DE19853233A1

DE19853233A1 - Nucleinsäure, die einen Nervengewebe-Natriumkanal kodiert

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Publication number: DE19853233A1
Application number: DE19853233A
Authority: DE
Inventors: Paul Shartzer Dietrich; Linda Marie Fish; Reena Khare; Douglas Kenneth Rabert; Lakshmi Sangameswaran
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2018-11-19
Also published as: ITMI982507A1; IT1306213B1; GB9825378D0; BE1014938A4; IE980956A1; GB2332906A; NL1010602A1; CH693031A5; ATA194298A; NL1010602C2; CA2251262A1; SE9803962L; SE9803962D0; AU9327298A; GB2332906A8; AT410672B; JPH11235186A; AU710551B2; FR2771103A1; DE19853233C2

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Natriumkanalproteine und genauer eine neue Nucleinsäuresequenz, die eine Säugetier-α- Untereinheit eines spannungsgesteuerten, bevorzugt Tetrodo toxin-resistenten, Nervengewebe-Natriumkanalproteins codiert. Die Erfindung betrifft weiterhin seine Herstellung mit Gen technik.

Die Basiseinheit an Information, die von einem Teil des Ner vensystems zu einem anderen übertragen wird, ist ein einzel nes Aktionspotential oder ein Nervenimpuls. Die "Übertra gungsleitung" für diese Impulse ist das Axon oder die Nerven faser. Es wurde gezeigt, daß die elektrische Erregbarkeit der Nervenmembran von dem spannungsempfindlichen ionischen Per meabilitätssystem der Membran abhängt, das es zuläßt, Energie zu verwenden, die in ionischen Konzentrationsgradienten gespeichert wird. Die elektrische Aktivität des Nervs wird ausgelöst durch eine Depolarisierung der Membran, die Kanäle durch die Membran öffnet, die äußerst selektiv für Natrium ionen sind, die dann durch den elektrochemischen Gradienten nach innen getrieben werden. Von den vielen Ionenkanälen ist der spannungsgesteuerte oder spannungsempfindliche Natrium kanal der am besten untersuchte. Es ist ein Transmembran protein, das wesentlich ist zur Erzeugung von Aktionspoten tialen in erregbaren Zellen. Eine ausgezeichnete Übersicht über Natriumkanäle findet sich in Catterall, TINS 16 (12), 500 bis 506 (1993).

Die cDNA für mehrere Na⁺-Kanäle wurden kloniert und sequen ziert. Numa et al., Annals of the New York Academy of Sciences 479, 338 bis 355 (1986) beschreiben cDNA aus dem elektrischen Organ des Aals und zwei verschiedene aus Ratten gehirn. Rogart, U.S.-Patent Nr. 5 380 836 beschreibt cDNA aus dem Gewebe des Rattenherzens. Siehe auch Rogart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 8170 bis 8174 (1989). Die Sequenz von PN1 und seinen Orthologen bei Menschen (hNE) und Kaninchen (Na⁺s) wurde veröffentlicht (siehe z. B. Klugbauer et al., EMBOJ 14, 1084 bis 1090 (1995) und Belcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 923, 11034 bis 11038 (1995)). Die Sequenz von Ratten-PN1, die aus DRG kloniert wurde, und ihre Funktionsexpression wurden beschrieben (siehe z. B. Sangames waran et al., J. Biol. Chem. 272, 14805 bis 14809 (1997)). Andere klonierte Natriumkanäle schließen die Typen I und II des Rattengehirns, Noda et al., Nature 320, 188 bis 192 (1986), IIa, Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988) und III, Kayano et al., FEBS Lett. 228, 187 bis 194 (1988), Rat tenskelettmuskel (SkM1), Trimmer et al., Neuron 3, 33 bis 49 (1989), Ratten-NaCh6, Schaller et al., J. Neurosci. 15, 3231 bis 3242 (1995), periphere Nervennatriumkanäle Typ 3 der Ratte (tPN3), Sangameswaran et al., J. Biol. Chem. 271, 5953 bis 5956 (1996), auch als SNS bezeichnet, Akopian et al., Nature 379, 257 bis 262 (1996), atypische Rattenkanäle, Felipe et al., J. Biol. Chem. 269, 30125 bis 30131 (1994) und den Glia-Natriumkanal der Ratte, Akopian et al., FEBS Lett. 400, 183 bis 187 (1997) ein.

Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß die Aminosäuresequenz des Na⁺-Kanals über einen langen evolutionären Zeitraum kon serviert ist. Diese Untersuchungen haben auch gezeigt, daß der Kanal ein einziges Polypeptid ist, das vier interne Sequenzwiederholungen oder homologe Domänen (Domänen I bis IV) mit ähnlichen Aminosäuresequenzen enthält. Jede Domäne faltet sich in sechs vorhersagbare und helikale Transmembran segmente: fünf sind hydrophobe Segmente und eins ist stark geladen mit vielen positiv geladenen Lysin- und Arginin resten. Dieses stark geladene Segment ist das vierte Trans membransegment in jeder Domäne (S4-Segment) und ist wahr scheinlich an der Spannungssteuerung beteiligt. Die positiv geladenen Seitenketten an dem S4-Segment sind wahrscheinlich gepaart mit den negativ geladenen Seitenketten an den anderen fünf Segmenten, so daß die Membrandepolarisierung die Position einer Helix bezogen auf die andere verschieben könnte, wodurch der Kanal geöffnet wird. Zusätzliche Untereinheiten können die Funktion des Kanals modifizieren.

Der therapeutische Nutzen von rekombinanten Materialien, die aus der DNA zahlreicher Natriumkanäle stammen, wurde gefun den. Z.B. offenbart U.S.-Patent Nr. 5 132 296 von Cherksey gereinigte Na⁺-Kanäle, die sich als nützliche therapeutische und diagnostische Werkzeuge erwiesen haben.

Isoformen von Natriumkanälen werden in "Unterfamilien" unter teilt. Der Ausdruck "Isoform" wird hier verwendet, um distinkte aber nah verwandte Natriumkanalproteine zu bezeich nen, d. h. solche mit einer Aminosäurehomologie von ungefähr 60 bis 80%. Diese zeigen auch eine starke Homologie in den Funktionen. Der Ausdruck "Unterfamilie" wird verwendet, um distinkte Natriumkanäle zu bezeichnen, die eine Aminosäure homologie von ungefähr 80 bis 95% haben. Kombinationen mehre rer Faktoren werden verwendet, um die Unterschiede innerhalb einer Unterfamilie zu bestimmen, z. B. die Geschwindigkeit eines Kanals, die chromosomale Anordnung, die Expressions daten, die Homologie mit anderen Kanälen innerhalb einer Art und die Homologie mit einem Kanal der gleichen Unterfamilie über die Arten hinweg. Eine andere Überlegung ist eine Affi nität zu Tetrodotoxin ("TTX"). TTX ist ein äußerst potentes Toxin aus dem "Puffer"- oder Fugufisch, das die Leitung von Nervenimpulsen entlang der Axone und in erregbaren Membranen von Nervenfasern blockiert. TTX bindet an den Na⁺-Kanal und blockiert den Fluß der Natriumionen.

Untersuchungen unter Anwendungen von TTX als Sonde haben Licht auf den Mechanismus und die Struktur von Na⁺-Kanälen geworfen. Es gibt 3 Na⁺-Kanal-Unterarten, die durch die Affi nität für TTX definiert werden, die durch IC₅₀-Werte gemessen werden kann: TTX-empfindliche Na⁺-Kanäle (IC₅₀ = 1 bis 30 nM), TTX-unempfindliche Na⁺-Kanäle (IC₅₀ = 1 bis 5 µM) und TTX-re sistente Na⁺-Kanäle (IC₅₀ ≧ 50 µM).

TTX-unempfindliche Aktionspotentiale wurden zuerst im Rattenskelettmuskel untersucht (Redfern et al., Acta Physiol. Scand. 82, 70 bis 78 (1971)). Anschließend wurden diese Aktionspotentiale für andere Säugetiergewebe beschrieben, einschließlich dem Säugetierskelettmuskel bei Neugeborenen, Säugetierherzmuskel, Mausganglionzellen der Dorsalwurzel in vitro und in Kultur, gezüchtetem Säugetierskelettmuskel und L6-Zellen. Siehe Rogart, Ann. Rev. Physiol. 43, 711 bis 725 (1980).

Rattenganglienneuronen der Dorsalwurzel besitzen sowohl TTX-em pfindliche (IC₅₀ ∼ 0,3 nM) als auch TTX-resistente (IC₅₀ ∼ 100 µM) Natriumkanalströme, wie von Roy et al., J. Neurosci. 12, 2104 bis 2111 (1992) beschrieben. TTX-resistente Natrium ströme wurden auch in Rattenknoten und Petrosal-Ganglien gemessen. Siehe Ikeda et al., J. Neurophysiol. 55, 527 bis 539 (1986) und Stea et al., Neurosci. 47, 727 bis 736 (1992). Elektrophysiologen nehmen an, daß andere TTX-resistente Natriumkanäle noch entdeckt werden müssen.

Obwohl cDNA aus Rattenskelettmuskel, Herz und Gehirn bekannt ist, wurde die Identifizierung und Isolierung von cDNA aus peripherem sensorischen Nervengewebe, wie den Ganglien der Dorsalwurzel, bisher durch die Schwierigkeit, mit solchem Gewebe zu arbeiten, behindert.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue gereinigte und iso lierte Nucleinsäuresequenzen, die Natriumkanalproteine des Nervengewebes von Säugetieren, insbesondere TTX-resistente, codieren, die stark exprimiert werden in ausgewachsenen DRG und Knotenganglien, weniger stark im Gehirn, Rückenmark und oberen Zervikalganglien exprimiert wird und nicht in Ischias nerv, Herz oder Skelettmuskel exprimiert wird. In derzeit bevorzugten Formen umfassen neue DNA-Sequenzen cDNA-Sequen zen, die Natriumkanalprotein aus Rattennervengewebe codieren. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die α-Untereinheit dieses Natriumkanalproteins.

Es wird DNA, cDNA und mRNA offenbart, die von den Nuclein säuresequenzen der Erfindung abgeleitet ist, und cRNA, die von mRNA abgeleitet ist. Insbesondere codieren zwei cDNA-Se quenzen zusammen die gesamte Länge des Natriumkanals aus Rattennervengewebe.

Die Erfindung schließt auch andere DNA-Formen, wie genomische DNA, DNA, die durch teilweise oder vollständige chemische Synthese aus Nucleotiden hergestellt wurde und DNA mit Deletionen oder Mutationen, ein.

Weitere Aspekte der Erfindung sind das neue TTX-resistente Natriumkanalprotein und Fragmente davon, die von der erfin dungsgemäßen DNA codiert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind rekombinante Poly nucleotide und Oligonucleotide, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die aus der DNA-Sequenz der Erfindung abgeleitet ist.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Sta bilisierung von cDNA der vollen Länge, das die Proteinsequenz der Erfindung codiert.

Weitere Aspekte der Erfindung schließen Expressionsvektoren ein, die die DNA der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, und eine cDNA-Bibliothek dieser Wirtszellen.

Teil der Erfindung bildet auch ein Assay für Inhibitoren des Natriumkanalproteins, der umfaßt, daß man eine Verbindung, von der angenommen wird, daß sie ein Inhibitor ist, in Kon takt bringt mit dem exprimierten Natriumkanal und die Aktivi tät des Natriumkanals mißt.

Weiterhin wird ein Verfahren zur Hemmung der Aktivität des TTX-resistenten Natriumkanals bereitgestellt, das umfaßt, daß man eine wirksame Menge einer Verbindung mit einem IC₅₀ von 10 µM oder weniger verabreicht.

Zusätzlich werden Methoden bereitgestellt zur Anwendung der DNA zur Bildung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern zur Verwendung als Zielmoleküle für das Auffinden von Arznei mitteln, als hochspezifische Marker für spezifische Antigene, Detektormoleküle, diagnostische Assays und für therapeutische Anwendungen, wie Schmerzlinderung, eine Sonde für den PN5-Kanal in anderem Säugetiergewebe, die Entwicklung von Thera peutika und das Screenen von Therapien.

Kurze Beschreibung der SEQ IDs und Figuren

Die Fig. 1A bis E zeigen die native cDNA-Sequenz mit 5908 Nucleotiden, die den Rattennatriumkanal Typ 5 ("PN5") (SEQ ID Nr. 1) codiert, die aus zwei überlappenden cDNA-Klonen stammt, die mit 26.2 und 1.18 bezeichnet werden.

Die Fig. 2A bis F zeigen die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5 (SEQ ID Nr. 2, dargestellt in Drei-Buchstaben- Aminosäurecode). Die Fig. 2G bis H, die die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5 im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode zeigen, zeigen auch die homologen Domänen (I bis IV), mög liche Transmembransegmente (S1 bis S6); die Aminosäure, die die Resistenz gegenüber TTX beiträgt (⬩); N-Glycosilierungs stellen (⚫); eine Phosphorylierungsstelle für eine cAMP- abhängige Proteinkinase A (PKA), (0) und das Stopcodon (*).

Fig. 3A zeigt eine Sequenz für das menschliche PN5 mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3). Fig. 3B zeigt einen Aminosäure sequenzvergleich des hPN5-Fragments mit Ratten-PN5.

Fig. 4 zeigt die Sequenz der neuen Sonde für die Natrium kanal-Domäne IV (SEQ ID Nr. 4).

Die Fig. 5A bis E zeigen die Nucleinsäuresequenz mit 5334 Nucleotiden modifiziert für Stabilität und Expression (SEQ ID Nr. 5). Die Nucleotide 24 bis 5518 bilden die 5295bp-Region, die ein Protein mit 1765 Aminosäuren codiert.

Fig. 6 zeigt die Klonierungskarte von PN5.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine gereinigte und iso lierte Nucleinsäuresequenz, die ein neues Säugetier-Natrium kanalprotein, das bevorzugt TTX-resistent ist, codiert. Der Ausdruck "gereinigte und isolierte DNA" bezieht sich auf DNA, die im wesentlichen frei ist, d. h. weniger als etwa 30%, bevorzugt weniger als etwa 10%, und noch bevorzugter weniger als etwa 1% der DNA enthält, mit der die interessierende DNA natürlicherweise assoziiert ist. Techniken, um diese Reinheit zu erreichen, sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen z. B. Restriktionskartierung, Agarosegelelektropho rese und Zentrifugation mit CsCl-Gradient ein.

Der Ausdruck "DNA" soll "cDNA" oder komplementäre DNA ein schließen, die einzelsträngig oder doppelstrangig sein kann, DNA-Sequenzen, die durch reverse Transkription aus mRNA her gestellt wurden, die aus einer Donorzelle oder durch chemi sche Synthese isoliert wurde. Z.B. liefert die Behandlung von mRNA mit einer reversen Transkriptase, wie AMV-reverse-Tran skriptase oder M-MuLV-reverse Transkriptase, in Gegenwart eines Oligonucleotidprimers ein RNA-DNA-Duplex, das mit RNase H, DNA-Polymerase und DNA-Ligase behandelt werden kann, um doppelsträngige cDNA zu erzeugen. Falls erwünscht, kann die doppelstrangige cDNA mit üblichen Techniken denaturiert wer den, z. B. Erwärmen, um einzelsträngige cDNA zu erzeugen. Der Ausdruck "cDNA" schließt cDNA ein, die eine komplementäre Kopie der natürlich vorkommenden RNA ist, ebenso wie komple mentäre Kopien von Varianten der natürlich vorkommenden RNA, die die gleiche biologische Aktivität haben. Varianten schließen z. B. Insertionen, Deletionen, Sequenzen mit degene rierten Codons und Allele ein.

"cRNA", die mRNA entspricht, die aus einer DNA-Sequenz trans kribiert wurde, die die α-Untereinheit eines neuen, bevor zugt TTX-resistenten, Natriumkanalproteins codiert, wird erfindungsgemäß ebenfalls in Betracht gezogen. Der Ausdruck "cRNA" bezieht sich auf RNA, die eine Kopie der von der Zelle transkribierten mRNA ist.

Spezifisch umfaßt die Erfindung DNA mit den nativen Versionen der Nucleotidsequenzen, die in den Fig. 1A bis E (SEQ ID Nr. 1) angegeben sind, die hier als Natriumkanal Typ 5 (PN5) bezeichnet werden. Die Fig. 1A bis E zeigen ein cDNA-Kon strukt mit 5908 Nucleotiden, das einen offenen Leserahmen mit 5298 Basen (wobei das Stop-Codon mitzählt) umfaßt (SEQ ID Nr. 1). Der Nucleotidrest 79 stellt die Startstelle der Trans lation dar und der Rest 5376 stellt das Ende des Stop-Codons dar.

Die Erfindung umfaßt auch technisch hergestellte Versionen von PN5 und spezifisch die Version, die in den Fig. 5A bis E angegeben ist (SEQ ID Nr. 5). Diesem SalI-XbaI-Klon mit 5334 Nucleotiden fehlt das meiste der untranslatierten Sequenzen, wobei der offene Leserahmen der 5298 Nucleotide bei Nucleotid 24 beginnt und bei Nucleotid 5321 endet. Die Start- und Stop-Codons sind unterstrichen, ebenso wie die bezüglich der Translation stillen Mutationen bei den Nucleo tiden 3932, 3935, 3941, 3944 und 3947, die durch Blockumlage rung in diesem Bereich während des Wachstums von E. coli ein geführt wurden.

Die Nucleotidsequenz von SEC ID Nr. 1 (Fig. 1A bis E) ent spricht der cDNA der Ratte. Eine Homologiesuche zeigte, daß sich der am nächsten verwandte Natriumkanal im Rattenherz kanal findet, mit einer Homologie von 72,5%. Die am nächsten verwandten Kanäle sind rPN1 mit 72% und aus dem Rattengehirn die Typen I und III mit 71,8% bzw. 71,3%. Die Homologie von rPN3a, hPN3, rPN4, rPN4a, Rattengehirn Typ II und Rattenske lettmuskel ist jeweils ungefähr 70 bis 71%.

Außerdem wurde ein Klon mit 856 Basenpaaren (SEQ ID Nr. 3), wie in Fig. 3A gezeigt, aus einer "cDNA-Bibliothek" von Humanganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, der eng ver wandt ist mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 mit 79% Identität und 86% Homologie. Die humane PN5-Sequenz über spannt die Region zwischen IIIS1 und der Interdomäne III/IV, die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d. h. IFM) ein schließt, die innerhalb der Interdomäne III/IV angeordnet ist.

Der Ausdruck "cDNA-Bibliothek" bezieht sich auf eine Ansamm lung von Klonen, gewöhnlich in einem Bakteriophagen oder weniger häufig in bakteriellen Plasmiden, die cDNA-Kopien von mRNA-Sequenzen enthalten, die aus einer Donorzelle oder Gewebe stammen.

Es wird angenommen, daß weitere Homologe des neuen TTX-re sistenten Rattennatriumkanals, der hier beschrieben wird, auch in anderen Säugetiergeweben exprimiert werden.

Eine Northern-Blot-Analyse (Beispiel 5) zeigt, daß PN5 von einem ∼6,5 kb Transkript codiert wird.

Die abgeleitete Aminosäuresequenz von PN5, die in den Fig. 2A bis F (SEQ ID Nr. 2) gezeigt ist, hat die primären Struk turmerkmale einer α-Untereinheit eines spannungsgesteuerten, TTX-resistenten Natriumkanals. In den Fig. 2G bis H sind die homologen Domänen (I bis IV), die möglichen Transmembran segmente (S1 bis S6), die Aminosäure, die die Resistenz gegenüber TTX beiträgt (⬩), N-Glycosilierungsstellen (⚫) und c-AMP-abhängige PKA-Phosphorylierungsstellen (0) gezeigt. DNA-Sequenzen, die die gleichen oder allelische Varianten oder analoge Natriumkanalproteinpolypeptide des Nervensystems durch Verwendung, von zumindest teilweise degenerierten Codons, codieren, werden auch erfindungsgemäß in Betracht gezogen.

Ein interessantes Merkmal dieser abgeleiteten Aminosäure sequenz ist es, daß die Aminosäure, die am verantwortlichsten für die TTX-Empfindlichkeit ist, an Position 355 angeordnet ist und nicht aromatisch ist. In Natriumkanälen aus der Ratte und dem menschlichen Gehirn, Skelettmuskelkanälen und in PN1 und PN4 ist diese Aminosäure Tyrosin oder Phenylalanin und diese Kanäle sind alle TTX-empfindlich. In PN3 und PN5 ist die Aminosäure ein Serin. Da PN3 äußerst resistent gegenüber TTX ist, ist die Schlußfolgerung, daß PN5 auch ein TTX-resi stenter Kanal ist. Der Herzkanal hat ein Cystein an dieser Stelle und ist "unempfindlich" für TTX.

Obwohl PN5 alle wichtigen Merkmale eines spannungsgesteuerten Natriumkanals enthält, hat es einzigartige strukturelle Merk male, die ihn von anderen Natriumkanälen unterscheiden. Z.B. hat DIIS4 5 basische Aminosäuren, die in allen Natriumkanälen konserviert sind, die eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Spannungsempfindlichkeit der Kanalfunktion spielen könnten. In PN5 ist die erste basische Aminosäure durch ein Alanin ersetzt. In ähnlicher Weise hat in DIIIS4 PN5 5 basische Aminosäuren statt 6, die in anderen Natriumkanalsequenzen vorhanden sind, wobei das letzte Arginin durch ein Glutamin ersetzt ist. In DIIIS3 enthält das Transmembransegment nur 18 Aminosäuren im Gegensatz zu 22 Aminosäuren in anderen Kanä len. Auch die kurze Linkerschleife (4 Aminosäuren) zwischen S3 und S4 in DIII ist noch kürzer durch eine "Deletion" von 3 Aminosäuren. Diese Verkürzung von S3 und der Linkerschleife wurde bestätigt, indem Primer im geeigneten Bereich der Sequenz für ein RT-PCR-Experiment aus Ratten-DRG entwickelt wurden und das amplifizierte DNA-Fragment sequenziert wurde. Ein solcher Versuch wurde durchgeführt, um die Sequenz einer anderen Region von PN5, in der DIVS5-S6-Schleife zu bestäti gen, wo eine Deletion eines Peptids mit 8 Aminosäuren war.

Eine Gewebeverteilungsanalyse mit reverser Transkriptions- Polymerase-Kettenreaktion (durch Oligonucleotid geprimte RT- PCR) von RNA aus dem Rattenzentral- und Periphernervensystem, insbesondere aus Ratten-DRG, wurde durchgeführt. Acht Haupt gewebearten wurden gescreent auf die Expression der einzigar tigen PN5-Gene, die den Positionen 5651 bis 5903 von SEQ ID Nr. 1 entsprechen (Fig. 1A bis E). mRNA von PN5 war in 5 der untersuchten Gewebe vorhanden: Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und obere Zervikalganglien. PN5 war nicht vor handen in den verbleibenden untersuchten Geweben: Ischias nervgewebe, Herz oder Skelettmuskelgewebe. Es wurde gefunden, daß PN5 am stärksten in DRG und Knotenganglien ist, was die Anmelder dazu bringt, anzunehmen, daß DRG mit PN5 ange reichert ist. PN5 zeigt dramatische Unterschiede über einen Bereich von Geweben. PN5 hat einen Expressionsgradienten mit einer hohen Expression in DRG. PN5 hat einen Expressionsgra dienten wie andere Kanäle, aber mit begrenzterer Verteilung.

Die Erfindung schließt nicht nur das gesamte Protein ein, das von den cDNA-Sequenzen von SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 exprimiert wird, sondern schließt auch Proteinfragmente ein. Diese Frag mente können erhalten werden, indem die vollständigen Pro teine gespalten werden oder durch Verwendung kleinerer DNA-Sequen zen oder "Polynucleotide", um das gewünschte Fragment zu exprimieren.

Der Ausdruck "Polynucleotid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine polymere Form von Polynucleotiden jeg licher Länge, sowohl Ribonucleotiden als auch Desoxyribo nucleotiden. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls. Daher schließt dieser Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA ebenso wie doppel- und einzelsträn gige RNA ein. Er schließt auch modifizierte, z. B. durch Methylierung modifizierte und/oder am 5'-Ende modifizierte, und unmodifizierte Formen des Polynucleotids ein.

Weiterhin soll der Ausdruck "Polynucleotid" ein rekombinantes Polynucleotid einschließen, das genomischen Ursprungs, von cDNA, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs ist, das aufgrund seines Ursprungs oder durch Manipulation nicht mit allem oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist und/oder einem Polynucleo tid verbunden ist, außer dem, mit dem es in der Natur verbun den ist.

Demzufolge schließt die Erfindung auch Polynucleotide ein, die verwendet werden können, um Polypeptide mit einer Länge von etwa 10 bis 1500, bevorzugt 10 bis 100 Aminosäuren herzu stellen. Die Isolierung und Reinigung solcher rekombinanten Polypeptide kann mit Techniken erreicht werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z. B. präparative chromatogra phische Trennung oder Affinitätschromatographie. Außerdem können Polypeptide auch mit synthetischen Mitteln hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind.

Die Erfindung ermöglicht die Manipulation von genetischem Material mit Gentechnik zur Erzeugung von Polypeptiden, die strukturelle und funktionelle Eigenschaften der spannungs gesteuerten, TTX-resistenten Natriumkanal-α-Untereinheit besitzen, die in sensorischen Nerven gefunden wird. Eine ortsgerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um solche rekombinanten Polypeptide zu liefern. Z.B. können synthe tische Oligonucleotide spezifisch in den Teil des interessie renden Gens eingesetzt oder substituiert werden, um Gene zu erzeugen, die eine spezifische Mutante codieren und diese exprimieren. Statistische degenerierte Oligonucleotide können auch eingesetzt werden und eine Phagendisplaytechnik kann verwendet werden, um Polypeptide, die eine funktionelle Eigenschaft, an der man interessiert ist, besitzen, zu iden tifizieren und zu isolieren.

Außerdem werden für die vorliegende Erfindung rekombinante Polynucleotide mit einer Länge von etwa 15 bis 20 kb, bevor zugt 10 bis 15 kb, Nucleotiden in Betracht gezogen, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die von der DNA der Erfindung "abgeleitet" ist.

Der Ausdruck "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die aus einer Sequenz mit ungefähr mindestens 6 bis 8 Nucleotiden, bevor zugter mindestens 10 bis 12 Nucleotiden und noch bevorzugter mindestens 15 bis 20 Nucleotiden aufgebaut ist, die einem Bereich der bezeichneten Sequenz entsprechen, d. h. dazu homo log oder komplementär sind. Die abgeleitete Sequenz ist nicht notwendigerweise physikalisch von der gezeigten Nucleotid sequenz abgeleitet, kann aber in irgendeiner Weise abgeleitet sein, z. B. durch chemische Synthese oder DNA-Replikation oder reverse Transkription, die auf der Information basiert, die durch die Sequenzen von Basen in dem Bereich, aus dem das Polynucleotid abgeleitet ist, stammt.

Ein neonataler Expressionstest wurde mit F11 durchgeführt, einer Fusionszellinie, die aus neonatalem Ratten-DRG fusio niert mit einer Mauszellinie, N18TG von Massachusetts General Hospital, entwickelt wurde. F11 reagiert auf trophische Mittel, wie NGF, durch Verlängerung von Dendriten. Es wurde gefunden, daß PN5 sowohl in nativem F11 als auch in F11, das mit NGF behandelt worden war, vorhanden war, das die Anmelder zu der Annahme führt, daß der Natriumkanal nativ in F11 exprimiert wird.

Die in-situ-Hybridisierung von PN5-mRNA mit Ratten-DRG-Gewebe liefert eine Lokalisierung hauptsächlich in den kleineren und mittleren Neuronen ohne Nachweis in großen Neuronen.

PN5 wurde auch bezüglich der cytogenetischen Lokalisierung auf Mauschromosomen-Präparaten kartiert. PN5 liegt auf dem gleichen Chromosom wie der Herzkanal und PN3.

Im allgemeinen umfassen Natriumkanäle eine α- und zwei β- Untereinheiten. Die β-Untereinheiten können die Funktion des Kanals modulieren. Da jedoch die α-Untereinheit alles ist, was erforderlich ist, damit der Kanal vollständig funktionell ist, liefert die Expression der cDNA in SEQ ID Nr. 1 (Fig. 1A bis E) ein voll funktionsfähiges Protein. Das Gen, das die β₁-Untereinheit in peripherem Nervengewebe codiert, hat sich als identisch erwiesen zu dem, das in Rattenherz, Gehirn und Skelettmuskel gefunden wird. Die cDNA der β₁-Untereinheit wird hier nicht beschrieben, da sie im Stand der Technik wohlbekannt ist, siehe Isom et al., Neuron 12, 1183 bis 1194 (1994). Es versteht sich jedoch, daß man durch Kombinieren der bekannten Sequenz für die β-Untereinheit mit der hier beschriebenen Sequenz der α-Untereinheit den vollständigen, spannungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten PN5-Natrium kanal erhalten kann.

Die vorliegende Erfindung schließt auch "Expressionsvektoren" ein, die die oben beschriebene DNA oder cDNA umfassen, Wirts zellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, die den Natriumkanal der Erfindung erzeugen können und cDNA-Bibliotheken, die diese Wirtszellen umfassen.

Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezieht sich auf irgendein genetisches Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, einen Virus, der sich entweder als autonome Einheit der Polynucleo tidexpression innerhalb einer Zelle verhält oder zur Replika tion fähig gemacht wird durch Insertion in ein Wirtszellchro mosom, das an ein anderes Polynucleotidsegment gebunden wird, um die Replikation und/oder Expression des gebundenen Segmen tes zu erreichen. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bak teriophagen und Cosmide ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Vektoren enthalten Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Ligierung oder Insertion des Vektors in eine gewünschte Wirtszelle zu bewirken und die Expression des gebundenen Segments zu bewirken. Solche Sequenzen unterschei den sich abhängig vom Wirtsorganismus und schließen Promotor sequenzen ein, um die Transkription zu bewirken, Enhancer sequenzen, um die Transkription zu erhöhen, ribosomale Bin dungsstellensequenzen und Transkriptions- und Translations terminationssequenzen.

Der Ausdruck "Wirtszelle" bezieht sich allgemein auf pro karyotische oder eukaryotische Organismen und schließt irgendeinen transformierbaren oder transfizierbaren Organis mus ein, der ein Protein exprimieren kann und als Empfänger für Expressionsvektoren oder andere transferierte DNA verwen det werden kann oder verwendet wurde. Wirtszellen können auch dazu gebracht werden, Protein zu exprimieren durch direkte Injektion von exogener cRNA, die in das interessierende Pro tein translatierbar ist. Eine bevorzugte Wirtszelle ist der Xenopus-Oocyt.

Der Ausdruck "transformiert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Sequenzen in eine prokaryotische Wirtszelle. Der Ausdruck "transfiziert" bezieht sich auf irgendeine bekannte Methode zur Insertion von fremden DNA- oder RNA-Sequenzen in eine eukaryotische Wirtszelle. Solche transformierten oder trans fizierte Zellen schließen stabil transformierte oder trans fizierte Zellen ein, in denen die insertierte DNA zur Repli kation in der Wirtszelle fähig gemacht worden ist. Sie schließen auch vorübergehend exprimierende Zellen ein, die die insertierte DNA oder RNA nur für einen begrenzten Zeit raum exprimieren. Das Transformations- oder Transfektionsver fahren hängt von der zu transformierenden Wirtszelle ab. Es kann ein Verpacken des Polynucleotids in einen Virus ebenso einschließen, wie die direkte Aufnahme des Polynucleotids, wie z. B. durch Lipofektion oder Mikroinjektion. Die Transfor mation und Transfektion kann zu einem Einbau der insertierten DNA in das Genom der Wirtszelle führen oder zur Aufrecht erhaltung der insertierten DNA innerhalb einer Wirtszelle in Plasmidform. Methoden zur Transformation sind im Stand der Technik wohlbekannt und schließen virale Infektion, Elektro poration, Lipofektion und durch Calciumphosphat vermittelte direkte Aufnahme ein, ohne darauf beschränkt zu sein.

Es versteht sich, daß die Erfindung andere Formen von Expres sionsvektoren, Wirtszellen und Transformationstechniken ein schließen soll, die äquivalenten Funktionen dienen und im Stand der Technik bekannt sind.

Die Erfindung betrifft auch einen Assay für Inhibitoren des neuen TTX-resistenten Natriumkanalproteins, der umfaßt, daß eine Verbindung, von der angenommen wird, daß sie ein Inhibi tor ist, mit dem exprimierten Natriumkanal in Kontakt gebracht wird und die Aktivität des Natriumkanals gemessen wird. Die Verbindung kann eine im wesentlichen reine Verbin dung synthetischen Ursprungs sein, die mit einem wäßrigen Medium kombiniert ist, oder die Verbindung kann ein natürlich vorkommenden Material sein, so daß das Testmedium ein Extrakt biologischen Ursprungs ist, z. B. ein Pflanzen-, Tier- oder mikrobieller Zellextrakt.

Die PN5-Aktivität kann mit Methoden, wie Elektrophysiologie (Zwei-Elektroden-Spannungsklemme oder Einzel-Elektroden- Whole-Cell-Klemme), Guanidiniumionenfluß-Assays und Toxinbin dungs-Assays gemessen werden. Ein "Inhibitor" wird allgemein definiert als die Menge, die zu einer mehr als 50%igen Abnahme, bevorzugt mehr als 70%igen Abnahme der PN5-Aktivi tät, noch bevorzugter mehr als 90%igen Abnahme der PN5-Akti vität, der PN5-Aktivität führt.

Es gibt viele Verwendungen für die Erfindung, von denen wenige im folgenden beschrieben sind:

1. Sonde für Säugetierkanäle

Wie oben erwähnt, wird angenommen, daß weitere Homologe des neuen TTX-resistenten Rattennatriumkanals, der hier beschrie ben wird, auch in Säugetiergewebe exprimiert werden, insbe sondere in menschlichem Gewebe. Die vollständigen cDNAs von PN5-Rattennatriumkanälen der vorliegenden Erfindung können als Sonde verwendet werden, um festzustellen, ob zusätzliche neue spannungsgesteuerte, bevorzugt TTX-resistente, PN5-Natrium kanäle im menschlichen Gewebe existieren und, falls ja, die Isolierung der cDNAs für das menschliche Protein zu fördern.

Die humanen Homologen der TTX-resistenten Ratten-PN5-Kanäle können kloniert werden unter Verwendung einer Human-DRG-cDNA-Biblio thek. Human-DRG wird bei einer Autopsie erhalten. Das gefrorene Gewebe wird homogenisiert und die RNA mit Guani dinisothiocyanat extrahiert (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 bis 5299, (1979)). Die RNA wird der Größe nach frak tioniert auf einem Saccharosegradienten, um große mRNAs anzu reichern, da die Natriumkanal-α-Untereinheiten von großen (7 bis 11 kb) Transkripts codiert werden. Doppelsträngige cDNA wird hergestellt unter Verwendung des SuperScript Choice cDNA-Kits (GIBCO BRL) entweder mit Oligo(dT) oder statisti schen Hexamerprimern. EcoRI-Adapter werden an die doppel strängige cDNA ligiert, die dann phosphoryliert wird. Die cDNA-Bibliothek wird konstruiert, indem die doppelsträngige cDNA in den Bakteriophagen lambda-ZAPII-Vektor (Stratagene) ligiert wird und anschließend in Phagenteilchen verpackt wird.

Phagen werden auf 150 mm-Platten auf einem Rasen von XLI-Blue MRF'-Bakterien (Stratagene) ausplattiert und Plaque-Abdrücke werden auf Hybond N-Nylonmembranen (Amersham) erstellt. Die Filter werden mit Ratten-PN5-cDNA-Sonden mit Standardverfah ren hybridisiert und durch Autoradiographie oder Chemilumi neszenz nachgewiesen. Das von den Ratten-PN5-Sonden erzeugte Signal, das mit positiven humanen Klonen mit hoher Stringenz hybridisiert, sollte stärker sein, als das, das mit Natrium kanalsonden aus Rattengehirn erhalten wird, die mit diesen Klonen hybridisieren. Positive Plaques werden weiter gerei nigt durch begrenzte Verdünnung und erneutes Screenen durch Hybridisierung oder PCR. Eine Restriktionskartierung und Polymerase-Kettenreaktion identifiziert überlappende Klone, die mit Standardtechniken zusammengesetzt werden können zu einem humanen Homolog von Ratten-PN5 mit voller Länge. Der Humanklon kann exprimiert werden, indem cRNA in vitro aus dem cDNA-Klon voller Länge in Xenopus-Oocyten indiziert wird oder indem eine Säugetierzellinie mit einem Vektor transfiziert wird, der die cDNA, gebunden an einen geeigneten Promotor, enthält.

2. Antikörper gegen PN5

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind sehr nützlich zur Ent wicklung von Antikörpern gegen PN5. Solche Antikörper können in der Affinitätschromatographie verwendet werden, um rekom binante Natriumkanalproteine oder Polypeptide zu reinigen oder sie können verwendet werden als Forschungshilfsmittel. Z.B. können Antikörper, die an ein Reportermolekül gebunden sind, verwendet werden für histochemische Anfärbungstechni ken, um andere Gewebe- und Zelltypen zu identifizieren, in denen PN5 vorhanden ist, oder sie können verwendet werden, um Epitop- oder funktionelle Regionen des erfindungsgemäßen Natriumkanalproteins zu identifizieren.

Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und können mit Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Polyklonale Antikörper werden wie folgt hergestellt: ein immunogenes Konjugat, das PN5 oder ein Fragment davon umfaßt, gegebenenfalls gebunden an ein Träger protein, wird verwendet, um ein ausgewähltes Säugetier, z. B. eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege etc., zu immunisieren. Serum von dem immunisierten Säugetier wird gesammelt und mit bekannten Verfahren behandelt, um die Immunglobulinfraktion abzutrennen.

Monoklonale Antikörper werden mit Standardhybridomazelltech nologie hergestellt auf Basis des Artikels von Köhler und Milstein in Nature 256, 495 bis 497 (1975). Milzzellen werden von einem Wirtstier erhalten, das mit dem PN5-Protein oder einem Fragment davon immunisiert wurde, gegebenenfalls gebun den an einen Träger. Hybridzellen werden gebildet, indem diese Milzzellen mit einer geeigneten Myelomzellinie fusio niert werden und gezüchtet werden. Die von den Hybridzellen erzeugten Antikörper werden auf ihre Fähigkeit, an expri mierte PN5-Proteine zu binden, gescreent.

Eine Anzahl von Screeningtechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, z. B. vorwärts oder rückwärts gerichtete enzymgebundene Immunosorbent-Assay-Screeningmethoden können angewendet werden. Die Hybridzellen, die solche Antikörper erzeugen, werden dann einer erneuten Klonierung und hohen Verdünnungsbedingungen unterzogen, um eine Hybridzelle auszu wählen, die eine homogene Population von Antikörpern sezer niert, die für ein PN5-Protein spezifisch sind.

Außerdem können Antikörper gezüchtet werden durch Klonieren und Exprimieren von Nucleotidsequenzen oder mutagenisierte Versionen davon, die mindestens die Aminosäuresequenzen codieren, die für die spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlich sind, und diese exprimierten Pro teine können als Immunogen verwendet werden.

Antikörper können das vollständige Immunglobulin oder ein Fragment davon einschließen. Antikörper können an eine Repor tergruppe, z. B. wie oben für Polynucleotide beschrieben, gebunden sein.

Beispiel 10 erläutert ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers.

3. Therapeutische Ziele für Verbindungen, um Störungen zu behandeln, und Tests dafür

Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung der neuen spannungsgesteuerten, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanal-α-Untereinheit als therapeutisches Ziel für Verbindungen ein, um Störungen des Nervensystems auf Basis von RT-PCR-Lokalisierungsdaten zu behandeln. Die Störungen schließen Epilepsie, Schäden durch Schlaganfall, Gehirnschä den, diabetische Neuropathie, traumatische Schäden, chro nisch-neuro pathische Schmerzen und mit MDS assoziierte Neuropathie ein, ohne darauf beschränkt zu sein.

4. Entwicklung von Therapeutika, basierend auf der Hemmung von PN5 und Tests dafür

Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, die Aktivität von PN5 in Gehirn, Rückenmark, DRG, Knotenganglien und oberen Zervikalgangliengeweben zu hemmen. Es versteht sich jedoch, daß weitere Untersuchungen ergeben können, daß PN5 in anderen Geweben vorhanden ist, und diese Gewebe können dann auch Zielbereiche sein. Z.B. deutet der Nachweis von PN5-mRNA in Knotenganglien darauf hin, daß PN5 TTX-resistente Natrium ströme in diese und andere sensorische Ganglien des Nerven systems leiten könnte.

Außerdem wurde gefunden, daß Proteine, die normalerweise nicht in bestimmten Geweben exprimiert werden, bei einem Krankheitszustand exprimiert werden. Daher soll die Erfindung die Hemmung von PN5 in Geweben und Zellarten, in denen das Protein normalerweise exprimiert wird, und in solchen Geweben und Zellarten, wo das Protein nur während eines Krankheitszu standes exprimiert wird, umfassen.

Es wird z. B. angenommen, daß TTX-resistente Natriumkanäle eine Schlüsselrolle bei der Übertragung von Nervenimpulsen spielen, die sich auf sensorische Inputs, wie Schmerz und Druck beziehen. Diese Information erleichtert die Entwicklung von Therapeutika, die spezifisch in Bereiche, wie das peri phere Nervengewebe, geführt werden können.

Das rekombinante Protein der vorliegenden Erfindung kann ver wendet werden, um potentielle Therapeutika zu screenen, die die Fähigkeit haben, den interessierenden Natriumkanal zu hemmen. Insbesondere wäre es nützlich, selektiv die Funktion von Natriumkanälen in peripherem Nervengewebe zu hemmen, das für die Übermittlung von Schmerz- und Drucksignalen verant wortlich ist, ohne gleichzeitig die Funktion der Natrium kanäle in anderen Geweben, wie Herz und Muskel, zu beein flussen. Eine solche Selektivität würde die Behandlung von Schmerzen zulassen, ohne Nebenwirkungen zu verursachen auf grund von Herz- oder neuromuskulären Komplikationen. Es wäre daher nützlich, DNA-Sequenzen zur Verfügung zu haben, die Natriumkanäle codieren, die selektiv in peripherem Nerven gewebe exprimiert werden.

5. Schmerzlinderung

Natriumkanäle in peripherem Nervengewebe spielen eine große Rolle in der Übertragung von Nervenimpulsen und daher sind sie ein Instrument, um die neuropathische Schmerzübertragung zu verstehen. Neuropathischer Schmerz läßt sich in zwei Kom ponenten aufteilen: Allodynie, bei der ein normalerweise nicht schmerzlicher Stimulus schmerzerzeugend wird und Hyper algesie, wo ein gewöhnlicher normal schmerzerzeugender Sti mulus extrem schmerzvoll wird.

In Gewebelokalisierungsuntersuchungen kartiert PN5-mRNA kleine und mittlere Neurone von DRG. PN5-mRNA ist auch im Gehirn und Rückenmark vorhanden. Das Hemmen der Aktivitäten kann das Auftreten von Kopfschmerzen und Migräne verhüten helfen. Die Fähigkeit, die Aktivität dieser Natriumkanäle zu hemmen, d. h. die Übertragung von Nervenimpulsen zu vermin dern, beeinflußt die Fähigkeit der Nerven, Schmerzimpulse zu übertragen. Die selektive Hemmung von Natriumkanälen in sen sorischen Neuronen, wie DRG, läßt die Blockierung von Schmerzimpulsen zu, ohne Nebenwirkungen zu erzeugen, die durch die Hemmung von Natriumkanälen in anderen Geweben, wie Gehirn und Herz verursacht werden. Außerdem werden bestimmte Krankheiten durch Natriumkanäle verursacht, die Impulse mit einer extrem hohen Frequenz erzeugen. Die Fähigkeit, die Aktivität des Kanals zu vermindern, kann dann die Krankheit eliminieren oder lindern. Somit können potentielle therapeu tische Verbindungen mit Methoden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, gescreent werden, um festzustellen, ob sie die Aktivität des erfindungsgemäßen rekombinanten Natrium kanals hemmen können. M. Barram et al., Naun-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 347, 125 bis 132 (1993) und E.T. McNeal et al., J. Med. Chem. 28, 381 bis 388 (1985). Für ähn liche Studien mit dem Acetylcholinrezeptor siehe Claudio et al., Science 238, 1688 bis 1694 (1987).

Z.B. können Schmerzen gelindert werden, indem die Aktivität des neuen, bevorzugt TTX-resistenten, Natriumkanals gehemmt wird, was umfaßt, daß man eine therapeutisch wirksame Menge mit einem IC₅₀ von ungefähr 10 µM oder weniger, bevorzugt ≦ 1 µM, verabreicht. Potentielle therapeutische Verbindungen wer den identifiziert auf Basis ihrer Fähigkeit, die Aktivität von PN5 zu hemmen. Daher kann der vorher erwähnte Test ver wendet werden, um Verbindungen mit einer therapeutisch wirk samen IC₅₀ zu identifizieren.

Der Ausdruck "IC₅₀" bezieht sich auf die Konzentration einer Verbindung, die erforderlich ist, um die Axtivität von expri miertem PN5 um 50% zu hemmen, wenn die Aktivität mit Elektro physiologie, Strömungstests und Toxinbindungstests, wie oben erwähnt, gemessen wird.

6. Diagnostische Tests

Die Basistechniken der Molekularbiologie, die verwendet wer den, um Merkmale der Erfindung zu erreichen, wie RNA-, DNA- und Plasmidisolierung, Restriktionsenzymverdau, Herstellung und Sondierung einer cDNA-Bibliothek, Sequenzierung von Klonen, Konstruktion von Expressionsvektoren, Transformation von Zellen, Aufrechterhaltung und Züchtung von Zellkulturen und andere allgemeine Techniken sind im Stand der Technik wohlbekannt und Beschreibungen dieser Techniken finden sich in üblichen Laborhandbüchern, wie Molecular Cloning: A Labo ratory Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Labora tory Press, 2. Ausgabe, 1989).

Z.B. können die Polynucleotide der Erfindung an ein "Repor termolekül" gebunden werden, um eine Polynucleotidsonde zu bilden, die für die Northern- und Southern-Blot-Analyse und für in-situ-Hybridisierungen nützlich ist.

Der Ausdruck "Reportermolekül" bezieht sich auf eine chemi sche Einheit, die mit einem geeigneten Nachweismittel nachge wiesen werden kann, einschließlich von spektrophotometri schen, chemilumineszierenden, immunochemischen und radio chemischen Mitteln, ohne darauf beschränkt zu sein. Die erfindungsgemäßen Polynucleotide können an ein Reportermole kül mit im Stand der Technik wohlbekannten Techniken konju giert werden. Typischerweise enthält das Reportermolekül eine funktionelle Gruppe, die geeignet ist zur Bindung an oder zum Einbau in das Polynucleotid. Die funktionellen Gruppen, die zur Bindung der Reportergruppe geeignet sind, sind gewöhnlich aktivierte Ester oder Alkylierungsmittel. Details von Techni ken, um Reportergruppen zu binden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z. B. J.A. Matthews, A. Batki, C. Hynds und L.J. Kricka, Anal. Biochem. 151, 205 bis 209 (1985) und Engelhardt et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 302 175.

Somit sind die folgenden Beispiele nur erläuternd für Techni ken, mit denen die Erfindung durchgeführt werden kann.

Abkürzungen

Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet und haben die jeweils unten definierten Bedeutungen:
BSA: Rinderserumalbumin
Denhardt's Lösung: 0,02% BSA, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll (0,1 g BSA, 0,1 g Ficoll und 0,1 g Polyvinylpyrrolidon pro 500 ml)
DRG: Ganglien der Dorsalwurzel
EDTA: Tetranatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure
MEN: 20 mM MOPS, 1 mM EDTA, 5 mM Natriumacetat, pH 7,0
MOPS: 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (Sigma Chemical Com pany)
PN5: Peripherer Nervennatriumkanal 5
PNS: Peripheres Nervensystem
SDS: Natriumdodecylsulfat
SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0
SSPE: 80 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM Ethylendiamin tetraacetat, pH 8,0
TEV: Zwei-Elektroden-Spannungsklemme
TTX: Tetrodotoxin (Sigma Chemical Company)

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Durchführung der Erfin dung.

Materialien

Das Plasmid pBK-CMV wurde von Stratagene (La Jolla, CA) erhalten; das Plasmid pBSTA wird von Goldin et al. in Methods in Enzymology (Rudy & Iverson, Herausgeber), 207, 279 bis 297 beschrieben; das Plasmid pCIneo wurde von Promega (Madison, WI) erhalten und das Plasmid pCRII wurde von Invitrogen (Carlsbad, CA) erhalten.

Das Oocyten-Expressionsvektor-Plasmid pBSTAcIIr wurde aus pBSTA konstruiert durch Insertion eines synthetischen Oligo nucleotidlinkers; Plasmid pKK232-8 wurde von Pharmacia Bio tech (Piscataway, NJ) erhalten; Plasmid pCRII wurde von Invitrogen, San Diego, CA erhalten. Die kompetenten E. coli- Zellinien STBL2™ und SURE® wurden von Gibco/BRL bzw. Strata gene erhalten.

Beispiel 1 Gewinnung von RNA aus Ratten-DRG, Gehirn und Rückenmark

Lumbal-DRG Nr. 4 und Nr. 5 (L4 und L5), Gehirn und Rückenmark wurden aus anästhesierten männlichen ausgewachsenen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Präpariermikroskop entnommen. Die Gewebe wurden in Trockeneis eingefroren und mit einem Polytron-Homogenisator homogenisiert; die RNA wurde mit dem Guanidin-Isothiocyanat-Verfahren extrahiert (siehe Chomczynski et al., Anal. Biochemistry 162, 156 bis 159 (1987)). Die gesamte RNA (5 µg jeder Probe) wurde in MEN-Puf fer gelöst, der 50% Formamid, 6,6% Formaldehyd enthielt, und bei 65°C 5 bis 10 Minuten lang denaturiert. Die RNA wurde elektrophoretisch behandelt mit einem 0,8% Agarosegel, das 8,3% Formaldehyd in MEN-Puffer enthielt. Der Elektrodenpuffer war MEN-Puffer, der 3,7% Formaldehyd enthielt; das Gel wurde mit 50 Volt 12 bis 18 Stunden lang laufen gelassen.

Größenmarker, einschließlich ribosomale 18S- und 28S-RNA und RNA-Marker (GIBCO BRL) wurden in parallelen Bahnen des Gels laufen gelassen. Ihre Positionen wurden bestimmt, indem die ausgeschnittene Bahn mit Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) gefärbt wurde und anschließend unter UV-Licht photographiert wurde.

Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 2 × SSC gespült und die RNA wurde auf eine Duralose-Membran (Stratagene) über führt mit 20 × SSC durch Kapillarwirkung; die Membran wurde im Vakuum bei 80°C 1 Stunde lang gebacken.

Beispiel 2 Sonde aus Rattengehirn IIA

Eine mit ³²P-markierte cRNA-Sonde, die komplementär zu den Nucleotiden 4637 bis 5868 der Sequenz der Natriumkanal-α- Untereinheit von Rattengehirn IIA war, wurde in vitro mit T7-RNA-Po lymerase (Pharmacia) synthetisiert unter Verwendung von pEAF8-Matrizen-DNA (Noda et al., Nature 320, 188 bis 192 (1986)), die mit BstEII linearisiert worden war.

Die Protokolle für jedes oben erwähnte Verfahren finden sich in Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1989).

Beispiel 3 Hybridisierung von RNA mit der Sonde aus Rattengehirn IIA

Die Membran von Beispiel 1 wurde 16 Stunden bei 42°C mit 50% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 1 × Den hardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma- DNA (1 mg/ml) prähybridisiert. Die Membran wurde in 50% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 1 × Den hardt's Lösung, 0,5% SDS und hitzedenaturierter Lachssperma- DNA (200 µg/ml) mit der ³²P-markierten cRNA-Sonde (ca. 1 bis 3 × 10⁶ cpm/ml), wie in Beispiel 2 beschrieben, 18 Stunden lang bei 42°C hybridisiert.

Die Membran wurde mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gespült und dann aufeinander folgend mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C 30 Minuten lang, 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C 30 Minuten lang, 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 70°C 30 Minuten lang und 0,2 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophos phat bei 70°C 20 Minuten lang gewaschen. Der Filter wurde einem Kodak X-omat AR Film bei -80°C mit verstärkenden Schir men bis zu 2 Wochen lang ausgesetzt.

Die pEAF8-Sonde hybridisierte mit mRNAs in der DRG-Probe mit Größen von 11 kb, 9,5 kb, 7,3 kb und 6,5 kb, abgeschätzt auf Basis der Position relativ zu den Standards.

Beispiel 4 Neue Natriumkanal-Domäne-IV-Sonde

Die Sonde wurde wie folgt erhalten: eine RT-PCR wurde durch geführt an RNA, die aus Ratten-DRG isoliert wurde unter Ver wendung von degenerierten Oligonucleotidprimern, die auf Basis der Homologie zwischen bekannten Natriumkanälen in Domäne IV entwickelt wurden. Die Produkte der Domäne IV wur den in einem Plasmidvektor kloniert, in E. coli transformiert und einzelne Kolonien isoliert. Die für die Domäne IV spezi fischen PCR-Produkte, die aus verschiedenen dieser Kolonien erhalten worden waren, wurden einzeln sequenziert. Die klo nierte neue Sequenz der Domäne IV war wie folgt (SEQ ID Nr. 4):

Diese Sequenz wurde durch Random-Priming mit ³²P markiert.

Beispiel 5 Hybridisierung von RNA mit der neuen Natriumkanal-3'-UTR-Sonde

Ein Northern-Blot wurde vorbereitet mit 10 µg Gesamt-RNA aus Rattengehirn, Rückenmark und DRG. Der Blot wurde mit einer cRNA-Sonde aus der 3'-UTR hybridisiert. Die 3'-UTR wurde in einen pSP73-Vektor kloniert, die cRNA unter Verwendung eines Trans Probe T-Kits (Pharmacia Biotech) und von ³²P-UTP tran skribiert. Der Blot wurde 2 Stunden lang bei 65°C in einer Lösung, die 5 × SSC, 1 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 50 mM Natriumphosphat, pH 7,1, Lachssperma-DNA (1 mg/ml) und 50% Formamid enthielt, vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 45°C 18 Stunden lang in der obigen Lösung durchgeführt, außer daß die Lachssperma-DNA in einer Konzentration von 20 µg/ml enthalten war, und die mit ³²P markierte Sonde wurde mit 7,5 × 10⁵ cpm/ml Lösung zugegeben. Der Blot wurde anschließend dreimal mit 2 × SSC und 0,1% SDS bei Raumtempe ratur, einmal mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C 20 Minuten lang und einmal mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS und 0,1% Natriumpyro phosphat bei 65°C 20 Minuten lang gewaschen. Der Blot wurde mit einem PhosphoImager (BioRad) nach 2-tägiger Belichtung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß ein ∼6,5 kb Banden signal in Gehirn vorhanden war, nur in der Bahn, die die RNA von DRG enthielt. Wegen der geringeren Menge von PN5-mRNA, die durch den RT-PCR-Versuch gezeigt wurde, war die 6,5-kb-Bande in Gehirn und Rückenmark nicht nachweisbar.

Beispiel 6 Konstruktion und Screenen einer cDNA-Bibliothek von Ratten-DRG

Eine an EcoRI angepaßte cDNA-Bibliothek wurde aus der Ratten- DRG-poly(A)⁺-RNA von ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten erstellt unter Verwendung des SuperScript Choice Systems (GIBCO BRL). cDNA (< 4 kb) wurde mit einer Fraktionierung mit Saccharosegradient ausgewählt, wie von Kieffer, Gene 109, 115 bis 119 (1991) beschrieben. Die cDNA wurde dann in den Zap-Express-Vektor (Stratagene) ligiert und mit dem Gigapack-II-XL-lambda-Verpackungsextrakt (Stratagene) verpackt. In ähnlicher Weise wurde eine < 2 kb-DRG-cDNA- Bibliothek synthetisiert.

Der Phage (3,5 × 10⁵) wurde mit Filterhybridisierung mit einer mit ³²P-markierten Sonde (rBIIa, Basen 4637 bis 5868 gemäß Auld et al., Neuron 1, 449 bis 461 (1988)) gescreent. Die Filter wurden in 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung, 0,5% SDS, 250 µg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 50 mM Natriumphosphat bei 42°C hybridisiert und in 0,5 × SSC/0,1% SDS bei 50°C gewaschen.

Southern Blots von mit EcoRI verdauten Plasmiden wurden mit der mit ³²P markierten DNA-Sonde (SEQ ID Nr. 4) hybridisiert. Die Filter wurden dann in 50% Formamid, 6 × SSC, 5 × Den hardt's Lösung, 0,5% SDS und 100 µg/ml denaturierter Lachs sperma-DNA bei 42°C hybridisiert und in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 65°C gewaschen.

Positive Klone wurden in vivo abgetrennt in pBK-CMV unter Verwendung des ExAssist/XLOLR-Systems (Stratagene).

Beispiel 7 Klone und Nucleotidanalyse

cDNA-Klone, 26.2 und 25.1, wurden aus der <4 kb-DRG-cDNA- Bibliothek isoliert und der Klon 1.18 wurde aus der <2 kb- DRG-cDNA-Bibliothek isoliert. Durch Sequenzanalyse schien 26.2 eine cDNA voller Länge zu sein, die einen neuen Natrium kanal codiert und 25.1 erstreckte sich von Domäne II zu der 3'-UTR. Jedoch hatte jeder eine Deletion, die die codierende Region trunkierte. Klon 1.18 hatte die 3'-untranslatierte Region zusätzlich zu dem C-Terminus der abgeleiteten Aminosäuresequenz von PN5. Das Konstrukt in dem Expressions vektor pBSTACIIr bestand aus den Sequenzen von 26.2 und 1.18.

Die PN5-Homologie mit anderen bekannten Natriumkanälen wurde erhalten unter Verwendung des GAP/Best Fit (GCG) Programms:

Stabilisierung der PN5-cDNA voller Länge A. Medien, E. coli-Zellinien und Wachstumsbedingungen

Das Wachstum von Fragmenten von PN5 wurde unter den folgenden Standardbedingungen erreicht; das Wachstum von Plasmiden, die Konstrukte mit PN5 in voller Länge enthielten (in pCIneo, pBSTAcIIr und anderen Vektoren) konnte nicht ohne Verwendung spezieller Wachstumsmedien, Bedingungen und E. coli-Stämme erreicht werden. Die folgenden Bedingungen erwiesen sich als optimal:

(1) Verwendung von E. coli-STBL2™ für die primäre Transfor mation nach Ligierungsreaktionen und für die Züchtung in großem Maßstab;
(2) feste Medien waren 1/2 × FM (siehe unten) plus 1 × LB (Trypton 1%, Hefeextrakt 0,5%, NaCl 0,5%) plus 15 g/l Agar oder 1 × FM plus 1/2 × LB;
(3) flüssige Medien waren optimalerweise 1 × FM plus 1/2 × LB;
(4) Carbenicillin, 100 µg/ml wurde für alle Medien verwen det, da es weniger schnell als Ampicillin metabolisiert wird;
(5) die Temperatur für das Wachstum sollte nicht höher als 30°C sein, gewöhnlich 24 bis 26°C; dies erfordert län gere Wachstumsperioden als normalerweise angewendet von 24 bis 72 Stunden.

2 × Friermedium (2 × FM)

K₂HPO₄	12,6 g
Na₃Citrat	0,9 g
MgSO₄.7 H₂O	0,18 g
(NH₄)₂SO₄	1,8 g
KH₂PO₄	3,6 g
Glycerol	88 g
H₂O	auf 1 l

2 × FM und die verbleibenden Medienkomponenten werden getrennt, vorbereitet, durch Autoklavieren sterilisiert, auf mindestens 60°C gekühlt und zusammengegeben, um das fertige Medium zu bilden. Carbenicillin wird hergestellt mit 25 mg/ml H₂O und durch Filtration sterilisiert. 2 × FM wurde zuerst beschrieben zur Herstellung von gefrorenen Vorräten von Bak terienzellen (Practical Methods in Molecular Biology, R.F. Schleif und P.C. Wensink, Springer Verlag, New York (1981), Seiten 201 bis 202).

B. Expressionsvektoren

Um der cDNA mit voller Länge eine erhöhte Stabilität zu ver leihen, wurde der Oozyten-Expressionsvektor pBSTAcIIr modifi ziert, um die Plasmidkopienzahl zu vermindern, wenn er in E. coli gezüchtet wurde, und um möglicherweise die Transkription von Vektorsequenzen, die zu der toxischen kryptischen Expres sion von PN5-Protein führen könnten, zu vermindern, J. Bro sius, Gene 27, 151 bis 160 (1984). pBSTAcIIr wurde mit PvuII verdaut. Das 755 bp-Fragment, das den T7-Promotor, β-Globin- 5'-UTR, die multiple Klonierungsstelle, β-Globin-3'-UTR und den T3-Promotor enthielt, wurde mit dem 3,6 kb-Fragment, das den Replikationsursprung, das Ampicillin-Resistenzgen, die rrnBT₁- und rrnBT₁T₂-Transkriptionsterminatoren von pKK232-8 enthielt, das vollständig mit SmaI und teilweise mit PvuII- Gemisch verdaut worden war, liqiert und mit intestinaler Phosphatase von Krabben behandelt, um die Selbstligierung zu verhindern. Das entstehende Plasmid, in dem die Orientierung des pBSTA-Fragmentes so ist, daß der T7-Promotor proximal zu dem rrnBT₁-Terminator ist, wurde identifiziert durch Restrik tionskartierung und mit pHQ8 bezeichnet. Wie im Fall von pBSTA sind die Richtung der Transkription des Ampicillin- Resistenzgens und des Replikationsursprungs von pHQ8 entge gengesetzt der der Genexpressionskassette und die Gegenwart des rrnBT₁-Terminators sollte das Weiterlesen des Vektors in der von dem P7-Promotor gesteuerten Expressionskassette ver mindern.

C. Zusammenfügung von cDNA voller Länge für die Expression

Da pBK-CMV.26.2 eine Deletion von 58 bp hatte (entsprechend dem bp 4346 bis 4403 von SEQ ID Nr. 1) und die Sequenz von pBK-CMV.1.18 bei bp 4180 von SEQ ID Nr. 1 beginnt, könnte pBK-CMV.1.18 verwendet werden, um pBK-CMV.26.2 zu "reparie ren". Es wurde eine Strategie entwickelt, um eine cDNA voller Länge zusammenzusetzen aus den Klonen pBK-CMV.26.2 und pBK- CMV.1.18 in drei Sektionen, wobei die 5'- und 3'-UTRs trun kiert wurden und eine einzige Restriktionsstelle an den 5'- und 3'-Enden in dem Verfahren eingeführt wurde. Das 5'-Ende wurde erzeugt durch PCR aus 26.2, Trunkieren des 5'-UTRs durch Einbau einer SalI-Stelle direkt stromaufwärts des Start-Codons. Der Zentralbereich war ein Restriktionsfragment von 26.2. Das 3'-Ende wurde hergestellt durch überlappende PCR sowohl auf 26.2 als auch 1.18 und Einbau einer XbaI- Stelle direkt stromabwärts des Stopcodons. Diese Bereiche wurden an den einzelnen Restriktionsstellen verdaut und in pBSTAcIIr eingesetzt. Obwohl dieses Konstrukt eine korrekte Sequenz zu haben schien, wurden beim erneuten Klonieren als SalI-XbaI-Fragment in pCIneo zwei Arten von Isolaten gefun den, eines mit einer Deletion und eines mit einer 8 bp-Inser tion. Die erneute Untersuchung des pBSTAcIIr-Klons zeigte, daß die Sequenz in diesem Bereich "gemischt" war, so daß der Klon sich umgelagert haben mußte. Die 8 bp-Insertion erwies dich als Sequenzwiederholung eines Mitglieds einer 8 bp-Ver doppelung in der nativen Sequenz, was eine dreifache Sequenz wiederholung von 8 bp in dem umgelagerten Isolat bildete. Zahlreiche Klonierungsversuche führten unausweichlich zu die ser Umlagerung. Überlappende PCR wurde verwendet, um stille Mutationen in eine der 8 bp-Sequenzwiederholungen einzuführen und ein Fragment, das diese Region enthielt, war enthalten, als die PN5-codierende Region in HQ8 eingesetzt wurde, die Version mit niedriger Kopienzahl von pBSTAcIIr, was Plasmid HR-1 ergab. Diese Sequenz erwies sich als stabil (siehe Fig. 5A bis E, SEQ ID Nr. 5).

Das 5'-Ende des Fragmentes wurde mit PCR gebildet unter Ver wendung von pBK-CMV.26.2-DNA als Matrize und der Primer 4999 (CTTGGTCGACTCTAGATCAGGGTGAAGATGGAGGAG SalI-Stelle unterstrichen, PN5-Homologie kursiv, entsprechend bp 58 bis 77 von SEQ ID Nr. 1, Initiationscodon fett) und 4927 (GGGTTCAATGTGGTTTTATCT entsprechend bp 1067 bis 1047 von SEQ ID Nr. 1), gefolgt von einer Gelreinigung, Verdau mit SalI und KpnI (KpnI-Stelle bei pb 1003 bis 1008, SEQ ID Nr. 1) und Gelreinigung.

Das zentrale 3.1 kb-Fragment wurde hergestellt durch Verdau von pBK-CMV.26.2-DNA mit KpnI und AatII (AatII-Stelle bei 4133 bis 4138) und anschließende Gelreinigung.

Das 3'-Ende des Fragmentes wurde wie folgt hergestellt: PCR unter Verwendung der Primer 4837 (TCTGGGAAGTTTGGAAG entsprechend bp 3613 bis 3629 von SEQ ID Nr. 1) und 4931 (GACCACGAAGGCTATGTTGAGG entsprechend bp 4239 bis 4218 von SEQ ID Nr. 1) auf pBK- CMV.26.2-DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 0,6 kb. Eine PCR unter Verwendung der Primer 4930 (CCTCAACATAGCCTTCGTGGTC entsprechend bp 4218 bis 4239 von SEQ ID Nr. 1) und 4929 (GTCTTCTAGATGAGGGTTCAGTCATTGTG XbaI-Stelle unterstrichen, PN5-Homologie kursiv, entsprechend pb 5386 bis 5365 von SEQ ID Nr. 1; Stop-Codon fett) auf pBK- CMV.1.18-DNA als Matrize lieferte ein Fragment mit 1,2 kb, das eine XbaI-Stelle 7 bp vom Stop-Codon entfernt einführte. Somit ist das 3'-Ende des 4837 bis 4931-Fragmentes exakt kom plementär zu dem 5'-Ende des 4930 bis 4929-Fragments. Diese zwei Fragmente wurden mit Gel gereinigt und eine Fraktion jeweils als Matrize in einer PCR-Reaktion vereinigt unter Verwendung der Primer 4928 (CAAGCCTTTGTGTTCGAC entsprechend bp 4084 bis 4101 von SEQ ID Nr. 1) und 4929, was ein Fragment mit 1,3 kb ergab. Dieses Fragment wurde mit Gel gereinigt, mit AatII und XbaI verdaut und das 1,2 kb-Fragment wurde mit Gel gereinigt.

Das Fragment des 3'-Endes wurde in mit AatII und XbaI verdau tem pBSTAcIIr kloniert. Ein Isolat wurde mit SalI und KpnI verdaut und mit dem 5'-Ende-Fragment ligiert. Das entstehende Plasmid wurde nach Bestätigung der Sequenz mit KpnI und AatII verdaut und mit dem zentralen 3,1 kb-Fragment ligiert unter Bildung von pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21). pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21) wurde mit SalI und XbaI verdaut, um das 5,3 kb-PN5-Fragment freizusetzen, das in mit SalI und XbaI verdautem pCIneoII kloniert wurde. Multiple Isolate wurden gefunden, von denen GPII-1, das vollständig sequenziert wurde, typisch war und ein 8 bp-Insert enthielt. Dieses CAGAAGAA nach pb 3994 von SEQ ID Nr. 1 wandelte die direkte Wiederholung dieser Sequenz an diesem Ort in eine dreifache direkte Wiederholung um, was eine Verschiebung des Leserahmens verursachte. In einem Ver such, diesen Mangel zu beheben, wurde pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21) mit NheI (bp 2538 bis 2543 SEQ ID Nr. 1) und XhoI (bp 4828 bis 4833, SEQ ID Nr. 1) verdaut, was ein 6,2 kb-Fragment lie ferte, und mit AatII und XhoI verdaut, was ein 0,7 kb-Frag ment lieferte, das mit dem 1,6 kp-Fragment, das durch den Verdau von pBK-CMV.26.2 mit AatII und NheI entstand, ligiert wurde. Obwohl keine Isolate gefunden wurden, die vollständig korrekt waren, hatte ein Isolat, HA-4, nur eine einzige Basenveränderung, die Deletion von C an bp 4827 (SEQ ID Nr. 1), benachbart der XhoI-Stelle.

Um zu verhindern, daß die Umlagerung des 8 bp-Inserts auf trat, wurden drei stumme Mutationen eingeführt in die 5'- Sequenzwiederholung und zwei weitere Mutationen in einem Strang von Ts sollten auch eingeführt werden, wie unten gezeigt (bp 3982 bis 4014, SEQ ID Nr. 1, Mutationsstellen unterstrichen, 8 bp-Sequenzwiederholungen in der nativen Sequenz kursiv):

Da Isolat HA-4 die native direkte Wiederholungssequenz auf wies (im Gegensatz z. B. zu pBSTAcIIr.PN5 (Klon 21)) und der Bereich in der Nähe des XhoI-Defekts nicht betroffen war, wurde es als Matrizen-DNA für die folgenden PCR-Reaktionen verwendet. Der Primer P5-3716S (CCGAAGCCAATGTAACATTAGTAATTACTCGTG entsprechend pb 3684 bis 3716, SEQ ID Nr. 1) wurde mit Primer P5-3969AS (GCTCCTCAGTCATGAAGATGTCTTGGCCACCTAAC entsprechend bp 4003 bis 3969, SEQ ID Nr. 1, mutierte Basen unterstrichen) gepaart, was ein 320 bp-Produkt lieferte. Der Primer P5-4017S (GGCCAAGACATCTTCATGACTGAGGAGCAGAAGAAATATTAC entsprechend bp 3976 bis 4017, SEQ ID Nr. 1, mutierte Basen sind unterstrichen) wurde mit Primer P5-4247AS (CTCAAAGCAAAGACTTTGATGAGACACTCTATGG entsprechend bp 4280 bis 4247, SEQ ID Nr. 1) gepaart, was ein 305 bp-Produkt lieferte. Das 3'-Ende des 320 bp-Fragmentes stimmte somit in 28 bp exakt mit dem 5'-Ende des 305 bp-Frag mentes überein. Die zwei Banden wurden mit Gel gereinigt und eine Fraktion jeweils in einer neuen PCR-Reaktion mit den Primern P5-3716S und P5-4247AS vereinigt, was ein 597 bp-Pro dukt lieferte, das T/A-kloniert wurde im Vektor pCRII. Es wurde gefunden, daß das Isolat HO-7 die gewünschte Sequenz hatte. Eine Vierwege-Ligierung wurde durchgeführt, um den modifizierten PN5 mit voller Länge zusammenzusetzen: Der Oozyten-Expressionsvektor HQ-8 wurde mit SalI und XbaI ver daut, was ein 4,4 kb-Vektorfragment lieferte; GPII-1 wurde mit SalI und MluI verdaut, was ein 3,8 kb-Fragment lieferte, das die 5'-Hälfte von PN5 enthielt; HO-7 wurde mit MluI (bp 3866 bis 3871, SEQ ID Nr. 1) und AatII verdaut, was ein 0,3 kb-Fragment lieferte, das die mutierte 8 bp-Repeatregion von PN5 enthielt; GPII-1 wurde mit AatII und XbaI verdaut, was den verbleibenden 1,3 kb-3'-Teil von PN5 lieferte. Ein Teil der Ligierungsreaktion wurde in E. coli Stable-2-Zellen transformiert. Von den 9,6 kb-Isolaten, die alle vier Frag mente enthielten, wurde HR-1 sequenziert und es wurde gefun den, daß es die gewünschte 5,4 kb-Sequenz hatte. Diese Iso late wuchsen gut und zeigten keine Tendenz zu einer Umlage rung. Die Sequenz dieser bearbeiteten Version von PN5 ist in den Fig. 5A bis E gezeigt (SEQ ID Nr. 5).

Beispiel 8 Menschliches PN5

Ein 856 bp-Klon (Fig. 3A, SEQ ID Nr. 3) wurde aus einer cDNA-Bibliothek der menschlichen Ganglien der Dorsalwurzel (DRG) isoliert, die am nächsten verwandt ist mit Ratten-PN5 mit 79% Identität der Aminosäuresequenz. Die menschliche PN5-Se quenz überspannt die Region zwischen IIIS1 und der Inter domäne III/IV, die die schnelle Inaktivierungssteuerung (d. h. IFM) einschließt, die innerhalb der Interdomäne III/IV ange ordnet ist.

Die menschliche DRG-cDNA-Bibliothek wurde aus Lumbal4- und 5- DRG Gesamt-RNA konstruiert, die statistisch geprimet wurde. cDNA des ersten Strangs wurde mit SuperScriptII reverse Transkriptase (GIBCO BRL) synthetisiert und die Synthese des zweiten Strangs erfolgte mit T4-DNA-Polymerase. EcoRI-Adapter wurden an die Enden der doppelsträngigen cDNA ligiert und die Fragmente in dem ZAPII-Vektor (Sratagene) kloniert. Die Bibliothek wurde mit mit Digoxigenin markierten Ratten-PN3-, Ratten-PN1- und menschlichen Herz hH1-Sonden gescreent. Posi tive Klone wurden sequenziert und mit bekannten menschlichen und Rattennatriumkanalsequenzen verglichen. Nur der vorher erwähnte Klon wurde als menschliche PN5-Sequenz identifi ziert.

Fig. 3B vergleicht die Aminosäuresequenz des hPN5-Fragmentes mit der Aminosäuresequenz von Ratten-PN5 in der geeigneten Region.

Beispiel 9 Gewebeverteilung mit RT-PCR

Gehirn-, Wirbelsäulen-, DRG-, Knotenganglien-, obere Zer vikalganglien-, Ischiasnerv-, Herz- und Skelettmuskelgewebe wurden aus anästhesierten normalen ausgewachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten isoliert und bei -80°C aufbewahrt. Die RNA wurde aus jedem Gewebe isoliert unter Verwendung von RNAzol (Tel-Test, Inc.). Statistisch geprimete cDNA wurde umgekehrt transkribiert aus 500 ng RNA aus jedem Gewebe. Der Vorwärtsprimer (CAGATTGTGTTCTCAGTACATTCC) und der Rückwärtsprimer (CCAGGTGTCTAACGAATAAATAGG) wurden aus dem 3'-untranslatierten Bereich erzeugt, was ein 252-Basenpaar-Fragment lieferte. Die Zyklusparameter waren: 94°C/2 min (Denaturierung), 94°C/30 s, 65°C/30 s und 72°C/1 min (35 Zyklen) und 72°C/4 min. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 4% Agarosegel analysiert.

Eine positive Kontrolle und eine Kontrolle ohne Matrize waren auch enthalten. cDNA aus jedem Gewebe wurde auch mit PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, die spezifisch für Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase sind, um die Lebens fähigkeit der Matrize zu zeigen, wie von Tso et al., Nucleic Acid Res. 13, 2485 bis 2502 (1985) beschrieben.

Das Gewebeverteilungsprofil von rPN5 durch Analyse der RNA aus ausgewählten Rattengeweben mit RT-PCR war wie folgt:

PN5 wurde auch nach nur 25 Zyklen (24 + 1) in den gleichen 5 Geweben, wie oben, in der gleichen relativen Häufigkeit nach gewiesen.

Beispiel 10 Antikörper

Ein synthetisches Peptid (26 Aminosäuren in der Interdomäne II und III, Reste 977 bis 1002) wurde mit KLH konjugiert und Antikörper in Kaninchen erzeugt. Das Antiserum wurde anschließend durch Affinität gereinigt.

PN5 bildet eine Unterfamilie von neuen Natriumkanalgenen; diese Gene sind verschieden von solchen, die mit anderen Son den nachweisbar sind (z. B. PEAF8 und PN3-Sonden).

Obwohl die vorhergehende Erfindung im Detail durch Erläute rung und Beispiele zur besseren Klarheit und zum besseren Verständnis beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können innerhalb des Schutzbereichs der beigefügten Ansprüche.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte DNA-Sequenz umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 3.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz ein Natriumkanalprotein oder ein Fragment davon codiert.

3. DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumkanalprotein die α-Untereinheit oder ein Fragment davon ist.

4. DNA nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Natriumkanalprotein Tetrodotoxin-resistent ist.

5. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß das Natriumkanalprotein in Säugetieren gefunden wird.

6. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß das Natriumkanalprotein in Ratten gefunden wird.

7. DNA nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß das Natriumkanalprotein in Menschen gefun den wird.

8. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA cDNA ist.

9. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA synthetische DNA ist.

10. Expressionsvektor enthaltend die DNA von Anspruch 8.

11. Expressionsvektor enthaltend die synthetische DNA von Anspruch 9.

12. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 10.

13. Wirtszelle transformiert mit dem Expressionsvektor von Anspruch 11.

14. Rekombinantes Polynucleotid enthaltend eine Nuclein säuresequenz, die aus der DNA-Sequenz von Anspruch 1 abgeleitet ist.

15. Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

16. Tetrodotoxin-resistentes Natriumkanalprotein, das von einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder alleli schen Varianten davon codiert wird.

17. Protein nach Anspruch 16 mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2.

18. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren von Tetro dotoxin-resistentem Natriumkanalprotein umfassend, daß man eine Verbindung, von der angenommen wird, daß sie ein Inhibitor ist, mit Natriumkanalprotein nach Anspruch 16 in Kontakt bringt und die Aktivität des exprimierten Natriumkanals mißt.

19. Poly- und/oder monoklonale Antikörper gegen ein Tetrodo toxin-resistentes Natriumkanalprotein, das von DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder allelischen Varianten davon codiert wird.

20. Diagnosekit umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 14, das spezifisch mit einem Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanalprotein oder einem Fragment davon hybridi sieren kann.

21. Verwendung einer isolierten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, um eine Verbindung zu identifizieren, von der angenommen wird, daß sie ein Inhibitor von Tetrodotoxin-resistentem Natriumkanalprotein ist.