JP2002517194A - Ｃ．エレガンスのｕｎｃ−５３タンパク質のヒトホモログ - Google Patents
Ｃ．エレガンスのｕｎｃ−５３タンパク質のヒトホモログInfo
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Abstract
(57)【要約】
Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質のヒトホモログおよび該ホモログまたはその機能性の等価物をコードするｃＤＮＡ配列が開示される。本発明はまた、細胞の挙動を制御する化合物の同定方法、同定した化合物、該化合物を含む医薬組成物、並びに該遺伝子またはタンパク質が機能不全である疾患状態を同定する方法およびアッセイにも関する。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、Ｃ．エレガンス（C. elegans）のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動
物ホモログおよび該ホモログまたはその機能性の等価物をコードするｃＤＮＡ配
列に関する。本発明はまた、細胞の挙動を制御する化合物の同定方法、同定され
た化合物、および該化合物を含む医薬組成物、さらには該遺伝子またはタンパク
質が機能不全である疾患状態を同定する方法およびアッセイにも関する。
物ホモログおよび該ホモログまたはその機能性の等価物をコードするｃＤＮＡ配
列に関する。本発明はまた、細胞の挙動を制御する化合物の同定方法、同定され
た化合物、および該化合物を含む医薬組成物、さらには該遺伝子またはタンパク
質が機能不全である疾患状態を同定する方法およびアッセイにも関する。
【０００２】 （背景技術） 細胞の運動性、細胞の形状および軸索の細胞増殖（outgrowth）または他の細
胞増殖の指向性（directionality）の制御は、単細胞および多細胞の両生物の形
態形成および機能において本質的な特性である。 細胞移動の指向性および潜在性（potential）を制御する幾つかの細胞表面タ
ンパク質および細胞外分子が同定されているが、それに関与するプロセスは一般
に理解されていない。一般に、細胞プロセスの長距離移動（成長円錐の伸長とし
ても知られる）は段階的な事象であり、その際、各伸長の前および後に細胞の先
導端に構造物が生成されると考えられている。アクチン細胞骨格の局所的な安定
化および微小管のプラス端領域との会合が、指向的な伸長の選択を支配している
一般的な細胞生物学的プロセスである。
胞増殖の指向性（directionality）の制御は、単細胞および多細胞の両生物の形
態形成および機能において本質的な特性である。 細胞移動の指向性および潜在性（potential）を制御する幾つかの細胞表面タ
ンパク質および細胞外分子が同定されているが、それに関与するプロセスは一般
に理解されていない。一般に、細胞プロセスの長距離移動（成長円錐の伸長とし
ても知られる）は段階的な事象であり、その際、各伸長の前および後に細胞の先
導端に構造物が生成されると考えられている。アクチン細胞骨格の局所的な安定
化および微小管のプラス端領域との会合が、指向的な伸長の選択を支配している
一般的な細胞生物学的プロセスである。
【０００３】 本発明者らは、驚くべきことに、微小管、とりわけ微小管のプラス端領域に結
合する、ＵＮＣ−５３ファミリーに属する新規なヒト遺伝子／タンパク質を見出
した。 「ｕｎｃ−５３」と呼ばれる自由生活性線虫Ｃ．エレガンス（Caenorhabditis
elegans）からの遺伝子は、以前に同定されクローニングされている（要約、In
ternational C. elegans Meeting、１９９１年６月１〜５日、マジソン、ウイス
コンシン、５８、ボガート・アンド・ゴー）。本発明者らは以前に、Ｃ．エレガ
ンスにおいて細胞移動および／または細胞形状の指向性を制御するシグナルトラ
ンスデューサーまたはシグナルインテグレーターとしてＵＮＣ−５３タンパク質
を同定した（ＷＯ９６／３８５５５）。
合する、ＵＮＣ−５３ファミリーに属する新規なヒト遺伝子／タンパク質を見出
した。 「ｕｎｃ−５３」と呼ばれる自由生活性線虫Ｃ．エレガンス（Caenorhabditis
elegans）からの遺伝子は、以前に同定されクローニングされている（要約、In
ternational C. elegans Meeting、１９９１年６月１〜５日、マジソン、ウイス
コンシン、５８、ボガート・アンド・ゴー）。本発明者らは以前に、Ｃ．エレガ
ンスにおいて細胞移動および／または細胞形状の指向性を制御するシグナルトラ
ンスデューサーまたはシグナルインテグレーターとしてＵＮＣ−５３タンパク質
を同定した（ＷＯ９６／３８５５５）。
【０００４】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質（Ｃｅｕｎｃ５３）および以前に見
出されたそのヒトホモログ（ｈｓ−ｕｎｃ５３／１およびｈｓ−ｕｎｃ５３／２
）は、細胞の移動、細胞の形状および増殖の伸長を制御するシグナルトランスデ
ューサーまたはシグナルインテグレーターをコードすることがわかった。証拠が
示すところによれば、現在見出されたｈｓ−ｕｎｃ５３／３と称するホモログは
細胞外シグナルをアクチン細胞骨格に連結させるアダプターとして作用するらし
い。第一に、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３は細胞質表層（cortical）アクチン結合タン
パク質とのホモロジーを示し、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３タンパク質はインビトロでＦ
−アクチンと結合し、哺乳動物細胞中で発現されたときにインビボでのアクチン
の再構成に導き、糸状仮足および扇形の膜状物（lammelipodia）の数が増大する
という結果となることが示されている。さらに、神経突起の伸長の増大および細
胞の移動性の増大を観察することができた。ｈｓ−ＵＮＣ−５３−３は種々の疾
患の進展において重要な役割を果たしているのかもしれない。
出されたそのヒトホモログ（ｈｓ−ｕｎｃ５３／１およびｈｓ−ｕｎｃ５３／２
）は、細胞の移動、細胞の形状および増殖の伸長を制御するシグナルトランスデ
ューサーまたはシグナルインテグレーターをコードすることがわかった。証拠が
示すところによれば、現在見出されたｈｓ−ｕｎｃ５３／３と称するホモログは
細胞外シグナルをアクチン細胞骨格に連結させるアダプターとして作用するらし
い。第一に、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３は細胞質表層（cortical）アクチン結合タン
パク質とのホモロジーを示し、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３タンパク質はインビトロでＦ
−アクチンと結合し、哺乳動物細胞中で発現されたときにインビボでのアクチン
の再構成に導き、糸状仮足および扇形の膜状物（lammelipodia）の数が増大する
という結果となることが示されている。さらに、神経突起の伸長の増大および細
胞の移動性の増大を観察することができた。ｈｓ−ＵＮＣ−５３−３は種々の疾
患の進展において重要な役割を果たしているのかもしれない。
【０００５】 本発明の第一の側面によれば、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊
椎動物タンパク質ホモログが提供され、該タンパク質は、図４に示す配列ブロッ
クＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨの１またはそれ以上を有するアミノ酸配
列または保存的アミノ酸変化においてこれらブロックとは異なるものを有するア
ミノ酸配列を含む。
椎動物タンパク質ホモログが提供され、該タンパク質は、図４に示す配列ブロッ
クＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨの１またはそれ以上を有するアミノ酸配
列または保存的アミノ酸変化においてこれらブロックとは異なるものを有するア
ミノ酸配列を含む。
【０００６】 本発明のさらなる側面によれば、図１（ｅ）に示すヌクレオチド配列によって
コードされるアミノ酸配列を有する、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質
の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能性の等価物、誘導体または生物学
的前駆体が提供される。 本発明の目的のためには、「誘導体」は変異誘導体、融合、内部欠失、スプラ
イス変異体およびミューテイン（muteins）を意味するものととるべきである。 好ましくは、該脊椎動物ホモログはヒトホモログであり、好ましくは哺乳動物
またはマウスタンパク質である。 本発明のさらなる側面は、図１（ｆ）に示すアミノ酸配列またはその変異体、
または図１（ｆ）に示すアミノ酸配列とは１またはそれ以上の保存的アミノ酸変
化においてのみ有意の程度に異なるアミノ酸配列を含む脊椎動物ホモログを包含
する。
コードされるアミノ酸配列を有する、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質
の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能性の等価物、誘導体または生物学
的前駆体が提供される。 本発明の目的のためには、「誘導体」は変異誘導体、融合、内部欠失、スプラ
イス変異体およびミューテイン（muteins）を意味するものととるべきである。 好ましくは、該脊椎動物ホモログはヒトホモログであり、好ましくは哺乳動物
またはマウスタンパク質である。 本発明のさらなる側面は、図１（ｆ）に示すアミノ酸配列またはその変異体、
または図１（ｆ）に示すアミノ酸配列とは１またはそれ以上の保存的アミノ酸変
化においてのみ有意の程度に異なるアミノ酸配列を含む脊椎動物ホモログを包含
する。
【０００７】 本発明のさらなる側面において、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の
脊椎動物ホモログ、または本発明による該ホモログの機能的に等価な誘導体、断
片または生物学的前駆体をコードする核酸分子（ＤＮＡが好ましい）も提供され
る。好ましくは該ｃＤＮＡは、図１（ｆ）に示すアミノ酸配列またはその変異体
、または該図に示す配列とは１またはそれ以上の保存的アミノ酸変化においての
み有意の程度に異なるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの配列を含む。好
ましくは、該ＤＮＡはｃＤＮＡであり、該ｃＤＮＡは図１（ｅ）に示す配列また
は該図に示した変異体を含む。また、本発明による核酸またはＤＮＡ配列に高ス
トリンジェンシー条件下（該条件は当業者にはよく知られている）でハイブリダ
イズし得る核酸配列も提供される。
脊椎動物ホモログ、または本発明による該ホモログの機能的に等価な誘導体、断
片または生物学的前駆体をコードする核酸分子（ＤＮＡが好ましい）も提供され
る。好ましくは該ｃＤＮＡは、図１（ｆ）に示すアミノ酸配列またはその変異体
、または該図に示す配列とは１またはそれ以上の保存的アミノ酸変化においての
み有意の程度に異なるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの配列を含む。好
ましくは、該ＤＮＡはｃＤＮＡであり、該ｃＤＮＡは図１（ｅ）に示す配列また
は該図に示した変異体を含む。また、本発明による核酸またはＤＮＡ配列に高ス
トリンジェンシー条件下（該条件は当業者にはよく知られている）でハイブリダ
イズし得る核酸配列も提供される。
【０００８】 本発明によるｃＤＮＡは発現ベクター中に含まれていてよく、該発現ベクター
自体は宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに用いられ、該宿
主細胞はその起源が細菌または真核細胞であってよく、たとえば動物細胞、植物
細胞、真菌細胞または昆虫細胞を含む。それゆえ、有利にも、本発明によるＣ．
エレガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログのゲノムに対応するｃＤＮＡがた
とえば逆転写酵素などを用いて合成されたら、該選択したｃＤＮＡクローンを適
当な発現ベクター中に導入した後に所定範囲の細胞、組織または生物体をトラン
スフェクションすることができる。本発明による発現ベクターは、Ｃ．エレガン
スまたはヒト、マウスまたはウイルス由来のプロモーター、および任意にたとえ
ば緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）などのリポータータンパ
ク質をコードする配列を含んでいてよい。
自体は宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに用いられ、該宿
主細胞はその起源が細菌または真核細胞であってよく、たとえば動物細胞、植物
細胞、真菌細胞または昆虫細胞を含む。それゆえ、有利にも、本発明によるＣ．
エレガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログのゲノムに対応するｃＤＮＡがた
とえば逆転写酵素などを用いて合成されたら、該選択したｃＤＮＡクローンを適
当な発現ベクター中に導入した後に所定範囲の細胞、組織または生物体をトラン
スフェクションすることができる。本発明による発現ベクターは、Ｃ．エレガン
スまたはヒト、マウスまたはウイルス由来のプロモーター、および任意にたとえ
ば緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）などのリポータータンパ
ク質をコードする配列を含んでいてよい。
【０００９】 それゆえ、本発明はまた、本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物ホモログを発現しうるトランスジーンを含むトランスジェニック
細胞、組織または生物体をも包含する。本明細書において「Ｃ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを発現しうるトランスジーン」とは、
同じ機能および／または活性を有する、本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−
５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現へと導く適当な核酸配列を意味する。
トランスジーンとしては、たとえば、適当な脊椎動物から単離したゲノム核酸ま
たはｃＤＮＡを含む合成核酸が挙げられる。本明細書において「トランスジェニ
ック生物、組織または細胞」とは、ゲノム中に安定に組み込まれているかあるい
は染色体外の状態にある外来核酸を含む、適当な生物体および／または生物体の
一部、組織または細胞を意味する。
ク質の脊椎動物ホモログを発現しうるトランスジーンを含むトランスジェニック
細胞、組織または生物体をも包含する。本明細書において「Ｃ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを発現しうるトランスジーン」とは、
同じ機能および／または活性を有する、本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−
５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現へと導く適当な核酸配列を意味する。
トランスジーンとしては、たとえば、適当な脊椎動物から単離したゲノム核酸ま
たはｃＤＮＡを含む合成核酸が挙げられる。本明細書において「トランスジェニ
ック生物、組織または細胞」とは、ゲノム中に安定に組み込まれているかあるい
は染色体外の状態にある外来核酸を含む、適当な生物体および／または生物体の
一部、組織または細胞を意味する。
【００１０】 好ましくは、トランスジェニック細胞は、ＣＯＳ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＣ
Ｆ−７またはＮ４神経芽細胞腫細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、結腸直腸細胞、癌腫細
胞、または繊維芽細胞などのヒト由来細胞を含む。トランスジェニック生物は、
昆虫、非ヒト動物または植物、好ましくはＣ．エレガンスまたは関連する線虫で
あってよい。好ましくは、トランスジーンは本発明による脊椎動物ホモログをコ
ードする上記核酸またはｃＤＮＡ配列を含む。トランスジーンは、好ましくは本
発明による発現ベクターを含む。
Ｆ−７またはＮ４神経芽細胞腫細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、結腸直腸細胞、癌腫細
胞、または繊維芽細胞などのヒト由来細胞を含む。トランスジェニック生物は、
昆虫、非ヒト動物または植物、好ましくはＣ．エレガンスまたは関連する線虫で
あってよい。好ましくは、トランスジーンは本発明による脊椎動物ホモログをコ
ードする上記核酸またはｃＤＮＡ配列を含む。トランスジーンは、好ましくは本
発明による発現ベクターを含む。
【００１１】 本明細書において「機能性の断片」とは、本発明によるＣ．エレガンスのＵＮ
Ｃ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の断片を意味する。
たとえば、該遺伝子は欠失または突然変異を含んでいてよいが、依然としてＵＮ
Ｃ−５３タンパク質の機能性の脊椎動物ホモログをコードしている。
Ｃ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の断片を意味する。
たとえば、該遺伝子は欠失または突然変異を含んでいてよいが、依然としてＵＮ
Ｃ−５３タンパク質の機能性の脊椎動物ホモログをコードしている。
【００１２】 本発明によりさらに提供されるのは、本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の
脊椎動物ホモログをコードする野生型遺伝子に変異を有する変異体の脊椎動物非
ヒト生物を産生する方法であって、該変異は細胞の挙動または細胞運動性または
細胞の形状または細胞移動の方向性または微小管プラス端上に局在するタンパク
質複合体の微小管プラス端安定性または機能および局在性の制御に影響を及ぼし
、該生物においてＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ中に突然変異を誘
発することを含む方法である。これら変異体生物は、これら細胞機能に対する化
合物の影響を同定するためのスクリーニングに用いることができる。
脊椎動物ホモログをコードする野生型遺伝子に変異を有する変異体の脊椎動物非
ヒト生物を産生する方法であって、該変異は細胞の挙動または細胞運動性または
細胞の形状または細胞移動の方向性または微小管プラス端上に局在するタンパク
質複合体の微小管プラス端安定性または機能および局在性の制御に影響を及ぼし
、該生物においてＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ中に突然変異を誘
発することを含む方法である。これら変異体生物は、これら細胞機能に対する化
合物の影響を同定するためのスクリーニングに用いることができる。
【００１３】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ、または該ホモ
ログまたは該ホモログの機能性の等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体を
コードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、有利にも本発明によるＵＮＣ−５３
の脊椎動物ホモログの過剰発現の抑制に関連する疾患を治療または予防するため
の医薬として、またはかかる医薬の製造に用いることができる。そのような疾患
は、ニューロンの再生、血管再生または創傷の治癒を促進すること、または慢性
の神経変性疾患、精神病疾患または急性の外傷性障害または線維症疾患または細
胞もしくは上皮の極性を必要とする生理学的事象が異常に機能している疾患の治
療により軽減することができる。従って、本発明による脊椎動物ホモログ、その
優性の正もしくは負の変異体（dominant positive or negative mutants）、ま
たはそのインヒビターは、細胞の接触阻害を誘発または軽減するためにまたは癌
腫の進展を防ぐために有利に用いることができる。
ログまたは該ホモログの機能性の等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体を
コードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、有利にも本発明によるＵＮＣ−５３
の脊椎動物ホモログの過剰発現の抑制に関連する疾患を治療または予防するため
の医薬として、またはかかる医薬の製造に用いることができる。そのような疾患
は、ニューロンの再生、血管再生または創傷の治癒を促進すること、または慢性
の神経変性疾患、精神病疾患または急性の外傷性障害または線維症疾患または細
胞もしくは上皮の極性を必要とする生理学的事象が異常に機能している疾患の治
療により軽減することができる。従って、本発明による脊椎動物ホモログ、その
優性の正もしくは負の変異体（dominant positive or negative mutants）、ま
たはそのインヒビターは、細胞の接触阻害を誘発または軽減するためにまたは癌
腫の進展を防ぐために有利に用いることができる。
【００１４】 典型的に、上記医学的状態は、哺乳動物およびさらに好ましくはヒトにおいて
、ＵＮＣ−５３タンパク質のホモログかまたは本発明によるタンパク質またはタ
ンパク質自体をコードする核酸により治療することができる。あるいは、該ＵＮ
Ｃ−５３脊椎動物ホモログに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてそ
の発現を防ぐことができる。使用できる他の核酸配列の例としてはｍＲＮＡの３
'非翻訳領域が挙げられ、これは本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動
物ホモログをコードするゲノム配列の転写を防ぐのに用いることができる。
、ＵＮＣ−５３タンパク質のホモログかまたは本発明によるタンパク質またはタ
ンパク質自体をコードする核酸により治療することができる。あるいは、該ＵＮ
Ｃ−５３脊椎動物ホモログに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてそ
の発現を防ぐことができる。使用できる他の核酸配列の例としてはｍＲＮＡの３
'非翻訳領域が挙げられ、これは本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動
物ホモログをコードするゲノム配列の転写を防ぐのに用いることができる。
【００１５】 本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログは、適当な担体、希
釈剤または賦形剤とともに製薬学的に許容しうる組成物中に配合することができ
る。医薬組成物は、本発明による上記核酸配列をさらにまたは代わりに含んでい
るのが有利である。
釈剤または賦形剤とともに製薬学的に許容しうる組成物中に配合することができ
る。医薬組成物は、本発明による上記核酸配列をさらにまたは代わりに含んでい
るのが有利である。
【００１６】 薬理学的手段によるｈｕ−ＵＮＣ−５３／３の発現の誘発または抑制は、ニュ
ーロンの再生、血管再生または創傷の治癒を誘発するのに有利に用いることがで
き、または慢性の神経変性疾患、または急性の外傷性障害または線維症疾患、ま
たは細胞の極性を必要とする生理学的事象、または細胞の癌化（oncology）およ
び転移、またはアポトーシス経路に関与することができる。
ーロンの再生、血管再生または創傷の治癒を誘発するのに有利に用いることがで
き、または慢性の神経変性疾患、または急性の外傷性障害または線維症疾患、ま
たは細胞の極性を必要とする生理学的事象、または細胞の癌化（oncology）およ
び転移、またはアポトーシス経路に関与することができる。
【００１７】 それゆえ、本発明はまた、ある化合物が細胞の挙動、増殖、形質転換、細胞の
形状または運動性または細胞移動の方向性、微小管プラス端上のタンパク質複合
体の微小管プラス端安定性または機能および局在性の制御のインヒビターまたは
エンハンサーであるか否かの決定方法であって、該化合物を本発明によるトラン
スジェニック細胞と接触させ、ついで該細胞の表現型変化をスクリーニングする
ことを含む方法をも提供する。それゆえ、該方法は、該化合物が該トランスジェ
ニック細胞のシグナル伝達経路（本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎
動物ホモログは該経路の成員である）のインヒビターまたはエンハンサーを含む
か否か、あるいは該化合物が該細胞において平行するまたは重複するシグナル伝
達経路のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定するのに用いるこ
とができる。本発明はまた、該シグナル伝達経路における該タンパク質が本発明
によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログであること
を決定する方法をも提供する。
形状または運動性または細胞移動の方向性、微小管プラス端上のタンパク質複合
体の微小管プラス端安定性または機能および局在性の制御のインヒビターまたは
エンハンサーであるか否かの決定方法であって、該化合物を本発明によるトラン
スジェニック細胞と接触させ、ついで該細胞の表現型変化をスクリーニングする
ことを含む方法をも提供する。それゆえ、該方法は、該化合物が該トランスジェ
ニック細胞のシグナル伝達経路（本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎
動物ホモログは該経路の成員である）のインヒビターまたはエンハンサーを含む
か否か、あるいは該化合物が該細胞において平行するまたは重複するシグナル伝
達経路のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定するのに用いるこ
とができる。本発明はまた、該シグナル伝達経路における該タンパク質が本発明
によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログであること
を決定する方法をも提供する。
【００１８】 好ましくは、スクリーニングすべき表現型変化は、細胞の形状の変化または細
胞の移動性の変化を含む。トランスジェニック細胞を本発明の方法の一つの態様
に従って用いる場合には、Ｎ４神経芽細胞腫細胞を用いることができ、そのよう
な態様においてスクリーニングすべき表現型の変化は、神経突起増殖の長さ、糸
状仮足増殖の変化、波うち（ruffling）挙動または細胞接着の変化、微小管細胞
骨格の変化、微小管のプラス端領域上のタンパク質の局在性の変化またはアポト
ーシスのような細胞の変化であってよい。
胞の移動性の変化を含む。トランスジェニック細胞を本発明の方法の一つの態様
に従って用いる場合には、Ｎ４神経芽細胞腫細胞を用いることができ、そのよう
な態様においてスクリーニングすべき表現型の変化は、神経突起増殖の長さ、糸
状仮足増殖の変化、波うち（ruffling）挙動または細胞接着の変化、微小管細胞
骨格の変化、微小管のプラス端領域上のタンパク質の局在性の変化またはアポト
ーシスのような細胞の変化であってよい。
【００１９】 本発明の方法の他の態様において、トランスジェニック細胞はＭＣＦ−７乳癌
腫細胞を含む。典型的にそのような態様では、スクリーニングすべき表現型変化
はファゴキネシス（phagokinesis）の程度または糸状仮足の形成を含む。本発明
のこの側面の他の態様において、トランスジェニック細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞を
含む。典型的にそのような態様では、スクリーニングすべき表現型変化はフォー
カス形成の接触阻害の喪失を含む。本発明による方法はまた、本発明による上記
変異体細胞または変異体生物をも利用するものであり、その際、該変異体細胞は
組織培養またはインビボで増殖することができ、細胞かまたは生物体のいずれか
が野生型ｕｎｃ−５３遺伝子中に変異を有している。
腫細胞を含む。典型的にそのような態様では、スクリーニングすべき表現型変化
はファゴキネシス（phagokinesis）の程度または糸状仮足の形成を含む。本発明
のこの側面の他の態様において、トランスジェニック細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞を
含む。典型的にそのような態様では、スクリーニングすべき表現型変化はフォー
カス形成の接触阻害の喪失を含む。本発明による方法はまた、本発明による上記
変異体細胞または変異体生物をも利用するものであり、その際、該変異体細胞は
組織培養またはインビボで増殖することができ、細胞かまたは生物体のいずれか
が野生型ｕｎｃ−５３遺伝子中に変異を有している。
【００２０】 本発明によれば、「表現型変化」は上記細胞、組織または生物体のライフサイ
クルのいずれかの適当な時点での変化の結果生じる表現型を含み、該変化は本発
明のトランスジーンの発現、たとえば増殖、生存能、形態、挙動、運動、細胞移
動または細胞プロセスまたは細胞の成長円錐の伸長に帰することができるもので
あり、体型、移動、走化性、接触阻害、つがい行動などの変化を含む。表現型変
化は、好ましくは細胞を全体として視覚で検査することによって直接、またはＦ
−アクチン細胞骨格微小管ネットワークおよび微小管または微小管上にあるタン
パク質の微小管プラス端安定性をモニターすることにより、あるいはたとえば内
生のまたはトランスジーンにより導入された組織化学的マーカーまたは他のリポ
ーター遺伝子（たとえば、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質など
）を含む生存能の指標を測定することによってモニターすることができる。
クルのいずれかの適当な時点での変化の結果生じる表現型を含み、該変化は本発
明のトランスジーンの発現、たとえば増殖、生存能、形態、挙動、運動、細胞移
動または細胞プロセスまたは細胞の成長円錐の伸長に帰することができるもので
あり、体型、移動、走化性、接触阻害、つがい行動などの変化を含む。表現型変
化は、好ましくは細胞を全体として視覚で検査することによって直接、またはＦ
−アクチン細胞骨格微小管ネットワークおよび微小管または微小管上にあるタン
パク質の微小管プラス端安定性をモニターすることにより、あるいはたとえば内
生のまたはトランスジーンにより導入された組織化学的マーカーまたは他のリポ
ーター遺伝子（たとえば、β−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質など
）を含む生存能の指標を測定することによってモニターすることができる。
【００２１】 本発明による上記方法により、たとえば細胞の形状または運動性または細胞移
動の方向性の制御などの上記で同定されたプロセスのエンハンサーとして同定さ
れうる化合物は、ニューロン再生、血管再生または創傷の治癒を促進するための
、または慢性の神経変性疾患または急性の外傷性障害または線維症の治療のため
の医薬として、あるいは医薬の製造に用いることができる。ニューロン再生の促
進の例としては、たとえば、外傷および脊髄外傷後の末梢神経の再生が挙げられ
る。
動の方向性の制御などの上記で同定されたプロセスのエンハンサーとして同定さ
れうる化合物は、ニューロン再生、血管再生または創傷の治癒を促進するための
、または慢性の神経変性疾患または急性の外傷性障害または線維症の治療のため
の医薬として、あるいは医薬の製造に用いることができる。ニューロン再生の促
進の例としては、たとえば、外傷および脊髄外傷後の末梢神経の再生が挙げられ
る。
【００２２】 上記方法によりある化合物が細胞の形状または運動性または細胞移動の方向性
の制御のインヒビターとして同定される場合には、該化合物は、転移における癌
腫の広まりのような疾患誘発細胞の広まりを実質的に軽減するため、または接触
阻害の喪失を軽減するための医薬として、あるいは医薬の製造に用いることがで
きる。有利にも、上記方法に従ってインヒビターまたはエンハンサーとして同定
された化合物はまた、各化合物および製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または
賦形剤を含む医薬組成物中に含まれていてよい。
の制御のインヒビターとして同定される場合には、該化合物は、転移における癌
腫の広まりのような疾患誘発細胞の広まりを実質的に軽減するため、または接触
阻害の喪失を軽減するための医薬として、あるいは医薬の製造に用いることがで
きる。有利にも、上記方法に従ってインヒビターまたはエンハンサーとして同定
された化合物はまた、各化合物および製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または
賦形剤を含む医薬組成物中に含まれていてよい。
【００２３】 細胞の運動性、形状、増殖または細胞移動の方向性または微小管またはそのプ
ラス端領域への会合のインヒビターかまたはエンハンサーのいずれかとして同定
された化合物の特定の作用機構は制限されるものではない。好ましくは該化合物
はシグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーとして作用する。これら
化合物はまた、平行経路に対してまたはＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク
質の脊椎動物ホモログに対して直接作用する。たとえば、該化合物の作用方法と
しては、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログとの直接相互作用、ＵＮＣ
−５３の脊椎動物ホモログのリン酸化または脱リン酸化の制御プロセスとの相互
作用、またはｕｎｃ−５３遺伝子の活性の制御プロセスとの相互作用または転写
後もしくは翻訳後修飾のプロセスとの相互作用などが挙げられる。
ラス端領域への会合のインヒビターかまたはエンハンサーのいずれかとして同定
された化合物の特定の作用機構は制限されるものではない。好ましくは該化合物
はシグナル伝達経路のインヒビターまたはエンハンサーとして作用する。これら
化合物はまた、平行経路に対してまたはＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク
質の脊椎動物ホモログに対して直接作用する。たとえば、該化合物の作用方法と
しては、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログとの直接相互作用、ＵＮＣ
−５３の脊椎動物ホモログのリン酸化または脱リン酸化の制御プロセスとの相互
作用、またはｕｎｃ−５３遺伝子の活性の制御プロセスとの相互作用または転写
後もしくは翻訳後修飾のプロセスとの相互作用などが挙げられる。
【００２４】 好ましくは、該化合物は、本発明の方法により細胞、組織または生物体の表現
型の差異（可視化できるものである）を利用することにより、インヒビターまた
はエンハンサーとして同定される。あるいは、内生またはトランスジーンにより
導入した組織化学的マーカーまたはリポーター遺伝子を含む視覚化の指標を用い
ることもできる。
型の差異（可視化できるものである）を利用することにより、インヒビターまた
はエンハンサーとして同定される。あるいは、内生またはトランスジーンにより
導入した組織化学的マーカーまたはリポーター遺伝子を含む視覚化の指標を用い
ることもできる。
【００２５】 本発明のさらなる態様によれば、リポーター分子をコードする核酸配列に作動
可能に連結した本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ
をコードする遺伝子のプロモーター配列を含むように構築したトランスジェニッ
ク細胞または組織培養液もまた提供される。好ましくは、リポーター配列は、検
出可能なタンパク質、たとえば、抗生物質耐性、β−ガラクトシダーゼ、または
分光測光アッセイ、分光蛍光アッセイ、ルミネセントアッセイもしくは放射能ア
ッセイにより検出しうる分子などの視覚検査によりモニターしうるものをコード
している。
可能に連結した本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ
をコードする遺伝子のプロモーター配列を含むように構築したトランスジェニッ
ク細胞または組織培養液もまた提供される。好ましくは、リポーター配列は、検
出可能なタンパク質、たとえば、抗生物質耐性、β−ガラクトシダーゼ、または
分光測光アッセイ、分光蛍光アッセイ、ルミネセントアッセイもしくは放射能ア
ッセイにより検出しうる分子などの視覚検査によりモニターしうるものをコード
している。
【００２６】 本発明はまた、ある化合物が本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タン
パク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転写のインヒビターまたはエン
ハンサーであるか否かを決定する方法をも提供し、該方法は、工程： （ａ）該化合物を本発明による上記トランスジェニック細胞と接触させ、ついで （ｂ）該リポーター分子のレベルをモニターし、このモニター工程で得られた結
果を、該化合物の不在下のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該
ホモログの機能性の断片をコードする遺伝子のプロモーター配列およびリポータ
ー分子を含む対照と比較すること を含む。 本発明のこの側面による方法の一つの態様において、リポーター分子はメッセ
ンジャーＲＮＡを含む。
パク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転写のインヒビターまたはエン
ハンサーであるか否かを決定する方法をも提供し、該方法は、工程： （ａ）該化合物を本発明による上記トランスジェニック細胞と接触させ、ついで （ｂ）該リポーター分子のレベルをモニターし、このモニター工程で得られた結
果を、該化合物の不在下のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該
ホモログの機能性の断片をコードする遺伝子のプロモーター配列およびリポータ
ー分子を含む対照と比較すること を含む。 本発明のこの側面による方法の一つの態様において、リポーター分子はメッセ
ンジャーＲＮＡを含む。
【００２７】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該ホモロ
グの機能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体をコードする遺伝子の転写の
エンハンサーとして同定された化合物はまた、ニューロン再生、血管再生または
創傷の治癒を促進するための、または慢性の神経変性疾患または急性の外傷性障
害または線維症の治療のための医薬として、あるいは医薬の製造に用いることが
できる。さらに、そのような化合物は、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤また
は賦形剤を含む医薬組成物中に配合することができる。転写のインヒビターとし
て同定された化合物は、有利にも、癌腫などの細胞を誘発する疾患の広まりまた
は転移または接触阻害の喪失を軽減するために用いることができる。
グの機能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体をコードする遺伝子の転写の
エンハンサーとして同定された化合物はまた、ニューロン再生、血管再生または
創傷の治癒を促進するための、または慢性の神経変性疾患または急性の外傷性障
害または線維症の治療のための医薬として、あるいは医薬の製造に用いることが
できる。さらに、そのような化合物は、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤また
は賦形剤を含む医薬組成物中に配合することができる。転写のインヒビターとし
て同定された化合物は、有利にも、癌腫などの細胞を誘発する疾患の広まりまた
は転移または接触阻害の喪失を軽減するために用いることができる。
【００２８】 本発明はまた、ある化合物が細胞増殖、形質転換、細胞の運動性または形状ま
たは細胞移動の方向性の制御のエンハンサーかまたはインヒビターであるか否か
を決定するためのキットをも提供するものであり、該キットは本発明による上記
トランスジェニック細胞または変異細胞またはトランスジェニック非ヒト生物体
または変異非ヒト生物体の少なくとも一つおよび同じ型の複数の野生型細胞また
は野生型生物体、または細胞系または組織培養液および該化合物を該細胞または
生物体と接触させる手段を含む。
たは細胞移動の方向性の制御のエンハンサーかまたはインヒビターであるか否か
を決定するためのキットをも提供するものであり、該キットは本発明による上記
トランスジェニック細胞または変異細胞またはトランスジェニック非ヒト生物体
または変異非ヒト生物体の少なくとも一つおよび同じ型の複数の野生型細胞また
は野生型生物体、または細胞系または組織培養液および該化合物を該細胞または
生物体と接触させる手段を含む。
【００２９】 また、ある化合物が本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の
脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転写インヒビターかまたはエンハンサー
であるか否かを決定するキットも提供され、該キットは、本発明による少なくと
も一つのトランスジェニック細胞、該化合物を該細胞と接触させる手段および本
発明による該トランスジェニック細胞の転写レベルをモニターする手段を含む。
脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転写インヒビターかまたはエンハンサー
であるか否かを決定するキットも提供され、該キットは、本発明による少なくと
も一つのトランスジェニック細胞、該化合物を該細胞と接触させる手段および本
発明による該トランスジェニック細胞の転写レベルをモニターする手段を含む。
【００３０】 本発明の目的のためには、「ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログまたは該ホモロ
グの機能性の断片をコードする遺伝子」は、図１に示す核酸配列またはその断片
（異なってスプライシングされるイソ型および該核酸配列の転写開始を含む）を
含み、該配列はＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該タンパク質
の機能性の等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体をコードするものである
。
グの機能性の断片をコードする遺伝子」は、図１に示す核酸配列またはその断片
（異なってスプライシングされるイソ型および該核酸配列の転写開始を含む）を
含み、該配列はＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該タンパク質
の機能性の等価物、誘導体、断片または生物学的前駆体をコードするものである
。
【００３１】 本発明はまた、本発明によるＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログがその成員であ
るシグナル伝達経路において活性であるタンパク質をコードする脊椎動物の遺伝
子または該遺伝子の断片を同定する方法をも提供する。好ましい方法は、適当な
ｃＤＮＡライブラリーに上記核酸分子またはその断片を、本発明による上記ｃＤ
ＮＡ配列のいずれか一つのｃＤＮＡクローンと統計的に有意なホモロジーを有す
る遺伝子を同定するために適当なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ
させることを含む。
るシグナル伝達経路において活性であるタンパク質をコードする脊椎動物の遺伝
子または該遺伝子の断片を同定する方法をも提供する。好ましい方法は、適当な
ｃＤＮＡライブラリーに上記核酸分子またはその断片を、本発明による上記ｃＤ
ＮＡ配列のいずれか一つのｃＤＮＡクローンと統計的に有意なホモロジーを有す
る遺伝子を同定するために適当なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズ
させることを含む。
【００３２】 さらに、細胞のシグナル伝達経路（本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５
３タンパク質の脊椎動物ホモログがその成員である）において活性であるタンパ
ク質を同定する方法も提供される。本発明のこの側面によれば、該方法は、 （ａ）該細胞の抽出液をＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該タ
ンパク質の機能性の等価物、断片または生物学的前駆体に対する抗体と接触させ
、 （ｂ）抗体／ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ複合体を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合し
た該抗体以外のタンパク質を同定する ことを含む。
３タンパク質の脊椎動物ホモログがその成員である）において活性であるタンパ
ク質を同定する方法も提供される。本発明のこの側面によれば、該方法は、 （ａ）該細胞の抽出液をＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該タ
ンパク質の機能性の等価物、断片または生物学的前駆体に対する抗体と接触させ
、 （ｂ）抗体／ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログ複合体を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合し
た該抗体以外のタンパク質を同定する ことを含む。
【００３３】 それゆえ、ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログは、シグナル伝達経路
に関与する他のタンパク質の領域に結合する。シグナル伝達経路に関与するタン
パク質の全領域を連続的に同定することも可能である。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに対する抗体は、当業者に知られ
た方法により産生することができる。たとえば、マウスなどの宿主動物に本発明
によるタンパク質またはタンパク質のエピトープを接種し、ついで免疫血清を回
収することによりポリクローナル抗体を調製できる。
に関与する他のタンパク質の領域に結合する。シグナル伝達経路に関与するタン
パク質の全領域を連続的に同定することも可能である。 ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに対する抗体は、当業者に知られ
た方法により産生することができる。たとえば、マウスなどの宿主動物に本発明
によるタンパク質またはタンパク質のエピトープを接種し、ついで免疫血清を回
収することによりポリクローナル抗体を調製できる。
【００３４】 本発明のこの側面は、細胞のシグナル伝達経路（ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモ
ログがその成員である）において活性であるさらなるタンパク質の同定方法をも
包含し、該方法は： （ａ）上記方法においてＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合した
最初に同定されたタンパク質に対する抗体を生成させ、 （ｂ）細胞の抽出液を該抗体と接触させ、 （ｃ）抗体／タンパク質複合体を同定し、 （ｄ）該複合体を分析して該第一のタンパク質に結合した該抗体以外のさらなる
タンパク質を同定し、ついで （ｅ）任意に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して該経路においてさらなるタンパク
質を同定する ことを含む。
ログがその成員である）において活性であるさらなるタンパク質の同定方法をも
包含し、該方法は： （ａ）上記方法においてＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合した
最初に同定されたタンパク質に対する抗体を生成させ、 （ｂ）細胞の抽出液を該抗体と接触させ、 （ｃ）抗体／タンパク質複合体を同定し、 （ｄ）該複合体を分析して該第一のタンパク質に結合した該抗体以外のさらなる
タンパク質を同定し、ついで （ｅ）任意に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返して該経路においてさらなるタンパク
質を同定する ことを含む。
【００３５】 本発明のこの側面によれば、該抗体がシグナル伝達経路または発癌経路におい
て本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合することによ
って該プロセスが開始される。ついで、該結合した抗体またはＵＮＣ−５３タン
パク質と複合体を形成していることがわかった他のタンパク質を、該経路に関与
するさらなる相互作用タンパク質を同定するのに用いることができる。
て本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合することによ
って該プロセスが開始される。ついで、該結合した抗体またはＵＮＣ−５３タン
パク質と複合体を形成していることがわかった他のタンパク質を、該経路に関与
するさらなる相互作用タンパク質を同定するのに用いることができる。
【００３６】 また、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを用いる
ことにより、細胞のシグナル伝達経路（ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログがその
成員である）に関与するタンパク質を同定することも可能である。本発明のこの
側面によれば、該方法は： （ａ）該細胞の抽出液をＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホ
モログまたは該ホモログの機能性の等価物、断片または生物学的前駆体と接触さ
せ、 （ｂ）生成したＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ／タンパク質複合体
を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合し
たＵＮＣ−５３タンパク質の同脊椎動物ホモログ以外のタンパク質を同定する ことを含む。
ことにより、細胞のシグナル伝達経路（ＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログがその
成員である）に関与するタンパク質を同定することも可能である。本発明のこの
側面によれば、該方法は： （ａ）該細胞の抽出液をＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホ
モログまたは該ホモログの機能性の等価物、断片または生物学的前駆体と接触さ
せ、 （ｂ）生成したＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ／タンパク質複合体
を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合し
たＵＮＣ−５３タンパク質の同脊椎動物ホモログ以外のタンパク質を同定する ことを含む。
【００３７】 この方法はまた、有利にも、上記で用いた細胞の抽出液を、工程（ｃ）におい
てＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログではないと同定されたタンパク質
と接触させ、ついで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことにより、細胞のシグ
ナル伝達経路におけるさらなるタンパク質を同定するのに用いることができる。
てＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログではないと同定されたタンパク質
と接触させ、ついで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことにより、細胞のシグ
ナル伝達経路におけるさらなるタンパク質を同定するのに用いることができる。
【００３８】 細胞のシグナル伝達経路におけるタンパク質を同定するのに用いることのでき
る他の方法としては、たとえば、当業者によく知られたウエスタンブロット重層
（overlay）法が挙げられる。細胞抽出液をゲル上で処理してタンパク質を分離
し、その後、ナイロン膜上にブロッティングする。ついで、これら膜を、たとえ
ば、ビオチンや放射性標識などの標識を付着したＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモロ
グを含む培地中でインキュベートし、ついでタンパク質コンジュゲートをたとえ
ばストレプトアビジンまたはアルカリホスファターゼ結合抗体で視覚化する。
る他の方法としては、たとえば、当業者によく知られたウエスタンブロット重層
（overlay）法が挙げられる。細胞抽出液をゲル上で処理してタンパク質を分離
し、その後、ナイロン膜上にブロッティングする。ついで、これら膜を、たとえ
ば、ビオチンや放射性標識などの標識を付着したＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモロ
グを含む培地中でインキュベートし、ついでタンパク質コンジュゲートをたとえ
ばストレプトアビジンまたはアルカリホスファターゼ結合抗体で視覚化する。
【００３９】 本発明はまた、有利にも、上記方法のため、細胞移動の速度および方向性また
は細胞増殖または形状の制御に関与するタンパク質またはその断片を認識する結
合抗体の製造方法をも提供する。 ＵＮＣ−５３の適当な脊椎動物ホモログ（またはその機能性の等価物）に結合
するモノクローナル抗体は、Kohler R.およびMilstein C.,(1975)Nature 256,49
5-497に記載されているような公知の技術により製造できる。
は細胞増殖または形状の制御に関与するタンパク質またはその断片を認識する結
合抗体の製造方法をも提供する。 ＵＮＣ−５３の適当な脊椎動物ホモログ（またはその機能性の等価物）に結合
するモノクローナル抗体は、Kohler R.およびMilstein C.,(1975)Nature 256,49
5-497に記載されているような公知の技術により製造できる。
【００４０】 細胞のシグナル伝達経路（本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物ホモログがその成員である）に関与するタンパク質を同定するの
に用いることのできる他の方法は、ツーハイブリッドベクター法を用いてタンパ
ク質−タンパク質相互作用を調べることを含む。この方法は当業者によく知られ
たものであるが、Chienら（1991）によって最初に開発された。この技術は、リ
ポーター遺伝子を活性化する転写要素のインビボでの機能的な再構築に基づく。
さらに詳細には、この技術は、プロモーター（ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化
ドメインを有する転写要素により制御されている）の制御下でリポーター遺伝子
を含むＤＮＡ構築物を有する適当な宿主細胞を用意し、本発明による核酸配列の
断片またはすべてと該転写要素の該ＤＮＡ結合ドメインかまたは該活性化ドメイ
ンとの第一の融合をコードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞中で発
現させ、該転写要素の該ＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインのいずれか
（第一の融合中に導入されたものでないもの）とともに調べようとする推定結合
タンパク質をコードする少なくとも一つの第二のハイブリッドＤＮＡ配列（ライ
ブラリーなど）を宿主細胞中で発現させ、宿主細胞中でのリポーター遺伝子産物
の存在を検出することにより本発明によるタンパク質への調べようとするタンパ
ク質の結合を検出し、ついで任意に該結合タンパク質をコードする第二のハイブ
リッドＤＮＡ配列を単離することを含む。
ク質の脊椎動物ホモログがその成員である）に関与するタンパク質を同定するの
に用いることのできる他の方法は、ツーハイブリッドベクター法を用いてタンパ
ク質−タンパク質相互作用を調べることを含む。この方法は当業者によく知られ
たものであるが、Chienら（1991）によって最初に開発された。この技術は、リ
ポーター遺伝子を活性化する転写要素のインビボでの機能的な再構築に基づく。
さらに詳細には、この技術は、プロモーター（ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化
ドメインを有する転写要素により制御されている）の制御下でリポーター遺伝子
を含むＤＮＡ構築物を有する適当な宿主細胞を用意し、本発明による核酸配列の
断片またはすべてと該転写要素の該ＤＮＡ結合ドメインかまたは該活性化ドメイ
ンとの第一の融合をコードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列を宿主細胞中で発
現させ、該転写要素の該ＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインのいずれか
（第一の融合中に導入されたものでないもの）とともに調べようとする推定結合
タンパク質をコードする少なくとも一つの第二のハイブリッドＤＮＡ配列（ライ
ブラリーなど）を宿主細胞中で発現させ、宿主細胞中でのリポーター遺伝子産物
の存在を検出することにより本発明によるタンパク質への調べようとするタンパ
ク質の結合を検出し、ついで任意に該結合タンパク質をコードする第二のハイブ
リッドＤＮＡ配列を単離することを含む。
【００４１】 そのような技術の一例では酵母におけるＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡ
Ｌ４は酵母におけるガラクトース代謝の転写アクチベーターであり、ガラクトー
ス代謝遺伝子の上流のアクチベーターに結合する別個のドメインおよびタンパク
質結合ドメインを有する。その一つがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードす
るヌクレオチド残基を含むヌクレオチドベクターを構築することができる。これ
ら結合ドメイン残基は、知られたタンパク質コード配列、たとえばＵＮＣ−５３
の脊椎動物ホモログをコードする配列に融合することができる。
Ｌ４は酵母におけるガラクトース代謝の転写アクチベーターであり、ガラクトー
ス代謝遺伝子の上流のアクチベーターに結合する別個のドメインおよびタンパク
質結合ドメインを有する。その一つがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードす
るヌクレオチド残基を含むヌクレオチドベクターを構築することができる。これ
ら結合ドメイン残基は、知られたタンパク質コード配列、たとえばＵＮＣ−５３
の脊椎動物ホモログをコードする配列に融合することができる。
【００４２】 他のベクターは、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードする残基を含む
。これら残基を、好ましくは当該脊椎動物のシグナル伝達経路からの被験タンパ
ク質をコードする残基に融合させる。ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモロ
グと試験すべきタンパク質との間の相互作用は、これらベクターを形質転換した
ＧＡＬ−４転写欠損酵母細胞でのリポーター分子の転写活性化へと導く。好まし
くは、β−ガラクトシダーゼなどのリポーター分子は、酵母のガラクトース代謝
遺伝子の転写の回復とともに活性化される。この方法は、調べようとするシグナ
ル伝達経路または平行もしくは重複経路に関与するタンパク質間の相互作用を可
能にする。
。これら残基を、好ましくは当該脊椎動物のシグナル伝達経路からの被験タンパ
ク質をコードする残基に融合させる。ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモロ
グと試験すべきタンパク質との間の相互作用は、これらベクターを形質転換した
ＧＡＬ−４転写欠損酵母細胞でのリポーター分子の転写活性化へと導く。好まし
くは、β−ガラクトシダーゼなどのリポーター分子は、酵母のガラクトース代謝
遺伝子の転写の回復とともに活性化される。この方法は、調べようとするシグナ
ル伝達経路または平行もしくは重複経路に関与するタンパク質間の相互作用を可
能にする。
【００４３】 細胞（たとえば、哺乳動物細胞であってよい）のシグナル伝達経路において同
定されたタンパク質はまた、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と
ともに医薬組成物中に配合することができる。
定されたタンパク質はまた、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と
ともに医薬組成物中に配合することができる。
【００４４】 本発明はまた、本発明によるＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎
動物ホモログの製造方法をも提供し、該方法は、本発明による上記ｃＤＮＡ配列
を有するｃＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞
を培養し、ついで発現されたタンパク質ホモログを回収することを含む。該細胞
は、有利には細菌細胞、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞であってよい。
動物ホモログの製造方法をも提供し、該方法は、本発明による上記ｃＤＮＡ配列
を有するｃＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞
を培養し、ついで発現されたタンパク質ホモログを回収することを含む。該細胞
は、有利には細菌細胞、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞であってよい。
【００４５】 ＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホモログを製造するための特に好ましい
方法は昆虫細胞を用いる。従って、本発明は、本発明によるＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの製造方法を提供するものであり、該
方法は、組換えバキュロウイルスベクターで形質転換またはトランスフェクショ
ンした昆虫細胞を培養し、その際、該ベクターは該バキュロウイルスのポリヘド
リンプロモーターの下流に本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホ
モログをコードするヌクレオチド配列を含み、ついで発現されたタンパク質を回
収することを含む。有利にも、この方法は、回収のために大量のタンパク質を産
生する。昆虫細胞は、たとえば、Spodoptera frugiperdaまたはDrosophila Mela
nogesterからのものであってよい。
方法は昆虫細胞を用いる。従って、本発明は、本発明によるＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの製造方法を提供するものであり、該
方法は、組換えバキュロウイルスベクターで形質転換またはトランスフェクショ
ンした昆虫細胞を培養し、その際、該ベクターは該バキュロウイルスのポリヘド
リンプロモーターの下流に本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホ
モログをコードするヌクレオチド配列を含み、ついで発現されたタンパク質を回
収することを含む。有利にも、この方法は、回収のために大量のタンパク質を産
生する。昆虫細胞は、たとえば、Spodoptera frugiperdaまたはDrosophila Mela
nogesterからのものであってよい。
【００４６】 本発明によれば、定められた核酸配列は、同一の核酸のみならず保存的なアミ
ノ酸置換における縮重コードのために同義コドン（同じアミノ酸を指定する異な
るコドン）という結果となる天然核酸配列からのマイナーな塩基変異（とりわけ
塩基の置換を含む）をも含む。「核酸配列」なる語はまた、所定の一本鎖配列（
塩基変異に関する上記定義を含む）に相補的な配列をも包含する。
ノ酸置換における縮重コードのために同義コドン（同じアミノ酸を指定する異な
るコドン）という結果となる天然核酸配列からのマイナーな塩基変異（とりわけ
塩基の置換を含む）をも含む。「核酸配列」なる語はまた、所定の一本鎖配列（
塩基変異に関する上記定義を含む）に相補的な配列をも包含する。
【００４７】 さらに、本発明により定められたタンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸配
列は、同一のアミノ酸配列のみならず、保存的なアミノ酸置換（側鎖が関連した
アミノ酸による置換）を含む天然アミノ酸配列からのマイナーなアミノ酸変異を
も含む。また、天然のアミノ酸とは異なるが天然に存在する配列によってコード
されるポリペプチドと免疫学的に同一または類似のポリペプチドという結果とな
るアミノ酸配列も含まれる。そのようなポリペプチドは対応する核酸配列によっ
てコードされてよい。
列は、同一のアミノ酸配列のみならず、保存的なアミノ酸置換（側鎖が関連した
アミノ酸による置換）を含む天然アミノ酸配列からのマイナーなアミノ酸変異を
も含む。また、天然のアミノ酸とは異なるが天然に存在する配列によってコード
されるポリペプチドと免疫学的に同一または類似のポリペプチドという結果とな
るアミノ酸配列も含まれる。そのようなポリペプチドは対応する核酸配列によっ
てコードされてよい。
【００４８】 本発明のさらなる側面は、本発明による核酸の少なくとも１５ヌクレオチド、
好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列を提供する。 これら配列は、有利にも複製等を開始するためのプローブまたはプライマーと
して用いることができる。そのような核酸配列は、組換え手段や合成手段などの
当該技術分野においてよく知られた方法に従って製造することができる。そのよ
うな核酸配列はまた、本発明による核酸の存在を検出するための診断キット等に
おいて用いることができる。これら試験は一般に、該プローブを試料とハイブリ
ダイズ条件下で接触させ、ついで該プローブと該試料中の核酸との間の二本鎖生
成の存在を検出することを含む。本発明による核酸配列はまた、Sambrookら（Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual,1989）により記載されているような組
換え手段または合成手段を用いて製造できる。有利にも、本発明によるＤＮＡの
ヒトアレル変異体または多型は、たとえば、所定の範囲の個体からのＤＮＡ、た
とえば異なる集団からのものをプローブすることにより同定することができる。
さらに、本発明による核酸およびプローブは、当該技術分野でよく知られた技術
、たとえばサンガーのジデオキシチェインターミネーション法を用いて患者から
のゲノムＤＮＡをシークエンシングするのに用いることができ、該方法は有利に
もある患者のある疾患への疾病素質を確認することができる。
好ましくは１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列を提供する。 これら配列は、有利にも複製等を開始するためのプローブまたはプライマーと
して用いることができる。そのような核酸配列は、組換え手段や合成手段などの
当該技術分野においてよく知られた方法に従って製造することができる。そのよ
うな核酸配列はまた、本発明による核酸の存在を検出するための診断キット等に
おいて用いることができる。これら試験は一般に、該プローブを試料とハイブリ
ダイズ条件下で接触させ、ついで該プローブと該試料中の核酸との間の二本鎖生
成の存在を検出することを含む。本発明による核酸配列はまた、Sambrookら（Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual,1989）により記載されているような組
換え手段または合成手段を用いて製造できる。有利にも、本発明によるＤＮＡの
ヒトアレル変異体または多型は、たとえば、所定の範囲の個体からのＤＮＡ、た
とえば異なる集団からのものをプローブすることにより同定することができる。
さらに、本発明による核酸およびプローブは、当該技術分野でよく知られた技術
、たとえばサンガーのジデオキシチェインターミネーション法を用いて患者から
のゲノムＤＮＡをシークエンシングするのに用いることができ、該方法は有利に
もある患者のある疾患への疾病素質を確認することができる。
【００４９】 本発明に従い、ある化合物がＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモロ
グの発現のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを検出する方法もまた
提供され、該方法は、該ホモログを発現する細胞を該化合物と接触させ、ついで
該化合物と接触させていない対照細胞と比較した表現型変化をモニターすること
を含む。 好ましくは、細胞は上記トランスジェニック細胞である。あるいは該細胞は接
触阻害の喪失を受けていてもよい。
グの発現のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを検出する方法もまた
提供され、該方法は、該ホモログを発現する細胞を該化合物と接触させ、ついで
該化合物と接触させていない対照細胞と比較した表現型変化をモニターすること
を含む。 好ましくは、細胞は上記トランスジェニック細胞である。あるいは該細胞は接
触阻害の喪失を受けていてもよい。
【００５０】 本発明はまた、該化合物が該脊椎動物ホモログの発現のインヒビターであるか
否かを決定する方法をも提供する。一つの態様において、試験すべき化合物は核
酸である。 好ましくは、該核酸配列はアンチセンスＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を含む
。 好ましくは、該ｍＲＮＡ配列は該脊椎動物ホモログをコードするｍＲＮＡの３
'非翻訳領域を含む。
否かを決定する方法をも提供する。一つの態様において、試験すべき化合物は核
酸である。 好ましくは、該核酸配列はアンチセンスＤＮＡ配列またはｍＲＮＡ配列を含む
。 好ましくは、該ｍＲＮＡ配列は該脊椎動物ホモログをコードするｍＲＮＡの３
'非翻訳領域を含む。
【００５１】 あるいは、試験すべき化合物はタンパク質であってよい。好ましくは、該タン
パク質は該脊椎動物ホモログの機能を阻害するのに潜在的に適したアミノ酸配列
を有するタンパク質を含み、好ましくは上記方法により同定したタンパク質を含
む。 本発明はまた、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに化合
物、たとえば上記方法に従って同定したアンチセンス核酸を含む医薬組成物をも
提供する。
パク質は該脊椎動物ホモログの機能を阻害するのに潜在的に適したアミノ酸配列
を有するタンパク質を含み、好ましくは上記方法により同定したタンパク質を含
む。 本発明はまた、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに化合
物、たとえば上記方法に従って同定したアンチセンス核酸を含む医薬組成物をも
提供する。
【００５２】 本発明のこの側面に従って同定される核酸配列またはタンパク質は、癌の接触
阻害の喪失（ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該ホモログの機
能性の等価物、断片、誘導体または生物学的前駆体によって媒体される）を治療
するための医薬として、または医薬の製造に用いることができる。 さらに本発明によって提供されるのは、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の発現を抑制するための医薬の製造
に使用するための上記核酸である。
阻害の喪失（ＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたは該ホモログの機
能性の等価物、断片、誘導体または生物学的前駆体によって媒体される）を治療
するための医薬として、または医薬の製造に用いることができる。 さらに本発明によって提供されるのは、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の発現を抑制するための医薬の製造
に使用するための上記核酸である。
【００５３】 さらに本発明によって提供されるのは、脊椎動物細胞においてＣ．エレガンス
のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現を検出するためのアッセイ
であり、該アッセイは細胞またはその抽出液を該脊椎動物ホモログに対する抗体
（該抗体はリポーター分子に融合されている）と接触させ、未結合の抗体を除去
し、ついで該リポーター分子の存在をモニターすることを含む。 好ましくは、該リポーター分子は、たとえばフルオレセインなどの蛍光団（fl
uorophore）あるいはストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体
である。
のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現を検出するためのアッセイ
であり、該アッセイは細胞またはその抽出液を該脊椎動物ホモログに対する抗体
（該抗体はリポーター分子に融合されている）と接触させ、未結合の抗体を除去
し、ついで該リポーター分子の存在をモニターすることを含む。 好ましくは、該リポーター分子は、たとえばフルオレセインなどの蛍光団（fl
uorophore）あるいはストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体
である。
【００５４】 本発明のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の発
現を検出する方法もまた提供され、該方法は、本発明による該脊椎動物ホモログ
をコードするまたは該脊椎動物ホモログに対応するタンパク質配列の核酸に特異
的なプローブ（該プローブはリポーターに連結されている）を細胞抽出液と接触
させ、ついで該リポーターの存在を分析することを含む。 好ましくは、該プローブは本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物
ホモログをコードする該遺伝子から転写されたｍＲＮＡの所定の領域に相補的な
配列である。
現を検出する方法もまた提供され、該方法は、本発明による該脊椎動物ホモログ
をコードするまたは該脊椎動物ホモログに対応するタンパク質配列の核酸に特異
的なプローブ（該プローブはリポーターに連結されている）を細胞抽出液と接触
させ、ついで該リポーターの存在を分析することを含む。 好ましくは、該プローブは本発明によるＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物
ホモログをコードする該遺伝子から転写されたｍＲＮＡの所定の領域に相補的な
配列である。
【００５５】 好ましくは、該相補的な配列は該ｍＲＮＡの３'または５'非翻訳領域である。
好ましくは、該リポーターはディグ（dig）標識、蛍光団、ハプテンまたは放射
能標識であってよい。 好ましくは、該プローブは該ＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホモログに
特異的な抗体を含む。 好ましくは、該リポーター分子は、たとえばフルオレセインなどの蛍光団ある
いはストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体である。
好ましくは、該リポーターはディグ（dig）標識、蛍光団、ハプテンまたは放射
能標識であってよい。 好ましくは、該プローブは該ＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホモログに
特異的な抗体を含む。 好ましくは、該リポーター分子は、たとえばフルオレセインなどの蛍光団ある
いはストレプトアビジンなどの酵素にコンジュゲートした抗体である。
【００５６】 上記のように、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質は微小管、とりわけ
微小管の（＋）端に局在することがわかっている。それゆえ、本発明のさらなる
側面により、ある化合物が本発明のＵＮＣ−５３ホモログの微小管またはそのプ
ラス端への会合のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法
が提供され、該方法は、（ａ）該化合物を該脊椎動物ホモログ（該タンパク質は
リポーター分子に作動可能に連結されている）を発現するトランスジェニック細
胞、組織または生物体と接触させ、ついで（ｂ）該化合物と接触させなかった工
程（ａ）による細胞と比較して該リポーター分子の局在をスクリーニングするこ
とを含む。
微小管の（＋）端に局在することがわかっている。それゆえ、本発明のさらなる
側面により、ある化合物が本発明のＵＮＣ−５３ホモログの微小管またはそのプ
ラス端への会合のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法
が提供され、該方法は、（ａ）該化合物を該脊椎動物ホモログ（該タンパク質は
リポーター分子に作動可能に連結されている）を発現するトランスジェニック細
胞、組織または生物体と接触させ、ついで（ｂ）該化合物と接触させなかった工
程（ａ）による細胞と比較して該リポーター分子の局在をスクリーニングするこ
とを含む。
【００５７】 上記方法によって同定される化合物もまた本発明の一部を構成する。該脊椎動
物ホモログと微小管またはそのプラス端との局在または会合のインヒビターとし
て同定されたそのような化合物は、疾患を誘発する細胞の広がりまたは移転また
は接触阻害の喪失を軽減するのに用いることができる。さらに、該脊椎動物ホモ
ログと微小管またはそのプラス端との会合のエンハンサーとして同定された化合
物は、たとえば、ニューロンの再生、血管再生または創傷治癒の促進、または慢
性の神経変性疾患または急性の外傷性障害または線維症の治療に用いることがで
きる。ついで、これら化合物は、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形
剤とともに医薬組成物中に配合できる。
物ホモログと微小管またはそのプラス端との局在または会合のインヒビターとし
て同定されたそのような化合物は、疾患を誘発する細胞の広がりまたは移転また
は接触阻害の喪失を軽減するのに用いることができる。さらに、該脊椎動物ホモ
ログと微小管またはそのプラス端との会合のエンハンサーとして同定された化合
物は、たとえば、ニューロンの再生、血管再生または創傷治癒の促進、または慢
性の神経変性疾患または急性の外傷性障害または線維症の治療に用いることがで
きる。ついで、これら化合物は、製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形
剤とともに医薬組成物中に配合できる。
【００５８】 さらに本発明により、ある化合物が本発明による脊椎動物ホモログと微小管ま
たはそのプラス端領域との会合のインヒビターまたはエンハンサーであるか否か
を決定するキットも提供され、該キットは、該ＵＮＣ−５３脊椎動物タンパク質
ホモログおよびリポーター分子を発現する少なくとも一つのトランスジェニック
細胞または本発明による宿主細胞またはトランスジェニック細胞および対照とし
て使用するための同じ細胞型の少なくとも一つの細胞および該化合物を該少なく
とも一つのトランスジェニック細胞の一つと接触させる手段を含む。上記のよう
にして微小管会合のインヒビターまたはエンハンサーとして同定された化合物は
、有利にも組成物中に配合され、本発明による該脊椎動物ホモログに連結させて
該化合物を微小管またはそのプラス端領域へターゲティングすることができる。
そのような組成物はまた、たとえば、適当なトランスフェクション剤または形質
転換剤をも含んでいてよい。
たはそのプラス端領域との会合のインヒビターまたはエンハンサーであるか否か
を決定するキットも提供され、該キットは、該ＵＮＣ−５３脊椎動物タンパク質
ホモログおよびリポーター分子を発現する少なくとも一つのトランスジェニック
細胞または本発明による宿主細胞またはトランスジェニック細胞および対照とし
て使用するための同じ細胞型の少なくとも一つの細胞および該化合物を該少なく
とも一つのトランスジェニック細胞の一つと接触させる手段を含む。上記のよう
にして微小管会合のインヒビターまたはエンハンサーとして同定された化合物は
、有利にも組成物中に配合され、本発明による該脊椎動物ホモログに連結させて
該化合物を微小管またはそのプラス端領域へターゲティングすることができる。
そのような組成物はまた、たとえば、適当なトランスフェクション剤または形質
転換剤をも含んでいてよい。
【００５９】 本発明のさらなる側面によれば、タンパク質を微小管またはそのプラス端領域
へターゲティングする方法が提供され、該方法は、宿主細胞、組織または生物体
に本発明による該ＵＮＣ−５３脊椎動物ホモログを発現しうる配列を含むトラン
スジーンを導入することを含み、その際、キメラタンパク質が発現されてその結
果として該タンパク質の該微小管またはそのプラス端領域へのターゲティングと
なるように該配列はターゲティングしようとする該タンパク質をコードする配列
に作動可能に連結されている。
へターゲティングする方法が提供され、該方法は、宿主細胞、組織または生物体
に本発明による該ＵＮＣ−５３脊椎動物ホモログを発現しうる配列を含むトラン
スジーンを導入することを含み、その際、キメラタンパク質が発現されてその結
果として該タンパク質の該微小管またはそのプラス端領域へのターゲティングと
なるように該配列はターゲティングしようとする該タンパク質をコードする配列
に作動可能に連結されている。
【００６０】 本発明のさらなる側面は、本発明によるＵＮＣ−５３の該脊椎動物ホモログを
共有結合的に修飾する分子の同定方法をも包含し、該方法は、（ａ）該脊椎動物
ホモログを発現する細胞からの抽出液と候補のＵＮＣ−５３修飾酵素を含む酵素
混合物とをタンパク質の共有結合修飾の指標の存在下で接触させ、（ｂ）工程（
ａ）の共有結合的に修飾したＵＮＣ−５３タンパク質を同定し、ついで（ｃ）該
修飾工程に関与した該分子を同定することを含む。そのような指標は32Ｐであっ
てよい。
共有結合的に修飾する分子の同定方法をも包含し、該方法は、（ａ）該脊椎動物
ホモログを発現する細胞からの抽出液と候補のＵＮＣ−５３修飾酵素を含む酵素
混合物とをタンパク質の共有結合修飾の指標の存在下で接触させ、（ｂ）工程（
ａ）の共有結合的に修飾したＵＮＣ−５３タンパク質を同定し、ついで（ｃ）該
修飾工程に関与した該分子を同定することを含む。そのような指標は32Ｐであっ
てよい。
【００６１】 さらに本発明によって提供されるのは、本発明による該ＵＮＣ−５３脊椎動物
ホモログの毒性を軽減または促進する、またはアポトーシスを軽減または促進す
る化合物の同定方法である。前者の方法は、該化合物を本発明によるトランスジ
ェニック細胞、組織または生物体と接触させ、ついで該微小管またはそのプラス
端領域に隣接する該リポーター分子の存在をモニターすることを含む。アポトー
シスの場合は、該方法は細胞死に対する該化合物の効果をモニターすることを含
む。
ホモログの毒性を軽減または促進する、またはアポトーシスを軽減または促進す
る化合物の同定方法である。前者の方法は、該化合物を本発明によるトランスジ
ェニック細胞、組織または生物体と接触させ、ついで該微小管またはそのプラス
端領域に隣接する該リポーター分子の存在をモニターすることを含む。アポトー
シスの場合は、該方法は細胞死に対する該化合物の効果をモニターすることを含
む。
【００６２】寄託した材料 プラスミドｐＧ１３３０３およびｐＧ１３３０５は、１９７７年４月２８日の
ブダペスト条約の規定に従い、ラボラトリウム・フォーア・モレキュレーレ・ビ
オロジー−プラスミデンコレクティブ（Laboratorium voor Moleculaire Biolog
ie - Plasmidencollective）（ＬＭＢＰ）Ｂ−９０００ゲーント、ベルギーのベ
ルジアン・コーディネーテッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニスムス
（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）（ＢＣＣＭ）にそれ
ぞれ受託番号ＬＭＢＰ３９３６およびＬＭＢＰ３９３７にて１９９９年５月２８
日に寄託してある。
ブダペスト条約の規定に従い、ラボラトリウム・フォーア・モレキュレーレ・ビ
オロジー−プラスミデンコレクティブ（Laboratorium voor Moleculaire Biolog
ie - Plasmidencollective）（ＬＭＢＰ）Ｂ−９０００ゲーント、ベルギーのベ
ルジアン・コーディネーテッド・コレクションズ・オブ・ミクロオーガニスムス
（Belgian Coordinated Collections of Microorganisms）（ＢＣＣＭ）にそれ
ぞれ受託番号ＬＭＢＰ３９３６およびＬＭＢＰ３９３７にて１９９９年５月２８
日に寄託してある。
【００６３】Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３は真正のＵＮＣ−５３である（図１；２；３） すでに知られている動物のＵＮＣ−５３の配列を用いたBlastnおよびTblastn
ＥＳＴ−データベースマイニング（mining）は、新規なｕｎｃ−５３を示唆する
３つのＥＳＴの同定へと導いた（実験手順を参照）。適当なライブラリーを用い
た３'−および５'−ＲＡＣＥ拡張により、これらＥＳＴがＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３と称する新規なｕｎｃ−５３を同定したことが示された（図１ｅ；ｆ）。配列
ＡＢ０２３１５５の刊行物（Nagaseら、1999,DNA Res.6:63-70）は、Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３の３'末端の正しさおよびＡＢ０２３１５５の５'末端を形成する一
つの新規なイントロンの存在を独立に確認した。Ｃ．エレガンスおよび３つのヒ
トＵＮＣ−５３配列のアラインメント（図２）は、Ｃ．エレガンスＵＮＣ−５３
タンパク質の第三のヒトホモログが真正のＵＮＣ−５３であることを明らかに説
明しており、これはＨｓ−ｕｎｃ−５３／２と最も高い類似性を有し、Ｈｓ−ｕ
ｎｃ−５３／１ついで（Ｃ．エレガンスＵＮＣ−５３）Ｃｅ−ＵＮＣ−５３の順
で低くくなる類似性を有している。
ＥＳＴ−データベースマイニング（mining）は、新規なｕｎｃ−５３を示唆する
３つのＥＳＴの同定へと導いた（実験手順を参照）。適当なライブラリーを用い
た３'−および５'−ＲＡＣＥ拡張により、これらＥＳＴがＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３と称する新規なｕｎｃ−５３を同定したことが示された（図１ｅ；ｆ）。配列
ＡＢ０２３１５５の刊行物（Nagaseら、1999,DNA Res.6:63-70）は、Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３の３'末端の正しさおよびＡＢ０２３１５５の５'末端を形成する一
つの新規なイントロンの存在を独立に確認した。Ｃ．エレガンスおよび３つのヒ
トＵＮＣ−５３配列のアラインメント（図２）は、Ｃ．エレガンスＵＮＣ−５３
タンパク質の第三のヒトホモログが真正のＵＮＣ−５３であることを明らかに説
明しており、これはＨｓ−ｕｎｃ−５３／２と最も高い類似性を有し、Ｈｓ−ｕ
ｎｃ−５３／１ついで（Ｃ．エレガンスＵＮＣ−５３）Ｃｅ−ＵＮＣ−５３の順
で低くくなる類似性を有している。
【００６４】 Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３のドメインの多くは、他の動物のＵＮＣ−５３の機能
性のドメインとの高い類似性を示す（図２）。このことは、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３
／３が種々のアッセイ（Ｆ−アクチン結合、細胞培養におけるＦ−アクチン再構
成、培養細胞における微小管および微小管（＋）端結合、ＳＥＭ−５／ＧＲＢ−
２やプロリンリッチアルファ−ヘリックスの他のタイプのバインダーなどのＳＨ
３−ドメインアダプターの結合を含む）においてＣｅ−ＵＮＣ−５３で観察され
る重要な機能を有している可能性が高いことを決定的に示唆している。これら結
果は、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３と同様にＨｓ−ＵＮＣ−５３／１、Ｈｓ−ＵＮＣ−５
３／２、またはＨｓ−ＵＮＣ−５３／３が診断アッセイにおいて機能するＨｓ−
ｕｎｃ−５３の組織特異的または疾患特異的なモデュレーターの発見を目指した
生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび動物アッセイに用いることができること
を示している。
性のドメインとの高い類似性を示す（図２）。このことは、Ｈｕ−ＵＮＣ−５３
／３が種々のアッセイ（Ｆ−アクチン結合、細胞培養におけるＦ−アクチン再構
成、培養細胞における微小管および微小管（＋）端結合、ＳＥＭ−５／ＧＲＢ−
２やプロリンリッチアルファ−ヘリックスの他のタイプのバインダーなどのＳＨ
３−ドメインアダプターの結合を含む）においてＣｅ−ＵＮＣ−５３で観察され
る重要な機能を有している可能性が高いことを決定的に示唆している。これら結
果は、Ｃｅ−ＵＮＣ−５３と同様にＨｓ−ＵＮＣ−５３／１、Ｈｓ−ＵＮＣ−５
３／２、またはＨｓ−ＵＮＣ−５３／３が診断アッセイにおいて機能するＨｓ−
ｕｎｃ−５３の組織特異的または疾患特異的なモデュレーターの発見を目指した
生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび動物アッセイに用いることができること
を示している。
【００６５】Ｕｎｃ−５３ファミリーのさらなる拡張（図１１、１２） 上記３つのヒトＵＮＣ−５３タンパク質配列でのデータベースサーチは、ヒト
ＵＮＣ−５３と有意の類似性を示す幾つかの発現配列タグ（expressed sequence
tags）（ＥＳＴ）およびゲノムＤＮＡ配列（ＢＡＣ）を明らかにした。
ＵＮＣ−５３と有意の類似性を示す幾つかの発現配列タグ（expressed sequence
tags）（ＥＳＴ）およびゲノムＤＮＡ配列（ＢＡＣ）を明らかにした。
【００６６】Ｃ．ブリッグシエ（C. briggsiae） Ｃ．エレガンスゲノムの組合（consortium）は、Ｃ．ブリッグシエのｕｎｃ−
５３相同遺伝子の遺伝子座をシークエンシングした。遺伝子予測プログラムおよ
びＣ．エレガンスのｕｎｃ−５３のｃＤＮＡ配列により、Ｃ．ブリッグシエのタ
ンパク質配列について予測することができる。得られたＣ．ブリッグシエのアミ
ノ酸配列とＣ．エレガンスのアミノ酸配列との図３のアラインメントは、両タン
パク質の強いホモロジーを示している。
５３相同遺伝子の遺伝子座をシークエンシングした。遺伝子予測プログラムおよ
びＣ．エレガンスのｕｎｃ−５３のｃＤＮＡ配列により、Ｃ．ブリッグシエのタ
ンパク質配列について予測することができる。得られたＣ．ブリッグシエのアミ
ノ酸配列とＣ．エレガンスのアミノ酸配列との図３のアラインメントは、両タン
パク質の強いホモロジーを示している。
【００６７】Ｄ．メラノガスター ＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５（ＡＣ００５７１９）はＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３に対して高いホモロジーを有する３つの異なるエクソンを明らかに含んで
いる（図１１）。遺伝子構造予測プログラムFgene（Solovyevら、1995, Proceed
ings of the Third International Conference on Intelligent Systems for Mo
lecular Biology（Rawlingら編、ケンブリッジ、英国、ＡＡＡＩプレス）；Solo
vyevおよびLawrence,1993, Abstracts of the 4th annual keck symposium,ピッ
ツバーグ、４７）を用い、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３に対してホモロジーを示すＢ
ＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５によってコードされるＯＲＦを予測することが
可能であった（図１１ｂ）。
３／３に対して高いホモロジーを有する３つの異なるエクソンを明らかに含んで
いる（図１１）。遺伝子構造予測プログラムFgene（Solovyevら、1995, Proceed
ings of the Third International Conference on Intelligent Systems for Mo
lecular Biology（Rawlingら編、ケンブリッジ、英国、ＡＡＡＩプレス）；Solo
vyevおよびLawrence,1993, Abstracts of the 4th annual keck symposium,ピッ
ツバーグ、４７）を用い、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３に対してホモロジーを示すＢ
ＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５によってコードされるＯＲＦを予測することが
可能であった（図１１ｂ）。
【００６８】 しかしながら、ＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５によって部分的または全体
的にコードされ、図１１ａに示されているように１またはそれ以上の配列ブロッ
クを含むすべてのDrosophila ｃＤＮＡは、ＵＮＣ−５３ファミリーのファミリ
ー成員と考えなければならない。「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」サーチは
、図１１ａに示す３つのホモロジーブロックの間に位置する配列がヒトとDrosop
hilaとの間で保存されていないことを示している（図１１ｃ）。Drosophila mel
anogasterのＵＮＣ５３遺伝子の予測されたＯＲＦは、該ファミリーの新たな成
員を同定するのに用いることができる。
的にコードされ、図１１ａに示されているように１またはそれ以上の配列ブロッ
クを含むすべてのDrosophila ｃＤＮＡは、ＵＮＣ−５３ファミリーのファミリ
ー成員と考えなければならない。「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」サーチは
、図１１ａに示す３つのホモロジーブロックの間に位置する配列がヒトとDrosop
hilaとの間で保存されていないことを示している（図１１ｃ）。Drosophila mel
anogasterのＵＮＣ５３遺伝子の予測されたＯＲＦは、該ファミリーの新たな成
員を同定するのに用いることができる。
【００６９】 ゼブラダニオ（zebrafish）のＥＳＴ ｆｃ２１ｄ０６（ＡＩ６５８３０９）は
、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／２に対して８４％の同一性および９２％のホモロジーを
示す。これは明らかにＨｓ−ＵＮＣ−５３／２のゼブラダニオホモログの一部で
あると考えられる（図１２）。最後に、ヒトＥＳＴの全系列を公的なドメインデ
ータベースに入れた。本発明者らの知見によれば、本明細書に記載するレベルま
でこれらＥＳＴを真正のＨｓ−ｕｎｃ−５３を記載するコンティグに配置するこ
とはこれまで誰にもできなかった。現在利用できるｕｎｃ−５３配列（発現され
たものかまたはゲノムの）、ｕｎｃ−５３遺伝子ファミリーが動物界の３つの主
要な綱である蠕虫（helminths）、脊椎動物および節足動物における真正の動物
遺伝子ファミリーであることをさらに強調している。
、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／２に対して８４％の同一性および９２％のホモロジーを
示す。これは明らかにＨｓ−ＵＮＣ−５３／２のゼブラダニオホモログの一部で
あると考えられる（図１２）。最後に、ヒトＥＳＴの全系列を公的なドメインデ
ータベースに入れた。本発明者らの知見によれば、本明細書に記載するレベルま
でこれらＥＳＴを真正のＨｓ−ｕｎｃ−５３を記載するコンティグに配置するこ
とはこれまで誰にもできなかった。現在利用できるｕｎｃ−５３配列（発現され
たものかまたはゲノムの）、ｕｎｃ−５３遺伝子ファミリーが動物界の３つの主
要な綱である蠕虫（helminths）、脊椎動物および節足動物における真正の動物
遺伝子ファミリーであることをさらに強調している。
【００７０】アラインメントに基づくＵＮＣ−５３ファミリーの正確な記載（図４） ３つのヒトＵＮＣ−５３配列およびＣ．エレガンスＵＮＣ−５３配列のアライ
ンメントは、ＵＮＣ−５３における保存領域の一層正確な定義を可能とする。図
４に４つの動物ＵＮＣ−５３かまたは３つのヒトＵＮＣ−５３についての幾つか
のproSiteサイン（signatures）をまとめてある。
ンメントは、ＵＮＣ−５３における保存領域の一層正確な定義を可能とする。図
４に４つの動物ＵＮＣ−５３かまたは３つのヒトＵＮＣ−５３についての幾つか
のproSiteサイン（signatures）をまとめてある。
【００７１】ノーザンブロットによるＨｕ−ＵＮＣ−５３／３の特異な発現（図５） 脊椎動物のＵＮＣ−５３がどの細胞および組織で役割を果たしているかを決定
するため、ノーザンブロット分析を行った。実験セクションに示したように、関
連するプローブを増幅し用いて、どの正常ヒト組織においておよびどの癌細胞株
において上記３つのヒトＵＮＣ−５３が発現されるかを視覚化した。
するため、ノーザンブロット分析を行った。実験セクションに示したように、関
連するプローブを増幅し用いて、どの正常ヒト組織においておよびどの癌細胞株
において上記３つのヒトＵＮＣ−５３が発現されるかを視覚化した。
【００７２】 １．Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／１でプローブした癌細胞株ＲＮＡブロット 幾つかの癌細胞株（黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０
、バーキットリンパ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４、リンパ性白血病Ｋ５６
２、ＨｅＬａ Ｓ３および前骨髄球性白血病ＨＬ６０）からのポリＡ＋ＲＮＡの
ノーザンブロットをｐＨＨ３ｂの全挿入を用いてプローブした。バーキットリン
パ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４および前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞株で
は発現は検出されないかまたは弱かった。残りの癌細胞株では５つの異なる転写
物が検出される：転写物１および２は９.５ｋｂよりも大きく、転写物３および
４は６〜７ｋｂであり、第五の転写物は約６ｋｂである。転写物１および２はす
べての発現細胞株に存在するが、異なるレベルにおいてである。転写物３および
４は黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９（弱い）および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０に限
られており、黒色腫Ｇ３６１および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０における主たる転写
物である。転写物５はリンパ性白血病Ｋ５６２（弱い）およびＨｅＬａ Ｓ３（
優勢）に限られ、ＨｅＬａ Ｓ３において主たる転写物である。
、バーキットリンパ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４、リンパ性白血病Ｋ５６
２、ＨｅＬａ Ｓ３および前骨髄球性白血病ＨＬ６０）からのポリＡ＋ＲＮＡの
ノーザンブロットをｐＨＨ３ｂの全挿入を用いてプローブした。バーキットリン
パ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４および前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞株で
は発現は検出されないかまたは弱かった。残りの癌細胞株では５つの異なる転写
物が検出される：転写物１および２は９.５ｋｂよりも大きく、転写物３および
４は６〜７ｋｂであり、第五の転写物は約６ｋｂである。転写物１および２はす
べての発現細胞株に存在するが、異なるレベルにおいてである。転写物３および
４は黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９（弱い）および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０に限
られており、黒色腫Ｇ３６１および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０における主たる転写
物である。転写物５はリンパ性白血病Ｋ５６２（弱い）およびＨｅＬａ Ｓ３（
優勢）に限られ、ＨｅＬａ Ｓ３において主たる転写物である。
【００７３】 ２．Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／２でプローブした癌細胞株ＲＮＡブロット 癌細胞株ノーザンブロットの同様のセットを、プライマー
【化１】 および
【化２】 を用いることにより増幅したＥＳＴ４６０３７の６５２ｂｐ断片でプローブした
。Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／２は黒色腫Ｇ３６１、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０、リンパ性
白血病Ｋ５６２およびＨｅＬａ Ｓ３で発現される。肺癌Ａ５４９、バーキット
リンパ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４および前骨髄球性白血病ＨＬ６０では
検出されなかった。興味深いことに、リンパ性白血病Ｋ５６２およびＨｅＬａ
Ｓ３で発現された約７ｋｂと黒色腫Ｇ３６１および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０およ
びＨｅＬａ Ｓ３（弱く）での＞９.５ｋｂの転写物という２つのみの転写物サイ
ズが検出された。注目すべきは黒色腫Ｇ３６１での非常に高い発現である。
。Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／２は黒色腫Ｇ３６１、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０、リンパ性
白血病Ｋ５６２およびＨｅＬａ Ｓ３で発現される。肺癌Ａ５４９、バーキット
リンパ腫ＤＲａｊｉｉ、白血病Ｍｏｌｔ４および前骨髄球性白血病ＨＬ６０では
検出されなかった。興味深いことに、リンパ性白血病Ｋ５６２およびＨｅＬａ
Ｓ３で発現された約７ｋｂと黒色腫Ｇ３６１および結腸直腸腺癌ＳＷ４８０およ
びＨｅＬａ Ｓ３（弱く）での＞９.５ｋｂの転写物という２つのみの転写物サイ
ズが検出された。注目すべきは黒色腫Ｇ３６１での非常に高い発現である。
【００７４】 ３．Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／１でプローブした正常ヒト組織 正常ヒト組織からのポリＡ＋ＲＮＡのノーザンブロットをファージＨＨ３ｂの
全挿入を用いてプローブした。発現レベルはすべての組織で低く、最も高いのは
心臓および胎盤であり、数倍低いレベルで脳および精巣、さらに低いレベルで骨
格筋、膵臓、胸腺、結腸、小腸、卵巣および前立腺である。末梢血白血球、肺、
肝臓、腎臓、脾臓での発現はわずかに検出しうる程度である。
全挿入を用いてプローブした。発現レベルはすべての組織で低く、最も高いのは
心臓および胎盤であり、数倍低いレベルで脳および精巣、さらに低いレベルで骨
格筋、膵臓、胸腺、結腸、小腸、卵巣および前立腺である。末梢血白血球、肺、
肝臓、腎臓、脾臓での発現はわずかに検出しうる程度である。
【００７５】 ４．Ｈｓ−ＵＮＣ５３／２でプローブした正常ヒト組織 ブロットの同様のセットを、プライマー
【化３】 および
【化４】 を用いることにより増幅したＥＳＴ４６０３７の６５２ｂｐ断片でプローブした
。発現レベルはすべての組織で低く、最も高いレベルは腎臓、胎盤および膵臓、
より低いレベルは心臓および肺である。骨格筋、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸、結腸、末梢血白血球、胃、甲状腺、脊髄、気管、副腎および骨髄では
わずかに検出されるかまたは検出できない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２はまた異な
る転写物として発現されると思われる（図５ａ）。
。発現レベルはすべての組織で低く、最も高いレベルは腎臓、胎盤および膵臓、
より低いレベルは心臓および肺である。骨格筋、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵
巣、小腸、結腸、末梢血白血球、胃、甲状腺、脊髄、気管、副腎および骨髄では
わずかに検出されるかまたは検出できない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２はまた異な
る転写物として発現されると思われる（図５ａ）。
【００７６】 ｈｓ−ＵＮＣ５３／１およびｈｓ−ＵＮＣ−５３／２ホモログは明らかに高度
に制御された遺伝子であり、強い組織特異性およびおそらく別の制御機構（すな
わち、異なるプロモーターの特異なスプライシング）を示している。プローブｈ
ｈ１５によって同定されたＲＮＡに由来する異なるタンパク質は、おそらくカル
ボキシ末端のヌクレオチド結合ドメインを共通に有している。Ｃｅ−ＵＮＣ−５
３は複雑な遺伝子座および複雑な転写ユニットであることが示された。異なる転
写物は、異なるシグナルおよびレセプター、異なる組織および異なる移動方向に
関して、このシグナル伝達経路の必要な特異性および機能的な多様性を確実にす
る機構であると考えられる。癌細胞株ブロットにおける新たな転写物の生成また
は発現レベルにおいて観察される変化は、これら細胞のトランスフォーメーショ
ン状態の確立または維持におけるｈｓ−ＵＮＣ−５３／３の役割を示唆している
。
に制御された遺伝子であり、強い組織特異性およびおそらく別の制御機構（すな
わち、異なるプロモーターの特異なスプライシング）を示している。プローブｈ
ｈ１５によって同定されたＲＮＡに由来する異なるタンパク質は、おそらくカル
ボキシ末端のヌクレオチド結合ドメインを共通に有している。Ｃｅ−ＵＮＣ−５
３は複雑な遺伝子座および複雑な転写ユニットであることが示された。異なる転
写物は、異なるシグナルおよびレセプター、異なる組織および異なる移動方向に
関して、このシグナル伝達経路の必要な特異性および機能的な多様性を確実にす
る機構であると考えられる。癌細胞株ブロットにおける新たな転写物の生成また
は発現レベルにおいて観察される変化は、これら細胞のトランスフォーメーショ
ン状態の確立または維持におけるｈｓ−ＵＮＣ−５３／３の役割を示唆している
。
【００７７】ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３の発現パターン 幾つかの癌細胞株からのポリＡ＋ＲＮＡのノーザンブロットを、Ｈｓ−ｕｎｃ
−５３ファミリーからの３つの遺伝子の独特の断片でプローブした。Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３は肺癌細胞株Ａ５４９において高い発現レベルを有するが、該細胞
株ではｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の中くらいの発現しか検出されていない。さらに
、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の中くらいの発現が黒色腫細胞株Ｇ３６１で観察され
たが、該細胞株では高発現のｈｓ−ＵＮＣ−５３／１およびｈｓ−ＵＮＣ−５３
／２が観察されている。このことは、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３が少なくとも２つの
癌細胞株に関与していることを示している。
−５３ファミリーからの３つの遺伝子の独特の断片でプローブした。Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３は肺癌細胞株Ａ５４９において高い発現レベルを有するが、該細胞
株ではｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の中くらいの発現しか検出されていない。さらに
、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の中くらいの発現が黒色腫細胞株Ｇ３６１で観察され
たが、該細胞株では高発現のｈｓ−ＵＮＣ−５３／１およびｈｓ−ＵＮＣ−５３
／２が観察されている。このことは、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３が少なくとも２つの
癌細胞株に関与していることを示している。
【００７８】 正常なヒト組織では、ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の発現は明らかに新しく以前に
は観察されなかった発現パターンを示す。このようなｈｓ−ｕｎｃ−５３／３と
そのホモログであるｈｓ−ｕｎｃ５３／１およびｈｓ−ｕｎｃ５３／２との発現
の違いは、ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３に機能を割り当てるうえで重要である。
は観察されなかった発現パターンを示す。このようなｈｓ−ｕｎｃ−５３／３と
そのホモログであるｈｓ−ｕｎｃ５３／１およびｈｓ−ｕｎｃ５３／２との発現
の違いは、ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３に機能を割り当てるうえで重要である。
【００７９】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は、ノーザンブロットに示されるように（図５ａ）脳
で高度に発現される。図５ｂに示されるように、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３はまた
脳の異なる部位で異なって発現されることがわかる。そのホモログは脳では発現
されないかまたは弱く発現される。このことは、細胞移動の方向性および成長円
錐の舵取り（steering）における機能が脳の特定の領域または細胞と関係してい
るであろうとの指標を与える。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３はニューロンの増殖、軸
索の誘導、およびシナプス連結の形成および維持へのシグナルを関連づける重要
なシグナルトランスデューサーまたはシグナルアダプターであろうことが導き出
される。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の機能は、ニューロン−ニューロン相互作用、
ニューロンの増殖、ニューロンと筋肉の相互作用、およびシナプス後シグナル伝
達と関係していると思われる。さらに、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は神経芽細胞腫
のようにニューロン由来の癌の進展に関与しているのかもしれず、あるいは腫瘍
の発生は網膜芽腫のような幾つかの眼疾患のように脳にその発生源を有している
であろう。
で高度に発現される。図５ｂに示されるように、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３はまた
脳の異なる部位で異なって発現されることがわかる。そのホモログは脳では発現
されないかまたは弱く発現される。このことは、細胞移動の方向性および成長円
錐の舵取り（steering）における機能が脳の特定の領域または細胞と関係してい
るであろうとの指標を与える。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３はニューロンの増殖、軸
索の誘導、およびシナプス連結の形成および維持へのシグナルを関連づける重要
なシグナルトランスデューサーまたはシグナルアダプターであろうことが導き出
される。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の機能は、ニューロン−ニューロン相互作用、
ニューロンの増殖、ニューロンと筋肉の相互作用、およびシナプス後シグナル伝
達と関係していると思われる。さらに、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は神経芽細胞腫
のようにニューロン由来の癌の進展に関与しているのかもしれず、あるいは腫瘍
の発生は網膜芽腫のような幾つかの眼疾患のように脳にその発生源を有している
であろう。
【００８０】 脳組織におけるＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の高発現の有意さは、脊髄（ニューロ
ン組織を含む）でも観察される高発現レベルと関係付けることができる。ここで
、ニューロン（軸索）増殖およびニューロン−ニューロン連結は重要である。こ
の経路に作用する薬理学的ツールの開発は、ニューロン細胞の増殖および移動、
および外傷後のニューロン連結の再生に関与する疾患の治療、または神経芽細胞
腫などのニューロン性癌の抑制へと導く。その特異的な発現のため、Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３に特異的なインヒビターおよび／またはエンハンサーはＨｓ−ｕｎ
ｃ−５３ファミリーの遺伝子およびタンパク質に作用する一層一般的な化合物に
比べて医薬化合物として有利であろう。
ン組織を含む）でも観察される高発現レベルと関係付けることができる。ここで
、ニューロン（軸索）増殖およびニューロン−ニューロン連結は重要である。こ
の経路に作用する薬理学的ツールの開発は、ニューロン細胞の増殖および移動、
および外傷後のニューロン連結の再生に関与する疾患の治療、または神経芽細胞
腫などのニューロン性癌の抑制へと導く。その特異的な発現のため、Ｈｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３に特異的なインヒビターおよび／またはエンハンサーはＨｓ−ｕｎ
ｃ−５３ファミリーの遺伝子およびタンパク質に作用する一層一般的な化合物に
比べて医薬化合物として有利であろう。
【００８１】 ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３が高度に発現され他のヒトホモログが発現されない第
二の組織は脾臓である。それゆえ、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３は白血球の成熟に関
与するシグナル伝達経路の一部として機能しうる。この経路の機能不全は、白血
球の不正確な成熟および慢性関節リウマチや硬化症などの自己免疫疾患の進展へ
と導く。白血球の認識でのシグナル伝達機能のつぎに、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３
はまた脾臓における白血球のアポトーシスを支配している機構の誘発および／ま
たはシグナル伝達経路において重要な役割を果たしているかもしれない。ｈｓ−
ＵＮＣ−５３／３経路が関与する医薬方法（たとえば、その発現の抑制および／
または促進という結果となるもの）は、これら疾患の治療へと導く。さらに、ｈ
ｓ−ＵＮＣ−５３／２は、一層特異的な仕方で作用するｈｓ−ｕｎｃ５３／３に
特異的なインヒビターまたはエンハンサーとして有利であるかもしれない。
二の組織は脾臓である。それゆえ、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３は白血球の成熟に関
与するシグナル伝達経路の一部として機能しうる。この経路の機能不全は、白血
球の不正確な成熟および慢性関節リウマチや硬化症などの自己免疫疾患の進展へ
と導く。白血球の認識でのシグナル伝達機能のつぎに、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３
はまた脾臓における白血球のアポトーシスを支配している機構の誘発および／ま
たはシグナル伝達経路において重要な役割を果たしているかもしれない。ｈｓ−
ＵＮＣ−５３／３経路が関与する医薬方法（たとえば、その発現の抑制および／
または促進という結果となるもの）は、これら疾患の治療へと導く。さらに、ｈ
ｓ−ＵＮＣ−５３／２は、一層特異的な仕方で作用するｈｓ−ｕｎｃ５３／３に
特異的なインヒビターまたはエンハンサーとして有利であるかもしれない。
【００８２】 Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３タンパク質はまた卵巣でも高度に発現されるが、卵巣
では他の２つのヒトホモログもまた発現される。最後に、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３
の中くらいから低い発現が心臓、胎盤、精巣、胃および副腎で観察される。 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の主たる転写物は＞９ｋｂであるが、しばしば不鮮明
が生じ、これは若干高い強度で５.５−６.５ｋＢで終わる。この短い転写物はＡ
Ｂ０２３１５５に対応する。
では他の２つのヒトホモログもまた発現される。最後に、ｈｓ−ｕｎｃ５３／３
の中くらいから低い発現が心臓、胎盤、精巣、胃および副腎で観察される。 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の主たる転写物は＞９ｋｂであるが、しばしば不鮮明
が生じ、これは若干高い強度で５.５−６.５ｋＢで終わる。この短い転写物はＡ
Ｂ０２３１５５に対応する。
【００８３】 Ｈｓ−ｕｎｃ５３／３遺伝子は高度に制御された遺伝子であり、これまでにそ
の知られたホモログで同定されたことのない強い組織特異性および別の制御機構
を示す。それゆえ、これら知見は、ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３および／またはＨｓ
−ＵＮＣ−５３／３経路の一層特異的なインヒビターまたはエンハンサーの開発
へと導く。ノーザンブロット研究は、これら３つのヒトｕｎｃ−５３が高度に制
御された組織特異性を有する複雑な転写ユニットであること、および長さの異な
る転写物が存在することを示している。
の知られたホモログで同定されたことのない強い組織特異性および別の制御機構
を示す。それゆえ、これら知見は、ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３および／またはＨｓ
−ＵＮＣ−５３／３経路の一層特異的なインヒビターまたはエンハンサーの開発
へと導く。ノーザンブロット研究は、これら３つのヒトｕｎｃ−５３が高度に制
御された組織特異性を有する複雑な転写ユニットであること、および長さの異な
る転写物が存在することを示している。
【００８４】ヒトｕｎｃ−５３のスプライス変異体 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３をクローニングしている間に、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／
３の少なくとも３つの発現変異体（おそらく別のスプライス）が存在することが
明らかとなった（図１ｅ、ｆ；小文字の領域）。他の２つのヒトＵＮＣ−５３に
対するターゲティング努力は、他のヒトＵＮＣ−５３が変異体を含むことを示し
た（図１ａ、ｃおよびｅ領域）。
３の少なくとも３つの発現変異体（おそらく別のスプライス）が存在することが
明らかとなった（図１ｅ、ｆ；小文字の領域）。他の２つのヒトＵＮＣ−５３に
対するターゲティング努力は、他のヒトＵＮＣ−５３が変異体を含むことを示し
た（図１ａ、ｃおよびｅ領域）。
【００８５】 現在観察されるスプライス変異体は特定の領域に集中しているように思われる
。第一のもの（図２において位置１２５２から開始）（全体のアミノ酸類似性は
弱い）は、Ｃｅ−ｕｎｃ−５３およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の両者において２
つの（スプライス）変異体を含む。蠕虫（worm）では、これら２つのエクソンの
ｕｎｃ−５３中での存在または不在は、細胞が細胞外シグナル勾配を誘引シグナ
ルまたは反発シグナルとして異なって翻訳するような仕方でＵＮＣ−５３タンパ
ク質の機能を制御している。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２の最も３'側の変異体は、
２つのＣｅ−ｕｎｃ−５３変異体をほぼカバーしている。
。第一のもの（図２において位置１２５２から開始）（全体のアミノ酸類似性は
弱い）は、Ｃｅ−ｕｎｃ−５３およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の両者において２
つの（スプライス）変異体を含む。蠕虫（worm）では、これら２つのエクソンの
ｕｎｃ−５３中での存在または不在は、細胞が細胞外シグナル勾配を誘引シグナ
ルまたは反発シグナルとして異なって翻訳するような仕方でＵＮＣ−５３タンパ
ク質の機能を制御している。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２の最も３'側の変異体は、
２つのＣｅ−ｕｎｃ−５３変異体をほぼカバーしている。
【００８６】 この領域でのＨｕ−ＵＮＣ−５３／３の変化の複雑さは、線虫の状況と似てい
るかもしれない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３では、たとえば、位置３７９５〜４３
２５（図１ｅ）の領域は２つの隣接するブロック（図１ｅの３７９５〜４２８３
および４２８６〜４３２５）からなり、これらは独立に前頭皮質組織からのｃＤ
ＮＡに存在するかまたは存在しない。対照的に、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／１または
Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／２ではこの領域において変異体が未だに観察されていない
。
るかもしれない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３では、たとえば、位置３７９５〜４３
２５（図１ｅ）の領域は２つの隣接するブロック（図１ｅの３７９５〜４２８３
および４２８６〜４３２５）からなり、これらは独立に前頭皮質組織からのｃＤ
ＮＡに存在するかまたは存在しない。対照的に、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／１または
Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／２ではこの領域において変異体が未だに観察されていない
。
【００８７】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の第二の変異体（図２）はボックス（ＭＱＬＤＮＲＴ
ＬＰＫＫＧＬＲ）を欠き、これはすべてのヒトｕｎｃ−５３において高度に保存
されている（太字）。このような変異体が存在することは、異なって作用するＨ
ｓ−ｕｎｃ５３／３の機能性の変異体を示している。
ＬＰＫＫＧＬＲ）を欠き、これはすべてのヒトｕｎｃ−５３において高度に保存
されている（太字）。このような変異体が存在することは、異なって作用するＨ
ｓ−ｕｎｃ５３／３の機能性の変異体を示している。
【００８８】 スプライス変異体が観察された第二の領域は、ｕｎｃ−５３の主たる高度に保
存されたドメインを含む。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は、この保存されたドメイン
の最もＮ末端側の部分（ＳＧＳＦＲＤ）を含む第一の変異体を有する。Ｈｓ−ｕ
ｎｃ−５３／１の第二のスプライス変異体（ＡＥＥＲＭＯＳＥ）は、この高度に
保存されたドメイン内に存在する。ヒトｕｎｃ−５３におけるスプライス変異の
ための他の保存されたスポットが見出されている（図２）：Ｈｓ−ｕｎｃ−５３
／１｛ＶＹＥ｝；Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２｛ＶＮＥ｝およびＨｓ−ｕｎｃ−５３
／３｛ＮＳＲＧＳＥＬ｝。これらのスプライスエクソンはすべて、２つの保存さ
れた荷電ドメイン（推定の核局在化シグナル）によりフランキングされている。
この保存を仮定して、本発明者らはＣ．エレガンスにおいてスプライス変異を調
べ、エクソン外（extra exon）（ＡＬＳＶＤＳＱ）の形態で存在することがわか
った（図２）。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は他の変異体（ＳＰＬＶＷＰＰＫＫＲＱ
ＮＧＰＶＩＹＫＨＳＲ）を有する（図２）。 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３をクローニングする間にＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の最
も３'側のスプライス変異体が見出され、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー中に唯
一存在することが示された。
存されたドメインを含む。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は、この保存されたドメイン
の最もＮ末端側の部分（ＳＧＳＦＲＤ）を含む第一の変異体を有する。Ｈｓ−ｕ
ｎｃ−５３／１の第二のスプライス変異体（ＡＥＥＲＭＯＳＥ）は、この高度に
保存されたドメイン内に存在する。ヒトｕｎｃ−５３におけるスプライス変異の
ための他の保存されたスポットが見出されている（図２）：Ｈｓ−ｕｎｃ−５３
／１｛ＶＹＥ｝；Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２｛ＶＮＥ｝およびＨｓ−ｕｎｃ−５３
／３｛ＮＳＲＧＳＥＬ｝。これらのスプライスエクソンはすべて、２つの保存さ
れた荷電ドメイン（推定の核局在化シグナル）によりフランキングされている。
この保存を仮定して、本発明者らはＣ．エレガンスにおいてスプライス変異を調
べ、エクソン外（extra exon）（ＡＬＳＶＤＳＱ）の形態で存在することがわか
った（図２）。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は他の変異体（ＳＰＬＶＷＰＰＫＫＲＱ
ＮＧＰＶＩＹＫＨＳＲ）を有する（図２）。 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３をクローニングする間にＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の最
も３'側のスプライス変異体が見出され、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー中に唯
一存在することが示された。
【００８９】単一ヌクレオチド多型 クローニングおよびＰＣＲ研究は、サイレントでない単一ヌクレオチド多型が
Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の位置１２３２およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の位置９
２９に存在することを示した。このことは、ＵＮＣ−５３タンパク質の正しい機
能、それゆえ（ある場合には）疾患に関連する変異がヒトｕｎｃ−５３に存在す
ることを示している。
Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の位置１２３２およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の位置９
２９に存在することを示した。このことは、ＵＮＣ−５３タンパク質の正しい機
能、それゆえ（ある場合には）疾患に関連する変異がヒトｕｎｃ−５３に存在す
ることを示している。
【００９０】ＲＴ−ＰＣＲによる正常細胞および腫瘍細胞での発現 クローニングの努力はヒトｕｎｃ−５３においてスプライス変異体の存在を示
し、ノーザンブロットは各ヒトｕｎｃ−５３に対してある範囲の転写物を明らか
にした。これらデータを組み合わせても観察された転写物の範囲を完全には説明
できない。それゆえ、ヒトｕｎｃ−５３の発現の複雑さに対する本発明者らの理
解は不完全であり、さらに詳細なＲＴ−ＰＣＲ研究を行った。
し、ノーザンブロットは各ヒトｕｎｃ−５３に対してある範囲の転写物を明らか
にした。これらデータを組み合わせても観察された転写物の範囲を完全には説明
できない。それゆえ、ヒトｕｎｃ−５３の発現の複雑さに対する本発明者らの理
解は不完全であり、さらに詳細なＲＴ−ＰＣＲ研究を行った。
【００９１】 曖昧にする因子の一つは、すべての研究が異なる割合で存在する異なる正常ヒ
ト細胞型から構築されている全組織のｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡに対して行った
ことであった。この理由および皮膚がノーザンブロット研究に含まれていなかっ
たことから、正常なヒトの皮膚の異なる細胞のｃＤＮＡ調製物：（１）表皮の角
質細胞、（２）メラノーマ細胞、（３）皮膚繊維芽細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲ研
究を設定した。さらに、正常細胞と腫瘍細胞とを比較研究するため、系列をマッ
チさせた形質転換細胞株または腫瘍細胞を研究に含めた。ヒト臍静脈内皮細胞（
ＨＵＶＥＣ）を内皮細胞株に対する正常ヒトマッチとして採用した。
ト細胞型から構築されている全組織のｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡに対して行った
ことであった。この理由および皮膚がノーザンブロット研究に含まれていなかっ
たことから、正常なヒトの皮膚の異なる細胞のｃＤＮＡ調製物：（１）表皮の角
質細胞、（２）メラノーマ細胞、（３）皮膚繊維芽細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲ研
究を設定した。さらに、正常細胞と腫瘍細胞とを比較研究するため、系列をマッ
チさせた形質転換細胞株または腫瘍細胞を研究に含めた。ヒト臍静脈内皮細胞（
ＨＵＶＥＣ）を内皮細胞株に対する正常ヒトマッチとして採用した。
【００９２】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１のＲＴ−ＰＣＲ研究は、最も５'側のスプライス変異
体が正常細胞株と腫瘍細胞株とで異なって発現されることを明らかにした。この
エクソンは７／７角質細胞、ＨＵＶＥＣおよびメラノーマ細胞には存在するが、
ＨａＣａｔ、ＥＣＶ３０４、２／７黒色腫細胞およびＭＣＦ−７細胞（乳癌）に
は欠如している。
体が正常細胞株と腫瘍細胞株とで異なって発現されることを明らかにした。この
エクソンは７／７角質細胞、ＨＵＶＥＣおよびメラノーマ細胞には存在するが、
ＨａＣａｔ、ＥＣＶ３０４、２／７黒色腫細胞およびＭＣＦ−７細胞（乳癌）に
は欠如している。
【００９３】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２のＲＴ−ＰＣＲ研究はさらに驚くべき実態を明らかに
した。発癌性の内皮細胞株ＥＣＶ３０４はＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の発現を欠如
しているが、一方、その正常な対応物ＨＵＶＥＣはＨｓ−ｕｎｃ−５３／２を発
現しており、ＥＣＶ３０４における遺伝子欠失または発現の不活化が示唆された
。表皮の角質細胞および系列のマッチした自発的にトランスフォーメーションし
た角質細胞ＨａＣａＴおよびＭＣＦ−７はＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の５'末端の
発現は欠如しているが、３'末端（微小管結合ドメインまたはその近傍から開始
）は発現する。このことは、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３のＡＢ０２３１５５と同様
にＨｓ−ｕｎｃ−５３／２もまた、先端欠失した３'変異体として細胞特異的な
仕方で発現されうることを示唆している。
した。発癌性の内皮細胞株ＥＣＶ３０４はＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の発現を欠如
しているが、一方、その正常な対応物ＨＵＶＥＣはＨｓ−ｕｎｃ−５３／２を発
現しており、ＥＣＶ３０４における遺伝子欠失または発現の不活化が示唆された
。表皮の角質細胞および系列のマッチした自発的にトランスフォーメーションし
た角質細胞ＨａＣａＴおよびＭＣＦ−７はＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の５'末端の
発現は欠如しているが、３'末端（微小管結合ドメインまたはその近傍から開始
）は発現する。このことは、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３のＡＢ０２３１５５と同様
にＨｓ−ｕｎｃ−５３／２もまた、先端欠失した３'変異体として細胞特異的な
仕方で発現されうることを示唆している。
【００９４】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２のスプライス変異体もまた、正常から発癌につれて異
なると思われる：｛ＶＮＥ｝エクソンはすべての角質細胞単離物に存在すること
が示されたが、ＨａＣａＴには存在せず、メラノーマ細胞もまた該エクソンを発
現するが２／７黒色腫またはＭＣＦ−７は発現しない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３
のＲＴ−ＰＣＲ研究をＡＢ０２３１５５の脳以外の組織での発現を示すことに集
中した。この記載した新たなエクソンは、角質細胞、ＨＵＶＥＣ、皮膚の繊維芽
細胞、メラノーマ細胞およびそれらのトランスフォーメーションした／腫瘍変異
体に存在することが示され、ヒトの組織で広く発現されることが示された。
なると思われる：｛ＶＮＥ｝エクソンはすべての角質細胞単離物に存在すること
が示されたが、ＨａＣａＴには存在せず、メラノーマ細胞もまた該エクソンを発
現するが２／７黒色腫またはＭＣＦ−７は発現しない。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３
のＲＴ−ＰＣＲ研究をＡＢ０２３１５５の脳以外の組織での発現を示すことに集
中した。この記載した新たなエクソンは、角質細胞、ＨＵＶＥＣ、皮膚の繊維芽
細胞、メラノーマ細胞およびそれらのトランスフォーメーションした／腫瘍変異
体に存在することが示され、ヒトの組織で広く発現されることが示された。
【００９５】別の５'開始エクソン Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２では５つの異なる開始エクソンがＲＴ−ＰＣＲを用い
てクローニングされており、そのうちの３つは少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ
ライブラリーに存在することが確認されている（図１ｂ、ｃ）。同様に、Ｈｓ−
ｕｎｃ−５３／３についても異なる５'エクソンが見出されており、そのうちの
２つは確認されている（図１ｅ、ｆ）。これら５'エクソンは、ヒトｕｎｃ−５
３がこれら異なる５'エクソンの５'側にある別のプロモーターの制御により発現
される可能性の高いことを示している。また、線虫では異なる（イントロン性の
）プロモーターがＣ．エレガンスのｕｎｃ−５３の５'変異体の発現を駆動する
ことが示されている。
てクローニングされており、そのうちの３つは少なくとも２つの異なるｃＤＮＡ
ライブラリーに存在することが確認されている（図１ｂ、ｃ）。同様に、Ｈｓ−
ｕｎｃ−５３／３についても異なる５'エクソンが見出されており、そのうちの
２つは確認されている（図１ｅ、ｆ）。これら５'エクソンは、ヒトｕｎｃ−５
３がこれら異なる５'エクソンの５'側にある別のプロモーターの制御により発現
される可能性の高いことを示している。また、線虫では異なる（イントロン性の
）プロモーターがＣ．エレガンスのｕｎｃ−５３の５'変異体の発現を駆動する
ことが示されている。
【００９６】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の５'末端 相当の努力にもかかわらず、またノーザンブロットが＞９.５ｋｂの転写物の
存在を示している事実にもかかわらず、クローニングはＨｓ−ｕｎｃ−５３／１
の真正の５'末端（Ｆ−アクチン結合ドメインを含む）の同定には至らなかった
。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／３がともに完全長および
先端欠失形態で発現されるとの仮定のもと、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は短い形態
でも発現されないのか否かという疑問を掲げることができる。
存在を示している事実にもかかわらず、クローニングはＨｓ−ｕｎｃ−５３／１
の真正の５'末端（Ｆ−アクチン結合ドメインを含む）の同定には至らなかった
。Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２およびＨｓ−ｕｎｃ−５３／３がともに完全長および
先端欠失形態で発現されるとの仮定のもと、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は短い形態
でも発現されないのか否かという疑問を掲げることができる。
【００９７】 ｃＤＮＡライブラリークローニングおよび５'−ＲＡＣＥは、Ｃ．エレガンス
のｕｎ−５３中のドメイン（別の開始位置が存在する）とマッチする位置で終了
する隣接配列を提供している。この議論に基づき、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は線
虫の該転写物のヒトにおける機能性の等価物でありうる。
のｕｎ−５３中のドメイン（別の開始位置が存在する）とマッチする位置で終了
する隣接配列を提供している。この議論に基づき、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１は線
虫の該転写物のヒトにおける機能性の等価物でありうる。
【００９８】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の「一層長い」変異体をさらに追跡するため、ゲノム
ＢＡＣ ＤＮＡシークエンシングを行った。図１ｇにＢＡＣ ５８５Ｅ０９からの
４９８４断片の配列を示す。この配列は、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の現在知られ
ているｃＤＮＡの５'側の配列を含む。適任のものとして（to the qualified）
２つのグループの遺伝子構造予測コンピュータープログラムにより、４９８４ｂ
ｐゲノム配列断片中の異なるが匹敵するエクソンを予測することができる（図１
４）。プログラムＧＥＮＳＣＡＮ、ＨＥＸＯＮおよびＭＺＥＦはすべてｂｐ１０
８９とｂｐ１８８０との間のエクソンを予測する。この予測されたエクソンの末
端（ｂｐ１８８０）はｃＤＮＡ配列により確認される。それゆえ、この予測は正
しいエクソン長を表示するうえで大きな変化を与える。プログラムＧＲＡＩＬ、
ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲおよびＨＭＭＧＥＮＥはすべてｂｐ１１２３とｂｐ２０３
１との間のエクソンを予測する。予測したエクソンのいずれも、別の開始コドン
の５'側にインフレームで停止コドンを含んでいない。従って、別の開始コドン
を含むエクソンの５'側に未同定のエクソンが存在する可能性がある。
ＢＡＣ ＤＮＡシークエンシングを行った。図１ｇにＢＡＣ ５８５Ｅ０９からの
４９８４断片の配列を示す。この配列は、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の現在知られ
ているｃＤＮＡの５'側の配列を含む。適任のものとして（to the qualified）
２つのグループの遺伝子構造予測コンピュータープログラムにより、４９８４ｂ
ｐゲノム配列断片中の異なるが匹敵するエクソンを予測することができる（図１
４）。プログラムＧＥＮＳＣＡＮ、ＨＥＸＯＮおよびＭＺＥＦはすべてｂｐ１０
８９とｂｐ１８８０との間のエクソンを予測する。この予測されたエクソンの末
端（ｂｐ１８８０）はｃＤＮＡ配列により確認される。それゆえ、この予測は正
しいエクソン長を表示するうえで大きな変化を与える。プログラムＧＲＡＩＬ、
ＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲおよびＨＭＭＧＥＮＥはすべてｂｐ１１２３とｂｐ２０３
１との間のエクソンを予測する。予測したエクソンのいずれも、別の開始コドン
の５'側にインフレームで停止コドンを含んでいない。従って、別の開始コドン
を含むエクソンの５'側に未同定のエクソンが存在する可能性がある。
【００９９】 本発明での実態は、線虫およびヒトのｕｎｃ−５３が複雑な転写ユニットと思
われることを決定的に示唆している。さらに、最も複雑なスプライス変異体の幾
つかがＵＮＣ−５３タンパク質の同様の領域にマッピングされるという事実は、
たとえばシグナル源へ向けてのまたはシグナル源からの細胞の指向的な移動に関
してＵＮＣ−５３の進化的に保存された機能性の変異体を指し示している。対照
的に、ヒトのＵＮＣ−５３の変異体の幾つかは高度に保存されたドメインに位置
している；これら（および他の）変異体は、ｕｎｃ−５３遺伝子の一つから転写
された別個の（未だ発見されていない）機能的に異なるＵＮＣ−５３タンパク質
を生成しているのかもしれない。
われることを決定的に示唆している。さらに、最も複雑なスプライス変異体の幾
つかがＵＮＣ−５３タンパク質の同様の領域にマッピングされるという事実は、
たとえばシグナル源へ向けてのまたはシグナル源からの細胞の指向的な移動に関
してＵＮＣ−５３の進化的に保存された機能性の変異体を指し示している。対照
的に、ヒトのＵＮＣ−５３の変異体の幾つかは高度に保存されたドメインに位置
している；これら（および他の）変異体は、ｕｎｃ−５３遺伝子の一つから転写
された別個の（未だ発見されていない）機能的に異なるＵＮＣ−５３タンパク質
を生成しているのかもしれない。
【０１００】 ２つのおよびおそらく３つのヒトｕｎｃ−５３が完全長および先端欠失形態と
して細胞特異的な発現により存在するという事実、最終的に異なるプロモーター
によって制御される一連の別の５'開始エクソンが存在するという事実、および
スプライス変異体の幾つかの形態が線虫からヒトへ保存されているという事実、
これらはすべてｕｎｃ−５３の発現が極めて複雑であること、およびＵＮＣ−５
３タンパク質の生物学的機能の幾つかが極めて保存されていることを示している
。
して細胞特異的な発現により存在するという事実、最終的に異なるプロモーター
によって制御される一連の別の５'開始エクソンが存在するという事実、および
スプライス変異体の幾つかの形態が線虫からヒトへ保存されているという事実、
これらはすべてｕｎｃ−５３の発現が極めて複雑であること、およびＵＮＣ−５
３タンパク質の生物学的機能の幾つかが極めて保存されていることを示している
。
【０１０１】 一方、ノーザンブロットでの異なる発現、正常細胞と系列のマッチした腫瘍細
胞との間でのスプライス変異の差異および３つのヒトｕｎｃ−５３の２つにおけ
るサイレントでない単一ヌクレオチド変化、これらはすべてヒトｕｎｃ−５３の
疾患における役割を深く理解するために広範囲の診断アッセイがいかに重要であ
るかを示している。
胞との間でのスプライス変異の差異および３つのヒトｕｎｃ−５３の２つにおけ
るサイレントでない単一ヌクレオチド変化、これらはすべてヒトｕｎｃ−５３の
疾患における役割を深く理解するために広範囲の診断アッセイがいかに重要であ
るかを示している。
【０１０２】Genemap98によるＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の染色体位置決定（図１３および１(ｃ )) ＡＡ１１５０１４（ＡＡ１１５０１５と同じＥＳＴを記載）は３'ＵＴＲ中に
Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子の別のスプライス変異体を含んでいるが、ＥＳＴク
ローンＡＡ９１８６０１、ＡＩ２４８５８５、ＡＡ１１５０１４およびＡＡ１１
５０１５は、明らかにＨｓ−Ｕｎｃ−５３／２ ｃＤＮＡの３'−ＵＴＲに相同で
ある（図１(ｃ)）。genemap98データベース（１９９８年１１月に公開（release
））において質問（query）としてＥＳＴ ＡＡ９１８６０１、ＡＩ２４８５８５
、ＡＡ１１５０１４またはＡＡ１１５０１５を用いた調査は、Ｈｓ−Ｕｎｃ５３
／２遺伝子が第１１染色体に位置していることを明らかにした（http.//www.ncb
i.nlm.nih.gov/genemap98/loc.cgi?ID=21224）。
Ｈｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子の別のスプライス変異体を含んでいるが、ＥＳＴク
ローンＡＡ９１８６０１、ＡＩ２４８５８５、ＡＡ１１５０１４およびＡＡ１１
５０１５は、明らかにＨｓ−Ｕｎｃ−５３／２ ｃＤＮＡの３'−ＵＴＲに相同で
ある（図１(ｃ)）。genemap98データベース（１９９８年１１月に公開（release
））において質問（query）としてＥＳＴ ＡＡ９１８６０１、ＡＩ２４８５８５
、ＡＡ１１５０１４またはＡＡ１１５０１５を用いた調査は、Ｈｓ−Ｕｎｃ５３
／２遺伝子が第１１染色体に位置していることを明らかにした（http.//www.ncb
i.nlm.nih.gov/genemap98/loc.cgi?ID=21224）。
【０１０３】 染色体上の位置決定に用いＨｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子の３'ＵＴＲ中に位置
するＳＴＳは、ＳＨＧＣ−３３４５６と称する（ｄｂＳＴＳ Ｉｄ：４１８９１
．ジーンバンクＡｃｃ：Ｇ２８０３６、ジーンバンクｇｉ：１３９６７５５）（
図１３ａ）。ＳＴＳはＮＩＧＭＳヒト／マウス体細胞ハイブリッドパネル上での
分析により位置決定された（ｄｂＳＴＳ Ｉｄ：４１８９１）。放射性ハイブリ
ッドの結果を図１３ｂにまとめてある。これらデータをまとめると、ＳＨＧＣ−
３３４５６に関連するすべての疾患または表現型はＨｓ−Ｕｎｃ−５３／２遺伝
子によるものであることが示唆される。
するＳＴＳは、ＳＨＧＣ−３３４５６と称する（ｄｂＳＴＳ Ｉｄ：４１８９１
．ジーンバンクＡｃｃ：Ｇ２８０３６、ジーンバンクｇｉ：１３９６７５５）（
図１３ａ）。ＳＴＳはＮＩＧＭＳヒト／マウス体細胞ハイブリッドパネル上での
分析により位置決定された（ｄｂＳＴＳ Ｉｄ：４１８９１）。放射性ハイブリ
ッドの結果を図１３ｂにまとめてある。これらデータをまとめると、ＳＨＧＣ−
３３４５６に関連するすべての疾患または表現型はＨｓ−Ｕｎｃ−５３／２遺伝
子によるものであることが示唆される。
【０１０４】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の機能的特徴付け Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３のＦ−アクチン再構成および微小管結合 その構造的な特徴に基づき、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３は真正のヒトｕｎｃ−５
３として分類されうる。その機能をさらに理解するため、および薬理学的な化合
物スクリーニングアッセイを開発することを見込んで、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３
を実験セクションに記載し図７ａに示した方法に従って物理的にクローニングし
た。完全長（Ａ〜Ｌ）および３'側半分（Ｇ〜Ｌ）のＨｓ−ｕｎｃ−５３／３を
含む誘導Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３クローンをさらに操作して緑色蛍光タンパク質
とのキメラを生成させ、ついで真核細胞のトランスフェクションに適した発現ベ
クター中にクローニングした。これら構築物の核酸配列およびアミノ酸配列を図
７ｂ〜ｅに示す。これら構築物を細胞中にトランスフェクションし、Ｆ−アクチ
ン細胞骨格およびマウス神経芽細胞腫細胞Ｎ４の微小管への結合に対する効果（
線虫ｕｎｃ−５３およびヒトｕｎｃ−５３／１について知られている機能）を評
定した。
３として分類されうる。その機能をさらに理解するため、および薬理学的な化合
物スクリーニングアッセイを開発することを見込んで、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３
を実験セクションに記載し図７ａに示した方法に従って物理的にクローニングし
た。完全長（Ａ〜Ｌ）および３'側半分（Ｇ〜Ｌ）のＨｓ−ｕｎｃ−５３／３を
含む誘導Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３クローンをさらに操作して緑色蛍光タンパク質
とのキメラを生成させ、ついで真核細胞のトランスフェクションに適した発現ベ
クター中にクローニングした。これら構築物の核酸配列およびアミノ酸配列を図
７ｂ〜ｅに示す。これら構築物を細胞中にトランスフェクションし、Ｆ−アクチ
ン細胞骨格およびマウス神経芽細胞腫細胞Ｎ４の微小管への結合に対する効果（
線虫ｕｎｃ−５３およびヒトｕｎｃ−５３／１について知られている機能）を評
定した。
【０１０５】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の３'側半分へのＧＦＰ融合物（ｐＧＩ３３０３、図
７ｂ）でトランスフェクションしたＮ４細胞は、顕著な糸状仮足および扇形の膜
状物の増殖を示し、これはＦ−アクチン細胞骨格の再構成を伴っていた（図８）
。この観察は、線虫ｕｎｃ−５３およびヒトｕｎｃ−５３／１と同様にＦ−アク
チン結合ドメインはＮ４細胞のＦ−アクチン細胞骨格の再構成を誘発するのに必
要でないことを示している。さらに、ｐＧＩ３３０３にコードされた融合タンパ
ク質は微小管とともに局在化されずＮ４細胞の細胞質に局在化され、微小管の会
合にとって重要なドメインがＨｓ−ｕｎｃ−５３／３のこのＣ末端断片で欠如し
ていることを示している。アラインメントにおいて、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の
Ｃ末端側半分（およそＫＩＡＡ０９３８）が保存された微小管結合ドメインを含
んでいないことが図２からわかる。
７ｂ）でトランスフェクションしたＮ４細胞は、顕著な糸状仮足および扇形の膜
状物の増殖を示し、これはＦ−アクチン細胞骨格の再構成を伴っていた（図８）
。この観察は、線虫ｕｎｃ−５３およびヒトｕｎｃ−５３／１と同様にＦ−アク
チン結合ドメインはＮ４細胞のＦ−アクチン細胞骨格の再構成を誘発するのに必
要でないことを示している。さらに、ｐＧＩ３３０３にコードされた融合タンパ
ク質は微小管とともに局在化されずＮ４細胞の細胞質に局在化され、微小管の会
合にとって重要なドメインがＨｓ−ｕｎｃ−５３／３のこのＣ末端断片で欠如し
ていることを示している。アラインメントにおいて、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の
Ｃ末端側半分（およそＫＩＡＡ０９３８）が保存された微小管結合ドメインを含
んでいないことが図２からわかる。
【０１０６】 対照的に、完全長のＨｓ−ｕｎｃ−５３／３へのＧＦＰ融合物（ｐＧＩ３３０
５、図７ｄ）を低レベルないし中くらいのレベルで発現したＮ４細胞は、ＧＦＰ
融合タンパク質と微小管との同時局在化を示した（図９）。中心体でさえも幾つ
かのトランスフェクション細胞で明らかに検出できた。非常に低い量の融合タン
パク質を発現した細胞は、特異な微小管（＋）端結合を示した（図９）。ｐＧＩ
３３０５でトランスフェクションしたＮ４細胞の形態は対照のトランスフェクシ
ョン細胞と明らかな違いはないが、ｐＧＩ３３０５でトランスフェクションした
細胞の集合（rounding up）および糸状仮足の増殖の傾向が認められる。
５、図７ｄ）を低レベルないし中くらいのレベルで発現したＮ４細胞は、ＧＦＰ
融合タンパク質と微小管との同時局在化を示した（図９）。中心体でさえも幾つ
かのトランスフェクション細胞で明らかに検出できた。非常に低い量の融合タン
パク質を発現した細胞は、特異な微小管（＋）端結合を示した（図９）。ｐＧＩ
３３０５でトランスフェクションしたＮ４細胞の形態は対照のトランスフェクシ
ョン細胞と明らかな違いはないが、ｐＧＩ３３０５でトランスフェクションした
細胞の集合（rounding up）および糸状仮足の増殖の傾向が認められる。
【０１０７】化合物スクリーンとしての機能アッセイの確認 Ｒ７４２８８は以前にＣ．エレガンスにおいて線虫機能のインヒビターである
ことが示されている（Ｃｅ−ｕｎｃ−５３でトランスフェクションしたＮ４細胞
において確認された活性であり、トランスジーンで誘発された効果のみがＲ７４
２８８によって抑制された）。全哺乳動物システムでの化合物Ｒ７４２８８の活
性を確認するため、プラスミドｐＧＩ３１５０の安定なトランスフェクションを
Ｎ４神経芽細胞腫細胞株でリポフェクタミン法（Gibco BRL）により行った。ｐ
ＧＩ３１５０はＨｓ−ｕｎｃ−５３／１のＣ末端と融合したｅＧＦＰタンパク質
を発現する（図１５ａ参照）。
ことが示されている（Ｃｅ−ｕｎｃ−５３でトランスフェクションしたＮ４細胞
において確認された活性であり、トランスジーンで誘発された効果のみがＲ７４
２８８によって抑制された）。全哺乳動物システムでの化合物Ｒ７４２８８の活
性を確認するため、プラスミドｐＧＩ３１５０の安定なトランスフェクションを
Ｎ４神経芽細胞腫細胞株でリポフェクタミン法（Gibco BRL）により行った。ｐ
ＧＩ３１５０はＨｓ−ｕｎｃ−５３／１のＣ末端と融合したｅＧＦＰタンパク質
を発現する（図１５ａ参照）。
【０１０８】 Ｇ４１８選択の２週間後、ｐＧＩ３１５０プラスミドが安定に組み込まれた２
０のクローンを選択し、単離した。これらクローンのＧＦＰ発現について、蛍光
顕微鏡により、および抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより試
験した（表１）。扇形の膜状物増殖の表現型は視覚によりチェックした（図１５
ｂ参照）。化合物Ｒ７４２８８を、４つのランダムに選択したｐＧＩ３１５０で
安定にトランスフェクションされたクローン：８.１、８.２、８.３および１０.
１、およびｐＥＧＦＰＣ１で安定にトランスフェクションされたＮ４対照細胞の
プールで試験した。
０のクローンを選択し、単離した。これらクローンのＧＦＰ発現について、蛍光
顕微鏡により、および抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより試
験した（表１）。扇形の膜状物増殖の表現型は視覚によりチェックした（図１５
ｂ参照）。化合物Ｒ７４２８８を、４つのランダムに選択したｐＧＩ３１５０で
安定にトランスフェクションされたクローン：８.１、８.２、８.３および１０.
１、およびｐＥＧＦＰＣ１で安定にトランスフェクションされたＮ４対照細胞の
プールで試験した。
【０１０９】 クローン８.２および１０.１はクローン８.１および８.３に比べて扇形の膜状
物の増殖が少なかった。化合物および溶媒をこれら安定にトランスフェクション
された細胞に加えた（ＤＭＳＯ中に１０5Ｍ）。２４時間インキュベートした後
、２人が独立にこれら細胞の処理の効果について評定した。表１に示すように、
両人はクローン８.２および１０.１に対する化合物２の効果（弱いトランスジー
ン誘発された扇形の膜状物表現型を伴う）を認めた。この効果は、未処理細胞に
比べて処理細胞が一層平らな形状であることからなっていた。化合物２はＲ７４
２８８であった。
物の増殖が少なかった。化合物および溶媒をこれら安定にトランスフェクション
された細胞に加えた（ＤＭＳＯ中に１０5Ｍ）。２４時間インキュベートした後
、２人が独立にこれら細胞の処理の効果について評定した。表１に示すように、
両人はクローン８.２および１０.１に対する化合物２の効果（弱いトランスジー
ン誘発された扇形の膜状物表現型を伴う）を認めた。この効果は、未処理細胞に
比べて処理細胞が一層平らな形状であることからなっていた。化合物２はＲ７４
２８８であった。
【０１１０】表１．扇形の膜状物形成に対する化合物の効果
【表１】
【０１１１】細胞形状の測定による自動化化合物スクリーニング 化合物スクリーニングアッセイは、薬剤の発見に適した充分に高い処理量を有
していなければならない。この目的を達成するため、本発明者らは完全長または
３'側半分のＨｓ−ｕｎｃ−５３／３とＧＦＰとのキメラでの一過性のトランス
フェクション後に細胞で誘発される形態学的変化の測定手順を自動化した。細胞
培養、トランスフェクション、蛍光染色および顕微鏡観察手順を９６−ウエルプ
レート（オールインワン）で行う。蛍光染色法は、三重の蛍光標識手順を含む：
（１）細胞の核についてはHoechst 33342またはＤＡＰＩなどのＤＮＡ二重らせ
んインターカレート染料を使用、（２）キメラタンパク質のトランスフェクショ
ン効率および発現レベルについてはＧＦＰ蛍光を使用および（３）Ｆ−アクチン
の細胞骨格については蛍光標識したファロイジン（ミクロフィラメント染料）。
していなければならない。この目的を達成するため、本発明者らは完全長または
３'側半分のＨｓ−ｕｎｃ−５３／３とＧＦＰとのキメラでの一過性のトランス
フェクション後に細胞で誘発される形態学的変化の測定手順を自動化した。細胞
培養、トランスフェクション、蛍光染色および顕微鏡観察手順を９６−ウエルプ
レート（オールインワン）で行う。蛍光染色法は、三重の蛍光標識手順を含む：
（１）細胞の核についてはHoechst 33342またはＤＡＰＩなどのＤＮＡ二重らせ
んインターカレート染料を使用、（２）キメラタンパク質のトランスフェクショ
ン効率および発現レベルについてはＧＦＰ蛍光を使用および（３）Ｆ−アクチン
の細胞骨格については蛍光標識したファロイジン（ミクロフィラメント染料）。
【０１１２】 これら３つの異なる蛍光像を電動ステージとステージドライバーおよびフレー
ムグラバーを用いて寄せ集め、ウエル中の細胞の継ぎ目のない合成像を形成させ
た。この操作を行うソフトプログラムは「ＳＣＩＬ」としてパブリックドメイン
（public domain）において知られている（ユニバーシティー・オブ・アムステ
ルダム）。ついで、これら継ぎ目のない像を操作者が培養の質を調べるための偽
彩色（pseudocolour）を用いて重ね合わせた。
ムグラバーを用いて寄せ集め、ウエル中の細胞の継ぎ目のない合成像を形成させ
た。この操作を行うソフトプログラムは「ＳＣＩＬ」としてパブリックドメイン
（public domain）において知られている（ユニバーシティー・オブ・アムステ
ルダム）。ついで、これら継ぎ目のない像を操作者が培養の質を調べるための偽
彩色（pseudocolour）を用いて重ね合わせた。
【０１１３】 さらに、ＳＣＩＬプログラムは、（１）細胞をその核によって同定し、（２）
ＧＦＰ蛍光強度を測定し、（３）核を取り囲むＦ−アクチン（ファロイジン）染
色の領域を線引きし、（４）個々の各細胞のＦ−アクチン染色パターンの特徴を
客観的に表す所定範囲のパラメーターを計算するような仕方で編集した。そのよ
うなパラメーターの一つの例は「形状因子（form factor）」と呼ばれる。これ
は細胞の樹状突起度（dendricity）を反映する恣意的な値である。これは、（Ａ
）像中に認められる細胞のＦ−アクチン染色領域の真の円周および（Ｂ）該所定
細胞のＦ−アクチン染色の面積を計算することにより得られる。比４ｘＰＩｘ（
Ｂ)2＝形状因子。円形の細胞では形状因子はおよそ１であるが、糸状仮足および
扇形の膜状物増殖の増大した細胞では真の円周は円の円周よりも遥かに大きくな
り、その結果、形状因子は＜＜１となるであろう。
ＧＦＰ蛍光強度を測定し、（３）核を取り囲むＦ−アクチン（ファロイジン）染
色の領域を線引きし、（４）個々の各細胞のＦ−アクチン染色パターンの特徴を
客観的に表す所定範囲のパラメーターを計算するような仕方で編集した。そのよ
うなパラメーターの一つの例は「形状因子（form factor）」と呼ばれる。これ
は細胞の樹状突起度（dendricity）を反映する恣意的な値である。これは、（Ａ
）像中に認められる細胞のＦ−アクチン染色領域の真の円周および（Ｂ）該所定
細胞のＦ−アクチン染色の面積を計算することにより得られる。比４ｘＰＩｘ（
Ｂ)2＝形状因子。円形の細胞では形状因子はおよそ１であるが、糸状仮足および
扇形の膜状物増殖の増大した細胞では真の円周は円の円周よりも遥かに大きくな
り、その結果、形状因子は＜＜１となるであろう。
【０１１４】 実際、実験では、一過性にトランスフェクションしたＮ４細胞集団は対照の細
胞に比べて異なる形状因子を示した。ウエル中の細胞集団の中間および平均の形
状因子は、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の３'側半分でトランスフェクションした後
に低減した。さらに詳細には、最小の形状因子を示すトランスフェクション培養
液の細胞数が有意に減少し、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３トランスジーンが円形の細
胞をとりわけ一層樹状の形状へと誘発したことが示唆された（図１６）。
胞に比べて異なる形状因子を示した。ウエル中の細胞集団の中間および平均の形
状因子は、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の３'側半分でトランスフェクションした後
に低減した。さらに詳細には、最小の形状因子を示すトランスフェクション培養
液の細胞数が有意に減少し、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３トランスジーンが円形の細
胞をとりわけ一層樹状の形状へと誘発したことが示唆された（図１６）。
【０１１５】役割疾患（role disease）を示すＦＩＳＨによるＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の染色
体上の位置決定 ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の唯一の断片を用いたＦＩＳＨ法により、本発明者ら
はｈｓ−ｕｎｃ５３／３遺伝子を１２ｑ２１.１上に位置決定することができる
。染色体１２ｑ２１.１は、常染色体優性の扁平角膜および閉塞角緑内障に関与
していることが示されている（Sigler-Villanuevaら、Ophthalmic Genetics 18:
55-62,1997）。このことは、ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパク質が眼の発生、そ
れゆえ網膜芽腫などの眼の疾患に関与しているかもしれないことを示している。
神経芽細胞腫細胞株ＮＰＧおよび脂肪肉腫細胞株ＷＤＬＰＳおよび他の肉腫細胞
株は、この領域が増幅している。神経芽細胞腫の増幅はより遠位に位置している
（１２ｑ２４）と思われるのに対し、脂肪肉腫細胞株は１２ｑ２１に位置してい
る（Van Royalら、Cancer Genetics and Cytogenetics 82:151-4,1995）。
体上の位置決定 ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の唯一の断片を用いたＦＩＳＨ法により、本発明者ら
はｈｓ−ｕｎｃ５３／３遺伝子を１２ｑ２１.１上に位置決定することができる
。染色体１２ｑ２１.１は、常染色体優性の扁平角膜および閉塞角緑内障に関与
していることが示されている（Sigler-Villanuevaら、Ophthalmic Genetics 18:
55-62,1997）。このことは、ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパク質が眼の発生、そ
れゆえ網膜芽腫などの眼の疾患に関与しているかもしれないことを示している。
神経芽細胞腫細胞株ＮＰＧおよび脂肪肉腫細胞株ＷＤＬＰＳおよび他の肉腫細胞
株は、この領域が増幅している。神経芽細胞腫の増幅はより遠位に位置している
（１２ｑ２４）と思われるのに対し、脂肪肉腫細胞株は１２ｑ２１に位置してい
る（Van Royalら、Cancer Genetics and Cytogenetics 82:151-4,1995）。
【０１１６】 表皮の棘細胞離開および角化不全を特徴とする常染色体優性の遺伝性皮膚疾患
であるダリエ病に関連する３つの遺伝子座もまた、領域１２ｑ２１−ｑ２４中に
マッピングされている（Wrightら、Journal of Investigative Dermatology 103
:665-8）。１２ｑ２１はまた、非ホジキンリンパ腫の病因と関連する脆弱な部位
であることがわかっている（Chary-Reddyら、Cancer Letter 86:111-7,1994）。
腎芽細胞腫の発癌に関連する重複が１２ｑ２１−ｑ２３領域で一般に見出されて
いる（Austruyら、Genes Chromosomes Cancer 14:285-294,1995）。精神遅滞（
脳性麻痺に類似する終局の異常および臨床所見）を患う少女で、他の常染色体か
らのセグメントのバンド１２ｑ２１への位置付けが見出された（Biedermanら、A
nn.Genet.19:257-260,1976）。
であるダリエ病に関連する３つの遺伝子座もまた、領域１２ｑ２１−ｑ２４中に
マッピングされている（Wrightら、Journal of Investigative Dermatology 103
:665-8）。１２ｑ２１はまた、非ホジキンリンパ腫の病因と関連する脆弱な部位
であることがわかっている（Chary-Reddyら、Cancer Letter 86:111-7,1994）。
腎芽細胞腫の発癌に関連する重複が１２ｑ２１−ｑ２３領域で一般に見出されて
いる（Austruyら、Genes Chromosomes Cancer 14:285-294,1995）。精神遅滞（
脳性麻痺に類似する終局の異常および臨床所見）を患う少女で、他の常染色体か
らのセグメントのバンド１２ｑ２１への位置付けが見出された（Biedermanら、A
nn.Genet.19:257-260,1976）。
【０１１７】 骨髄性白血病の細胞遺伝学的分析は、１２ｑ２１に染色体切断点（breakpoint
s）を有する複雑な核型を示した（Weinsteinら、Cancer Genet.Cytogenet.48:75
-81,1990）。最後に、奇形の子供および自然流産からの複雑な染色体再配置の分
析は、部位１２ｑ２１での特定の切断点を示した（Gorskiら、Am.J.Med.Genet.2
9:247-261,1997）。これらの疾患の殆どは、細胞移動、異所性の発生、または細
胞−細胞接触およびニューロン組織またはニューロン発生に関与していることが
示されている。
s）を有する複雑な核型を示した（Weinsteinら、Cancer Genet.Cytogenet.48:75
-81,1990）。最後に、奇形の子供および自然流産からの複雑な染色体再配置の分
析は、部位１２ｑ２１での特定の切断点を示した（Gorskiら、Am.J.Med.Genet.2
9:247-261,1997）。これらの疾患の殆どは、細胞移動、異所性の発生、または細
胞−細胞接触およびニューロン組織またはニューロン発生に関与していることが
示されている。
【０１１８】放射性ハイブリッドパネルを用いたＦＩＳＨの確認 ヒトｕｎｃ−５３の染色体上の位置決定を確認および正確にするため、別のＦ
ＩＳＨ法を用いた。放射性ハイブリッド（ＲＨ）マッピングは、哺乳動物染色体
の高解像で隣接するマップを構築するために開発された体細胞ハイブリッド法で
ある。ＲＨマッピングは、何百万もの塩基対のＤＮＡにまたがるＤＮＡマーカー
を他のマッピング法で容易に得られる解像度で順序付ける方法を提供する。ＲＨ
マッピングの幾つかの利点は、（１）この方法によって推定される距離は物理的
な距離に比例していること、（２）減数分裂マッピングでは使用できない非多型
ＤＮＡマーカーをこの方法では使用できること、および（３）他の方法では得る
ことのできない高解像マップが得られることである。
ＩＳＨ法を用いた。放射性ハイブリッド（ＲＨ）マッピングは、哺乳動物染色体
の高解像で隣接するマップを構築するために開発された体細胞ハイブリッド法で
ある。ＲＨマッピングは、何百万もの塩基対のＤＮＡにまたがるＤＮＡマーカー
を他のマッピング法で容易に得られる解像度で順序付ける方法を提供する。ＲＨ
マッピングの幾つかの利点は、（１）この方法によって推定される距離は物理的
な距離に比例していること、（２）減数分裂マッピングでは使用できない非多型
ＤＮＡマーカーをこの方法では使用できること、および（３）他の方法では得る
ことのできない高解像マップが得られることである。
【０１１９】 ３つのヒトｕｎｃ−５３についてのＦＩＳＨおよびＲＨマッピングの結果を表
ＡＡにまとめてある。公的に利用できるデータベース（実験セクションを参照）
を用いることにより、ＦＩＳＨとＲＨマッピングとの間の相関関係についての情
報を得ることができる。ＲＨマッピングは、このようにして３つのｕｎｃ−５３
についてのＦＩＳＨデータを確認するために示した。
ＡＡにまとめてある。公的に利用できるデータベース（実験セクションを参照）
を用いることにより、ＦＩＳＨとＲＨマッピングとの間の相関関係についての情
報を得ることができる。ＲＨマッピングは、このようにして３つのｕｎｃ−５３
についてのＦＩＳＨデータを確認するために示した。
【０１２０】表２．ＲＨマッピングプライマーおよび結果
【表２】 （＊）網羅的でないリスト
【０１２１】 パブリックドメインで利用できる配列情報もまた、下記の例のようにｕｎｃ−
５３遺伝子の位置付けを正確にするのに役立ちうる。ＥＳＴクローンＡＡ９１８
６０１、ＡＩ２４８５８５、ＡＡ１１５０１４およびＡＡ１１５０１５は、明ら
かにＨｓ−Ｕｎｃ５３／２ ｃＤＮＡに相同である。しかしながら、ＡＡ１１５
０１４（ＡＡ１１５０１５と同じＥＳＴを記載）は３'ＵＴＲ中にＨｓ−Ｕｎｃ
５３／２遺伝子の別のスプライス変異体を含む。ＥＳＴＡＡ９１８６０１、ＡＩ
２４８５８５、ＡＡ１１５０１４またはＡＡ１１５０１５を質問としてgenemap9
8データベース（１９９８年１１月に公開）で調査したところ、Ｈｓ−ｕｎｃ５
３／２遺伝子が第１１染色体に位置することが明らかとなった（http://www.ncb
i.nlm.nih.gov/genemap98/loc.cgi?ID=21224）。
５３遺伝子の位置付けを正確にするのに役立ちうる。ＥＳＴクローンＡＡ９１８
６０１、ＡＩ２４８５８５、ＡＡ１１５０１４およびＡＡ１１５０１５は、明ら
かにＨｓ−Ｕｎｃ５３／２ ｃＤＮＡに相同である。しかしながら、ＡＡ１１５
０１４（ＡＡ１１５０１５と同じＥＳＴを記載）は３'ＵＴＲ中にＨｓ−Ｕｎｃ
５３／２遺伝子の別のスプライス変異体を含む。ＥＳＴＡＡ９１８６０１、ＡＩ
２４８５８５、ＡＡ１１５０１４またはＡＡ１１５０１５を質問としてgenemap9
8データベース（１９９８年１１月に公開）で調査したところ、Ｈｓ−ｕｎｃ５
３／２遺伝子が第１１染色体に位置することが明らかとなった（http://www.ncb
i.nlm.nih.gov/genemap98/loc.cgi?ID=21224）。
【０１２２】 染色体上の位置決定に用いＨｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子の３'ＵＴＲ中に位置
するＳＴＳは、ＳＨＧＣ−３３４５６と称する（ｄｂＳＴＳ ｉｄ：４１８９１
、ジーンバンクＡｃｃ：Ｇ２８０３６、ジーンバンクｇｉ：１３９６７５５）（
図１３）。ＳＴＳはＮＩＧＭＳヒト／マウス体細胞ハイブリッドパネル上での分
析により位置決定された（ｄｂＳＴＳ ｉｄ：４１８９１）。放射性ハイブリッ
ドの結果を図１３にまとめてある。これらデータをまとめると、ＳＨＧＣ−３３
４５６に関連するすべての疾患または表現型はＨｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子によ
るものであることが示唆される。
するＳＴＳは、ＳＨＧＣ−３３４５６と称する（ｄｂＳＴＳ ｉｄ：４１８９１
、ジーンバンクＡｃｃ：Ｇ２８０３６、ジーンバンクｇｉ：１３９６７５５）（
図１３）。ＳＴＳはＮＩＧＭＳヒト／マウス体細胞ハイブリッドパネル上での分
析により位置決定された（ｄｂＳＴＳ ｉｄ：４１８９１）。放射性ハイブリッ
ドの結果を図１３にまとめてある。これらデータをまとめると、ＳＨＧＣ−３３
４５６に関連するすべての疾患または表現型はＨｓ−Ｕｎｃ５３／２遺伝子によ
るものであることが示唆される。
【０１２３】実験手順 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３のクローニングおよびシークエンシング Ｈｓ−ｕｎｃ５３／３をＨｓ−ｕｎｃ−５３／１またはＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２に類似してはいるが同一ではない一連のＥＳＴから開始してクローニングした
。ＥＳＴは以下の通りであった：
２に類似してはいるが同一ではない一連のＥＳＴから開始してクローニングした
。ＥＳＴは以下の通りであった：
【０１２４】 １．ＷａｓｈＵ−Ｍｅｒｃｋ ＥＳＴ７６７７３５ ＥＳＴ７６７７３５配列を含む形質転換細胞をResearch Geneticsから注文し
た。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲン（Qiagen）プラスミドＤＮ
Ａ単離キット）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
た。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲン（Qiagen）プラスミドＤＮ
Ａ単離キット）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
【０１２５】 ２．ＡＴＣＣ ｃＤＮＡクローン８６４５９ ｃＤＮＡクローン８６４５９配列を含む形質転換細胞をＡＴＣＣから注文した
。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲンプラスミドＤＮＡ単離キット
）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲンプラスミドＤＮＡ単離キット
）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
【０１２６】 ３．Geneexpress ｃＤＮＡプログラムからのGenethon ｃＤＮＡクローンｃ０９
ａ０３ ｃＤＮＡクローンｃ０９ａ０３配列を含む形質転換細胞をGenethonから注文
した。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲンプラスミドＤＮＡ単離キ
ット）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
ａ０３ ｃＤＮＡクローンｃ０９ａ０３配列を含む形質転換細胞をGenethonから注文
した。プラスミドＤＮＡを標準プロトコール（キアゲンプラスミドＤＮＡ単離キ
ット）を用いて単離し、挿入物の配列を決定した。
【０１２７】 これらＥＳＴを一つのＯＲＦを形成するように以下のようにして拡張した： １．ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）によるＥＳＴ ７６７７３５の５'拡
張 Marathon-Ready ｃＤＮＡ（Clontech）は、ＲＡＣＥ実験に鋳型としてすぐに
使用できるアダプター結合した二本鎖ｃＤＮＡの前以て調製した「ライブラリー
」である。５ｍｌのMarathon-Ready ｃＤＮＡを通例の５０ｍｌ ＲＡＣＥにおい
て鋳型として用いた。ＲＡＣＥ混合物は、１×KlenTaq ＰＣＲ緩衝液、０.２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ、１×アドバンテージ（advantage）KlenTaqポリメラーゼ混合物
（Clontech）、０.１５ｍＭのＡＰ１アダプタープライマーおよび０.１５ｍＭの
ＲＡＣＥ遺伝子特異的プライマーを含んでいた。
張 Marathon-Ready ｃＤＮＡ（Clontech）は、ＲＡＣＥ実験に鋳型としてすぐに
使用できるアダプター結合した二本鎖ｃＤＮＡの前以て調製した「ライブラリー
」である。５ｍｌのMarathon-Ready ｃＤＮＡを通例の５０ｍｌ ＲＡＣＥにおい
て鋳型として用いた。ＲＡＣＥ混合物は、１×KlenTaq ＰＣＲ緩衝液、０.２ｍ
Ｍの各ｄＮＴＰ、１×アドバンテージ（advantage）KlenTaqポリメラーゼ混合物
（Clontech）、０.１５ｍＭのＡＰ１アダプタープライマーおよび０.１５ｍＭの
ＲＡＣＥ遺伝子特異的プライマーを含んでいた。
【０１２８】 増幅条件は以下のとおりであった：９４℃で３０秒および６８℃で４分間。１
００倍希釈のＲＡＣＥ生成物を、ＡＰ２アダプターおよび遺伝子特異的ネステッ
ドＰＣＲプライマーとともにネステッドＰＣＲに鋳型として用いた。特定のネス
テッドＰＣＲ断片をｐＣＲ２（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）中にクロ
ーニングし、挿入物の配列を決定した。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ
５３ ９７１０１７０２）：
００倍希釈のＲＡＣＥ生成物を、ＡＰ２アダプターおよび遺伝子特異的ネステッ
ドＰＣＲプライマーとともにネステッドＰＣＲに鋳型として用いた。特定のネス
テッドＰＣＲ断片をｐＣＲ２（ＴＡクローニングキット、Invitrogen）中にクロ
ーニングし、挿入物の配列を決定した。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ
５３ ９７１０１７０２）：
【化５】 ；ネステッド遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９７１０１７０１）
【化６】 Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤、ヒト心臓、ヒト慢性骨髄性白血病
、ヒト結腸直腸腺癌。
、ヒト結腸直腸腺癌。
【０１２９】 ２．ＲＡＣＥによるＥＳＴ ７６７７３５の３'拡張 上記に記載した方法。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９７１０
２７０２）：
２７０２）：
【化７】 ；ネステッド遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９７１０２７０３）
【化８】 Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤、ヒト心臓、ヒトＨｅＬａ、ヒト黒
色腫。
色腫。
【０１３０】 ３．ＲＡＣＥによるｃＤＮＡクローンｃ０９ａ０３の３'拡張 上記に記載した方法。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２
０４０１）：
０４０１）：
【化９】 ；ネステッド遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２０４０２）
【化１０】 Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤、ヒト心臓、ヒトＨｅＬａ、ヒト黒
色腫、ヒト結腸直腸腺癌、ヒト慢性骨髄性白血病。
色腫、ヒト結腸直腸腺癌、ヒト慢性骨髄性白血病。
【０１３１】 ４．ＲＡＣＥによるｃＤＮＡクローン８６４５９の５'拡張（１） 上記に記載した方法。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２
０４０３）：
０４０３）：
【化１１】 ；ネステッド遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２０４０４）
【化１２】 Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤、ヒト心臓、ヒトＨｅＬａ、ヒト黒
色腫。重複する配列を単一の隣接する配列で組み立てた。
色腫。重複する配列を単一の隣接する配列で組み立てた。
【０１３２】 ５．ＲＡＣＥによるｃＤＮＡクローン８６４５９の５'拡張（２） 上記に記載した方法。遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２
２５０２）：
２５０２）：
【化１３】 ；ネステッド遺伝子特異的プライマー（ｈｈ３ＵＮＣ５３ ９８０２２５０１）
【化１４】 Marathon ｃＤＮＡライブラリー：ヒト胎盤、ヒト心臓、ヒトＨｅＬａ、ヒト黒
色腫、ヒト結腸直腸腺癌、ヒト慢性骨髄性白血病。
色腫、ヒト結腸直腸腺癌、ヒト慢性骨髄性白血病。
【０１３３】ｃＤＮＡ配列の５'末端での変異体の確認 最後の５'ＲＡＣＥ実験において、その配列がＩＹＴＤＷＡＮタンパク質配列
（図１ｅの位置２８９または図１ｆの位置８２）の上流で異なる２つの変異体が
見出された。プライマー
（図１ｅの位置２８９または図１ｆの位置８２）の上流で異なる２つの変異体が
見出された。プライマー
【化１５】 および
【化１６】 をｃＤＮＡクローンに用いることにより、ランダムプライミングＤＮＡラベリン
グキット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて放射性標識したＨｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３特異的ＰＣＲ生成物が得られ、ヒトＤＮＡ ＢＡＣフィルター（Res
earch Genetics）にハイブリダイズさせた。両プライマーはＩＹＴＤＷＡＮボッ
クスの近くに位置している。
グキット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて放射性標識したＨｓ−ｕｎ
ｃ−５３／３特異的ＰＣＲ生成物が得られ、ヒトＤＮＡ ＢＡＣフィルター（Res
earch Genetics）にハイブリダイズさせた。両プライマーはＩＹＴＤＷＡＮボッ
クスの近くに位置している。
【０１３４】 ４つのＢＡＣが陽性であることがわかった（４１５Ｊ１１、４６４Ｃ１７、５
２５Ｃ０２および５３７Ｂ０２）。ＩＹＴＤＷＡＮタンパク質配列の上流の領域
がこれらＢＡＣへ直接ＤＮＡシークエンシングされたことは、読み取り枠中の複
数の停止コドンおよびコンセンサスＡＧイントロンアクセプター配列によって証
拠だてられるように、この領域が推定のイントロン配列によって先行されている
ことを示していた。シークエンシング目的のため、改変QiagenプラスミドＤＮＡ
法に従ってＢＡＣ ＤＮＡを調製した。
２５Ｃ０２および５３７Ｂ０２）。ＩＹＴＤＷＡＮタンパク質配列の上流の領域
がこれらＢＡＣへ直接ＤＮＡシークエンシングされたことは、読み取り枠中の複
数の停止コドンおよびコンセンサスＡＧイントロンアクセプター配列によって証
拠だてられるように、この領域が推定のイントロン配列によって先行されている
ことを示していた。シークエンシング目的のため、改変QiagenプラスミドＤＮＡ
法に従ってＢＡＣ ＤＮＡを調製した。
【０１３５】 図１ｅに完全に示すように変異体の５'末端を増幅するようにプライマーペア
を特別にデザインした（プライマー
を特別にデザインした（プライマー
【化１７】 および
【化１８】 ）。これらプライマーを用いてＢＡＣ ＤＮＡに対して行ったＰＣＲは、４つの
ＢＡＣのうち３つにおいてこの変異体をコードするゲノム配列の存在を示した（
ＢＡＣ ４１５Ｊ１１には存在しない）。
ＢＡＣのうち３つにおいてこの変異体をコードするゲノム配列の存在を示した（
ＢＡＣ ４１５Ｊ１１には存在しない）。
【０１３６】 図１ｅに変異体として示すようにＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の他の５'末端変異
体をコードするゲノム配列を含むＢＡＣを、Research Genetics ヒトＤＮＡ Ｇ
ＡＣフィルターをプライマー
体をコードするゲノム配列を含むＢＡＣを、Research Genetics ヒトＤＮＡ Ｇ
ＡＣフィルターをプライマー
【化１９】 （ガンマ−Ｐ３２−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性標識
）とハイブリダイズすることにより同定した。陽性ＢＡＣは４０４Ｆ１４、４５
０Ｋ１８および７６４Ｌ１５であった。
）とハイブリダイズすることにより同定した。陽性ＢＡＣは４０４Ｆ１４、４５
０Ｋ１８および７６４Ｌ１５であった。
【０１３７】 ２つの別の５'エクソン内から３'方向での各ＢＡＣへの直接シークエンシング
およびゲノムＤＮＡ配列と以前に決定されたｃＤＮＡ配列との比較は、ＧＴイン
トロンドナー部位を同定した。予測されたイントロン配列を除去した後に両５'
エクソンからのゲノム配列およびＩＹＴＤＷＡＮコード配列を連結させると、両
変異体についてオープンリーディングフレームの翻訳に影響を及ぼすことなく５
'ＲＡＣ実験の配列が回復された。
およびゲノムＤＮＡ配列と以前に決定されたｃＤＮＡ配列との比較は、ＧＴイン
トロンドナー部位を同定した。予測されたイントロン配列を除去した後に両５'
エクソンからのゲノム配列およびＩＹＴＤＷＡＮコード配列を連結させると、両
変異体についてオープンリーディングフレームの翻訳に影響を及ぼすことなく５
'ＲＡＣ実験の配列が回復された。
【０１３８】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３構築物のクローニング Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の完全長オープンリーディングフレームをクローニン
グする目的で、サイズが１〜２ｋｂｐの範囲の６つの重複する断片でＯＲＦが増
幅されるようにプライマーペアを選択した。これら断片間の重複は、それらが完
全長の遺伝子のクローニングに適したエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含
むように選択した。５'断片については、下流方向に向いたプライマーを変異体
１中に第一の推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むように選択した（図１ｅに完全に
示すもの）。これら断片すべてについてExpand High Fidelity ＰＣＲシステム
（Roche Molecular Biochemicals）を用いるＰＣＲ条件は以下の通りであった。
最初の変性を９５℃で５分；９５℃で３４秒の変性、５５℃で４５秒のプライマ
ーアニーリングついで７２℃で１分（プライマーの組み合わせＡ＋Ｂについては
３分）の伸長からなるサイクルを３０サイクル；さらに７２℃で７分のさらなる
インキュベーションおよび４℃で貯蔵。ＰＣＲはPE Biosystems 9700 PCR機で行
った。
グする目的で、サイズが１〜２ｋｂｐの範囲の６つの重複する断片でＯＲＦが増
幅されるようにプライマーペアを選択した。これら断片間の重複は、それらが完
全長の遺伝子のクローニングに適したエンドヌクレアーゼ制限酵素認識部位を含
むように選択した。５'断片については、下流方向に向いたプライマーを変異体
１中に第一の推定開始コドン（ＡＴＧ）を含むように選択した（図１ｅに完全に
示すもの）。これら断片すべてについてExpand High Fidelity ＰＣＲシステム
（Roche Molecular Biochemicals）を用いるＰＣＲ条件は以下の通りであった。
最初の変性を９５℃で５分；９５℃で３４秒の変性、５５℃で４５秒のプライマ
ーアニーリングついで７２℃で１分（プライマーの組み合わせＡ＋Ｂについては
３分）の伸長からなるサイクルを３０サイクル；さらに７２℃で７分のさらなる
インキュベーションおよび４℃で貯蔵。ＰＣＲはPE Biosystems 9700 PCR機で行
った。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】 プライマーＡは、それぞれ真核発現ベクター（ｐＥＧＦＰｃ３）および酵母ツ
ーハイブリッドベクター（ｐＡＳ２−１）中での最終サブクローニングに適した
制限部位（ＸｈｏＩおよびｎｈｅＩ）を含んでいた。 ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウム染色に
より可視化した。図１ｅに記載するスプライス変異体がアガロースゲル上に複数
のバンドとして観察された。単一バンドのＰＣＲ生成物はQiaquick ＰＣＲ精製
キットを用いて精製し、一方、複数バンドのＰＣＲ生成物は個々のバンドとして
ゲルから切り出し、Qiaquickゲル抽出キットを用いて精製した。
ーハイブリッドベクター（ｐＡＳ２−１）中での最終サブクローニングに適した
制限部位（ＸｈｏＩおよびｎｈｅＩ）を含んでいた。 ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウム染色に
より可視化した。図１ｅに記載するスプライス変異体がアガロースゲル上に複数
のバンドとして観察された。単一バンドのＰＣＲ生成物はQiaquick ＰＣＲ精製
キットを用いて精製し、一方、複数バンドのＰＣＲ生成物は個々のバンドとして
ゲルから切り出し、Qiaquickゲル抽出キットを用いて精製した。
【０１４１】 ＰＣＲ生成物を供給者のプロトコール（Invitrogen）に従ってｐＣＲ２.１中
にクローニングした。各断片について複数のクローンを選択ＬＢ寒天プレートか
ら取り出し、biorot 9600（Qiagen）上かまたは手動で陰イオン交換交換カラム
（Qiagenチップ２０またはチップ１００）上のいずれかでＤＮＡ調製のための抗
生物質選択圧下で一夜増殖させた。挿入配列をBigdyeターミネーターレディーリ
アクションサイクルシークエンシングキット（PE Biosystems）を用いて決定し
た。各クローンについての個々のシークエンシング反応をSequencherソフトウエ
アパッケージ（GeneCodes）を用いて単一配列コンティグとして組み立てた。
にクローニングした。各断片について複数のクローンを選択ＬＢ寒天プレートか
ら取り出し、biorot 9600（Qiagen）上かまたは手動で陰イオン交換交換カラム
（Qiagenチップ２０またはチップ１００）上のいずれかでＤＮＡ調製のための抗
生物質選択圧下で一夜増殖させた。挿入配列をBigdyeターミネーターレディーリ
アクションサイクルシークエンシングキット（PE Biosystems）を用いて決定し
た。各クローンについての個々のシークエンシング反応をSequencherソフトウエ
アパッケージ（GeneCodes）を用いて単一配列コンティグとして組み立てた。
【０１４２】 配列を以前に決定したコンセンサス配列とSeqEdソフトウエアパッケージフォ
ームPE Biosystemsを用いて比較した。各断片について正しい配列および所望の
スプライス変異体を含むクローンを選択した。Ｉ−Ｊ断片については、心臓特異
的な２２アミノ酸のスプライス変異体を欠如したクローンを選択した（図１ｆ）
。Ｋ−Ｌ断片クローンでは、完全長の遺伝子をそれぞれ酵母ツーハイブリッドベ
クター（ｐＡＳ２−１）および真核発現ベクター（ｐＥＧＦＰｃ３）中へサブク
ローニングするのを容易にするため、ｐＣＲ２.１のマルチプルクローニングサ
イトのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
ームPE Biosystemsを用いて比較した。各断片について正しい配列および所望の
スプライス変異体を含むクローンを選択した。Ｉ−Ｊ断片については、心臓特異
的な２２アミノ酸のスプライス変異体を欠如したクローンを選択した（図１ｆ）
。Ｋ−Ｌ断片クローンでは、完全長の遺伝子をそれぞれ酵母ツーハイブリッドベ
クター（ｐＡＳ２−１）および真核発現ベクター（ｐＥＧＦＰｃ３）中へサブク
ローニングするのを容易にするため、ｐＣＲ２.１のマルチプルクローニングサ
イトのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。
【０１４３】 完全長遺伝子の全クローニング戦略を図７ａに可視化してある。図７ａ（１）
は重複するＰＣＲ断片と断片およびプライマーペアの命名を示す。図７ａ（２）
はｐＣＲ２.１中での該遺伝子の３'側半分の組み立てを示す。内部のＢａｍＨＩ
（Ｉ−Ｊ断片）およびＸｈｏＩ（Ｋ−Ｌ断片）部位並びにｐＣＲ２.１のマルチ
プルクローニングサイトからの制限部位（図に示す）を、Quickchange Site-Dir
ected突然変異誘発キット（stratagene）を用いて部位特異的突然変異誘発（Ｓ
ＤＭ）により除去した。ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ Ｇ−Ｈ断片およびＥｃｏＲＩ−
ＮｈｅＩ Ｉ−Ｊｄ２２（ｄ２２は２２アミノ酸のスプライス変異体が存在しな
いことを示す）を、Ｋ−Ｌ断片クローンＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ部位に正しい方
向でクローニングした。複数のクローンを取り出し、ＤＮＡシークエンシングに
より確認した。図７ａ（３）は５'側半分の組み立てを示す。内部のＸｈｏＩ（
Ｃ−Ｄ断片）およびＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（Ｅ−Ｆ断片）部位をＳＤＭにより
除去した。
は重複するＰＣＲ断片と断片およびプライマーペアの命名を示す。図７ａ（２）
はｐＣＲ２.１中での該遺伝子の３'側半分の組み立てを示す。内部のＢａｍＨＩ
（Ｉ−Ｊ断片）およびＸｈｏＩ（Ｋ−Ｌ断片）部位並びにｐＣＲ２.１のマルチ
プルクローニングサイトからの制限部位（図に示す）を、Quickchange Site-Dir
ected突然変異誘発キット（stratagene）を用いて部位特異的突然変異誘発（Ｓ
ＤＭ）により除去した。ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ Ｇ−Ｈ断片およびＥｃｏＲＩ−
ＮｈｅＩ Ｉ−Ｊｄ２２（ｄ２２は２２アミノ酸のスプライス変異体が存在しな
いことを示す）を、Ｋ−Ｌ断片クローンＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ部位に正しい方
向でクローニングした。複数のクローンを取り出し、ＤＮＡシークエンシングに
より確認した。図７ａ（３）は５'側半分の組み立てを示す。内部のＸｈｏＩ（
Ｃ−Ｄ断片）およびＳｆｉＩおよびＸｈｏＩ（Ｅ−Ｆ断片）部位をＳＤＭにより
除去した。
【０１４４】 挿入物を適当な制限酵素（それぞれ、ＸｈｏＩ＋ＳａｌＩ；ＳａｌＩ＋Ｎａｒ
ＩおよびＮａｒＩ＋ＢａｍＨＩ）で制限消化することによりベクターから切り出
し、アガロースゲル電気泳動後にゲルから精製した。これら３つの断片をライゲ
ートし、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで再度切断し、ゲル上で分離した。予測され
たサイズのバンドをゲルから切り出し、精製し、ついで３'側半分（ＸｈｏＩお
よびＢａｍＨＩでの消化により開裂してあった）の前にクローニングした（図７
ａ（４））。複数のクローンを取り出し、シークエンシングにより確認した。
ＩおよびＮａｒＩ＋ＢａｍＨＩ）で制限消化することによりベクターから切り出
し、アガロースゲル電気泳動後にゲルから精製した。これら３つの断片をライゲ
ートし、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで再度切断し、ゲル上で分離した。予測され
たサイズのバンドをゲルから切り出し、精製し、ついで３'側半分（ＸｈｏＩお
よびＢａｍＨＩでの消化により開裂してあった）の前にクローニングした（図７
ａ（４））。複数のクローンを取り出し、シークエンシングにより確認した。
【０１４５】 図７ａは、このクローニングプロジェクトのモジュール方式の性質を説明して
いる。構築ブロック断片内のスプライス変異体のすべての可能な組み合わせにつ
いて、一つの代表的なクローンを利用できる。機能的な分析の観点から、構築ブ
ロックをｐＣＲ２.１構築物中かまたは最終的な真核発現構築物または酵母ツー
ハイブリッド構築物中のいずれかで標準法により容易に交換することができる。
いる。構築ブロック断片内のスプライス変異体のすべての可能な組み合わせにつ
いて、一つの代表的なクローンを利用できる。機能的な分析の観点から、構築ブ
ロックをｐＣＲ２.１構築物中かまたは最終的な真核発現構築物または酵母ツー
ハイブリッド構築物中のいずれかで標準法により容易に交換することができる。
【０１４６】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３ ＧＦＰキメラの構築 哺乳動物発現ベクターｐＧＩ３３０３およびｐＧＩ３３０５の構築を図７ａ、
７ｂおよび７ｄの凡例に説明してある。ｐＧＩ３３０３は、哺乳動物細胞または
動物においてｅＧＦＰとＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の１１２８アミノ酸Ｃ末端断片
との融合タンパク質を過剰発現するのに用いることができる（図７ｃ）。ｐＧＩ
３３０５は、哺乳動物細胞または動物においてｅＧＦＰと２３６３アミノ酸完全
長Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３との融合タンパク質を過剰発現するのに用いることが
できる（図７ｄ）。ｐＧＩ３３０３およびｐＧＩ３３０５中のＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３ ｃＤＮＡは、これらベクター中の異なるタイプの別のスプライス変異体
を容易にサブクローニングできるように、特定の制限部位を導入もしくは除去す
るサイレント変異を含んでいる。
７ｂおよび７ｄの凡例に説明してある。ｐＧＩ３３０３は、哺乳動物細胞または
動物においてｅＧＦＰとＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の１１２８アミノ酸Ｃ末端断片
との融合タンパク質を過剰発現するのに用いることができる（図７ｃ）。ｐＧＩ
３３０５は、哺乳動物細胞または動物においてｅＧＦＰと２３６３アミノ酸完全
長Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３との融合タンパク質を過剰発現するのに用いることが
できる（図７ｄ）。ｐＧＩ３３０３およびｐＧＩ３３０５中のＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３ ｃＤＮＡは、これらベクター中の異なるタイプの別のスプライス変異体
を容易にサブクローニングできるように、特定の制限部位を導入もしくは除去す
るサイレント変異を含んでいる。
【０１４７】ゲノムＤＮＡシークエンシング（ＢＡＣ ５８５Ｅ０９） プライマー
【化２０】 および
【化２１】 を用い、Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１に特異的なＰＣＲを開発した。ＰＣＲ生成物を
Random Prime ＤＮＡラベリングキット（Roche Molecular Biochemicals）を用
いて放射性標識し、ヒトゲノムＤＮＡ ＢＡＣフィルター（Research Genetics）
上でハイブリダイズした。陽性のシグナルがＢＡＣクローン３６６Ｈ２１、４８
３Ｌ１４、４７１Ｊ０９および５８５Ｅ０９について得られた。ＢＡＣ ＤＮＡ
をQiagenプラスミドＤＮＡ調製法の変法に従って大腸菌ゲノムクローン５８５Ｅ
０９から単離した。
Random Prime ＤＮＡラベリングキット（Roche Molecular Biochemicals）を用
いて放射性標識し、ヒトゲノムＤＮＡ ＢＡＣフィルター（Research Genetics）
上でハイブリダイズした。陽性のシグナルがＢＡＣクローン３６６Ｈ２１、４８
３Ｌ１４、４７１Ｊ０９および５８５Ｅ０９について得られた。ＢＡＣ ＤＮＡ
をQiagenプラスミドＤＮＡ調製法の変法に従って大腸菌ゲノムクローン５８５Ｅ
０９から単離した。
【０１４８】 １９２０のクローンのショットガンライブラリーをＧＡＴＣにて構築した（Ko
nstanz、ドイツ）。ＢＡＣ ＤＮＡを調製し、霧状にし（nebulized）、ついで末
端修復した後にシークエンスベクターｐＴＺ１９Ｒ中にサブクローニングした。
ＪＲＦにてＤＮＡを１４４０のクローンからBiorobot 9600（Qiagen）上で調製
した。Ｍ１３フォアウォードプライマー（
nstanz、ドイツ）。ＢＡＣ ＤＮＡを調製し、霧状にし（nebulized）、ついで末
端修復した後にシークエンスベクターｐＴＺ１９Ｒ中にサブクローニングした。
ＪＲＦにてＤＮＡを１４４０のクローンからBiorobot 9600（Qiagen）上で調製
した。Ｍ１３フォアウォードプライマー（
【化２２】 ）およびリバースプライマー（
【化２３】 ）を用いた末端シークエンシング反応を７６８のクローンに対して行った。６７
２のさらなるクローンをＭ１３のみを用いてシークエンシングした。BigDye Ter
minator Ready Reactionシークエンシングキットを用い、５μｌのＤＮＡを１５
μｌの最終反応容量で用いた。シークエンシング反応をMJ Research PTC200 Ｐ
ＣＲ機上で行った。反応生成物をPE ABI 377 ＤＮＡシークエンサー上で処理し
、分析した。
２のさらなるクローンをＭ１３のみを用いてシークエンシングした。BigDye Ter
minator Ready Reactionシークエンシングキットを用い、５μｌのＤＮＡを１５
μｌの最終反応容量で用いた。シークエンシング反応をMJ Research PTC200 Ｐ
ＣＲ機上で行った。反応生成物をPE ABI 377 ＤＮＡシークエンサー上で処理し
、分析した。
【０１４９】 すべてのシークエンシング結果をSequencher（GeneCodes）ソフトウエアパッ
ケージ中に引き入れた。混入ベクター配列および低品質の付随（trailing）配列
は切り取った。個々の配列を標準ソフトウエアセッティングを用いてコンティグ
にて組み立てた。５００ｂｐ未満から１０ｋｂｐを超えるものにわたる範囲の多
数のコンティグを構築した。単一個体（singleton）も依然として存在する。一
続きの知られた配列を探すことにより、ｈＵＮＣ５３ｈ１の知られて信頼できる
５'末端を含みこの配列を５'方向に伸長するコンティグが見出された。この配列
およびそれに関連する特性を図１ｇおよびその凡例に記載してある。
ケージ中に引き入れた。混入ベクター配列および低品質の付随（trailing）配列
は切り取った。個々の配列を標準ソフトウエアセッティングを用いてコンティグ
にて組み立てた。５００ｂｐ未満から１０ｋｂｐを超えるものにわたる範囲の多
数のコンティグを構築した。単一個体（singleton）も依然として存在する。一
続きの知られた配列を探すことにより、ｈＵＮＣ５３ｈ１の知られて信頼できる
５'末端を含みこの配列を５'方向に伸長するコンティグが見出された。この配列
およびそれに関連する特性を図１ｇおよびその凡例に記載してある。
【０１５０】ノーザンブロッティング 各レーンに８つの異なるヒト組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓
、および膵臓）からの２ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むヒトマルチプル組織ノーザ
ン（ＭＴＮ−１、Clontech）および各レーンに脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣
、小腸、結腸および末梢血白血球からの２ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むＭＴＮ−
ＩＩヒトマルチプル組織ノーザンを製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせ
、０.１×ＳＳＣ：０.２％ＳＤＳ中、５５℃で洗浄した。同様にClontechから、
ヒト癌細胞株（黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０、バー
キットリンパ腫Ｒａｊｉ、白血病Ｍｏｌｔ４、リンパ性白血病Ｋ５６２、ＨｅＬ
ａ Ｓ３および前骨髄球性白血病ＨＬ６０）からのポリＡ＋ＲＮＡブロットを試
験した。
、および膵臓）からの２ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むヒトマルチプル組織ノーザ
ン（ＭＴＮ−１、Clontech）および各レーンに脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣
、小腸、結腸および末梢血白血球からの２ｍｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むＭＴＮ−
ＩＩヒトマルチプル組織ノーザンを製造業者の指示に従ってハイブリダイズさせ
、０.１×ＳＳＣ：０.２％ＳＤＳ中、５５℃で洗浄した。同様にClontechから、
ヒト癌細胞株（黒色腫Ｇ３６１、肺癌Ａ５４９、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０、バー
キットリンパ腫Ｒａｊｉ、白血病Ｍｏｌｔ４、リンパ性白血病Ｋ５６２、ＨｅＬ
ａ Ｓ３および前骨髄球性白血病ＨＬ６０）からのポリＡ＋ＲＮＡブロットを試
験した。
【０１５１】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３でプローブした癌細胞株ＲＮＡブロット 癌細胞株のノーザンブロットのセットを、プライマー
【化２４】 および
【化２５】 を用いて増幅したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の６６５ｂｐ断片でプローブした。Ｈ
Ｕ−ｕｎｃ−５３／３は黒色腫Ｇ３６１および肺癌Ａ５４９で発現され、転写物
のサイズは＞０.５ｋｂと検出された。前骨髄球性白血病ＨＬ−６０、ＨｅＬａ
細胞Ｓ３、慢性骨髄性白血病Ｋ−５６２、白血病ＭＯＬＴ−４、バーキットリン
パ腫Ｒａｊｉおよび結腸直腸腺癌ＳＷ４８０では発現は検出されなかった。
Ｕ−ｕｎｃ−５３／３は黒色腫Ｇ３６１および肺癌Ａ５４９で発現され、転写物
のサイズは＞０.５ｋｂと検出された。前骨髄球性白血病ＨＬ−６０、ＨｅＬａ
細胞Ｓ３、慢性骨髄性白血病Ｋ−５６２、白血病ＭＯＬＴ−４、バーキットリン
パ腫Ｒａｊｉおよび結腸直腸腺癌ＳＷ４８０では発現は検出されなかった。
【０１５２】Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３でプローブした正常ヒト組織ＲＮＡブロット 正常ヒト組織のノーザンブロットのセットを、プライマー
【化２６】 および
【化２７】 を用いて増幅したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の６６５ｂｐ断片でプローブした。高
発現レベルが脳、脾臓、卵巣および脊髄で検出され、低発現レベルが心臓、胎盤
、精巣、胃、および副腎で検出された。転写物のサイズは＞＝９.５ｋｂであっ
た。ＦＩＳＨ Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３は染色体１２ｑ２１.１に位置決定される。
発現レベルが脳、脾臓、卵巣および脊髄で検出され、低発現レベルが心臓、胎盤
、精巣、胃、および副腎で検出された。転写物のサイズは＞＝９.５ｋｂであっ
た。ＦＩＳＨ Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３は染色体１２ｑ２１.１に位置決定される。
【０１５３】 スライドの調製： ヒト血液から単離した白血球を、１０％ウシ胎仔血清およびフィトヘムアグル
チニン（ＰＨＡ）を補充したα−最小必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃で６８〜７
２時間培養した。白血球の培養液をＢｒｄＵ（０.１８ｍｇ／ｍｌ、Sigma）で処
理して細胞集団の周期を合わせた。周期の合った細胞を血清不含培地で３回洗浄
してブロックを放出させ（release the block）、チミジン（２.５μｇ／ｍｌ：
Sigma）とともにα−ＭＥＭ中で３７℃にて６時間再度培養した。細胞を回収し
、スライドを低浸透圧処置、固定および空気乾燥を含む標準手順を用いることに
より調製した。
チニン（ＰＨＡ）を補充したα−最小必須培地（ＭＥＭ）中、３７℃で６８〜７
２時間培養した。白血球の培養液をＢｒｄＵ（０.１８ｍｇ／ｍｌ、Sigma）で処
理して細胞集団の周期を合わせた。周期の合った細胞を血清不含培地で３回洗浄
してブロックを放出させ（release the block）、チミジン（２.５μｇ／ｍｌ：
Sigma）とともにα−ＭＥＭ中で３７℃にて６時間再度培養した。細胞を回収し
、スライドを低浸透圧処置、固定および空気乾燥を含む標準手順を用いることに
より調製した。
【０１５４】 インシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーションおよびＦＩＳＨ検出： ｃＤＮＡプローブをBRL BioNickラベリングキット（Hengら、1992）を用いて
ｄＡＴＰでビオチン化した（１５℃、１時間）。ＦＩＳＨ検出の手順はHengら、
1992およびHengおよびTsui,1993に従って行った（Hengら：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 89:9505-9513(1992)、Hengら、Chromosoma. 102:325-332(1993)）。簡単に
説明すると、スライドを５５℃で１時間燒結した。ＲＮａｓｅ処理後、スライド
を２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミド中、７０℃で２分間変性させ、ついでエタ
ノールで脱水した。
ｄＡＴＰでビオチン化した（１５℃、１時間）。ＦＩＳＨ検出の手順はHengら、
1992およびHengおよびTsui,1993に従って行った（Hengら：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 89:9505-9513(1992)、Hengら、Chromosoma. 102:325-332(1993)）。簡単に
説明すると、スライドを５５℃で１時間燒結した。ＲＮａｓｅ処理後、スライド
を２×ＳＳＣ中の７０％ホルムアミド中、７０℃で２分間変性させ、ついでエタ
ノールで脱水した。
【０１５５】 プローブを５０％ホルムアミドと１０％硫酸デキストランとからなるハイブリ
ダイゼーション混合物中、７５℃にて５分間変性した。プローブを変性した染色
体スライド上に負荷した。一夜ハイブリダイズした後、スライドを洗浄し、検出
および増幅した。ＦＩＳＨシグナルおよびＤＡＰＩバンドパターンを写真を撮る
ことにより別々に記録し、ＦＩＳＨマッピングデータの染色体バンドへの割り当
てを、ＦＩＳＨシグナルをＤＡＰＩバンド形成染色体と重ね合わせることにより
行った（Hengら、1993）。
ダイゼーション混合物中、７５℃にて５分間変性した。プローブを変性した染色
体スライド上に負荷した。一夜ハイブリダイズした後、スライドを洗浄し、検出
および増幅した。ＦＩＳＨシグナルおよびＤＡＰＩバンドパターンを写真を撮る
ことにより別々に記録し、ＦＩＳＨマッピングデータの染色体バンドへの割り当
てを、ＦＩＳＨシグナルをＤＡＰＩバンド形成染色体と重ね合わせることにより
行った（Hengら、1993）。
【０１５６】結果 使用した条件下で、このプローブのハイブリダイゼーション効率は約６７％で
あった（チェックした１００の有糸分裂像のうち６７が染色体ペア上にシグナル
を示した）。ＤＡＰＩバンド形成は特定の染色体を同定するために用いたので、
プローブからのシグナルと第１２染色体の長腕との割り当てが得られた。その詳
細な位置を、１０の写真からの要約に基づく図表でさらに決定した。
あった（チェックした１００の有糸分裂像のうち６７が染色体ペア上にシグナル
を示した）。ＤＡＰＩバンド形成は特定の染色体を同定するために用いたので、
プローブからのシグナルと第１２染色体の長腕との割り当てが得られた。その詳
細な位置を、１０の写真からの要約に基づく図表でさらに決定した。
【０１５７】放射性ハイブリッドマッピング 放射性ハイブリッド分析はＰＣＲ法であり、放射性ハイブリッドＤＮＡのパネ
ルはこれら反応に適したＴＥ緩衝液中に２５ｎｇ／μｌの濃度で提供される。典
型的には２５ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＰＣＲ反応に用いる。 放射性ハイブリッドパネルの幾つかはｅ−メールサーバーにより支持されてお
り、これはマーカーの染色体位置決定に役立ちうる。Stanford G3およびＴＮＧ
パネルを用いたマーカーの染色体位置決定のためのサーバーは、http://www-shg
c.stanford.eduで利用できる。カタログ刊行の時点ではStanford ＴＮＧサーバ
ーは第２、第４、第７および第２１染色体でのみ染色体位置決定できた。
ルはこれら反応に適したＴＥ緩衝液中に２５ｎｇ／μｌの濃度で提供される。典
型的には２５ｎｇのＤＮＡを１０μｌのＰＣＲ反応に用いる。 放射性ハイブリッドパネルの幾つかはｅ−メールサーバーにより支持されてお
り、これはマーカーの染色体位置決定に役立ちうる。Stanford G3およびＴＮＧ
パネルを用いたマーカーの染色体位置決定のためのサーバーは、http://www-shg
c.stanford.eduで利用できる。カタログ刊行の時点ではStanford ＴＮＧサーバ
ーは第２、第４、第７および第２１染色体でのみ染色体位置決定できた。
【０１５８】 GeneBridge4パネルからのマーカーの染色体位置決定は、サーバーにhttp://ww
w-genome.wi.mit.eduにてアクセスすることにより行うことができる。ＲＨマッ
ピングは、マーカー同士の互いの相対的順序を決定するために数個から多数個の
マーカーの統計分析を含む。ＲＨマッピングは統計的なプログラムを用いて行う
ことができ、一つの順序と他の順序との相対的な蓋然性の測定値とともに最適の
マップを提供するであろう。
w-genome.wi.mit.eduにてアクセスすることにより行うことができる。ＲＨマッ
ピングは、マーカー同士の互いの相対的順序を決定するために数個から多数個の
マーカーの統計分析を含む。ＲＨマッピングは統計的なプログラムを用いて行う
ことができ、一つの順序と他の順序との相対的な蓋然性の測定値とともに最適の
マップを提供するであろう。
【０１５９】 このタイプの分析は、ＲＨマップ上にマーカーの順序（別の順序に比べて有意
に蓋然性が高いもの）を首尾よく生成することが示されている。ＲＨマッピング
のための２つの統計的なプログラムをWorld Wide Webから無料でダウンロードす
ることができる。SAMapperはStanford Human Genome Centerで作成されたもので
あり、http://www-shgc.stanford.edu/Mapping/SAMapper/index.htmlにてダウン
ロードすることができる。ＲＨＭＡＰはUniversity of MichiganのMichael Boeh
nkeらによって書かれたものであり、http://www.sph.umich.edu/group/statgen/
softwareにてダウンロードすることができる。放射性ハイブリッドマッピングに
関する包括的なウエブページ（分析ソフトウエアおよび他の情報のウエブサイト
とリンク）は、http://linkage.rockefeller.edu/tara/rhmap/にて見出すことが
できる。
に蓋然性が高いもの）を首尾よく生成することが示されている。ＲＨマッピング
のための２つの統計的なプログラムをWorld Wide Webから無料でダウンロードす
ることができる。SAMapperはStanford Human Genome Centerで作成されたもので
あり、http://www-shgc.stanford.edu/Mapping/SAMapper/index.htmlにてダウン
ロードすることができる。ＲＨＭＡＰはUniversity of MichiganのMichael Boeh
nkeらによって書かれたものであり、http://www.sph.umich.edu/group/statgen/
softwareにてダウンロードすることができる。放射性ハイブリッドマッピングに
関する包括的なウエブページ（分析ソフトウエアおよび他の情報のウエブサイト
とリンク）は、http://linkage.rockefeller.edu/tara/rhmap/にて見出すことが
できる。
【０１６０】細胞のトランスフェクションプロトコール ＮＳ神経芽細胞腫細胞株をＬａｂ Ｔｅｋチェンバード（chambered）カバーガ
ラス（Nalgene Nunc International）中に植え付け、リポフェクタミン（Life T
echnologies BRL）を用いてｐＥＧＦＰ（対照）、ｐＧＩ３３０３およびｐＧＩ
３３０５でトランスフェクションした。２４〜４８時間後、チェンバードカバー
ガラスを倒立蛍光顕微鏡（ＧＦＰ蛍光を生きた細胞で可視化することができる）
に置いた。この方法の詳細はＰＣＴ／ＥＰ９６／０２３１１に記載されている。
顕微鏡観察およびファロイジンを用いた蛍光染色 これは以前に記載されている（ＥＰ９７／０６９５６）。
ラス（Nalgene Nunc International）中に植え付け、リポフェクタミン（Life T
echnologies BRL）を用いてｐＥＧＦＰ（対照）、ｐＧＩ３３０３およびｐＧＩ
３３０５でトランスフェクションした。２４〜４８時間後、チェンバードカバー
ガラスを倒立蛍光顕微鏡（ＧＦＰ蛍光を生きた細胞で可視化することができる）
に置いた。この方法の詳細はＰＣＴ／ＥＰ９６／０２３１１に記載されている。
顕微鏡観察およびファロイジンを用いた蛍光染色 これは以前に記載されている（ＥＰ９７／０６９５６）。
【０１６１】配列表 配列番号１は、図１ａに示す位置２８７３〜３０４３のヌクレオチドを欠失し
たＨｓ ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。 配列番号２は、図１ａに示す位置３０９８〜３１２１のヌクレオチドを欠失し
たＨｓ ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。 配列番号３は、図１ａに同定した配列の位置３５１８〜３５２６のヌクレオチ
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。
たＨｓ ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。 配列番号２は、図１ａに示す位置３０９８〜３１２１のヌクレオチドを欠失し
たＨｓ ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。 配列番号３は、図１ａに同定した配列の位置３５１８〜３５２６のヌクレオチ
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１の核酸配列である。
【０１６２】 配列番号４は、図１ｂに同定した配列の位置９５８〜１０１４のアミノ酸を欠
失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号５は、図１ｂに同定した配列の位置１０３３〜１０４０のアミノ酸を
欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号６は、図１ｂに同定した配列の位置１１７３〜１１７５のアミノ酸を
欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。
失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号５は、図１ｂに同定した配列の位置１０３３〜１０４０のアミノ酸を
欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号６は、図１ｂに同定した配列の位置１１７３〜１１７５のアミノ酸を
欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／１タンパク質のアミノ酸配列である。
【０１６３】 配列番号７は、図１ｃに記載した配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチ
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号８は、図１ｃに記載した配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチ
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号９は、図１ｃに記載した変異体１の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５３
／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１０は、図１ｃに記載した変異体２の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５
３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１１は、図１ｃに記載した変異体３の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５
３／２をコードするヌクレオチド配列である。
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号８は、図１ｃに記載した配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチ
ドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号９は、図１ｃに記載した変異体１の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５３
／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１０は、図１ｃに記載した変異体２の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５
３／２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１１は、図１ｃに記載した変異体３の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５
３／２をコードするヌクレオチド配列である。
【０１６４】 配列番号１２は、図１ｃに記載した変異体１の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１３は、図１ｃに記載した変異体１の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１３は、図１ｃに記載した変異体１の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
【０１６５】 配列番号１４は、図１ｃに記載した変異体２の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１５は、図１ｃに記載した変異体２の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１５は、図１ｃに記載した変異体２の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
【０１６６】 配列番号１６は、図１ｃに記載した変異体３の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１７は、図１ｃに記載した変異体３の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
配列の位置５４２５〜５４３３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号１７は、図１ｃに記載した変異体３の配列を有し、図１ｃに記載した
配列の位置５９２４〜６０２４のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
２をコードするヌクレオチド配列である。
【０１６７】 配列番号１８は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号１９は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体１の
アミノ酸配列である。 配列番号２０は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体２の
アミノ酸配列である。 配列番号２１は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体３の
アミノ酸配列である。
を欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２タンパク質のアミノ酸配列である。 配列番号１９は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体１の
アミノ酸配列である。 配列番号２０は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体２の
アミノ酸配列である。 配列番号２１は、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体３の
アミノ酸配列である。
【０１６８】 配列番号２２は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体１のアミノ
酸配列である。 配列番号２３は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体２のアミノ
酸配列である。 配列番号２４は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体３のアミノ
酸配列である。
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体１のアミノ
酸配列である。 配列番号２３は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体２のアミノ
酸配列である。 配列番号２４は、図１ｄに同定した配列の位置１７７６〜１７７８のアミノ酸
を欠失した、図１ｄに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／２配列の変異体３のアミノ
酸配列である。
【０１６９】 配列番号２５は、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌク
レオチド配列である。 配列番号２６は、図１ｅに同定した配列の位置３７９５〜４２８３のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号２７は、図１ｅに同定した配列の位置４２８４〜４３２５のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。
レオチド配列である。 配列番号２６は、図１ｅに同定した配列の位置３７９５〜４２８３のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号２７は、図１ｅに同定した配列の位置４２８４〜４３２５のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。
【０１７０】 配列番号２８は、図１ｅに同定した配列の位置３７９５〜４３２５のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号２９は、図１ｅに同定した配列の位置５１５３〜５１７３のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号３０は、図１ｅに同定した配列の位置５３４３〜５４０８のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号２９は、図１ｅに同定した配列の位置５１５３〜５１７３のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。 配列番号３０は、図１ｅに同定した配列の位置５３４３〜５４０８のヌクレオ
チドを欠失した、図１ｅに記載したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３をコードするヌクレ
オチド配列である。
【０１７１】 配列番号３１は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有するＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３２は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置３７９５〜４２８３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３３は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置４２８４〜４３２５のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。
３／３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３２は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置３７９５〜４２８３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３３は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置４２８４〜４３２５のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。
【０１７２】 配列番号３４は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置３７９５〜４３２５のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３５は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置５１５３〜５１７３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３６は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置５３４３〜５４０８のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。
配列の位置３７９５〜４３２５のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３５は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置５１５３〜５１７３のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。 配列番号３６は、図１ｅに記載した変異体１の配列を有し、図１ｅに同定した
配列の位置５３４３〜５４０８のヌクレオチドを欠失したＨｓ−ｕｎｃ−５３／
３をコードするヌクレオチド配列である。
【０１７３】 配列番号３７は、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タン
パク質のアミノ酸配列である。 配列番号３８は、図１ｆに同定した配列の位置１３２６〜１４１３のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。 配列番号３９は、図１ｆに同定した配列の位置１４１４〜１４２７のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。
パク質のアミノ酸配列である。 配列番号３８は、図１ｆに同定した配列の位置１３２６〜１４１３のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。 配列番号３９は、図１ｆに同定した配列の位置１４１４〜１４２７のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。
【０１７４】 配列番号４０は、図１ｆに同定した配列の位置１７０３〜１７０９のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。 配列番号４１は、図１ｆに同定した配列の位置１７６８〜１７８８のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。 配列番号４１は、図１ｆに同定した配列の位置１７６８〜１７８８のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆの配列において同定したＨｓ−ｕｎｃ−５３／３タンパ
ク質のアミノ酸配列である。
【０１７５】 配列番号４２は、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のア
ミノ酸配列である。 配列番号４３は、図１ｆに同定した配列の位置１３２６〜１４１３のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。 配列番号４４は、図１ｆに同定した配列の位置１４１４〜１４２７のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。
ミノ酸配列である。 配列番号４３は、図１ｆに同定した配列の位置１３２６〜１４１３のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。 配列番号４４は、図１ｆに同定した配列の位置１４１４〜１４２７のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。
【０１７６】 配列番号４５は、図１ｆに同定した配列の位置１７０３〜１７０９のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。 配列番号４６は、図１ｆに同定した配列の位置１７６８〜１７８８のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。 配列番号４６は、図１ｆに同定した配列の位置１７６８〜１７８８のアミノ酸
残基を欠失した、図１ｆにおいて同定した変異体１のＨｓ−ｕｎｃ−５３のアミ
ノ酸配列である。
【図１ａ】 Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／１と命名されたＵＮＣ−５３の第一のヒ
トホモログをコードするヌクレオチド配列およびそのさらなる変異体を示す。
トホモログをコードするヌクレオチド配列およびそのさらなる変異体を示す。
【図１ｂ】 図１(ａ)の配列によりコードされるｈｓ−ＵＮＣ−５３／１の
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
【図１ｃ】 Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／２と命名されたＣ．エレガンスのＵＮＣ
−５３タンパク質の第二のヒトホモログをコードするヌクレオチド配列およびそ
のさらなる変異体を示す。
−５３タンパク質の第二のヒトホモログをコードするヌクレオチド配列およびそ
のさらなる変異体を示す。
【図１ｄ】 図１(ｃ)の配列によりコードされるｈｓ−ＵＮＣ−５３／２の
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
【図１ｅ】 Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／３と命名された本発明によるＵＮＣ−５
３タンパク質の第三のヒトホモログをコードするヌクレオチド配列およびその変
異体を示す。
３タンパク質の第三のヒトホモログをコードするヌクレオチド配列およびその変
異体を示す。
【図１ｆ】 図１(ｅ)の配列によりコードされるｈｓ−ＵＮＣ−５３／３の
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
【図１ｇ】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／１の推定５'エクソンを含むゲノムＤＮ
Ａ断片のヌクレオチド配列を示す。
Ａ断片のヌクレオチド配列を示す。
【図１ｈ】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３の３'半分を含む転写物であるタンパ
ク質ＫＩＡＡ０９３８をコードするヌクレオチド配列ＡＢ０２３１５５を示す。
ク質ＫＩＡＡ０９３８をコードするヌクレオチド配列ＡＢ０２３１５５を示す。
【図１ｉ】 クローニングしたＣ．エレガンスおよびヒトのＵＮＣ−５３タ
ンパク質の概略を示す。５'側の先端欠失変異体および幾つかの知られたスプラ
イス変異体を示してある。
ンパク質の概略を示す。５'側の先端欠失変異体および幾つかの知られたスプラ
イス変異体を示してある。
【図２】 Ｃｅ−ＵＮＣ−５３、Ｈｓ−ＵＮＣ−５３／１、Ｈｓ−ＵＮＣ−
５３／２およびＨｓ−ＵＮＣ−５３／３のアミノ酸配列のアラインメントを示す
。
５３／２およびＨｓ−ＵＮＣ−５３／３のアミノ酸配列のアラインメントを示す
。
【図３】 Ｃ．エレガンスのＵｎｃ−５３とＣ．ブリッグシエの予測された
アミノ酸配列とのアラインメントを示す。
アミノ酸配列とのアラインメントを示す。
【図４】 配列アラインメントに基づく脊椎動物ＵＮＣ−５３のProSiteサ
イン（signatures）のリストを示す。
イン（signatures）のリストを示す。
【図５ａ】 ノーザンブロッティングにより調べた３つのヒトＵＮＣ−５３
の発現を示す。
の発現を示す。
【図５ｂ】 異なる脳部位でのＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の特異な発現を示す
。
。
【図６ａ】 ＲＴ−ＰＣＲを用いたＨｓ−ｕｎｃ−５３／１の特異なスプラ
イス発現を示す。
イス発現を示す。
【図６ｂ】 ＲＴ−ＰＣＲを用いたＨｓ−ｕｎｃ−５３／２の特異なスプラ
イス発現を示す。
イス発現を示す。
【図６ｃ】 ＲＴ−ＰＣＲを用いたＨｓ−ｕｎｃ−５３／３の特異なスプラ
イス発現を示す。
イス発現を示す。
【図６ｄ】 ＲＴ−ＰＣＲを用いた脳以外の細胞でのＡＢ０２３１５５発現
の配列確認を示す。
の配列確認を示す。
【図７ａ】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３のクローニングを示す。
【図７ｂ】 ｐＧＩ３３０３発現ベクター（ＧＦＰと融合したＣ末端Ｈｓ−
ｕｎｃ−５３／３断片）のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。
ｕｎｃ−５３／３断片）のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。
【図７ｃ】 ＧＦＰ：Ｃ末端Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３断片（ｐＧＩ３３０３
の挿入物）のアミノ酸配列を示す。
の挿入物）のアミノ酸配列を示す。
【図７ｄ】 ｐＧＩ３３０５発現ベクター（ＧＦＰと融合した完全長のＨｓ
−ｕｎｃ−５３／３）のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。
−ｕｎｃ−５３／３）のプラスミドマップおよびヌクレオチド配列を示す。
【図７ｅ】 ＧＦＰ：Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３（ｐＧＩ３３０５の挿入物）
のアミノ酸配列を示す。
のアミノ酸配列を示す。
【図８】 ｐＧＩ３３０３でトランスフェクションしたＮ４マウス神経芽細
胞腫細胞の糸状仮足および扇形の膜状物の増殖を示す。
胞腫細胞の糸状仮足および扇形の膜状物の増殖を示す。
【図９】 ｐＧＩ３３０５でトランスフェクションしたＮ４マウス神経芽細
胞腫細胞でのＧＦＰ：Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３融合タンパク質と微小管との同時
局在化を示す。
胞腫細胞でのＧＦＰ：Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３融合タンパク質と微小管との同時
局在化を示す。
【図１１ａ】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／３とDrosophilia melanogasterＢＡＣ
クローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５（ＡＣ００５７１９）によって（部分的に）コード
される遺伝子との間のホモロジードメインを示す。質問としてＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３に対して非重複データベースに基づいて行ったＴＢＬＡＳＴＮサーチの結
果。
クローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５（ＡＣ００５７１９）によって（部分的に）コード
される遺伝子との間のホモロジードメインを示す。質問としてＨｓ−ｕｎｃ−５
３／３に対して非重複データベースに基づいて行ったＴＢＬＡＳＴＮサーチの結
果。
【図１１ｂ】 コンピュータープログラムFgeneによって予測されたDrosoph
ila melanogasterのＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５（ＡＣ００５７１９）に
よってコードされるＯＲＦを示す。
ila melanogasterのＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５（ＡＣ００５７１９）に
よってコードされるＯＲＦを示す。
【図１１ｃ】 質問としてのＨｓ−ｕｎｃ−５３／３と、Drosophila melan
ogasterのＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５のFgeneによって予測されたＵＮＣ
５３ホモロジーＯＲＦとに対して「ＢＬＡＳＴ２ sequences」サーチを行った結
果を示す。
ogasterのＢＡＣクローンＢＡＣＲ４８Ｍ０５のFgeneによって予測されたＵＮＣ
５３ホモロジーＯＲＦとに対して「ＢＬＡＳＴ２ sequences」サーチを行った結
果を示す。
【図１２】 Ｄｒ−ｕｎｃ−５３／２をコードするゼブラダニオＥＳＴを示
す。
す。
【図１３】 Ｈｓ−ｕｎｃ−５３／２についてのGenemap98の結果を示す。
【図１４】 ヒトＨｓ−ｕｎｃ−５３／１の推定の別の開始コドンをエクソ
ンの配列の模式図を示す。
ンの配列の模式図を示す。
【図１５】 ｐＧＩ３１５０のヌクレオチド配列およびＨｓ−Ｕｎｃ−５３
／１のＣ末端断片とのｅＧＦＰ融合のアミノ酸配列を示す。
／１のＣ末端断片とのｅＧＦＰ融合のアミノ酸配列を示す。
【図１６】 ＥＳＴクローンｙｋ４８０ｂ６とＣｅ−ｕｎｃ−５３とのアラ
インメントであり、Ｃｅ−ｕｎｃ−５３の新規なスプライス変異体を示している
。
インメントであり、Ｃｅ−ｕｎｃ−５３の新規なスプライス変異体を示している
。
【図１７】 Ｎ４細胞の形態要素（form factor）に対するＨｓ−ｕｎｃ−
５３／３ＧＦＰキメラ一過性トランスフェクションの効果を示すグラフである。
５３／３ＧＦＰキメラ一過性トランスフェクションの効果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 17/02 29/00 １０１ 25/00 37/02 29/00 １０１ 43/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 マルク・カール・デ・レーイメーカー べルギー国ベー．−2340ベルセ、トルンハ ウッサーヴェヒ30、ヤンセン・ファーマシ ューティカ・エヌ．ベー． (72)発明者 ヨハン・ヨーゼフ・グスタフェ・ヘンドリ ク・ガイセン べルギー国ベー．−2340ベルセ、トルンハ ウッサーヴェヒ30、ヤンセン・ファーマシ ューティカ・エヌ．ベー． (72)発明者 ティエリー・ア・オ・ウ・ボゲール べルギー国ベー．−8500コルトレイク、ウ ォルフェンドレーフ26ヘー番 (72)発明者 リュック・ジャック・シモン・メルテン べルギー国ベー．−9052ズウェイナール デ、テヒノロヒーパルク・ズウェイナール デ９番、ブロック・デーエフ１．60．14、 デフヘン・エヌ．ベー． (72)発明者 ペーテル・フェルハッセルト べルギー国ベー．−2340ベルセ、トルンハ ウッサーヴェヒ30、ヤンセン・ファーマシ ューティカ・エヌ．ベー． (72)発明者 マルク・ファン・デ・クレーン べルギー国ベー．−9052ズウェイナール デ、テヒノロヒーパルク・ズウェイナール デ９番、ブロック・デーエフ１．60．14、 デフヘン・エヌ．ベー．
Claims (97)
- 【請求項１】 図４に示す配列ブロックＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇまたは
Ｈの１またはそれ以上を有するアミノ酸配列を含むか、または該ブロックと保存
的アミノ酸変化において異なることを特徴とする、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５
３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログ。 - 【請求項２】 図１(ｅ)に示すヌクレオチド配列、または位置１〜２８８の
ヌクレオチド領域が図１(ｅ)に示す変異体１の配列で置換された図１(ｅ)の配列
、および／または３７９５〜４２８３、４２８４〜４３２５、５１５３〜５１７
３または５３４３〜５４０８の配列のいずれかがさらに欠如している配列によっ
てコードされるアミノ酸配列を有する、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク
質の脊椎動物タンパク質ホモログまたはその機能性の等価物、誘導体または生物
学的前駆体。 - 【請求項３】 図１(ｆ)に示すアミノ酸配列、またはアミノ酸１〜８１を図
１(ｆ)の変異体１の配列で置換することによっておよび／または位置１３２６〜
１４１３、１４１４〜１４２７、１７０３〜１７０９もしくは１７６８〜１７８
８の欠失を含むことによって図１(ｆ)に記載するアミノ酸配列とは異なるアミノ
酸配列、または１またはそれ以上の保存的アミノ酸変化において該配列とは異な
るアミノ酸配列を有する、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物
タンパク質ホモログ。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵＮ
Ｃ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードするｃＤＮＡ分子。 - 【請求項５】 図１(ｅ)に示すヌクレオチドの配列を含む、請求項４に記載
のｃＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項４または５に記載のｃＤＮＡ配列に高ストリンジェン
シー条件下でハイブリダイズしうる核酸分子。 - 【請求項７】 請求項４または５に記載のｃＤＮＡ分子を含むＤＮＡ発現ベ
クター。 - 【請求項８】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質または請求項１な
いし７のいずれかに記載のその脊椎動物ホモログのプロモーターを含む、請求項
７に記載のベクター。 - 【請求項９】 該プロモーター配列が、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タン
パク質のマウスまたはヒトホモログをコードする遺伝子に由来するものである、
請求項８に記載のベクター。 - 【請求項１０】 リポーター分子をコードする配列をさらに含む、請求項７
ないし９のいずれかに記載のベクター。 - 【請求項１１】 該リポーター分子が蛍光団である請求項１０に記載のベク
ター。 - 【請求項１２】 請求項７ないし１１のいずれかに記載のベクターで形質転
換またはトランスフェクションした宿主細胞。 - 【請求項１３】 請求項１０または１１に記載のベクターで形質転換または
トランスフェクションした宿主細胞。 - 【請求項１４】 細菌細胞などの原核細胞、または真菌細胞、動物細胞、植
物細胞または昆虫細胞などの真核細胞を含む、請求項１２または１３に記載の宿
主細胞。 - 【請求項１５】 請求項１ないし３のいずれかに記載のタンパク質を発現し
うるトランスジーンを含む、トランスジェニック細胞、組織または生物体。 - 【請求項１６】 ＣＯＳ細胞、Ｈｅｐ Ｇ２、ＭＣＦ−７細胞、Ｎ４マウス
神経芽細胞腫細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、または結腸直腸癌またはヒト由来細胞の
いずれかを含む、請求項１５に記載のトランスジェニック細胞、組織または生物
体。 - 【請求項１７】 該トランスジーンが請求項７ないし１１のいずれかに記載
のベクターを含む、請求項１５または１６に記載のトランスジェニック細胞、組
織または生物体。 - 【請求項１８】 該トランスジーンが請求項１０または１１に記載のベクタ
ーを含む、請求項１５または１７に記載のトランスジェニック細胞、組織または
生物体。 - 【請求項１９】 該生物体が昆虫、真菌、非ヒト哺乳動物、植物または線虫
のいずれかを含む、請求項１５ないし１７のいずれかに記載のトランスジェニッ
ク細胞、組織または生物体。 - 【請求項２０】 変異脊椎動物非ヒト生物体の作製方法であって、該変異は
細胞の挙動または細胞移動の制御または形状または細胞移動の方向性に影響を及
ぼすものであり、ＵＮＣ−５３ Ｃ．エレガンスタンパク質の脊椎動物ホモログ
をコードする野生型遺伝子に変異を誘発することを含む方法。 - 【請求項２１】 医薬として使用するための請求項１ないし３のいずれかに
記載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物タンパク質ホモログ
。 - 【請求項２２】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物タンパク質ホモログの使用。 - 【請求項２３】 製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに
請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質
の脊椎動物ホモログを含む医薬組成物。 - 【請求項２４】 医薬として使用するための、請求項４ないし６のいずれか
に記載の核酸分子またはｃＤＮＡ分子またはその機能性の断片。 - 【請求項２５】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、請求項４ないし６のいずれかに記載の核酸分子またはｃＤＮＡ分子の使用。 - 【請求項２６】 請求項４ないし６のいずれかに記載の核酸分子またはｃＤ
ＮＡ分子、および製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組
成物。 - 【請求項２７】 ある化合物が細胞の挙動、増殖、細胞の形状または移動性
または細胞移動の方向性の制御のインヒビターまたはエンハンサーであるか否か
を決定する方法であって、該化合物を請求項１２または１４に記載の宿主細胞ま
たは請求項１５ないし１８のいずれかに記載のトランスジェニック細胞と接触さ
せ、ついで該細胞の表現型の変化をスクリーニングすることを含む方法。 - 【請求項２８】 スクリーニングすべき該表現型の変化が、細胞増殖の変化
、または形状、または細胞移動性の変化または糸状仮足増殖、波うち挙動、細胞
接着、接触阻害または神経突起増殖の長さである、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 該トランスジェニック細胞がＮ４神経芽細胞腫細胞であり
、スクリーニングすべき該表現型の変化が神経突起増殖の長さである、請求項２
７に記載の方法。 - 【請求項３０】 該トランスジェニック細胞がＭＣＦ−７乳癌細胞株または
ＮＩＨ３Ｔ３細胞であり、スクリーニングすべき該表現型の変化がファゴキネシ
スまたは接触阻害の程度である、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項３１】 ある化合物が細胞の形状、細胞の増殖または移動性、また
は細胞移動の方向性の制御のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決
定する方法であって、該化合物を請求項１５ないし１９のいずれかに記載のトラ
ンスジェニック生物体または請求項２０に記載の方法によって作製された変異生
物体と接触させ、ついで該生物体の表現型の変化をスクリーニングすることを含
む方法。 - 【請求項３２】 医薬として使用するために請求項２７に記載の方法により
細胞の形状、または増殖または移動性または細胞移動の方向性の制御のエンハン
サーとして同定された化合物。 - 【請求項３３】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、請求項２７に記載の方法により細胞の形状、または増殖または移動性または
細胞移動の方向性の制御のエンハンサーとして同定された化合物の使用。 - 【請求項３４】 請求項２７ないし３１のいずれかに記載の方法により同定
された化合物、および製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医
薬組成物。 - 【請求項３５】 医薬として使用するために請求項１７ないし３１のいずれ
かに記載の方法により細胞の移動性、増殖、または形状、または細胞移動の方向
性の制御のインヒビターとして同定された化合物。 - 【請求項３６】 疾患誘発細胞の広まりまたは転移または接触阻害の喪失を
軽減するための医薬を製造するための、請求項３５に記載の化合物の使用。 - 【請求項３７】 請求項３５に記載の化合物、および製薬学的に許容しうる
担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 - 【請求項３８】 ある化合物が請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エ
レガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の転
写のインヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定する方法であって、工
程：（ａ）該化合物を請求項１３または１８に記載の細胞と接触させ、ついで（
ｂ）該リポーター分子のレベルをモニターし、該モニター工程で得られた結果を
、該化合物と接触させていない請求項１３または１８に記載の細胞を含む対照と
比較することを含む方法。 - 【請求項３９】 検出する該リポーター分子がｍＲＮＡまたは緑色蛍光タン
パク質である、請求項３８に記載の方法。 - 【請求項４０】 医薬として使用するために請求項３８または３９に記載の
方法により請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３
タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子または該遺伝子の機能性の断
片の転写のエンハンサーとして同定された化合物。 - 【請求項４１】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、請求項３８または３９に記載の方法により請求項１ないし３のいずれかに記
載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする
遺伝子または該遺伝子の機能性の断片の転写のエンハンサーとして同定された化
合物の使用。 - 【請求項４２】 請求項４０に記載の化合物、および製薬学的に許容しうる
担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 - 【請求項４３】 医薬として使用するために請求項３８または２９に記載の
方法により請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３
タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子または該遺伝子の機能性の断
片の転写のインヒビターとして同定された化合物。 - 【請求項４４】 疾患誘発細胞の広まりまたは転移または接触阻害の喪失を
軽減するための医薬を製造するための、請求項３８または３９に記載の方法によ
りＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺
伝子または該遺伝子の機能性の断片の転写のインヒビターとして同定された化合
物の使用。 - 【請求項４５】 請求項４３に記載の化合物、および製薬学的に許容しうる
担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 - 【請求項４６】 ある化合物が細胞の移動性、増殖または形状、または細胞
移動の方向性の制御のエンハンサーまたはインヒビターであるか否かを決定する
ためのキットであって、該化合物と接触させる請求項１３ないし１７のいずれか
に記載の少なくとも一つのトランスジェニック細胞および対照として使用する請
求項１２ないし１９のいずれかに記載の少なくとも一つの細胞、および該化合物
を該少なくとも一つのトランスジェニック細胞と接触させるための手段を含むキ
ット。 - 【請求項４７】 ある化合物がＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の
脊椎動物ホモログをコードする遺伝子または該遺伝子の機能性の断片の転写のイ
ンヒビターまたはエンハンサーであるか否かを決定するためのキットであって、
請求項１２ないし１９のいずれかに記載の少なくとも一つの細胞および該化合物
を該細胞と接触させるための手段を含むキット。 - 【請求項４８】 ある化合物がＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の
脊椎動物ホモログまたは該脊椎動物ホモログタンパク質の機能性の等価物、誘導
体、断片または生物学的前駆体の活性のエンハンサーまたはインヒビターである
か否かを決定するためのキットであって、請求項２０に記載の方法によって作製
された少なくとも一つの脊椎動物変異体非ヒト生物体または請求項１５ないし１
９のいずれかに記載のトランスジェニック生物体および該脊椎動物変異生物体の
野生型を含むキット。 - 【請求項４９】 Ｃ．エレガンスのｕｎｃ−５３遺伝子の脊椎動物ホモログ
またはその機能性の断片を同定する方法であって、ＤＮＡライブラリーに、ＵＮ
Ｃ−５３またはその機能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体をコードする
核酸配列の１５ないし５０ヌクレオチドの適当なオリゴヌクレオチド配列を適当
なストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせて、請求項４または５のいず
れかに記載のｃＤＮＡと統計的に有意なホモロジーを有する遺伝子を同定するこ
とを含む方法。 - 【請求項５０】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログがその成員である細胞のシグナル伝達
経路において活性なタンパク質を同定する方法であって、 （ａ）該細胞の抽出液をＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホ
モログに対する抗体と接触させ、 （ｂ）抗体／脊椎動物ホモログ複合体を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物
ホモログに結合した該抗体以外のタンパク質を同定する ことを含む方法。 - 【請求項５１】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＵＮＣ−５３タンパ
ク質の脊椎動物ホモログがその成員である細胞のシグナル伝達経路において活性
であるさらなるタンパク質の同定方法であって、 （ａ）請求項５０においてＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物
ホモログに結合した最初に同定されたタンパク質に対する抗体を生成させ、 （ｂ）細胞の抽出液を該抗体と接触させて抗体／タンパク質複合体を同定し、 （ｃ）該複合体を分析して該第一のタンパク質に結合した該抗体以外のさらなる
タンパク質を同定し、ついで （ｄ）任意に工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して該経路においてさらなるタンパク
質を同定する ことを含む方法。 - 【請求項５２】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログがその成員である細胞のシグナル伝達
経路において活性であるタンパク質を同定する方法であって、 （ａ）該細胞の抽出液をＣ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物
ホモログと接触させ、 （ｂ）生成したＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ／タンパク質複合体
を同定し、ついで （ｃ）該複合体を分析してＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログに結合し
たＵＮＣ−５３タンパク質の同脊椎動物ホモログ以外のタンパク質を同定する ことを含む方法。 - 【請求項５３】 細胞の抽出液を、使用したＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎
動物ホモログと同じではないと工程（ｃ）において同定されたタンパク質と接触
させ、ついで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返すことにより、該細胞のシグナル
伝達経路に関与するさらなるタンパク質を同定することをさらに含む、請求項５
２に記載の方法。 - 【請求項５４】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモ
ログがその成員である細胞のシグナル伝達経路に関与するタンパク質の同定方法
であって、 （ａ）ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって制御
されるプロモーターの制御下にリポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を有する適
当な宿主細胞を用意し、 （ｂ）請求項４または５に記載のＤＮＡ配列の断片またはすべてと該転写因子の
該ＤＮＡ結合ドメインかまたは該活性化ドメインのいずれかとの第一の融合物を
コードする第一のハイブリッドＤＮＡ配列を該宿主細胞で発現させ、 （ｃ）調べようとする推定の結合タンパク質と該第一の融合物には導入しなかっ
た該転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインのいずれかとをコ
ードする少なくとも一つの第二のハイブリッドＤＮＡ配列を該宿主細胞で発現さ
せ、ついで （ｄ）該宿主細胞中にリポーター遺伝子産物の生成を検出することにより、調べ
ようとするタンパク質と請求項１ないし３のいずれかに記載のタンパク質との結
合を検出する ことを含む方法。 - 【請求項５５】 医薬として使用するために請求項５０ないし５４のいずれ
かに記載の方法により同定されたタンパク質。 - 【請求項５６】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、請求項５０ないし５４のいずれかに記載の方法により同定されたタンパク質
の使用。 - 【請求項５７】 請求項５０ないし５４のいずれかに記載の方法により同定
されたタンパク質、および製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含
む医薬組成物。 - 【請求項５８】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの製造方法であって、請求項１２ない
し１４のいずれかに記載の細胞を培養し、ついで発現されたＵＮＣ−５３タンパ
ク質の該脊椎動物ホモログを回収することを含む方法。 - 【請求項５９】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの製造方法であって、組換えバキュロ
ウイルスベクターでトランスフェクションした昆虫細胞を培養し、その際、該ベ
クターはバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターの下流にＵＮＣ−５３タ
ンパク質の該脊椎動物ホモログをコードするＤＮＡ挿入物を含んでおり、ついで
発現されたＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログを回収することを含む方
法。 - 【請求項６０】 ある化合物が請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エ
レガンスのＵＮＣ−５３の脊椎動物ホモログの発現のインヒビターまたはエンハ
ンサーであるか否かを検出する方法であって、該ホモログを発現する細胞を該化
合物と接触させ、ついで該化合物と接触させなかった対照細胞と比較した表現型
の変化をモニターすることを含む方法。 - 【請求項６１】 該細胞が請求項１２ないし１９のいずれかに記載の細胞を
含む、請求項６０に記載の方法。 - 【請求項６２】 該細胞が接触阻害の喪失を受けている請求項６０に記載の
方法。 - 【請求項６３】 試験すべき該化合物が核酸を含む請求項６０ないし６２の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項６４】 該核酸配列がアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む
、請求項６３に記載の方法。 - 【請求項６５】 該ｍＲＮＡ配列が該脊椎動物ホモログをコードするｍＲＮ
Ａの３'非翻訳領域を含む、請求項６４に記載の方法。 - 【請求項６６】 試験すべき該化合物が、該脊椎動物ホモログの機能を阻害
するのに潜在的に適したアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項６０な
いし６２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６７】 該タンパク質が請求項５０ないし５４のいずれかに記載の
方法により同定されたタンパク質を含む、請求項６６に記載の方法。 - 【請求項６８】 製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに
請求項６０ないし６７のいずれかに記載の方法により同定された化合物を含む医
薬組成物。 - 【請求項６９】 医薬として使用するために請求項６３ないし６５のいずれ
かに記載の方法により同定された核酸配列。 - 【請求項７０】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモ
ログによって媒体される接触阻害の喪失または癌の治療のための医薬を製造する
ための、請求項６３ないし６５のいずれかに記載の方法により同定された核酸配
列の使用。 - 【請求項７１】 Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモ
ログをコードする遺伝子の発現を抑制するための医薬を製造するための、請求項
６９に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項７２】 脊椎動物細胞中での請求項１ないし３のいずれかに記載の Ｃ．エレガンス のＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログの発現を検出する
ためのアッセイであって、細胞またはその抽出液を該脊椎動物ホモログに対する
抗体と接触させ、その際、該抗体はリポーター分子に結合されており、未結合の
抗体を除去し、ついで該リポーター分子の存在をモニターすることを含む方法。 - 【請求項７３】 該リポーター分子が適当な蛍光団または検出可能な酵素と
コンジュゲートした抗体である、請求項７２に記載のアッセイ。 - 【請求項７４】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＣ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログをコードする遺伝子の発現を検出する
方法であって、請求項１ないし３のいずれかに記載の該脊椎動物ホモログをコー
ドするまたは対応する核酸またはタンパク質配列に特異的なプローブを細胞抽出
液と接触させ、その際、該プローブはリポーターに連結されており、ついで該リ
ポーターの存在について分析することを含む方法。 - 【請求項７５】 該プローブが、ＵＮＣ−５３タンパク質の該脊椎動物ホモ
ログをコードする該遺伝子から転写されたｍＲＮＡの所定の領域に相補的な配列
を含む、請求項７４に記載の方法。 - 【請求項７６】 該相補的な配列が該ｍＲＮＡの３'または５'非翻訳領域で
ある、請求項７５に記載の方法。 - 【請求項７７】 該リポーターが放射性標識を含む、請求項７４または７６
に記載の方法。 - 【請求項７８】 該プローブが請求項１ないし３のいずれかに記載の該ＵＮ
Ｃ−５３タンパク質の該脊椎動物ホモログに特異的な抗体を含む、請求項７４に
記載の方法。 - 【請求項７９】 該リポーターが検出可能な蛍光団または酵素にコンジュゲ
ートした抗体を含む、請求項７８に記載の方法。 - 【請求項８０】 ある化合物が請求項１ないし３のいずれかに記載の脊椎動
物ホモログの微小管またはそのプラス端領域への会合のインヒビターまたはエン
ハンサーであるか否かを決定する方法であって、 （ａ）該化合物をＵＮＣ−５３タンパク質または該脊椎動物ホモログを発現する
トランスジェニック細胞、組織または生物体と接触させ、その際、該タンパク質
はリポーター分子に作動可能に連結されており、ついで （ｂ）該化合物と接触していない工程（ａ）の細胞と比較して該リポーター分子
の局在化をスクリーニングする ことを含む方法。 - 【請求項８１】 請求項８０に記載の方法によって同定した化合物。
- 【請求項８２】 医薬として使用するための請求項８１に記載の化合物。
- 【請求項８３】 ニューロン再生、血管再生または創傷治癒の促進ための、
または慢性神経変性疾患または急性外傷性障害または線維症疾患または慢性関節
リウマチもしくは硬化症などの自己免疫疾患の治療のための医薬を製造するため
の、該脊椎動物ホモログと微小管またはそのプラス端領域との会合のエンハンサ
ーとしての請求項８１に記載の化合物の使用。 - 【請求項８４】 請求項８１または８２に記載の化合物、および製薬学的に
許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。 - 【請求項８５】 ある化合物が請求項１ないし３のいずれかに記載の脊椎動
物ホモログの微小管またはそのプラス端領域への会合のインヒビターまたはエン
ハンサーであるか否かを決定するためのキットであって、該ホモログおよびリポ
ーター分子を発現する少なくとも一つのトランスジェニック細胞または請求項１
２ないし１９のいずれかに記載の細胞および対照として使用するための同じ細胞
型の少なくとも一つの細胞、および該化合物を該少なくとも一つのトランスジェ
ニック細胞と接触させるための手段を含むキット。 - 【請求項８６】 請求項１ないし３のいずれかに記載の脊椎動物ホモログと
微小管またはそのプラス端領域との会合のインヒビターまたはエンハンサーとし
て同定された化合物に連結した該脊椎動物ホモログを含む、該化合物を該微小管
またはそのプラス端領域へターゲティングするのに使用するための組成物。 - 【請求項８７】 細胞形質転換剤または細胞トランスフェクション剤をさら
に含む、請求項８６に記載の組成物。 - 【請求項８８】 タンパク質を細胞微小管またはそのプラス端領域にターゲ
ティングする方法であって、宿主細胞、組織または生物体中に請求項１ないし３
のいずれかに記載の脊椎動物ホモログを発現しうる配列を含むトランスジーンを
導入することを含み、その際、キメラタンパク質が発現されてターゲティングす
べき該タンパク質が該微小管またはそのプラス端領域にターゲティングされるよ
うに、該配列が該タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されていること
を特徴とする方法。 - 【請求項８９】 請求項１ないし３のいずれかに記載の脊椎動物ホモログを
共有結合的に修飾する分子の同定方法であって、 （ａ）該脊椎動物ホモログを発現する細胞からの抽出液を候補の修飾酵素を含む
酵素混合物とタンパク質の共有結合修飾のインヒビターの存在下で接触させ、 （ｂ）工程（ａ）の共有結合的に修飾したＵＮＣ−５３タンパク質を同定し、つ
いで （ｃ）該修飾工程に関与した該分子を同定する ことを含む方法。 - 【請求項９０】 該指標が32Ｐを含む請求項８９に記載の方法。
- 【請求項９１】 請求項１ないし３のいずれかに記載の脊椎動物ホモログの
毒性を軽減または増大させる化合物を同定する方法であって、該化合物を請求項
１８に記載の細胞、組織または生物体と接触させ、ついで該微小管またはそのプ
ラス端領域に隣接する該リポーター分子の存在をモニターすることを含む方法。 - 【請求項９２】 図１ａに示すヌクレオチド配列によってコードされ、該ヌ
クレオチド配列は位置２８７３〜３０４３、３０９８〜３１２１または３５１８
〜３５２６のヌクレオチド領域のいずれかを欠如している、Ｃ．エレガンスのＵ
ＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機能性の等価物、誘導体ま
たは生物学的前駆体。 - 【請求項９３】 図１ｂに示すアミノ酸配列を有し、残基９５８〜１０１４
、１０３３〜１０４０または１１７３〜１１７５のヌクレオチド領域の１または
それ以上を欠如しており、または該アミノ酸配列と１またはそれ以上の保存的ア
ミノ酸変化において異なる、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動
物ホモログまたはその機能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体。 - 【請求項９４】 図１ｃに示すヌクレオチド配列によってコードされ、該ヌ
クレオチド配列は配列位置１〜３６６が図１ｃの変異体１〜３として同定される
配列で置換されており、および／または該配列は位置５６２４〜６０２４の領域
を欠如している、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログ
またはその機能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体。 - 【請求項９５】 図１ｄにおいて同定されるアミノ酸配列または図１ｄの配
列の位置１〜８９のアミノ酸配列が変異体１〜３の配列で置換された配列を有し
、および／または該配列は位置１７７６〜１７７８のアミノ酸配列を欠如してい
る、Ｃ．エレガンスのＵＮＣ−５３タンパク質の脊椎動物ホモログまたはその機
能性の等価物、誘導体または生物学的前駆体。 - 【請求項９６】 受託番号ＬＭＢＰ３９３６で寄託されているプラスミドｐ
Ｇ３１３３０３。 - 【請求項９７】 受託番号ＬＭＢＰ３９３７で寄託されているプラスミドｐ
Ｇ１３３０５。
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