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Diese
Erfindung wurde unter Verwendung der Bewilligungen der U.S. Regierung
des NIH, CA47527, CA09320, GM26449, CA41183, CA42705, CA57435, und
CA35494, sowie der Bewilligungen der Abteilung für Energie, DOE/ERN/F139 und
DE-FG 09291ER-61139 gemacht. Daher behält die U.S. Regierung bestimmte Rechte
an dieser Erfindung.
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Diese
Anmeldung ist eine Continuation-in-part mit der Seriennummer 08/056,546,
eingereicht am 5. Mai 1993.
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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft ein Gen, das Individuen eine Veranlagung zu kolorekatelem
und anderen Arten von Krebs verleiht. Zusätzlich betrifft sie biochemische
Tests, die verwendet werden können,
um Medikamente zur Behandlung betroffener Individuen zu identifizieren.
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Hintergrund
der Erfindung
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HNPCC
(Lynch-Syndrom) ist eines der häufigsten
Krebsveranlagungssyndrome, das nicht weniger als 1 von 200 Individuen
in der westlichen Welt betrifft (Lynch et al., 1993). Betroffene
Individuen entwickeln Tumore des Colons, des Endometriums, der Eierstöcke und
anderer Organe, oft vor Erreichen des 50. Lebensjahres. Auch wenn
der familiengebundene Charakter dieses Syndroms vor fast einem Jahrhundert
entdeckt worden ist (Warthin et al., 1913), bleibt die Rolle der
Erblichkeit von dessen Ursache schwierig zu bestimmen (Lynch et
al., 1966). Neuerdings jedoch haben Verbindungsanalysen zweier großer Verwandschaften
eine Verbindung mit polymorphen Markern auf dem Chromosom 2 gezeigt
(Peltomaki et al., 1993a). Untersuchungen anderer Familien legten
nahe, daß Neoplasie
in einem großen
Teil der HNPCC-Verwandtschaften verbunden mit dem gleichen Locus
auf dem Chromosom 2p ist (Aaltonen et al., 1993).
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HNPCC
wird in klinischem Sinn mit dem Auftreten von früh ausbrechendem Colon- und
anderen bestimmten Arten von Krebs in Verwandten ersten Grades definiert,
das mindestens zwei Generationen überdauert (Lynch et al., 1993).
Die Veranlagung wird auf autosomal dominante Weise vererbt. Anfangs
wurde erwartet, daß das
Gen/die Gene, die für
HNPCC verantwortlich ist/sind, ein Tumorsuppressorgen/e ist/sind,
da andere, vorher charakterisierte Syndrome der Veranlagung für Krebs
mit dieser Art der Vererbung durch Mutationen der Suppressorgene
verursacht werden (rückschauend
zusammengefaßt
in Knudson, 1993). Aber die Analyse von Tumoren von HNPCC-Patienten
legten einen anderen Mechanismus nahe. Viele Loci, die für Tumorsuppressorgene
codieren, erleiden während
der Tumorgenese somatische Verluste (Stanbridge, 1990). Im Gegensatz
dazu fand man heraus, daß beide
Allele der Loci des Chromosoms 2p in HNPCC-Tumoren erhalten bleiben
(Aaltonen et al., 1993). Während
dieser Suche nach Verlusten des Chromosoms 2 bemerkte man jedoch,
daß HNPCC-Tumore
somatische Veränderungen
vieler Microsatellit-Sequenzen aufwiesen.
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Weit
verbreitete, feine Veränderungen
des Krebszellgenoms wurden erstmals in einer Teilmenge sporadischer,
colorectaler Tumore mit Verwendung der zufällig-geprimten Polymerasekettenreaktion
entdeckt (Peinado et al., 1992). Anschließend fand man heraus, daß diese
Veränderungen
Deletionen von bis zu 4 Nukleotiden in genomischen polyA-Bereichen
ausmachen (Ionov et al., 1993). Andere Untersuchungen zeigten, daß eine ähnliche,
ausgeprägte
Untergruppe sporadischer Tumore Insertionen oder Deletionen in einer
Vielzahl einfach wiederholter Sequenzen aufwies, im besonderen Mikrosatellitsequenzen,
die aus Wiederholungen von Dinukleotiden oder Trinukleotiden bestehen
(Ionov et al., 1993; Thibodeau et al., 1993; Aaltonen et al., 1993).
Interessanterweise hatten diese sporadischen Tumore bestimmte Eigenschaften
mit jenen gemeinsam, die sich bei HNPCC-Verwandschaften entwickelten,
wie z. B. die Neigung, an der rechten Seite des Colons angeordnet
und fast diploid zu sein. Diese und andere Daten legten nahe, daß HNPCC
und eine Teilmenge sporadischer Tumore mit einem erblichen Defekt
in Zusammenhang zu bringen war, der Replikationsfehler (replication
errors, RER) von Mikrosatelltiten verursacht (Ionov et al., 1993;
Aaltonen et al., 1993).
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Der
Mechanismus, der dem postulierten Defekt zugrunde liegt, konnte
nicht mit der Untersuchung der Tumor-DNA bestimmt werden, aber Untersuchungen
in einfacheren Organismen stellten eine verblüffende Möglichkeit zur Verfügung (Levinson
und Gutman, 1987; Strand et al., 1993). Diese Arbeit zeigte, daß Bakterien
und Hefen, die defekte Reparaturgene für Fehlpaarungen enthalten,
Instabilität
von Wiederholungen der Dinukleotide aufzeigen. Der Bruch von Genen,
die primär
an die DNA-Replikation
oder -Rekombination beteiligt sind, hatte keine offensichtliche
Wirkung auf die Genauigkeit der Mikrosatellitreplikation (rückschauend
zusammengefaßt
in Kunkel, 1993). Diese zentralen Untersuchungen legten nahe, daß eine gestörte Reparatur von
Fehlpaarungen für
die Veränderungen
der Mikrosatelliten in den Tumoren von HNPCC-Patienten verantwortlich
sein könnte
(Strand et al., 1993).
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WO
95/14085 legt eine abweichende Sequenz von hMSH2 offen. Zudem kommt
der veröffentlichten, abweichenden
hMSH2-Sequenz nicht das früheste
Prioritätsdatum
zu und sie gehört
nicht zum Stand der Technik für
die vorliegende Anmeldung. WO 95/14085 legt 3 Fragmente der in SEQ
ID NO. 1 dargestellten hMSH2-Sequenz hierin offen. Die 3 Fragmente
werden durch die vorliegende Erfindung nicht umfaßt.
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Daher
ist es ein notwendiges Anliegen der Wissenschaft, das eigentliche
Gen und Protein, das für
den erblichen, nicht polypösen,
colorectalen Krebs und den Phänotyp
mit Replikationsfehler, der sowohl bei erblichen als auch bei sporadischen
Tumoren gefunden wurde, zu bestimmen. Die Bestimmung des Gens und
des Proteins würde
ein breiteres, diagnostisches Screenen nach erblichem, nicht polypösem, colorectalem
Krebs ermöglichen,
als es momentan möglich
ist. Die Bestimmung des beteiligten Gens und Proteins würde auch
ein breiter angelegtes Screenen nach Verbindungen, die bei der medikamentösen Therapie
von erblichem, nicht polypösem,
colorectalem Krebs angewendet werden, ermöglichen und würde eine
Gentherapie betroffener Individuen ermöglichen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
ist Aufgabe der Erfindung, ein DNA-Molekül zur Verfügung zu stellen, das, wenn
es mutiert, die genetische Determinante für erblichen, nicht-polypösen, colorectalen
Krebs darstellt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, DNA-Moleküle zur Verfügung zu stellen, die bestimmte
Mutationen enthalten, die erblichen, nicht-polypösen colorectalen Krebs verursachen.
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Es
ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Behandlung
von Patienten zur Verfügung
zu stellen, die eine Veranlagung für erblichen, nicht-polypösen colorectalen
Krebs aufweisen.
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Es
ist ebenfalls Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Bestimmung einer
Veranlagung für
Krebs zur Verfügung
zu stellen.
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Es
ist desweiteren Aufgabe der Erfindung, Verfahren für Bestandteile
von Screening-Untersuchungen zur Verfügung zu stellen, um therapeutische
Mittel zur Behandlung von Patienten, die eine Veranlagung für erblichen,
nicht-polypösen,
colorectalen Krebs haben, zu bestimmen.
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Es
ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Protein zur Verfügung zu
stellen, das wichtig für die
Reparatur von Fehlpaarungen menschlicher DNA ist.
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Es
ist ebenfalls eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein transgenes
Tier zur Untersuchung möglicher Behandlungsmöglichkeiten
von erblichem, nicht-polypösem,
colorectalem Krebs zur Verfügung
zu stellen.
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Diese
und andere Aufgaben der Erfindung werden durch eine oder mehrere
der unten beschriebenen Ausführungsformen
zur Verfügung
gestellt. In einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt.
Das Molekül
hat eine hMSH2-Sequenz von mindestens ca. 20 Nukleotiden von hMSH2,
wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, wobei die hMSH2-Sequenz nicht aus den
Nukleotiden 2085 bis 2405, 2118 bis 2135 oder 2279 bis 2296 der
SEQ ID No. 1 besteht.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül zur Verfügung gestellt. Das DNA-Molekül hat eine
Sequenz von mindestens ca. 20 Nukleotiden eines hMSH2-Allels, das
in einem Tumor zu finden ist, wobei dieses DNA-Molekül eine Mutation
relativ zu dem in SEQ ID NO: 1 gezeigte hMSH2 aufweist.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten,
der eine Veranlagung zu erblichem, nicht-polypösem, colorectalen Krabs hat,
zur Verfügung
gestellt. Das Verfahren verhindert die Anhäufung somatischer Mutationen.
Das Verfahren beinhaltet, ein DNA-Molekül, welches eine Sequenz von
mindestens ca. 20 Nukleotiden von hMSH2, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt,
hat, einem Patienten zu verabreichen, der eine Mutation in einem
hMSH2-Allel hat, welche dem Patienten eine Veranlagung zu erblichem,
nicht-polypösem,
colorectalem Krebs verleiht, wobei dieses DNA-Molekül ausreicht, die
Mutation in einem hMSH2-Allel des Patienten zu beseitigen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung einer Veranlagung
für Krebs
zur Verfügung
gestellt. Das Verfahren beinhaltet die Untersuchung einer Körperprobe
eines Menschen, um das Vorhandensein einer Mutation von hMSH2 nachzuprüfen, die
hMSH2-Expression oder die Proteinfunktion von hMSH2 betrifft, wobei
das Vorhandensein einer solchen Mutation eine Veranlagung zu Krebs
anzeigt.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren des Screenens zur Verfügung gestellt,
um therapeutische Mittel zu bestimmen, die Tumore verhindern oder
abschwächen
können.
Das Screeening-Verfahren
beinhaltet das in-Kontaktbringen einer Testverbindung mit einem
gereingten hMSH2-Protein oder einer Zelle; das Bestimmen der Fähigkeit
des hMSH2-Proteins
oder der Zelle, die Reparatur der fehlgepaarten DNA durchzuführen, wobei
eine Testmischung, die die Fähigkeit
dieses hMSH2-Proteins oder dieser Zelle die Reparatur der fehlgepaarten
DNA durchführen
erhöht,
ein mögliches
therapeutisches Mittel darstellt.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Protein zur Verfügung gestellt.
Das Protein hat die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Sequenz.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein transgenes Tier zur Verfügung gestellt. Das transgene
(nicht humane) Tier enthält
ein hMSH2-Allel in seiner Keimbahn. Das hMSH2-Allel ist eines, das
bei Menschen, die erblichen, nicht-polypösen, colorectalen Krebs haben,
oder in RER+-Tumoren zu finden ist. Es werden
auch Tiere zur Verfügung
gestellt, die keine Wild-Typ
MSH2-Allele, entsprechend den vorgestellten Mutationen, haben.
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Daher
stellt die vorliegende Erfindung der Fachwelt die Sequenz des Gens,
das für
erblichen, nicht-polypösen,
colorectalen Krebs verantwortlich ist, und die Informationen über den
Mechanismus, durch welchen es Tumore verursacht, zur Verfügung. Dies
ermöglicht
der Wissenschaft, eine Vielzahl an Techniken auszuführen, um
Patienten mit dem Risiko der Entwicklung einer Vielzahl von Krebsarten
zu bestimmen und sie zu behandeln, um die tatsächliche Entwicklung solcher
Krebsarten zu verhindern.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 faßt die Marker,
die in somatischen Zellhybriden festgehalten werden und zur Positionsbestimmung
des hMHSH2-Gens verwendet wurden, zusammen.
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PCR
wurde dazu verwendet zu bestimmen, ob jeder der aufgezählten Marker
im angegebenen Hybrid vorhanden (schwarzes Kästchen) oder nicht vorhanden
(weißes
Kästchen)
war. Der Laborname jedes Hybrids und der offizielle Name (in Klammern)
ist angegeben. Das Hybridfeld wurde auch mit zehn zusätzlichen
polymorphen Markern außerhalb
der 136–177
Region bestätigt.
M: Hybrid, das vom von Mikrozellen vermittelten Transfer des Chromosoms,
2 stammt; T: stammt von der t(X;2)-Translokation; X: stammt vom mit Röntgenstrahlen
bestrahlten Chromosomendonor 2. MO: Maus-Mensch-Hybrid; HA: Hamster-Mensch-Hybrid;
RA: Ratte-Mensch-Hybrid; TEL: Telomere; CEN: Centromere.
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2 zeigt eine FISH-Analyse, die dazu verwendet
wurde, die Nachbarschaft und Anordnung der DNA-Sequenzen im Chromosomenband
2p16 zu bestimmen.
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Die
Tafeln 2A und 2B zeigen die FISH-Aufzeichung des 123 Markers. Tafel
2A zeigt die G-Bande der Metaphase des Chromosoms 2. Tafel 2B zeigt
zur Tafel 2A identische Chromosome, denen auf FISH ein Biotin gelabelter
P1-Klon für
den 123 Marker folgt. Ergebnisse geben die Position des 123 Markers
auf dem Chromosomenband 2p16.3 an. Die Tafeln 2C und 2D zeigen Co-Hybridisierung,
womit die übereinstimmende
Position einer Microdissection-(Micro-FISH) Sonde des Chromosoms 2p16 und
des 123 Markers belegt wird. Tafel 2C zeigt das DAPI gefärbte Chromosom
2 in der Metaphase. Tafel 2D zeigt die gleichzeitige Hybridisierung der
Biotin markierten 123 Probe (erscheint als intensiv gefärbter, kleinerer
Kreis) und der mit Spectrum-Orange gelabelten 2p16 Micro-FISH-Probe
(erscheint als diffus gefärbter,
größerer Kreis).
Feld 2E zeigt ein repräsentatives
Beispiel eines Interphasen-Nucleus,
der gleichzeitig mit P1-Klonen für
CA5, hMSH2 und ze3 hybridisierte. Die Ergebnisse wurden dazu verwendet,
direkt die Abstände
zwischen den Markern zu messen, um die Anordnung und relative Entfernung
zwischen den Markern zu ermitteln (nach Trask et al., 1989). Einfügung: Das
bildverarbeitende Programm NIH Image wurde dazu verwendet, eine
durchschnittliche Graustufe, die beim Oberflächenplot abgebildet wird, zur
Verfügung
zu stellen, um die Längenmessungen
zu erleichtern und um graphisch die Informationen der relativen
Anordnungen darzustellen. Der gezeigte Oberflächenplot definiert das bestimmte
Interphasen-Chromosom und die relative Anordnung CA-MSH2-ze3.
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3 zeigt
die Bindungsanalyse der HNPCC-Stämme.
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Alle
betroffenen Individuen, in denen meiotische Rekombination zwischen
den Markern 119 und 136 auftrat, sind mit eingeschlossen. Ein schwarzes
Kästchen
zeigt an, daß das
Individuum nicht das mit der Krankheit in Verbindung gebrachte Allel
in seiner Familie enthielt, oder daß das Individuum ein Allel,
das nicht mit der Krankheit in Verbindung gebracht werden konnte,
von seinen davon betroffenen Elternteil geerbt hat. Ein weißes Kästchen zeigt
an, daß das
Individuum ein Allel hatte, welches die gleiche Größe wie das
mit der Krankheit in Verbindung gebrachte Allel hatte. Ein schraffierter
Kreis zeigt an, daß der
Marker nicht untersucht wurde. Alle Individuen hatten Colon- oder
endometrialen Krebs in einem Alter von weniger als 55 Jahren, oder hatten
Vorfahren mit einer solchen Krankheit, was aber nicht angab, daß der Patient
notwendigerweise mit der Krankheit in Verbindung zu bringende Allele
hatte, weil das Stadium gewöhnlich
nicht bestimmt werden konnte.
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4 zeigt die Positionsbestimmung des hMSH2-Gens.
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Southern
Blots, die EcoRI (4A und 4C) und
PstI (4B und 4D), verdaute
DNA von den angegeben somatischen Zellhybriden (4A und 4B)
oder YAC-Klone (4C und 4D)
enthielten, wurden mit einem radio-gelabelten Insert des cDNA-Klons
pNP-23 hybridisiert. Southern Blotting und Hybridisierung wurden
wie beschrieben durchgeführt
(Vogelstein et al., 1987). Autoradiogramme sind gezeigt. Das 5.0
kb PstI-Fragment in den Hybriden Z11 und Z12 stammt aus Hamster-DNA.
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5 zeigt die cDNA-Sequenz des hMSH2.
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Ein
offener Leserahmen (ORF) beginnt beim Nukleotid 1 und endet bei
nt 2802. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist gezeigt. Die
Sequenz downstream zu nt 2879 wurde nicht bestimmt.
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6 zeigt die Homologie zwischen Hefe- und
humanen MSH2-Genen.
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Die
vorhergesagten Aminosäuresequenzen
von Hefe (y)-MSH2-
(Reenan und Kolodner, 1992) und humanen MSH2-Genen werden innerhalb
des Bereichs höchster
Homologie verglichen. Blöcke ähnlicher
Aminosäuren
sind schattiert.
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7 zeigt Keimbahn- und somatische Mutationen
von hMSH2.
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Autoradiographen
von Polyacrylamidgelen, die die Sequenzierungsreaktionen, die von
PCR-Produkten stammen, enthalten, sind gezeigt. Die 1.4 kb PCR-Produkte,
die einen konservierten Bereich von hMSH2 enthalten, wurden aus
genomischen DNA-Proben, wie in Beispiele beschrieben, erzeugt. Antisense-Primer wurden
bei den Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die ddA-Mischungen jeder
Sequenzierurngsreaktion wurden benachbarten Bahnen zugeführt, um
einen Vergleich zu ermöglichen,
ebenso wie diejenigen für
C, G und T. Die DNA-Proben stammten vom Tumor (Bahn 1) und vom normalen
Colon (Bahn 2) des Patienten Cx10, von einer RER-Colontumor-Zellinie
(Bahn 3), und von Lymphozyten der Patienten J-42 (Bahn 4) und J-143 (Bahn
5). 7A: Ein Übergang
(C für
T im Codon 622) in der Lymphocyten-DNA kann bei den HNPCC-Patienten
J-42 und J-143 beobachtet werden. 7B: Ein Übergang
(C für
T am nt Codon 639) im Tumor (Bahn 1) und in normaler Darmschleimhaut
(colonischer Mucosa) (Bahn 2) des Patienten Cx10. 7C:
Eine Substitution eines TG-Dinukleotids
für ein
A beim Codon 663 kann in der DNA des Tumorpatienten Cx10, (Bahn 1),
beobachtet werden, aber nicht in der DNA ihres normalen Kolons (Bahn
2). Pfeile markieren die Substitutionen in Tafel A und B und die
TG-Dinukleotid-Insertionsstelle
in Tafel C.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Auf
die Offenbarung aus Seriennummer 08/056,546, eingereicht am 5. Mai
1993, wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung wurde überraschenderweise
festgestellt, daß das
Gen, das für
erblichen, nicht polypösen
colorectalen Krebs verantwortlich ist, hMSH2 ist, welches ein humanes
Analogon des bakteriellen MutS ist. Die cDNA-Sequenz von hMSH2 ist
in SEQ ID No: 1 dargestellt. Dieses Gen codiert für ein Enzym
zur Reparatur fehlgepaarter DNA. Eine Mutation des Gens verursacht,
daß Zellen
Mutationen anhäufen.
Zum Beispiel, beruht der beobachtete Phänotyp mit Replikationsfehler
(RER+), der sowohl in sporadischem als auch
erblichem, nicht polypösem,
colorectalen Krbes gefundenn wird, auf Variationen (Insertionen
und Deletionen) in der Mikrosatelliten-DNA. In Hefen und Bakterien
verursachen defekte, zu MutS-gehörige
Gene genauso andere Arten von Mutationen.
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Entsprechend
der Erfindung sind nützliche
DNA-Moleküle solche,
die spezifisch mit den hMSH2-Sequenzen hybridisieren werden. Diese
haben typischerweise eine Länge
von 20 Nukleotiden und die in SEQ ID No: 1 dargestellte Nukleotidsequenz.
Solche Moleküle
können,
mit jeglicher in der Wissenschaft bekannten Technik, wie z. B, radioaktiven
Markern, fluoreszierenden Markern, enzymatischen Markern, Sequenztags usw.,
markiert sein. Entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung enthalten
die DNA-Moleküle
eine Mutation, die in Tumoren von HNPCC-Patienten oder in sporadischen RER+-Tumoren gefunden wurde. Solche Moleküle können als
Proben allel-spezifischer
Oligonukleotide verwendet werden, um eine bestimmte Mutation innerhalb
einer Familie aufzufinden.
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Entsprechend
einiger Aspekte der Erfindung, ist es wünschenswert, daß die DNA
für alle
Teile des hMSH2-Proteins
codiert, wie in SEQ ID No: 2 dargstellt. Um eine Expression des
Proteins zu erreichen, kann die DNA-Sequenz operabel mit geeigneten Kontrollsequenzen,
wie z. B. mit Promotoren, mit dem Kozak-Consensus, und Terminatorsequenzen,
verbunden sein.
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Ein
Patient, der eine Veranlagung hat, Krebs durch Vererbung eines mutierten
hMSH2-Allels zu entwickeln, kann durch Applikation eines DNA-Moleküls, das
alles oder einen Teil der normalen hMSH2-Gensequenz, wie in SEQ
ID NO: 1 gezeigt, enthält,
behandelt werden. Ein Teil der Gensequenz wird nützlich sein, da es die Position
der Mutation, die im mutiertierten Allel vorhanden ist, umfaßt, so daß ein doppeltes
Rekombinantionsereignis zwischen dem mutierten Allel und dem normalen
Teil den Defekt, der im Patienten vorliegt, "korrigiert". Ein Teil des Gens kann auch nützlicherweise
angewendet werden, da es genug vom Protein codiert, um ein Enzym
zur Reparatur fehlgepaarter funktioneller DNA zu exprimieren. Solch
ein Teil muß nicht notwendigerweise
mit dem mutierten Allel rekombinieren, aber kann als separater Locus
im Genom oder einem unabhägigen
Replikationsvektor beibehalten werden. Wege, DNA Menschen zu applizieren,
sind in der Wissenschaft bekannt und jeder davon kann so verwendet
werden, wie es am geeignetsten erscheint. Eine Vielzahl von Vektoren
sind auch für
diesen Zweck bekannt. Entsprechend einiger Verfahren werden keine
Vektoren benötigt.
Solche Verfahren sind Durchschnittsfachkräften gut bekannt.
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Als
Teil der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung einer kombinierten
anti-neoplastischen Therapiekur betrachtet. Solche eine kombinierte
Kur ist für
Patienten nützlich,
die einen RER+-Tumor, entweder sporadisch
oder in Verbindung mit HNPCC, haben. Die Kur verbindet jegliche
Standard anti-neoplatische Therapie, auf welche ein Patient resistent
werden kann, mit der hMSH2-Gentherapie, wie oben beschrieben ist.
Durch Beheben des Defekts, der in RER+-Zellen
auftritt, z. B. eine hMSH2-Mutation, wird die Wahrscheinlichkeit,
daß der
Tumor eine Resistenzmutation entwickelt, erheblich vermindert. Durch
Verzögerung
und Verhinderung der Entstehung eines Resistenz, kann das Leben
der Krebspatienten verlängert
werden. Zusätzlich ermöglicht eine
solche Verhinderung einer Resistenz einen höheren Grad der Zerstörung des
Tumors durch therapeutische Mittel. Beispiele anti-neoplastischer
Therapien, die in Kombination mit hMSH2-Gentherapie verwendet werden
können,
sind Hormone, Strahlung, cytotoxische Medikamente, Cytotoxine und
Antikörper.
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Körperproben
können
untersucht werden, um zu bestimmen, ob das hMSH2-Gen normal oder
mutiert vorliegt. Mutationen sind jene Abweichungen von der in SEQ
ID NO: 1 gezeigten Sequenz, die mit einer Krankheit in Verbindung
gebracht werden und die eine Veränderung
in der Funktion oder Expression des hMSH2-Proteins verursachen.
Solche Mutationen beinhalten nichtkonservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen,
vorzeitige Terminationen und Rahmenverschiebungen. Siehe Tabelle
I. Geeignete Körperproben für Untersuchungen
beinhalten jene, die DNA, RNA, oder Protein enthalten, und die zum
Beispiel aus Biopsien, Blut erhalten werden.
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Mit
der zur Verfügung
gestellten Information, daß der
Defekt, der HNPCC und sporadische RER+-Tumore
verursacht, in einem Enzym zur Reparatur fehlgepaarter DNA liegt,
kann man Untersuchungen an Testverbindungen und -zusammensetzungen
vornehmen, um zu bestimmen, ob sie den Defekt beheben werden. Solche
therapeutischen Verbindungen konnten an missense, mutierte hMSH-Proteine
binden, um die Proteine in die normale, aktive Konformation zurückzubringen.
Alternativ konnten solche therapeutischen Verbindungen die Expression
wechselnder Wege zur Reparatur der Fehlpaarungen stimulieren. Das
Screenen nach solchen therapeutischen Verbindungen konnte vorgenommen
werden, indem man Testverbindungen mit Zellen, entweder normale
oder jene mit einer hMSH2-Mutation,
die in Tumoren gefunden wurde, in Kontakt brachte. Die Fähigkeit
der Zellen, die in Kontakt mit den Testverbindungen gebracht worden
sind, wurde mit der Fähigkeit der
gleichen Zellen verglichen, die nicht wegen Aktivität der Reparatur
von Fehlpaarungen in Kontakt gebracht worden sind. Solche Aktivität kann,
wie in der Wissenschaft bekannt, untersucht werden. Siehe, zum Beispiel, Levinson
und Gutman, 1987, und Strand et al., 1993. Beobachtung von Veränderungen
in Mikrosatelliten-DNA in
Zellen ist ein Weg der Untersuchung von Aktivität der Reparatur von Fehlpaarungen.
Ein anderer Ansatz ist der, die Reparatur fehlgepaarter DNA in vitro
in Nuklearextrakten zu untersuchen. Siehe Holmes, 1990; Thomas,
1991; und Fang, 1993.
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Mit
cDNA-Sequenz und der Aminosäure
des hMSH2-Proteins
ausgestattet, kann ein Durchschnittsfachmann leicht das hMSH2-Protein
herstellen, isoliert und von anderen humanen Proteinen gereinigt.
Zum Beispiel, können rekombinante
Zellen oder Organismen dazu verwendet werden, das Protein in Bakterien,
Hefen, oder anderen üblichen
Zellsystemen herzustellen. Das isolierte und gereinigte Protein
kann beim Screenen neuer therapeutischer Mittel verwendet werden,
zum Beispiel, bei in vitro Untersuchungen der Reparatur fehlgepaarter
DNA. Das Protein kann auch dazu verwendet werden, Antikörper gegen
hMSH2 zu erzeugen. Therapeutische Applikation des Proteins wird
auch in Erwägung
gezogen.
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Transgene
Tiere werden in der vorliegenden Erfindung ebenfalls betrachtet.
Diese Tiere würden
in ihrer Keimbahn hMSH2-Allele eingeschleust haben, die mit HNPCC
oder sporadischen Tumoren in Verbindung stehen. Solche Tiere könnten Modellsysteme
zur Untersuchung von Medikamenten und anderen therapeutischen Mitteln
zur Verfügung
stellen, die die Entwicklung von Tumoren verhindern oder verzögern. Gentechnisch
veränderte
Tiere, die eine oder mehrere Mutationen in ihren eigenen MSH2-Genen aufweisen,
werden ebenfalls in Erwägung
gezogen. Die Mutationen werden so vorgenommen werden, daß sie Mutationen,
die in hMSH2-Allelen gefunden wurden, die in von HNPCC betroffenen
Individuen oder anderen humanen RER+-Tumoren
gefunden wurden, entsprechen. Tiere, bei denen beide native MSH2-Allele
inaktiviert sind und die ein humanes Wildtyp- oder mutiertes hMSH2-Allel
enthalten, sind besonders erwünscht.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Somatische
Zellhybride
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Ein
Feld mit Hybridzellinien Mensch-Hamster, Mensch-Maus und Mensch-Ratte wurde entwickelt,
um eine Kartierung von HNPCC zu ermöglichen. Hybride, die nur Teile
des Chromosoms 2 enthalten, wurden durch durch Mikrozellen vermittelte
Chromosomenübertragung
oder durch Fusionen mit Standardzellen erhalten, die auf eine Röntgenbestrahlung
des Chromosom 2-Donors folgten. Zusätzlich wurden zwei Hybride
verwendet, die eine (X;2)(q28;p21)-Translokation enthielten, die
aus humanen Fibroblasten stammte. In vorhergehenden Untersuchungen
wurde der HNPCC-Locus in der 25 cM Region abgebildet, die den Marker
123 umgibt und von den Markern 119 und 136 begrenzt ist (Peltomaki
et al., 1993a). Achtunddreißig
Hybride wurden mit diesen drei Chromosom 2p-Markern gescreent. Acht
dieser Hybride haben sich als nützlich
für die
Kartierung des relevanten Teils des Chromosoms 2p herausgestellt.
Zum Beispiel, enthielten die Hybride L1 und L2 die distale Hälfte des
Bereichs, einschließlich
des Markers 123, während
das Hybrid y3 die Hälfte
in der Nähe des
Markers 123 enthielt (1).
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Verfahren
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Verfahren
zur Ableitung der durch Mikrozellen vermittelte Hybride des Chromosoms
2 wurden vorher beschrieben (Chen et al., 1992; Spurr et al., 1993).
Einige Hybride wurden, folgend auf eine Fusion röntgenbestrahlter Donorzellen,
die das humane Chromosom 2 enthielten, mit CHO-Zellen hergestellt
(Chen et al., 1994). Maushybride wurden erhalten, indem man HPRT
fehlerhafte L-Zellen (A9) mit humanen Fibroblasten (GM7503) fusioniert
hat, die eine t(X;2)(q28,p21)-Translokation
enthielten und die in einem Medium, das HAT enthielt, selektiert
wurden.
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Beispiel 2
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Polymorphe Marker
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Um
den HNPCC-Locus ganeuer zu kartographieren, wurden zusätzliche
polymorphe Marker auf drei Arten erhalten. Erstens wurde ein genomischer
Klon, der 85 kb, die den 123 Marker umgaben, für Fluoreszenz in situ Hybridisierung
(FISH) verwendet, um ihn auf der chromosomalen Bande 2p16.3 anzuordnen (2A,B). Die 2p16 Bandenregion wurde dann mikroanalysiert,
und die Sequenzen innerhalb dieser Bande wurden unter Verwendung
der Polymerasekettenreaktion amplifiziert und in Plasmidvektoren
subkloniert (siehe Experimentelles Vorgehen). Die Genauigkeit der
Mikroanalyse wurde bestätigt
durch Verwendung einer Zwei-Farben-FISH durch gleichzeitiges Hybridisieren
des mikroanalysierten Materials und eines genomischen Klons, der
den Marker 123 enthielt (2C, D). Die Subklone wurde durch Hybridisierung
mit einer (CA)15-Vorlage gescreent, und
die hybridisierenden Klone wurden bestimmt und sequenziert. Diese
Sequenzen wurden dann dazu verwendet, Oligonukleotidprimer für PCR-Analyse
der genomischen DNA zu gestalten. Neunzehn (CA)n-Wiederholungsmarker
wurden auf diese Weise bestimmt. Von diesen waren vier hochpolymorph
und mappten zu dem Bereich zwischen den Markern 119 und 136, wie
es mit dem Feld der somatischen Zellhybride, das in 1 dargestellt
ist, untersucht wurde. Zweitens fand man heraus, daß acht zusätzliche
(CA)n-Marker, die zufällig aus der humanen, genomischen
DNA bei Verwendung einer poly(CA)-Vorlage kloniert wurden, zwischen
den Markern 119 und 136 liegen, wobei eine Bindungsanalyse in CEPH-Stämmen verwendet
wurde. Fünf
von diesen waren teilweise informationsliefernd und wurden bei unseren
weiteren Untersuchungen verwendet. Als letztes wurde ein zusätzlicher
Marker bestimmt, indem man Subklone eines genomischen P1-Klons,
der den Marker 123 mit einer (CA)15-Vorlage
enthielt, gescreent hat. Durch diese Analysen wurden dreizehn neue
polymorphe Marker im 25 cM-Intervall zwischen den Markern 119 und
136 bestimmt, was zur Folge hatte, daß ein durchschnittlicher Marker
~2 cM groß war
(Tabelle II). Diese Marker wurden in Bezug zueinander durch Verbindung
in CEPH- und HNPCC- Stammbäumen sowie
durch Analyse somatischer Zellhybride gesetzt. Diese zwei Abbildungstechniken
stellten übereinstimmende
und ergänzende
Informationen zur Verfügung.
Zum Beispiel, konnten die relativen Positionen von CA16 und CA18
nicht durch Bindungsanalyse unterschieden werden, aber sie konnten
mit den somatischen Zellhybriden L1, L2 und Y3 bestimmt werden. Im
Gegensatz dazu konnte die relative Position der ze3- und yh5-Marker nicht
mit der Abbildung somatischer Zellhybride bestimmt werden, aber
sie konnte mit der Bindungsanalyse unterschieden werden.
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Verfahren
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Alle
Marker wurden durch Screenen human-genomischer Bibliotheken mit
radioaktiv markierten (CA)n-Sonden erhalten
(Weber und May, 1989). Die "T"-Marker (siehe Tabelle
I) wurden aus einer Bibliothek, die aus Gesamt-human-genomischer DNA gemacht worden
war, erzeugt, wie bei Weissenbach et al., 1992 beschrieben. Die "M"-Marker wurden aus Bibliotheken gemacht,
die aus dem mikroanalysierten Chromosom 2p16 erzegut worden waren,
wie unten beschrieben ist. Der CA2-Marker wurde aus einer Bibliothek
erzeugt, die aus dem P1-Klon 210 gemacht worden war, der zur Vervollständigung
mit Sau3 verdaut worden war und in die XhoI-Schnittstelle des lambda
YES kloniert worden war (Elledge et al., 1991). Die Sequenzen der
Klone, die aus diesen Bibliotheken erhalten wurden, wurden bestimmt,
und die Primer, die die CA-Wiederholungen umgeben,
wurden rausgewählt.
Nur Primer, die eine robuste Amplifikation und hohe Heterozygosität zulassen, wurden
für genaue
Analyse der HNPCC-Verwandten verwendet. Es wurde sowohl durch Bindungsanalyse
in den CEPH-Stämmen
als auch durch Bewertung im Feld der somatischen Zellhybride, das
in 1 gezeigt ist, gezeigt, daß alle Marker, die bei dieser
Untersuchung verwendet wurden, vom Chromosom 2p stammten. Die Sequenzen
der Primer und andere Einzelheiten, die für jeden Marker spezifisch sind,
wurden in der Genom-Daten-Bank
(Genome Data Base) hinterlegt. Bindungsanalyse zur Erzeugung einer
Abbildung der Marker-Loci in den CEPH-Familien 1331, 1332, 1347, 1362, 1413,
1416, 884 und 102 (Weissenbach et al., 1992) wurden unter Anwendung
des CLINK-Programms des LINKAGE-Programmpakets (Lathrop et al.,
1984) ohne Option der Unterscheidung des Geschlechts und mit 11-Punkt-Berechnungen
durchgeführt.
Die Chancen für die
beste Locus-Anordnung, die von den Daten gestützt wird, wurde gegen paarweise
Inversionen der Loci ausgewertet.
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Beispiel 3
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Genomische Klone
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Viele
der in Tabelle I gezeigten, polymorphen Marker wurden dazu verwendet,
genomische Klone, die 2p16- Sequenzen
enthielten, abzuleiten. Genomische Klone wurden durch PCR-Screenen
der Bibliotheken von humanem P1 und von YAC mit diesen polymorphen
Markern, mit zehn zusätzlichen
sequenz-markierten Stellen (STS), die von der Mikroanalyse des Chromosoms
2p16 stammten, oder mit YAC-Kreuzungen, erhalten. Dreiundzwanzig
P1–Klone,
jeder 85–95
kb enthaltend, sowie 35 YAC-Klone, die 300 bis 1800 kb enthielten,
wurden erhalten. Die YAC-Klone bestätigten in manchen Fällen die
Verbindungen und die Kartierungen der somatischen Zellhybride. Zum
Beispiel wurden die Marker ze3 und yh5 beide in den YACs 4F4 und
1E1 gefunden, während
CA16 und CA18 beide in YAC 8E5 gefunden wurden, was ihre Nachbarschaft
belegt. Die größte Dichte
genomischer Klone (28 YAC und 17 P1-Klone) wurde zwischen den Markern
yb9 und yh5 (Tabelle I) erhalten, wodurch dies zur Region wurde,
welche die Region mit der größten Wahrscheinlichkeit
für das Beinhalten
das HNPCC-Gens während
des Ablaufs dieser Untersuchungen wurde. Es wurde vorhergesagt, daß die Region
zwischen yh5 und yb9 ~9 Mb (angenommen 1 Mb pro cM) enthielt. Basierend
auf den Größen der
YAC-Klone, und ihre Chimerität
beachtend, schätzten
wir, daß sie über 70%
der Sequenzen zwischen yh5 und yb9 enthielten.
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Verfahren
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Die
in Tabelle I beschriebenen Marker wurden dazu verwendet, YRC- oder
P1-Bibliotheken mit PCR zu screenen. Die CEPH A-Bibliothek wurde
von Research Genetics, Inc. erhalten und bestand aus 21,000 YAC-Klonen,
die in einem Format angeordnet sind, das leichtes Screenen und eindeutige
Bestimmung positiver Klone ermöglicht.
Die Größen von
zehn der Marker enthaltenden YAC-Klone wurden durch queralternierende
pulse-field-Gelelektrophorese (transverse alternating pulse-field
gel electrophoresis) unter Verwendung eines GeneLine II-Geräts von Beckmann
bestimmt und auf 0.7 Mb (Bereich 0.2–1.8 Mb) im Durchschnitt festgelegt.
In einigen Fällen
wurde inverse PCR dazu verwendet, die YAC-Kreuzungen zu bestimmen
(Joslyn et al., 1991), und um die abgeleitete Sequenz für "Chromosomenwanderung", die bei YAC- oder
P1-Bibliotheken verwendet wurde, zu bestimmen. Die Verbindungen
wurden auch dazu verwendet, Primer zu gestalten, um zu testen, ob
die Enden der YAC-Klone auf dem Chromosom 2p16 lokalisiert werden
könnten
(und daher vermutlich nicht-chimär wären). Von
drei der vier YAC-Klone, die auf diese Weise getestet wurden, lagen
beide Enden innerhalb der erwarteten Region des Chromosoms 2, wie
mit dem Feld somatischer Zellhybride beurteilt wurde. Die human-genomische P1-Bibliothek
wurde auch mit PCR gescreent (Genome Systems, Inc.). Die P1-Klone
M1015 und M1016, die das hMSH2-Gen enthalten, wurden dazu verwendet,
Intron-Exon-Grenzen zu
bestimmen, wobei Sequenzierungsprimer von den Exons und SequiThermTM-Polymerase (Epicentre Technologies) verwendet
wurden.
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Beispiel 4
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Analyse der
HNPCC-Familien
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Die
in Tabelle I beschriebenen Marker wurden dann dazu verwendet, sechs
große
HNPCC-Verwandschaften, die vorher mit dem Chromosom 2p in Verbindung
gebracht worden waren, zu analysieren (Peltomaki et al., 1993a).
Zweihundertdreizehn Individuen, einschließlich 56 Mitgliedern, die von
colorectalem oder endometrialem Krebs betroffen sind, wurden untersucht.
Vier der Verwandtschaften waren aus den Vereinigten Staaten, eine
aus Neufundland und eine aus Neuseeland. Um die Zahl der betroffenen
Individuen, die untersucht werden konnten, zu erhöhen, erhielten
wir mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Teile normalen Gewebes
von verstorbenen Individuen und deren gereinigte DNA (Goelz et al.,
1985a). Man fand, daß ein
einzelnes Allel von jedem der dreizehn Marker in jeder der sechs
Familien mit der Krankheit segregierte (d. h., das Allel wurde in über 50%
der betroffenen Individuen gefunden). Kein Allel irgendeines Markers
wurde von den betroffenen Mitgliedern von mehr als drei Verwandschaften
geteilt.
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Vierzehn
der betroffenen Mitglieder enthielten nur eine Teilmenge der erwarteten
Allele und daher hat bei ihnen eine Rekombination zwischen den Markern
119 und 136 stattgefunden. Elf von diesen Individuen schienen einfache,
einzelne Rekombinationsereignisse aufzuweisen. Am aufschlußreichsten
von ihnen war das Individuum 148 der J-Verwandschaft und das Individuum
44 der 621-Verwandschaft
(3). Das Individuum 621-44 behielt offenbar das
mit der Krankheit verbundene Allel bei den Markern distal zu CA5
bei, während
es verschiedene Rekombinationsmöglichkeiten
an näheren
Loci zeigte, weshalb der CA5-Marker an der nahen Begrenzung des
HNPCC-Locus angeordnet
wurde. Das Individuum J-148 behielt offenbar das mit der Krankheit
verbundene Alle bei allen Markern in der Nähe von yh5 bei, während es
Rekombinanten bei yh5 und 119 aufwies, weshalb die distale Begrenzung
bei yh5 angeordnet wurde. Unter der Annahmne, daß das gleiche Gen bei sowohl
der J- als auch bei der 621-Verwandschaft
beteiligt war, wurde vorausgesagt, daß das HNPCC-Gen zwischen den
Markern CA5 und yh5, einem Bereich von ungefähr 2 cM Größe (Tabelle I), angeordnet sein
würde.
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Die
DNA drei betroffener Individuen (C-202, 4-156, 4-92) schien sich zwei Rekombinationen
in dem Bereich unterzogen zu haben. Es gab möglicherweise eine Rekombination
pro Generation, und dieses konnte bei C-202 durch Analyse der DNA
seiner Eltern gezeigt werden; in anderen Fällen war die elterliche DNA
nicht verfügbar.
Allen drei Individuen behielten mit der Krankheit verbundene Allele
bei CA5 und ze3 bei, aber nicht an näheren und distalen Loci (3).
Kombiniert mit den Daten der Patienten mit einzelnen Rekombinationen, legten
die Doppelrekombinationen nahe, daß das HNPCC-Gen zwischen CA5
und ze3 lag, einem Abstand, der geringer war als 2 cM.
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Um
die physikalischen Entfernungen, die CA5, ze3 und yh5 trennen, zu
bestimmen, wurden Metaphasen- und Interphasen-FISH-Analysen durchgeführt. Zwei-Farben-FISH
mit P1-Klonen, die diese Marker enthalten, wurde mit den P1-Klonen
820 und 838 (die entsprechend die Marker CA5 und yh5 enthalten),
die mit Biotin markiert sind und die mit mit Fluorescein-markiertem
Avidin detektiert wurden, und mit dem Klon 836 (der den Marker ze3
enthält),
der mit Spectrum-Orange markiert wurde, durchgeführt (Meltzer et al., 1992).
Die Hybridisierungssignale dieser Marker schienen mit Metaphasechromosomen übereinzustimmen,
was bestätigte,
daß sie
innerhalb eines Intervals von < 1.0
Mb lagen. Als FISH auf Interphasen-Nuclei angewendet wurde, konnten
die relativen Positionen der drei Marker bestimmt werden und die
Abstände
zwischen ihnen geschätzt
werden (Trask et al., 1989). Die Ergebnisse bestätigten, daß die Orientierung der Marker
Telomer-yh5-ze3-CA5-Centromer war (Daten nicht gezeigt). Die direkte
Messung der Entfernung zwischen yh5 und ze3 wurde auf < 0.3 Mb geschätzt, was
mit der Anwesenheit beider dieser Marker auf den YAC-Klonen 4E4
und 1E1 übereinstimmt.
Messungen der 48 Interphasechromosomen stellte eine Schätzung der
Entfernung zwischen ze3 und CA5 auf < 0.8 Mb zur Verfügung, was unabhängig davon
die Bindungsdaten bestätigte.
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Verfahren
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Metaphase-Chromosomen
mit G-Banden wurden mit Mikronadeln aus Glas mikroseziert und mit
PCR amplifiziert, wie es vorher beschrieben wurde (Guan et al.,
1993, Kao und Yu, 1991). Für
die Zwei-Farben-FISH wurde das PCR-Produkt mit Fluorchrom markiert
(Spectrum-Orange,
Imagenetics, Naperville, IL) oder in einer zweiten PCR-Reaktion
biotinyliert. P1-Klone wurden durch Strangbruchtranslation oder
mit degenerierten Oligonukleotidprimern markiert (Guan et al., 1993).
FISH wurde wie vorher beschrieben ausgeführt (Guan et al., 1993) und
mit einem Zeiss Axiophot, der mit einem Dualbandpaßfilter
ausgestattet war, sichtbar gemacht. Zur Analyse der Interphase-FISH-Muster
wurde die Entfernung zwischen den Hybridisierungssignalen bei einer Minimalzahl
von 24 Nuclei gemessen (Trask et al., 1989).
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Beispiel 5
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Gen-Kandidaten
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Auf
der Basis der oben beschriebenen Kartierungsergebnisse, konnten
wir bestimmen, ob ein gegebenes Gen ein Kandidat für HNPCC
war, indem wir seine Position relativ zur CA5-ze3-Domäne bestimmt
haben. Das erste in Betracht gezogene Gen war ein humanes Homolog
des Drosophila SOS-Gens (rückschauend
zusammengefaßt
bei Egan und Weinberg, 1993). Dieses Gen übermittelt in verschiedenen
Eukaryoten Signale von an die Membran gebundenen Rezeptoren auf
dem ras-Pfad. Es wurde als Kandidat in Betracht gezogen, da ein
anderes mit ras-interagierendes
Gen, NF1, ein Syndrom mit der Veranlagung für Krebs verursacht (Viskochil
et al., 1990; Wallace et al., 1990), und SOS wurde auf dem Chromosom
2p16-21 durch in situ-Hybridisierung lokalisiert (Webb et al., 1993).
Unter Verwendung der PCR SOS-Sequenzen aus dem Hybrid-Feld, wurde jedoch
festgestellt, daß SOS
distal zur CA5-yh5-Domäne angeordnet
war (vorhanden im Hybrid Z19, aber nicht in Z29).
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Als
nächstes
untersuchten wir das Interferon induzierbare, RNA-aktivierte Proteinkinasegen
PKR. Es wurde gezeigt, daß dieses
Gen eine Tumorsuppressoreigenschaft hat (rückschauend zusammengefaßt bei Lengyel,
1993) und nahe zu 2p16 angeordnet ist (Hanash et al., 1993). Anfangs
konnten wir PKR nicht von der HNPCC-Domäne ausschließen, und
daher bestimmten wir die Sequenz seiner codierenden Region in zwei Individuen
der HNPCC-Verwandschaft C. Es wurde die Reverse Transkriptase verwendet,
um cDNA der von Lymphoblastoiden stammenden RNA dieser zwei Individuen
zu erzeugen, und eine PCR mit Primern, die für PKR spezifisch sind, wurde
durchgeführt.
Die PKR-Produkte wurden sequenziert, und es wurden keine Abweichungen
von der veröffentlichten
Sequenz innerhalb der codierenden Region bestimmt (Meurs et al.,
1990). Nachfolgende Untersuchungen zeigten, daß das PKR-Gen distal zum yh5-Marker angeordnet
war und daher als Basis der HNPCC ausgeschlossen werden konnte.
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Dann
zogen wir humane Homologe der Reparaturgene der Fehlpaarungen von
MutL und MutS in Betracht, die, wie vorher gezeigt worden war, eine
Mikrosatelliteninstabilität
in Bakterien und Hefen erzeugten, wenn sie unterbrochen waren (Levinson
und Gutman, 1987; Strand et al., 1993). Ein humanes Homolog Kramer
et des Hefe-MutL-bezogenen Gens PMS1 (al., 1989) scheint nicht auf
dem Chromosom 2p angeordnet zu sein (M. Liskay, persönliche Beratung).
Um Homologe von MutS zu bestimmen, verwendeten wir degenerierte
Oligonukleotidprimer, um cDNA von Colonkrebszellinien mit PCR zu
amplifizieren. Die gleichen Primer wurden vorher dazu verwendet,
das Hefe-MSH2-Gen auf Basis seiner MutS-Homologie zu bestimmen (Reenan und Kolodner,
1992). Unter nicht strengen Bedigungen einer PCR, wurde ein Fragment
der erwarteten Größe erhalten,
und diese Fragmente wurden in Plasmidvektoren kloniert. Viele der
Klone enthielten ribosomale RNA-Gene, die reichlich vorhandene Transkripte
mit schwacher Homologie zu den degenerierten Primern darstellen.
Eine Teilmenge der Klone enthielt jedoch Sequenzen, die ähnlich zu
der des Hefe-MSH2-Gens waren, und ein solcher Klon, pNP-23, wurde
weiter ausgewertet. Das humane Gen von welchem dieser Klon stammte, wird
im weiteren als hMSH2 bezeichnet.
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Das
Insert des Klons pNP-23 wurde als eine Sonde in Southern Blots von
DNA somatischer Zellhybride verwendet. Das Insert hybridisierte
mit einem oder mit zwei Fragmenten in der humanen, genomischen DNA,
die entsprechend mit PstI oder EcoRI verdaut wurde, und diese Fragmente
waren im Hybrid Z30, das den größten Teil
des humanen Chromosoms 2p enthält,
vorhanden. Eine Analyse anderer Hybride zeigte, daß das Fragment
in den Hybriden Z11, Z29, L1 und L2, aber nicht in Z12, Y3 oder
Z19 vorhanden war, wobei dadurch das humane MSH2 (hMSH2)-Gen in
einer Region angeordnet wurde, die von den Markern CA18 und 119
begrenzt wurde (Beispiele in 4). Die
in Tabelle I aufgelisteten YAC-Klone wurden dann analysiert, und EcoRI-
und PstI-Fragmente der erwarteten Größe wurden im YAC 5A11, der
vom Screenen der YAC-Bibliothek mit
dem CA5-Marker stammte, bestimmt (4).
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Um
die Southern Blots zu bestätigen,
gestalteten wir nicht-generierte Primer auf Basis der Sequenz von
pNP-23. Verschiedene Gruppen von Primern wurden untersucht, so daß man genomische
DNA als Template für
die PCR verwenden konnte; ein dazwischenliegendes Intron verhinderte,
daß die
ursprünglichen
Primer effektiv mit anderen als cDNA-Templates verwendet werden konnten.
PCR mit diesen Primern stimmte perfekt mit den Ergebnissen des Southern
Blots überein.
Das erwartete 101 bp-Fragment war in den Hybriden Z4, Z11, Z29,
L1 und L2, und im YAC 5A11, aber nicht in anderen Hybriden oder
YAC-Klonen vorhanden (nicht gezeigt).
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Die
Anordnung der hMSH2-Sequenzen im YAC 5A11 zeigte die Nähe dieser
Sequenzen zum Marker CA5. Um die Entfernung und die relative Orientierung
des hMSH2 in Bezug auf CA5 zu bestimmen, nahmen wir eine Interphase-FISH-Analyse vor.
P1-Klone, die CA5, ze3 und hMSH2-Sequenzen
(entsprechend die Klone 820, 836, und M1015) enthalten, wurden gleichzeitig
mit Interphase-Nuclei, im Anschluß das Markieren mit Fluorescein
und Spectrum Orange (Meltzer et al., 1992), hybridisiert. Die Ergebnisse
zeigten, daß MSH2
innerhalb des HNPCC-Locus, der laut Bindungsanalyse zwischen CA5
und ze3 angeordnet ist, und weniger als 0.3 Mb vom Marker CA5 entfernt
liegt (2E).
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cDNA-Bibliotheken,
die aus humanen Colonkrebszellen oder aus humanem, fötalem Hirngewebe
erzeugt wurden, wurden dann mit dem Insert aus pNP-23 gescreent,
um zusätzliche
Sequenzen dieses Gens zu erhalten. Fünfundsiebzig cDNA-Klone wurden
zu Anfang bestimmt und teilweise sequenziert. PCR-Produkte, die
die Enden der cDNA-Sequenz contig darstellen, wurden dann als Vorlagen
verwendet, um nochmal cDNA-Bibliotheken zu screenen. Dieser cDNA-"Walk" wurde mit neuen
contig-Enden erneut wiederholt. Insgesamt wurden 147 cDNA-Klone
bestimmt. Die gemischte Sequenz, die von diesen Klonen stammte,
ist in 5 dargestellt. Ein offener
Leserahmen (ORF) begann 69 nt downstream des 5'-Endes der cDNA contig, und ging 2802
bp weiter. Das Methionin, mit dem dieser ORF anfing, stand in einem
Sequenzzusammenhang, der mit effizienter Translation kompatibel
ist (Kozak, 1986), und ihm gingen in-frame Terminationscodons voran.
RNA aus Placenta und Hirn wurden bei einem auf PCR basierenden Verfahren
(RACE, Frohmann et al., 1988) verwendet, um die Position des 5'-Endes der hMSH2-Transkripte
unabhängig
zu bestimmen. Diese Anlayse zeigte, daß die 5'-Enden aller erfaßbaren Transkripte weniger
als 100 bp upstream der in 5 gezeigten
Sequenz liegen, und heterogen upstream von nt -69 sind. Die Region
der höchsten
Homologie zum Hefe-MSH2-Gen ist in 6 dargestellt.
Diese Region umfaßt
die "Helix-turn-Helix"-Domäne, die
vielleicht für
das Binden von MutS an die DNA verantwortlich ist (Reenan und Kolodner,
1992). Die von Hefe und Menschen stammenden MHS2-Proteine waren
zwischen den Codons 615 und 788 zu 77% identisch. Es gab verschiedene
andere Blöcke ähnlicher
Aminosäuren,
die auf die Länge
dieser zwei Proteine verteilt waren (entsprechend 966 Aminosäuren bei
Hefe und entsprechend 934 beim Menschen).
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Verfahren
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cDNA,
die aus der RNA von colorectalen Krebszellen mit der Reversen Transkriptse
erzeugt wurde, wurde als Template für eine PCR mit den degenerierten
Primern 5'-CTG GAT CCA C(G/A/T/C)G
G(G/A/T/C)C C(G/A/T/C)A A(T/C)A TG-3' und 5'-CTG GAT CC(G/A) TA(G/A) TG(G/A/T/C)
GT(G/A/T/C) (G/A)C(G/A) AA-3' verwendet.
Diese zwei Primer wurden vorher dazu verwendet, das Hefe-MSH2-Gen
zu bestimmen und basierten auf den Sequenzen, die bei verwandten
Säuger-
und bakteriellen Genen konserviert sind (Reenan und Kolodner, 1992).
Die optimalen PCR-Bedingungen
zur Erfassung des humanen MSH2-Gens bestanden aus 35 Zyklen bei
95° für 30 Sekunden,
41° für 90 Sekunden,
und 70° für 90 Sekunden,
in dem vorher beschriebenen Puffer (Sidransky et al., 1991). PCR-Produkte wurden in
Vektoren mit T-Schwanz wie beschrieben (Holton und Graham, 1991)
kloniert und mit einer modifizierten T7 Polymerase (USB) sequenziert.
Das Insert eines Klons (pNP-23), das die zum Hefe-MSH2-Gen homologen
humanen Sequenzen enthielt, wurde dann dazu verwendet, cDNA-Bibliotheken
zu screenen, die aus RNA von SW480 Colonkrebszellen (Clontech) oder
von fötalem Hirn
(Strategene) erzeugt worden waren. Nach zwei weiteren Runden des
Screenens, wurden positive Klone in Plasmide umgewandelt und unter
Verwendung der modifizierten T7 Polymerase (Kinzler et al., 1991)
sequenziert. In eingen Fällen
wurden die Inserts unter Verwendung eines hMSH2-spezifischen Primers und eines Vektor-spezifischen
Primers amplifiziert, und dann mit der SequiTherm Polymerase (Epicentre
Technologies) sequenziert. Um das 5'-Ende der MSH2-Transkripte zu bestimmen,
wurde RACE durchgeführt
(Frohmann et al., 1989), wobei man Hirn- und Placenta-DNA (Clontech)
verwendete.
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Beispiel 6
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Mutation des hMSH2
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Das
physikalische Kartographieren des hMSH2 im HNPCC-Locus war verblüffend, aber konnte nicht nachweisen,
daß dieses
Gen für
die Krankheit verantwortlich ist. Um mehr zwingendes Beweismaterial
zu erhalten, bestimmten wir, ob Keimbahnveränderungen des hMSH2-Gens in
den zwei HNPCC-Verwandschaften vorlagen,
die ursprünglich
eine Verbindung zum Chromosom 2 begründeten (Peltomaki et al., 1993a).
Intron-Exon-Grenzen innerhalb der am meisten konservierten Region
des hMSH2 (6) wurden durch das Sequenzieren
genomischer PCR-Fragmente, die angrenzende Exons enthielten, bestimmt.
Proben genomischer DNA von Lymphozyten betroffener Mitglieder dieser
zwei Verwandtschaften wurden dann als Templates für die PCR
verwendet, um die Sequenz dieser Domäne zu bestimmen. Die DNA des
Individuums J-42, heimgesucht von Colon- und endometrialem Krebs
im Alter von 42, bzw. 44 Jahren, hatte, wie sich herausstellte,
ein Allel mit einer C für
T Transition am Codon 622 (CCA für
CTA), was in einer Substition von Leucin für Prolin resultierte (7, oben). Zwanzig zusätzliche DNA-Proben nicht verwandter
Individuen codierten alle Prolin an dieser Position. Einundzwanzig
Mitglieder der J-Verwandschaft wurde dann durch direktes Sequenzieren
der PCR-Produkte analysiert. Alle elf betroffenen Individuen enthielten
ein Allel mit einer C für
T Transition im Codon 622, während
alle zehn nicht betroffenen Mitglieder zwei normale Allele enthielten,
wodurch eine perfekte Trennung von der Krankheit belegt wurde. Wichtigerweise
war das Prolin an einer hochkonservierten Position, dem identischen
Aufenthaltsort, der in allen bekannten mit MutS verwandten Genen
von Prokaryoten und Eukaryoten gefunden wurde (6 und
Reenan und Kolodner, 1992).
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In
der Verwandschaft C wurden keinen Mutationen der konservierten Region
von MSH2 bestimmt, daher untersuchten wir als nächstes andere Teile des hMSH2-Transkripts. RNA
wurde aus lymphoblastoiden Zellen des Patienten C-202, eines 27
Jahre alten Mannes mit Colonkrebs, gereinigt. Eine mit Reverser
Transkriptase gekoppelte PCR (RT-PCR) wurde dazu verwendet, vier
hMSH2-spezifische
Produkte zu erzeugen, die die Codons 89 bis 934 diser RNA umfaßten (siehe
Experimetelles Vorgehen). Ein anomales, kleineres RT-PCR-Produkt
wurde mit einem der verwendeten Primerpaare bestimmt. Abbildungs-
und Sequenzierungsuntersuchungen unter Verwendung verschiedener
MSH2-Primer zeigten, daß das
anomale Produkt das Ergebnis eines vermutlichen Spleißdefekts
war, der die Codons 265 bis 314 vom hMSH2-Transkript entfernte. Man
fand heraus, daß das
anomale Transkript mit der Krankheit in der C-Verandschaft ausscheidet,
und in zwanzig nicht verwandten Individuen nicht gefunden wurde.
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Als
nächstes
war es unser Wunsch, zu bestimmen, ob hMSH2 in einer der in der
jüngeren
Zeit verbundenen Familien verändert
war (R. P. und M. N-L., unveröffentlichte
Daten), und suchten Verwandschaft 8 für eine genauere Untersuchung
aus. DNA und RNA wurden von lymphoblastoiden Zellen von 8–143, einem
42 Jahre alten Mann mit Colonkrebs, erhalten. Die konservierte Region
des hMSH2 wurde aus genomischer DNA unter Verwendung der PCR amplifiziert
und direkt sequenziert. Eine T für
C Substitution wurde im Polypyrimidintrakt upstream des Exons beim
Codon 669 (an der Intronposition-6) beginnend festgestellt. Jedoch
wurde diese Substitution auch in zwei der zwanzig nicht verwandten,
normalen Individuen gefunden, und war daher ein mit der Krankheit
nicht in Verbindung stehender Polymorphismus, mit einer Allelhäufigkeit
von 0.05. Das meiste der hMSH2 codierenden Region wurde dann mit
RT-PCR amplifiziert, wie oben beschrieben, und es es wurden keine
anomalen Transkripte erfaßt.
Das Sequenzieren der PCR-Produkte legte jedoch eine C für T Transition
am Codon 406 (CGA für
TGA) offen, die eine Substitution eines Terminationscodons zu einem
Argininrest verursachte. RNA wurde von den Lymphozyten eines zweiten
betroffenen Mitglieds der Verwandschaft 8 erhalten und es wurde
das gleiche Stopcodon bestimmt. Diese Veränderung wurde in zwanzig anderen,
nicht verwandten Individuen nicht gefunden.
-
Schließlich war
es unser Wunsch zu bestimmen, ob Mutationen dieses Gens in RER+-Tumoren von Patienten ohne offensichtliche
familiäre
Krebshistorien vorkommen. Die konservierte Region des MSH2 wurde in
vier colorectalen Tumorzellinien solcher Patienten bestimmt, wobei
genomische DNA als Template für
PCR verwendet wurde. Man fand heraus, daß ein Tumor (vom Patient Cx10)
zwei hMSH2-Veränderungen
enthielt. Die erste war eine C für
T Transition im Codon 639 (CAT für
TAT), die in einer Substitution von Tyrosin für Histidin resultierte. Dieser
Austausch wurde in keiner der zwanzig Proben unverwandter Individuen
gefunden, aber sie war in der DNA des normalen Colons dieses Patienten
vorhanden, und es schien daher eine Keimbahnveränderung darzustellen (7, Mitte). Wie die Mutation einer Fehlrichtung
(missense mutation) in der J-Verwandschaft, war die Cx10 Veränderung
an einer in allen MutS-Homologen perfekt konservierten Position (6 und Reenan und Kolodner, 1992). Die
zweite Veränderung
im Tumor von Cx10 war eine Substitution eines GT-Dinukleotids für ein A
im Codon 663 (ATG für
TGTG). Es war vorhergesagt worden, daß die Insertion eines bp eine
Rahmenverschiebung verursacht, die ein Terminationscodon 36 nt downstream
erzeugte. Diese Mutation wurde sowohl in RNA als auch in DNA, die
aus den Cx10-Tumor gereinigt wurden, nachgewiesen, aber sie war
nicht im normalen Colon des Patienten vorhanden, was daher eine
somatische Mutation bedeutete (7,
unten). Die PCR-Produkte vom Cx10 wurden kloniert und sequenziert,
und es wurde gezeigt, daß die
Insertionsmutation am Codon 663 und die Transition am Codon 639
auf verschiedenen Allelen vorliegen.
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Verfahren
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Um
Mutation zu erfassen, wurden PCR-Produkte aus cDNA und humanen,
genomischen DNA-Templates erzeugt, dann direkt sequenziert, wobei
man SequiThermTM verwendete. In einigen
Fällen
wurden die PCR-Produkte in Vektoren mit T-Schwanz zur Sequenzierung kloniert,
um die Daten der direkten Sequenzierung zu bestätigen. Die verwendeten Primer
zur Amplifikation der konservierten Region des MSH2 aus genomischer
DNA waren 5'-CCA
CAA TGG ACA CTT CTG C-3' und
5'-CAC CTG TTC CAT
ATG TAC G-3', was
in einem 1.4 kb-Fragment, das die hMSH2-Codons 614 bis 705 enthielt,
resultierte, und die Primer 5'-AAA
ATG GGT TGC AAA CAT GC-3' und
5'-GTG ATA GTA CTC
ATG GCC C-3', was
in einem 2.0 kb-Fragment, das die MSH2-cDNA-Codons 683 bis 783 enthielt,
resultierte. Die Primer der RT-PCR waren 5'-AGA TCT TCT TCT GGT TCG TC-3' und 5'-GCC AAC AAT AAT
TTC TGG TG-3' für die Codons
89 bis 433, 5'-TGG
ATA AGA ACA GAA TAG AGG-3' und
5'-CCA CAA TGG ACA
CTT CTG C-3' für die Codons
350–705,
5'-CAC CTG TTC CAT ATG
TAC G-3' und 5'-AAA ATG GGT TGC
AAA CAT GC-3' für die Codons
614 bis 783, und 5'-GTG
ATA GTA CTC ATG GCC C-3' und
5'-GAC AAT AGC TTA
TCA ATA TTA CC-3' für die Codons
683–949.
-
Diskussion
-
Drei
Hauptschlußfolgerungen
können
aus den hier beschriebenen Beispielen gezogen werden. Erstens, eine
physikalische Kartographierungs- und Herkunftsanalyse hat den HNPCC-Locus
auf dem Chromosom 2 als ein 0.8 Mb-Segment, das von den Markern CA5 und
ze3 begrenzt ist, lokalisiert. Zweitens wurde ein neues humanes
Homolog des Hefe-MSH2-Gens bestimmt, und es wurde gezeigt, daß dieses
Gen im gleichen 0.8 Mb-Interval liegt. Drittens traten Veränderungen
des hMSH2-Gens in der Keimbahn von Patienten mit RER+-Tumoren,
mit oder ohne klassische HNPCC, auf, und zusätzliche somatische Veränderungen
dieses Gens traten in Tumoren auf (zusammengefaßt in Tabelle I). Die Veränderungen
kamen in hoch konservierten Regionen vor oder veränderten
entscheidend das erwartete Genprodukt und stellten daher Mutationen
mit wichtigen Funktionseffekten dar. Diese Ergebnisse deuten an,
daß Mutationen
des hMSH2 für
HNPCC und den RER+-positiven Phänotyp, der
in Tumoren gefunden wird, verantwortlich sind.
-
Diese
Daten haben wesentliche Auswirkungen auf das Verstehen neoplastischer
Krankheiten, die bei HNPCC beobachtet wurden. Besonders legen sie
nahe, daß die
Mikrosatellitenveränderungen,
die vorher in Tumoren von diesen Patienten beobachtet worden waren,
keine Epiphänomene
sind, sondern intrinsisch mit der Pathogenese in Verbindung zu bringen
sind. Zusätzlich
sind die in mit defekten MutS-verbundenen Gene in Hefen und Bakterien
nicht auf Insertionen und Deletionen einfach wiederholter Sequenzen
beschränkt,
obwohl diese Sequenzen geeignete Hilfsmittel zu Analysezwecken zur
Verfügung
stehen (Modrich, 1991). Ähnlich
würde man
erwarten, daß viele
Mutation zusätzlich
zu Microsatelliteninsertionen oder -deletionen in HNPCC-Tumoren zu finden
wären.
Das könnte
zu vielseitigen, sequenziellen Mutationen in Oncogenen und Tumorsuppressorgenen
führen,
die, wie man gezeigt hat, die colorectale Tumorgenese steuern (Fearon
und Vogelstein, 1990). Daher scheint die molekulare Pathogenese
der HNPCC-Tumore ähnlich
zu der zu sein, die in nicht HNPCC-Fällen auftritt, obwohl sie durch
die erhöhte
Rate der Mutation, die in Verbindung mit Reparaturdefekten bei Fehlpaarungen
steht, angehäuft
wird. Dementsprechend wurde gezeigt, daß Colontumore von HNPCC-Patienten
Mutationen von APC, p53 und RAS in Häufigkeiten enthalten, die ähnlich zu
denen sind, die bei Arten von sporadischem, colorectalem Krebs gefunden
werden (Aaltonen et al., 1993).
-
Colorectale
Tumore von HNPCC-Patienten werden durch ihre relativ normale cytogenetische
Zusammensetzung unterschieden (Kouri et al., 1990), und man hat
gezeigt, daß sporadische
RER+-Tumore wesentlich weniger Chromosomenverluste
haben als jene, die bei RER–-Fällen auftreten (Thibodeau et
al., 1993; Aaltonen et al., 1993). Diese Daten legen nahe, daß genetische
Heterogenität
für die
Entwicklung colorectalen Krebses entscheidend ist, aber auf zwei
Arten erzeugt werden kann (Thibodeau et al., 1993). Meistens entwickelt
sie sich durch grobe Veränderungen,
die in Aneuploidie resultieren, wie es vor achtzig Jahren vorgeschlagen
wurde (Boveri, 1914). In von HNPCC stammenden Tumoren und RER+ sporadischen Tumoren ist die Vielfalt vermutlich
feiner, wobei sie aus verschiedenen kleinen Sequenzveränderungen,
die über
das Genom verteilt sind, besteht. Der spätere Mechanismus der Erzeugung
von Vielfalt kann weniger gefährlich
für den
Wirt, sein, da HNPCC-Patienten, ebensowie Patienten mir RER+ sporadischen Tumoren, eine bessere Prognose, als
nach histopathologischer Analyse ihrer Tumore zu erwarten wäre, zu haben
scheinen (Ionov et al., 1993; Thibodeau et al., 1993; Lothe et al.,
1993; Lynch et al., 1993).
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