DE69433915T2

DE69433915T2 - MDC-Proteine und dafür kodierende DNS

Info

Publication number: DE69433915T2
Application number: DE69433915T
Authority: DE
Inventors: Yusuke Nakamura; Mitsuru Bunkyo-ku Emi
Original assignee: Eisai Co Ltd; Cancer Institute
Current assignee: Cancer Institute; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1993-05-14
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2014-05-14
Also published as: US5705341A; US5631351A; EP0633268A3; EP0633268B1; EP0633268A2; DE69433915D1; US5552526A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft MDC-Proteine, DNA, die diese kodieren, und Genanalyseverfahren unter Verwendung der DNA. Die Erfindung kann auf den Gebieten der medizinischen Behandlung und Diagnose eingesetzt werden.
Stand der Technik
Die Auffassung, dass Mutationen in zellulären Proteinen eine wichtige Rolle beim Krebsausbruch spielen, ist seit langem bekannt. Erkenntnisse in der Biotechnologie ermöglichen die Analyse von Genmutationen in Tumorzellen und führte zu einem markanten Fortschritt auf dem Gebiet der Krebsforschung.
Bis zu diesem Zeitpunkt sind die Analyse und Identifizierung von Onkogenen einem solchen Fortschritt unterlegen gewesen, dass sich die Zahl derer auf mehrere Dutzend beläuft. Auf der anderen Seite hat sich seit mehreren Jahren die Aufmerksamkeit auf tumorunterdrückende Gene gerichtet. Die tumorunterdrückenden Gene, die entdeckt worden sind, schließen bisher das Rb-Gen für Retinoblastoma (S. H. Friend et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9095, 1987), das p53-Gen (D. P. Lane et al., Nature, 278, 261, 1979) und das APC-Gen (W. K. Kenneth et al., Science, 253, 661, 1991) für kolonrektalen Tumor, das WT1-Gen für Wilms-Tumor (K. M. Call et al., Cell 60, 509, 1990) und dergleichen ein. Im Fall des p53-Gens ist bei einigen Familien bekannt, dass es sich um inhärente Mutationen in dem Gen handelt ["Li-Fraumenisyndrom" (D. Makin et al., Science, 250, 1233, 1990; S. Scrivastava et al., Nature, 348, 747, 1990)]. Darüber hinaus wird immer klarer, dass Defekte in mehreren Genen und nicht nur in einem Gen an dem Fortschritt des malignanten Krebsphänotyps teilhaben, und es wird angenommen, dass es wesentlich mehr nicht identifizierte Onkogene und Tumorunterdrückungsgene gibt. Deren Entdeckung und Aufklärung wird nicht nur von Forschern und Ärzten erwartet, sondern von Menschen in der gesamten Welt.
Brustkrebs wird klassifiziert in erblichen (familiären) Brustkrebs und nicht-erblichen (sporadischen) Brustkrebs, wobei erblicher Brustkrebs in früh-beginnende und spät-beginnende Erkrankungen gemäß dem Ausbruchsalter klassifiziert wird. Es wurde durch Kopplungsanalysen festgestellt, dass mindestens früh-ausbrechender familiärer Brustkrebs mit einem sehr kleinen Bereich auf dem Chromosom 17 verbunden ist (J. M. Hall et al., Science, 250, 1684–1689, 1990). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass erblicher Eierstockkrebs mit dem gleichen Bereich verbunden ist (S. A. Narod et al., Lancet, 338, 82–83, 1991).
Demzufolge wird angenommen, dass ein Tumorunterdrückungsgen in diesem Bereich vorhanden ist und Proteinmangel oder Mutation der durch eine Allelendeletion oder Mutation des Gens ausgelöst wird, eine der Ursachen von Brust- und Eierstockkrebs ist.
Es wird angenommen, dass beim Ausbruch von weit verbreitetem (sporadischem) Brustkrebs das Auftreten einer erworbenen Mutation oder Allelendeletion des Gens in diesem Bereich auch in einer Proteinmutation oder -mangel resultiert, und dies die Transformation einer normalen Zelle in eine Brustkrebszelle verursacht (Sato et al., Cancer Res., 51, 5794–5799, 1991). Demzufolge werden die Isolierung des verursachenden Gens, das in diesem Bereich vorhanden ist, und die Identifizierung des Proteins, das durch das Gen kodiert wird, nicht nur für Ärzte sondern auch Forscher auf der ganzen Welt, als dringend aufzuklärend angesehen, sondern auch von Menschen, insbesondere Frauen, in Europa und Amerika, wo es eine Vielzahl von Patienten mit Brustkrebs gibt.
Die Erfindung betrifft neue Proteine, die am Brustkrebs und Eierstockkrebs beteiligt sind, DNA, die diese kodieren, und Verfahren zur Untersuchung und Diagnose von Krebs unter Verwendung derselben.
Die Erfinder offenbaren ein neues Gen, das ein Protein mit 524-Aminosäuren kodiert und das aus dem chromosomalen Bereich 17q21.3 von dem angenommen wird, dass sich dort ein Tumorunterdrückungsgen/-gene für Brust- und Eierstockkrebs befindet, isoliert wurde (Nature genetics, 5, 151–157, 1993; auf dieses Dokument ist in Nature genetics, 5, Nr. 2, 101–102, 1993 Bezug genommen).
Offenbarung der Erfindung
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Positionen auf dem Chromosom 17 zeigt, an die 342 Cosmidklone hybridisieren. Die Klonnamen sind nur durch Klonzahlen gekennzeichnet.
2 ist ein Diagramm, das Teildeletionen auf dem Chromosom 17q bei Eierstockkrebs zeigt. Ausgefüllte Kreise stellen den Verlust der Heterozygosität (LOH) dar, und offene Kreise stellen die Beibehaltung beider Allele dar. Zwei häufig deletierte Bereiche sind durch Seitenlinien dargestellt.
3 ist ein Diagramm, das Teildeletionen auf dem Chromosom 17q bei Brustkrebs zeigt. Ausgefüllte Kreise stellen den Verlust der Heterozygosität (LOH) dar, und offene Kreise stellen die Beibehaltung beider Allele dar. Zwei häufig deletierte Bereiche sind durch Seitenlinien gekennzeichnet.
4 ist ein Diagramm, das Verfahren beginnend mit Markern auf dem Chromosom 17q21.3 bis zur Isolierung des Gens zeigt, sowie die Bereiche, an denen Genomumordnungen in Tumorgeweben auftraten (gestrichelte Kästchen). Klonnamen sind nur durch Klonzahlen angegeben.
5–7 sind Diagramme, die den Nachweis von Genomumordnungen bei Brustkrebs durch Southern-Blot-Analyse zeigen. Die Symbole N und T stellen DNA jeweils aus normalem Gewebe und Tumorgewebe dar.
8 ist ein Diagramm, das eine Arbeitskurve zur Bestimmung der Konzentration des MDC-Proteins durch ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers und eines polyklonalen Antikörpers vom Kaninchen zeigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder haben eine Vielzahl von Cosmidklonen mit DNA-Fragmenten des menschlichen Chromosoms 17, die darin eingeführt wurden, hergestellt. Anschließend wurde jeder der Vielzahl von Cosmidklonen über das Chromosom hinweg durch Fluoreszenz in-situ-Hybridisierung lokalisiert (FISH; Inazawa et al., Genomics, 10, 1075–1078, 1991). Die Cosmidklone (Cosmidmarker), die sich auf Chromosom befinden, ermöglichten die Herstellung einer hochaufgelösten physikalischen Karte des menschlichen Chromosoms 17. Die Klonnamen der Cosmide als Sonden, d. h. die Sondennamen, ihre genaue Kartenpositionen und diagrammatische Zusammenfassung des Kartierens sind jeweils in Tabellen 1–3 und 1 gezeigt. In 1 werden Klonnamen nur durch Klonnummern bezeichnet.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
Unter diesen Markern wurden solche, die Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) entfalten, wobei sich die Längen der Restriktionsfragmente im Individuum unterscheiden, nämlich RFLP-Marker, ausgewählt. Die ausgewählten Markerklone, die verwendeten Restriktionsenzyme und die bestimmten Längen der verschiedenen hierdurch nachgewiesenen Fragmente sind in Tabellen 4–6 gezeigt.
Tabelle 4
Tabelle 5
Tabelle 6
RFLP-Marker sind dadurch gekennzeichnet, dass sie verwendet werden können, um zwischen zwei von den Eltern vererbten Allelen durch den Unterschied im Polymorphismus ("informativ") zu unterscheiden [sie sind dagegen nicht unterscheidbar, wenn beide das gleiche polymorphe Muster aufweisen ("nicht-informativ")]. Wenn ein solcher Unterschied in polymorphen Mustern zwischen zwei Allelen ("Heterozygosität") in normalen Geweben vorkommt und der Verlust der Heterozygosität (LOH) im Tumorgewebe nachweisbar ist, wird dadurch die Alleldeletion in der RFLP-Markerstelle auf einem spezifischen Chromosom des Tumorgewebes impliziert. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass die Inaktivierung eines Tumursuppressionsgens auf beiden Allelen, wie es durch die Deletion eines Allels und die Mutation des anderen verursacht wird, zu einer malignanten Transformation führen kann. Folglich wird angenommen, dass ein Tumorsuppressionsgen in einem Bereich vorhanden ist, der häufig in vielen Krebsarten deletiert ist.
Unter Verwendung der detaillierten Chromosomenkarte und der so erhaltenen RFLP-Marker untersuchten die Erfinder ungefähr 300 Brustkrebse und ungefähr 100 Eierstockkrebse auf LOH im Chromosom 17. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass bei informativen Fällen ein Bereich (2,4 cM lang), der zwischen den Cosmidmarkern cCI17-701 und cCI17-730 liegt, und der sich in der Nähe von 17q21 befindet, mit hoher Frequenz deletiert war.
2 zeigt Teildeletionen auf dem Chromosom 17q bei Eierstockkrebs. Die gefüllten Kreise stellen den Verlust der Heterozygosität (LOH) dar, und die offenen Kreise stellen die Retention beider Allele dar. Zwei häufig deletierte Bereiche sind durch Seitenlinien bezeichnet.
3 zeigt Teildeletionen auf Chromosom 17q bei Brustkrebs. Die ausgefüllten Kreise stellen den Verlust der Heterozygosität (LOH) und die offenen Kreise stellen die Retention beider Allele dar. Zwei häufig deletierte Bereiche sind durch Seitenlinien gekennzeichnet.
Einer der häufig deletierten Bereiche überlappt teilweise mit dem Bereich, in dem die Gegenwart eines verursachenden Gens durch Kopplungsanalysen von Familien, bei denen erblicher Brustkrebs auftrat, angenommen worden war. Bei der Untersuchung von 650 Fällen von sporadischem Brustkrebs auf somatische Umordnung durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Cosmiden, die sich im überlappenden Bereich befinden, als Sonden, wurde festgestellt, dass ein Teilbereich in der DNA des Cosmidklons cCI17-904, der wie oben beschrieben ausgewählt worden war, Amplifizierung nachwies. Bei näherer Untersuchung dieser Änderungen wurde festgestellt, dass Segmente von ungefähr 6–9 kb Länge miteinander verbunden waren, um eine abnormale Wiederholung, bestehend aus ungefähr 4–6 Kopien zu bilden. Darüber hinaus wurde ein Gen, das ein neues Protein kodiert, durch Screenen von cDNA-(DNA mit einer komplementären Basensequenz, die umgekehrt von Messenger-RNA transkribiert ist)Bibliotheken isoliert, wobei als Sonde ein Restriktionsfragment dieses Cosmidklons mit einer Sequenz, die unter diesen Arten konserviert ist, verwendet wurde. Durch die Bestimmung der Sequenzstruktur dieses Gens und der Gegenwart oder Abwesenheit von Genomänderungen in diesem Gen bei Brustkrebs wurde eine unterschiedliche Genmutation identifiziert. Diese Ergebnisse haben ergeben, dass der Mangel oder die Mutation in diesem Protein und die Alleldeletion oder Mutation der DNA, die diese kodiert, an dem Ausbruch von Brust- und Eierstockkrebs stark beteiligt ist.
4 zeigt das oben beschriebene Verfahren, das mit einer Gruppe von Markern beginnt und zur Isolierung des Gens führt, sowie die Bereiche, in denen Genomänderungen in Tumorgeweben auftraten. Die Klonnamen sind durch Klonnummern allein bezeichnet.
Die Erfindung ist sehr wichtig, da sie Verfahren und Materialien bereitstellt, um schwierige Probleme zu lösen (wie Risikodiagnose, frühes Auffinden, Beobachten des Verlaufs, Bestimmung des Behandlungsplans und Schätzung der Prognose) betreffend mindestens einen Teil von Brust- und Eierstockkrebs, z. B. durch Untersuchung der Gegenwart oder Abwesenheit, des Verlusts (Fehlens) oder der Mutation in dem erfindungsgemäßen Protein oder der Gegenwart oder Abwesenheit der Alleldeletion oder Mutation in dem Gen, das es kodiert, wodurch ein deutlicher Fortschritt in der Technologie auf diesem Gebiet erbracht wird.
Genauer gesagt, betrifft die Erfindung (1) ein MDC-Protein, dargestellt durch eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 gezeigt, (2) eine DNA, die das obige MDC-Protein kodiert, dargestellt durch SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO. 7, (3) ein Plasmid, enthaltend die DNA, wie oben unter (2) ausgeführt, ein Transformant, der das Plasmid trägt, d. h. ein Transformant, transformiert mit dem Plasmid, und ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen MDC-Proteins, das die Schritte des Kultivierens des oben beschriebenen Transformanten und des Sammelns des resultierenden Expressionsproduktes umfasst, (4) einen Antikörper, der speziell an das oben beschriebene MDC-Protein als Antigen binden kann und (5) einen Primer oder eine Sonde, die eine DNA-Sequenz aufweist, die eine DNA-Sequenz umfasst, die komplementär mit 17 Basen der DNA-Sequenz, wie unter (2) aufgeführt ist, und ein Genanalyseverfahren, das den Schritt des Hybridisierens des oben beschriebenen Primers oder der Sonde an eine zu untersuchende DNA umfasst.
Der Ausdruck "MDC-Protein" in dieser Beschreibung bedeutet ein Protein und ein Peptid (einschließlich ein Oligopeptid und ein Polypeptid), das an der Definition des Ausdrucks "das MDC-Protein" beteiligt ist.
Darüber hinaus wird die Anwendbarkeit der Erfindung durch die nachfolgende detaillierte Beschreibung deutlich. Es ist verständlich, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele nur beispielhaft anzusehen sind, und bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen zeigen, unterschiedliche Änderungen und Modifizierungen der Erfindung sind jedoch für den Fachmann bei Betrachtung der detaillierten Beschreibung offensichtlich.
Die Erfindung wird hiernach genau beschrieben.
Genaue Beschreibung der Erfindung
(1) Isolierung von cDNA-Klonen
Cosmidklone mit einer DNA, die vom humanen Chromosom 17 abstammen, das darin eingeführt ist, können hergestellt werden z. B. durch Extrahieren chromosomaler DNA aus einer humanen-Maushybridzelllinie, enthaltend ein einzelnes humanes Chromosom 17 in einem Mausgenomhintergrund und Einführen von Fragmenten der chromosomalen DNA in einen Vektor, wie pWEX15, gemäß einem von Tokino et al. berichteten Verfahren (Tokino et al., Am. J. Hum. Genet., 48, 258–268, 1991). Unter diesen können Klone mit einem Insert, das von dem humanen Chromosom abstammt, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung der gesamten humanen DNA als Sonde ausgewählt werden.
Die Kartenposition jedes Cosmidklons kann durch FISH bestimmt werden. Anschließend können sie als Marker verwendet werden, um eine hochaufgelöste physikalische Chromosomenkarte zu erstellen. Darüber hinaus können RFLP-Marker auf Basis des Fragmentlängenmusters bei der Southern-Blot-Analyse ausgewählt werden (Nakamura et al., Am. J. Hum. Genet., 43, 854–859, 1988). Wenn diese Karte und diese RFLP-Marker eingesetzt werden, um DNA zu untersuchen, die aus Tumorgeweben von Krebspatienten auf LOH (Verlust der Heterozygosität) erhalten wurden, kann der häufig deletierte Bereich auf dem Chromosom auf einen kleinen Bereich in der Nähe von q21 des Chromosoms 17 eingegrenzt werden.
Southern-Blot-Analysen der DNA aus Tumorgeweben unter Verwendung eines Cosmidklons, dessen hybridisierbarer Teil in diesem lokalisierten Bereich vorhanden ist, als Sonde ermöglicht, Klone mit einer DNA-Sequenz auszuwählen, die mit Genomänderungen in Tumorgeweben verbunden sind. Darüber hinaus ermöglichen Southern-Blot-Analysen chromosomaler DNA aus verschiedenen Säugern unter Verwendung von Restriktionsfragmenten des Cosmidklons als Sonden das Auswählen eines Fragments, das eine DNA-Sequenz enthält, die unter den Arten konserviert ist und an fundamentalen zellulären Wirkungen beteiligt ist. DNA-Sequenzen, die wichtige Proteine kodieren, sind häufig unter anderen Arten konserviert. In der Tat, sind viele der bisher isolierten Gene für erbliche Krankheiten unter den Arten konserviert (K. M. Call et al., Cell, 60, 509–520, 1990).
Wenn das so erhaltene DNA-Fragment als Sonde eingesetzt wird, kann die cDNA, die sich in einem lokalisierten Bereich in der Nähe von q21 des humanen Chromosoms 17 befindet, kloniert werden. Die Basensequenz dieser cDNA kann auf herkömmliche Weise bestimmt werden (J. Maniatis et al., Molecular Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989).
Zur Bestätigung, dass die so erhaltenen DNA-Klone Klone des gewünschten begründenden Gens sind, können ihre Sequenzen verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Genomänderungen bei Krebspatienten und das Auftreten von Genomänderungen gemäß dem SSCP-Verfahren (M. Orita et al., Genomics, 5, 874–879, 1984; M. Orita et al., Cell, 60, 509–520, 1990), dem RNase-Schutzverfahren (E. Winter, M. Perucho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575–7579, 1985; R. M. Myers et al., Science, 230, 1242–1246, 1985) und anderen Verfahren zu untersuchen.
(2) Bestätigung der Gesamtstruktur des Gens
Es wurde bestätigt, dass die DNA-Sequenzen beider cDNA, die durch das oben beschriebene Verfahren erhalten wurden, neu sind und den DNA entsprechen, die durch SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 dargestellt sind. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind ebenfalls identifiziert worden als solche der Proteine, die durch SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 dargestellt sind. Darüber hinaus haben 5'-RACE und RT-PCR die DNA-Sequenz der durch die SEQ ID NO: 8 dargestellten DNA ergeben, und die Aminosäuresequenz des Proteins, das durch die SEQ ID NO: 4 dargestellt ist, wurde als eine entsprechende DNA-Sequenz abgeleitet. Im Hinblick auf Genom-DNA wurde darüber hinaus die Struktur der DNA, dargestellt durch SEQ ID NO: 9, einschließlich von Intronen und Exonen, ermittelt durch Analysieren der Basensequenz des ursprünglichen Cosmidklons cCI17-904 und Vergleichen desselben mit der Basensequenz des isolierten cDNA-Klons, um die Intron-Exon-Verbindungen zu bestimmen.
Von den vorliegenden Erfindern werden Proteine, die die Gesamt- oder einen Teil der Aminosäuresequenz des durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Proteins umfasst, welches eine Aminosäuresequenz ist, die alle oben beschriebenen Proteine gemein haben, MDC-Proteine genannt, und werden hiernach als MDC-Proteine bezeichnet.
Der Ausdruck "ein Teil des Proteins" bedeutet z. B. ein Polypeptid mit oder umfassend eine Aminosäuresequenz, bestehend aus kontinuierlich mindestens drei Aminosäuren, die in SEQ ID NO: 1 beschrieben ist.
Die Aminosäuresequenz besteht bevorzugt aus mindestens drei bis fünf Aminosäuren, bevorzugt aus mindestens acht oder mindestens acht bis zehn Aminosäuren und am meisten bevorzugt aus mindestens elf bis zwanzig Aminosäuren.
Der Ausdruck "im wesentlichen äquivalent" bedeutet, wie er hier verwendet wird, dass bei Proteinen, umfassend den gesamten oder einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins, die z. B. durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, ihre Aminosäuresequenzen mit einem Austausch, einer Deletion und/oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäure(n) versehen ist, aber die gleiche Wirkung in der Forschung und Diagnose unter Verwendung der Proteine, umfassend die gesamte oder einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins, das z. B. durch SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, erzeugen. Solche Äquivalente fallen ebenfalls in den erfindungsgemäßen Umfang und werden auch MDC-Proteine genannt.
Die DNA-Sequenz, die allen DNA gemein ist, die MDC-Proteine kodieren, ist eine DNA, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt ist.
Eine DNA gemäß der Erfindung kann bei der Genanalyse und Diagnose eingesetzt werden. Das heißt, ein Primer oder eine Sonde, umfassend einen Teil der DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA oder umfassend eine DNA-Sequenz, die mit einem Teil der DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA komplementär ist, wird bei der Genanalyse und Diagnose verwendet.
Ein Teil der DNA-Sequenz besteht aus mindestens 6 Basen, bevorzugt mindestens 8 Basen, weiter bevorzugt 10–12 Basen, und insbesondere bevorzugt ungefähr 15–25 Basen. Das heißt, das Oligonukleotid, das als Primer oder Sonde verwendet wird, umfasst mindestens 6 Basen, die von der DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA abstammen, oder von der DNA-Sequenz, die mit der DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA komplementär ist, und, wenn notwendig, eine andere Base/Basen abstammt.
In Verbindung mit der erfindungsgemäßen DNA hat der Ausdruck "im wesentlichen äquivalent" die gleiche Bedeutung, wie oben für Proteine beschrieben, außer das ihre Basensequenzen einen Austausch, eine Deletion und/oder Insertion ein oder mehrerer Basen beinhalten.
Die Einführung von Austausch-, Deletions- und Insertions-Mutationen in eine bestimmte Basensequenz können gemäß einem herkömmlichen Verfahren erreicht werden, einschließlich solcher, die in F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Kapitel 8, 1987 beschrieben sind.
Das MDC-Protein, das durch die erfindungsgemäße DNA kodiert wird, d. h. das MDC-Protein gemäß der Erfindung, kann unter Verwendung desselben als Epitop eingesetzt werden, um einen Antikörper herzustellen. Dieser Antikörper kann bei experimentellen und diagnostischen Reagenzien verwendet werden. Der Ausdruck "Epitop" bedeutet eine antigene Determinante eines Polypeptids und setzt sich im allgemeinen aus mindestens 5 Aminosäuren zusammen. Es ist gut bekannt, dass ein Polypeptid, zusammengesetzt aus 6 Aminosäuren, an einen Antikörper bindet, wie z. B. in der veröffentlichten Japanischen Übersetzung der Internationalen Patentanmeldung Nr. 60-500684 offenbart.
(3) Rekombinante Expressionsvektoren und Transformanten, die hierdurch erzeugt werden
Ein Transformant kann erhalten werden durch Einführen einer DNA, die humanes MDC-Protein kodiert, das durch das oben beschriebene Verfahren erhalten worden ist, oder eines Fragmentes davon in einen geeigneten Vektor und Einführen dieses Vektors in geeignete Wirtszellen. Durch Kultivieren dieses Transformanten auf eine herkömmliche Art und Weise können größere Mengen humanem MDC-Protein aus der Kultur erhalten werden. Genauer gesagt, kann ein rekombinanter Expressionsvektor hergestellt werden durch Verbinden einer DNA, die ein humanes MDC-Protein oder ein Fragment davon oder eines Fragments davon, an der stromabwärts liegenden Seite des Promotors eines Vektors, der sich zur Expression eignet, gemäß einem gut bekannten Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase. Einsetzbare Vektoren umfassen z. B. Plasmide pRB322 und pUC18, die von Escherichia coli abstammen, das Plasmid pUB110, das vom Bacillus subtilis abstammt, das Plasmid pRB15, das von Hefe abstammt, die Phagenvektoren λgt10 und λgt11, und der Vektor SV40, der von einem Tiervirus abstammt. Der verwendete Vektortyp unterliegt keiner bestimmten Beschränkung, solange er sich im Wirt vermehrt und amplifiziert. Auch der Promotor und Terminator unterliegen keiner bestimmten Beschränkung, solange sie mit dem Wirt kompatibel sind, der zur Expression der DNA-Basensequenz, die humanes MDC-Protein kodiert, kompatibel sind. Sie können in einer geeigneten Kombination in Abhängigkeit des Wirts eingesetzt werden. Die verwendete DNA kann jede DNA sein, die humanes MDC-Protein kodiert. Sie ist nicht beschränkt auf Basensequenzen, dargestellt durch SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9, sondern kann jede DNA sein, bei der ein Teil der Basensequenz einem Austausch einer Deletion, Insertion oder einer Kombination davon, unterlegen ist, gleichgültig ob mit Absicht oder nicht. Zusätzlich können chemisch synthetisierte DNA ebenfalls verwendet werden.
Ein Transformant wird durch Einführung des so erhaltenen rekombinanten Expressionsvektors in einen Wirt gemäß dem kompetenten Zellverfahren (J. Mol. Biol., 53, 154, 1970), dem Protoplastenverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), dem Calciumphosphatverfahren (Science, 221, 551, 1983), dem in vitro-Packungsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975) oder dem Virusvektorverfahren (Cell, 37, 1053, 1984) erzeugt. Der verwendete Wirt kann Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefe oder können Tierzellen sein, und der resultierende Transformant wird in einem geeigneten Medium in Abhängigkeit des Wirts wachsen gelassen. Der Transformant wird gewöhnlich bei einer Temperatur von 20 bis 45°C und einem pH von 5 bis 8 wachsen gelassen, wahlweise durch Belüftung und Rühren. Die Trennung und Reinigung des MDC-Proteins aus der Kultur kann unter Verwendung einer geeigneten Kombination von gut bekannten Trennungs- und Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Diese gut bekannten Verfahren umfassen das Aussalzen, Lösungsmittelausfällung, Dialyse, Gelfiltrierung, Elektrophorese, Ionenaustauscher-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Hochdruckumkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und dergleichen.
(4) Herstellung von Antikörpern
Antikörper können auf eine Weise unter Verwendung eines Antigens hergestellt werden, dessen Epitopteil ein MDC-Protein umfasst. Zum Beispiel kann ein polyklonaler Antikörper durch z. B. vollständiges Immunisieren eines Tieres, z. B. einer Maus, eines Meerschweinchens und Kaninchens über eine Vielzahl von subkutanen, intramuskulären, intraperitonealen oder intravenösen Injektionen des oben beschriebenen Antigens hergestellt werden, Sammeln von Blut aus diesem Tier und Trennen des Serums daraus. Im Handel erhältliche Adjuvanzien können auch verwendet werden.
Ein monoklonaler Antikörper kann z. B. durch Immunisieren einer Maus mit dem oben beschriebenen Antigen, Fusionieren von Milzzellen mit im Handel erhältlichen Myelomzellen der Maus zur Herstellung eines Hybridoms und Sammeln eines Antikörpers aus dem Kulturüberstands des Hybridoms oder der Aszites der mit dem Hybridom geimpften Maus hergestellt werden.
Das MDC-Protein, das als Antigen verwendet wird oder das verwendet wird, um ein Antigen herzustellen, braucht nicht unbedingt die gesamte Aminosäurestruktur aufzuweisen, die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 aufgeführt ist, sondern kann eine Teilstruktur der Aminosäuresequenz aufweisen, die in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 beschrieben ist. Alternativ kann das MDC-Protein eine Variante oder ein Derivat des MDC-Proteins, dargestellt durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3, sein. Das Antigen kann ein MDC-Protein als solches sein oder ein Fusionspeptid, bestehend aus einem MDC-Protein (einschließlich einem Peptid) und einem anderen Peptid. Die Herstellung des Fusionspeptids kann durchgeführt werden gemäß biologischer oder chemischer Syntheseverfahren.
Die Antikörper ermöglichen die Identifizierung und Bestimmung des MDC-Proteins, das in humanen biologischen Proben enthalten ist und kann folglich als Reagens zur Diagnose von Krebs und dergleichen eingesetzt werden.
Die immunologische Bestimmung des MDC-Proteins kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren erfolgen. Zum Beispiel kann jedes fluoreszierende Antikörperverfahren, das passive Agglutinationsverfahren und das Enzym-Antikörperverfahren eingesetzt werden.
(5) Genanalyse von humanen Tumorgeweben
Die biologischen Proben, die zur Genanalyse verwendet werden können, umfassen humane normale Gewebe und verschiedene Arten von humanen Tumorgeweben sowie humanes Blut, humane Körperflüssigkeiten, humane Sekretion und dergleichen. Die Extraktion und Herstellung der DNA kann durchgeführt werden z. B. gemäß dem Verfahren von Sato et al. (T. Sato et al., Cancer Res., 50, 7184, 1990).
Die Gegenwart oder Abwesenheit von Mutationen des Gens kann untersucht werden unter Verwendung eines Restriktionsfragments der DNA, die humanes MDC-Protein kodiert, wie es durch die Erfindung bereitgestellt wird, als Sonde oder durch Auswählen einer Basensequenz der DNA, die sich in einer geeigneten Position befindet, Synthetisieren eines Oligonukleotids mit der ausgewählten Basensequenz und Verwenden des Oligonukleotids als Primer.
Diese Analysen können auch andere Änderungen, wie eine Insertion und Deletion des Gens in den Proben nachweisen.
Die zu diesem Zweck ausgewählten Basensequenzen können Exonteile, Intronteile oder Verbindungsteile dazwischen sein. Es versteht sich, dass künstlich modifizierte Basensequenzen verwendet werden können. Wenn eine künstlich modifizierte Basensequenz verwendet wird, um Primer herzustellen, kann die entsprechende Genmutation durch Genanalyse nachgewiesen werden.
Die Analysen können z. B. durchgeführt werden durch Amplifizieren einer Teilsequenz durch PCR unter Verwendung von zwei ausgewählten Sequenzen als Primer und Analysieren der Basensequenz dieses Amplifikationsprodukts direkt oder durch Einführen des Amplifikationsprodukts in ein Plasmid auf die gleiche Weise, wie oben beschrieben ist, Transformieren der Wirtszellen mit diesem Plasmid, Kultivieren der transformierten Zellen, und Analysieren der Basensequenz des so erhaltenen Klons. Alternativ kann die Gegenwart oder Abwesenheit bestimmter Mutationen des Gens in Proben direkt durch die Verwendung des Ligasekettenreaktionsverfahrens (Wu et al., Genomics, 4, 560–569, 1989) und darüber hinaus des Mutantensequenz-spezifischen-PCR-Verfahrens (Ruano und Kidd, Nucleic Acid Research, 17, 8392, 1989; C. R. Newton et al., Nucleic Acid Research, 17, 2503–2517, 1989) nachgewiesen werden.
Unter Verwendung von Sonden, die davon ausgewählte DNA-Sequenzen oder davon abgeleitete RNA-Sequenzen enthalten, können in ähnlicher Weise Punktmutationen durch das SSCP-Verfahren oder das RNase-Schutzverfahren nachgewiesen werden. Darüber hinaus macht es die Verwendung dieser Sonden möglich, Mutationen des Gens in Proben durch Southern-Hybridisierung und Abnormalitäten im Expressionsgrad des Gens in Proben durch Northern-Hybridisierung nachzuweisen.
Escherichia coli DH5/pBR1 und Escherichia coli XL1-Blue MRF'Kan/pCR-5P2, die alle ein Plasmid tragen, das die dieses MDC-Protein kodierende DNA enthält, und Escherichia coli 490A/cCI 17-904, das ein Cosmid trägt, das die Genom-DNA enthält, wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry am 28. April 1993, 8. Februar 1994 und 28. April 1993, jeweils unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-4286, FERM BP-4555 und FERM BP-4287, hinterlegt.
Von dem MDC-Proteinen und den DNA, die die erfindungsgemäßen MDC-Proteine kodieren, ist zu erwarten, dass sie als Reagenzien bei der Krebsforschung, bei Untersuchungs- und diagnostischen Reagenzien und therapeutischen Mitteln nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung wird nun in größeren Details unter Bezugnahme der folgenden Beispiele beschrieben, die aber nicht als einschränkend für den Umfang der Erfindung anzusehen sind.
Beispiel 1 Isolierung von Cosmidklonen, die für das humane Chromosom 17 spezifisch sind und Herstellung einer Chromosomkarte
Eine humane-Maus-Hybridzelllinie (GM10331), enthaltend ein einzelnes humanes Chromosom 17 in einem Genomhintergrund der Maus, wurde unter Hybridzellen ausgewählt, die durch Fusion von humanen normalen Zellen mit Zellen einer etablierten Mauszelllinie hergestellt worden sind, und Cosmidklone, die spezifisch für das humane Chromosom 17 sind, wurden gemäß dem Verfahren von Tokino et al (Tokino et al., Am. J. Hum. Genet., 48, 258–268, 1991) isoliert. Die chromosomale DNA der Hybridzelllinie wurde gut mit dem Restriktionsenzym Sau 3AI verdaut, und die Enden der so erhaltenen Fragmente wurden durch Teilauffüllung mit dATP und dGTP behandelt. Fragmente mit einer Größe von 35–42 kb wurden davon getrennt und in den Cosmidvektor pWEX15 eingeführt, der zuvor mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut worden war und auf ähnliche Weise an seinen Enden durch Teilauffüllung mit dCTP und dTTP behandelt worden war. Unter den resultierenden Cosmidklonen wurden Klone, die humane DNA-Fragmente enthalten, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung von ³²P-markierter humaner chromosomaler DNA als Sonde ausgewählt. Auf diese Weise wurden 342 Cosmidklone, die spezifisch für das humane Chromosom 17 sind, isoliert.
Im Hinblick auf jeden dieser Cosmidklone, der spezifisch für humanes Chromosom 17 ist, wurde die Stelle, an die ihre Cosmid-DNA auf dem Chromosom hybridisiert, durch FISH bestimmt (Inazawa et al., Genomics, 10, 1075–1078, 1991). Eine physikalische Chromosomenkarte für das Chromosom 17 wurde so hergestellt (siehe Tabellen 1–3 und 1).
Unter Verwendung der aus sechs nicht verwandten Individuen erhaltenen DNA wurden Cosmidklone (Cosmidmarker), deren Stellen auf dem Chromosom an das ihre Cosmid-DNA hybridisiert bestimmt worden war, durch ein bekanntes Verfahren (Nakamura et al., Am. J. Hum. Genet., 43, 854–859, 1988) untersucht, um festzustellen, ob RFLP nachgewiesen werden konnte oder nicht. Das verwendete Restriktionsenzym war MspI, TaqI, BglII, PstI, PvuII, RsaI oder EcoRI. Als Folge wurde in 43 Klonen RFLP festgestellt (siehe Tabellen 4–6). Das heißt, diese 43 Klone waren als RFLP-Marker verwendbar.
Beispiel 2 Nachweis von häufig detektierten Bereichen auf dem Chromosom 17q in Eierstock- und Brustkrebs
Tumorgewebe wurden von 94 Patienten mit Eierstockkrebs und 246 Patienten mit Brustkrebs, bei denen eine Operation durchgeführt worden ist, erhalten. Entsprechendes normales Gewebe oder periphere Blutproben wurden ebenfalls von den jeweiligen Patienten erhalten. DNA wurden aus diesen Geweben oder Proben gemäß einem bekannten Verfahren extrahiert (Sato et al., Cancer Res., 50, 7184–7189, 1990). Jede DNA wurde mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und die so erhaltenen Fragmente wurden einer 1,0%-igen Agarosegelelektrophorese und anschließend Southern unterworfen, und dann auf eine Nylonmembran mit 0,1 N NaOH/0,1 M NaCl übertragen (Sato et al., Cancer Res., 50, 7184–7189, 1990).
Die so erhaltenen Membranen wurden auf LOH (Verlust der Heterozygosität) durch Southern-Hybridisierung (Sato et al., Cancer Res., 50, 7184–7189, 1990) unter Verwendung der RFLP-Marker, die durch das Verfahren von Beispiel 1 erhalten wurden, als Sonden untersucht (siehe Tabelle 7).
Insgesamt 84 der 94 Eierstockkrebse waren für mindestens einen Lokus informativ und 33 (39,3%) davon zeigten LOH für mindestens einen Lokus auf dem Chromosom 17q. Unter den 246 untersuchten Brustkrebsen waren 214 für mindestens einen Lokus informativ und 88 (41,4%) zeigten LOH für mindestens einen Lokus auf dem Chromosom 17q.
Aus den obigen Ergebnissen wurden die Fälle, die für zwei oder mehrere Loki informativ waren und sowohl Verluste der Heterozygosität an einem Lokus als auch Beibehaltung der Heterozygosität an dem anderen Lokus auf Chromosom 17q entfalteten, zusammengefasst.
Auf diese Weise wurden zwei häufig deletierte Bereiche in acht Eierstockkrebsen aufgefunden (siehe 2). Einer davon war ein Bereich, der zwischen den Markern CI17-316 (17q12-21.1) und CI17-507 (17q21.3) liegt und der andere war ein Bereich, der von dem Marker CI17-516 (17q25.1) entfernt liegt.
Gleichermaßen wurden zwei häufig deletierte Bereiche bei 35 Brustkrebsen festgestellt (siehe 3). Einer davon war ein Bereich, der zwischen den Markern CI17-701 (17q21.3) und CI17-730 (17q21.3) liegt, der ebenfalls bei Eierstockkrebsen festgestellt wurde, aber enger lokalisiert wurde. Der andere war ein Bereich, der zwischen der terminalen Stelle des Markers CI17-516 (17q25.1) liegt, der dem Bereich entsprach, bei dem eine Deletion bei Eierstockkrebs beobachtet wurde.
Von den zwei häufig deletierten Bereichen, die durch die oben beschriebene Deletionskarte definiert sind, wurde festgestellt, dass der Bereich der von den Markern CI17-701 und CI17-730 flankiert ist, eng an dem 17q21-Bereich liegt, der eine enge Korrelation mit dem Ausbruch von Krebs auf Basis der Ergebnisse der Kopplungskartenuntersuchungen bei erblichem Brustkrebs und Eierstockkrebs zeigt (Hall et al., Am. J. Hum. Genet., 50, 1235–1242, 1992). Die Länge dieses Bereiches (d. h. der genetische Abstand zwischen den beiden Markern) wurde durch Kopplungsanalyse auf 2,4 cM geschätzt (Lathrop et al., Am. J. Hum. Genet., 37, 482–498, 1985; Donis-Keller et al., Cell, 51, 319–337, 1987).
Beispiel 3 Isolierung von Cosmidklonen, die in dem minimalen lokalisierten Bereich enthalten sind
Durch die Ergebnisse der Verkopplungskarte wurde gezeigt, dass der lokalisierte Bereich ein Bereich ist, der zwischen den Markern THR1 und Mfd188 auf 17q21 liegt (Hall et al., Am. J. Hum. Genet., 52, 1235–1242, 1992; A. M. Bowcock et al., Am. J. Hum. Genet., 52, 718–22, 1993), ein Versuch wurde unternommen, die relative Reihenfolge dieser Marker und der Marker CI17-701 und CI17-7309 festzustellen und dadurch die erhaltene Karteninformation durch zwei unterschiedliche Strategien zu kombinieren. Die relative Reihenfolge der Marker wurde durch ein Zwei-Farben-FISH-Verfahren bestimmt, das von den Erfindern neu entwickelt worden ist. Dieses Verfahren ist eine Modifizierung von FISH, bei dem ein stark ausgedehntes Chromosomenpräparat, das durch Synchronisieren der Zellen erhalten wurde, verwendet wurde, um den Feinheitsgrad zu verbessern, und darüber hinaus wurden Sonden verwendet, die mit fluoreszierendem Material unterschiedlicher Farben markiert sind. Dieses Verfahren ermöglicht das Bestimmen der relativen Reihenfolge der Marker, die eng beieinander liegen.
Dadurch wurde festgestellt, dass der Marker Mfd188 zwischen den Markern CI17-701 und CI17-730 liegt und der Marker THRA1 an der zentromeren Seite von CI17-701 liegt (siehe 4a). Das heißt, der mit erblichem Brustkrebs assoziierte Bereich, der durch Kopplungskartierung lokalisiert wurde, und der häufig bei sporadischem Brustkrebs deletierte Bereich, der durch Deletionskartierung lokalisiert wurde, überlappen miteinander und der überlappende minimale Bereich ist von den Marken CI17-701 und Mfd188 flankiert (siehe 4a). Durch Erstellung einer physikalischen Karte dieses Bereichs durch Puls-Feld-Gelelektrophorese wurde die Länge des überlappenden Bereichs bis auf ungefähr 500 kb eingeengt.
Darüber hinaus wurden von den Cosmidklonen, die durch das Verfahren von Beispiel 1 erhalten wurden, 37 Klone auf 17q21.3 lokalisiert, und drei bekannte Marker THRA1, Mfd188 und PPY wurden ausgewählt und zur Feinkartierung dieses chromosomalen Bereichs durch zweifarbiges FISH verwendet. Dadurch wurden 15 Cosmidklone in einem Bereich lokalisiert, der von Markern CI17-701 und CI17-730 flankiert ist. Von diesen wurde festgestellt, dass zwei Cosmidklone, CI17-527 und CI17-904, in dem oben beschriebenen überlappenden Bereich liegen (siehe 4a und b).
Beispiel 4 Nachweis von Genomänderungen bei Brustkrebs
Von dem überlappenden Bereich von ungefähr 500 kb sind ungefähr 150 kb durch vier Cosmidklone CI17-701, CI17-527, CI17-904 und Mfd188 abgedeckt. Folglich wurde ein Versuch unternommen, Restriktionsfragmente (SacI, PvuII oder PstI) der DNA aus Tumorgeweben von 650 sporadischen Brustkrebsen durch Southern-Blot-Analyse zu screenen, wobei die DNA dieser Cosmidklone oder deren Fragmente als Sonden verwendet wurden und dadurch grobe Genomstrukturänderungen (sogenannte Genomumordnungen), wie Deletion, Duplikation, Amplifikation und Translokation, nachgewiesen wurden, die in den Tumorzellen auftraten. Bei der Verwendung der DNA von CI17-904 oder seines 9,5 kb HindIII-Fragments (siehe 4c) als Sonde wurden Genomumordnungen in den Tumorgeweben von zwei Brustkrebsen festgestellt (5a und b). Diese Genomumordnungen traten nur in den Tumorgeweben auf, wobei Extrabanden unterschiedlicher Größe, die nicht in normalen Geweben beobachtet wurden, auftraten. Zusätzlich erhöhten sich die Intensitäten einiger Banden. Das heißt, eine Genamplifizierung trat in einem bestimmten DNA-Bereich entsprechend (d. h. hybridisierbar) dieser Sonde. Bei einem Fall der oben erwähnten zwei Brustkrebs wurde keine Genamplifizierung nachgewiesen, wenn eine Southern-Blot-Analyse des SacI-Fragments der DNA aus dem Brustkrebsgewebe unter Verwendung des E-H5.2 oder Hind6.1-Fragments, das sich neben dem 9,5 kb HindIII-Fragment befindet (siehe 4c), als Sonde durchgeführt wurde (siehe 6, Fall 1). Dies deutet darauf hin, dass die Genamplifizierung in diesem Fall innerhalb des Bereichs auftrat, der dem 9,5 kb HindIII-Fragment entspricht und eine 4- bis 5-fache Amplifizierung war.
Zur näheren Untersuchung wurden Southern-Blot-Analysen der SacI-Fragmente der DNA aus Brustkrebsgewebe durchgeführt unter Verwendung der sechs SacI-Fragmente, die von dem 9,5 kb HindIII-Fragment abstammen, A, B, C, D, E und F (siehe 4c) als Sonde. Dadurch wurden amplifizierte Banden abnormaler Größe bei 2,5 kb mit den Sonden A und B, bei 3,0 kb mit den Sonden B, C und D, bei 2,5 kb mit den Sonden E und F und bei 0,9 kb mit der Sonde F beobachtet (siehe 7).
In einem anderen Fall wurde Genamplifizierung nachgewiesen, wenn eine Southern-blot-Analyse der SacI-Fragmente der DNA aus Brustkrebsgewebe durchgeführt wurde, wobei das E-H5.2-Fragment als Sonde verwendet wurde (siehe 6, Fall 2). Keine Amplifizierung wurde jedoch nachgewiesen, wenn das Hind6.1-Fragment als Sonde verwendet wurde (siehe 6, Fall 2). Wenn das E-H5.2-Fragment als Sonde verwendet wurde, wurde in diesem Fall nur eine Amplifizierung beobachtet, die von keiner Bande abnormaler Größe begleitet war. Dies deutet darauf hin, dass die Genamplifizierung in diesem Fall in einem Segment auftrat, das von innerhalb des Bereichs, entsprechend dem 9,5 kb HindIII-Fragment, bis zu der äußeren (telomeren) Stelle des Bereiches, entsprechend dem E-H5.2-Fragment, reicht.
Beispiel 5 Isolierung von cDNA und Bestimmung der Struktur
Zur Isolierung eines exprimierten Gens in dem Bereich oder in der Nähe des Bereichs, in dem Genomumordnungen bei zwei Brustkrebsen nachgewiesen wurden, wurden DNA-Fragmente, die DNA-Sequenzen enthalten, die an fundamentalen zellulären Wirkungen teilnehmen und unter anderen Arten erhalten sind, von DNA-Fragmenten des Cosmidklons CI17-904 ausgewählt. Genauer gesagt, wurde jedes DNA-Fragment des Cosmidklons CI17-904 als Sonde in Southern-Blot-Hybridisierungsanalysen der DNA-Fragmente der Kuh, des Schweins, der Maus, der Ratte und des Huhn verwendet. Das 3,5 kb HindIII-KspI-Fragment (siehe 4c) des Cosmidklons CI17-904 hybridisierte mit DNA der Kuh, des Schweins, der Maus und der Ratte und zeigte keine Erhaltung.
Unter Verwendung dieses 3,5 kb HindIII-KspI-Fragments als Sonde wurden humane cDNA-Bibliotheken, abstammend von fünf unterschiedlichen Organen (z. B. Brustdrüse, Brustkrebszelllinie, Hirn vom Fötus, Cerebrum und Cerebellum) gescreent. Die längste cDNA wurde aus der cerebellaren cDNA-Bibliothek kloniert. Diese cDNA hybridisierte an das 3,5 kb HindIII-KspI-Fragment des Cosmidklons CI17-904 an eine Vielzahl von daneben liegenden Restriktionsfragmenten und reichte über einen Bereich von mehr als 20 kb auf dem Chromosom.
Die Analyse der Basensequenz dieser cDNA ergab, dass sie aus 2923 Basenpaaren (bp) besteht und eine neue DNA-Basensequenz ist, die einen 5'-nicht-translatierten Bereich von 27 bp, einen kodierenden Bereich von 1575 bp, einen 3'-nicht-translatierten Bereich von 1306 bp und ein Poly(A)-Ende von 15 bp enthält (siehe SEQ ID NO: 6). Der offene Leserahmen, der in dieser cDNA-Sequenz enthalten ist, kodiert ein neues Protein (MDC-Protein; siehe SEQ ID NO: 2). Ein Terminationskodon im Leserahmen liegt unmittelbar stromaufwärts des ersten ATG des offenen Leserahmens. Ein Polyadenylierungssignal, AATAAA, befindet sich ungefähr 20 bp stromaufwärts der Polyadenylierungsstelle.
Beispiel 6 Bestimmung der Struktur der genomischen DNA
Zur Klarstellung der Struktur der genomischen DNA, entsprechend der cDNA, die in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde der Cosmidklon CI17-904 untersucht, um die Basensequenz der Teile zu untersuchen, die die Basensequenz dieser cDNA und Teile darum enthalten. Die Sequenzen von beiden wurden anschließend verglichen, um die Exon-Intron-Junktionen zu bestimmen. Die Sequenzstruktur einer neuen DNA, enthaltend 25 Exone, entsprechend der in Beispiel 5 erhaltenen cDNA, wurde so klargestellt (siehe SEQ ID NO: 9). Es wurde dadurch gezeigt, dass diese 25 Exone verhältnismäßig klein sind und über einen ungefähr 20 kb-Bereich des Chromosoms vorkommen.
Beispiel 7 Nachweis der Änderungen in der Exonstruktur des Gens bei Brustkrebs
Aus der Struktur der DNA enthaltenen Exonen/Intronen, wie in Beispiel 6 dargelegt, wurde deutlich, dass die Exone 2, 3 und 4 in dem Sequenzbereich der Sonde (des 9,5 kb HindIII-Fragments des Cosmidklons CI17-904), mit der Änderungen in Tumorgeweben von zwei Brustkrebsen, wie in Beispiel 4 beschrieben, nachgewiesen wurden, vorhanden sind. Genauer gesagt, ist das Exon 2 in dem Sequenzbereich der Probe E, und die Exone 3 und 4 sind in dem Sequenzbereich der Probe F vorhanden (siehe 4c). Folglich wurde angenommen, dass die Genumordnungen, die den 9,5 kb HindIII-Fragmentbereich beinhalten, wie in Beispiel 4 beschrieben, die normale Exonstruktur in dem Bereich, enthaltend die drei Exone des Gens, zerstört. Zur Bestätigung wurden die chromosomalen DNA der Tumorgewebe der oben beschriebenen zwei Brustkrebse durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung von Sonden mit DNA-Sequenzen, die den Exonen 2, 3 und 4 entsprechen, untersucht.
Die amplifizierten Banden abnormaler Größe wurden so ähnlich zu den zuvor beschriebenen Ergebnissen, die bei der Sonde E oder F erhalten wurden, festgestellt (siehe 7).
Beispiel 8 Gewebespezifizität der Genexpression
mRNA, abstammend von verschiedenen humanen Geweben (Gehirn, Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Placenta, Skelettmuskel, Kolon, peripheren Blutlymphozyten, Eierstock, Dünndarm, Milz, Hoden und Thymus) wurden durch Northern-Blot-Analyse unter Verwendung der cDNA, die in Beispiel 5 erhalten wurde, als Sonde untersucht. Die stärkste Expression wurde im Gehirn beobachtet und eine schwache Expression im Herz, dem Eierstock und dem Hoden.
Die Amplifizierung durch RT-PCR (Umkehrtranskriptase PCR) wurde darüber hinaus durchgeführt, um eine schwächere Expression nachzuweisen. Genauer gesagt, wurden unter Verwendung von zufälligen Hexameren als Primer einzelsträngige cDNR aus mRNA, abstammend von verschiedenen humanen Geweben, durch die Wirkung von Umkehrtranskriptase synthetisiert. Die PCR-Amplifizierung aus diesen Matrizen wurde anschließend durchgeführt unter Verwendung von den Primern BC09 und BC012 mit Sequenzen, die von den Sequenzen der Exone 21 bzw. 23 abstammen, die in Beispiel 6 ermittelt worden sind. Ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe wurde so hauptsächlich in Geweben des zentralen Nervensystems (Cerebrum, Cerebellum und Fötusgehirn) und in Endocrinen oder Fortpflanzungsorganen (Hoden, Eierstock, Brustdrüsen, Nebennierendrüse, Thymus und Pankreas) festgestellt.
Die Sequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt:
BC09 5'-GCACCTGCCCCGGCAGT-3' (SEQ ID NO: 10) (kodierender Strang, entsprechend den Basennummern 1764–1780 der SEQ ID NO: 6)
BC012 5'-CCAGGACAGCCCCAGCGATG-3' (SEQ ID NO: 11) Antisinn-Strang, entsprechend der Basennummern 1976–1957 der SEQ ID NO: 6).
Beispiel 9 Direkte Sequenzierung der mRNA durch RT-PCR
mRNA, abstammend von humanem Fötusgehirn und humanem Hoden wurden durch RT-PCR unter Verwendung des Primers GMA701 mit einer Sequenz, die von der Sequenz auf Exon 19 abstammt und des Primers GMB704 mit einer Sequenz, die von der Sequenz auf Exon 21 abstammt, amplifiziert. Die Basensequenzen der amplifizierten DNA wurden anschließend direkt bestimmt unter Verwendung des Primers GMA702 oder GMB703. Eine Sequenz, bei der 10 Basen (Basennummern 1512–1521) der cerebellaren cDNA-Sequenz von SEQ ID NO. 6, die in Beispiel 5 erhalten wurde, deletiert waren, wurde auf diese Weise aufgefunden, wodurch die Expression der mRNA entsprechend der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 7 ermittelt wurde. Sowohl die mRNA des Fötusgehirns als auch der Hoden ergab identische Ergebnisse. Die offenen Leserahmen, die in der cDNA-Sequenz der SEQ ID NO: 7 enthalten sind, kodieren ein MDC-Protein (siehe SEQ ID NO: 3), zusammengesetzt aus 670 Aminosäuren.
Dies scheint durch alternatives RNA-Splicing am Anfang des Exons 20 verursacht zu sein, das mit der Basenzahl 6083 anstatt der Basenzahl 6078 auf der genomischen DNA der SEQ ID NO: 9 beginnt. Eine solche Variierung durch Splicing ist ebenfalls bekannt aus z. B. einem Bereich von Oda et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun., 193, 897–904 (1993)]. Die Aminosäuresequenzen, die durch die cDNA der SEQ ID NO: 6 und der cDNA der SEQ ID NO: 7 kodiert werden, unterscheiden sich an und bevor dieser Stelle (siehe SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3). Genauer gesagt, erzeugt die cDNA von SEQ ID NO: 6 ein Terminationskodon innerhalb des Exons 20, wohingegen der Leserahmen in der cDNA von SEQ ID NO: 7 verschoben ist, wodurch der offene Leserahmen bis zu einer stromabwärts liegenden Position fortgesetzt wird.
Die Sequenzen der Primer, die bei der PCR- und DNA-Sequenzierung verwendet wurden, sind wie folgt:
GMA701 5'-GGCTGCTGATCGCTTCTGCTAC-3' (SEQ ID NO: 12) (kodierender Strang, entsprechend den Basennummern 1413–1434 in SEQ ID NO: 6)
GMA702 5'-GAGAAGCTGAATGTGGAGGG-3' (SEQ ID NO: 13) (kodierender Strang, entsprechend den Basennummern 1435–1456 in SEQ ID NO: 6)
GMB703 5'-GTCAGAGCCGTCCGCCAGC-3' (SEQ ID NO: 14) Antisinn-Strang, entsprechend den Basennummern 1675–1657 in SEQ ID NO: 6)
GMB704 5'-GCCATCCTCCACATAGCTCAGG-3' (SEQ ID NO: 15) (Antisinn-Strang, entsprechend den Basennummern 1696–1655 in SEQ ID NO: 6)
Beispiel 10 Amplifizierung der 5'-terminalen Sequenz durch RACE
Um die vollständige cDNA, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt ist, zu erhalten, wurde PCR-Amplifizierung des 5'-cDNA-Endes durchgeführt (5'-RACE; Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, 8998–9002, 1988; Belyavski et al., Nucleic Acid Res., 17, 2919–2932, 1988). Unter Verwendung eines spezifischen Oligomers SGN012 als Primer zusammen mit einem im Handel erhältlichen Synthesekit wurde einzelsträngige cDNA aus 2 μg Poly-A(+) RNR, abstammend vom humanen Gehirn, synthetisiert (hergestellt durch Clontech). Anschließend wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits 5'-RACE auf Basis des Verfahrens von Edwards et al. durchgeführt, um ein Ankeroligomer an ein Ende einer einzelsträngigen cDNA zu binden (Nucleic Acid Res., 19, 5227–5232, 1991). Als Folge der PCR unter Verwendung des Ankeroligomers des Kits und eines anderen spezifischen Oligomers SGN011 als Sonde wurde ein Amplifizierungsprodukt von ungefähr 580 bp durch Elektrophorese festgestellt.
Dieses Amplifizierungsprodukt wurde aus dem elektrophoretischen Gel extrahiert, gereinigt, in die SrfI-Spaltstelle des Plasmidvektors pCR-Script (hergestellt von Stratagene) eingeführt und kloniert. Die Plasmid-DNA wurde aus jedem Klon gereinigt, und seine Basensequenz wurde bestimmt. Einer der Klone, pCR-5P2, hatte ein cDNA-Insert von 501 bp, beginnend mit ATG, neben der Sequenz des Ankeroligomers. Die Basensequenz des Inserts, die sich von der Basennummer 315 an erstreckt, entspricht exakt der Basensequenz der SEQ ID NO: 7, die sich von der Basenzahl 45 an (die Anfangsstelle des Exons 2) erstreckt, außer einer Base, die nachfolgend erwähnt wird. Darüber hinaus, was den Leserahmen anbetrifft, entspricht der von pCR-5P2, der mit dem ersten ATG beginnt, mit dem Polypeptid, das durch die cDNA der SEQ ID NO: 7 kodiert ist. Der N-terminale Bereich der so erhaltenen Polypeptidsequenz kodierte ein einzelnes Peptid, umfassend eine Reihe von hydrophoben Aminosäuren.
RT-PCR von mRNA wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass die obige 5'-terminale Sequenz, die durch 5'-RACE erhalten wurde, tatsächlich an die Sequenz der SEQ ID NO: 7, die von der Basenzahl 45 an sich erstreckt, gebunden war. Unter Verwendung zufälliger Hexamere als Primer wurden einzelsträngige cDNA aus Poly A(+) RNA, abstammend vom humanen Hirn, Fötusgehirn, Eierstock und Hoden (hergestellt von Clontech) synthetisiert. Die cDNA-Matrix wurde anschließend durch PCR unter Verwendung eines Oligomers der ersten 20 Basen (SGN013) der Sequenz von pCR-5P2 als Sinn-Primer und SGN011 oder SGN012 als Antisinn-Primer amplifiziert. Das erwartete Amplifizierungsprodukt (ungefähr 500 bp für SGN013/SGN011 und ungefähr 750 bp für SGN013/SGN012) wurde durch Elektrophorese mit jeder verwendeten Gewebe-RNA nachgewiesen.
Folglich wurde bestätigt, dass die 5'-terminale Sequenz der durch 5'-RACE erhaltenen pCR-5P2 (auf mRNA), an die Sequenz der SEQ ID NO: 7 gebunden war, die sich von der Basennummer 45 an erstreckt, was zu der Herstellung einer cDNA, dargestellt durch SEQ ID NO: 8 führt. Der offene Leserahmen der cDNA der SEQ ID NO: 8 kodiert ein MDC-Protein, zusammengesetzt aus 769 Aminosäuren (siehe SEQ ID NO: 4).
Die Sequenzen der spezifisch verwendeten Oligomere sind wie folgt:
SGN011 5'-GATGTAAGTCAAGTTCCCATCAGAGA-3' (SEQ ID NO: 16) (Antisinn-Strang, entsprechend den Basennummern 231–206 in SEQ ID NO: 7)
SGN012 5'-AACAGCFDTGGTGGTCGTTGATCACAA-3' (SEQ ID NO: 17) (Antisinn-Strang, entsprechend den Basennummern 485–461 in SEQ ID NO: 7)
SGN013 5'-ATGAGGCTGCTGCGGCGCTG-3' (SEQ ID NO: 18) (kodierender Strang, entsprechend den Basennummern 1–20 in SEQ ID NO: 8)
Die oben erwähnte Base in SEQ ID NO: 8 nach der Anfangsstelle des Exons 2, die sich in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 unterscheidet, ist die vierte Base von der Anfangsstelle des Exons 2 an, d. h. das C der Basennummer 318 in SEQ ID NO: 8. Die entsprechende Base SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 ist das A der Basennummer 48. Die Base C der Basennummer 318 in SEQ ID NO: 8 kodiert His an der Aminosäurenzahl 106 in SEQ ID NO: 4. Die Base A der Basennummer 48 in SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 kodiert Gln der Aminosäurenzahl 7 in SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3. Diese Tatsache reflektiert Polymorphismus.
Eine Aminosäuresequenz, die diese drei Varianten MDC-Proteine gemein haben (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) ist eine Sequenz, die sich aus 488 Aminosäuren zusammensetzt (siehe SEQ ID NO: 1), und eine DNA-Sequenz, die diesen Teil kodiert, ist auch eine allgemeine Sequenz (siehe SEQ ID NO: 5).
Beispiel 11 Homologie mit bekannten Proteinen
Die Aminosäuresequenz der MDC-Proteine zeigte Homologie mit einer Familie von Blutung betreffenden Schlangengiften, einschließlich HR1B (Takeya et al., J. Biol. Chem., 265, 16068–16073, 1990), Prorhodostomin (Au et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181, 585–593, 1991) und Protrigramin (Neeper et al., Nucleic Acid Res., 18, 4255, 1990).
Sie zeigten auch Homologie mit dem Oberflächenprotein PH30 des Meerschweinchensamens (Blobel et al., Nature, 356, 248–252, 1992) und des Ratten- oder Affenepididymisproteins EAPI (Perry et al., Biochem. J., 286, 671–675, 1992).
Die Homologie dieser Proteine mit den MDC-Proteinen, dargestellt durch SEQ ID NO: 2 (524 Aminosäuren) und SEQ ID NO: 4 (769 Aminosäuren) wird angezeigt durch die folgende "prozentuale Identität/Anzahl der Aminosäuren in dem untersuchten Bereich". Die Werte für SEQ ID NO: 2 sind auf der linken Seite angegeben und die für SEQ ID NO: 4 auf der rechten Seite:

HR1B 32,5/335 32,2/379

Prorhodostomin 29,0/420 29,0/420

Protrigramin 27,7/430 28,1/438

PH30b 38,1/147 30,8/302

EAP1 (Ratte) 36,0/364 33,1/475

EAP1 (Affe) 30,4/503 29,9/599
Beispiel 12 Herstellung von Transformanten
Ein DNA-Fragment, kodierend einen Teil des MDC-Proteins, dargestellt durch SEQ ID NO: 2, wurde aus der DNA (SEQ ID NO: 6), kodierend das MDC-Protein (SEQ ID NO: 2) durch PCR unter Verwendung der Primer SGN006 und SGN008 amplifiziert. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind wie folgt:
SGN006 5'-CACAGATCTGGGGGCATATGCTCCCTG-3' (SEQ ID NO: 19) (kodierender Strang, entsprechend den Basennummern 766–783 in SEQ ID NO: 6)
SGN008 5'-AACAAGCTTCTACTGATGTCTCCCACC-3' (SEQ ID NO: 20) (antisense-Strang, entsprechend den Basennummern 1602–1585 in SEQ ID NO: 6; die Unterstreichung bezeichnet ein Terminationskodon).
Zum Zweck der Vektorherstellung werden die 5'-terminalen Enden dieser Primer mit BglII und HindIII Sequenzen von Spaltstellen jeweils versehen.
Das PCR-Amplifizierungsprodukt wurde durch Agarosegelelektrophorese getrennt und mit BglII und HindIII gespalten. Die resultierenden DNA-Fragmente, die einen Teil des MDC-Proteins kodieren, wurden mit dem Vektor pMAL-c2 (hergestellt von New England Biolabs) kombiniert, der zuvor mit BamHI und HindIII gespalten worden war, um das Plasmid pMAL-MDC(C1) herzustellen.
In ähnlicher Weise wurde das gleiche DNA-Fragment mit dem Vektor pQE-13 (herstellt von Diagen) verbunden, der zuvor mit BamHI und HindIII gespalten worden war, um das Plasmid pH6-MDC(C1) herzustellen.
Darüber hinaus wurde eine DNA-Sequenz stromabwärts der BamHI-Spaltstelle (Basennummer 1483 in SEQ ID NO: 6) von dem MDC-Protein kodierenden Bereich von pMAL-MDC(C1) entfernt durch Spalten von pMAL-MDC(C1) mit BamHI und HindIII und Vereinigen derselben nach der Bildung von glatten Enden. Dies führte zu der Herstellung des Plasmids pMAL-MDC(dC1), das die Expression eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz vermittelt, die Variante MDC-Proteine gemein haben (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3).
Da das in den Vektor pMAL-c2 eingeführte Fragment als Fusionsprotein mit einem Maltosebindungsprotein (MBP) an der N-terminalen Stelle ausgedrückt wird, wurde dieses Fusionsprotein durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Amylosesäule gereinigt. Da das in den Vektor pQE-13 eingeführte Fragment als Fusionsprotein mit einem Peptid (His 6), zusammengesetzt aus sechs Histidinresten am N-terminalen Ende, ausgedrückt wird, wird auf der anderen Seite dieses Protein durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Metallchelatsäule gereinigt.
Verschiedene Transformanten wurden durch Transformieren von E. coli JM109 mit jeweils den Plasmiden pMAL-MDC(C1), pMAL-MDC(dC1) und pH6-MDC(C1) und Auswählen der Ampicillinresistenz erhalten.
Beispiel 13 Expression und Reinigung von rekombinanten MDC-Proteinen
Jede der in Beispiel 12 erhaltenen Transformanten wurde wachsen gelassen und das resultierende rekombinante MDC-Fusionsprotein wurde aus der Kultur extrahiert und gereinigt.
Genauer gesagt, wurden 100 ml LB-Medium (1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) mit jedem Transformanten geimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Kultur wurde 10-fach auf 37°C mit zuvor erwärmtem LB-Medium verdünnt und zusätzliche 30–90 Minuten inkubiert, um eine Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase zu erhalten. Zu 1 Liter der Kultur wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) auf eine Endkonzentration von 1 mM gegeben. Diese Kultur wurde 3 bis 4 Stunden inkubiert und anschließend zentrifugiert, um die Zellen daraus zu sammeln.
Im Fall von Transformanten des Plasmids pMAL-MDC(C1) oder pMAL-MDC(dC1) wurden die Zellen in 10 ml Säulenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl) suspendiert und anschließend durch Beschallung disintegriert. Da das rekombinante MDC-Fusionsprotein in der unlöslichen Fraktion der disintegrierten Zellsuspension vorhanden war, wurde diese durch Zentrifugierung getrennt und in denaturiertem Puffer (8 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM Dithiothreitol) aufgelöst. Anschließend wurde diese Lösung gegen den Säulenpuffer dialysiert und zentrifugiert, um eine lösliche Überstandsfraktion zu sammeln. Die dialysierte, nicht-lösliche Fraktion wurde anschließend denaturiert, dialysiert und zentrifugiert, um zusätzliche lösliche Überstandsfraktionen zu sammeln. Die kombinierte lösliche Fraktion wurde auf eine Amylosesäule aufgebracht (hergestellt von New England Biolabs), die mit Säulenpuffer gewaschen worden war und wurde mit dem Säulenpuffer, enthaltend 10 mM Maltose, eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden durch Absorptiometrie bei 280 nm und SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (mit Coomassie-Blau-Befärbung) analysiert und in Fraktionen verbunden. Eine Fraktion, in der das gewünschte MBP-(Maltosebindungsprotein)Fusionsprotein (ungefähr 68 Kd) als hauptsächliche Bande nachgewiesen werden konnte, wurde für jeden der Transformanten erhalten, die durch die Plasmide pMAL-MDC(C1) und pMAL-MDC(dC1) erzeugt worden waren. Die Ausbeute betrug jeweils 46,4 mg und 10,0 mg (wenn eine OD₂₈₀ von 1 als 1 mg/ml genommen wurde). Diese Fusionsproteine werden hiernach jeweils als MBP-MDC(C1) und MBP-MDC(dC1) bezeichnet.
In gleicher Weise wurden im Fall der Transformanten des Plasmids pH6-MDC(C1) die Zellen in 10 ml Beschallungspuffer (10 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 200 mM NaCl) suspendiert und durch Beschallung disintegriert. Da das rekombinante MDC-Fusionsprotein in der nicht-löslichen Fraktion der disintegrierten Zellsuspension vorhanden war, wurde diese durch Zentrifugierung getrennt und in Puffer A (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) aufgelöst. Diese Lösung wurde anschließend zentrifugiert, um eine lösliche Überstandsfraktion zu sammeln, die auf eine Ni-NTA-Säule (hergestellt von Diagen) aufgetragen wurde. Diese Säule wurde mit Puffer A und anschließend mit Puffer B (8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) gewaschen und schrittweise mit Puffer C (8 M Harnstoff 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 6,3), Puffer D, 8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 5,9), Puffer E (8 M Harnstoff, 100 mM NaH₂PO₄, 10 mM Tris-HCl, pH 4,5) und Puffer F (6 M Guanidinhydrochlorid, 200 mM Essigsäure) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden durch Absorptiometrie bei 280 nm und SDS-Polyacrylamidelektrophorese (mit Coomassie-Blau-Anfärbung) analysiert und in Fraktionen verbunden. Eine Fraktion wurde als Folge nachgewiesen, bei der das gewünschte His6-Fusionsprotein (ungefähr 34 Kd) als einzelne Bande aus dem Effluent, der von der Elution mit Puffer F stammte, erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 51,9 mg (wenn eine OD₂₈₀ von 1 als 1 mg/ml genommen wurde). Dieses Fusionsprotein wird hierin als His6-MDC(C1) bezeichnet.
Beispiel 14 Herstellung eines monoklonalen Antikörpers und eines polyklonalen Antikörpers vom Kaninchen
Die drei rekombinanten Fusionsproteine, His6-MDC(C1), MBP-MDC(dC1) und MBP-MDC(C1), die in Beispiel 13 erhalten wurden, wurden jeweils verwendet als immunisierendes Antigen, Antigen für Antikörperreinigung und Screening und Standardantigen zur Messung.
Ein anti-MDC-Protein spezifischer monoklonaler Antikörper wurde durch Immunisieren einer Maus mit His6-MDC(C1) hergestellt. Genauer gesagt, wurde eine Lösung aus His6(MDC(C1) (500–1000 μg/ml) in 3 M Harnstoff/PBS mit vollständigem Adjuvans in einem Verhältnis von 1 : 1 gemischt, und diese Mischung wurde in den peritonealen Hohlraum einer Maus bei einer Dosis von 100 μg pro Tier injiziert. Diese Injektion wurde 4- bis 6-mal in Intervallen von 2 Wochen wiederholt. Nach der Vervollständigung der Immunisierung wurden Hybridome durch Fusionieren von P3U1-Zellen mit B-Zellen in der Gegenwart von PEG1500 hergestellt. Anschließend wurden Hybridome, die anti-MDC-Protein-spezifischen Antikörper herstellen, durch Beobachten des Antikörpertiters im Kulturüberstand ausgewählt.
Zur Messung des Antikörpertiters wurde eine erste Reaktion durch Zugabe von 100 μl des Kulturüberstands zu einer Polystyrolkappe mit einer Festphase, gebildet aus dem MBP-MDC(dC1)-Fusionsprotein, erhalten wie in Beispiel 13 (5 μg/ml), bewirkt. Nach dem Waschen wurde eine zweite Reaktion durch Zugabe von anti-Maus-IgG HRP (Meerrettichperoxidase) bewirkt. Nach dem Waschen wurde eine Farbreaktion (dritte Reaktion) durch Zugabe einer Enzymsubstratlösung bewirkt [d. h. eine Mischlösung aus Wasserstoffperoxid und ABTS [2,2'-Azido-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)]], und die erzeugte Farbe wurde verfolgt.
Die Hybridome wurden auf einer 96 Vertiefungs-Multiplatte wachsen gelassen und durch HAT-Medium gescreent. Nach ungefähr 2 Wochen wurden Kolonien, die spezifisch mit dem Antigen reagieren, durch Messen des Antikörpertiters im Kulturüberstand ausgewählt. Als Folge weiterer Klonierung wurden drei Klone (G1-5A2-2C8, G2-2F2-3D11 und G2-2D10-3F5) als Antikörper-herstellende Hybridome etabiliert. Diese Klasse und Unterklasse der jeweils hergestellten Antikörper der etablierten Klone war IgG₁ für G1-5A2-2C8, IgG_2b für G2-2F2-3D11 und IgM für G2-2D10-3F5. 3.000.000 Zellen jedes Hybridoms wurden in den peritonealen Hohlraum einer BALB/c-Maus eingeführt, in den 0,5 ml Pristan ungefähr 1 Woche davor intraperitoneal verabreicht worden waren. Nach 8 bis 10 Tagen wurden die Aszites gesammelt. Aus den Aszites, die von jedem Tier gesammelt wurden, wurde ein Antikörper durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein G-Säule gereinigt.
Ein anti-MDC-Protein-polyklonaler Antikörper wurde auf gleiche Weise hergestellt durch Immunisieren eines Kaninchens mit einem immunisierenden Antigen, umfassend His6-MDD(C1), das in Beispiel 13 erhalten wurde.
Genauer gesagt, wurde ein Kaninchen wie die Maus mit einer Mischung immunisiert, die durch Mischen einer Lösung aus His6-MDC(C1) (500–1000 μg/ml) in 3 M Harnstoff/PBS mit vollständigem Adjuvans in einem Verhältnis von 1 : 1 hergestellt worden war. Nach der Beendigung der Immunisierung wurde Antiserum gesammelt und der Antikörpertiter wurde gemessen unter Verwendung einer Polystyrolkappe mit einer Festphase, die aus MBP-MDC(dC1)-Fusionsprotein, das in Beispiel 13 erhalten wurde, gebildet worden war. Das Antiserum wurde 500- bis 64.000-fach verdünnt, 100 μl jeder Verdünnung wurden zu den Vertiefungen gegeben und ihre Antikörpertiter wurden mit anti-Kaninchen-IgG-HRP der Ziege untersucht. Der Antikörpertiter war bis zu einer 64.000-fachen Verdünnung nachweisbar. Da kein Antikörper, der mit MBP-MDC(dC1) reagierte, in dem Serum vor der Immunisierung vorhanden war, konnte bestätigt werden, dass ein Antikörper, der spezifisch mit dem Protein reagierte, hergestellt wurde.
Darüber hinaus wurde das Antiserum durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein G-Säule und einer Sepharosesäule mit dem MBP-MDC(dC1)-Fusionsprotein, das darauf immobilisiert war, gereinigt.
Ein Verfahren zur Bestimmung des MDC-Proteins durch ELISA unter Verwendung des gereinigten monoklonalen Antikörpers und gereinigten polyklonalen Antikörpers vom Kaninchen, das auf die gleiche Weise wie oben beschrieben worden war, erhalten worden war, wurde etabiliert.
Der gereinigte monoklonale Antikörper, der von einem Hybridom (G2-2F2-3D11) abstammt, wurde auf einer 96-Vertiefungsplatte immobilisiert und mit BSA blockiert (Rinderserumalbumin). Die Testlösungen, die gereinigtes MBP-MDC(C1) enthielten, wurden bei Konzentrationen von 0,156 bis 5,00 μg/ml hergestellt, zu den Vertiefungen in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen der Vertiefungen, wurde eine Lösung (5 μg/ml) des gereinigten polyklonalen Antikörpers vom Kaninchen in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde umgesetzt. Danach wurden die Vertiefungen gewaschen, anti-Kaninchen-IgG-HRP (5 μg/ml) in einer Menge von 100 μg pro Vertiefung wurde zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde umgesetzt. Nach der Beendigung der Reaktion wurde 2 mM Natriumazid in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung zugegeben, und die Absorptionen bei 405 nm und 490 nm wurden gemessen. Es wurde bestätigt, dass die unterschiedlich erhaltenen Absorptionen eng mit den Konzentrationen der Testlösungen korrelierten, und eine ungefähre lineare Beziehung im Bereich von 0 bis 2,5 μg/ml entfalteten (siehe 8). Dies deutet darauf hin, dass ELISA unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper und polyklonalen Antikörper vom Kaninchen als Verfahren zur Bestimmung des MDC-Proteins verwendet werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

MDC-Protein, das durch eine in den SEQ ID NOS: 2 und 3 gezeigte Aminosäuresequenz dargestellt ist.
MDC-Protein wie in Anspruch 1 beansprucht, umfassend eine Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus mehr als 20 kontinuierlichen Aminosäuren einer Sequenz, die durch die SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.
DNA, die das in Anspruch 1 beanspruchte MDC-Protein kodiert, dargestellt durch eine DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 oder 7 gezeigt ist.
Plasmid enthaltend die in Anspruch 3 beanspruchte DNA.
Transformant, der das in Anspruch 4 beanspruchte Plasmid trägt.
Verfahren zur Herstellung des in Anspruch 1 beanspruchten MDC-Proteins, das die Schritte des Kultivierens des Transformanten, der in Anspruch 5 beansprucht ist, und das Sammeln des resultierenden Expressionsprodukts umfaßt.
Antikörper, der gegen das in Anspruch 1 beanspruchte MDC-Protein spezifisch ist.
Primer oder Sonde, aufweisend eine DNA-Sequenz, die eine DNA-Sequenz umfaßt, die mit mindestens siebzehn Basen der DNA-Sequenz, die in Anspruch 3 beansprucht ist, komplementär ist.
Verfahren zur Genanalyse, das einen Hybridisierungsschritt des Primers oder der Sonde, wie in Anspruch 8 beansprucht, mit einer zu untersuchenden DNA umfaßt.