JP2000502246A - 脊椎動物Ｄｅｌｔｅｘタンパク質、核酸および抗体ならびに関連方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、脊椎動物deltex遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれによりコードされる脊椎動物Deltexタンパク質のアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、脊椎動物Deltexタンパク質の断片、他の誘導体および類似体、ならびに該タンパク質に対する抗体に関する。このような断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲内である。前記タンパク質および誘導体の、例えば組換え法による生産を提供する。特定の実施態様において、本発明はヒトのdeltex核酸およびタンパク質に関する。本発明はまた、脊椎動物Deltexタンパク質、核酸または抗体に基づく治療・診断法および組成物に関する。さらに、本発明は、細胞内のNotch機能の不活性化法、脊椎動物Deltexタンパク質のNotchタンパク質への結合を抑制または低下させる化合物の同定法、および非最終分化細胞(non-terminallydifferentiated cell)の増殖法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 脊椎動物Deltexタンパク質、核酸および抗体 ならびに関連方法および組成物 １．序 本発明は、脊椎動物deltex遺伝子およびそれらのコード化タンパク質産物、な らびにその誘導体および類似体に関する。本発明はさらに、脊椎動物Deltexタン パク質、誘導体および抗体の生産に関する。また、関連した治療用組成物ならび に治療および診断法が提供される。 ２．発明の背景 キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)では、いわゆる「Notchグ ループ」の遺伝子が様々な前駆細胞の正しい発生的選択にとってきわめて重要な 事象に関与している（Fortini and Artavanis-Tsakonas，1993，Cell 75:1245-1 247; Artavanis-Tsakonas and Simpson，1991，Trends Genet．7:403-408を参照 のこと）。遺伝子および分子に関する研究の蓄積から、これらの遺伝子は細胞表 面、細胞質および核の諸成分を含む細胞コミュニケーション機構のエレメントを コードすることが示唆される。 脊椎動物のような高等生物では、細胞運命の選択の根底にあるメカニズムにつ いてほとんど何も知られていない。こうしたメカニズムを知ることで、異常な分 化現象と関連した病理を洞察することができよう。したがって、当技術分野では 、deltexを含めて「Notchグループ」の遺伝子のヒト・メンバーを取得して特性 づける必要性が存在している。なぜならば、これらの遺伝子は細胞運命の決定に おいて決定的な役割を果たしているように思われるからである。 最近の膨大な発生遺伝学的研究により、Notch遺伝子座はショウジョウバエの きわめて広範囲の発生しつつある組織の細胞運命の決定に影響する調節現象にお いて中心的な役割を担っていることが示された（Artavanis-Tsakonas and Simps on，1991，Trends Genet．7:403-408; Artavanis-Tsakonasら，1991,Ann．Rev． Cell Biol．7:427-452中に論評）。Notch機能のこの多面発現性 (pleiotropy)はあらゆる発生段階および種々の組織に影響する突然変異により示 される（例えば、Welshons，1965，Science 150:1122-1229; Welshons，1971，G enetics 68:259-268; Shellenbarger and Mohler，1978，Dev Biol．62:432-446 ）。Notch機能の劇的な例は胚の神経系の発生において見られ、そこでは機能突 然変異の減少が上皮前駆細胞の神経発生経路へのミスルーティング(misrouting) を引き起こし、結果的に「神経原性」(neurogenic)表現型と呼ばれるものをもた らす(Poulson，1937，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，23:133-137;Lehmanら，198 3，Roux's Arch．Dev．Biol．192:62-74)。 Notchタンパク質が細胞表面からのシグナルを核に伝達する分子的関係を理解 する試みにおいて、遺伝学的手段を用いて、種々のNotch対立遺伝子と表現型的 に相互作用する遺伝子座を同定した。これらの遺伝学的研究により、「Notchグ ループ」と機能的に命名された相互作用性遺伝子座の小グループを規定するに至 った(Artavanis-Tsakonas and Simpson，1991，Trends Genet．7:403-408)。Not chグループの他のメンバーとしては、deltex(Xu and Artavanis-Tsakonas，1991 ，Genetics 126:665-677)、Enhancer of（split）［E(spl)］(Knustら，1987，E MBO J．6:4113-4123; Hartleyら，1988，Cell 55:785-795; Preissら，1988，EM BO J．7:3917-3927; Klambtら，1989，EMBO J．8:203-210)、およびmastermind （mam）（Smollerら，1990，Genes Dev．4:1688-1700）がある。mastermind、 H airless(H)、Enhancer of（split）およびSuppressor ofHairless（Su(H)）は核 タンパク質をコードしている(Smollerら，1990，GenesDev．4:1688-1700; Bang ら，1992，Genes Dev．6:1752-1769; Maierら，1992，Mech Dev．38:143-156; D elidakisら，1991，Genetics 129:803-823; Schronsら，1992，Genetics 132:48 1-503; Furukawaら，1991，J．Biol Chem．266:23334-23340; Furukawaら，1992 ，Cell 69:1191-1197; Schweisguthら，1992，Cell 69:1199-1212)。deltexの突 然変異はAbruptexクラスのNotch対立遺伝子のいくつかの異質対立遺伝単位の組 合せによりもたらされる蛹の致死率を低下させる(Xuら，1990，Genes Dev．4:46 4-475)。この同じ遺伝子スクリーニングから遺伝子Deltaおよびmastermindも同 定されたが、両遺伝子ともNotchと同じ遺伝子の「神経原性」クラスに属してい る。というのは、それらが類似の突然変異表 現型を現すからである。さらに、その後の分析から、deltexの対立遺伝子はDelt a、mastermind、HairlessおよびSu(H)の対立遺伝子との遺伝的相互作用を示すこ とがわかり、これらの遺伝子座同士の機能的な結びつきがさらに示唆された(Xu and Artavanis-Tsakonas，1990，Genetics 126:665-677)。 Notchが決定的な事象に影響を与えると考えられるやり方は間接的であり、す なわち、細胞運命を直接指定するものではない。その代わりに、最近の実験的研 究(Coffmanら，1993，Cell 73:659-671; Fortiniら，Nature，印刷中)から、Not ch活性は分化を遅らせ、この方法で前駆細胞が任意の数の特定の発生合図を受け 取りかつ／または解析できるようにすることが示された(Cagan and Ready，1989 ，Genes Dev．3:1099-1112）。機能突然変異の低下では、この抑制が失われ、細 胞が分化の不履行(default)経路をとる。例えば、ショウジョウバエの神経系の 発生中に、Notch機能が存在しないと通常は表皮になる細胞が代わりに神経運命 を選びとる。しかしながら、Notch活性の目立った特徴はその多面発現性である 。Notchは複眼(Cagan and Ready，1989，Genes Dev．3:1099-1112)、卵巣(Ruoho laら，1991，Cell 66:433-449; Xuら，1992，Development 115:913-922)、およ び中胚葉(Corbinら，1991，Cell 67:311-323)を含めた多くの他の細胞型の適切 な指定にとって必要である。同様に、脊椎動物Notch同族体により示される広範 な発現パターンもこれらの種における広域に及ぶ機能的役割を示唆している(Cof fmanら，1993，Cell 73:659-671; Coffmanら，1990，Science 249:1438-1441; W einmasterら，1991，Development 113:199-205; Weinmasterら，1991，Developm ent 116:931-941; Kopan and Weintraub，1993，J．Cell Biol．121:631-641; F ranco del Amoら，1992，Development 115:737-744; Ellisenら，1991，Cell 66 :649-661; Stifaniら，1992，Nature Genetics 2:119-127)。 Notch相同体は様々な脊椎動物種から単離されており、構造、発現パターンお よびリガンド結合特性の点でショウジョウバエのその等価物と非常に似ているこ とがわかった(Rebayら，1991，Cell 67:687-699; Coffmanら，1990，Science249 :1438-1441; Ellisenら，1991，Cell 66:649-661; Weinmasterら，1991，Develo pment 113:199-205)。２種類のヒトNotch相同体が単離され(1992年11月12日付け のPCT公開番号WO 92/19737)、ｈＮおよびTAN-1と命名された。ヒト Notch(TAN-1)の機能不全はリンパ性の癌と関連があった(Ellisenら，1991，Cell 66:649-661)。 Notchは構造的に複雑な大型の膜貫通タンパク質をコードしており、このこと は細胞−細胞コミュニケーションへのかかわり合いと合致する(Whartonら，1985 ，Cell 43:567-581; Kiddら，1986，Mol．Cell．Biol．6:3094-3108）。Notchは 36個のタンデムＥＧＦ様リピートと３個のNotch/lin12リピートを含む細胞外ド メインを有する。その細胞内ドメインは６個のcdc10/SW16/アンキリンリピート （ＡＮＫリピート）（Luxら，1990，Nature 344:36-42; Breeden and Nasmyth， 1987，Nature 329:651-654; Michaely and Bennett，1992，Trends Cell Biol． 2:127-129; Blankら，1992，Trends Biochem．Sci．17:135-140; Bennett，1992 ，J．Biol．Chem．267:8703-8706）、「ｏｐａ」として知られるポリグルタミン 領域、およびＰＥＳＴモチーフ(Stifaniら，1992，Nature Genetics 2:119-127) を含むいくつかの共通の構造モチーフを保持する。これらのモチーフが次の動物 ：マウス(Weinmasterら，1991，Development 113:199-205; Weinmasterら，1992 ，Development 116:931-941; Kopan and Weintraub，1993，J．Cell Biol．121: 631-641)、ラット(Kopan and Weintraub，1993，J．Cell Biol．121:631-641; F ranco del Amoら，1993，Genomics 15:259-264)、ヒト(Ellisenら，1991，Cell 66:649-661; Stifaniら，1992，Nature Genetics 2:119-127;1992年11月12日付 けのPCT公開番号WO 92/19737)、およびツメガエル(Coffmanら，1993，Cell 73:6 59-671; Coffmanら，1990，Science 249:1438-1441)から単離された相同体にお いて保存されていた驚くべき保存の程度は、それらが共通の生化学的作用様式を もつであろうことを暗示するものである。特に、Notchとその脊椎動物等価物(St ifaniら，1992，Nature Genetics 2:119-127)の間で最も高く保存されていた領 域（約70％のアミノ酸同一性）を構成するＡＮＫリピートは、シグナル伝達過程 および細胞骨格相互作用に関与するタンパク質を含めて、多様なタンパク質のグ ループ間のタンパク質−タンパク質相互作用を仲介すると考えられる(Luxら，19 90，Nature 344:36-42; Breeden and Nasmyth，1987，Nature 329:651-654; Mic haely and Bennett，1992，Trends Cell Biol．2:127-129; Blankら，1992，Tre nds Biochem．Sci．17:135-140; Bennett，1992，J．Biol．Chem． 267:8703-8706）。実際、Rebayら(1993，Cell 74:319-329)は、最近、ＡＮＫリ ピートがNotch媒介シグナル伝達現象にきわめて重要であることを実証した。Ｅ ＧＦ様リピートとアンキリンモチーフはどちらも、他のタンパク質分子と相互作 用することが知られている様々なタンパク質中に見いだされている。事実、Notc hとDeltaおよびSerrate遺伝子座（これらもＥＧＦ様リピートを含む膜貫通タン パク質をコードする）の産物との直接的相互作用が明らかとなった(Fehonら，19 90，Cell 61:523-534; Rebayら，1991，Cell 67:687-699)。 ショウジョウバエでは、優性の「活性型」表現型が細胞外の大部分のリガンド 結合配列を欠くNotchタンパク質のin vivo過剰発現から生じるのに対し、「ドミ ナントネガティブ(dominant-negative)」表現型は大部分の細胞内配列を欠くタ ンパク質の過剰発現から生じることが実証された(Rebayら，1993，Cell 74:319- 329)。 ショウジョウバエでは、Deltexが発生および他の生理学的プロセス、特に細胞 運命（分化）の決定に係わるNotchのシグナル伝達経路においてきわめて重要な 役割を果たしていることが実証された。我々は、ショウジョウバエの培養細胞、 酵母および成虫羽原基で行った発現実験を通して、ショウジョウバエのDeltexが Notch機能に関与するシグナル伝達カスケードの細胞内部分を媒介することを突 き止めた(Diederichら，1994，Development 120:473-481)。これらの実験から、 ショウジョウバエのDeltexは細胞質内に存在し、ユニークな配列のタンパク質で 、同型相互作用を示し、ショウジョウバエNotchの細胞内ＡＮＫリピートと物理 的に直接相互作用することが明らかになった。さらに、我々は、ショウジョウバ エDeltexがヒトNotchのＡＮＫリピートと直接相互作用することを実証した。 ＡＮＫリピートモチーフは多くのタンパク質が持っており、タンパク質−タン パク質相互作用に係わっている(Luxら，1990，Nature 344:36-42; Thompsonら， 1991，Science 253:762-768; Bennett，1992，J．Biol．Chem．267:8703-8706;B lankら，1992，Trends Biochem．Sci．17:135-140; Rebayら，1993，Cell 74:31 9-329)。さらに、種々の末端切断型のNotchのin vivo機能分析により、これらの ＡＮＫリピートが下流のシグナル伝達現象に関与していること、優性の「活性型 」表現型が細胞外の大部分のリガンド結合配列を欠くNotchタンパク質のin vivo過剰発現から生じるのに対し、「ドミナントネガティブ(dominant-negative )」表現型は大部分の細胞内配列を欠くタンパク質の過剰発現から生じることが 示された(Rebayら，1993，Cell 74:319-329)。さらに、deltexはNotchおよびDel ta（両方とも膜貫通タンパク質）と、そして核局在タンパク質のmastermind(Smo llerら，1990，Genes Dev．4:1688-1700)と遺伝的相互作用を示す。これによりd eltexは相互作用性遺伝子座のNotchグループの最初に同定された細胞質成分とな る。 我々はまた、その後、大部分がNotchタンパク質のアンキリンリピートからな る断片がNotchとSu(H)タンパク質との分子相互作用を媒介することを証明した(F ortiniら，1994，Cell 79:273-282)。ショウジョウバエSu(H)遺伝子は594アミノ 酸からなるタンパク質をコードし、いくつかのウイルスおよび細胞遺伝子のプロ モーターと結合してエプスタイン-バーウイルス核抗原２（EBNA2；ウイルスがＢ 細胞分化の正常なプログラムをくつがえすことを可能にする）と称するウイルス のトランスアクチベータ−タンパク質と直接相互作用する(Schweisguth，F.ら， 1992，Cell 69:1199; Furukawa T.ら，1991，J．Biol．Chem．266:23334）。遺 伝子および分子の研究からは、DeltexとDeltaとは共同してNotchタンパク質を多 量体化し、NotchによるSu(H)の細胞質保持を妨げることでNotchシグナル伝達経 路を活性化するように作用していることが示唆される(Diederich，J.ら，1994， Development 120:473; Fortini，M.ら，1994，Cell79:273; Matsuno，K.ら，未 発表; Artavanis-Tsakonasら，1995，Science，268:225-232）。この経路は、未 始動細胞(uncommitted cell)をより分化した状態へと進めるように影響を与える べく核現象を制御していると考えられる。推定上の核タンパク質 Hairless、Enh ancer of splitおよびmastermindをコードする３つの遺伝子座がこれらの核現象 に係わっている。 ショウジョウバエdeltex遺伝子のクローニング（1995年７月27日公開のPCT公 開WO 95/19770を参照）にもかかわらず、本発明以前には脊椎動物deltex遺伝子 は全く得られていなかった。 本明細書中の文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術であること を認めるものと解釈されるべきでない。 ３．発明の概要 本発明は、脊椎動物deltex遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれによりコー ドされる脊椎動物Deltexタンパク質のアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、 脊椎動物Deltexタンパク質の断片、他の誘導体および類似体、ならびに該タンパ ク質に対する抗体に関する。このような断片または誘導体をコードする核酸も本 発明の範囲内である。前記タンパク質および誘導体の、例えば組換え法による生 産を提供する。 特定の実施態様において、本発明はヒトのdeltex核酸およびタンパク質に関す る。 別の特定の実施態様において、本発明は哺乳動物のdeltex核酸およびタンパク 質に関する。 特定の実施態様において、本発明は、SH3結合ドメイン、リング-H2-ジンク(ri ng-H2-Zinc)フィンガー、Notchへの結合もしくはNotch cdc10/SW16/アンキリン （ＡＮＫ）リピートを含むNotch誘導体への結合を媒介するドメイン、または前 記ドメインの任意の組合せを含むがこれらに限らない、脊椎動物Deltexタンパク 質の１以上のドメインを含み、機能的に活性である本発明の脊椎動物Deltexタン パク質誘導体および類似体に関する。 本発明はまた、脊椎動物Deltexタンパク質および核酸に基づく治療・診断法お よび組成物に関する。本発明は本発明の治療用化合物を投与することによる細胞 運命または分化の疾患の治療法を提供する。このような治療用化合物（本明細書 では「治療薬」と記す）としては、脊椎動物Deltexタンパク質、その類似体およ び誘導体（断片を含む）；それらに対する抗体；脊椎動物Deltexタンパク質、そ の類似体および誘導体をコードする核酸；および脊椎動物deltexアンチセンス核 酸がある。好ましい実施態様において、本発明の治療薬は癌の症状を治療するた めに、または前新生物または非悪性状態から新生物または悪性状態へと進行する のを防ぐために投与される。他の特定の実施態様では、本発明の治療薬は神経系 疾患を治療するために、または組織の再生および修復を促進するために投与され る。 一つの実施態様において、脊椎動物Notchおよび／またはDeltex機能と拮抗す るまたは該機能を抑制する治療薬（以後「アンタゴニスト治療薬」という）が治 療効果のために投与される。もう一つの実施態様では、脊椎動物Notchおよび／ またはDeltex機能を促進する治療薬（以後「アゴニスト治療薬」という）が治療 効果のために投与される。 細胞運命の疾患、特に、脊椎動物Notchおよび／またはDeltexタンパク質の発 現もしくは活性または局在の異常レベルまたは望ましくないレベルを伴う高増殖 性疾患（例えば、癌）または低増殖性疾患の診断が、以下で詳述するように、こ のようなレベルを検出することで可能である。 好ましい面において、本発明の治療薬はNotchタンパク質またはその断片への 結合を媒介する脊椎動物Deltexの断片（本明細書では「接着断片」という）から 少なくとも成るタンパク質である。 さらに、本発明は、細胞内のNotch機能の不活性化法、脊椎動物Deltexタンパ ク質のNotchタンパク質への結合を抑制または低下させる化合物の同定法、およ び非最終分化細胞(non-terminally differentiated cell)の増殖法を提供する。 ４．図面の説明 図 1A〜F.-Drosophlila deltex cＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号 1)、お よび推定アミノ酸配列（配列番号２）。 図 2A〜C．該ｃＤＮＡ(ヌクレオチド 1〜2547)から誘導された複合ヌクレオチ ド配列（配列番号 11）、およびヒト deltex遺伝子座の推定アミノ酸配列（配列 番号 12）。推定されたアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の下に示されている。記号 ＊は T05200 の開始点を表し、記号＄は T05200 の終了点を表す。Ring-H2-ジン クフィンガーのコアH残基およびコアC残基には、下線が付けられている。PCR プ ライマーhdx-1〜４〔それぞれ(配列番号 26)、(配列番号 27)、(配列番号 28)、 および(配列番号 29)〕は、太字で示されている。XおよびNはそれぞれ、まだ決 定されていないアミノ酸残基およびヌクレオチド残基を表す。 図 3． ヒト Deltexタンパク質(配列番号 12)および DrosophlilaDeltexタン パク質(配列番号２)のアミノ酸配列の並記。残基が同等である位置には陰影が付 けられている。アミノ酸が化学的に同じである部位は、矩形で囲んである。 図 4A〜B． Drosophlila Deltexのアミノ酸配列(配列番号２)、およびタンパ ク質間相互作用に関与する断片の指定。断片 A-D(それぞれ配列番号 13〜16)が 示されている。 図 5． Deltex間相互作用を仲介する Deltex断片の略図。 図 6． Deltex-Notch相互作用を仲介する Deltex断片および Notch断片の略 図。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、脊椎動物 deltex遺伝子のヌクレオチド配列、およびそれによりコ ードされる Deltexタンパク質のアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、脊椎 動物 Deltexタンパク質の断片および他の誘導体、ならびに類似体に関する。こ のような断片または誘導体をコードする核酸も本発明の範囲内にある。前記タン パク質および誘導体の、例えば組換え法による生産を提供する。 特定の実施態様において、本発明は、ヒトの deltex遺伝子およびタンパク質 に関する。 もう１つの特定の実施態様において、本発明は、哺乳動物の deltex遺伝子お よびタンパク質に関する。 本発明はまた、機能的に活性である、すなわち、全長（野生型）脊椎動物 Del texタンパク質が関与する１つ以上の既知の機能的活性を呈することのできる、 本発明の脊椎動物 Deltexタンパク質誘導体および類似体に関する。このような 機能的活性としては、抗原性［抗脊椎動物 Deltexタンパク質抗体に結合する(ま たは、結合に対して、脊椎動物 Deltexタンパク質と競合する)能力］、免疫原性 (脊椎動物 Deltexタンパク質と結合する抗体を産生する能力)、Notchタンパク質 もしくは第２の Deltexタンパク質、または他のタンパク質、あるいはそれらの 断片に結合する(または、結合に対して、脊椎動物 Deltexタンパク質と競合する )能力、脊椎動物 Deltexタンパク質に対する受容体またはリガンドに結合する( または、結合に対して、脊椎動物 Deltexタンパク質と競合する)能力が挙げられ るが、これらに限定されるものではない。 本発明はさらに、脊椎動物 Deltexタンパク質(以下を参照のこと)の１つ以上 のドメインを含む、脊椎動物 Deltexタンパク質の断片(ならびにその誘導体およ び類似体)に関する。該ドメインとしては、SH3 結合ドメイン；ring-H2 ジンク フィンガー；Notch(もしくはは Notch ANK リピートを含むその誘導体)との結合 または第２の Deltex分子もしくはその断片との結合を仲介するドメイン；ある いはこれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 脊椎動物 Deltexタンパク質、それらの誘導体および類似体、に対する抗体も 提供する。 Drosophila deltexをプローブとして用いて、ヒト、ゼブラフィッシュ、およ び Xenopusの deltexをクローン化しようとする我々の以前の試みは、失敗に終 わった。このような以前の失敗とは対照的に、本発明は、ヒト deltexのクロー ニングの成功に基づくものである。実施例により以下で説明するように、我々は 、革新的な方法を用いて、ヒト deltexに対 応する転写単位をクローン化した。本明細書中に記載されているように(第６節 を参照のこと)、我々の結果は、ヒトにおける Deltexの顕著な構造保存を示し、 機能保存を示唆するものである。さらに、我々は、ヒトDeltexが、ヒトおよび D rosophilaの両方の Notch細胞内 ANK リピートと直接に分子的相互作用をするこ とを示す(第７節を参照のこと)。ヒトdeltexの配列を理解することにより、Dros ophilaとヒトとの間で強く保存される領域の同定が可能になるとともに、このよ うな強く保存される領域を用いて、他の脊椎動物 Deltex遺伝子を簡単に単離す る方法が提供される(以下の第5.6節および第８節を参照のこと)。 本発明の脊椎動物 deltex核酸配列およびアミノ酸配列ならびにそれらに対す る抗体は、脊椎動物 deltex ｍＲＮＡおよびタンパク質の検出および定量に利用 することができ、これにより、それらの発現を調べ、分化過程および他の生理的 過程の研究、アッセイ、および操作において、脊椎動物 Deltexタンパク質、断 片、および他の誘導体、ならびにそれらの類似体を生産することができ、さらに 、以下に記載されているように、治療および診断にも利用される。Deltex機能の アゴニストおよびアンタゴニストを利用すると、細胞の分化能力を変えることが できる。また、脊椎動物 deltex核酸および抗体を利用すると、以下に記載され ているように、他の種の脊椎動物 deltex相同体をクローン化することができる 。このような脊椎動物 deltex相同体は、互いに顕著な相同性を呈すること、お よび Notchタンパク質に結合する能力を示すタンパク質をコードすることが期待 される。 本発明はまた、脊椎動物 Deltexタンパク質および核酸に基づく治療・診断法 および組成物に関する。本発明は、本発明の治療用化合物を投与することにより 、細胞寿命および細胞分化の異常の治療に利用できる。このような治療用化合物 (本明細書中では「治療薬」と記す)としては、脊椎動物 Deltexタンパク質なら びにそれらの類似体および誘導体(断片を含む)；これらに対する抗体；脊椎動物 Deltexタンパク質、類似体、または誘導体をコードする核酸；ならびに脊椎動 物 deltexアンチセンス核酸が挙げられる。好ましい実施態様において、本発明 の治療薬を投与 することにより、癌性病状の治療を行うか、または腫瘍発生前もしくは非悪性の 状態から腫瘍性もしくは悪性の状態への進行を防止する。他の特定の実施態様に おいて、本発明の治療薬を投与することにより、神経系障害の治療を行うか、ま たは組織の再生および修復を促進する。 １実施態様において、Notchおよび／または脊椎動物 Deltexの機能に拮抗する かまたはその機能を阻害する治療薬(これ以降では「アンタゴニスト治療薬」と 記す)を投与することにより、治療効果を得る。もう１つの実施態様において、N otchおよび／または脊椎動物 Deltexの機能を促進する治療薬(これ以降では「ア ゴニスト治療薬」と記す)を投与することにより、治療効果を得る。 異常なまたは望ましくないレベルの Notchおよび／または脊椎動物 Deltexタ ンパク質の発現または活性または局在化が関与する細胞寿命の異常、特に、高増 殖性疾患(例えば、癌)または低増殖性疾患は、このようなレベルを検出すること により、診断することができるが、これについては、以下でより詳細に説明する 。 好ましい態様において、本発明の治療薬は、少なくとも、Notchタンパク質、 第２の Deltexタンパク質、または Notchもしくは Deltexの断片との結合を仲介 する脊椎動物 Deltexの断片を含むタンパク質である。 以下の実施例により、本発明を説明する。特に、ヒト deltexのクローニング および配列決定、ならびに Notchの ANK リピートに結合することが予想される か、またはヒト Deltexの領域に結合することが予想されるヒト Deltexの領域の 同定について説明する。 開示内容を明確にするために、発明の詳細な説明を以下に示すサブセクション に分割するが、これらに限定されるものではない。 5.1． 脊椎動物 deltex核酸の単離 本発明は、脊椎動物 deltex核酸のヌクレオチド配列に関する。特定の実施態 様において、ヒト deltex核酸は、図 2A〜C に示されたｃＤＮＡ配列(配列番号 11)、またはそのコード領域(ヌクレオチド番号 504-2363)、またはヒト Deltex タンパク質をコードする核酸(例えば、配列番号 12の 配列を有するもの)を含む。本発明は、脊椎動物 deltex配列のうちの少なくとも ８個のヌクレオチド(すなわち、ハイブリダイズ可能な部分)を含む核酸を提供す るが、他の実施態様において、該核酸は、脊椎動物 deltex配列のうちの少なく とも 25個の(連続した)ヌクレオチド、50個のヌクレオチド、100個のヌクレオチ ド、150個のヌクレオチド、もしくは200個のヌクレオチド、または全長の脊椎動 物 deltexコード配列を含む。本発明はまた、上記の配列にハイブリダイズでき るかまたは該配列と相補的な核酸に関する。特定の態様において、脊椎動物 del tex遺伝子のうちの少なくとも 10個、25個、50個、100個、もしくは 200個のヌ クレオチド、または全コード領域、に相補的な配列を含む核酸を提供する。 特定の実施態様において、該配列は天然に存在するものである。 他の特定の実施態様において、本発明は、配列番号 11の配列のうちの少なく とも 110個、150個、または 200個の連続したヌクレオチドを含む核酸を提供す る。他の実施態様において、本発明は、配列番号 12の最初の 25個、50個、100 個、150個、200個、または 230個のアミノ酸を含む核酸を提供する。 特定の実施態様において、脊椎動物 deltex核酸は、ヒト deltexのアミノ末端 の 180個のアミノ酸をコードする核酸(例えば、配列番号 11のヌクレオチド番号 504〜1044によりコードされる)またはその断片と実質的に相同な核酸を含む。 １実施態様において、脊椎動物 deltex核酸は、同じサイズのヒト deltexの対応 するヌクレオチド配列に対して少なくとも 50%の同一性を有する。もう１つの実 施態様において、この同一性は 55%を超える。好ましい実施態様において、脊椎 動物 deltexのヌクレオチド配列の同一性は、60%を超える。より好ましい実施態 様において、この同一性は 65%を超える。最も好ましい実施態様において、脊椎 動物 deltexのヌクレオチド配列の同一性は、同じサイズのヒト deltexの対応す るヌクレオチド配列の同一性に対して 70%を超える。 もう１つの特定の実施態様において、脊椎動物 deltex核酸は、ヒト deltexの 中央領域のアミノ酸をコードする核酸(例えば、配列番号 11のヌクレオチド番号 1045〜1821)またはその断片と実質的に相同な核酸を 含む。１実施態様において、脊椎動物 Deltexタンパク質の中央のアミノ酸をコ ードする核酸は、同じサイズの対応するヒト deltex配列に対して少なくとも 50 %のヌクレオチド配列の同一性を有する。もう１つの実施態様において、この同 一性は 55%を超える。好ましい実施態様において、このヌクレオチド配列の同一 性は、 60%を超える。より好ましい実施態様において、この同一性は 65%を超え る。最も好ましい実施態様において、脊椎動物 deltexの中央領域のアミノ酸を コードする核酸の相同性は、同じサイズのヒト deltexの対応するヌクレオチド 配列の相同性に対して 65%を超えるヌクレオチド配列の同一性を有する。 もう１つの特定の実施態様において、脊椎動物 deltex核酸は、ヒト deltexの 180 個のカルボキシ末端アミノ酸をコードする核酸(ヌクレオチド番号 1822〜2 366)またはその断片と実質的に相同な核酸を含む。１実施態様において、脊椎動 物 Deltexタンパク質のカルボキシ末端領域をコードする核酸は、同じサイズの 対応するヒト deltex配列に対して少なくとも 50%のヌクレオチド配列の同一性 を有する。もう１つの実施態様において、この同一性は 55%を超える。好ましい 実施態様において、この同一性は、60%を超える。より好ましい実施態様におい て、この同一性は 65%を超える。最も好ましい実施態様において、脊椎動物 del texのアミノ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドの同一性は、同じサイズの ヒトdeltexの対応するヌクレオチド配列の同一性に対して 70%を超える。 特定の実施態様において、ストリンジェンシーの低い条件下で、脊椎動物 del tex核酸とハイブリダイズできる核酸(例えば、配列番号 11を有するもの)、また は脊椎動物 deltex誘導体をコードする核酸を提供する。具体的には、ストリン ジェンシーの低いこのような条件を用いる手順は、以下の通りであるが(Shilo a nd Weinberg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:6789-6792を参照のこと) 、これに限定されるものではない。すなわち、40℃において、35% ホルムアミド 、5X SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA 、および 500μg/mlの変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で、ＤＮＡを含有す るフィルターを６時間前処理する。同じ溶液中で、ハイブリダイゼーションを行 うが、ただし、次のような変更を行う。すなわち、0.02% PVP、0.02% Ficoll 0. 2%-BSA、100μg/mlのサケ精子ＤＮＡ、10％(wt/vol)の硫酸デキストラン、およ び 5〜20×10⁶cpm³²P標識プローブ、を使用する。40℃においてハイブリダイゼ ーション混合液中でフィルターを18時間〜20時間インキュベートし、次いで、55 ℃において、2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA、および 0.1% SDS を含 有する溶液中で 1.5時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液に置き換えて、60℃に おいて更に 1.5時間インキュベートする。フィルターをブロットして乾燥し、オ ートラジオグラフィーにかける。必要な場合には、65℃〜68℃において３回目の フィルターの洗浄を行ってからフィルムに接触させる。ストリンジェンシーの低 い他の使用可能な条件は、当該技術分野で周知である(例えば、種間ハイブリダ イゼーションで利用される条件)。 もう１つの特定の実施態様において、ストリンジェンシーの高い条件下で、脊 椎動物 deltex核酸とハイブリダイズできる核酸を提供する。具体的には、スト リンジェンシーの高いこのような条件を用いる手順は、以下の通りであるが、こ れに限定されるものではない。すなわち 65℃において、6X SSC、50mM Tris-HCl (pH7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、および 500μg/ml の変性サケ精子ＤＮＡを含有する緩衝液中で、ＤＮＡを含有するフィルターを８ 時間〜１晩、プレハイブリダイゼーション処理する。65℃において、100μg/ml の変性サケ精子ＤＮＡをおよび 5〜20×10⁶cpmの³²P標識プローブを含有するプ レハイブリダイゼーション混合液中で、フィルターを 48時間ハイブリダイズす る。37℃において、2X SSC、0.01 PVP、0.01% Ficoll、および 0.01% BSAを含有 する溶液中で、フィルターの洗浄を１時間行う。この後、50℃において、0.1X S SC中で 45分間洗浄を行ってからオートラジオグラフィーにかける。ストリンジ ェンシーの高い他の使用可能な条件は、当該技術分野で周知である。 この他に、脊椎動物 Deltexタンパク質の誘導体（例えば、断片）をコードす る核酸(第5.6節を参照のこと)および脊椎動物 deltexアンチセンス核酸(第5.11 節を参照のこと)を提供する。容易に理解されるように、本 明細書中で使用する場合、「脊椎動物 Deltexタンパク質の断片または部分をコ ードする核酸」とは、脊椎動物 Deltexタンパク質の列挙された断片または部分 のみをコードし、連続した配列である脊椎動物 Deltexタンパク質の他の隣接部 分はコードしない核酸を意昧するものとする。 脊椎動物 deltex遺伝子、例えば、ヒト deltex遺伝子、のクローニングに対す る特定の実施態様を具体例として示すと以下のようになるが、これらに限定され るものではない。 すなちわ、発現クローニング(当該技術分野で周知の技術)を行うために、発現 ライブラリーを入手するか、または当該技術分野で周知の方法により作製する。 例えば、mＲＮＡ(例えば、ヒト mＲＮＡ)を単離し、 cＤＮＡを調製し、発現ベ クター（例えば、バクテリオファージ誘導体）中に連結する。この結果、これが 導入された宿主細胞による発現が可能となる。次に、種々のスクリーニングアッ セイを用いて、発現された脊椎動物 Deltex産物の選択を行うことができる。好 ましい態様において、抗ヒト Deltex抗体を用いて、クローン化された脊椎動物 deltex遺伝子を発現する組換え宿主細胞を選択することができる。 特定の実施態様において、PCR を用いてゲノムライブラリーまたは cＤＮＡラ イブラリー中の所望の脊椎動物 deltex配列の増幅を行った後で、選択を行う（ 具体的には以下の第８節を参照のこと）。既知の脊椎動物deltex配列、好ましく は、Drosophilaとヒトとの間で保存されることが分かっている領域、を表すオリ ゴヌクレオチドプライマーを、PCR におけるプライマーとして使用することがで きる。合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして利用し、目的にかなうと考え られる供給源(ＲＮＡまたはＤＮＡ)、好ましくは cＤＮＡライブラリー、から得 られた配列を PCR により増幅してもよい。PCR は、例えば、Perkin-Elmer Cetu s サーマルサイクラーおよび Taq ポリメラーゼ(Gene Amp^TM)を使用することに より、行うことができる。増幅の対象となるＤＮＡとしては、ヒト mＲＮＡまた は cＤＮＡまたはゲノムＤＮＡが挙げられる。PCR 反応に使用するための数種の 異なる縮重プライマーを合成することもできる。また、PCR反応の開始に利用さ れるハイブリダイゼーション条件のストリンジェン シーを変えることにより、既知の脊椎動物 deltexヌクレオチド配列と単離され る核酸相同体との間のヌクレオチド配列の類似度を増大または減少させることも できる。種間ハイブリダイゼーションに対しては、ストリンジェンシーの低い条 件が好ましい(先の記載を参照のこと)。同種間ハイブリダイゼーションに対して は、中程度又は高度にストリンジェントな条件が好ましい。脊椎動物 deltex遺 伝子相同体のセグメントの増幅に成功した後、このセグメントを分子クローニン グし、配列決定し、更に、完全 cＤＮＡまたはゲノムクローンを単離するための プローブとして用いることができる。これにより、次に、以下で説明するように 、ゲノムの完全ヌクレオチド配列の決定、その発現の解析、および機能解析のた めのタンパク質産物の生産を行うことができる。好ましい態様において、Deltex タンパク質をコードするヒト遺伝子を、この方法により同定することができる。 この他、先に述べたように、ハイブリダイゼーションによる選択に替えて、PCR 増幅されたＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、発現クローニングを行うことがで きる。 種間ハイブリダイゼーションにより(異なる種の脊椎動物 deltex遺伝子のすべ てまたは一部分を表す脊椎動物 deltexプローブへの直接のハイブリダイゼーシ ョンによるか、または異なる種の脊椎動物 deltex遺伝子の配列から誘導された オリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCR により)、脊椎動物 deltex遺伝子 を単離することが望まれる場合、実施例８に記載したように、ヒトと Drosophi1 aとの間で高度に保存された領域をコードする deltex配列を含むプローブを用い てスクリーニングを行うことによるか、または該配列を含むオリゴヌクレオチド を用いて PCR を開始することにより、所望の脊椎動物 deltex遺伝子を単離する ことができる。例えば、ヒト Deltexアミノ酸ストレッチ 414〜419 (配列番号 3 0)、475〜480 (配列番号 31)、504〜511 (配列番号 32)、531〜539 (配列番号 3 3)、および557〜564 (配列番号 34)はそれぞれ、Drosophila Deltexアミノ酸ス トレッチ 549〜555 (配列番号 35)、603〜608 (配列番号 36)、632〜639 (配列 番号 37)、659〜667 (配列番号 38)、685〜692 (配列番号 39)中で保存されてい る。好ましい実施態様において、50 個〜500 個 の長さのヌクレオチドにより分離された配列を含む一対のオリゴヌクレオチドを 、PCRのプライマーとして使用する。本発明は、Deltexタンパク質の保存領域を コードする核酸を組み合わせて使用して、他の生物体の Deltexコード核酸を単 離することをも含むが、この際、該核酸を PCRに使用して種々の配列を増幅する か、または PCR を用いずに、プローブとして使用して直接的コロニーハイブリ ダイゼーションによる選択を行う(例えば、Grunstein，M．and Hogness，D.，19 75，Proc．Natl．Acad.Sci．U.S.A．72，3961)。 種間ハイブリダイゼーションにより(進化的に遠縁の異なる種の deltex遺伝子 のすべてまたは一部分を表す deltexプローブへの直接のハイブリダイゼーショ ンによるか、または異なる進化的に遠縁の種の deltex遺伝子の配列から誘導さ れたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた PCRにより)、deltex遺伝子を単離 することが望まれる場合、所望の deltex遺伝子は、より段階的な進化ウォーク( evolutionary walking)の方法により、単離することができる。すなわち、最初 に、より近縁の種に由来する deltex遺伝子を単離し、種間で保存された deltex 部分を同定し、次いで、保存された配列を含有するプローブを用いてスクリーニ ングをおこなうか、または保存された配列を含有する核酸を用いて PCR を開始 する。この方法は、厄介ではあるが、単純明快であり、通常の方法により容易に 実施可能である。例えば、進化的系統樹をさらに下がっていくことが望まれる場 合、ヒト Deltexをコードする核酸をプローブとして使用し、マウス deltex遺伝 子を最初に単離してもよい。次に、マウス deltex配列の保存部分を使用して、 鳥類ライブラリー中の deltexのスクリーニングまたは増幅を行う。次に、鳥類 クローンの保存部分を使用し、両生類ライブラリーのスクリーニングを行い、さ らに、両生類クローンの保存部分を使用し、魚類ライブラリーのスクリーニング を行う、などの処理を続ける。必要な場合には、それぞれの種から得られたゲノ ムＤＮＡを含有するサザンブロットに deltexプローブをハイブリダイズさせ、 ハイブリダイゼーションを起こす種を選択することにより、スクリーニングの次 のラウンドで選ばれる種を決めることができる。 上記の方法は、脊椎動物 deltexのクローンが得られる方法についての以下の 一般的な説明を制限するものではない。 いずれの真核細胞も、脊椎動物 deltex遺伝子の分子クローニングに対する核 酸の供給源となりうる。ＤＮＡは、クローン化ＤＮＡ(例えば、ＤＮＡライブラ リー)から、当該技術分野で周知の標準的方法により、すなわち、化学合成によ り、cＤＮＡクローニングにより、またはゲノムＤＮＡもしくはその断片のクロ ーニングにより、得ることができる(例えば、Sambrook et al.，1989，Molecula r Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，2d．Ed.， Cold Spring Harbor，NewYork; Glover，D.M．(ed.)，1985，DNA Cloning; A Pr actical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K．Vol．I，IIを参照されたい )。ゲノムＤＮＡから誘導されたクローンは、コード領域の他に、調節ＤＮＡお よびイントロンＤＮＡの領域を含有する可能性があり、cＤＮＡから誘導された クローンは、エキソン配列のみを含有するであろう。いずれの供給源を用いる場 合においても、遺伝子を好適なベクター中に分子クローニングを行い、遺伝子の 増殖をする必要がある。 ゲノムＤＮＡから得られた遺伝子の分子クローニングを行う場合、ＤＮＡ断片 を作製するが、その中に所望の遺伝子をコードするものが含まれるであろう。Ｄ ＮＡは、種々の制限酵素を用いて、特定の部位で切断することができる。この他 、マンガンの存在下でＤＮＡse を使用してＤＮＡを断片に分割するか、または 例えば、超音波処理により物理的に剪断することもできる。次に、標準的な方法 により、線状ＤＮＡ断片をサイズによって分けることができる。標準的な方法と しては、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法およびカラムクロ マトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 ＤＮＡ断片が得られた後、所望の遺伝子を含有する特定のＤＮＡ断片を、いく つかの方法によって同定することができる。例えば、所定量の(任意の種の)脊椎 動物 deltex遺伝子もしくはその特定のＲＮＡ、またはそれらの断片（例えば、 接着ドメイン）の部分が得られ、精製され、かつ標識化できる場合、生成したＤ ＮＡ断片は、標識化されたプローブへの 核酸のハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる(Benton ，W．and Davis，R.，1977，Science 196，180; Grunstein，M. And Hogness，D .，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．72．3961)。プローブに対して実質的 な相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする。種間ハイブリダイゼーションに 対しては、ストリンジェンシーの低い条件が好ましい(先の記載を参照されたい) 。同種間ハイブリダイゼーションに対しては、中程度にストリンジェントな条件 が好ましい(先の記載を参照されたい)。また、制限酵素による消化を行い、断片 のサイズを、既知の制限地図(入手可能であれば)から予測されるものと比較する ことにより、適切な断片を同定することができる。遺伝子の性質に基づいて、更 なる選択を行うことができる。この他、遺伝子の存在は、該遺伝子により発現さ れた産物の物理的、化学的、または免疫学的性質に基づくアッセイにより検出す ることができる。例えば、電気泳動移動度、等電点電気泳動挙動、タンパク質消 化地図、Notchとの結合、または脊椎動物 Deltexに対して知られている抗原特性 が類似しているかまたは同じであるタンパク質を生産する適切な mＲＮＡをハイ ブリッド選択する cＤＮＡクローンまたはＤＮＡクローンを選ぶことができる。 脊椎動物 Deltexに対する抗体が入手可能であれば、ELISA(enzyme-linked immun osorbentassay)タイプの手順を用いて、標識抗体を、脊椎動物 Deltexを合成す ると推定されるクローンに結合させることにより、脊椎動物 Deltexタンパク質 を同定することができる。 また、脊椎動物 deltex遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるmＲＮＡ の選択、続く in vitro での翻訳により、同定することもできる。この方法では 、断片を用いて、ハイブリダイゼーションにより相補的 mＲＮＡを単離する。こ のようなＤＮＡ断片は、他の種(例えば、ヒト)の入手可能な精製された脊椎動物 deltex ＤＮＡを表す可能性がある。一単離された mＲＮＡの単離された産物の in vitro 翻訳された産物の免疫沈降分析または機能アッセイ(例えば、Notchに 結合する能力)により mＲＮＡが認識されるので、所望の配列を含む相補的ＤＮ Ａ断片が認識される。 更に、細胞から単離されたポリソームの、特に脊椎動物 Deltexタンパク 質に対して指向性を有する固定化抗体への吸着により、特定の mＲＮＡを選択で きる。選択された mＲＮＡ(吸着されたポリソームから得られたもの)を鋳型とし て使用することにより、放射能標識された脊椎動物 deltex cＤＮＡを合成する ことができる。次に、放射能標識された mＲＮＡまたは cＤＮＡをプローブとし て用いて、他のゲノムＤＮＡ断片中から脊椎動物 deltexＤＮＡを同定すること ができる。 脊椎動物 deltexゲノムＤＮＡを単離するための別法としては、既知の配列か ら遺伝子配列そのものを化学的に合成する方法、または cＤＮＡから、脊椎動物 deltex遺伝子をコードする mＲＮＡを作製する方法が挙げられるが、これらに 限定されるものではない。例えば、脊椎動物 deltex遺伝子の cＤＮＡクローニ ングに用いられるＲＮＡは、脊椎動物 Deltexを発現する細胞から単離すること ができる。他の方法も利用可能であるが、こうした方法も本発明の範囲内にある 。 次に、同定および単離された遺伝子を適切なクロ-ニングベクター中に挿入す ることができる。当該技術分野で周知の多数のベクター-宿主系が使用できる。 使用可能なベクターとしては、プラスミドまたは修飾ウイルスが挙げられるが、 これらに限定されるものではない。ただし、こうしたベクター系は、使用される 宿主細胞との適合性を持たなければならない。このようなベクターとしては、λ 誘導体などのバクテリオファージ、または PBR322、pUC、もしくは Bluescript (Stratagene)プラスミド誘導体などのプラスミドが挙げられるが、これらに限定 されるものではない。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的付着 末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡ断片を連結することにより行うこ とができる。しかしながら、ＤＮＡを断片に分割するために使用される相補的制 限部位が、クローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端が酵素 的に修飾される可能性がある。この他、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ 末端上に連結することにより、所望の任意の部位を形成することができる。これ らの連結されたリンカーには、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特 定の化学合成されたオリゴヌクレオチドが含まれていてもよい。別法において、 切断されたベ クターおよび脊椎動物 deltex遺伝子を、ホモポリマーテーリングにより修飾し てもよい。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔な どを介して、宿主細胞中に導入することができ、その結果、遺伝子配列の多数の コピーが形成される。 別法において、「ショットガン」法による好適なクローニングベクター中への 挿入の後、所望の遺伝子を同定および単離してもよい。クローニングベクター中 への挿入の前に、例えば、サイズ分画化法により所望の遺伝子の含有率を増大さ せることができる。 特定の実施態様において、単離された脊椎動物 deltex遺伝子、cＤＮＡ、また は合成されたＤＮＡの配列を含む組換えＤＮＡ分子を用いた宿主細胞の形質転換 により、遺伝子の多数のコピーの形成が可能である。従って、形質転換体の培養 、形質転換体からの組換えＤＮＡ分子の単離、および必要な場合には、単離され た組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の分離を行うことにより、遺伝子が大量に得ら れる。 本発明により提供される脊椎動物 deltex配列としては、本来の脊椎動物 Delt exタンパク質中に見出されるものと実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌク レオチド配列、および機能的に等価なアミノ酸を有するコードされたアミノ酸配 列が挙げられる。これらはいずれも、以下の第5.6節に脊椎動物 Deltex誘導体と して記載されている。 5.2. 脊椎動物 deltex核酸の発現 脊椎動物 Deltexタンパク質をコードする核酸もしくは機能的に活性な断片、 またはそれらの他の誘導体は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタン パク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター、の中に挿入す ることができる。また、必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、もとの脊椎 動物 deltex遺伝子および／またはその隣接領域から供給することができる。様 々な宿主-ベクター系を利用して、タンパク質コード配列を発現することができ る。こうした系としては、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイ ルスなど)を感染させた脊椎動物細胞系；ウイルス(例えば、バクロウイルス)を 感染さ せた昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、またはバクテリオ ファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡを用いて形質転 換された細菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ベクターの発 現要素の強度および特異性は、様々である。利用される宿主 - ベクター系にも よるが、任意の数の好適な転写要素および翻訳要素を使用してもよい。特定の実 施態様において、Notchに結合するか、または Notch ANK リピートを含む分子に 結合するタンパク質をコードする脊椎動物 deltex遺伝子の部分を含む分子が発 現される。もう１つの実施態様において、Deltexタンパク質の断片に結合するタ ンパク質をコードする脊椎動物 deltex遺伝子の部分を含む分子が発現される。 他の特定の実施態様において、哺乳動物 deltex遭伝子が発現されるか、または 哺乳動物 Deltexの機能的活性部分をコードする配列が発現される。他の特定の 実施態様において、ヒト deltex遺伝子が発現されるか、またはヒト Deltexの機 能的活性部分をコードする配列が発現される。特定の実施態様において、脊椎動 物 Deltexタンパク質の Notch結合ドメインを含むキメラタンパク質が発現され る。他の実施態様において、全長脊椎動物 deltex cＤＮＡが発現されるか、ま たは脊椎動物 Deltexタンパク質の機能的活性部分をコードする配列が発現され る。さらにもう１つの実施態様において、脊椎動物 Deltexタンパク質のドメイ ンを含む脊椎動物 Deltexタンパク質の断片、もしくは他の誘導体、または脊椎 動物 Deltexタンパク質の類似体が発現される。 ベクター中へＤＮＡ断片を挿入するための上述した方法のいずれかを用いて、 適切な転写／翻訳調節シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺 伝子を含んでなる発現ベクターを作製することができる。これらの方法において 、、in vitro 組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびに in vivo 組換え体(遺伝 子組換え)を利用してもよい。脊椎動物Deltexタンパク質またはペプチド断片を コードするヌクレオチド配列の発現は、第２のヌクレオチド配列により調節する ことができ、その結果、脊椎動物 Deltexタンパク質またはペプチドは、組換え ＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現される。例えば、脊椎動物 Deltexタ ンパク質の 発現は、当該技術分野で周知の任意のプロモーター／エンハンサーを用いて調節 することができる。脊椎動物 deltex遺伝子発現を調節するために使用可能なプ ロモーターとしては、SV40 初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon，1981 ，Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの長い３'末端リピートに含まれる プロモーター(Yamamoto et al.，1980，Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキ ナーゼプロモーター(Wagner etal.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，78 :1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.，1982，Nat ure 296:39-42)；β-ラクタマーゼなどの原核細胞発現ベクター(Villa-Kamaroff etal.，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．75:3727-3731)、tac(Deboer et al.，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80:21-25)、λP1、または trc プ ロモーター；Scientific American 1980，242:74-94の「組換え細菌から得られ た有用なタンパク質」もを参照されたい；ノパリンシンセターゼプロモーター領 域またはカリフラワーモザイクウイルス 35S ＲＮＡプロモーターを含む植物発 現ベクター(Gardner et al.,1981，Nucl．Acids Res．9:2871)、および光合成酵 素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310:115-120);酵母または他の真菌から得られるプロモータ ー要素、例えば、Ga14プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモ ーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファタ ーゼプロモーター、および組織特異性を呈し、トランスジェニック動物に利用さ れてきた次の動物転写調節領域：膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺 伝子調節領域(Swift et al.，1984，Cell 38:629-646; Ornitz et al.，1986，C old Sring Harbor Symp.Quant．Biol．50:399-409; MacDonald，1987，Hepatolo gy 7:425-515)；膵臓ベータ細胞中で活性であるインスリン遺伝子調節領域(Hana han，1985，Nature 315:155-122)、リンパ系細胞中で活性である免疫グロブリン 遺伝子調節領域(Grosschedl et al.，1984，Cell 38:647-658; Adames et al.， 1985，Nature 318:533-538; Alexander et al.，1987，Mol．Cell．Biol．7:143 6-1444)、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、 およびマスト細胞中で活性であるマウス乳癌ウイルス調節領域(Leder etal.，19 86,Cell 45:485-495)、肝臓中で活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel．1:268-276)、肝臓で活性であるαフェトプロ テイン遺伝子調節領域(Krumlauf et al.，1985，Mol．Cell．Biol．5:1639-1648 ; Hammer et al.，1987，Science235:53-58； 肝臓中で活性であるα１アンチ トリプシン遺伝子調節領域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel．1:161-171 )、骨髄細胞中で活性であるβグロビン遺伝子調節領域(Mogram et al.，Nature 315:338-340; Kollias et al.，1986，Cell 46:89-94; 脳の乏突起膠細胞中で活 性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readhead et al.,1987，Cel l 48:703-712)；骨格筋中で活性であるミオシンＬ鎖-2 遺伝子調節領域(Sani，1 985，Nature 314:283-286)、ならびに視床下部中で活性である性腺刺激ホルモン 放出ホルモン遺伝子調節領域(Mason et al.，1986，Science 234:1372-1378)が 挙げられるが、これらに限定されるものではない。 脊椎動物 deltex遺伝子インサートを含有する発現ベクターは、３つの一般的 な手法：(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の有無、 および(c)挿入された配列の発現、により同定することができる。第１の手法で は、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在が、挿入された脊椎動物 del tex遺伝子に相同的な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション により、検出できる。第２の手法では、組換えベクター／宿主系が、ベクター中 への外来遺伝子の挿入により生じる「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジン キナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バクロウイルス中にお ける閉鎖体の形成など)の有無に基づいて同定および選択できる。例えば、脊椎 動物 deltex遺伝子をベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入する場合、脊椎動 物 deltexインサートを含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能が存在しない ことにより同定できる。第３の手法では、組換え発現ベクターは、組換え体によ り発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより同定することができる。 このようなアッセイは、例えば、in vitro アッセイ系における脊椎動物 deltex遺伝子産物の物理的または機能的性質、例 えば、Notchへの結合、抗体による結合、に基づいて行うことができる。 特定の組換えＤＮＡ分子を同定および単離した後、当該技術分野で周知の数種 の方法を用いて、これを増殖することができる。好適な宿主系および増殖条件が 決まれば、組換え発現ベクターを増殖させて大量に調製することができる。先に 説明したように、使用可能な発現ベクターとしては、次のベクターまたはその誘 導体：すなわち、僅かではあるが、これらを列挙すると、ワクシニアウイルスま たはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バクロウイルスなどの昆虫 ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(例えば、λバクテリオ ファージベクター)、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター、が挙 げられるが、これらに限定されるものではない。 さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を修飾して所 望の特定の形態で保有する宿主細胞株を選択してもよい。所定のプロモーターか らの発現は、所定のインデューサーの存在により評価できる。従って、遺伝子工 学的に生産される脊椎動物 Deltexタンパク質の発現は、調節可能である。さら に、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳処理および翻訳後処理ならびに修飾( 例えば、リン酸化、開裂)に対して、それぞれ特徴的かつ特異的な機構を呈する 。適切な細胞系統または宿主系を用いれば、発現される外来タンパク質に対する 所望の修飾および処理を確実に行うことができる。 他の特定の実施態様において、脊椎動物 Deltexタンパク質、断片、類似体、 または誘導体は、融合タンパク質産物またはキメラタンパク質産物〔異種タンパ ク質配列(異なるタンパク質の配列)にペプチド結合を介して結合されたタンパク 質、断片、類似体、または誘導体〕として、発現させてもよい。このようなキメ ラ産物は、当該技術分野で周知の方法を用いて、所望のアミノ酸配列をコードす る適切な核酸配列を適切なコーディングフレーム中で互いに連結し、当該技術分 野で周知の方法を用いて、キメラ産物を発現することにより、形成することがで きる。この 他、このようなキメラ産物は、タンパク質合成技術により、例えば、ペプチド合 成機を用いて、形成することもできる。 cＤＮＡおよびゲノム配列のいずれをも、クローン化および発現することがで きる。 他の実施態様において、脊椎動物 deltexcＤＮＡ配列を、染色体に組み込んで 発現させてもよい。当該技術分野で周知の異種組換え法を使用してもよい。 5.3. 脊椎動物 deltex遺伝子産物の同定および精製 特定の態様において、本発明は、抗原決定基を含むか(すなわち、抗体により 認識可能であるか)、または機能的活性のある、脊椎動物 Deltex、好ましくはヒ ト Deltex、のアミノ酸配列、および断片、ならびにそれらの誘導体を提供し、 さらに、上記物質をコードする核酸配列を提供する。本明細書中で使用する場合 、「機能的活性」物質とは、全長(野生型)脊椎動物 Deltexタンパク質産物が関 与する１つ以上の既知の機能的活性を呈する物質を意味するが、こうした活性と しては、例えば、Notchまたはその一部分への結合、他の Deltex分子またはその 一部分への結合、任意の他の Deltexリガンドへの結合、抗原性(抗脊椎動物 Del tex抗体への結合)、免疫原性(抗 Deltex抗体の産生)、Notch細胞内シグナル形質 導入などが挙げられる。 特定の実施態様において、本発明は、少なくとも６個のアミノ酸、10個のアミ ノ酸、50個のアミノ酸、または少なくとも 75個のアミノ酸から成る脊椎動物 De ltexタンパク質の断片を提供する。他の実施態様において、該タンパク質は、１ つ以上の SH3 結合ドメイン(例えば、表 IIIの配列番号 17〜21)；１つ以上の r ing-H2 ジンクフィンガードメイン(例えば、配列番号 25)、もしくは Notchと結 合する部分(例えば、脊椎動物 Deltexの最初の約 230 個のアミノ酸を含む部分) 、または脊椎動物 Deltexタンパク質中の上記物質の組合せ、を含むかまたはそ れらから成る。脊椎動物 Deltexの上記の領域の一部または全部が欠けている断 片、または該断片を含むタンパク質もまた、提供される。上記の領域のコピーを ２ つ以上含む分子もまた、提供される。上記の領域をコードする核酸も、提供され る。 脊椎動物 deltex遺伝子配列を発現する組換え体を同定した後、遺伝子産物を 分析することができる。この分析は、産物の物理的または機能的性質に基づくア ッセイにより行われるが、具体的には、産物の放射能標識、それに続くゲル電気 泳動、免疫アッセイなどによる分析が行われる。化学的に合成されたタンパク質 、誘導体、および類似体も、同様に分析することができる。 脊椎動物 Deltexタンパク質を同定した後、標準的方法、例えば、クロマトグ ラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ ラフィー、サイジングクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタン パク質精製のための任意の他の標準的手法により、単離および精製を行うことが できる。任意の好適なアッセイを利用して、機能的性質を評価することができる (第5.7節を参照のこと)。 この他、脊椎動物 Deltexタンパク質のアミノ酸配列は、組換え体に含まれる キメラ遺伝子のヌクレオチド配列から導くことができる。こうしてアミノ酸配列 が分かれば、当該技術分野で周知の化学的方法により、タンパク質を合成するこ とができる(例えば、Hunkapiller et al.，1984，Nature 310:105-111を参照の こと)。 具体例として、こうして導かれた、ヒト Deltexタンパク質のアミノ酸配列(配 列番号 12)を図 2A〜C に示す。 5.4 脊椎動物 deltex遺伝子およびタンパク質の構造 脊椎動物 deltex遺伝子およびタンパク質の構造は当業界に公知の種々の方法 で分析することができる。 5.4.1. 遺伝子解析 脊椎動物 deltex遺伝子に対応するクローン化された DNA または cDNA は、以 下の例に限定されるものではないが、サザン・ハイブリダイゼーション(Souther n，1975，J．Mol．Biol.，98: 503-517)、ノーザン・ハイブリダイゼーション（ 例えば、Freeman et al.，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,80: 4094-409 8参照）、制限エンドヌクレアーゼ・マッピング（Maniatis，1982，Molecular C loning，A Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)および DNA 配列解析な どの方法によって解析することができる。ポリメラーゼ・チェイン・リアクショ ン（PCR; 米国特許第 4,683,202 号、4,683,195 号および 4,889,818 号；Gylle nstein et al.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，85: 7652-7656；Ochma n et al.，1988，Genetics，120: 621-623；Loh et al.，1989，Science，243: 217-220）の後で脊椎動物 deltex特異的プローブでサザン・ハイブリダイゼーシ ョンを行うことによって、種々の細胞型から DNA の脊椎動物 deltex遺伝子を検 出することができる。一実施態様によれば、サザン・ハイブリダイゼーションを 使用して脊椎動物 deltexの遺伝子結合を測定することができる。ノーザン・ハ イブリダイゼーション解析は脊椎動物 deltex遺伝子の発現を測定するのに使用 することができる。種々の発生状態または活性状態において、脊椎動物 deltex 遺伝子の発現につき、様々な細胞型をテストすることができる。サザン・ハイブ リダイゼーションおよびノーザン・ハイブリダイゼーションに対するハイブリダ イゼーション条件のストリンジェンシーを調整すれば、使用した特定の脊椎動物 deltexプローブに対して望ましい関連度をもつ核酸を確実に検出することがで きる。 制限エンドヌクレアーゼ・マッピングを用いて、脊椎動物 deltex遺伝子の遺 伝子構造の概略を決定することができる。制限エンドヌクレアーゼ切断によ って得られる制限地図は DNA 配列分析によって確認することができる。あるい は、塩基配列がわかれば、それから制限地図を得ることができる。 DNA 配列分析は当業界に公知の方法いずれによっても行うことができ、以下の 例示には限定されないが、マキサム・ギルバートの方法(1980，Meth．Enzymol. ，65: 499-560)、サンガーのジデオキシ法（Sanger et al.，1977,Proc.Natl．A cad．Sci．U.S.A.，74: 5463）、T7 DNA ポリメラーゼの使用（Taborand Richar dson，米国特許第 4,795,699 号；Sequenase，U.S．BiochemicalCorp.）、Taq ポリメラーゼ、自動 DNA 配列決定機の使用（例えば、Applied Biosystems，Fos ter City，CA）などを挙げることができる。ヒト deltex遺伝子の cDNA 配列を 第 2A-C（SEQ ID NO: 11）に示す。この配列については下記第６節で説明する。 5.4.2. タンパク質分析 脊椎動物 Deltexタンパク質のアミノ酸配列は、DNA 配列から導くことができ る。あるいはまた、例えば、自動アミノ酸シークエンサーを使って、直接タンパ ク質の配列決定を行うことによっても知ることができる。代表的な脊椎動物 Del texタンパク質のアミノ酸配列は実質上、第 2A-C(SEQ ID NO: 12)に記載の配列 からなる。その詳細については以下の第６節に述べる。 脊椎動物 Deltexタンパク質の配列は、親水性度分析によっても特性化するこ とができる（Hopp and Woods，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，78: 382 4）。親水性分布を使用して脊椎動物 Deltexタンパク質の疎水性領域および親水 性領域並びにその領域をコードする遺伝子配列の対応領域を同定することができ る。親水性領域は免疫原性であると考えられている。 第二に、構造解析（Chou and Fasman，1974，Biochemistry，13: 222）をおこ なって、特定の二次構造と思われる脊椎動物 Deltexタンパク質の領域を同定す ることができる。 操作、翻訳、二次構造予測ならびにオープン・リーディング・フレーム予測お よびプロッティングは、当分野で利用できるコンピュータ・ソフトウェア・ プログラムを使っても実施することができる。 構造解析についてはその他の方法も使用することができる。以下の例示に限ら れないが、構造解析法としては、X線結晶学法（Engstorm，1974，Biochem. Exp ．Biol.，11:7-13）およびコンピュータ・モデリング（Fletterick and Zoller 編、1986,Computer Graphics and Molecular Modeling,in Current Communicati ons in Molecular Biology，Cold Sprin Harbor Laboratory,Cold Spring Harbo r，New York）を例示することができる。 5.5. 脊椎動物 Deltexタンパク質およびその誘導体の抗体産生 本発明によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質、その断片若しくはその他の誘 導体、またはその類似体を免疫原として使用し、そのような免疫原を認識する抗 体を産生してもよい。以下の例示に限られないが、そのような抗体としてはポリ クローナル、モノクローナル、キメラ、単一鎖、Fab 断片および Fab 発現ライ ブラリーを例示することができる。好ましい態様によれば、特異的に脊椎動物 D eltexタンパク質に結合する抗体が産生される。さらに好ましい態様によれば、 脊椎動物 Deltexタンパク質（例えばほ乳類、好ましくはヒト）に結合するが（ 全長の）Drosophila Deltexタンパク質とは結合しない抗体が産生する。好まし い態様によれば、そのような抗体は、免疫原として、Drosophila melanogaster と脊椎動物 Deltexタンパク質との間にほとんど保存されない領域を使用して産 生される。 他の態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質の特定のドメインに対する抗 体が産生される。一実施態様によれば、Notchに結合する脊椎動物 Deltex断片に 結合する抗体が産生される。また他の態様によれば、抗体は脊椎動物 Deltexの 最初の 230 アミノ末端アミノ酸を含む分子と結合する。さらに別の態様によれ ば、抗体は、脊椎動物 Deltexの最初の 200 アミノ酸以下を含む脊椎動物 Delte xのアミノ末端断片と結合する。さらに他の態様によれば、抗体は第二の Deltex 分子と結合する脊椎動物 Deltexの断片と結合する。 脊椎動物 Deltexタンパク質、その誘導体または類似体のポリクローナル抗 体を製造するには、当業界に公知の種々の方法を使用することができる。一実施 態様によれば、第 2A-C 図に記載の配列またはそのサブ配列をもつ脊椎動物Delt exタンパク質のエピトープに対するウサギポリクローナル抗体を産生することが できる。抗体産生には、例えば、ウサギ、マウス、ラットなどを含む（これらに 限定されない）種々の宿主動物を、天然または合成の脊椎動物 Deltexタンパク 質またはその誘導体（例えば断片）を注射して免疫することができる。宿主の種 に応じて、フロインド（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのごときミネ ラルゲル、リソレシチンやプルロニックポリオール、ポリアニオンのごとき界面 活性物質、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホール・リンペット・へモシア ニン、ジニトロフェノールのような種々のアジュバントおよび BCG（bacille Ca lmette-Guerin）および corynebacterium parvum のごとき非常に有用なヒトア ジュバントを使用して免疫反応を増強することができる。 好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質の親水性部分（例えば、H opp and Woods 法（1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，78: 3824）によっ て同定される）を用いることによって、ポリクローナル抗体またはモノクローナ ル抗体を産生する。 脊椎動物 Deltexタンパク質配列またはその類似体に対するモノクローナル抗 体を産生するには、連続細胞株培養によって抗体分子を産生する手法であればい かなる方法も使用することができる。例えば、Kohler および Milstein によっ て初めて開発されたハイブリドーマ法（1975，Nature，256: 495-497）ならびに トリオーマ法、ヒト B細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.，1983，Immunolog y Today，4:72）およびヒトモノクローナル抗体を産生するための EBV-ハイブリ ドーマ法（Cole et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy ，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-96）を利用することができる。本発明のさらに 他の態様によれば、モノクローナル抗体を無菌動物で産生することができる（19 89年12月28日のPCT Publication No．WO 89/12690）。本発明によれば、ヒト抗 体を使用してもよく、ヒト抗体は、ヒトハイブリドーマ を使用して（Cote et al.，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，80: 2026-2 030）または、イン・ビトロでヒトＢ細胞を EBV ウィルスにより形質転換して（ Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R． Liss，Inc.，pp．77-96）、または当分野で公知のその他の方法を使って得るこ とができる。実際、脊椎動物 Deltexタンパク質に特異的なマウス抗体分子の遺 伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子と一緒にスプライシングすることによって 「キメラ抗体」を作るために開発された技術（Morrison et al.，1984，Proc．N atl．Acad．Sci．U.S.A.，81: 6851-6855；Neuberger etal.，1984，Nature，31 2: 604-608；Takeda et al.，1985，Nature，314: 452-454）も本発明に従って 利用することができ、そのような抗体は本発明の範囲に含まれる。非ヒト抗体は Winter の方法によりヒト化することができる（米国特許第5,225,539号参照） 。 本発明によれば、単一鎖抗体を産生する方法として記載された手法（米国特許 第4,946,778号）に準じて、脊椎動物 Deltexタンパク質特異的単一鎖抗体を産生 することができる。本発明のさらに他の態様によれば、Fab発現ライブラリー(Hu se et al.，1989，Science 246:1275-1281)について記載された方法を利用する ことにより、脊椎動物 Deltexタンパク質、その誘導体または類似体に対して所 望の特異性をもつモノクローナル Fab断片を迅速かつ簡単に同定することができ る。 分子のイディオタイプ（結合ドメイン）を含む抗体断片およびその他の誘導体 は公知の方法で生成することができる。例えばそのような断片としては、以下の 例示に限られないが、抗体分子のペプシン消化で産生することができるF(ab’)₂ 断片、F(ab’)₂断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成できるFab ’断片、および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成で きる Fab断片を挙げることができる。 抗体産生において、所望の抗体をスクリーニングするには、当分野に周知の手 法、例えば、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）によって行うことが できる。例えば、脊椎動物 Deltexタンパク質の特定のドメインを認識す る抗体を選択するには、そのようなドメインを含む脊椎動物 Deltex断片に結合 する生成物について、生成ハイブリドーマをアッセイすればよい。ヒト Deltex タンパク質に特異的な抗体の選択は、ヒト Deltexタンパク質に対するポジティ ブ結合および Drosophila Deltexタンパク質に対する結合の欠如に基づいて行う ことができる。 具体的な実施態様によれば、脊椎動物 Deltexのリン酸化エピトープに特異的 な抗体が産生する。 前記抗体は、本発明のタンパク質配列の局在化および活性に関する当分野に周 知の方法において、これらタンパク質を画像化し、適当な生理学的試料中でその レベルを測定するなどに利用することができる。脊椎動物 Deltex（通常Notchと 一緒に局在しているので）の抗体は、以下に述べる診断法において、Notchおよ び/または脊椎動物 Deltexの細胞内分布を決定するのに使用することができる。 本発明のさらに他の態様によれば（下記参照）、抗脊椎動物Deltex抗体およびそ の結合ドメインを含む断片は治療剤として有用である。 5.6. 脊椎動物 Deltexタンパク質、その誘導体および類似体 本発明はさらに、脊椎動物 Deltexタンパク質および脊椎動物 Deltexタンパク 質の誘導体（断片を含むがこれらに限定されない）および類似体を提供する。本 発明はまた、脊椎動物 Deltexタンパク質誘導体およびタンパク質類似体をコー ドする核酸も提供する。一態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質は前記第5 .1節に記載の脊椎動物 deltex核酸によりコードされる。さらに詳細には、その タンパク質、誘導体または類似体は、マウス；ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤ ギ、ブタ等のごとき家畜；ネコ、イヌ等の愛玩動物；またはその他の飼育動物ま たは霊長類の Deltexタンパク質である。 脊椎動物 Deltexに関連する誘導体および類似体の産生・使用は本発明の範囲 に含まれる。特定の態様において、前記誘導体または類似体は機能的に活性であ る。すなわち、完全長の野生型脊椎動物 Deltexタンパク質に関連する一または それ以上の機能的活性を発揮する能力をもっている。 特に脊椎動物 Deltex誘導体は、機能的に等価の分子を与える置換、付加また は欠失によって脊椎動物 deltex配列を変更することにより作ることができる。 本発明の実施には、塩基コード配列の縮重により脊椎動物 deltex遺伝子として 実質的に同じアミノ酸配列をコードするその他の DNA配列も用いることができる 。これらの DNA配列としては、その配列内で機能的に等価なアミノ酸基をコード する異なったコドンの置換によって変更され、従って無変化の変更（silent cha nge）となる、脊椎動物 deltex遺伝子のすべてまたはその一部からなる塩基配列 を例示することができる。しかしながら、DNA配列はこの例示だけに限定される ものではない。同様に、本発明の脊椎動物 Deltex誘導体としては、一次アミノ 酸配列として、その配列内で機能的に等価なアミノ酸基が置換されている、従っ て無変化の変更となる、変更配列を含む脊椎動物 Delteｘタンパク質のすべてま たはその一部からなるアミノ酸配列を含むものを例示することができる。しかし ながら、上記誘導体はこの例示だけに限定されるものではない。例えば、その配 列内の一またはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用する同様な 極性の他のアミノ酸で置換することができ、従って結果としては無変化の変更と なる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバー から選択してもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、 ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファ ンおよびメチオニンがある。極性の中性アミノ酸としては、例えば、グリシン、 セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが ある。陽性荷電（塩基性）アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リジンおよ びヒスチジンがある。陰性荷電（酸性）アミノ酸としては例えば、アスパラギン 酸およびグルタミン酸がある。 特定の態様によれば、本発明は、脊椎動物 Deltexタンパク質の少なくとも10 個の（連続）アミノ酸からなる脊椎動物 Deltexタンパク質の断片からなるタン パク質、またはその断片を含むタンパク質を提供する。その他の態様によれば、 その断片は脊椎動物Deltexタンパク質の少なくとも20個または50個のアミノ酸か らなる。具体的には、そのような断片は35、100または200個の アミノ酸以下である。脊椎動物 Deltexの誘導体または類似体としては、ヒトDel texまたばその断片と実質的に相同であるペプチドを例示できるがこれらには限 定されない。 特定の態様によれば、脊椎動物 Deltexの誘導体または類似体にはヒト Delte xのアミノ末端180アミノ酸（1 - 180）と実質的に相同であるぺプチドが含まれ るがこれらには限定されない。一態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質の アミノ末端領域は、同一サイズのヒト Deltexのアミノ末端アミノ酸配列のうち 少なくと30％の同一性をもっている。他の態様によれば、この同一性は35％より も大である。好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexのアミノ末端アミノ酸の 同一性は45％よりも大きい。さらに好ましい態様によれば、この同一性は55％よ りも大きい。最も好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexのアミノ末端アミノ 酸の相同性は、同一サイズの対応ヒト Deltexのアミノ末端アミノ酸配列の、65 ％よりも大きい。 さらに他の具体的な態様によれば、脊椎動物 Deltexの誘導体または類似体と しては、ヒト Deltexの中心領域（アミノ酸181 - 441）またはその断片と実質的 に相同であるペプチドが例示できるがこれらには限定されない。一態様によれば 、脊椎動物 Deltexタンパク質の中心領域は、同一サイズの対応ヒトDeltex配列 について、少なくと30％の同一性をもっている。他の態様によれば、この同一性 は35％よりも大である。好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexの中心領域と ヒト Deltexとのアミノ酸同一性は45％よりも大きい。さらに好ましい態様によ れば、この同一性は55％よりも大きい。最も好ましい態様によれば、同一サイズ の対応ヒト Deltexのアミノ酸に対する脊椎動物 Deltexの中心アミノ酸の相同性 は、65％よりも大きい。 さらに、脊椎動物 Deltexの誘導体または類似体としては、ヒト Deltexのカル ボキシ末端アミノ酸またはその断片と実質的に相同であるペプチドが例示できる がこれらには限定されない。一態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質のカ ルボキシ末端アミノ酸（カルボキシ末端 180 アミノ酸）は、同一サイズのアミ ノ酸配列について、少なくと45％の同一性をもつている。他の態様によ れば、この同一性は50％よりも大である。好ましい態様によれば、脊椎動物 Del texのアミノ末端アミノ酸の同一性は55％よりも大きい。さらに好ましい態様に よれば、この同一性は60％よりも大きい。最も好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexのアミノ末端アミノ酸の相同性は、65％よりも大きい。 さらに他の好ましい態様によれば、脊椎動物 Deltexの誘導体または類似体は 、Drosophilaおよびヒト Deltex間に保存された領域を含む（第８節参照）。 本発明の脊椎動物 Deltexタンパク質の誘導体および類似体は、当業界に公知 の種々の方法で製造することができる。これら誘導体および類似体を得るための 操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで起こればよい。例えば、クローン化さ れた脊椎動物 deltex遺伝子は、当分野で知られている多数の方法によって改変 ・修飾することができる（Sambrook et al.，1990，Molecular Cloning，A Labo ratory Manual，2d ed.，Cold Spring Habor Laboratory，ColdSpring Harbor， New York）。その配列は、制限エンドヌクレアーゼにより適当なサイトで開裂し 、次いで必要があればさらに酵素的修飾を行い、単離し、インビトロでの連結に 付することができる。脊椎動物 Deltexタンパク質の誘導体または類似体をコー ドする遺伝子を製造する場合、翻訳終結シグナルによって妨害されることなく、 改変された遺伝子が確実に、所望の脊椎動物 Delteｘ活性をコードする遺伝子領 域の、脊椎動物 deltex遺伝子と同じ翻訳リーディングフレーム内にあるように 注意を払わなければならない。 さらに、脊椎動物 Deltexをコードする核酸配列は、インビトロまたはインビ ボにおいて突然変異処理して翻訳の開始および/または終結配列を創出および/ま たは破壊することができ、あるいは、コード領域に変更を加えたりおよび/また は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を生成し、または既存の制限エンドヌクレ アーゼ部位を破壊してさらにインビトロ改変・修飾を行うことができる。当分野 に公知であればいかなる突然変異誘発法も使用することができ、例えば、インビ トロ特定部位突然変異誘発（Hutchinson et al.，1978，J．B が、これらの例示には限定されない。 脊椎動物 deltex配列の操作はタンパク質レベルで行ってもよい。翻訳中また は翻訳後、桐えば、アセチル化、リン酸化、カルボキシル化、アミド化、公知の 保護基/ブロック基による誘導体化、タンパク分解、抗体分子または他の細胞リ ガンドとの結合などによって、異なるように改変された脊椎動物 Delteｘタンパ ク質の断片、その他の誘導体または類似体も本発明の範囲に含まれる。以下の例 示に限られないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プ ロテアーゼ、NaBH₄、アセチル化、フォルミル化、酸化、還元などによる特異的 な化学的開裂のごとき多数の化学的改変修飾はいずれも、公知の手法に従って行 うことができる。 好ましい観点によれば、精製された脊椎動物 Deltexタンパク質またはその誘 導体は、種々の程度にリン酸化され、またはその代わりに脱リン酸化される。分 子のリン酸化状態は、Notch機能の細胞内シグナル・トランスダクションの役割 にとって重要である。リン酸化は適当なキナーゼ（例えば、可能なら cdc２また はCK II）と反応させることによって行うことができる。脱リン酸化は適当なフ ォスファターゼとの反応によって行うことができる。 さらに脊椎動物 Deltexタンパク質の類似体および誘導体は化学的に合成する ことができる。例えば、所望のドメインを含む、あるいはインビトロで所望の活 性を伝達する、脊椎動物 Deltexタンパク質の一部に対応するペプチドは、ペプ チド合成機を利用して合成することができる。さらに所望であれば、脊椎動物 D eltexタンパク質配列に、置換または付加として、古典的でないアミノ酸または 化学的アミノ酸類縁体を導入することができる。古典的でないアミノ酸としては 、以下の例示に限られないが、普通のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸 、4-アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸 、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルア ラニン、β-アラニン、β-メチルアミノ酸類、Cα-メチルアミノ酸およびNα-メ チルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸を挙げることができる。 特定の実施態様によれば、脊椎動物 Deltex誘導体は、そのアミノまたはカ ルボキシ末端においてペプチド結合により異なるタンパク質に結合した、脊椎動 物 Deltexタンパク質またはその断片（好ましくは、少なくとも脊椎動物 Deltex タンパク質のドメインまたはモチーフ、または脊椎動物 Deltexタンパク質の少 なくとも10個のアミノ酸からなる）キメラまたは融合タンパク質である。一態様 によれば、そのようなキメラタンパク質は、そのタンパク質（異なるタンパク質 のコード配列にインフレーム結合した脊椎動物 Deltexコード配列を含む）をコ ードする核酸のリコンビナント発現によって製造する。そのようなキメラタンパ ク質は、適当なコードフレームにおいて、当分野に公知の方法により、所望のア ミノ酸配列をコードする適当な核酸配列同士を連結し、得られたキメラ生成物を 周知の方法で発現させることによっても作ることができる。あるいは、そのよう なキメラ生成物は、例えば、ペプチド合成機を使用するタンパク質合成法によっ て作ってもよい。特定の態様は、脊椎動物 Deltexタンパク質のドメインまたは モチーフ、例えば、Notchタンパク質または第二の Deltexタンパク質に結合する 部分、SH-3結合ドメイン、リング-H2-亜鉛フィンガードメインなどを含む脊椎動 物 Deltexタンパク質の断片からなるキメラタンパク質に関する。特定の態様に よれば、キメラ核酸は、非 Deltexタンパク質に結合した脊椎動物 Deltex Notch -結合断片からなる融合タンパク質をコードして構築することができる。他の例 として（この例に限られないが）、本発明によれば、脊椎動物 deltex遺伝子お よび「Notchグループ」のメンバーである他の遺伝子双方のコード部を含むリコ ンビナント分子を構築することができる。さらに他の特定の態様は、少なくとも ６個のアミノ酸の脊椎動物Deltexタンパク質断片を含むキメラタンパク質に関す る。ヒト Deltexまたは種々の Notch断片を含む融合タンパク質の構築および発 現の例は、第７節で説明する。 誘導体および類似体のその他の具体的な態様は以下の副節および以下の実施例 の節において詳説する。 5.6.1. 脊椎動物 Deltexの一またはそれ以上のドメインを含む当該タンパク 質の誘導体 特定の態様によれば、本発明は脊椎動物 Deltexの誘導体および類似体、特に 、例えば、限定されないがNotchタンパク質（またはその ANK リピートを含む分 子）と結合する領域、第二の Deltexタンパク質またはその一部と結合する領域 、SH3-結合ドメイン、またはリング-H2-亜鉛フィンガードメインを含む脊椎動物 Deltexタンパク質の一またはそれ以上のドメインを含むかまたはそれらドメイ ンからなる脊椎動物 Deltexの断片および当該断片の誘導体を提供する。特定の 態様によれば、上記脊椎動物 Deltexの誘導体は、前記ドメインの一またはそれ 以上のすべてまたは一部を欠いていてもよい。 ヒト Deltexタンパク質のドメインに関する特定の態様によれば、上記ドメイ ンはおよそ以下のアミノ酸配列からなる（下記第6.1.1.節参照）。 SH3結合ドメイン：SEQ ID NOS: 17-21 リング-H2-亜鉛フィンガードメイン：SEQ ID NO: 25 他の結合断片、例えば、上記断片より小さい断片は常法によって、例えば、そ のような断片をコードする核酸を構築し結合をアッセイすることによって同定す ることができる（例えば、下記第７節に記載の相互トラップ法により）。 ヒト以外の種の脊椎動物 Deltexタンパク質に関する特定の実施態様によれば 、脊椎動物 Deltexの特定ドメインを含む断片は、ヒト Deltexタンパク質の特定 ドメインに最も相同性をもつ各脊椎動物 Deltexタンパク質のドメインを含む断 片である。 本発明者らは Drosophila DeltexがヒトNotch-1およびNotch-2に結合すること を明らかにしたが、これはヒトと Drosophila Deltex間に生物化学活性の進化的 保存があることを示唆している。本発明者らはさらに、ヒト DeltexがヒトNotch -1およびNotch-2に結合すること、そしてヒト Deltexが Drosophila Notchに結 合することも明らかにした。アッセイに相互トラップシステム（下記に説明）を 採用して、欠失解析により、タンパク質−タンパク質相互作用を起こすNotchお よび Deltexのドメインを系統的に検討した。Deltex-Deltex相互作用、Deltex-N otch相互作用の両方とも検出された。Drosophila Delt ex，Drosophila NotchおよびヒトNotchの様々な断片（下記）をコードする欠失 構築物が合構築物（LexA または ACT 融合体）として発現されたのでこれをアッ セイした。 発現した Drosophila Deltexの断片Ａ - Ｄ（それぞれ SEQ ID NOS: 13-16） を第 4A-Bに示す。 第５図は、本発明者らが検出した Deltex-Deltex相互作用の概略を示すもので ある。断片Ａは断片Ａと相互作用する（同型相互作用）。断片Ｂは断片Ｂと相互 作用する（同型相互作用）。断片Ｃは断片Ｃと相互作用する（同型相互作用）。 さらに本発明者らは断片Ｃと断片Ｂ間の相互作用も検出した。しかしながら、断 片 C-B 間の相互作用は、断片Ｃを「餌」として（すなわち LexA融合体として） テストした場合にのみ検出することができる。断片Ｂが餌である場合、この相互 作用は検出されない。その他の上記相互作用はすべて、どの断片を餌として使用 するかには関係なく、相互作用を生じる。断片Ａはアミノ酸１-303からなる。断 片Ｂはアミノ酸306-486からなる。断片Ｃはアミノ酸514-737からなる。 Notchおよび Deltex間の異型相互作用は、Notchの ANK リピート領域と Delte xの断片Ｄ（これは断片Ａの一部であリアミノ酸1-204を含む）との間に起こる。 Drosophila Notch ANKリピートならびに両方のヒト Notchタンパク質（TAN-1お よびhNによってコードされる）の ANK リピートを、この相互作用アッセイでテ ストしたところ、断片Ｄに対する陽性の結合を示した。ANK リピート領域を含む 以下の断片を使用した。Drosophila Notchアミノ酸：1889-2076（Wharton et al .，1985，Cell，43: 567-581 に従ってナンバーリング）；ヒトNotch TAN-1アミ ノ酸：1826-2146；ヒトNotch hNアミノ酸：1772-2093。すべての断片は断片Ｄと の相互作用を示した。図６にこの相互作用の概略を図示する。 特定の実施態様によれば、図 4A-B に示すように、Drosophilaの断片Ａ（SEQ ID NO: 13）、断片Ｂ（SEQ ID NO: 14）、断片Ｃ（SEQ ID NO: 15）および断片 Ｄ（SEQ ID NO: 16）に最も相同性をもつ脊椎動物 Deltex領域が提供され る。図５および図６に、断片同士の結合相互作用を矢印で示す。A-D と相同性の 領域もまた図５および図６に示す結合相互作用をもつと考えられる。従って、ア ミノ酸1-237、238-391、392-620およびSEQ ID NO: 12の1-175はそれぞれDrosoph ila 断片 A-D に相当する。一またはそれ以上の前記領域を含む分子も提供され る。従って、例を挙げると、SEQ ID NO: 12のアミノ酸番号 1-237を含む分子も Notchアンキリンリピートに結合すると考えられている。 さらに本発明は、前記タンパク質と Notchまたは第二の Deltexタンパク質と の相互作用の阻害剤（例えば、ペプチド阻害剤）も提供する。 Notchタンパク質またはDeltexタンパク質（またはその誘導体）に対する結合 能力は、相互トラップ技術（下記第７節）のようなインビトロ測定によって検証 することができる。 そのような測定に使用する Notchまたは脊椎動物 Deltexタンパク質またはそ の断片をコードする核酸は、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、霊長類源および公 知の遺伝子同族が同定できるその他のあらゆる動物から単離することができる。 例えば、DeltexまたはDeltex誘導体と結合して発現測定できる ANK リピートを 含む Notchタンパク質またはその一部は、ヒトhN、ヒトTAN-1、Xenopus およびD rosophila など、あらゆるNotch同族体からも誘導することができる。 ヌクレオチドコード配列の縮重があるので、本発明を実施するのに、上記ドメ インと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の DNA配列を用いてもよい。こ のような DNA配列としては、以下の例示に限られないが、配列内の機能的に等価 なアミノ酸残基をコードする相異なるコドンの置換によって改変された、すなわ ちサイレントな変更を生じる、脊椎動物 deltex遺伝子の全部またはその一部を 含むヌクレオチド配列を挙げることができる。同様に、本発明の脊椎動物 Delte xタンパク質、その断片または誘導体は、一次アミノ酸配列として、配列内の残 基をこれと機能的に等価なアミノ酸残基で置換した改変配列（「保存的」変更） を含むドメインのアミノ酸配列全部またはその一部を含むものであるが、これら には限定されない。 本発明の誘導体、類似体およびペプチドは、当分野に公知の種々の方法で産生 することができる。この産生操作は遺伝子またはタンパク質レベルであることが できる。 さらに、核酸配列はインビトロまたはインビボで突然変異を誘発することがで き、その配列操作もタンパク質レベルで行うことができる。 さらに類似体およびペプチドは化学的に合成することができる。 5.7. 脊椎動物 Deltexタンパク質、誘導体および類似体のインビトロ・アッセ イ 種々の方法により、インビトロで脊椎動物 Deltexタンパク質、誘導体および 類似体の機能的活性を測定することができる。 一態様によれば、例えば、抗脊椎動物 Deltex抗体に対する結合について野生 型脊椎動物 Deltexの結合能力または競合能力を測定しようとする場合、当分野 に公知の様々な免疫測定法を使用することができる。そのような免疫測定法とし ては、以下の例示に限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA （enzyme linked immunosorbent assay）、 「サンドイッチ」イムノアッセイ 、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散法、インサイ チュイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用 いて）、ウエスタンブロット、沈殿反応、凝集法（例えば、ゲル凝集法、血球凝 集法）、完全固定法、免疫蛍光法、プロテインＡ測定法、免疫電気泳動法などの 手法を用いて、競合的および非競合的アッセイシステムを利用することができる 。一実施態様によれば、抗体結合は一次抗体の標識を検出することによって検出 することができる。他の実施態様によれば、一次抗体はこの一次抗体に対する二 次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらに他の実施態 様によれば、二次抗体は標識されている。当分野では、イムノアッセイにおいて 結合を検出する方法は、数多く知られており、それらの方法も本発明の範囲に含 まれる。 他の実施態様によれば、第二の Deltexタンパク質またはその一部に対する Notchタンパク質またはその一部（例えば、Notchアンキリンリピート）の結合を 仲介する能力を測定しようとする場合には、後記第７節に記載のごとき測定を行 うことができる。 当業者に公知となるその他の方法も本発明の範囲に含まれる。 他の態様によれば、脊椎動物 Deltexタンパク質とNotchタンパク質との結合を 阻害するかまたは減少させる分子を同定する方法が提供される。このような方法 で、Deltexのアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。その方 法は、Notchタンパク質と Deltexタンパク質間の結合を阻害または減少させる能 力についてテストすることが望ましい一またはそれ以上の分子の存在下、Notch タンパク質と脊椎動物 Deltexタンパク質とをNotchタンパク質および Deltexタ ンパク質間の結合ができるように暴露する工程、および、Notchタンパク質に対 する Deltexタンパク質の結合を阻害または減少させる分子を同定する工程から なる。当分野に公知のいろいろな結合アッセイ法のいずれも、そのような方法を 行うのに使用することができ、例えば、以下の例示に限定されるものではないが 、酵母相互トラップアッセイ、細胞培養インビトロ凝集法、精製Notchタンパク 質および Deltexタンパク質を用いる可溶性結合アッセイを挙げることができる 。特定の態様として以下の方法を例示する。別々の誘発性プロモーターの下に N otchおよび deltexをもつプラスミド発現構築物と一緒に、培養細胞をコトラン スフェクションする。これらの細胞においてまずNotch発現が起こって細胞表面 への適切な局在化が達成される。次いでDeltex発現が起こる。その後、これらの 細胞はDeltexを発現する細胞とともに凝集され、相互接触点においてNotchおよ び Deltexの相互キャップを形成する（Singer J.，1992，Science，255: 1671-1 677; Fehonetal.，1990,Cell，61: 523-534; Heitzler，etal.，1991，Cell，64 : 1083-1092参照）。上記の条件下、DeltexはNotchに対する結合のためキャップ を形成したNotchと共に局在化する。次いで、Notchと Deltex間の結合を阻害す る能力についてテストすることが望ましい一またはそれ以上の分子（好ましくは 精製された分子）の存在下、これらの細胞をインキュベーションする。Notchに 対する De ltexの結合を阻害又は減少させる分子は、細胞質を通して Deltexの局在化の増 大をもたらす。このように増大した局在化は、当分野に公知の方法によって測定 することができる（例えば、Deltexの抗体で免疫蛍光染色）。この方法はまた、 それぞれ Deltexおよび Notchに対する結合を媒介する NotchおよびDeltex誘導 体を用いても行うことができる。 5.8. 治療への使用 本発明は、本発明の治療用化合物を投与することによって細胞原基または細胞 分化疾患の治療を提供する。そのような治療用化合物としては（本発明では以下 「治療薬」と称する）、脊椎動物 Deltexタンパク質およびその類似体と誘導体 （断片を含む）（例えば前記）；その抗体（例えば前記）；脊椎動物Deltexタン パク質、類似体または誘導体をコードする核酸（例えば前記）；および脊椎動物 deltexアンチセンス核酸を例示することができる。上記したように、本発明の アンタゴニスト治療薬は脊椎動物 Deltexの機能および/またはNotchの機能と拮 抗するかまたは阻害する治療薬である。そのようなアンタゴニスト治療薬は、例 えば、脊椎動物 Deltexと他のタンパク質（例えば、Notchタンパク質）との結合 を阻害する能力、または、好ましくはインビトロあるいは細胞培養でアッセイさ れる公知の Notchまたは脊椎動物 Deltexの機能を阻害する能力に基づいて、適 当な公知のインビトロ測定法により同定するのが最も望ましい。また遺伝子アッ セイ（例えば、Drosophila またはマウスにおいて）を使用してもよい。好まし い実施態様によれば、アンタゴニスト治療薬は、Notchまたはその抗体に対する 結合を仲介する脊椎動物 Deltex断片のごとき、機能的に活性な断片を含むタン パク質またはその誘導体である。他の特定の態様によれば、そのようなアンタゴ ニスト治療薬は、Notchまたは脊椎動物 deltexアンチセンス核酸（本明細書の第 5.11節参照）と結合する脊椎動物 Deltex断片を含む分子を発現することができ る核酸である。以下に述べるように、組織の発生歴によってアンタゴニストまた はアゴニスト治療薬のどちらが望ましいかがわかるから、特定の治療薬の効果お よび患部組織の治療にその投与を指 示するかどうかを判定するには、適当なインビトロまたはインビボの測定を利用 するのが好ましいことに留意すべきである。 本発明の他の態様によれば、脊椎動物 deltex遺伝子の一部を含む核酸をアン タゴニスト治療薬として使用し、相同組み換えによる脊椎動物 deltexの不活性 化を促進する（Koller and Smithies，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.， 86: 8932-8935; Zijlstra et al.，1989，Nature，342: 435-438）。 本発明のアゴニスト治療薬は前記のように、脊椎動物De1texの機能を促進する 。そのようなアゴニスト治療薬としては、以下の例示に限られないが、脊椎動物 Deltexに対する結合を仲介するNotch部分、すなわち、ANK反復を含むタンパク 質および誘導体、前記をコードする核酸（投与するとインビトロでそのコード産 物を発現することができる）を挙げることができる。 本発明の治療薬のさらなる記載及び供給源についてはさらに本明細書のセクシ ョン5.1から5.7に記載されている。 所望の脊椎動物 Deltexの性質、例えば、Notchとの結合、細胞内リガンドとの 結合を保持または阻害する分子は、それぞれ、そのような性質およびその生理学 的相関の誘発剤または阻害剤として治療に使用することができる。特定の態様に よれば、Notchに結合する脊椎動物 Deltexの一部配列を含むペプチド（例えば、 アミノ酸6-50または15-25；特に約10、15、20または25のアミノ酸の範囲のペプ チド）を使用してNotch機能と拮抗させることができる。特定の態様によれば、 そのようなアンタゴニスト治療薬を使用して、増加したNotch発現に関連するヒ トまたは他の悪性腫瘍（例えば、子宮頸癌、結腸癌、乳癌、側頭鱗癌腫（下記参 照））を治療または予防する。脊椎動物De1texの誘導体または類似体は、前記例 示の方法に限定されるものではないがそれら公知方法によって、所望の活性をテ ストすることができる。例えば、Notch ANKリピートに結合するDe1tex断片を含 む分子（セクション７参照）は、ヒト Deltexの（または他の種の配列の）欠失 突然変異体を発現させ、以下の実施稠セクションに記載する相互トラップシステ ムなどいくつかの方法のいずれかによって、発現産物とNotchとの結合を測定す ることによって得ることができ選択することができる。特定の一態様によれば、 ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって所望の活性をもつペプ チドを選択することができる。 そのようなスクリーニングは、例えば、NotchまたはNotch ANK リピートを含む 分子との結合性を測定することによって行うことができる。 本発明のアゴニストおよびアンタゴニスト治療薬は細胞原基の疾患に有用な治 療薬である。アゴニスト治療薬は以下の疾患に治療用として投与される（予防的 な投与を含む）。（1）Notchまたは脊椎動物Deltex機能の欠如または（正常また は所望のレベルに比べて）減少したレベルに関連する病気または疾患、例えば、 Notchまたは脊椎動物De1texタンパク質の欠如、遺伝的欠陥、生物学的不活性ま たは活性不足または発現不足の患者；および（2）インビトロ（またはインビボ ）アッセイ（下記参照）によって脊椎動物 Deltexアゴニストの投与を必要とす ることがわかった病気または疾患。Notchまたは脊椎動物 Deltex機能の欠如また は減少レベルは、例えば、患者の組織試料（例えば、生検組織）を得て、これを 、発現したNotchまたは脊椎動物Deltexタンパク質のタンパク質レベル、構造お よび/または活性についてインビトロで測定することによって、簡単に検出する ことができる。従って当分野で知られた多数の標準的な方法を使用することがで き、以下の例示には限定されないが、Notchまたは脊椎動物 Deltexタンパク質を 検出および/または可視化するイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット、 免疫沈降に次いで SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う方法、イムノサ イトケミストリーなど）および/または、Notchまたは脊椎動物 deltexのmRNAそ れぞれを検出および/または可視化することによってNotchまたは脊椎動物 Delte x発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザン法、ドッ トブロット、in situハイブリダイゼーションなど）を挙げることができる。 特定のアゴニスト治療薬またはアンタゴニスト治療薬の投与を必要とするかど うかを判定するのに使用することができるインビトロアッセイとしては,患者組 織試料を培養して成長させ、治療薬に暴露するかまたは投与して、組織試料に対 する治療薬の効果を観察するインビトロ細胞培養アッセイが挙げられる。一態様 によれば、患者が悪性腫瘍に罹患している場合、その悪性腫瘍から得た細胞試料 をプレートアウト(plate out)し培養成長させた後、その細胞を治療 薬に暴露する。インビボでの治療用として、悪性腫瘍細胞の生存または成長を阻 害する治療薬を選択する（例えば、末端分化を促進することにより）。当分野で 知られた多数の標準的な方法を使用して、そのような生存および/または成長を 評価することができる。例えば細胞増殖は、³H-チミジンの取り込みを測定する ことによって、直接的な細胞の計数により、プロトオンコジーン（例えば、fos 、myc）のような公知の遺伝子または細胞周期マーカーの転写活性変化を検出す ることにより測定することができる。また細胞生存性はトリパンブルー染色によ って測定でき、分化は視覚的に形態の変化などに基づいて測定することができる 、などである。特定の局面によれば、悪性腫瘍細胞培養物を個別に（1）アゴニ スト治療薬、および（2）アンタゴニスト治療薬に暴露する。測定結果から、ど ちらのタイプの治療薬に治療効果があるかがわかる。 他の態様によれば、それぞれ過増殖性または低増殖性疾患を有するまたはその 疑いがある組織から患者の細胞試料について、細胞増殖の阻害または促進のうち 、所望の効果を示すほうの治療薬を使用する。そのような過増殖性または低増殖 性疾患としては以下のセクション5.8.1〜5.8.3に記載の疾患が含まれるが、これ らには限定されない。 さらに他の特定の態様によれば、本発明の治療薬は、罹患した患者型の神経細 胞から神経再生/軸索伸長のインビトロ促進を示す神経損傷または神経系の変性 疾患（セクション5.8.2参照）を治療するのに使用される。 さらに、本発明のアンタゴニスト治療薬は、Notchまたは Deltex優性活性化表 現型（「機能獲得」突然変異）に関連することが決定または公知の病気または疾 患にも必要とされる。アゴニスト治療薬の投与は、Notchまたは Deltex優性のネ ガティブ表現型（「機能喪失」突然変異）に関連することが決定または公知の病 気または疾患に必要とされる。Notchタンパク質の様々な構造ドメインの機能は 、hsp 70熱ショックプロモーター、並びに眼特異的プロモーター（Rebay et al. ，1993，Cell，74: 319-329参照）の下、一連の Drosophila Notch欠失突然変異 体の異所性発現によって、インビボで調べられている。二クラスの優性表現型が 観察された。一方はNotch機能喪失型突然変異体、他 方はNotch機能獲得型突然変異体と考えられる。優性「活性化」表現型は、最も 細胞外の配列を欠くタンパク質の過発現によるものであったが、一方優性「ネガ ティブ」表現型は最も細胞内の配列を欠くタンパク質の過発現から生じた。この 結果から、細胞外ドメインがリガンド結合を仲介するリセプターとして、Notch が機能することによって、細胞質ドメインによる発生シグナルを伝達しているこ とがわかった。観察された表現型はまた、細胞内ドメインの ANKリピート領域が Notch仲介シグナルトランスダクション事象（細胞内機能）に重要な役割を果た していることを示唆している。本発明者らは Drosophila deltexがNotchの ANK リピート領域と結合することを示した。 いろいろな特定の態様によれば、患者の病気に関連する細胞型のうち代表的な 細胞を用いてインビトロアッセイを行い、そのような細胞型に本発明の治療薬が 所望の効果をもっているかどうかを判定することができる。 他の態様によれば、腫瘍前段階の疑いがある患者の組織試料の細胞を同様にプ レートアウトまたはインビトロで成長させ、本発明の治療薬に暴露する。より正 常な（すなわち、腫瘍前段階、腫瘍段階、悪性腫瘍段階、または転換表現型）細 胞表現型を生じる治療薬を治療用として選択する。当分野で知られた多数の標準 的な方法を使用して、腫瘍前段階、腫瘍段階、転換または悪性腫瘍型表現型が存 在するかどうかを評価することができる。例えば、転換表現型に関連する特徴（ インビボの腫瘍形成能力に関連する一連のインビトロの特徴）として、より丸く なった細胞形態、ゆるんできた原質（substratum）付着、接触阻害の喪失、アン カー依存性の喪失、プラスミノーゲン活性化剤のようなプロテアーゼの放出、増 加した糖輸送、減少した血清要求、胎児性抗原の発現、250,000ダルトンの表面 タンパク質の消失などが挙げられる（Luria et al.，1978，General Virology， 3d Ed.，John Wiley & Sons，New York，pp．436-446参照）。 他の特定の態様によれば、上記のインビトロアッセイは、治療対象の特定患者 から得られた細胞試料よりもむしろ、治療または予防が望ましい悪性腫瘍、腫瘍 段階または腫瘍前段階の疾患から誘導されるか、またはそれら疾患に関連 する特徴を示す細胞株を使って、または本発明に従い効果を発揮する神経細胞ま たはその他の細胞型から誘導される細胞株を使って、行うことができる。 特定の態様によれば、アンタゴニスト治療薬として使用できるNotchおよび/ま たは Deltex機能のアンタゴニストは、プロテアーゼまたはそのタンパク分解活 性断片に共有結合した、Notch結合を伝達するDe1texタンパク質またはその一部 を含む分子である。そのようなプロテアーゼは、Notchタンパク質を開裂できる ことが好ましい。上記分子は、好ましくは融合タンパク質である（すなわち、共 有結合はペプチド結合である）。Deltexタンパク質は脊椎動物のタンパク質であ ることが好ましい。最も好ましいのはヒトである。従って本発明は、Deltexが細 胞中で結合する（例えば、Notch）タンパク質を標的化するかまたは不活性化す る方法を提供する。本発明の方法によれば、Deltexタンパク質またはその一部お よびプロテアーゼ配列を含む分子を化学的な方法または分子生物学的方法によっ て作る。この分子（例えば融合タンパク質）を、当分野に公知の手法で細胞に導 入する（例えば、その発現が分子内で起こるような分子をコードする核酸をもつ 細胞のトランスフェクション）。細胞内部で、この分子はNotchおよび/または他 のDeltex結合相手と結合することができる。その結合の際、分子のプロテアーゼ 部分はその分子が結合しているタンパク質を分解してこれを不活性化する。例え ば、ヒト DeltexのドメインＩとプロテアーゼサーモリシンを含む融合タンパク 質は細胞に導入されると、Notchに結合してこれを分解し、それによってNotchの シグナル回路を不活化する。プロテアーゼの代わりに、例えば、タンパク質と結 合することによってタンパク質機能を不活化する分子を使用することもできる。 本発明のアンタゴニスト治療薬は以下の疾患に治療用として投与される（予防 的な投与を含む）。（1）Notchまたは脊椎動物 Deltex機能が亢進したレベル（ 正常または望ましいレベルに比べて）と関連する病気または疾患、例えば、Notc hまたは脊椎動物 Deltexタンパク質が過剰に発現されるか過剰活性となる場合； および（2）インビトロ（またはインビボ）アッセイによって脊椎動物 Deltexア ンタゴニストの投与が有用であると判明した病気または疾患。Not chまたは脊椎動物 Deltex機能の上昇レベルは、上記の方法によってタンパク質 および/またはRNAを定量することによって、簡単に検出することができる。上記 したように、患者組織試料の細胞または適当な細胞株または細胞型を使うインビ トロアッセイにより、治療の有用性を判定することができる。 5.8.1. 悪性腫瘍 上記のように本発明の効果をアンタゴニストまたはアゴニスト治療薬でテスト することができ、従って治療の有用性を指示して治療することができる悪性腫瘍 および腫瘍前段階の症状としては、以下のセクション5.8.1および5.9.1に記載の 症状を挙げることができるが、これらの例示には限定されない。 その細胞型がインビトロ（および/またはインビボ）でテストでき、かつ適 当な測定結果を観察の上本発明に従って治療される悪性腫瘍および関連疾患を表 １に掲げるが、これらの例には限定されない（そのような疾患の総説として、Fi shman et al.，1985，Medicine，2d Ed.，J.B．Lippincott Co.，Phi1adelphia 参照）。 第１表悪性腫瘍および関連疾患 白血病 急性白血病 急性リンパ球白血病 急性骨髄球性白血病 骨髄芽球性 前骨髄球性 骨髄性単球性 単球性 赤血球白血病 慢性白血病 慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病 慢性リンパ球白血病 真性多血球血症 リンパ腫 ホジキン病 非ホジキン病 多発性骨髄腫 ワルデンストレーム高分子グロブリン血症 重鎖疾患 固形腫瘍 肉腫および癌腫 線維肉腫 粘液肉腫 脂肪肉腫 軟骨肉腫 骨肉腫 背索腫 血管肉腫 内皮肉腫 リンパ管肉腫 リンパ管内皮肉腫 滑膜性腫瘍 中皮腫 Ewing腫瘍 平滑筋肉腫 横紋筋肉腫 結腸癌腫 膵臓癌 乳癌 子宮癌 前立腺癌 側頭鱗細胞癌腫 基底細胞癌腫 腺癌 汗腺癌腫 皮脂腺癌 乳頭状癌 乳頭状腺癌 嚢腫癌 髄様癌 気管支癌 腎臓細胞癌腫 肝癌 胆管癌腫 脈絡膜癌 精上皮腫 胎生期癌 Wilm腫瘍 頸癌 睾丸腫瘍 肺癌腫 小細胞肺癌腫（small cell lung carcinoma） 膀胱癌腫 上皮癌腫 膠腫 星状細胞腫 髄芽細胞腫 頭蓋咽頭腫 皮細胞腫 松果体腫 血管芽細胞腫 聴音神経腫癌（acousti cneuroma） 乏枝神経膠腫 髄膜腫 黒色腫 神経芽細胞腫 網膜芽細胞腫 特定の態様によれば、悪性腫瘍または増殖異常変化（dysproliferative chang es）（化生および異形成のごとき）は、頸管、食道および肺などの上皮組織で治 療または予防する。 結腸および頸管の悪性腫瘍は、そのような非悪性腫瘍組織に対するヒトNotch の発現増加として現れる（1994年４月14日付で公開されたPCT Publication WO 9 4/07474、その全文を本明細書中に援用する）。従って特定の態様によれば、本 発明のアンタゴニスト治療薬の有効量を投与することによって、結腸または頸管 の悪性腫瘍を治療または予防する。結腸癌および頸管癌中で増加するNotchの発 現は、さらに多くの癌性および過増殖性症状が、アップレギュレートされたNotc h示すことを示唆している。従って特定の態様によれば、例えば、乳癌、側頭鱗 癌腫、精上皮腫、黒色腫および肺癌などの種々の癌ならびにその他の過増殖性の 疾患は、本発明のアンタゴニスト治療薬を投与することによって、治療または予 防することができる。 5.8.2. 神経系疾患 本発明のアンタゴニストまたはアゴニスト治療薬を用いて、上記のように本発 明の効果をテストでき、かつ治療の有用性を示して治療することができる細 胞型を含む神経系疾患として、以下の例示に限られないが、神経系損傷、軸索の 切断、ニューロンの一部消失または変性、髄鞘脱落のいずれかをもたらす病気ま たは疾患を挙げることができる。本発明に従って患者(ヒト及び非ヒト脊椎動物 患者を含む)の治療が可能な神経系疾患には、以下のような中枢（脊髄、脳を含 む）または末梢神経系の疾患が含まれるが、これらの例示には限定されない。 （i）物理的損傷によって生じた、または手術に関連する疾患を含む外傷性疾 患、例えば、神経系の一部を切断する疾患または圧迫性損傷、 （ii）脳梗塞、脳虚血、脊髄梗塞、脊髄虚血を含む、神経系の一部における酸 素欠乏がニューロンの損傷または死をもたらす虚血性疾患、 （iii）神経系関連悪性腫瘍または非神経系組織から誘導された悪性腫瘍のい ずれかである悪性腫瘍組織によって神経系の一部が破壊または損傷を受けている 悪性疾患、 （iv）例えば、膿瘍によって、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹または 単純へルペスウイルスによる感染に関連した、またはライム（Lyme）病、結核、 梅毒に関連した感染の結果として神経系の一部が破壊されたり損傷を受けたりし た変感染性疾患、 （v）以下の例示に限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハ ッチンソン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症に関連する変性を含む変性プロセス の結果として、神経系の一部が破壊されたり損傷を受けたりした変性疾患、 （vi）以下の例示に限定されないが、ビタミンB₁₂欠乏症、葉酸欠乏症、ウェ ルニッケ病、タバコ-アルコール中毒弱視、マルキャファーヴァ・ビギャミ病（ 脳梁の一次変性）およびアルコール中毒性小脳変性を含む栄養障害または代謝障 害によって、神経系の一部が破壊されたり損傷を受けたりした栄養病または栄養 疾患に関連する疾患、 （vii）以下の例示に限定されないが、糖尿病（糖尿病性神経症、ベル麻痺） 、全身性紅斑性狼瘡、癌腫またはサルコイドーシスを含む全身性疾患に関連する 神経疾患、 （viii）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む毒物により生じる疾患、 （ix）以下の例示に限定されるものではないが、多発性硬化症、ヒト免疫不全 ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症または種々の病因、進行性多病巣白脳症およ び中枢性脳橋ミエリン溶解症を含む髄鞘脱落病によって、神経系の一部が破壊さ れたり損傷を受けたりした髄鞘脱落疾患。 神経系疾患の治療に有用な本発明の治療薬は、ニューロンの生存または分化を 促進する生物活性をテストすることによって選択してもよい（セクション5.8も 参照）。例えば、以下の効果のういちいずれかを発揮する治療薬は本発明に有用 であり得る。 （i）培養におけるニューロンの生存時間増加、 （ii）培養またはインビボでニューロンの成長増加、 （iii）培養またはインビボでニューロン関連分子、例えば運動ニューロンに 関してコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの 産生増加、または、 （iv）インビボでニューロン機能不全症候減少。 上記効果は当分野に公知のあらゆる方法によって測定することができる。好ま しい、限定的でない態様によれば、ニューロン生存の増加はArakawaら（1990，J ．Neurosci.，10: 3507-3515）に記載の方法によって測定することができる。ニ ューロンの成長増加は、Pestronkら（1980，Exp．Neurol.，70: 65-82）またはB rownら（1981，Ann．Rev．Neurosci.,4:17-42）に記載の方法によって測定する ことができる。またニューロン関連分子の産生増加は、測定対象の分子に応じて 、バイオアッセイ、酵素法、抗体結合、ノーザンブロット法、などによって測定 することができる。運動ニューロンの機能不全は、運動ニューロン疾患の物理的 兆候、例えば、衰弱、運動ニューロン伝導速度または機能不全を評価して測定す ることができる。 特定の態様によれば、本発明に従い治療できる運動ニューロン疾患には、以下 の例示に限定されるものではないが、運動ニューロンおよび神経系のその他成分 に影響し得る、梗塞、感染、トキシン暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患 または悪性腫瘍；ならびに筋萎縮性側索硬化症のようなニューロンに選択的な影 響を与える疾患が含まれ、例えば、限定的ではないが、進行性脊髄性筋萎縮症、 進行性延髄麻痺、一次側索硬化症、幼児性および若年性筋萎縮症、進行性延髄小 児麻痺（Fazio-Londe症候群）、小児麻痺および後ポリオ症候群、遺伝性運動知 覚神経症（Charcot-Marie-Tooth病）を例示できる。 5.8.3. 組織修復および再生 本発明の他の態様によれば、本発明の治療薬は、限定さないが、良性の増殖不 全疾患治療を含む、組織の再生および修復を促進するのに使用される。特定の態 様は、肝硬変（傷形成によって正常な肝再生過程が取り戻された状態）、ケロイ ド（肥厚傷）生成（傷形成プロセスが正常な修復を妨げる皮膚の毀損）、乾癬（ 皮膚の過剰な増殖および適切な細胞原基決定の遅れによって特徴づけられる通常 の皮膚状態）および禿頭（最終分化毛嚢（Notchに富む組織）が適正に機能しな い状態）の治療に関する。 Deltexアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、最終分化してない細胞（ 例えば、幹および前駆細胞）の分化状態を操作することができる。例えば、幹細 胞をそのようなアゴニストに暴露すると、その分化および成長条件下のインビト ロ培養によって幹細胞集団を拡大することができる。そのような幹細胞は、その 後代細胞のインビボ再集団用の移植および組織再生に利用される（前記に使用で きる方法については、Artavanis-Tsakonas et al.により1995年９月29日に出願 された米国特許出願第08/537,210号、発明の名称「Notch経路を用いる非最終分 化細胞の操作」参照。この出願明細書全文を本発明の明細書中に援用する）。例 えば、前駆体細胞（例えば、ヒト幹または前駆細胞）の増大法は、細胞を脊椎動 物（例えばヒト）Deltexタンパク質またはその機能的活性部分を細胞の分化を阻 害するのに有効な量と接触させ、その細胞が増殖するよう、その細胞を細胞増殖 条件に暴露する工程を含む。種々の態様によれば前駆体細胞は、以下の例に限ら れないが、造血性前駆体細胞、上皮前駆体細胞、腎臓前駆体細胞、神経前駆体細 胞、皮膚前駆体細胞、骨芽前駆体細胞、軟骨細 胞前駆体細胞、肝前駆体細胞、および筋肉細胞であることができる。 5.9. 予防的使用 5.9.1. 悪性腫瘍 本発明の治療薬は、これを投与して限定的ではないが表１に掲げた疾患を含む 腫瘍または悪性腫瘍状態の進行を防ぐことができる。上記のように、治療薬がア ッセイにおいてそのような疾患の治療または予防に有用性があるとわかった場合 に投与が行われる。特に、過形成、化生からなる非腫瘍細胞の成長が起こった場 合、さらに特定すれば、異形成が起こった場合、腫瘍または癌に先行する進行に ついて知られた、またはその疑いがある症状において、そのような予防的な使用 が必要とされる（異常な成長症状の総説として、Robbins and Angell，1976，Ba sic Pathology，2d Ed.，W.B．Saunders Co.，Philadelphia,pp．68-79参照）。 過形成は、構造または機能に重要な変更を生じることなく、組織または器官の細 胞数が増加するなどの制御された細胞増殖の形である。１例を挙げると、子宮内 膜過形成は子宮内膜癌に先行することが多い。化生は、１タイプの成体または完 全に分化した細胞が他のタイプの成細胞に置換する、制御された細胞増殖の形で ある。化生は上皮または結合組織細胞に起こり得る。異型性化生はやや無秩序な 化生的上皮を含む。異形成は大抵の場合癌の前兆であり、主に上皮に見出される 。異形成は、個々の細胞の均一性喪失および細胞の構造的配向喪失を含む、非腫 瘍性細胞増殖の最も無秩序な形である。異形成細胞は異常に大きい濃く染色され る核を持っていることが多く、かつ多態性を示す。慢性的な刺激または炎症があ る場合には、特徴的に異形成が生じ、頸管、呼吸気道、口腔および胆嚢に発見さ れることが多い。 過形成、化生または異形成として特徴づけられる異常な細胞増殖の代わりに、 またはこれに加えて、患者の細胞試料によってインビボであらわれる、またはイ ンビトロであらわれる、１またはそれ以上の転換された表現型または悪性腫瘍の 表現型が存在すれば、それは本発明の治療薬を予防的/治療的に投与することが 望ましいことを示すものであり得る。上記したように、転換された表現 型のそのような特徴は、形態変化、ゆるんできた基質付着、接触阻害の喪失、ア ンカー依存性の喪失、プロテアーゼの放出、増加した糖輸送、減少した血清要求 、胎児性抗原の発現、250,000ダルトンの表面タンパク質の消失などが挙げられ る（転換された表現型または悪性腫瘍の表現型に関連する特徴については、同前 のpp.84-90を参照のこと）。 特定の態様によれば、白斑、良性として出現する上皮の過形成的または異形成 的病変、ボーエン病、インサイチュ癌腫は、予防的対応が望ましいことを示す前 腫瘍病変である。 他の態様によれば、線維細胞嚢胞病（嚢胞過形成、乳腺異形成、特に腺疾患（ 良性上皮過形成））は予防的対応が望ましいことを示す兆候である。 さらに他の態様によれば、一またはそれ以上の以下に記載する悪性腫瘍化しや すいファクターを示す患者は、有効量の治療薬を投与することによって処置され る。悪性腫瘍化しやすいファクターとは、悪性腫瘍に関連する染色体の転座（例 えば、慢性骨髄性白血病のフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫のｔ(14;18 )など）、家族性ポリープ腫またはガードナー症候群（結腸癌の疑わしい兆候） 、良性モノクローナル免疫グロブリン異常症（多発性骨髄腫の疑わしい兆候）お よびメンデル（遺伝的）遺伝パターンを示す癌または前癌病をもつ人の一等親族 （例えば、家族性結腸ポリープ腫、ガードナー症候群、遺伝性多骨症、多腺性内 分泌腺腫様増殖症、アミロイド産生および褐色細胞腫を伴う髄様胸腺癌、Peutz- Jeghers症候群、Von Recklinghausen神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈小体 腫瘍、眼内黒色癌、色素性乾皮症、血管拡張性運動失調症、Chediak-Higashi症 候群、先天性色素欠如症、ファンコニ再生不良性貧血およびブルーム症候群；Ro bbins and Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B．Saunders Co.，Phi1 adelphia，pp．112-113参照）など。 さらに他の特定態様によれば、本発明のアンタゴニスト治療薬はヒト患者に投 与され、乳癌、結腸癌、または子宮頸癌の進行を防ぐ。 5.9.2. 他の疾患 他の態様によれば、本発明の治療薬はセクション5.8.2に記載の神経系疾患ま たはセクション5.8.3に記載した他の疾患（例えば、肝硬変、乾癬、ケロイド、 禿頭）を予防するのに投与することができる。 5.10. 治療または予防の有用性の実例 本発明の治療薬は、所望の治療または予防活性についてインビボでテストする ことができる。例えば、そのような化合物はヒトでのテストを行う前に、ラット 、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含む、これらの例に限定されな い適当な動物モデル系を使ってテストすることができる。インビボテストについ てはヒトに投与する前に、当分野で公知の動物モデル系を使用することができる 。 5.11. 脊椎動物 Deltex発現のアンチセンス制御 本発明は、脊椎動物 Deltexまたはその一部をコードする遺伝子またはcDNAの アンチセンスである少なくとも６塩基のヌクレオチドの核酸を治療または予防に 使用することを提供する。本明細書中で使われる「アンチセンス」とは、配列相 補性があるために、脊椎動物 deltex RNA（好ましくはmRNA）の一部にハイブリ ダイズすることができる核酸をいう。そのようなアンチセンス核酸は本発明のア ンタゴニスト治療薬として有用であり、先のセクション5.8およびそのサブセク ションに記載した疾患の治療または予防に使用することができる。 本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖のRNAまたはDNAまたはその 誘導体であるオリゴヌクレオチドであり得、細胞に直接投与することができる。 また導入された外来性の配列の転写によって細胞内で産生することもできる。 特定の態様によれば、本発明で提供される脊椎動物 deltexアンチセンス核酸 は、腫瘍型または疾患が脊椎動物 deltex遺伝子またはNotch遺伝子を発現するこ とを証明できる（インビトロまたはインビボで）、腫瘍または他の疾患を治療す るのに使用することができる。そのような証明はRNAまたはタンパク 質の検出によって行うことができる。 本発明はさらに、下記セクション5.12に記載のとおり、薬剤学的に許容できる 担体に本発明の脊椎動物 deltexアンチセンス核酸の有効量を含む薬剤組成物を 提供する。本発明はまた、本発明の薬剤組成物を投与することからなる疾患（セ クション5.8および5.9に記載した疾患のごとき）の治療および予防方法も提供す る。 他の態様によれば、本発明は、本発明のアンチセンス脊椎動物 deltex核酸含 有組成物の有効量と共に細胞を提供する工程を包含する、原核または真核細胞に おいて脊椎動物 deltex核酸配列の発現を阻害する方法に関する。 脊椎動物 deltexアンチセンス核酸およびその使用について、以下に詳述する 。 5.11.1. 脊椎動物 deltexアンチセンス核酸 脊椎動物 deltexアンチセンス核酸は少なくとも６個のヌクレオチドであり、 好ましくはオリゴヌクレオチド（６〜約50個のオリゴヌクレオチドの範囲）であ る。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも10個のヌクレオチド 、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも100個のヌクレオチド、または少 なくとも200個のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAある いはそのキメラ混合物または誘導体、またはその改変体であってもよく、また一 本鎖でも二本鎖でもよい。オリゴヌクレオチドは、その塩基部分、糖部分、また はリン酸骨格で修飾され得る。オリゴヌクレオチドはペプチドのようなその他の 付加基を含んでもよいし、また細胞膜を通る輸送促進剤（例えば、Lestinger et al.，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，86:6553-6556; Lemaitre et al. ，1987，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，84:648-652; 1988年12月15日公開のP CT公開WO 88/09810参照）または血液-脳関門（1988年４月25日公開のPCT公開WO 89/10134参照）、ハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤（例えば 、Krol et al.，1988，BioTecllniques，6: 958-976参照）またはインターカレ ーション試薬（例えば、Z on，1988，Pharm．Res.，5: 539-549参照）であってもよい。 本発明の好ましい局面によれば、脊椎動物 deltexアンチセンスオリゴヌクレ オチドが提供され、これは一本鎖DNAであることが好ましい。最も好ましい局面 によれば、このオリゴヌクレオチドは、SH3-結合ドメインまたは脊椎動物deltex のNotch結合ドメインまたは亜鉛フィンガードメインをコードする配列に対する 配列アンチセンスを含み、最も好ましくはこれらドメインはヒト deltexのもの である。オリゴヌクレオチドはその構造のどの位置であっても、当分野で一般的 に知られている置換基により改変することができる。 脊椎動物 deltexアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の、これらに限ら れない群から選ばれる少なくとも一つの改変された塩基部分を含んでいてもよい 。改変された塩基の例を以下に挙げる。５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシ ル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４ -アセチルシトシン、５-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５-カルボ キシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチル ウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-Ｄ-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6 -イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジ メチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン 、５-メチルシトシン、N6-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチ ルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、ベータ-Ｄ-マンノシ ルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２ -メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、ワ イブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２-チオシトシン、５-メチル- ２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウ ラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（v）、５-メチ ル-２-チオウラシル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-2-カルボキシプロピル)ウラシル、( acp3)wおよび2,6-ジアミノプリン。 さらに他の態様によれば、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２-フルオ ロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む、これらの例に限定さ れない群から選ばれる少なくとも一つの修飾された糖部分を含んでいる。 さらに他の態様によれば、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートホスホ ロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジ アミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルム アセタールまたはその類縁体からなる群から選ばれる少なくとも一つの修飾され たリン酸骨格を含んでいる。 さらに他の態様によれば、オリゴヌクレオチドはα-アノマーオリゴヌクレオ チドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは相補性 RNA と特定の二本鎖ハイ ブリッドを形成し、その場合通常のβ-ユニットとは反対に、その鎖は互いに平 行になる（Gautier et al.，1987，Nucl．AcidsRes.，15: 6625-6641）。 オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション によりトリガーされる架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションによりトリガー される開裂剤などとコンジュゲートしていてもよい。 本発明のオリゴヌクレオチドは、当分野で公知方法、例えば、自動 DNA 合成 機（例えばBiosearch，Applied Biosystemsなどから市販されているごとき）を 使用して合成することができる。例を挙げると、ホスホロチオエートオリゴヌク レオチドは、Steinらの方法（1988，Nucl．Acids Res.，16: 3209）により合成 することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された口径のガ ラスポリマー支持体を使って作ることができる（Sarin et al.，1988, Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A.，85: 7448-7451）。 具体的な態様によれば、脊椎動物 deltex アンチセンスオリゴヌクレオチドは 、触媒RNA、すなわちリボザイムを含む（例えば、1990年10月４日公開のPCT 国 際公報 WO 90/11364; Sarveretal.，1990，Science，247: 1222-1225）。他の態 様によれば、オリゴヌクレオチドは2'-0-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al .，1987，Nucl．Acids es.，15: 6131-6148）、または、キメラRNA-DNA類縁体で ある（Inoue et al.，1987，FEBS Lett.，215: 327-330）。 さらに他の態様によれば、本発明の脊椎動物 deltexアンチセンス核酸は外来 配列から転写することによって細胞内で作られる。例えば、細胞に取り込まれる ようにベクターをインビボで導入し、その細胞内にベクターまたはその一部を転 写すれば、本発明のアンチセンス核酸（RNA）を作ることができる。そのような ベクターは脊椎動物 deltexアンチセンス核酸をコードする配列を含む。そのよ うなベクターは転写されて所望のアンチセンス RNA を産生することができれば 、エピソームのままでもよいし、染色体に組み込まれてもよい。そのようなベク ターは、当分野において標準的な組み換え DNA 技術によって構築することがで きる。ベクターは、脊椎動物細胞の複製および発現に使用されるプラスミド、ウ イルスまたはその他公知のものであってよい。脊椎動物delteｘアンチセンス RN A をコードする配列の発現は、脊椎動物細胞、好ましくはヒト細胞において働く 当分野で知られているあらゆるプロモータによって行うことができる。そのよう なプロモーターは誘発性であってもまた構成性であってもよい。そのようなプロ モーターとしては、これらの例に限られないが以下の例を挙げることができる。 SV40 初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon，1981，Nature，290: 304- 310）、ラウス肉腫ウイルスの3'長鎖末端リピートに含まれるプロモーター（Yam amoto et al.，1990，Cell，22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモ ーター（Wagneret al.，1981，Proc．Natl.Acad．Sci．U.S.A.，78: 1441-1445 ）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al.，1982，Nature，296: 39-42）など。 本発明のアンチセンス核酸は、脊椎動物 deltex 遺伝子、好ましくはヒトdelt ex遺伝子 RNA 転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含む。絶対相補性であ るほうが望ましいが、必要ではない。本明細書中でいう「RNAの少なくとも一部 に対して相補的な」配列とは、RNAにハイブリダイズすることができ、安定な二 本鎖を形成するに十分な相補性をもっている配列を指す。二本鎖脊椎動物 delte xアンチセンス核酸の場合には従って、二本鎖 DNA の一方の鎖をテストすればよ く、三本鎖をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は相補性度およびア ンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダ イズする核酸が長ければ長いほど、それが含み得る脊椎動物 deltexRNAとミスマ ッチする塩基は多くなり、それでもなお安定な二本鎖を形成する（またはケース により三本鎖）。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定する常法を 用いて、許容できるミスマッチの程度を確認することができる。 5.11.2 脊椎動物 Deltexアンチセンス核酸の治療における有用性 脊椎動物 deltexアンチセンス核酸は、脊椎動物 deltexまたはNotchを発現す ることが示されている細胞型の悪性疾患または他の障害を治療（または予防）す るために用いることができる。特定の実施態様においては、悪性疾患は子宮頸癌 、乳癌若しくは結腸癌、または鱗状腺癌である。そのような発現を試験できる悪 性、新生物性および前新生物性の細胞としては、上記第5.8.1節および第5.9.1節 に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい 実施態様においては、一本鎖ＤＮＡのアンチセンス脊椎動物 deltexオリゴヌク レオチドが用いられる。 脊椎動物 DeltexまたはNotchＲＮＡを発現する悪性の（特に腫瘍）細胞型は、 当業者に公知のさまざまな方法により同定できる。このような方法としては、脊 椎動物 DeltexまたはNotchに特異的な核酸とのハイブリダイゼーション(たとえ ば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション 、in situハイブリダイゼーション)、その細胞型からのＲＮＡの in vitroでNot chまたは脊椎動物 Deltexに翻訳される能力の観察、イムノアッセイ等が挙げら れるが、これらに限定されるものではない。好ましい態様においては、治療に先 立って、患者の原発性腫瘍組織をNotchまたは脊椎動物 Deltexの発現について、 例えば免疫細胞化学またはin situハイブリダイゼーションによってアッセイす ることができる。 製剤学的に許容される担体中の有効量の脊椎動物 deltexアンチセンス核酸を 含む本発明の医薬組成物は(第5.12節参照)、Notchまたは脊椎動物 deltex ＲＮ Ａまたはタンパク質を発現するタイプの悪性疾患を有する患者に投与することが できる。 特定の障害または病態の治療に有効な脊椎動物 deltexアンチセンス核酸の量 は、その障害または病態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定するこ とができる。可能ならば、ヒトでの試験および使用に先立って、治療されるべき 腫瘍の型のアンチセンス細胞傷害性を in vitro で、次いで有用な動物モデル系 で測定することが望ましい。 特定の実施態様においては、脊椎動物 deltexアンチセンス核酸を含む医薬組 成物は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルによって投与される。本 発明のさまざまな実施態様において、脊椎動物 deltexアンチセンス核酸を徐放 性にするために、このような組成物を用いることは有用である。特定の実施態様 においては、抗体により特定の認識可能な腫瘍の抗原を標的としたリポソームを 利用することが望ましい(Leonetti ら，1990，Proc．Nat1．Acad．Sci．U.S.A.8 7:2448-2451; Renneisen ら，1990，J．Biol．Chem．265:16337-16342)。 5.12. 治療/予防用の投与および組成物 本発明は、被験者に本発明の治療薬を有効量投与することによる治療（および 予防）の方法を提供する。好ましい態様においては、治療薬は実質的に精製され ている。被験者は好ましくは動物、たとえば、これらに限定されるものではない がウシ、ブタ、ニワトリ等のような動物、および好ましくは哺乳類、最も好まし くはヒトである。 さまざまなデリバリーシステムが知られており、本発明の治療薬を投与するた めに用いることができる。このようなデリバリーシステムとしては、例えば、リ ポソーム、微粒子、マイクロカプセル中へのカプセル化、組換え細胞による発現 、受容体媒介エンドサイトーシス(たとえば、Wu 及び Wu，1987，J．Biol．Chem .262:4429-4432)、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての 治療薬核酸の構築などがある。導入の方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静 脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるが、これらに限定 されるものではない。化合物は、都合の良い経路、たとえば注入（infusion）若 しくはボーラス注射により、または、上皮若しくは粘膜皮膚への塗布からの吸収 （例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等）により投与されてもよいし、他の 生物学的に活性な試薬と共に投与されてもよい。投与は全身的でもよいし局所的 でもよい。さらに、本発明の医薬組成物を適切な経路、たとえば脳室内および鞘 内注入、により中枢神経系に導入することも望ましく、脳室内注入は、たとえば Ommayaレザバーのようなレザバーに取り付けた脳室内カテーテルにより促進して もよい。肺への投与、たとえば、吸入器若しくは噴霧器およびエアロゾル化試薬 を有する製剤を用いる投与もまた採用できる。 特定の実施態様においては、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする部位に 局所的に投与することが望ましい。これは、たとえば、手術中の局所的注入(inf usion)、たとえば手術後の創傷包帯と組合せるような局所的な適用、注射、カテ ーテル、坐剤、または、シアラスティック膜のような膜または繊維などの多孔性 若しくは無孔性またはゼラチン様の素材からなる移植片により実施することがで きるが、これらに限定されない。一つの実施態様によれば、投与は、悪性腫瘍ま たは新生物若しくは前新生物組織の部位（または以前これらがあった部位）への 直接の注入であってもよい。 別の実施態様においては、治療薬は小胞、特にリポソームに入れて送達しても よい（Langer，Science 249:1527-1533(1990); Treat ら，感染性疾患および癌 の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease andCancer)，Lopez-Berestein及びFi1der（編）,Liss，New York，pp.353-365(1 989);Lopez-Berestein，同書，pp．317-327; 一般には同書参照)。 さらに別の実施態様においては、治療薬は制御放出系により送達することもで きる。一つの実施態様においてはポンプを用いることができる(Langer，上掲;Se fton, CRCCrit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Buchwald ら，Surger y88:507(1980); Saudek ら，N．Engl．J．Med．321:574(1989)参照)。別の実施 態様においては、高分子材料が用いられる(制御放出の医学的応用(MedicalApp1i cations of Controlled Release)，Langer及びWise(編),CRC Pres.，BocaRaton ，F1orida(1974); 制御された薬物バイオアベイラビリティー、製薬デザインお よびパフォーマンス(Controlled DrugBioavailability,Drug Product Designand Performance)，Smolen及びBall(編)，Wiley，New York(1984); Ranger及びPepp as，J．Macromol.Sci．Rev．Macromol．Chem．23:61(1983)参照；また、Levy ら ,Science 228:190(1985);Duringら,Ann.Neurol.25:351(1989);Howardら，J．Neu rosurg．71:105(1989)も参照のこと)。さらに別の実施態様においては、制御放 出系を治療の標的、すなわち脳に近接した位置に置くことにより、全身投与の何 分の一かの投与量しか必要としなくなる（たとえば、Goodson，制御放出の医学 的応用(Medical Applications of Controlled Release)、上掲、vol.2,pp.115-1 38(1984)参照)。 他の制御放出系は Langer による総説に論じられている（Science 249:1527-1 533(1990))。 特定の実施態様においては、Notch 発現細胞への治療薬の投与は、治療薬をDe lta（または他のトポリスミックな）タンパク質またはNotchへの結合を仲介する ことができるそれらのタンパク質の一部と連結させることによりおこなわれる。 Notch発現細胞と連結した治療薬とが接触すると、連結した治療薬がそのDelta部 分を介して細胞の表面で Notchと結合した後、連結した治療薬は Notch発現細胞 に取り込まれる。 特定の実施態様においては、治療薬は細胞内に送達される（たとえば、核酸ベ クターからの発現により、またはNotchへの結合能を有するDe1taタンパク質に連 結した後に結合およびインターナリゼーションすることにより、或いは受容体媒 介メカニズム若しくは拡散メカニズムによって)。 治療薬がタンパク質治療薬をコードする核酸であるような特定の実施態様にお いては、核酸は、適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、たとえば、レト ロウイルスベクターの使用（米国特許第 4,980,286号参照)、直接的注入、微粒 子衝撃（例、遺伝子ガン（a gene gun）；Biolistic，Dupont)、脂質若しくは細 胞表面受容体又はトランスフェクション試薬によるコーティング、または核に入 ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連結させて投与すること（た とえば、Joliotら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA88:1864-1868参照）等の 方法により細胞内に入るように投与することによって、コードされたタンパク質 の発現を促進するようにin vivoに投与することができる。また別の方法では、 核酸治療薬を細胞内に導入し、相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡに取り込ませて 発現させることができる。 特定の障害の治療または予防を目的とした特定の実施態様においては、以下の ような投与の形式を用いるのが好ましい。 障害 好ましい投与の形 子宮頚癌 局所 胃腸癌 経口；静脈内 肺癌 吸入；静脈内 白血病 静脈内；体外 転移性癌 静脈内；経口 脳癌 標的；静脈内；鞘内 肝硬変 経口；静脈内 乾癬 局所 ケロイド 局所 禿頭症 局所 脊髄損傷 標的；静脈内；鞘内 パーキンソン病 標的；静脈内；鞘内 運動ニューロン疾患 標的；静脈内；鞘内 アルツハイマー病 標的；静脈内；鞘内 本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効な量 の治療薬および製剤学的に許容される担体からなる。特定の実施態様においては 、「製剤学的に許容される」という用語は、動物、特にヒトへの使用について、 合衆国または州政府の監督官庁により承認されたもの、または合衆国薬局方ある いは他の一般的に認められた薬局方に列挙されたものを意味する。「担体」とい う用語は、治療薬とともに投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒ クルを指す。このような医薬用担体は、水や油のような無菌の液体であってよく 、油にはピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等のような、石油、動物、植 物または合成に由来するものが含まれる。医薬組成物を静脈内投与する場合には 水が好ましい担体である。生理食塩水並びにデキストロース水溶液およびグリセ リン水溶液もまた、特に注入用溶液の液体担体として採用できる。好ましい医薬 用賦形剤としては、でんぷん、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン 、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノス テアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセ リン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。所望により、組成 物は少量の湿潤剤若しくは乳化剤、または pH 緩衝剤を含有することができる。 これらの組成物は溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製 剤 等の形を取ってもよい。組成物は、従来のバインダーおよびトリグリセリドのよ うな担体を加えて坐剤として製剤化してもよい。経口投与用の製剤は、医薬用グ レードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サ ッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的な担体を 含んでいてよい。好適な医薬用担体の例は、E.W.Martin著“Remingtonの薬化学 ”(“Remington's Pharmaceutical Sciences”)に記載されている。このような 組成物は、好ましくは精製された形の治療的に有効な量の治療薬と、患者に適正 な投与ができるような形を与えるのに適当な量の担体とを含有する。製剤化は投 与の様式にふさわしいものでなくてはならない。 好ましい実施態様によれば、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬 組成物の通常の手順に従って製剤化される。他の好ましい実施態様によれば、組 成物は、哺乳類への静脈内投与に適した医薬組成物の通常の手順に従って製剤化 される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の水性等張緩衝液に溶かし た溶液である。必要ならば、組成物は可溶化剤および注入する部位の痛みをやわ らげるためのリグノカインのような局所麻酔薬を含有してもよい。一般に、これ らの成分は別々にまたは剤形単位中に混合されて、たとえば、凍結乾燥された乾 燥した粉末または水を含まない濃縮物として、活性な試薬の量を示したアンプル または袋のような気密性の密閉容器に入れたものとして供給される。組成物が注 入（infusion）により投与されるものである場合、医薬用グレードの無菌水また は無菌生理食塩水が入った温浸ビンで調剤してもよい。組成物が注入により投与 される場合、注入用の無菌水または無菌生理食塩水のアンプルを用意して、投与 の前に処方成分を混合することができる。 本発明の治療薬は、中性または塩の形で処方することができる。製剤学的に許 容される塩には、遊離アミノ基と塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等とか ら形成されたもの、および遊離カルボン酸とナトリウム、カリウム、アンモニウ ム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エ チルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等とから形成されたものが含ま れる。 本発明の治療薬の特定の障害または病態の治療に有効な量は、その障害または 病態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。さらに、最適な投与 量の範囲の決定を補助するために必要に応じてin vitroのアッセイをおこなう。 製剤化において採用すべき正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重 篤度にも依存し、医師の判断とそれぞれの患者の状況に従って決定しなければな らない。しかし、静脈内投与に適した投与量の範囲は、一般的に体重 1kgあたり 活性化合物約20-500μgである。鼻腔内投与に適した投与量の範囲は一般的に約0 .01pg/kg体重から 1mg/kg体重である。有効な用量は、in vitroまたは動物モデ ル試験系から得られた用量-反応曲線から推定される。 坐剤は一般的に活性成分を重量で0.5％から10％の範囲で含む。経口投与用の 製剤は好ましくは10％から95％の活性成分を含む。 本発明はまた、本発明の医薬組成物の一以上の成分を入れた一以上の容器から なる医薬用パックまたはキットを提供する。必要に応じて、この（これらの）容 器には、医薬品あるいは生物学的製品の生産、使用または販売を監督する政府機 関により定められた様式での、生産、使用または販売を監督する官庁によるヒト への投与に対する承認を示す掲示をつけることができる。 5.13． 診断への有用性 脊椎動物 Deltex タンパク質、それらの類似物、誘導体およびサブシークエン ス、脊椎動物 deltex 核酸（およびそれらに相補的な配列）、抗脊椎動物 Delte x抗体は、診断に使用することができる。これらの分子は、脊椎動物 Deltex の 発現に影響を与えるさまざまな病態、疾患および障害を、検出、余後の判定、診 断またはモニタリングするための、またはそれらの治療をモニタリングするため の、イムノアッセイのようなアッセイに使用することができる。特に、このよう なイムノアッセイは、免疫特異的結合が生じるような条件で患者に由来するサン プルを抗脊椎動物 Deltex 抗体と接触させ、抗体によるすべての免疫特異的結合 の量を検出または測定することを含む方法によっておこなわれる。特定の態様に おいては、組織切片中の、好ましくは抗 Notch の結合と共同している、このよ うな抗体の結合は、病的な状態における Notch および/または脊椎動物 Deltex の異常な局在または Notch-脊椎動物 Deltex の異常なレベルの共局在を検出ず るのに使用 できる。特定の実施態様においては、脊椎動物 Deltex の異常なレベルが病的な 状態の指標となる場合に、脊椎動物 Deltex に対する抗体を、患者の組織または 血清サンプル中の脊椎動物 Deltex の存在をアッセイするために使用する。内因 性 Notch タンパク質の脊椎動物Deltex結合能力の異常なレベル、または内因性 脊椎動物 Deltex タンパク質の Notch(または他の脊椎動物 Deltex リガンド)へ の結合能力の異常なレベルは、細胞の発育の障害（例えば、癌等）の指標となる 。“異常なレベル”は、障害を持たない被験者からの類似のサンプル中に存在す るもの、またはこれらに存在するものの標準的なレベルと比較して増加または減 少したレベルを意味する。 使用できるイムノアッセイには、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセ イ、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)、“サンドウィッチ”イムノア ッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、 凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光イムノアッセイ、タ ンパク質Ａイムノアッセイ等のような技術を用いた競合および非競合アッセイ系 が含まれるが、これらに限定されるものではない。 脊椎動物 deltex 遺伝子および関連する核酸配列およびサブシークエンス、た とえば、相補的配列および他のトポリスミックな遺伝子配列は、ハイブリダイゼ ーションアッセイにも使用できる。少なくとも約８のヌクレオチドを含む脊椎動 物 deltex 核酸配列またはそのサブシークエンスは、ハイブリダイゼーションの プローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイを、脊椎動物delt ex の発現および/または上記の活性における異常な変化を伴う状態、障害、また は病的状態を、検出、余後の判定、診断またはモニタリングするために使用する ことができる。特に、このようなハイブリダイゼーションアッセイは、核酸を含 むサンプルを、ハイブリダイゼーションがおこり得るような条件で、脊椎動物 d e1texＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイゼーションすることができる核酸プロ ーブと接触させ、その結果おこるハイブリダイゼーションをすべて検出または測 定することを含む方法によりおこなわれる。 ６．実施例：ヒト deltex のクローニングと特性付け 本明細書に記載されるように、我々はヒト deltex の単離及び分子の特性付け をおこなった。我々はヒト deltex のクローニングおよび配列決定について報告 する。ヒトdeltexには、ショウジョウバエDeltexに見つかっている対応するモチ ーフと同様の位置に、５つの推定SH3 ドメイン結合部位およびリング-H2-ジンク フィンガーがコードされている。 6.1． 結果 6.1.1． ヒトdeltex座の分子クローニング コンピューター及び生化学的スクリーニングを組み合わせて、ヒト deltex を 単離した。まず、ヒト EST(expressed sequence tag)のデータベースをショウジ ョウバエ Deltex のアミノ酸配列に対する相同性についてスクリーングした。 この検索の重要な部分は、データベースの特定のリーディングフレーム中の終止 コドンは配列決定の誤りの結果であるという仮定であった。したがって、終止コ ドンは無視され、オープンリーディングフレームは別のフレームにまで拡張され た。次いで、仮定上のオープンリーディングフレームによりコードされた、予測 されるアミノ酸配列を、ショウジョウバエ deltex の転写ユニットのタンパク質 産物と比較した。 以前本発明者らは、生殖系列（germline）に仲介された形質転換の実験によっ て、ショウジョウバエ deltex の転写ユニットを含むゲノム断片がほとんどのde ltex 変異体欠損を補足することができることを示すことにより、ショウジョウ バエ deltex の転写ユニットを同定した。さらに、このゲノム断片は、ハエがde ltex および nd の二重の変異体となるような、通常ならば致命的な遺伝子の相 互作用からレスキューした。最後に、ノーザン解析によれば、deltex 転写物は 分化しつつある卵母細胞に母親から導入され、ホモ接合変異体の母により産卵さ れた卵の胚形成で観察される母性効果（Xu 及びArtavanis-tsakonas，1990Genet ics 126:665-677）と一致する知見が得られた。転写ユニットと相同なｃＤＮＡ クローンを、胎児ｃＤＮＡライブラリーから単離し、次いで、完全なヌクレオチ ド配列（配列番号：１）および予測されるタンパク生産物（配列番号：２）を決 定した。 ショウジョウバエ Deltex のアミノ酸配列と我々がデータベースの中から仮定 上のオープンリーディングフレームであると推定したものから予測されるアミノ 酸配列とを比較することにより、配列：gnl I dbest Ｉ 24254 T05200 がショウ ジョウバエ Deltex と顕著な相同性を示すことがわかった。T05200の中には、異 なるリーディングフレームの中に五つの保存されたアミノ酸の領域が発見された 。これらは、残基 7-39(配列番号：４)、102-149(配列番号：６)、138-245(配列 番号：８)、および 200-310(配列番号：10)にあり、それぞれショウジョウバエD eltexの残基 545-555(配列番号：３)、565-580(配列番号：５)、581-616(配列番 号：７)、および602-638(配列番号：９)と対応している。これらの配列を表IIに 示し、一致したアミノ酸を太字で示す。 一連の二つの５’プライマー(hdx-1(配列番号：26)およびhdx-2(配列番号：27 ))および二つの３’プライマー(hdx-3(配列番号：28)およびhdx-4(配列番号：29 ))をgnl I dbest Ｉ 24254 T05200のＤＮＡ配列に基づいて合成した。四つの異 なるプライマーの組み合わせと、鋳型としてヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリー （Invitrogene）を用いてPCR反応をおこなった。PCR産物を配列決定し、gnl I dbest Ｉ 24254 T05200 と同一のＤＮＡ配列を持つことを見いだした。 次いで、hdx-1およびhdx-4プライマーを用いて生成したPCR産物を標識し、別 のヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。単離物は配列 決定され(配列番号：11)、予測されるタンパク質を決定した(配列番号：12)(図2 A-C)。配列番号：11の107以下の連続したヌクレオチドはT05200に存在した。次 いで、標準的な技術を適用し、PCR 産物をプローブとして用いて得られたｃＤＮ Ａ単離物を標識して、それ自体をさまざまなヒト組織サンプルから単離されたポ リ(A)＋ｍＲＮＡを含むノーザンブロットをスクリーニングするためのプローブ として使用した。このプローブは、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓お よび脾臓で、5.4-kb ＲＮＡにハイブリダイズすることが観察された。このプロ ーブをサザンハイブリダイゼーションによってズーブロット（zoo blot）（Clon tech から入手したさまざまな種のゲノムEcoRI-消化ＤＮＡを含むブロット）の スクリーニングに使用すると、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシおよび 酵母のゲノムＤＮＡにおいてハイブリダイゼーションが観察された。ハイブリダ イゼーションはウサギおよびニワトリのゲノムＤＮＡでは観察されなかった。 ヒトDeltexタンパク質の構造解析 予測されるヒト Deltex産物は 720アミノ酸を有し、概算された分子量はおよ そ80kDaである。ヒトDeltexの180のアミノ末端残基はショウジョウバエDeltexの 対応するアミノ酸残基とおよそ 33%の同一性を有し、これらのアミノ酸をコード する核酸はおよそ 52%の同一性を有する。ヒト Deltex の 180 のカルボキシ末 端のアミノ酸は、ショウジョウバエDeltexの対応するアミノ酸残基とおよそ48％ の同一性を有し、これらのカルボキシ末端アミノ酸をコードする核酸はおよそ49 %の同一性を有する。 ヒト Deltex タンパク質の構造解析により、Deltex タンパク質間での保存さ れた構造が明らかになった（図３参照）。ショウジョウバエDeltexと同様に、ヒ トDeltex は、リング-H2-ジンクフィンガー（アミノ酸 411-471）（配列番号：2 5）および推定SH3-結合ドメインの両方を有する。ヒト Deltex にはショウジョ ウバ エ Deltex の一次構造を三つのドメインに区切っている二つの opa リピートが 存在しないことは注目される。酵母“相互作用トラップアッセイ”を用いて、そ れぞれのショウジョウバエ Deltex ドメインＩ、IIおよびIIIがホモタイプの相 互作用を仲介することができることを見いだした（下記参照）。 ｉ） ドメインＩ： ドメインＩはショウジョウバエ Deltex の N-末端の 303 アミノ酸およびヒト Deltex の最初の 237 アミノ酸に相当する。ショウジョウバエにおいて、我々は ドメインＩの最初の 175 アミノ酸に対応するヒトDeltexの領域は Notch ANK リ ピートに結合するのに必要十分であり、このドメインの過剰発現は Deltex の機 能不全表現型をレスキューすることを示した。ショウジョウバエ Deltex はヒト Notch-1および２に結合できるので、ヒト Deltex とショウジョウバエのドメイ ンＩとの間に結合活性が保存されているといわれている。さらに、これは実証さ れた（下記参照）。 ii） 推定SH3結合ドメイン： ショウジョウバエ Deltex のドメインIIは推定SH3-結合部位(アミノ酸476-484 )を含む(Matsunoら，1995,Development 121(8):2633-2644)。五つの推定SH3-結 合部位(配列番号：17-21)が、ヒト Deltex（アミノ酸226-377の中）のショウジ ョウバエDeltexのドメイン IIの SH3-結合部位に対応する位置に発見された(表I II)。 SH2 および SH3 ドメインは、がん遺伝子 Src との相同性(Src Homology)に基 づいて名付けられた保存されたタンパク質モジュールである。これらのモチーフ は、多くのシグナル導入経路におけるタンパク質-タンパク質相互作用の仲介に 関連している（Cell 71:359-362; Science 252:668-674; Trends Cell Biol.3:8 -13; FEBS 307:55-61に総説あり)。最近、SH3 ドメインに結合する相補モチ 259:1157-1161)。SH3-BDのコア結合領域はプロリンが豊富でおよそ 10 残基の長 さをもつ。表IIIに示すように、このモチーフは、実験的に SH3 ドメイン（配列 番号：23）に結合したマウスタンパク質から定義されたが、ショウジョウバエDe ltexの推定SH3-結合部位（配列番号：22）およびヒトにおいてこのモチーフ に相当する五つの領域(配列番号：17-21)と一列に並ぶことが示された。これら の領域はDeltexタンパク質の中心に位置する。参考までに、SH3-BDを含むショウ ジョウバエ、サンオブセブンレス(Son of sevenless)(SOS)タンパク質（配列番 号：24）によりコードされたタンパク質の領域を示す。グアニンヌクレオチド交 換因子(GNEF)と推定されるサンオブセブンレス(Son of sevenless)にコードされ たタンパク質は、SH2 および SH3 モジュー=ルのみを含む‘アダプター’タンパ ク質(drk)と結合することが示されたが、結合を仲介する実際の残基は現在は決 定されていない（SimonM.ら,1993,Cell 73:169-177、およびOlivierJ.ら，1993, Cell 73:179-191)。 現在のところ、ショウジョウバエで同定された SH3 を含むタンパク質は６種 のみであるが、これらはどれも Deltex の直接的な結合相手であって、したがっ てNotchの間接的な結合相手であると思われる。 欠失分析をおこなうと、推定 SH3 ドメイン結合部位およびリング-H2-ジンク フィンガーを含むショウジョウバエの Deltex ドメインII-IIIの欠失により Not ch シグナル経路を活性化する能力が著しく減少することから、これらのドメインの 機能的必要条件が提案された。これらの結果はドメインIIおよびIIIは重複して いないことを示している。 iii） リング-H2-ジンクフィンガー： ヒト deltex（配列番号：11のヌクレオチド1734-1916）は、リング-H2-ジンク フィンガー（配列番号：25）をコードしており、リング-H2-ジンクフィンガーは ショウジョウバエ Deltex のドメインIIIに対応するヒト Deltex の部分に配列 番号：12のアミノ酸411-471として現れる。この型のジンクフィンガーはタンパ ク質-タンパク質相互作用に関係していると考えられている。 6.2. 材料および方法 6.2.1. 配列決定および解析 EcoRI-cＤＮＡインサートを、Bluescript KSに両方の向きで直接サブクローニ ングした。二方向欠失を発生させるためのＤＮＡseＩ法（Eberle ら，1993,Biot echniques 14:408)を用いて、インサート上に重複する欠失を作った。その結果 生じた欠失を IBI 自動シークエンサーを用いて解析した。 ＤＮＡ配列決定操作は IntelligeneticのPC-GENE ソフトウェアを用いておこ なった。オープンリーディングフレームの予測およびプロットはウィスコンシン 大学(University of Wisconsin)プログラム C0DONPREFERENCE(Gribshovら，1984 ,Nucl．Acids Res．12:539-549)を用いておこなった。BITNET を通じた GenBank FASTAサーバーによって利用できるFASTAプログラム(Pearson及びLipman,1988,Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA，85:2444-2448)を用いて、推定されるアミノ酸配列 の全部または一部について GenPept および SWISS-PROT データベースを検索し た。 ７．実施例：ヒト Deltex はヒトおよびショウジョウバエNotchに結合する 我々はショウジョウバエにおいて、Deltex と Notch ANK リピートの間に特異 的で直接的な物理的相互作用があることを証明した(Diederich ら，1994,Develo pment 120:473-481)。ヒト Deltex とヒトおよびショウジョウバエ Notch 受容体のさまざまな細胞質ドメインとの間のタンパク質-タンパク質相互 作用を研究するために、いわゆる‘相互作用トラップ’アッセイ技術（Zervosら ，1993，Cell 72:223-232）を用いて酵母における発現の研究を行った。 このアッセイにおいて、一つのタンパク質セグメントを LexA タンパク質のＤ ＮＡ結合ドメインに融合させると、今度はこれが転写を活性化することなくLexA op-lacZレポーター構築物のプロモーターと結合する。これらの構築物はpEGと呼 ばれる。第二の外来のタンパク質セグメントを、それ自体ではＤＮＡと結合しな い酸性転写活性化ドメインに融合する。これらの構築物はpJGと呼ばれる。酵母 細胞中でのこれらの二つのタンパク質の共発現は、外来のタンパク質がもう一方 と物理的に相互作用する場合には、活性化 LexA“ハイブリッド”転写因子の機 能再構築をもたらす。ハイブリッド転写因子の活性は、β-ガラクトシダーゼレ ポーター遺伝子の転写によりモニタリングする。pJG構築物からの融合タンパク 質の発現は、酵母細胞がグルコース培地ではなくガラクトース培地で培養された 場合に誘導される。その結果、正の相互作用はガラクトース培地中でのみ観察さ れる。 酵母の相互作用を用いて試験された構築物は以下の通りである：pEGhDeリtex構 築物はヒトDeリtexのコード領域全体を含む;pJGhNotch-1はアミノ酸1826-2147の ヒトNotch-1のアンキリンリピート領域をコードする；pJGhNotch-2はアミノ酸17 72-2084のヒトNotch-2のアンキリンリピート領域をコードする;pJGhNotchはアミ ノ酸1827-2259のショウジョウバエNotchのアンキリンリピートをコードする；JG FHairless はショウジョウバエのヘアレス(Drosophila Hairless)をコードした 領域全体を含む。 表 IV に示されるように、pEGhDeltex と、pJGhNotch-1、pJGHNotch-2またはp JGHfNotch を同時トランスフェクトされた酵母細胞をガラクトーズ培地で培養し た場合に、β-ガラクトシダーゼ活性の有意な誘導が観察された（表 IV）。これ らの結果は、ヒト Deltexは、アンキリンリピートヒトNotch-1、ヒトNotch-2と 同様にショウジョウバエNotchのアンキリンリピートと結合することを示してい る。標準偏差を括弧の中に示す。８．実施例：脊椎動物 deltex 遺伝子のクローニング ヒトとショウジョウバエの進化は約６億年前に分かれた。先に論じたように、 Deltex タンパク質は、これら二つの進化上かけ離れた種の間で保存された構造 を実証するものである。タンパク質の保存された領域の知ることにより、Deltex をコードする核酸の他の生物体へのクローニングを可能にするハイブリダイゼー ションおよびPCR反応に使用するための合成縮重プライマーを設計することがで きる。 ヒトとショウジョウバエの間で高い保存を示す五つの領域が、ヒト Deltex の アミノ酸ストレッチの中に、アミノ酸番号414-419(配列番号:30)、475-480（配 列番号：31)、504-511(配列番号:32)、531-539(配列番号：33)、および 557-564 (配列番号：34)として見出される。これらの配列はそれぞれショウジョウバエDe ltexのアミノ酸ストレッチ549-555(配列番号：35)、603-608(配列番号：36)、63 2-639(配列番号：37)、659-667(配列番号：38)および685-692(配列番号：39)に 保存されている。保存されたアミノ酸領域は単独でまたは組み合わせて、他の生 物体のDeltexをコードした核酸を単離ずるために使われる。 例として、マウスの deltex 遺伝子を以下のようにして得る。標準的な技術を 利用して、ショウジョウバエのアミノ酸 414-419(配列番号：30)およびヒトの54 9-555(配列番号：35)をコードする一連の縮重プライマーを５'から３'への向き で合成する。ショウジョウバエの 475-480(配列番号：31)およびヒトの 603-608 (配列番号：36)のアミノ酸をコードする核酸のアンチセンス鎖に対応する第二の 一連の縮重プライマーもまた合成する。二つの連続したプライマーを PCR 増幅 の鋳型としてマウス胎児ｃＤＮＡを含む混合物に加える。周知の方法に従って、 その結果として既知の deltex 配列と単離されたマウス核酸相同体との間のヌク レオチドの類似性がさまざまな程度で許容される範囲のストリンジェンシーでPC Rをおこなった。 PCR 増幅が成功した後、マウス deltex 遺伝子のセグメントを当業者に公知の 方法により分子クローニングおよび配列決定する。このセグメントを完全なｃＤ ＮＡおよびゲノムクローンを単離するためのプローブとして用いる。マウスdelt ex相同体の完全なヌクレオチド配列を配列解析により決定する。 9． 微生物の寄託 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従い 、完全長ヒト deltex をコードするｃＤＮＡインサートを含むプラスミド pBS h dxが、Bluescriptベクター（Stratagene）中の EcoRI インサートとして、Ya1e 大学を代理するPennie & Edmonds，1155 Avenue of Americas，New York，New Y ork10036のS.Leslie Misrockにより1995年11月17日に、American Type CultureC ollection，1201 Park1awn Drive，Rockville，Mary1and 20852に寄託され、承 認番号 97341 を付与された。 本発明は、寄託された微生物または本明細書に記載された特定の実施態様によ ってその範囲を限定されるものではない。実際に、上記の記載および添付した図 から、当業者には本明細書に記載されたものに加えて本発明のさまざまな修正が 明らかとなろう。このような修正は、添付した請求の範囲の範囲に含まれるもの とする。 本明細書にさまざまな出版物を引用したが、それらの記載の全体を本明細書に 組み込む

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｋ 35/12 35/76 35/76 38/00 39/395 Ｎ 39/395 Ｄ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 7/04 Ｃ０７Ｋ 7/04 14/07 14/07 16/18 16/18 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/577 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．精製された脊椎動物Deltexタンパク質。 ２．哺乳動物のタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。 ３．ヒトのタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。 ４．図２Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列番号１２）を有する、請求項１に記 載のタンパク質。 ５．脊椎動物Deltexタンパク質の少なくとも10個の連続したアミノ酸からなる脊 椎動物Deltexタンパク質の断片を含んでなる、精製されたタンパク質。 ６．脊椎動物Deltexタンパク質の少なくとも20個の連続したアミノ酸からなる脊 椎動物Deltexタンパク質の断片を含んでなる、精製されたタンパク質。 ７．脊椎動物Deltexタンパク質の少なくとも10個の連続したアミノ酸からなり、 全長脊椎動物Deltexタンパク質と関連した１以上の機能活性を示す、脊椎動物 Deltexタンパク質の精製された断片。 ８．Deltexタンパク質の少なくとも20個の連続したアミノ酸からなる、請求項７ に記載の断片。 ９．Deltexタンパク質に対する抗体と結合することができる、請求項５に記載の タンパク質。 10．Notchタンパク質に、またはNotchタンパク質のcdc10/SW16/アンキリンリピ ートを含む分子に結合する脊椎動物Deltexタンパク質の断片を含んでなる、精 製されたタンパク質。 11．第２Deltexタンパク質に、または第２Deltexタンパク質の断片を含む分子に 結合する第１脊椎動物Deltexタンパク質の断片を含んでなる、精製されたタン パク質。 12．脊椎動物Deltexタンパク質のSH3結合ドメインを含む脊椎動物Deltexタンパ ク質の断片を含んでなる、精製されたタンパク質。 13．脊椎動物Deltexタンパク質以外のタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合 により連結された脊椎動物Deltexタンパク質の機能的に活性な断片を含んでな るキメラタンパク質。 14．前記断片がNotchタンパク質に、またはNotchタンパク質のcdc10/SW16/アン キリンリピートを含む分子に結合する、請求項13に記載のタンパク質。 15．前記断片がSH3結合ドメインを含む、請求項13に記載のタンパク質。 16．前記断片がジンクフィンガードメインを含む、請求項13に記載のタンパク質 。 17．請求項１に記載のタンパク質に対する抗体と結合する能力によって特徴づけ られ、該タンパク質に対して１以上の挿入、欠失または置換を有する、請求項 １に記載のタンパク質の精製された誘導体。 18．脊椎動物Deltexタンパク質配列の一部である10〜35アミノ酸の範囲のアミノ 酸配列を有する、精製されたペプチド。 19．請求項１に記載のタンパク質の１以上の機能活性を示すことができる、請求 項１に記載のタンパク質の精製された誘導体。 20．ヒトDeltexタンパク質の配列を含んでなる分子。 21．脊椎動物Deltexタンパク質に結合するが、ショウジョウバエDeltexタンパク 質に結合しない抗体。 22．ヒトDeltexタンパク質に結合する、請求項21に記載の抗体。 23．モノクローナルである、請求項21に記載の抗体。 24．請求項23に記載の抗体の結合ドメインを含有する該抗体のフラグメントまた は誘導体。 25．脊椎動物Deltexタンパク質をコードする精製された核酸。 26．イントロンを欠失している、請求項25に記載の核酸。 27．図２Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列番号１２）を有するタンパク質をコ ードする、請求項25に記載の核酸。 28．図２Ａ−Ｃに示したヌクレオチド配列のコード領域（配列番号１１の一部） を含んでなる、請求項25に記載の核酸。 29．請求項25に記載の核酸に相補的である、精製された核酸。 30．ヒトDeltexタンパク質をコードする、請求項25に記載の核酸。 31．図２Ａ−Ｃに示したヌクレオチド配列（配列番号１１）を含む第２核酸に低 ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であり、配列番号１１の少なく とも110個の連続したヌクレオチドを含んでなる、精製された第１核酸。 32．図２Ａ−Ｃに示したヌクレオチド配列（配列番号１１）を含む第２核酸に高 ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であり、配列番号１１の少なく とも110個の連続したヌクレオチドを含んでなる、精製された第１核酸。 33．図２Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列番号１２）を含むタンパク質をコー ドする第２核酸に低ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であり、配 列番号１２の最初の50アミノ酸を含むタンパク質をコードする、精製された第 １核酸。 34．図２Ａ−Ｃに示したアミノ酸配列（配列番号１２）を含むタンパク質をコー ドする第２核酸に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能であり、配 列番号１２の最初の50アミノ酸を含むタンパク質をコードする、精製された第 １核酸。 35．配列番号１１のヌクレオチド番号500-1044、1045-1821または1822-2380を含 む第２核酸に高ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能である、精製さ れた第１核酸。 36．配列番号１１のヌクレオチド番号500-1044、1045-1821または1822-2370を含 む第２核酸に低ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能である、精製さ れた第１核酸。 37．配列番号１２の最初の25アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列を含んでなる、精製された核酸。 38．配列番号１２の最初の50アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列を含んでなる、精製された核酸。 39．配列番号１２の最初の100アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオ チド配列を含んでなる、精製された核酸。 40．配列番号１２の最初の150アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオ チド配列を含んでなる、精製された核酸。 41．配列番号１２の最初の230アミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオ チド配列を含んでなる、精製された核酸。 42．配列番号１１の110個の連続したヌクレオチドを含んでなる、精製された核 酸。 43．請求項５に記載のタンパク質をコードする、精製された核酸。 44．請求項101に記載のタンパク質をコードする、精製された核酸。 45．請求項11に記載のタンパク質をコードする、精製された核酸。 46．請求項12に記載のタンパク質をコードする、精製された核酸。 47．請求項13に記載のキメラタンパク質をコードする核酸。 48．ATCCに寄託されて受託番号97341を指定されたプラスミドpBShdx中に含まれ る、請求項25に記載の核酸。 49．請求項25に記載の核酸を含有する核酸ベクター。 50．請求項26に記載の核酸を含有する核酸ベクター。 51．請求項49に記載の核酸ベクターを含有する組換え細胞。 52．請求項50に記載の核酸ベクターを含有する組換え細胞。 53．請求項51に記載の組換え細胞を培養して、該細胞において脊椎動物Deltexタ ンパク質を発現させ、そして発現された脊椎動物Deltexタンパク質を回収する ことを含んでなる、脊椎動物Deltexタンパク質の生産方法。 54．請求項33に記載の核酸を含む組換え核酸を含有する細胞を培養して、該細胞 においてタンパク質を発現させ、そして発現されたタンパク質を回収すること を含んでなる、タンパク質の生産方法。 55．治療に有効な量の脊椎動物Deltexタンパク質および製剤学的に許容される担 体を含有する医薬組成物。 56．脊椎動物Deltexタンパク質がヒトDeltexタンパク質である、請求項55に記載 の組成物。 57．治療に有効な量の請求項７に記載のタンパク質および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 58．治療に有効な量の請求項10に記載のタンパク質および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 59．治療に有効な量の請求項11に記載のタンパク質および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 60．治療に有効な量の請求項12に記載のタンパク質および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 61．治療に有効な量の請求項13に記載のタンパク質および製剤学的に許容される 担体を含有する医薬組成物。 62．Notchタンパク質に、またはNotchタンパク質のcdc10/SW16/アンキリンリピ ートを含む分子に結合する能力により特徴づけられる脊椎動物Deltexタンパク 質の誘導体を治療に有効な量で含有する医薬組成物。 63．治療に有効な量の脊椎動物Deltexタンパク質をコードする核酸および製剤学 的に許容される担体を含有する医薬組成物。 64．前記Deltexタンパク質がヒトDeltexタンパク質である、請求項63に記載の医 薬組成物。 65．治療に有効な量の、脊椎動物Deltexタンパク質に結合するがショウジョウバ エDeltexタンパク質には結合しない抗体またはその結合ドメインを含む該抗体 のフラグメントもしくは誘導体、および製剤学的に許容される担体を含有する 医薬組成物。 66．被験者における疾患または障害を治療もしくは予防する方法であって、かか る治療または予防を必要とする被験者に、治療有効量の、脊椎動物Deltexタン パク質の機能に拮抗する分子を投与することを含んでなる方法。 67．前記疾患または障害が、同様の非悪性サンプルのNotch活性または発現と比 べて、増大したNotch活性またはNotchタンパク質もしくは抗Notch抗体と結合 可能なNotch誘導体の増大した発現により特徴づけられる悪性疾患である、請 求項66に記載の方法。 68．前記疾患または障害が子宮頸癌である、請求項66に記載の方法。 69．前記疾患または障害が乳癌である、請求項66に記載の方法。 70．前記疾患または障害が結腸癌である、請求項66に記載の方法。 71．前記悪性疾患がメラノーマ、精上皮腫および肺癌よりなる群から選択される 、請求項66に記載の方法。 72．被験者がヒトである、請求項67に記載の方法。 73．前記分子が脊椎動物Deltexに対する抗体またはその結合ドメインを含む該抗 体の誘導体であり、該抗体はショウジョウバエDeltexには結合しない、請求項 66に記載の方法。 74．前記分子がNotchタンパク質に、またはNotchタンパク質のcdc10/SW16/アン キリンリピートを含む第２分子に結合できる脊椎動物Deltexタンパク質の一部 を含むタンパク質である、請求項66に記載の方法。 75．前記分子が脊椎動物Deltexタンパク質のSH3結合ドメインを含むタンパク質 である、請求項66に記載の方法。 76．前記分子が脊椎動物Deltexタンパク質のジンクフィンガードメインを含むタ ンパク質である、請求項66に記載の方法。 77．前記分子がオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドは（a）少な くとも６個のヌクレオチドからなり、（b）脊椎動物deltex遺伝子のＲＮＡ転 写産物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、（c）該ＲＮＡ転写産物とハ イブリダイズ可能である、請求項66に記載の方法。 78．被験者における疾患または障害を治療もしくは予防する方法であって、かか る治療または予防を必要とする被験者に、治療有効量の、脊椎動物Deltexタン パク質の機能を促進する分子を投与することを含んでなる方法。 79．被験者における悪性疾患を治療もしくは予防する方法であって、かかる治療 または予防を必要とする被験者に、有効量の脊椎動物Deltexタンパク質を投与 することを含んでなる方法。 80．Deltexタンパク質がヒトDeltexタンパク質である、請求項79に記載の方法。 81．被験者における悪性疾患を治療もしくは予防する方法であって、かかる治療 または予防を必要とする被験者に、有効量の請求項25に記載の核酸を投与する ことを含んでなる方法。 82．被験者における悪性疾患を治療もしくは予防する方法であって、かかる治療 または予防を必要とする被験者に、有効量の請求項21に記載の抗体を投与する ことを含んでなる方法。 83．Notchまたは脊椎動物deltex遺伝子の発現により特徴づけられる腫瘍型の腫 瘍をもつ患者を治療する方法であって、該患者に、有効量の、（a）少なくと も６個のヌクレオチドからなり、（b）脊椎動物deltex遺伝子のＲＮＡ転写産 物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、（c）該ＲＮＡ転写産物とハイブ リダイズ可能であるオリゴヌクレオチドを投与することを含んでなる方法。 84．少なくとも６個のヌクレオチドからなり、脊椎動物deltex遺伝子のＲＮＡ転 写産物の少なくとも一部に相補的な配列を含み、該ＲＮＡ転写産物とハイブリ ダイズ可能である、単離されたオリゴヌクレオチド。 85．請求項84に記載のオリゴヌクレオチドおよび製剤学的に許容される担体を含 有する医薬組成物。 86．細胞における脊椎動物Deltexタンパク質をコードする核酸配列の発現を抑制 する方法であって、該細胞に、有効量の請求項84に記載のオリゴヌクレオチド を供給することを含んでなる方法。 87．患者におけるNotch−脊椎動物Deltexタンパク質の結合活性の異常なレベル により特徴づけられる疾患または障害を診断する方法であって、患者から得ら れたサンプル中のNotchタンパク質の脊椎動物Deltexタンパク質への結合能を 測定することを含んでなり、その際、Notchタンパク質の脊椎動物Deltexタン パク質への結合能が、正常個体から得られた同様のサンプルにおける該結合能 と比べて増加または低下していることが患者における該疾患または障害の存在 を示すことからなる、上記方法。 88．脊椎動物Deltexタンパク質のNotchタンパク質への結合を抑制または低減さ せる分子を同定する方法であって、 （a）（i）Notchタンパク質またはDeltexタンパク質への結合を媒介するその 断片、および(ii)脊椎動物Deltexタンパク質またはNotchタンパク質への結合 を媒介するその断片を、Notchタンパク質またはその断片とDeltexタンパク質 またはその断片との結合を抑制または低減させる能力について試験することを 望む１以上の分子の存在下で、Notchタンパク質またはその断片とDeltexタン パク質またはその断片との結合が起こるように接触させ、そして （b）Deltexタンパク質またはその断片のNotchタンパク質またはその断片へ の結合を抑制または低減させる１以上の分子を同定する、 ことを含んでなる方法。 89．Deltexタンパク質がヒトDeltexタンパク質である、請求項88に記載の方法。 90．細胞内のNotch機能を不活性化する方法であって、該細胞に、（a）Deltexタ ンパク質またはNotchタンパク質への結合を媒介するその一部、および（b）プ ロテアーゼまたはそのタンパク質分解活性部分、を含む分子を導入することを 含んでなる方法。 91．前駆細胞を増殖させる方法であって、該細胞を、該細胞の分化を抑制するの に有効な量の脊椎動物Deltexタンパク質またはその機能的に活性な部分と接触 させ、そして該細胞が増殖するような細胞増殖条件に該細胞をさらす、 ことを含んでなる方法。