CH693031A5

CH693031A5 - Nucleinsäure, die einen Nervengewebe-Natriumkanal kodiert.

Info

Publication number: CH693031A5
Application number: CH02305/98A
Authority: CH
Inventors: Linda Marie Fish; Reena Khare; Douglas Kenneth Rabert
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-17
Publication date: 2003-01-31
Also published as: AU710551B2; DE19853233A1; NL1010602A1; IT1306213B1; JPH11235186A; GB2332906A; AU9327298A; SE9803962L; SE9803962D0; DE19853233C2; GB2332906B; CA2251262A1; IE980956A1; BE1014938A4; ATA194298A; CA2251262C; FR2771103A1; ITMI982507A1; GB2332906A8; AT410672B

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Natriumkanalproteine und genauer eine neue Nucleinsäuresequenz, die eine Säugetier- alpha -Untereinheit eines spannungsgesteuerten, bevorzugt Tetrodotoxin-resistenten, Nervengewebe-Natriumkanalproteins codiert. Die Erfindung betrifft weiterhin seine Herstellung mit Gentechnik.

Die Basiseinheit an Information, die von einem Teil des Nervensystems zu einem anderen übertragen wird, ist ein einzelnes Aktionspotenzial oder ein Nervenimpuls. Die "Übertragungsleitung" für diese Impulse ist das Axon oder die Nervenfaser. Es wurde gezeigt, dass die elektrische Erregbarkeit der Nervenmembran von dem spannungsempfindlichen ionischen Permeabilitätssystem der Membran abhängt, das es zulässt, Energie zu verwenden, die in ionischen Konzentrationsgradienten gespeichert wird. Die elektrische Aktivität des Nervs wird ausgelöst durch eine Depolarisierung der Membran, die Kanäle durch die Membran öffnet, die äusserst selektiv für Natriumionen sind, die dann durch den elektrochemischen Gradienten nach innen getrieben werden. Von den vielen lonenkanälen ist der spannungsgesteuerte oder spannungsempfindliche Natriumkanal der am besten untersuchte.

Es ist ein Transmembranprotein, das wesentlich ist zur Erzeugung von Aktionspotenzialen in erregbaren Zellen. Eine ausgezeichnete Übersicht über Natriumkanäle findet sich in Catterall, TINS 16 (12), 500 bis 506 (1993).

Die cDNA für mehrere Na<+>-Kanäle wurden kloniert und sequenziert. Numa et al., Annals of the New York Academy of Sciences 479, 338 bis 355 (1986) beschreiben cDNA aus dem elektrischen Organ des Aals und zwei verschiedene aus Rattengehirn. Rogart, U.S.-Patent Nr. 5 380 836 beschreibt cDNA aus dem Gewebe des Rattenherzens. Siehe auch Rogart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 8170 bis 8174 (1989). Die Sequenz von PN1 und seinen Orthologen bei Menschen (hNE) und Kaninchen (Na<+>s) wurde veröffentlicht (siehe z.B. Klugbauer et al., EMBOJ 14, 1084 bis 1090 (1995) und Belcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 923, 11034 bis 11038 (1995)). Die Sequenz von Ratten-PN1, die aus DRG kloniert wurde, und ihre Funktionsexpression wurden beschrieben (siehe z.B. Sangameswaran et al., J. Biol. Chem. 272, 14805 bis 14809 (1997)).

Andere klonierte Natriumkanäle schliessen die Typen I und II des Rattengehirns, Noda et al., Nature 320, 188 bis 192 (1986), IIa, Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988) und III, Kayano et al., FEBS Lett. 228, 187 bis 194 (1988), Rattenskelettmuskel (SkM1), Trimmer et al., Neuron 3, 33 bis 49 (1989), Ratten-NaCh6, Schaller et al., J. Neurosci. 15, 3231 bis 3242 (1995), periphere Nervennatriumkanäle Typ 3 der Ratte (tPN3), Sangameswaran et al., J. Biol. Chem. 271, 5953 bis 5956 (1996), auch als SNS bezeichnet, Akopian et al., Nature 379, 257 bis 262 (1996), atypische Rattenkanäle, Felipe et al., J. Biol. Chem. 269, 30125 bis 30131 (1994) und den Glia-Natriumkanal der Ratte, Akopian et al., FEBS Lett. 400, 183 bis 187 (1997) ein.

Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die Aminosäuresequenz des Na<+>-Kanals über einen langen evolutionären Zeitraum konserviert ist. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, dass der Kanal ein einziges Polypeptid ist, das vier interne Sequenzwiederholungen oder homologe Domänen (Domänen I bis IV) mit ähnlichen Aminosäuresequenzen enthält. Jede Domäne faltet sich in sechs vorhersagbare und helikale Transmembransegmente: fünf sind hydrophobe Segmente und eins ist stark geladen mit vielen positiv geladenen Lysin- und Argininresten. Dieses stark geladene Segment ist das vierte Transmembransegment in jeder Domäne (S4-Segment) und ist wahrscheinlich an der Spannungssteuerung beteiligt.

Die positiv geladenen Seitenketten an dem S4-Segment sind wahrscheinlich gepaart mit den negativ geladenen Seitenketten an den anderen fünf Segmenten, sodass die Membrandepolarisierung die Position einer Helix bezogen auf die andere verschieben könnte, wodurch der Kanal geöffnet wird. Zusätzliche Untereinheiten können die Funktion des Kanals modifizieren.

Der therapeutische Nutzen von rekombinanten Materialien, die aus der DNA zahlreicher Natriumkanäle stammen, wurde gefunden. Z.B. offenbart U.S.-Patent Nr. 5 132 296 von Cherksey gereinigte Na<+>-Kanäle, die sich als nützliche therapeutische und diagnostische Werkzeuge erwiesen haben.

Isoformen von Natriumkanälen werden in "Unterfamilien" unterteilt. Der Ausdruck "Isoform" wird hier verwendet, um distinkte aber nah verwandte Natriumkanalproteine zu bezeichnen, d.h. solche mit einer Aminosäurehomologie von ungefähr 60 bis 80%. Diese zeigen auch eine starke Homologie in den Funktionen. Der Ausdruck "Unterfamilie" wird verwendet, um distinkte Natriumkanäle zu bezeichnen, die eine Aminosäurehomologie von ungefähr 80 bis 95% haben. Kombinationen mehrerer Faktoren werden verwendet, um die Unterschiede innerhalb einer Unterfamilie zu bestimmen, z.B. die Geschwindigkeit eines Kanals, die chromosomale Anordnung, die Expressions daten, die Homologie mit anderen Kanälen innerhalb einer Art und die Homologie mit einem Kanal der gleichen Unterfamilie über die Arten hinweg. Eine andere Überlegung ist eine Affinität zu Tetrodotoxin ("TTX").

TTX ist ein äusserst potentes Toxin aus dem "Puffer"- oder Fugufisch, das die Leitung von Nervenimpulsen entlang der Axone und in erregbaren Membranen von Nervenfasern, blockiert. TTX bindet an den Na<+>-Kanal und blockiert den Fluss der Natriumionen.

Untersuchungen unter Anwendungen von TTX als Sonde haben Licht auf den Mechanismus und die Struktur von Na<+>-Kanälen geworfen. Es gibt 3 Na<+>-Kanal-Unterarten, die durch die Affinität für TTX definiert werden, die durch IC50-Werte gemessen werden kann: TTX-empfindliche Na<+>-Kanäle (IC50 = 1 bis 30 nM), TTX-unempfindliche Na<+>-Kanäle (IC50 = 1 bis 5 mu M) und TTX-resistente Na<+>-Kanäle (IC50 >/= 50 mu M).

TTX-unempfindliche Aktionspotenziale wurden zuerst im Rattenskelettmuskel untersucht (Redfern et al., Acta Physiol. Scand. 82, 70 bis 78 (1971)). Anschliessend wurden diese Aktionspotenziale für andere Säugetiergewebe beschrieben, einschliesslich dem Säugetierskelettmuskel bei Neugeborenen, Säugetierherzmuskel, Mausganglionzellen der Dorsalwurzel in vitro und in Kultur, gezüchtetem Säugetierskelettmuskel und L6-Zellen. Siehe Rogart, Arm. Rev. Physiol. 43, 711 bis 725 (1980).

Rattenganglienneuronen der Dorsalwurzel besitzen sowohl TTX-empfindliche (IC50 &tilde& 0,3 nM) als auch TTX-resistente (IC50 &tilde& 100 mu M) Natriumkanalströme, wie von Roy et al., J. Neurosci. 12, 2104 bis 2111 (1992) beschrieben. TTX-resistente Natriumströme wurden auch in Rattenknoten und Petrosal-Ganglien gemessen. Siehe Ikeda et al., J. Neurophysiol. 55, 527 bis 539 (1986) und Stea et al., Neurosci. 47, 727 bis 736 (1992). Elektrophysiologen nehmen an, dass andere TTX-resistente Natriumkanäle noch entdeckt werden müssen.

Obwohl cDNA aus Rattenskelettmuskel, Herz und Gehirn bekannt ist, wurde die Identifizierung und Isolierung von cDNA aus peripherem sensorischem Nervengewebe, wie den Ganglien der Dorsalwurzel, bisher durch die Schwierigkeit, mit solchem Gewebe zu arbeiten, behindert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenzen, die Natriumkanalproteine des Nervengewebes von Säugetieren, insbesondere TTX-resistente, codieren, die stark exprimiert werden in ausgewachsenen DRG und Knotenganglien, weniger stark im Gehirn, Rückenmark und oberen Zervikalganglien exprimiert wird und nicht in Ischiasnerv, Herz oder Skelettmuskel exprimiert wird. In derzeit bevorzugten Formen umfassen neue DNA-Sequenzen cDNA-Sequenzen, die Natriumkanalprotein aus Rattennervengewebe codieren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die alpha -Untereinheit dieses Natriumkanalproteins.

Es wird DNA, cDNA und mRNA offenbart, die von den Nucleinsäuresequenzen der Erfindung abgeleitet ist, und cRNA, die von mRNA abgeleitet ist. Insbesondere codieren zwei cDNA-Sequenzen zusammen die gesamte Länge des Natriumkanals aus Rattennervengewebe.

Die Erfindung schliesst auch andere DNA-Formen, wie genomische DNA, DNA, die durch teilweise oder vollständige chemische Synthese aus Nucleotiden hergestellt wurde und DNA mit Deletionen oder Mutationen ein.

Weitere Aspekte der Erfindung sind das neue TTX-resistente Natriumkanalprotein und Fragmente davon, die von der erfindungsgemässen DNA codiert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind rekombinante Polynucleotide und Oligonucleotide, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die aus der DNA-Sequenz der Erfindung abgeleitet ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Stabilisierung von cDNA der vollen Länge, das die Proteinseguenz der Erfindung codiert.

Weitere Aspekte der Erfindung schliessen Expressionsvektoren ein, die die DNA der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, und eine cDNA-Bibliothek dieser Wirtszellen.

Teil der Erfindung bildet auch ein Assay für Inhibitoren des Natriumkanalproteins, der umfasst, dass man eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, in Kontakt bringt mit dem exprimierten Natriumkanal und die Aktivität des Natriumkanals misst.

Weiterhin wird ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität des TTX-resistenten Natriumkanals bereitgestellt, das umfasst, dass man eine wirksame Menge einer Verbindung mit einem IC50 von 10 mu M oder weniger verabreicht.

Zusätzlich werden Methoden bereitgestellt zur Anwendung der DNA zur Bildung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern zur Verwendung als Zielmoleküle für das Auffinden von Arzneimitteln, als hochspezifische Marker für spezifische Antigene, Detektormoleküle, diagnostische Assays und für therapeutische Anwendungen, wie Schmerzlinderung, eine Sonde für den PN5-Kanal in anderem Säugetiergewebe, die Entwicklung von Therapeutika und das Screenen von Therapien.

Kurze Beschreibung der SEQ IDs und Figuren
<LI> <LI>Die Fig. 1A bis E zeigen die native cDNA-Sequenz mit 5908 Nucleotiden, die den Rattennatriumkanal Typ 5 ("PN5") (SEQ ID Nr. 1) codiert, die aus zwei überlappenden cDNA-Klonen stammt, die mit 26.2 und 1.18 bezeichnet werden. <LI>Die Fig. 2A bis F zeigen die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5 (SEQ ID Nr. 2, dargestellt in Drei-Buchstaben-Aminosäurecode).

Die Fig. 2G bis H, die die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5 im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode zeigen, zeigen auch die homologen Domänen (I bis IV), mögliche Transmembransegmente (S1 bis S6); die Aminosäure, die die Resistenz gegenüber TTX beiträgt ( &diams& ); N-Glycosilierungsstellen (.); eine Phosphorylierungsstelle für eine cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA), (0) und das Stopcodon (*). <LI>Fig. 3A zeigt eine Sequenz für das menschliche PN5 mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3). Fig. 3B zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich des hPN5-Fragments mit Ratten-PN5. <LI>Fig. 4 zeigt die Sequenz der neuen Sonde für die Natriumkanal-Domäne IV (SEQ ID Nr. 4). <LI>Die Fig. 5A bis E zeigen die Nucleinsäuresequenz mit 5334 Nucleotiden modifiziert für Stabilität und Expression (SEQ ID Nr. 5).

Die Nucleotide 24 bis 5518 bilden die 5295bp-Region, die ein Protein mit 1765 Aminosäuren codiert. <LI>Fig. 6 zeigt die Klonierungskarte von PN5.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine gereinigte und isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein neues Säugetier-Natriumkanalprotein, das bevorzugt TTX-resistent ist, codiert. Der Ausdruck "gereinigte und isolierte DNA" bezieht sich auf DNA, die im Wesentlichen frei ist, d.h. weniger als etwa 30%, bevorzugt weniger als etwa 10%, und noch bevorzugter weniger als etwa 1% der DNA enthält, mit der die interessierende DNA natürlicherweise assoziiert ist. Techniken, um diese Reinheit zu erreichen, sind im Stand der Technik wohlbekannt und schliessen z.B. Restriktionskartierung, Agarosegelelektrophorese und Zentrifugation mit CsCl-Gradient ein.

Der Ausdruck "DNA" soll "cDNA" oder komplementäre DNA einschliessen, die einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann, DNA-Sequenzen, die durch reverse Transkription aus mRNA hergestellt wurden, die aus einer Donorzelle oder durch chemische Synthese isoliert wurde. Z.B. liefert die Behandlung von mRNA mit einer reversen Transkriptase, wie AMV-reverse-Transkriptase oder M-MuLV-reverse Transkriptase, in Gegenwart eines Oligonucleotidprimers ein RNA-DNA-Duplex, das mit RNase H, DNA-Polymerase und DNA-Ligase behandelt werden kann, um doppelsträngige cDNA zu erzeugen. Falls erwünscht, kann die doppelsträngige cDNA mit üblichen Techniken denaturiert werden, z.B. Erwärmen, um einzelsträngige cDNA zu erzeugen.

Der Ausdruck "cDNA" schliesst cDNA ein, die eine komplementäre Kopie der natürlich vorkommenden RNA ist, ebenso wie komplementäre Kopien von Varianten der natürlich vorkommenden RNA, die die gleiche biologische Aktivität haben. Varianten schliessen z.B. Insertionen, Deletionen, Sequenzen mit degenerierten Codons und Allele ein.

"cRNA", die mRNA entspricht, die aus einer DNA-Sequenz transkribiert wurde, die die alpha -Untereinheit eines neuen, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanalproteins codiert, wird erfindungsgemäss ebenfalls in Betracht gezogen. Der Ausdruck "cRNA" bezieht sich auf RNA, die eine Kopie der von der Zelle transkribierten mRNA ist.

Spezifisch umfasst die Erfindung DNA mit den nativen Versionen der Nucleotidsequenzen, die in den Fig. 1A bis E (SEQ ID Nr. 1) angegeben sind, die hier als Natriumkanal Typ 5 (PN5) bezeichnet werden. Die Fig. 1A bis E zeigen ein cDNA-Konstrukt mit 5908 Nucleotiden, das einen offenen Leserahmen mit 5298 Basen (wobei das Stop-Codon mitzählt) umfasst (SEQ ID Nr. 1). Der Nucleotidrest 79 stellt die Startstelle der Translation dar und der Rest 5376 stellt das Ende des Stop-Codons dar.

Die Erfindung umfasst auch technisch hergestellte Versionen von PN5 und spezifisch die Version, die in den Fig. 5A bis E angegeben ist (SEQ ID Nr. 5). Diesem Sall-Xbal-Klon mit 5334 Nucleotiden fehlt das meiste der untranslatierten Sequenzen, wobei der offene Leserahmen der 5298 Nucleotide bei Nucleotid 24 beginnt und bei Nucleotid 5321 endet. Die Start- und Stop-Codons sind unterstrichen, ebenso wie die bezüglich der Translation stillen Mutationen bei den Nucleotiden 3932, 3935, 3941, 3944 und 3947, die durch Blockumlagerung in diesem Bereich während des Wachstums von E. coli eingeführt wurden.

Die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 (Fig. 1A bis E) entspricht der cDNA der Ratte. Eine Homologiesuche zeigte, dass sich der am nächsten verwandte Natriumkanal im Rattenherzkanal findet, mit einer Homologie von 72,5%. Die am nächsten verwandten Kanäle sind rPN1 mit 72% und aus dem Rattengehirn die Typen I und III mit 71,8% bzw. 71,3%. Die Homologie von rPN3a, hPN3, rPN4, rPN4a, Rattengehirn Typ II und Rattenskelettmuskel ist jeweils ungefähr 70 bis 71%.

Ausserdem wurde ein Klon mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3), wie in Fig. 3A gezeigt, aus einer "cDNA-Bibliothek" von Humanganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, der eng verwandt ist mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 mit 79% Identität und 86% Homologie. Die humane PN5-Sequenz über spannt die Region zwischen IIIS1 und der Interdomäne III/IV, die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d.h. IFM) einschliesst, die innerhalb der Interdomäne III/IV angeordnet ist.

Der Ausdruck "cDNA-Bibliothek" bezieht sich auf eine Ansammlung von Klonen, gewöhnlich in einem Bakteriophagen oder weniger häufig in bakteriellen Plasmiden, die cDNA-Kopien von mRNA-Sequenzen enthalten, die aus einer Donorzelle oder Gewebe stammen.

Es wird angenommen, dass weitere Homologe des neuen TTX-resistenten Rattennatriumkanals, der hier beschrieben wird, auch in anderen Säugetiergeweben exprimiert werden.

Eine Northern-Blot-Analyse (Beispiel 5) zeigt, dass PN5 von einem &tilde& 6,5 kb Transkript codiert wird.

Die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5, die in den Fig. 2A bis F (SEQ ID Nr. 2) gezeigt ist, hat die primären Strukturmerkmale einer alpha -Untereinheit eines spannungsgesteuerten, TTX-resistenten Natriumkanals. In den Fig. 2G bis H sind die homologen Domänen (I bis IV), die möglichen Transmembransegmente (S1 bis S6), die Aminosäure, die die Resistenz gegenüber TTX beiträgt ( &diams& ), N-Glycosilierungsstellen (.) und c-AMP-abhängige PKA-Phosphorylierungsstellen (0) gezeigt. DNA-Sequenzen, die die gleichen oder allelische Varianten oder analoge Natriumkanalproteinpolypeptide des Nervensystems durch Verwendung, von zumindest teilweise degenerierten Codons, codieren, werden auch erfindungsgemäss in Betracht gezogen.

Ein interessantes Merkmal dieser abgeleiteten Aminosäuresequenz ist es, dass die Aminosäure, die am verantwortlichsten für die TTX-Empfindlichkeit ist, an Position 355 angeordnet ist und nicht, aromatisch ist. In Natriumkanälen aus der Ratte und dem menschlichen Gehirn, Skelettmuskelkanälen und in PN1 und PN4 ist diese Aminosäure Tyrosin oder Phenylalanin und diese Kanäle sind alle TTX-empfindlich. In PN3 und PN5 ist die Aminosäure ein Serin. Da PN3 äusserst resistent gegenüber TTX ist, ist die Schlussfolgerung, dass PN5 auch ein TTX-resistenter Kanal ist. Der Herzkanal hat ein Cystein an dieser Stelle und ist "unempfindlich" für TTX.

Obwohl PN5 alle wichtigen Merkmale eines spannungsgesteuerten Natriumkanals enthält, hat es einzigartige strukturelle Merkmale, die ihn von anderen Natriumkanälen unterscheiden. Z.B. hat DIIS4 5 basische Aminosäuren, die in allen Natriumkanälen konserviert sind, die eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Spannungsempfindlichkeit der Kanalfunktion spielen könnten. In PN5 ist die erste basische Aminosäure durch ein Alanin ersetzt. In ähnlicher Weise hat in DIIIS4 PN5 5 basische Aminosäuren statt 6, die in anderen Natriumkanalsequenzen vorhanden sind, wobei das letzte Arginin durch ein Glutamin ersetzt ist. In DIIIS3 enthält das Transmembransegment nur 18 Aminosäuren im Gegensatz zu 22 Aminosäuren in anderen Kanälen. Auch die kurze Linkerschleife (4 Aminosäuren) zwischen S3 und S4 in DIII ist noch kürzer durch eine "Deletion" von 3 Aminosäuren.

Diese Verkürzung von S3 und der Linkerschleife wurde bestätigt, indem Primer im geeigneten Bereich der Seguenz für ein RT-PCR-Experiment aus Ratten-DRG entwickelt wurden und das amplifizierte DNA-Fragment sequenziert wurde. Ein solcher Versuch wurde durchgeführt, um die Sequenz einer anderen Region von PN5, in der DIVS5-S6-Schleife zu bestätigen, wo eine Deletion eines Peptids mit 8 Aminosäuren war.

Eine Gewebeverteilungsanalyse mit reverser Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (durch Oligonucleotid geprimte RT-PCR) von RNA aus dem Rattenzentral- und Periphernervensystem, insbesondere aus Ratten-DRG, wurde durchgeführt. Acht Hauptgewebearten wurden gescreent auf die Expression der einzigartigen PN5-Gene, die den Positionen 5651 bis 5903 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen (Fig. 1A bis E). mRNA von PN5 war in 5 der untersuchten Gewebe vorhanden: Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und obere Zervikalganglien. PN5 war nicht vorhanden in den verbleibenden untersuchten Geweben: Ischiasnervgewebe, Herz oder Skelettmuskelgewebe. Es wurde gefunden, dass PN5 am stärksten in DRG und Knotenganglien ist, was die Anmelder dazu bringt, anzunehmen, dass DRG mit PN5 angereichert ist. PN5 zeigt dramatische Unterschiede über einen Bereich von Geweben.

PN5 hat einen Expressionsgradienten mit einer hohen Expression in DRG. PN5 hat einen Expressionsgradienten wie andere Kanäle, aber mit begrenzterer Verteilung.

Die Erfindung schliesst nicht nur das gesamte Protein ein, das von den cDNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 exprimiert wird, sondern schliesst auch Proteinfragmente ein. Diese Fragmente können erhalten werden, indem die vollständigen Proteine gespalten werden oder durch Verwendung kleinerer DNA-Sequenzen oder "Polynucleotide", um das gewünschte Fragment zu expriraieren.

Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine polymere Form von Polynucleotiden jeglicher Länge, sowohl Ribonucleotiden als auch Desoxyribonucleotiden. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls. Daher schliesst dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträngige RNA ein. Er schliesst auch modifizierte, z.B. durch Methylierung modifizierte und/oder am 5 min -Ende modifizierte, und unmodifizierte Formen des Polynucleotids ein.

Weiterhin soll der Ausdruck "Polynucleotid" ein rekombinantes Polynucleotid einschliessen, das genomischen Ursprungs, von cDNA, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs ist, das auf Grund seines Ursprungs oder durch Manipulation nicht mit allem oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist und/oder einem Polynucleo tid verbunden ist, ausser dem, mit dem es in der Natur verbunden ist.

Demzufolge schliesst die Erfindung auch Polynucleotide ein, die verwendet werden können, um Polypeptide mit einer Länge von etwa 10 bis 1500, bevorzugt 10 bis 100 Aminosäuren herzustellen. Die Isolierung und Reinigung solcher rekombinanten Polypeptide kann mit Techniken erreicht werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z.B. präparative chromatographische Trennung oder Affinitätschromatographie. Ausserdem können Polypeptide auch mit synthetischen Mitteln hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.

Die Erfindung ermöglicht die Manipulation von genetischem Material mit Gentechnik zur Erzeugung von Polypeptiden, die strukturelle und funktionelle Eigenschaften der spannungsgesteuerten, TTX-resistenten Natriumkanal- alpha -Untereinheit besitzen, die in sensorischen Nerven gefunden wird. Eine ortsgerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um solche rekombinanten Polypeptide zu liefern. Z.B. können synthetische Oligonucleotide spezifisch in den Teil des interessierenden Gens eingesetzt oder substituiert werden, um Gene zu erzeugen, die eine spezifische Mutante codieren und diese exprimieren. Statistische degenerierte Oligonucleotide können auch eingesetzt werden und eine Phagendisplaytechnik kann verwendet werden, um Polypeptide, die eine funktioneile Eigenschaft, an der man interessiert ist, besitzen, zu identifizieren und zu isolieren.

Ausserdem werden für die vorliegende Erfindung rekombinante Polynucleotide mit einer Länge von etwa 15 bis 20 kb, bevorzugt 10 bis 15 kb, Nucleotiden in Betracht gezogen, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die von der DNA der Erfindung "abgeleitet" ist.

Der Ausdruck "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die aus einer Sequenz mit ungefähr mindestens 6 bis 8 Nucleotiden, bevorzugter mindestens 10 bis 12 Nucleotiden und noch bevorzugter mindestens 15 bis 20 Nucleotiden aufgebaut ist, die einem Bereich der bezeichneten Sequenz entsprechen, d.h. dazu homolog oder komplementär sind. Die abgeleitete Sequenz ist nicht notwendigerweise physikalisch von der gezeigten Nucleotidsequenz abgeleitet, kann aber in irgendeiner Weise abgeleitet sein, z.B. durch chemische Synthese oder DNA-Replikation oder reverse Transkription, die auf der Information basiert, die durch die Sequenzen von Basen in dem Bereich, aus dem das Polynucleotid abgeleitet ist, stammt.

Ein neonataler Expressionstest wurde mit F11 durchgeführt, einer Fusionszelllinie, die aus neonatalem Ratten-DRG fusioniert mit einer Mauszelllinie, N18TG von Massachusetts General Hospital, entwickelt wurde. F11 reagiert auf trophische Mittel, wie NGF, durch Verlängerung von Dendriten. Es wurde gefunden, dass PN5 sowohl in nativem F11 als auch in F11, das mit NGF behandelt worden war, vorhanden war, das die Anmelder zu der Annahme führt, dass der Natriumkanal nativ in F11 exprimiert wird.

Die in-situ-Hybridisierung von PN5-mRNA mit Ratten-DRG-Gewebe liefert eine Lokalisierung hauptsächlich in den kleineren und mittleren Neuronen ohne Nachweis in grossen Neuronen.

PN5 wurde auch bezüglich der cytogenetischen Lokalisierung auf Mauschromosomen-Präparaten kartiert. PN5 liegt auf dem gleichen Chromosom wie der Herzkanal und PN3.

Im Allgemeinen umfassen Natriumkanäle eine alpha - und zwei beta -Untereinheiten. Die beta -Untereinheiten können die Funktion des Kanals modulieren. Da jedoch die alpha -Untereinheit alles ist, was erforderlich ist, damit der Kanal vollständig funktionell ist, liefert die Expression der cDNA in SEQ ID Nr. 1 (Fig. 1A bis E) ein voll funktionsfähiges Protein. Das Gen, das die beta 1-Untereinheit in peripherem Nervengewebe codiert, hat sich als identisch erwiesen zu dem, das in Rattenherz, Gehirn und Skelettmuskel gefunden wird. Die cDNA der beta 1-Untereinheit wird hier nicht beschrieben, da sie im Stand der Technik wohlbekannt ist, siehe Isom et al., Neuron 12, 1183 bis 1194 (1994).

Es versteht sich jedoch, dass man durch Kombinieren der bekannten Sequenz für die beta 1-Untereinheit mit der hier beschriebenen Sequenz der alpha -Untereinheit den vollständigen, spannungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten PN5-Natriumkanal erhalten kann.

Die vorliegende Erfindung schliesst auch "Expressionsvektoren" ein, die die oben beschriebene DNA oder cDNA umfassen, Wirtszellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, die den Natriumkanal der Erfindung erzeugen können und cDNA-Bibliotheken, die diese Wirtszellen umfassen.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezieht sich auf irgendein genetisches Element, z.B. ein Plasmid, ein Chromosom, einen Virus, der sich entweder als autonome Einheit der Polynucleotidexpression innerhalb einer Zelle verhält oder zur Replikation fähig gemacht wird durch Insertion in ein Wirtszellchromosom, das an ein anderes Polynucleotidsegment gebunden wird, um die Replikation und/oder Expression des gebundenen Segmentes zu erreichen. Geeignete Vektoren schliessen Plasmide, Bakteriophagen und Cosmide ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Vektoren enthalten Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Ligierung oder Insertion des Vektors in eine gewünschte Wirtszelle zu bewirken und die Expression des gebundenen Segments zu bewirken.

Solche Sequenzen unterscheiden sich abhängig vom Wirtsorganismus und schliessen Promotorsequenzen ein, um die Transkription zu bewirken, Enhancersequenzen, um die Transkription zu erhöhen, ribosomale Bin dungsstellensequenzen und Transkriptions- und Translationsterminationssequenzen.

Der Ausdruck "Wirtszelle" bezieht sich allgemein auf prokaryotische oder eukaryotische Organismen und schliesst irgendeinen transformierbaren oder transfizierbaren Organismus ein, der ein Protein exprimieren kann und als Empfänger für Expressionsvektoren oder andere transferierte DNA verwendet werden kann oder verwendet wurde. Wirtszellen können auch dazu gebracht werden, Protein zu exprimieren durch direkte Injektion von exogener cRNA, die in das interessierende Protein translatierbar ist. Eine bevorzugte Wirtszelle ist der Xenopus-Oocyt.

Der Ausdruck "transformiert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Sequenzen in eine prokaryotische Wirtszelle. Der Ausdruck "transfiziert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Seguenzen in eine eukaryotische Wirtszelle. Solche transformierten oder transfizierten Zellen schliessen stabil transformierte oder transfizierte Zellen ein, in denen die insertierte DNA zur Replikation in der Wirtszelle fähig gemacht worden ist. Sie schliessen auch vorübergehend exprimierende Zellen ein, die die insertierte DNA oder RNA nur für einen begrenzten Zeitraum exprimieren. Das Transformations- oder Transfektionsverfahren hängt von der zu transformierenden Wirtszelle ab.

Es kann ein Verpacken des Polynucleotids in einen Virus ebenso einschliessen, wie die direkte Aufnahme des Polynucleotids, wie z.B. durch Lipofektion oder Mikroinjektion. Die Transformation, und Transfektion kann zu einem Einbau der insertierten DNA in das Genom der Wirtszelle führen oder zur Aufrechterhaltung der insertierten DNA innerhalb einer Wirtszelle in Plasmidform. Methoden zur Transformation sind im Stand der Technik wohlbekannt und schliessen virale Infektion, Elektro poration, Lipofektion und durch Calciumphosphat vermittelte direkte Aufnahme ein, ohne darauf beschränkt zu sein.

Es versteht sich, dass die Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren, Wirtszellen und Transformationstechniken einschliessen soll, die äquivalenten Funktionen dienen und im Stand der Technik bekannt sind.

Die Erfindung betrifft auch einen Assay für Inhibitoren des neuen TTX-resistenten Natriumkanalproteins, der umfasst, dass eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, mit dem exprimierten Natriumkanal in Kontakt gebracht wird und die Aktivität des Natriumkanals gemessen wird. Die Verbindung kann eine im Wesentlichen reine Verbindung synthetischen Ursprungs sein, die mit einem wässrigen Medium kombiniert ist, oder die Verbindung kann ein natürlich vorkommendes Material sein, sodass das Testmedium ein Extrakt biologischen Ursprungs ist, z.B. ein Pflanzen-, Tier- oder mikrobieller Zellextrakt.

Die PN5-Aktivität kann mit Methoden, wie Elektrophysiologie (Zwei-Elektroden-Spannungsklemme oder Einzel-Elektroden-Whole-Cell-Klemme), Guanidiniumionenfluss-Assays und Toxinbindungs-Assays gemessen werden. Ein "Inhibitor" wird allgemein definiert als die Menge, die zu einer mehr als 50%igen Abnahme, bevorzugt mehr als 70%igen Abnahme der PN5-Aktivität, noch bevorzugter mehr als 90%igen Abnahme der PN5-Aktivität der PN5-Aktivität führt.

Es gibt viele Verwendungen für die Erfindung, von denen wenige im Folgenden beschrieben sind:

1. Sonde für Säugetierkanäle

Wie oben erwähnt, wird angenommen, dass weitere Homologe des neuen TTX-resistenten Rattennatriumkanals, der hier beschrieben wird, auch in Säugetiergewebe exprimiert werden, insbe sondere in menschlichem Gewebe. Die vollständigen cDNAs von PN5-Rattennatriumkanälen der vorliegenden Erfindung können als Sonde verwendet werden, um festzustellen, ob zusätzliche neue spannungsgesteuerte, bevorzugt TTX-resistente, PN5-Natriumkanäle im menschlichen Gewebe existieren und, falls ja, die Isolierung der cDNAs für das menschliche Protein zu fördern.

Die humanen Homologen der TTX-resistenten Ratten-PN5-Kanäle können kloniert werden unter Verwendung einer Human-DRG-cDNA-Bibliothek. Human-DRG wird bei einer Autopsie erhalten. Das gefrorene Gewebe wird homogenisiert und die RNA mit Guanidinisothiocyanat extrahiert (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 bis 5299, (1979)). Die RNA wird der Grösse nach fraktioniert auf einem Saccharosegradienten, um grosse mRNAs anzureichern, da die Natriumkanal- alpha -Untereinheiten von grossen (7 bis 11 kb) Transkripts codiert werden. Doppelsträngige cDNA wird hergestellt unter Verwendung des SuperScript Choice cDNA-Kits (GIBCO BRL) entweder mit Oligo (dT) oder statistischen Hexamerprimern. EcoRI-Adapter werden an die doppelsträngige cDNA ligiert, die dann phosphoryliert wird.

Die cDNA-Bibliothek wird konstruiert, indem die doppelsträngige cDNA in den Bakteriophagen lambda- ZAPII-Vektor (Stratagene) ligiert wird und anschliessend in Phagenteilchen verpackt wird.

Phagen werden auf 150 mm-Platten auf einem Rasen von XLI-Blue MRF min -Bakterien (Stratagene) ausplattiert und Plaque-Abdrücke werden auf Hybond N-Nylonmembranen (Amersham) erstellt. Die Filter werden mit Ratten-PN5-cDNA-Sonden mit Standardverfahren hybridisiert und durch Autoradiographie oder Chemilumineszenz nachgewiesen. Das von den Ratten-PN5-Sonden erzeugte Signal, das mit positiven humanen Klonen mit hoher Stringenz hybridisiert, sollte stärker sein, als das, das mit Natriumkanalsonden aus Rattengehirn erhalten wird, die mit diesen Klonen hybridisieren. Positive Plaques werden weiter gerei nigt durch begrenzte Verdünnung und erneutes Screenen durch Hybridisierung oder PCR.

Eine Restriktionskartierung und Polymerase-Kettenreaktion identifiziert überlappende Klone, die mit Standardtechniken zusammengesetzt werden können zu einem humanen Homolog von Ratten-PN5 mit voller Länge. Der Humanklon kann exprimiert werden, indem cRNA in vitro aus dem cDNA-Klon voller Länge in Xenopus-Oocyten indiziert wird oder indem eine Säugetierzelllinie mit einem Vektor transfiziert wird, der die cDNA, gebunden an einen geeigneten Promotor, enthält.

2. Antikörper gegen PN5

Die erfindungsgemässen Polypeptide sind sehr nützlich zur Entwicklung von Antikörpern gegen PN5. Solche Antikörper können in der Affinitätschromatographie verwendet werden, um rekombinante Natriumkanalproteine oder Polypeptide zu reinigen oder sie können verwendet werden als Forschungshilfsmittel. Z.B. können Antikörper, die an ein Reportermolekül gebunden sind, verwendet werden für histochemische Anfärbungstechniken, um andere Gewebe- und Zelltypen zu identifizieren, in denen PN5 vorhanden ist, oder sie können verwendet werden, um Epitop- oder funktionelle Regionen des erfindungsgemässen Natriumkanalproteins zu identifizieren.

Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können mit Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Polyklonale Antikörper werden wie folgt hergestellt: ein immunogenes Konjugat, das PN5 oder ein Fragment davon umfasst, gegebenenfalls gebunden an ein Trägerprotein, wird verwendet, um ein ausgewähltes Säugetier, z.B. eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege etc., zu immunisieren. Serum von dem immunisierten Säugetier wird gesammelt und mit bekannten Verfahren behandelt, um die Immunglobulinfraktion abzutrennen.

Monoklonale Antikörper werden mit Standardhybridomazelltechnologie hergestellt auf Basis des Artikels von Köhler und Milstein in Nature 256, 495 bis 497 (1975). Milzzellen werden von einem Wirtstier erhalten, das mit dem PN5-Protein oder einem Fragment davon immunisiert wurde, gegebenenfalls gebunden an einen Träger. Hybridzellen werden gebildet, indem diese Milzzellen mit einer geeigneten Myelomzelllinie fusioniert werden und gezüchtet werden. Die von den Hybridzellen erzeugten Antikörper werden auf ihre Fähigkeit, an exprimierte PN5-Proteine zu binden, gescreent.

Eine Anzahl von Screeningtechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z.B. vorwärts oder rückwärts gerichtete enzymgebundene Immunosorbent-Assay-Screeningmethoden können angewendet werden. Die Hybridzellen, die solche Antikörper erzeugen, werden dann einer erneuten Klonierung und hohen Verdünnungsbedingungen unterzogen, um eine Hybridzelle auszuwählen, die eine homogene Population von Antikörpern sezerniert, die für ein PN5-Protein spezifisch sind.

Ausserdem können Antikörper gezüchtet werden durch Klonieren und Exprimieren von Nucleotidsequenzen oder mutagenisierte Versionen davon, die mindestens die Aminosäuresequenzen codieren, die für die spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlich sind und diese exprimierten Proteine können als Immunogen verwendet werden.

Antikörper können das vollständige Immunglobulin oder ein Fragment davon einschliessen. Antikörper können an eine Reportergruppe, z.B. wie oben für Polynucleotide beschrieben, gebunden sein.

Beispiel 10 erläutert ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers.

3.Therapeutische Ziele für Verbindungen, um Störungen zu behandeln, und Tests dafür

Die vorliegende Erfindung schliesst auch die Verwendung der neuen spannungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanal- alpha -Untereinheit als therapeutisches Ziel für Verbindungen ein, um Störungen des Nervensystems auf Basis von RT-PCR-Lokalisierungsdaten zu behandeln. Die Störungen schliessen Epilepsie, Schäden durch Schlaganfall, Gehirnschäden, diabetische Neuropathie, traumatische Schäden, chronisch-neuro-pathische Schmerzen und mit AIDS assoziierte Neuropathie ein, ohne darauf beschränkt zu sein.

4. Entwicklung von Therapeutika, basierend auf der Hemmung von PN5 und Tests dafür

Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, die Aktivität von PN5 in Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und oberen Zervikalgangliengeweben zu hemmen. Es versteht sich jedoch, dass weitere Untersuchungen ergeben können, dass PN5 in anderen Geweben vorhanden ist, und diese Gewebe können dann auch Zielbereiche sein. Z.B. deutet der Nachweis von PN5-mRNA in Knotenganglien darauf hin, dass PN5 TTX-resistente Natriumströme in diese und andere sensorische Ganglien des Nervensystems leiten könnte.

Ausserdem wurde gefunden, dass Proteine, die normalerweise nicht in bestimmten Geweben exprimiert werden, bei einem Krankheitszustand exprimiert werden. Daher soll die Erfindung die Hemmung von PN5 in Geweben und Zellarten, in denen das Protein normalerweise exprimiert wird, und in solchen Geweben und Zellarten, wo das Protein nur während eines Krankheitszustandes exprimiert wird, umfassen.

Es wird z.B. angenommen, dass TTX-resistente Natriumkanäle eine Schlüsselrolle bei der Übertragung von Nervenimpulsen spielen, die sich auf sensorische Inputs, wie Schmerz und Druck beziehen. Diese Information erleichtert die Entwicklung von Therapeutika, die spezifisch in Bereiche, wie das periphere Nervengewebe, geführt werden können.

Das rekombinante Protein der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um potenzielle Therapeutika zu screenen, die die Fähigkeit haben, den interessierenden Natriumkanal zu hemmen. Insbesondere wäre es nützlich, selektiv die Funktion von Natriumkanälen in peripherem Nervengewebe zu hemmen, das für die Übermittlung von Schmerz- und Drucksignalen verantwortlich ist, ohne gleichzeitig die Funktion der Natriumkanäle in anderen Geweben wie Herz und Muskel, zu beeinflussen. Eine solche Selektivität würde die Behandlung von Schmerzen zulassen, ohne Nebenwirkungen zu verursachen auf Grund von Herz- oder neuromuskulären Komplikationen. Es wäre daher nützlich, DNA-Sequenzen zur Verfügung zu haben, die Natriumkanäle codieren, die selektiv in peripherem Nervengewebe exprimiert werden.

5. Schmerzlinderung

Natriumkanäle in peripherem Nervengewebe spielen eine grosse Rolle in der Übertragung von Nervenimpulsen und daher sind sie ein Instrument, um die neuropathische Schmerzübertragung zu verstehen. Neuropathischer Schmerz lässt sich in zwei Komponenten aufteilen: Allodynie, bei der ein normalerweise nicht schmerzlicher Stimulus schmerzerzeugend wird und Hyperalgesie, wo ein gewöhnlicher normal schmerzerzeugender Stimulus extrem schmerzvoll wird.

In Gewebelokalisierungsuntersuchungen kartiert PN5-mRNA kleine und mittlere Neurone von DRG. PN5-mRNA ist auch im Gehirn und Rückenmark vorhanden. Das Hemmen der Aktivitäten kann das Auftreten von Kopfschmerzen und Migräne verhüten helfen. Die Fähigkeit, die Aktivität dieser Natriumkanäle zu hemmen, d.h. die Übertragung von Nervenimpulsen zu vermindern, beeinflusst die Fähigkeit der Nerven, Schmerzimpulse zu übertragen. Die selektive Hemmung von Natriumkanälen in sensorischen Neuronen, wie DRG, lässt die Blockierung von Schmerzimpulsen zu, ohne Nebenwirkungen zu erzeugen, die durch die Hemmung von Natriumkanälen in anderen Geweben, wie Gehirn und Herz verursacht werden. Ausserdem werden bestimmte Krankheiten durch Natriumkanäle verursacht, die Impulse mit einer extrem hohen Frequenz erzeugen.

Die Fähigkeit, die Aktivität des Kanals zu vermindern, kann dann die Krankheit eliminieren oder lindern. Somit können potenzielle therapeutische Verbindungen mit Methoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Aktivität des erfindungsgemässen rekombinanten Natriumkanals hemmen können. M. Barram et al., Naun-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 347, 125 bis 132 (1993) und E.T. McNeal et al., J. Med. Chem. 28, 381 bis 388 (1985). Für ähnliche Studien mit dem Acetylcholinrezeptor siehe Claudio et al., Science 238, 1688 bis 1694 (1987).

Z.B. können Schmerzen gelindert werden, indem die Aktivität des neuen, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanals gehemmt wird, was umfasst, dass man eine therapeutisch wirksame Menge mit einem IC50 von ungefähr 10 mu M oder weniger, bevorzugt </= 1 mu M, verabreicht. Potenzielle therapeutische Verbindungen werden identifiziert auf Basis ihrer Fähigkeit, die Aktivität von PN5 zu hemmen. Daher kann der vorher erwähnte Test verwendet werden, um Verbindungen mit einer therapeutisch wirksamen IC50 zu identifizieren.

Der Ausdruck "IC50" bezieht sich auf die Konzentration einer Verbindung, die erforderlich ist, um die Aktivität von exprimiertem PN5 um 50% zu hemmen, wenn die Aktivität mit Elektrophysiologie, Strömungstests und Toxinbindungstests, wie oben erwähnt, gemessen wird.

6. Diagnostische Tests

Die Basistechniken der Molekularbiologie, die verwendet werden, um Merkmale der Erfindung zu erreichen, wie RNA-, DNA- und Plasmidisolierung, Restriktionsenzymverdau, Herstellung und Sondierung einer cDNA-Bibliothek, Sequenzierung von Klonen, Konstruktion von Expressionsvektoren, Transformation von Zellen, Aufrechterhaltung und Züchtung von Zellkulturen und andere allgemeine Techniken sind im Stand der Technik wohlbekannt und Beschreibungen dieser Techniken finden sich in üblichen Laborhandbüchern, wie Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989).

Z.B. können die Polynucleotide der Erfindung an ein "Reportermolekül" gebunden werden, um eine Polynucleotidsonde zu bilden, die für die Northern- und Southern-Blot-Analyse und für in-situ-Hybridisierungen nützlich ist.

Der Ausdruck "Reportermolekül" bezieht sich auf eine chemische Einheit, die mit einem geeigneten Nachweismittel nachgewiesen werden kann, einschliesslich von spektrophotometrischen, chemilumineszierenden, immunochemischen und radiochemischen Mitteln, ohne darauf beschränkt zu sein. Die erfindungsgemässen Polynucleotide können an ein Reportermolekül mit im Stand der Technik wohlbekannten Techniken konjugiert werden. Typischerweise enthält das Reportermolekül eine funktionelle Gruppe, die geeignet ist zur Bindung an oder zum Einbau in das Polynucleotid. Die funktionellen Gruppen, die zur Bindung der Reportergruppe geeignet sind, sind gewöhnlich aktivierte Ester oder Alkylierungsmittel. Details von Techniken, um Reportergruppen zu binden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. J.A. Matthews, A. Batki, C. Hynds und L. J. Krickat, Anal.

Biochem. 151, 205 bis 209 (1985) und Engelhardt et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 302 175. Somit sind die folgenden Beispiele nur erläuternd für Techniken, mit denen die Erfindung durchgeführt werden kann.

Abkürzungen

Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet und haben die jeweils unten definierten Bedeutungen:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>BSA:<SEP>Rinderserumalbumin
<tb><SEP>Denhardt's
Lösung:<SEP>0,02% BSA, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll
(0,1 g BSA, 0,1 g Ficoll und 0,1 g Polyvinylpyrrolidon pro 500 ml)
<tb><SEP>DRG:<SEP>Ganglien der Dorsalwurzel
<tb><SEP>EDTA:<SEP>Tetranatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure
<tb><SEP>MEN:<SEP>20 mM MOPS, 1 mM EDTA, 5 mM Natriumacetat, pH 7,0
<tb><SEP>MOPS:<CEL AL=L>3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (Sigma Chemical Company)
<tb><SEP>PN5:<SEP>Peripherer Nervennatriumkanal 5
<tb><CEL AL=L>PNS:<SEP>Peripheres Nervensystem
<tb><SEP>SDS:<SEP>Natriumdodecylsulfat
<tb><SEP>SSC:<SEP>150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0
<tb><SEP>SSPE:<SEP>80 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM Ethylendiamintetraacetat, pH 8,0
<tb><SEP>TEV:

<SEP>Zwei-Elektroden-Spannungsklemme
<tb><SEP>TTX:<SEP>Tetrodotoxin (Sigma Chemical Company)
<tb></TABLE>

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Durchführung der Erfindung.

Materialien:

Das Plasmid pBK-CMV wurde von Stratagene (La Jolla, CA) erhalten; das Plasmid pBSTA wird von Goldin et al. in Methods in Enzymology (Rudy & Iverson, Herausgeber), 207, 279 bis 297 beschrieben; das Plasmid pCIneo wurde von Promega (Madison, WI) erhalten und das Plasmid pCRII wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA) erhalten.

Das Oocyten-Expressionsvektor-Plasmid pBSTAcllr wurde aus pBSTA konstruiert durch Insertion eines synthetischen Oligonucleotidlinkers; Plasmid pKK232-8 wurde von Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) erhalten; Plasmid pCRII wurde von Invitrogen, San Diego, CA erhalten. Die kompetenten E. coli-Zelllinien STBL2 TM und SURE< TM > wurden von Gibco/BRL bzw. Stratagene erhalten.

Beispiel 1

Gewinnung von RNA aus Ratten-DRG, Gehirn und Rückenmark

Lumbal-DRG Nr. 4 und Nr. 5 (L4 und L5), Gehirn und Rückenmark wurden aus anästhesierten männlichen ausgewachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Präpariermikroskop entnommen. Die Gewebe wurden in Trockeneis eingefroren und mit einem Polytron-Homogenisator homogenisiert; die RNA wurde mit dem Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren extrahiert (siehe Chomczynski et al., Anal. Biochemistry 162, 156 bis 159 (1987)). Die gesamte RNA (5 mu g jeder Probe) wurde in MEN-Puffer gelöst, der 50% Formamid, 6,6% Formaldehyd enthielt und bei 65 DEG C 5 bis 10 Minuten lang denaturiert. Die RNA wurde elektrophoretisch behandelt mit einem 0,8% Agarosegel, das 8,3% Formaldehyd in MEN-Puffer enthielt. Der Elektrodenpuffer war MEN-Puffer, der 3,7% Formaldehyd enthielt; das Gel wurde mit 50 Volt 12 bis 18 Stunden lang laufen gelassen.

Grössenmarker, einschliesslich ribosomale 18S- und 28S-RNA und RNA-Marker (GIBCO BRL) wurden in parallelen Bahnen des Gels laufen gelassen. Ihre Positionen wurden bestimmt, indem die ausgeschnittene Bahn mit Ethidiumbromid (0,5 mu g/ml) gefärbt wurde und anschliessend unter UV-Licht fotografiert wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 2 x SSC gespült und die ENA wurde auf eine Duralose-Membran (Stratagene) überführt mit 20 x SSC durch Kapillarwirkung; die Membran wurde im Vakuum bei 80 DEG C 1 Stunde lang gebacken.

Beispiel 2

Sonde aus Rattengehirn IIA

Eine mit <3><2>P-markierte cRNA-Sonde, die komplementär zu den Nucleotiden 4637 bis 5868 der Sequenz der Natriumkanal- alpha -Untereinheit von Rattengehirn IIA war, wurde in vitro mit T7-RNA-Polymerase (Pharmacia) synthetisiert unter Verwendung von pEAF8-Matrizen-DNA (Noda et al., Nature 320, 188 bis 192 (1986)), die mit BstEII linearisiert worden war.

Die Protokolle für jedes oben erwähnte Verfahren finden sich in Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989).

Beispiel 3

Hybridisierung von RNA mit der Sonde aus Rattengehirn IIA

Die Membran von Beispiel 1 wurde 16 Stunden bei 42 DEG C mit 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 1 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma-DNA (1 mg/ml) prähybridisiert. Die Membran wurde in 50% Formamid, 5 x SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 1 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma-DNA (200 mu g/ml) mit der <3><2>P-markierten cRNA-Sonde (ca. 1 bis 3 x 10<6> cpm/ml), wie in Beispiel 2 beschrieben, 18 Stunden lang bei 42 DEG C hybridisiert.

Die Membran wurde mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gespült und dann aufeinander folgend mit 2 x SSC, 0,1% SDS bei 55 DEG C 30 Minuten lang, 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 65 DEG C 30 Minuten lang, 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 70 DEG C 30 Minuten lang und 0,2 x SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat bei 70 DEG C 20 Minuten lang gewaschen. Der Filter wurde einem Kodak X-omat AR Film bei -80 DEG C mit verstärkenden Schirmen bis zu 2 Wochen lang ausgesetzt.

Die pEAF8-Sonde hybridisierte mit mRNAs in der DRG-Probe mit Grössen von 11 kb, 9,5 kb, 7,3 kb und 6,5 kb, abgeschätzt auf Basis der Position relativ zu den Standards.

Beispiel 4

Neue Natriumkanal-Domäne-IV-Sonde

Die Sonde wurde wie folgt erhalten: eine RT-PCR wurde durchgeführt an RNA, die aus Ratten-DRG isoliert wurde unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotidprimern, die auf Basis der Homologie zwischen bekannten Natriumkanälen in Domäne IV entwickelt wurden. Die Produkte der Domäne IV wurden in einem Plasmidvektor kloniert in E. coli transformiert und einzelne Kolonien isoliert. Die für die Domäne IV spezifischen PCR-Produkte, die aus verschiedenen dieser Kolonien erhalten worden waren, wurden einzeln sequenziert. Die klonierte neue Seguenz der Domäne IV war wie folgt (SEQ ID Nr. 4):
EMI29.1

Diese Sequenz wurde durch Random-Priming mit <3><2>P markiert.

Beispiel 5

Hybridisierung von RNA mit der neuen Natriumkanal-3 min -UTR-Sonde

Ein Northern-Blot wurde vorbereitet mit 10 mu g Gesamt-RNA aus Rattengehirn, Rückenmark und DRG. Der Blot wurde mit einer cRNA-Sonde aus der 3 min -UTR hybridisiert. Die 3 min -UTR wurde in einen pSP73-Vektor kloniert, die cRNA unter Verwendung eines Trans Probe T-Kits (Pharmacia Biotech) und von <3><2>P-UTP transkribiert. Der Blot wurde 2 Stunden lang bei 65 DEG C in einer Lösung, die 5 x SSC, 1 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, Lachssperma-DNA (1 mg/ml) und 50% Formamid enthielt, vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 45 DEG C 18 Stunden lang in der obigen Lösung durchgeführt, ausser dass die Lachssperma-DNA in einer Konzentration von 20 mu g/ml enthalten war, und die mit <3><2>P markierte Sonde wurde mit 7,5 x 10<5> cpm/ml Lösung zugegeben.

Der Blot wurde anschliessend dreimal mit 2 x SSC und 0,1% SDS bei Raumtemperatur, einmal mit 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 65 DEG C 20 Minuten lang, und einmal mit 0,2 x SSC, 0,1% SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat bei 65 DEG C 20 Minuten lang gewaschen. Der Blot wurde mit einem Phospholmager (BioRad) nach 2-tägiger Belichtung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass ein &tilde& 6,5 kb Bandensignal, in Gehirn vorhanden war, nur in der Bahn, die die RNA von DRG enthielt. Wegen der geringeren Menge von PN5-mRNA, die durch den RT-PCR-Versuch gezeigt wurde, war die 6,5-kb-Bande in Gehirn und Rückenmark nicht nachweisbar.

Beispiel 6

Konstruktion und Screenen einer cDNA-Bibliothek von Ratten-DRG

Eine an EcoR1 angepasste cDNA-Bibliothek wurde aus der Ratten-DRG-poly(A)+ -RNA von ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten erstellt unter Verwendung des SuperScript Choice Systems (GIBCO BRL). cDNA (> 4 kb) wurde mit einer Fraktionierung mit Saccharosegradient ausgewählt, wie von Kieffer, Gene 109, 115 bis 119 (1991) beschrieben. Die cDNA wurde dann in den Zap-Express-Vektor (Stratagene) ligiert und mit dem Gigapack-II-XL-lambda-Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt. In ähnlicher Weise wurde eine > 2 kb-DRG-cDNA-Bibliothek synthetisiert.

Der Phage (3,5 x 10<5>) wurde mit Filterhybridisierung mit einer mit <3><2>P-markierten Sonde (rBIIa, Basen 4637 bis 5868 gemäss Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988)) gescreent. Die Filter wurden in 50% Formamid, 5 x SSPE, 5 x Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 250 mu g/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 50 mM Natriumphosphat bei 42 DEG C hybridisiert und in 0,5 x SSC/0,1% SDS bei 50 DEG C gewaschen.

Southern Blots von mit EcoRI verdauten Plasmiden wurden mit der mit <3><2>P markierten DNA-Sonde (SEQ ID Nr. 4) hybridisiert. Die Filter wurden dann in 50% Formamid, 6 x SSC, 5 x Den hardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 mu g/ml denaturierter Lachssperma-DNA bei 42 DEG C hybridisiert und in 0,1 x SSC/0,1% SDS bei 65 DEG C gewaschen.

Positive Klone wurden in vivo abgetrennt in pBK-CMV unter Verwendung des ExAssist/XLOLR-Systems (Stratagene).

Beispiel 7

Klone und Nucleotidanalyse

cDNA-Klone, 26.2 und 25.1, wurden aus der > 4 kb-DRG-cDNA-Bibliothek isoliert und der Klon 1.18 wurde aus der > 2 kb-DRG-cDNA-Bibliothek isoliert. Durch Sequenzanalyse schien 26.2 eine cDNA voller Länge zu sein, die einen neuen Natriumkanal codiert und 25.1 erstreckte sich von Domäne II zu der 3 min -UTR. Jedoch hatte jeder eine Deletion, die die codierende Region trunkierte. Klon 1.18 hatte die 3 min -untranslatierte Region zusätzlich zu dem C-Terminus der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PN5. Das Konstrukt in dem Expressionsvektor pBSTACIIr bestand aus den Sequenzen von 26.2 und 1.18.

Die PN5-Homologie mit anderen bekannten Natriumkanälen wurde erhalten unter Verwendung des GAP/Best Fit(GCG)Programms:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 1: Kanal
<tb>Head Col 2: % Ähnlichkeit
<tb>Head Col 3: % Identität
<tb><SEP>PN3a<SEP>71<SEP>54
<tb><SEP>hPN3<SEP>71<SEP>55
<tb><CEL AL=L>PN4<CEL AL=L>71<SEP>53
<tb><SEP>PN4a<SEP>71<SEP>53
<tb><SEP>PN1<SEP>72<SEP>55
<tb><CEL AL=L>Rattengehirn Typ I<SEP>72<SEP>55
<tb><SEP>Rattengehirn Typ II<SEP>71<SEP>54
<tb><SEP>Rattengehirn Typ III<CEL AL=L>71<SEP>54
<tb><SEP>Rattenherzkanal<SEP>73<SEP>56
<tb><SEP>Rattenskelettmuskelkanal<SEP>71<CEL AL=L>53
<tb></TABLE>

Stabilisierung der PN5-cDNA voller Länge

A. Medien, E. coli-Zelllinien und Wachstumsbedingungen

Das Wachstum von Fragmenten von PN5 wurde unter den folgenden Standardbedingungen erreicht; das Wachstum von Plasmiden, die Konstrukte mit PN5 in voller Länge enthielten (in pCIneo, pBSTAcIIr und anderen Vektoren) konnte nicht ohne Verwendung spezieller Wachstumsmedien, Bedingungen und E. coli-Stämme erreicht werden.

Die folgenden Bedingungen erwiesen sich als optimal:
(1) Verwendung von E. coli-STBL2 TM für die primäre Transformation nach Ligierungsreaktionen und für die Züchtung in grossem Massstab;
(2) feste Medien waren 1/2 x FM (siehe unten) plus 1 x LB (Trypton, 1%, Hefeextrakt 0,5%, NaCl, 0,5%) plus 15 g/l Agar oder 1 x FM plus 1/2 x LB;
(3) flüssige Medien waren optimalerweise 1 x FM plus 1/2 x LB;
(4) Carbenicillin, 100 mu g/ml wurde für alle Medien verwendet, da es weniger schnell als Ampicillin metabolisiert wird;
(5) die Temperatur für das Wachstum sollte nicht höher als 30 DEG C sein, gewöhnlich 24 bis 26 DEG C; dies erfordert längere Wachstumsperioden als normalerweise angewendet von 24 bis 72 Stunden.

2 x Friermedium (2 x FM):

<tb><TABLE> Columns=2
<tb><SEP>K2HPO4<SEP>12,6 g
<tb><SEP>Na3Citrat<SEP>0,9 g
<tb><SEP>MgSO4 . 7 H2O<CEL AL=L>0,18 g
<tb><SEP>(NH4)2SO4<SEP>1,8 g
<tb><SEP>KH2PO4<SEP>3,6 g
<tb><SEP>Glycerol<SEP>88 g
<tb><CEL AL=L>H2O<SEP>auf 1l
<tb></TABLE>

2 x FM und die verbleibenden Medienkomponenten werden getrennt, vorbereitet, durch Autoklavieren sterilisiert, auf mindestens 60 DEG C gekühlt und zusammengegeben, um das fertige Medium zu bilden. Carbenicillin wird hergestellt mit 25 mg/ml H2O und durch Filtration sterilisiert. 2 x FM wurde zuerst beschrieben zur Herstellung von gefrorenen Vorräten von Bakterienzellen (Practical Methods in Molecular Biology, R.F. Schleif und P.C. Wensink, Springer Verlag, New York (1981), Seiten 201 bis 202).

B. Expressionsvektoren

Um der cDNA mit voller Länge eine erhöhte Stabilität zu verleihen, wurde der Oozyten-Expressionsvektor pBSTAcIIr modifiziert, um die Plasmidkopienzahl zu vermindern, wenn er in E. coli gezüchtet wurde, und um möglicherweise die Transkription von Vektorsequenzen, die zu der toxischen kryptischen Expression von PN5-Protein führen könnten, zu vermindern, J. Brosius, Gene 27, 151 bis 160 (1984). pBSTAcIIr wurde mit PvuII verdaut.

Das 755 bp-Fragment, das den T7-Promotor, beta -Globin-5 min -UTR, die multiple Klonierungsstelle, beta -Globin-3 min -UTR und den T3-Promotor enthielt, wurde mit dem 3,6 kb-Fragment, das den Replikationsursprung, das Ampicillin-Resistenzgen, die rrnBT1- und rrnBT1T2-Transkriptionsterminatoren von pKK232-8 enthielt, das vollständig mit Smal und teilweise mit PvuII-Gemisch verdaut worden war, ligiert und mit intestinaler Phosphatase von Krabben behandelt, um die Selbstligierung zu verhindern. Das entstehende Plasmid, in dem die Orientierung des pBSTA-Fragmentes so ist, dass der T7-Promotor proximal zu dem rrnBT1-Terminator ist, wurde identifiziert durch Restriktionskartierung und mit pHQ8 bezeichnet.

Wie im Fall von pBSTA sind die Richtung der Transkription des Ampicillin-Resistenzgens und des Replikationsursprungs von pHQ8 entgegengesetzt der der Genexpressionskassette und die Gegenwart des rrnBT1-Terminators sollte das Weiterlesen des Vektors in der von dem P7-Promotor gesteuerten Expressionskassette vermindern.

C. Zusammenfügung von cDNA voller Länge für die Expression

Da pBK-CMV.26.2 eine Deletion von 58 bp hatte (entsprechend dem bp 4346 bis 4403 von SEQ ID Nr. 1) und die Sequenz von pBK-CMV.1.18 bei bp 4180 von SEQ ID Nr. 1 beginnt, könnte pBK-CMV.1.18 verwendet werden, um pBK-CMV.26.2 zu "reparieren". Es wurde eine Strategie entwickelt, um eine cDNA voller Länge zusammenzusetzen aus den Klonen pBK-CMV.26.2 und pBK-CMV.1.18 in drei Sektionen, wobei die 5 min - und 3 min -UTRs trunkiert wurden und eine einzige Restriktionsstelle an den 5 min - und 3 min -Enden in dem Verfahren eingeführt wurde. Das 5 min -Ende wurde erzeugt durch PCR aus 26.2, Trunkieren des 5 min -UTRs durch Einbau einer Sall-Stelle direkt stromaufwärts des Start-Codons. Der Zentralbereich war ein Restriktionsfragment von 26.2.

Das 3 min -Ende wurde hergestellt durch überlappende PCR sowohl aus 26.2 als auch 1.18 und Einbau einer Xbal-Stelle direkt stromabwärts des Stopcodons. Diese Bereiche wurden an den einzelnen Restriktionsstellen verdaut und in pBSTAcIIr eingesetzt. Obwohl dieses Konstrukt eine korrekte Sequenz zu haben schien, wurden beim erneuten Klonieren als Sall-Xbal-Fragment in pCIneo zwei Arten von Isolaten gefunden, eines mit einer Deletion und eines mit einer 8 bp-Insertion. Die erneute Untersuchung des pBSTAcIIr-Klons zeigte, dass die Sequenz in diesem Bereich "gemischt" war, sodass der Klon sich umgelagert haben musste. Die 8 bp-Insertion erwies sich als Sequenzwiederholung eines Mitglieds einer 8 bp-Verdoppelung in der nativen Sequenz, was eine dreifache Sequenzwiederholung von 8 bp in dem umgelagerten Isolat bildete.

Zahlreiche Klonierungsversuche führten unausweichlich zu dieser Umlagerung. Überlappende PCR wurde verwendet, um stille Mutationen in eine der 8 bp-Sequenzwiederholungen einzuführen und ein Fragment, das diese Region enthielt, war enthalten, als die PN5-codierende Region in HQ8 eingesetzt wurde, die Version mit niedriger Kopienzahl von pBSTAcIIr, was Plasmid HR-1 ergab. Diese Sequenz erwies sich als stabil (siehe Fig. 5A bis E, SEQ ID Nr. 5).

Das 5 min -Ende des Fragmentes wurde mit PCR gebildet unter Verwendung von pBK-CMV.26.2-DNA als Matrize und der Primer 4999
EMI35.1
Sall-Stelle unterstrichen, PN5-Homologie kursiv, entsprechend bp 58 bis 77 von SEQ ID Nr. 1, Initiationscodon fett) und 4927
EMI35.2
entsprechend bp 1067 bis 1047 von SEQ. ID Nr. 1), gefolgt von einer Gelreinigung, Verdau mit Sall und Kpnl (Kpnl-Stelle bei pb 1003 bis 1008, SEQ ID Nr. 1) und Gelreinigung.

Das zentrale 3.1 kb-Fragment wurde hergestellt durch Verdau von pBK-CMV.26.2-DNA mit Kpnl und Aatll (Aatll-Stelle bei 4133 bis 4138) und anschliessende Gelreinigung.

Das 3 min -Ende des Fragmentes wurde wie folgt hergestellt: PCR unter Verwendung der Primer 4837
EMI35.3
entsprechend bp 3613 bis 3629 von SEQ. ID Nr. 1) und 4931
EMI35.4
entsprechend bp 4239 bis 4218 von SEQ ID Nr. 1) auf pBK-CMV.26.2-DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 0,6 kb. Eine PCR unter Verwendung der Primer 4930
EMI35.5
entsprechend bp 4218 bis 4239 von SEQ ID Nr. 1) und 4929
EMI35.6
Xbal-Stelle unterstrichen, PN5-Homologie kursiv, entsprechend pb 5386 bis 5365 von SEQ ID Nr. 1; Stop-Codon fett) auf pBK-CMV.1.18-DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 1,2 kb, das eine Xbal-Stelle 7 bp vom Stop-Codon entfernt einführte. Somit ist das 3 min -Ende des 4837 bis 4931-Fragmentes exakt komplementär zu dem 5 min -Ende des 4930 bis 4929-Fragments.

Diese zwei Fragmente wurden mit Gel gereinigt und eine Fraktion jeweils als Matrize in einer PCR-Reaktion vereinigt unter Verwendung der Primer 4928
EMI35.7
entsprechend bp 4084 bis 4101 von SEQ ID Nr. 1) und 4929, was ein Fragment mit 1,3 kb ergab. Dieses Fragment wurde mit Gel gereinigt, mit Aatll und Xbal verdaut und das 1,2 kb-Fragment wurde mit Gel gereinigt.

Das Fragment des 3 min -Endes wurde in mit Aatll und Xbal verdautem pBSTAcIIr kloniert. Ein Isolat wurde mit Sall und Kpnl verdaut und mit dem 5 min -Ende-Fragment ligiert. Das entstehende Plasmid wurde nach Bestätigung der Sequenz mit Kpnl und Aatll verdaut und mit dem zentralen 3,1 kb-Fragment ligiert unter Bildung von pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21). pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21) wurde mit Sall und Xbal verdaut, um das 5,3 kb-PN5-Fragment freizusetzen, das in mit Sall und Xbal verdautem pCIneoII kloniert wurde. Multiple Isolate wurden gefunden, von denen GPII-1, das vollständig sequenziert wurde, typisch war und ein 8 bp-Insert enthielt. Dieses CAGAAGAA nach pb 3994 von SEQ ID Nr. 1 wandelte die direkte Wiederholung dieser Sequenz an diesem Ort in eine dreifache direkte Wiederholung um, was eine Verschiebung des Leserahmens verursachte.

In einem Versuch, diesen Mangel zu beheben, wurde pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21) mit Nhel (bp 2538 bis 2543 SEQ ID Nr. 1) und Xhol (bp 4828 bis 4833, SEQ. ID Nr. 1) verdaut, was ein 6,2 kb-Fragment lieferte, und mit Aatll und Xhol verdaut, was ein 0,7 kb-Fragment lieferte, das mit dem 1,6 kp-Fragment, das durch den Verdau von pBK-CMV.26.2 mit Aatll und Nhel entstand, ligiert wurde. Obwohl keine Isolate gefunden wurden, die vollständig korrekt waren, hatte ein Isolat, HA-4, nur eine einzige Basenveränderung, die Deletion von C an bp 4827 (SEQ ID Nr. 1), benachbart der XhoI-Stelle.

Um zu verhindern, dass die Umlagerung des 8 bp-Inserts auftrat, wurden drei stumme Mutationen eingeführt in die 5 min -Sequenzwiederholung und zwei weitere Mutationen in einem Strang von Ts sollten auch eingeführt werden, wie unten gezeigt (bp 3982 bis 4014, SEQ. ID Nr. 1, Mutationsstellen unterstrichen, 8 bp-Sequenzwiederholungen in der nativen Sequenz kursiv):
EMI37.1

Da Isolat HA-4 die native direkte Wiederholungssequenz aufwies (im Gegensatz z.B. zu pBSTAcIlr.PN5 (Klon 21)) und der Bereich in der Nähe des XhoI-Defekts nicht betroffen war, wurde es als Matrizen-DNA für die folgenden PCR-Reaktionen verwendet. Der Primer P5-3716S
EMI37.2
entsprechend pb 3684 bis 3716, SEQ ID Nr. 1) wurde mit Primer P 5-3969AS
EMI37.3

entsprechend bp 4003 bis 3969, SEQ, ID Nr. 1, mutierte Basen unterstrichen) gepaart, was ein 320 bp-Produkt lieferte. Der Primer P5-4017S
EMI37.4
entsprechend bp 3976 bis 4017, SEQ ID Nr. 1, mutierte Basen sind unterstrichen) wurde mit Primer P5-4247AS
EMI37.5
entsprechend bp 4280 bis 4247, SEQ ID Nr. 1) gepaart, was ein 305 bp-Produkt lieferte. Das 3 min -Ende des 320 bp-Fragmentes stimmte somit in 28 bp exakt mit dem 5 min -Ende des 305 bp-Fragmentes überein. Die zwei Banden wurden mit Gel gereinigt und eine Fraktion jeweils in einer neuen PCR-Reaktion mit den Primern P5-3716S und P5-4247AS vereinigt, was ein 597 bp-Produkt lieferte, das T/A-kloniert wurde im Vektor pCRII. Es wurde gefunden, dass das Isolat HO-7 die gewünschte Sequenz hatte.

Eine Vierwege-Ligierung wurde durchgeführt, um den modifizierten PN5 mit voller Länge zusammenzusetzen: Der Oozyten-Expressionsvektor HQ-8 wurde mit Sall und Xbal verdaut, was ein 4,4 kb-Vektorfragment lieferte; GPII-1 wurde mit Sall und Mlul verdaut, was ein 3,8 kb-Fragment lieferte, das die 5 min -Hälfte von PN5 enthielt; HO-7 wurde mit Mlul (bp 3866 bis 3871, SEQ ID Nr. 1) und Aatll verdaut, was ein 0,3 kb-Fragment lieferte, das die mutierte 8 bp-Repeatregion von PN5 enthielt; GPII-1 wurde mit Aatll und Xbal verdaut, was den verbleibenden 1,3 kb-3 min -Teil von PN5 lieferte. Ein Teil der Ligierungsreaktion wurde in E. coli Stable-2-Zellen transformiert. Von den 9,6 kb-Isolaten, die alle vier Fragmente enthielten, wurde HR-1 sequenziert und es wurde gefunden, dass es die gewünschte 5,4 kb-Sequenz hatte. Diese Isolate wuchsen gut und zeigten keine Tendenz zu einer Umlagerung.

Die Sequenz dieser bearbeiteten Version von PN5 ist in den Fig. 5A bis E gezeigt (SEQ ID Nr. 5).

Beispiel 8

Menschliches PN5

Ein 856 bp-Klon (Fig. 3A, SEQ ID Nr. 3) wurde aus einer cDNA-Bibliothek der menschlichen Ganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, die am nächsten verwandt ist mit Ratten-PN5 mit 79% Identität der Aminosäuresequenz. Die menschliche PN5-Sequenz überspannt die Region zwischen IIIS1 und der Interdomäne III/IV, die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d.h. IFM) einschliesst, die innerhalb der Interdomäne III/IV angeordnet ist.

Die menschliche DRG-cDNA-Bibliothek wurde aus Lumbal4- und 5-DRG Gesamt-RNA konstruiert, die statistisch geprimet wurde. cDNA des ersten Strangs wurde mit SuperScriptll reverse Transkriptase (GIBCO BRL) synthetisiert und die Synthese des zweiten Strangs erfolgte mit T4-DNA-Polymerase. EcoRI-Adapter wurden an die Enden der doppelsträngigen cDNA ligiert und die Fragmente in dem ZAPII-Vektor (Stratagene) kloniert. Die Bibliothek wurde mit mit Digoxigenin markierten Ratten-PN3-, Ratten-PN1- und menschlichen Herz hH1-Sonden gescreent. Positive Klone wurden sequenziert und mit bekannten menschlichen und Rattennatriumkanalsequenzen verglichen.

Nur der vorher erwähnte Klon wurde als menschliche PN5-Sequenz identifiziert.
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Head Col 1: Kanal
<tb>Head Col 2: % Ähnlichkeit
<tb>Head Col 3: % Identität
<tb><SEP>Menschliches Gehirn (HBA)<SEP>76<SEP>69
<tb><SEP>Menschliches Herz (hH1)<CEL AL=L>81<SEP>74
<tb><SEP>Menschliches atypisches Herz<SEP>60<SEP>52
<tb><SEP>Menschlicher Skelettmuskel<CEL AL=L>80<SEP>71
<tb><SEP>Menschliches Neuroendokrin<SEP>78<SEP>71
<tb><SEP>Menschliches PN3<CEL AL=L>77<CEL AL=L>70
<tb><SEP>Ratten-PN1<SEP>79<SEP>72
<tb><SEP>Ratten-PN3<SEP>78<SEP>71
<tb><CEL AL=L>Ratten-PN4<SEP>78<SEP>70
<tb><SEP>Ratten-PN5<SEP>86<SEP>79
<tb></TABLE>

Fig. 3B vergleicht die Aminosäuresequenz des hPN5-Fragmentes mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 in der geeigneten Region.

Beispiel 9

Gewebeverteilung mit RT-PCR

Gehirn-, Wirbelsäulen-, DRG-, Knotenganglien-, obere Zervikalganglien-, Ischiasnerv-, Herz- und Skelettmuskelgewebe wurden aus anästhesierten normalen ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten isoliert und bei -80 DEG C aufbewahrt. Die RNA wurde aus jedem Gewebe isoliert unter Verwendung von RNAzol (Tel-Test, Inc.). Statistisch geprimete cDNA wurde umgekehrt transkribiert aus 500 ng RNA aus jedem Gewebe. Der Vorwärtsprimer
EMI39.1
und der Rückwärtsprimer
EMI39.2
wurden aus dem 3 min -untranslatierten Bereich erzeugt, was ein 252-Basenpaar-Fragment lieferte. Die Zyklusparameter waren: 94 DEG C/2 min (Denaturierung), 94 DEG C/30 s, 65 DEG C/30 s und 72 DEG C/1 min (35 Zyklen) und 72 DEG C/4 min. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 4% Agarosegel analysiert.

Eine positive Kontrolle und eine Kontrolle ohne Matrize waren auch enthalten. cDNA aus jedem Gewebe wurde auch mit PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, die spezifisch für Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase sind, um die Lebensfähigkeit der Matrize zu zeigen, wie von Tso et al., Nucleic Acid Res. 13, 2485 bis 2502 (1985) beschrieben.

Das Gewebeverteilungsprofil von rPN5 durch Analyse der RNA aus ausgewählten Rattengeweben mit RT-PCR war wie folgt:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Head Col 1: Gewebe
<tb>Head Col 2: RT-PCR (35 Zyklen)
<tb><SEP>Gehirn (SEP)<+>(TB><SEP>Rückenmark (SEP)<+>(TB><SEP>DRG<CEL AL=L>+++
<tb><SEP>Knotenganglien<SEP>+++
<tb><SEP>Obere Zervikalganglien (SEP)<+>(TB><SEP>Ischiasnerv<CEL AL=L>-
<tb><SEP>Herz (SEP)<->(TB><SEP>Skelettmuskel (SEP)<->(TB><SEP>F11-unbehandelt (SEP)<+>(TB><CEL AL=L>F11-behandelt<SEP>+
<tb></TABLE>

PN5 wurde auch nach nur 25 Zyklen (24 + 1) in den gleichen 5 Geweben, wie oben, in der gleichen relativen Häufigkeit nachgewiesen.

Beispiel 10

Antikörper

Ein synthetisches Peptid (26 Aminosäuren in der Interdomäne II und III, Reste 977 bis 1002) wurde mit KLH konjugiert und Antikörper in Kaninchen erzeugt. Das Antiserum wurde anschliessend durch Affinität gereinigt.

PN5 bildet eine Unterfamilie von neuen Natriumkanalgenen; diese Gene sind verschieden von solchen, die mit anderen Sonden nachweisbar sind (z.B. PEAF8 und PN3-Sonden).

Obwohl die vorhergehende Erfindung im Detail durch Erläuterung und Beispiele zur besseren Klarheit und zum besseren Verständnis beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können innerhalb des Schutzbereichs der beigefügten Ansprüche.
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Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz ein Natriumkanalprotein oder ein Fragment davon codiert.

3. DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein die alpha -Untereinheit oder ein Fragment davon ist.

4. DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein Tetrodotoxin-resistent ist.

5. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein in Säugetieren gefunden wird.

6. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein in Ratten gefunden wird.

7. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumkanalprotein in Menschen gefunden wird.

8.

DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA cDNA ist.

9. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA synthetische DNA ist.

10. Expressionsvektor enthaltend die DNA von Anspruch 8.

11. Expressionsvektor enthaltend die synthetische DNA von Anspruch 9.

12. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 10.

13. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 11.

14. Rekombinantes Polynucleotid enthaltend eine Nucleinsäureseuenz, die aus der DNA-Sequenz von Anspruch 1 abgeleitet ist.

15. Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

16. Tetrodotoxin-resistentes Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

17.

Protein nach Anspruch 16 mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.

18. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von Tetrodotoxin-resistentem Natriumkanalprotein umfassend, dass man eine Verbindung, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor ist, mit Natriumkanalprotein nach Anspruch 16 in Kontakt bringt und die Aktivität des exprimierten Natriumkanals misst.

19. Poly- und/oder monoklonale Antikörper gegen ein Tetrodotoxin-resistentes Natriumkanalprotein, das von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

20. Diagnosekit umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 14, das spezifisch mit einem Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanalprotein oder einem Fragment davon hybridisieren kann.

21.

Verwendung einer isolierten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, um eine Verbindung zu identifizieren, von der angenommen wird, dass sie ein Inhibitor von Tetrodotoxin-resistentem Natriumkanalprotein ist.