DE69233191T2

DE69233191T2 - Cyclin Prad1 (Cyclin D1) und seine cDNA

Info

Publication number: DE69233191T2
Application number: DE69233191T
Authority: DE
Inventors: Andrew Arnold
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-03-11
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2012-03-12
Also published as: EP0575546A1; DE69233191D1; CA2104871A1; EP0575546A4; CA2104871C; ATE249476T1; WO1992015603A1; US5858655A; DK0575546T3; JP3369169B2; JPH06505398A; US6110700A; US6107541A; EP0575546B1

Description

Die hier beschriebene Arbeit wurde durch die U.S.-Regierung teilweise finanziell gefördert, die dadurch bestimmte Rechte an der Erfindung hat.
Diese Erfindung betrifft das Gebiet von Cyclinen.
Die Cycline sind eine Klasse eukaroytischer Proteine, die ursprünglich durch ihre zyklische Ansammlung und Zerstörung an definierten Punkten im embryonalen Zellzyklus aufgefunden wurden (Evans et al., Cell 33:389-396, 1983). Sie binden an und sind wesentlich für die Aktivierung der cdc2 Protein-Kinase (beschrieben in Murray et al., Science 246:614-621, 1989; Nurse, Nature 344:503-508, 1990; Draetta et al., Cell 56:829-838, 1989). Gegenwärtig können die Cycline auf der Grundlage ihrer Schwankungs-Kinetiken während des Zellzyklus, ihren Aminosäuresequenzen und in einigen Fällen von genetischen Experimenten in Hefe, bei denen bestimmt wurde, wann deren Funktionen benötigt werden, in drei Familien aufgeteilt werden (beschrieben in Nurse, 1990; Nasmyth, Cell 63:1117-1120, 1990; Westendorf, J. Cell Biol. 108:1431-1444, 1989). Die B-Typ "mitotischen" Cycline steuern Zellen in die Mitose, wobei deren Sequenzen von Hefe bis zum Menschen konserviert sind (Nurse, 1990; Westendorf et al., 1989; und Pines et al., Cell 58:833-846, 1989). Die A-Typ Cycline, die weniger gut verstanden sind, können früher im Zellzyklus wirken (Minshull et al., EMBO J. 9:2865-2875, 1990; Pines et al., Nature 346:760-763, 1990; Swenson et al., Cell 47:861-870, 1986). Es wird davon ausgegangen, dass, die kürzlich beschriebenen CLNs (oder "G1-Cycline") knospender Hefe durch Wechselwirkung mit cdc2 Homologen analoge Funktionen am START erfüllen, die die Zellen in die S-Phase führen (Nasmyth, 1990). A-, B- und CLN-Cycline können als Stufen-spezifische Regulatoren des Fortgangs durch den Zellzyklus, durch Übertragung ausgewählter Substratspezifität auf die cdc2-Kinase (Minshull et al., 1990) oder durch ausgewähltes Targeting von cdc2 zu verschiedenen intrazellulären Kompartimenten wirken.
Die Erfindung betrifft ein neues Cyclin, prad1, und eine isolierte DNS (PRAD1 genannt), die für dieses codiert. Diese DNS kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann genomische DNS, cDNS oder synthetische DNS sein. Sie kann identisch zu einer natürlich auftretenden PRAD1-Sequenz (wie etwa humanes PRAD1, cDNS, SEQ ID Nr. 1) sein, oder kann von einer solchen Sequenz durch die Deletion, Addition oder Substitution von einer oder mehreren Nukleotiden verschieden sein. Mit "isoliert" wird angezeigt, dass die DNS frei ist von codierenden Sequenzen von Genen, die in dem natürlich auftretenden Genom des Organismus, von dem die DNS der Erfindung abgeleitet ist, die das prad1 codierende Gen unmittelbar flankieren. In dem Ausdruck prad1 ist menschliches prad1 und jedes Homolog von menschlichem prad1 eingeschlossen (d.h., aus anderen Tierarten oder einer genetisch veränderten Version eines natürlich auftretenden prad1, das eine biologische Aktivität ähnlich der von dem natürlich auftretenden Protein aufweist, insbesondere welches in einem Lysat von Muschel-Embryonen Kinaseaktivität induziert), das durch eine DNS codiert wird, die fähig ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edn., Cold Spring Harbor, NY, 1989: durch Bezugnahme hier mit aufgenommen) an eine einzelsträngige Sonde zu hybridisieren, die aus einem Abschnitt von mindestens acht (vorzugsweise 18-40) Nukleotiden besteht, die komplementär zu der menschlichen PRAD1 cDNS (SEQ ID Nr. 1) der menschlichen PRAD1 genomischen DNS ist. Ebenso hier offenbart sind Peptid-Fragmente eines natürlich auftretenden prad1, wobei die Fragmente mindestens sechs Aminosäuren und vorzugsweise 10-50 Aminosäuren lang sind, sowie einzelsträngige DNS- oder RNS-Sonden (vorzugsweise radioaktiv markierte), die enthalten, mindestens 36 Nukleotide, jedoch weniger als alle der menschliches PRAD1-codierenden RNS, menschlichen PRAD1 cDNS (SEQ ID Nr. 1) oder menschlicher PRAD1 genomischen DNS und vorzugsweise nicht mehr als 3000 oder 5000 Basen. Derartige DNS oder RNS-Sonden können in einem diagnostischen Verfahren verwendet werden, das die Schritte umfasst, Gewinnen einer Nukleinsäureprobe aus einem Tier, das einen gegebenen neoplastischen Zustand aufweisen soll (oder aus einem bekannten Tumor), Inkontaktbringens der Nukleinsäureprobe mit einer einzel-strängigien DNS oder RNS-Sonde, die an das PRAD1 Homolog der Art, der das Tier angehört, hybridisieren kann, und Nachweisen des Grads der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäureprobe, wobei der Grad diagnostisch für den neoplastischen Zustand ist. Zwei Beispiele von neoplastischen Zuständen, die durch dieses Verfahren diagnostiziert werden können, schließen zentrozytische Lymphome ein, die abnormal große Mengen von PRAD1-mRNS zu exprimieren scheinen und solche Brustkarzinome, die durch einen hohen Grad amplifizierter PRAD1 DNS gekennzeichnet sind.
Die erfindungsgemäße DNS-Sequenz, die unter der Transkriptionskontrolle eines heterologen Promotors sein kann (definiert als eine Promotorsequenz, die anders ist als der natürlich auftretende Promotor des prad1 codierenden Gens) kann in einen Vektor eingebaut sein (wie etwa einen Phagen) und dadurch in eine Zelle eingebracht werden. Eingeschlossen in der Erfindung ist eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle (oder eine im wesentlichen homogene Population derartiger Zellen, jedoch kein menschliches Wesen), die enthalten (und vorzugsweise exprimieren können) ein prad1 codierendes rekombinantes DNS-Molekül: das heißt, eine Zelle, in die (oder in einen Vorfahren von diesem) mittels Gentechnik, ein prad1 codierendes DNS-Molekül eingebracht wurde, was dazu führt, dass das DNS-Molekül zu einer DNS-Sequenz benachbart angeordnet ist, zu der es normalerweise nicht benachbart ist (beispielsweise ist die prad1-codierende Sequenz in das Genom einer derartigen Zelle eingebracht). Das erfindungsgemäße prad1-Protein kann durch Kultur derartiger Zellen und Rückgewinnung von prad1 aus den Zellen oder aus ihrem Medium hergestellt werden. Alternativ kann prad1 codierende DNS oder mRNS mit einem in-vitro Standard-Expressionssystem kombiniert werden, um prad1 herzustellen. Derart hergestelltes prad1 kann in Kombination mit einem pharmakologisch-akzeptablen Träger verwendet werden, um Wundheilung in einem Tier zu fördern, oder kann verwendet werden die Proliferation einer tierischen Zelle durch Behandlung der Zelle mit einer Proliferations-induzierenden Menge des erfindungsgemäßen Proteins zu fördern (beispielsweise durch Transfektion der Zelle mit prad1 codierender DNS, so dass die Zelle selbst eine derartige Proliferations-induzierende Menge von prad1 herstellt). Alternativ kann das prad1 (oder ein durch Standardmethodik bestimmtes antigenes Fragment davon) verwendet werden polyklonale oder monoklonale Antikörper zu züchten, die fähig sind Immunkomplexe mit prad1 zu bilden und die nicht mit dem Xenopus laevis Cyclin A1 kreuzreagieren, und daher als ein Diagnostikum für bestimmte neoplastische Zustände, die durch abnormal hohe Grade von prad1-Expression gekennzeichnet sind, nützlich sein. Das Verfahren einer Verwendung eines solchen Antikörpers als ein Diagnostikum würde die Schritte einschließen: Inkontaktbringen einer Probe eines Gewebes, das aus einem Tier erhalten wurde, das vermutlich einen solchen neoplastischen Zustand aufweist (beispielsweise, bestimmte Lymphome oder Brustkarzinome), mit dem Antikörper, und Nachweis der Menge, der durch den Antikörper gebildeten Immunkomplexe, wobei eine derartige Menge für den neoplastischen Zustand diagnostisch ist.
Ebenso von der Erfindung umfasst ist ein transgenes, nicht-menschliches Wirbeltier (vorzugsweise ein Säugetier wie etwa ein Nagetier, beispielsweise ein Maus), das ein Transgen trägt (d.h., ein Stück DNS, das künstlich in eine embryonale Zelle eingefügt wurde und Teil des Genoms des Tieres, das sich aus dieser Zelle entwickelt, wird), das eine prad1 codierende DNS-Sequenz und jegliche Zellen oder Zelllinien, die von einem derartigen Tier stammen, einschließt. Ein transgenes Tier ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, welches Transgen in das Tier oder einen Vorfahren des Tieres auf embryonaler Stufe, eingefügt wurde. Wenn die embryonale Stufe eine Ein-Zell-Stufe ist, dann werden alle kernhaltigen Zellen des Tieres das Transgen tragen. Das besondere prad1, für dass das Transgen codiert, kann für die Art des transgenen Tieres endogen sein oder kann das einer verschiedenen An (beispielsweise, Mensch) sein. Bei der Verwendung eines PRAD1 zusammen mit einem geeigneten Promotor wird ein transgenes Tier, das leicht Neoplasien in einem gewählten Organ oder Gewebetyp entwickelt, erhalten, was ein derartiges Tier, als ein Model zum Studium von Krebs/Karzinom in dem Organ oder Gewebe, nützlich macht.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden, ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen offensichtlich werden.
Die Zeichnungen werden zuerst beschrieben.
1 ist ein Southern-Blot von Msp1-verdauter DNS, der mit der 5'PTH-Gen-Sonde (Spuren 1, 2) und 3'PTH-Gen-Sonde (Spuren 3, 4) getestet wurde.
2 ist eine schematische Darstellung von a) dem normalen PTH-Gen und b) der sich aus der Umordnung in Tumor M ergebenden zwei Fragmente.
3 ist eine schematische Darstellung der D11S287 Region, die bekannte Restriktionsstellen und die Orte des 500 bp-Fragments, des 1,6 kb XhoI-Fragments und der Sonde B anzeigt.
4 ist eine Northern-Analyse von einer D11S287 Ausprägung in verschiedenen Zell-Typen.
5 ist eine schematische Darstellung von PTH/D11S287 Umordnungen in zwei Nebenschilddrüsen-Adenomen und den relativen Orten von Sonde B und einer Reihe von klonienen cDNS-Abschnitten.
6 ist eine Darstellung der Nukleotid-Sequenz und der prognostizierten Aminosäure-Sequenz von menschlicher PRAD1 (SEQ ID Nr. 1) cDNS.
7 ist eine Darstellung einer Sequenzhomologie zwischen der "Cyclin-Box" Region menschlichen prad1 und der entsprechenden Regionen einiger A-Typ-, B-Typ- und G1 Cycline. 8 ist eine Northern-Blotanalyse von D11S287 [(menschliches PRAD1 (SEQ ID Nr. 1)] Ausprägung in verschiedenen Zell-Typen.
9 ist a) eine Northern-Blotanalyse von HeLa-Zellen RNS, die mit einer menschlichen PRAD1 cDNS (SEQ ID Nr. 1) -Sonde, einer H4-Histon-Sonde und 28S rRNS getestet wurde, und b) eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse des Northern-Blots darstellt.
10 ist eine Analyse der biologischen Aktivität rekombinaten menschlichen prad1.
Vorausgehende Untersuchungen an DNS aus Zellen eines gutartigen Nebenschilddrüsen-Adenoms (berichtet in Arnold et al., J. Clin. Invest. 83:2034-2040, 1989) offenbarte Beweismaterial einer DNS-Umordnung, die den chromosomalen Ort (bei Chromosom 11, Bande p15) des Nebenschilddrüsen-Hormons (PTH) und einen DNS-Abschnitt (gekennzeichnet als Human Genome Database-Zuordnung D11S287), der normalerweise auf Chromosom 11, Band q13 kartiert, verwickelt. Jetzt ist bekannt, dass a) obwohl eine Anzahl vonausgehendidentifizierter Oncogene (einschließlich INT-2 und HST-1), wie auch der Translokations-Bruchpunkt-Marker BCL-1 und möglicherweise das Gen für multiple endokrine Neoplasie Typ-I (MEN-I) auf die 11q13 Region kartieren, der sogenannte D11S287 Ort, der mindestens bei einigen Nebenschilddrüsen-Adenomas umgeordnet ist, von den vorrausgehend beschriebenen Markern verschieden ist, b) D11S287 mRNS ist, obwohl in allen analysierten Geweben nachweisbar, signifikant in solchen Nebenschilddrüsen-Adenomas über-ausgeprägt, die eine 11q13/11p15 chromosomale Umordnung aufweisen, und ebenso in bestimmten Lymphomen (bemerkenswert zentrozytische Lymphome), die durch Umordnung des BCL-1 Ortes gekennzeichnet sind, und c) der D11S287 Ort ist bei vielen Plattenepithelzell- und Brustkarzinomen vervielfältigt und ausgeprägt. Dieses Beweismaterial legt nahe das D11S287 (auf das hierin ebenso als menschliches PRAD1, für Parathyreoideaadenom Bezug genommen wird) ein neu-identifizienes Oncogen ist, das sich bei verschiedenen Typen von Neoplasien darstellen lässt.
Menschliche PRAD1 cDNS (SEQ ID Nr. 1) wurde durch die unten ausführlich beschriebenen Verfahren geklont und sequenziert, wodurch die in 6 gezeigte Sequenz erhalten wurde. Der längste offene Leserahmen, der bei dem ersten ATG Codon startet, codiert für ein prognostiziertes Protein von 295 Aminosäuren (M_r 33.729). Durchmustern der Genbank-Peptid-Datenbank mit dieser Sequenz offenbart signifikante Homologie lediglich zu Mitgliedern der Cyclin-Familie, mit der größten Ähnlichkeit in der konservierten Region unter den Cyclinen, die von 19,1 % bis 33,6% Identität und 44,1 % bis 59,2% Ähnlichkeit reichen. Das menschliche PRAD1 (SEQ ID Nr. 1) Protein (prad1) weist signifikante Sequenzähnlichkeiten zu allen drei Typen von Cyclinen (A, B und CLN Cyclinen) auf, kann aber nicht leicht zu einem der Typen zugeordnet werden. Dies legt nahe, das prad1 ein neues und verschiedenes Mitglied der Cyclin-Familie darstellen kann.
Die PRAD1 mRNS wird in vielen Geweben ausgeprägt und ist über die Arten (7) hoch konserviert. Wie bei anderen Cyclin mRNSs, die in menschlichen Zellen exprimiert sind (Pines et al., Cell 58:833-846, 1989; Pines et al., Nature 346:760-763, 1990) variieren die Mengen der menschlichen PRAD1 mRNS über den Zellzyklus (9), was vereinbar ist mit einer, aber eine Rolle in der Zell-Zyklus-Regualtion nicht beweist. Der Gipfel bei PRAD1 mRNS-Mengen ereignet sich spät in dem Zell-Zyklus oder in G1.
In Bakterien ausgeprägtes rekombinantes menschliches prad1, das wie unten ausführlich beschrieben hergestellt wird, wurde verwendet, um die Verbindung zwischen menschlichem PRAD1 und den Cyclinen weiter zu untersuchen. Cycline sind bekannt mit der p34^cdc2 Protein-Kinase Komplexe zu bilden, was zur ihrer Aktivierung führt, die unter Verwendung exogenen Histons H1 als ein Substrat getestet wird. Darüberhinaus können die Cyclin/p34^cdc2 Komplexe unter Ausnutzung der Fähigkeit von an Kügelchen gebundenem p13^suc1, einem anderen Zell-Zyklus Protein, p34^cdc2 stark (avidly) zu binden und seinerseits alle mit p34^cdc2 komplexierten Proteine zu ko-reinigen (Draetta et al., Cell 56:829-838, 1989), aufgereinigt werden. Wenn rekombinantes menschliches prad1 zu Interphasen-Zellysaten von Muschel-Embyonen zugegeben wurde (welchen endogene Cycline fehlen und inaktives p34^cdc2 enthalten), wurden sowohl p34^cdc2 und prad1 durch p13^suc1-Kügelchen (10) gebunden. Da prad1 nicht an Protein-A-Sepharose Kügelchen bindet, geschieht seine Bindung an p13^suc1 sehr wahrscheinlich aufgrund seiner Wechselwirkungen mit p34^cdc2 oder einem nahe verwandten Protein. Desweiteren wurde die Kinaseaktivität durch die Zugabe des in-vitro Translationsproduktes von menschlichem PRAD1 (SEQ IDNr. 1) zu Interphase-Lysaten induziert (10). Diese Kinaseaktivität war niedriger als die mit Cyclin A gesehene. Cyclin B stellte eine negativ Kontrolle bereit, aus bis jetzt nicht verstandenen Gründen war das Cyclin B Translationsprodukt nicht fähig bei diesem Testtyp p34^cdc2 zu aktivieren. Der Unterschied zwischen den durch Cyclin A und menschlichem prad1 hervorgerufenen Aktivitäten, könnte spezifisch für dieses Muschel- Testsystem sein, oder kann einen natürlichen Unterschied zwischen den Funktionen von oder den durch Cyclin A gegenüber dem von menschlichem prad1 übertragenen Substratspezifitäten widerspiegeln.
Sowohl prad1 als auch ein prad1 codierendes Nukleotid sind nützlich zur Herstellung diagnostischer Werkzeuge zur Klassifikation und/oder Prognose von Lymphomen, Brustkarzinomen und Plattenepithelkarzinomen wie auch anderen Karzinomen, die durch einen hohen Grad von Expression und/oder Vervielfältigung des PRAD1 Gens gekennzeichnet sind. Beispielsweise könnte prad1 oder ein antigenes Peptid-Fragment von prad1 im Übereinstimmung mit Standardverfahren (siehe, beispielsweise Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988; Yanaihara et al., U.S. Patent 4,855,406; und Slamon et al., U.S. Patent 4,918,162; alle sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen) verwendet werden, polyklonale oder monoklonale Antikörper zu züchten, die fähig sind Immunkomplexe mit prad1 zu bilden, und für den Nachweis abnormalgroßer Mengen von prad1 in einer gegebenen Gewebeprobe nützlich sind. Ähnlich kann eine Hybridisierungs-Sonde aus einem Abschnitt von mindestens 12 (und vorzugsweise mehr als 250) Nukleotiden einer für menschliches PRAD1 codierenden RNS, menschlichen PRAD1 cDNS (SEQ ID Nr. 1) hergestellt werden, oder menschliche PRAD1 genomische DNS kann als Mittel zum Bestimmen der Anzahl vorhandener Kopien von PRAD1 in der genomischen DNS einer gegebenen Probe oder des Grades von exprimierter PRAD1 mRNS in Zellen derartiger Proben, verwendet werden.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können ebenso therapeutisch verwendet werden. OligoNukleotide, die antisense zu menschlicher PRAD1 mRNS sind (oder die RNS ausprägen die antisense zu menschlicher PRAD1 RNS ist) kann synthetisiert werden, um als eine Antikrebstherapie in solchen Fällen zu dienen, bei denen diagnostiziert wurde, dass sie eine Umordnung oder ein Vervielfältigung von menschlichem PRAD1 aufweisen: solche OligoNukleotide würden in vivo in Tumorzellen als Mittel, die die Produktion von prad1 in solchen Zellen verringert, eingebracht werden, und, um dadurch neoplastisches Wachstum, das durch eine Überfülle von prad1 induziert wird, zu verringern. (Siehe beispielsweise Weinberg et al., U.S. Patent 4,740,463, hierin durch Bezugnahme aufgenommen.) Durch Verbinden einer PRAD1-Sequenz mit einem ausgewählten Gewebe-spezifischen Promotor oder Enhancer und Einbringen des sich ergebenden Hybridgens in einen tierischen Embryo zu einer frühen Entwicklungsstufe (beispielsweise die befruchtete Oocyten-Stufe) durch Standardverfahren (beispielsweise wie durch Leder et al., U.S. Patent 4,736,866 beschrieben, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) kann ein transgenes Tier, das erhöhte Mengen von prad1 in ausgewählten Geweben exprimiert (beispielsweise Brust, Plattenepithel, B-lymphozytären Zellen, Nebenschilddrüse und andere), hergestellt werden. Die Form des verwendeten PRAD1 kann eine sein, die ein prad1 codiert, das ähnlich zu dem der verwendeten Tierart ist, oder es kann das prad1 Homolog einer unterschiedlichen Art (beispielsweise Mensch) codieren. Solch ein Tier würde für ein in vivo Model neoplastischer Erkrankungen in dem ausgewählten Gewebe nützlich sein. Darüberhinaus können Zellen, die aus solch einem transgenen Tier stammen verwendet werden eine unsterbliche Zelllinie zu erzeugen, die mindestens einige ihrer entwicklungsgemäßen Merkmale behält, während sie sich unbegrenzt in vitro proliferiert. Alternativ könnte man primäre Zellen (beispielsweise, ein Typ, der nachweislich schwer in Kultur zu halten ist, wie etwa Hypophysen-Zellen) mit einem PRAD1 Gen, das mit einem geeigneten Promotor (beispielsweise, der Metallothionin-Promotor) verbunden ist, der hohe Grade von Expression des Gens sicherstellt, und dadurch eine unsterbliche Zelllinie erzeugt, die von solchen primären Zellen stammt, stabil transfektieren. PRAD1-Sequenzen können besonders in dieser Hinsicht nützlich sein, da Überexpression von PRAD1 (mindestens in Nebenschilddrüsengewebe) die Proliferation von normalerweise ruhenden Zellen auszulösen scheint, ohne das sie dabei vollständig ihren entwicklungsgemäßen Phänotyp verlieren.
Die DNS-Abnormität in dem Nebenschilddrüsen-Tumor M war ursprünglich durch Southern-Analyse von MspI Verdaus, unter Verwendung spezifischer Sonden für die 5' und 3' Regionen in dem PTH-Gen (siehe unten), gekennzeichnet worden, wodurch eine einzigartige, tumorspezifische Bande offenbart wurde. 1 stellt diese Southern-Blots von Tumor M (T) und peripheren Blut-Leukozyten (L) DNS-Paaren dar. MspI verdaute DNS wurde mit der 5'PTH Gen-Sonde (Spuren 1, 2) und 3' PTH Gen-Sonde (Spuren 3, 4) getestet. Quadrate zeigen das normale Gen (6,3 kb), Pfeile zeigen das umgeordnete Allel an (1,5 kb in Spur 1, 5,4 kb in Spur 3). Es gibt eine MspI-Stelle in der DNS, an die die 3'-Sonde hybridisiert (siehe 2a), und daher ist eine kleinere Bande (2,2 kb), die den am weitesten 3'-wärts gelegenen Abschnitt des normalen PTH Gens darstellt, in den vorliegenden Spuren 3 und 4, vorhanden. Die Intensitäten der Banden, die das anormale Allel darstellen, waren ungefähr gleich zu denen, die das normale Allel darstellen. Folglich ist in Tumor M, wie in Tumor Y (Arnold et al., 1989) eine klonale Umordnung des PTH-Gens aufgetreten: in jeder Tumorzelle bleibt eines von zwei Allelen des PTH-Gens normal, aber das Andere wird auseinandergerissen. 2(a) stellt das normale PTH-Gen mit den Positionen seiner drei Exons dar (Vasicek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2127-2131, 1983), wobei die beim Kartieren und Klonieren verwendeten 5'- und 3'-Sonden und die MspI-Stellen angegeben sind. Im Vergleich zeigt 2(b) die zwei sich aus der Umordnung in Tumor M ergebenden Fragmente: eines besteht aus den 5' PTH-Gen-Sequenzen plus daran angrenzende nicht-PTH-DNS (gestreifter Bereich), während die Andere aus 3' PTH-Gen-Sequenzen plus daran angrenzende nicht-PTH DNS besteht (quergestreifter Bereich). In jedem Fragment ist der Ort des Bruchpunktes durch eine diagonale Line gezeigt. Die Orte einiger Restriktionsenzymstellen, die durch Southern-Blotanalyse von Tumor DNS bestimmt wurden, sind angezeigt: EcoRI (R), BamHI (B), HindIII (H), XhoI (X), SstI (S), MspI (M). Die Orte und Größen der 1,5 kb und 5,4 kb umgeordneten MspI-Fragmente (in 1 gezeigt) sind über jedem Fragment angezeigt. Unter jedem Fragment bezeichnen Linien, die in Pfeilspitzen enden, die 1,5 kb und 16 kb klonierten Tumor DNS-Fragmente. Analyse mit mehreren zusätzlichen Restriktionsenzymen zeigten an, dass das Gen in zwei Teile getrennt ist, wobei der Bruchpunkt sich im ersten Intron befindet (2b). Folglich sind stromaufwärts befindliche regulatorische Elemente und das erste nicht-codierende Exon in dem 5'-Fragment von den codierenden Sequenzen im 3'-Fragment getrennt. Jedes PTH-Gen-Fragment bleibt intern intakt (innerhalb der Grenzen der Empfindlichkeit der Restriktionskartierung) wurde aber zu nicht-PTH DNS nebenangrenzend (bzw. angrenzend gestellt). Um die umgeordnete nicht-PTH DNS (schattiert und quer- schraffierte Bereiche in 2b) zu identifizieren, wurden zwei DNS-Fragmente, die PTH-Gen-Sequenzen plus Bruchpunkt-benachbarte DNS enthalten von Tumor M DNS geklont. Eines war ein 16 kb BamHI-Fragment, das ungefähr 8 kb von nicht-PTH-Gen-DNS benachbart zu 8 kb von 3' PTH-Gen-Sequenzen enthielt (2b). Genomische Southern-Blots normaler DNS, die mit Subklonen, die den größten Anteil der 8 kb nicht-PTH DNS überspannen, getestet wurden, zeigten unklare Verschmierungen, die keine Verbesserung bei Versuchen durch Verdrängung mit überschüssiger menschlicher DNS erbrachten (Sealy et al., 1985). Dies zeigte an, dass die nicht-PTH DNS in dem 16 kb-Fragment hochrepetitive Sequenzen in dem menschlichen Genom enthielt und seine Lokalisierung auf dem Chromosom ausschloss.
Es wurde ebenso ein 1,5 kb EcoRI-Fragment kloniert, das ungefähr 1 kb der PTH-Gen 5'-Region plus 500 bp von angrenzender nicht-PTH DNS enthielt (2b). Testung normaler DNS-Blots vom Menschen mit dem subklonierten 500 bp Fragment veranschaulichte, dass es einmalig im Genom vorkommende DNS enthielt, und in situ Hybridisierung und Analyse von Somazellhybriden offenbarte, dass die normale Chromosomen-Position des 500 bp-Fragments 11q13 ist.
Hybridisierung des 500 bp Bruchpunkt-benachbarten DNS-Fragments mit einem RNS-Blot von sechs Nebenschilddrüsen-Adenomen einschließlich zweier mit PTH-Gen Umordnungen war negativ. Um transkribierte Sequenzen nahe am Bruchpunkt zu identifizieren, die durch die Umordnung beeinflusst werden könnten, wurde durch Testung einer normalen menschlichen Bibliothek mit dem 500 bp subklonierten Fragment entlang des Chromosoms gewandert. Erhalten wurde ein Bakteriophagenklon mit einem 14 kb Insert, aber Northern-Blot-Analysen offenbarten keine Hybridisierung von Subklonen, die das gesamte Insert überspannen. Kartierung des 14 kb Inserts zeigte, dass das 500 bp Fragment an einem Ende war und veranschaulichte, dass die benachbarte klonierte DNS eine Restriktionskarte aufwies, die identisch ist zu der der genomischen DNS angrenzenden des in Tumor M umgeordnetem 5'PTH-Gen Fragments. (Vergleiche 2b und 3). An dem anderen Ende des 14 kb Inserts war ein 1,6 kb XhoI Fragment (3), das in der Größe mit einem XhoI Fragment, das 1 kb von dem Bruchpunkt D11S287 des Tumor Y entfernt liegt, identisch ist (Arnold et al., 1989). Diese zwei unabhängigen 1,6 kb XhoI Fragmente (eines aus dem obigen normalen Phagenklon und eines aus einem aus Tumor Y-stammenden Klon) wurden subkloniert und aufeinanderfolgend verwendet, um Blots normaler menschlicher genomischer DNS, die mit 7 Restriktionsenzymen verdaut wurde, zu testen. Bei jedem Enzym, hybridisierten die zwei Sonden mit genau ko-migrirenden Fragmenten. Darüberhinaus waren die Restriktionskarten der zwei 1,6 kb Fragmente selbst für alle sechs verwendeten Enzyme identisch. Folglich verband das 1,6 kb XhoI Fragment die Bruchpunkt-benachbarte DNS von Tumor M mit der von Tumor Y (D11S287), bestätigend, dass die 11q13 Bruchpunkte in den zwei Adenomen beide, durch 15 kb getrennt, in der D11S287 Region liegen. Die zusammengesetzte Restriktionskarte der nicht-umgeordneten D11S287 Region wird in 3 gezeigt, die die Restriktionsstellen für die Enzyme HindIII (H), BamHI (B), EcoRI (E), SacI (S), MspI (M) und XhoI (X) angezeigt. Die Positionen des 500 bp Fragments, das 1,6 kb XhoI Fragment und die Sonde B werden gezeigt. Diese Karte stammt von den Karten der vorstehend und durch Arnold et al., (1989) beschriebenen Phagenklone, und die Southern-Blots von DNS aus Tumoren M und Y.
Die Nähe des 11q13 Bruchpunktes legt nahe, das die Umordnungen ähnliche funktionale Konsequenzen haben könnten. Da keine der DNS zwischen den zwei Bruchpunkten der Tumoren in Nebenschilddrüsenzellen transkribiert wird, wurde nach transkribierten Sequenzen, die distal zu dem Bruchpunkt von Tumor Y liegen, gesucht. Es wurden Fragment B (3), ein Bruchpunkt-benachbartes DNS Fragment aus Tumor Y verwendet, um einen Blot, der Gesamt-RNS aus menschlicher Plazenta, einigen Nebenschilddrüsen-Adenomen, denen PTH-Gen Umordnungen fehlen, und Tumoren M und Y enthält, zu testen. Ebenso wurde Sonde B mit einem anderen Blot hybridisiert, der Gesamt-RNS aus Plazenta und einem anderen Nebenschilddrüsen-Adenom (Tumor F) enthält, bei dem kürzlich aufgefunden wurde, dass er eine klonale Umordnung der PTH- und D 115287 -Orte (Friedman et al., 1990) enthält, wobei Southern-Blotting anzeigte, dass die Umordnung von Tumor F der von Tumor Y sehr ähnlich ist. 4 stellt die Ergebnisse der Northern-Blots dar, in denen 10 Mikrogramm von Gesamt-RNS mit Sonde B (obere Aufstellungen) und mit einer 285 rRNS Sonde (untere Aufstellungen) getestet wurden. Die Größenbestimmung basierte auf der Wanderung der 28S rRNS. Die Spuren enthalten folgende Proben: Spuren 1, 7: Plazenta, Spuren 2, 3, 4: Nebenschilddrüsen-Adenome ohne PTH-Gen oder D11S287 Umordnungen, Spuren 5, 6, 8: Tumore Y, M beziehungsweise F, Spuren 7 und 8 sind getrennte Northern-Filter. Die mittlere Aufstellung ist eine längere Exposition von Spuren 1-6 in der oberen Aufstellung. In den Spuren 5 und 8 (Tumore Y und F) war eine schwache Bande sichtbar, die größer war als die hoch-überausgeprägte 4,5 kb Bande, die nicht in Spur 6 (Tumor M) (Daten nicht gezeigt) gesehen wurde. Expositionszeiten: obere Reihe (Sonde B): Spuren 1-6, 17 Std. Spuren 7 und 8, 12 Std., mittlere Reihe (Sonde B): alle Spuren 52 Std., untere Reihe (28S rRNS): alle Spuren 1,5 Std. Ein ungefähr 4,5 kb Transkript (geringfügig kleiner als die 28S rRNS Bande) war in allen Spuren von 4 zu sehen: Jedoch war die Intensität der 4,5 kb Bande in Tumoren M, Y und F ungefähr 15-fach größer als in jedem anderen Probematerial. Es wurde dargestellt, dass die 4,5 kb Bande polyadenylierte RNS darstellt durch Auffinden, das ihre Intensität vervielfältigt in poly A+ RNS ist (Daten nicht gezeigt).
Nebenschilddrüsen-Adenom M wurde ursprünglich während Untersuchungen über die Monoklonalität von Nebenschilddrüsen-Adenomen identifiziert da es ein anormales PTH-Gen aufweist (Tumor 1 in Arnold et al., N. Eng. J. Med. 318:658-662, 1988). Alle Tumorproben wurden kurz nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Extrahieren von DNS mit hohem Molekulargewicht, Verdau mit Restriktionsenzym und Southern-Blotting wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt (Arnold et al., N. Eng. J. Med., 309:1593-1599, 1983) Gesamt-RNS wurde durch das Guanidinium-Thiocyanat/Cäsiumchlorid Verfahren isoliert, in einem denaturierenden Formaldhyd-Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose- oder Nylon-Filter übertragen (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 7.19-7.22, 7.37-7.39, 11.31-11.32, 1989). Die Hybridisierungsbedingungen waren ähnlich denen, die für Southern-Filter verwendet werden. Die Blots wurden mit hoher Stringenz (0,1 × SSC, 65°) gewaschen.
Die als Hybridisierungs-Sonden verwendeten PTH Fragmente waren das 775 bp BgIII Fragment (5'PTH-Sonde) und das 2,6 kb SstI-EcoRI Fragment (3' PTH-Sonde), aus pPTHg108 (Igarashi et al., Mol. Cell. Biol. 6:1830-1833, 1986) (2a). Das 500 bp Fragment und Sonde B (3) wurden in pUC-18 von der Bruchpunkt-benachbarten DNS der Phagenklone, die das umgeordnete PTH-Gen Fragment plus benachbarte DNS aus Tumor M (siehe oben) beziehungsweise Tumor Y (Arnold et al., 1989) enthalten, subkloniert. Das 1,6 kb XhoI Fragment von dem 14kb Insert, das von der normalen menschlichen genomischen Bibliothek kloniert wurde, wurde ebenso in pUC-18 subkloniert. Das 1,6 kb XhoI Fragment von Tumor Y wurde von einem λPhagen 2001 Klon, der das 17 kb HindIII Fragment des nicht-umgeordneten D11S287 Allels von Tumor Y (Arnold et al., 1989) enthält, subkloniert. Alle Sonden wurden (random primed) zufallsprimerunterstützt synthetisiert und mit [³²P]dATP markiert (Feinberg & Vogelstein, Anal. Biochem. 132:6-13, 1983). Die 28S RNS OligoNukleotide wurden mit [³²P]dATP end-markiert (Sambrook et al., 1989) und verwendet die Northern-Filter zu testen, um die Menge von in jeder Spur vorhandener RNS, mit hohem Molekulargewicht, zu kontrollieren.
Um das umgeordnete 5' PTH-Gen Fragment (2b) zu klonieren, wurde eine EcoRI Bibliothek von genomischer Tumor DNS unter Verwendung des λZapII-Vektors (Stratagene) hergestellt. Diese Bibliothek wurde mit der 5' PTH-Gen Sonde durchmustert und das umgeordnete Allel wurde von dem normalen Allel durch Größe unterschieden, da DNS-Blots prognostizierten, dass das umgeordnete EcoRI Fragment eine Größe von 1,5 kb aufweisen würde und das normale Fragment 3,5 kb. Ein Klon, der das umgeordnete Gen enthält, wurde unter 1 × 10⁶ Plaques/Löchern, die durchmustert wurden, identifiziert.
Um das umgeordnete 3' PTH-Gen Fragment zu klonieren (2b) wurde eine BamHI Bibliothek von genomischer Tumor DNS in EMBL-3 hergestellt. Da Restriktionskartierung anzeigte, dass sowohl die normalen, als auch die umgeordneten 3' PTH BamHI Fragmente 16 kb Größe aufwiesen, wurde die Bibliothek mit der 3' PTH-Sonde (erwartet mit sowohl den normalen und umgeordneten PTH Allelen zu hybridisieren) und dann mit der 5' PTH-Sonde (erwartet nur mit dem normalen Allel zu hybridisieren) durchmustert. Ein Klon, der das umgeordnete Allel enthält wurde unter 6,5 ×10³ durchmusterten Löchern identifiziert. Wie prognostiziert enthielt er 8 kb der 3' PTH-Gen Sequenzen und 8 kb der neu-benachbarten DNS. Das meiste dieser 8 kb wurde in ungefähr 2 kb Einheiten in pUC-18 subkloniert und verwendet, um Southern-Filter normaler genomischer DNS zu testen.
Vorreassoziation (prereassociation) wurde ausgeführt durch Ultraschallbehandlung von 1 mg menschlicher genomischer DNS aus der Plazenta und sie wurde für 10-60 Min. mit 50-100 ng markierter Wiederholung(s-Sequenz)-enthaltender, subklonierter DNS, inkubiert. Diese Mischung wurde dann unter Standardbedingungen mit einem Southern-Filter hybridisiert, der normale menschliche DNS enthält.
Die genomische Bibliothek, die verwendet wurde, um das 14 kb Insert zu erhalten war ein teilweiser Verdau normaler menschlicher DNS mit Sau-3a, die in einem EMBL-3 ähnlichen Vektor (Clontech) kloniert wurde.
Chromosomenkartierung wurde unter Verwendung von Mensch-Maus Somazellhybriden (Shows et al., Adv. Hum. Genet. 12:341-452; 1982; Shows et al., Somatic Cell Mol. Genet. 10:315-318, 1984), Southern Blotting (Naylor et al., J. Exp. Med. 57:1020-1027, 1983) und in situ-Hybridisierung (Zabel et al., Cytogenet. Cell Genet. 39:200-205, 1985; Nakai et al., Cytogenet. Cell Genet. 43:215-217, 1986) wie vorstehend beschrieben ausgeführt.
Eine λgt11 cDNS Plazenta Bibliothek (Clontech) wurde mit der radioaktiv markierten Sonde B durchmustert. Ein λP1-4 bezeichneter Klon und ein anderer ähnlicher Phagenklon wurden isoliert. Sonde B und das Insert von λP1-4 wurden sequenziert. Die Region der Überlappung von genomischer und von cDNS wurde in Sonde B durch eine GT Spender Spleiß-Sequenz in nur einer Richtung verfolgt, wobei die Hybrdisierungsdaten bestätigt wurden, die eine Transkrition in der links nach rechts Richtung, wie in 5 gezeigt, nahegelegt hatten. Die nächste Sonde wurde Vervielfältigung der 3' Region des λP1-4 cDNS Inserts durch Polymerase-Ketten-Reaktion hergestellt und verwendet, um die gleiche Bibliothek erneut zu durchmustern. Von 5 × 10⁵ pfu dieser Bibliothek wies einer von 16 positiven Klonen, λP1-5, ein sich weiter stromabwärts erstreckendes Insert auf. Das PstI/EcoRI Fragment von λP1-5 wurde dann verwendet, um die Bibliothek erneut zu durchmustern, und wobei 12 ähnliche Klone, deren längster λP2-3 war, erhalten wurden. Die Sequenz von Insert λP2-3 offenbarte, übereinstimmend mit der erwarteten Richtung, Polyadenylierungssignale und einen polyA-Schwanz von 16 Nukleotiden in einer geeigneten Position. Standardverfahren zum Durchmustern einer Bibliothek und Markieren von Sonde wurden verwendet (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Elsuevier, New York, Amsterdam, London, 1986). Diese Klone werden in 5, zusammen mit einer schematischen Darstellung der PTH/D11S287 Umordnung in zwei Nebenschilddrüsen-Adenomen, dargestellt. In jedem dieser Adenome wurde die 5' PTH Region (11p15, dicke Linien) angrenzend zu der D11S287 Region (11q13, dünne Linien) angeordnet. Die Bruchpunkte in der D11S287-Region liegen 15 kb entfernt. Die genomische Sonde B ist als eine geschwärzte Box gezeigt, deren offener Bereich das erste Exon von PRAD1 darstellt. Ebenso gezeigt sind Restriktionskarten der Inserte von repräsentativ überlappenden PRAD1 cDNS Klonen, λP1-4, λP1-5 und λP2-3 und die abgeleitete Restriktionskarte der PRAD1 cDNS. Die codierende Region ist als eine querschraffierte Box gezeigt. Der Maßstab von 1 kb ist als Pfeile) gezeigt. Die für die Restriktionsstellen verwendeten Symbole sind: B, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; P, PstI.
Die Inserte der in 5 gezeigten der Klone, λP1-4, λP1-5 und λP2-3 und von anderen unabhängigen Klonen wurden in pGEM7Zf(+) (Promega) subkloniert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Doppelstrang-DNS-Sequenzierungs Verfahrens (Dideoxy-Verfahren) mit veränderter T7 DNa Polymerase (Sequenase; U.S. Biochemical Cooperation), wie vom Hersteller beschrieben, erhalten. Einige Oligonukleotide wurden als interne Primer synthetisiert, um die Sequenzierung zu erleichtern. Die codierende Region wurde in beiden Richtungen und in mindestens zwei unabhängigen Klonen sequenziert. In 6 sind die Nukleotidsequenz und die prognostizierte Aminosäure-Sequenz der PRAD1 cDNS vom Menschen (SEQ ID Nr. 1) dargestellt. Die Nukleotidnummerierungen stehen auf der rechten Seite. Das Nukleotid 3495, gezeigt als W, zeigt A oder T an, da die Sequenzen von zwei unabhängigen Klonen nicht übereinstimmen. Nukleotid 4017 ist als R gezeigt, was aus dem gleichen Grund A oder G bedeutet.
Die 7 stellt die Sequenzhomologie zwischen der "Cyclin Box" Region des prognostizierten PRAD1 Proteins (prad1) und der von Typ-A-Cyclinen (Mensch und Muschel Cyclin A) (Swanson et al., Cell 47:861-870, 1986 und Wang et al., Nature 343:555-557, 1990), B-Typ Cyclinen (Mensch Cyclin B und S. pombe cdc13) (Pines et al., Cell 58:833-846, 1989 und Booher et al., EMBO J. 7:2321-2327, 1988), und einem S. cerevisiae G1 Cyclin (cln3) (Nash et al., EMBO J: 7:4335-4346, 1988, Cross et al., Mol. Cell. Biol. 8:4675-4684, 1988) dar. Muschel Cyclin A und S. pombe cdc13 weist Homologien mit prad1 auf, die repräsentativ für die in ihren Familien gefundenen sind, wobei sich cln13 näher nach prad1 ausrichtet als es cln1 und 2 tun. Identische Aminosäuren sind als ¦ gezeigt. Konservative Substitutionen sind als * gezeigt. Die Ausrichtung wurde mit Unterstützung des BESTFIT-Programms (Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387-395, 1984) ausgeführt und konservative Aminosäuren sind wie folgt gruppiert: D, E, N, Q; H, K, R; A, G, P, S, T; I, L, M, V; F, W, Y. Die Aminosäureanzahl ist auf der rechten Seite angegeben.
RNSs wurden von den angezeigten Geweben mittels Standardverfahren (Davis et al., 1986) für Northern-Blot-Analysen hergestellt. 10 μg Gesamt-RNS wurde aufgetragen und in einem Agarose-Formaldehyd Gel aufgetrennt, auf Nitrocellulose geblottet und mit Sonde B oder dem 28S rRNS Oligonukleotid hybridisiert. Die Filter wurden mit hoher Stringenz gewaschen (0,1 × SSC, 60°C) und einer Autoradiographie ausgesetzt. 8 stellt eine Northern-Blot Analyse von Gesamt-RNS aus menschlicher Schilddrüse (Spur 1), menschlicher Plazenta (Spur 2), Rinder Nebenschilddrüse (Spur 3), Rinder Schilddrüse (Spur 4), Rinder Lymphknoten (Spur 5), Rinder Skelettmuskel (Spur 6), Maus Herz (Spur 7) und Mausleber (Spur 8) dar. Die PRAD1 mRNS (in der oberen Aufstellung gezeigt) weist ungefähr eine Größe von 4,5 kb auf, die geringfügig kleiner ist als die 28S rRNS; und die 28S rRNS Hybridisierung ist in der unteren Aufstellung gezeigt. 9(a) zeigt eine Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNS aus HeLa S3 Zellen nach dem Entlassen aus der G1/S-Blockierung. HeLa S3 Zellen (American Type Culture Collection), die in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM, GIBCO) mit 7% fötalem Rinderserum (FBS) gehalten werden, wurden an der G1/S Grenze durch sequentielle Thymidin-Aphidicolin-Behandlung (Heintz et al., Mol. Cell. Biol. 3:539-550, 1983) mit einer kleinen Veränderung, synchronisiert. Log-Phasen-Zellen wurden in komplettem Medium (DMEM mit 7% FBS, Penicillin G und Streptomycin) mit Zugabe von 2 mM Thymidin (Sigma) für 12 Std. inkubiert. Nach Entlassen aus der Thymidin-Blockierung, durch 3-maliges Waschen mit PBS, wurden die Zellen für 10 Std. mit 24 μM Deoxycytidin (Sigma) und 24 μM Thymidin inkubiert, durch Behandlung mit Trypsin zurückgewonnen, gezählt und in gleiche Teilmengen (5,0 × 10⁴ Zellen/cm²) aufgeteilt. Einer Inkubation mit 5 μg/ml Aphidicolin (Sigma) für 14 Std., folgte das Entlassen aus der G1/S-Blockierung mittels 4 DMEM-Waschgängen und Inkubation in komplettem Medium. [³H]Thymidin (NEN) wurde einer Teilmenge 15 Min. vor jedem angezeigten Zeitpunkt zugegeben, worauf eine 30 Min. Inkubation und Ernten zur Trichloressigsäure (TCA)-Ausfällung folgten. RNSs von parallelen Teilmengen wurden zu den angezeigten Zeitpunkten gewonnen (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162:156-159, 1987), wobei Zeitpunkt Null gerade vor dem Entlassen von Aphidicolin geschah. RNSs (5 μg pro Spur) wurden auf Nitrocellulose geblottet und aufeinanderfolgend mit dem PRAD1 λP1-4 cDNS Insert, menschlichem H4 Histon pF0108X (Pauli et al., Science 236:1308-1311, 1987) und einem 28S rRNS Oligonukleotid, wie vorstehend beschrieben, hybridisiert. Menschliche PRAD1 mRNS wird in der oberen Aufstellung von 9(a) gezeigt, wobei in der mittleren Aufstellung H4 Histon mRNS, das in gut synchronisierten Zellen erwartete Muster zeigt (Heintz et al., 1983) und die 28S rRNS wird in der unteren Aufstellung als Kontrolle für RNS-Beladung gezeigt. In 9(b) werden die relativen Mengen von menschlicher PRAD1 mRNS (-•-), H4 Histon mRNS (-∘-) und [³H]Thymidin Einbau (-∘-) von HeLa S3 Zellen nach Entlassen aus der G1/S-Blockierung verglichen. Die Signale des in 9(a) gezeigten Blots wurden durch Densitometrie erfasst und auf die 28S rRNS normalisiert, um den Graphen von 9(b) herzustellen.
InterphasenZellysate von Muschel-Embryonen, denen endogene Cycline fehlen, wurden, wie vorhergehend beschrieben (Luca et al., J. Cell Biol. 109:1895-1909, 1989) durch Zugabe von 100 μM Emetin, während der ersten Mitose, gefolgt durch Aufschließen und Zentrifugation bei 150.000 × g, erzeugt. Teilmengen des Überstandes wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren. [³⁵S]Methionin-markiertes prad1 wurde in einem Reticulocytenlysat – in vitro – Translationssystem (Promega) gemäß den Instruktionen des Herstellers, unter Verwendung eines Plasmids (bezeichnet pP1-8), dass das λP1-4 Insert im pGEM7Zf(+) (Promega) enthält, hergestellt. Um prad1 in E. coli herzustellen, wurde pT4R-1 durch Insertion des λP1-4 Inserts in die NcoI und BamHI-Stellen von pET-3d hergestellt (Studier et al., Meth. Enzym. 108:60-89, 1990). BL21 (DE3) -Zellen wurden mit pT4R-1 transformiert, kultiviert und mit 0,4 mM Isopropylthio-Beta-Galactosidase (IPTG) für 3 St. behandelt, um prad1 Expression zu induzieren. Das induzierte Produkt wurde als Einschlusskörper von der Zellkultur aufgereinigt (Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859, 1990). Auf SDS-Polyacrylamid-Gelen waren die offensichtlichen Größen des in vitro-Translations-Produktes und des in Bakterien exprimierten Produktes die gleichen (Mr 35 kD). Anti-prad1-Kaninchen-Antiseren wurden gegen ein synthetisches Peptid, das den Aminosäuren 9-37 von prad1 entspricht, gezüchtet. Die Antiseren wurden durch Immunpräzipitation des in vitro Translations-Produktes getestet. Die Antiseren-Spezifität wurde durch Vergleich mit normalem Kaninchenserum und durch erfolgreiche Verdrängung mit dem (9-37) Peptid gezeigt (Daten nicht gezeigt).
Aufgetautes Lysat von Muschel-Embryonen (16,5 μl) und in Bakterien exprimiertes prad1 (5,5 μl) wurden gemischt und vor der Übertragung auf 4°C bei 18°C für 30 Min. inkubiert, mit 4 Volumen von Puffer A verdünnt (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM Ammoniummolybdat) und die Zugabe von p13^suc1 oder, Protein A-Sepharose wurde gefolgt von 1 Std. Mischen. Die Kügelchen wurden dann zu einem Sediment zentrifugiert (bzw. pelletiert) und in Puffer A + 0,5% Tween-20, in Puffer B (50 mM Tris pH 7.4, 1, 0 M NaCI, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM Molybdat, 0,5% Tween-20) und schließlich in Puffer A ohne Tween-20, jeweils bei 4°C gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen wurden in SDS-Probenpuffer für 3 Min. gekocht und der Überstand in drei Proben zur elektrophoretischen Auftrennung aufgeteilt. Gele wurden einer Silberfärbung unterzogen oder auf Nitrocellulose-Filter geblottet und mit, gegen in Bakterien exprimiertes Voll-Längen S. pombe cdc2 Protein oder prad1 Peptide, wie vorstehend, erzeugte Kaninchen-Antikörpern, zur Reaktion gebracht. Die Antikörperbindung wurde durch alkalische Phosphatase-gekoppelte sekundäre Antikörper, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega), sichtbar gemacht. 10 zeigt, dass das zu den Zelllysaten von Muschel-Embryonen zugegebene prad1-Protein an p13^suc1-Sepharose Kügelchen bindet und Histon H1 Kinaseaktivität aktiviert. In Bakterien exprimiertes prad1 wurde mit einem Interphasenlysat von Muschel-Embryonen, dem endogene Cycline A und B fehlen, inkubiert. Die Lysate wurden dann mit p13^suc1 oder Protein A-Sepharose-Kügelchen gemischt. Das gebundene Material wurde ausgewaschen/eluiert, elektrophoretisch aufgetrennt und entweder einer Silberfärbung (a) oder einem Immun-Blotting mit anti-prad1 Antiserum (b) oder anti-cdc2 Antiserum (c) unterzogen. Spur M zeigt Molekulargewichts-Marker (von oben nach unten) von 116, 94, 68, 56, 40 und 31 kD. Die Spur 1 zeigt gesamtes Interphasenlysat von Muschel-Embryonen plus 18 ng prad1 Protein. Die Spuren 2, 3, 4, 5, und 6 stellen Lysat von Muschel-Embryonen dar, denen jeweils 0, 18, 45, 225 oder 18 ng prad1 zugegeben wurden, wobei diese Mischungen dann auf Materialbindung von p13^suc1-Sepharose- (Spuren 2-5) oder Protein A-Sepharose-Kügelchen (Spur 6) getestet wurden. Spur 7 zeigt in Bakterien exprimiertes prad1. Die Pfeile zeigen die Positionen von prad1- und cdc2-Markenproteinen an.
Gleiche Volumina von Interphasenlysat von Muschel-Embryonen und Retikulozytenlysat, die [³²P]-markierte Kinaseprodukte enthalten, wurden dann durch SDS-PAGE und nachfolgender Autoradiographie, untersucht. Synthetische Muschel Cycline A und B (Westendorf et al., J. Cell Biol. 108:1431-1444; Swanson et al., Cell 47:861-870, 1986) und prad1 mRNSs wurden, wie vorstehend beschrieben, transkribiert und translatiert. Das Translationsprodukt (3 μl) und Lysat von Muschel-Embryonen (3 μl) wurden gemischt. Die Proben wurden sofort in flüssigen Stickstoff eingefroren. Der Rest wurde für 30 Min. bei 18°C inkubiert und dann eingefroren. Die Proben wurden mit 1 Volumen eiskalten Puffers A verdünnt, auf Eis stehend aufgetaut und mit einem gleichen Volumen einer Kinasemischung (40 mM Hepes pH 7.3, 20 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 0,2 mg/ml Histon H1, 10 μM cAMP-abhängigen Kinase-Hemmer (Sigma), 0,5 mCi/ml [γ-³²P]ATP gemischt und bei 23°C für 10 Min. inkubiert. Doppeltstarker SDS-Probenpuffer wurde dann zugegeben und die gesamte Mischung wurde, wie in 10(d) gezeigt, durch SDS-PAGE mit nachfolgender Autoradiographie analysiert.

Claims

Isoliertes DNA-Molekül umfassend eine Sequenz, die prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, worin genanntes prad1 die gleiche Aminosäuresequenz wie das durch SEQ ID NO:1 codierte Polypeptid aufweist.
Isolierter Vektor, wobei genannter Vektor ein isoliertes DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz umfasst, die prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Vektor nach Anspruch 3, worin genannte DNA-Sequenz, die prad1 codiert, sich unter Transkriptionskontrolle eines heterologen Promotors befindet.
Zelle, bei der es sich nicht um eine humane Embryonalzelle handelt, die ein isoliertes DNA-Molekül umfasst, das prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Zelle nach Anspruch 5, worin genanntes isoliertes DNA-Molekül in das Genom von genannter Zelle integriert ist.
Zelle nach Anspruch 6, worin genannte Zelle eine eukaryontische Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 5, worin genannte Zelle zur Expression von prad1 aus genanntem rekombinantem DNA-Molekül fähig ist.
Zelle nach Anspruch 5, worin genannte Zelle genanntes prad1 aus genanntem isoliertem DNA-Molekül exprimiert, worin genanntes prad1 durch eine DNA-Sequenz unter der Transkriptionskontrolle eines Promotors codiert ist.
Verfahren zur Verwendung der Zelle nach Anspruch 5, welches Verfahren Folgendes umfasst: Kultivieren genannter Zelle in einem Medium unter Bedingungen, die zur Expression geeignet sind; und Wiedergewinnung von prad1 aus genannter Zelle oder genanntem Medium.
Verfahren nach Anspruch 10, worin genanntes prad1 die gleiche Aminosäuresequenz wie das durch SEQ ID NO:1 codierte Polypeptid aufweist. 12: Zelle nach Anspruch 5, worin genanntes prad1 die gleiche Aminosäuresequenz wie das durch SEQ ID NO:1 codierte Polypeptid aufweist.
Weitgehend homogene Zellpopulation, bei der es sich nicht um ein humanes Wesen handelt, von denen jede ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst, das prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Zellpopulation nach Anspruch 13, worin jede der genannten Zellen eine eukaryontische Zelle ist.
Zellpopulation nach Anspruch 13, worin jede der genannten Zellen eine prokaryontische Zelle ist.
Zellpopulation nach Anspruch 13, worin genanntes prad1 die gleiche Aminosäuresequenz wie das durch SEQ ID NO:1 codierte Polypeptid aufweist.
Prad1, produziert durch Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls, das prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Prad1, synthetisiert durch die Zelle nach Anspruch 5.
Prad1, synthetisiert durch die Zellpopulation nach Anspruch 13.
Weitgehend gereinigte Präparation des prad1 nach Ansprüchen 17, 18 oder 19.
Verfahren zur Herstellung von prad1, welches Verfahren Folgendes umfasst: Kombination der gereinigten DNA nach Anspruch 1 mit einem Expressionssystem zum Herstellen von prad1; und Wiedergewinnung von genanntem prad1 aus genanntem Expressionssystem.
Therapeutische Zusammensetzung umfassend prad1, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNR-Molekül unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA und einem pharmakologisch unbedenklichen Träger besteht.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22 zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung der Wundheilung, welches Verfahren Folgendes umfasst: Identifikation eines Tieres mit einer Wunde; und Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der therapeutischen Zusammensetzung an genanntes Tier.
Transgenes, nicht humanes Wirbeltier, das ein Transgen trägt, umfassend eine DNA-Sequenz, die prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu in SEQ ID NO:1 dargelegtem humanem PRAD1 oder cDNA besteht.
Transgenes Tier nach Anspruch 24, worin genanntes Tier ein Säuger ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 25, worin genanntes Tier ein Nagetier ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 26, worin genanntes Tier eine Maus ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 24, worin genanntes prad1 ein für die Spezies von genanntem transgenem Tier endogenes prad1 ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 24, worin genanntes prad1 humanes prad1 ist.
Zelle, abgeleitet von dem transgenen Tier nach Anspruch 24.
Prad1, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung der Proliferation einer Zelle induziert, welches Verfahren Folgendes umfasst: Vorsehen einer Tierzelle und Behandlung genannter Zelle mit einer Proliferationinduzierenden Menge von prad1, worin genanntes prad1 durch ein DNA-Molekül codiert ist, das unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Ex-vivo-Verfahren zur Förderung der Proliferation einer Zelle, welches Verfahren Folgendes umfasst: Vorsehen einer Tierzelle; und Behandlung genannter Zelle mit einer Proliferationinduzierenden Menge von prad1, einem Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes prad1 durch ein DNA-Molekül codiert ist, das unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Verfahren zur Verwendung einer isolierten Nukleinsäure, die prad1 codiert, wobei genanntes prad1 ein Cyclin ist, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, welches Verfahren Folgendes umfasst: Einführung genannter isolierter Nukleinsäure, die prad1 codiert, in ein Retikulozytenlysat in einem In-vitro-Expressionssystem; Inkubation von genanntem Expressionssystem zur Herstellung von genanntem prad1; und Wiedergewinnung von genanntem prad1 aus genanntem Expressionssystem, worin genannte isolierte Nukleinsäure unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus mindestens 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
Verfahren nach Anspruch 33, worin genanntes prad1 die gleiche Aminosäuresequenz wie das durch SEQ ID NO:1 codierte Polypeptid aufweist.
Isoliertes, einsträngiges DNA-Molekül, umfassend ein Segment aus einem PRAD1, wobei jedes von genanntem PRAD1 und genanntem Segment ein DNA-Molekül ist, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die prad1-codierende cDNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder das Komplement davon hybridisiert, wobei genanntes Segment mindestens eine Länge von 40 Nukleotiden aufweist.
Einsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 35, worin genanntes PRAD1 ein genomisches PRAD1 ist.
Einsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 35, worin genanntes PRAD1 eine PRAD1-cDNA ist.
Einsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 35, worin genanntes DNA-Molekül radioaktiv markiert ist.
Einsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 35, worin genanntes DNA-Molekül Antisense ist.
Einsträngiges DNA-Molekül nach Anspruch 35, worin genanntes PRAD1 humanes PRAD1 ist.
Einsträngige DNA nach Anspruch 40, worin genanntes PRAD1 in SEQ ID NO:1 dargelegte humane PRAD1-cDNA ist.
Einsträngige DNA nach Anspruch 38, worin genanntes Segment von genanntem PRAD1 weniger als alle von genanntem PRAD1 ist.
Einsträngige DNA nach Anspruch 38, worin genanntes Segment von genanntem PRAD1 eine Länge von 40 – 3000 Nukleotiden aufweist.
Diagnostisches Verfahren, umfassend: Kontaktieren einer Nukleinsäureprobe, entnommen aus einem Tier mit Verdacht auf eine neoplastische Erkrankung, mit einer einsträngigen DNA nach Anspruch 37, wobei genanntes PRAD1 das PRAD1-Homologon der Spezies darstellt, zu der genanntes Tier gehört, und Nachweis des Hybridisierungsgrades unter stringenten Hybridisierungsbedingungen von genannter einsträngiger DNA mit genannter Nukleinsäureprobe, wobei genannter Grad für genannte neoplastische Erkrankung diagnostisch ist.
Verfahren nach Anspruch 44, worin genanntes Tier ein Säuger ist.
Verfahren nach Anspruch 45, worin genannter Säuger ein Mensch ist.
Antikörper, der zum Bilden eines Immunkomplexes mit prad1 fähig ist, einem Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes DNA-Molekül unter stringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht und die nicht mit dem Cyclin A1 von Xenopus laevis kreuzreagiert.
Gereinigte Präparation des Antikörpers nach Anspruch 47.
Antikörper nach Anspruch 47, worin genanntes prad1 humanes prad1 ist.
Gereinigte Präparation nach Anspruch 48, worin genanntes prad1 humanes prad1 ist.
Diagnostisches Verfahren, umfassend: Kontaktieren einer Probe eines Gewebes, das aus einem Tier mit Verdacht auf eine neoplastische Erkrankung entnommen wurde, mit dem Antikörper nach Anspruch 46; und Nachweis der Konzentration der durch genannten Antikörper gebildeten Immunkomplexe, wobei genannte Konzentration für genannte neoplastische Erkrankung diagnostisch ist.
Verfahren nach Anspruch 51, worin genanntes Tier ein Mensch ist.
Weitgehend gereinigtes RNA-Molekül umfassend eine Sequenz, die prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Zelllysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genanntes RNA-Molekül unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, die aus einem Segment aus mindestens 40 Nukleotiden, komplementär zu der in SEQ ID NO:1 dargelegten humanen PRAD1-cDNA besteht.
RNA-Molekül nach Anspruch 53, worin genanntes prad1 humanes prad1 ist.
Isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine Sequenz, die prad1 codiert, ein Cyclin, das Kinaseaktivität in einem Interphasen-Lysat von Muschel-Embryonen induziert, worin genannte Sequenz, die prad1 codiert, aus der Sequenz von SEQ ID NO:1 besteht.
Isoliertes doppelsträngiges DNA-Molekül, umfassend ein Segment von einem PRAD1, wobei genanntes PRAD1 ein DNA-Molekül ist, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die prad1-codierende cDNA-Sequenz von SEQ ID NO:1 oder das Komplement davon hybridisiert, wobei genanntes Segment mindestens eine Länge von 40 Nukleotiden aufweist.
RNA-Molekül, transkribiert aus der isolierten DNA nach Anspruch 1.
DNA-Molekül nach Anspruch 56, worin genannte Sequenz eine Länge von 40 – 3000 Nukleotiden aufweist.