DE10042609A1

DE10042609A1 - Verwendung von T-Proteinen zur differentiellen Charakterisierung und Therapie von Verletzungen und Tumoren des Nervensystems

Info

Publication number: DE10042609A1
Application number: DE2000142609
Authority: DE
Inventors: Annemarie Poustka; Johannes Coy
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2002-03-28
Also published as: WO2002017947A3; WO2002017947A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von T-Proteinen bzw. den dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen und Antikörpers gegen die T-Proteine zur differentiellen Charakterisierung und Therapie von Verletzungen und Tumoren des Nervensystems.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von T-Proteinen bzw. den dafür kodierenden Nukleinsäuresequenzen und Antikörpern gegen die T-Proteine zur differentiellen Charakterisierung und Therapie von Verletzungen und Tumoren des Nervensystems.

Bisher ist es ein wesentliches Problem bei der Behandlung von Tumoren des Nervensystems, insbesondere von Hirntumoren, daß sehr ähnlich aussehende Tumoren oft grundsätzliche Unterschiede in den genetischen Veränderungen aufweisen, die zur Tumorentstehung geführt haben. Diese Heterogenität der molekularen Veränderungen bei verschiedenen Tumoren eines anscheinend gleich aussehenden Tumortyps beeinflußt die Behandlung dieser Tumoren oft sehr negativ, mit einschneidenden, oft tödlichen Konsequenzen für die Krebspatienten. So ist z. B. die Amplifikation des N-Myc-Gens bei Neuroblastomen für die Über lebenswahrscheinlichkeit der Patienten von großer Bedeutung. Aufgrund dieser Tatsache wird bei Neuroblastompatienten getestet, ob eine Amplifikation des N- Myc-Gens vorliegt und die nachfolgende Behandlung wird daraufhin ausgerichtet, d. h. bei Vorliegen einer Amplifikation wird eine rigidere Therapie angewandt als wenn keine Amplifikation vorgelegen hätte. Dies zeigt, wie wichtig es ist, die molekularen Prozesse, die zur Tumorentstehung geführt oder beigetragen haben, erfassen zu können. Es gibt aber nicht genügend Marker von der Aussagequalität des N-Myc-Gens.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, diagnostische und therapeutische Mittel bereitzustellen, die es erlauben, die unterschiedlichen mole kularen Veränderungen bei verschiedenen Tumoren und Verletzungen des Nerven systems zu identifizieren und zu therapieren. Hierdurch soll eine differentielle Diagnose und Therapie von Verletzungen und Tumoren des Nervensystems ermöglicht werden.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprü chen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung mindestens einer DNA-Sequenz zur differentiellen Identifizierung und Therapie molekularer Ver änderungen bei Verletzungen und Tumoren des Nervensystems, wobei die DNA- Sequenz folgende DNA-Sequenzen umfaßt:

a) die DNA-Sequenz von Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 3;
b) Varianten, Derivate, Vorläufer oder Fragmente der DNA-Sequenz von (a); oder
c) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz von (a) oder (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

Die in den Fig. 1 bis 3 gezeigten Sequenzen sind Fragmente bzw. Varianten der T-Gene (T1, T2, T3), die in den älteren Anmeldungen DE 199 08 423.8 und PCT/DE00/00583 detailliert beschrieben sind.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß das T1-Protein nach einer Verlet zung des Gehirns verstärkt in den Zellen - hauptsächlich Astrozyten - gebildet wird, die die Narbe umgeben. Keine verstärkte Expression findet sich in den Neuronen und Gliazellen in der Zone der anterograden Degeneration in der frühen Phase der Degeneration. Das zentrale Nervensystem antwortet auf Verletzungen und Er krankungen durch starke Proliferation von Astrozyten, die zu einer Bildung einer neuralen/glialen Narbe führt. Dieser Prozeß unterliegt genauen Kontrollmecha nismen, da eine ZNS-Verletzung nicht zu einer unkontrollierten Proliferation von Astrozyten führt, wie es z. B. bei glialen Tumoren der Fall ist. Fehler bei regenerati ven nach einer Verletzung des Nervensystems oder Störungen in der Kontrolle dieser Prozesse können so zu Tumorerkrankungen des Nervensystems führen. Von den Erfindern wurden deshalb die Kontrollmechanismen und die daran beteiligten Proteine identifiziert. Durch die gezielte Charaktierisierung und Beeinflussung dieser Mechanismen und Proteine ist so eine positive Beeinflussung von Heilungs prozessen des Nervensystems und der Therapie von Tumoren des Nervensytems zu erreichen.

Von den Erfindern wurde weiter erkannt, daß nicht alle Astrozyten nach einer Verletzung des Nervensystems proliferieren und daß die, die proliferieren, auf sehr definierte Weise proliferieren, wodurch in bestimmten Fällen eine Krebserkrankung ausgelöst werden kann. Die Mechanismen, die die Astrozytenproliferation kon trollieren, sind kaum verstanden. Die Identifikation des T1-Proteins als Komponente in diesem Regenerationsprozeß erlaubt nun, gezielt in diese Prozesse einzugreifen und Therapien für die Behandlung von traumatischen Verletzungen und Tumoren zu entwickeln.

Von den Erfindern wurden differentiell gespleißte Exons, die in den Sequenzen der Fig. 1, 2 und 3 mit Unterstreichungen angegeben sind, identifiziert. Diese stellen die entscheidenden Identifikationsparameter für die Einteilung der unter schiedlichen Verletzungen und Tumoren des Nervensystems dar. Aus ihrem Vorliegen bzw. ihrer Abwesenheit können die notwendigen Rückschlüsse auf die Erkrankung gezogen werden. Mit Hilfe dieser differentiell gespleißten Exons ist es möglich, Proteine oder andere Moleküle zu identifizieren, die mit diesen Sequenzen interagieren. Diese wiederum können für die Diagnose und Therapie von Verlet zungen und Tumoren des Nervensystems ebenso eingesetzt werden, wie die oben identifizierten Sequenzen der Fig. 1, 2 oder 3.

Von den Erfindern wurde gefunden, daß die Gene T1, T2 und T3 in Tumoren des Nervensystems differentiell exprimiert werden. In den Glioblastoma-Zellinien H4 und A172 werden die Gene T1 und T2 exprimiert, wohingegen die Expression von T3 fehlt. In den vier von sieben getesteten Glioblastoma-Zellinien (U118MG, U373MG, U87MG und HS683) werden alle Mitglieder der T-Genfamilie exprimiert. In der Glioblastoma-Zellinie U343MG war keine Expression der T-Genfamilie detektierbar.

Die Medulloblastoma-Zellimie DAOY wies eine reduzierte T1- und T2-Expression auf, während die T3-Expression fehlte. In der Leukämie-Zellinie konnte keine Expression der T-Genfamilie detektiert werden. In der primitiven neuroektodermalen Tumor-Zellinie MHH-PNET liegt nur eine Expression des T3-Gens vor. Diese Analyse zeigt, daß die drei T-Gene in Tumor-Zellinien differentiell exprimiert wer den. Weiterhin zeigt die Analyse der Expression von T1 in primären Tumoren, daß die Expression in Neuroblastomen reduziert ist. In 4 von 10 getesteten Neu roblastomen (NB-T3, NB-T4 m, NB-T7, NB-T8) konnte eine reduzierte oder fast fehlende Expression von T1 festgestellt werden. Das Ausmaß der Reduzierung der Expression ist noch viel stärker, da die Tumoren einen Normalgewebeanteil (ca. 20-50%) aufweisen. Bei primären Neuroblastomen geht der maligne Phänotyp mit einer reduzierten Expression von T1 einher. Diese Ergebnisse werden in Fig. 4 bestätigt.

Die Gene T1, T2 und T3 werden auf der Transkriptionsebene reguliert. Eine weitere Komplexizität der Regulation dieser Gene konnte aufgezeigt werden, da multiple Spleißvarianten der T-Gene isoliert werden konnten. Es konnten die in den Fig. 1, 2 und 3 mit Unterstreichungen gekennzeichneten Exons identifiziert werden. Die Größe von zwei dieser alternativ gespleißten Exons ist 42 und 24 bp. Das dritte differentiell Exon weist eine unterschiedliche Größe innerhalb der T-Genfamilie auf. In T1 ist das dritte differentiell gespleißte Exon 21 bp, während es in T2 und T3 jeweils nur 9 bp lang ist. Differentielles Spleißen dieser drei Exons führt zu acht unterschiedlichen Proteinisoformen, zu 24 verschiedenen Proteinisoformen in nerhalb der T-Genfamilie und zu 512 Proteinisoformkombinationen insgesamt. Alle drei differentiell gespleißten Exons sind in einem Bereich lokalisiert, der bei T1 durch den Leucin-Zipper und die PXXP-Motife flankiert wird. Leucin-Zipper und PXXP-Motife sind gut untersuchte Proteinmotife, die Protein-Proteinbindungen ermöglichen. Die drei differentiell gespleißten Exons liegen genau in diesem Bereich und verändern gezielt die Wechselwirkung der T-Proteine mit anderen Proteinen.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Varianten" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den Figuren ange gebenen Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen codierte Protein bzw. Peptid noch die vorstehend erwähn ten Eigenschaften aufweist. Es ist dabei bevorzugt, daß die Varianten noch eine Homologie von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90% und ganz bevorzugt 95% aufweisen. Es zählen deshalb funktionelle Äquivalente, Derivate, Vorläufer (bioprecursors) dazu. Unter Derivaten sind beispielsweise Mutationsderivate (erzeugt durch z. B. Deletionen oder Insertionen), Fusionen, Allelvarianten, Muteine und Spleißvarianten zu verstehen. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die vorstehend erwähnten Eigenschaften verfügt. Bevorzugte Fragmente sind die in den Fig. 1, 2 und 3 durch Unterstreichungen hervorgehobenen Sequenzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Ver wendung einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 3 oder Teile davon umfaßt, wobei das Protein die vorstehend definierte biologische Aktivität hat und zur Diagnose und Therapie von Verletzungen und Tumoren des Nervensystems verwendet werden kann. Die Teile der Sequenzen sind bevorzugt die in den Figuren durch Unterstreichungen hervor gehobenen Fragmente.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden DNA-Sequenzen können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit können auch diese DNA- Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren erfindungsgemäß verwendet werden. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z. B. pUC18, pBR322, pBlueScript), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das DNA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1- Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40- Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor den Promotor des humanen T- Gens oder eines Orthologen des T-Gens. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vekto ren zählen pY100 und Ycpad1, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4. Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insekten zellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungs gemäß zu verwendenden DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinations verfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Die erfindungsgemäß zu verwendenden DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden, sodaß die DNA-Sequenzen beispielsweise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können. Bevorzugt sind diese anderen DNAs Reportersequenzen, die ein Reportermolekül codieren, das ein detektierbares Protein umfaßt, z. B. einen Farbstoff, eine Antibiotikaresistenz, β-Galactosidase oder eine durch spektrops hotometrische, spektrofluorometrische, luminescente oder radioaktive Assays nachweisbare Substanz.

Die in einen Vektor inserierten DNA-Sequenzen können in Wirtszellen gebracht werden. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Pilze, z. B. Hefen, vor zugsweise S. cerevisiae, Pflanzenzellen, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Vertebraten- oder Säugerzellen. Bevorzugte Säuger zellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Proteine weisen bevorzugt die in den Fig. 1, Fig. 2 oder Fig. 3 gezeigten Aminosäuresequenzen auf bzw. stellen Fusionen, Fragmente, Derivate oder Vorläufer (bioprecursors) davon dar, wobei die vor stehend erwähnten Eigenschaften im Sinne funktioneller Äquivalente erhalten bleiben. Hinsichtlich der Definitionen dieser Begriffe wird auf die jeweiligen vor stehenden Ausführungen verwiesen. Unter Derivaten sind insbesondere solche veränderten Proteine bzw. Peptide zu verstehen, die sich von den in den Figuren gezeigten Sequenzen durch konservative Aminosäurenaustauche unterscheiden oder solche nichtkonservativen Aminosäureaustausche enthalten, die die Funktion der T-Proteine nicht wesentlich verändern. Bevorzugte Fragmente sind die in den Fig. 1, 2 oder 3 durch Unterstreichungen hervorgehobenen Sequenzen.

Zu den erfindungsgemäßen diagnostischen oder therapeutischen Zwecken können statt der vorbeschriebenen DNA-Moleküle oder Proteine auch Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen Proteine oder gegen Fragmente davon, insbesondere gegen die in den Fig. 1, 2 oder 3 unterstrichenen Sequenzen, verwendet werden. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der voll ständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fach mann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den DNA-Sequenzen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise als ersten Schritt die Herstellung von polyclonalen Antikörpern unter Verwendung der erfin dungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon (beispielsweise synthetische Peptide) als Immunogen zur Immunisierung geeigneter Tiere, beispielsweise Kaninchen oder Hühner, und die Gewinnung der polyclonalen Antikörper aus dem Serum bzw. Eigelb. Dann werden beispielsweise Zell-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und cloniert. An schließend wird ein Clon selektioniert, der einen Antikörper produziert, der für das verwendete Antigen spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Bei spiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelom zellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels dem Antigen nach dem Enzym-Antikörper-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Clone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Clone werden beispielsweise BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoclonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionierung, Ionenaus tauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromatographie) gereinigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikör pern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immung lobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentli chen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humani sierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig frem den Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. Die Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipi tation der vorstehend diskutierten Proteine im Rahmen der differentiellen Diagnose und Therapie von Tumoren des Nervensystems verwendet werden. Durch die Bereitstellung der Antikörper ist es möglich, Schnitte oder Abstriche von Tumoren oder anderem Patientenmaterial zu untersuchen und festzustellen, ob Proteinisofor men der T-Proteinfamilie vorliegen, die für Tumoren oder Verletzungen spezifisch sind. Desweiteren ist es auch möglich, Proteinisoformen zu identifizieren, die prognostische Bedeutung für die Behandlung der Patienten haben.

Die Erfindung ermöglicht die differentielle Diagnose und Behandlung von Krebs, u. a. von Tumoren des Nervensystems, wie Neuroblastom, Astrozytom, Glioblastom, Medulloblastom. Diese Diagnose kann nicht nur postnatal, sondern bereits pränatal erfolgen. Mit einer wie oben definierten DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, festgestellt werden, ob sie ein Gen enthalten, das das erfindungsgemäße Protein codiert und/oder exprimiert bzw. ob dieses Gen zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist. Dazu kann der Fachmann übliche Verfah ren, wie Reverse Transkription, PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich für die Diagno stik, d. h. beispielsweise zum Nachweis des Vorhandensein und/oder der Konzen tration des erfindungsgemäßen Proteins, einer verkürzten oder verlängerten Form des Proteins etc., in einer Probe. Die Antikörper können beispielsweise in Immuno assays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immungssays sind ELISA und RIA.

Die differentiell gespleißten Exonsequenzen und und die darin kodierten Proteiniso form-spezifischen Aminosäuresequenzen können auch dazu verwendet werden, neue Verfahren und Medikamente zu entwickeln. Hierzu können z. B. die proteiniso formspezifischen Aminosäuresequenzen als Bindepartner für andere Proteine oder Stoffe allgemein (Chemikalien, Stoffbibliotheken) verwendet werden, um Moleküle oder andere Proteine zu identifizieren, die an die proteinisoformspezifischen Aminosäuresequenzen binden. Durch dieses Verfahren können neue Moleküle oder Proteine gefunden werden, die gezielt die Wirkung einzelner Proteinisoformen blockieren oder verstärken. Durch die gefundenen neuen Moleküle können dann auch andere Proteine beeinflußt werden, die in der Signalkaskade an anderer Stelle ansetzen.

Unter Verletzungen des Nervensystems sind beispielsweise Schädel-Hirn-Traumata oder Querschnittslähmungen zu verstehen.

Somit erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer gestörten Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins (Spleißvariante), bei dem man eine Probe mit den DNA- oder Protein-Sequenzen oder dem Antikörper oder Fragment davon in Berührung bringt und sodann beispielsweise direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Amino säuresequenz im Vergleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewonnenen Protein unterscheiden.

Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Durchführung therapeutischer Maß nahmen bei den vorstehend diskutierten Störungen, d. h. die vorstehend beschrie benen, erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, Proteine und Antikörper können auch zur Herstellung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Austausch einer mutierten Form des Gens gegen eine funktionelle Form verwendet werden und somit auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder der Behandlung von Tumorerkrankungen des Nervensystems. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein in Säu gern, insbesondere den Menschen, durch übliche Maßnahmen eingebracht wer den. Hierzu kann es günstig sein, das Protein an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder Rinderserumalbumin (BSA) zu koppeln. Mit dem erwähnten Antikörper kann die Expression des Proteins bzw. der verwandten Proteine kontrolliert und reguliert werden.

Die erfindungsgemäße Therapie erfolgt mit einem Arzneimittel, das die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, den Expressionsvektor, das Protein oder den Antikörper bzw. Fragmente davon enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenen falls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu ge eigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraven trikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc. .

Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert und, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Vektors in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Schließlich wird zur Durchführung der vorliegende Erfindung auch ein diagnosti scher Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens bereitgestellt, der mindestens eine der oben beschriebenen DNA-Sequenzen, das Protein oder den vorstehend beschriebenen Antikörper oder Fragmente davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können die DNA-Sequenz, Protein-Sequenz bzw. der Antikörper oder Fragmente davon immobilisiert sein.

Sequenzen der T-Gene können auf Nylonmembranen oder Glasträger aufgebracht werden und mit Proben (DNA, cDNA oder RNA) aus Tumoren und zugehörigen Normalgeweben, oder krankem und zugehörigen gesundem Gewebe hybridisiert werden. Hierdurch ist die (vollautomatisierte) Erfassung der Expresssion dieser Gene möglich. Die hierzu verwendeten Sequenzen können z. B. die gesamte cDNA- Sequenz oder kurze Sequenzabschnitte z. B. 10-15 bp-Oligomere sein. Nach Determination der Expression der T-Gene kann dann die Therapie, unter anderem die Krebstherapie gezielt der nach der jeweiligen individuellen Situation des Patien ten ausgewählt oder angepasst werden. Mittels der Hybridisierung mit den T- Genen ist es möglich, die Expression der einzelnen T-Gen und T-Gen-Teilsequen zen zu bestimmen. Hierdurch ist es möglich, eine sehr schnelle Diagnose durch zuführen und eine Therapie den molekulargenetischen Besonderheiten anzupas sen. Damit ist eine deutlich erhöhte Therapie- oder Heilungsrate verbunden.

Die Isolierung und Charakterisierung der obigen Sequenzen, insbesondere der unterschiedlichen Spleißvarianten, erlauben die Etablierung eines Tiermodells, was für das weitere Studium von Verletzungen des Nervensytems und von Krebs erkrankungen auf molekularer Ebene sehr wertvoll ist. Zu diagnostischen Zwecken wird ferner ein nicht-menschliches Säugetier entwickelt, dessen T1-Gen bzw. T2- oder T3-Gen verändert ist, z. B. durch Insertion einer heterologen Sequenz, ins besondere einer Selektionsmarkersequenz.

Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier, dessen T-Gen bzw. T2- oder T3-Gen verändert sein kann. Beispiele solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.

Der Ausdruck "T-Gen bzw. T2- oder T3-Gen, das verändert ist" bedeutet, daß in dem im nicht-menschlichen Säugetier natürlich vorkommenden entsprechenden Gen durch Standardmethoden eine Veränderung der Genstruktur oder der Gense quenz durchgeführt wird. Dies kann unter anderem durch die Einführung einer Deletion von ca. 1-2 kb, an dessen Stelle eine heterologe Sequenz, z. B. ein Konstrukt zur Vermittlung von Antibiotika-Resistenz (z. B. eine "neo-Kassette"), eingeführt wird, erreicht werden. Desweiteren können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, in vivo Zeit- und gewebespezifische Deletionen durchzuführen. Weiterhin können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, die Expression des T-Gens in vivo zu verfol gen. Dies kann unter anderem durch die Insertion einer für das GFP (green fluo rescent protein)-Protein codierenden Sequenz innrerhalb eines Exons oder als eigenständiges Exon durchgeführt werden. Diese Methoden sind allgemein in Sch wartzberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, S. 3210-3214, 1990 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird. Insbesondere sollen "nicht-menschliche Säugetiere" bereitgestellt werden, bei denen einzelne differentiell gespleißte Ex onsequenzen deletiert sind. Dies führt zum Ausfall einzelner Proteinisoformen, ohne aber die Bildung der anderen Proteinisoformen zu verhindern. Bie jedem einzelnen T-Gen können so jeweils drei verschiedene "Knockouts" durchgeführt werden, bei dem jeweils ein differentiell gespleißtes Exon deletiert ist. Daraus resultieren dann drei verschiedene "Knock-out"-Typen pro T-Gen und insgesamt neun "Knock-out"- Typen für alle drei T-Gene. Durch Kreuzen dieser neun "Knock-out"-Typen können dann alle 512 möglichen Genotypen gebildet werden. Diese Tiere können als Tiermodell verwendet werden, um die Auswirkungen des Fehlens einzelner Protei nisoformen zu untersuchen. Gleichzeitig können die Tiere verwendet werden, um neue Medikamente gegen die aufgetretenen Symptome zu entwickeln.

Insbesondere kann die Veränderung wie nachfolgend beschrieben durch geführt werden. So kann man z. B. die unterstrichenen Exon-Sequenzen deletieren oder so verändern, dass das Gen in anderer Weise als üblich gespleißt wird. Desweiteren kann durch Einbau einer Spleißakzeptorsequenz eines anderen Exons des T-Gens in die Intronsequenz eine Sequenz in dieses Intron inseriert werden, die als Exon erkannt wird und an die davor liegenden Exons des T-Gens herangespleißt wird. Diese inserierte Sequenz kann z. B. ein Exon sein, das das EGFP-Protein (Enhan ced Green Fluorescent Protein) kodiert. Hierdurch wird aus dem ursprünglichen T- Gen ein Fusionsprotein, das das EGFP-Protein beinhaltet. Hierdurch kann bevor zugt eine Maus generiert werden, die es erlaubt, die Expression des T-Gens in vivo zu verfolgen. Die inserierte Sequenz kann am Ende so gestaltet sein (z. B. PolyA- Signal, Spleißsignale usw.), daß keine weiteren Exons des T-Gens an das inserierte Exon herangespleißt werden oder das heranspleißte Exons nicht mehr translatiert werden. Hierdurch entsteht eine Deletion des Maus T-Proteins am C-terminalen Ende oder ein vorzeitiger Abbruch des Leserahmens und eine (zumindest teil weise) Inaktitivierung der Proteinfunktion des Maus T-Gens kann erreicht werden. Desweiteren können auch solche Sequenzen als neue Exonsequenzen inseriert werden, die eine mRNA-Sequenz ergeben, bei der am 3'-Ende diese neue mRNA- Sequenz lokalisiert ist. Durch geeignete Sequenzen ist dann eine Veränderung der Stabilität der mRNA oder eine veränderte Lokalisation in der Zelle zu erreichen. Die damit einhergenden Phänotype der so veränderten Mäuse können dann wichtige Rückschlüsse auf die Funktion des T-Gens ergeben. Diese Mäuse können dann auch zum Auffinden neuer Wirkstoffe verwendet werden, die den Funktionsverlust des T-Gens kompensieren.

Es können auch Zellen aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zeilen können in jeglicher Form vorliegen, z. B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.

Ein nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Verfahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes T-, T2- oder T3-Gen, wobei das Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, verändert worden ist;
b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säu ger (bevorzugt Maus);
c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA- Fragment von Schritt (a), wobei das T-Gen in den embryonalen Stammzel len durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) ver ändert wird,
d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,
f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zeilen in Säuger-Blastozysten (bevorzugt Maus- Blastozysten), Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des T-Gens.

In Schritt (c) wird der Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R. M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) ausgenutzt, um embryonale Stammzellen zu transfizieren. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwendung embryona ler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.

Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung des T-Gens eignen. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung des T1-, T2- oder T3-Gens ermöglicht. Vorzugsweise weist der Vektor einen Marker auf, mit dem auf vorhan dene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die gewünschte Rekom bination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z. B. die IoxP/tk neo-Cassette, die mit Hilfe des Cre/IoxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, dessen T1-, T2- oder T3-Gen verändert ist. Diese Veränderung kann ein Ausschalten der Genexpression-regulierenden Funktion sein. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die Genexpression-kontrollierende Funktion des T-Prateins untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arznei mittel und Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die kontrollierende Funktion eingewirkt werden kann. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Basis, um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken. Solche Erkrankun gen sind z. B. Einschränkungen der ZNS-Funktionen durch Verletzung oder die Induktion von Krebs durch Fehler bei der Kontolle der Zellproliferation.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Fig. 1 humane cDNA-Sequenz (Gen T1) und abgeleitete Aminosäurese quenz unterstrichene Sequenzen: Exon

Fig. 2 humane cDNA-Sequenz (Gen T2) und abgeleitete Aminosäurese quenz unterstrichene Sequenzen: Exon

Fig. 3 humane cDNA-Sequenz (Gen T3) und abgeleitete Aminosäurese quenz unterstrichene Sequenzen: Exon

Fig. 4 Differentielle Expression der T-Gene in Tumor-Zellinien

Folgende Clone wurden gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, am 18. August 1998 hinterlegt:

- Clon JFC277 (DSM12371); humane cDNA; repräsentiert die humane cDNA-Sequenz von Bp 1218-3690
- Clon JFC N2112 (DSM12376); humaner genomischer Clon; wurde vollständig sequenziert. Die Sequenz ist in Fig. 2 ge zeigt und enthält die Sequenz von Bp 1756-4228 der humanen cDNA-Sequenz.

Am 2. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

- Clon JFC-BN27 (DSM 12659); enthält die Sequenz von Bp 4370-8690 der humanen cDNA-Sequenz

Am 19. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

- Clon JFC-BN20 (DSM 12698); enthält die Sequenz von Bp 2025-6280 der humanen cDNA-Sequenz

Am 1. Februar 2000 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

- cDNA-Klon pL70 (DSM13270); repräsentiert wesentliche Teile des Gens T3.

Die in Fig. 1 gezeigte Sequenz stammt aus den Clonen JFC277 (DSM 12371), JFC405 (DSM 12372) und JFC-BN27 (DSM 12659) und JFC-BN20 (DSM 12698).

Die Erfindung wird weiter anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels be schrieben.

BEISPIELE

Hinsichtlich der verwendeten Methoden wird auch auf Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual; second edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) hingewiesen, wobei die nachfolgend erwähnten Techniken, insbesondere Präparation von DNA bzw. RNA und PCR dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.

BEISPIEL 1 Durchführung von RT-PCR

Gesamt-RNA wurde aus den folgenden Hirntumor-Zellinien isoliert: H4; DAOY; U343MG; U118MG; U373MG; U87MG; U937; HS683; A172 und MHH-PNET.

Die Erststrang-cDNA wurde synthetisiert, indem 250 ng Hexanukleotide (Fa. Pharmacia) pro 1 µg Gesamt-RNA verwendet wurden. Die PCR-Reaktionen wurden mit genspezifischen Primern und Erststrang-cDNA durchgeführt. Die folgenden Primer und Primerkombinationen wurden verwendet:
POMFIL 1-1 + POMFIL 1-2 + TFR2 + TFR4: für primäre Neuroblastome
POMFIL 1-1 + POMFIL 1-2 + TFR1 + TFR4: für Tumorzelllinienanalyse
POMFIL 2-1 + POMFIL 2-2 + POMFIL 3-1 + POMFIL 3-2: für Tumorzell linienanalyse

T1-Gen

T3-Gen

T2-Gen

Transferin-Rezeptor (TFR)

Von den POMFIL-Primern wurden jeweils 300 ng pro 50 µl PCR-Reaktion verwen det, wohingegen bei den Transferin-Rezeptor-Primern jeweils 38 ng verwendet wurden.

PCR-Bedingungen

35 Zyklen: 1 Min. 94°C, 1 Min. 60°C, 4 Min. 72°C.

Duplex-PCRs wurden mit Primern durchgeführt, die eine unabhängige Kontrolle amplifizierten. Dies ist in Fig. 4A oben: POMFIL1 und als Kontrolle TFR sowie POMFIL2 und POMFIL3 als gegenseitige Kontrolle. Dasselbe gilt für Fig. 4B.

5 µl Aliquots der PCR-Ansätze wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und durch Elektrophorese aufgetrennt. Das Ergebnis ist in Fig. 4 zu sehen. Daraus ergibt sich, daß in den Glioblastoma-Zellinien H4 und A172 die Gene T1 und T2 exprimiert werden, wohingegen die Expression von T3 fehlt. In den vier von sieben getesteten Glioblastoma-Zellinien (U118MG, U373MG, U87MG und HS683) werden alle Mitglieder der T-Genfamilie exprimiert, in der Glioblastoma-Zellinie U343MG war keine Expression der T-Genfamilie detektierbar. Die Medulloblastoma-Zellimie DAOY wies eine reduzierte T1- und T2-Expression auf, während die T3-Expression fehlte. In der Leukämie-Zellinie konnte kein Expression der T-Genfamilie detektiert werden. In der primitiven neuroektodermalen Tumor-Zellinie MHH-PNET liegt nur eine Expression des T3-Gens vor. Diese Analyse zeigt, daß die drei T-Gene in Tumor-Zellinien differentiell exprimiert werden. Weiterhin zeigt die Analyse der Expression von T1 in primären Tumoren, daß die Expression in Neuroblastomen reduziert ist. In 4 von 10 getesteten Neuroblastomen (NB-T3, NB-T4 m, NB-T7, NB- T8) konnte eine reduzierte oder fast fehlende Expression von T1 festgestellt wer den. Das Ausmaß der Reduzierung der Expression ist noch viel stärker, da die Tumoren einen Normalgewebeanteil (ca. 20-50%) aufweisen. Bei primären Neuro blastomen geht der maligne Phänotyp mit einer reduzierten Expression von T1 einher.

BEISPIEL 2 Herstellung von Antikörpern

Mit einen synthetisch hergestellten Peptid der Sequenz "EKGEDPETRRMRTVKNIAD "werden Tiere zur Erzeugung von Antikörpern gegen das T-Protein wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung werden 600 µg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freunds Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freunds Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird das zur Immunisierung eingesetzte Peptid einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikör per inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwick lerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung werden 100 µg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freunds Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung werden 250 µg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freunds Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Peptid in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag O: 1. Immunisierung (komplettes Freunds Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freunds Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Die Analyse der T-Genfamilie hat gezeigt, daß z. B. bisher nicht zu unterscheidende Gehirntumoren durch die Erfassung der Expression der drei T-Gene in verschiedene Gehirntumor-Subtypen zu unterscheiden sind. Dies stellt eine hervorragende Möglichkeit dar, wie eine molekulargenetische Klassifizierung von Tumoren durch geführt werden kann. Hierbei wird mit Hilfe von PCR eine Erfassung der Expression dieser Gene durchgeführt. Von besonderer Bedeutung ist hierbei, daß jedes dieser drei Gene nicht nur ein Protein kodiert, sondern viele Spleißvarianten zu unter schiedlichen Proteinisoformen führen. Nicht nur die Expression der einzelnen T- Gene, sondern auch die einzelnen Proteinisoformen können so als tumorrelevante Marker verwendet werden. Dadurch ist es z. B. möglich, bisher nicht zu unter scheidende Formen von Gehirntumoren molekulargenetisch in Subklassen ein zuordnen. Dies eröffnet die Möglichkeit, die Therapie dieser Tumoren optimal den molekulargenetischen Gegebenheiten anzupassen. Dadurch ist es möglich, den Therapierfolg deutlich zu steigern.

Mit Hilfe der genspezifischen Primer kann die Expression von jedem Mitglied der T-Genfamilie erfasst werden. Hierzu bieten sich Sequenzen an, die in allen T-Gen- Transkripten vorhanden sind (nicht differentiell gespleißte Sequenzen). So kann man feststellen, ob alle drei T-Gene exprimiert sind oder nur eines oder zwei. Durch die Determinierung der Kombinationen sowie der Expressionsstärke der einzelnen T-Gene ist ein Klassifizierung der Tumoren möglich. Dadurch können bisher nicht zu unterscheidende Gehirntumoren molekulargenetisch unterschieden werden. Weiterhin kann die Expression der differentiell gespleißten Exons, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die in unterschiedlichen Proteinisoformen vor kommen, determiniert werden. Mit Hilfe von z. B. PCR-Primern, die solche Ex onsequenzen flankieren, ist es möglich festzustellen, ob die entsprechende Ex onsequenz exprimiert wird. Bisher konnten jeweils drei differentiell gespleißte Exons nachgewiesen werden. Die verschiedenen Spleißmöglichkeiten erlauben für jedes einzelne T-Protein allein acht verschiedene Proteinisoformen. da es drei verschie dene T-Gene gibt, resultieren daraus 512 mögliche Proteinisoform-Kombinationen. Dies bedeutet, daß jede Zelle, ohne die quantitative Expressionsmenge zu berück sichtigen, eine große Vielzahl an Möglichkeiten hat, die T-Proteine und -Isoformen zusammenzusetzen. Durch die vorstehend beschriebene Vorgehensweise ist es nun möglich zu bestimmen, welche dieser Proteinisoform-Kombinationen vorliegt.

Darüberhinaus ist es weiter möglich, die einzelnen mRNAs oder Proteinisoform mengen zu quantifizieren. Durch die qualitative und quantitative Determinierung der Proteinisoform-Kombinationen ist es möglich, die Erkrankungen auf mRNA-Ebene und Proteinebene zu klassifizieren.

Claims

1. Verwendung mindestens einer DNA-Sequenz zur differentiellen Identifizie rung und Therapie molekularer Veränderungen bei Verletzungen und Tumo ren des Nervensystems, wobei die DNA-Sequenz folgende DNA-Sequenzen umfaßt:

2. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die ein Protein bzw. Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 2, oder Fig. 3 umfaßt.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz in einem Expressionsvektor vorliegt.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Expressionsvektor zusätzlich den Promotor des humanen T-Gens oder eines Orthologen des T-Gens beinhal tet.

5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Expressionsvektor das T1-, T2- oder T3-Protein oder Fragmente davon in Form eines Reporterfusions proteins kodiert.

6. Verwendung eines Protein bzw. Fusionsproteine, Fragmente, Varianten, Derivate oder Vorläufer des Proteins, das von der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, zur differentiellen Identifizierung und Therapie molekularer Veränderungen bei Verletzungen und Tumoren des Nerven systems.

7. Verwendung eines Antikörpers oder Fragment davon, der gegen das Protein nach Anspruch 6 gerichtet ist, zur differentiellen Identifizierung und Therapie molekularer Veränderungen bei Verletzungen und Tumoren des Nerven systems.

8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA-Sequenz in einem nicht-menschlichen Säugetier vorliegt.

9. Diagnoseverfahren zum Nachweis einer gestörten Expression des Proteins definiert in Anspruch 6 oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins, bei dem man eine Probe mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder dem Antikörper oder dem Fragment davon nach Anspruch 7 in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Aminosäuresequenz im Vergleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewonnenen Protein unterscheiden.

10. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 9, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 und/oder den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7 enthält.