DE69929876T2

DE69929876T2 - Für hm1.24 antigen kodierendes gen und dessen promotor

Info

Publication number: DE69929876T2
Application number: DE69929876T
Authority: DE
Inventors: Toshihiko Gotenba-shi OHTOMO; Masayuki Gotenba-shi TSUCHIYA; Yasuo Gotenba-shi KOISHIHARA; Masaaki Tokushima-shi KOSAKA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: US20030180889A1; ATE317900T1; WO1999043803A9; WO1999043803A1; US6613546B1; AU2640299A; ES2255247T3; DE69929876D1; US6908750B2; EP1065269A1; EP1065269B1; EP1065269A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein genomisches Gen, codierend das HM1.24-Antigenprotein, einen Promotor des Gens, codierend das HM1.24-Antigenprotein und Verwendungen davon.
Stand der Technik
Der Maus-anti-HM1.24-monoklonale Antikörper wurde unter Verwendung einer menschlichen Myelomzellinie KPC-32 als Immonogen hergestellt (Goto, T. et al., Blood 84: 1922–1930, 1994). Das HM1.24-Antigen, das von diesem Antikörper erkannt wird, ist ein Membranprotein mit einem Molekulargewicht von 29 bis 33 kDa, das auf der Oberfläche von Myelomzellen überexprimiert wird. Weiterhin wurde seine Expression für normale Zellen und in Immunglobulin-produzierenden B-Zellen (Plasmazellen, lymphoplasmacytoide Zellen) bestätigt, jedoch wird die Expression selten in anderen Zellen und Geweben beobachtet (Goto T. et al., supra). Es ist jedoch nichts über das HM1.24-Antigen bekannt, außer seiner Expressionsverteilung und seinem Molekulargewicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde als Ergebnis der Klonierung der genomischen DNA, codierend das HM1.24-Antigen die Bestimmung seiner Nukleotidsequenz und der deduzierten Aminosäuresequenz und durch weitere Homologierecherche demonstriert, daß das HM1.24-Antigen ein Molekül ist, das identisch zu BST2 ist, wobei es sich um ein Oberflächenantigen handelt, das auf Stromazellen exprimiert wird, die aus dem Knochenmark von Patienten isoliert werden, die Myelom haben und dem Knochenmark und der Synovialmembran von Patienten mit rheumatoider Arthritis. Es wurde gezeigt, daß das BST2 eine Fähigkeit zur Unterstützung des Wachstums von prä-B-Zellen aufweist und es wird angenommen, daß es an der Pathologie der rheumatoiden Arthritis beteiligt ist, jedoch sind andere physiologische Funktionen nicht bekannt (Ishikawa J. et al., Genomics 26: 527–534, 1995).
Bei der Herstellung eines nützlichen Genprodukts, abgeleitet von einem Tier durch gentechnische Verfahren, passiert es häufig, daß das Gen nicht exprimiert wird, ein Genprodukt, ein Protein, keine korrekte Konformation annimmt, die posttranslationale Modifikation nicht korrekt auftritt und ähnliches, wenn ein Mikroorganismuswirt wie Escherichia coli, Bacillus subtilis oder eine Hefe verwendet werden. Um solche Probleme zu lösen werden häufig Tierzellen als Wirtszellen verwendet, in welchem Fall die Selektion eines Promotors eine große Auswirkung auf die Expressionseffizienz hat. Konventionell beinhalten häufig verwendete Promotoren für Tierzellen den SV40-Promotor, den Cytomegalievirus-Promotor, den Actin-Promotor und ähnliche.
Offenbarung der Erfindung
Unter Betrachtung des obigen Standes der Technik wird eine genomische DNA bereitgestellt, codierend das HM1.24-Antigenprotein.
Es wird auch ein Verfahren zur Erzeugung des HM1.24-Antigenproteins durch diese genomische DNA bereitgestellt, wobei Tierzellen verwendet werden.
Wenn ein nützliches Genprodukt in großen Mengen unter Verwendung von tierischen Zellen als Wirt erzeugt werden soll, sind konventionell verwendete Promotoren für tierische Zellen nicht immer zufriedenstellend im Hinblick auf ihre Transkriptionsaktivität und daher besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung stärkerer Promotoren. Es ist so eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine DNA mit einer stärkeren Promotoraktivität als Promotor für tierische Zellen bereitzustellen und Verwendungen davon.
Um die obigen Probleme zu lösen stellt die vorliegende Erfindung eine genomische DNA bereit, codierend das HM1.24-Antigenprotein, wobei die DNA 4 Exonregionen umfaßt, codierend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO.: 3 und drei Introns; wobei das erste Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Val 95 und Met 96 von SEQ ID NO.: 3 positioniert ist; wobei das zweite Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Gly 118 und Glu 119 von SEQ ID NO.: 3 positioniert ist und wobei das dritte Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Arg 138 und Arg 139 von SEQ ID NO.: 3 positioniert ist. Als Beispiel der obigen genomischen DNA stellt die vorliegende Erfindung eine genomische DNA bereit, mit der in SEQ ID NO.: 2 dargestellten Nukleotidsequenz.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Spleißvariante der obigen genomischen DNA bereit, wobei die DNA das HM1.24-Antigenprotein codiert. Ein spezifisches Beispiel der vorliegenden Erfindung ist eine Spleißvariante, der Exons 2 und 3 fehlen.
Zur Information beinhaltet ein anderes Beispiel eine Spleißvariante, der Exon 2 fehlt und ähnliche.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erzeugung des HM1.24-Antigenproteins bereit, wobei das Verfahren die Kultivierung von Tierzellen umfaßt, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der die obige genomische DNA umfaßt.
Es wird auch eine Promotorseqenz-DNA bereitgestellt, die die Nukleotidsequenz des 5'-nicht-codierenden Bereiches aufweist, wie dargestellt in SEQ ID NO.: 4 oder ein DNA-Fragment dieser Sequenz mit einer Promotoraktivität in tierischen Zellen.
Es wird auch eine DNA bereitgestellt, die mit der obigen DNA oder einem Fragment davon unter stringenten Bedingungen hybridisiert und Promotoraktivität in tierischen Zellen aufweist. Die obige DNA mit Promotoraktivität stammt vorzugsweise von tierischen Zellen ab, insbesondere Säugerzellen.
Es wird auch eine DNA bereitgestellt, die durch Deletion, Addition und/oder Substitution mit anderen Nukleotiden von einer oder einer Vielzahl von Nukleotiden in der Nukleotidsequenz des 5'-nicht-codierenden Bereichs wie dargestellt in SEQ ID NO.: 4 modifiziert wurde und eine Promotoraktivität in tierischen Zellen aufweist.
Es wird auch eine rekombinante DNA bereitgestellt, bei der eine nützliches Gen operabel mit der obigen DNA mit einer Promotoraktivität verbunden ist. Als die obigen nützlichen Gene können zum Beispiel Nukleinsäuren erwähnt werden, selektiert aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, die nützliche Proteine codieren, Antisinn-DNA, Antisinn-RNA, Nukleinsäuren codierende Decoys und Ribozyme.
Es wird auch ein Vektor bereitgestellt, umfassend die obige rekombinante DNA. Der Vektor ist ein Plasmidvektor oder ein Virusvektor.
Es werden auch tierische Zellen bereitgestellt, in die die obige rekombinante DNA eingeführt wurde.
Es werden auch tierische Zellen bereitgestellt, die mit dem obigen Vektor transformiert werden.
Es wird auch ein Tier mit den obigen tierischen Zellen bereitgestellt.
Es wird auch ein Verfahren bereitgestellt zur Expression eines nützlichen Gens, wobei das Verfahren das Kultivieren von tierischen Zellen umfaßt, in die die obige rekombinante DNA eingeführt wurde.
Es wird auch ein Verfahren zur Erzeugung eines nützlichen Proteins bereitgestellt, wobei das Verfahren das Kultivieren von tierischen Zellen umfaßt, transformiert mit einem Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure, codierend ein nützliches Protein, operabel gebunden an die obige DNA mit Promotoraktivität.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz von cDNA darstellt, codierend das HM1.24-Antigenprotein und die korrespondierende Aminosäuresequenz. Der unterstrichene Teil zeigt ein N-Typ-Zuckerkettenbindungsmotiv.
2 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz von cDNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein und die korrespondierende Aminosäuresequenz darstellt.
3 ist ein schematisches Diagramm, das einen Klon P3.19 darstellt, isoliert unter Verwendung des Panning-Verfahrens und 5 Klone (IS1 bis IS5), isoliert durch das Immunoscreening-Verfahren.
4 ist eine Zeichnung, die das Ergebnis einer Fluß-Cytometrieanalyse darstellt, wobei der anti-HM1.24-Antikörper verwendet wurde (A: CHO/NEO, B: CHO/HM). Das Histogramm des anti-HM1.24-Antikörpers ist durch eine durchgezogene Linie dargestellt und dasjenige des Kontrollantikörpers (UPC10), der einen passenden Isotyp darstellt, ist durch eine unterbrochene Linie dargestellt. In der Figur betrifft die Abszisse die Fluoreszenzintensität und die Ordinate die Zellzahl.
5 ist ein Photographie, worin die Expression des HM1.24-Antigens in jeder Zellinie und von HM1.24-Antigen-exprimierenden CHO-Zellen durch das Immunopräzipitations/Western-Blot-Verfahren unter Verwendung des anti-HM1.24-Antikörpers nachgewiesen wurde. Nach einer Immunopräzipitation unter Verwendung von anti-HM1.24-Antikörper-gebundener Sepharose 4B (Spuren 1–6) oder ungebundener Sepharose 4B (Spuren 7 und 8) wurde ein Western-Blot unter Verwendung von anti-HM1.24-Antikörper durchgeführt um HM1.24-Antigen nachzuweisen (rechts dargestellt). (*: anti-HM1.24-Antikörper-H-Kette).
6 ist eine Zeichnung die eine Restriktionskarte des 5'-nicht-translatierten Bereichs darstellt, umfassend den Promotorbereich des HM1.24-Antigenproteingens.
7 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz des 5'-nicht-translatierten Bereichs darstellt, umfassend den Promotorbereich des HM1.24-Antigenproteingens. Jedes Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv wurde unterstrichen.
8 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz des 5'-nicht-translatierten Bereichs darstellt, umfassend den Promotorbereich des HM1.24-Antigenproteingens. Jedes Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiv wurde unterstrichen, die TATA-ähnliche Sequenz wurde mit einem Kästchen versehen, der Translationsinitiationspunkt ist durch einen Pfeil dargestellt und der Bereich, codierend 7 Aminosäuren am N-terminalen Ende des Proteins ist durch den Einbuchstabencode der Aminosäuren repräsentiert.
In 9 zeigt (A) die Position eines Primers, korrespondierend zu den Genom, codierend das HM1.24-Antigenprotein und (B) zeigt die Basensequenz von jedem Primer.
10 ist eine Zeichnung, die eine Restriktionskarte der genomischen DNA darstellt, codierend das HM1.24-Antigenprotein und die Positionen der korrespondierenden Exons und Introns.
11 ist eine Zeichnung, die eine Restriktionskarte von genomischer DNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein darstellt und die korrespondierende Aminosäuresequenz (stromaufwärts gelegene Seite). Der Pfeil zeigt den Transkriptionsinitiationspunkt und die Unterstreichung zeigt das Zuckerkettenbindungsmotiv vom N-Typ.
12 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz der genomischen DNA darstellt, codierend das HM1.24-Antigenprotein und die korrespondierende Aminosäuresequenz (stromabwärts gelegene Seite). Die doppelte Unterstreichung zeigt das Poly-A-Additionssignal.
13 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz der Spleißvariante des menschlichen HM1.24-Antigenproteins darstellt und die korrespondierende Aminosäuresequenz. Der unterstrichene Teil zeigt, wo sich die Aminosäuresequenz von der von menschlichem HM1.24-Antigenprotein unterscheidet.
14 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz der genomischen DNA des HM1.24-Antigenproteins darstellt. Ein Genom lag vor, das die Mutationen a → g an Position 178, g → a an Position 262 und t → c an Position 232, wie auch eine Deletion von einem von 9 a's nahe Position 360 aufwies. Das Symbol "*" repräsentiert einen Transkriptionsinitiationspunkt. Es gab auch ein Genom, worin sich 19 bp an den Positionen 93–111 im Tandem wiederholen. Das Symbol "→" zeigt die Position des Sinn-Primers.
15 zeigt die Nukleotidsequenz von genomischer DNA des HM1.24-Antigenproteins und der korrespondierenden Aminosäuresequenz. Es gab auch ein Genom, worin 8 Basenpaare an Positionen 551–558 deletiert waren. Das Symbol "←" zeigt die Position des Antisinn-Primers.
16 ist eine Zeichnung, die die Nukleotidsequenz von genomischer DNA (Intronstelle) des HM1.24-Antigenproteins darstellt. Der → zeigt die Position des Sinn-Primers.
17 zeigt die Nukleotidsequenz von genomischer DNA des HM1.24-Antigenproteins und der korrespondierenden Aminosäuresequenz. Der → zeigt den Sinn-Primer und der ← zeigt den Antisinn-Primer.
18 zeigt die Nukleotidsequenz von genomischer DNA des HM1.24-Antigenproteins und der korrespondierenden Aminosäuresequenz. Es gab auch ein Genom, worin 3 von 5 c nahe Position 2315 deletiert waren. Der ← zeigt die Position des Antisinn-Primers.
Erfindungsgemäße Ausführungsform
Ein genomisches Gen, umfassend eine genomische DNA und einen Promotorbereich von menschlichem HM1.24-Antigen können einfach durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert werden. So kann eine genomische DNA von menschlichem HM1.24-Antigen durch Entwurf eines Sinn-Primers amplifiziert werden, der an das 5'-Ende einer genomischen DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 hybridisiert und eines Antisinn-Primers, der an das 3'-Ende hybridisiert und dann durch Durchführung einer PCR-Reaktion unter Verwendung einer Polymerase, wie zum Beispiel AmpliTaq (Perkin Elmer), LA-Taq (Takara Shuzo) und ähnlichen und unter Verwendung einer menschlichen genomischen DNA als Matrize, hergestellt gemäß einem Standardverfahren. Ein PCR-Produkt kann direkt in einen Klonierungsvektor wie zum Beispiel pCRII (Invitrogen) oder pGEM-T (Promega) inseriert werden.
Durch Einführung einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle in einen Sinn-Primer oder einen Antisinn-Primer kann er in einen gewünschten Vektor inseriert werden.
Genomische DNA, die einen Promotorbereich von menschlichem HM1.24-Antigen enthält, kann auch durch dasselbe Verfahren amplifiziert werden. So kann ein gewünschtes DNA-Fragment durch Entwurf eines Sinnprimers erhalten werden, der an das 5'-Ende der Sequenz gemäß SEQ ID NO.: 4 hybridisiert und eines Antisinn-Primers, der an das 3'-Ende hybridisiert und dann durch Amplifikation der PCR-Reaktion unter Verwendung menschlicher genomischer DNA als Matrize.
Eine genomische DNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein der vorliegenden Erfindung umfaßt wie dargestellt in 10 4 Exons und 3 Introns, die sie verbinden und ihre spezifischen Nukleotidsequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Exon-Bereiche sind in den 11 und 12 dargestellt (SEQ ID NOs: 2 und 3). So codiert Exon 1 von Aminosäure Met an Position 1 bis Aminosäure Val an Position 95; Exon 2 codiert von Aminosäure Met an Position 96 bis Aminosäure Gly an Position 118; Exon 3 codiert von Aminosäure Glu an Position 119 bis Aminosäure Arg an Position 138; und Exon 4 codiert von Aminosäure Arg an Position 139 bis Aminosäure Gln an Position 180.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Spleißvarianten genomischer DNA bereit, codieren das HM1.24-Antigenprotein, worin Exons 2 und 3 entfernt sind.
Es werden auch Spleißvarianten von genomischer DNA bereitgestellt, codierend das HM1.24-Antigenprotein mit einer Nukleotidsequenz einer DNA, worin das Codon, korrespondierend zu jeder Aminosäure eines Exons, das sich außerhalb der Position befindet, da die Nukleotidsequenz in einem Exon aufgrund eines Spleißens deletiert wurde.
Da die Spleißvarianten die Leserahmen unterschiedlicher Aminosäuresequenzen aufweisen, haben sie andere Aminosäuresequenzen als das HM1.24-Antigenprotein, codiert durch Exons 1 bis 4. Als Beispiel solcher Spleißvarianten kann eine Spleißvariante erwähnt werden, die die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 17 aufweist.
Eine genomische DNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein der vorliegenden Erfindung kann durch Klonieren einer cDNA erhalten werden, die das HM1.24-Antigenprotein codiert, dann unter Verwendung dieser cDNA zum Entwurf eines Primer-Oligonukleotids, das durch das PCR-Verfahren unter Verwendung genomischer DNA als Matrize amplifiziert wird. Um die cDNA zu klonieren, werden tierische Zellen, exprimierend das HM1.24-Antigen, zum Beispiel KPMM2-Zellen kultiviert und aus der Zellkultur wird Gesamt-RNA gemäß Standardverfahren extrahiert und dann wird mRNA angereichert.
Zur Information wird, basierend auf der obigen mRNA, cDNA durch ein Standardverfahren synthetisiert, die unter Verwendung eines niedrigschmelzenden Agarosegels fraktioniert wird. Dann wird cDNA mit einer Größe von 0,7 kbp oder mehr in den Expressionsvektor pCOS1 oder λExCell zur Herstellung einer Bibliothek A inseriert, die zum Screening durch direkte Expressionsklonierung, d.h. Panning verwendet wird und einer Bibliothek B, die für ein Immunoscreening verwendet wird.
Für das Screening durch das Panningverfahren wurde ein Expressionsplasmid, das die Bibliothek A bildet, in COS-7-Zellen unter Verwendung einer Elektroporation eingeführt. Nach der Kultivierung wurden die angehafteten Zellen abgekratzt und mit einer Panningplatte kontaktiert, beschichtet mit anti-HM1.24-Antikörper, damit die Zellen, die HM1.24 exprimierten an die Platte anhaften konnten. Dann wurde Plasmid-DNA von den Zellen extrahiert, gebunden an die Platte, in E. coli amplifiziert und für darauffolgendes Panning verwendet. Das Panningverfahren wurde dreimal wiederholt, um Klone zu selektieren, die Antigen exprimieren, das mit dem anti-HM1.24-Antikörper reagiert und einer der Klone wurde als Klon P3.19 bezeichnet.
Eine Sequenzierung ergab, daß Klon P3.19 aus 1012 bp besteht und einen offenen Leserahmen, codierend 180 Aminosäuren, enthält. Die Nukleotidsequenz des cDNA-Inserts in diesem Klon P3.19 und die korrespondierende Aminosäuresequenz sind in 1 und SEQ ID NO.: 1 dargestellt. Die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ ID NO.: 3 dargestellt.
Für das Immunoscreening wurde andererseits eine Phagenkonstituierende Bibliothek B zusammen mit E. coli NM522 auf einer Agarplatte kultiviert, das Expressionsprodukt wurde auf einen Nitrocellulosefilter übertragen und der Filter wurde mit einer anti-HM1.24-Antikörperlösung kontaktiert. anti-HM1.24-Antikörper, der über Bindung mit dem Expressionsprodukt an einen Filter gebunden hatte, wurde mit markiertem anti-Maus-Immunglobulin (Ig)-Serum nachgewiesen.
Dies ergab 5 positive Klone: IS-1 bis IS-5. Die Nukleotidsequenzen dieser cDNA-Inserts wurden bestimmt und mit der Nukleotidsequenz der cDNA von P3.19 verglichen. Der Vergleich ergab wie dargestellt in 3, daß alle cDNAs in den Klonen IS-1 bis IS-5 ein Teil der cDNA von P3.19 waren und daß das 5'-Ende bei P3.19 deletiert war.
Dann wurde nach Einführung von P3.19 in CHO-Zellen zur Transformation der Zellen eine Flußcytometrie unter Verwendung des anti-HM1.24-Antikörpers durchgeführt. Das Ergebnis bestätigte, wie dargestellt in 4, daß HM1.24-Antigen exprimiert wurde. weiterhin wurde auch durch Immunopräzipitation betätigt, wie dargestellt in 4, daß P3.19 das HM1.24-Antigen codiert.
Dann, wie dargestellt in 9A wurde die cDNA-Sequenz in vier Bereiche unterteilt und Primerpaare wurden wie dargestellt in 9B zur Amplifikation jedes Teils entworfen. Die gemäß eines Standardverfahrens hergestellte genomische Bibliothek wurde durch PCR unter Verwendung der obigen jeweiligen Primerpaare amplifiziert, die dann ligiert wurden, um Gesamtlängen genomische DNA zu erhalten.
Das Ergebnis ist in den 11 und 12 und SEQ ID NO.: 2 dargestellt. Wie man sehen kann, weist die genomische DNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein 4 Exons und 3 Introns, die sie verbinden, auf. Diese Beziehungen sind schematisch in 10 dargestellt, worin auch eine Restriktionskarte der genomischen DNA dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung des HM1.24-Antigenproteins, wobei das Verfahren die Kultivierung von tierischen Zellen umfaßt, transformiert mit einem Expressionsvektor, in den die obige genomische DNA inseriert wurde. Als tierische Zellen zur Verwendung in diesem Verfahren können verschiedene tierische Zellen, zum Beispiel die unten beschriebenen im Hinblick auf die hier erwähnten Promotoren verwendet werden und Zellkulturen von Menschen, Säugern, wobei es nicht um Menschen handelt, Insekten und ähnlichen werden bevorzugt. Zum Beispiel werden HeLa-Zellen usw. als Zellkultur des Menschen verwendet; CHO, COS, Myelom, BHK, Vero usw. werden als Zellkulturen von Säugern, wobei es sich nicht um den Menschen handelt, erwähnt und Zellkulturen der Seidenraupe usw. werden als Zellkulturen von Insekten erwähnt. Als Vektoren zur Einführung von DNA, die das HM1.24-Antigenprotein der vorliegenden Erfindung codiert, in tierische Zellen, werden zum Beispiel Phagenvektoren wie M12 verwendet.
Die Kultivierung von tierischen Zellen zur Erzeugung des HM1.24-Antigenproteins kann gemäß einem Standardverfahren durchgeführt werden und die Isolierung des HM1.24-Antigenproteins aus der Kultur kann auch gemäß einem Standardverfahren durchgeführt werden.
Das Hybridom HM1.24, das den Maus-anti-HM1.24-monoklonalen Antikörper erzeugt, der spezifisch das HM1.24-Antigenprotein erkennt, wurde international gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags als FERM BP-5233 am 14. September 1995 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan hinterlegt.
Der hier erwähnte Promotor und seine Verwendungen werden nun unten beschrieben.
Das Wort "Promotor" wie hier verwendet, beinhaltet, ist jedoch nicht begrenzt auf, einen Bereich, der 20–30 Basenpaare stromaufwärts zum Transkriptionsinitationspunkt (+1) lokalisiert ist und die TATA-Box oder einen TATA-Box-ähnlichen Bereich beinhaltet, der für das Dirigieren der RNA-Polymerase zum Start der Transkription an korrekter Stellung verantwortlich ist und zusätzlich zu diesem Bereich kann er Bereiche beinhalten, die für Proteine nötig sind, wobei es sich nicht um RNA-Polymerase handelt, zur Assoziation zur Anpassung der Expression. Wenn die Bezeichnung "Promotorbereich" hier erwähnt wird, bedeutet dies einen Bereich, der den wie hier verwendeten Promotor beinhaltet.
Die Bezeichnung "Promotoraktivität" wie hier verwendet bedeutet eine Fähigkeit oder Funktion zur Ligation an ein nützliches Gen stromabwärts vom Promotor in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, so daß er, wenn er in einen Wirt (tierische Zelle) eingeführt wird, entweder intrazellulär oder extrazellulär ein Genprodukt des nützlichen Gens erzeugen kann. Im allgemeinen wird die Gegenwart oder Abwesenheit und/oder Intensität eines Promotors als Promotoraktivität durch Ligation, stromabwärts vom Promotor eines Gens (Reportergens), codierend ein einfach quantifizierbares Protein in einem Zustand ausgedrückt, der die Expression ermöglicht, Einführung in einen Wirt und dann Bestimmung der exprimierten Menge des Proteins. Wenn dann die Expression von Genprodukten eines nützlichen Gens entweder intrazellulär oder extrazellulär bestätigt wurde, nachdem das nützliche Gen stromabwärts von dem Promotor ligiert und in einen Wirt eingeführt wurde, sollte der Promotor eine Promotoraktivität in dem Wirt aufweisen, in den das Gen eingeführt wurde.
Die Worte "tierische Zellen" wie hier verwendet, beinhalten Zellen, die vom Menschen abstammen, sind jedoch nicht auf diese begrenzt, solang der hier erwähnte Promotor eine Promotoraktivität in einer tierischen Zelle aufweist. Es können zum Beispiel Säuger erwähnt werden, bei denen es sich nicht um Menschen handelt (zum Beispiel Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schweine, Rinder, Pferde, Hunde, Affen und Schimpansen), Vögel (zum Beispiel Hühner, Truthähne, Wachteln Enten und Gänse), Reptilien (zum Beispiel Schlangen, Krokodile und Schildkröten), Amphibien (zum Beispiel Frösche, Salamander und Molche), Fische (zum Beispiel Stachelmakrelen (Scads), Makrelen, Seebarsche, Goldbrassen, Zackenbarsche (sea perch), Gelbschwänze, Thunfische, Lachse, Forellen, Karpfen, Sweetfisch, Aale, Seezungen, Haie, Rochen und Störe).
Die Wörter "nützliche Gene" wie hier verwendet, beinhalten zum Beispiel Nukleinsäuren, die Proteine codieren, die in tierischen Zellen exprimiert werden können, Antisinn-DNA und Sinn-DNA von Genen, abstammend von tierischen Zellen, Nukleinsäuren, die Decoys codieren, die Gene aufweisen, die die Bindungsproteine von Transkriptionsfaktoren codieren, abgeleitet von tierischen Zellen oder Sequenzen der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren oder ähnliche Sequenzen und Ribozyme, die mRNA spalten, abgeleitet von tierischen Zellen.
Nukleinsäuren, die ein Protein codieren, das in tierischen Zellen exprimiert werden kann beinhalten diejenigen, die von Tieren abstammen solange sie in tierischen Zellen exprimiert werden können, diejenigen, die von Mikroorganismen abstammen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefen, Actinomyceten, Pilzen, Ascomyceten und Basidiomyceten oder diejenigen, die von lebenden Organismen abstammen, wie zum Beispiel Pflanzen und Insekten, sind jedoch nicht auf diese begrenzt und sind ebenfalls in den nützlichen Genen beinhaltet, die in dieser Beschreibung erwähnt sind.
Die Wörter "Nukleinsäuren, die Decoys codieren" wie hier verwendet bedeuten DNA, die Gene aufweist, codierend die Bindungsproteine von Transkriptionsfaktoren, abgeleitet von tierischen Zellen oder Sequenzen der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren oder ähnliche Sequenzen, die als "Decoys" in Zellen eingeführt werden, um die Wirkungen der Transkriptionsfaktoren zu unterdrücken. Die Bezeichnung "Ribozym" wie hier verwendet bedeutet diejenigen, die mRNA von spezifischen Proteinen spalten, und die die Translation dieser spezifischen Proteine inhibieren.
Ein Ribozym kann aus den Sequenzen entworfen werden, codierend spezifische Proteine und für ein hammerkopfartiges Ribozym kann zum Bsp. das in FEBS Letter, 228: 228–230 (1988) beschriebene verwendet werden. Zusätzlich zu den hammerkopfartigen Ribozymen können alle Ribozymarten, einschließlich haarnadelschleifenartigen Ribozyme, deltaartigen Ribozyme und ähnliche verwendet werden die mRNA dieser spezifischen Proteine spalten und die die Translation dieser spezifischen Proteine inhibieren und können als Ribozym, wie hier verwendet, beinhaltet sein.
Durch Ligation eines nützlichen Gens stromabwärts zu einem DNA-Fragment mit der hier beschriebenen Promotoraktivität in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, kann die Expression des nützlichen Gens verstärkt werden. So werden nützliche Gene in tierischen Zellen exprimiert, in die die rekombinante DNA, umfassend DNA mit der hier beschriebenen Promotoraktivität und ein nützliches Gen, ligiert in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, eingeführt wurde, mit oder ohne Verwendung eines Vektors. Als ein Vektor werden Plasmidvektoren oder Virusvektoren vorzugsweise verwendet. Wenn keine Vektoren verwendet werden, können DNA-Fragmente gemäß den in der Literatur beschriebenen Verfahren eingeführt werden [Virology, 52: 456 (1973); Molecular and Cellular Biology, 7: 2745 (1987); Journal of the National Cancer Institute, 41: 351 (1968); EMBO Journal, 1: 841 (1982)].
Tierische Zellen mit solchen rekombinanten DNA-Fragmenten wie hier beschrieben und Tiere mit solchen tierischen Zellen sind ebenfalls umfaßt. Als nützliche Gene, deren Expression verstärkt werden kann, können wie oben beschrieben DNA-codierendes Protein, Antisinn-DNA, Antisinn-RNA, Polynukleotide, codierend ein Decoy, Nukleotidsequenzen, die als Decoy funktionieren, Ribozyme und ähnliches erwähnt werden. Es werden auch Verfahren zur Erzeugung der Proteine von Interesse offenbart und Verfahren zur Expression nützlicher Gene unter Verwendung eines DNA-Fragments mit der hier beschriebenen Promotoraktivität.
So ist auch ein Verfahren zur Erzeugung eines Proteins hier umfaßt, wobei das Verfahren die Ligation einer Nukleinsäure, codierend ein Protein stromabwärts von einer DNA umfaßt, die die hier beschriebene Promotoraktivität aufweist, in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, wie auch die Kultivierung einer tierischen Zelle, transformiert mit einem Vektor, enthaltend die so erhaltene rekombinante DNA und Ernte des Proteins aus der Kultur. Auf ähnliche weise wird hier ein Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens beschrieben, umfassend die Ligation eines nützlichen Gens stromabwärts von einer DNA mit der hier beschriebenen Promotoraktivität in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, Einführung der so erhaltenen rekombinanten DNA in eine tierische Zelle und Kultivierung oder ein Verfahren zur Expression eines nützlichen Gens unter Verwendung einer tierischen Zelle, wobei das Verfahren die Transformation einer tierischen Zelle mit einem Vektor umfaßt, enthaltend die rekombinante DNA und Kultivierung der tierischen Zelle.
DNA mit der hier beschriebenen Promotoraktivität ist eine DNA mit der am 5'-Ende des nicht-codierenden Bereiches gemäß SEQ ID NO.: 4 oder einem Fragment davon, daß die Promotoraktivität beibehält, dargestellten Nukleotidsequenz. Der nicht-codierende Bereich des 5'-Endes bedeutet die Nukleotidsequenz bis zur Position 2040 in SEQ ID NO.: 4. Es ist bekannt, daß eine Größe von 5 Nukleotiden oder mehr nötig ist, um eine Promotoraktivität in tierischen Zellen auszuüben. So haben DNA-Fragmente mit der hier beschriebenen Promotoraktivität eine Größe von mindestens 5 Nukleotiden oder mehr, vorzugsweise 30 Nukleotiden oder mehr und noch bevorzugter 2000 Nukleotiden oder mehr.
Hier wird auch eine DNA beschrieben, die mit der DNA in SEQ ID NO.: 4 dargestellten Nukleotidsequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und eine Promotoraktivität aufweist. Die hybridisierende DNA ist zum Beispiel eine genomische DNA-Bibliothek, abgeleitet von natürlichen Quellen, zum Beispiel Säugern wie den Menschen, Mäusen, Ratten und Affen. Als stringente Bedingungen können zum Beispiel niedrig-stringente Bedingungen erwähnt werden. Beispielsweise ist eine niedrig stringente Bedingung eine Waschbedingung von 42°C in 5 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat und 50% Formamid. Noch bevorzugter kann eine hoch stringente Bedingung erwähnt werden. Beispielsweise ist eine hoch stringente Bedingung eine Waschbedingung, bereitgestellt durch 60°C in 0,1 × SSC und 0,1% Natriumdodecylsulfat.
Hier wird auch ein DNA-Fragment beschrieben, das durch Deletion, Addition und/oder Substitution mit anderen Basen von einer oder einer Vielzahl von Nukleotiden in der Nukleotidsequenz des Promotors gemäß SEQ ID NO.: 4 modifiziert wurde und eine Promotoraktivität beibehält. Der Modifikationsgrad liegt im Bereich von 70% Homologie zu der in SEQ ID NO.: 4 dargestellten Nukleotidsequenz, vorzugsweise einer Homologie von 80% oder mehr und noch bevorzugter einer Homologie von 90% oder mehr.
"Homologie" wie hier verwendet, bedeutet den Identitätsgrad von Resten, der von zwei oder mehr nicht-komplementären Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen gezeigt wird (Gene Cloning 2. Auflage, T. A. Brown, Chapman und Hall, 1990). So bedeutet eine Homologie von 90%, daß 90 Reste oder mehr von 100 in zwei oder mehr Sequenzen identisch sind.
Nun wird ein Verfahren zur Erzeugung von DNA mit der hier beschriebenen Promotoraktivität, eines Fragments und einer modifizierten Version davon unten beschrieben. Die DNA mit der in SEQ ID NO.: 4 dargestellten Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung eines Primers AP1 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3') (SEQ ID NO.: 5) korrespondierend zu einem Adapter und dem HM1-Primer (Sequenz: 5'-ATC CCC GTC TTC CAT GGG CAC TCT GCA-3' (SEQ ID NO.: 6) korrespondierend zu Nukleotid-Nrn. 47–72 des cDNA-Klons P3.19, kloniert durch das oben erwähnte Panning-Verfahren und einer menschlichen genomischen DNA-Bibliothek als Matrize durch PCR amplifiziert und dann unter Verwendung des PCR-amplifizierten Produkts als Matrize wurde eine Nest-PCR unter Verwendung des AP2-Primers (Sequenz: ACTATAGGGCACGCGTGGT) (SEQ ID NO.: 7) und HM2-Primers (Sequenz 5'- ATA GTC ATA CGA AGT AGA TGC CAT CCA G-3') (SEQ ID NO.: 8) korrespondierend zu Nukleotiden 19–40 von Klon P3.19 zum Subklonieren in einen Klonierungsvektor pCRII (Invitrogen) durchgeführt. Durch das Sequenzieren wurde eine DNA mit der in SEQ ID NO.: 4 dargestellten Nukleotidsequenz erhalten.
Ein DNA-Fragment mit einem Promotor kann zum Beispiel auf folgende Weise erhalten werden. Ein Verfahren zum Verdau einer DNA, subkloniert in den obigen Klinierungsvektor pCRII mit den Restriktionsenzymen ScaI, BamHI, PvuII, PstI, usw., ein Verfahren unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung, eine chemische Synthese durch das Phosphoamidid-Verfahren, ein Herstellungsverfahren unter Verwendung einer PCR usw. können verwendet werden. Zum Beispiel kann ein gewünschtes DNA-Fragment einfach durch die Herstellung eines Primers wie geeignet aus der DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO.: 4 und Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion hergestellt werden.
Ein Hybridisierungsverfahren, das die Nukleotidsequenz des hier beschriebenen Promotors verwendet, kann verwendet werden, um einen Promotor von einem Gen, abgeleitet von anderen Zellen zu erhalten. In diesem Fall kann zum Beispiel das folgende Verfahren verwendet werden. Zunächst wird eine chromosomale DNA, erhalten von einer Gen-Quelle von anderen Zellen in ein Plasmid oder einen Phagenvektor ligiert und dann in einen Wirt gemäß einem Standardverfahren zur Konstruktion einer Bibliothek eingeführt. Die Bibliothek wird auf einer Platte kultiviert und Kolonien oder Plaques, die gewachsen sind, werden auf eine Nitrocellulos- oder Nylonmembran übertragen, die einer Denaturierung zur Immobilisierung der DNA auf der Membran unterzogen wird. Die Membran wird in einer Lösung inkubiert, enthaltend eine Sonde (als Sonde wird ein DNA-Fragment gemäß SEQ ID NO.: 4 oder ein Teil davon verwendet), die vorher mit ³²P usw. markiert wurde, um ein Hybrid zwischen der DNA auf der Membran und der Sonde zu bilden.
Zum Beispiel wurde eine DNA immobilisierte Membran einer Hybridisierung mit einer Sonde in einer Lösung, enthaltend 6 × SSC, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 5 × Denhardt's bei 65°C für 20 Stunden unterzogen. Nach der Hybridisierung wird die nicht-spezifische Adsorption abgewaschen und ein Autoradiogramm usw. wird durchgeführt um Klone zu identifizieren, die mit der Sonde hybridisiert sind. Das Verfahren wird wiederholt, bis ein einzelner Klon, der ein Hybrid bildete, erhalten wird. In einen so erhaltenen Klon sollte eine DNA, codierend einen gewünschten Promotor eingeführt werden.
Der obige Promotor, der durch die Deletion, Addition und/oder Substitution von Nukleotiden modifiziert wurde, kann zum Beispiel durch konventionell bekannte Verfahren wie zum Beispiel eine ortsgerichtete Mutagenese oder ein PCR-Verfahren hergestellt werden.
Das erhaltene Gen wird im Hinblick auf seine Nukleotidsequenz sequenziert, zum Beispiel auf die folgende Weis um zu bestätigen, daß das erhaltene Gen der Promotor von Interesse ist. Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wird im Fall eines Klons, erhalten durch Hybridisierung, der Transformant in einem Teströhrchen kultiviert, falls es sich um E. coli handelt und ein Plasmid wird dann daraus gemäß einem Standardverfahren extrahiert. Dies wird mit einem Restriktionsenzym gespalten, um ein inseriertes Fragment zu extrahieren, das in einen M12 Phagenvektor usw. subkloniert wird und die Nukleotidsequenz wird durch das Didesoxyverfahren oder ähnliche bestimmt.
Wenn der Transformant ein Phage ist, können im wesentlichen ähnliche Schritt zur Bestimmung der Nukleotidsequenz verwendet werden. Standardverfahren von der Kultivierung bis zur Nukleotidsequenzbestimmung werden wie zum Beispiel in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, T. Maniatis, Kapitel 1, S. 90–104, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 beschrieben durchgeführt.
Ob das erhaltene Gen ein Promotor von Interesse ist oder nicht kann bestimmt werden, indem die bestimmte Nukleotidsequenz mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung verglichen wird und die Homologie geschätzt wird. Wenn angenommen wird, daß das erhaltene Gen nicht einen gesamten Promotor enthält wird ein synthetischer DNA-Primer, basierend auf dem erhaltenen Gen konstruiert, fehlende Regionen werden durch PCR amplifiziert und das erhaltene Gen-Fragment wird als Sonde zum Screening von DNA oder cDNA-Bibliotheken verwendet, so daß die Nukleotidsequenz des gesamten codierenden Bereichs des Promotors, der mit dem hier beschriebenen Promotor hybridisiert, bestimmt werden kann.
Das Verfahren zur Expression nützlicher Gene wie hier beschrieben ist dadurch gekennzeichnet, daß ein DNA-Fragment, das durch Ligation in einem Zustand, der eine Expression ermöglicht, eines nützlichen Gens stromabwärts zu dem hier beschriebenen Promotor erhalten wird, in eine tierische Zelle eingeführt wird und die resultierende Zelle kultiviert wird.
Für die Ligation eines nützlichen Gens stromabwärts zu dem DNA-Fragment des hier beschriebenen Promotors wie oben hergestellt in einem Zustand, der die Expression ermöglicht, können das DNA-Ligaseverfahren oder das Homopolymerverfahren verwendet werden.
Wenn eine DNA-Ligase für die Ligation der beiden verwendet wird, werden sie durch Verdau mit Restriktionsenzymen ligiert und wenn sie dieselbe Restriktionsenzymstelle aufweisen, dann werden beide DNA-Fragmente in einem Reaktionspuffer wie beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, T. Maniatis et al. Hrsg., Kapitel eins, S. 62, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 vermischt und durch Zugabe einer DNA-Ligase dazu oder, falls sie sich nicht dieselbe Restriktionsenzymstelle teilen, werden die Enden mit T4 DNA-Polymerase (hergestellt von Takara) glatt gemacht und dann mit DNA-Ligase wie oben beschrieben behandelt.
Wenn andererseits das Homopolymerverfahren verwendet wird, wird die Ligation durch Anhaftung einer Poly-G-Kette an das 3'-Ende eines Vektors, linearisiert mit einem Restriktionsenzym unter Verwendung der terminalen Desoxyribonukleotidyltransferase und dGTP, Anhaften auf ähnliche Weise einer Poly-C-Kette an das 3'-Ende der Insert-DNA und dann Verkleben dieser Poly G-Kette und Poly-C-Kette zum Beispiel durch das Calciumchloridverfahren zur Einführung in E. coli [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727 (1978)] bewirkt.
Die nützlichen Gene von Interesse, die wie hier beschrieben verwendet werden können, beinhalten das Interleukin 1–12 Gen, die Interferon α-, β-, γ-Gene, das Tumornekrosefaktorgen, das koloniestimulierende Faktorgen, das Erythropoietin-Gen, das transformierende Wachstumsfaktor-β-Gen, das Immunoglobulin-Gen, das Gewebsplasminogen-Aktivatorgen, das Urokinasegen, das Meerrettichperoxidasegen und ähnliche, sind jedoch nicht darauf begrenzt.
Es können zum Beispiel Gene der Superoxiddismutase, des Tumornekrosefaktors, Insulin, Calcitonin, Somatostatin, Secretin, Wachstumshormon, Endorphin, virales Protein, Amylase, Lipase, Alkoholdehydrogenase und ähnliche erwähnt werden.
Das oben erhaltene DNA-Fragment, worin die genomische DNA der vorliegenden Erfindung und ein nützliches Gen ligiert sind, können in einen geeigneten Vektor zum Erhalt eines Plasmids für die Gen-Expression integriert werden. Beispiele für solche Vektoren beinhalten pTM [Nucleic Acids Research, 10: 6715 (1982)], cos202 [The EMBO Journal, 6: 355 (1987)], p91203 (B) [Science, 228: 810 (1985)], BCMGSNeo [Journal of Experimental Medicine, 172: 969 (1990)] und ähnliche.
Das so für eine Gen-Expression erhaltene Plasmid kann in einen geeigneten Wirt durch das Calciumphosphat-Verfahren [Molecular und Cellular Biology, 7: 2745 (1987)], das Elektroporationsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984)], Das DEAE-Dextran-Verfahren [Methods in Nucleic Acids Research, Seite 283, Column et al., Hrsg. CRC Press, herausgegeben 1991], das Liposomen-Verfahren [BioTechniques, 6: 682 (1989)] und ähnliche eingeführt werden.
Beispiele für solche Wirtszellen beinhalten COS-Zellen. HeLa-Zellen, CHO-Zellen, BHK-21-Zellen und ähnliche. Durch Kultivierung der resultierenden transformierten Zellen in einem geeigneten Medium kann das nützliche Genprodukt von Interesse auf effiziente Weise erhalten werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail unter Bezugnahme auf die folgenden Arbeits- und Referenzbeispiele beschrieben.
Referenzbeispiel 1: Klonierung von cDNA, codierend des HM1.24-Antigenprotein
1) Zellinien
Die menschlichen multiplen Myelomzellinien RPMI8226 und U266 wurden in einem RPMI1640-Medium (GIBCO-BRL), supplementiert mit 10%igem fötalem Rinderserum (FBS), kultiviert und eine menschliche multiple Myelomzellinie KPMM2 (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 7-236475) wurde in einem RPMI1640-Medium (GIBCO-BRL), supplementiert mit 20%igem fötalem Rinderserum kultiviert.
2) Konstruktion der cDNA-Bibliothek
Gesamt-RNA wurde von 1 × 10⁸ KPMM2-Zellen durch ein Guanidinthiocyanat/Cäsiumchlorid-Verfahren isoliert und die mRNA wurde unter Verwendung des Fast Track mRNA-Isolation Kit (Invitrogen) gereinigt. Nach Synthese der cDNA aus 10 μg mRNA unter Verwendung von NotI/oligo-dT₁₈-Primer (Time Saver cDNA Synthesis Kit; Pharmacia Biotech) wurde ein EcoRI-Adapter daran ligiert. Eine cDNA mit einer Größe von mehr als 0,7 kbp wurde unter Verwendung eines 1,0%-Niedrigschmelzpunkt-Agarosegels (Sigma) fraktioniert und mit NotI verdaut. Diese wurde dann in die EcoRI/NotI-Stelle eines pCOS1-Expressionsvektors oder eines λExCell-Vektors (Pharmacia Biotech) zur Herstellung einer Bibliothek (Bibliothek A) zur Verwendung beim direkten Expressionsklonieren (Screening durch Panning) bzw. einer Bibliothek (Bibliothek B) zur Verwendung beim Immunoscreening inseriert.
Der PCOS1-Expressionsvektor wurde aus HEF-PMh-gλ1 (siehe WO92-19759) durch Deletion des enthaltenen Gens mit EcoRI- und SmaI-Verdau und dann durch Ligation des EcoRI-NotI-BamHI-Adapters (Takara Shuzo) konstruiert.
3) Panning
Die Bibliothek A wurde in COS-7-Zellen durch das Elektroporationsverfahren eingeführt. Dann wurden 20 μg einer Plasmid-DNA (enthaltend 5 × 10⁵ unabhängige Klone) mit 0,8 ml der Zellen (1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS) vermischt und die Mischung wurde einer Elektroporation unter einer Bedingung von 1,5 kV und 25 μFD-Kapazität unter Verwendung des Gene Pulser (Bio-Rad) unterzogen. Nachdem man dies bei Raumtemperatur 10 Minuten stehenließ, wurden die Zellen in DMEM (hergestellt von GIBCO-BRL), enthaltend 10% FBS suspendiert, in vier 100 mm-Kulturschalen verteilt und 72 Stunden bei 37°C kultiviert.
Nach dem Kultivieren wurden die Zellen mit Phosphatsalzpuffer (PBS) gewaschen und durch Zugabe von PBS, enthaltend 5 mM EDTA abgeschabt um die Zellsuspension auf 1 bis 2 × 10⁶ Zellen/ml in PBS, enthaltend 5% FBS und 0,02% NaN₃ einzustellen. Man ließ die Zellen dann auf einer Panningplatte (siehe unten) stehen, beschichtet mit anti-HM1.24-Antikörper für 2 Stunden und die Platte wurde vorsichtig dreimal mit 3 ml PBS, enthaltend 5% FBS und 0,02% NaN₃ gewaschen. Nach dem Waschen wurde die Plasmid-DNA aus den Zellen, die an die Platte gebunden hatten, unter Verwendung von Hirt's-Lösung (Hitt J., Mol. Biol. 26: 365–369, 1983) (0,6% SDS 10 mM EDTA) gewonnen. Die gewonnene Plasmid-DNA wurde in E. coli amplifiziert und für das folgende Panning verwendet.
Eine Panningplatte wurde wie folgt hergestellt: 3 ml einer anti-HM1.24-Antikörperlösung (10 μg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 9,5) wurde zu einer Zellkulturschale (Falcon) mit einem Durchmesser von 60 mm zugefügt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in 0,15 M NaCl, wurden 3 ml PBS, enthaltend 5% FBS, 1 mM EDTA und 0,02% NaN₃ der Schale zugefügt. Nach einem Blockieren, indem man 2 Stunden bei Raumtemperatur stehenließ, wurde die Panningplatte bei –20°C bis zur Verwendung gelagert.
Durch dreifaches Wiederholen des Pannings unter Verwendung einer Plasmidbibliothek (Bibliothek A), enthaltend 5 × 10⁵ Klone als Startmaterial wurde eine Plasmid-DNA mit ungefähr 0,9 kbp cDNA als Insert konzentriert. Unter Verwendung eines Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (hergestellt von Applied Biosystems) wurde die Nukleotidsequenz unter Verwendung des 373A oder 377DNA Sequencers (Applied Biosystems) bestimmt. Das Ergebnis ergab, daß Klon P3.19 eine 1012 bp cDNA umfaßt und einen offenen Leserahmen (23–549) aufweist, codierend 180 Aminosäuren (1 und 2) (SEQ ID NO.: 1). Die aus der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz hat eine Struktur, die für Typ II-Membranproteine charakteristisch ist und weist zwei Zuckerketten-Bindungsstellen vom N-Typ auf.
4) Immunoscreening
Die Bibliothek B wurde einem Immunoscreening unter Verwendung eines anti-HM1.24-Antikörpers unterzogen. So wurde ein Phagenbibliothek, enthaltend 1,5 × 10⁵ unabhängige Klone auf Agar geschichtet, zusammen mit E. coli NM522 (Pharmacia Biotech) und wurde bei 42°C 3,5 Stunden kultiviert. Nach dem Kultivieren wurde ein Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell), mit 10 mM IPTG vorbehandelt, auf die Platte geschichtet und wurde weiter bei 37°C für 3 Stunden kultiviert. Nachdem der Filter mit 0,05% (V/V) Tween 20-versetztem TBS (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) gewaschen worden war, wurde 1% (G/V) BSA-versetztes TBS zugefügt und es wurde durch Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert.
Nach dem Blockieren wurde eine anti-HM1.24-Antikörperlösung (ein 10 μg/ml Blockierungpuffer) zugefügt, bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert und ein 5000-fach verdünntes alkalische Phosphatase-konjugiertes Antimaus-IgG-Antiserum (picoBlue Immunoscereening kit; Stratagene) zugefügt, das weiter eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Punkte, die mit dem Antikörper reagiert hatten, ließ man mit einer Entwicklungslösung (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂), enthaltend 0,3 mg/ml Nitrobluetetrazolium und 0,15 g/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat Farbe entwickeln.
Durch ein Immunoscreening wurden fünf positive Klone isoliert, die alle mit der Teilsequenz von P3.19 (3) konsistent waren. Eine Homologiesuche von diesen ergab, daß P3.19 mit der DNA-Sequenz von BST-2 (Ishikawa J. et al., Genomics, 26: 527–534, 1995) identisch ist, exprimiert im Knochenmark oder Synovialstromazellen. Dasselbe Molekül wurde durch zwei Arten eines Screenings erhalten, was deutlich nahelegte, daß das Membranprotein, codiert von P3.19 das HM1.24 Antigenmolekül ist.
E. coli mit dem Plasmit pRS38-pUC19, worin DNA, codierend ein menschliches Protein mit derselben Sequenz wie das oben erwähnte menschliche HM1.24-Antigenprotein zwischen die XbaI-Stellen des pUC-Vektors inseriert wurde, wurde als Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19) bezeichnet und international gemäß den Vorgaben des Budapester Vertrags am 5. Oktober 1993 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-4434 hinterlegt.
5) FACS-Analyse
Um weiterhin zu bestätigen, daß das von p3.19 codierte Protein tatsächlich an den anti-HM1.24-Antikörper bindet, wurde eine CHO-Transformantenzellinie, worin P3.19 eingeführt worden war, etabliert. So wurde, nachdem der P3.19-Klon in CHO-Zellen durch das Elektroporationsverfahren eingeführt worden war, in Gegenwart von 500 μg/ml G418 (GIBCO-BRL) kultiviert, um ein CHO-Zellinie zu erhalten, die das HM1.24-Antigen exprimiert.
Die kultivierten Zellen (1 × 10⁶) wurden in FACS-Puffer (PBS (–)/2% FCS/0,1% NaN₃) suspendiert, HM1.24-Antikörper wurde zugefügt, und dies wurde 30 Minuten auf Eis umgesetzt. Nach einem Waschen in dem FACS-Puffer wurde in einer GAM-FITC-Lösung (25 μg/ml in dem FACS-Puffer, Becton Dickinson) resuspendiert und es wurde weiter 30 min auf Eis umgesetzt. Nach zweimaligem waschen mit dem FACS-Puffer wurde in 600 μl des FACS-Puffers zur Messung durch das FACScan (Becton Dickinson) suspendiert.
Als negative Kontrolle wurde UPC10 verwendet.
Als Ergebnis der FACS-Analyse konnte gezeigt werden, daß CHO-Zellen, in die P3.19 eingeführt worden war, stark mit dem anti-HM1.24-Antikörper reagierten, während bei CHO-Zellen (CHO/NEO) keine Bindung beobachtet wurde, in die der Kontrollexpressionsvektor eingeführt worden war (17). Es wurde daher bestätigt, daß das durch P3.19 codierte Protein an den anti-HM1.24-Antikörper bindet.
6) Immunopräzipitation
Nach zweimaligem Waschen der Zellen in PBS (–) wurden sie durch Ultraschallbehandlung in dem Zelllysatpufferverfahren (50 mM Natriumborat, 150 nm NaCl, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% Nonidet P-40, 0,1 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, Protease-Inhibitorcocktail [Boehringer Mannheim]) zerstört, um eine lösliche Fraktion zu erhalten. Die lösliche Fraktion wurde zu anti-HM1.24-Antikörper-konjugierten Sepharose-4B-Kügelchen zugefügt. Nach der Zentrifugation wurde das Präzipitat auf SDS-PAGE (12% Gel) aufgetrennt, das auf eine PVDF-Membran transferiert wurde. Die PVDF-Membran wurde mit anti-HM1.24-Antikörper umgesetzt und dann mit POD-anti-Maus IgG und unter Verwendung des ECL-Kits (Amersham) nachgewiesen.
Jede der Myelomzellineien KPMM2, RPMI8226 und U266 exprimierte HM1.24-Antigen stark und die Immunopräzipitation der Zelllysate davon mit anti-HM1.24-Antikörper ermöglichte den spezifischen Nachweis den Proteins mit einem Molekulargewicht von ungefähr 29 bis 33 kDa (5). In einem ähnlichen Experiment für CHO-Zellinien (CHO/HM), in die P3.19 eingeführt worden war, wurden Immunpräzipitanten in den CHO/HM-Zellen wie für die Myelomzellinien (5, Spur 4) bestätigt. Solche Immunpräzipitanten konnten bei den Kontrollzellen (CHO/NEO) nicht beobachtet werden, in die nur der Expressionsvektor pCOS1 eingeführt worden war (5, Spur 5).
P3.19 codiert ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 19,8 kDa, umfassend 180 Aminosäuren (1) und weist zwei Zuckerkettenbindungsmotive vom N-Typ auf (1). So wird nahegelegt, daß die Gegenwart von Substanzen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, beobachtet durch Immunpräzipitation, auf Unterschiede in der Modifikation der N-Typ-Zuckerketten zurückzuführen war. Tatsächlich wurde bestätigt, daß die Immunpräzipitanten an etliche Lectine banden.
Referenzbeispiel 2: Herstellung von Hybridomen, die Maus-anti-HM1.24 monoklonale Antikörper erzeugen
Gemäß dem Verfahren von Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992–1930, wurden Hybridome, die einen Maus-anti-HM1.24-molekularen Antikörper erzeugten, hergestellt.
Eine Plasmazellinie KPC-32 (1 × 10⁷), abstammend vom Knochenmark eines menschlichen Patienten mit multiplem Myelom (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400) wurde in die abdominalen Höhlungen von BALB/c-Mäusen (gezüchtet von Charles River) zweimal alle 6 Wochen injiziert.
Drei Tage vor Opferung des Tiers, wurden 1,5 × 10⁶ KPC-32 in die Milz der Maus injiziert, um die Antikörper-Erzeugungsfähigkeit der Maus weiter zu erhöhen (Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Nach einem Opfern des Tiers wurde die Milz extrahiert und das extrahierte Organ wurde einer Zellfusion mit der Myelomzelle SP2/0 gemäß dem Verfahren von Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) unterzogen.
Durch Cell-ELISA (Posner, M. R. et al., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) unter Verwendung von KPC-32 wurde ein Kulturüberstand eines Hybridoms im Hinblick auf den Antikörper einem Screening unterzogen. 5 × 10⁴ KPC-32 wurden in 50 ml PBS suspendiert und dann auf eine Platte mit 96 Vertiefungen in Aliquots verteilt (mit U-Boden, Corning, hergestellt von Iwaki), die dann über Nacht bei 37°C an der Luft getrocknet wurde. Nach einem Blockieren mit PBS, enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) wurde der Kulturüberstand der Hybridome dazugefügt und es wurde 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurde ein Peroxidase-markierter anti-Maus-IgG-Ziegenantikörper (hergestellt von Zymed) eine Stunde bei 4°C umgesetzt. Nach einem Waschen wurde eine o-Phenylendiamin-Lösung (Substratlösung) (hergestellt von Sumitomo Bakelite) 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 N Schwefelsäure beendet und die Absorption bei 492 nm unter Verwendung des ELISA-Ablesers (hergestellt von Bio-Rad) abgemessen. Um die Hybridome zu entfernen, die Antikörper gegen menschliches Immunglobulin erzeugen, war ein Kulturüberstand von positiven Hybridomen bereits vorher an menschliches Serum absorbiert worden und die Reaktivität gegenüber anderen Zellinien wurde durch ELISA einem Screening unterzogen. Es wurden positive Hybridome selektiert und ihre Reaktivität gegenüber verschiedenen Zellen wurde durch Flußcytometrie untersucht. Der letzte selektierte Hybridomklon wurde zweimal kloniert und in die Abdominalhöhlung von Pristan-behandelten BALB/c-Mäusen injiziert. Ascites wurde von der Maus erhalten.
Der monoklonale Antikörper wurde aus dem Ascites der Maus durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und ein Protein A-Affinitäts-Chromatographiekit (Ampure PA, hergestellt von Amersham) gereinigt. Der gereinigte Antikörper wurde mit FITC unter Verwendung des Quick Tag FITC-Bindungskits (hergestellt von Boehringer Mannheim) markiert.
Im Ergebnis reagierten monoklonale Antikörper, erzeugt von 30 Hybridomklonen mit KPC-32 und RPMI 8226. Nach dem Klonieren wurde die Reaktivität der Kulturüberstände dieser Hybridome mit anderen Zellinien oder peripheren mononukleären Blutzellen untersucht.
Von diesen waren 3 Klone monoklonale Antikörper, die spezifisch mit der Plasmazelle reagierten. Von den 3 Klonen war ein Hybridomklon für die flußcytometrische Analyse besonders nützlich und hatte eine CDC-Aktivität gegenüber RPMI 8226 und wurde dementsprechend selektiert und als HM1.24 bezeichnet. Die Unterklasse des von diesem Hybridom erzeugten monoklonalen Antikörpers wurde durch einen ELISA unter Verwendung eines subklassen-spezifischen anti-Maus-Kaninchen-Antikörpers (hergestellt von Zymed) bestimmt. Der anti-HM1.24-Antikörper hatte eine Subklasse von IgG2a κ. Das Hybridom HM1.24, das den anti-HM1.24-Antikörper erzeugt wurde international gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags als FERM BP-5233 am 14. September 1995 hinterlegt, und zwar beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology of 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan.
Beispiel 1: Klonierung des Promotorbereichs des HM1.24-Antigen-Gens
Da das HM1.24-Antigen stark in allen soweit analysierten Myelomzellen exprimiert wurde, ist es sehr wahrscheinlich, daß die Expression von HM1.24-Antigen intensiv an den physiologischen Eigenschaften von multiplem Myelom beteiligt ist. So ist die Erhellung des Mechanismus der HM1.24-Antigenexpression eine wichtige Herausforderung und die Erfinder haben die Genstruktur des Promotorsbereichs klargestellt.
Der Promotorbereich des HM1.24-Antigen-Gens wurde unter Verwendung des PromotorFinder DNA Walking-Kits (Clontech) isoliert. Aus der Nukleotidsequenz des 5'-Endes von Klon P3.19, isoliert durch Panning wurden zwei PCR Primer entworfen: HM1 (5'-ATC CCC GTC TTC CAT GGG CAC TCT GCA-3') (SEQ ID NO.: 6) und HM2 (5'-ATA GTC ATA CGA AGT AGA TGC CAT CCA G-3') (SEQ ID NO.: 8). Die erste PCR wurde unter Verwendung des Primers AP1 (dem Kit beigefügt), korrespondierend zu dem Adapter durchgeführt und dem HM1-Primer, gemäß dem dem Kit beigefügten Instruktionsheft und dann wurde das PCR-Produkt einer Nest-PCR unter Verwendung des AP2-Primers (dem Kit beigefügt) und des HM2-Primers unterzogen. Nachdem das endgültige PCR-Produkt gereinigt worden war, wurde es in den PCRII-Klonierungsvektor (Invitrogen) subkloniert.
Das Promotorbereichsgen wurde einfach durch das PCR-Verfahren isoliert. So wurden PCR-Produkte mit ungefähr 2,0 kb, 0,7 kb und 0,3 kb spezifisch aus den EcoRV-, PvuII- bzw. DraI-Bibliotheken (Promoter Finder Kit; Clontech) amplifiziert. Es wurde demonstriert, daß sie von derselben genomischen DNA abstammten, basierend auf den Spaltungsmustern mit Restriktionsenzymen (6). Als Ergebnis des Sequenzierens der Nukleotidsequenzen wurde die Gensequenz der cDNA vom 5'-Ende bis zu 1959 bp stromaufwärts bestimmt (7 und 8) (SEQ ID NO.: 4). Durch eine Bindungsmotivsuche bekannter Transkriptionsfaktoren wurde die Gegenwart von transkriptionskontrollierenden Elementen von AP-2, Sp1, NF-IL6, NF-κB, STAT2 oder ISGF3 und ähnliche beobachtet, was die Möglichkeit nahelegte, daß die Expression durch die Stimulierung entzündlicher Cytokine wie z.B. IL-6 oder IFN-α kontrolliert wird.
Es ist bekannt, daß IL-6 als Wachstumsfaktor von Myelomzellen dient und daher wurde deutlich nahegelegt, daß NF-IL6 und STAT3, die Transkriptionsfaktoren sind, die stromabwärts von IL-6 wirken, an der Expressionskontrolle des HM1.24-Antigens in Myelomzellen beteiligt sind (7 und 8). Der Transkriptionsinitiationspunkt wurde als Nukleotid aus der Nukleotidsequenz von PCR-Produkten geschätzt, amplifiziert unter Verwendung des CapSwitch-Oligonukleotids (CapFnder-Kit; Clontech) und an 27 Positionen stromaufwärts davon wurde eine TATA-Box-ähnliche Sequenz (TAATAAA) beobachtet (7 und 8).
Beispiel 2: Klonierung genomischer DNA für das HM1.24-Antigen
Genomische DNA für das HM1.24-Antigen wurde aus menschlicher genomischer DNA (Clontech) amplifiziert, hergestellt aus einer menschlichen genomischen DNA-Bibliothek (Promotor Finder DNA walking-Kit; Clontech) oder peripherem Blut unter Verwendung jedes der PCR-Primer, die in 9 dargestellt sind. Nach der Reinigung wurden die PCR-Produkte jeweils in den PCRII-Vektor subkloniert und die Nukleotidsequenz wurde bestimmt.
Genomische DNA, die das HM1.24-Antigen codierte, wurde in vier Fragmente unterteilt, die aus menschlicher genomischer DNA amplifiziert wurden, hergestellt aus einer menschlichen genomischen DNA-Bibliothek (Promotor Finder Kit; Clontech) oder menschlichem peripheren Blut (9). Nach Bestätigung ihrer Nukleotidsequenzen wurden sie mit der Nukleotidsequenz der HM1.24-Antigen-cDNA verglichen, mit dem Ergebnis, daß das HM1.24-Antigen-Gen aus vier Exons und drei Introns mit 850 bp, 183 bp und 307 bp besteht (10).
Aus der menschlichen genomischen DNA-Bibliothek, hergestellt aus menschlichem Plazentagewebe, wurde jedoch nur ein Gen hergestellt, bestehend aus 3 Exons, dem Intron 3 fehlte, was die Gegenwart eines genomischen Gens, mit einer unterschiedlichen Exon/Intronstruktur nahelegte. In jeder Struktur waren zwei Zuckerketten-Bindungsstellen vom N-Typ und drei Cysteinreste, vorliegend im extrazellulären Bereich des HM1.24-Antigens alle in Exon I vorhanden (11 und 12) (SEQ ID NO.: 2).
Beispiel 3: Bestätigung der HM1.24-Antigen-Spleißvarianten
Um die Gegenwart von Spleißvarianten des HM1.24-Antigens zu bestätigen, wurde die HM1.24-Antigen-cDNA durch das PCR-Verfahren amplifiziert, wobei als Matrizen-cDNA solche verwendet wurde, die aus einer menschlichen Myelomzellinie KPMM2 gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Der Sinn-Primer BST2-N (SEQ ID NO.: 17; ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC), verwendet in der PCR, korrespondiert zu Basen 10 bis 30 von P3.19 (SEQ ID NO.: 1) wie hier isoliert und der Antisinn-Primer S3 (SEQ ID NO.: 18; AAC CGT GTT GCC CCA TGA) korrespondiert zu den Basen 641–658 von P3.19.
Die PCR-amplifizierten Produkte wurde in einen Klonierungsvektor PCRII (Invitrogen) kloniert und aus den resultierenden unabhängigen Klonen wurde Plasmid-DNA wiedergewonnen, mit dem Ergebnis, daß zwei Inserts in unterschiedlichen Größen von ungefähr 650 bp und ungefähr 550 bp beobachtet wurden. Nach der Bestimmung jeder Nukleotidsequenz wurde festgestellt, daß das Insert mit ungefähr 650 bp eine identische Sequenz zu der von P3.19 aufwies, während das Insert mit ungefähr 550 bp eine Deletion aufwies, korrespondierend zu den Basen 294 bis 422 von P3.19 (SEQ ID NO.: 19). Die Region, in der die Deletion beobachtet wurde, korrespondiert zu Exons 2 und 3 der menschlichen HM1.24-Antigen genomischen DNA, was die Gegenwart von Varianten aufgrund differentiellen Spleißens anzeigt.
Beispiel 4: Analyse des Polymorphismus des HM1.24-Gens
Im Zusammenhang mit dem Polymorphismus, der im HM1.24 Gen angetroffen wird, wurde seine Beziehung zum multiplen Myelom untersucht. Die peripheren Blutproben von normalen gesunden Menschen wurden als Blutpuffer(buffy)beschichtung von gespendeten Blutproben des Japanischen Rot-Kreuz-Tokushima Blutcenters zur Verfügung gestellt. Für Patienten mit Myelom wurden das periphere Blut oder Knochenmarksflüssigkeit von Patienten in dem Tokushima University First Internal Medicine Hospital oder damit in Verbindungen stehenden Krankenhäuser gesammelt. Die Blutproben wurden einer Ficoll-Conrey-Dichtezentrifugation zur Abtrennung mononukleärer Zellen unterzogen. Myelomzellinien wurden in einem RPMI1640-Medium (GIBCO-BRL, Rockville, MD USA), enthaltend 10% fötales Rinderserum bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator kultiviert. Die peripheren mononukleären Blutzellen oder Myelomzellinien wurden mit den DNAzol-Reagens (GIBCO-BRL) gemäß dem Protokoll zur Extraktion genomischer DNA aus den Zellen behandelt.
Die Nukleotidsequenz wurde durch das PCR-Direktsequenzierungsverfahren bestimmt. Der 5'-Promotorbereich wurde durch PCR amplifiziert (30 Zyklen von 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute) mit einer amlpliTaq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Chiba) unter Verwendung des Primers 6S (TCCATAGTCCCCTCGGTGG) (SEQ ID NO.: 22) und BST2B (ATAGTCATACGAAGTAGATGCCATCCAG) (SEQ ID NO.: 23). Der HM-codierende Bereich wurde durch PCR mit LA Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo, Otsu) amplifiziert unter Verwendung des Primer HMP2K (AAAGGTACCAGCTGTCTTTCTGTCTGTC) (SEQ ID NO.: 24) und BST2-R4 (GTGCTCTCCCCGCTAACC) (SEQ ID NO.: 25). Mit der Reaktionsmischung als Matrize wurde weiter eine PCR mit einer Ex Taq DNA-Polymerase (Takara Shuzo) durchgeführt unter Verwendung des Primers 8S (GGACGTTTCCTATGCTAA) (SEQ ID NO.: 26) und BST2-R1 (AAAGCGGCCGCTCATCACTGCAGCAGAGCGCTGAG) (SEQ ID NO.: 27).
Die Reaktionsmischung wurde durch das QIA Quick PCR Purification Kit (QIAGEN, Tokyo) gereinigt und mit dem resultierenden PCR-Fragment als Matrize umgesetzt, wobei als Primer 6S oder BST2B für den 5'-Promotorbereich verwendet wurde und 8S, HMINTIF (AGGGGAACTCACCAGACC) (SEQ ID NO.: 28), HMEX2F (ATGGCCCTAATGGCTTCC) (SEQ ID NO.: 29), HMEX3F (CATTAAACCATAAGCTTCAGG) (SEQ ID NO.: 30), HMEX2R (CCCTCAAGCTCCTCCACT) (SEQ ID NO.: 31) oder BST2-R1 für den HM-Codierungsbereich durch das BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). Die Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung des ABI3777 DNA Sequencer (Perkin Elmer) bestimmt. Die Frequenz einer 8 Basenpaar-Deletion in der Nachbarschaft von 20 Basenpaaren stromaufwärts zum Initationscodon des HM1.24-Gens wurde durch PCR nachgewiesen. So wurde eine PCR (30 Cyclen mit 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute) mit ampliTaq DNA Polymerase (Perkin Elmer, Chiba) durchgeführt unter Verwendung der Primer 8S und BST-R3 (GACGGATCCTAAAGCTTACAGCGCTTATC) (SEQ ID NO.: 32). Die Reaktionsmischung wurde auf einem 4%igen Agarosegel elektrophoretisch behandelt und durch Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen.
Polymorphismus des 5'-Promotorbereichs des HM1.24-Gens
Für Proben von normalen gesunden Menschen und Patienten wurde die Nukleotidsequenz des 5'-Promotorbereichs des HM1.24-Gens bestimmt. Das Ergebnis ist in den 14–18 (SEQ ID NO.: 33) dargestellt. Es gab Proben, für die Nukleotidsubstitutionen in den unterstrichenen 187, 262 und 323 in 14 und Deletionen nahe 360 in 14 und nahe 555 in 15 beobachtet wurden, und es gab eine Probe, für die der Bereich von 366 bis 558 nicht decodiert werden konnte. Wenn die in den 14 bis 18 (SEQ ID NO.: 33) beschriebene Sequenz als Typ A bezeichnet wurde, und der Mutationstyp mit der obigen Nukleotidsubstitution/Deletion als Typ B, konnte die Probe, für die der Bereich 366 bis 558 nicht decodiert werden konnte, als Heterozygot (AB) von A und B angesehen werden und die Probe, die als Typ A oder B decodiert werden konnte, konnte als Homozygot (AA) von A oder Homozygot (BB) von B angesehen werden. Zusätzlich zu dem obigen Polymorphismus wurde klargestellt, daß 19 bp Tandem in dem doppelt unterstrichenen Bereich in der Myelomzellinie HS-Sultan (Typ M) inseriert waren.
Polymorphismus des HM1.24-Gens
Für den genomischen Gen-Bereich der Zellinien von Typ AA (U266, HS-Sultan) und zwei Proben vom Typ BB von normalen gesunden Menschen wurde die Nukleotidsequenz bestimmt. Im Ergebnis wurde festgestellt, daß 3 Basen von c nahe 2315 des Introns 3 in der Sequenz von Typ B fehlten, während im codierenden Bereich keine Mutation beobachtet wurde.
Genfrequenz von Typ A und Typ B
Ein Polymorphismus und eine Erkrankungssensitivität wurden untersucht. Wenn eine 8-Basendeletion durch PCR nahe 20 Basenpaaren stromaufwärts vom Initiationscodon des HM1.24-Gens nachgewiesen wurde, gab es keinen Unterschied in der Frequenz eines Polymorphismus zwischen 94 Fällen von normalen gesunden Menschen und 46 Fällen von Patienten mit Myelom (Tablette 1). Sowohl bei den normalen gesunden Menschen als auch den Patienten mit Myelom war das Typ A-Gen dominant, da die Genverteilung ungefähr A:B = 2:1 war. Für die Zellinien gab es eine Gewichtung zu Typ A, mit 9 Fällen von 11, die Typ AA waren.
Es wurden keine Beziehungen zwischen dem Polymorphismus des HM1.24-Promotorbereiches und der Empfindlichkeit gegenüber Myelomerkrankungen beobachtet.
Tabelle 1: Häufigkeit von Polymorphismus
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde das genomische Gen des HM1.24-Antigens erhalten, das in allen Myelomzellen hochexprimiert wird. Das genomische Gen, das das HM1.24-Antigen codiert, ist für die Analyse des HM1.24-Antigens nützlich. Da das HM1.24-Antigen stark exprimiert wird, wird angenommen, daß der Promotorbereich eine starke Promotoraktivität aufweist und dementsprechend für die Expression nützlicher Gene geeignet ist.
Referenz im Hinblick auf die unter dem Patent-Zusammenarbeitsvertrag hinterlegten Mikroorganismen, Regel 13-2 und Name der Hinterlegungsstelle
Hinterlegungsstelle

Name: the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology
Adresse: 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref. Japan

Organismus (1)

Name: Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19)
Hinterlegungsnummer: FERM BP-4434
Hinterlegungsdatum: 5. Oktober 1993

Organismus (2)

Name: Maus-Maus-Hybridom HM1.24
Hinterlegungsnummer: FERM BP-5233
Hinterlegungsdatum: 14. September 1995

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Genomische DNA, codierend das HM1.24-Antigenprotein, wobei die DNA 4 Exon-Regionen, codierend die Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 3, und drei Introns enthält; wobei das erste Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Val 95 und Met 96 von SEQ ID NO: 3 positioniert ist; wobei das zweite Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Gly 118 und Gly 119 von SEQ ID NO: 3, positioniert ist; und wobei das dritte Intron zwischen der DNA, codierend die Aminosäuren Arg 138 und Arg 139 von SEQ ID NO: 3, positioniert ist.
Genomische DNA gemäss Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleotidsequenz.
Splicevariante der genomischen DNA gemäss Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA das HM1.24-Antigenprotein codiert.
Splicevariante gemäss Anspruch 3, der die Exons 2 und 3 fehlen.
Verfahren zur Erzeugung eines HM1.24-Antigenproteins, wobei das Verfahren das Kultivieren von Tierzellen umfasst, transformiert mit einem Expressionsvektor, umfassend die genomische DNA gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.