DE69433940T2

DE69433940T2 - Menschliches mutator-gen nmsh2 und seine verbindung zum hereditaren, nichtpolypösen kolorrektalen karzinom

Info

Publication number: DE69433940T2
Application number: DE69433940T
Authority: DE
Inventors: Albert De La Chapelle; Bert Vogelstein; W. Kenneth KINZLER
Original assignee: LA CHAPELLE ALBERT DE; Johns Hopkins University
Current assignee: LA CHAPELLE ALBERT DE; Johns Hopkins University
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-12-02
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2014-12-03
Also published as: JPH09506509A; WO1995015381A2; ATE273387T1; CA2177252A1; EP0730648B1; JP4312827B2; JP2005224243A; EP0730648A1; DE69433940D1; WO1995015381A3

Description

Diese Erfindung wurde unter Verwendung der Bewilligungen der U.S. Regierung des NIH, CA47527, CA09320, GM26449, CA41183, CA42705, CA57435, und CA35494, sowie der Bewilligungen der Abteilung für Energie, DOE/ERN/F139 und DE-FG 09291ER-61139 gemacht. Daher behält die U.S. Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part mit der Seriennummer 08/056,546, eingereicht am 5. Mai 1993.
Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Gen, das Individuen eine Veranlagung zu kolorekatelem und anderen Arten von Krebs verleiht. Zusätzlich betrifft sie biochemische Tests, die verwendet werden können, um Medikamente zur Behandlung betroffener Individuen zu identifizieren.
Hintergrund der Erfindung
HNPCC (Lynch-Syndrom) ist eines der häufigsten Krebsveranlagungssyndrome, das nicht weniger als 1 von 200 Individuen in der westlichen Welt betrifft (Lynch et al., 1993). Betroffene Individuen entwickeln Tumore des Colons, des Endometriums, der Eierstöcke und anderer Organe, oft vor Erreichen des 50. Lebensjahres. Auch wenn der familiengebundene Charakter dieses Syndroms vor fast einem Jahrhundert entdeckt worden ist (Warthin et al., 1913), bleibt die Rolle der Erblichkeit von dessen Ursache schwierig zu bestimmen (Lynch et al., 1966). Neuerdings jedoch haben Verbindungsanalysen zweier großer Verwandschaften eine Verbindung mit polymorphen Markern auf dem Chromosom 2 gezeigt (Peltomaki et al., 1993a). Untersuchungen anderer Familien legten nahe, daß Neoplasie in einem großen Teil der HNPCC-Verwandtschaften verbunden mit dem gleichen Locus auf dem Chromosom 2p ist (Aaltonen et al., 1993).
HNPCC wird in klinischem Sinn mit dem Auftreten von früh ausbrechendem Colon- und anderen bestimmten Arten von Krebs in Verwandten ersten Grades definiert, das mindestens zwei Generationen überdauert (Lynch et al., 1993). Die Veranlagung wird auf autosomal dominante Weise vererbt. Anfangs wurde erwartet, daß das Gen/die Gene, die für HNPCC verantwortlich ist/sind, ein Tumorsuppressorgen/e ist/sind, da andere, vorher charakterisierte Syndrome der Veranlagung für Krebs mit dieser Art der Vererbung durch Mutationen der Suppressorgene verursacht werden (rückschauend zusammengefaßt in Knudson, 1993). Aber die Analyse von Tumoren von HNPCC-Patienten legten einen anderen Mechanismus nahe. Viele Loci, die für Tumorsuppressorgene codieren, erleiden während der Tumorgenese somatische Verluste (Stanbridge, 1990). Im Gegensatz dazu fand man heraus, daß beide Allele der Loci des Chromosoms 2p in HNPCC-Tumoren erhalten bleiben (Aaltonen et al., 1993). Während dieser Suche nach Verlusten des Chromosoms 2 bemerkte man jedoch, daß HNPCC-Tumore somatische Veränderungen vieler Microsatellit-Sequenzen aufwiesen.
Weit verbreitete, feine Veränderungen des Krebszellgenoms wurden erstmals in einer Teilmenge sporadischer, colorectaler Tumore mit Verwendung der zufällig-geprimten Polymerasekettenreaktion entdeckt (Peinado et al., 1992). Anschließend fand man heraus, daß diese Veränderungen Deletionen von bis zu 4 Nukleotiden in genomischen polyA-Bereichen ausmachen (Ionov et al., 1993). Andere Untersuchungen zeigten, daß eine ähnliche, ausgeprägte Untergruppe sporadischer Tumore Insertionen oder Deletionen in einer Vielzahl einfach wiederholter Sequenzen aufwies, im besonderen Mikrosatellitsequenzen, die aus Wiederholungen von Dinukleotiden oder Trinukleotiden bestehen (Ionov et al., 1993; Thibodeau et al., 1993; Aaltonen et al., 1993). Interessanterweise hatten diese sporadischen Tumore bestimmte Eigenschaften mit jenen gemeinsam, die sich bei HNPCC-Verwandschaften entwickelten, wie z. B. die Neigung, an der rechten Seite des Colons angeordnet und fast diploid zu sein. Diese und andere Daten legten nahe, daß HNPCC und eine Teilmenge sporadischer Tumore mit einem erblichen Defekt in Zusammenhang zu bringen war, der Replikationsfehler (replication errors, RER) von Mikrosatelltiten verursacht (Ionov et al., 1993; Aaltonen et al., 1993).
Der Mechanismus, der dem postulierten Defekt zugrunde liegt, konnte nicht mit der Untersuchung der Tumor-DNA bestimmt werden, aber Untersuchungen in einfacheren Organismen stellten eine verblüffende Möglichkeit zur Verfügung (Levinson und Gutman, 1987; Strand et al., 1993). Diese Arbeit zeigte, daß Bakterien und Hefen, die defekte Reparaturgene für Fehlpaarungen enthalten, Instabilität von Wiederholungen der Dinukleotide aufzeigen. Der Bruch von Genen, die primär an die DNA-Replikation oder -Rekombination beteiligt sind, hatte keine offensichtliche Wirkung auf die Genauigkeit der Mikrosatellitreplikation (rückschauend zusammengefaßt in Kunkel, 1993). Diese zentralen Untersuchungen legten nahe, daß eine gestörte Reparatur von Fehlpaarungen für die Veränderungen der Mikrosatelliten in den Tumoren von HNPCC-Patienten verantwortlich sein könnte (Strand et al., 1993).
WO 95/14085 legt eine abweichende Sequenz von hMSH2 offen. Zudem kommt der veröffentlichten, abweichenden hMSH2-Sequenz nicht das früheste Prioritätsdatum zu und sie gehört nicht zum Stand der Technik für die vorliegende Anmeldung. WO 95/14085 legt 3 Fragmente der in SEQ ID NO. 1 dargestellten hMSH2-Sequenz hierin offen. Die 3 Fragmente werden durch die vorliegende Erfindung nicht umfaßt.
Daher ist es ein notwendiges Anliegen der Wissenschaft, das eigentliche Gen und Protein, das für den erblichen, nicht polypösen, colorectalen Krebs und den Phänotyp mit Replikationsfehler, der sowohl bei erblichen als auch bei sporadischen Tumoren gefunden wurde, zu bestimmen. Die Bestimmung des Gens und des Proteins würde ein breiteres, diagnostisches Screenen nach erblichem, nicht polypösem, colorectalem Krebs ermöglichen, als es momentan möglich ist. Die Bestimmung des beteiligten Gens und Proteins würde auch ein breiter angelegtes Screenen nach Verbindungen, die bei der medikamentösen Therapie von erblichem, nicht polypösem, colorectalem Krebs angewendet werden, ermöglichen und würde eine Gentherapie betroffener Individuen ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein DNA-Molekül zur Verfügung zu stellen, das, wenn es mutiert, die genetische Determinante für erblichen, nicht-polypösen, colorectalen Krebs darstellt.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die bestimmte Mutationen enthalten, die erblichen, nicht-polypösen colorectalen Krebs verursachen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Behandlung von Patienten zur Verfügung zu stellen, die eine Veranlagung für erblichen, nicht-polypösen colorectalen Krebs aufweisen.
Es ist ebenfalls Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Bestimmung einer Veranlagung für Krebs zur Verfügung zu stellen.
Es ist desweiteren Aufgabe der Erfindung, Verfahren für Bestandteile von Screening-Untersuchungen zur Verfügung zu stellen, um therapeutische Mittel zur Behandlung von Patienten, die eine Veranlagung für erblichen, nicht-polypösen, colorectalen Krebs haben, zu bestimmen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Protein zur Verfügung zu stellen, das wichtig für die Reparatur von Fehlpaarungen menschlicher DNA ist.
Es ist ebenfalls eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein transgenes Tier zur Untersuchung möglicher Behandlungsmöglichkeiten von erblichem, nicht-polypösem, colorectalem Krebs zur Verfügung zu stellen.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden durch eine oder mehrere der unten beschriebenen Ausführungsformen zur Verfügung gestellt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt. Das Molekül hat eine hMSH2-Sequenz von mindestens ca. 20 Nukleotiden von hMSH2, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, wobei die hMSH2-Sequenz nicht aus den Nukleotiden 2085 bis 2405, 2118 bis 2135 oder 2279 bis 2296 der SEQ ID No. 1 besteht.
In einer anderen Ausführungsform wird ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt. Das DNA-Molekül hat eine Sequenz von mindestens ca. 20 Nukleotiden eines hMSH2-Allels, das in einem Tumor zu finden ist, wobei dieses DNA-Molekül eine Mutation relativ zu dem in SEQ ID NO: 1 gezeigte hMSH2 aufweist.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der eine Veranlagung zu erblichem, nicht-polypösem, colorectalen Krabs hat, zur Verfügung gestellt. Das Verfahren verhindert die Anhäufung somatischer Mutationen. Das Verfahren beinhaltet, ein DNA-Molekül, welches eine Sequenz von mindestens ca. 20 Nukleotiden von hMSH2, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, hat, einem Patienten zu verabreichen, der eine Mutation in einem hMSH2-Allel hat, welche dem Patienten eine Veranlagung zu erblichem, nicht-polypösem, colorectalem Krebs verleiht, wobei dieses DNA-Molekül ausreicht, die Mutation in einem hMSH2-Allel des Patienten zu beseitigen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer Veranlagung für Krebs zur Verfügung gestellt. Das Verfahren beinhaltet die Untersuchung einer Körperprobe eines Menschen, um das Vorhandensein einer Mutation von hMSH2 nachzuprüfen, die hMSH2-Expression oder die Proteinfunktion von hMSH2 betrifft, wobei das Vorhandensein einer solchen Mutation eine Veranlagung zu Krebs anzeigt.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren des Screenens zur Verfügung gestellt, um therapeutische Mittel zu bestimmen, die Tumore verhindern oder abschwächen können. Das Screeening-Verfahren beinhaltet das in-Kontaktbringen einer Testverbindung mit einem gereingten hMSH2-Protein oder einer Zelle; das Bestimmen der Fähigkeit des hMSH2-Proteins oder der Zelle, die Reparatur der fehlgepaarten DNA durchzuführen, wobei eine Testmischung, die die Fähigkeit dieses hMSH2-Proteins oder dieser Zelle die Reparatur der fehlgepaarten DNA durchführen erhöht, ein mögliches therapeutisches Mittel darstellt.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Protein zur Verfügung gestellt. Das Protein hat die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein transgenes Tier zur Verfügung gestellt. Das transgene (nicht humane) Tier enthält ein hMSH2-Allel in seiner Keimbahn. Das hMSH2-Allel ist eines, das bei Menschen, die erblichen, nicht-polypösen, colorectalen Krebs haben, oder in RER⁺-Tumoren zu finden ist. Es werden auch Tiere zur Verfügung gestellt, die keine Wild-Typ MSH2-Allele, entsprechend den vorgestellten Mutationen, haben.
Daher stellt die vorliegende Erfindung der Fachwelt die Sequenz des Gens, das für erblichen, nicht-polypösen, colorectalen Krebs verantwortlich ist, und die Informationen über den Mechanismus, durch welchen es Tumore verursacht, zur Verfügung. Dies ermöglicht der Wissenschaft, eine Vielzahl an Techniken auszuführen, um Patienten mit dem Risiko der Entwicklung einer Vielzahl von Krebsarten zu bestimmen und sie zu behandeln, um die tatsächliche Entwicklung solcher Krebsarten zu verhindern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 faßt die Marker, die in somatischen Zellhybriden festgehalten werden und zur Positionsbestimmung des hMHSH2-Gens verwendet wurden, zusammen.
PCR wurde dazu verwendet zu bestimmen, ob jeder der aufgezählten Marker im angegebenen Hybrid vorhanden (schwarzes Kästchen) oder nicht vorhanden (weißes Kästchen) war. Der Laborname jedes Hybrids und der offizielle Name (in Klammern) ist angegeben. Das Hybridfeld wurde auch mit zehn zusätzlichen polymorphen Markern außerhalb der 136–177 Region bestätigt. M: Hybrid, das vom von Mikrozellen vermittelten Transfer des Chromosoms, 2 stammt; T: stammt von der t(X;2)-Translokation; X: stammt vom mit Röntgenstrahlen bestrahlten Chromosomendonor 2. MO: Maus-Mensch-Hybrid; HA: Hamster-Mensch-Hybrid; RA: Ratte-Mensch-Hybrid; TEL: Telomere; CEN: Centromere.
2 zeigt eine FISH-Analyse, die dazu verwendet wurde, die Nachbarschaft und Anordnung der DNA-Sequenzen im Chromosomenband 2p16 zu bestimmen.
Die Tafeln 2A und 2B zeigen die FISH-Aufzeichung des 123 Markers. Tafel 2A zeigt die G-Bande der Metaphase des Chromosoms 2. Tafel 2B zeigt zur Tafel 2A identische Chromosome, denen auf FISH ein Biotin gelabelter P1-Klon für den 123 Marker folgt. Ergebnisse geben die Position des 123 Markers auf dem Chromosomenband 2p16.3 an. Die Tafeln 2C und 2D zeigen Co-Hybridisierung, womit die übereinstimmende Position einer Microdissection-(Micro-FISH) Sonde des Chromosoms 2p16 und des 123 Markers belegt wird. Tafel 2C zeigt das DAPI gefärbte Chromosom 2 in der Metaphase. Tafel 2D zeigt die gleichzeitige Hybridisierung der Biotin markierten 123 Probe (erscheint als intensiv gefärbter, kleinerer Kreis) und der mit Spectrum-Orange gelabelten 2p16 Micro-FISH-Probe (erscheint als diffus gefärbter, größerer Kreis). Feld 2E zeigt ein repräsentatives Beispiel eines Interphasen-Nucleus, der gleichzeitig mit P1-Klonen für CA5, hMSH2 und ze3 hybridisierte. Die Ergebnisse wurden dazu verwendet, direkt die Abstände zwischen den Markern zu messen, um die Anordnung und relative Entfernung zwischen den Markern zu ermitteln (nach Trask et al., 1989). Einfügung: Das bildverarbeitende Programm NIH Image wurde dazu verwendet, eine durchschnittliche Graustufe, die beim Oberflächenplot abgebildet wird, zur Verfügung zu stellen, um die Längenmessungen zu erleichtern und um graphisch die Informationen der relativen Anordnungen darzustellen. Der gezeigte Oberflächenplot definiert das bestimmte Interphasen-Chromosom und die relative Anordnung CA-MSH2-ze3.
3 zeigt die Bindungsanalyse der HNPCC-Stämme.
Alle betroffenen Individuen, in denen meiotische Rekombination zwischen den Markern 119 und 136 auftrat, sind mit eingeschlossen. Ein schwarzes Kästchen zeigt an, daß das Individuum nicht das mit der Krankheit in Verbindung gebrachte Allel in seiner Familie enthielt, oder daß das Individuum ein Allel, das nicht mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden konnte, von seinen davon betroffenen Elternteil geerbt hat. Ein weißes Kästchen zeigt an, daß das Individuum ein Allel hatte, welches die gleiche Größe wie das mit der Krankheit in Verbindung gebrachte Allel hatte. Ein schraffierter Kreis zeigt an, daß der Marker nicht untersucht wurde. Alle Individuen hatten Colon- oder endometrialen Krebs in einem Alter von weniger als 55 Jahren, oder hatten Vorfahren mit einer solchen Krankheit, was aber nicht angab, daß der Patient notwendigerweise mit der Krankheit in Verbindung zu bringende Allele hatte, weil das Stadium gewöhnlich nicht bestimmt werden konnte.
4 zeigt die Positionsbestimmung des hMSH2-Gens.
Southern Blots, die EcoRI (4A und 4C) und PstI (4B und 4D), verdaute DNA von den angegeben somatischen Zellhybriden (4A und 4B) oder YAC-Klone (4C und 4D) enthielten, wurden mit einem radio-gelabelten Insert des cDNA-Klons pNP-23 hybridisiert. Southern Blotting und Hybridisierung wurden wie beschrieben durchgeführt (Vogelstein et al., 1987). Autoradiogramme sind gezeigt. Das 5.0 kb PstI-Fragment in den Hybriden Z11 und Z12 stammt aus Hamster-DNA.
5 zeigt die cDNA-Sequenz des hMSH2.
Ein offener Leserahmen (ORF) beginnt beim Nukleotid 1 und endet bei nt 2802. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist gezeigt. Die Sequenz downstream zu nt 2879 wurde nicht bestimmt.
6 zeigt die Homologie zwischen Hefe- und humanen MSH2-Genen.
Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von Hefe (y)-MSH2- (Reenan und Kolodner, 1992) und humanen MSH2-Genen werden innerhalb des Bereichs höchster Homologie verglichen. Blöcke ähnlicher Aminosäuren sind schattiert.
7 zeigt Keimbahn- und somatische Mutationen von hMSH2.
Autoradiographen von Polyacrylamidgelen, die die Sequenzierungsreaktionen, die von PCR-Produkten stammen, enthalten, sind gezeigt. Die 1.4 kb PCR-Produkte, die einen konservierten Bereich von hMSH2 enthalten, wurden aus genomischen DNA-Proben, wie in Beispiele beschrieben, erzeugt. Antisense-Primer wurden bei den Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die ddA-Mischungen jeder Sequenzierurngsreaktion wurden benachbarten Bahnen zugeführt, um einen Vergleich zu ermöglichen, ebenso wie diejenigen für C, G und T. Die DNA-Proben stammten vom Tumor (Bahn 1) und vom normalen Colon (Bahn 2) des Patienten Cx10, von einer RER-Colontumor-Zellinie (Bahn 3), und von Lymphozyten der Patienten J-42 (Bahn 4) und J-143 (Bahn 5). 7A: Ein Übergang (C für T im Codon 622) in der Lymphocyten-DNA kann bei den HNPCC-Patienten J-42 und J-143 beobachtet werden. 7B: Ein Übergang (C für T am nt Codon 639) im Tumor (Bahn 1) und in normaler Darmschleimhaut (colonischer Mucosa) (Bahn 2) des Patienten Cx10. 7C: Eine Substitution eines TG-Dinukleotids für ein A beim Codon 663 kann in der DNA des Tumorpatienten Cx10, (Bahn 1), beobachtet werden, aber nicht in der DNA ihres normalen Kolons (Bahn 2). Pfeile markieren die Substitutionen in Tafel A und B und die TG-Dinukleotid-Insertionsstelle in Tafel C.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Auf die Offenbarung aus Seriennummer 08/056,546, eingereicht am 5. Mai 1993, wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß das Gen, das für erblichen, nicht polypösen colorectalen Krebs verantwortlich ist, hMSH2 ist, welches ein humanes Analogon des bakteriellen MutS ist. Die cDNA-Sequenz von hMSH2 ist in SEQ ID No: 1 dargestellt. Dieses Gen codiert für ein Enzym zur Reparatur fehlgepaarter DNA. Eine Mutation des Gens verursacht, daß Zellen Mutationen anhäufen. Zum Beispiel, beruht der beobachtete Phänotyp mit Replikationsfehler (RER⁺), der sowohl in sporadischem als auch erblichem, nicht polypösem, colorectalen Krbes gefundenn wird, auf Variationen (Insertionen und Deletionen) in der Mikrosatelliten-DNA. In Hefen und Bakterien verursachen defekte, zu MutS-gehörige Gene genauso andere Arten von Mutationen.
Entsprechend der Erfindung sind nützliche DNA-Moleküle solche, die spezifisch mit den hMSH2-Sequenzen hybridisieren werden. Diese haben typischerweise eine Länge von 20 Nukleotiden und die in SEQ ID No: 1 dargestellte Nukleotidsequenz. Solche Moleküle können, mit jeglicher in der Wissenschaft bekannten Technik, wie z. B, radioaktiven Markern, fluoreszierenden Markern, enzymatischen Markern, Sequenztags usw., markiert sein. Entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung enthalten die DNA-Moleküle eine Mutation, die in Tumoren von HNPCC-Patienten oder in sporadischen RER⁺-Tumoren gefunden wurde. Solche Moleküle können als Proben allel-spezifischer Oligonukleotide verwendet werden, um eine bestimmte Mutation innerhalb einer Familie aufzufinden.
Entsprechend einiger Aspekte der Erfindung, ist es wünschenswert, daß die DNA für alle Teile des hMSH2-Proteins codiert, wie in SEQ ID No: 2 dargstellt. Um eine Expression des Proteins zu erreichen, kann die DNA-Sequenz operabel mit geeigneten Kontrollsequenzen, wie z. B. mit Promotoren, mit dem Kozak-Consensus, und Terminatorsequenzen, verbunden sein.
Ein Patient, der eine Veranlagung hat, Krebs durch Vererbung eines mutierten hMSH2-Allels zu entwickeln, kann durch Applikation eines DNA-Moleküls, das alles oder einen Teil der normalen hMSH2-Gensequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, enthält, behandelt werden. Ein Teil der Gensequenz wird nützlich sein, da es die Position der Mutation, die im mutiertierten Allel vorhanden ist, umfaßt, so daß ein doppeltes Rekombinantionsereignis zwischen dem mutierten Allel und dem normalen Teil den Defekt, der im Patienten vorliegt, "korrigiert". Ein Teil des Gens kann auch nützlicherweise angewendet werden, da es genug vom Protein codiert, um ein Enzym zur Reparatur fehlgepaarter funktioneller DNA zu exprimieren. Solch ein Teil muß nicht notwendigerweise mit dem mutierten Allel rekombinieren, aber kann als separater Locus im Genom oder einem unabhägigen Replikationsvektor beibehalten werden. Wege, DNA Menschen zu applizieren, sind in der Wissenschaft bekannt und jeder davon kann so verwendet werden, wie es am geeignetsten erscheint. Eine Vielzahl von Vektoren sind auch für diesen Zweck bekannt. Entsprechend einiger Verfahren werden keine Vektoren benötigt. Solche Verfahren sind Durchschnittsfachkräften gut bekannt.
Als Teil der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung einer kombinierten anti-neoplastischen Therapiekur betrachtet. Solche eine kombinierte Kur ist für Patienten nützlich, die einen RER⁺-Tumor, entweder sporadisch oder in Verbindung mit HNPCC, haben. Die Kur verbindet jegliche Standard anti-neoplatische Therapie, auf welche ein Patient resistent werden kann, mit der hMSH2-Gentherapie, wie oben beschrieben ist. Durch Beheben des Defekts, der in RER⁺-Zellen auftritt, z. B. eine hMSH2-Mutation, wird die Wahrscheinlichkeit, daß der Tumor eine Resistenzmutation entwickelt, erheblich vermindert. Durch Verzögerung und Verhinderung der Entstehung eines Resistenz, kann das Leben der Krebspatienten verlängert werden. Zusätzlich ermöglicht eine solche Verhinderung einer Resistenz einen höheren Grad der Zerstörung des Tumors durch therapeutische Mittel. Beispiele anti-neoplastischer Therapien, die in Kombination mit hMSH2-Gentherapie verwendet werden können, sind Hormone, Strahlung, cytotoxische Medikamente, Cytotoxine und Antikörper.
Körperproben können untersucht werden, um zu bestimmen, ob das hMSH2-Gen normal oder mutiert vorliegt. Mutationen sind jene Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz, die mit einer Krankheit in Verbindung gebracht werden und die eine Veränderung in der Funktion oder Expression des hMSH2-Proteins verursachen. Solche Mutationen beinhalten nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, vorzeitige Terminationen und Rahmenverschiebungen. Siehe Tabelle I. Geeignete Körperproben für Untersuchungen beinhalten jene, die DNA, RNA, oder Protein enthalten, und die zum Beispiel aus Biopsien, Blut erhalten werden.
Mit der zur Verfügung gestellten Information, daß der Defekt, der HNPCC und sporadische RER⁺-Tumore verursacht, in einem Enzym zur Reparatur fehlgepaarter DNA liegt, kann man Untersuchungen an Testverbindungen und -zusammensetzungen vornehmen, um zu bestimmen, ob sie den Defekt beheben werden. Solche therapeutischen Verbindungen konnten an missense, mutierte hMSH-Proteine binden, um die Proteine in die normale, aktive Konformation zurückzubringen. Alternativ konnten solche therapeutischen Verbindungen die Expression wechselnder Wege zur Reparatur der Fehlpaarungen stimulieren. Das Screenen nach solchen therapeutischen Verbindungen konnte vorgenommen werden, indem man Testverbindungen mit Zellen, entweder normale oder jene mit einer hMSH2-Mutation, die in Tumoren gefunden wurde, in Kontakt brachte. Die Fähigkeit der Zellen, die in Kontakt mit den Testverbindungen gebracht worden sind, wurde mit der Fähigkeit der gleichen Zellen verglichen, die nicht wegen Aktivität der Reparatur von Fehlpaarungen in Kontakt gebracht worden sind. Solche Aktivität kann, wie in der Wissenschaft bekannt, untersucht werden. Siehe, zum Beispiel, Levinson und Gutman, 1987, und Strand et al., 1993. Beobachtung von Veränderungen in Mikrosatelliten-DNA in Zellen ist ein Weg der Untersuchung von Aktivität der Reparatur von Fehlpaarungen. Ein anderer Ansatz ist der, die Reparatur fehlgepaarter DNA in vitro in Nuklearextrakten zu untersuchen. Siehe Holmes, 1990; Thomas, 1991; und Fang, 1993.
Tabelle I
Mit cDNA-Sequenz und der Aminosäure des hMSH2-Proteins ausgestattet, kann ein Durchschnittsfachmann leicht das hMSH2-Protein herstellen, isoliert und von anderen humanen Proteinen gereinigt. Zum Beispiel, können rekombinante Zellen oder Organismen dazu verwendet werden, das Protein in Bakterien, Hefen, oder anderen üblichen Zellsystemen herzustellen. Das isolierte und gereinigte Protein kann beim Screenen neuer therapeutischer Mittel verwendet werden, zum Beispiel, bei in vitro Untersuchungen der Reparatur fehlgepaarter DNA. Das Protein kann auch dazu verwendet werden, Antikörper gegen hMSH2 zu erzeugen. Therapeutische Applikation des Proteins wird auch in Erwägung gezogen.
Transgene Tiere werden in der vorliegenden Erfindung ebenfalls betrachtet. Diese Tiere würden in ihrer Keimbahn hMSH2-Allele eingeschleust haben, die mit HNPCC oder sporadischen Tumoren in Verbindung stehen. Solche Tiere könnten Modellsysteme zur Untersuchung von Medikamenten und anderen therapeutischen Mitteln zur Verfügung stellen, die die Entwicklung von Tumoren verhindern oder verzögern. Gentechnisch veränderte Tiere, die eine oder mehrere Mutationen in ihren eigenen MSH2-Genen aufweisen, werden ebenfalls in Erwägung gezogen. Die Mutationen werden so vorgenommen werden, daß sie Mutationen, die in hMSH2-Allelen gefunden wurden, die in von HNPCC betroffenen Individuen oder anderen humanen RER⁺-Tumoren gefunden wurden, entsprechen. Tiere, bei denen beide native MSH2-Allele inaktiviert sind und die ein humanes Wildtyp- oder mutiertes hMSH2-Allel enthalten, sind besonders erwünscht.
Beispiele
Beispiel 1
Somatische Zellhybride
Ein Feld mit Hybridzellinien Mensch-Hamster, Mensch-Maus und Mensch-Ratte wurde entwickelt, um eine Kartierung von HNPCC zu ermöglichen. Hybride, die nur Teile des Chromosoms 2 enthalten, wurden durch durch Mikrozellen vermittelte Chromosomenübertragung oder durch Fusionen mit Standardzellen erhalten, die auf eine Röntgenbestrahlung des Chromosom 2-Donors folgten. Zusätzlich wurden zwei Hybride verwendet, die eine (X;2)(q28;p21)-Translokation enthielten, die aus humanen Fibroblasten stammte. In vorhergehenden Untersuchungen wurde der HNPCC-Locus in der 25 cM Region abgebildet, die den Marker 123 umgibt und von den Markern 119 und 136 begrenzt ist (Peltomaki et al., 1993a). Achtunddreißig Hybride wurden mit diesen drei Chromosom 2p-Markern gescreent. Acht dieser Hybride haben sich als nützlich für die Kartierung des relevanten Teils des Chromosoms 2p herausgestellt. Zum Beispiel, enthielten die Hybride L1 und L2 die distale Hälfte des Bereichs, einschließlich des Markers 123, während das Hybrid y3 die Hälfte in der Nähe des Markers 123 enthielt (1).
Verfahren
Verfahren zur Ableitung der durch Mikrozellen vermittelte Hybride des Chromosoms 2 wurden vorher beschrieben (Chen et al., 1992; Spurr et al., 1993). Einige Hybride wurden, folgend auf eine Fusion röntgenbestrahlter Donorzellen, die das humane Chromosom 2 enthielten, mit CHO-Zellen hergestellt (Chen et al., 1994). Maushybride wurden erhalten, indem man HPRT fehlerhafte L-Zellen (A9) mit humanen Fibroblasten (GM7503) fusioniert hat, die eine t(X;2)(q28,p21)-Translokation enthielten und die in einem Medium, das HAT enthielt, selektiert wurden.
Beispiel 2
Polymorphe Marker
Um den HNPCC-Locus ganeuer zu kartographieren, wurden zusätzliche polymorphe Marker auf drei Arten erhalten. Erstens wurde ein genomischer Klon, der 85 kb, die den 123 Marker umgaben, für Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) verwendet, um ihn auf der chromosomalen Bande 2p16.3 anzuordnen (2A,B). Die 2p16 Bandenregion wurde dann mikroanalysiert, und die Sequenzen innerhalb dieser Bande wurden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion amplifiziert und in Plasmidvektoren subkloniert (siehe Experimentelles Vorgehen). Die Genauigkeit der Mikroanalyse wurde bestätigt durch Verwendung einer Zwei-Farben-FISH durch gleichzeitiges Hybridisieren des mikroanalysierten Materials und eines genomischen Klons, der den Marker 123 enthielt (2C, D). Die Subklone wurde durch Hybridisierung mit einer (CA)₁₅-Vorlage gescreent, und die hybridisierenden Klone wurden bestimmt und sequenziert. Diese Sequenzen wurden dann dazu verwendet, Oligonukleotidprimer für PCR-Analyse der genomischen DNA zu gestalten. Neunzehn (CA)_n-Wiederholungsmarker wurden auf diese Weise bestimmt. Von diesen waren vier hochpolymorph und mappten zu dem Bereich zwischen den Markern 119 und 136, wie es mit dem Feld der somatischen Zellhybride, das in 1 dargestellt ist, untersucht wurde. Zweitens fand man heraus, daß acht zusätzliche (CA)_n-Marker, die zufällig aus der humanen, genomischen DNA bei Verwendung einer poly(CA)-Vorlage kloniert wurden, zwischen den Markern 119 und 136 liegen, wobei eine Bindungsanalyse in CEPH-Stämmen verwendet wurde. Fünf von diesen waren teilweise informationsliefernd und wurden bei unseren weiteren Untersuchungen verwendet. Als letztes wurde ein zusätzlicher Marker bestimmt, indem man Subklone eines genomischen P1-Klons, der den Marker 123 mit einer (CA)₁₅-Vorlage enthielt, gescreent hat. Durch diese Analysen wurden dreizehn neue polymorphe Marker im 25 cM-Intervall zwischen den Markern 119 und 136 bestimmt, was zur Folge hatte, daß ein durchschnittlicher Marker ~2 cM groß war (Tabelle II). Diese Marker wurden in Bezug zueinander durch Verbindung in CEPH- und HNPCC- Stammbäumen sowie durch Analyse somatischer Zellhybride gesetzt. Diese zwei Abbildungstechniken stellten übereinstimmende und ergänzende Informationen zur Verfügung. Zum Beispiel, konnten die relativen Positionen von CA16 und CA18 nicht durch Bindungsanalyse unterschieden werden, aber sie konnten mit den somatischen Zellhybriden L1, L2 und Y3 bestimmt werden. Im Gegensatz dazu konnte die relative Position der ze3- und yh5-Marker nicht mit der Abbildung somatischer Zellhybride bestimmt werden, aber sie konnte mit der Bindungsanalyse unterschieden werden.
Tabelle II
Verfahren
Alle Marker wurden durch Screenen human-genomischer Bibliotheken mit radioaktiv markierten (CA)_n-Sonden erhalten (Weber und May, 1989). Die "T"-Marker (siehe Tabelle I) wurden aus einer Bibliothek, die aus Gesamt-human-genomischer DNA gemacht worden war, erzeugt, wie bei Weissenbach et al., 1992 beschrieben. Die "M"-Marker wurden aus Bibliotheken gemacht, die aus dem mikroanalysierten Chromosom 2p16 erzegut worden waren, wie unten beschrieben ist. Der CA2-Marker wurde aus einer Bibliothek erzeugt, die aus dem P1-Klon 210 gemacht worden war, der zur Vervollständigung mit Sau3 verdaut worden war und in die XhoI-Schnittstelle des lambda YES kloniert worden war (Elledge et al., 1991). Die Sequenzen der Klone, die aus diesen Bibliotheken erhalten wurden, wurden bestimmt, und die Primer, die die CA-Wiederholungen umgeben, wurden rausgewählt. Nur Primer, die eine robuste Amplifikation und hohe Heterozygosität zulassen, wurden für genaue Analyse der HNPCC-Verwandten verwendet. Es wurde sowohl durch Bindungsanalyse in den CEPH-Stämmen als auch durch Bewertung im Feld der somatischen Zellhybride, das in 1 gezeigt ist, gezeigt, daß alle Marker, die bei dieser Untersuchung verwendet wurden, vom Chromosom 2p stammten. Die Sequenzen der Primer und andere Einzelheiten, die für jeden Marker spezifisch sind, wurden in der Genom-Daten-Bank (Genome Data Base) hinterlegt. Bindungsanalyse zur Erzeugung einer Abbildung der Marker-Loci in den CEPH-Familien 1331, 1332, 1347, 1362, 1413, 1416, 884 und 102 (Weissenbach et al., 1992) wurden unter Anwendung des CLINK-Programms des LINKAGE-Programmpakets (Lathrop et al., 1984) ohne Option der Unterscheidung des Geschlechts und mit 11-Punkt-Berechnungen durchgeführt. Die Chancen für die beste Locus-Anordnung, die von den Daten gestützt wird, wurde gegen paarweise Inversionen der Loci ausgewertet.
Beispiel 3
Genomische Klone
Viele der in Tabelle I gezeigten, polymorphen Marker wurden dazu verwendet, genomische Klone, die 2p16- Sequenzen enthielten, abzuleiten. Genomische Klone wurden durch PCR-Screenen der Bibliotheken von humanem P1 und von YAC mit diesen polymorphen Markern, mit zehn zusätzlichen sequenz-markierten Stellen (STS), die von der Mikroanalyse des Chromosoms 2p16 stammten, oder mit YAC-Kreuzungen, erhalten. Dreiundzwanzig P1–Klone, jeder 85–95 kb enthaltend, sowie 35 YAC-Klone, die 300 bis 1800 kb enthielten, wurden erhalten. Die YAC-Klone bestätigten in manchen Fällen die Verbindungen und die Kartierungen der somatischen Zellhybride. Zum Beispiel wurden die Marker ze3 und yh5 beide in den YACs 4F4 und 1E1 gefunden, während CA16 und CA18 beide in YAC 8E5 gefunden wurden, was ihre Nachbarschaft belegt. Die größte Dichte genomischer Klone (28 YAC und 17 P1-Klone) wurde zwischen den Markern yb9 und yh5 (Tabelle I) erhalten, wodurch dies zur Region wurde, welche die Region mit der größten Wahrscheinlichkeit für das Beinhalten das HNPCC-Gens während des Ablaufs dieser Untersuchungen wurde. Es wurde vorhergesagt, daß die Region zwischen yh5 und yb9 ~9 Mb (angenommen 1 Mb pro cM) enthielt. Basierend auf den Größen der YAC-Klone, und ihre Chimerität beachtend, schätzten wir, daß sie über 70% der Sequenzen zwischen yh5 und yb9 enthielten.
Verfahren
Die in Tabelle I beschriebenen Marker wurden dazu verwendet, YRC- oder P1-Bibliotheken mit PCR zu screenen. Die CEPH A-Bibliothek wurde von Research Genetics, Inc. erhalten und bestand aus 21,000 YAC-Klonen, die in einem Format angeordnet sind, das leichtes Screenen und eindeutige Bestimmung positiver Klone ermöglicht. Die Größen von zehn der Marker enthaltenden YAC-Klone wurden durch queralternierende pulse-field-Gelelektrophorese (transverse alternating pulse-field gel electrophoresis) unter Verwendung eines GeneLine II-Geräts von Beckmann bestimmt und auf 0.7 Mb (Bereich 0.2–1.8 Mb) im Durchschnitt festgelegt. In einigen Fällen wurde inverse PCR dazu verwendet, die YAC-Kreuzungen zu bestimmen (Joslyn et al., 1991), und um die abgeleitete Sequenz für "Chromosomenwanderung", die bei YAC- oder P1-Bibliotheken verwendet wurde, zu bestimmen. Die Verbindungen wurden auch dazu verwendet, Primer zu gestalten, um zu testen, ob die Enden der YAC-Klone auf dem Chromosom 2p16 lokalisiert werden könnten (und daher vermutlich nicht-chimär wären). Von drei der vier YAC-Klone, die auf diese Weise getestet wurden, lagen beide Enden innerhalb der erwarteten Region des Chromosoms 2, wie mit dem Feld somatischer Zellhybride beurteilt wurde. Die human-genomische P1-Bibliothek wurde auch mit PCR gescreent (Genome Systems, Inc.). Die P1-Klone M1015 und M1016, die das hMSH2-Gen enthalten, wurden dazu verwendet, Intron-Exon-Grenzen zu bestimmen, wobei Sequenzierungsprimer von den Exons und SequiTherm^TM-Polymerase (Epicentre Technologies) verwendet wurden.
Beispiel 4
Analyse der HNPCC-Familien
Die in Tabelle I beschriebenen Marker wurden dann dazu verwendet, sechs große HNPCC-Verwandschaften, die vorher mit dem Chromosom 2p in Verbindung gebracht worden waren, zu analysieren (Peltomaki et al., 1993a). Zweihundertdreizehn Individuen, einschließlich 56 Mitgliedern, die von colorectalem oder endometrialem Krebs betroffen sind, wurden untersucht. Vier der Verwandtschaften waren aus den Vereinigten Staaten, eine aus Neufundland und eine aus Neuseeland. Um die Zahl der betroffenen Individuen, die untersucht werden konnten, zu erhöhen, erhielten wir mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Teile normalen Gewebes von verstorbenen Individuen und deren gereinigte DNA (Goelz et al., 1985a). Man fand, daß ein einzelnes Allel von jedem der dreizehn Marker in jeder der sechs Familien mit der Krankheit segregierte (d. h., das Allel wurde in über 50% der betroffenen Individuen gefunden). Kein Allel irgendeines Markers wurde von den betroffenen Mitgliedern von mehr als drei Verwandschaften geteilt.
Vierzehn der betroffenen Mitglieder enthielten nur eine Teilmenge der erwarteten Allele und daher hat bei ihnen eine Rekombination zwischen den Markern 119 und 136 stattgefunden. Elf von diesen Individuen schienen einfache, einzelne Rekombinationsereignisse aufzuweisen. Am aufschlußreichsten von ihnen war das Individuum 148 der J-Verwandschaft und das Individuum 44 der 621-Verwandschaft (3). Das Individuum 621-44 behielt offenbar das mit der Krankheit verbundene Allel bei den Markern distal zu CA5 bei, während es verschiedene Rekombinationsmöglichkeiten an näheren Loci zeigte, weshalb der CA5-Marker an der nahen Begrenzung des HNPCC-Locus angeordnet wurde. Das Individuum J-148 behielt offenbar das mit der Krankheit verbundene Alle bei allen Markern in der Nähe von yh5 bei, während es Rekombinanten bei yh5 und 119 aufwies, weshalb die distale Begrenzung bei yh5 angeordnet wurde. Unter der Annahmne, daß das gleiche Gen bei sowohl der J- als auch bei der 621-Verwandschaft beteiligt war, wurde vorausgesagt, daß das HNPCC-Gen zwischen den Markern CA5 und yh5, einem Bereich von ungefähr 2 cM Größe (Tabelle I), angeordnet sein würde.
Die DNA drei betroffener Individuen (C-202, 4-156, 4-92) schien sich zwei Rekombinationen in dem Bereich unterzogen zu haben. Es gab möglicherweise eine Rekombination pro Generation, und dieses konnte bei C-202 durch Analyse der DNA seiner Eltern gezeigt werden; in anderen Fällen war die elterliche DNA nicht verfügbar. Allen drei Individuen behielten mit der Krankheit verbundene Allele bei CA5 und ze3 bei, aber nicht an näheren und distalen Loci (3). Kombiniert mit den Daten der Patienten mit einzelnen Rekombinationen, legten die Doppelrekombinationen nahe, daß das HNPCC-Gen zwischen CA5 und ze3 lag, einem Abstand, der geringer war als 2 cM.
Um die physikalischen Entfernungen, die CA5, ze3 und yh5 trennen, zu bestimmen, wurden Metaphasen- und Interphasen-FISH-Analysen durchgeführt. Zwei-Farben-FISH mit P1-Klonen, die diese Marker enthalten, wurde mit den P1-Klonen 820 und 838 (die entsprechend die Marker CA5 und yh5 enthalten), die mit Biotin markiert sind und die mit mit Fluorescein-markiertem Avidin detektiert wurden, und mit dem Klon 836 (der den Marker ze3 enthält), der mit Spectrum-Orange markiert wurde, durchgeführt (Meltzer et al., 1992). Die Hybridisierungssignale dieser Marker schienen mit Metaphasechromosomen übereinzustimmen, was bestätigte, daß sie innerhalb eines Intervals von < 1.0 Mb lagen. Als FISH auf Interphasen-Nuclei angewendet wurde, konnten die relativen Positionen der drei Marker bestimmt werden und die Abstände zwischen ihnen geschätzt werden (Trask et al., 1989). Die Ergebnisse bestätigten, daß die Orientierung der Marker Telomer-yh5-ze3-CA5-Centromer war (Daten nicht gezeigt). Die direkte Messung der Entfernung zwischen yh5 und ze3 wurde auf < 0.3 Mb geschätzt, was mit der Anwesenheit beider dieser Marker auf den YAC-Klonen 4E4 und 1E1 übereinstimmt. Messungen der 48 Interphasechromosomen stellte eine Schätzung der Entfernung zwischen ze3 und CA5 auf < 0.8 Mb zur Verfügung, was unabhängig davon die Bindungsdaten bestätigte.
Verfahren
Metaphase-Chromosomen mit G-Banden wurden mit Mikronadeln aus Glas mikroseziert und mit PCR amplifiziert, wie es vorher beschrieben wurde (Guan et al., 1993, Kao und Yu, 1991). Für die Zwei-Farben-FISH wurde das PCR-Produkt mit Fluorchrom markiert (Spectrum-Orange, Imagenetics, Naperville, IL) oder in einer zweiten PCR-Reaktion biotinyliert. P1-Klone wurden durch Strangbruchtranslation oder mit degenerierten Oligonukleotidprimern markiert (Guan et al., 1993). FISH wurde wie vorher beschrieben ausgeführt (Guan et al., 1993) und mit einem Zeiss Axiophot, der mit einem Dualbandpaßfilter ausgestattet war, sichtbar gemacht. Zur Analyse der Interphase-FISH-Muster wurde die Entfernung zwischen den Hybridisierungssignalen bei einer Minimalzahl von 24 Nuclei gemessen (Trask et al., 1989).
Beispiel 5
Gen-Kandidaten
Auf der Basis der oben beschriebenen Kartierungsergebnisse, konnten wir bestimmen, ob ein gegebenes Gen ein Kandidat für HNPCC war, indem wir seine Position relativ zur CA5-ze3-Domäne bestimmt haben. Das erste in Betracht gezogene Gen war ein humanes Homolog des Drosophila SOS-Gens (rückschauend zusammengefaßt bei Egan und Weinberg, 1993). Dieses Gen übermittelt in verschiedenen Eukaryoten Signale von an die Membran gebundenen Rezeptoren auf dem ras-Pfad. Es wurde als Kandidat in Betracht gezogen, da ein anderes mit ras-interagierendes Gen, NF1, ein Syndrom mit der Veranlagung für Krebs verursacht (Viskochil et al., 1990; Wallace et al., 1990), und SOS wurde auf dem Chromosom 2p16-21 durch in situ-Hybridisierung lokalisiert (Webb et al., 1993). Unter Verwendung der PCR SOS-Sequenzen aus dem Hybrid-Feld, wurde jedoch festgestellt, daß SOS distal zur CA5-yh5-Domäne angeordnet war (vorhanden im Hybrid Z19, aber nicht in Z29).
Als nächstes untersuchten wir das Interferon induzierbare, RNA-aktivierte Proteinkinasegen PKR. Es wurde gezeigt, daß dieses Gen eine Tumorsuppressoreigenschaft hat (rückschauend zusammengefaßt bei Lengyel, 1993) und nahe zu 2p16 angeordnet ist (Hanash et al., 1993). Anfangs konnten wir PKR nicht von der HNPCC-Domäne ausschließen, und daher bestimmten wir die Sequenz seiner codierenden Region in zwei Individuen der HNPCC-Verwandschaft C. Es wurde die Reverse Transkriptase verwendet, um cDNA der von Lymphoblastoiden stammenden RNA dieser zwei Individuen zu erzeugen, und eine PCR mit Primern, die für PKR spezifisch sind, wurde durchgeführt. Die PKR-Produkte wurden sequenziert, und es wurden keine Abweichungen von der veröffentlichten Sequenz innerhalb der codierenden Region bestimmt (Meurs et al., 1990). Nachfolgende Untersuchungen zeigten, daß das PKR-Gen distal zum yh5-Marker angeordnet war und daher als Basis der HNPCC ausgeschlossen werden konnte.
Dann zogen wir humane Homologe der Reparaturgene der Fehlpaarungen von MutL und MutS in Betracht, die, wie vorher gezeigt worden war, eine Mikrosatelliteninstabilität in Bakterien und Hefen erzeugten, wenn sie unterbrochen waren (Levinson und Gutman, 1987; Strand et al., 1993). Ein humanes Homolog Kramer et des Hefe-MutL-bezogenen Gens PMS1 (al., 1989) scheint nicht auf dem Chromosom 2p angeordnet zu sein (M. Liskay, persönliche Beratung). Um Homologe von MutS zu bestimmen, verwendeten wir degenerierte Oligonukleotidprimer, um cDNA von Colonkrebszellinien mit PCR zu amplifizieren. Die gleichen Primer wurden vorher dazu verwendet, das Hefe-MSH2-Gen auf Basis seiner MutS-Homologie zu bestimmen (Reenan und Kolodner, 1992). Unter nicht strengen Bedigungen einer PCR, wurde ein Fragment der erwarteten Größe erhalten, und diese Fragmente wurden in Plasmidvektoren kloniert. Viele der Klone enthielten ribosomale RNA-Gene, die reichlich vorhandene Transkripte mit schwacher Homologie zu den degenerierten Primern darstellen. Eine Teilmenge der Klone enthielt jedoch Sequenzen, die ähnlich zu der des Hefe-MSH2-Gens waren, und ein solcher Klon, pNP-23, wurde weiter ausgewertet. Das humane Gen von welchem dieser Klon stammte, wird im weiteren als hMSH2 bezeichnet.
Das Insert des Klons pNP-23 wurde als eine Sonde in Southern Blots von DNA somatischer Zellhybride verwendet. Das Insert hybridisierte mit einem oder mit zwei Fragmenten in der humanen, genomischen DNA, die entsprechend mit PstI oder EcoRI verdaut wurde, und diese Fragmente waren im Hybrid Z30, das den größten Teil des humanen Chromosoms 2p enthält, vorhanden. Eine Analyse anderer Hybride zeigte, daß das Fragment in den Hybriden Z11, Z29, L1 und L2, aber nicht in Z12, Y3 oder Z19 vorhanden war, wobei dadurch das humane MSH2 (hMSH2)-Gen in einer Region angeordnet wurde, die von den Markern CA18 und 119 begrenzt wurde (Beispiele in 4). Die in Tabelle I aufgelisteten YAC-Klone wurden dann analysiert, und EcoRI- und PstI-Fragmente der erwarteten Größe wurden im YAC 5A11, der vom Screenen der YAC-Bibliothek mit dem CA5-Marker stammte, bestimmt (4).
Um die Southern Blots zu bestätigen, gestalteten wir nicht-generierte Primer auf Basis der Sequenz von pNP-23. Verschiedene Gruppen von Primern wurden untersucht, so daß man genomische DNA als Template für die PCR verwenden konnte; ein dazwischenliegendes Intron verhinderte, daß die ursprünglichen Primer effektiv mit anderen als cDNA-Templates verwendet werden konnten. PCR mit diesen Primern stimmte perfekt mit den Ergebnissen des Southern Blots überein. Das erwartete 101 bp-Fragment war in den Hybriden Z4, Z11, Z29, L1 und L2, und im YAC 5A11, aber nicht in anderen Hybriden oder YAC-Klonen vorhanden (nicht gezeigt).
Die Anordnung der hMSH2-Sequenzen im YAC 5A11 zeigte die Nähe dieser Sequenzen zum Marker CA5. Um die Entfernung und die relative Orientierung des hMSH2 in Bezug auf CA5 zu bestimmen, nahmen wir eine Interphase-FISH-Analyse vor. P1-Klone, die CA5, ze3 und hMSH2-Sequenzen (entsprechend die Klone 820, 836, und M1015) enthalten, wurden gleichzeitig mit Interphase-Nuclei, im Anschluß das Markieren mit Fluorescein und Spectrum Orange (Meltzer et al., 1992), hybridisiert. Die Ergebnisse zeigten, daß MSH2 innerhalb des HNPCC-Locus, der laut Bindungsanalyse zwischen CA5 und ze3 angeordnet ist, und weniger als 0.3 Mb vom Marker CA5 entfernt liegt (2E).
cDNA-Bibliotheken, die aus humanen Colonkrebszellen oder aus humanem, fötalem Hirngewebe erzeugt wurden, wurden dann mit dem Insert aus pNP-23 gescreent, um zusätzliche Sequenzen dieses Gens zu erhalten. Fünfundsiebzig cDNA-Klone wurden zu Anfang bestimmt und teilweise sequenziert. PCR-Produkte, die die Enden der cDNA-Sequenz contig darstellen, wurden dann als Vorlagen verwendet, um nochmal cDNA-Bibliotheken zu screenen. Dieser cDNA-"Walk" wurde mit neuen contig-Enden erneut wiederholt. Insgesamt wurden 147 cDNA-Klone bestimmt. Die gemischte Sequenz, die von diesen Klonen stammte, ist in 5 dargestellt. Ein offener Leserahmen (ORF) begann 69 nt downstream des 5'-Endes der cDNA contig, und ging 2802 bp weiter. Das Methionin, mit dem dieser ORF anfing, stand in einem Sequenzzusammenhang, der mit effizienter Translation kompatibel ist (Kozak, 1986), und ihm gingen in-frame Terminationscodons voran. RNA aus Placenta und Hirn wurden bei einem auf PCR basierenden Verfahren (RACE, Frohmann et al., 1988) verwendet, um die Position des 5'-Endes der hMSH2-Transkripte unabhängig zu bestimmen. Diese Anlayse zeigte, daß die 5'-Enden aller erfaßbaren Transkripte weniger als 100 bp upstream der in 5 gezeigten Sequenz liegen, und heterogen upstream von nt -69 sind. Die Region der höchsten Homologie zum Hefe-MSH2-Gen ist in 6 dargestellt. Diese Region umfaßt die "Helix-turn-Helix"-Domäne, die vielleicht für das Binden von MutS an die DNA verantwortlich ist (Reenan und Kolodner, 1992). Die von Hefe und Menschen stammenden MHS2-Proteine waren zwischen den Codons 615 und 788 zu 77% identisch. Es gab verschiedene andere Blöcke ähnlicher Aminosäuren, die auf die Länge dieser zwei Proteine verteilt waren (entsprechend 966 Aminosäuren bei Hefe und entsprechend 934 beim Menschen).
Verfahren
cDNA, die aus der RNA von colorectalen Krebszellen mit der Reversen Transkriptse erzeugt wurde, wurde als Template für eine PCR mit den degenerierten Primern 5'-CTG GAT CCA C(G/A/T/C)G G(G/A/T/C)C C(G/A/T/C)A A(T/C)A TG-3' und 5'-CTG GAT CC(G/A) TA(G/A) TG(G/A/T/C) GT(G/A/T/C) (G/A)C(G/A) AA-3' verwendet. Diese zwei Primer wurden vorher dazu verwendet, das Hefe-MSH2-Gen zu bestimmen und basierten auf den Sequenzen, die bei verwandten Säuger- und bakteriellen Genen konserviert sind (Reenan und Kolodner, 1992). Die optimalen PCR-Bedingungen zur Erfassung des humanen MSH2-Gens bestanden aus 35 Zyklen bei 95° für 30 Sekunden, 41° für 90 Sekunden, und 70° für 90 Sekunden, in dem vorher beschriebenen Puffer (Sidransky et al., 1991). PCR-Produkte wurden in Vektoren mit T-Schwanz wie beschrieben (Holton und Graham, 1991) kloniert und mit einer modifizierten T7 Polymerase (USB) sequenziert. Das Insert eines Klons (pNP-23), das die zum Hefe-MSH2-Gen homologen humanen Sequenzen enthielt, wurde dann dazu verwendet, cDNA-Bibliotheken zu screenen, die aus RNA von SW480 Colonkrebszellen (Clontech) oder von fötalem Hirn (Strategene) erzeugt worden waren. Nach zwei weiteren Runden des Screenens, wurden positive Klone in Plasmide umgewandelt und unter Verwendung der modifizierten T7 Polymerase (Kinzler et al., 1991) sequenziert. In eingen Fällen wurden die Inserts unter Verwendung eines hMSH2-spezifischen Primers und eines Vektor-spezifischen Primers amplifiziert, und dann mit der SequiTherm Polymerase (Epicentre Technologies) sequenziert. Um das 5'-Ende der MSH2-Transkripte zu bestimmen, wurde RACE durchgeführt (Frohmann et al., 1989), wobei man Hirn- und Placenta-DNA (Clontech) verwendete.
Beispiel 6
Mutation des hMSH2
Das physikalische Kartographieren des hMSH2 im HNPCC-Locus war verblüffend, aber konnte nicht nachweisen, daß dieses Gen für die Krankheit verantwortlich ist. Um mehr zwingendes Beweismaterial zu erhalten, bestimmten wir, ob Keimbahnveränderungen des hMSH2-Gens in den zwei HNPCC-Verwandschaften vorlagen, die ursprünglich eine Verbindung zum Chromosom 2 begründeten (Peltomaki et al., 1993a). Intron-Exon-Grenzen innerhalb der am meisten konservierten Region des hMSH2 (6) wurden durch das Sequenzieren genomischer PCR-Fragmente, die angrenzende Exons enthielten, bestimmt. Proben genomischer DNA von Lymphozyten betroffener Mitglieder dieser zwei Verwandtschaften wurden dann als Templates für die PCR verwendet, um die Sequenz dieser Domäne zu bestimmen. Die DNA des Individuums J-42, heimgesucht von Colon- und endometrialem Krebs im Alter von 42, bzw. 44 Jahren, hatte, wie sich herausstellte, ein Allel mit einer C für T Transition am Codon 622 (CCA für CTA), was in einer Substition von Leucin für Prolin resultierte (7, oben). Zwanzig zusätzliche DNA-Proben nicht verwandter Individuen codierten alle Prolin an dieser Position. Einundzwanzig Mitglieder der J-Verwandschaft wurde dann durch direktes Sequenzieren der PCR-Produkte analysiert. Alle elf betroffenen Individuen enthielten ein Allel mit einer C für T Transition im Codon 622, während alle zehn nicht betroffenen Mitglieder zwei normale Allele enthielten, wodurch eine perfekte Trennung von der Krankheit belegt wurde. Wichtigerweise war das Prolin an einer hochkonservierten Position, dem identischen Aufenthaltsort, der in allen bekannten mit MutS verwandten Genen von Prokaryoten und Eukaryoten gefunden wurde (6 und Reenan und Kolodner, 1992).
In der Verwandschaft C wurden keinen Mutationen der konservierten Region von MSH2 bestimmt, daher untersuchten wir als nächstes andere Teile des hMSH2-Transkripts. RNA wurde aus lymphoblastoiden Zellen des Patienten C-202, eines 27 Jahre alten Mannes mit Colonkrebs, gereinigt. Eine mit Reverser Transkriptase gekoppelte PCR (RT-PCR) wurde dazu verwendet, vier hMSH2-spezifische Produkte zu erzeugen, die die Codons 89 bis 934 diser RNA umfaßten (siehe Experimetelles Vorgehen). Ein anomales, kleineres RT-PCR-Produkt wurde mit einem der verwendeten Primerpaare bestimmt. Abbildungs- und Sequenzierungsuntersuchungen unter Verwendung verschiedener MSH2-Primer zeigten, daß das anomale Produkt das Ergebnis eines vermutlichen Spleißdefekts war, der die Codons 265 bis 314 vom hMSH2-Transkript entfernte. Man fand heraus, daß das anomale Transkript mit der Krankheit in der C-Verandschaft ausscheidet, und in zwanzig nicht verwandten Individuen nicht gefunden wurde.
Als nächstes war es unser Wunsch, zu bestimmen, ob hMSH2 in einer der in der jüngeren Zeit verbundenen Familien verändert war (R. P. und M. N-L., unveröffentlichte Daten), und suchten Verwandschaft 8 für eine genauere Untersuchung aus. DNA und RNA wurden von lymphoblastoiden Zellen von 8–143, einem 42 Jahre alten Mann mit Colonkrebs, erhalten. Die konservierte Region des hMSH2 wurde aus genomischer DNA unter Verwendung der PCR amplifiziert und direkt sequenziert. Eine T für C Substitution wurde im Polypyrimidintrakt upstream des Exons beim Codon 669 (an der Intronposition-6) beginnend festgestellt. Jedoch wurde diese Substitution auch in zwei der zwanzig nicht verwandten, normalen Individuen gefunden, und war daher ein mit der Krankheit nicht in Verbindung stehender Polymorphismus, mit einer Allelhäufigkeit von 0.05. Das meiste der hMSH2 codierenden Region wurde dann mit RT-PCR amplifiziert, wie oben beschrieben, und es es wurden keine anomalen Transkripte erfaßt. Das Sequenzieren der PCR-Produkte legte jedoch eine C für T Transition am Codon 406 (CGA für TGA) offen, die eine Substitution eines Terminationscodons zu einem Argininrest verursachte. RNA wurde von den Lymphozyten eines zweiten betroffenen Mitglieds der Verwandschaft 8 erhalten und es wurde das gleiche Stopcodon bestimmt. Diese Veränderung wurde in zwanzig anderen, nicht verwandten Individuen nicht gefunden.
Schließlich war es unser Wunsch zu bestimmen, ob Mutationen dieses Gens in RER⁺-Tumoren von Patienten ohne offensichtliche familiäre Krebshistorien vorkommen. Die konservierte Region des MSH2 wurde in vier colorectalen Tumorzellinien solcher Patienten bestimmt, wobei genomische DNA als Template für PCR verwendet wurde. Man fand heraus, daß ein Tumor (vom Patient Cx10) zwei hMSH2-Veränderungen enthielt. Die erste war eine C für T Transition im Codon 639 (CAT für TAT), die in einer Substitution von Tyrosin für Histidin resultierte. Dieser Austausch wurde in keiner der zwanzig Proben unverwandter Individuen gefunden, aber sie war in der DNA des normalen Colons dieses Patienten vorhanden, und es schien daher eine Keimbahnveränderung darzustellen (7, Mitte). Wie die Mutation einer Fehlrichtung (missense mutation) in der J-Verwandschaft, war die Cx10 Veränderung an einer in allen MutS-Homologen perfekt konservierten Position (6 und Reenan und Kolodner, 1992). Die zweite Veränderung im Tumor von Cx10 war eine Substitution eines GT-Dinukleotids für ein A im Codon 663 (ATG für TGTG). Es war vorhergesagt worden, daß die Insertion eines bp eine Rahmenverschiebung verursacht, die ein Terminationscodon 36 nt downstream erzeugte. Diese Mutation wurde sowohl in RNA als auch in DNA, die aus den Cx10-Tumor gereinigt wurden, nachgewiesen, aber sie war nicht im normalen Colon des Patienten vorhanden, was daher eine somatische Mutation bedeutete (7, unten). Die PCR-Produkte vom Cx10 wurden kloniert und sequenziert, und es wurde gezeigt, daß die Insertionsmutation am Codon 663 und die Transition am Codon 639 auf verschiedenen Allelen vorliegen.
Verfahren
Um Mutation zu erfassen, wurden PCR-Produkte aus cDNA und humanen, genomischen DNA-Templates erzeugt, dann direkt sequenziert, wobei man SequiTherm^TM verwendete. In einigen Fällen wurden die PCR-Produkte in Vektoren mit T-Schwanz zur Sequenzierung kloniert, um die Daten der direkten Sequenzierung zu bestätigen. Die verwendeten Primer zur Amplifikation der konservierten Region des MSH2 aus genomischer DNA waren 5'-CCA CAA TGG ACA CTT CTG C-3' und 5'-CAC CTG TTC CAT ATG TAC G-3', was in einem 1.4 kb-Fragment, das die hMSH2-Codons 614 bis 705 enthielt, resultierte, und die Primer 5'-AAA ATG GGT TGC AAA CAT GC-3' und 5'-GTG ATA GTA CTC ATG GCC C-3', was in einem 2.0 kb-Fragment, das die MSH2-cDNA-Codons 683 bis 783 enthielt, resultierte. Die Primer der RT-PCR waren 5'-AGA TCT TCT TCT GGT TCG TC-3' und 5'-GCC AAC AAT AAT TTC TGG TG-3' für die Codons 89 bis 433, 5'-TGG ATA AGA ACA GAA TAG AGG-3' und 5'-CCA CAA TGG ACA CTT CTG C-3' für die Codons 350–705, 5'-CAC CTG TTC CAT ATG TAC G-3' und 5'-AAA ATG GGT TGC AAA CAT GC-3' für die Codons 614 bis 783, und 5'-GTG ATA GTA CTC ATG GCC C-3' und 5'-GAC AAT AGC TTA TCA ATA TTA CC-3' für die Codons 683–949.
Diskussion
Drei Hauptschlußfolgerungen können aus den hier beschriebenen Beispielen gezogen werden. Erstens, eine physikalische Kartographierungs- und Herkunftsanalyse hat den HNPCC-Locus auf dem Chromosom 2 als ein 0.8 Mb-Segment, das von den Markern CA5 und ze3 begrenzt ist, lokalisiert. Zweitens wurde ein neues humanes Homolog des Hefe-MSH2-Gens bestimmt, und es wurde gezeigt, daß dieses Gen im gleichen 0.8 Mb-Interval liegt. Drittens traten Veränderungen des hMSH2-Gens in der Keimbahn von Patienten mit RER⁺-Tumoren, mit oder ohne klassische HNPCC, auf, und zusätzliche somatische Veränderungen dieses Gens traten in Tumoren auf (zusammengefaßt in Tabelle I). Die Veränderungen kamen in hoch konservierten Regionen vor oder veränderten entscheidend das erwartete Genprodukt und stellten daher Mutationen mit wichtigen Funktionseffekten dar. Diese Ergebnisse deuten an, daß Mutationen des hMSH2 für HNPCC und den RER⁺-positiven Phänotyp, der in Tumoren gefunden wird, verantwortlich sind.
Diese Daten haben wesentliche Auswirkungen auf das Verstehen neoplastischer Krankheiten, die bei HNPCC beobachtet wurden. Besonders legen sie nahe, daß die Mikrosatellitenveränderungen, die vorher in Tumoren von diesen Patienten beobachtet worden waren, keine Epiphänomene sind, sondern intrinsisch mit der Pathogenese in Verbindung zu bringen sind. Zusätzlich sind die in mit defekten MutS-verbundenen Gene in Hefen und Bakterien nicht auf Insertionen und Deletionen einfach wiederholter Sequenzen beschränkt, obwohl diese Sequenzen geeignete Hilfsmittel zu Analysezwecken zur Verfügung stehen (Modrich, 1991). Ähnlich würde man erwarten, daß viele Mutation zusätzlich zu Microsatelliteninsertionen oder -deletionen in HNPCC-Tumoren zu finden wären. Das könnte zu vielseitigen, sequenziellen Mutationen in Oncogenen und Tumorsuppressorgenen führen, die, wie man gezeigt hat, die colorectale Tumorgenese steuern (Fearon und Vogelstein, 1990). Daher scheint die molekulare Pathogenese der HNPCC-Tumore ähnlich zu der zu sein, die in nicht HNPCC-Fällen auftritt, obwohl sie durch die erhöhte Rate der Mutation, die in Verbindung mit Reparaturdefekten bei Fehlpaarungen steht, angehäuft wird. Dementsprechend wurde gezeigt, daß Colontumore von HNPCC-Patienten Mutationen von APC, p53 und RAS in Häufigkeiten enthalten, die ähnlich zu denen sind, die bei Arten von sporadischem, colorectalem Krebs gefunden werden (Aaltonen et al., 1993).
Colorectale Tumore von HNPCC-Patienten werden durch ihre relativ normale cytogenetische Zusammensetzung unterschieden (Kouri et al., 1990), und man hat gezeigt, daß sporadische RER⁺-Tumore wesentlich weniger Chromosomenverluste haben als jene, die bei RER^–-Fällen auftreten (Thibodeau et al., 1993; Aaltonen et al., 1993). Diese Daten legen nahe, daß genetische Heterogenität für die Entwicklung colorectalen Krebses entscheidend ist, aber auf zwei Arten erzeugt werden kann (Thibodeau et al., 1993). Meistens entwickelt sie sich durch grobe Veränderungen, die in Aneuploidie resultieren, wie es vor achtzig Jahren vorgeschlagen wurde (Boveri, 1914). In von HNPCC stammenden Tumoren und RER⁺ sporadischen Tumoren ist die Vielfalt vermutlich feiner, wobei sie aus verschiedenen kleinen Sequenzveränderungen, die über das Genom verteilt sind, besteht. Der spätere Mechanismus der Erzeugung von Vielfalt kann weniger gefährlich für den Wirt, sein, da HNPCC-Patienten, ebensowie Patienten mir RER⁺ sporadischen Tumoren, eine bessere Prognose, als nach histopathologischer Analyse ihrer Tumore zu erwarten wäre, zu haben scheinen (Ionov et al., 1993; Thibodeau et al., 1993; Lothe et al., 1993; Lynch et al., 1993).
Referenzen

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Ein isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül mit einer hMSH2-Sequenz von wenigstens 20 Nukleotiden von hMSH2, gezeigt in SEQ ID NO: 1, wobei die hMSH-Sequenz nicht aus der Sequenz:
besteht.
Das DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches cDNA ist.
Das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, welches markiert ist.
Das DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches operabel mit einer Promotorsequenz verbunden ist.
Das DNA-Molekül nach Anspruch 4, welches nach der Transkription ein RNA-Molekül produziert, das die Sequenz von nativer hMSH2-mRNA hat.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches für das vollständige hMSH2-Protein, wie gezeigt in SEQ ID NO: 2, codiert.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 1, welches die Sequenz umfaßt, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Ein isoliertes und auf gereinigtes Molekül mit einer Sequenz von wenigstens 20 Nukleotiden von einem hMSH2-Allel, wie es in einem Tumor gefunden wird, wobei das DNA-Molekül eine Mutation relativ zu hMSH2, das in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, enthält, wobei die Mutation ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Substitution mit einer nicht-konservativen Aminosäure, einer Deletion, einer zu frühen Terminierung und einer Frameshift-Mutation.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei der Tumor ein RER⁺-Tumor ist.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die Mutation ein C nach T-Übergang bei Nukleotid 1934, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 (Codon 622, wie gezeigt in 5B), ist, welches die codierte Aminosäure von einem Prolin in ein Leucin verändert.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die Mutation eine Deletion der Nukleotide 793 bis 942 ist, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die Mutation ein C nach T-Übergang bei Nukleotid 1285, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 (Codon 406, wie gezeigt in 5A), ist, welche ein Arginin in ein Stopcodon verwandelt.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die Mutation ein C nach T-Übergang bei Nukleotid 1984, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 (Codon 639, wie gezeigt in 5B), ist, welches ein Histidin in ein Tyrosin verwandelt.
Das isolierte und aufgereinigte DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei die Mutation ein Frameshift bei Nukleotid 2056, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 (Codon 663, wie gezeigt in 5B), ist, welches ein ATG-Codon in TGTG verwandelt.
Ein Verfahren zum Bestimmen einer Veranlagung für Krebs, umfassend: Testen einer Körperprobe eines Menschen in vitro, um die Gegenwart einer Mutation in hMSH2, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, festzustellen, welche die hMSH2-Expression oder die hMSH2-Proteinfunktion beeinflußt, wobei die Gegenwart solch einer Mutation die Veranlagung für Krebs anzeigt.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe DNA ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe RNA ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe Protein ist.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Probe aus vorgeburtlichen oder aus embryonalen Zellen isoliert wird.
Ein Verfahren zum Screenen, um therapeutische Mittel zu identifizieren, welche Tumoren vorbeugen können oder sie abschwächen können, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einer isolierten Zelle, wobei die Zelle eine hMSH2-Mutation, die in einem Tumor gefunden wird, enthält; Bestimmen der Fähigkeit der Zelle, eine DNA-Mismatch-Reparatur auszuführen, wobei eine Testverbindung, welche die Fähigkeit der Zelle erhöht, eine DNA-Mismatch-Reparatur auszuführen, ein potentielles therapeutisches Mittel ist.
Ein Verfahren zum Screenen, um therapeutische Mittel zu identifizieren, welche Tumoren vorbeugen können oder sie abschwächen können, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einem isolierten und aufgereinigten hMSH2-Protein; Bestimmen der Fähigkeit des hMSH2-Proteins, eine DNA-Mismatch-Reparatur auszuführen, wobei eine testverbindung, die die Fähigkeit des Proteins erhöht, eine DNA-Mismatch-Reparatur auszuführen und ein potentielles therapeutisches Mittel ist.
Das Verfahren nach Anspruch 21, wobei das hMSH2-Protein eine Mutation enthält, die in einem Tumor gefunden wird.
Ein isoliertes und aufgereinigtes Protein, welches die Sequenz hat, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Ein nicht-humanes transgenes Tier, wobei das Transgen ein Allel eines hMSH2-Gens ist, wobei die Nukleotidsequenz des Wildtyp-hMSH2-Gens in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Das nicht-humane transgene Tier nach Anspruch 24, wobei das Allel ein mutiertes Allel von hMSH2 ist, das in einem Patienten, der ein erbliches non-Polyposis-kolorektales Karzinom hat, oder in einem RER⁺-Tumor gefunden wird.
Ein nicht-humanes transgenes Tier, welches kein natives MSH2-Allel des Wildtyps enthält.
Das transgene Tier nach Anspruch 24, wobei das Tier ein mutiertes natives MSH2-Allel enthält.
Eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Person mit einem RER⁺-Tumor, um der Ansammlung von somatischen Mutationen vorzubeugen, die zur Resistenz gegenüber einem therapeutischen anti-Krebs-Mittel führt, wobei die Zusammensetzung aus folgendem besteht: (a) einem DNA-Molekül, welches eine Sequenz von wenigstens etwa 20 Nukleotiden von hMSH2, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1, enthält, wobei das DNA-Molekül ausreichend ist, um einer Mutation in einem hMSH2-Allel der Person abzuhelfen; und (b) einem anti-neoplastischen therapeutischen Mittel.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 28, wobei das antineoplastische therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: einem Hormon, Strahlung, einem zytotoxischen Medikament, einem Zytotoxin und einem Antikörper.