AT410672B - Nucleinsäure, die einen nervengewebe-natriumkanal kodiert - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft allgemein Natriumkanalproteine und genauer eine neue Nucleinsäurese- quenz, die eine Säugetier-a-Untereinheit eines spannungsgesteuerten, bevorzugt Tetrodotoxin- resistenten, Nervengewebe-Natriumkanalproteins codiert. Die Erfindung betrifft weiterhin seine Herstellung mit Gentechnik. 



   Die Basiseinheit an Information, die von einem Teil des Nervensystems zu einem anderen übertragen wird, ist ein einzelnes Aktionspotential oder ein Nervenimpuls. Die   "Übertragungslei-   tung" für diese Impulse ist das Axon oder die Nervenfaser. Es wurde gezeigt, dass die elektrische Erregbarkeit der Nervenmembran von dem spannungsempfindlichen ionischen Permeabilitäts- system der Membran abhängt, das es zulässt, Energie zu verwenden, die in ionischen Konzentrati- onsgradienten gespeichert wird. Die elektrische Aktivität des Nervs wird ausgelöst durch eine Depolarisierung der Membran, die Kanäle durch die Membran öffnet, die äusserst selektiv für Natri- umionen sind, die dann durch den elektrochemischen Gradienten nach innen getrieben werden. 



  Von den vielen lonenkanälen ist der spannungsgesteuerte oder spannungsempfindliche Natrium- kanal der am besten untersuchte. Es ist ein Transmembranprotein, das wesentlich ist zur Erzeu- gung von Aktionspotentialen in erregbaren Zellen. Eine ausgezeichnete Obersicht über Natrium- kanäle findet sich in Catterall, TINS 16 (12), 500 bis 506 (1993). 



   Die cDNA für mehrere Na+-Kanäle wurden kloniert und sequenziert. Numa et al., Annals of the New York Academy of Sciences 479, 338 bis 355 (1986) beschreiben cDNA aus dem elektrischen Organ des Aals und zwei verschiedene aus Rattengehirn. Rogart, U.S.-Patent Nr. 5 380 836 beschreibt cDNA aus dem Gewebe des Rattenherzens. Siehe auch Rogart et al., Proc. Natl. Acad. 



  Sci. 86,8170 bis 8174 (1989). Die Sequenz von PN1 und seinen Orthologen bei Menschen (hNE) und Kaninchen (Na+s) wurde veröffentlicht (siehe z.B. Klugbauer et al., EMBOJ 14,1084 bis 1090 (1995) und Belcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 923,11034 bis 11038 (1995)). Die Sequenz von Ratten-PN1, die aus DRG kloniert wurde, und ihre Funktionsexpression wurden beschrieben (siehe z. B. Sangameswaran et al., J. Biol. Chem. 272,14805 bis 14809 (1997)). Andere klonierte Natriumkanäle schliessen die Typen I und ll des Rattengehirns, Noda et al., Nature 320,188 bis 192 (1986), lla, Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988) und lll, Kayano et al., FEBS Lett. 228, 187 bis 194 (1988), Rattenskelettmuskel (SkM1), Trimmer et al., Neuron 3,33 bis 49 (1989), Ratten-NaCh6, Schaller et al., J.

   Neurosci. 15,3231 bis 3242 (1995), periphere Nervennatrium- kanäle Typ 3 der Ratte (tPN3), Sangameswaran et al., J. Biol. Chem. 271,5953 bis 5956 (1996), auch als SNS bezeichnet, Akopian et al., Nature 379, 257 bis 262 (1996), atypische Rattenkanäle, Felipe et al., J. Biol. Chem. 269,30125 bis 30131 (1994) und den Glia-Natriumkanal der Ratte, Akopian et al., FEBS Lett. 400,183 bis 187 (1997) ein. 



   Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aminosäuresequenz des   Na+-Kanals   über einen langen evolutionären Zeitraum konserviert ist. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, dass der Kanal ein einziges Polypeptid ist, das vier interne Sequenzwiederholungen oder homologe Domä- nen (Domänen I bis IV) mit ähnlichen Aminosäuresequenzen enthält. Jede Domäne faltet sich in sechs vorhersagbare und helikale Transmembransegmente: fünf sind hydrophobe Segmente und eins ist stark geladen mit vielen positiv geladenen Lysin- und Argininresten. Dieses stark geladene Segment ist das vierte Transmembransegment in jeder Domäne (S4-Segment) und ist wahrschein- lich an der Spannungssteuerung beteiligt.

   Die positiv geladenen Seitenketten an dem S4-Segment sind wahrscheinlich gepaart mit den negativ geladenen Seitenketten an den anderen fünf Segmen- ten, sodass die Membrandepolarisierung die Position einer Helix bezogen auf die andere verschie- ben könnte, wodurch der Kanal geöffnet wird. Zusätzliche Untereinheiten können die Funktion des Kanals modifizieren. 



   Der therapeutische Nutzen von rekombinanten Materialien, die aus der DNA zahlreicher Natri- umkanäle stammen, wurde gefunden. Z. B. offenbart U. S.-Patent Nr. 5 132 296 von Cherksey gereinigte Na+-Kanäle, die sich als nützliche therapeutische und diagnostische Werkzeuge erwie- sen haben. 



   Isoformen von Natriumkanälen werden in "Unterfamilien" unterteilt. Der Ausdruck "Isoform" wird hier verwendet, um distinkte aber nah verwandte Natriumkanalproteine zu bezeichnen, d.h. solche mit einer Aminosäurehomologie von ungefähr 60 bis 80%. Diese zeigen auch eine starke Homologie in den Funktionen. Der Ausdruck "Unterfamilie" wird verwendet, um distinkte Natrium- kanäle zu bezeichnen, die eine Aminosäurehomologie von ungefähr 80 bis 95% haben. Kombinati- onen mehrerer Faktoren werden verwendet, um die Unterschiede innerhalb einer Unterfamilie zu 

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 bestimmen, z. B. die Geschwindigkeit eines Kanals, die chromosomale Anordnung, die Expressi- onsdaten, die Homologie mit anderen Kanälen innerhalb einer Art und die Homologie mit einem Kanal der gleichen Unterfamilie über die Arten hinweg.

   Eine andere Überlegung ist eine Affinität zu Tetrodotoxin ("TTX"). TTX ist ein äusserst potentes Toxin aus dem "Puffer"- oder Fugufisch, das die Leitung von Nervenimpulsen entlang der Axone und in erregbaren Membranen von Nervenfasern blockiert. TTX bindet an den Na+-Kanal und blockiert den Fluss der Natriumionen. 



   Untersuchungen unter Anwendungen von TTX als Sonde haben Licht auf den Mechanismus und die Struktur von Na+-Kanälen geworfen. Es gibt 3 Na+-Kanal-Unterarten, die durch die Affinität 
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 Kanäle (IC50 = 1 bis 30 nM), TTX-unempfindliche Na+-Kanäle   (ICso   = 1 bis 5   uM)   und TTX- 
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   TTX-unempfindliche Aktionspotentiale wurden zuerst im Rattenskelettmuskel untersucht (Red- fern et al., Acta Physiol. Scand. 82, 70 bis 78 (1971)). Anschliessend wurden diese Aktionspotentia- le für andere Säugetiergewebe beschrieben, einschliesslich dem Säugetierskelettmuskel bei Neu- geborenen, Säugetierherzmuskel, Mausganglionzellen der Dorsalwurzel in vitro und in Kultur, gezüchtetem Säugetierskelettmuskel und L6-Zellen. Siehe Rogart, Ann. Rev. Physiol. 43,711 bis 725 (1980). 



   Rattenganglienneuronen der Dorsalwurzel besitzen sowohl TTX-empfindliche (C50- 0,3 nM) als auch TTX-resistente (IC50- 100   M)   Natriumkanalströme, wie von Roy et al., J. Neurosci. 12, 2104 bis 2111 (1992) beschrieben. TTX-resistente Natriumströme wurden auch in Rattenknoten und Petrosal-Ganglien gemessen. Siehe Ikeda et al., J. Neurophysiol. 55,527 bis 539 (1986) und Stea et al., Neurosci. 47,727 bis 736 (1992). Elektrophysiologen nehmen an, dass andere TTX- resistente Natriumkanäle noch entdeckt werden müssen. 



   Obwohl cDNA aus Rattenskelettmuskel, Herz und Gehirn bekannt ist, wurde die Identifizierung und Isolierung von cDNA aus peripherem sensorischen Nervengewebe, wie den Ganglien der Dorsalwurzel, bisher durch die Schwierigkeit, mit solchem Gewebe zu arbeiten, behindert. 



   Zusammenfassung der Erfindung 
Die vorliegende Erfindung liefert neue gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen, die Natriumkanalproteine des Nervengewebes von Säugetieren, insbesondere TTX-resistente, codie- ren, die stark exprimiert werden in ausgewachsenen DRG und Knotenganglien, weniger stark im Gehirn, Rückenmark und oberen Zervikalganglien exprimiert wird und nicht in Ischiasnerv, Herz oder Skelettmuskel exprimiert wird. In derzeit bevorzugten Formen umfassen neue DNA-Sequen- zen cDNA-Sequenzen, die Natriumkanalprotein aus Rattennervengewebe codieren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die a-Untereinheit dieses Natriumkanalproteins. 



   Es wird DNA, cDNA und mRNA offenbart, die von den Nucleinsäuresequenzen der Erfindung abgeleitet ist, und cRNA, die von mRNA abgeleitet ist. Insbesondere codieren zwei cDNA- Sequenzen zusammen die gesamte Länge des Natriumkanals aus Rattennervengewebe. 



   Die Erfindung schliesst auch andere DNA-Formen, wie genomische DNA, DNA, die durch teilweise oder vollständige chemische Synthese aus Nucleotiden hergestellt wurde und DNA mit Deletionen oder Mutationen, ein. 



   Weitere Aspekte der Erfindung sind das neue TTX-resistente Natriumkanalprotein und Frag- mente davon, die von der erfindungsgemässen DNA codiert werden. 



   Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind rekombinante Polynucleotide und Oligonucleotide, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die aus der DNA-Sequenz der Erfindung abgeleitet ist. 



   Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Stabilisierung von cDNA der vollen Länge, das die Proteinsequenz der Erfindung codiert. 



   Weitere Aspekte der Erfindung schliessen Expressionsvektoren ein, die die DNA der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, und eine cDNA- Bibliothek dieser Wirtszellen. 



   Teil der Erfindung bildet auch ein Assay für Inhibitoren des Natriumkanalproteins, der umfasst, dass man eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, in Kontakt bringt mit dem exprimierten Natriumkanal und die Aktivität des Natriumkanals misst. 



   Weiterhin wird ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität des TTX-resistenten Natriumkanals 

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 bereitgestellt, das umfasst, dass man eine wirksame Menge einer Verbindung mit einem Ic50 von 
10   M   oder weniger verabreicht. 



   Zusätzlich werden Methoden bereitgestellt zur Anwendung der DNA zur Bildung von monoklo- nalen und polyklonalen Antikörpern zur Verwendung als Zielmoleküle für das Auffinden von Arz- neimitteln, als hochspezifische Marker für spezifische Antigene, Detektormoleküle, diagnostische 
Assays und für therapeutische Anwendungen, wie Schmerzlinderung, eine Sonde für den PN5- 
Kanal in anderem Säugetiergewebe, die Entwicklung von Therapeutika und das Screenen von 
Therapien. 



   Kurze Beschreibung der SEQ IDS und Figuren 
Die Figuren 1A bis E zeigen die native cDNA-Sequenz mit 5908 Nucleotiden, die den Ratten- natriumkanal Typ 5 ("PN5") (SEQ ID Nr. 1) codiert, die aus zwei überlappenden cDNA-Klonen stammt, die mit 26. 2 und 1.18 bezeichnet werden. 



   Die Figuren 2A bis F zeigen die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5 (SEQ ID Nr. 2, dar- gestellt in Drei-Buchstaben-Aminosäurecode). Die Figuren 2G bis H, die die abgeleitete Aminosäu- resequenz von PN5 im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode zeigen, zeigen auch die homologen Domänen (I bis IV), mögliche Transmembransegmente (S1 bis S6); die Aminosäure, die die Resis- tenz gegenüber TTX beiträgt   (#);   N-Glycosilierungsstellen (D); eine Phosphorylierungsstelle für eine cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA), (0) und das Stopcodon   (*).   



   Figur 3A zeigt eine Sequenz für das menschliche PN5 mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3). 



  Figur 3B zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich des hPN5-Fragments mit Ratten-PN5. 



   Figur 4 zeigt die Sequenz der neuen Sonde für die Natriumkanal-Domäne IV (SEQ ID Nr. 4). 



   Die Figuren 5A bis E zeigen die Nucleinsäuresequenz mit 5334 Nucleotiden modifiziert für Sta- bilität und Expression (SEQ ID Nr. 5). Die Nucleotide 24 bis 5518 bilden die 5295bp-Region, die ein Protein mit 1765 Aminosäuren codiert. 



   Figur 6 zeigt die Klonierungskarte von PN5. 



   Detaillierte Beschreibung der Erfindung 
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein neues Säugetier-Natriumkanalprotein, das bevorzugt TTX-resistent ist, codiert. Der Ausdruck "gereinigte und isolierte DNA" bezieht sich auf DNA, die im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 30%, bevorzugt weniger als etwa 10%, und noch bevorzugter weniger als etwa   1 %   der DNA enthält, mit der die interessierende DNA natürlicherweise assoziiert ist. Techniken, um diese Rein- heit zu erreichen, sind im Stand der Technik wohlbekannt und schliessen z. B. Restriktionskartie- rung, Agarosegelelektrophorese und Zentrifugation mit CsCI-Gradient ein. 



   Der Ausdruck "DNA" soll "cDNA" oder komplementäre DNA einschliessen, die   einzeisträngig   oder doppelsträngig sein kann, DNA-Sequenzen, die durch reverse Transkription aus mRNA hergestellt wurden, die aus einer Donorzelle oder durch chemische Synthese isoliert wurde. Z.B. liefert die Behandlung von mRNA mit einer reversen Transkriptase, wie AMV-reverse-Transkrip- tase oder M-MuLV-reverse Transkriptase, in Gegenwart eines Oligonucleotidprimers ein RNA- DNA-Duplex, das mit RNase H, DNA-Polymerase und DNA-Ligase behandelt werden kann, um doppelsträngige cDNA zu erzeugen. Falls erwünscht, kann die doppelsträngige cDNA mit üblichen Techniken denaturiert werden, z. B. Erwärmen, um einzelsträngige cDNA zu erzeugen.

   Der Aus- druck "cDNA" schliesst cDNA ein, die eine komplementäre Kopie der natürlich vorkommenden RNA ist, ebenso wie komplementäre Kopien von Varianten der natürlich vorkommenden RNA, die die gleiche biologische Aktivität haben. Varianten schliessen z. B. Insertionen, Deletionen, Sequenzen mit degenerierten Codons und Allele ein. 



   "cRNA", die mRNA entspricht, die aus einer DNA-Sequenz transkribiert wurde, die die a-Unter- einheit eines neuen, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanalproteins codiert, wird erfindungs- gemäss ebenfalls in Betracht gezogen. Der Ausdruck "cRNA" bezieht sich auf RNA, die eine Kopie der von der Zelle transkribierten mRNA ist. 



   Spezifisch umfasst die Erfindung DNA mit den nativen Versionen der Nucleotidsequenzen, die in den Figuren 1A bis E (SEQ ID Nr. 1) angegeben sind, die hier als Natriumkanal Typ 5 (PN5) 

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 bezeichnet werden. Die Figuren 1A bis E zeigen ein cDNA-Konstrukt mit 5908 Nucleotiden, das einen offenen Leserahmen mit 5298 Basen (wobei das Stop-Codon mitzählt) umfasst (SEQ ID Nr. 



  1). Der Nucleotidrest 79 stellt die Startstelle der Translation dar und der Rest 5376 stellt das Ende des Stop-Codons dar. 



   Die Erfindung umfasst auch technisch hergestellte Versionen von PN5 und spezifisch die Versi- on, die in den Figuren 5A bis E angegeben ist (SEQ ID Nr. 5). Diesem Sall-Xbal-Klon mit 5334 Nucleotiden fehlt das meiste der untranslatierten Sequenzen, wobei der offene Leserahmen der 5298 Nucleotide bei Nucleotid 24 beginnt und bei Nucleotid 5321 endet. Die Start- und Stop- Codons sind unterstrichen, ebenso wie die bezüglich der Translation stillen Mutationen bei den Nucleotiden 3932,3935, 3941,3944 und 3947, die durch Blockumlagerung in diesem Bereich während des Wachstums von E. coli eingeführt wurden. 



   Die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 (Figuren 1A bis E) entspricht der cDNA der Ratte. 



  Eine Homologiesuche zeigte, dass sich der am nächsten verwandte Natriumkanal im Rattenherz- kanal findet, mit einer Homologie von 72,5%. Die am nächsten verwandten Kanäle sind rPN1 mit 72% und aus dem Rattengehirn die Typen I und lll mit 71,8% bzw. 71,3%. Die Homologie von rPN3a, hPN3, rPN4, rPN4a, Rattengehirn Typ ll und Rattenskelettmuskel ist jeweils ungefähr 70 bis   71%.   



   Ausserdem wurde ein Klon mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3), wie in Figur 3A gezeigt, aus einer "cDNA-Bibliothek" von Humanganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, der eng verwandt ist mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 mit 79% Identität und 86% Homologie. Die humane PN5-Sequenz überspannt die Region zwischen IIIS1 und der Interdomäne   III/IV,   die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d. h. IFM) einschliesst, die innerhalb der Interdomäne III/IV angeordnet ist. 



   Der Ausdruck "cDNA-Bibliothek" bezieht sich auf eine Ansammlung von Klonen, gewöhnlich in einem Bakteriophagen oder weniger häufig in bakteriellen Plasmiden, die cDNA-Kopien von mRNA-Sequenzen enthalten, die aus einer Donorzelle oder Gewebe stammen. 



   Es wird angenommen, dass weitere Homologe des neuen TTX-resistenten Rattennatriumka- nals, der hier beschrieben wird, auch in anderen Säugetiergeweben exprimiert werden. 



   Eine Northern-Blot-Analyse (Beispiel 5) zeigt, dass PN5 von einem - 6,5 kb Transkript codiert wird. 



   Die abgeleitete Aminosäureseguenz von PN5, die in den Figuren 2A bis F (SEQ ID Nr. 2) ge- zeigt ist, hat die primären Strukturmerkmale einer a-Untereinheit eines spannungsgesteuerten, TTX-resistenten Natriumkanals. In den Figuren 2G bis H sind die homologen Domänen (I bis IV), die möglichen Transmembransegmente (S1 bis S6), die Aminosäure, die die Resistenz gegenüber TTX beiträgt   (#)   N-Glycosilierungsstellen (.) und c-AMP-abhängige PKA-Phosphorylierungsstellen (0) gezeigt. DNA-Sequenzen, die die gleichen oder allelische Varianten oder analoge Natrium- kanalproteinpolypeptide des Nervensystems durch Verwendung, von zumindest teilweise degene- rierten Codons, codieren, werden auch erfindungsgemäss in Betracht gezogen. 



   Ein interessantes Merkmal dieser abgeleiteten Aminosäuresequenz ist es, dass die Aminosäu- re, die am verantwortlichsten für die TTX-Empfindlichkeit ist, an Position 355 angeordnet ist und nicht aromatisch ist. In Natriumkanälen aus der Ratte und dem menschlichen Gehirn, Skelettmus- kelkanälen und in PN1 und PN4 ist diese Aminosäure Tyrosin oder Phenylalanin und diese Kanäle sind alle TTX-empfindlich. In PN3 und PN5 ist die Aminosäure ein Serin. Da PN3 äusserst resistent gegenüber TTX ist, ist die Schlussfolgerung, dass PN5 auch ein TTX-resistenter Kanal ist. Der Herzkanal hat ein Cystein an dieser Stelle und ist "unempfindlich" für TTX. 



   Obwohl PN5 alle wichtigen Merkmale eines spannungsgesteuerten Natriumkanals enthält, hat es einzigartige strukturelle Merkmale, die ihn von anderen Natriumkanälen unterscheiden. Z. B. hat DIIS4 5 basische Aminosäuren, die in allen Natriumkanälen konserviert sind, die eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Spannungsempfindlichkeit der Kanalfunktion spielen könnten. In PN5 ist die erste basische Aminosäure durch ein Alanin ersetzt. In ähnlicher Weise hat in DIIIS4 PN5 5 basische Aminosäuren statt 6, die in anderen Natriumkanalsequenzen vorhanden sind, wobei das letzte Arginin durch ein Glutamin ersetzt ist. In DIIIS3 enthält das Transmembransegment nur 18 Aminosäuren im Gegensatz zu 22 Aminosäuren in anderen Kanälen. Auch die kurze Linkerschleife (4 Aminosäuren) zwischen S3 und S4 in Dill ist noch kürzer durch eine "Deletion" von 3 Aminosäu- ren.

   Diese Verkürzung von S3 und der Linkerschleife wurde bestätigt, indem Primer im geeigneten Bereich der Sequenz für ein RT-PCR-Experiment aus Ratten-DRG entwickelt wurden und das 

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 amplifizierte DNA-Fragment sequenziert wurde. Ein solcher Versuch wurde durchgeführt, um die Sequenz einer anderen Region von PN5, in der DIVS5-S6-Schleife zu bestätigen, wo eine Deletion eines Peptids mit 8 Aminosäuren war. 



   Eine Gewebeverteilungsanalyse mit reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (durch Oligonucleotid geprimte RT-PCR) von RNA aus dem Rattenzentral- und Periphernervensystem, insbesondere aus Ratten-DRG, wurde durchgeführt. Acht Hauptgewebearten wurden gescreent auf die Expression der einzigartigen PN5-Gene, die den Positionen 5651 bis 5903 von SEQ ID Nr. 



   1 entsprechen (Figuren 1A bis E). mRNA von PN5 war in 5 der untersuchten Gewebe vorhanden: Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und obere Zervikalganglien. PN5 war nicht vorhanden in den verbleibenden untersuchten Geweben: Ischiasnervgewebe, Herz oder Skelettmuskelgewe- be. Es wurde gefunden, dass PN5 am stärksten in DRG und Knotenganglien ist, was die Anmelder dazu bringt, anzunehmen, dass DRG mit PN5 angereichert ist, PN5 zeigt dramatische Unterschiede über einen Bereich von Geweben. PN5 hat einen Expressionsgradienten mit einer hohen Expres- sion in DRG. PN5 hat einen Expressionsgradienten wie andere Kanäle, aber mit begrenzterer Verteilung. 



   Die Erfindung schliesst nicht nur das gesamte Protein ein, das von den cDNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 exprimiert wird, sondern schliesst auch Proteinfragmente ein. Diese Frag- mente können erhalten werden, indem die vollständigen Proteine gespalten werden oder durch Verwendung kleinerer DNA-Sequenzen oder "Polynucleotide", um das gewünschte Fragment zu exprimieren. 



   Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine polymere Form von Polynucleotiden jeglicher Länge, sowohl Ribonucleotiden als auch Desoxyribonucleotiden. 



  Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls. Daher schliesst dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträngige RNA ein. Er schliesst auch modifizierte, z. B. durch Methylierung modifizierte und/oder am 5'-Ende modifizierte, und unmodifizierte Formen des Polynucleotids ein. 



   Weiterhin soll der Ausdruck "Polynucleotid" ein rekombinantes Polynucleotid einschliessen, das genomischen Ursprungs, von cDNA, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs ist, das aufgrund seines Ursprungs oder durch Manipulation nicht mit allem oder einem Teil des Polynucle- otids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist und/oder einem Polynucleotid verbunden ist, ausser dem, mit dem es in der Natur verbunden ist. 



   Demzufolge schliesst die Erfindung auch Polynucleotide ein, die verwendet werden können, um Polypeptide mit einer Länge von etwa 10 bis 1500, bevorzugt 10 bis 100 Aminosäuren herzustel- len. Die Isolierung und Reinigung solcher rekombinanten Polypeptide kann mit Techniken erreicht werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z.B. präparative chromatographische Tren- nung oder Affinitätschromatographie. Ausserdem können Polypeptide auch mit synthetischen Mitteln hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. 



   Die Erfindung ermöglicht die Manipulation von genetischem Material mit Gentechnik zur Er- zeugung von Polypeptiden, die strukturelle und funktionelle Eigenschaften der spannungsgesteuer- ten, TTX-resisrenten Natriumkanal-a-Untereinheit besitzen, die in sensorischen Nerven gefunden wird. Eine ortsgerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um solche rekombinanten Polypep- tide zu liefern. Z. B. können synthetische Oligonucleotide spezifisch in den Teil des interessieren- den Gens eingesetzt oder substituiert werden, um Gene zu erzeugen, die eine spezifische Mutante codieren und diese exprimieren. Statistische degenerierte Oligonucleotide können auch eingesetzt werden und eine Phagendisplaytechnik kann verwendet werden, um Polypeptide, die eine funktio- nelle Eigenschaft, an der man interessiert ist, besitzen, zu identifizieren und zu isolieren. 



   Ausserdem werden für die vorliegende Erfindung rekombinante Polynucleotide mit einer Länge von etwa 15 bis 20 kb, bevorzugt 10 bis 15 kb, Nucleotiden in Betracht gezogen, die eine Nuclein- säuresequenz umfassen, die von der DNA der Erfindung "abgeleitet" ist. 



   Der Ausdruck "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz bezieht sich auf eine Nucleinsäure- sequenz, die aus einer Sequenz mit ungefähr mindestens 6 bis 8 Nucleotiden, bevorzugter minde- stens 10 bis 12 Nucleotiden und noch bevorzugter mindestens 15 bis 20 Nucleotiden aufgebaut ist, die einem Bereich der bezeichneten Sequenz entsprechen, d. h. dazu homolog oder komplementär sind. Die abgeleitete Sequenz ist nicht notwendigerweise physikalisch von der gezeigten Nucleo- tidsequenz abgeleitet, kann aber in irgendeiner Weise abgeleitet sein, z. B. durch chemische 

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 Synthese oder DNA-Replikation oder reverse Transkription, die auf der Information basiert, die durch die Sequenzen von Basen in dem Bereich, aus dem das Polynucleotid abgeleitet ist, stammt. 



   Ein neonataler Expressionstest wurde mit F11durchgeführt, einer Fusionszellinie, die aus neo- natalem Ratten-DRG fusioniert mit einer Mauszellinie, N18TG von Massachusetts General Hospi- tal, entwickelt wurde. F11reagiert auf trophische Mittel, wie NGF, durch Verlängerung von Dendri- ten, Es wurde gefunden, dass PN5 sowohl in nativem F11als auch in F11, das mit NGF behandelt worden war, vorhanden war, das die Anmelder zu der Annahme führt, dass der Natriumkanal nativ in F11exprimiert wird. 



   Die in-situ-Hybridisierung von PN5-mRNA mit Ratten-DRG-Gewebe liefert eine Lokalisierung hauptsächlich in den kleineren und mittleren Neuronen ohne Nachweis in grossen Neuronen. 



   PN5 wurde auch bezüglich der cytogenetischen Lokalisierung auf Mauschromosomen- Präparaten kartiert. PN5 liegt auf dem gleichen Chromosom wie der Herzkanal und PN3. 



   Im allgemeinen umfassen Natriumkanäle eine a- und zwei &num;-Untereinheiten. Die &num;-Unterein- heiten können die Funktion des Kanals modulieren. Da jedoch die a-Untereinheit alles ist, was erforderlich ist, damit der Kanal vollständig funktionell ist, liefert die Expression der cDNA in SEQ 
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 ben, da sie im Stand der Technik wohlbekannt ist, siehe Isom et al., Neuron 12,1183 bis 1194 (1994). Es versteht sich jedoch, dass man durch Kombinieren der bekannten Sequenz für die ss1- Untereinheit mit der hier beschriebenen Sequenz der a-Untereinheit den vollständigen, span- nungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten PN5-Natriumkanal erhalten kann. 



   Die vorliegende Erfindung schliesst auch "Expressionsvektoren" ein, die die oben beschriebene DNA oder cDNA umfassen, Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, die den Natriumkanal der Erfindung erzeugen können und cDNA-Bibliotheken, die diese Wirtszellen umfassen. 



   Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezieht sich auf irgendein genetisches Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, einen Virus, der sich entweder als autonome Einheit der Polynucleo- tidexpression innerhalb einer Zelle verhält oder zur Replikation fähig gemacht wird durch Insertion in ein Wirtszellchromosom, das an ein anderes Polynucleotidsegment gebunden wird, um die Replikation und/oder Expression des gebundenen Segmentes zu erreichen. Geeignete Vektoren schliessen Plasmide, Bakteriophagen und Cosmide ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Vekto- ren enthalten Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Ligierung oder Insertion des Vektors in eine gewünschte Wirtszelle zu bewirken und die Expression des gebundenen Segments zu bewirken.

   Solche Sequenzen unterscheiden sich abhängig vom Wirtsorganismus und schliessen Promotorsequenzen ein, um die Transkription zu bewirken, Enhancersequenzen, um die Transkrip- tion zu erhöhen, ribosomale Bindungsstellensequenzen und Transkriptions- und Translations- terminationssequenzen. 



   Der Ausdruck "Wirtszelle" bezieht sich allgemein auf prokaryotische oder eukaryotische Orga- nismen und schliesst irgendeinen transformierbaren oder transfizierbaren Organismus ein, der ein Protein exprimieren kann und als Empfänger für Expressionsvektoren oder andere transferierte DNA verwendet werden kann oder verwendet wurde. Wirtszellen können auch dazu gebracht werden, Protein zu exprimieren durch direkte Injektion von exogener cRNA, die in das interessie- rende Protein translatierbar ist. Eine bevorzugte Wirtszelle ist der Xenopus-Oocyt. 



   Der Ausdruck "transformiert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Sequenzen in eine prokaryotische Wirtszelle. Der Ausdruck "transfiziert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Sequen- zen in eine eukaryotische Wirtszelle. Solche transformierten oder transfizierten hellen schliessen stabil transformierte oder transfizierte Zellen ein, in denen die insertierte DNA zur Repli-kation in der Wirtszelle fähig gemacht worden ist. Sie schliessen auch vorübergehend exprimierende Zellen ein, die die insertierte DNA oder RNA nur für einen begrenzten Zeitraum exprimieren. Das Trans- formations- oder Transfektionsverfahren hängt von der zu transformierenden Wirtszelle ab.

   Es kann ein Verpacken des Polynucleotids in einen Virus ebenso einschliessen, wie die direkte Auf- nahme des Polynucleotids, wie z. B. durch Lipofektion oder Mikroinjektion. Die Transformation und Transflektion kann zu einem Einbau, der insertierten DNA in das Genom der Wirtszelle führen 

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 oder zur Aufrechterhaltung der insertierten DNA innerhalb einer Wirtszelle in Plasmidform. Metho- den zur Transformation sind im Stand der Technik wohlbekannt und schliessen virale Infektion, Elektroporation, Lipofektion und durch Calciumphosphat vermittelte direkte Aufnahme ein, ohne darauf beschränkt zu sein. 



   Es versteht sich, dass die Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren, Wirtszellen und Transformationstechniken einschliessen soll, die äquivalenten Funktionen dienen und im Stand der Technik bekannt sind. 



   Die Erfindung betrifft auch einen Assay für Inhibitoren des neuen TTX-resistenten Natrium- kanalproteins, der umfasst, dass eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, mit dem exprimierten Natriumkanal in Kontakt gebracht wird und die Aktivität des Natrium- kanals gemessen wird. Die Verbindung kann eine im wesentlichen reine Verbindung synthetischen Ursprungs sein, die mit einem wässrigen Medium kombiniert ist, oder die Verbindung kann ein natürlich vorkommendes Material sein, sodass das Testmedium ein Extrakt biologischen Ursprungs ist, z. B. ein Pflanzen-, Tier- oder mikrobieller Zellextrakt. 



   Die PN5-Aktivität kann mit Methoden, wie Elektrophysiologie (Zwei-Elektroden-Spannungs- klemme oder Einzel-Elektroden-Whole-Cell-Klemme), Guanidiniumionenfluss-Assays und Toxinbin- dungs-Assays gemessen werden. Ein "Inhibitor" wird allgemein definiert als die Menge, die zu einer mehr als 50%igen Abnahme, bevorzugt mehr als   70%igen   Abnahme der PN5-Aktivität, noch bevorzugter mehr als 90%igen Abnahme der PN5-Aktivität, der PN5-Aktivität führt. 



   Es gibt viele Verwendungen für die Erfindung, von denen wenige im folgenden beschrieben sind : 
 EMI7.1 
 
Wie oben erwähnt, wird angenommen, dass weitere Homologe des neuen TTX-resistenten Rattennatriumkanals, der hier beschrieben wird, auch in Säugetiergewebe exprimiert werden, insbesondere in menschlichem Gewebe. Die vollständigen cDNAs von PN5-Rattennatriumkanälen der vorliegenden Erfindung können als Sonde verwendet werden, um festzustellen, ob zusätzliche neue spannungsgesteuerte, bevorzugt TTX-resistente, PN5-Natriumkanäle im menschlichen Gewebe existieren und, falls ja, die Isolierung der cDNAs für das menschliche Protein zu fördern. 



   Die humanen Homologen der TTX-resistenten   Ratten-PN5-Kanäle   können kloniert werden un- ter Verwendung einer Human-DRG-cDNA-Bibliothek. Human-DRG wird bei einer Autopsie erhal- ten. Das gefrorene Gewebe wird homogenisiert und die RNA mit Guanidinisothiocyanat extrahiert (Chirgwin et al., Biochemistry 18,5294 bis 5299, (1979)). Die RNA wird der Grösse nach fraktioniert auf einem Saccharosegradienten, um grosse mRNAs anzureichern, da die Natriumkanal-a-Unter- einheiten von grossen (7 bis 11kb) Transkripts codiert werden. Doppelsträngige cDNA wird herge- stellt unter Verwendung des SuperScript Choice cDNA-Kits (GIBCO BRL) entweder mit Oligo(dT) oder statistischen Hexamerprimern. EcoRI-Adapter werden an die doppelsträngige cDNA ligiert, die dann phosphoryliert wird.

   Die cDNA-Bibliothek wird konstruiert, indem die doppelsträngige cDNA in den Bakteriophagen lambda-ZAPII-Vektor (Stratagene) ligiert wird und anschliessend in Phagenteilchen verpackt wird. 



   Phagen werden auf 150 mm-Platten auf einem Rasen von XLI-Blue MRF'-Bakterien (Stratage- ne) ausplattiert und Plaque-Abdrücke werden auf Hybond N-Nylonmembranen (Amersham) er- stellt. Die Filter werden mit Ratten-PN5-cDNA-Sonden mit Standardverfahren hybridisiert und durch Autoradiographie oder Chemilumineszenz nachgewiesen. Das von den Ratten-PN5-Sonden erzeugte Signal, das mit positiven humanen Klonen mit hoher Stringenz hybridisiert, sollte stärker sein, als das, das mit Natriumkanalsonden aus Rattengehirn erhalten wird, die mit diesen Klonen hybridisieren. Positive Plaques werden weiter gereinigt durch begrenzte Verdünnung und erneutes Screenen durch Hybridisierung oder PCR.

   Eine Restriktionskartierung und Polymerase-Ketten- reaktion identifiziert überlappende Klone, die mit Standardtechniken zusammengesetzt werden können zu einem humanen Homolog von Ratten-PN5 mit voller Länge. Der Humanklon kann exprimiert werden, indem cRNA in vitro aus dem cDNA-Klon voller Länge in Xenopus-Oocyten injiziert wird oder indem eine Säugetierzellinie mit einem Vektor transfiziert wird, der die cDNA, gebunden an einen geeigneten Promotor, enthält. 



   2. Antikörper qeaen PN5 

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Die erfindungsgemässen Polypeptide sind sehr nützlich zur Entwicklung von Antikörpern gegen 
PN5. Solche Antikörper können in der Affinitätschromatographie verwendet werden, um rekom- binante Natriumkanalproteine oder Polypeptide zu reinigen oder sie können verwendet werden als 
Forschungshilfsmittel. Z. B. können Antikörper, die an ein Reportermolekül gebunden sind, verwen- det werden für histochemische Anfärbungstechniken, um andere Gewebe- und Zelltypen zu identi- fizieren, in denen PN5 vorhanden ist, oder sie können verwendet werden, um Epitop- oder funktio- nelle Regionen des erfindungsgemässen Natriumkanalproteins zu identifizieren. 



   Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können mit Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, Polyklonale Antikörper werden wie folgt hergestellt : ein immunogenes Konjugat, das PN5 oder ein Fragment davon umfasst, gegebenenfalls gebunden an ein Trägerprotein, wird verwendet, um ein ausgewähltes Säugetier, z. B. eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege etc., zu immunisieren. Serum von dem immunisierten Säugetier wird gesammelt und mit bekannten Verfahren behandelt, um die Immunglobulinfraktion abzutrennen. 



   Monoklonale Antikörper werden mit Standardhybridomazelltechnologie hergestellt auf Basis des Artikels von Köhler und Milstein in Nature 256,495 bis 497 (1975). Milzzellen werden von einem Wirtstier erhalten, das mit dem PN5-Protein oder einem Fragment davon immunisiert wurde, gegebenenfalls gebunden an einen Träger. Hybridzellen werden gebildet, indem diese Milzzellen mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert werden und gezüchtet werden. Die von den Hybrid- zellen erzeugten Antikörper werden auf ihre Fähigkeit, an exprimierte PN5-Proteine zu binden, gescreent. 



   Eine Anzahl von Screeningtechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z.b. vorwärts oder rückwärts gerichtete enzymgebundene Immunosorbent-Assay-Screeningmethoden können angewendet werden. Die Hybridzellen, die solche Antikörper erzeugen, werden dann einer erneu- ten Klonierung und hohen Verdünnungsbedingungen unterzogen, um eine Hybridzelle auszuwäh- len, die eine homogene Population von Antikörpern sezerniert, die für ein PN5-Protein spezifisch sind. 



   Ausserdem können Antikörper gezüchtet werden durch Klonieren und Exprimieren von Nucleo- tidsequenzen oder mutagenisierte Versionen davon, die mindestens die Aminosäuresequenzen codieren, die für die spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlich sind, und diese exprimierten Proteine können als Immunogen verwendet werden. 



   Antikörper können das vollständige Immunglobulin oder ein Fragment davon einschliessen. An- tikörper können an eine Reportergruppe, z. B. wie oben für Polynucleotide beschrieben, gebunden sein. 



   Beispiel 10 erläutert ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers. 



   3. Therapeutische Ziele für Verbindungen, um Störungen zu behandeln, und Tests dafür 
Die vorliegende Erfindung schliesst auch die Verwendung der neuen spannungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanal-a-Untereinheit als therapeutisches Ziel für Verbindungen ein, um Störungen des Nervensystems auf Basis von RT-PCR-Lokalisierungsdaten zu behandeln. 



  Die Störungen schliessen Epilepsie, Schäden durch Schlaganfall, Gehirnschäden, diabetische Neuropathie, traumatische Schäden, chronisch-neuropathische Schmerzen und mit AIDS assozi- ierte Neuropathie ein, ohne darauf beschränkt zu sein. 



   4. Entwicklung von Therapeutika, basierend auf der Hemmung von PN5 und Tests dafür 
Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, die Aktivität von PN5 in Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und oberen Zervikalgangliengeweben zu hemmen. Es versteht sich jedoch, dass weitere Untersuchungen ergeben können, dass PN5 in anderen Geweben vorhanden ist, und diese Gewebe können dann auch Zielbereiche sein. Z. B. deutet der Nachweis von PN5-mRNA in Kno- tenganglien darauf hin, dass PN5 TTX-resistente Natriumströme in diese und andere sensorische Ganglien des Nervensystems leiten könnte. 



   Ausserdem wurde gefunden, dass Proteine, die normalerweise nicht in bestimmten Geweben exprimiert werden, bei einem Krankheitszustand exprimiert werden. Daher soll die Erfindung die Hemmung von PN5 in Geweben und Zellarten, in denen das Protein normalerweise exprimiert wird, und in solchen Geweben und Zellarten, wo das Protein nur während eines Krankheitszustan- des exprimiert wird, umfassen. 

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   Es wird z.B. angenommen, dass TTX-resistente Natriumkanäle eine Schlüsselrolle bei der Übertragung von Nervenimpulsen spielen, die sich auf sensorische Inputs, wie Schmerz und Druck beziehen. Diese Information erleichtert die Entwicklung von Therapeutika, die spezifisch in Berei- che, wie das periphere Nervengewebe, geführt werden können. 



   Das rekombinante Protein der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um potentielle Therapeutika zu screenen, die die Fähigkeit haben, den interessierenden Natriumkanal zu hem- men. Insbesondere wäre es nützlich, selektiv die Funktion von Natriumkanälen in peripherem Nervengewebe zu hemmen, das für die Übermittlung von Schmerz- und Drucksignalen verantwort- lich ist, ohne gleichzeitig die Funktion der Natriumkanäle in anderen Geweben, wie Herz und Muskel, zu beeinflussen. Eine solche Selektivität würde die Behandlung von Schmerzen zulassen, ohne Nebenwirkungen zu verursachen aufgrund von Herz- oder neuromuskulären Komplikationen. 



  Es wäre daher nützlich, DNA-Sequenzen zur Verfügung zu haben, die Natriumkanäle codieren, die selektiv in peripherem Nervengewebe exprimiert werden. 
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Natriumkanäle in peripherem Nervengewebe spielen eine grosse Rolle in der Übertragung von Nervenimpulsen und daher sind sie ein Instrument, um die neuropathische Schmerzübertragung zu verstehen. Neuropathischer Schmerz lässt sich in zwei Komponenten aufteilen: Allodynie, bei der ein normalerweise nicht schmerzlicher Stimulus schmerzerzeugend wird und Hyperalgesie, wo ein gewöhnlicher normal schmerzerzeugender Stimulus, extrem schmerzvoll wird. 



   In Gewebelokalisierungsuntersuchungen kartiert PN5-mRNA kleine und mittlere Neurone von DRG. PN5-mRNA ist auch im Gehirn und Rückenmark vorhanden. Das Hemmen der Aktivitäten kann das Auftreten von Kopfschmerzen und Migräne verhüten helfen. Die Fähigkeit, die Aktivität dieser Natriumkanäle zu hemmen, d. h. die Übertragung von Nervenimpulsen zu vermindern, beeinflusst die Fähigkeit der Nerven, Schmerzimpulse zu übertragen. Die selektive Hemmung von Natriumkanälen in sensorischen Neuronen, wie DRG, lässt die Blockierung von Schmerzimpulsen zu, ohne Nebenwirkungen zu erzeugen, die durch die Hemmung von Natriumkanälen in anderen Geweben, wie Gehirn und Herz verursacht werden. Ausserdem werden bestimmte Krankheiten durch Natriumkanäle verursacht, die Impulse mit einer extrem hohen Frequenz erzeugen.

   Die Fähigkeit, die Aktivität des Kanals zu vermindern, kann dann die Krankheit eliminieren oder lindern. 



  Somit können potentielle therapeutische Verbindungen mit Methoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Aktivität des erfindungsgemässen rekombinanten Natriumkanals hemmen können. M. Barram et al., Naun-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 347, 125 bis 132 (1993) und E.T. McNeal. et al., J. Med. Chem. 28, 381 bis 388 (1985). Für ähnliche Studien mit dem Acetylcholinrezeptor siehe Claudio et al., Science 238,1688 bis 1694 (1987). 



   Z. B.   können   Schmerzen gelindert werden, indem die Aktivität des neuen, bevorzugt TTX- resistenten, Natriumkanals gehemmt wird, was umfasst, dass man eine therapeutisch wirksame 
 EMI9.2 
 le therapeutische Verbindungen werden identifiziert auf Basis ihrer Fähigkeit, die Aktivität von PN5 zu hemmen. Daher kann der vorher erwähnte Test verwendet werden, um Verbindungen mit einer therapeutisch wirksamen   1C50   zu identifizieren. 



   Der Ausdruck "IC50" bezieht sich auf die Konzentration einer Verbindung, die erforderlich ist, um die Aktivität von exprimiertem PN5 um 50% zu hemmen, wenn die Aktivität mit Elektrophysiologie, Strömungstests und Toxinbindungstests, wie oben erwähnt, gemessen wird. 



   6. Diagnostische Tests
Die Basistechniken der Molekularbiologie, die verwendet werden, um Merkmale der Erfindung zu erreichen, wie RNA-, DNA-und Plasmidisolierung, Restriktionsenzymverdau, Herstellung und Sondierung einer cDNA-Bibliothek, Sequenzierung von Klonen, Konstruktion von Expressionsvektoren, Transformation von Zellen, Aufrechterhaltung und Züchtung von Zellkulturen und andere allgemeine Techniken sind im Stand der Technik wohlbekannt und Beschreibungen dieser Techniken finden sich in üblichen Laborhandbüchern, wie Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989). 



   Z. B. können die Polynucleotide der Erfindung an ein "Reportermolekül" gebunden werden, um 

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 eine Polynucleotidsonde zu bilden, die für die Northern- und Southern-Blot-Analyse und für in-situ- Hybridisierungen nützlich ist. 



   Der Ausdruck "Reportermolekül" bezieht sich auf eine chemische Einheit, die mit einem geeig- neten Nachweismittel nachgewiesen werden kann, einschliesslich von spektrophotometrischen, chemilumineszierenden, immunochemischen und radiochemischen Mitteln, ohne, darauf be- schränkt zu sein. Die erfindungsgemässen Polynucleotide können an ein Reportermolekül mit im Stand der Technik wohlbekannten Techniken konjugiert werden. Typischerweise enthält das Re- portermolekül eine funktionelle Gruppe, die geeignet ist zur Bindung an oder zum Einbau in das Polynucleotid. Die funktionellen Gruppen, die zur Bindung der Reportergruppe geeignet sind, sind gewöhnlich aktivierte Ester oder Alkylierungsmittel. Details von Techniken, um Reportergruppen zu binden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. J.A. Matthews, A. Batki, C. Hynds und L. J. Kricka, Anal.

   Biochem. 151,205 bis 209 (1985) und Engelhardt et al., Europäische Patentan- meldung Nr. 0 302 175. 



   Somit sind die folgenden Beispiele nur erläuternd für Techniken, mit denen die Erfindung durchgeführt werden kann. 



   Abkürzungen 
Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet und haben die jeweils unten definierten Bedeutungen: 
BSA : Rinderserumalbumin   Denhardt's Lösung : BSA, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll (0,1 g BSA, 0,1 g   
Ficoll und 0,1 g Polyvinylpyrrolidon pro 500 ml) 
DRG : Ganglien der Dorsalwurzel 
EDTA: Tetranatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure 
MEN : 20 mM MOPS, 1 mM EDTA, 5 mM Natriumacetat, pH 7,0 
MOPS : 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (Sigma Chemical Company) 
PN5: Peripherer Nervennatriumkanal 5 
PNS : Peripheres Nervensystem 
SDS : Natriumdodecylsulfat 
SSC : 150 mM NaCI, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0 
SSPE : 80 mM NaCI, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM Ethylendiamintetraacetat, pH 8,0 
TEV : Zwei-Elektroden-Spannungsklemme 
TTX :

   Tetrodotoxin (Sigma Chemical Company) 
Beispiele 
Die folgenden Beispiele erläutern die Durchführung der Erfindung. 



   Materialien: 
Das Plasmid pBK-CMV wurde von Stratagene (La Jolla, CA) erhalten; das Plasmid pBSTA wird von Goldin et al. in Methods in Enzymology (Rudy & Iverson, Herausgeber), 207,279 bis 297 beschrieben ; das Plasmid pCIneo wurde von Promega (Madison, WI) erhalten und das Plasmid pCRll wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA) erhalten. 



   Das Oocyten-Expressionsvektor-Plasmid pBSTAcllr wurde aus pBSTA konstruiert durch Inser- tion eines synthetischen Oligonucleotidlinkers; Plasmid pKK232-8 wurde von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) erhalten; Plasmid pCrll wurde von Invitrogen, San Diego, CA erhalten. Die kom- petenten E. coli-Zellinien stbl2tm und SURE wurden von Gibco/BRL bzw. Stratagene erhalten. 



   Beispiel 1 
Gewinnung von RNA aus Ratten-DRG. Gehirn und Rückenmark 
Lumbal-DRG Nr. 4 und Nr. 5 (L4 und L5), Gehirn und Rückenmark wurden aus anästhesierten 

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 männlichen ausgewachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Präpariermikroskop entnommen. 



   Die Gewebe wurden in Trockeneis eingefroren und mit einem Polytron-Homogenisator homogeni- siert ; die RNA wurde mit dem Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren extrahiert (siehe Chomczynski et al., Anal. Biochemistry 162,156 bis 159 (1987)). Die gesamte RNA (5  g jeder Probe) wurde in 
MEN-Puffer gelöst, der 50% Formamid, 6,6% Formaldehyd enthielt, und bei 65 C 5 bis 10 Minuten lang denaturiert. Die RNA wurde elektrophoretisch behandelt mit einem 0,8% Agarosegel, das 8,3% Formaldehyd in MEN-Puffer enthielt. Der Elektrodenpuffer war MEN-Puffer, der 3,7% Form- aldehyd enthielt ; das Gel wurde mit 50 Volt 12 bis 18 Stunden lang laufen gelassen. 



   Grössenmarker, einschliesslich ribosomale 18S- und 28S-RNA und RNA-Marker (GIBCO BRL) wurden in parallelen Bahnen des Gels laufen gelassen. Ihre Positionen wurden bestimmt, indem die ausgeschnittene Bahn mit Ethidiumbromid (0,5   g/ml)   gefärbt wurde und anschliessend unter UV-Licht photographiert wurde. 



   Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 2 x SSC gespült und die RNA wurde auf eine   Duralose-Membran (Stratagene) überführt mit 20 x SSC durch Kapillarwirkung ; Membran   wurde im Vakuum bei 80 C 1 Stunde lang gebacken. 



   Beispiel 2 
Sonde aus Rattengehirn IIA 
Eine mit   32P-markierte   cRNA-Sonde, die komplementär zu den Nucleotiden 4637 bis 5868 der Sequenz der Natriumkanal-a-Untereinheit von Rattengehirn IIA war, wurde in vitro mit T7-RNA- Polymerase (Pharmacia) synthetisiert unter Verwendung von pEAF8-Matrizen-DNA (Noda et al., Nature 320,188 bis 192 (1986)), die mit BstEll linearisiert worden war. 



   Die Protokolle für jedes oben erwähnte Verfahren finden sich in Molecular Cloning: A Laborato- ry Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989). 



   Beispiel 3 
Hvbridisierunq von RNA mit der Sonde aus Rattenqehirn IIA 
Die Membran von Beispiel 1 wurde 16 Stunden bei 42 C mit 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1,1 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma- DNA (1 mg/ml) prähybridisiert. Die Membran wurde in 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natrium- phosphat, pH 7,1,1 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma-DNA (200   g/ml)   mit der 32P-markierten cRNA-Sonde (ca. 1 bis 3 x 106 cpm/ml), wie in Beispiel 2 be- schrieben, 18 Stunden lang bei 42 C hybridisiert. 



   Die Membran wurde mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gespült und dann aufeinander folgend mit 2 x SSC,   0,1 %   SDS bei 55 C 30 Minuten lang, 0,2 x SSC,   0,1 %   SDS bei 65 C 30 Minuten lang, 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 70 C 30 Minuten lang und 0,2 x SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat bei 70 C 20 Minuten lang gewaschen. Der Filter wurde einem Kodak X-omat AR Film bei -80 C mit verstärkenden Schirmen bis zu 2 Wochen lang ausgesetzt. 



   Die pEAF8-Sonde hybridisierte mit mRNAs in der DRG-Probe mit Grössen von 11 kb, 9,5 kb, 7,3 kb und 6,5 kb, abgeschätzt auf Basis der Position relativ zu den Standards. 



   Beispiel 4 
Neue Natriumkanal-Domäne-IV-Sonde 
Die Sonde wurde wie folgt erhalten- eine RT-PCR wurde durchgeführt an RNA, die aus Ratten- DRG isoliert wurde unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotidprimern, die auf Basis der Homologie zwischen bekannten Natriumkanälen in Domäne IV entwickelt wurden. Die Produkte der Domäne IV wurden in einem Plasmidvektor kloniert in E. coli transformiert und einzelne Kolo- nien isoliert. Die für die Domäne IV spezifischen PCR-Produkte, die aus verschiedenen dieser Kolonien erhalten worden waren, wurden einzeln sequenziert.

   Die klonierte neue Sequenz der 

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 Domäne IV war wie folgt (SEQ ID Nr. 4): 1 CTCAACATGG TTACGATGAT GGTGGAGACC GACGAGCAGG GCGAGGAGAA 51 GACGAAGGTT CTGGGCAGAA TCAACCAGTT CTTTGTGGCC GTCTTCACGG 101 GCGAGTGTGT GATGAAGATG TTCGCCCTGC GACAGTACTA TTTCACCAAC 151 GGCTGGAACG TGTTCGACTT CATAGTGGTG ATCCTGTCCA TTGGGAGTCT 201 GCTGTTTCT GCAATCCTTA AGTCACTGGA AAACTACTTC TCCCCGACGC 251 TCTTCCGGGT CATCCGTCTG GCCAGGATCG GCCGCATCCT CAGGCTGATC 301 CGAGCAGCCA AGGGGATTCG CACGCTGCTC TTCGCCCTCA TGATGTCCCT 351 GCCCGCCCTC TTCAACATCG GCCTCCTCCT CTTCCTCGTC ATGTTCATCT 401 ACTCCATCTT CGGCATGGCC AGCTTCGCTA ACGTCGTGGA CGAGGCCGGC 451 ATCGACGACA TGTTCAACTT CAAGACCTTT GGCAACAGCA TGCTGTGCCT 501 GTTCCAGATC ACCACCTCGG CCGGCTGGGA CGGCCTCCTC AGCCCCATCC 551 TCAACACGGG GCCTCCCTAC TGCGACCCCA ACCTGCCCAA AGCAACGGC 601 TCCCGGGGGA ACTGCGGGAG CCCGGCGGTG GGCATCATCT TCTTCACCAC 651 CTACATCATC ATCTCCTTCC 

  TCATCGTGGT CAACATGTAT ATCGCAGTCA 701 TC 
Diese Sequenz wurde durch Random-Priming mit 32P markiert. 



   Beispiel 5 
Hybridisierung von RNA mit der neuen Natriumkanal-3'-UTR-Sonde 
Ein Northern-Blot wurde vorbereitet mit 10  g Gesamt-RNA aus Rattengehirn, Rückenmark und DRG. Der Blot wurde mit einer cRNA-Sonde aus der 3'-UTR hybridisiert. Die 3'-UTR wurde in einen pSP73-Vektor kloniert, die cRNA unter Verwendung eines Trans Probe T-Kits (Pharmacia Biotech) und von 32P-UIP transkribiert. Der Blot wurde 2 Stunden lang bei 65 C in einer Lösung, die 5 x SSC, 1 x Denhardt' s Lösung, 0,5% SDS, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, Lachssperma- DNA (1   mg/ml)   und 50% Formamid enthielt, vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 45 C 18 Stunden lang in der obigen Lösung durchgeführt, ausser dass die Lachs sperma-DNA in einer Kon- zentration von 20  g/ml enthalten war, und die mit 32P markierte Sonde wurde mit 7,5 x 105 cpm/ml Lösung zugegeben.

   Der Blot wurde anschliessend dreimal mit 2 x SSC und 0,1% SDS bei Raum- temperatur, einmal mit 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 65 C 20 Minuten lang, und einmal mit 0,2 x SSC, 0,1% SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat bei 65 C 20 Minuten lang gewaschen. Der Blot wurde mit einem Phospholmager (BioRad) nach 2-tägiger Belichtung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass ein -6,5 kb Bandensignal, in Gehirn vorhanden war, nur in der Bahn, die die RNA von DRG enthielt. Wegen der geringeren Menge von PN5-mRNA, die durch den RT-PCR-Versuch gezeigt wurde, war die 6,5-kb-Bande in Gehirn und Rückenmark nicht nachweisbar. 



   Beispiel 6 
Konstruktion und Screenen einer cDNA-Bibliothek von Ratten-DRG 
Eine an EcoR1 angepasste cDNA-Bibliothek wurde aus der Ratten-DRG-poly (A) +-RNA von ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten erstellt unter Verwendung des SuperScript Choice Systems (GIBCO BRL). cDNA ( > 4 kb) wurde mit einer Fraktionierung mit Saccharosegra- dient ausgewählt, wie von Kieffer, Gene 109,115 bis 119 (1991) beschrieben. Die cDNA wurde 
 EMI12.1 
 Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt. In ähnlicher Weise wurde eine > 2 kb-DRG-cDNA- Bibliothek synthetisiert. Mit 
Der Phage (3,5 x 105) wurde mit Filterhybridisierung mit einer mit 32P-markierten Sonde (rBlla, Basen 4637 bis 5868 gemäss Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988)) gescreent.

   Die Filter wur- den in 50% Formamid, 5 x SSPE, 5 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 250   pg/ml   denaturierter Lachssperma-DNA und 50 mM Natriumphosphat bei 42 C hybridisiert und in 0,5 x SSC/0,1% SDS bei 50 C gewaschen. 

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   Southern Blots von mit   EcoRI   verdauten Plasmiden wurden mit der mit 32P markierten DNA- Sonde (SEQ ID Nr. 4) hybridisiert. Die Filter wurden dann in 50% Formamid, 6 x SSC, 5 x Den- hardt's Lösung, 0,5% SDS und 100  g/ml denaturierter Lachssperma-DNA bei 42 C hybridisiert und in 0,1x   SSC/0,1%   SDS bei 65 C gewaschen. 



   Positive Klone wurden in vivo abgetrennt in pBK-CMV unter Verwendung des ExAssist/XLOLR- Systems (Stratagene). 



   Beispiel 7 
Klone und Nucleotidanalyse cDNA-Klone, 26. 2 und 25. 1, wurden aus der > 4 kb-DRG-cDNA-Bibliothek isoliert und der Klon 1. 18 wurde aus der > 2 kb-DRG-cDNA-Bibliothek isoliert. Durch Sequenzanalyse schien 26. 2 eine cDNA voller Länge zu sein, die einen neuen Natriumkanal codiert und 25. 1 erstreckte sich von Domäne ll zu der 3'-UTR. Jedoch hatte jeder eine Deletion, die die codierende Region trunkierte. 



  Klon 1. 18 hatte die 3'-untranslatierte Region zusätzlich zu dem C-Terminus der abgeleiteten Ami- nosäuresequenz von PN5. Das Konstrukt in dem Expressionsvektor   pBSTACIIr   bestand aus den Sequenzen von 26. 2 und 1.18. 



   Die PN5-Homologie mit anderen bekannten Natriumkanälen wurde erhalten unter Verwendung des GAP/Best Fit (GCG) Programms : 
 EMI13.1 
 
<tb> Kanal <SEP> % <SEP> Ähnlichkeit <SEP> % <SEP> Identität
<tb> 
<tb> PN3a <SEP> 71 <SEP> 54
<tb> 
<tb> 
<tb> hPN3 <SEP> 71 <SEP> 55
<tb> 
<tb> 
<tb> PN4 <SEP> 71 <SEP> 53
<tb> 
<tb> 
<tb> PN4a <SEP> 71 <SEP> 53
<tb> 
<tb> 
<tb> PN1 <SEP> 72 <SEP> 55
<tb> 
<tb> 
<tb> Rattengehirn <SEP> Typ <SEP> I <SEP> 72 <SEP> 55
<tb> 
<tb> 
<tb> Rattengehirn <SEP> Typ <SEP> 11 <SEP> 71 <SEP> 54
<tb> 
<tb> 
<tb> Rattengehirn <SEP> Typ <SEP> lll <SEP> 71 <SEP> 54
<tb> 
<tb> 
<tb> Rattenherzkanal <SEP> 73 <SEP> 56
<tb> 
<tb> 
<tb> Rattenskelettmuskelkanal <SEP> 71 <SEP> 53
<tb> 
 
Stabilisierung der PNS-cDNA voller Länge 
A. Medien.

   E. coli-Zellinien und Wachstumsbedingungen 
Das Wachstum von Fragmenten von PN5 wurde unter den folgenden Standardbedingungen erreicht ; das Wachstum von Plasmiden, die Konstrukte mit PN5 in voller Länge enthielten (in   pClneo,     pBSTAcllr   und anderen Vektoren) konnte nicht ohne Verwendung spezieller Wachstums- medien, Bedingungen und E. coli-Stämme erreicht werden.

   Die folgenden Bedingungen erwiesen sich als optimal: 
 EMI13.2 
 nen und für die Züchtung in grossem Massstab; (2) feste Medien waren 1/2 x FM (siehe unten) plus 1 x LB (Trypton, 1%, Hefeextrakt 0,5%, 
NaCI, 0,5%) plus 15 g/l Agar oder 1 x FM plus 1/2 x LB; (3) flüssige Medien waren optimalerweise 1 x FM plus 1/2 x LB; (4)   Carbenicillin,   100  g/ml wurde für alle Medien verwendet, da es weniger schnell als Ampi- cillin metabolisiert wird ; (5) die Temperatur für das Wachstum sollte nicht höher als 30 C sein, gewöhnlich 24 bis 
26 C; dies erfordert längere Wachstumsperioden als normalerweise angewendet von 24 bis 72 Stunden. 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 



   2 x Friermedium (2 x FM): 
K2HP04 12,6 g 
Na3Citrat 0,9 g   MgS04   7 H20 0,18   (NH4)2S04 1,8 g    
KH2P04 3,6 g   Glycerol 88 g   
H20 auf 1 I 
2 x FM und die verbleibenden Medienkomponenten werden getrennt, vorbereitet, durch Auto- klavieren sterilisiert, auf mindestens 60 C gekühlt und zusammengegeben, um das fertige Medium zu bilden. Carbenicillin wird hergestellt mit 25 mg/ml H20 und durch Filtration sterilisiert. 2 x FM wurde zuerst beschrieben zur Herstellung von gefrorenen Vorräten von Bakterienzellen (Practical Methods in Molecular Biology, R. F. Schleif und P.C. Wensink, Springer Verlag, New York (1981), Seiten 201 bis 202). 



     B.   Expressionsvektoren 
Um der cDNA mit voller Länge eine erhöhte Stabilität zu verleihen, wurde der Oozyten- Expressionsvektor   pBSTAcllr   modifiziert, um die Plasmidkopienzahl zu vermindern, wenn er in E. coli gezüchtet wurde, und um möglicherweise die Transkription von Vektorsequenzen, die zu der toxischen kryptischen Expression von PN5-Protein führen könnten, zu vermindern, J. Brosius, Gene 27,151 bis 150 (1984). pBSTAcllr wurde mit Pvull verdaut.

   Das 755 bp-Fragment, das den T7-Promotor,   &num;-Globin-5'-UTR,   die multiple Klonierungsstelle,   &num;-Globin-3'-UTR   und den T3-Promo- tor enthielt, wurde mit dem 3,6 kb-Fragment, das den Replikationsursprung, das Ampicillin- 
 EMI14.1 
 vollständig mit Smal und teilweise mit Pvull-Gemisch verdaut worden war, ligiert und mit intestina- ler Phosphatase von Krabben behandelt, um die Selbstligierung zu verhindern. Das entstehende Plasmid, in dem die Orientierung des pBSTA-Fragmentes so ist, dass der T7-Promotor proximal zu 
 EMI14.2 
 net. Wie im Fall von pBSTA sind die Richtung der Transkription des Ampicillin-Resistenzgens und des Replikationsursprungs von pHQ8 entgegengesetzt der der Genexpressionskassette und die 
 EMI14.3 
 Promotor gesteuerten Expressionskassette vermindern. 



   C. Zusammenfügung von cDNA voller Länge für die Expression
Da pBK-CMV.26.2 eine Deletion von 58 bp hatte (entsprechend dem bp 4346 bis 4403 von SEQ ID Nr. 1) und die Sequenz von pBK-CMV.1.18 bei bp 4180 von SEQ ID Nr. 1 beginnt, könnte pBK-CMV. 1.18 verwendet werden, um pBK-CMV. 26.2 zu "reparieren". Es wurde eine Strategie entwickelt, um eine cDNA voller Länge zusammenzusetzen aus den Klonen pBK-CMV. 26.2 und pBK-CMV. 1.18 in drei Sektionen, wobei die 5'- und 3'-UTRs trunkiert wurden und eine einzige Restriktionsstelle an den 5'- und 3'-Enden in dem Verfahren eingeführt wurde. Das 5'-Ende wurde erzeugt durch PCR aus 26. 2, Trunkieren des 5'-UTRs durch Einbau einer Sall-Stelle direkt stromaufwärts des Start-Codons. Der Zentralbereich war ein Restriktionsfragment von 26. 2.

   Das 3'-Ende wurde hergestellt durch überlappende PCR sowohl aus 26.2 als auch 1.18 und Einbau einer XbalStelle direkt stromabwärts des Stopcodons. Diese Bereiche wurden an den einzelnen Restriktionsstellen verdaut und in   pBSTAcllr   eingesetzt. Obwohl dieses Konstrukt eine korrekte Sequenz zu haben schien, wurden beim erneuten Klonieren als Sall-Xbal-Fragment in   pCIneo   zwei Arten von Isolaten gefunden, eines mit einer Deletion und eines mit einer 8 bp-Insertion. Die erneute Untersuchung des   pBSTAcllr-Klons   zeigte, dass die Sequenz in diesem Bereich "gemischt" war, sodass der Klon sich umgelagert haben musste. Die 8 bp-Insertion erwies sich als Sequenzwiederholung eines der Mitglieder einer 8 bp-Verdoppelung in der nativen Sequenz, was eine dreifache Sequenzwiederholung von 8 bp in dem umgelagerten Isolat bildete.

   Zahlreiche Klonierungsversuche führten unausweichlich zu dieser Umlagerung. Überlappende PCR wurde verwendet, um stille Mutationen in eine der 8 bp-Sequenzwiederholungen einzuführen und ein Fragment, das diese Region enthielt, war enthalten, als die PN5-codierende Region in HQ8 eingesetzt wurde, die Versi 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 on mit niedriger Kopienzahl von pBSTAcllr, was Plasmid HR-1 ergab. Diese Sequenz erwies sich als stabil (siehe Figuren 5A bis E, SEQ ID Nr. 5). 



   Das 5'-Ende des Fragmentes wurde mit PCR gebildet unter Verwendung von pBK-CMV.26.2-
DNA als Matrize und der Primer 4999   (CTTGGTCGACTCTAGATCAGGGTGAAGATGGAGGAG  
Sall-Stelle unterstrichen, PN5-Homologie kursiv, entsprechend bp 58 bis 77 von SEQ ID Nr. 1,
Initiationscodon fett) und 4927 (GGGTTCAATGTGGTTTTATCT entsprechend bp 1067 bis 1047 von SEQ. ID Nr. 1), gefolgt von einer Gelreinigung, Verdau mit Sall und Kpnl (Kpnl-Stelle bei pb
1003 bis 1008, SEQ ID Nr. 1) und Gelreinigung. 



   Das zentrale 3. 1 kb-Fragment wurde hergestellt durch Verdau von pBK-CMV. 26.2-DNA mit
Kpnl und Aatll (Aatll-Stelle bei 4133 bis 4138) und anschliessende Gelreinigung. 



   Das 3'-Ende des Fragmentes wurde wie folgt hergestellt: PCR unter Verwendung der Primer
4837 (TCTGGGAAGTTTGGAAG entsprechend bp 3613 bis 3629 von SEQ. ID Nr. 1) und 4931 (GACCACGAAGGCTATGTTGAGG entsprechend bp 4239 bis 4218 von SEQ ID Nr. 1) auf pBK-
CMV. 26.2-DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 0,6 kb. Eine PCR unter Verwendung der
Primer 4930 (CCTCAACATAGCCTTCGTGGTC entsprechend bp 4218 bis 4239 von SEQ. ID Nr.
1) und 4929 (GTCTTCTAGATGAGGGTTCAGTCATTGTG Xbal-Stelle unterstrichen, PN5-Homolo- gie kursiv, entsprechend pb 5386 bis 5365 von SEQ ID Nr. 1; Stop-Codon fett) auf pBK-CMV.1.18-
DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 1,2 kb, das eine Xbal-Stelle 7 bp vom Stop-Codon ent- fernt einführte. Somit ist das 3'-Ende des 4837 bis 4931-Fragmentes exakt komplementär zu dem
5'-Ende des 4930 bis 4929-Fragments.

   Diese zwei Fragmente wurden mit Gel gereinigt und eine
Fraktion jeweils als Matrize in einer PCR-Reaktion vereinigt unter Verwendung der Primer 4928 (CAAGCCTTTGTGTTCGAC entsprechend bp 4084 bis 4101 von SEQ ID Nr. 1) und 4929, was ein
Fragment mit 1,3 kb ergab. Dieses Fragment wurde mit Gel gereinigt mit Aatll und Xbal verdaut und das 1,2 kb-Fragment wurde mit Gel gereinigt. 



   Das Fragment des 3'-Endes wurde in mit Aatll und Xbal verdautem pBSTAcllr kloniert. Ein Iso- lat wurde mit Sall und Kpnl verdaut und mit dem 5'-Ende-Fragment liqiert. Das entstehende Plas- mid wurde nach Bestätigung der Sequenz mit Kpnl und Aatll verdaut und mit dem zentralen 3,1 kb-
Fragment ligiert unter Bildung von pBSTAcllr.PN5 (Klon 21). pBSTAcllr.PN5 (Klon 21) wurde mit Sall und Xbal verdaut, um das 5,3 kb-PN5-Fragment freizusetzen, das in mit Sall und Xbal verdautem   pClneoll   kloniert wurde. Multiple Isolate wurden gefunden, von denen GPII-1, das vollständig sequenziert wurde, typisch war und ein 8 bp-Insert enthielt. Dieses CAGAAGAA nach pb 3994 von SEQ ID Nr. 1 wandelte die direkte Wiederholung dieser Sequenz an diesem Ort in eine dreifache direkte Wiederholung um, was eine Verschiebung des Leserahmens verursachte.

   In einem Versuch, diesen Mangel zu beheben, wurde pBSTAcllr.PN5 (Klon 21) mit Nhel (bp 2538 bis 2543 SEQ ID Nr. 1) und Xhol (bp 4828 bis 4833, SEQ. ID Nr. 1) verdaut, was ein 6,2 kb-Fragment lieferte, und mit Aatll und Xhol verdaut, was ein 0,7 kb-Fragment lieferte, das mit dem 1,6 kpFragment, das durch den Verdau von pBK-CMV. 26.2 mit Aatll und Nhel entstand, ligiert wurde. Obwohl keine Isolate gefunden wurden, die vollständig korrekt waren, hatte ein Isolat, HA-4, nur eine einzige Basenveränderung, die Deletion von C an bp 4827 (SEQ ID Nr. 1), benachbart der Xhol-Stelle. 



   Um zu verhindern, dass die Umlagerung des 8 bp-Inserts auftrat, wurden drei stumme Mutationen eingeführt in die 5'-Sequenzwiederholung und zwei weitere Mutationen in einem Strang von Ts sollten auch eingeführt werden, wie unten gezeigt (bp 3982 bis 4014, SEQ, ID Nr. 1, Mutationsstellen unterstrichen, 8 bp-Sequenzwiederholungen in der nativen Sequenz kursiv): 
Nativ GAC ATT TTT ATG ACA GAA GAA CAG AAG AAA TAT 
Asp lle Phe Met Thr Glu Glu Gin Lys Lys Tyr 
Mutante GAC ATC TTC ATG ACT GAG GAG CAG AAG AAA TAT 
Da Isolat HA-4 die native direkte Wiederholungssequenz aufwies (im Gegensatz z. B. zu pBSTAcllr.PN5 (Klon 21)) und der Bereich in der Nähe des Xhol-Defekts nicht betroffen war, wurde es als Matrizen-DNA für die folgenden PCR-Reaktionen verwendet.

   Der Primer P5-3716S (CCGAAGCCAATGTAACATTAGTAATTACTCGTG entsprechend pb 3684 bis 3716, SEQ ID Nr. 1) 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 wurde mit Primer P5-3969AS (GCTCCTCAGTCATGAAGATGTCTTGGCCACCTAAC entspre- chend bp 4003 bis 3969, SEQ ID Nr. 1) mutierte Basenunterstrichen) gepaart, was ein 320 bp-Produkt lieferte. Der Primer P5-4017S (GGCCAAGACATCTTCATGACTGAGGAGCAGAAGAAATATTAC entsprechend bp 3976 bis 4017, SEQ ID Nr. 1, mutierte Basen sind unterstrichen) wurde mit Primer P5-4247AS 4247AS (CTCAAAGCAAAGACTTTGATGAGACACTCTATGG entsprechend bp 4280 bis 4247, SEQ ID Nr. 



    1)   gepaart, was ein 305 bp-Produkt lieferte. Das 3'-Ende des 320 bp-Fragmentes stimmte somit in 28 bp exakt mit dem 5'-Ende des 305 bp-Fragmentes überein. Die zwei Banden wurden mit Gel gereinigt und eine Fraktion jeweils in einer neuen PCR-Reaktion mit den Primern P5-3716S und P5-4247AS vereinigt, was ein 597 bp-Produkt lieferte, das T/A-kloniert wurde im Vektor pCRll. Es wurde gefunden, dass das Isolat HO-7 die gewünschte Sequenz hatte.

   Eine Vierwege-Ligierung wurde durchgeführt, um den modifizierten PN5 mit voller Länge zusammenzusetzen: Der Oozyten- Expressionsvektor HQ-8 wurde mit Sall und Xbal verdaut, was ein 4,4 kb-Vektorfragment lieferte; GPII-1 wurde mit Sall und Mlul verdaut, was ein 3,8 kb-Fragment lieferte, das die 5'-Hälfte von PN5 enthielt ; HO-7 wurde mit Mlul (bp 3866 bis 3871, SEQ ID Nr. 1) und Aatll verdaut, was ein 0,3 kb- Fragment lieferte, das die mutierte 8 bp-Repeatregion von PN5 enthielt; GPII-1 wurde mit Aatll und Xbal verdaut, was den verbleibenden 1,3 kb-3'-Teil von PN5 lieferte. Ein Teil der Ligierungsreakti- on wurde in E. coli Stable-2-Zellen transformiert. Von den 9,6   kb-Isolaten,   die alle vier Fragmente enthielten, wurde HR-1 sequenziert und es wurde gefunden, dass es die gewünschte 5,4 kb- Sequenz hatte.

   Diese Isolate wuchsen gut und zeigten keine Tendenz zu einer Umlagerung. Die Sequenz dieser bearbeiteten Version von PN5 ist in den Figuren 5A bis E gezeigt (SEQ ID Nr. 5). 



   Beispiel 8 
Menschliches PN5 
Ein 856 bp-Klon (Figur 3A, SEQ ID Nr. 3) wurde aus einer cDNA-Bibliothek der menschlichen Ganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, die am nächsten verwandt ist mit Ratten-PN5 mit 79% Identität der Aminosäuresequenz. Die menschliche PN5-Sequenz überspannt die Region zwischen IIIS1 und der Interdomäne   III/IV,   die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d. h. IEM) einschliesst, die innerhalb der Interdomäne   III/IV   angeordnet ist. 



   Die menschliche DRG-cDNA-Bibliothek wurde aus Lumbal4- und 5-DRG Gesamt-RNA kon- struiert, die statistisch geprimet wurde. cDNA des ersten Strangs wurde mit SuperScriptll reverse Transkriptase (GIBCO BRL) synthetisiert und die Synthese des zweiten Strangs erfolgte mit T4- DNA-Polymerase. EcoRI-Adapter wurden an die Enden der doppelsträngigen cDNA ligiert und die Fragmente in dem ZAPII-Vektor (Stratagene) kloniert. Die Bibliothek wurde mit mit Digoxigenin markierten Ratten-PN3-, Ratten-PN1- und menschlichen Herz hH1-Sonden gescreent. Positive Klone wurden sequenziert und mit bekannten menschlichen und Rattennatriumkanalsequenzen verglichen. Nur der vorher erwähnte Klon wurde als menschliche PN5-Sequenz identifiziert. 
 EMI16.1 
 
<tb> 



  Kanal. <SEP> % <SEP> Ähnlichkeit <SEP> % <SEP> Identität
<tb> 
<tb> Menschliches <SEP> Gehirn <SEP> (HBA) <SEP> 76 <SEP> 69
<tb> 
<tb> Menschliches <SEP> Herz <SEP> (hH1) <SEP> 81 <SEP> 74
<tb> 
<tb> Menschliches <SEP> atypisches <SEP> Herz <SEP> 60 <SEP> 52
<tb> Menschlicher <SEP> Skelettmuskel <SEP> 80 <SEP> 71
<tb> 
<tb> Menschliches <SEP> Neuroendokrin <SEP> 78 <SEP> 71
<tb> 
<tb> Menschliches <SEP> PN3 <SEP> 77 <SEP> 70
<tb> 
<tb> Ratten-PN1 <SEP> 79 <SEP> 72
<tb> 
<tb> Ratten-PN3 <SEP> 78 <SEP> 71
<tb> 
<tb> Ratten-PN4 <SEP> 78 <SEP> 70
<tb> 
<tb> Ratten-PN5 <SEP> 86 <SEP> 79
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 
Figur 3B vergleicht die Aminosäuresequenz des hPN5-Fragmentes mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 in der geeigneten Regicn. 



   Beispiel 9 
 EMI17.1 
 
Gehirn-, Wirbelsäulen-, DRG-, Knotenganglien-, obere Zervikalganglien-, Ischiasnerv-, Herz- und Skelettmuskelgewebe wurden aus anästhesierten normalen ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten isoliert und bei -80 C aufbewahrt. Die RNA wurde aus jedem Gewebe isoliert unter Verwendung von RNAzol (Tel-Test, Inc.). Statistisch geprimete cDNA wurde umge- kehrt transkribiert aus 500 ng RNA aus jedem Gewebe. Der Vorwärtsprimer (CAGATTGTGTTCTCAGTACATTCC) und der Rückwärtsprimer (CCAGGTGTCTAACGAATAAATAGG) wurden aus dem 3'-untranslatierten Bereich erzeugt, was ein 252-Basenpaar-Fragment lieferte. Die Zyklusparameter waren : 94 C/2 min (Denaturierung), 94 C/30 s, 65 C/30 s und 72 C/1 min (35 Zyklen) und 72 C/4 min. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 4% Agarosegel analysiert. 



   Eine positive Kontrolle und eine Kontrolle ohne Matrize waren auch enthalten. cDNA aus jedem Gewebe wurde auch mit PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, die spezifisch für Glyce- rinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase sind, um die Lebensfähigkeit der Matrize zu zeigen, wie von Tso et al., Nucleic Acid Res. 13,2485 bis 2502 (1985) beschrieben. 



   Das Gewebeverteilungsprofil von rPN5 durch Analyse der RNA aus ausgewählten Rattenge- weben mit RT-PCR war wie folgt: 
 EMI17.2 
 
<tb> Gewebe <SEP> RT-PCR <SEP> (35 <SEP> Zyklen)
<tb> 
<tb> 
<tb> Gehirn <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> Rückenmark <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> DRG <SEP> +++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Knotenganglien <SEP> +++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Obere <SEP> Zervikalganglien <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> Ischiasnerv <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Herz-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Skelettmuskel <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> F11-unbehandelt <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> F11-behandelt <SEP> +
<tb> 
 
PN5 wurde auch nach nur 25 Zyklen   (24 + 1)   in den gleichen 5 Geweben, wie oben, in der gleichen relativen Häufigkeit nachgewiesen. 



   Beispiel 10 
Antikörper 
Ein synthetisches Peptid (26 Aminosäuren in der Interdomäne ll und ll. Reste 977 bis 1002) wurde mit KLH konjugiert und Antikörper in Kaninchen erzeugt. Das Antiserum wurde anschlie- &num;end durch Affinität gereinigt. 



   PN5 bildet eine Unterfamilie von neuen Natriumkanalgenen; diese Gene sind verschieden von solchen, die mit anderen Sonden nachweisbar sind (z. B. PEAF8 und PN3-Sonden). 



   Obwohl die vorhergehende Erfindung im Detail durch Erläuterung, und Beispiele zur besseren Klarheit und zum besseren Verständnis beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können innerhalb des Schutzbereichs der beigefügten Ansprüche. 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 



   SEQUENZPROTOKOLL (1) 1) ALLGEMEINE INFORMATION: (i) ANMELDER:    (A) NAME : HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) STRASSE : 124   (C) ORT: Basel (D) STAAT :    (E) LAND : (F) POSTLEITZAHL (ZIP): CH-4010   (G) TELEPHON :    (H) TELEFAX : 061-6881395(I) TELEX : 962292/965542 hlr ch   (ii) ANMELDETITEL: 
Nucleinsäure, die einen Nervengewebe-Natriumkanal kodiert (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN :   (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:   (A)   DATENTRÄGER   Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE:   Patentin   Release &num; 1.0, Version &num; 1.30 (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 1. 



   (i) SEQUENZ CHARACTERISTICA: (A) LÄNGE: 5908 Basenpaare (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE' linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: Nein (iv) ANTI-SENSE: Nein (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS :    (F) ART DES GEWEBES: Ganglien der Dorsalwurzel (G) ART DER ZELLE :

   Nerv   (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG- SEQ ID NO : 1: 
1 GAAGTCACAG GAGTGTCTGT CAGCGAGAGG AAGAAGGGAG AGTTTACTGA 
51 GTGTCTTCTG CCCCTCCTCA GGGTGAAGAT GGAGGAGAGG TACTACCCGG 101 TGATCTTCCC GGACGAGCG AATTTCCGCC CCTTCACTTC CGACTCTCTG 151 GCTGCCATAG AGAAGCGGAT TGCTATCCAA AAGGAGAGG AAAGTCCAA 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 
201 AGACAAGGCG GCAGCTGAGC CCAGCCTCG GCCTCAGCTT GACCTAAAGG 
251 CCTCCAGGAA GTTACCTAAG CTTTATGGTG ACATTCCCCC TGAGCTTGTA 
301 GCGAAGCCTC TGGAAGACCT GGACCCATTC TACAAAGACC ATAAGACATT 
351 CATGGTGTTG AACAAGAAGA GAACAATTTA TCGCTTCAGC GCCAAGCGGG 
401 CCTTGTTCAT TCTGGGGCCT TTTAATCCCC TCAGAAGCTT AATGATTCGT 
451 ATCTCTGTCC ATTCAGTCTT TAGCATGTTC ATCATCTGCA CGGTGATCAT 
501 CAACTGTATG TTCATGGCGA ATTCTATGGA GAGAAGTTTC GACAACGACA 
551 TTCCCGAATA CGTCTTCATT GGGATTTATA TTTTAGAAGC TGTGATTAAA 
601 ATATTGGCAA GAGGCTTCAT TGTGGATGAG TTTTCCTTCC TCCGAGATCC 
651 GTGGAACTGG CTGGACTTCA 

  TTGTCATTGG AACAGCGATC GCAACTTGTT 
701 TTCCGGGCAG CCAAGTCAAT CTTTCAGCTC CTTTCAGCTC CCGAGTGTTC 
751 AGAGCTCTGA AGGCGATTTC AGTTATCTCA GGTCTGAAGG TCATCGTAGG 
801 TGCCCTGCTG CGCTCGGTGA AGAAGCTGGT AGACGTGATG GTCCTCACTC 
851 TCTTCTGCCT CAGCATCTTT GCCCTGGTCG GTCAGCAGCT GTTCATGGGA 
901 ATTCTGAACC AGAAGTGTAT TAAGCACAAC TGTGGCCCCA ACCCTGCATC 
951 CAACAAGGA TTGCTTTGAAA AGGAAAAAGA TAGCGAAGAC TTCATAATGT 1001 GTGGTACCTG GCTCGGCAGC AGACCCTGTC CCAATGGTTC TACGTGGAT 1051 AAAACCACAT TGAACCCAGA CAATAATTAT ACAAAGTTTG ACAACTTTGG 1101 CTGGTCCTTT CTCGCCATGT TCCGGGTTAT GACTCAAGA TCCTGGGAG 1151 GGCTTTACCG ACAGATCCTG CGGACCTCTG GGATCTACTT TGTCTTCTTC 1201 TTCGTGGTGG TCATCTTCCT GGGCTCCTTC TACCTGCTTA ACCTAACCCT 1251 GGCTGTTGTC ACCATGGCTT ATGAAGAACA GAACAGAAAT GTAGCTGCTG 1301 AGACAGAGGC CAAGGAGAAA ATGTTTCAGG AAGCCCAGC GCTGTTAAGG 1351 GAGGAGAAGG AGGCTCTGGT TGCCATGGGA ATTGACAGAA GTTCCCTTAA 1401 TTCCCTTCAA 

  GCTTCATCCT TTTCCCCGAA GAAGAGGAA TTTTCGGTA 1451 GTAAGACAAG AAAGTCCTTC TTTATGAGAG GGTCCAAGA GGCCCAAGCC 1501 TCAGCGTCTG ATTCAGAGGA CGATGCCTCT AAAAATCCAC AGCTCCTTGA 1551 GCAGACCAAA CGACTGTCCC AGAACTTGCC AGTGGATCTC TTTGATGAGC 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 
1601 ACGTGGACCC CCTCCACAGG CAGAGAGCGC TGAGCGCTGT CAGTATCTTA 
1651 ACCATCACCA TGCAGGAACA AGAAAAATTC CAGGAGCCT GTTTCCCATG 
1701 TGGGAAAAAT TTGGCCTCTA AGTACCTGGT GTGGGACTG AGCCCTCAGT 1751 GGCTGTGCAT AAAGAAGGTC CTGCGGACCA TCATGACGG TCCCTTTACT 1801 GAGCTGGCCA TCACCATCTG CATCATCATC AATACCGTTT TCTTAGCCGT 1851 GGAGCACCAC AACATGGATG ACAACTTAAA GACCATACT AAAATAGGAA 1901 ACTGGGTTTT CACGGGAATT TTCATAGCGG AAATGTGTCT CAAGATCATC 1951 GCGCTCGACC CTTACCACTA CTTCCGGCAC GGCTGGAATG TTTTTGACAG 2001 CATCGTGGCC CTCCTGAGTC TCGCTGATGT GCTCTACAAC ACACTGTCTG 2051 ATAACAATAG GTCTTTCTTG GCTTCCCTCA GAGTGCTGA GGTCTTCAAG 2101 TTAGCCAAAT CCTGGCCCAC GTTAAACACT 

  CTCATTAAGA TCATCGGCCA 2151 CTCCGTGGGC GCGCTTGGAA ACCTGACTGT GGTCCTGAC ATCGTGGTCT 2201 TCATCTTTTC TGTGGTGGGC ATGCGGCTCT TCGGCACCA GTTTAACAAG 2251 ACCGCCTACG CCACCCAGGA GCGGCCCAGG CGGCGCTGG ACATGGATAA 2301 TTTCTACCAC TCCTTCCTGG TGGTGTTCCG CATCCTCTGT GGGGAATGGA 2351 TCGAGAACAT GTGGGGCTGC ATGCAGGATA TGGACGGCT CCCGTTGTGC 2401 ATCATTGTCT TTGTCCTGAT AATGGTGATC GGGAAGCTT TGGTGCTTAA 2451 CCTCTTCATT GCCTTGCTGC TCAATTCCTT CAGCAATGA GAGAAGGATG 2501 GGAGCCTGGA AGGAGAGACC AGGAAAACCA AAGTGCAGC AGCCCTGGAT 2551 CGGTTCCGCC GGGCCTTCTC CTTCATGCTG CACGCTCTTC   AGAGTTTTTG   2601 TTGCAAGAAA TGCAGGAGGA AAAACTCGCC AAAGCCAAAA GAGACAACAG 2651 AAAGCTTTGC TGGTGAGAAT AAAGACTCAA TCCTCCCGG TGCGAGGCCC 2701 TGGAAGGAGT ATGATACAGA CATGGCTTTG TACACTGGAC AGGCCGGGGC 2751 TCCGCTGGCC CCACTCGCAG AGGTAGAGGA CGATGTGGA TATTGTGGTG 2801 AAGGCGGTGC CCTACCCACC TCACAACATA GTGCTGGAG TCAGGCCGGT 2851 GACCTCCCTC

  CAGAGACCAA GCAGCTCACT AGCCCGGAT ACCAAGGGGT 2901 TGAAATGGAA GTATTTTCTG AAGAAGATCT GCATTTAAGC ATACAGAGTC 2951 CTCGAAAGAA GTCTGACGCA GTGAGCATGC TCTCGGAAT CAGCACAATT 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 3001 GACCTGAATG ATATCTTTAG AAATTTACAG AAAACAGTTT CCCCCAAAAA 3051 GCAGCCAGAT AGATGCTTTC CCAAGGGCCT TAGTTGTCAC TTTCTATGCC 3101 ACAAAACAGA CAAGAGAAAG TCCCCCTGGG TCCTGTGGT GAACATTCGG 3151 AAAACCTGCT ACCAAATCGT GAAGCACAGC TGGTTTGAGA GTTTCATAAT 3201 CTTTGTTATT CTGCTGAGCA GTGGAGCGCT GATATTTGAA GATGTCAATC 3251 TCCCCAGCCG GCCCCAAGTT GAGAAATTAC TAAGGTGTAC CGATAATATT 3301 TTCACATTTA TTTTCCTCCT GGAAATGATC CTGAAGTGGG TGGCCTTTGG 3351 ATTCCGGAGG TATTTCACCA GTGCCTGGTG CTGGCTTGAT TTCCTCATTG 3401 TGGTGGTGTC TGTGCTCAGT CTCATGAATC TACCAAGCTT GAAGTCCTTC 3451 CGGACTCTGC GGGCCCTGAG ACCTCTGCGG GCGCTGTCC AGTTTGAAGG 3501 AATGAAGGTT GTCGTCTACG CCCTGATCAG CGCCATACC GCCATTCTCA 3551 ATGTCTTGCT GGTCTGCCT ATTTTCTGGC 

  TCGTATTTTG TATCTTGGGA 3601 GTAAATTTAT TTTCTGGGAA GTTTGGAAGG TGCATTAACG GGACAGACAT 3651 AAATATGTAT TTGGATTTTA CCGAAGTTCC GAACCGAAG CAATGTAACA 3701 TTAGTAATTA CTCGTGGAAG GTCCCGCAGG TCAACTTTGA CAACGTGGGG 3751 AATGCCTATC TCGCCCTGCT GCAAGTGGCA ACCTATAAGG GCTGGCTGGA 3801 AATCATGAAT GCTGCTGTCG ATTCCAGAGA GAAAGACGA CAGCCGGACT 3851 TTGAGGCGAA CCTCTACGCG TATCTCTACT TTGTGGTTTT TATCATCTTC 3901 GGCTCCTTCT TTACCCTGAA CCTCTTTATC GGTGTTATTA TTGACAACTT 3951 CAATCAGCAG CAGAAAAAGT TAGGTGGCCA AGACATTTTT ATGACAGAAG 4001 AACAGAAGAA ATATTACAAT GCAATGAAAA AGTTAGGAA CAAGAAACCT 4051 CAAAAGCCCA TCCCAAGGCC CCTGAACAAA TGTCAAGCCT TTGTGTTCGA 4101 CCTGGTCACA AGCCAGGTCT TTGACGTCAT CATTCTGGGT CTTATTGTCT 4151 TAAATATGAT TATCATGATG GCTGAATCTG CCGACCAGC CAAAGATGTG 4201 AAGAAAACCT TTGATATCCT CAACATAGCC TTCGTGGTCA TCTTTACCAT 4251 AGAGTGTCTC ATCAAAGTCT TTGCTTTGAG GCAACACTA TTCACCAATG 4301 GCTGGAACTT ATTTGATTGT GTGGTCGTGG 

  TTCTTTCTAT CATTAGTACC 4351 CTGGTTTCCC GCTTGGAGGA CAGTGACATT TCTTTCCCGC CCACGCTCTT 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 4401 CAGAGTCGTC CGCTTGGCTC GGATTGGTCG AATCCTCAG CTGGTCCGGG 4451 CTGCCCGGGG AATCAGGACC CTCCTCTTTG CTTTGATGAT GTCTCTCCCC 4501 TCTCTCTTCA ACATCGGTCT GCTGCTCTTC CTGGTGATG TCATTTACGC 4551 CATCTTTGGG ATGAGCTGGT TTTCCAAAGT GAAGAAGGG TCCGGGATCG 4601 ACGACATCTT CAACTTCGAG ACCTTTACGG GCAGCATGC GTGCCTCTTC 4651 CAGATAACCA CTTCGGCTGG CTGGGATACC CTCCTCAACC CCATGCTGGA 4701 GGCAAAAGAA CACTGCAACT CCTCCTCCCA AGACAGCTG CAGCAGCCGC 4751 AGATAGCCGT CGTCTACTTC GTCAGTTACA TCATCATCTC CTTCCTCATC 4801 GTGGTCAACA TGTACATCGC TGTGATCCTC GAGAACTTCA ACACAGCCAC 4851 GGAGGAGAGC GAGGACCCTC TGGGAGAGGA CGACTTTGAA ATCTTCTATG 4901 AGGTCTGGGA GAAGTTTGAC CCCGAGGCGT CGCAGTTCAT CCAGTATTCG 4951 GCCCTCTCTG ACTTTGCGGA CGCCCTGCCG GAGCCGTTG GTGTGGCCAA 5001 GCCGAATAAG TTTCAGTTTC TAGTGATGGA CTTGCCCAT GTGATGGGCG 5051 

  ACCGCCTCCA TTGCATGGAT GTTCTCTTTG CTTTCACTAC CAGGGTCCTC 5101 GGGGACTCCA GCGGCTTGGA TACCATGAAA ACCATGATG AGGAGAAGTT 5151 TATGGAGGCC AACCCTTTTA AGAAGCTCTA CGAGCCCAT GTCACCACCA 5201 CCAAGAGGAA GGAGGAGGAG CAAGGCGCCG CCGTCATCC GAGGGCCTAC 5251 CGGAAACACA TGGAGAAGAT GGTCAAACTG AGGCTGAAG ACAGGTCAAG 5301 TTCATCGCAC CAGGTGTTTT GCAATGGAGA CTTGTCCAG TTGGATGTGG 5351 CCAAGGTCAA GGTTCACAAT GACTGAACCC TCATCTCCAC CCCTACCTCA 5401 CTGCCTCACA GCTTAGCCTC CAGCCTCTGG CGAGCAGGC GCAGACTCAC 5451 TGAACACAGG CCGTTCGATC TGTGTTTTTG GCTGAACGA GTGACAGGTT 5501 GGCGTCCATT TTTAAATGAC TCTTGGAAAG ATTTCATGTA GAGAGATGTT 5551 AGAAGGGACT GCAAAGGACA CCGACCATAA CGGAAGGCC GGAGGACAGT 5601 CCAACTTACA TAAAGATGAG AAACAAGAAG GAAAGATCC AGGAAAACTT 5651 CAGATTGTGT TCTCAGTACA TCCCCCAATG TGTCTGTTCG GTGTTTTGAG 5701 TATGTGACCT GCCACATGTA   GCTCTTTTTT   GCATGTACG CAAAACCCTG 5751 CAGTAAGTTG ATAGCTTGCT ACGGGTGTTC 

  CTACCAGCAT CACAGAATTG 

 <Desc/Clms Page number 23> 

 5801 GGTGTATGAC TCAAACCTAA AAGCATGACT CTGACTTGTC AGTCAGCACC 5851 CCGACTTTCA GACGCTCCAA TCTCTGTCCC AGGTGTCTAA CGAATAAATA 5901 GGTAAAAG (3) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 2 : (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:   (A) LÄNGE : 1765Aminosäuren   (B) ART:Aminosäure (C) STRANGFORM: (D) TOPOLOGIE: nicht relevant (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (iii) HYPOTHETISCH: Ja (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE : (A) ORGANISMUS :   (F) ART DES GEWEBES: Ganglien der Dorsalwurzel (G) ART DER ZELLE : Nerv   (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG:

   SEQ ID NO : 2 : 
Met Glu Glu Arg Tyr Tyr Pro Val lle Phe Pro Asp Glu Arg Asn Phe   1 5   10 15 
Arg Pro Phe Thr Ser Asp Ser Leu Ala Ala lle Glu Lys Arg lle   Ala   
20 25 30 lle Gin Lys Glu Arg Lys Lys Ser Lys Asp Lys Ala Ala Ala Glu Pro 
35 40 45 
Gln Pro Arg Pro Gin Leu Asp Leu Lys Ala Ser Arg Lys Leu Pro Lys 
50 55 60 
Leu Tyr Gly Asp lle Pro Pro Glu Leu Val Ala Lys Pro Leu Glu Asp 
65 70 75 80 
Leu Asp Pro Phe Tyr Lys Asp His Lys Thr Phe Met Val Leu Asn Lys 
85 90 95 
Lys Arg Thr lle Tyr Arg Phe Ser Ala Lys Arg Ala Leu Phe lle Leu 
100 105 110 
Gly Pro Phe Asn Pro Leu Arg Ser Leu Met lle Arg lle Ser Val His 
115 120 125 
 EMI23.1 
 
130 135 140 Phe Met Ala Asn Ser Met Glu Arg Ser Phe Asp Asn Asp lle Pro Glu 145 150 155 160 
 EMI23.2 
 
165 170 175 Ala Arg Gly Phe lle Val Asp Glu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Pro Trp 
180 185 190 Asn Trp Leu Asp 

  Phe lle Val lle Gly Thr Ala lle Ala Thr Cys Phe 
195 200 205 Pro Gly Ser Gln Val Asn Leu Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Phe 
210 215 220 Arg Ala Leu Lys Ala lle Ser Val lle Ser Gly Leu Lys Val lle Val 225 230 235 240 

 <Desc/Clms Page number 24> 

 Gly Ala Leu Leu Arg Ser Val Lys Lys Leu Val Asp Val Met Val Leu 
245 250 255 Thr Leu Phe Cys Leu Ser lle Phe Ala Leu Val Gly Gin Gln Leu Phe 
260 265 270 Met Gly lle Leu Asn Gln Lys Cys lle Lys His Asn Cys Gly Pro Asn 
275 280 285 Pro Ala Ser Asn Lys Asp Cys Phe Glu Lys Glu Lys Asp Ser Glu Asp 
290 295 300 Phe lle Met Cys Gly Thr Trp Leu Gly Ser Arg Pro Cys Pro Asn Gly 305 310 315 320 Ser Thr Cys Asp Lys Thr Thr Leu Asn Pro Asp Asn Asn Tyr Thr Lys 
325 330 335 Phe Asp Asn Phe Gly Trp Ser Phe Leu Ala Met Phe Arg Val Met Thr 
340 345 350 Gln Asp Ser Trp Glu Arg Leu Tyr Arg Gln lle Leu Arg Thr Ser Gly 
355 360 365 lle Tyr Phe Val Phe Phe 

  Phe Val Val Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe 
370 375 380 Tyr Leu Leu Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Thr Met Ala Tyr Glu Glu 385 390 395 400 Gln Asn Arg Asn Val Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Lys Met Phe 
405 410 415 Gln Glu Ala Gin Gln Leu Leu Arg Glu Glu Lys Glu Ala Leu Val Ala 
420 425 430 Met Gly lle Asp Arg Ser Ser Leu Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ser Phe 
435 440 445 Ser Pro Lys Lys Arg Lys Phe Phe Gly Ser Lys Thr Arg Lys Ser Phe 
450 455 460 Phe Met Arg Gly Ser Lys Thr Ala Gln Ala Ser Ala Ser Asp Ser Glu 465 470 475 480 Asp Asp Ala Ser Lys Asn Pro Gln Leu Leu Glu Gln Thr Lys Arg Leu 
485 490 495 Ser Gln Asn Leu Pro Val Asp Leu Phe Asp Glu His Val Asp Pro Leu 
500 505 510 His Arg Gin Arg Ala Leu Ser Ala Val Ser lle Leu Thr lle Thr Met 
515 520 525 Gln Glu Gln Glu Lys Phe Gln Glu Pro Cys Phe Pro Cys Gly Lys Asn 
530 535 540 Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Val Trp Asp Cys Ser Pro Gln Trp Leu Cys 

  545 550 555 560 lle Lys Lys Val Leu Arg Thr lle Met Thr Asp Pro Phe Thr Glu Leu 
565 570 575 
 EMI24.1 
 
580 585 590 His His Asn Met Asp Asp Asn Leu Lys Thr lle Leu Lys lle Gly Asn 
595 600 605 Trp Val Phe Thr Gly lle Phe lle Ala Glu Met Cys Leu Lys lle lle 
610 615 620 Ala Leu Asp Pro Tyr His Tyr Phe Arg His Gly Trp Asn Val Phe Asp 625 630 635 640 Ser lle Val Ala Leu Leu Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Asn Thr Leu 
645 650 655 Ser Asp Asn Asn Arg Ser Phe Leu Ala Ser Leu Arg Val Leu Arg Val 
660 665 670 

 <Desc/Clms Page number 25> 

 Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Thr Leu lle Lys lle 
675 680 685 lle Gly His Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Val Val Leu Thr 
690 695 700 lle Val Val Phe lle Phe Ser Val Val Gly Met Arg Leu Phe Gly Thr 705 710 715 720 Lys Phe Asn Lys Thr Ala Tyr Ala Thr Gin Glu Arg Pro Arg Arg Arg 
725 730 735 Trp His Met Asp Asn Phe Tyr His Ser Phe Leu 

  Val Val Phe Arg lle 
740 745 750 Leu Cys Gly Glu Trp lle Glu Asn Met Trp Gly Cys Met Gin Asp Met 
755 760 765 Asp Gly Ser Pro Leu Cys lle lle Val Phe Val Leu lle Met Val lle 
770 775 780 Gly Lys Leu Val Val Leu Asn Leu Phe lle Ala Leu Leu Leu Asn Ser 785 790 795 800 Phe Ser Asn Glu Glu Lys Asp Gly Ser Leu Glu Gly Glu Thr Arg Lys 
805 810 815 Thr Lys Val Gin Leu Ala Leu Asp Arg Phe Arg Arg Ala Phe Ser Phe 
820 825 830 Met Leu His Ala Leu Gln Ser Phe Cys Cys Lys Lys Cys Arg Arg Lys 
835 840 845 Asn Ser Pro Lys Pro Lys Glu Thr Thr Glu Ser Phe Ala Gly Glu Asn 
850 855 860 Lys Asp Ser lle Leu Pro Asp Ala Arg Pro Trp Lys Glu Tyr Asp Thr 865 870 875 880 Asp Met Ala Leu Tyr Thr Gly Gln Ala Gly Ala Pro Leu Ala Pro Leu 
885 890 895 Ala Glu Val Glu Asp Asp Val Glu Tyr Cys Gly Glu Gly Gly Ala Leu 
900 905 910 Pro Thr Ser Gin His Ser Ala Gly Val Gln Ala Gly Asp Leu Pro Pro 
915 920 925 Glu Thr 

  Lys Gin Leu Thr Ser Pro Asp Asp Gin Gly Val Glu Met Glu 
930 935 940 Val Phe Ser Glu Glu Asp Leu His Leu Ser lle Gln Ser Pro Arg Lys 945 950 955 960 Lys Ser Asp Ala Val Ser Met Leu Ser Glu Cys Ser Thr lle Asp Leu 
965 970 975 Asn Asp lle Phe Arg Asn Leu gln Lys Thr Val Ser Pro Lys Lys Gln 
980 985 990 Pro Asp Arg Cys Phe Pro Lys Gly Leu Ser Cys His Phe Leu Cys His 
995 1000 1005 Lys Thr Asp Lys Arg Lys Ser Pro Trp Val Leu Trp Trp Asn lle Arg 
1010 1015 1020 Lys Thr Cys Tyr Gin lle Val Lys His Ser Trp Phe Glu Ser Phe lle 1025 1030 1035 1040 lle Phe Val lle Leu Leu Ser Ser Gly Ala Leu lle Phe Glu Asp Val 
1045 1050 1055 Asn Leu Pro Ser Arg Pro Gin Val Glu Lys Leu Leu Arg Cys Thr Asp 
1060 1065 1070 Asn lle Phe Thr Phe Ile Phe Leu Leu Glu Met lle Leu Lys Trp Val 
1075 1080 1085 Ala Phe Gly Phe Arg Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Trp Cys Trp Leu Asp 
1090 1095 1100 

  

 <Desc/Clms Page number 26> 

 Phe Leu lle Val Val Val Ser Val Leu Ser Leu Met Asn Leu Pro Ser 1105 1110 1115 1120 Leu Lys Ser Phe Arg Thr Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu 
1125 1130 1135 Ser Gln Phe Glu Gly Met Lys Val Val Val Tyr Ala Leu Ile Ser Ala 
1140 1145 1150 lle Pro Ala lle Leu Asn Val Leu Leu Val Cys Leu lle Phe Trp Leu 
1155 1160 1165 Val Phe Cys lle Leu Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Lys Phe Gly Arg 
1170 1175 1180 Cys lle Asn Gly Thr Asp lle Asn Met Tyr Leu Asp Phe Thr Glu Val 1185 1190 1195 1200 Pro Asn Arg Ser Gin Cys Asn lle Ser Asn Tyr Ser Trp Lys Val Pro 
1205 1210 1215 Gin Val Asn Phe Asp Asn Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Leu Gin 
1220 1225 1230 Val Ala Thr Tyr Lys Gly Trp Leu Glu lle Met Asn Ala Ala Val Asp 
1235 1240 1245 Ser Arg Glu Lys Asp Glu gln Pro Asp Phe Glu Ala Asn Leu Tyr Ala 
1250 1255 1260 Tyr Leu Tyr Phe Val Val Phe lle lle Phe Gly Ser Phe 

  Phe Thr Leu 1265 1270 1275 1280 
 EMI26.1 
 
1285 1290 1295 Lys Leu Gly Gly Gln Asp lle Phe Met Thr Glu Glu Gln Lys Lys Tyr 
1300 1305 1310 Tyr Asn Ala Met Lys Lys Leu Gly Thr Lys Lys Pro Gln Lys Pro lle 
1315 1320 1325 Pro Arg Pro Leu Asn Lys Cys Gln Ala Phe Val Phe Asp Leu Val Thr 
1330 1335 1340 
 EMI26.2 
 1345 1350 1355 1360 lle lle Met Met Ala Glu Ser Ala Asp gln Pro Lys Asp Val Lys Lys
1365 1370 1375 
 EMI26.3 
 
1380 1385 1390 Cys Leu lle Lys Val Phe Ala Leu Arg gln His Tyr Phe Thr Asn Gly 
1395 1400 1405 Trp Asn Leu Phe Asp Cys Val Val Val Val Leu Ser lle Ile Ser Thr 
1410 1415 1420 Leu Val Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asp lle Ser Phe Pro Pro Thr Leu 1425 1430 1435 1440 Phe Arg Val Val Arg Leu Ala Arg lle Gly Arg lle Leu Arg Leu Val 
1445 1450 1455 Arg Ala Ala Arg Gly lle Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser 
1460 1465 1470 Leu Pro Ser Leu Phe Asn lle Gly Leu Leu Leu Phe Leu 

  Val Met Phe 
1475 1480 1485 lle Tyr Ala lle Phe Gly Met Ser Trp Phe Ser Lys Val Lys Lys Gly 
1490 1495 1500 Ser Gly lle Asp Asp lle Phe Asn Phe Glu Thr Phe Thr Gly Ser Met 1505 1510 1515 1520 Leu Cys Leu Phe Gln lle Thr Thr Ser Ala Gly Trp Asp Thr Leu Leu 
1525 1530 1535 

 <Desc/Clms Page number 27> 

 Asn Pro Met Leu Glu Ala Lys Glu His Cys Asn Ser Ser Ser Gln Asp 
1540 1545 1550 Ser Cys Gin Gin Pro Gin lle Ala Val Val Tyr Phe Val Ser Tyr lle 
1555 1560 1565 
 EMI27.1 
 
1570 1575 1580 Glu Asn Phe Asn Thr Ala Thr Glu Glu Ser Glu Asp Pro Leu Gly Glu 1585 1590 1595 1600 Asp Asp Phe Glu lle Phe Tyr Glu Val Trp Glu Lys Phe Asp Pro Glu 
1605 1610 1615 Ala Ser Gln Phe lle Gln Tyr Ser Ala Leu Ser Asp Phe Ala Asp Ala 
1620 1625 1630 Leu Pro Glu Pro Leu Arg Val Ala Lys Pro Asn Lys Phe Gln Phe Leu 
1635 1640 1645 Val Met Asp Leu Pro Met Val Met Gly Asp Arg Leu His Cys Met Asp 
1650 1655 

  1660 Val Leu Phe Ala Phe Thr Thr Arg Val Leu Gly Asp Ser Ser Gly Leu 1665 1670 1675 1680 Asp Thr Met Lys Thr Met Met Glu Glu Lys Phe Met Glu Ala Asn Pro 
1685 1690 1695 Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Pro lle Val Thr Thr Thr Lys Arg Lys Glu 
1700 1705 1710 Glu Glu Gln Gly Ala Ala Val lle Gin Arg Ala Tyr Arg Lys His Met 
1715 1720 1725 Glu Lys Met Val Lys Leu Arg Leu Lys Asp Arg Ser Ser Ser Ser His 
1730 1735 1740 Gln Val Phe Cys Asn Gly Asp Leu Ser Ser Leu Asp Val Ala Lys Val 1745 1750 1755 1760 Lys Val His Asn Asp 
1765 (4) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3 : (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:   (A) LÄNGE : 856Basenpaare   (B) ART: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE:linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH : Nein (iv) ANTI-SENSE: Nein (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE : (A) ORGANISMUS :   (F) ART DES GEWEBES:

   Ganglien der Dorsalwurzel (G) ART DER ZELLE : Nerv   (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3 
1 GCTGAGCAGT GGGGCACTGA TATTTGAAGA TGTTCACCTT GAGAACCAAC 
51 CCAAAATCCA AGAATTACTA AATTGTACTG ACATTATTTT TACACATATT 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 101 TTTATCCTGG AGATGGTACT AAAATGGGTA GCCTTCGGAT TTGGAAAGTA 151 TTTCACCAGT GCCTGGTGCT GCCTTGATTT CATCATTGTG ATTGTCTCTG 201 TGACCACCCT CATTAACTTA ATGGAATTGA AGTCCTTCCG GACTCTACGA 251 GCACTGAGGC CTCTTCGTGC GCTGTCCCAG TTTGAAGGAA TGAAGGTGGT 301 GGTCAATGCT CTCATAGGTG CCATACCTGC CATTCTGAAT GTTTTGCTTG 351 TCTGCCTCAT TTTCTGGCTC GTATTTTGTA TTCTGGGAGT ATACTTCTTT 401 TCTGGAAAAT TTGGGAAATG CATTAATGGA ACAGACTCAG TTATAAATTA 451 TACCATCATT ACAAATAAAA GTCAATGTGA AAGTGGCAAT TTCTCTTGGA 501 TCAACCAGAA AGTCAACTTT GACAATGTGG GAAATGCTTA CCTCGCTCTG 551 CTGCAAGTGG CAACATTTAA GGGCTGGATG GATATTATAT ATGCAGCTGT 601 TGATTCCACA GAGAAAGAAC AACAGCCAGA GTTTGAGAGC 

  AATTCACTCG 651 GTTACATTTA CTTCGTAGTC TTTATCATCT TTGGCTCATT CTTCACTCTG 701 AATCTCTTCA TTGGCGTTAT CATTGACAAC TTCAACCAAC AGCAGAAAAA 751 GTTAGGTGGC CAAGACATTT TTATGACAGA AGAACAGAAG AAATACTATA 801 ATGCAATGAA AAAATTAGGA TCCAAAAAAC CTCAAAAACC CATTCCACGG 851 CCCGTT (5) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 4 : (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA: (A) LÄNGE: 702 Basenpaare (B) RT: Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE:linear (ii) ART DES MOLEKÜLS :   (A) BESCHREIBUNG: /desc = I DNA probe/domain IV"   (iii) HYPOTHETISCH: Nein (iv) ANTI-SENSE: Nein (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE : (A) ORGANISMUS: Ratte   (F) ART DES GEWEBES : der Dorsalwurzel (G) ART DER ZELLE :

   Nerv   (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG- SEQ ID NO : 4 : 
1 CTCAACATGG TTACGATGAT GGTGGAGACC GACGAGCAGG GCGAGGAGAA 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 
51 GACGAAGGTT CTGGGCAGAA TCAACCAGTT CTTTGTGGCC GTCTTCACGG 101 GCGAGTGTGT GATGAAGATG TTCGCCCTGC GACAGTACTA TTTCACCAAC 151 GGCTGGAACG TGTTCGACTT CATAGTGGTG ATCCTGTCCA TTGGGAGTCT 201 GCTGTTTCT GCAATCCTTA AGTCACTGGA AAACTACTTC TCCCCGACGC 251 TCTTCCGGGT CATCCGTCTG GCCAGGATCG GCCGCATCCT CAGGCTGATC 301 CGAGCAGCCA AGGGGATTCG CACGCTGCTC TTCGCCCTCA TGATGTCCCT 351 GCCCGCCCTC TTCAACATCG GCCTCCTCCT CTTCCTCGTC ATGTTCATCT 401 ACTCCATCTT CGGCATGGCC AGCTTCGCTA ACGTCGTGGA CGAGGCCGGC 451 ATCGACGACA TGTTCAACTT CAAGACCTTT GGCAACAGCA TGCTGTGCCT 501 GTTCCAGATC ACCACCTCGG CCGGCTGGGA CGGCCTCCTC AGCCCCATCC 551 TCAACACGGG GCCTCCCTAC TGCGACCCCA ACCTGCCCAA CAGCAACGGC 601 TCCCGGGGGA ACTGCGGGAG CCCGGCGGTG GGCATCATCT TCTTCACCAC 651 CTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT 

  CAACATGTAT ATCGCAGTCA 701 TC (5) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 5 : (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA- (A) LÄNGE. 5334 Basenpaare (B) ART Nucleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE:linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: RT-PCR (A) BESCHREIBUNG: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: Nein (iv) ANTI-SENSE: Nein (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE. 



   (A) ORGANISMUS: (F) ART DES GEWEBES (G) ART DER ZELLE- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5 : 
1 GTCGACTCTA GATCAGGGTG AAGATGGAGG AGAGGTACTA CCCGGTGATC 
51 TTCCCGGACG AGCGGAATTT CCGCCCCTTC ACTTCCGACT CTCTGGCTGC 101 CATAGAGAAG CGGATTGCTA TCCAAAAGGA GAGGAAGAAG TCCAAAGACA 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 
151 AGGCGGCAGC TGAGCCCCAG CCTCGGCCTC AGCTTGACCT AAAGGCCTCC 
201 AGGAAGTTAC CTAAGCTTTA TGGTGACATT CCCCCTGAGC TTGTAGCGAA 
251 GCCTCTGGAA GACCTGGACC CATTCTACAA AGACCATAAG ACATTCATGG 
301 TGTTGAACAA GAAGAGAACA ATTTATCGCT TCAGCGCCAA GCGGGCCTTG 
351 TTCATTCTGG GGCCTTTTAA TCCCCTCAGA AGCTTAATGA TTCGTATCTC 
401 TGTCCATTCA GTCTTTAGCA TGTTCATCAT CTGCACGGTG ATCATCAACT 
451 GTATGTTCAT GGCGAATTCT ATGGAGAGAA GTTTCGACAA CGACATTCCC 
501 GAATACGTCT TCATTGGGAT TTATATTTTA GAAGCTGTGA TTAAAATATT 
551 GGCAAGAGGC TTCATTGTGG ATGAGTTTTC CTTCCTCCGA GATCCGTGGA 
601 ACTGGCTGGA CTTCATTGTC ATTGGAACAG 

  CGATCGCAAC TTGTTTTCCG 
651 GGCAGCCAAG TCAATCTTTC AGCTCTTCGT ACCTTCCGAG TGTTCAGAGC 
701 TCTGAAGGCG   ATTTCAGTTA   TCTCAGGTCT GAAGGTCATC GTAGGTGCCC 
751 TGCTGCGCTC GGTGAAGAAG CTGGTAGACG TGATGGTCCT CACTCTCTTC 
801 TGCCTCAGCA TCTTTGCCCT GGTCGGTCAG CAGCTGTTCA TGGGAATTCT 
851 GAACCAGAAG TGTATTAAGC ACAACTGTGG CCCCAACCCT GCATCCAACA 
901 AGGATTGCTT TGAAAAGGAA AAAGATAGCG AAGACTTCAT AATGTGTGGT 
951 ACCTGGCTCG GCAGCAGACC CTGTCCCAAT GGTTCTACGT GCGATAAAAC 1001 CACATTGAAC CCAGACAATA ATTATACAAA GTTTGACAAC TTTGGCTGGT 1051 CCTTTCTCGC CATGTTCCGG GTTATGACTC AAGACTCCTG GGAGAGGCTT 1101 TACCGACAGA TCCTGCGGAC CTCTGGGATC TACTTTGTCT TCTTCTTCGT 1151 GGTGGTCATC TTCCTGGGCT CCTTCTACCT GCTTAACCTA ACCCTGGCTG 1201 TTGTCACCAT GGCTTATGAA GAACAGAACA GAAATGTAGC TGCTGAGACA 1251 GAGGCCAAGG AGAAAATGTT TCAGGAAGCC CAGCAGCTGTT AAGGGAGGA 1301 GAAGGAGGCT CTGGTTGCCA TGGGAATTGA CAGAAGTTCC CTTAATTCCC 1351 

  TTCAAGCTTC ATCCTTTTCC CCGAAGAAGA GGAAGTTTTT CGGTAGTAAG 1401 ACAAGAAAGT CCTTCTTTAT GAGAGGGTCC AAGACGGCCC AAGCCTCAGC 1451 GTCTGATTCA GAGGACGATG CCTCTAAAAA TCCACAGCTC CTTGAGCAGA 1501 CCAAACGACT GTCCCAGAAC TTGCCAGTGG ATCTCTTTGA TGAGCACGTG 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 
1551 GACCCCCTCC ACAGGCAGAG AGCGCTGAGC GCTGTCAGT ATCTTAACCAT 
1601 CACCATGCAG GAACAAGAAA AATTCCAGGA GCCTTGTTTC CCATGTGGGA 1651 AAAATTTGG CTCTAAGTAC CTGGTGTGGG ACTGTAGCCC TCAGTGGCTG 1701 TGCATAAAGA AGGTCCTGCG GACCATCATG ACGGATCCCT TTACTGAGCT 1751 GGCCATCACC ATCTGCATCA TCATCAATAC CGTTTTCTTA GCCGTGGAGC 1801 ACCACAACAT GGATGACAAC TTAAAGACCA TACTGAAAAT AGGAAACTGG 1851 GTTTTCACGG GAATTTTCAT AGCGGAAATG TGTCTCAAGA TCATCGCGCT 1901 CGACCCTTAC CACTACTTCC GGCACGGCTG GAATGTTTTT GACAGCATCG 1951 TGGCCCTCC GAGTCTCGCT GATGTGCTCT ACAACACACT GTCTGATAAC 2001 AATAGGTCTT TCTTGGCTTC CCTCAGAGTG CTGAGGGTCT TCAAGTTAGC 2051 CAAATCCTGG CCCACGTTAA 

  ACACTCTCAT TAAGATCATC GGCCACTCCG 2101 TGGGCGCGC TGGAAACCTG ACTGTGGTCC TGACTATCGT GGTCTTCATC 2151 TTTTCTGTGG TGGGCATGCG GCTCTTCGGC ACCAAGTTTA ACAAGACCGC 2201 CTACGCCACC CAGGAGCGGC CCAGGCGGCG CTGGCACATG GATAATTTCT 2251 ACCACTCCTT CCTGGTGGTG TTCCGCATCC TCTGTGGGGA ATGGATCGAG 2301 AACATGTGGG GCTGCATGCA GGATATGGAC GGCTCCCCGT TGTGCATCAT 2351 TGTCTTTGTC CTGATAATGG TGATCGGGAA GCTTGTGGTG CTTAACCTCT 2401 TCATTGCCTT GCTGCTCAAT TCCTTCAGCA ATGAGGAGAA GGATGGGAGC 2451 CTGGAAGGAG AGACCAGGAA AACCAAAGTG CAGCTAGCCC TGGATCGGTT 2501 CCGCCGGGCC TTCTCCTTCA TGCTGCACGC TCTTCAGAGT TTTTGTTGCA 2551 AGAAATGCAG GAGGAAAAAC TCGCCAAAGC CAAAAGAGAC AACAGAAAGC 2601 TTTGCTGGTG AGAATAAAGA CTCAATCCTC CCGGATGCGA GGCCCTGGAA 2651 GGAGTATGAT ACAGACATGG CTTTGTACAC TGGACAGGCC GGGGCTCCGC 2701 TGGCCCCACT CGCAGAGGTA GAGGACGATG TGGAATATTG TGGTGAAGGC 2751 GGTGCCCTAC CCACCTCACA ACATAGTGCT GGAGTTCAGG CCGGTGACCT 2801 CCCTCCAGAG 

  ACCAAGCAGC TCACTAGCCC GGATGACCAA GGGGTTGAAA 2851 TGGAAGTATT TTCTGAAGAA GATCTGCATT TAAGCATACA GAGTCCTCGA 2901 AAGAAGTCTG ACGCAGTGAG CATGCTCTCG GAATGCAGCA CAATTGACCT 

 <Desc/Clms Page number 32> 

 2951 GAATGATATC TTTAGAAATT TACAGAAAAC AGTTTCCCCC AAAAAGCAGC 3001 CAGATAGATG CTTTCCCAAG GGCCTTAGTT GTCACTTTCT ATGCCACAAA 3051 ACAGACAAGA GAAAGTCCCC CTGGGTCCTG TGGTGGAACA TTCGGAAAAC 3101 CTGCTACCAA ATCGTGAAGC ACAGCTGGTT TGAGAGTTTC ATAATCTTTG 3151 TTATTCTGCT GAGCAGTGGA GCGCTGATAT TTGAAGATGT CAATCTCCCC 3201 AGCCGGCCCC AAGTTGAGAA ATTACTAAGG TGTACCGATA ATATTTTCAC 3251 ATTTATTTTC CTCCTGGAAA TGATCCTGAA GTGGGTGGCC TTTGGATTCC 3301 GGAGGTATTT CACCAGTGCC TGGTGCTGGC TTGATTTCCT CATTGTGGTG 2251 GTGTCTGTGC TCAGTCTCAT GAATCTACCA AGCTTGAAGT CCTTCCGGAC 3401 TCTGCGGGCC CTGAGACCTC TGCGGGCGCT GTCCCAGTTT GAAGGAATGA 3451 AGGTTGTCGT CTACGCCCTG ATCAGCGCCA TACCTGCCAT TCTCAATGTC 3501 TTGCTGGTCT GCCTCATTTT CTGGCTCGTA 

  TTTTGTATCT TGGGAGTAAA 3551 TTTATTTTCT GGGAAGTTTG GAAGGTGCAT TAACGGGACA GACATAAATA 3601 TGTATTTGGA TTTTACCGAA GTTCCGAACC GAAGCCAAT GTAACATTAG 3651 AATTACTCGT GGAAGGTCCC GCAGGTCAAC TTTGACAACG TGGGGAATGC 3701 CTATCTCGCC CTGCTGCAAG TGGCAACCTA TAAGGGCTGG CTGGAAATCA 3751 TGAATGCTGC TGTCGATTCC AGAGAGAAAG ACGAGCAGCC GGACTTTGAG 3801 GCGAACCTCT ACGCGTATCT CTACTTTGTG GTTTTTATCA TCTTCGGCTC 3851 CTTCTTTACC CTGAACCTCT TTATCGGTGT TATTATTGAC AACTTCAATC 3901 AGCAGCAGAA AAAGTTAGGT GGCCAAGACA TCTTCATGAC TGAGGAGCAG 3951 AAGAAATATT ACAATGCAAT GAAAAAGTTA GGAACCAAGA AACCTCAAAA 4001 GCCCATCCCA AGGCCCCTGA ACAAATGTCA AGCCTTTGTG TTCGACCTGG 4051 TCACAAGCCA GGTCTTTGAC GTCATCATTC TGGGTCTTAT TGTCTTAAAT 4101 ATGATTATCA TGATGGCTGA ATCTGCCGAC CAGCCCAAAG ATGTGAAGAA 4151 AACCTTTGAT ATCCTCAACA TAGCCTTCGT GGTCATCTTT ACCATAGAGT 4201 GTCTCATCAA AGTCTTTGCT TTGAGGCAAC ACTACTTCAC CAATGGCTGG 4251 AACTTATTTG ATTGTGTGGT 

  CGTGGTTCTT TCTATCATTA GTACCCTGGT 4301 TTCCCGCTTG GAGGACAGTG ACATTTCTTT CCCGCCCACG CTCTTCAGAG 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 4351 TCGTCCGCTT GGCTCGGATT GGTCGAATCC TCAGGCTGGT CCGGGCTGCC 4401 CGGGGAATCA GGACCCTCCT CTTTGCTTTG ATGATGTCTC TCCCCTCTCT 4451 CTTCAACATC GGTCTGCTGC TCTTCCTGGT GATGTTCATT TACGCCATCT 4501 TTGGGATGAG CTGGTTTTCC AAAGTGAAGA AGGGCTCCGG GATCGACGAC 4551 ATCTTCAACT TCGAGACCTT TACGGGCAGC ATGCTGTGCC TCTTCCAGAT 4601 AACCACTTCG GCTGGCTGGG ATACCCTCCT CAACCCCATG CTGGAGGCAA 4651 AAGAACACTG CAACTCCTCC TCCCAAGACA GCTGTCAGCA GCCGCAGATA 4701 GCCGTCGTCT ACTTCGTCAG TTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT 4751 CAACATGTAC ATCGCTGTGA TCCTCGAGAA CTTCAACACA GCCACGGAGG 4801 AGAGCGAGGA CCCTCTGGGA GAGGACGACT TTGAAATCTT CTATGAGGTC 4851 TGGGAGAAGT TTGACCCCGA GGCGTCGCAG TTCATCCAGT ATTCGGCCCT 4901 CTCTGACTTT GCGGACGCCC TGCCGGAGCC GTTGCGTGTG GCCAAGCCGA 4951 ATAAGTTTCA GTTTCTAGTG ATGGACTTGC CCATGGTGAT 

  GGGCGACCGC 5001 CTCCATTGCA TGGATGTTCT CTTTGCTTTC ACTACCAGGG TCCTCGGGGA 5051 CTCCAGCGGC TTGGATACCA TGAAAACCAT GATGGAGGAG AAGTTTATGG 5101 AGGCCAACCC TTTTAAGAAG CTCTACGAGC CCATAGTCAC CACCACCAAG 5151 AGGAAGGAGG AGGAGCAAGG CGCCGCCGTC ATCCAGAGGG CCTACCGGAA 5201 ACACATGGAG AAGATGGTCA AACTGAGGCT GAAGGACAGG TCAAGTTCAT 5251 CGCACCAGGT GTTTTGCAAT GGAGACTTGT CCAGCTTGGA TGTGGCCAAG 5301 GTCAAGGTTC ACAATGACTG AACCCTCATC TAGA 
PATENTANSPRÜCHE: 
1. Isolierte DNA-Sequenz umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, 
SEQ ID Nr. 5 oder die Nukleotide 79 bis 5376 von SEQ ID Nr. 1.

Claims (1)

1. 2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ein Natrium- kanalprotein oder ein Fragment davon codiert.

   3. DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein die a- Untereinheit oder ein Fragment davon ist.

   4. DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein Tetrodoto- xin-resistent ist.

   5. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA cDNA ist.

   6. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA synthetische DNA ist 7. Expressionsvektor enthaltend die DNA von Anspruch 5.

   8. Expressionsvektor enthaltend die synthetische DNA von Anspruch 6. <Desc/Clms Page number 34>

   9. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 7.

   10. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 8.

   11. Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder alleli- schen Varianten davon codiert wird.

   12. Tetrodotoxin-resistentes Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprü- che 1 bis 6 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

   13. Protein nach Anspruch 12 mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.

   14. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von Tetrodotoxin-resistentem Natriumkanal- protein umfassend, dass man eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, mit Natriumkanalprotein nach Anspruch 12 in Kontakt bringt und die Aktivität des exprimierten Natriumkanals misst.

   15. Poly- und/oder monoklonale Antikörper gegen ein Tetrodotoxin-resistentes Natriumkanal- protein, das von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

   16. Diagnosekit umfassend ein Polynucleotid enthaltend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, das spezifisch mit einem Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanalprotein oder einem Fragment davon hybridisieren kann.

   17. Verwendung einer isolierten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, um eine Verbindung zu identifizieren, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor von Tetro- dotoxin-resistentem Natriumkanalprotein ist.

   HIEZU 27 BLATT ZEICHNUNGEN