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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Krebs-Diagnose und
Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren
zum Nachweis und zur Behandlung menschlicher t(2;5) positiver Lymphome.
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Großzell-Lymphome
umfassen ungefähr
ein Viertel aller Non-Hodgkin Lymphome bei Kindern und jungen Erwachsenen.
Ungefähr
ein Drittel dieser Tumore weisen eine chromosomale t(2;5)(p23;g35) Translokation
auf (H. Stein und F. Dallenbach, in Neoplastic Hematophatology,
D.M. Knowles, Ed. (Williams & Williams,
Baltimore pp. 675–714
(1992)), die darauf schließen
lässt,
dass die Umlagerung zellulärer
Proto-Onkogene auf diesen Chromosomen zur Lymphomagenese beiträgt. Lymphome
mit der t(2;5) umfassen gewöhnlich
Lymphknoten, Haut, Lunge, Weichgewebe, Knochen und den Gastrointestinal-Trakt
und entstehen hauptsächlich
aus aktivierten T-Lymphozyten (Y. Kaneko et al., Blood. 73:806 (1989);
M.M. Le Beau et al., Leukemia 3:866 (1989); R. Rimokh et al., Br.
J. Haematol. 71:31 (1989); D.Y. Mason et al., Br. J. Haematol. 74:161
(1990); M.A. Bitter Am. J. Surg. Phatol. 14:305 (1990); M.E. Kadin, J.
Clin. Oncol. 9:533 (1991); J.P. Greer et al., J. Clin. Oncol. 9:539
(1991); V. Vecchi et al., Med. Pediatr. Oncol. 21:402 (1993)). Die
malignen Zellen exprimieren IL-2 Rezeptoren und CD30 (Ki-1) Antigen,
einen Rezeptor für
ein neu beschriebenes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Ligand-Familie
(H. Durkop et al., Cell 68:421 (1992); C.A. Smith et al., Cell 73:1349 (1993)).
Durch die aktualisierte Kieler-Lymphom-Klassifizierung werden die
meisten Tumore mit der t(2;5) als anaplastische Großzell Non-Hodgkin Lymphome
klassifiziert (A.G. Stansfeld et al., Lancet 1:292 (1988)).
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Chromsomale
Abnormalitäten
stehen häufig mit
malignen Krankheiten in Verbindung. In mehreren Beispielen wurden
spezifische chromosomale Translokationen charakterisiert, die Fusionsgene
erzeugen, die Proteine mit onkogenen Eigenschaften kodieren (Sawyers
et al., Cell 64:337–350
(1991)). Ein spezifische t(2;5) Translokation ist das Kennzeichen der
menschlichen anaplastischen Großzell-Non-Hodgkin-Lymphome.
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Hierin
wird die Klonierung und Sequenzierung der menschlichen Nukleinsäuresequenzen
offenbart, die in dem chromosomalen t(2;5)(p23;g35) Translokations-Ereignis
umgelagert werden, das sich in menschlichen t(2;5) Lymphomen ereignet.
Es wurde gefunden, dass bei der Umlagerung Sequenzen des nucleolaren
Phosphoprotein Gens (das NPM Gen) auf Chromosom 5q35 zu denen einer
zuvor nicht identifizierten Protein Tyrosinkinase Gens (im Folgenden
das ALK Gen) auf Chromosom 2q23 verschiebt. Die Sequenzen des Fusionsgens
und Fusionsproteins werden ebenfalls bekannt gegeben (im Folgenden
jeweils das NPM/ALK Fusionsgen oder Fusionsprotein).
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Unter
Verwendung der Sequenzen des identifizierten NPM/ALK Fusionsgens
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung auf
die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz
in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet und
die die Schritte umfasst von:
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- Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäure-Amplifikationsprimern,
wobei der erste Nukleinsäure-Amplifikationsprimer
in der Lage ist an die Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren, die NPM oder eine dazu komplementäre Sequenz
kodiert, und ein zweiter Nukleinsäure-Amplifikationsprimer, der
in der Lage ist an die Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren, die NPM oder eine dazu komplementäre Sequenz
kodiert;
- Amplifizieren der mit Primerunterstützung erhalten Sequenzen in
einer Probe, die an die zwei Primer hybridisiert; und
- Nachweisen der Anwesenheit der amplifizierten Nukleinsäuresequenz
in der Probe, die die NPM/ALK Fusion enthält.
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Die
vorliegende Erfindung stellt alternative Verfahren zur Identifizierung
der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz
in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusion beinhaltet und die
die Schritte umfasst von:
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- Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäuresonden,
worin die erste Nukleinsäuresonde
in der Lage ist an die NPM kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren
und eine zweite Nukleinsäuresonde
in der Lage ist an die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;
und
- Nachweisen der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in der Probe, die
sowohl an die erste als auch die zweite Nukleinsäuresonde hybridisiert.
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Alternativ
kann eine einzelne Nukleinsäuresonde,
die die Verbindungsstelle der NPM/ALK Fusion umfasst, anstelle der
zwei verschiedenen Sonden verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin alternative Verfahren zum
Nachweis der Anwesenheit der NPM/ALK Fusion bereit, die auf Antikörper-Nachweis-Systemen
beruhen. Da insbesondere eine NPM/ALK Fusion in t(2:5) Lymphom-Zellen
exprimiert ist, können
das Fusionsprotein identifizierende Antikörper zum Nachweis auf die Anwesenheit
des NPM/ALK Fusionsproteins verwendet werden. Das NPM/ALK Fusionsprotein
kann beispielsweise nachgewiesen werden durch:
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- Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Antikörpern, worin
ein erster Antikörper
in der Lage ist an NPM zu binden und ein zweiter Antikörper in
der Lage ist an ALK zu binden; und
- Nachweisen der Anwesenheit eines Proteins in der Probe, das
sowohl an den ersten als auch den zweiten Antikörper bindet.
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Außerdem kann
aufgrund der Art des bei der NPM/ALK Fusion erzeugten Fusionsproteins
ein einzelner selektiv das Fusionsprotein bindender Antikörper erzeugt
und zur Identifizierung der NPM/ALK Fusion verwendet werden.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Kits mit Unterteilungen zur Aufnahme
von einem oder mehreren Behältern
in strenger Eingrenzung bereit, die die bei den vorstehend beschriebenen
Nachweisverfahren benutzten Reagenzien beinhalten.
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1 (Tafeln A–C): (A)
Southernblot Analyse von DNAs einer karyotypisch normalen, Epstein-Barr-Virus-immortalisierten
menschlichen Lymphozyten Zelllinie (Kontrolle, Spuren 1, 4 und 7)
und die t(2;5)-positiven Zelllinien SU-DHL-1 (Spuren 2, 5 und 8)
und SUP-M2 (Spuren 3, 6 und 9) mit der p16–3/1.35 Sonde. Pfeilspitzen
zeigen umgelagerte Restriktionsfragmente an. (B) Northern Blot Analyse der
RNAs aus t(2;5)-negativem B-Lymphoid- (NALM-6, Spur 2), T-Lymphoid- (MOLT4),
Spur 1; CEM, Spur 3) und Rhabdomyosarcoma- (Rh30, Spur 7) transformierten
Zelllinien und den t(2;5)-positiven Linien SU-DHL-1, SUP-M2 und
UCONN-L2 (Spuren 4–6)
mit einem 5' NPM
cDNA Fragment (obere Tafel) und einem 3' Fragment der NPM-ALK cDNA (pS 1.2) (unter Tafel) (Die
schwachen, ungefähr
4 kb Banden verdeutlichen in der t(2;5)-positiven Zelllinie RNAs, die
mit pS1.2 repräsentierenden
Kreuzhybridisierung dieser Probe mit der 28S ribosomalen RNA hybridisiert
wurden; derartige Banden sind bei der Hybridisierung von poly (A)+
RNA nicht aufgetreten). Jede Proben-Spur, mit Ausnahme von Rh30
[8 μg poly (A+],
wurde mit zwanzig Mikrogramm an Gesamt-RNA beladen. (C) Analyse
der RNAs [2 μg
poly (A)+ pro Spur; Clonetech, San Diego, CA] aus verschiedenen
adulten und fötalen
menschlichen Geweben mit einer 3' NPM-ALK
cDNA Sonde (pS 1.2). Offene Kreise, 6.5 kb ALK Transkripte; geschlossene Kreise
8.0 kb Transkripte; offene Quadrate, 4.4 kB Transkripte; Pfeilspitzen,
6.0 kb Transkripte. Hybridisierungsergebnisse, die mit einer β-Actin cDNA
Sonde erhalten wurden, werden in der unteren Tafel gezeigt. Die
mit pS 1.2 hybridisierten Tafeln stellen eine 6-tägige autoradiographische
Bestrahlung dar; die β-Actin
Hybridisierungen wurden 4 Stunden bestrahlt.
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2 (Tafeln A–C): Abgeleitete
Aminosäuresequenz
von (A) NPM-ALK und (B) dem unmittelbar angrenzenden Anteil von
ALK an die Fusions-Verbindung und (C) Homologievergleich der katalytischen Domäne von ALK
mit anderen Tyrosinkinasen der Insulinrezeptoren-Unterfamilie. In
Tafel A zeigen ganze Kreise mögliche
Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen an; gestrichelt-unterstrichene
potentielle metallbinde Domänen;
Pfeile Grenzen der katalytischen Domäne von ALK; Sternchen konservierte
Reste der konservierten ATP Erkennungssequenz und den ATP-Binde-Lysinrest;
durchgehend-unterstrichene für
Tyrosinkinasen spezifische Konsensussequenzen. In Tafel B zeigt
der Pfeil die Lage in normalem ALK an, an der sich die NPM-ALK Fusion
ereignet; die Kästchen
wahrscheinlich eine Transmembrandomäne umfassende Reste (Hydrophobizität größer als 1,5)
an. In Tafel C sind die Aminosäurereste
der Tyrosinkinase entlang katalytischer Domänen ausgerichtet (aligned),
wobei die Lücken
(gaps) durch Striche angezeigt werden. Schattierte Kästchen zeigen zu
den Aminosäuren
von ALK identische Reste in den verwandten Tyrosinkinasen an. Alle
Sequenzen stellen menschliche Proteine dar, mit Ausnahme von Sevenless
(Drosophila melanogaster Sevenless) (J.J. Krolewski et al., EMBO
J. 10:2911 (1991); H. Toyoshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90:5404 (1993); D. Martin-Zanca et al., Natrue 319:743 (1986); H.
Matsushime et al., Mol. Cell. Biol. 6:3000 (1986); J.M. Cehn at
al., Oncogene. 6:257 (1991); K. Basler et al., Cell 54:299 (1988);
D.D. Bowtell et al., Genes and Development 2:260 (1988); A. Ullrich
et al. EMBO J. 5:2503 (1986); A. Ullrich et al., Nature 313:756
(1985); Y. Ebina et al., Cell 40:747 (1985)).
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3 (Tafeln A–C): (A)
Southernblot Analyse der NPM-ALK und NPM RNA-PCR Produkte. Gesamt-RNAs
(1 μg) von
t(2;5)-positiven Zelllinien (SU-DHL-I,SUP-M2 und UCONN-L2; Spuren
3–5) und
diagnostische Proben (Pts. 1–4,
Spuren 6–9) wurden
analysiert; zusätzlich
wurden RNAs aus den t(2;5)-negativen B- und T-Lymphoiden Leukämie-Zelllinien
(jeweils NALM-6 und CEM; Spuren 1,2) und die Rh30 Rhabdomyosarcom-Zelllinie
(Spur 10), die keine Translokation zeigt, allerdings gewöhnliches
ALK exprimiert, als Negativkontrollen genauso wie ein Blank ohne
RNA (Spur 11) hinzugenommen. (B) Nukleotidsequenz des NPM-ALK RNA-PCR-Produkts.
Einfach-unterstrichene Sequenzhomologe (5' Ende) oder Komplementäre (3' Ende) zu den Amplifikationsprimern;
doppelt-unterstrichene Sequenzhomologe zu dem als Sonde für die Southernhybridisierung
verwendeten Nachweisoligonukleotid; vertikale Linie Fusionsverbindung
zwischen NPM und ALK. (C) Schematische Darstellung der Proteine,
die durch gewöhnliches
NPM, dem NPM-ALK Fusionsgen und gewöhnlichem ALK kodiert werden.
Pfeile zeigen die Lage der NPM-ALK Fusionsverbindung und der entsprechenden
Lagen in NPM und ALK an; MB Metallbinde Domäne; AC saure Aminosäurecluster;
N nukleare Lokalisierungssignale; Tm Lage der wahrscheinlichen Transmembrandomäne von gewöhnlichem
ALK. NPM Phosphorylierungsstellen werden ebenso angezeigt (gefüllte Kreise
Proteinkinase C; offener Kreis Nukleolar Typ II Kinase; Sternchen
cdc2 Kinase). Die zwei Proteinkinase C Phosphorylisierungsstellen
in dem NPM Aminoterminus sind nur mögliche Stellen; alle anderen
Stellen wurden in-vitro oder in-vivo nachgewiesen (M. Peter et al.,
Cell 60:791 (1990); P.k. Chan et. Al., Biochem. J. 270:549 (1990);
R. Beckmann et al., Eur. J. Biochem. 210:45 (1992)). Der nicht vollständig charakterisierte Anteil
von ALK ist innerhalb gestrichelter Linien gezeigt.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung der Nukleinsäuresequnez,
die aufgrund des mit dem menschlichen t(2;5) Lymphom (im Folgenden
als NPM/ALK Fusionsgen) assoziierten Translokationsereignisses vorliegt,
der Identifizierung eines neuen Protein Tyrosinkinasegens auf dem Chromosom
2p23 (im Folgenden das ALK Gen und Protein), der Identifizierung
von mRNA, die eine Fusion zwischen dem Nukleolar en Phosphoprotein Gen
(im Folgenden NPM) und dem in t(2;5) Lymphomzellen vorliegenden
ALK Gen enthält
und der Identifizierung eines offenen Leserasters innerhalb der
NPM/ALK Fusions mRNA, die ein neues Fusions-Proteinprodukt kodiert
(im Folgenden das NPM/ALK Fusionsprotein).
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Auf
diesen Beobachtungen beruhend stellt eine erfindungsgemäße Ausführungsform
eine isolierte Nukleinsäuresequenz
bereit, die ein partielles ALK Protein (Seq. ID. No. 1) kodiert,
eine isolierte Nukleinsäuresequenz,
die das NPM/ALK Fusionsprotein (Seq. ID. No. 2) kodiert, ein isoliertes
partielles ALK Protein (Seq. ID. No. 3) und ein isoliertes ALK/NPM
Fusionsprotein (Seq. ID. No. 4).
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Insbesondere
wird die partielle Aminosäuresequenz
des ALK Proteins in 2b und c (Seq. ID. No. 3) gezeigt, die ALK kodierende
partielle Nukleinsäuresequenz
wird in Seq. ID. No. 1 gezeigt, die Aminosäuresequenz des NPM/ALK Fusionsproteins
wird in 2a (Seq. ID.
No. 2) gezeigt, die Aminosäuresequenz
der NPM/ALK Fusionsverbindung wird in 2a (Seq.
ID. No. 7) gezeigt und die die NPM/ALK Fusionsverbindung kodierende
Nukleinsäuresequenz
wird in 3b (Seq. ID.
No. 4) gezeigt. Ein die ALK cDNA enthaltender Klon wurde gemäß den Bestimmungen
des Budapester Vertrags bei der ATCC unter der Bezeichnung ATCC
69497 hinterlegt.
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Durch
das Einfügen
irgendeiner erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
in einen geeigneten Vektor, kann ein Fachmann ohne weiteres große Mengen
der spezifischen Sequenz herstellen. Alternativ können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
in einen Expressionsvektor eingefügt werden, um die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz
herzustellen.
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Es
gibt zahlreiche verfügbare
Wirt/Vektor Systeme zur Propagation von Nukleinsäuresequenzen und/oder zur Herstellung
von exprimierten Proteinen. Diese beinhalten Plasmid- und virale-Vektoren und
prokaryotische und eukaryotische Wirte, wobei sie allerdings nicht
auf sie begrenzt sind. Ein Fachmann kann ohne weiteres irgendein
Wirt/Vektor System anpassen, das in der Lage ist heterologe DNA
zu propagieren oder zu exprimieren, um die erfindungsgemäßen Sequenzen
herzustellen oder zu exprimieren.
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In
Beispiel 1 stellt die vorliegende Erfindung einen Beweis bereit,
dass die die NPM/ALK Fusionssequenz enthaltende Nukleinsäuresequenzen
in Patienten mit t(2;5) Lymphomen vorliegen. Auf dieser Beobachtung
beruhend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für den Assay
auf die Anwesenheit von NPM/ALK Fusion enthaltender Nukleinsäuresequenzen
in der Probe und dadurch einen Assay für den Nachweis von t(2;5) Lymphomen
bereit.
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Ein
Beispiel der erfindungsgemäßen Assayverfahren
zur Verwendung beim Nachweis von NPM/ALK Fusionen beruhen auf der
bevorzugten Amplifizierung von Sequenzen in einer Probe, die die NPM/ALK
Fusionsprotein enthaltende Nukleinsäuresequenz kodiert.
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Im
Allgemeinen wird eine Amplifizierungsreaktion wie die Polymerase
Kettenreaktion (PCR) verwendet, um entweder die NPM/ALK Fusionsprotein kodierende
mRNA oder die genomische DNA zu amplifizieren, die die t(2;5) Translokation
beinhaltet.
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Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung unter Verwendung der Sequenzen
des identifizierten Fusionsgen-Verfahrens zur Identifizierung der Anwesenheit
einer Nukleinsäuresequenz
in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet, umfassend
die Schritte von:
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- In Kontaktbringen einer Probe mit zwei Primer zur Nukleinsäureamplifizierung,
wobei ein erster Primer zur Nukleinsäureamplifizierung, der in der
Lage ist an die NPM kodierende Nukleinsäuresequenz oder an eine dazu
komplementäre
Sequenz zu hybridisieren und einen zweiten Primer zur Nukleinsäureamplifizierung,
der in der Lage ist and die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz
oder eine dazu komplementäre Sequenz
zu hybridisieren;
- Amplifizieren der mit Primer versehenen Nukleinsäuresequenz
in der Probe; und
- Nachweis der Anwesenheit der amplifizierten Nukleinsäuresequenz
in der Probe, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet.
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Wie
hierin verwendet ist ein Amplifizierungsprimer irgendeine kurze
DNA Sequenz, die an eine Zielsequenz hybridisieren kann und die
Amplifizierung der Zielsequenz ermöglicht, falls sie mit den geeigneten
Reagenzien unter der geeigneten Bedingung inkubiert wird. Siehe
Beispielsweise Ausubel et al., Current Protocolls in Molecular Biology,
Wiley Press (1993). Die Amplifizierung erfordert die Verwendung
zweier Primer, die den zu amplifizierenden Bereich flankieren. Ein
Primer hybridisiert an die Zielsequenz, wohingegen der andere Primer
an eine zu der Zielsequenz komplementären Sequenz hybridisiert.
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In
der vorliegenden Erfindung stammt einer der Amplifizierungsprimer
von der Sequenz des NPM Gens wohingegen der zweite Primer von der
Sequenz des ALK Gens stammt. Irgendein Fragment der NPM oder ALK
Gensequenzen kann verwendet werden, um die geeigneten Amplifizierungsprimer gleicher
Länge wie
die gewählten
Fragmente der Sequenz zu erzeugen und in dem NPM/ALK Fusionsgen
vorliegen. In Beispiel 1, Seq. ID No. 5 und die reverskomplementäre Sequenz
von Seq. ID No. 6 wurden als Primer ausgewählt. Ein Fachmann wird ohne weiteres
erkennen, dass andere Fragmente der NPM und ALK Gene als Primer
verwendet werden können, um ähnliche
Ergebnisse zu erhalten.
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Die
zu amplifizierende Zielsequenz kann entweder die das NPM/ALK Fusionsprotein
kodierende mRNA oder die t(2;5) Translokation enthaltende genomische
DNA sein. Ein Fachmann kann ohne weiteres dem Stand der Technik
bekannte Techniken einsetzen, um eine das geeignete Zielmolekül enthaltende
Probe vorzubereiten.
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Wie
hierin verwendet ist ein Amplifizierungsprimer in der Lage an eine
Nukleinsäuresequenz
zu hybridisieren, falls der Primer in der Lage ist Wasserstoffbrücken mit
der Zielsequenz unter geeigneter Bedingung zu bilden. Im Allgemeinen
ist die bevorzugte Bedingung dadurch gekennzeichnet, dass es sich
um eine Bedingung hoher Stringenz handelt. Ein Fachmann kann ohne
weiteres die geeigneten Bedingungen bestimmen, wobei die folgenden
Verfahren anderweitig beschrieben sind (PCR Protocols, Cold Spring
HArbor Press (1991), Privitera et al., Blood 79:1781 (1992)).
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Wie
hierin verwendet bezieht sich Amplifizierung auf ein Verfahren zur
Erzeugung mehrfacher Kopien einer Zielsequenz. Verschiedene Verfahren und
Enzyme sind zum Erreichen dieses Ziels verfügbar. In der bevorzugten Ausführungsform
wird Taq-1 Polymerase bei dem als PCR bekannten Verfahren verwendet,
um die Zielsequenz (siehe Beispiel 1) zu amplifizieren. Allerdings
kann ein Fachmann die Taq-1 Polymerase durch andere Enzyme ersetzen, soweit
wie das Amplifizierungsziel erhalten wird.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich das Nachweisen der amplifizierten
Zielsequenz auf irgendein Verfahren, das eingesetzt werden kann,
um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz
einer gegebenen Größe oder
besonderer Sequenz zu bestimmen. In einer Anwendung wird das Amplifizierungsprodukt
einer Agarose- oder Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die
verschiedenen Größen der
Nukleinsäuren
aufzulösen,
die in der amplifizierten Probe vorliegen. Das resultierende Gel
kann anschließend
visuell unter Verwendung einer Nukleinsäure-Färbung, beispielsweise Ethidiumbromid,
analysiert werden, um zu bestimmen, ob ein Nukleinsäure-Molekül von geeigneter
Größe in der
amplifizierten Probe vorliegt.
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Alternativ
kann eine nachweisbar markierte Sonde verwendet werden, um zu bestimmen,
ob die Probe die amplifizierte Sequenz (siebe Beispiel 1) enthält. Eine
derartige Sonde kann gemäß der vorstehend
beschriebenen Elektrophorese verwendet werden, oder kann in einem
Dot-Blot oder in einem in situ Assay Verfahren verwendet werden.
Die Erzeugung einer auf dem NPM/ALK Fusionsproteins beruhenden Nachweissonde
wird nachstehend ausführlich
beschrieben.
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Zusätzlich zu
den Verfahren, die von der Amplifizierung einer Zielsequenz abhängig sind,
stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von
die NPM/ALK Fusionen enthaltenden Nukleinsäuren bereit, die keine Sequenzamplifizierung benötigen. Insbesondere
können
die bekannten Verfahren von Southern und Northern Blot Hybridisierung
verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Probe die NPM/ALK Nukleinsäure-Fusionssequenz beinhaltet
(Sambrook et al., Molecular Cloning ed. Spring Harbor Press (1989)).
Im Detail können
derartige Fusionen nachgewiesen werden durch:
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- Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäuresonden,
worin eine erst Nukleinsäuresonde
in der Lage ist an die Alk kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren
und eine zweite Nukleinsäuresonde in
der Lage ist an die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren;
und
- Nachweisen der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in der Probe, die
sowohl an die erste als auch die zweite Nukleinsäuresonde hybridisiert.
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Die
Nukleinsäuresequenzen
der vorliegenden Erfindungen beinhalten DNA genau so wie RNA Sonden,
wobei derartige Sonden unter Verwendung von dem Stand der Technik
bekannten Verfahren erzeugt werden (Sambrook et al., Molecular Cloning ed.
Spring Harbor Press (1989)). Ein Fachmann kann derartige bekannte
Techniken unter Verwendung der hierin beschriebenen Gensequenzen
oder Fragmente davon als Sonden einsetzen.
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In
einer anderen Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens
wird eine einzelne Nukleinsäuresonde,
im Gegensatz zu zwei getrennten Sonden, die den Fusionsbereich der
NPM/ALK Fusion umfasst, in dem Southern oder Northern Assay-System
eingesetzt.
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Eine
derartiges Verfahren umfasst insbesondere die Schritte von:
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- In Kontaktbringen einer Probe mit einer einzelnen Nukleinsäuresonde,
worin die Nukleinsäuresonde
in der Lage ist and die Fusionsverbindung des NPM/ALK Fusionsgens
zu hybridisieren; und
- Nachweisen der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen in der Probe,
die an die Nukleinsäuresonde hybridisiert.
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Alternativ
kann eine einzelne Sonde, die entweder auf der ALK, NPM oder NPM/ALK
Fusionssequenz beruht, entworfen werden. Eine derartige Sonde wird
zu einem Restriktionsenzymsfragment des NPM oder ALK korrespondieren,
dessen Größe aufgrund
der Umlagerung verändert
ist (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus,
RFLP Analyse).
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Irgendeines
dem Stand der Technik bekanntes Verfahren kann zum Markieren der
Sonden, die in vorstehenden Assay Verfahren verwendet wurden, genutzt
werden. In der zwei Sonden Ausführungsform
können
die erste und die zweite Sonde mit verschiedenen Radioisotopen,
Enzymen oder Chromophoren markiert werden. Bei Verwendung der verschien
markierten Sonden kann die DNA Sequenz identifiziert werden, die
eine oder beide Proben bindet. In einer anderen Anwendung können die
erste und die zweite Sonde auf eine derarte Weise markiert werden,
dass ein Signal hervorgerufen wird, falls die Sonden an das gleiche
Nukleinsäurefragment
hybridisieren. Ein derartiges Verfahren ist in U.S. Patent Nummer
4,820,630 beschrieben.
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In
einer Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird eine
der Nukleinsäuresonden
auf einem festen Träger
immobilisiert. Beispiel von derartigen festen Träger beinhalten, sind allerdings
nicht auf sie beschränkt,
Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie Agarose
und Sepharose und Acrylharze wie Polyacrylamid- und Latex-Körner. Techniken
zur Kopplung von Nukleinsäuresonden
an derartige feste Träger
sind im Stand der Technik gut bekannt.
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Die
Proben, die in den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren
verwendet werden, beinhalten, sind aber nicht auf sie beschränkt, Zellen
oder Gewebe, Protein, Membran, oder Nukleinsäure Extrakte der Zellen oder
Gewebe und biologische Fluide wie Blut, Serum und Plasma. Die in
dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendete Probe wird beruhend
auf dem Assayformat, Beschaffenheit des Nachweisverfahrens und den
Geweben, Zellen oder Extrakten, die als Probe verwendet werden,
variieren. Verfahren zur Herstellung von Proteinextrakten, Mebranextrakten
oder Nukleinsäureextrakten
von Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt und können ohne
weiters angepasst werden, um eine Probe zu erhalten, die auf das
genutzte Verfahren abgestimmt ist.
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Ein
bevorzugter Proben-Typ, der in der vorliegenden Erfindung genutzt
werden kann, stammt von isolierten Lymphomzellen. Solche Zellen
können zur
Herstellung eines geeigneten Extrakts verwendet werden, oder können bei
auf in situ Analyse beruhenden Verfahren verwendet werden. Ein Beispiel
einer in situ Analyse bezieht sich auf Fluoreszenz in situ Hybridisierung
(FISH) und wird detailliert in Beispiel 1 und von Selleri et al.
PNAS 88:887–891
(1991) und Tkachuk et al., Science 250:559–562 (1990) beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter Verfahren zum Nachweis von NPM/ALK
Fusionen bereit, die von der Fähigkeit
eines Antikörpers
abhängen
selektiv an ein spezifisches Antigen zu binden.
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In
einer Ausführungsform
wird ein NPM/ALK Fusionsprotein durch Verwendung eines Antikörpersets
nachgewiesen, wobei ein Set einen Antikörper umfasst, der in der Lage
ist an das NPM Protein zu binden und das andere Set einen Antikörper umfasst, der
in der Lage ist an das ALK Protein zu binden.
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Insbesondere
umfassen ein solches Verfahren die Schritte von:
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- In Kontaktbringen einer Probe mit zwei Antikörpern, wobei
ein erster Antikörper
in der Lage ist an NPM zu binden und ein zweiter Antikörper in
der Lage ist an ALK zu binden; und
- Nachweisen der Anwesenheit von Proteinen in der Probe, die sowohl
an den ersten als auch den zweiten Antikörper bindet.
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Die
in den vorstehenden Verfahren verwendeten Antikörper können monoklonale oder polyklonale
Antikörper,
genauso wie Fragmente dieser Antikörper sein. Im Allgemeinen sind
Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern im Stand der Technik
gut bekannt (Campbell, A.M., "Monoclonal Antibody
Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology." Elsevier
Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands (1984); St. Groth
et al., J. Immunol. Methods 35:1–21 (1980). Beispielsweise
kann ein Antikörper,
der in der Lage ist an das NPM oder ALK Protein zu binden, durch Immunsierung
eines Tiers mit einem Polypeptid erzeugt werden, dessen Sequenz
aus einem Bereich der NPM oder ALK Proteine erhalten wird, die in
dem NPM/ALK Fusionsprotein vorliegen.
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Irgendein
Tier (maus, Hase, etc.) von dem es bekannt ist, dass es Antikörper herstellt,
kann zur Herstellung von Antikörper
mit der gewünschten Spezifität genützt werden.
Verfahren zur Immunisierung sind im Stand der Technik gut bekannt.
Solche Verfahren beinhalten subkutane oder intraperitoneale Injektion
des Polypeptids. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Menge an für die Immunisierung verwendetem
Polypeptid beruhend auf dem zu immunisierenden Tier, der Antigenizität des gewählten Polypeptids
und der Injektionsstelle variieren wird. Das Polypeptid kann modifiziert
oder in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Peptid Antigenizität zu erhöhen. Verfahren
zur Erhöhung
der Antigenizität eines
Polypeptids sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Verfahren
beinhalten das Koppeln des Antigens mit einem heterologen Protein
(wie Globulin oder β-Galactosidase)
oder durch das Einbeziehen eines Adjuvans während der Immunisierung.
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Zur
Erzeugung monoklonaler Antikörper werden
Milzzellen von dem immunisierten Tier entfernt, mit Myelomazellen,
wie SP2/0-Ag14 Myelomazellen, fusioniert und es wird ihnen gestattet
zu monoklonale Antikörper
produzierenden Hybridomazellen zu werden.
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Irgendeine
der zahlreichen im Stand der Technik bekannten Verfahren kann zur
Identifizierung der Hybridomazelle verwendet werden, die einen Antikörper mit
den gewünschten
Eigenschaften herstellt. Diese beinhalten das Screening der Hybridomas
mit einem ELISA Assay, Western Blot Analyse oder Radioimmunoassay
(Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109–124 (1988)).
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Die
gewünschten
Antikörper
sekretierende Hybridomas werden kloniert und die Klasse und Unterklasse
wird durch Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren
bestimmt (Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers,
Amsterdam, The Netherlands (1984)).
-
Für polyklonale
Antikörper
wird ein Antisera enthaltender Antikörper von dem immunisierten
Tier isoliert und auf die Anwesenheit von Antikörpern mit der gewünschten
Spezifität
unter Verwendung eines der vorstehend beschriebenen Verfahrens gescreent.
-
Bedingungen
für die
Inkubation eines Antikörpers
mit einer Testprobe variieren. Inkubierungsbedinungen eines Antikörpers hängen von
dem für den
Assay verwendeten Format ab, der verwendeten Nachweisverfahren,
der Beschaffenheit der Testprobe und dem Typ und der Beschaffenheit
des in dem Assay verwendeten Antikörpers. Ein Fachmann wird erkennen,
dass irgendeines der üblich
verfügbaren immunologischen
Assayformate (wie Radioimmunoassays, Enzymverknüpfte Immunosorbentassays, auf
Diffusion basierendem Ouchterlony oder rocket Immunofluoreszenzassays)
ohne weiteres angepasst werden kann, um die erfindungsgemäßen Antikörper zu
verwenden. Beispiele für
solche Assays können
in Chard, T. " An
Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques" Elsevier Science Publishers,
Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G.R. et al., "Techniques in Immunocytochemistry, "Academic Press, Orlando,
FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., "Practice and Theory
of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology," Elsevier
Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985) gefunden werden.
-
In
einer Ausführungsform
des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird entweder der anti-NPM Antikörper oder
der anti-ALK Antikörper
auf einem festen Träger
immobilisiert. Beispiel von solchen festen Trägern beinhalten, sind allerdings
nicht auf sie beschränkt,
Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie Agarose
und Sepharose und Acrylharze wie Polyacrylamid- und Latex-Körner. Techniken
zur Kopplung von Antikörpern
an derartige feste Träger
sind im Stand der Technik gut bekannt (Weir, D.M. et al., "Handbook of Experimental
Immunology" eth
Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter
10 (1986), Jacoby, W.D. at al., Meth. Enzym. 34 Academic Press,
N.Y. (1974).
-
Zusätzlich können einer
oder mehrere der in den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendeten
Antikörper
vor der Verwendung nachweisbar markiert werden. Antikörper können durch
die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarker (wie Biotin, Avidin,
etc.), enzymatischer Marker (wie Meerrettich Peroxidase, alkalischer
Phosphatase, etc.), fluoreszierender Marker (wie FITC oder Rhodamin, etc.),
paramagnetischen Atomen, etc. nachweisbar markiert werden. Verfahren
zur Durchführung
einer derartigen Markierung sind im Stand der Technik gut bekannt,
siehe beispielsweise Starnberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem.
18:315 (1970), Bayer, E.A. et al., Meth. EEnzym. 62:308 (1979),
Engval, E. et al., immunol. 109:129 (1972), Goding, J. W., J. Immunol.
Meth. 13:215 (1976).
-
In
einem anderen Beispiel der vorstehenden Verfahren werden die Antikörper derart
markiert, dass ein Signal hervorgerufen wird, falls die beiden Antikörper an
das gleiche Molekül
binden. Ein solches System wird in U.S. Patent Nummer 4,663,278 beschrieben.
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In
einer anderen Ausführungsform
eines auf Antikörper
beruhendem Nachweissystems, wird ein einzelner Antikörper eingesetzt,
der in der Lage ist an ein Epitop zu binden, das an der Fusionsverbindung des
NPM/ALK Fusionsproteins vorliegt, das allerdings nicht in den Nicht-Fusion NPM oder ALK
Proteinen vorliegt. Die Fusionsverbindung des NPM/ALK Fusionsproteins
wird in 3b beschrieben.
Ein Fachmann kann ohne weiteres die Aminosäuresequenz der Fusionsverbindung
einsetzen, um Peptidantigene zur Verwendung bei den vorstehend beschriebenen
Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern zu erzeugen, Die in den
vorstehend beschriebenen Assayverfahren verwendeten Werkstoffe (sowohl
auf Nukleinsäure
als auch auf Protein beruhend) sind für die Herstellung eines Kits
ideal geeignet. Beispielswiese stellt die Erdfindung für die auf Amplifizierung
beruhenden Nachweissysteme einen Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme
von einem oder mehreren Behältern
in strenger Eingrenzung, bereit welcher umfasst:
-
- (a) einen ersten Behälter, welcher einen oder mehrere
erfindungsgemäße Amplifikationsprimer umfasst;
und
- (b) einen oder mehrere andere Behälter, welche eines oder mehreres
des Nachstehenden umfassen: ein Probenreservoir, Amplifikationsreagenzien,
Waschreagenzien und Nachweisreagenzien.
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Für auf Antikörper beruhenden
Nachweissysteme, stellt die vorliegende Erfindung einen Kit mit Unterteilungen
zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung,
bereit welcher umfasst:
-
- (a) einen ersten Behälter, welcher einen Antikörper umfasst,
der in der Lage ist an NPM zu binden;
- (b) einen zweiten Behälter,
welcher einen Antikörper
umfasst, der in der Lage ist an ALK zu binden; und
- (c) einen oder mehrere Behälter,
welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagens
und Reagenzien, welche die Anwesenheit von gebundenem Antikörper von
dem ersten und zweiten Behälter
nachweisen können.
-
Die
Erfindung stellt weiter einen Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme
von einem oder mehreren Behältern
in strenger Eingrenzung bereit, welcher umfasst:
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- (a) Einen ersten Behälter, der einen Antikörper umfasst
der in der Lage ist an ein Epitop zu binden, das in der Fusionsbindung
des NPM/ALK Fusionsproteins vorliegt und das in keinem der zwei nicht-Fusionsproteine
vorliegt; und
- (b) einen oder mehrere andere Behälter, welche eines oder mehreres
des Nachstehenden umfassen: Waschreagens und Reagenzien, welche
die Anwesenheit von gebundenem Antikörper von dem ersten Behälter nachweisen
können.
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Im
Detail beinhaltet ein Kit mit Unterteilungen irgendeinen Kit in
dem Reagenzien in verschiedenen Behältern enthalten sind. Solche
Behälter
beinhalten kleine Glasbehälter,
Kunststoffbehälter
oder Kunststoff- oder Papier-Streifen. Solche Behälter gestatten es
effizient Reagenzien von einer Untereilung in eine andere Unterteilung
derart zu übertragen,
dass die Proben und Reagenzien nicht kreuz-kontaminiert werden und
dass die die Agenzien oder Lösungen
jeden Behälters
auf eine quantitative Art von einem Behälter in einen anderen hinzugefügt werden
können. Solche
Behälter
werden einen Behälter
beinhalten, der die Testprobe aufnimmt, einen Behälter der
die in dem Assay verwendeten Antikörper oder Sonden enthält, Waschreagenzien
(wie Phosphat gepufferte Salzlösung,
Tris-Puffer, etc.) enthaltende Behälter und Behälter, die
die Reagenzien enthalten, die verwendet werden, um den gebundenen
Antikörper
oder die hybridisierte Sonde nachzuweisen.
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Für Nukleinsäuresonden
beinhalten Beispiele der Nachweisreagenzien, sind allerdings nicht
auf radioaktivmarkierte Sonden beschränkt, enzymatisch markierte
Sonden (wie Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase) und
affinitätsmarkierte
Sonden (Biotin, Avidin oder Streptavidin). Für Antikörper beinhalten Beispiele der
Nachweisreagenzien, sind allerdings nicht auf sie beschränkt, markierte
sekundäre
Antikörper,
oder alternativ falls der erste Antikörper markiert ist, die chromophoren,
enzymatischen oder Antikörper
bindenden Reagenzien, die in der Lage sind mit dem markierten Antikörper zu
reagieren. Ein Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass die Antikörper- und
Nukleinsäuresonden,
die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, ohne weiteres in
eines der etablierten Kit-Formate aufgenommen werden kann, die im
Stand der Technik gut bekannt sind.
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet weiter Verfahren zum selektiven
Abtöten
von Zellen, die das NPM/ALK Fusionsprotein exprimieren. Eine solches Verfahren
umfasst im Detail Das Inkontaktbringen einer das NPM/ALK Fusionsprotein
exprimierenden Zelle mit einem Toxin dervatisierten Antikörper, worin der
Antikörper
in der Lage ist an das Fusionsprotein zu binden allerdings nicht
in der Lage ist an das Nicht-fusions- NPM oder ALK Protein zu binden.
Beispiele solcher Antikörper
sind Toxin derivatisierte Antikörper,
die an die Fusionsverbindung der Seq. ID No. 2 binden.
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Wie
hierin verwendet ist ein Antikörper "Toxin derviatisiert", falls der Antikörper kovalent
an einen Toxin-Anteil gebunden ist. Verfahren zur Kopplung von solchen
Anteilen an ein Molekül
sind im Stand der Technik gut bekannt.
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Das
Binden eines Toxin derivatisierten Antikörpers an eine Zelle bringt
den Toxin-Anteil in nächste
Nähe Zelle
und fördert
dadurch den Zelltot. Durch Bereitstellen eines solchen Antikörpermoleküls für ein Säugetier,
kann die das Fusionsprotein exprimierende Zelle bevorzugt abgetötet werden.
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Irgendein
geeigneter Toxin-Anteil kann eingesetzt werden, allerdings werden
bevorzugt solche Toxine eingesetzt wie beispielsweise das Ricin
Toxin, das Cholera Toxin, das Diphterie Toxin, radioistopische Toxine,
oder Membrankanal-ausbildende Toxine.
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Die
erfindungsgemäßen Antikörper können einem
Säugetier
intravenös,
intramuskulär,
subkutan, enteral, lokalisiert oder parenteral verabreicht werden.
Falls die Antikörper
durch Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung durch
kontinuierliche Injektionen, oder durch einfache oder mehrfache
Injektionen erfolgen.
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Es
ist beabsichtigt die erfindungsgemäßen Antikörper dem Empfänger-Säugetier
in einer "pharmazeutisch
akzeptablen Form" in
einer ausreichenden Menge um "therapeutisch
wirksam" zu sein
bereit zu stellen. Eine Menge ist therapeutisch wirksam, falls die
Dosierung, der Verabreichungs-Weg, etc. des Agens ausreichend sind,
um bevorzugt einen Anteil der das NPM/ALK Fusionsprotein exprimierenden Zellen
abzutöten.
Ein Antikörper
ist in "pharmazeutisch
wirksamer Form",
falls seine Verabreichung durch einen Empfänger-Patienten vertragen wird. Die
erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß den Verfahren
zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher
Verbindungen formuliert werden, wobei diese Werkstoffe oder ihre
funktionellen Derivative mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel kombiniert
werden. Geeignet Vehikel und ihre Formulierung , einschließlich anderer
menschlichen Proteine , beispielsweise menschliches Serum-Albumin werden
beispielsweise in Remington's
Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A.,Ed., Mack, Easton PA
(1980)) beschrieben. Um eine pharmazeutisch akzeptable Verbindung
zu bilden, die zur wirksamen Verabreichung geeignet ist, werden
solche Verbindungen eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers zusammen
mit einer geeigneten Menge an Träger
enthalten. Zusätzlich
zu den Trägern
können
die erfindungsgemäßen Antikörper in humanisierter
Form zur Verfügung
gestellt werden.
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Humanisierte
Antikörper
können
beispielsweise durch Ersetzen eines immunogenen Anteils eines Antikörpers durch
einen korrespondierenden, allerdings nicht-immunogenen Anteil hergestellt
werden (beispielsweise chimäre
Antikörper)
(Robinson, R.R. et al., Internationales Patent PCT/US86/02269; Akira,
K. et al., Europäische
Patent Anmeldung 184,187; Taniguchi, M., Europäische Patent Anmeldung 171,496;
Morrison, S.L. et al., Europäische
Patent Anmeldung 173,494; Neuberger, M.S. et al., PCT Anmeldung
WO 86/01533; Cabilly, S. et al., Europäische Patent Anmeldung 125,023;
Better, M. et al., Science 240:1041–1043 (1988); Liu, A.Y. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439–3443 (1987); Liu, A.Y. et
al., J. Immunol. 139:3521–3526
(1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218 (1987); Nishimura,
Y. et al., Canc. Res. 47:999–1005
(1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446–449 (1985)); Shaw et al.,
J. Natl. Cancer Inst. 80:1553–1559 (1988).
-
Beim
Bereitstellen eines Toxin dervatisierten Antikörpers für einen Patienten wird die
Dosierung des Verabreichungs-Agens in Abhängigkeit von solchen Faktoren
wie dem Alter des Patienten, Gewicht, Größe, Geschlecht, generelle medizinische
Verfassung, seitheriger medizinischer Verlauf, etc. variieren. Im
Allgemeinen ist es wünschenswert
den Empfänger
mit einer Dosierung des Antikörpers
bereitzustellen, die in dem Bereich von ungefähr 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht
des Patienten) liegt, obgleich eine geringere oder höhere Dosierung
verabreicht werden kann.
-
In
einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden Verfahren zur Modulierung der Translation der RNA bereit
gestellt, die das NPM/ALK Fusionsprotein in der Zelle kodiert. Insbesondere umfassen
solche Verfahren das Einbringen einer DNA Sequenz, die in der Lage
ist RNA zu transkribieren die komplementär zu der das NPM/ALK Fusionsprotein
kodierenden mRNA ist, in eine Zelle. Durch das Einbringen einer
solchen DNA Sequenz in eine Zelle wird antisense RNA hergestellt,
die hybridisieren und die Translation des NPM/ALK Fusionsproteins
blockieren wird. Antisense Klonierung wurde anderweitig detaillierter
beschrieben durch Methis et al., Blood 82:1395–1401 (1993); Stein et al.,
Science 261:1004–1012
(1993); Mirabella et al., Anti-Cancer Drug Design 6:647–661 (1991);
Rosenberg et al., Nature 313:703–706 (1985), Preiss et al.,
Nature 313:27–32(1985),
Melton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:144–148 (1985) und Kim et al.,
Cell 42:129–139 (1985).
-
Transkription
der eingebrachten DNA wird zu vielfachen Kopien der erzeugten antisense
RNA führen.
Durch Kontrolle des Transkriptionshöhe der antisense RNA und der
Gewebe-Spezifität der Expression
durch Promotor-Auswahl oder Gen-Targeting der antisense Expressionssequenz
kann ein Fachmann die Translationshöhe des NPM/ALK Fusionsproteins in
spezifischen Zellen in einem Patienten einstellen.
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Die
Expressionshöhe
des NPM/ALK Fusionsproteins kann ebenso durch die Verwendung von Ribozym-Technologie
gesteuert werden (sie beispielsweise Shore et al., Oncogen 8:3183-3188 (1993); Sarver
et al., Science 247:1222–1225
(1990); und Cech, T., JAMA 260:303–3034 (1988). Im Detail können unter
Verwendung bekannter Verfahren für die
NPM/ALK Fusions-mRNA
spezifische Ribozyme erzeugt werden und entweder für ein Zelle
bereitgestellt werden oder in ihr exprimiert werden. Das Bereitstellen
oder die Expression des Ribozyms führt zur Spaltung der die NPM/ALK
Fusion kodierenden mRNA.
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In
einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden Verfahren für
identifizierende Agenzien bereitgestellt, die in der Lage sind an
das hierin beschriebene NPM/ALK Fusionsprotein zu binden.
-
Im
Detail umfassen derartige Verfahren:
-
- (a) In Kontaktbringen eines Agens mit dem NPM/ALK
Fusionsprotein, oder einem Fragment davon; und
- (b) Bestimmen, ob das Agens an das Fusionsprotein bindet.
-
Bei
der Verwendung dieses Verfahrens kann ein Agens identifiziert werden,
das zur Anpassung der Aktivität
des NPM/ALK Fusionsproteins verwendet werden kann.
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In
einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden Verfahren für
identifizierende Agenzien bereitgestellt, die in der Lage sind an
die hierin beschriebene ALK Fusion zu binden.
-
Im
Detail umfassen derartige Verfahren:
-
- (a) In Kontaktbringen eines Agens mit dem ALK Protein,
oder einem Fragment davon; und
- (b) Bestimmen, ob das Agens an das ALK Protein bindet.
-
Bei
der Verwendung dieses Verfahrens kann ein Agens identifiziert werden,
das zur Anpassung der Aktivität
des ALK Proteins verwendet werden kann.
-
Es
gibt viele Variationen der vorstehenden Assays, die von einem Fachmann
ohne Notwendigkeit zum übertriebenen
Experimentieren verwendet werden können, um Agonisten, Antagonisten
und Liganden von ALK zu isolieren. Beispielsweise kann ein Antikörper zur
Kopräzipitation
des ALK gebundenen Agens verwendet werden, um bei der Aufreinigung
und Identifizierung zu unterstützen.
Zusätzlich kann
das ALK Protein, oder ein das aktive Zentrum enthaltendes Fragment
verwendet werden, um eine Expressionsbibliothek auf Gene zu screenen,
die ALK bindende Proteine kodieren. Weiterhin können Zellen, die ALK auf ihrer
Oberfläche
exprimieren, als eine Alternative zur Verwendung von isoliertem
ALK Protein verwendet werden.
-
Die
Agenzien zum Screening in dem vorstehenden Assay können Peptide,
Carbohydrate, oder Vitaminderivate sein, sind allerdings nicht darauf
beschränkt.
Die Agenzien können
unter Verwendung von Protein-Modelling-Techniken zufällig ausgewählt oder
gescreent, oder rational ausgewählt
oder konstruiert werden. Für
das Zufalls-Screening werden Agenzien wie Peptide oder Carbohydrate
zufällig ausgewählt und
ein Assay auf ihre Fähigkeit
an das pseudogene Peptid zu binden wird durchgeführt. Alternativ können Agenzien
rational ausgewählt
oder konstruiert werden. Wie hierin verwendet ist ein Agens "rational ausgewählt oder
konstruiert", falls das
Agens beruhend auf der Konfiguration des pseudogenen Peptids ausgewählt ist.
Beispielsweise kann ein Fachmann ohne weiteres momentan verfügbare Verfahren
zum Erzeugen von Peptiden anpassen, die in der Lage sind an eine
spezifische Peptidsequenz zu binden, um rational konstruierte Antipeptid
Peptide zu erzeugen, siehe beispielsweise Hurby et al., Application
of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", in Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman,
NY, pp. 289–307
(1992), und Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230–8 (1989).
-
Unter
Verwendung des vorstehenden Verfahrens stellt die vorliegende Erfindung
Agenzien bereit, die in der Lage sind an das NPM/ALK Fusionsprotein
zu binden, hergestellt durch die Schritte von:
-
- (a) In Kontaktbringen des Agens mit dem NPM/ALK
Fusionsprotein, oder einem Fragment davon; und
- (b) Bestimmen, ob das Agens an das NPM/ALK Fusionsprotein bindet.
- Unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens stellt die vorliegende
Erfindung Agenzien bereit, die in der Lage sind an das ALK Protein
zu binden, hergestellt durch die Schritte von:
- (c) In Kontaktbringen des Agens mit dem ALK Protein, oder einem
Fragment davon; und
- (d) Bestimmen, ob das Agens an das ALK Protein bindet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Erzeugen von
transgenen Tieren bereit, die die NPM/ALK Genfusion und/oder das
Alk Gen enthalten. Derartige Tiere sind als Tiermodelle für menschliche
t(2;5) Lymphome und zum Studieren der ALK-Funktion und Aktivität nützlich.
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Im
Allgemeinen sind Verfahren zum Erzeugen von transgenen Tieren im
Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Grosveld et
al., Transgenic Animals, Academic Press Ltd., San Diego, Ca (1992)).
Unter Verwendung der hierin für
die NPM/ALK Fusion oder das ALK Protein bekannt gegebenen Sequenzen
kann ein Fachmann ohne weiteres ein transgenes Tier erzeugen, das
das NPM/ALK Fusionsprotein und/oder das ALK Protein enthält und exprimiert.
Transgene Tiere (wie Mäuse und
Schweine), die die NPM/ALK Fusion exprimieren, können als Tiermodell für das menschliche
t(2;5) Lymphom verwendet werden. Transgene Tiere, die das ALK Protein
exprimieren, sind für
das Studieren der ALK-Funktion und Aktivität nützlich.
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Zusätzlich zu
transgenen nicht-menschlichen Säugetieren,
die geändert
wurden, um das menschliche ALK Gen oder das NPM/ALK Fusionsgen zu
enthalten, stellt die vorliegende Erfindung weiterhin nicht-menschliche
transgene Säugetiere
bereit, die geändert
wurden, um die Expression des gewöhnlichen nicht-menschlichen
Homologen des ALK Gens auszuschalten (knock-out). Insbesondere unter Verwendung
von anderweitig beschriebenen Verfahren des Gen-Targeting kann ein Fachmann das erfindungsgemäße ALK Gen
einsetzen, um ein homologes Gen in einem nicht-menschlichen Säugetier
zu inaktivieren (auszuschalten) (Mansour et al., Nature 336:348–352 (1988)).
Das "Ausschalt-" Verfahren wurde
erfolgreich bei vielen Säugetier-Systemen eingesetzt,
siehe beispielsweise Lui et al., Cell 75:59–72 (1993). Aufgrund des hohen
Konservierungsgrads des ALK Gens, kann die menschliche ALK Sequenz in
nicht-menschlichen Säugetieren
bei den gewöhnlichen
Ausschalt-Verfahren eingesetzt werden.
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Durch
das Allgemeine Beschreiben in der Erfindung werden die Agenzien
und Verfahren für
deren Erhalt ohne weiteres unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele
verstanden werden, die mittels Veranschaulichung bereit gestellt
werden, wobei sie nicht beschränkend
auf die vorliegende Erfindung sind, es sei denn es wurde spezifiziert.
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Um
durch t(2;5) umgelagerte Gene zu klonieren, wurde eine positionelle
(positional) Strategie gewählt,
die auf Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) beruht, um die
Reihenfolge von bereichsmäßig abgeleiteten
Cosmid-Klonen festzulegen. (Im Gegensatz zu der zu der Mehrheit
von Leukämie-
und Lymphom-verbundenen chromosomalen Translokationen, die auf molekularer
Ebene charakterisiert wurden, beinhaltet die t (2;5) nicht Immunoglobulin
oder T-Zellen Rezeptorgene,
noch andere klonierte Gene, die vorherig an den Bruchpunkt-Bereichen
lokalisiert wurden. Um dadurch den Bruchpunkt auf Chromosom 5 zu
identifizieren, wurden mikropräparierte
Klone aus den Banden 5q34–q35
isoliert und verwendet, um 39 Cosmidklone zu identifizieren (D.
Salman et al., Nucleic Acids Res. 20:1401 (1992)), die anschließend relativ
zu dem Bruchpunkt durch FISH Analyse der metaphasen Chromosomen
der SUP-M2 und SU-DHL-1
t(2;5)-positiven Zelllinien [R. Morgan et al., Blood 73:2155 (1989]
orientiert waren. Siebzehn Klone wurden in Bezug auf den Bruchpunkt
centromer und 22 Klone wurden telomer kartografiert, wobei Klone
dieser Gruppen durch Zweifarben Metaphasen FISH Analyse relativ
zu einem anderen orientiert wurden. FISH wurde wie vorstehend beschrieben
durchgeführt
[S. Morris et al., Blood 78:2013 (1991); D. Saltman et al., Genomics
16:726 (1993)]. Der geschätzte
genomische Abstand zwischen den zwei Cosmiden, die den Bruchpunkt
am nächsten
flankierten, bezeichnet als cos47C12 (centromer) und cos191E7 (telomer),
betrug 280 kb durch interphasen FISH Analyse [J. Lawrence et al.,
Science 249:928 (1990); B. Trask et al., Am. J. Hum. Genet. 48:1
(1991)] in Zellen, die ein gewöhnliches
Chromosom 5 beinhalten. Ungeachtet ihrer Nähre zu dem Chromosom 5 Bruchpunkt
wiesen Sonden, die aus diesen Cosmiden hergestellt wurden, keine
angeordneten Restriktionsfragmente durch Southern-Blot Analyse oder
Pulsfeld Gelen nach, die aus DNA von t(2;5)-enthaltenden Zelllinien
hergestellt wurden.
-
Bidirektionelle
Chromosomen-Läufe
(chromosome walks) wurde mit Cosmiden durchgeführt, ungefähr 290 kb entfernt, die den
Bruchpunkt auf Chromsom 5 flankierten, wobei jeder Lauf einen Bereich
von 150 kb umfasste. Unter Verwendung von Genom-Sonden von 70 kb
des isolierten Telomer-Cosmids, wurden angeordnete Restriktionsfragment
in DNAs von zwei die t(2;5) enthaltende Zelllinien nachgewiesen
(1A). (Ungefähr 70 kB
in Bezug auf den Bruchpunkt von dem telomer flankierenden Klon,
wurden Chromosom 5-spezifische Sonden (p16–3/1.2S) und p21–3/3E) isoliert,
die angeordnete Fragmente mit mehreren Enzymen bei der Southernblot
Analyse von DNAs der t(2;5)-positiven Zelllinien identifizierten.
Das Genom-Fragment
p16–3/1.2S
ist unmittelbar centromer an den Chromosom 5 Bruchpunkt lokalisiert,
wobei p21–3/3E
genau telomer an dem Bruch liegt. Beide Sonden identifizierten ein
1,6 kb Transkript bei der Northern Analyse von RNAs aus t(2;5)-positiven
und negativen Zelllinien; zusätzlich hybridisierte
p163/1.2S an ein 2,4 kb Transkript, das ausschließlich in
t(2;5)-positiven RNAs gefunden wurde.)
-
Eine
der Sonden (p21–3/3E)
wurde an eine cDNA Bibliothek hybridisiert, die aus der polyadenylierten
RNA der UOC-B1 pro-B Leukämie-Zelllinie hergestellt
wurde, die kein t(2;5) aufweist. Mehrere cDNA Klone wurden isoliert,
die an eine ubiquitär
exprimierte 1,6 kb mRNA hybrisierten, die durch Sequenz-Analyse
als Nucleophosmin kodieren vorhergesagt wurde (NPM; ebenfalls als
B23 oder Numatrin bekannt) – ein
hoch konserviertes nucleolares Phosphoprotein, das ribosomale Komponenten
zwischen dem Nucleus und dem Cytoplasma bei den späteren Stufen
der Ribosomen-Anlagerung transportiert (shuttle) (W.Y. Chan et al.,
Biochemistry 28:1033 (1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989)).
Das Sondieren von RNAs aus Zelllinien ohne t(2;5) unter Verwendung
eines Subklones des 5' Endes
der NPM cDNA identifizierte sowohl ein gewöhnliches NPM Transkript als
auch ein 2,4 kB Transkript, das auf t(2;5)-positive Zelllinien beschränkt ist
(1B, oben). Ein 3' nicht-translatierte
Sequenzen enthaltender Subklon wies ausschließlich die gewöhnliche
1,6 NPM Transkript nach (nicht gezeigt).
-
Durch
das Screening einer cDNA Bibliothek, die aus der mRNA der SU-DHL-1
t(2;5)-enthaltenden Ziellinie
hergestellt wurde, wurden über
20 Klone isoliert, die an 5' allerdings
nicht an 3' NPM
Sonden hybridisierten. Sequenzen der 5' Enden der drei längsten Klone waren zu 5' NPM cDNA Sequenzen
identisch, waren allerdings nach dem Codon für Val117 unterschiedlich.
NPM Sequenzen 3' dieses
Codons wurden durch 1223 Nukleotide ersetzt, was zu einem offenen
Leseraster von 1575 Nukleotiden führte (2A). Eine Sonde aus dem 3' Ende der Fusions cDNA
(pS1.2) identifizierte das gleiche 2,4 kb Transkript, das mit der
5' Sonde in RNAs
von t(2;5)-positiven Zellen nachgewiesen wurde (1B, unten). Dieses Fragment war an die
Bande p23 des Chromosoms 2 lokalisiert durch Hybridisierung an DNAs menschlicher
x rodent somatischer Zellhybride und durch metaphasen FISH Analyse
(nicht gezeigt) und zeigte an, dass die 2,4 kb RNA durch ein fusioniertes Gen
kodiert wird, das durch t(2;5) erzeugt wurde.
-
Der
3' Anteil der chimären t(2;5)
cDNA kodiert für
die katalytische Domäne
von Mitgliedern der Protein-Tyrosinkinase (PTK) Genfamilie charakteristische
konservierte Reste (S.K. Hanks et al., Science 241:42 (1988); S.S.
Taylor, et al., Annu. Rev. Cell Biol. 8:429 (1992)). (2, A und C).
Der Vergleich dieser neu identifizierten anaplastischen Loymphomkinase
(ALK) (NPM und ALK bezeichnen gebilligte HMG Gen-Symbole. (P. McAlpine,
persönliche
Mitteilung)) mit bekannten PTK Familienmitgliedern zeigte höchste Homologie
zu Mitgliedern der Insulin Rezeptorkinase Subfamilie, beinhaltend
die Leukozyten Tyrosinkinase (LTK; 64% Aminosäure Identität), TRKA (38%), ROS (37%) und
seinem Drosophila Homologen Sevenless (35%), der β-Kette des
Insulinrezeptors (IR; 36%) (J.J. Krolewski et al., EMBO J. 10:2911 (1991);
H. Toyoshima et al., Nature 319:743 (1986); H. Matsushime et al.,
Mol. Cell. Biol. 6:3000 (1986); J.M. Chen et al., Oncogene. 6:257
(1991); K. Basler et al., Cell 54:299 (1988); D.D. Bowtell et al.,
Genes and Development 2:620 (1988); A. Ullrich et al., EMBO J. 5:2503
(1986); A. Ullrich et al., Nature 313:756 (1985); Y. Ebina et al.,
Cell 40:747 (1985)).
-
Die
Struktur von gewöhnlichen
ALK Proteinen wurde durch das Screening einer aus einer Rhabdomyosarom
Zelllinie (Rh30) hergestellten cDNA Bibliothek unter Verwendung
der pS1.2 ALK Sonde bestimmt. Analyse der Insertionen der zwei größten Klone,
pRMS4 und pRMS17–2,
zeigte 3' ALK Sequenzen
identisch zu denen in der Fusionsgen cDNA und zeigte, dass keine
Mutationen in dem Chimären
Protein stattgefunden hatten. Sequenzen des ALK unmmittelbar aufwärts der
NPM-ALK Verbindung kodierten 23 hydrophobe für eine Transmembrandomäne typische
Aminosäuren
(2B), während diejenigen
der äußersten
5' Enden der ALK Klone
zu 50% zu Sequenzen identisch waren, die Insulin-ähnliches-Wachstumsfaktor-Bindeprotein-1
kodieren (IBP-1) (IBP-1 ist ein 30 kDa sekretiertes Protein, das
in menschlichem Plasma und in Fruchtwasser gefunden wird und das
Insulin-ähnlichen-Wachstumsfaktor-1
(IGF1) mit höherer
Affinität
bindet [A. Brinkman et al., EMBO J. 7:2417 (1988); Y.L. Lee et al.,
Mol. Endocrinol. 2:404 (1988); M. Julkunen et al., FEBS Lett. 236:295
(1988)]). Diese Vergleiche zeigen, dass das gewöhnliche ALK Produkt ein membranumfassender
Tyrosinkinase-Rezeptor ist. Insbesondere sind das Transmembran-Segment
und die wahrscheinliche extrazelluläre Ligand-Binde-Domäne nicht in dem NPM-ALK Chimär-Protein
enthalten.
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ALK
mRNAs von 6,5 kb und 8,0 kb wurden ohne weiteres in kleinen intestinalen
und Rhabdomyosarcom Zelllinien identifiziert und wurden schwach in
Gehirn (fötal
und adult), Grimmdarm und Prostata (1, B [unten] und C) exprimiert.
Reichliche Mengen von 4,4 kb und 6,0 kb mRNAs wurden im Testikel nachgewiesen,
während
Plazenta und fötale
Leber jeweils ein einzelnes 6.0 kb Transkript exprimierten. Alle
vier mRNAs wurden ebenso mit einer Sonde nachgewiesen, die ausschließlich 3' nicht-translatierte
mRNAs enthielt, und daher darauf schließen lässt, dass sie unterschiedlich
gesplicte ALK mRNAs darstellt und nicht Kreuz-Hybridisierte Transkripte von anderen
PTK Genen. ALK Transkripte wurden nicht in gewöhnlicher Milz, Thymus, peripherem
Blut, Leukozyten, B-lymphoblastoiden Zelllinien, Phytohämagglutin-stimulierten
oder t(2;5)-negativen Leukämie/Lymphom
Zelllinien von Myeloider oder T-Lymphoider Abstammung nachgewiesen,
was darauf schließen
lässt,
dass sie in hämatopoietischen
Zellen nicht gewöhnlich
exprimiert werden.
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FISH
Kartografierung zeigte, dass NPM und ALK in centromerer oder telomerer
Orientierung auf jeweils den Chromsomen 5 und 2 mit dem aus dem abgeleitetem
5 translokierten Chromosom erzeugten 2,4 kb Fusionstranskript transkribiert
werden. Northern Blot Analyse erbrachte keinen Hinweis auf die Expression
eines reziproken ALK-NPM Chimär-Transkripts, das
aus dem abgeleiteten 2 Chromosom hätte erzeugt werden können.
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Eine
auf RNA beruhende Polymerase-Kettenreaktions-(RNA-PCR) Verfahren
bestätigte
die Spezifität
der Fusionsverbindung in chimären
Transkripten, die in t(2;5) aufnehmenden Lymphomen exprimiert wurden
(3, A und B)
(RNA-PCR wurde wie vorstehend beschrieben in E. Privitera et al., Blood
79:1781 (1992) durchgeführt.
Reaktionen wurden gleichzeitig mit für das chimäre NPM-ALK Transkript (siehe 3B) spezifischen Oligonukleotidprimern
und mit einem Primerpaar durchgeführt, das aus dem ubiquitär exprimierten
NPM Gen als Kontrolle für
die Reverse Transkription und Amplifikation stammte. Ein 3' NPM Primer (5'-GCTACCACCTCC AGGGGCAGA-3' (Seq. ID No. 8))
wurde mit dem in 3B gezeigten
NPM Primer für
die Kontroll-Amplifikationen verwendet; wobei das 185 bp NPM Produkt
durch Hybridisierung mit einem endmarkiertem Oligonukleotid nachgewiesen
wurde, das homolog zu gewöhnlichen
NPM Sequenzen aus dem Bereich ist in dem sich die Fusionsverbindung
ereignet (5'-AGCACTTAGTAGCTGTGGAGGAAG-3' (Seq. ID No. 9)).
NPM-ALK Fusion RNA-PCR Produkte wurden mit einem endmarkiertem Oligonukleotid
nachgewiesen, das die Fusionsverbindung umfasst (5'-AGCACTTAGTAGTGTACCGCCGGA-3') (Seq. ID No. 10).
Stringente nach-Hybridisierungs-Waschschritte wurden bei 62°C in 2×SSC/0.1%
SDS für
sowohl die NPM-ALK als auch die NPM Nachweis-Oligonukleotide durchgeführt.
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Umgekehrt
wurden Fusions-Transkripte nicht in Zelllinien ohne das t(2;5) nachgewiesen,
die verschiedene Rhabdomyosarcoma Linien enthielten, die ALK Transkripte
exprimierten. NPM-ALK Verbindungssequenzen wurden in RNAs von allen
sieben t(2;5)-positiven Proben gefunden, die die SU-DHL-1, SUP-M2
und UCONN-L2 Zelllinien und diagnostische Proben von vier Patienten
mit anaplastischen Großzell-Lymphomen
beinhalteten (Die Patientenproben (drei Lymphknotenbiopsien, eine
pleurale Effusion) zeigten jeweils durch zytogenetische Analyse,
das sie Lymphomzellen mit dem t(2;5) enthielten. Die Sequenz der
RNA-PCR Produkte von Zellen der Patienten 2 und 4 wurde bestimmt
und herausgefunden, dass sie identisch zu der aus der SU_DHL-1 Zelllinie
erhaltenen cDNA Sequenz ist (3B).
Eine schriftliche Bestätigung über die
Information wurde von den Patienten oder ihren Eltern erhalten und
die Untersuchungen wurden durch das klinische-Studien Review-Komitee
des St. Jude Children's
Research Hospital genehmigt).
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Es
scheint, dass die Bruchpunkte der 2;5 Translokation daher konsistent
die gleichen Introns der NPM und ALK Gene beinhalten, was zu identischen
Verbindungen in gesplicten mRNAs führt, die aus dem Fusionsgen
entstanden sind. Aufgrund der Schwierigkeiten bei der zytogenen
Analyse der Lymphom-Biopsieproben sollte der molekulare Nachweis der
NPM-ALK Fusion mRNAs durch RNA-PCR die Identifizierung dieser Tumore
bedeutend verbessern.
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Die
Häufigkeit
der t(2;5) in anaplastischen Großzell-Lymphomen zeigt, dass
das NPM-ALK Produkt eine wesentliche Rolle bei der Phatogenese dieser
Neoplasmen ausübt.
Das gewöhnliche
NPM Protein ist ein nicht-ribosomales nucleolares Phosphoprotein,
das an der Zusammenlagerung von präribosomalen Teilchen in kleine
und große
ribosomale Untereinheiten beteiligt ist (W.Y. Chan et al., Biochemistry
28:1033 (1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989); M.S. Schmidt-Zachmann
et al., EMBO J. 6:1881 (1987); M.S. Schmidt-Zachmann et al., Chromosoma.
96:417 (1988); D. Hernandez-Verdun, J. Cell. Sci. 99:465 (1991)).
Es bindet kooperativ mit hoher Affinität an einzelsträngige Nukleinsäuren, ermöglicht RNA-Helix
destabilisierende Aktivität
und wird in Zusammenhang mit den meisten gereiften nucleolaren präribosomalen
Ribonucleoproteinen gefunden (T.S. Dumbar et al., Biochemistry 28:9495 (1989)).
Die relative Häufigkeit
der NPM Transkripte und Protein wird durch den Zellzyklus reguliert.
Das NPM Transkriptions- und Translations-Maximum liegt gerade vor
dem Eintritt der Zellen in die S Phase mit einem Abfall zu der Basislinie
gerade vor dem Beginn der G2 Phase (N. Feuerstein et al., J. Immunol. 139:1818
(1987); N. Feuerstein at al., J. Biol. Chem. 262:11389 (1987); N.
Feuerstein et al., J. Biol. Chem. 263:10608 (1988); N. Feuerstein
et al. J. Cell Biol. 107:1629 (1988); N. Feuerstein et al., Exp.
Cell Res. 194:289 (1991)).
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Sequenzen,
die die meisten strukturellen Domänen des NPM kodieren, sind
nicht in dem Fusionstranskript enthalten (W.Y. Chan et al., Biochemistry 28:1033
(1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989); M. Peter et al. Cell
60:791 (1990); P.K. Chan et al., Biochem. J. 270:549 (1990); R.
Beckmann et al., Eur. J. Biochem. 210:45(1992)) (3C). Wir postulieren, dass das NPM Gen
einen aktiven Promotor zum Antrieb der Expression der ALK katalytischen
Domäne in
Lymphomazellen mit dem t(2;5) beiträgt. Diese Rolle des NPM würde entscheidend
erscheinen , da der ALK Promotor für gewöhnlicht still in Lymphoiden Zellen
vorliegt. Eine onkogene Rolle, falls es eine gibt, muss für die Amino-terminalen
NPM kodierenden Sequenzen etabliert werden, die in NPM-ALK eingebracht
sind und die möglichen
Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Ser43 und
Thr78) und ein mögliches C-X5-H-X4H Metallbindemotif (Reste 104–115) beinhalten.
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Die
Beteiligung von anomal aktivierten Rezeptor-Tyrosinkinasen an der
malignen Transformation wurde gut erkannt (J. Schlessinger et al.,
Neuron 9:383 (1992); T. Pawson, Curr. Opin. Gen. Dev. 2:4 (1992)).
Beispielsweise kann sich eine maligne Aktivierung des TRKA durch
Genfusionen ähnlich
zu NPM-ALK ereignen, wobei die extrazelluläre Domäne des Enzyms durch Aminosäuren ersetzt
wird, die von anderen Genen, beinhaltend jene für Nicht-Muskel Tropomyosin und das ribosomale
Protein L7a, kodiert werden D. Martin-Zanca et al., Nature 319:743 (1986);
F. Coulier et al., Mol. Cell. Biol. 9:15 (1989); R. Oskam et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2964 (1988); S.C. Kozma et al.,
EMBO J. 7:147 (1988); A. Ziemiecki et al., EMBO J. 9:191 (1990)). Eine
konsistente Eigenschaft der onkogenen TRKA Fusionsproteine und ebenfalls
der anderen Tyrosinkinase-Onkogene, beinhaltend BCR-ABL, EGFR, HER2/NEU
und CSF-1R, ist, dass ein Großteil
ihrer Wirksamkeit Mutationen oder Genfusionen zugeschrieben werden
können,
die zu einer konstitutiv aktiven katalytischen Domäne führen (j.
Schlessinger et al., Neuron 9:383 (1992); T. Pawson, Curr. Opin. Gen.
Dev. 2:4 (1992); D. Martin-Zanca et al., Nature 319:743, (1986);
F. Coulier et al., Mol. Cell. Biol. 9:15 (1989); R. Oskam et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2964 (1988); S.C. Kozma et al., EMBO
J. 7:147 (1988); A. Ziemiecki et al., EMBO J. 9:191 (1990)). Daher
würde man
in NPM-ALK Fusionsproteinen vorhersagen,
in denen die gekürzte
ALK Kinase dereguliert ist und intrazelluläre Substrate phosphoryliert,
um eine maligne Transformation auszulösen. Da anaplastische Großzell-Lymphome
aus aktivierten T-Lymphozyten entstehen, die für Wachstum und Lebensfähigkeit
von IL-2 abhängen
(K.A. Smith, Science 240:1169 (1988)), kann NPM-ALK Substrate phosphorylieren, die als
Antwort auf IL-2 Rezeptorübertragene
Signale gewöhnlich
phosphoryliert sind (E.M. Saltzman et al., J. Biol. Chem. 263:6956 (1988);
D.K. Ferris et al., J. Immunol. 143:870 (1989); LD: Horak et al.,
Proc. Natl. Acad. U.S.A. 88:1996 (1991); M. Hatakeyama et al., Science
252:1523 (1991); N. Kobayashio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:4201 (1993)), führen
zu einer konstitutiven Aktivierung dieser Signalübertragungswege.
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Unser
Ergebnis steht in deutlichem Kontrast zu vorherigen molekulargenetischen
Studien von T-Zell-Lymphomen und Leukämien, die in Zellen mit einem
unreifen (thymischen) Immunphänotyp
entstehen. Chromosomale Translokationen in lymphoblastischen T-Zell-Malignitäten beeinflussen
ständig
Verstärker
(enhancers), die in dem TCR β-Ketten-Lokus auf
Chromosom 7, Bande q34, oder dem α/δ Lokus auf
Chromosom 14, Bande q11 enthalten sind (M.L. Cleary, Cell 66:619
(1991); T.H. Rabbitts, Cell 67:641 (1991)). In jedem Fall verursachen
diese Verstärker, die
in T-Zellen-Vorläufern
hoch aktiv sind, eine deregulierte Expression von entwicklungsbedingt
regulierten Transkriptionsfaktor-Genen (beispielsweise TAL/SCL,
LYL 1, RHOMB/TTG und HOX 11), die auf den Bruchstellen auf den reziproken
Chromosomen lokalisiert sind. Unsere Beobachtungen bei Großzell-Lymphomen
lassen darauf schließen,
dass die Wege, die zur malignen Transformation in reifen T-Lymphozyten
führen,
sich von jenen unterscheiden, die für den Differenzierungs-Stopp
und das erhöhte
Wachstum von thymischen Vorläufern
verantwortlich sind.