、プローブと
してＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の小さな（〜５００ｂｐ）制限フラグ
メントを用いるステップにて行う。まず、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子
を、遺伝子配列を約５００ｂｐのフラグメントに切断する制限酵素を用いて消化
する。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離し、ゲルから精製し、個々
に、両定位にてＳＰ６ベクター（例えばｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）にクロー
ン化する。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子フラグメントのインサートを含
むＳＰ６に基くプラスミドを当該分野で周知のＳＰ６転写系を、［α-３２Ｐ］
ＧＴＰの存在下で用いてイン・ビトロで転写し、遺伝子の両鎖の放射能標識ＲＮ
Ａ転写産物を生成する。
【０１７４】 個々に、常法を用い、対立遺伝子ＤＮＡを用いてヘテロ二量体を形成するため
に、これらのＲＮＡ転写産物を使用する。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１フラグ
メントと個体からのＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１対立遺伝子サブクローンの間
の配列の違いによるＲＮＡ:ＤＮＡヘテロ二本鎖に生じるミスマッチは、ＲＮａ
ｓｅＡを用いて処理すると、ＲＮＡ鎖の開裂を生じる。そのようなミスマッチは
、点変異または個体の対立遺伝子の小欠失の結果である可能性がある。ＲＮＡ鎖
の開裂により、変性ゲル上でＲＮＡプローブそのものよりも早く移動する２また
はそれ以上の小ＲＮＡフラグメントが得られる。 見出されるいずれの違いも、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子の分子変種
を有する個体および、その結果としてのＱＴ延長症候群の存在を証明する。これ
らの変種は多くの形態をとることができる。ほとんどのひどい型は、遺伝子に異
常なタンパク質をコードさせるフレームシフト変異または大きな欠失であるか、
タンパク質の発現を明らかに変更するものである。よりひどくはない切断破壊変
異には、生み出されるタンパク質に明らかな影響を有する小さなインフレーム欠
失および非保存的塩基対置換、例えばシステイン残基への、またはシステイン残
基からの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への、またはその逆の変化、疎
水性から親水性アミノ酸への、またはその逆の変化または、二次または三次タン
パク質構造に影響を与える他の変異が含まれる。サイレント変異または保存的ア
ミノ酸置換に帰着する置換がタンパク質の機能を破壊するとは一般には考えられ
ない。
【０１７５】 遺伝子試験により、出生時または出生以前からもＬＱＴの危険にある個体を同
定することが可能となる。ＬＱＴの前症状診断により、これらの疾患の予防が可
能となる。ベータアドレナリン作動性遮断剤を含む現存している医薬治療法によ
り、該疾患に関連する問題の発症を予防することおよび遅らせることができる。
最終的に、本発明は、全自然死の１１％を占める心不整脈のような共通の心疾患
の原因および治療に関する我々の理解を変える。現存している診断法は、心電図
からＱＴ間隔を測定することに焦点を当てている。この方法は、ＱＴ延長症候群
の存在の十分迅速な指標ではない。本発明は、該疾患の存在のより迅速な指標で
ある。ＬＱＴの遺伝的試験および改善されたメカニズム理解により、生命を脅か
す不整脈の予防のための機会が合理的治療により提供される。例えば、カリウム
チャネル開放剤が、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１変異を有する患者において不
整脈のリスクを減じることが可能である。これに対してナトリウムチャネル遮断
剤が、ＳＣＮ５Ａの機能を変更する変異を有する患者のためのより有効な治療法
である可能性がある。これらの不整脈はしばしば正常な心臓再分極を伴い、遺伝
要因と獲得要因の組み合わせから生じる可能性があるので、最終的にこれらの研
究により、一般の不整脈の基礎となるメカニズムに洞察が提供され得る。
【０１７６】 医薬組成物および投与経路 本発明のＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１ポリペプチド、抗体、ペプチドおよび
核酸は、慣用的な医薬配合技術にしたがって調製される医薬組成物に処方できる
。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publ
ishing Co., Easton, PA)を参照のこと。組成物は、有効物質または有効物質の
医薬上許容される塩を含有していてもよい。これらの組成物は、１の有効物質に
加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤または他の当該
分野でよく知られた物質を含んでいてもよい。かかる物質は、非毒性であって、
有効成分の効力を妨害しないべきである。担体は、例えば、静脈内、経口、鞘内
、神経弓上または非経口などの投与に望ましい調製物の形態に依存して、多種多
様な形態をとってもよい。
【０１７７】 経口投与の場合、化合物をカプセル、丸薬、錠剤、ロゼンジ、メルト、粉末、
懸濁液またはエマルジョンのような固体または液体調製物に処方することができ
る。経口投薬形態の組成物を調製するには、経口液体調製物（例えば、懸濁液、
エリキシルおよび溶液）の場合、通常の医薬媒体のいくつか、例えば、水、グリ
コール、油、アルコール、フレーバー剤、保存料、着色料、懸濁化剤などを用い
てもよく；経口固体調製物（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤）の場合、デン
プン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような担体を用いて
もよい。投与が安易なため、錠剤およびカプセルが最も有益な経口投与単位形態
を示し、この場合、固体医薬担体が明らかに用いられる。所望ならば、錠剤を標
準技術により、糖被覆または腸溶性被覆してもよい。有効物質をカプセルに包ん
で、血脳関門を通過させるのと同時に、胃腸管を安定に通過させることができる
。例えば、ＷＯ９６／１１６９８参照のこと。
【０１７８】 非経口投与の場合、化合物は、医薬担体中に溶解させ、溶液または懸濁液のい
ずれかとして投与してもよい。適当な担体の例は、水、セーライン、デキストロ
ース溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物性、植物性もしくは合成
起源の油である。担体は、また、他の成分、例えば、保存料、懸濁化剤、可溶化
剤、バッファーなどを含有していてもよい。化合物が鞘内に投与されるとき、そ
れらはまた、脳脊髄液中に溶解していてもよい。
【０１７９】 有効物質は、好ましくは、治療上有効量で投与される。実際の投与量ならびに
投与の速度および時間推移は、治療される状態の性質および重篤度に依存するで
あろう。治療の規定、例えば、投与量、タイミングなどの決定は、一般的な従業
者または専門家の責任内にあり、典型的には、治療されるべき障害、個々の患者
の状態、デリバリー部位、投与方法および従業者に既知の他の因子を考慮に入れ
る。技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに
おいて見出すことができる。
【０１８０】 別法では、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのよ
うなターゲティング系の使用によって、ある特定の型の細胞に有効物質をより特
異的にデリバリーしてもよい。ターゲティングは、種々の理由、例えば、物質が
許容できない毒性である場合、または別法で高すぎる投与量を必要とする場合、
または別法で標的細胞に侵入することができない場合に望ましい。
【０１８１】 これらの物質を直接投与する代わりに、それらを標的細胞中、例えば、上記の
ようなウイルスベクター中または米国特許第５，５５０，０５０号およびＰＣＴ
公開公報ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３
、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ
９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載のような、患者における移
植のために設計された細胞に基づくデリバリー系において生産できた。ベクター
は、治療されるべき特異的細胞を標的とすることができるか、または標的細胞に
対してより組織特異的な調節エレメントを含有することができた。細胞に基づく
デリバリー系は、患者の体内において所望の標的部位に移植されるように設計さ
れており、有効物質のコーディング配列を含有する。別法では、該物質は、治療
されるべき細胞中で生産されるか、または該細胞を標的とする活性化物質による
活性形態への変換のための前駆形態で投与できた。例えば、ＥＰ４２５，７３１
ＡおよびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと。
【０１８２】 本発明は、さらに、下記の実施例において詳述され、該実施例は、例示のため
に提供されるのであって、いかなる方法においても本発明を制限しようとするも
のではない。当該分野でよく知られた標準技術または特に下記される技術を利用
する。
【０１８３】 実施例１ 表現型評価方法 これらの研究のために、６個の大きなＬＱＴ一族（Ｋ１５３２、Ｋ１７２３、
Ｋ２６０５、Ｋ１８０７、Ｋ１６１およびＫ１６２）ならびにいくつかの小さい
一族および散在するケースが研究された。ＬＱＴ患者は、北アメリカおよびヨー
ロッパ中の病院から同定された。２つの因子：１）歴史的データ（失神の存在、
失神症状の数、発作の存在、症状の発病年齢および突然死の発生）および２）心
拍数に対して補正された心電図上のＱＴ間隔（ＱＴｃ）が表現型について考慮さ
れた（Bazzett, 1920）。個体の分類ミスを避けるために、以前の研究において
成功した表現型割り当てに対する同じ保守的なアプローチを用いた（Keatingら
、1991 a; Keatingら、1991b; Jiangら、1994）。インフォームド・コンセント
が各患者、または彼らの保護者から、地方で制度化された再考評議会のガイドラ
イン（local institutional review board guidelines）にしたがって得られた
。表現型データは、遺伝子型の知見なしで解釈された。０．４５秒以上の補正し
たＱＴ間隔（ＱＴｃ）を有する徴候性個体および０．４７秒以上のＱＴｃを有す
る無徴候性個体を、罹患したものとして分類した。０．４１秒以下のＱＴｃを有
する無徴候性個体を罹患していないものとして分類した。０．４１〜０．４７秒
のＱＴｃを有する無徴候性個体および０．４４秒以下のＱＴｃを有する徴候性個
体を不確定なものとして分類した。
【０１８４】 実施例２ 遺伝子型および連鎖解析 ゲノムＤＮＡを末梢血リンパ球またはエプスタイン−バーウイルス形質転換リ
ンパ球由来の細胞系統から、標準的手法を用いて調製した（AndersonおよびGuse
lla, 1984）。遺伝子型分析の場合、以前に染色体１１ｐ１５．５上に位置付け
られた４個の小さいタンデム反復配列（ＳＴＲ）多形：Ｄ１１Ｓ９２２、ＴＨ、 Ｄ１１Ｓ１３１８ およびＤ１１Ｓ８６０を用いた（Gyapayら、1994）。ＲＦＬＰ
マーカー（ＨＲＡＳ１、Ｄ１１Ｓ４５４およびＤ１１Ｓ１２）の遺伝子型決定は
、以前に記載されたとおりに行った（Keatingら、1991a）。
【０１８５】 対合連鎖解析は、ＬＩＮＫＡＧＥｖ５．１におけるＭＬＩＮＫを用いて行った
（Lathropら、1985）。浸透度に関して０．９０およびＬＱＴ遺伝子頻度に関し
て０．００１の仮の値を用いた。遺伝子頻度は、雄と雌の間で等しいと想定した
。雄および雌組換え頻度は、等しいと考えられた。ＳＴＲ対立遺伝子頻度は、１
／ｎ（ここに、ｎ＝観察された対立遺伝子の数）であった。Ｄ１１Ｓ４５４に関
する最大ＬＯＤスコアは組換え率０で同定されたが、１の非−絶対的組換え体の
存在（個体ＶＩ−１４、図１）がＤ１１Ｓ４５４のテロメア側に該ＬＱＴ遺伝子
を示す。
【０１８６】 実施例３ 物理的マッピング ＴＨ−ＩＮＳ−ＩＧＦＩＩおよびＤ１１Ｓ４５４遺伝子座由来の配列に基づい
てプライマーを設計し、ＰＣＲに基づく技術を用いて、ＣＥＰＨ ＹＡＣライブ
ラリーからクローンを同定および単離した（GreenおよびOlson, 1990: Kwiatkow
skiら、1990）。ＹＡＣ末端配列は、記載（Ochmanら、1988）のように逆ＰＣＲ
によって決定され、ＳＴＳとして用いた。
【０１８７】 Ｐ１クローンは、以前に同定されたコスミドｃｏｓＱＷ２２（本研究）、ｃＣ
Ｉ１１−４６９（Ｄ１１Ｓ６７９）、ｃＣＩ１１−３８５（Ｄ１１Ｓ５５１）、
ｃＣＩ１１−５６５（Ｄ１１Ｓ６０１）、ｃＣＩ１１−２３７（Ｄ１１Ｓ４５４
）由来の単一コピープローブを用いて単離された（Tanigamiら、1992; Tokinoら
、1991; Sternberg, 1990）。新たに単離されたＰ１は、ＦＩＳＨまたはサザン
分析によって、染色体１１ｐ１５に位置付けられた。末端特異的リボプローブは
、新たに単離されたＰ１から生じ、付加的な隣接クローンを同定するために用い
られた（Riboprobe Gemini Core System Kit; Promega）。Ｐ１およびコスミド
クローンのＤＮＡは、アルカリ溶解プラスミド単離を用いて調製され、記載（Sa
mbrookら、1989）のようにＣｓＣｌ−エチジウムブロミド勾配中の平衡遠心分離
によって精製された。Ｐ１挿入末端配列は、記載（WangおよびKeating, 1994）
のようなサイクルシークエンシングによって決定された。ＳＴＳは、これらの挿
入末端配列に基づいて生じた。Ｐ１とコスミドの間の重複は、共通の制限フラグ
メントを合計することによって計算された。
【０１８８】 実施例４ ＫＶＬＱＴ１クローンの単離および特徴付け 成人心臓ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）を培養し、捕捉したエキソン４
１８１Ａをプローブとして用いて、１ｘ１０６プラークをスクリーンした。捕捉
したエキソン４１８１Ａの配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
のためのオリゴヌクレオチドプローブを設計した。ＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲＴＭ ｃＤＮＡ陽性選択システムを用いて、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Life T
echnologies, Inc.）から１ｘ１０１１個のクローンをスクリーンした。捕獲お
よび修復オリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧ
ＣＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＧＴＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧ
−３’（配列番号：８）であった。
【０１８９】 ＫＶＬＱＴ１の複合ｃＤＮＡ配列は、重複するｃＤＮＡクローンの末端配列決
定によって、およびプライマー歩行によって得られた。配列決定は、ファルマシ
ア（Pharmacia）Ａ．Ｌ．Ｆ．自動シークエンサーを用いて自動的に、またはシ
ークエナーゼ・バージョン２．０ＤＮＡシークエンシング・キット（Sequenase
Version 2.0 DNA Sequencing Kit）（United States Biochemical, Inc.）を用
いて手動で行った。データベース分析および配列分析を、ＧＣＧソフトウェア・
パッケージ、ＩＧソフトウェア・パッケージおよびバイオテクノロジー情報のた
めのナショナル・センター由来のＢＬＡＳＴネットワーク・サービスを用いて行
った。
【０１９０】 ＫＶＬＱＴ１の部分的ゲノム構造（膜スパニングドメインＳ２〜Ｓ６）は、記
載（WangおよびKeating, 1994）のようにＰ１ １８Ｂ１２のサイクルシークエ
ンシングによって決定された。プライマーは、ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡ配列に基
づいて設計され、サイクルシークエンシングに用いられた。
【０１９１】 実施例５ 突然変異分析 ＳＳＣＰは、以前に記載されたように行った（Wangら、1995a; Wangら、1995b
）。正常および異常型ＳＳＣＰ産物は、記載（WangおよびKeating, 1994）のよ
うに直接、単離配列決定されるか、またはＴ−ベクター法（Marchukら、1991）
を用いてpBluescript（ＳＫ＋；Staratagene）中にサブクローン化された。後者
の方法を用いた場合、SequenaseTM Version 2.0（United States Biochemicals,
Inc.）を用いるジデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって、数個の
クローンが配列決定された。
【０１９２】 実施例６ ノーザン分析 複合組織ノーザンフィルター（multiple tissue Nothern filter）（Human MT
N blot 1, Clontech）を以前の記載のように、３２Ｐ標識したＫＶＬＱＴ１ ｃ
ＤＮＡプローブでプローブした（Curranら、1995）。
【０１９３】 実施例７ ＬＱＴ１の微細な遺伝学的および物理的位置測定 ＬＱＴ１の正確な位置を、一族１５３２（Ｋ１５３２）、北ヨーロッパ系の大
きなユタの一族における遺伝子型分析によって決定した（図１）。該一族は、第
１のＬＱＴ遺伝子、ＬＱＴ１を染色体１１ｐ１５．５に結びつける最初の研究に
おいて用いられた（Keatingら、1991a; Keatingら、1991b）。付加的な一族のメ
ンバーは、２１７個体の全試料サイズについて同定され、表現型が決定された。
表現型決定は、以前の記載のように行われた（Keatingら、1991a; Keatingら、1
991b; Jiangら、1994）。ＨＲＡＳ、ＴＨ、Ｄ１１Ｓ４５４およびＤ１１Ｓ１２
でのマーカーを用いる予備的な遺伝子型分析は、Ｋ１５３２の全ての確定メンバ
ーを包含した。これらの実験は、該一族の有益な分家を同定した。付加的な遺伝
子型分析は、染色体１１ｐ１５．５由来の３つの非常に多形なマーカー：Ｄ１１ Ｓ９２２ 、Ｄ１１Ｓ１３１８およびＤ１１Ｓ８６０を用いて行われた（Gyapayら
、1994）。各マーカーに関する遺伝子型および対合ＬＯＤスコアは、図１および
表２に示される。これらのマーカーのうち、ＴＨおよびＤ１１Ｓ１３１８は、完
全に連鎖した。組換えは、ＨＲＡＳを包含する試験された全ての多のマーカーを
用いて同定されたが、各ケースにおいて、統計学的に有意な正のＬＯＤスコア（
＋３以上）が同定された。これらのデータは、該一族においてＬＱＴ１が完全に ＴＨ およびＤ１１Ｓ１３１８に連鎖すること、および疾患遺伝子がＨＲＡＳのセ
ントロメア側に位置することを示す。
【０１９４】
【表２】
【０１９５】 ＬＱＴ１の位置測定を正確にするために、Ｋ１５３２のハプロタイプ分析を行
った（図１参照）。有益な組換え事象を有する９個の染色体を同定した。テロメ
ア組換え事象は、罹患していない個体ＩＶ−２２（Ｄ１１Ｓ９２２およびＴＨ間
）、罹患した個体ＩＶ−２５（Ｄ１１Ｓ９２２およびＴＨ間）、罹患していない
個体Ｖ−６（ＨＲＡＳおよびＤ１１Ｓ９２２間）および罹患した個体Ｖ−２４（ ＨＲＡＳ およびＤ１１Ｓ９２２間）において観察された。セントロメア組換え事
象は、罹患していない個体Ｖ−１７（Ｄ１１Ｓ８６０およびＤ１１Ｓ４５４間）
、罹患した個体Ｖ−２４（Ｄ１１Ｓ８６０およびＤ１１Ｓ４５４間）、罹患して
いない個体Ｖ−３４（Ｄ１１Ｓ８６０およびＤ１１Ｓ４５４間）、罹患していな
い個体ＶＩ−１３（Ｄ１１Ｓ８６０およびＤ１１Ｓ４５４間）、罹患していない
個体ＶＩ−１４（Ｄ１１Ｓ４５４およびＤ１１Ｓ１３１８間）および罹患した個
体ＶＩ−１６（Ｄ１１Ｓ８６０およびＤ１１Ｓ４５４間）において観察された。
これらのデータは、ＬＱＴ１がＤ１１Ｓ９２２とＤ１１Ｓ４５４の間に位置する
ことを示す。ＬＱＴ１をＴＨのセントロメア側に位置付ける近年の研究と共に（
Russellら、1995）、これらのデータは、ＬＱＴ１をＴＨとＤ１１Ｓ４５４との
間に位置付けた。
【０１９６】 ＬＱＴ１を含有する領域のサイズは、染色体１１Ｐ１５．５由来のゲノムプロ
ーブを用いるパルス−フィールドゲル分析を用いて評価された。ＴＨ、Ｄ１１Ｓ ５５１ およびＤ１１Ｓ４５４由来のプローブは、７００ｋｂ Ｍｌｕ Ｉ制限フ
ラグメントにハイブリダイズした（図２）。これらのデータは、ＬＱＴ１を含有
する領域が７００ｋｂ未満であることを示唆した。該領域の物理的表示は、酵母
人工染色体（ＹＡＣ）およびＰ１ライブラリーを該領域由来のプローブでスクリ
ーニングすることによって達成された（Tanigamiら、1992; Tokinoら、1991）。
これらのクローンの順番は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩ
ＳＨ）分析を用いて：テロメア−ＴＨ−Ｄ１１Ｓ５５１−Ｄ１１Ｓ６７９−Ｄ１ １Ｓ６０１ −Ｄ１１Ｓ４５４−セントロメアとして確認された。次いで、最初の
実験において同定されたクローンを隣接する重複クローンの同定に使用した。Ｌ ＱＴ１ 間隔由来のクローンの最小セットを図２に示す。
【０１９７】 実施例８ ＫＶＬＱＴ１の同定および特徴付け 物理的地図由来のクローンを用いるエキソン増幅を行って、ＬＱＴ１の候補遺
伝子を同定した。エキソン捕捉は、以前に記載されたように、ｐＳＰＬ３Ｂ（Bu
rnら、1995）を用いてゲノムＰ１クローン上で行った（Buckerら、1991; Church
ら、1994）。各Ｐ１クローン由来の１２８個の捕捉したエキソンの最小のものを
最初、ＰＣＲ産物をサイズ分類することによって特徴付けた。これらから、さら
に４００個のクローンを、Ａ．Ｌ．Ｆ．自動シークエンサー（Pharmacia）を用
いるジデオキシ配列決定によって分析した。ＤＮＡ配列およびデータベース分析
は、イオンチャネルに類似の予測アミノ酸配列を有する８個の可能性のあるエキ
ソンを明らかにした。最も高い類似性は、推定孔領域の一部に対する類似性を包
含する複数の種由来のカリウムチャネルタンパク質に対して５３％の類似性を有
する２３８塩基対捕捉エキソン（４１８１Ａ）について得られた。ＰＣＲ分析を
用いて、４１８１Ａを染色体１１の短いアームおよび物理地図由来の２つのＰ１
（１１８Ａ１０，１８Ｂ１２）に位置付けた。これらのデータは、４１８１Ａが
染色体１１ｐ１５．５上のカリウムチャネル遺伝子の一部であったことを示唆し
た。
【０１９８】 ２個の異なるｃＤＮＡライブラリースクリーニング法を用いて、捕捉エキソン
４１８１Ａが遺伝子の一部であるかどうかを決定した。成人心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーを用いる伝統的なプラークフィルターハイブリダイゼーションは、単一陽
性クローンの同定を導いた。ｃＤＮＡ選択の変種を用いて、第二の心臓ｃＤＮＡ
ライブラリー（GENETRAPPERTM cDNA Positive Selection System, Life Technol
ogies, Inc.）をスクリーンし、１２個の独立クローンを回収した。ＤＮＡ配列
分析は、４１８１Ａおよび上記の多の捕捉エキソン由来の配列を有する完全なア
ラインメントを明らかにした。最長のオープン・リーディング・フレームは、１
６５４塩基対に及んだ。２つの共通ポリアデニル化シグナルが、３’非翻訳領域
におけるポリ（Ａ）尾部の上流に同定された。完全ｃＤＮＡは、該研究のこの段
階で得られなかった。
【０１９９】 部分ｃＤＮＡは、カリウムチャネルの構造的特徴を有するタンパク質を予測し
た。ヒドロパシー分析は、膜−スパンニング（spanning）α−ヘリックスを示し
得る６個の主要な疎水性領域のトポロジーを示唆した。これらの領域は、カリウ
ムチャネル膜スパニングドメインＳ１−Ｓ６と類似の配列を有する。同定した遺
伝子由来の予測アミノ酸配列とＳｈａｋｅｒ（ＳＨＡ）カリウムチャネル（Pong
ら、1998）の比較を図３に示す。Ｓ１−Ｓ６を含有する領域において、アミノ酸
配列同一性は３０％であり、類似性は５９％であった。Ｓ１−Ｓ６の３’に位置
する配列は、いずれの既知タンパク質に対しても有意な類似性を有さなかった。
該遺伝子は、電位依存性カリウムチャネル遺伝子に対して高い類似性を有し、Ｌ ＱＴ１ の強力な候補になったので、ＫＶＬＱＴ１と名づけられた。
【０２００】 ノーザンブロット分析を用いて、ＫＶＬＱＴ１ ｍＲＮＡの組織分布を決定し
た。ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡプローブは、ヒト膵臓、心臓、腎臓、肺および胎盤
において３．２ｋｂの転写産物を検出したが、骨格筋、肝臓または脳においては
検出しなかった（図４）。心臓は、最も高レベルのＫＶＬＱＴ１ ｍＲＮＡを示
した。ノーザン分析は、Curranら、1995に記載のように、複合組織ノーザンフィ
ルター（Human MTN blot1, Clontech）を用いて行った。
【０２０１】 実施例９ 完全ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡの特徴付け 上記の研究は、ＫＶＬＱＴ１の不完全なｃＤＮＡのクローニングおよび特徴付
けをもたらした。この不完全なｃＤＮＡの配列は、６個の疎水性膜−スパンニン
グα−ヘリックス（Ｓ１−Ｓ６）および典型的なＫ＋チャネル孔サイン配列を有
するタンパク質を予測した（Heginbothamら、1994）。しかしながら、該ｃＤＮ
Ａは、アミノ末端ドメインを失っているようであり、機能的に発現しなかった。 ＫＶＬＱＴ１ の完全配列を定義付けるために、数個のｃＤＮＡライブラリーをス
クリーンし、新規なクローンを単離した。エキソン３〜６を含有するｃＤＮＡプ
ローブを用いて、スーパースクリプト・チョイス・システム（SuperScript Choi
ce system）（GIBCO BRL）を用いて研究室で調製された成人心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーから３つの全長ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡクローンを単離した。完全ｃＤＮ
Ａ配列およびコードされるタンパク質を図５Ａ−５Ｂに示す。
【０２０２】 実施例１０ ＫＶＬＱＴ１のゲノム構造 ＫＶＬＱＴ１のゲノムＤＮＡを調べ、エキソン／イントロン境界を全エキソン
について決定した。
【０２０３】 Ａ．ｃＤＮＡクローンの単離 エキソン３〜６を含有するｃＤＮＡプローブを用いて、３つの全長ＫＶＬＱＴ １ ｃＤＮＡクローンを、スーパースクリプト・チョイス・システム（GIBCO BR
L）を用いて研究室で調製された成人心臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【０２０４】 Ｂ．ゲノムクローンの単離 ＫＶＬＱＴ１ Ｐ１クローンを記載のように単離した（Wangら、1996）。エキ
ソン１を含有するコスミドをエキソン１由来のｃＤＮＡプローブを用いて、ヒト
ゲノムコスミドライブラリー（Stratagene）をスクリーニングすることによって
単離した。
【０２０５】 Ｃ．エキソン／イントロン境界決定 ｃＤＮＡ配列に対して設計されたプライマーを用いて、全ゲノムクローンを配
列決定した。ＫＶＬＱＴ１ Ｐ１クローンをサーモシークエナーゼ（ThermoSequ
enase）（Amersham Life Science）を用いてサイクルシークエンシングした。Ｋ ＶＬＱＴ１ コスミドは、ジデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって、
アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）モデル３７３Ａ ＤＮＡ
シークエンサーにおいて配列決定した。正確なエキソン／イントロン境界は、ｃ
ＤＮＡ、ゲノム配列および既知のスプライス部位共通配列の比較によって決定さ
れた。
【０２０６】 Ｄ．ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲ反応条件の設計 ２つの遺伝子のエキソンを増幅するためのプライマーは、経験的に、またはOL
IGO 4.0（NBI）を用いて設計された。増幅条件は： （１）９４℃で３分間、次いで、９４℃で１０秒、５８℃で２０秒および７２
℃で２０秒を３０サイクル、および７２℃で５分伸長。 （２）反応物が１０％グリセロールおよび４％ホルムアミドの最終濃度を有し
、ミネラルオイルを上にかぶせることを除いて（１）と同じ条件。 （３）９４℃で３分間、次いで、９４℃で１０秒間、６４℃で２０秒間および
７２℃で２０秒間を５サイクル、および９４℃で１０秒間、６２℃で２０秒間お
よび７２℃で２０秒間を３０サイクル、および７２℃で５分伸長。
【０２０７】 Ｅ．ＫＶＬＱＴ１ゲノム構造およびプライマーセット 全長ｃＤＮＡクローンを成人心臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した。これら
のクローンの１つから生じた５’−ｃＤＮＡプローブを用いて、ｃｏｓ１、エキ
ソン１を含有するゲノムコスミドクローンを単離した。ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡ
の残りを含むＰ１ゲノムクローンは、以前に単離された（Wangら、1996）。これ
らのゲノムクローンは、染色体１１ｐ１５．５上の約４００ｋｂに及ぶ（図６）
。エキソン構造およびエキソン／イントロン境界を決定するために、ｃＤＮＡに
対して設計されたプライマーを用いて、ｃｏｓ１およびＰ１クローン１１８Ａ１
０、１１２Ｅ３、４６Ｆ１０および４９Ｅ５を配列決定した。ＫＶＬＱＴ１のゲ
ノムおよびｃＤＮＡ配列の比較は、１６個のエキソンの存在を明らかにした（図
５Ａ−５Ｂおよび表３）。エキソンサイズは、４７ｂｐ（エキソン１４）〜１１
２２ｂｐ（エキソン１６）の範囲であった。全イントロン配列は、不変のＧＴお
よびＡＧを各々、ドナーおよびアクセプタースプライス部位に含有した（表３）
。一対のＰＣＲプライマーが、エキソン２〜１６に隣接する各イントロン配列に
対して設計され、重複生産物を有する二対のプライマーがその大きいサイズのた
め、エキソン１に対して設計された(表４）。これらのプライマーを用いて、全
ＫＶＬＱＴ１エキソンをスクリーンできる。
【０２０８】 実施例１１ ＫＶＬＱＴ１機能の特徴付け ＫＶＬＱＴ１の機能を定義付けるために、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞を実施例９に上記した完全ｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＫＶＬＱ Ｔ１ ｃＤＮＡをｐＣＥＰ４（InVitrogen)中にサブクローン化した。ＣＨＯ細
胞をＨａｍのＦ−１２培地中で培養し、リポフェクタミン（Gibco BRL）を用い
て一時的にトランスフェクトした。細胞を１８時間、６μＬリポフェクタミン、
０．５μｇ緑色蛍光タンパク質(pGreen Lantern-1, Gibco BRL）および１．５μ
ｇのｐＣＥＰ４中のＫＶＬＱＴ１を含有する３５ｍｍ皿において形質転換した。
蛍光細胞は、Axopatch 200 パッチ・クランプ増幅器（Axon Instruments）を用
いて、トランスフェクション後４８〜７８時間、電圧固定した。浸漬溶液は、ｍ
Ｍ単位で：１４２ ＮａＣｌ、２ ＫＣｌ、１．２ ＭｇＣｌ２、１．８ ＣａＣｌ２ 、１１．１ グルコース、５．５ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４、２２−
２５℃）を含有した。ピペット溶液は、ｍＭ単位で：１１０ グルタミン酸カリ
ウム、２０ ＫＣｌ、１．０ ＭｇＣｌ２、５ ＥＧＴＡ、５ Ｋ２ＡＴＰ、１０
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含有した。データ獲得および分析は、ｐＣＬＡＭＰ
６（Axon Instruments）を用いて行った。電流活性化の電位依存性は、尾部電流
（試験パルスの最後への電流の非活性化相の補外によって決定される）と試験電
位との間の関係をボルツマン関数に当てはめることによって決定された。尾部電
流は、各卵母細胞の最も大きい値に相対的に標準化された。
【０２０９】
【表３】
【０２１０】
【表４】
【０２１１】 電位依存性外向きＫ＋電流が、−６０ｍＶ以上の電位への膜脱分極後に観察さ
れた(図７Ａ）。該電流は、＋４０ｍＶにて１秒以内に定常状態に達した。短時
間の遅延の後に電流が活性化し、−７０ｍＶへの再分極化が、非活性化の前に振
幅（フック）における最初の増加を伴う尾部電流を顕在化させた。同様の尾部電
流フックは、以前にＨＥＲＧ Ｋ＋チャネルに関して観察されており、非活性化
よりも速い速度で不活性化からチャネルを回復することが原因であるとされた（
Sanguinettiら、1995; Smithら、1996; Spectorら、1996）。ＫＶＬＱＴ１電流
の活性化曲線は、−１１．６±０．６ｍＶで最大値の半分（Ｖ１／２）であり、
１２．６±０．５ｍＶの傾斜ファクターを有した（ｎ＝６；図７Ｂ）。
【０２１２】 ＫＶＬＱＴ１の生物物理学的特性は、他の既知の心臓Ｋ＋電流と異なる。ＫＶ
ＬＱＴ１は、別のサブユニットを共に集合させて、既知の心臓チャネルを形成し
得ることが仮説として取り上げられた。ゆっくり活性化する遅延整流Ｋ＋電流、
ＩＫｓは、心臓作用電位の再分極化を調節する。集中的な研究にもかかわらず、
ＩＫｓチャネルの分子構造は未知である。生理学的データは、ＩＫｓチャネルの
１の成分がｍｉｎＫ（GoldsteinおよびMiller, 1991; Hausdorffら、1991; Taku
miら、1991; Buschら、1992; WangおよびGoldstein, 1995; Wangら、1996）、単
一推定膜スパニングドメインを有する１３０アミノ酸タンパク質（Takumiら、19
88）であることを示唆する。しかしながら、該タンパク質のサイズおよび構造は
、ｍｉｎＫが単独で機能的チャネルを形成することに疑問をもたらした（Attali
ら、1993; Lesageら、1993）。
【０２１３】 該仮説を試験するために、ＣＨＯ細胞をＫＶＬＱＴ１およびヒトＫＣＮＥ１
ｃＤＮＡでコトランスフェクトした。ＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡは、ｐＣＥＰ４（In
Vitrogen）中にサブクローン化し、トランスフェクションはＫＶＬＱＴ１単独に
ついて上記したように行った。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１のコトランスフェ
クションの場合、０．７５μｇの各ｃＤＮＡを用いた。以前に報告されたように
（Lesageら、1993）、ＣＨＯ細胞のＫＣＮＥ１単独でのトランスフェクションは
、検出可能な電流を誘導しなかった（ｎ＝１０、図７Ｃ）。ＫＣＮＥ１とＫＶＬ ＱＴ１ のコトランスフェクションは、ゆっくり活性化する遅延整流電流を誘導し
、それは、ＫＶＬＱＴ１単独でトランスフェクトした細胞における電流よりも非
常に大きかった（図７Ｄおよび７Ｅ）。数百ミリ秒連続した遅延の後、コトラン
スフェクトＣＨＯ細胞における電流がゆっくり活性化し、それは、有意なホモマ
ーＫＶＬＱＴ１チャネル電流が存在しないことを示した。電流は、長い脱分極化
パルスの間、飽和せず、最初の遅延および電流活性化の二つの相を最もよく描写
するために３−指数関数を必要とした。＋４０ｍＶまでの３０秒の脱分極化パル
スの間、電流は、０．６８±０．１８、１．４８±０．１６および８．０±０．
６秒の時定数で活性化した（ｎ＝４）。電流に対する等時性（７．５秒）活性化
曲線は、７．５±０．９ｍＶのＶ１／２および１６．５±０．８ｍＶの傾斜ファ
クターを有した（ｎ＝７、図９Ｂ）。比較すると、ヒト心臓ＩＫｓの活性化曲線
のＶ１／２および傾斜は、９．４ｍＶおよび１１．８ｍＶである（Liら、1996）
。ＣＨＯ細胞中で共同発現したＫＶＬＱＴ１およびｈｍｉｎＫのように、心臓ＩＫｓ の活性化は、極度にゆっくりであり、３−指数関数によって最もよく描写さ
れた（Balserら、1990; SanguinettiおよびJukiewicz, 1990）。キニジン（５０
μＭ）は、単離筋細胞におけるＩＫｓに対するその効果（４０−５０％遮断）と
同様に（Balserら、1991）、コトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において尾部電
流を３０±８％（ｎ＝５）遮断した。したがって、ＣＨＯ細胞におけるＫＶＬＱ
Ｔ１およびｈｍｉｎＫの共同発現は、心臓ＩＫｓとほとんど同一の生物物理学的
特性を有するＫ＋電流を誘導した。
【０２１４】 ｈｍｉｎＫおよびＫＶＬＱＴ１の特性をさらに特徴付けるために、これらのチ
ャネルを部分的に、ツメガエル属卵母細胞中で一緒に発現させた。ゼナパス・ラ
エビス（Xenopus laevis）卵母細胞を単離し、Sanguinettiら（1995）による記
載のようにｃＲＮＡを注入した。ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡをｐＳＰ６４（Promeg
a）中にサブクローン化した。ＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡは、R. Swansonから入手し
た。おおよそ等モル濃度のＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡ（卵母細胞あたり５．８ｎｇ
）およびＫＣＮＥ１（卵母細胞あたり１ｎｇ）ｃＲＮＡを共同注入実験に使用し
た。浸漬溶液は、ｍＭ単位で：９８ ＮａＣｌ、２ ＫＣｌ、２ ＭｇＣｌ２、０
．１ ＣａＣｌ２および５ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６、２２−２５℃）を含有した
。逆転−電位実験の場合、外部ＫＣｌを等モルのＮａＣｌで置換することによっ
て浸透度を維持した。卵母細胞にｃＲＮＡを注入後、標準的な２−微小電極電圧
クランプ技術を用いて３日間、電流を記録した（Sanguinettiら、1995）。０．
５ｋＨｚで電流をろ過し、２ｋＨｚでデジタル化した。データは平均±ｓ．ｅ．
ｍ．で示される。
【０２１５】 ＫＶＬＱＴ１完全ＲＮＡを注入した卵母細胞は、ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡでト
ランスフェクトしたＣＨＯ細胞とほぼ同一の活性化の電位依存性で、迅速に活性
化する外向きＫ＋電流を発現した（図８Ａおよび８Ｂ）。ＫＶＬＱＴ１チャネル
のＫ＋選択性は、細胞外Ｋの種々の濃度（［Ｋ＋］ｅ）で尾部電流の逆転電位（
Ｅｒｅｖ）を測定することによって決定した。Ｅｒｅｖとｌｏｇ［Ｋ＋］ｅとの
関係の傾斜は、４９．９±０．４ｍＶ（ｎ＝７；図８Ｃ）であり、完全に選択的
なＫ＋チャネルに関してネルンスト方程式によって予測される（５８ｍＶ）より
も有意に小さい。ＫＶＬＱＴ１とＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡの卵母細胞への共同注入
は、ＩＫｓに類似の電流を誘導した（図９Ｃ）。共同注入した卵母細胞に関する
Ｅｒｅｖとｌｏｇ［Ｋ＋］ｅとの関係の傾斜は、ＫＶＬＱＴ１単独の場合および
モルモット心臓ＩＫｓ（４９ｍＶ）（Matsuuraら、1987）の場合に類似して、４
９．９±４ｍＶ（ｎ＝６）であった。共同注入した卵母細胞に関する等時性（７
．５秒）活性化曲線は、心臓ＩＫsに類似して、６．２ｍＶのＶ１／２および１
２．３ｍＶの傾斜を有した（図９Ｅ）。
【０２１６】 実施例１２ アフリカツメガエル（Xenopus）におけるＫＶＬＱＴ１遺伝子の同定 ＣＨＯ細胞と対照してみると、ＫＣＮＥ１は、アフリカツメガエル卵母細胞に
おいて機能的発現を受けることができた（図９Ｂ）。誘導電流（ＩｓＫ）は、コ
インジェクトされる卵母細胞において誘導される電流よりも小さいが、活性化の
動力学および電位依存性は類似していた（図９Ａ−Ｅ）。２つの観察結果により
、アフリカツメガエル卵母細胞におけるＩｓＫがｍｉｎＫと未確認の構成的に発
現されたサブユニットとのコアセンブリーにより形成されるチャネルから生じる
という仮説が立てられた。第一に、ＩｓＫの大きさは、非常に少量のＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡの注入後に飽和し（図９Ｄ）、このことは、限定量の内因性成分が機
能的発現に必要であることを示唆している（Wang and Goldstein, 1995；Cui et
al., 1994）。第二に、哺乳動物細胞におけるｍｉｎＫの異種発現は、検出可能
な電流を誘導せず（Lesage et al., 1993）（図７Ｃ）、このことは、ｍｉｎＫ
が機能的チャネルを形成するのに十分ではないことを示唆している。この未確認
サブユニットは、ＫＶＬＱＴ１の相同体であるかもしれないという仮説が立てら
れた。この仮説を吟味するために、アフリカツメガエル卵母細胞ｃＤＮＡライブ
ラリー（クローンテク（Clontech））をＳ３−Ｓ５ドメインに及ぶＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡクローンでスクリーニングした。１.６ｋｂの部分クローン（ＸＫＶＬ ＱＴ１ 、図１０Ａ）を単離した。ＸＫＶＬＱＴ１は、ＫＶＬＱＴ１の対応する領
域とアミノ酸レベルで８８％同一である（図１０Ａ）。これらのデータは、Ｉｓ Ｋ がＸＫＶＬＱＴ１およびｍｉｎＫタンパクのコアセンブリーから生じることを
示唆している。
【０２１７】 ＫＶＬＱＴ１およびｈｍｉｎＫがコアセンブリー形成して心臓ＩＫｓチャネル
を形成すると考えられた。２つの遅延整流器Ｋ＋電流ＩＫｒおよびＩＫｓは、心
臓筋細胞における活動電位時間を調節する（Li et al., 1996；Sanguinetti and
Jurkiewicz, 1990）。従前の研究は、ＩＫｒチャネルの機能不全がＱＴ延長症
候群に関与していることを示した（Sanguinetti et al., 1995；Curran et al.,
1995；Sanguinetti et al., 1996a）。ＫＶＬＱＴ１変異もまたこの障害を引き
起こすという観察結果（Wang et al., 1996）およびＫＶＬＱＴ１がＩＫｓチャ
ネルの一部を形成するという知見は、両方の心臓遅延整流器Ｋ＋チャネルの機能
不全が心臓性不整脈から突然死を引き起こす危険性の一因となることを示してい
る。
【０２１８】 実施例１３ ６つの大きな家族におけるＬＱＴについてのＫＶＬＱＴ１ミスセンス変異のコ
セグリゲーション ＫＶＬＱＴ１がＬＱＴ１であるという仮説を吟味するために、一本鎖コンホメ
ーション多型性（ＳＳＣＰ）分析を用いて、第１１染色体への関与を示した最も
大きいＬＱＴ家族であるＫ１５３２の罹患メンバーにおける機能的変異について
スクリーニングした。ＳＳＣＰは、従前の開示（Wang et al., 1995a；Wang et
al., 1995b）に従って行った。正常なＳＳＣＰ産生物および異常なＳＳＣＰ産生
物を単離し、従前の開示（Wang and Keating, 1994）に従って直接配列決定する
か、または、Ｔ−ベクター法（Marchuk et al., 1991）を用いてｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ（ＳＫ＋）（ストラータジーン（Stratagene））にサブクローンした。
後者の方法を用いた場合、いくつかのクローンを、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ Ｖ
ｅｒｓｉｏｎ ２.０（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカルズ，インコーポ
レイテッド（United States Biochemicals, Inc.））を用いてジデオキシチェー
ンターミネーション法により配列決定した。Ｓ２とＳ６との間の領域は、ＫＶＬ
ＱＴ１機能に重要であるので、分析は、これらの領域に集中した。本発明者らは
、ｃＤＮＡ配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＫＶＬＱＴ １ 含有Ｐ１，１８Ｂ１２とのサイクル配列決定反応（Wang and keating, 1994）
にこれらのプライマーを用いた。これらの実験により、Ｓ２−Ｓ６をコードする
エキソンの隣にあるイントロン配列が定義された。次いで、これらのイントロン
配列から付加プライマーを得、ＳＳＣＰ分析に用いた（表５）。
【０２１９】 ＳＳＣＰ分析により、Ｋ１５３２の７０の罹患メンバーにおいて異常なコンホ
ーマーが同定された（図１１Ａ）。この異常なコンホーマーは、この血族の１４
７の罹患していないメンバーにおいても２００を超える血縁のない対照個体由来
のゲノムＤＮＡにおいても観察されなかった。この異常とＬＱＴとの間の関与に
ついての二点ＬＯＤスコアは、０の組換えフラクションで１４.１９であった（
表２）。ＫＶＬＱＴ１とＬＱＴ１との間で組換えは観察されず、このことは、こ
れらの座が完全に連鎖していることを示している。正常なＳＳＣＰコンホーマー
および異常なＳＳＣＰコンホーマーのＤＮＡ配列分析により、コドンＶａｌ−１
２５の第１ヌクレオチドでの単個塩基置換、すなわち、ＧからＡへのトランジシ
ョンが明らかになった（図１１Ａおよび表６）。この変異は、Ｓ４とＳ５との間
の予測される細胞内ドメインにおいてバリンからメチオニンへの置換を引き起こ
す。
【０２２０】 ＫＶＬＱＴ１における変異がＬＱＴを引き起こすという仮説をさらに吟味する
ために、追加された５つの大きいＬＱＴ血族の罹患メンバー由来のＤＮＡ試料を
研究した。この領域からの多型性マーカーを用いる関連性分析により、該疾患表
型がこれらの家族において第１１染色体に関与していたことが証明された。異常
なＳＳＣＰコンホーマーがＫ２６０５、Ｋ１７２３、Ｋ１８０７（図１１Ｂ−Ｄ
）、Ｋ１６１およびＫ１６２の罹患メンバーにおいて同定された。Ｋ１６１およ
びＫ１６２において同定されたＳＳＣＰの異常は、Ｋ１８０７において観察され
たものと同一であった。異常なＳＳＣＰコンホーマーは、これらの血族の罹患し
ていないメンバーにおいても２００を超える血縁のない対照個体由来のＤＮＡ試
料においても見られなかった。各家族において同定された正常なコンホーマーお
よび異常なコンホーマーを配列決定した。ヌクレオチド変化、コード化の影響、
および各変異の位置を表６にまとめて示す。
【０２２１】
【表５】
【０２２２】
【表６】
【０２２３】 実施例１４ 小さい家族および散発的なケースにおけるＬＱＴに関与するＫＶＬＱＴ１遺伝
子内欠失および１５のミスセンス変異 ＫＶＬＱＴ１における付加的なＬＱＴ関連変異を同定するために、小さい血族
および散発的なケースについてさらになるＳＳＣＰ分析を行った。ＳＳＣＰによ
り、血族１３２１６において異常なコンホーマーが明らかとなった（図１２Ａ）
。２００を超える対照個体の分析は、この異常を示さなかった。この異常なコン
ホーマーをクローン化し、配列決定し、コドン１６７および１６８を包含する三
塩基対欠失が明らかとなった。この変異は、推定Ｓ２ドメインにおけるフェニル
アラニンからトリプトファンへの置換およびグリシンの欠失を引き起こす（表６
）。
【０２２４】 付加的な血族の罹患メンバーにおいて異常なＳＳＣＰコンホーマーを同定した
。Ｋ２０５０において同定された異常なＳＳＣＰコンホーマーは、Ｋ１７２３に
おけるものと同一であり、Ｋ１６１、Ｋ１６２、Ｋ１６３およびＫ１６４におい
て同定された異常なコンホーマーは、Ｋ１８０７において観察されたものと同一
であった。また、血族２６２５、２６７３および３６９８は、同一の変異を有し
ていた。２００を超える対照個体由来のＤＮＡ試料において、異常なコンホーマ
ーは、全く同定されなかった。各ケースにおいて、正常なコンホーマーおよび異
常なコンホーマーを配列決定した。これらのデータは、図１２Ａ−Ｏに示してお
り、表６にまとめて示した。全体的に、２４の家族または散発的なケースにおい
てＬＱＴに関与するＫＶＬＱＴ１変異を同定し、ＫＶＬＱＴ１の変異がＬＱＴの
第１１染色体関与形態を引き起こすという有力な分子遺伝学的証明が得られた。
【０２２５】 実施例１５ ＬＱＴを引き起こすＫＣＮＥ１変種 ｍｉｎＫの変種発見において種々の個体についての分離研究を行った。これら
の研究は、以下の方法を用いて行った。 Ａ．表現型分析 個体を、心拍数について補正したＱＴ間隔に基づいて表現型で特徴付けした。
個体は、ＱＴｃ≧０.４６秒の場合に罹患していると特徴付けた。個体は、ＱＴ
ｃ≦０.４２秒の場合に罹患していないとした。ローカル・インスティチューシ
ョナル・リビュー・ボード・ガイドラインに従って、全ての個体または彼らの保
護者から告知に基づく同意を得た。表現型データは、遺伝子型の知識を用いずに
解釈した。
【０２２６】 Ｂ．変異分析 以下のプライマー対を用いてＰＣＲによりゲノム試料を増幅した。 ＭＩＮＫ１Ｆ − 5'-CTGCAGCAGTGGAACCTTAATG-3'（配列番号：８７）および ＭＩＮＫ１Ｒ − 5'-GTTCGAGTGCTCCAGCTTCTTG-3'（配列番号：８８）； ＭＩＮＫ２Ｆ − 5'-AGGGCATCATGCTGAGCTACAT-3'（配列番号：８９）および ＭＩＮＫ２Ｒ − 5'-TTTAGCCAGTGGTGGGGTTCA-3'（配列番号：９０）； ＭＩＮＫ３Ｆ − 5'-GTTCAGCAGGGTGGCAACAT-3'（配列番号：９１）および ＭＩＮＫ３Ｒ − 5'-GCCAGATGGTTTTCAACGACA-3'（配列番号：９２）。
【０２２７】 開示（KW Wang et al., 1996）に従ってＳＳＣＰ分析においてＰＣＲ産生物を
用いた。ＰＣＲは、Perkin-Elmer Cetus 9600サーモサイクラーを用いて１０μ
Ｌの容量でＤＮＡ ７５ｂを用いて行った。増幅条件は、９４℃で３分間、次い
で、９４℃で１０秒間、５８℃で２０秒間、７２℃で２０秒間のサイクルを３０
回および７２℃で５分間延長であった。反応物を０.１％ＳＤＳ／１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ ４０μＬで希釈し、次いで、９５％ホルムアミド・ロード染料３０μＬで
希釈した。該混合物を９４℃で５分間変性し、氷上に放置した。各試料３μＬを
、４℃で５％および１０％非変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビ
スアクリルアミド（４９：１））上で分離し、室温で０.５Ｚおよび１Ｘ ＭＤＥ
（変異検出強化）ゲル（エフエムシー・バイオプロダクツ（FMC BioProducts）
）上で分離した。５％および１０％ゲル上での電気泳動は、４０Ｗで３〜５時間
行い、０.５Ｘおよび１Ｘ ＭＤＥゲル上での電気泳動は、各々、３５０Ｖおよび
６００Ｖで一夜行った。ゲルを３ＭＭ濾紙上で乾燥させ、−７０℃で１８時間フ
ィルムに暴露した。
【０２２８】 ゲルからＳＳＣＰバンドを切出し、６５℃で３０分間、二重蒸留水１００μＬ
で溶離した。溶出したＤＮＡ １０μＬを最初のプライマー対を用いて再度増幅
した。産生物を１％低融点アガロースゲル（ＦＭＣ）上で分離し、フェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させた。Applied Biosystemsモデル３７３
Ａ ＤＮＡシークエンサーにてジデオキシチェーンターミネーション法によりＤ
ＮＡを両方向に配列決定した。
【０２２９】 Ｃ．機能的発現 ＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡ発現構築物を全ヒトＤＮＡからのＰＣＲにより増幅し、
以下のプライマーを用いてｐＳＰ６４転写ベクター（プロメガ（Promega））に
てクローン化した。
【０２３０】 ＭＩＮＫＦ − 5'-CAGTGGAAGCTTAATGCCCAGGATGATC-3'（配列番号９３）および
ＭＩＮＫＲ − 5'-CAGGAGGATCCAGTTTAGCCAGTGGTGGGGGTTCA-3'（配列番号９４）
。
【０２３１】 太字のヌクレオチドは、この変化がＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉ制限部
位（下線を引いた）を生じさせたことを意味している。ヒト心臓ｃＤＮＡライブ
ラリーから全長ＫＶＬＱＴ１ ｃＤＮＡクローン（Yang et al., (1997) により
報告されたものと同一である）を単離し、ｐＳＰ６４プラスミド発現ベクターに
サブクローン化した。全ての構築物をＤＮＡ配列分析法により確認した。ｍＣＡ
Ｐ ＲＮＡキャッピングキット（ストラータジーン（Stratagene））を用いて、
相補的ＲＮＡを合成した。
【０２３２】 アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞の単離およびｃＲＮＡ注入は
、開示（Sanguinetti et al., 1995）に従って行った。電圧クランプデータを得
、ＰＣＬＡＭＰ ｖ６.０ソフトウェア（アクソン・インストゥルメンツ（Axon I
nstruments））を用いて分析した。定常状態測定値よりも等時性（７.５秒）測
定値を用いてＩＫｓ活性化の電位依存性を推定した。ＩＫｓ活性化の電位依存性
は、Boltzman関数にピークテール電流を当て嵌めることにより決定した。このパ
ルスプロトコールを用いて電流が半分活性化される電圧Ｖ１／２および勾配因子
をこれらのデータから算出した。活性化電流を二指数関数に当て嵌めて活性化の
遅いおよび速い時定数を得た。非活性化時定数は、単一指数関数に種々の試験電
位で低下するテール電流を当て嵌めることにより得られた。
【０２３３】 全てのデータは、平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.である。統計学的分析は、フィッシャーのL
east Significance post hoc 検定および不対スチューデントＴ検定を用いて、
反復測定値分散分析を用いて行った。ｐ値＜０.０５を統計学的に有意であると
考えた。
【０２３４】 Ｄ．結果 イオンチャネルβサブユニットは、αサブユニットとコアセンブリーを形成し
てゲーティング動力学を調節し、多量体チャネル複合体の安定性を強化する補助
タンパクである（Rettig et al., 1994；Shi et al., 1996）。それらの機能的
重要性にもかかわらず、カリウムβサブユニットの機能不全は、疾患に関与しな
かった。最近の生理学的研究は、ＫＣＮＥ１が、ＫｖＬＱＴ１αサブユニットと
コアセンブリーを形成してゆっくりと活性化する遅延整流器Ｋ＋（ＩＫｓ）チャ
ネルを形成するβサブユニットをコードすることを示唆している（Sanguinetti
et al., 1996b；Barhanin et al., 1996）。ＫＶＬＱＴ１変異がＱＴ延長症候群
（ＬＱＴ）において不整脈感受性を引き起こすので（Q. Wang et al., 1996；Ne
yroud et al., 1997；Splawski et al., 1997a）、本発明者らは、ＫＣＮＥ１に
おける変異もまたこの障害を引き起こすという仮説を立てた。ここで、ＫＣＮＥ １ ミスセンス変異は、２つのＬＱＴ家族の罹患メンバーにおいて同定される。両
方の変異（Ｓ７４Ｌ、Ｄ７６Ｎ）は、活性化の電位依存性をシフトし、チャネル
非活性化を加速することにより、ＩＫｓを低下させた。Ｄ７６Ｎ ｈｍｉｎＫは
、また、優位な負の作用を有していた。これらの変異の機能的結果は、心臓の再
分極の遅延および不整脈の危険性増加である。これらのデータは、ＫＣＮＥ１を
ＬＱＴ遺伝子として確立し、ｈｍｉｎＫがＩＫｓチャネルの不可欠タンパクであ
ることを確認する。
【０２３５】 ＬＱＴを有する個体を評価し、表現型で特徴付けた（Keating et al., 1991a
；Jiang et al., 1994）。血族１７８９の罹患メンバーにおいて異常なコンホー
マーを同定させるＫＣＮＥ１にわたるプライマーを用いて、一本鎖コンホメーシ
ョン多型性（ＳＳＣＰ）を分析する（図１３Ａ）。このコンホーマーは、罹患し
ていない家族メンバーにおいても２００の血縁のない対照個体（４００染色体）
においても観察されなかった。ＤＮＡ配列分析は、コドン７６の第一ヌクレオチ
ドでのＧからＡへのトランジション（ＡｓｐからＡｓｎへの置換を引き起こす）
を明らかにした（Ｄ７６Ｎ）（図１３Ｃ）。ＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡおよびそのタ
ンパク産生物の配列を、各々、配列番号：３および配列番号：４として記載する
。コドン７６の第一ヌクレオチドは、配列番号：３の塩基４１８である。
【０２３６】 さらにＳＳＣＰ分析は、血族１７５４において疾患について共分離した第二の
異常を定義した（図１３Ｂ）。この異常は、該家族の罹患していないメンバーに
おいても２００の対照においても観察されなかった。ＤＮＡ配列分析は、コドン
７４の第二ヌクレオチド（配列番号：３の塩基４１３）におけるＣからＴへのト
ランジション（ＳｅｒからＬｅｕへの置換を導く）を明らかにした（Ｓ７４Ｌ）
（図１３Ｃ）。ＬＱＴを有する血縁のない個体から得たさらなるＤＮＡ試料の分
析は、付加的なＫＣＮＥ１変異を明らかにした。表７にＬＱＴ家族においてみら
れるＫＣＮＥ１変異を示す。
【０２３７】
【表７】
【０２３８】 これらのＫＣＮＥ１変異の機能的結果を測定するために、本発明者らは、アフ
リカツメガエル卵母細胞において変異体および野生型（ＷＴ）タンパクを発現さ
せた。ＫＶＬＱＴ１およびｍｉｎＫ相互作用の化学量論は知られていないので、 ＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡの量を変化させて（０.０１〜２.５ｎｇ／卵母細胞）、固
定量（６ｎｇ／卵母細胞）のＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡと結合させ、得られた電流
を記録した。ＩＫｓ振幅は、注入したＫＣＮＥ１の関数として増加し、≧０.６
ｎｇ／卵母細胞のＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡレベルで飽和した（図１４Ａ−１４Ｂ）
。次なる同時発現実験は、１.２ｎｇ／卵母細胞のＫＣＮＥ１および６ｎｇ／卵
母細胞のＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡを用いて行って、ＫＣＮＥ１が異種多量体チャ
ネルの発現についての制限因子ではなかったことを確認した。
【０２３９】 Ｄ７６Ｎ ＫＣＮＥ１およびＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡのコインジェンクションは
、検出可能なＫ＋電流を誘導しなかった（ｎ＝１３）。ＬＱＴが常染色体優性形
質として遺伝するので、罹患した個体は、１個の正常なＫＣＮＥ１対立遺伝子と
１個の変異体ＫＣＮＥ１対立遺伝子を有する。したがって、変異体ＫＣＮＥ１
ｃＲＮＡをＷＴ ＫＣＮＥ１およびＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡとコインジェクトした
。Ｄ７６Ｎ ＫＣＮＥ１（０.６ｎｇ／卵母細胞）、ＷＴ ＫＣＮＥ１（０.６ｎｇ
／卵母細胞）およびＫＶＬＱＴ１ ｃＲＮＡ（６ｎｇ／卵母細胞）のコインジェ
クションにより誘導された電流（ＩＫｓ−Ｄ７６Ｎ）は、＋４０ｍＶで、ＷＴ
ＫＣＮＥ１（１.２ｎｇ／卵母細胞）およびＫＶＬＱＴ１（６ｎｇ／卵母細胞）
ｃＲＮＡにより誘導された電流（ＩＫｓ−ＷＴ）よりも９１％小さかった（図１
５Ａおよび１５Ｂ）。これらのデータは、Ｄ７６Ｎ ｈｍｉｎＫサブユニットが
ＷＴ ｈｍｉｎＫおよびＫＶＬＱＴ１との異種多量体チャネルを形成し、強い優
性の負のメカニズムによりＩＫｓを誘導することを示している。
【０２４０】 野生型および変異体チャネルの生物物理的特性を比較するために、活性化の電
位依存性およびＩＫｓ−Ｄ７６ＮおよびＩＫｓ−ＷＴについての非活性化の動力
学を特徴付けた。ＩＫｓの大きさは、１００秒間のパルスで励起した場合でさえ
定常状態に達しない（Swanson et al., 1993）。したがって、７.５秒試験パル
スの後のテール電流振幅をＩＫｓの電位依存性の実験的測定値として用いた。ＩＫｓ−Ｄ７６Ｎ テール電流は、＋２８ｍＶで最大の中間であり、ＩＫｓ−ＷＴと
比較して＋１６ｍＶシフトしている（図１５Ｃ）。チャネルゲーティングにおけ
るシフトは、電流非活性化の電位依存性により確認された。ＩＫｓ−Ｄ７６Ｎチ
ャネル閉鎖（非活性化）の速度は、≧−８０ｍＶでＩＫｓ−ＷＴよりも速かった
（図１５Ｄ）。非活性化の時定数の電位依存性は、約＋３０ｍＶシフトした。か
くして、Ｄ７６Ｎ ｈｍｉｎＫは、３つのメカニズムによりＩＫｓを低下させる
：優性の負のチャネル機能抑制、チャネル非活性化の速度の増大、およびチャネ
ル活性化の電位依存性における正のシフト。これらの作用は、再分極期の間に外
向き電流を減少させ、心臓活動電位の持続を長期化する。
【０２４１】 Ｄ７６Ｎ ｈｍｉｎＫとは異なり、Ｓ７４Ｌ ｈｍｉｎＫは、ＫＶＬＱＴ１と同
時発現した場合に、別の機能であるにもかかわらず、ＩＫｓチャネルを形成した
。Ｓ７４Ｌ ＫＣＮＥ１（１.２ｎｇ／卵母細胞）およびＫＶＬＱＴ１（６.０ｎ
ｇ／卵母細胞） ｃＲＮＡの注入により誘導された電流は、ＩＫｓ−ＷＴよりも
約４０ｍＶ高い活性化についての閾値を有していた。得られた電流は、＋６０ｍ
Ｖへの７.５秒パルス（ｎ＝１５）後、ＩＫｓ−ＷＴよりも６６％小さかった。
Ｓ７４Ｌ ＫＣＮＥ１（０.６ｎｇ／卵母細胞）およびＷＴ ＫＣＮＥ１（０.６ｎ
ｇ／卵母細胞）をＫＶＬＱＴ１（６.０ｎｇ／卵母細胞） ｃＲＮＡと一緒にコイ
ンジェクトした場合、得られた電流（ＩＫｓ−Ｓ７４Ｌ）は、ＩＫｓ−ＷＴと比
較して、＋６０ｍＶで約３３％減少した（図１６Ａ−１６Ｂ）。図１６ｃに示す
ように、この減少は、主に、電流活性化の電位依存性における正のシフトのため
であった。非活性化の電位依存性は、約＋４０ｍＶシフトした（図１６Ｄ）。こ
のシフトは、ＩＫｓ−Ｓ７４Ｌ非活性化の速度を著しく増大させた。かくして、
Ｓ７４Ｌ ｈｍｉｎＫサブユニットは、ＷＴ ｈｍｉｎＫおよびＫＶＬＱＴ１との
異種多量体チャネルを形成し、チャネル活性化の電位依存性におけるシフトおよ
びチャネル非活性化の速度の増大によりＩＫｓを減少させる。ＩＫｓ−Ｓ７４Ｌ が＋６０ｍＶ（ゲーティングにおける単純なシフトについて予想される）でＩＫ ｓ−ＷＴ と等しくなかったので、Ｓ７４Ｌ変異体サブユニットは、また、機能的
ＩＫｓチャネルの数および／または単一チャネルコンダクタンスを減少させるこ
とが可能である。
【０２４２】 ＫＣＮＥ１のＬＱＴ関連変異がゲーティング動力学を変えるという観察結果に
より、ｈｍｉｎＫが、単にシャペロンとして作用するよりも、ＩＫｓチャネルの
不可欠部分を形成するという注目せずにはいられない証拠が得られる。ＫＶＬＱ
Ｔ１の知見が得られる前に行われたｍｉｎＫの初期研究は、また、この結論を支
持している（Takumi et al., 1991；Goldsstein and Miller, 1991；Wang and G
oldstein, 1995；K.W. Wang et al., 1996）。これらの研究のうちの一において
、Ｄ７６Ｎ ｈｍｉｎＫと類似する変異体ラットｍｉｎＫサブユニット（Ｄ７７
Ｎ）は、ＷＴ ｍｉｎＫと一緒にコアセンブリーを形成し、優性致死作用である
ＩＫｓ機能を抑制した（Wang and Goldstein, 1995）。
【０２４３】 ＩＫｓチャネルのβサブユニットをコードする遺伝子であるＫＣＮＥ１におけ
る変異は、ＩＫｓを減少させ、それにより、筋細胞再分極を遅延させることによ
り不整脈感受性を引き起こす。ＩＫｓにおける局所異質性は心筋層内にあるので
（Liu and Antzelevitch, 1995）、ＫＣＮＥ１における変異は、活動電位時間に
おいて異常な局所不一致を引き起こし、不整脈に対する基質を生じる。ＫＣＮＥ １ におけるＬＱＴ関連変異の知見は、この障害の前駆症状診断を容易にするであ
ろうし、治療についての掛かり合いを有する。
【０２４４】 実施例１６ ＫＣＮＥ１のゲノム構造 ＫＣＮＥ１のゲノムＤＮＡを試験し、エキソン／イントロン境界点を、ＫＶＬ ＱＴ１ について行ったと実質的に同様に全てのエキソンについて測定した。全ヒ
トＤＮＡから増幅し、全コーディング配列を含有するＰＣＲ産生物を用いて成人
の心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして２つの同一の１.７ｋｂ ＫＣ ＮＥ１ クローンを単離した。全ＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡを包含する２つの部分的に
重複するコスミドクローンもまた、プローブとして全長ＫＣＮＥ１を用いて単離
した（図１７）。該コスミドを、Applied Biosystemsモデル３７３Ａ ＤＮＡシ
ークエンサーにてジデオキシチェーンターミネーション法により配列決定して、 ＫＣＮＥ１ 遺伝子のゲノム構造を定義した。３つのエキソンは、ＫＣＮＥ１ ｃ
ＤＮＡを含む（図１８および表８）。２つのイントロンは、５'−ＵＴＲに位置
していた。両方のイントロンに対する供与スプライス部位および受容スプライス
部位は、各々、ＧＴおよびＡＧであった。ＫＣＮＥ１をスクリーニングするため
に３対のプライマーを設計した（表９）。第一の対と第二の対は、部分的に重複
しており、全コーディング配列を包含している。第三の対は、推定トランスメン
ブランドメインおよびいくつかのフランキング配列を包含するコーディング領域
の一部を増幅する。
【０２４５】
【表８】
【０２４６】
【表９】
【０２４７】 実施例１７ ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１に対するポリクローナル抗体の発生 ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１コーディング配列のセグメントをイー・コリ（
E. coli）中で融合タンパクとして発現させる。ゲル溶出により過剰発現タンパ
クを精製し、これを用い、Harlow and Lane (1988) により開示されている方法
と同様の方法を用いてウサギおよびマウスを免疫化し、この方法は、種々の他の
タンパクに対するＡｂｓを発生することも示された（例えば、Kraemer et al.,
1993 を参照のこと）。
【０２４８】 すなわち、ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１コーディング配列をプラスミドＰＥ
Ｔ５Ａ（ウィスコンシン州マディソンのノバジェン，インコーポレイテッド（No
vagen, Inc.））中で融合タンパクとしてクローン化する。ＩＰＴＧで誘導した
後、予想される分子量を有する融合タンパクの過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによ
り確認する。電気溶出により融合タンパクをゲルから精製する。該タンパクのＫ ＶＬＱＴ１ またはＫＣＮＥ１融合生成物としての同定をＮ−末端でのタンパク配
列決定法により確認する。次に、該精製タンパクをウサギにおいて免疫原として
用いる。ウサギを、フロイント完全アジュバント中の該タンパク１００μｇで免
疫化し、３週間おきに２回、最初は、フロイント不完全アジュバント中の免疫原
１００μｇで、次いで、ＰＢＳ中の免疫原１００μｇで追加免疫化する。その２
週間後に抗体含有血清を回収する。
【０２４９】 この方法を繰返してＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１遺伝子産生物の変異体形態
に対する抗体を発生させる。これらの抗体を野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ
１に対する抗体と合わせて用いて、種々の組織および生理学的液体における変異
体形態の存在および相対的なレベルを検出する。
【０２５０】 実施例１８ ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１に対して特異的なモノクローナル抗体の発生 以下のプロトコールに従ってモノクローナル抗体を発生させる。マウスを、よ
く知られているように、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてキーホールリ
ンペットヘモシアニンと結合した無傷ＫＶＬＱＴ１、ＫＣＮＥ１、ＫＶＬＱＴ１
ペプチドまたはＫＣＮＥ１ペプチド（野生型または変異体）を含む免疫原で免疫
化する。
【０２５１】 免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに免疫原１０〜１００μｇを４回
注射し、４回目の注射の後、マウスから血液試料を採取して血清が免疫原に対す
る抗体を含んでいるかを測定する。血清力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測
定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清を有するマウスをハイブリドーマ
産生用に選択する。
【０２５２】 免疫マウスから脾臓を取り出し、単個細胞懸濁液を調製する（Harlow and Lan
e, 1988 を参照のこと）。実質的に Kohler and Milstein (1975) による開示内
容に従って細胞融合を行う。すなわち、Harlow and Lane (1988) による開示内
容に従ってポリエチレングリコールを用いて、Ｐ３.６５.３骨髄腫細胞（メリー
ランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Amer
ican Type Culture Collection））を免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を、９６
ウエル組織培養プレートにて細胞２×１０５個／ウェルの密度で平板培養する。
個々のウェルを増殖について試験し、増殖しているウェルの上清を、野生型また
は変異体ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１標的タンパクを用いてＥＬＩＳＡまたは
ＲＩＡにより抗体に対して特異的なＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１の存在につい
て試験する。陽性ウェル中の細胞を増殖し、サブクローン化して単クローン性を
確立し確認する。 所望の特異性を有するクローンを増殖し、マウスまたはホローファイバー系に
て腹水として増殖させて、特徴付けおよびアッセイ開発用の十分量の抗体を産生
する。
【０２５３】 実施例１９ ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１についてのサンドイッチアッセイ モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子などの固体表面
に付着させる。好ましくは、抗体を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル表面
に付着させる。ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ペプチド／タンパク（野生型まは
た変異体）を含有する試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）１００μＬを
固相抗体に添加する。該試料を室温で２時間インキュベートする。次いで、試料
流体をデカントし、固相を緩衝液で洗浄して未結合物質を除去する。第二のモノ
クローナル抗体（ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ペプチド／タンパク上の異なる
決定要素に対する）１００μＬを固相に添加する。この抗体を検出分子（例えば
、１２５Ｉ、酵素、フルオロフォア、またはクロモフォア）で標識化し、第２の
抗体を有する固相を室温で２時間インキュベートする。第２の抗体をデカントし
、固相を緩衝液で洗浄して未結合物質を除去する。
【０２５４】 試料中に存在するＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１ペプチド／タンパクの量に比
例する結合標識の量を定量化する。野生型ＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１に対し
て特異的なモノクローナル抗体およびＫＶＬＱＴ１またはＫＣＮＥ１において同
定された各変異に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて分離アッセイを行
う。
【０２５５】 実施例２０ ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１ Ｋ＋チャネルに影響を及ぼす薬物をスクリー
ニングするアッセイ ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１がコアセンブリーを形成して心臓ＩＫｓカリウ
ムチャネルを形成するということを認識した上で、このチャネルに対して作用す
る薬物についてスクリーニングするためのアッセイを発明することが可能である
。２つの遺伝子ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１を卵母細胞または哺乳動物細胞に
コトランスフェクトし、上記に従って同時発現する。コトランスフェクションは
、野生型または特異的に変異したＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１の組合せたもの
を用いて行う。コトランスフェクションに用いる遺伝子の１つがＬＱＴを引き起
こす変異を含む場合、野生型遺伝子だけとのコトランスフェクションと比較して
誘導電流の変化がみられる。トランスフェクト細胞の浸漬溶液に候補薬物を添加
して誘導電流に対する該候補薬物の作用を試験する。野生型ＫＶＬＱＴ１および
ＫＣＮＥ１とコトランスフェクトした細胞についてみられる電流に近くなるよう
に誘導電流を変える候補薬物は、ＬＱＴの治療に有用である。
【０２５６】 本発明は、この特許出願にて本発明の好ましい実施態様の詳細な記載を引用し
て開示されているが、変形が本発明の精神および請求の範囲の範囲内で当業者に
容易に行われるであろうと考えられるので、この開示内容は本発明を限定するも
のではなく説明するものであると解すべきである。
【０２５７】LIST OF REFERENCES Altschul SF, et al. (1997). Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Anand, R (1992). Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academ
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ＬＱＴ血族１５３２の一部の家系構造を示す。
【図２】 ＬＱＴ１領域の物理的地図を示す。
【図３】 ＫＶＬＱＴ１のＳ１−Ｓ６領域の、ドロソフィラ・シェイカーカ
リウムチャネル、ＤＭＳＨＡＫＥ１（ＳＨＡ）との位置関係を示す。
【図４】 ヒトの心臓、胎盤、肺、腎臓および膵臓にてＫＶＬＱＴ１が発現
したことを示すノーザンブロット分析を示す。
【図５】 ＫＬＶＱＴ１コーディング領域と５’および３’非翻訳領域のゲ
ノムオルガニゼーションを示す。
【図６】 ＫＶＬＱＴ１の物理的地図およびエキソンオルガニゼーションを
示す。
【図７】 ＣＨＯ細胞におけるＫＶＬＱＴ１とｈｍｉｎＫの同時発現が、心
臓性ＩＫＳと略同じ電流を誘発することを示す。
【図８】 アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＶＬＱＴ１の発現を示す
。
【図９】 ＫＶＬＱＴ１およびｈｍｉｎＫの同時発現がアフリカツメガエル
卵母細胞でのＫＶＬＱＴ１相同体の存在を示唆することを示す。
【図１０】 ヒトＫＶＬＱＴ１アミノ酸配列の一部とアフリカツメガエルＫ
ＶＬＱＴ１アミノ酸配列の一部の比較を示す。
【図１１】 特定の血族において、ＫＶＬＱＴ１ミスセンス変異がＬＱＴと
一緒に分離したことを示す。
【図１２】 特定の血族における、ＬＱＴに伴うＫＶＬＱＴ１の遺伝子内欠
失およびミスセンス変異を示す。
【図１３】 ＬＱＴに関係するＫＣＮＥ１変異を示す。
【図１４】 ＩＫＳの大きさが注入したＫＣＮＥ１ ｃＲＮＡの関数として
変化することを示す。
【図１５】 Ｄ７６ＮＫＣＮ１変異の機能的効果を示す。
【図１６】 Ｓ７４Ｌ ＫＣＮＥ１変異の機能的効果を示す。
【図１７】 ＫＣＮＥ１の物理的地図およびエキソンオルガニゼーションを
示す。
【図１８】 ＫＣＮＥ１コーディングのゲノムオルガニゼーションならびに
５’および３’非翻訳領域を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｋ Ｒ (72)発明者 マイケル・シー・サングイネッティ アメリカ合衆国84108ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、ノース・ドナー・ヒル・ロー ド726番 (72)発明者 イゴア・スプラウスキ アメリカ合衆国02134マサチューセッツ州 オールストン、チェスター・ストリート97 番、アパートメント・エイ−２ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA36 FA34 FB02 FB03 GC20 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 CA20 DA02 EA04 GA13 HA11 HA12 HA13 HA14 4B063 QA05 QA13 QA17 QA19 QQ21 QQ41 QQ43 QQ53 QQ61 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 QS34 QX02 QX05 4B064 AG01 AG27 CA10 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA87X AA93Y AC14 BA01 BA05 BC01 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号：３の核酸を含む単離されたＤＮＡまたはその相補
    体。
  2. 【請求項２】 突然変異を含む配列番号：４のポリペプチドをコードする単
    離されたＤＮＡであって、ここに、該突然変異が該単離されたＤＮＡに：ａ）コ
    ドン７４にてロイシン、ｂ）コドン７６にてアスパラギン、ｃ）コドン２８にて
    ロイシン、ｄ）コドン３２にてヒスチジン、ｅ）コドン９８にてトリプトファン
    、ｆ）コドン１２７にてアラニン、またはｇ）コドン１２７にてトレオニンをコ
    ードさせる該単離されたＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 該ＤＮＡが：ａ）配列番号：３の塩基４１８にてＡ、ｂ）配
    列番号：３の塩基４１３にてＴ、ｃ）配列番号：３の塩基２７５にてＴ、ｄ）配
    列番号：３の塩基２８７にてＡ、ｅ）配列番号：３の塩基４８４にてＴ、ｆ）配
    列番号：３の塩基５７１にてＧ、およびｇ）配列番号：３の塩基５７１にてＡよ
    りなる群から選択される突然変異を含む請求項１記載の単離されたＤＮＡ。
  4. 【請求項４】 ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下で請求項
    ２または３記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸プローブであって、
    ここに、該ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件は、該核酸プローブ
    が配列番号：３のＤＮＡにハイブリダイズすることを妨げる該核酸プローブ。
  5. 【請求項５】 ＱＴ延長症候群を引起す多型性を診断する方法であって、該
    プローブの該多型性を含む核酸へのハイブリダイゼーションを許容するが、該プ
    ローブの配列番号：３の核酸へのハイブリダイゼーションは妨ぐストリンジェン
    ト条件下で請求項４記載のプローブを患者試料のＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリ
    ダイズすることを含み、ここに、当該ハイブリダイゼーション信号の存在が該多
    型性の存在を示す該方法。
  6. 【請求項６】 該患者のＤＮＡまたはＲＮＡが増幅されており、該増幅され
    たＤＮＡまたはＲＮＡがハイブリダイズされる請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 ハイブリダイゼーションがイン・サイチュで行われる請求項
    ６記載の方法。
  8. 【請求項８】 ＱＴ延長症候群を引起すヒトＫＣＮＥ１における多型性の存
    在を診断する方法であって、該方法は該多型性の存在を確認する手段によって実
    行され、ここに、該多型性は改変したアミノ酸を持つ配列番号：４のＫＣＮＥ１
    ポリペプチドの存在を生じるものであって、該改変したアミノ酸はａ）残基７４
    にてＬｅｕ、ｂ）残基７６にてＡｓｎ、ｃ）残基２８にてＬｅｕ、ｄ）残基３２
    にてＨｉｓ、ｅ）残基９８にてＴｒｐ、ｆ）残基１２７にてＡｌａ、およびｇ）
    残基１２７にてＴｈｒよりなる群から選択される該方法。
  9. 【請求項９】 該多型性が：ａ）該コーディング領域の塩基２２１にてＴ、
    ｂ）該コーディング領域の塩基２２６にてＡ、ｃ）該コーディング領域の塩基８
    ３にてＴ、ｄ）該コーディング領域の塩基９５にてＡ、ｅ）該コーディング領域
    の塩基２９２にてＴ、ｆ）該コーディング領域の塩基３７９にてＧ、およびｇ）
    該コーディング領域の塩基３７９にてＡよりなる群から選択される請求項８記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】 該手段が一本鎖コンホメーション多型性技術を用いて該多
    型性につきアッセイすることを含む請求項８または９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 該手段がヒトＫＣＮＥ１を配列決定することを含む請求項
    ８または９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 該手段がＲＮＡｓｅアッセイを実行することを含む請求項
    ８または９記載の方法。
  13. 【請求項１３】 突然変異ＫＣＮＥ１ポリペプチドには結合するが、野生型
    ＫＣＮＥ１ポリペプチドには結合しない抗体であって、ここに、該突然変異ＫＣ
    ＮＥ１ポリペプチドが、 ａ）残基７４にＬｅｕ、 ｂ）残基７６にＡｓｎ、 ｃ）残基２８にＬｅｕ、 ｄ）残基３２にＨｉｓ、 ｅ）残基９８にＴｒｐ、 ｆ）残基１２７にＡｌａ、または ｇ）残基１２７にＴｈｒ を含む配列番号：４である該抗体。
  14. 【請求項１４】 ＱＴ延長症候群を診断する方法であって、患者の試料と請
    求項１３記載の抗体とを反応させることによる患者における突然変異ＫＣＮＥ１
    ポリペプチドの存在についてのアッセイからなり、ここに、陽性反応の存在がＱ
    Ｔ延長症候群を示す該方法。
  15. 【請求項１５】 ＱＴ延長症候群を引起す突然変異を含む単離されたＫＣＮ
    Ｅ１ポリペプチドであって、ここに、該突然変異が： ａ）残基７４にてＬｅｕ、 ｂ）残基７６にてＡｓｎ、 ｃ）残基２８にてＬｅｕ、 ｄ）残基３２にてＨｉｓ、 ｅ）残基９８にてＴｒｐ、 ｆ）残基１２７にてＡｌａ、または ｇ）残基１２７にてＴｈｒ である該単離されたＫＣＮＥ１ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３
    、配列番号：１０４、配列番号：１０５および配列番号：１０６よりなる群から
    選択される単離された核酸。
  17. 【請求項１７】 当該プライマーが： ａ）配列番号：１０１および１０２； ｂ）配列番号：１０３および１０４；または ｃ）配列番号：１０５および１０６ である核酸プライマーの対。
  18. 【請求項１８】 ＫＣＮＥ１のエキソンを増幅するための請求項１７記載の
    核酸プライマーの対の使用。
  19. 【請求項１９】 請求項１ないし３いずれか１記載のＤＮＡでトランスフェ
    クトされた細胞。
  20. 【請求項２０】 請求項１ないし３いずれか１記載の単離されたＤＮＡを含
    むベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項２０記載のベクターでトランスフェクトされた細胞
    。
  22. 【請求項２２】 請求項１ないし３いずれか１記載のＤＮＡを含む非ヒト・
    トランスジェニック動物。
  23. 【請求項２３】 請求項２０記載のベクターを含む非ヒト・トランスジェニ
    ック動物。
  24. 【請求項２４】 配列番号：４の単離されたポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 ＫＣＮＥ１に突然変異を持つ人を治療するのに有用な薬物
    をスクリーンする方法であって、 ａ）突然変異を持つＫＣＮＥ１を発現する第１の細胞セットを第１の誘導Ｋ＋ 電流を測定するための浴液に入れ； ｂ）該第１の誘導Ｋ＋電流を測定し； ｃ）野生型ＫＣＮＥ１を発現する第２の細胞セットを第２の誘導Ｋ＋電流を測
    定するための浴液に入れ； ｄ）該第２の誘導Ｋ＋電流を測定し； ｅ）薬物を工程（ａ)の浴液に添加し； ｆ）工程（ｅ）における細胞の第３の誘導Ｋ＋電流を測定し；次いで ｇ）該第３の誘導Ｋ＋電流が該第１の誘導Ｋ＋電流によりも該第２の誘導Ｋ＋ 電流に近いかどうかを決定し、該第１の誘導Ｋ＋電流によりも該第２の誘導Ｋ＋ 電流により近い第３の誘導Ｋ＋電流を生じる薬物が該人の治療に有用であって、
    ここに、該突然変異は：ａ）残基７４にＬｅｕ、ｂ）残基７６にＡｓｎ、ｃ）残
    基２８にＬｅｕ、ｄ）残基３２にＨｉｓ、ｅ）残基９８にＴｒｐ、ｆ）残基１２
    ７にＡｌａ、またはｇ）残基１２７にＴｈｒを生じる突然変異よりなる群から選
    択されることを含む該方法。
  26. 【請求項２６】 該第１の細胞セット、該第２の細胞セットまたは両方の細
    胞セットをトランスジェニック動物から得るか、またはヒトＫＣＮＥ１ ＲＮＡ
    でトランスフェクトする請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該第１の細胞セットおよび該第２の細胞セットがさらに野
    生型ＫＶＬＱＴ１を発現する請求項２５記載の方法。
  28. 【請求項２８】 ＱＴ延長症候群の治療または予防に有用な薬物をスクリー
    ンする方法であって： ａ）野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１を発現する細胞を電流を測定
    するための浴液に入れ； ｂ）工程（ａ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｃ）突然変異ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１を発現する細胞を電流を測
    定するための浴液に入れ； ｄ）工程（ｃ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｅ）薬物を工程（ｃ）の浴液に添加し； ｆ）工程（ｅ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し；次いで ｇ）該薬物が、野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１を発現する細胞で
    観測される誘導Ｋ＋電流に、該薬物不存在下で突然変異ＫＶＬＱＴ１および野生
    型ＫＣＮＥ１を発現する細胞で観測される電流と比較して、より近いもしくはよ
    り近くない誘導Ｋ＋電流を生じたかどうかを決定し、ここに、野生型ＫＶＬＱＴ １ および野生型ＫＣＮＥ１を発現する細胞で観測される電流により近い電流を生
    じる薬物はＱＴ延長症候群の治療または予防に有用であって、該突然変異ＫＶＬ ＱＴ１ は、（配列番号：１に基づき）：塩基６６２〜６６４の欠失、塩基６９４
    にＣ、塩基７２７にＡ、塩基７３１にＡ、塩基９２２にＡ、塩基９７９にＴ、塩
    基１０７８にＡ、塩基１０９７にＴ、塩基１１８４にＡ、塩基１１８４にＴ、塩
    基１１９６にＡ、塩基６６４にＡ，塩基１１０２にＡ、塩基１１０６にＧ、塩基
    １１１６にＣ、塩基１２２０にＣ、および塩基１２５８にＴよりなる群から選択
    される突然変異を含むことを含む該方法。
  29. 【請求項２９】 ＱＴ延長症候群の治療または予防に有用な薬物をスクリー
    ンする方法であって、 ａ）野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされた
    トランスジェニック動物を調製し； ｂ）工程（ａ）のトランスジェニック動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｃ）野生型ＫＶＬＱＴ１および突然変異ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされ
    たトランスジェニック動物を調製し； ｄ）工程（ｃ）のトランスジェニック動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｅ）工程（ｃ）のトランスジェニック動物に薬物を投与し； ｆ）工程（ｅ）の薬物処理された動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｇ）該薬物が、野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェ
    クトされた動物で観測される誘導Ｋ＋電流に、該薬物不存在下で突然変異ＫＶＬ ＱＴ１ および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされた動物で観測される電
    流と比較して、より近いもしくはより近くない誘導Ｋ＋電流を生じたかどうかを
    決定し、ここに、野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェ
    クトされた動物で観測される電流により近い電流を生じる薬物はＱＴ延長症候群
    の治療または予防に有用であって、該突然変異ヒトＫＣＮＥ１は：ａ）残基７４
    にＬｅｕ、ｂ）残基７６にＡｓｎ、ｃ）残基２８にＬｅｕ、ｄ）残基３２にＨｉ
    ｓ、ｅ）残基９８にＴｒｐ、ｆ）残基１２７にＡｌａ、またはｇ）残基１２７に
    Ｔｈｒをコードすることを含む該方法。
  30. 【請求項３０】 ＱＴ延長症候群の治療または予防に有用な薬物をスクリー
    ンする方法であって、 ａ）野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされた
    トランスジェニック動物を調製し； ｂ）工程（ａ）のトランスジェニック動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｃ）突然変異ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされ
    たトランスジェニック動物を調製し； ｄ）工程（ｃ）のトランスジェニック動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｅ）工程（ｃ）のトランスジェニック動物に薬物を投与し； ｆ）工程（ｅ）の薬物治療された動物における誘導Ｋ＋電流を測定し； ｇ）該薬物が、野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェ
    クトされた動物で観測される誘導Ｋ＋電流に、該薬物不在下で突然変異ＫＶＬＱ Ｔ１ および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされた動物で観測される電流
    と比較して、より近いかより近くない誘導Ｋ＋電流を生じたかどうかを決定し、
    ここに、野生型ＫＶＬＱＴ１および野生型ＫＣＮＥ１で共トランスフェクトされ
    た動物で観測される電流により近い電流を生じる薬物はＱＴ延長症候群の治療ま
    たは予防に有用であって、該突然変異ＫＶＬＱＴ１は、（配列番号：１に基づき
    ）：塩基６６２〜６６４の欠失、塩基６９４にＣ、塩基７２７にＡ、塩基７３１
    にＡ、塩基９２２にＡ、塩基９７９にＴ、塩基１０７８にＡ、塩基１０９７にＴ
    、塩基１１８４にＡ、塩基１１８４にＴ、塩基１１９６にＡ、塩基６６４にＡ，
    塩基１１０２にＡ、塩基１１０６にＧ、塩基１１１６にＣ、塩基１２２０にＣ、
    および塩基１２５８にＴよりなる群から選択される突然変異を含むことを含む該
    方法。
  31. 【請求項３１】 ａ）配列番号：３のヌクレオチド１ないし１９２またはそ
    の相補体、ｂ）配列番号：３の塩基１ないし１９２のいずれかの１５個の連続し
    たヌクレオチドまたはその相補体、ｃ）配列番号：３の塩基１ないし１９２のい
    ずれかの１２個の連続したヌクレオチドまたはその相補体、ｄ）配列番号：３の
    ヌクレオチド５８３ないし１７０２またはその相補体、ｅ）配列番号：３の塩基
    ５８３ないし１７０２のいずれかの１５個の連続したヌクレオチドまたはその相
    補体、またはｆ）配列番号：３の塩基５８３ないし１７０２のいずれかの１２個
    の連続したヌクレオチドまたはその相補体よりなる群から選択される単離された
    核酸またはその相補体。
  32. 【請求項３２】 配列番号：４のポリペプチドをコードする核酸。
  33. 【請求項３３】 請求項３２記載の核酸でトランスフェクトされた細胞。
  34. 【請求項３４】 請求項３２記載の核酸を含むベクター。
  35. 【請求項３５】 請求項３２記載の核酸を含む非ヒト・トランスジェニック
    動物。
  36. 【請求項３６】 配列番号：４のポリペプチドをコードする核酸でトランス
    フェクトされた細胞であって、該ポリペプチドが： ａ）残基７４にてＳｅｒではなくてＬｅｕ、 ｂ）残基７６にてＡｓｐでなくてＡｓｎ、 ｃ）残基２８にてＳｅｒではなくてＬｅｕ、 ｄ）残基３２にてＡｒｇではなくてＨｉｓ、 ｅ）残基９８にてＡｒｇではなくてＴｒｐ、 ｆ）残基１２７にてＰｒｏではなくてＡｌａ、または ｇ）残基１２７にてＰｒｏではなくてＴｈｒ を含む該細胞。
  37. 【請求項３７】 配列番号：４のポリペプチドをコードする核酸および配列
    番号：２のポリペプチドをコードする核酸で共トランスフェクトされた細胞。
  38. 【請求項３８】 配列番号：４のポリペプチドが突然変異を含むか、配列番
    号：２のポリペプチドが突然変異を含むか、または配列番号：４のポリペプチド
    および配列番号：２のポリペプチドの両方が突然変異を含む請求項３７記載の細
    胞。
  39. 【請求項３９】 非ヒト・トランスジェニック動物であって、野生型ヒトＫ ＣＮＥ１ および突然変異ヒトＫＶＬＱＴ１を含む該動物。
  40. 【請求項４０】 非ヒト・トランスジェニック動物であって、突然変異ヒト ＫＣＮＥ１ および野生型ヒトＫＶＬＱＴ１を含む該動物。
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