DE69633664T2

DE69633664T2 - Genetische marker für brust und eierstockkrebs

Info

Publication number: DE69633664T2
Application number: DE69633664T
Authority: DE
Inventors: Mary-Claire King; Lori Friedman; Beth Ostermeyer; Sarah Rowel; Eric Lynch; Csilla Szabo; Ming Lee
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2016-04-20
Also published as: CA2217668A1; ATE280226T1; AU5566896A; EP0821733A2; EP0821733B1; WO1996033271A2; DE69633664D1; US5821328A; US6512091B1; AU698800B2; ES2231808T3; JPH11503915A; US5622829A; WO1996033271A3; CA2217668C

Description

Gebiet der Erfindung
Bei dem Gebiet der Erfindung handelt es sich um genetische Marker für erbliche Anfälligkeit gegen Brustkrebs.
Hintergrund
Der größte Anteil von erblichem Brustkrebs, der bislang beschrieben wurde, wurde einem genetischen Lokus zugeschrieben, dem BRCA1-Locus auf dem Chromosom 17q21 (Hall et al. 1990 Science 250: 1684–1689; Narod et al. 1991 Lancet 338: 82–83; Easton et al. 1993 Am J Hum Genet 52: 678–701). Hintergrundinformationen über die genetischen Marker für das Brustkrebs-Screening findet man in der Ausgabe vom 29. Januar 1993 von Science, Band 259, speziell Seite 622–625; siehe auch King et al., 1993 J Amer Med Assoc 269: 1975–198. Andere relevante Forschungs-Publikationen beinhalten King (1992) Nature Genet 2: 125–126; Merette et al. (1992) Amer J Human Genet 50: 515–519; NIH/CEPH Collaborative Mapping Group (1992) Science 258: 67–86.
Die Brustkrebs-Risiken für Frauen, welche den Locus erben, sind äußerst hoch, wobei sie 50% vor dem Alter von 50 überschreiten und mit einem Alter von 65 80% erreichen (Newman et al. 1988 Proc Natl Acad Sci USA 85: 3044–3048; Hall et al. 1992 Amer J Human Genet 50: 1235–1242; Easton et al. 1993). Die epidemiologischen Anzeichen für eine ererbte Anfälligkeit gegen Eierstockkrebs sind noch stärker (Cramer et al. 1983, J. Natl. Cancer Inst. 71: 711–716; Schildkraut & Thompson, 1988 Amer. J. Epidemiol. 128: 456–466; Schildkraut et al. 1989, Amer. J. Hum. Genet. 45: 521–529). Gemäß einer Untersuchung lässt sich bei mehr als 90% der Familien mit mehreren Verwandten mit Brust- und Eierstockkrebs die Anfälligkeit für die Krankheit auf das Chromosom 17q21 zurückführen (Easton et al. 1993).
Die Verknüpfung zwischen dem steigenden Risiko von Brust- und Eierstockkrebs und der vererbten Anfälligkeit für diese Krankheiten liegt in der Anwendung der Genetik auf Diagnose und Vorbeugung. Die Erzeugung molekularer Werkzeuge für eine frühere Diagnose und die Entwicklung von Vorgehensweisen zur Umkehrung der ersten Schritte der Krebsentstehung kann der wirkungsvollste Weg zur Bekämpfung von Brust- und Eierstockkrebs sein.
Unser Laboratorium hat früher den Genort für erbliche Anfälligkeit gegen Brustkrebs (BRCA1-Locus) auf eine 50 cM-Region des Chromosoms 17q kartiert (Hall et al. 1990). Noch kürzlicher entwickelten wir neue Polymorphismen bei ERBB2 (Hall und King 1991, Nucl Acids Res 19: 2515), THRA1 (Bowcock et al. 1993, Amer J Human Genet 52: 718–722), EDH17B (Friedman et al. 1993, Hum Molec Genet 2: 821) und mehreren anonymen Loci (Anderson et al., Genomics 17: 616–623), wodurch letztendlich eine Hochdichte-Kartierung von 17q12–q21 entwickelt wurde (Anderson et al. 1993; siehe auch: Simard et al. 1993, Human Molec Genet 2: 1193–1199). Wir fügten auch Familien zur genetischen Untersuchung hinzu; es gibt nun 100 Familien, für welche transformierte Lymphozyten-Linien eingerichtet wurden und von allen informativen Verwandten eine Genotypierung erstellt wurde. Wir verwendeten unsere neuen Marker und die zahlreichen Polymorphismen für das Chromosom 17q, welche in den letzten drei Jahren entwickelt wurden, um die Verknüpfung in unseren Familien zu testen, wobei die Region zuerst auf 8 cM (Hall et al. 1992), dann auf 4 cM (Bowcock et al. 1993), danach auf 1 Mb, basierend auf Polymorphismen aus unserer Hochdichte-Kartierung, eingegrenzt wurde (Anderson et al. 1993; siehe auch Flejter et al. 1993, Genomics 17: 624–631). Wir beschreiben hier eine Anzahl von Mutationen in BRCA1, welche mit der Krankheit in Korrelation stehen.
Relevante Literatur
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für eine BRCA1-cDNA und Familienuntersuchungen dieses Gens wurden beschrieben von Miki et al. (1994) Science 266, 66–71, und Futeal et al. (1994) Science 266, 120–122. Eine Untersuchung von kanadischen Krebs-Familien wird in Simard et al. (1994) Nature Genetics 8, 392–398, beschrieben. Eine kollaborative Untersuchung von BRCA1-Mutationen wird in Shattuch-Eidens et al. (1995) JAMA 273, 535–541, beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung offenbart Verfahren, Nukleinsäuren und Translationsprodukte, nützlich in der Diagnose und Behandlung von Brust- und Eierstockkrebs, assoziiert mit Mutationen und/oder seltenen Allelen von BRCA1, einem Brustkrebs-Anfälligkeitsgen. Spezifische genetische Sonden, welche für die erbliche Anfälligkeit gegen Brustkrebs diagnostisch sind, und Anwendungsverfahren werden vorgesehen. Markierte Nukleinsäuresonden, umfassend Sequenzen, komplementär zu spezifizierten BRCA1-Allelen werden an klinische Nukleinsäureproben hybridisiert. Eine Verknüpfungsanalyse und Vererbungsmuster der beschriebenen Marker werden angewandt, um eine genetische Anfälligkeit zu diagnostizieren. Darüber hinaus werden BRCA1-Mutationen und/oder seltene Allele direkt durch Hybridisierung, Polymorphismus und/oder Sequenzanalyse identifiziert. In einer anderen Ausführungsform werden markierte Antikörper, spezifisch für von den vorliegenden Nukleinsäuren codierte Peptide, verwendet, um Expressionsprodukte von diagnostischen Mutationen oder Allelen in Fluid- oder Gewebeproben, welche aus einem Patienten abgeleitet sind, zu identifizieren. Für ein therapeutisches Eingreifen werden Zusammensetzungen vorgesehen, welche die Transkriptions- oder Translationsprodukte der mit Brust- und Eierstockkrebs-Anfälligkeit assoziierten Mutationen und/oder seltenen Allele innerhalb von BRCA1 funktionell stören können. Derartige Produkte schließen Antisense-Nukleinsäuren, kompetitive Peptide, codiert von den vorliegenden Nukleinsäuren, und Antikörper, spezifisch z. B. für Translationsprodukte der offenbarten BRCA1-Mutationen und -Allele, ein.
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
Wir offenbaren hierin Verfahren und Zusammensetzungen zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von BRCA1-Mutationen und seltenen Allelen oder Translationsprodukten davon, welche in der Diagnose von Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs nützlich sind. Tumorogene BRCA1-Allele schließen das BRCA1-Allel #5803 (SEQ. ID. NR.: 1), 9601 (SEQ. ID. NR.: 2), 9815 (SEQ. ID. NR.: 3), 8403 (SEQ. ID. NR.: 4), 8203 (SEQ. ID. NR.: 5), 388 (SEQ. ID. NR.: 6), 6401 (SEQ. ID. NR.: 7), 4406 (SEQ. ID. NR.: 8), 10201 (SEQ. ID. NR.: 9), 7408 (SEQ. ID. NR.: 10), 582 (SEQ. ID. NR.: 11) oder 77 (SEQ. ID. NR.: 12) ein. Diese Nukleinsäuren oder Fragmente, welche in der Lage sind, in Gegenwart von anderen BRCA1-Allelen einzigartig mit dem entsprechenden Allel unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, finden eine breite diagnostische und therapeutische Anwendung. Genprodukte der offenbarten mutanten und/oder seltenen BRCA1-Allele finden ebenfalls einen weiten Bereich an therapeutischen und diagnostischen Anwendungen. Beispielsweise werden mutante und/oder selten-allelische BRCA1-Peptide zur Erzeugung von Antikörpern verwendet. Antikörper werden diagnostisch verwendet, um nicht-tumorogene Wildtyp- und tumorogene BRCA1-Translationsprodukte zu unterscheiden.
Die vorliegenden Nukleinsäuren (einschließlich Fragmente davon) können einzel- oder doppelsträngig sein und sind isoliert, teilweise gereinigt und/oder rekombinant. Eine "isolierte" Nukleinsäure ist andersartig vorhanden als ein natürlich vorkommendes Chromosom oder Transkript in seinem natürlichen Zustand, und von mindestens einem Nukleotid isoliert (nicht in Sequenz daran verknüpft), mit dem es normalerweise auf einem natürlichen Chromosom assoziiert ist; eine teilweise reine Nukleinsäure macht mindestens etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 30 Gew.-% und weiter bevorzugt mindestens etwa 90 Gew.-% der in einer gegebenen Fraktion vorhandenen Gesamtnukleinsäure aus; und eine rekombinante Nukleinsäure ist in Sequenz an mindestens ein Nukleotid verknüpft, mit welchem es normalerweise auf einem natürlichen Chromosom nicht assoziiert ist.
Fragmente der offenbarten Allele sind ausreichend lang zur Verwendung als spezifische Hybridisierungssonden zum Nachweisen endogener Allele und insbesondere zum Unterscheiden der offenbarten kritischen seltenen oder mutanten Allele, welche mit Krebsanfälligkeit korreliert sind, von anderen BRCA1-Allelen, einschließlich Allelen, codierend für das BRCA1-Translationsprodukt, abgebildet in Miki et al. (1994) siehe oben, unter stringenten Bedingungen. Bevorzugte Fragmente sind in der Lage zum Hybridisieren an das entsprechende mutante Allel unter Stringenzbedingungen, charakterisiert durch einen Hybridisierungspuffer, umfassend 0% Formamid in 0,9 M Kochsalzlösung/0,09 M Natriumcitrat(SSC)-Puffer, bei einer Temperatur von 37°C und Gebundenbleiben bei Unterziehen an Waschen bei 42°C mit dem SSC-Puffer bei 37°C. Weiter bevorzugte Fragmente werden in einem Hybridisierungspuffer, umfassend 20% Formamid in 0,9 M Kochsalzlösung/0,09 M Natriumcitrat(SSC)-Puffer, bei einer Temperatur von 42°C hybridisieren und bei Unterziehen an eine Waschung bei 42°C mit 2 × SSC-Puffer bei 42°C gebunden bleiben. In jedem Fall besitzen die Fragmente notwendigerweise eine ausreichende Länge, um für das entsprechende Allel einzigartig zu sein; d. h. es liegt eine Nukleotidsequenz vor, die wenigstens lang genug ist, um ein neues Oligonukleotid zu definieren, üblicherweise mit einer Länge von mindestens etwa 14, 16, 18, 20, 22 oder 24 bp, obwohl ein solches Fragment in Sequenz an andere Nukleotide verknüpft sein kann, bei welchen es sich um Nukleotide handeln kann, die das Fragment natürlicherweise flankieren.
In vielen Anwendungen sind die Nukleinsäuren mit direkt oder indirekt nachweisbaren Signalen oder Mitteln zur Verstärkung eines nachweisbaren Signals markiert. Beispiele schließen radioaktive Markierungen, lumineszente (z. B. fluoreszente) Markierungen, Komponenten von verstärkten Markierern, wie Antigen-markiertem Antikörper, Biotin-Avidin-Kombinationen etc. ein. Die Nukleinsäuren können einer Reinigung, Synthese, Modifikation, Sequenzierung, Rekombination, einem Einbau in eine Vielzahl von Vektoren, einer Expression, Transfektion, Verabreichung oder Anwendungsverfahren unterzogen werden, welche in Standard-Handbüchern, wie Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith und Stuhl, Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY, NY, 1992) offenbart oder welche anderweitig im Fachgebiet bekannt sind.
Die vorliegenden Nukleinsäuren werden in einer großen Vielzahl von Nukleinsäure-basierenden diagnostischen Verfahren angewandt, welche dem Fachmann bekannt sind. Beispielhafte Verfahren schließen ihre Verwendung als Allel-spezifische Oligonukleotidsonden (ASOs), in Ligase-vermittelten Verfahren zum Nachweisen von Mutationen, als Primer in PCR-basierenden Verfahren, direkten Sequenzierungsverfahren, worin die klinische BRCA1- Nukleinsäuresequenz mit den offenbarten Mutationen und seltenen Allelen verglichen wird, etc. ein. Die vorliegenden Nukleinsäuren sind in der Lage, die Gegenwart einer kritischen Mutante oder eines seltenen BRCA1-Allels in einer Probe nachzuweisen und das mutante oder seltene Allel von anderen BRCA1-Allelen zu unterscheiden. Falls die vorliegenden Nukleinsäuren zum Beispiel als PCR-Primer oder Hybridisierungssonden verwendet werden, umfaßt der vorliegende Primer oder die vorliegende Sonde ein Oligonukleotid, komplementär zu einem Strang des mutanten oder seltenen Allels, von einer ausreichenden Länge, um einzigartig mit dem mutanten oder seltenen Allel zu hybridisieren. Im allgemeinen umfassen diese Primer und Sonden mindestens 16 bp bis 24 bp, komplementär zu dem mutanten oder seltenen Allel, und können so groß sein, wie es für die Hybridisierungsbedingungen zweckmäßig ist.
Falls die kritische Mutation eine Deletion von Wildtyp-Sequenz ist, erfordern nützliche Primer/Sonden Wildtyp-Sequenzen, flankierend (beide Seiten) der Deletion mit mindestens 2, üblicherweise mindestens 3, noch üblicher mindestens 4, am üblichsten mindestens 5 Basen. Wo die Mutation eine Insertion oder Substitution ist, welche etwa 20 bp übersteigt, ist es im allgemeinen nicht notwendig, Wildtyp-Sequenz in die Sonden/Primer einzuschließen. Für Insertionen und Substitutionen von weniger als 5 bp, umfassen und flankieren bevorzugte Nukleinsäureabschnitte die Substitution/Insertion mit mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3, weiter bevorzugt mindestens 4, am stärksten bevorzugt mindestens 5 Basen. Für Substitutionen oder Insertionen von etwa 5 bis etwa 20 bp, ist es üblicherweise notwendig, die gesamte Insertion/Substitution und mindestens 2, üblicherweise mindestens 3, noch üblicher mindestens 4, am üblichsten mindestens 5 Basen Wildtyp-Sequenz von mindestens einer Flanke der Substitution/Insertion einzuschließen.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung als diagnostische genetische Sonden und Primer werden BRCA1-Nukleinsäuren verwendet, um eine Vielzahl von Gen-basierenden Therapien auszuführen; siehe z. B. Zhu et al. (1993) Science 261, 209–211; Gutierrez et al. (1992) Lancet 339, 715–721; Gary Nabel lab (Dez. 1993), Proc. Nat'l. Acad Sci USA. Beispielsweise werden therapeutische Nukleinsäuren verwendet, um die zelluläre Expression oder die intrazelluläre Konzentration oder Verfügbarkeit eines tumorogenen BRCA1-Translationsproduktes durch Einbringen von Komplementen der offenbarten Nukleinsäuren in Zellen zu modulieren. Diese Nukleinsäuren sind typischerweise einzelsträngige Antisense-Sequenzen, umfassend Komplemente der offenbarten relevanten BRCA1-Mutante. Die Antisense-Modulation der Expression einer gegebenen Mutante kann Antisense-Nukleinsäuren, funktionstüchtig verknüpft an genregulatorische Sequenzen, anwenden. Die Zellen werden mit einem Vektor transfiziert, umfassend eine solche Sequenz mit einer Promotor-Sequenz, welche derartig orientiert ist, daß die Transkription des Gens ein Antisense-Transkript ergibt, das zum Binden an das endogene tumorogene BRCA1-Allel oder -Transkript in der Lage ist. Die Transkription der Antisense-Nukleinsäure kann konstitutiv oder induzierbar sein, und der Vektor kann eine stabile extrachromosomale Beibehaltung oder eine Integration vorsehen. Alternativ dazu können einzelsträngige Antisense-Nukleinsäuren, welche an genomische BRCA1-DNA oder mRNA binden, an die Zielzelle, in einem Wirt oder zeitweilig daraus isoliert, bei einer Konzentration verabreicht werden, welche zu einer wesentlichen Verringerung der Expression des angezielten Translationsproduktes führt.
Verschiedene Techniken können für die Einführung der Nukleinsäuren in lebensfähige Zellen angewandt werden. Die Techniken variieren in Abhängigkeit davon, ob man die vorliegenden Zusammensetzungen in Kultur oder in vivo in einem Wirt verwendet. Verschiedene Techniken, welche als effektiv befunden wurden, schließen die Transfektion mit einem Retrovirus, die von einem Virushüllprotein-Liposom vermittelte Transfektion ein, siehe Dzau et al., Trends in Biotech 11, 205–210 (1993). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nukleinsäurequelle mit einem Mittel auszustatten, welches auf die Zielzellen hinlenkt, wie einen Antikörper, spezifisch für ein Oberflächenmembranprotein auf der Zielzelle, einem Liganden für einen Rezeptor auf der Zielzelle, etc. Falls Liposomen verwendet werden, können Proteine, welche an ein mit Endocytose assoziiertes Oberflächenmembranprotein binden, für das Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z. B. Capsidproteine oder Fragmente davon, welche für einen besonderen Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, welche beim Cyclieren einer Internalisierung unterliegen, Proteine, welche eine intrazelluläre Lokalisierung steuern und die intrazelluläre Halbwertszeit erhöhen. In Liposomen wird die "Decoy"-Konzentration im Lumen im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 μM bis 20 μM liegen. Für andere Techniken wird die Anwendungsrate empirisch bestimmt unter Verwendung herkömmlicher Techniken zur Bestimmung gewünschter Bereiche. Üblicherweise wird die Anwendung der vorliegenden Therapeutika lokal sein, so daß diese an die Stelle von Interesse verabreicht werden. Es können verschiedene Techniken zur Zuführung der vorliegenden Zusammensetzungen an die Stelle von Interesse angewandt werden, wie Injektion, Verwendung von Kathetern, Trocaren, Projektilen, Pluronic-Gel, Stents, Polymeren mit verzögerter Arzneimittelfreisetzung oder andere Vorrichtungen, welche einen Zugang nach innen vorsehen. Die systemische Verabreichung der Nukleinsäure unter Verwendung von Lipofektion, Liposomen mit Gewebe-Targeting (z. B. Antikörper), kann ebenfalls eingesetzt werden.
Es werden auch isolierte Translationsprodukte der beschriebenen BRCA1-Allele vorgesehen, welche sich von dem Wildtyp-BRCA1-Genprodukt unterscheiden. Beispielsweise wird für Allele, welche das trunkiene tumorogene Translationsprodukt codieren, der C-Terminus verwendet, um sich vom Wildtyp-BRCA1 zu unterscheiden. Folglich wird das Translationsprodukt von BRCA1-Allel #5803 (SEQ. ID. NR.: 13), 9601 (SEQ. ID. NR.: 14), 9815 (SEQ. ID. NR.: 15), 8203 (SEQ. ID. NR.: 17), 388 (SEQ. ID. NR.: 18), 6401 (SEQ. ID. NR.: 19), 4406 (SEQ. ID. NR.: 20), 10201 (SEQ. ID. NR.: 21), 7408 (SEQ. ID. NR.: 22), 582 (SEQ. ID. NR.: 23) oder 77 (SEQ. ID. NR.: 24), oder ein C-Terminus-Fragment davon, welches einzigartig für das Allel ist, und jenes von #8403 (SEQ. ID. NR.: 16) oder ein Fragment davon, welches einzigartig für das Allel ist, umfassend Gly an der Position 61, vorgesehen.
Die vorliegenden mutanten und/oder selten-allelischen BRCA1-Translationsprodukte umfassen eine Aminosäuresequenz, welche ein Ziel für das Unterscheiden des Produktes von demjenigen anderer BRCA1-Allele vorsieht. Bevorzugte Fragmente sind in der Lage, die Herstellung eines Peptid-spezifischen Antikörpers, in vivo oder in vitro, hervorzurufen, und in der Lage, ein Protein, umfassend das immunogene Peptid, von einem Widtyp-BRCA1-Translationsprodukt zu unterscheiden. Die Fragmente sind notwendigerweise einzigartig für das Translationsprodukt des offenbarten Allels dahingehend, daß es nicht in irgendeinem früher bekannten Protein gefunden wird und eine Länge besitzt, welche wenigstens ausreichend lang ist, um ein neues Peptid zu definieren, von etwa 5 bis etwa 25 Resten, vorzugsweise 6 bis 10 Resten Länge, abhängig von der jeweiligen Aminosäuresequenz.
Die vorliegenden Translationsprodukte (einschließlich Fragmenten) sind entweder isoliert (d. h. nicht begleitet von wenigstens einem gewissen Teil des Materials, mit welchem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind); teilweise gereinigt, d. h. sie machen wenigstens etwa 1 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 10 Gew.-% und weiter bevorzugt mindestens etwa 50 Gew.-% des Gesamttranslationsproduktes in einer gegebenen Probe aus; oder rein, d. h. sie machen mindestens etwa 60 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 80 Gew.-% und weiter bevorzugt mindestens etwa 90 Gew.-% des gesamten Translationsproduktes aus. Eingeschlossen im vorliegenden Translationsprodukt-Gewicht sind jedwede Atome, Moleküle, Gruppen etc., welche kovalent an die vorliegenden Translationsprodukte gekoppelt sind, wie nachweisbare Markierungen, Glycosylierungen, Phosphorylierungen etc. Die vorliegenden Translationsprodukte können isoliert, gereinigt, modifiziert oder an andere Verbindungen verknüpft sein, und zwar in einer Vielfalt von dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Weisen in Abhängigkeit davon, welche anderen Komponenten in der Probe vorhanden sind, und an welche Art von Einheit, falls vorhanden, das Translationsprodukt kovalent verknüpft ist.
Antikörper, welche für die offenbarten tumorerzeugenden BRCA1-Gene und -Genprodukte spezifisch sind, finden besondere Anwendung in der Krebsdiagnose. Das ausgewählte Diagnoseverfahren wird von der Natur des tumorogenen mutanten/seltenen BRCA1-Allels und dessen Transkriptions- oder Translationsprodukt(en) abhängen. Zum Beispiel können lösliche sezernierte Translationsprodukte der offenbarten Allele in einer Vielzahl von physiologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Antikörpers mit einer nachweisbaren Markierung, wie einer radioaktiven Markierung, einem fluoreszierenden Mittel etc., nachgewiesen werden. Der Nachweis von membrangebundenen oder intrazellulären Produkten erfordert im allgemeinen die vorbereitende Isolierung von Zellen (z. B. Blutzellen) oder Gewebe (z. B. Brust-Biopsiegewebe). Eine große Vielzahl spezifischer Bindungsassays, z. B. ELISA, kann angewandt werden.
Die offenbarten mutanten und/oder selten-allelischen BRCA1-Translationsprodukte werden als Immunogene verwendet, um spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen; siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, für allgemeine Verfahren. Spezifische Antikörper werden leicht zu einer monovalenten Form, wie Fab, Fab' oder Fv, modifiziert.
Die folgenden Beispiele werden auf dem Wege der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angeboten.
Beispiele
Beispiel 1. Positionale Klonierung
Contig-Konstruktion
YACs. Primer, welche polymorphe Wiederholungen in der 4-Mb-Region der Verknüpfung flankierten, wurden verwendet, um Pools aus den verfügbaren Bibliotheken CEPH, Washington University, und CEPH megaYAC zu amplifizieren. Es wurden 39 YACs selektiert. Von diesen wurden 23 mittels FISH hinsichtlich Chimärismus getestet, und von 12 wurde festgestellt, chimär zu sein. Die YACs wurden durch die Vorgehensweise, jedes YAC mit Primerpaaren aus bekannten "sequence-tagged" Stellen (STSes) zu amplifizieren, miteinander aligniert. Es wurden mehrere STSe durch Sequenzieren der Enden von YACs definiert, und diese neuen STSe wurden für eine weitere Alignierung und YAC-Identifikation verwendet.
Cosmide. Eine Raster- bzw. Gitternetz-Cosmid-Bibliothek des Chromosoms 17 wurde hergestellt. Alu-Alu-PCR-Produkte von YACs wurden an die Cosmid-Raster hybridisiert, und positiv hybridisierende Cosmide wurden für anschließende Untersuchungen verwendet. Contigs wurden auf zwei Weisen konstruiert. Cosmide mit den gleichen Restriktionsmustern wurden aligniert bzw. parallel übereinandergestellt; und die einzigartigen Sequenzen, welche polymorphe Marker flankieren, und unsere sequenzierten cDNAs wurden als STSe verwendet.
Physikalische Kartierung durch Pulsfeld-Gelelektrophorese. Die physikalischen Abstände wurden durch Pulsfeld-Gelelektrophorese geschätzt, wobei DNA aus Lymphozyten-Zelllinien aus mit BRCA1 verknüpften Patienten und aus Kontrollen verwendet wurde. Die DNA-Proben wurden mit NotI, MluI, RsrII, NruI, SacII und EclXI verdaut. Die Filter wurden mit aus Cosmiden isolierten Einzelkopie-Sequenzen und später mit cDNA-Klonen sondiert. Mehrere nicht-verwandte verknüpfte Patienten und Kontrollen wurden gescreent, um große Insertionen oder Deletionen nachzuweisen, welche mit BRCA1 assoziiert sind. Die Ergebnisse der PFGE wurden verwendet, um die zuerst zum Screenen von cDNA-Bibliotheken verwendete Region auf ~1 Mb und die vorliegende verknüpfte Region als < 500 kb zu definieren.
Screening von cDNA-Bibliotheken. Wir starteten das Bibliotheks-Screening, als die durch meiotische Rekombination definierte, verknüpfte Region sich auf ~1 Mb belief. Die erste Frage war, welche Bibliothek die Länge von cDNA-Klonen, die Repräsentation sowohl der 5'- als auch 3'-Enden von Genen und die Wahrscheinlichkeit, das BRCA1 exprimiert wird, optimieren würde. Wir treffen die Wahl, eine Zufalls-geprimte cDNA-Bibliothek, kloniert in lgt 10 aus kultivierten (nicht-transformierten) Fibroblasten einer menschlichen Frau, zu verwenden. Diese Bibliothek wurde ausgewählt, weil sie Inserts von durchschnittlich 1,8 kb mit 80% der Inserts zwischen 1 und 4 kb aufwies und weil sie aus kultivierten Fibroblasten konstruiert worden war, welche bekanntermaßen "unzuverlässig" hinsichtlich der Genexpression waren, und sie bekannterweise die 5'-Enden von Genen einschloß. Gleichzeitig screenten wir drei weitere Bibliotheken (aus Eierstock, fötalem Gehirn und Maus-Brustdrüsen-Epithel). Mit einer Ausnahme (nachstehend beschrieben) zeigten alle Transkripte aus diesen Bibliotheken eine Kreuzhybridisierung an Transkripte aus der Fibroblasten-Bibliothek.
Die Fibroblasten-Bibliothek wurde mit YAC-DNA, isoliert mittels PFGE, gescreent. Reine YAC-DNA (100 Nanogramm) wurde sowohl mit aP32-dATP (6000 mCi/mmol) als auch ³²P-dCTP (3000 mCi/mmol) Zufalls-geprimt und unmittelbar nach der Markierung verwendet. Filter von der Bibliothek wurden 24–48 Stunden lang mit humaner Placenta-DNA vorhybridisiert. Markierte YAC-DNA wurde 48 Stunden lang bei 65°C an die Filter hybridisiert. Es wurden ungefähr 250 Transkripte durch Screenen mit 7 YACs selektiert und danach kreuzhybridisiert. Wir verwendeten ebenfalls Pools von Cosmiden aus der verknüpften Region, um die Fibroblasten-Bibliothek zu screenen. Wir selektierten 122 Transkripte und führten eine Kreuzhybridisierung mit diesen an zuvor durch die YACs detektierte Klone durch.
Beispiel 2. Klonierung von BRCA1 und Charakterisierung desselben
A. Screening hinsichtlich Mutationen in Kandidaten-Genen.
Anfangs identifizierten wir 24 Gene in der 1 Mb großen BRCA1-Region, welche durch meiotische Rekombination definiert wurde, jeweilige Lokalisierungen auf dem YAC-Contig, Größen von repräsentativen cDNA-Klonen, Zahlen von Replikaten bzw. Wiedervorkommen in der Bibliothek, Größen von Transkripten, Homologien zu bekannten Genen und detektierten Varianten. Kandidaten-Gene wurden auf den folgenden Wegen charakterisiert:

(1) Kreuzhybridisierende Klone. Aus der Bibliothek isolierte cDNA-Klone werden gegeneinander hybridisiert. Kreuz-hybridisierende Klone werden als "Geschwister" des als Sonde verwendeten Klons angesehen und repräsentieren dasselbe Gen.
(2) Rück-Kartierung. Mindestens ein Klon aus jeder Geschwisterschaft wird auf die gesamte humane genomische DNA, auf Cosmide, auf YACs und auf somatische Zellhybrid-Linien zurückkartiert, von denen einige Deletionen von 17q enthalten, und von denen einer das Chromosom 17 als sein einziges humanes Chromosom enthält.
(3) Subklonierung und Sequenzierung. Einer der längsten Klone aus jeder Geschwisterschaft wird in M13 subkloniert und manuell durch Standardverfahren sequenziert, wobei neue Primer am Ende von jedem Fragment konstruiert werden, um das Sequenzieren fortzusetzen, bis das Ende des Klons erreicht ist.
(4) Erweiterung von Sequenzen mit "sibs". Um Klone zu finden, welche mehr von dem Gen enthalten, werden der letzte Sequenzierungsprimer für den Kon und Primer, welche aus λgt10 hergestellt wurden, verwendet, um "sibs" bzw. Geschwister des ersten Klons zu amplifizieren. Sibs, welche die längsten Fragmente amplifizieren, werden selektiert, subkloniert und sequenziert. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis wir die durch Northern-Blot definierte Größe des Transkripts erreichen und/oder bis die 3'-Sequenz ein polyA-Schwanz ist und die 5'-Sequenz Kennzeichen des Beginns der codierenden Region aufweist.
(5) Southerns. Um Insertions- oder Deletionsmutationen zu identifizieren, werden genomische DNA aus 20 nicht-verwandten Patienten aus Familien mit Brustkrebs, verknüpft mit 17q (d. h. "verknüpfte Patienten"), und Kontrollen mit BamI/TaqI und unabhängig mit HindIII/HinfI verdaut. Jeder cDNA-Klon wird verwendet, um Southern-Blots zu screenen. Varianten sind in zwei Genen nachgewiesen worden. Beide von diesen Varianten sind RFLPs, welche in gleicher Häufigkeit in den verknüpften Patienten und in Kontrollen vorkommen.
(6) Northerns. Um Splicing-Mutationen und/oder Längenmutationen zu identifizieren, stellten wir Gesamt-RNA und polyA+-RNA aus Keimbahn-DNA (aus Lymphoblasten-Linien) von 20 nicht verwandten verknüpften Patienten, aus Eierstock- und Brustgeweben, aus Fibroblasten, aus einer HeLa-Zellinie und aus Brustkrebs-Zelllinien her. Die Northern-Blots werden mit jedem Gen gescreent.
(7) Nachweis kleiner Mutationen. Um hinsichtlich Keimbahn-Punktmutationen in Patienten ohne Antreffen von Introns zu screenen, stellten wir cDNA aus poly-A+-mRNA aus Lymphoblasten-Zelllinien von 20 nicht-verwandten verknüpften Patienten und aus Kontrollen her. cDNA wurde auch in 65 Fällen von bösartigem Eierstock-Krebs aus Patienten hergestellt, welche nicht hinsichtlich der Familiengeschichte selektiert worden waren. Primer werden alle ~200 Basenpaare entlang der Sequenz konstruiert und verwendet, um diese cDNAs zu amplifizieren. Genomische DNA ist auch aus Zelllinien von allen Familienmitgliedern (verknüpft und nicht-verknüpft), aus bösartigen und normalen Zellen aus Paraffinblöcken aus deren Brust- und Eierstocks-Chirurgieproben und aus bösartigen und normalen Zellen aus 29 Brusttumoren, welche nicht hinsichtlich der Familiengeschichte selektiert worden waren, präpariert worden. Für Sequenzen ohne Introns sind die cDNA- und gDNA-Längen gleich, und die gDNA-Proben werden ebenfalls amplifiziert. Zwei Mutations-Nachweisverfahren werden angewandt, um jede Sequenz zu screenen. Amplifizierte Produkte werden hinsichtlich SSCPs unter Anwendung von Modifikationen gescreent, welche die Durchführung einer Elektrophorese mit lediglich einem Satz an Betriebsbedingungen ermöglichen (Keen et al. 1991, Trends Genet 7: 5; Soto und Sukumar 1992, PCR Meth. Appl. 2: 96–98). Um längere Segmente von DNA (100 – 1500 bp) zu screenen und von der SSCP ausgelassene Varianten nachzuweisen, werden die Sequenzen ebenfalls mittels CCM hinsichtlich Punktmutationen gescreent (Cotton 1993, Mutation Res. 285: 125–144), wobei im wesentlichen das Protokoll von Grompe et al. 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86: 5888–5892, angewandt wird. Eine für den Fehlpaarungs-Nachweis entwickelte Endonuklease reduziert die Toxizität des Verfahrens (Youil et al. 1993, Amer. J. Hum. Genet. 53 (Ergänzung): Zusammenfassung 1257).
(8) Polymorphismus oder Mutation. Varianten werden in Fallbeispielen und Kontrollen gescreent, um Polymorphismen von einer kritischen Mutation zu unterscheiden. Die Verknüpfung von Brustkrebs mit jeder Variante wird in allen informativen Familien getestet.

Beispiel 3. Charakterisierung von BRCA1-Mutationen in Keimbahn-DNA und Tumoren von Brustkrebspatienten
A. BRCA1-Mutationen in mit dem Chromosom 17q verknüpften Familien
Unsere Serie von Familien schließt 20 ausgedehnte Verwandtschaften ein, in welchen Brust- und Eierstockskrebs (und in einer Familie Prostata-Krebs) mit 17q21 bei individuellen Iod-Bewertungen > 1,5 verknüpft sind. Da verknüpfte Patienten in diesem Familien Mutationen in BRCA1 tragen, haben wir ihre Mutationen zuerst identifiziert.
Die Tabelle 1 faßt kritische Mutationen und seltene Allele von BRCA1 zusammen:
B. Keimbahn-BRCA1-Mutationen unter Brustkrebspatienten in der allgemeinen Bevölkerung
Aus jedem Brustkrebspatienten, nicht selektiert hinsichtlich Familiengeschichte, wird eine 30-ml-Probe Vollblut in Säure-Citrat-Dextrose abgenommen. DNA aus dem Blut wird extrahiert und in 3 Aliquots bei –70°C aufbewahrt. Keimbahn-Mutationen in BRCA1 werden unter Anwendung der obenstehend beschriebenen Vorgehensweisen und durch direktes Sequenzieren neuer Mutationen identifiziert. Paraffin-eingebettete Tumorproben aus demselben Patienten werden hinsichtlich Änderungen von p53, HER2, PRAD1 und ER gescreent. Keimbahn-BRCA1-Mutationen werden in den Tumor-Blöcken überprüft.
Eine vorläufige Einschätzung des Risikos, welches mit verschiedenen BRCA1-Mutationen assoziiert ist, wird aus den Verwandten von Patienten mit Keimbahn-Änderungen erhalten. Für jeden Patienten mit einer Keimbahn-BRCA1-Mutation, jede überlebende Schwester und Mutter (und für ältere Patienten ebenfalls Brüder) wird DNA aus einer Blutprobe extrahiert und hinsichtlich des Vorhandenseins der BRCA1-Mutation des Probanden getestet. Um eine Bestätigung bei Männern mit Prostatakrebs-Risiko vorzunehmen, werden auch von Brüdern von Brustkrebs-Patienten, mit Diagnose nach einem Alter von 55, Interviews und Proben erhoben. Paraffinblöcke von verstorbenen Verwandten, welche Krebs hatten, werden ebenfalls gescreent. Die Häufigkeit von Brust-, Eierstock- und Prostatakrebs unter Verwandten, welche BRCA1-Mutationen tragen, ist eine erste Schätzung des Risikos dieser Krebsarten, welche mit verschiedenen Mutationen assoziiert sind.
C. Somatische Änderungen von BRCA1 bei Brusttumoren
Bösartige Zellen werden von normalen Zellen aus Paraffinblocks herausgeschnitten. Durch Identifizieren von BRCA1-Mutationen in diesen Serien, schätzen wir die Häufigkeit von somatischen BRCA1-Änderungen ein, bestimmen BRCA1-Mutationen, welche für jede einzelne Stufe der Tumorentwicklung charakteristisch sind, und bewerten deren Assoziation mit der Prognose.
D. Charakterisieren von mutanten und seltenen Allelen von BRCA1
Die Funktion eines mutanten oder seltenen BRCA-1-Allels und dessen Expressionsmuster während der Entwicklung werden unter Verwendung von transformierten Zellen, welche das Allel exprimieren, und Knock-Out-Mäusen oder transgenen Mäusen charakterisiert. Beispielsweise werden phänotypische Änderungen im Tier oder der Zellinie, wie Wachstumsrate und Verankerungs-Unabhängigkeit, bestimmt. Darüber hinaus werden mehrere Verfahren angewandt, um Funktionsverlust-Mutationen zu untersuchen, einschließlich dem Ersetzen normaler Genen durch ihre mutanten Allele (BRCA1-/BRCA1-) mittels homologer Rekombination in Embryo-Stammzellen (ES) und der Ersetzung mutanter Allele mit ihren normalen Gegenstücken in differenzierten, kultivierten Zellen (Capecchi 1989, Science 244: 1288–1292; Weissman et al. 1987, Science 236: 175–180; Wang et al. 1993, Oncogene 8: 279–288). Brustkarzinom-Zellinien werden hinsichtlich Mutation am BRCA1-Lokus gescreent, und eine mutante BRCA1-Linie wird selektiert. Normale und mutante cDNAs von BRCA1 werden in einen Expressionsvektor subkloniert, der Gene trägt, welche Resistenz gegen Ampicillin und Geneticin vermitteln (Baker et al., 1990, Nature 249: 912–915). Subklone werden in mutante BRCA1-Brustkrebszellen transfiziert. Geneticin-resistente Kolonien werden isoliert und hinsichtlich jeglicher Änderung im tumorerzeugenden Phänotyp, wie Kolonie-Bildung in Weichagar, erhöhter Wachstumsrate und/oder Tumorbildung in athymischen Nacktmäusen untersucht. Funktionionelle Demonstrationen in vivo beinhalten das Einführen des normalen BRCA1-Gens in eine Brustkarzinom-Zelllinie, die an BRCA1 mutant ist, und das Injizieren dieser BRCA1+-Zellen in Nacktmäuse. Änderungen, die im tumorerzeugenden Wachstum im Vergleich zu Nacktmäusen beobachtet werden, welche mit hinsichtlich BRCA1 mutierten Brustkarzinom-Zellen injiziert wurden, sind leicht zu beobachten. Zum Beispiel verringert das Korrigieren des mutanten Gens das Vermögen der Brustkarzinom-Zellen, Tumoren in Nacktmäusen zu bilden (Weissman et al. 1987; Wang et al. 1993).
Alle in dieser Beschreibung zitierten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch den Bezug darauf einbezogen, als ob jede einzelne Veröffentlichung und Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch den Bezug darauf einbezogen gekennzeichnet wäre. Obwohl die vorausgehende Erfindung in einiger Ausführlichkeit auf dem Wege der Veranschaulichung und mit Beispielen aus Zwecken der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden ist, wird es dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet angesichts der Lehren dieser Erfindung ohne weiteres offensichtlich sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Sinn oder Umfang der beigefügten Patentansprüche abzuweichen.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isolierte Nucleinsäure, umfassend BRCA1-Allel #5803 (SEQ ID NO: 1), 9601 (SEQ ID NO: 2), 9815 (SEQ ID NO: 3), 388 (SEQ ID NO: 6) oder ein Fragment davon, wobei das Fragment in der Lage ist, in Gegenwart von Wildtyp BRCA1 einzigartig mit dem Allel zu hybridisieren.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend BRCA1-Alle) #5803 (SEQ ID NO: 1) oder ein Fragment davon, wobei das Fragment in der Lage ist, in Gegenwart von Wildtyp BRCA1 einzigartig mit dem Allel zu hybridisieren.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend BRCA1-Alle) #9601 (SEQ ID NO: 2) oder ein Fragment davon, wobei das Fragment in der Lage ist, in Gegenwart von Wildtyp BRCA1 einzigartig mit dem Allel zu hybridisieren.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend BRCA1-Alle) #9815 (SEQ ID NO: 3) oder ein Fragment davon, wobei das Fragment in der Lage ist, in Gegenwart von Wildtyp BRCA1 einzigartig mit dem Allel zu hybridisieren.
Isolierte Nucleinsäure, umfassend BRCA1-Allel #388 (SEQ ID NO: 6) oder ein Fragment davon, wobei das Fragment in der Lage ist, in Gegenwart von Wildtyp BRCA1 einzigartig mit dem Allel zu hybridisieren.
Isoliertes Translations-Produkt von BRCA1-Allel #5803 (SEQ ID NO: 13), 9601 (SEQ ID NO: 14), 9815 (SEQ ID NO: 15), 388 (SEQ ID NO: 18) oder ein C-Terminus-Fragment davon, das für das Allel einzigartig ist.
Isoliertes Translations-Produkt von BRCA1-Allel #5803 (SEQ ID NO: 13) oder ein C-Terminus-Fragment davon, das für das Allel einzigartig ist.
Isoliertes Translations-Produkt von BRCA1-Allel #9601 (SEQ ID NO: 14) oder ein C-Terminus-Fragment davon, das für das Allel einzigartig ist.
Isoliertes Translations-Produkt von BRCA1-Allel #9815 (SEQ ID NO: 15) oder ein C-Terminus-Fragment davon, das für das Allel einzigartig ist.
Isoliertes Translations-Produkt von BRCA1-Alle) #388 (SEQ ID NO: 18) oder ein C-Terminus-Fragment davon, das für das Allel einzigartig ist.
Verfahren zum Diagnostizieren der Krebs-Anfälligkeit eines Patienten, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst Zusammenbringen einer zweiten Nucleinsäure nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 mit einer Probe, die von dem Patienten isoliert worden ist und eine erste Nucleinsäure umfasst, enthaltend mindestens ein BRCA1-Alle) oder ein Fragment davon, unter Bedingungen, bei denen die zweite Nucleinsäure in der Lage ist, spezifisch mit der ersten Nucleinsäure zu hybridisieren; Nachweisen des Auftretens oder Nicht-Auftretens einer spezifischen Hybridisierung der zweiten Nucleinsäure mit der ersten Nucleinsäure; wobei das Auftreten einer spezifischen Hybridisierung der zweiten Nucleinsäure mit der ersten Nucleinsäure ein Diagnosezeichen für eine Krebs-Anfälligkeit ist.
Verfahren zum Diagnostizieren der Krebs-Anfälligkeit eines Patienten, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst Zusammenbringen eines Antikörpers, der für ein Protein davon spezifisch ist, oder ein C-terminales Fragment davon nach Anspruch 6, 7, 8, 9 oder 10 mit einer Zusammensetzung, die von dem Patienten isoliert worden ist und ein Translations-Produkt von mindestens einem BRCA1-Allel enthält, unter Bedingungen, bei denen der zweite Antikörper in der Lage ist, spezifisch mit dem Translatationsprodukt zu binden; Nachweisen des Auftretens oder Nicht-Auftretens einer spezifischen Bindung von Komplexen des Antikörpers und des Translatationsproduktes, wobei das Vorhandensein des Komplexes mit einer Krebs-Anfälligkeit zusammenhängt.