DE69633225T2

DE69633225T2 - OCIF-Protein und Verfahren zu dessen Gewinnung

Info

Publication number: DE69633225T2
Application number: DE69633225T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Shimotsuga-gun GOTO; Eisuke Shimotsuga-gun TSUDA; Shin'ichi Kawachi-gun MOCHIZUKI; Kazuki Shimotsuga-gun YANO; Fumie Kawachi-gun KOBAYASHI; Nobuyuki Kawachi-gun SHIMA; Hisataka Kawachi-gun YASUDA; Nobuaki Shimotsuga-gun NAKAGAWA; Tomonori Shimotsuga-gun MORINAGA; Masatsugu Kawagoe-shi UEDA; Kanji Kawagoe-shi HIGASHIO
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 1995-02-20
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2016-02-21
Also published as: EP0816380B1; NO973801D0; US6855808B2; KR100381788B1; HU224570B1; FI973402A; MX9706341A; NZ301362A; RU2194714C2; ATE274580T1; CN1218961C; US20050118682A1; FI973402A0; AU4677396A; RU2002120050A; AU702557C; TW538049B; IL117175A; AU702557B2; US20030153048A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das neuartige Protein Osteoklastogenese-inhibierender Fakor (OCIF) sowie Verfahren zur Herstellung des Proteins.
Hintergrund der Erfindung
Menschliche Knochen remodellieren sich ständig durch den wiederholten Prozess der Resorption und Rekonstitution. In dem Prozess werden Osteoblasten und Osteoklasten als die Zellen angesehen, die jeweils hauptsächlich für die Knochenbildung und Knochenresorption verantwortlich sind. Ein typisches Beispiel für eine Krankheit, die durch das Fortschreiten eines abnormen Knochenmetabolismus verursacht wird, ist Osteoporose. Die Krankheit wird bekanntlich durch den Zustand ausgelöst, bei dem die Knochenresorption durch Osteoklasten die Knochenbildung durch Osteoblasten übertrifft, allerdings wurde der Mechanismus der Osteoporose bisher noch nicht vollständig erklärt. Osteoporose verursacht Schmerzen im Knochen und macht den Knochen zerbrechlich, so dass es zur Fraktur kommt. Da durch die Osteoporose die Zahl bettlägeriger alter Menschen zunimmt, ist sie angesichts der steigenden Zahl älterer Menschen zu einem gesellschaftlichen Problem geworden. Man erwartet daher, dass wirksame Arzneimittel zur Behandlung der Krankheit entwickelt werden. Es wird davon ausgegangen, dass ein Rückgang der Knochenmasse, der durch einen abnormen Knochenmetabolismus verursacht wird, durch Inhibieren der Knochenresorption, Verbessern der Knochenbildung oder Verbessern des balancierten Metabolismus verhindert wird.
Die Knochenbildung wird voraussichtlich durch eine Wachstumsstimulation, Differenzierung oder Aktivierung von Osteoblasten gefördert. Viele Cytokine stimulieren Berichten zufolge das Wachstum oder die Differenzierung von Osteoblasten, d. h. Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) (Rodan S. B. et al. Endocrinology, Bd. 121, S. 1917, 1987), insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I) (Hock J. M. et al., Endocrinology, Bd. 122, S. 254, 1988), insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-II (IGF-II) (McCarthy T. et al., Endocrinology, Bd. 124, S. 301, 1989), Activin A (Centrella M. et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 11, S. 250, 1991), Vasculotropin (Varonique M et al., Biochem. Biopyhs. Res. Commun., Bd. 199, S. 380, 1994) und morphogenetisches Knochenprotein (BMP) (Yamaguchi, A et al., J. Cell Biol., Bd. 113 S. 682, 1991, Sampath T. K. et al., J. Biol. Chem., Bd. 267, S. 20532, 1992 und Knutsen R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 194, S. 1352, 1993).
Cytokinen, die eine Differenzierung und/oder Maturation von Osteoklasten inhibieren, wird hingegen Aufmerksamkeit geschenkt, und es werden intensive Untersuchungen durchgeführt. Man fand, dass Transforming Growth Factor-β (Chenu C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 5683, 1988) und Interleukin-4 (Kasano K. et al., Bone-Miner., Bd. 21, S. 179, 1993) die Differenzierung von Osteoklasten inhibieren. Man fand, dass Calcitonin (Bone-Miner., Bd. 17, S. 347, 1992), Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (Hattersley G. et al., J. Cell. Physiol., Bd. 137, S. 199, 1988), Interleukin-4 (Watanabe, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 172, S. 1035, 1990) und Interferon-y (Gowen M. et al., J. Bone Miner. Res., Bd. 1, S. 469, 1986) die Knochenresorption durch Osteoklasten inhibieren.
Diese Cytokine sind voraussichtlich wirksame Arzneimittel zur Verbesserung der Knochenmassenreduktion, indem die Knochenbildung stimuliert und/oder die Knochenresorption inhibiert wird. Cytokine wie insulin- ähnlicher Wachstumsfaktor-I und morphogenetische Knochenproteine werden jetzt in klinischen Versuchen im Hinblick auf ihre Wirkungen bei der Behandlung von Patienten mit Knochenkrankheiten untersucht. Calcitonin wird bereits als ein Arzneimittel eingesetzt, um Osteoporose zu behandeln und Schmerzen in Verbindung mit Osteoporose zu verringern.
Beispiele für Arzneimittel, die momentan zur Behandlung von Knochenkrankheiten und zur Verkürzung der Behandlungsdauer klinisch eingesetzt werden, sind Dihydroxyvitamin D₃, Vitamin K₂, Calcitonin und seine Derivate, Hormone wie Estradiol, Ipriflavon und Calciumpräparate. Diese Arzneimittel erzielen jedoch keine zufriedenstellenden therapeutischen Effekte und man erwartet die Entwicklung neuartiger Arzneimittelsubstanzen. Wie erwähnt, wird der Knochenmetabolismus hinsichtlich einer Ausgewogenheit zwischen Knochenresorption und Knochenbildung kontrolliert. Folglich wird erwartet, dass Cytokine, die eine Osteoklasten-Differenzierung und/oder -Maturation inhibieren, als Arzneimittel zur Behandlung von Knochenkrankheiten wie Osteoporose entwickelt werden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf den oben beschriebenen Standpunkt angeregt. Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, sowohl einen neuartigen Faktor mit der Bezeichnung Osteoklastogenese-inhibierender Faktor (OCIF) als auch ein effizientes Verfahren zur Herstellung dieses Faktors bereitzustellen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben intensiv nach Osteoklastogenese-inhibierenden Faktoren in durch humanen embryonalen Fibloblasten IMR-90 (ATCC CCL 186) konditioniertem Medium gesucht und einen neuartigen Osteoklastogenese-inhibierenden Faktor (OCIF) gefunden, der die Differenzierung und/oder Maturation von Osteoklasten inhibiert.
Die Erfinder haben ein Verfahren zum Akkumulieren des Proteins auf eine hohe Konzentration ermittelt, indem IMR-90 Zellen unter Verwendung von Tonerde-Keramik-Stücken als Zelladhäsionsmatrizen kultiviert werden.
Die Erfinder haben außerdem ein effizientes Verfahren zur Isolierung des Proteins OCIF vom IMR-90-konditionierten Medium unter Anwendung der folgenden aufeinander folgenden Säulenchromatographieverfahren ermittelt: Ionenaustausch, Heparinaffinität, Cibacron-Blue-Affinität und Umkehrphase.
Die Erfinder klonierten auf der Basis der Aminosäuresequenz des gereinigten natürlichen OCIF erfolgreich eine cDNA, die dieses Protein kodiert. Die Erfinder ermittelten außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieses Proteins, das die Differenzierung von Osteoklasten inhibiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das von humanen Lungenfibroblastenzellen produziert wird, eine relative Molekülmasse gemäß SDS-PAGE von 60 kD unter reduzierenden Bedingungen und 60 kD und 120 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen hat, Affinität zu Kationenaustauschharzen und Heparin hat, seine Aktivität zur Hemmung einer Osteoklastendifferenzierung und -maturation bei einer 10-minütigen Behandlung bei 70°C oder bei einer 30-minütigen Behandlung bei 56°C verringert, und seine Aktivität zur Hemmung einer Osteoklastendifferenzierung und -maturation durch eine 10-minütige Behandlung bei 90°C verliert. Die Aminosäuresequenz des in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Proteins OCIF wird durch die SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 bereitgestellt und unterscheidet sich eindeutig von allen bekannten Faktoren, die die Bildung von Osteoklasten inhibieren.
Ein Verfahren zur Reinigung von OCIF-Proteinen umfasst die folgenden Schritte: (1) Kultivieren humaner Fibroblasten, (2) Aufbringen des konditionierten Mediums auf eine Heparinsäule, um die adsorbierte Fraktion zu erhalten, (3) Reinigen des OCIF-Proteins mit einer Kationenaustauschsäule, (4) Reinigen des OCIF-Proteins mit einer Heparinaffinitätssäule, (5) Reinigen des OCIF-Proteins mit einer Cibacron-Blue-Affinitätssäule, (6) Isolieren des OCIF-Proteins unter Anwendung von Umkehrphasensäulenchromatographie. Cibacron-Blue F3GA, gekoppelt an einen Träger aus synthetischen, hydrophilen Polymeren, wird zum Beispiel als Material zur Herstellung von Cibacron-Blue-Säulen verwendet. Diese Säulen werden konventionell „blaue Säulen" genannt.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Akkumulieren des OCIF-Proteins auf eine hohe Konzentration durch Kultivieren humaner Fibroblasten unter Verwendung von Tonerde-Keramik-Stücken als Zelladhäsionsmatrizen.
Ferner ermittelten die Erfinder die Aminosäuresequenzen der vom OCIF abstammenden Peptide, gestalteten die Primer auf der Basis dieser Aminosäuresequenzen und erhielten OCIF kodierende cDNA-Fragmente von einer cDNA-Bibliothek von IMR-90 Zellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße OCIF-Protein kann von durch humane Fibroblasten konditioniertes Medium mit hoher Ausbeute isoliert werden. Das Verfahren zur Isolierung von OCIF basiert auf gewöhnlichen Techniken zur Reinigung von Proteinen von Biomaterialien gemäß den physikalischen und chemischen Eigenschaften des OCIF-Proteins. Das Konzentrierungsverfahren beinhaltet zum Beispiel gewöhnliche biochemische Techniken wie Ultrafiltration, Lyophilisation und Dialyse. Das Reinigungsverfahren beinhaltet Kombinationen mehrerer chromatographischer Techniken zum Reinigen von Proteinen, wie Ionenaustauschsäulenchromatographie, Affinitätssäulenchromatographie, Gelfiltrationssäulenchromatographie, Hydrophobsäulenchromatographie, Umkehrphasensäulenchromatographie und präparative Gelelektrophorese. Als humaner Fibroblast zur Herstellung des OCIF-Proteins wird vorzugsweise IMR-90 verwendet. Ein Verfahren zur Herstellung des IMR-90-konditionierten Mediums umfasst vorzugsweise das Adhärieren humaner embryonaler Fibroblasten-IMR-90-Zellen an Tonerde-Keramik-Stücke in Rollerflaschen, das Verwenden von mit 5% neonatalem Kälberserum angereichertem DMEM-Medium für die Zellkultur und das 7 bis 10 Tage lange Kultivieren der Zellen in Rollerflaschen durch stehende Kultivierung. In den Reinigungsschritten des OCIF-Proteins wird vorzugsweise CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat) als Detergens zum Puffer gegeben.
Das erfindungsgemäße OCIF-Protein kann anfänglich als eine heparinbindende OCIF-Grundfraktion erhalten werden, indem das Kulturmedium auf eine Heparinsäule (Heparin-Sepharose CL-6B, Pharmacia) aufgebracht, mit 10 mM Tris-HCl Puffer, pH 7,5, der 2 M NaCl enthält, eluiert wird und dann die OCIF-Fraktion auf eine Q·Anionenaustauschsäule (HiLoad-Q/FF, Pharmacia) aufgebracht und die nicht adsorbierte Fraktion aufgefangen wird. Das OCIF-Protein kann dadurch gereinigt werden, dass die erhaltene OCIF-Fraktion auf einer S·Kationenaustauschsäule (HiLoad-S/FF, Pharmacia), einer Heparinsäule (Heparin-5PW, TOSOH), Cibacrone-Blue-Säule (Blue-5PW, TOSOH) und einer Umkehrphasensäule (BU-300 C4, Perkin Elmer) einer Reinigung unterzogen wird, und das Material wird anhand der zuvor beschriebenen Eigenschaften definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren von cDNA, die das OCIF-Protein kodiert, auf der Basis der Aminosäuresequenz von natürlichem OCIF und ein Verfahren zum Erhalten eines rekombinanten OCIF-Proteins, das eine Differenzierung und/oder Maturation von Osteoklasten inhibiert. Das OCIF-Protein wird gemäß dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren gereinigt und mit Endopeptidase (z. B. Lysylendopeptidase) behandelt. Die Aminosäuresequenzen der durch den Verdau produzierten Peptide werden bestimmt und das Gemisch von Oligonucleotiden, die die jeweiligen internen Aminosäuresequenzen kodieren können, wird synthetisiert. Das OCIF cBNA-Fragment wird durch PCR (vorzugsweise RT-PCR, Umkehrtranskriptase-PCR) unter Verwendung der oben beschriebenen Oligonucleotidgemische als Primer erhalten. Die „full length" OCIF DNA, die das OCIF-Protein kodiert, wird von einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung des erhaltenen OCIF DNA-Fragments als Sonde kloniert. Die OCIF cDNA, die die gesamte Kodierregion enthält, wird in einen Expressionsvektor eingesetzt. Der rekombinante OCIF kann durch Exprimieren der OCIF cDNA, die die gesamte Kodierregion enthält, in Säugetierzellen oder Bakterien erzeugt werden.
Die neuartigen Proteine OCIF2, OCIF3, OCIF4 und OCIF5 sind Varianten von OCIF, die die oben beschriebene Aktivität aufweisen.
Diese OCIF-Varianten werden von der mit IMR-90 poly(A)+ RNA konstruierten cDNA-Bibliothek durch Hybridisierung unter Verwendung des OCIF cDNA-Fragments als Sonde erhalten. Jede der OCIF-Varianten-cDNAs, die die gesamte Kodierregion enthalten, wird in einen Expressionsvektor eingesetzt. Jede rekombinante OCIF-Variante kann durch Exprimieren der jeweiligen OCIF-Varianten-cDNAs, die die gesamte Kodierregion enthalten, in den konventionellen Wirten produziert werden. Jede rekombinante OCIF-Variante kann gemäß dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren gereinigt werden. Jede rekombinante OCIF-Variante ist in der Lage, die Osteoklastogenese zu inhibieren.
OCIF-Mutanten sind Substitutionsmutanten, die den Ersatz von einem Cysteinrest, der möglicherweise an der Dimerbildung beteiligt ist, durch einen Serinrest umfassen, und verschiedene Deletionsmutanten von OCIF. Substitutionen oder Deletionen werden in die OCIF cDNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder durch Restriktionsenzymverdau eingeführt. Jede dieser mutierten OCIF cDNAs wird in einen Vektor eingesetzt, der einen angemessenen Promotor zur Genexpression enthält. Der für die jeweiligen OCIF-Mutanten resultierende Expressionsvektor wird in eukaryotische Zellen wie Säugetierzellen transfiziert. Jede OCIF-Mutante kann von dem konditionierten Medium der transfizierten Zellen erhalten und gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt OCIF-Varianten, Mutanten oder verkürzte cDNA, wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt polyklonale Antikörper und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der OCIF-Konzentration unter Verwendung dieser polyklonalen Antikörper bereit.
Als Antigene (Immunogene) können natürlicher OCIF, der von IMR-90-konditioniertem Medium erhalten wird, rekombinanter OCIF, der von Wirten wie Mikroorganismen und Eukaryoten unter Verwendung von OCIF cDNA produziert wird, synthetische Peptide, die auf der Basis der Aminosäuresequenz von OCIF gestaltet werden, oder Peptide, die von OCIF durch teilweisen Verdau erhalten werden, verwendet werden. Polyklonale Anti-OCIF-Antikörper werden durch Immunisieren geeigneter Säugetiere mit den Antigenen, bei Bedarf in Kombination mit Immunisierungsadjuvanzien, und Reinigen von dem Serum durch gewöhnliche Reinigungsverfahren erhalten. Mit Radioisotopen oder Enzym markierte polyklonale Anti-OCIF-Antikörper können im Radioimmunoassay-(RIA)-System oder Immunoassay-(EIA)-System verwendet werden. Mit diesen Assay-Systemen können die OCIF-Konzentrationen in biologischen Materialien wie Blut und Ascites und Zellkulturmedium ohne weiteres bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können im Radioimmunoassay (RIA) oder Enzymimmunoassay (EIA) verwendet werden. Mit diesen Assay-Systemen kann die OCIF-Konzentration in biologischen Materialien wie Blut und Ascites ohne weiteres bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige monoklonale Antikörper und ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der OCIF-Konzentration mit diesen monoklonalen Antikörpern bereit.
Monoklonale Anti-OCIF-Antikörper können mit dem konventionellen Verfahren unter Verwendung von OCIF als Antigen produziert werden. Nativer OCIF, der von dem Kulturmedium von IMR-90 Zellen erhalten wird, und rekombinanter OCIF, der von Wirten wie Mikroorganismen und Eukaryoten unter Verwendung von OCIF cDNA produziert wird, können als Antigene verwendet werden. Alternativ können auch synthetisierte Peptide, die auf der Basis der Aminosäuresequenz von OCIF gestaltet werden, und Peptide, die von OCIF durch teilweisen Verdau erhalten werden, als Antigene verwendet werden. Immunisierte Lymphozyten, die durch Immunisieren von Säugetieren mit dem Antigen oder durch ein In-vitro-Immunisierungsverfahren erhalten werden, werden mit Myelomen von Säugetieren fusioniert, um Hybridome zu erhalten. Die Hybridomklone, die einen Antikörper ausscheiden, der OCIF erkennt, werden von den durch die Zellfusion erhaltenen Hybridomen selektiert. Die gewünschten Antikörper können durch Zellkultur der selektierten Hybridomklone erhalten werden. Bei der Präparation von Hybridomen werden normalerweise kleine Tiere wie Mäuse oder Ratten zur Immunisierung verwendet. Zur Immunisierung wird OCIF geeigneterweise mit einer Salzlösung (0,15 M NaCl) verdünnt und den Tieren alle 2 bis 20 Tage 2 bis 5 Mal intravenös oder intraperitoneal mit einem Adjuvans verabreicht. Das immunisierte Tier wird drei Tage nach der letzten Immunisierung getötet, die Milz wird entfernt und Splenozyten werden als immunisierte B-Lymphozyten verwendet.
Zu Maus-Myelomzelllinien für die Zellfusion mit den immunisierten B-Lymphozyten gehören zum Beispiel p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MFC-11, SP-2/0, F0, p3x63 Ag8.653 und 5194. Die R-210-Zelllinie von Ratten kann ebenfalls verwendet werden. Humane B-Lymphozyten werden durch ein In-vitro-Immunisierungsverfahren immunisiert und mit einer humanen Myelomzelllinie oder mit EB-Virus-transformierten humanen B-Lymphozyten fusioniert, die als Stammzelllinie zur Zellfusion verwendet werden, um einen humanen Antikörper zu produzieren.
Die Zellfusion der immunisierten B-Lymphozyten und der Myelomzelllinie erfolgt in erster Linie durch konventionelle Verfahren. Im Allgemeinen wird zum Beispiel das Verfahren von Koehler G. et al. (Nature 256, 495–497, 1975) angewendet; es kann auch ein Elektroimpulsverfahren für die Zellfusion angewendet werden. Die immunisierten B-Lymphozyten und transformierten B-Zellen werden in konventionellen Verhältnissen vermischt, und ein Zellkulturmedium ohne FBS, das Polyethylenglykol enthält, wird gewöhnlich zur Zellfusion verwendet. Mit Myelomzelllinien fusionierte B-Lymphozyten werden in FBS- haltigem HAT-Selektionsmedium kultiviert, um Hybridome zu selektieren.
Zum Screenen von Hybridomen, die Anti-OCIF-Antikörper produzieren, können hauptsächlich der EIA, Plaque-Assay, Ouchterlony- oder Agglutinationsassay angewendet werden. Von diesen wird im Allgemeinen EIA angewendet, der einfach und leicht anzuwenden ist und eine ausreichende Genauigkeit liefert. Mit EIA unter Verwendung von gereinigtem OCIF kann der gewünschte Antikörper leicht und akkurat selektiert werden. So erhaltene Hybridome können mit dem konventionellen Verfahren der Zellkultur kultiviert und bei Bedarf als Vorrat eingefroren werden. Der Antikörper kann durch Kultivieren von Hybridomen mit dem gewöhnlichen Zellkulturverfahren oder durch intraperitoneales Transplantieren von Hybridomen in Tiere produziert werden. Der Antikörper kann mit gewöhnlichen Reinigungsverfahren wie Salzfällung, Gelfiltration und Affinitätschromatographie gereinigt werden. Der erhaltene Antikörper reagiert speziell mit OCIF und kann zur Bestimmung der OCIF-Konzentration und zur Reinigung von OCIF verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper erkennen Epitope von OCIF und haben eine hohe Affinität zu OCIF. Sie können daher zur EIA-Konstruktion verwendet werden. Durch (Verwenden) dieses Assay-System(s) kann die Konzentration von OCIF in biologischen Materialien wie Blut und Ascites ohne weiteres bestimmt werden.
Der erfindungsgemäße OCIF kann als ein Agens zur Behandlung von Knochenkrankheiten verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine in der Herstellung von Medikamenten wie in den beiliegenden Ansprüchen dargelegt bereit.
Ratten wurde das linke Vorderglied denerviert. Testverbindungen wurden nach dem operativen Eingriff 14 Tage lang täglich verabreicht. Nach einer Behandlungsdauer von 2 Wochen wurden die Tiere geopfert und ihre Vordergliedmaßen seziert. Anschließend wurden die Knochen im Hinblick auf die mechanische Festigkeit mit dem Dreipunktbiegeverfahren getestet. OCIF verbesserte die mechanische Festigkeit des Knochens in dosisabhängiger Weise.
Das erfindungsgemäße OCIF-Protein ist als ein pharmazeutischer Bestandteil zur Behandlung oder Verbesserung von Knochenschwund wie zum Beispiel bei Osteoporose, Knochenkrankheiten wie Rheumatismus, Osteoarthritis und abnormem Knochenmetabolismus bei Mehrfachmyelom von Nutzen. Das OCIF-Protein ist auch als Antigen zur Feststellung der immunologischen Diagnose der Erkrankungen von Nutzen. Pharmazeutische Präparate, die das OCIF-Protein als einen Wirkstoff enthalten, werden formuliert und können oral oder parenteral verabreicht werden. Das Präparat enthält das erfindungsgemäße OCIF-Protein als einen wirksamen Bestandteil und kann Menschen und Tieren bedenkenlos verabreicht werden. Zu Beispielen für pharmazeutische Präparate gehören Zusammensetzungen zur Injektion oder Tropfinfusion, Suppositorien, Nasenpräparate, sublinguale Präparate und Bänder zur perkutanen Absorption. Das pharmazeutische Injektionspräparat kann durch Vermischen der pharmakologisch wirksamen Menge des OCIF-Proteins mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern hergestellt werden. Die Träger sind Vehikel und/oder Aktivatoren, wie z. B. Aminosäuren, Saccharide, Cellulosederivate und andere organische und anorganische Verbindungen, die gewöhnlich Wirkstoffen zugesetzt werden. Beim Vermischen des OCIF-Proteins mit den Vehikeln und/oder Aktivatoren zur Herstellung von Injektionen, können bei Bedarf Mittel zur Einstellung des pH-Wertes, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel, usw. zugegeben werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt das Elutionsmuster von OCIF-Rohprotein (Hiload-Q/FF Durchlauffraktion; Probe 3) von einer Hiload-S/HP-Säule.
2 zeigt das Elutionsmuster von OCIF-Rohprotein (Heparin-5PW Fraktion); Probe 5) von einer Blue-5PW-Säule.
3 zeigt das Elutionsmuster von OCIF-Protein (Blue-5PW Frakion 49 bis 50) von einer Umkehrphasensäule.
4 zeigt die SDS-PAGE von isolierten OCIF-Proteinen unter reduzierenden Bedingungen oder nichtreduzierenden Bedingungen.
Beschreibung der Bahnen

Bahn 1, 4: Molekülmassenmarkerproteine
Bahn 2, 5: OCIF-Protein von Peak 6 in 3
Bahn 3, 6: OCIF-Protein von Peak 7 in 3

5 zeigt das Elutionsmuster von Peptiden, die durch den Verdau des mit Lysylendopeptidase verdauten pyridylethylierten OCIF-Proteins erhalten wurden, auf einer Umkehrphasensäule.
6 zeigt die SDS-PAGE von isoliertem natürlichem(n) OCIF-Protein und rekombinanten(r) OCIF-Proteinen unter nichtreduzierenden Bedingungen. rOCIF(E) und rOCIF(C) wurden jeweils in 293/EBNA-Zellen und in CHO-Zellen erzeugt.
Beschreibung der Bahnen

Bahn 1: Molekülmassenmarkerproteine
Bahn 2: nOCIF-Protein des Monomertyps
Bahn 3: nOCIF-Protein des Dimertyps
Bahn 4: rOCIF(E)-Protein des Monomertyps
Bahn 5: rOCIF(E)-Protein des Dimertyps
Bahn 6: rOCIF(C)-Protein des Monomertyps
Bahn 7: rOCIF(C)-Protein des Dimertyps

7 zeigt die SDS-PAGE von isolierten natürlichen(n) OCIF-Proteinen und rekombinanten(r) OCIF-Proteinen unter reduzierenden Bedingungen. rOCIF(E) und rOCIF(C) wurden jeweils in 293/EBNA-Zellen und in CHO-Zellen erzeugt.
Beschreibung der Bahnen

Bahn 8: Molekülmassenmarkerproteine
Bahn 9: nOCIF-Protein des Monomertyps
Bahn 10: nOCIF-Protein des Dimertyps
Bahn 11: rOCIF(E)-Protein des Monomertyps
Bahn 12: rOCIF(E)-Protein des Dimertyps
Bahn 13: rOCIF(C)-Protein des Monomertyps
Bahn 14: rOCIF(C)-Protein des Dimertyps

8 zeigt die SDS-PAGE von isolierten natürlichen(n) OCIF-Proteinen und rekombinanten(r) OCIF-Proteinen, von denen N-verknüpfte Zuckerketten entfernt wurden, unter reduzierenden Bedingungen. rOCIF(E) und rOCIF(C) sind rOCIF-Proteine, die jeweils in 293/EBNA-Zellen und in CHO-Zellen erzeugt wurden.
Beschreibung der Bahnen

Bahn 15: Molekülmassenmarkerproteine
Bahn 16: nOCIF-Protein des Monomertyps
Bahn 17: nOCIF-Protein des Dimertyps
Bahn 18: rOCIF(E)-Protein des Monomertyps
Bahn 19: rOCIF(E)-Protein des Dimertyps
Bahn 20: rOCIF(C)-Protein des Monomertyps
Bahn 21: rOCIF(C)-Protein des Dimertyps

9 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich zwischen OCIF und OCIF2.
10 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich zwischen OCIF und OCIF3.
11 zeigt einen Aminosäuresquenzvergleich zwischen OCIF und OCIF4.
12 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich zwischen OCIF und OCIF5.
13 zeigt die Standardkurve zur Bestimmung der OCIF-Proteinkonzentration durch EIA unter Verwendung von polyklonalen Anti-OCIF-Antikörpern.
14 zeigt die Standardkurve zur Bestimmung der OCIF-Proteinkonzentration durch EIA unter Verwendung von monoklonalen Anti-OCIF-Antikörpern.
15 zeigt den Effekt von rOCIF-Protein auf Osteoporose.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert, die den Umfang der Erfindung allerdings nicht beschränken.
1. BEISPIEL
Herstellung eines konditionierten Mediums aus humanen Fibroblasten IMR-90
Humane fötale Lungenfibroblastenzellen IMR-90 (ATCC-CCL 186) wurden auf Tonerde-Keramik-Stücken (80 g) (Tonerde: 99,5%, hergestellt von Toshiba Ceramic K. K.) in DMEM-Medium (hergestellt von Gibco BRL Co.), angereichert mit 5% CS und 10 mM HEPES Puffer (500 ml/Rollerflasche), bei 37°C in Anwesenheit von 5% CO₂ 7 bis 10 Tage lang unter Verwendung von 60 Rollerflaschen (490 cm², 110 × 171 mm, hergestellt von Coning Co.) in statischer Kultur kultiviert. Das konditionierte Medium wurde geerntet und frisches Medium wurde in die Rollerflaschen gegeben. Je Batch-Kultur wurden etwa 30 l IMR-90-konditioniertes Medium erhalten. Das konditionierte Medium wurde als Probe 1 bezeichnet.
2. BEISPIEL
Testverfahren hinsichtlich der Hemmungsaktivität auf die Osteoklastenentwicklung
Die Hemmungsaktivität auf die Osteoklastenentwicklung wurde durch Messen der Aktivität der tartratresistenten sauren Phosphatase (TRAP) gemäß den Verfahren von M. Kumegawa et al. (Protein·Nucleic·Acid·Enzyme, Bd. 34, S. 999, 1989) und N. Takahashi et al. (Endocrynology, Bd. 122, S. 1373, 1988) mit Modifikationen getestet. Kurz, Knochenmarkzellen einer 17 Tage alten Maus wurden in α-MEM (hergestellt von GIBCO BRL Co.) suspendiert, das 10% FBS, 2 × 10^–8 M aktiviertes Vitamin D₃ und jede Testprobe enthielt, und in die jeweiligen Wells einer 96-Well-Platte mit einer Zelldichte von 3 × 10⁵ Zellen/0,2 ml/Well inokuliert. Die Platten wurden 7 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ inkubiert. Die Kulturen wurden fortgesetzt, indem 0,16 ml altes Medium am 3. und 5. Tag nach Kultivierungsbeginn durch das gleiche Volumen an frischem Medium ersetzt wurden. Am 7. Tag wurden die Zellen nach dem Waschen der Platten mit phosphatgepufferter Salzlösung mit Ethanol/Aceton (1 : 1) 1 Minute lang bei Raumtemperatur fixiert, woraufhin die Osteoklastenentwicklung durch Bestimmen der Phosphataseaktivität mit einem Kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, Catalog No. 387-A, hergestellt von Sigma Co.) getestet wurde. Der Rückgang TRAP-positiver Zellen wurde als ein Hinweis auf die OCIF-Aktivität genommen.
3. BEISPIEL
Reinigung von OCIF
i) Heparin-Sepharose-CL-6B-Säulenchromatographie
90 l IMR-90-konditioniertes Medium (Probe 1) wurden mit einem 0,22 μ Membranfilter (hydrophiler Milidisk, 2000 cm², Milipore Co.) filtriert und in drei Portionen aufgeteilt. Die jeweiligen Portionen (30 l) wurden auf eine Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (5 × 4,1 cm, Pharmacia Co.) aufgebracht, die mit 10 mM Tris-HCl mit 0,3 M NaCl, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, bei einer Fließgeschwindigkeit von 500 ml/h wurde die Heparin-Sepharose CL 6B adsorbierende Proteinfraktion mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, das 2 M NaCl enthielt, eluiert. Die Fraktion wurde als Probe 2 bezeichnet.
ii) HiLoad-Q/FF Säulenchromatographie
Die Heparin-Sepharose adsorbierende Fraktion (Probe 2) wurde gegen 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert, das mit CHAPS auf eine Endkonzentration von 0,1% angereichert war, bei 4°C über Nacht inkubiert und in zwei Portionen aufgeteilt. Die jeweiligen Portionen wurden dann auf eine Anionenaustauschsäule (HiLoad-Q/FF, 2,6 × 10 cm, Pharmacia Co.) aufgebracht, die mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, äquilibriert war, um eine nichtadsorbierende Fraktion (1000 ml) zu erhalten. Die Fraktion wurde als Probe 3 bezeichnet.
iii) HiLoad-S/HP Säulenchromatographie
Die nichtadsorbierende HiLoad-Q-Fraktion (Probe 3) wurde auf eine Kationenaustauschsäule (HiLoad-S/HP, 2,6 × 10 cm, Pharmacia CO.) aufgebracht, die mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min 100 Minuten lang eluiert und Fraktionen (12 ml) wurden aufgefangen. Jeweils zehn Fraktionen von Nummer 1 bis 40 wurden zur Bildung einer Portion gepoolt. Jeweils 100 μl der vier Portionen wurden hinsichtlich der OCIF-Aktivität getestet. OCIF-Aktivität wurde in den Fraktionen 11 bis 30 beobachtet (siehe 1). Die Fraktionen 21 bis 30 mit höherer spezifischer Aktivität wurden aufgefangen und als Probe 4 bezeichnet.
iv) Heparin-5PW-Affinitätssäulenchromatographie
Einhundertundzwanzig ml der HiLoad-S-Fraktion 21 bis 30 (Probe 4) wurden mit 240 ml von 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, verdünnt und auf eine Heparin-5PW-Affinitätssäule (0,8 × 7,5 cm, Tosoh Co.) aufgebracht, die mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 60 Minuten lang eluiert und Fraktionen (0,5 ml) wurden aufgefangen. Fünfzig μl wurden von jeder Fraktion entfernt, um die OCIF-Aktivität zu testen. Die aktiven Fraktionen, die mit 0,7 bis 1,3 M NaCl eluierten, wurden gepoolt und als Probe 5 bezeichnet.
v) Blue-5PW-Affinitätssäulenchromatographie
Zehn ml der Probe 5 wurden mit 190 ml 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, verdünnt und auf eine Blue-5PW-Affinitätssäule (0,5 × 5 cm, Tosoh Co.) aufgebracht, die mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 50 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten (30 ml) von 0 bis 2 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert und Fraktionen (0,5 ml) wurden aufgefangen. Die OCIF-Aktivität wurde mit 25 μl jeder Fraktion beurteilt. Die Fraktionen Nummer 49 bis 70, die mit 1,0–1,6 M NaCl eluierten, wiesen OCIF-Aktivität auf.
vi) Umkehrphasensäulenchromatographie
Die durch Auffangen der Fraktionen 49 bis 50 erhaltene Blue-5PW-Fraktion wurde mit 10 μl 25%iger TFA angesäuert und auf eine Umkehrphasen-C4-Säule (BU-300, 2,1 × 220 mm, hergestellt von Perkin-Elmer) aufgebracht, die mit 0,1% TFR und 25% Acetonitril äquilibriert war. Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 25 bis 55% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min 60 Minuten lang eluiert und jeder Proteinpeak wurde aufgefangen (3). Einhundert μl jeder Peakfraktion wurden in Bezug auf OCIF-Aktivität getestet, wobei Peak 6 und Peak 7 OCIF-Aktivität aufwiesen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
4. BEISPIEL
Relative Molekülmasse des OCIF-Proteins
Die beiden Proteinpeaks (6 und 7) mit OCIF-Aktivität wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelekrophorese unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen. Kurz, 20 μl jeder Peakfraktion wurden unter Vakuum konzentriert und in 1,5 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 2,5% SDS, 0,01% Bromphenolblau gelöst und über Nacht bei 37°C unter nichtreduzierenden Bedingungen oder unter reduzierenden Bedingungen (mit 5% 2-Mercaptoethanol) inkubiert. Jeweils 1,0 μl der Probe wurde dann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit einem Gradientengel von 10–15% Acrylamid (Pharmacia Co.) und einem Elektrophoresegerät (Fast System, Pharmacia Co.) analysiert. Die folgenden Molekülmassenmarkerproteine wurden zur Berechnung der relativen Molekülmasse verwendet: Phosphorylase b (94 kD), Rinderserumalbumin (67 kD), Ovalbumin (43 kD), Kohlensäureanhydrase (30 kD), Trypsininhibitor (20,0 kD) und Lactalbumin (14,4 kD). Nach der Elektrophorese wurden die Proteinbanden durch Silberfärbung mit dem Phast Silver Stain Kit visualisiert. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Eine Proteinbande mit scheinbar 60 kD wurde im Peak 6 Protein sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Eine Proteinbande mit scheinbar 60 kD wurde unter reduzierenden Bedingungen und eine Proteinbande mit scheinbar 120 kD wurde unter nichtreduzierenden Bedingungen im Peak 7 Protein nachgewiesen. Folglich wurde das Protein von Peak 7 als ein Homodimer des Proteins von Peak 6 angesehen.
5. BEISPIEL
Thermostabilität von OCIF
Zwanzig μl der Probe der Blue-5PW-Fraktionen 51 und 52 wurden mit 10 mM phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, auf 30 μl verdünnt und 10 Minuten lang bei 70°C oder 90°C oder 30 Minuten lang bei 56°C inkubiert. Die wärmebehandelten Proben wurden im Hinblick auf OCIF-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 enthalten.
Tabelle 2
6. BEISPIEL
Interne Aminosäuresequenz des OCIF-Proteins
Jeweils 2 Fraktionen (1 ml) von Nr. 51–70 der Blue-5PW-Fraktion wurden mit 10 μl 25%iger TFA angesäuert und auf eine Umkehrphasen-C4-Säule (BU-300, 2,1 × 220 mm, hergestellt von Perkin-Eimer Co.) aufgebracht, die mit 25% Acetonitril mit 0,1% TFA äquilibriert war. Das adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradienten (12 ml) von 25 bis 55% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min eluiert, und es wurden jeweils die Proteinfraktionen aufgefangen, die Peak 6 und Peak 7 entsprachen. Das Protein von jedem Peak wurde auf einen Proteinsequenzer (PROCISE 494, Perkin-Eimer Co.) aufgebracht. Die N-terminale Sequenz des Proteins von jedem Peak konnte jedoch nicht analysiert werden. Folglich wurde der N-Terminus des Proteins von jedem Peak als blockiert angesehen. Somit wurden die internen Aminosäuresequenzen dieser Proteine analysiert.
Das durch C4-HPLC gereinigte Protein von Peak 6 oder Peak 7 wurde durch Zentrifugation konzentriert und unter reduzierenden Bedingungen pyridilethyliert. Kurz, 50 μl 0,5 M Tris-HCl, pH 8,5, mit 100 μg Dithiothreitol, 10 mM EDTA, 7 M Guanidin-HCl und 1% CHAPS wurden zu den jeweiligen Proben gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Jedes Gemisch wurde mit 25% TFA angesäuert (Endkonzentration 0,1%) und auf eine Umkehrphasen-C4-Säule (BU-300, 2,1 × 30 mm, Perkin-Eimer Co.) aufgebracht, die mit 20% Acetonitril mit 0,1% TFA äquilibriert war. Das pyridilethylierte OCIF-Protein wurde mit einem linearen Gradienten (9 ml) von 20 bis 50% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min eluiert und jeder Proteinpeak wurde aufgefangen. Das pyridilethylierte OCIF-Protein wurde unter Vakuum konzentriert und in 25 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 9, das 8 M Harnstoff und 0,1% Tween 80 enthielt, gelöst.
Dreiundsiebzig μl 0,1 M Tris-HCl, pH 9, und 0,02 μg Lysylendopeptidase (Wako Pure Chemical, Japan) wurden in das Röhrchen gegeben und 15 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Jeder Verdau wurde mit 1 μl 25%iger TFA angesäuert und auf eine Umkehrphasen-C8-Säule (RP-300, 2,1 × 220 mm, Perkin-Eimer Co.) aufgebracht, die mit 0,1% TFA äquilibriert war.
Die Peptidfragmente wurden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0 bis 50% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min 70 Minuten lang eluiert und jeder Peptidpeak wurde aufgefangen. Jedes Peptidfragment (P1–P3) wurde auf den Proteinsequenzer aufgebracht. Die Sequenzen der Peptide sind jeweils in den Sequenzen Nr. 1–3 dargestellt.
7. BEISPIEL
Bestimmung der Nucleotidsequenz der OCIF cDNA
i) Isolierung von poly(A)+ RNA von IMR-90 Zellen
Etwa 10 μg poly(A)+ RNA wurden von 1 × 10⁸ IMR-90 Zellen mit dem Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) gemäß Herstelleranweisungen isoliert.
ii) Präparation von Mischprimern
Die folgenden zwei Mischprimer wurden auf der Basis der Aminosäuresequenzen von zwei Peptiden (Peptid P2 und Peptid P3, jeweils Sequenz Nr. 2 und 3) synthetisiert. Alle Oligonucleotide in den Mischprimern Nr. 2F können die Aminosäuresequenz vom sechsten Rest, Glutamin (Gln), zum zwölften Rest, Leucin (Leu), im Peptid P2 kodieren. Alle Oligonucleotide in den Mischprimern Nr. 3R können die Aminosäuresequenz vom sechsten Rest, Histidin (His), zum zwölften Rest, Lysin (Lys), im Peptid P3 kodieren. Die Sequenzen der Mischprimer Nr. 2F und Nr. 3R sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
iii) Amplifikation des OCIF cDNA Fragments durch PCR (Polymerasekettenreaktion)
Erststrang-cDNA wurde mit dem Superscript II cDNA Synthesekit (Gibco BRL) und 1 μg poly(A)+ RNA, die im 7. Beispiel i) erhalten wurde, gemäß Herstelleranweisungen erzeugt. Das OCIF kodierende DNA-Fragment wurde durch PCR mit der cDNA-Matrize und den Primern aus BEISPIEL 7 ii) erhalten. Die PCR wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Die Reaktionskomponenten wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen vermischt. Einem anfänglichen 3-minütigen Denaturierungsschritt bei 95°C folgten 30 Zyklen der Denaturierung bei 95°C (30 Sekunden), Annealing bei 50°C (30 Sekunden) und Extension bei 70°C (2 Minuten). Nach der Amplifikation wurde der letzte Verlängerungsschritt 5 Minuten lang bei 70°C durchgeführt. Die Größe der PCR-Produkte wurde anhand einer Gelelektrophorese (1,5% Agarosegel) bestimmt. Es wurden etwa 400 bp OCIF DNA-Fragment erhalten.
8. BEISPIEL
Klonierung des durch PCR amplifizierten OCIF cDNA-Fragments und Bestimmung seiner DNA-Sequenz
Das durch PCR im BEISPIEL 7 iii) amplifizierte OCIF cDNA-Fragment wurde mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo) gemäß dem Verfahren von Marchuk D. et al. (Nucleic Acids Res., Bd 19, S. 1154, 1991) in das Plasmid pBluescript II SK– eingesetzt. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit Ligationsgemisch transformiert. Die Transformanten wurden wachsen gelassen und ein die OCIF cDNA (etwa 400 bp) enthaltendes Plasmid wurde mit dem üblicherweise angewendeten Verfahren gereinigt. Dieses Plasmid wurde pBSOCIF genannt. Die Sequenz von OCIF cDNA in pBSOCIF wurde mit dem Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) bestimmt. Die Größe der OCIF cDNA liegt bei 397 bp. Die OCIF cDNA kodiert eine Aminosäuresequenz mit 132 Resten. Die Aminosäuresequenzen der internen Peptide (Peptid P2 und Peptid P3, jeweils Sequenz Nr. 2 und 3), die zur Gestaltung der Primer verwendet wurden, wurden auf der N- oder C-terminalen Seite der Aminosäuresequenz des 132-Aminosäure-Polypeptids gefunden, die durch die 397 bp OCIF cDNA vorhergesagt wurde. Darüber hinaus wurde auch die Aminosäuresequenz des internen Peptids P1 (Sequenz Nr. 1) in der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Polypeptids gefunden. Diese Daten zeigen, dass die 397 bp OCIF cDNA ein Abschnitt der „full length" OCIF cDNA ist.
9. BEISPIEL
Präparation der DNA-Sonde
Die 397 bp OCIF cDNA wurde gemäß den im Beispiel 7 iii) beschriebenen Bedingungen präpariert. Die OCIF cDNA wurde einer präparativen Agarosegelelektrophorese unterzogen. Die OCIF cDNA wurde von dem Gel mit dem QIAEX Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt, mit [α³²P]dCTP unter Verwendung des Megaprime DNA-Markierungssystems (Amersham) markiert und zum Selektieren eines Phagen verwendet, der die OCIF cDNA voller Länge enthielt.
10. Beispiel
Präparation der cDNA-Bibliothek
cDNA wurde mit dem Great Lengths cDNA Synthesekit (Clontech), Oligo(dT)-Primer, [α³²]dCTP und 2,5 μg poly(A)+ RNA aus dem Beispiel 7 i) gemäß Herstelleranweisungen erzeugt. EcoRI-SalI-NotI Adaptor wurde mit der cDNA ligiert. Die cDNA wurde von dem freien Adaptor und nicht eingebautem freiem [α³²P]dCTP separiert. Die gereinigte cDNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) gelöst. Die cDNA wurde mit dem Adaptor in λ ZAP EXPRESS Vektor (Stratagene) am EcoRI Ort eingesetzt. Die rekombinante λ ZAP EXPRESS Phagen-DNA mit der cDNA wurde mit Gigapack gold II Verpackungsextrakt (Stratagene) in vitro verpackt und es wurde eine rekombinante λ ZAP EXPRESS Phagenbibliothek präpariert.
11. BEISPIEL
Screenen des rekombinanten Phagen
E. Coli, XL1-Blue MRF'(Stratagene), wurde mit den im 10. BEISPIEL erhaltenen rekombinanten Phagen 15 Minuten lang bei 37°C infiziert. Die infizierten E. coli Zellen wurden bei 50°C in NZY-Medium gegeben, das 0,7% Agar enthielt, und auf die NZY-Agarplatten plattiert. Nachdem die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert worden waren, wurde Hybond N (Amersham) auf die Oberflächen plaquehaltiger Platten gegeben. Die Membranen wurden in der Alkalilösung denaturiert, neutralisiert und in 2 × SSC gemäß dem Standardprotokoll gewaschen. Die Phagen-DNA wurde auf den Membranen mit UV Crosslink (Stratagene) immobilisiert. Die Membranen wurden in dem Hybridisierungspuffer (Amersham), der 100 μg/ml Lachssperma-DNA enthielt, 4 Stunden lang bei 65°C inkubiert und dann über Nacht in dem gleichen Puffer mit 2 × 10⁵ cpm/ml denaturierter OCIF DNA-Sonde bei 65°C inkubiert. Die Membranen wurden zweimal mit 2 × SSC und zweimal mit einer Lösung aus 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C jeweils 10 Minuten lang gewaschen. Die positiven Klone wurden durch zweimaliges Wiederholen des Screening-Verfahrens gereinigt. Der gereinigte λ ZAP EXPRESS Phagenklon, der etwa 1,6 kb DNA-Insert enthielt, wurde in den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendet. Dieser Phage wurde λ OCIF genannt. Der gereinigte λ OCIF und der infizierte in E. Coli XL1-Blue MRF'(Stratagene) gemäß einem Protokoll des λ ZAP EXPRESS Klonierungskits (Stratagene)[sic]. Es wurde eine Kulturlösung von infiziertem XL1-Blue MRF' präpariert.
Gereinigter OCIF und ExAssist Helfer-Phage (Stratagene) wurden in den E. coli Stamm XL-1 Blue MRF' gemäß dem mit dem Kit gelieferten Protokoll koinfiziert. Die Kulturlösung des koinfizierten XL-1 Blue MRF' wurde in eine Kultur des E. coli Stammes XLOR (Stratagene) gegeben, um sie zu transformieren. Wir erhielten somit einen Kanamycin-resistenten Transformanten, der ein Plasmid mit der Bezeichnung pBKOCIF beinhaltete, das ein pBKCMV (Stratagene) Vektor ist, der das 1,6 kb Insertfragment enthält. Der das Plasmid mit etwa 1,6 kb OCIF cDNA enthaltende Transformant wurde durch Aufnehmen der Kanamycin-resistenten Kolonien erhalten. Das Plasmid wurde pBKOCIF genannt. Der Transformant ist beim National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology als „FERM BP-5267" als pBK/01F10 hinterlegt. Am 25. Oktober 1995 wurde eine nationale Hinterlegung (Beitritts-Nr. FERM P-14998) gemäß Budapester. Vertrag in eine internationale Hinterlegung übertragen. Der Transformant pBK/01F10 wurde wachsen gelassen und das Plasmid pBKOCIF wurde gemäß dem Standardprotokoll gereinigt.
12. BEISPIEL
Bestimmung der Nucleotidsequenz von OCIF cDNA, die die volle Kodierregion enthält
Die Nucleotidsequenz von OCIF cDNA, die im 11. BEISPIEL erhalten wurde, wurde mit dem Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) bestimmt. Als Primer wurden T3, T7 Primer (Stratagene) und synthetische Primer verwendet, die gemäß der OCIF cDNA Sequenz gestaltet waren. Die Sequenzen dieser Primer sind in den Sequenzen Nr. 16 bis 29 dargestellt. Die Nucleotidsequenz der OCIF cDNA ist in der Sequenz Nr. 6 dargestellt und die anhand der cDNA Sequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz ist in der Sequenz Nr. 5 dargestellt.
13. BEISPIEL
Produktion von rekombinantem OCIF durch 293/EBNA-Zellen
i) Konstruktion des Plasmids zur Expression von OCIF cDNA
pBKOCIF mit etwa 1,6 kb OCIF cDNA wurde wie im BEISPIEL 11 beschrieben hergestellt und mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Das OCIF cDNA-Insert wurde herausgeschnitten, durch Agarosegelelektrophorese separiert und mit dem QIAEX Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte OCIF cDNA-Insert wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 2 (Takara Shuzo) mit dem Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) ligiert, der mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut wurde. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Die Transformanten wurden wachsen gelassen und das Plasmid mit der OCIF cDNA (etwa 1,6 kb) wurde mit einer QIAGEN Säule (QIAGEN) gereinigt. Das Expressionsplasmid pCEPOCIF wurde mit Ethanol präzipitiert und gelöst in sterilem destilliertem Wasser wurde in den nachfolgend beschriebenen Experimenten verwendet [sic].
ii) Vorübergehende Expression von OCIF cDNA und Analyse der biologischen Aktivität
Rekombinanter OCIF wurde mit dem Expressionsplasmid pCEPOCIF aus BEISPIEL 13 i) mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren produziert. 8 × 10⁵ Zellen von 293/EBNA (Invitrogen) wurden in jedes Well einer 6-Well-Platte mit IMDM, das 10% fötales Kälberserum (Gibco BRL) enthielt, inokuliert. Nachdem die Zellen 24 Stunden lang inkubiert worden waren, wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden mit serumfreiem IMDM gewaschen. Das Expressionsplasmid pCEPOCIF und Lipofectamin (Gibco BRL) wurden mit OPTI-MEM (Gibco BRL) verdünnt und vermischt und zu den Zellen in jedem Well gemäß Herstelleranweisungen gegeben. Für jede Transfektion wurden drei μg pCEPOCIF und 12 μl Lipofectamin verwendet. Nachdem die Zellen mit pCEPOCIF und Lipofectamin 38 Stunden lang inkubiert worden waren, wurde das Medium durch 1 ml OPTI-MEM ersetzt. Nachdem die transfizierten Zellen 30 Stunden lang inkubiert worden waren, wurde das konditionierte Medium geerntet und für den biologischen Assay verwendet. Die biologische Aktivität von OCIF wurde mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren analysiert. Knochenmarkzellen von 17 Tage alten Mäusen wurden in α-MEM (hergestellt von GIBCO BRL Co.) mit 10% FBS, 2 × 10^–8 M aktiviertem Vitamin D₃ und jeder Testprobe suspendiert, inokuliert und 7 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ wie im 2. BEISPIEL beschrieben kultiviert. Im Laufe der Inkubation wurden am 3. und 5. Tag 160 μl altes Medium in jedem Well durch das gleiche Volumen an frischem Medium ersetzt, das die Testprobe verdünnt mit 1 × 10^–8 M aktiviertem Vitamin D₃ und α-MEM mit FBS enthielt. Nach dem Waschen der Wells mit phosphatgepufferter Salzlösung wurden die Zellen am 7. Tag mit Ethanol/Aceton (1 : 1) 1 Minute lang fixiert, woraufhin die Osteoklastenentwicklung mit dem Acid Phosphatase Activity Measuring Kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, Catalog No. 387-A, Sigma Co.) getestet wurde. Der Rückgang der Zahl TRAP-positiver Zellen wurde als ein Hinweis auf die OCIF-Aktivität genommen. Als Ergebnis wies das konditionierte Medium die gleiche OCIF-Aktivität wie natürliches OCIF-Protein von IMR-90-konditioniertem Medium (Tabelle 4) auf.
Tabelle 4
iii) Isolierung von rekombinantem OCIF-Protein von 293/EBNA-konditioniertem Medium
293/EBNA-konditioniertes Medium (1.8 l) aus der im Beispiel 13 ii) beschriebenen Zellkultivierung wurde mit 0,1% CHAPS angereichert und mit einem 0,22 μm Membranfilter (Steribecs GS, Milipore Co.) filtriert. Das konditionierte Medium wurde zu 50 ml einer Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (2,6 × 10 cm, Pharmacia Co.) aufgetragen, die mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min 100 Minuten lang von der Säule eluiert und Fraktionen (8 ml) wurden aufgefangen. Mit 150 μl jeder Fraktion wurde die OCIF-Aktivität gemäß dem im BEISPIEL 2 beschriebenen Verfahren getestet. Es wurde eine OCIF-aktive Fraktion (112 ml) erhalten, die mit etwa 0,6 bis 1,2 M NaCl eluierte.
Einhundertundzwölf ml der aktiven Fraktion wurden mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, auf 1000 ml verdünnt und auf eine Heparin-Affinitätssäule (Heparin-5PW 0,8 × 7,5 cm, Tosoh Co.) aufgebracht, die mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 60 Minuten lang von der Säule eluiert und Fraktionen (0,5 ml) wurden aufgefangen. Vier μl von jeder Fraktion wurden per SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen wie im 4. BEISPIEL beschrieben analysiert. Mit SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen wurde eine einzelne Bande des rOCIF Proteins mit scheinbar 60 kD in den Fraktionen 30 bis 32 nachgewiesen; unter nichtreduzierenden Bedingungen wurden ebenfalls Banden des rOCIF-Protein mit scheinbar 60 kD und 120 kD in den Fraktionen 30 bis 32 nachgewiesen. Die isolierte rOCIF Fraktion von 30 bis 32 wurde als rekombinanter OCIF bezeichnet, der von 293/EBNA (rOCIF(E)) abstammte. 1,5 ml des rOCIF(E) (535 μg/ml) wurden bei einer Bestimmung mit dem Lowry-Verfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardprotein erhalten.
14. BEISPIEL
Produktion von rekombinantem OCIF unter Verwendung von CHO-Zellen
i) Konstruktion des Plasmids zur Expression von OCIF
pBKOCIF mit etwa 1,6 kb OCIF cDNA wurde wie im 11. BEISPIEL beschrieben hergestellt und mit den Restriktionsenzymen SalI und EcoRV verdaut. Etwa 1,4 kb OCIF cDNA-Insert wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Der Expressionsvektor pcDL-SRα 296 (Molecular and Cellular Biology, Bd. 8, S. 466, 1998) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und KpnI verdaut. Etwa 3,4 kb des Expressionsvektorfragmentes wurden herausgeschnitten, durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Mit einem DNA-Blunting-Kit (Takara Shuzo) wurden Blunt-Enden des gereinigten OCIF cDNA-Inserts und des Expressionsvektorfragmentes gebildet. Das gereinigte OCIF cDNA-Insert und das Expressionsvektorfragment wurden mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert. Es wurde der das OCIF-Expressionsplasmid pSRα OCIF enthaltende Transformant erhalten.
ii) Herstellung eines Expressionsplasmids
Der im Beispiel 13 i) hergestellte Transformant mit dem OCIF-Expressionsplasmid pSRα OCIF und der in der WO92/01053 beschriebene Transformant mit dem Maus-DHFR-Expressionsplasmid pBAdDSV wurden mit dem Standardverfahren wachsen gelassen. Beide Plasmide wurden durch Alkalibehandlung, Polyethylenglykolpräzipitation und Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation mit dem Verfahren von Maniatis et al. (Molecular cloning, 2. Auflage) gereinigt.
iii) Adaption von CHOdhFr-Zellen an das proteinfreie Medium
CHOdhFr-Zellen (ATCC, CRL 9096) wurden in IMDM mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Die Zellen wurden an EX-CELL 301 (JRH Bioscience) und dann an EX-CELL PF CHO (JRH Bioscience) gemäß Herstelleranweisungen adaptiert.
iv) Transfektion des OCIF-Expressionsplasmids und des Maus-DHFR-Expressionsplasmids zu CHOdhFr-Zellen
Die im BEISPIEL 14 iii) präparierten CHOdhFr-Zellen wurden durch Elektroporation mit pSRα OCIF und mit im BEISPIEL 14 ii) präpariertem pBAdDSV transfiziert. 200 μg pSRα OCIF und 20 μg pBAdDSV wurden unter sterilen Bedingungen in 0,8 ml IMDM (Gibco BRL) mit 10% fötalem Kälberserum CG aufgelöst. 2 × 10⁷ Zellen von CHOdhFr– wurden in 0,8 ml dieses Mediums suspendiert. Die Zellsuspension wurde zu einer Küvette (Bio Rad) übertragen, und die Zellen wurden durch Elektroporation mit einem Gene-Pulser (Bio Rad) unter Bedingungen von 360 V und 960 μF übertragen. Die Suspension elektroporierter Zellen wurde in T-Kolben (Sumitomo Bakelite) übertragen, die 10 ml EX-CELL PF-CHO enthielten, und im CO₂-Inkubator 2 Tage lang inkubiert. Anschließend wurden die transfizierten Zellen in die jeweiligen Wells einer 96-Well-Platte (Sumitomo Bakelite) mit einer Dichte von 5000 Zellen/Well inokuliert und etwa 2 Wochen lang kultiviert. Es wurden die DHFR exprimierenden Transformanten selektiert, da EX-CELL PF-CHO keine Nucleotiden enthält und die Stammzelllinie CHO dhFr– nicht in diesem Medium wachsen kann. Die meisten der DHFR exprimierenden Transformanten exprimierten OCIF, da zehnmal so viel OCIF-Expressionsplasmid wie Maus-DHFR-Expressionsplasmid verwendet wurde. Von den DHFR exprimierenden Transformanten wurden gemäß dem im 2. BEISPIEL beschriebenen Verfahren Transformanten ausgewählt, deren konditioniertes Medium eine hohe OCIF-Aktivität aufwies. Die Transformanten, die hohe OCIF-Mengen exprimierten, wurden durch begrenzende Verdünnung kloniert. Die Klone, deren konditioniertes Medium eine hohe OCIF-Aktivität aufwies, wurden wie oben beschrieben selektiert, und es wurde ein Transformant erhalten, der eine hohe OCIF-Menge, 5561, exprimierte.
v) Produktion von rekombinantem OCIF
Zur Produktion von rekombinantem OCIF (rOCIF) wurde EX-CELL 301 Medium (3 l) in einer 3-l-Spinner-Flasche mit dem Klon (5561) bei einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml inokuliert. Die 5561 Zellen wurden in einer Spinner-Flasche 4 bis 5 Tage lange bei 37°C kultiviert. Als die Konzentration der 5561 Zellen 1 × 10⁶ Zellen/ml erreichte, wurden etwa 2,7 l des konditionierten Mediums geerntet. Anschließend wurden etwa 2,7 l EX-CELL 301 zu der Spinner-Flasche gegeben und die 5561 Zellen wurden wiederholt kultiviert. Etwa 20 l des konditionierten Mediums wurden unter Verwendung von drei Spinner-Flaschen geerntet.
vi) Isolierung von rekombinantem OCIF-Protein von durch CHO-Zellen konditioniertes Medium
Das im BEISPIEL 14 v) beschriebene CHO-Zellen-konditionierte Medium (1.0 l) wurde mit 1,0 g CHAPS angereichert und mit einem 0,22 μm Membranfilter (Steribecks GS, Millipore Co.) filtriert. Das konditionierte Medium wurde auf eine Heparin-Sepharose-FF-Säule (2,6 × 10 cm, Pharmacia Co.) aufgebracht, die mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min 100 Minuten lang von der Säule eluiert und Fraktionen (8 ml) wurden aufgefangen. Mit 150 μl jeder Fraktion wurde die OCIF-Aktivität mit dem im 2. BEISPIEL beschriebenen Verfahren getestet. Es wurde eine aktive Fraktion (112 ml) erhalten, die mit etwa 0,6 bis 1,2 M NaCl eluierte.
Die 112 ml aktive Fraktion wurden mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, auf 1200 ml verdünnt und auf eine Affinitätssäule (blue-5PW, 0,5 × 5,0 cm, Tosoh Co.) aufgebracht, die mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5 äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit 10 mM Tris-HCl, 0,1% CHAPS, pH 7,5, wurde das adsorbierte Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 3 M NaCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min 60 Minuten lang von der Säule eluiert und Fraktionen (0,5 ml) wurden aufgefangen. Vier μl jeder Fraktion wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen wie im 4. BEISPIEL beschrieben unterzogen. Bei der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen wurde eine einzelne Bande des rOCIF-Proteins mit scheinbar 60 kD in den Fraktionen 30 bis 38 nachgewiesen, unter nichtreduzierenden Bedingungen wurden Banden des rOCIF-Proteins mit scheinbar 60 kD und 120 kD ebenfalls in den Fraktionen 30 bis 38 nachgewiesen. Die isolierte rOCIF-Fraktion, 30 bis 38, wurde als gereinigter rekombinanter OCIF bezeichnet, der von CHO-Zellen abstammte (rOCIF(C)). 4,5 ml des OCIF(C) (113 μg/ml) wurden bei einer Bestimmung mit dem Lowry-Verfahren unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardprotein erhalten.
15. BEISPIEL
Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von rOCIFs
Jeweils 3 μg des isolierten rOCIF(E) und rOCIF(C) wurden auf Polyvinylidendifluorid-(PVDF)-Membranen mit Prospin (PERKIN ELMER Co.) adsorbiert. Die Membranen wurden mit 20% Ethanol gewaschen und die N-terminalen Aminosäuresequenzen der adsorbierten Proteine wurden mit einem Proteinsequenzer (PROCISE 492, PERKIN ELMBER Co.) analysiert. Die ermittelte N-terminale Aminosäuresequenz ist in Sequenz Nr. 7 dargestellt.
Die N-terminale Aminosäure von rOCIF(E) und rOCIF(C) war die 22. Aminosäure Glutamin von Met als Translationsausgangspunkt, wie in der Sequenz Nr. 5 dargestellt ist. Die 21 Aminosäuren von Met bis Gln wurden als ein Signalpeptid identifiziert. Die N-terminale Aminosäuresequenz von OCIF, isoliert von IMR-90-konditioniertem Medium, war nicht nachweisbar. Demzufolge kann das N-terminale Glutamin von OCIF blockiert werden, indem Glutamin während der Kultivierung oder Reinigung in Pyroglutamin umgewandelt wird.
16. BEISPIEL
Biologische Aktivität von rekombinantem(r) OCIF und natürlichem(n) OCIF
i) Inhibition von Vitamin D₃-induzierter Osteoklastenbildung von murinen Knochenmarkzellen
Die rOCIF(E) und nOCIF Probe wurde jeweils mit α-MEM (GIBCO BRL Co.) verdünnt, das 10% FBS und 2 × 10^–8 M an aktiviertem Vitamin D₃ enthielt (eine Endkonzentration von 250 ng/ml). Jede Probe wurde mit dem gleichen Medium seriell verdünnt, und 100 μl jeder verdünnten Probe wurden in die Wells von 96-Well-Platten gegeben. Knochenmarkzellen von 17 Tage alten Mäusen wurden mit einer Zelldichte von 3 × 10⁵ Zellen/100 μl/Well in jedes Well von 96-Well-Platten inokuliert und 7 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% Co₂ kultiviert. Am 7. Tag wurden die Zellen fixiert und mit einem Saure-Phosphatase-Messkit (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) gemäß dem im 2. BEISPIEL beschriebenen Verfahren gefärbt. Der Rückgang der Aktivität der sauren Phosphatase (TRAP) wurde als OCIF-Aktivität genommen. Der Rückgang von Saure-Phosphatase-positiven Zellen wurde durch Solubilisieren des Farbstoffpigmentes und Messen der Absorbanz beurteilt. Im Detail wurden 100 μl eines Gemischs aus 0,1 N NaOH und Dimethylsulfoxid (1 : 1) in jedes Well gegeben und das Well wurde zum Solubilisieren des Farbstoffs geschüttelt. Nach dem vollständigen Solubilisieren des Farbstoffes wurde bei 590 nm die Absorbanz jedes Wells gemessen, dabei wurde die Absorbanz bei 490 nm mit einem Mikroplattenleser (Immunoreader NJ-2000, InterMed) subtrahiert. Der Mikroplattenleser wurde unter Verwendung eines Wells mit einlagigen Knochenmarkzellen, die in dem Medium ohne aktiviertes Vitamin D₃ kultiviert wurden, auf eine Absorbanz von 0 eingestellt. Der Rückgang der TRAP-Aktivität wurde als prozentualer Anteil des Kontrollabsorbanzwertes (= 100%) des solubilisierten Farbstoffes von den Wells mit Knochenmarkzellen ausgedrückt, die ohne OCIF kultiviert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 enthalten.
Tabelle 5
Sowohl nOCIF als auch rOCIF(E) inhibierte die Osteoklastenbildung in dosisabhängiger Weise bei einer Konzentration von 16 ng/ml oder darüber.
ii) Inhibition der Vitamin D3-induzierten Osteoklastenbildung in Co-Kulturen von Stromazellen und Maus-Milzzellen
Die Wirkung von OCIF auf die durch Vitamin D₃ induzierte Osteoklastenbildung in Co-Kulturen von Stromazellen und Maus-Milzzellen wurde gemäß dem Verfahren von N. Udagawa et al. (Endocrinology, Bd. 125, S. 1805–1813, 1989) getestet. Im Detail wurden jeweils Proben von rOCIF(E), rOCIF(C) und nOCIF mit α-MEM (GIBCO BRL CO.) seriell verdünnt, das 10% FBS, 2 × 10^–8 M an aktiviertem Vitamin D₃ und 2 × 10^–7 M Dexamethason enthielt, und 100 μl jeder verdünnten Probe wurden in die jeweiligen Wells von 96-Well-Mikrowell-Platten gegeben. Vom Knochenmark stammende murine ST2-Stromazellen (RIKEN Cell Bank RCB0224), 5 × 10³ Zellen je 100 μl α-MEM mit 10% FBS, und Milzzellen von 8 Wochen alten ddy Mäusen, 1 × 10⁵ Zellen je 100 μl des gleichen Mediums, wurden in jedes Well von 96-Well-Platten inokuliert und 5 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ kultiviert. Am 5. Tag wurden die Zellen fixiert und mit einem Saure-Phosphatase-Kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) gefärbt. Der Rückgang von Saure-Phosphatase-positiven Zellen wurde als OCIF-Aktivität genommen. Der Rückgang von Saure-Phosphatase-positiven Zellen wurde gemäß dem im BEISPIEL 16 i) beschriebenen Verfahren beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 für rOCIF(E) und rOCIF(C) und in Tabelle 7 für rOCIF(E) und nOCIF enthalten.
Tabelle 6
Tabelle 7
iii) Inhibition der PTH-induzierten Osteoklastenbildung von murinen Knochenmarkzellen
Die Wirkung von OCIF auf die durch PTH induzierte Osteoklastenbildung wurde gemäß dem Verfahren von N. Takahashi et al. (Endocrinology, Bd. 122, S. 1373–1382, 1988) getestet. Im Detail wurden jeweils Proben von rOCIF(E) und nOCIF (125 ng/ml) mit α-MEM (hergestellt von GIBCO BRL Co.) mit 10% FBS und 2 × 10^–8 M PTH seriell verdünnt und 100 μl jeder verdünnten Probe wurden in 96-Well-Platten gegeben. Knochenmarkzellen von 17 Tage alten ddy Mäusen wurden mit einer Zelldichte von 3 × 10⁵ Zellen je 100 μl α-MEM, das 10% FBS enthielt, in die jeweiligen Wells von 96-Well-Platten inokuliert und 5 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ kultiviert. Am 5. Tag wurden die Zellen mit Ethanol/Aceton (1 : 1) 1 Minute lang bei Raumtemperatur fixiert und mit einem Saure-Phosphatase-Kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) gemäß dem im 2. BEISPIEL beschriebenen Verfahren gefärbt. Der Rückgang von Saure-Phosphatase-positiven Zellen wurde als OCIF-Aktivität genommen. Der Rückgang von Saure-Phospatasepositiven Zellen wurde gemäß dem im BEISPIEL 16 i) beschriebenen Verfahren beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 enthalten.
Tabelle 8
iv) Inhibition der IL-11-induzierten Osteoklastenbildung
Die Wirkung von OCIF auf die durch IL-11 induzierte Osteoklastenbildung wurde gemäß dem Verfahren von T. Tamura et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 90, S. 11924–11928, 1993) getestet. Im Detail wurden jeweils Proben von rOCIF(E) und nOCIF mit α-MEM (GIBCO BRL Co.) mit 10% FBS und 20 ng/ml IL-11 seriell verdünnt und 100 μl jeder verdünnten Probe wurden in die jeweiligen Wells von 96-Well-Platten gegeben. Von der Schädeldecke neugeborener Mäuse stammende Prä-Adipozyten-MC3T3-G2/PA6-Zellen (RIKEN Cell Bank RCB1127), 5 × 10³ Zellen je 100 μl α-MEM mit 10% FBS, und Milzzellen von 8 Wochen alten ddy Mäusen, 1 × 10⁵ Zellen je 100 μl des gleichen Mediums, wurden in die jeweiligen Wells von 96-Well-Platten inokuliert und 5 Tage lang bei 37°C in befeuchtetem 5% CO₂ kultiviert. Am 5. Tag wurden die Zellen fixiert und mit einem Saure-Phosphatase-Kit (Acid Phosphatase, Leucocyte, No387-A, Sigma) gefärbt. Saure-Phosphatase-positive Zellen wurden unter dem Mikroskop gezählt, wobei ein Rückgang der Zellzahl als OCIF-Aktivität genommen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 enthalten.
Tabelle 9
Sowohl nOCIF als auch rOCIF(E) inhibierte die Osteoklastenbildung in dosisabhängiger Weise bei einer Konzentration von 2 ng/ml oder darüber.
Die in den Tabellen 4–8 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass OCIF die durch Vitamin D₃, PTH und IL-11 induzierte Osteoklastenbildung mit fast der gleichen Dosis inhibiert. Demzufolge könnte OCIF zur Behandlung der verschiedenen Arten von Knochenerkrankungen mit verringerter Knochenmasse verwendet werden, die durch verschiedene, eine Knochenresorption induzierende Substanzen verursacht werden.
17. BEISPIEL
Isolierung von Monomer-OCIF und Dimer-OCIF
Die rOCIF(E) und rOCIF(C) Probe, die 100 μg OCIF-Protein enthielten, wurden jeweils mit 1/100 Volumen 25%iger Trifluoressigsäure angereichert und auf eine Umkehrphasensäule (PROTEIN-RP, 2,0 × 250 mm, YMC Co.) aufgebracht, die mit 30% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert war. OCIF-Protein wurde von der Säule mit einem linearen Gradienten von 30 bis 55% Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min 50 Minuten lang eluiert und jeder OCIF-Peak wurde aufgefangen. Die Peakfraktion des Monomer-OCIF und die Peakfraktion des Dimer-OCIF wurden jeweils lyophilisiert.
18. BEISPIEL
Bestimmung der relativen Molekülmasse von rekombinanten OCIFs
Jeweils 1 μg des mit der Umkehrphasensäule gemäß BEISPIEL 3 iv) gereinigten isolierten Monomer- und Dimer-nOCIF und jeweils 1 μg des im BEISPIEL 17 beschriebenen Monomer- und Dimer-rOCIF wurde unter Vakuum konzentriert. Jede Probe wurde in dem Puffer für SDS-PAGE inkubiert, einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ausgesetzt, und Proteinbanden auf dem Gel wurden mit dem in BEISPIEL 4 beschriebenen Verfahren mit Silber gefärbt. Die Ergebnisse der Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen und reduzierenden Bedingungen sind in den 6 und 7 dargestellt.
Eine Proteinbande mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 60 kD wurde in jeder Monomer-OCIF-Probe nachgewiesen, und eine Proteinbande mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 120 kD wurde in jeder Dimer-OCIF-Probe unter nichtreduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Eine Proteinbande mit einer scheinbaren relativen Molekülmasse von 60 kD wurde in jeder Monomer-OCIF-Probe unter reduzierenden Bedingungen nachgewiesen. Demzufolge waren die relativen Molekülmassen vom Monomer-nOCIF von IMR-90-Zellen, rOCIF von 293/EBNA-Zellen und rOCIF von CHO-Zellen fast gleich. Die relativen Molekülmassen vom Dimer-nOCIF von IMR-90-Zellen, rOCIF von 293/EBNA-Zellen und rOCIF von CHO-Zellen waren ebenfalls gleich.
19. BEISPIEL
Entfernen der N-verknüpften Oligosaccharidkette und Messen der relativen Molekülmasse von natürlichem und rekombinantem OCIF
Eine Probe mit 5 μg des mit der Umkehrphasensäule gemäß BEISPIEL 3 iv) gereinigten isolierten Monomer- und Dimer-nOCIF und eine Probe mit 5 μg des im BEISPIEL 17 beschriebenen Monomer- und Dimer-rOCIF wurden unter Vakuum konzentriert. Jede Probe wurde in 9,5 μl 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,6, der 100 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, angereichert mit 0,5 μl 250 U/ml N-Glycanase (Seikagaku kogyo Co.), gelöst und einen Tag lang bei 37°C inkubiert. Jede Probe wurde mit 10 μl 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 2 mM EDTA, 5% SDS und 0,02% Bromphenolblau angereichert und 5 Minuten lang auf 100°C erhitzt. Jeweils 1 μl der Proben wurde einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und Proteinbanden auf dem Gel wurden wie im 4. BEISPIEL beschrieben mit Silber gefärbt. Die Elektrophoresemuster sind in 8 dargestellt.
Die scheinbare relative Molekülmasse von jeweils deglykosyliertem nOCIF von IMR-90-Zellen, rOCIF von CHO-Zellen und rOCIF von 293/EBNA-Zellen lag unter reduzierenden Bedingungen bei 40 kD. Die scheinbare relative Molekülmasse von jeweils unbehandeltem nOCIF von IMR-90-Zellen, rOCIF von 293/EBNA-Zellen und rOCIF von CHO-Zellen lag unter reduzierenden Bedingungen bei 60 kD. Demzufolge zeigen die Ergebnisse, dass die OCIF-Proteine Glykoproteine mit N-verknüpften Zuckerketten sind.
20. BEISPIEL
Klonierung von OCIF-Varianten-cDNAs und Bestimmung ihrer DNA-Sequenzen
Das Plasmid pBKOCIF, das eingesetzte OCIF cDNA zu pBKCMV (Stratagene) ist, wurde von einem einiger gereinigten positiven Phagen wie im Beispiel 10 und 11 erhalten. Außerdem wurden im Laufe des Screenens der cDNA-Bibliothek mit der 397 bp OCIF cDNA-Sonde die Transformanten, die Plasmide enthielten, deren Insertgröße sich von der des pBKOCIF unterschied, erhalten. Diese plasmidhaltigen Transformanten wurden wachsen gelassen und die Plasmide wurden gemäß dem Standardverfahren gereinigt. Die Sequenz der Insert-DNA in jedem Plasmid wurde mit dem Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) bestimmt. Die verwendeten Primer waren T3, T7 Primer (Stratagene) und synthetische Primer, die auf der Basis der Nucleotidsequenz von OCIF cDNA präpariert wurden. Es gibt vier OCIF-Varianten (OCIF 2, 3, 4 und 5) neben OCIF. Die Nucleotidsequenz von OCIF2 ist in der Sequenz Nr. 8 dargestellt und die durch die Nucleotidsequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz von OCIF2 ist in der Sequenz Nr. 9 dargestellt. Die Nucleotidsequenz von OCIF3 ist in der Sequenz Nr. 10 dargestellt und die durch die Nucleotidsequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz von OCIF3 ist in der Sequenz Nr. 11 dargestellt. Die Nucleotidsequenz von OCIF4 ist in der Sequenz Nr. 12 dargestellt und die durch die Nucleotidsequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz von OCIF4 ist in der Sequenz Nr. 13 dargestellt. Die Nucleotidsequenz von OCIF5 ist in der Sequenz Nr. 14 dargestellt und die durch die Nucleotidsequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz von OCIF5 ist in der Sequenz Nr. 15 dargestellt. Die Strukturen der OCIF-Varianten sind in den 9 bis 12 dargestellt und werden nachfolgend kurz beschrieben.
OCIF2
OCIF2 cDNA hat eine Deletion von 21 bp von Guanin bei Nucleotid Nr. 265 bis Guanin bei Nucleotid Nr. 285 in der OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6). Folglich hat OCIF2 eine Deletion von 7 Aminosäuren von Glutaminsäure (Glu) bei Aminosäure Nr. 68 bis Glutamin (Gln) bei Aminosäure Nr. 74 in OCIF (Sequenz Nr. 5).
OCIF3
OCIF3 cDNA hat eine Punktmutation bei Nucleotid Nr. 9 in OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6), wo Cytidin durch Guanin ersetzt ist.
Demzufolge hat OCIF3 eine Mutation und Asparagin (Asn) bei Aminosäure Nr. –19 in OCIF (Sequenz Nr. 5) ist durch Lysin (Lys) ersetzt. Die Mutation scheint in der Signalsequenz vorzuliegen und hat keinen wesentlichen Effekt auf den sekretierten OCIF3. OCIF3 cDNA hat eine Deletion von 117 bp von Guanin bei Nucleotid Nr. 872 bis Cytidin bei Nucleotid Nr. 988 in OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6).
Folglich hat OCIF3 eine Deletion von 39 Aminosäuren von Threonin (Thr) bei Aminosäure Nr. 270 bis Leucin (Leu) bei Aminosäure Nr. 308 in OCIF (Sequenz Nr. 5).
OCIF4
OCIF4 cDNA hat zwei Punktmutationen in OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6). Cytidin bei Nucleotid Nr. 9 ist durch Guanin ersetzt und Guanin bei Nucleotid Nr. 22 ist durch Thymidin in OCIF cDNA ersetzt (Sequenz Nr. 6).
Folglich hat OCIF4 zwei Mutationen. Asparagin (Asn) bei Aminosäure Nr. –19 in OCIF (Sequenz Nr. 5) ist durch Lysin (Lys) ersetzt und Alanin (Ala) bei Aminosäure Nr. –14 ist durch Serin (Ser) ersetzt. Diese Mutationen scheinen in der Signalsequenz vorzuliegen und haben keinen wesentlichen Effekt auf sekretierten OCIF4.
Bei OCIF4 cDNA sind etwa 4 kb DNA, das Intron 2 vom OCIF-Gen, zwischen Nucleotid Nr. 400 und Nucleotid Nr. 401 in OCIF cDNA eingesetzt (Sequenz Nr. 6). Das offene Leseraster endet im Intron 2. Demzufolge hat OCIF4 eine zusätzliche neuartige Aminosäuresequenz, die 21 Aminosäuren hinter Alanin (Ala) bei Aminosäure Nr. 112 in OCIF (Sequenz Nr. 5) enthält.
OCIF5
OCIF5 cDNA hat eine Punktmutation bei Nucleotid Nr. 9 in OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6), wo Cytidin durch Guanin ersetzt ist.
Folglich hat OCIF5 eine Mutation und Asparagin (Asn) bei Aminosäure Nr. –19 in OCIF (Sequenz Nr. 5) ist durch Lysin (Lys) ersetzt. Die Mutation scheint in der Signalsequenz vorzuliegen und hat keinen wesentlichen Effekt auf sekretierten OCIF5.
Bei OCIF5 cDNA liegt der letztere Abschnitt (etwa 1,8 kb) des Introns 2 zwischen Nucleotid Nr. 400 und Nucleotid Nr. 401 in OCIF cDNA (Sequenz Nr. 6) vor. Das offene Leseraster stoppt im letzteren Abschnitt von Intron 2. Demzufolge hat OCIF5 eine zusätzliche neuartige Aminosäuresequenz mit 12 Aminosäuren hinter Alanin (Ala) bei Aminosäure Nr. 112 in OCIF (Sequenz Nr. 5).
21. BEISPIEL
Produktion von OCIF-Varianten
i) Konstruktion des Plasmids zur Expression von OCIF-Varianten
Das Plasmid mit OCIF2 oder OCIF3 cDNA wurde wie im 20. BEISPIEL beschrieben erhalten und pBKOCIF2 bzw. pBKOCIF3 genannt. pBKOCIF2 und pBKOCIF3 wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Die OCIF2 und OCIF3 cDNA-Inserts wurden durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Die gereinigten OCIF2 und OCIF3 cDNA-Inserts wurden einzeln unter Verwendung des DNA-Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo) mit dem Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) ligiert, der mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut worden war. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert.
Das Plasmid mit OCIF4 cDNA wurde wie im 20. BEISPIEL beschrieben erhalten und pBKOCIF4 genannt. pBKOCIF4 wurde mit den Restriktionsenzymen SpeI und XhoI (Takara Shuzo) verdaut. Das OCIF4 cDNA-Insert wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Das gereinigte OCIF4 cDNA-Insert wurde unter Verwendung des DNA-Ligationskits Ver. 2 (Takara Shuzo) mit dem Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) ligiert, der mit den Restriktionsenzymen NheI und XhoI (Takara Shuzo) verdaut worden war. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert.
Das Plasmid mit OCIF5 cDNA wurde wie in BEISPIEL 20 beschrieben erhalten und pBKOCIF5 genannt. pBKOCIF5 wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII (Takara Shuzo) verdaut. Abschnitt 5' der Kodierregion im OCIF5 cDNA-Insert wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Das OCIF-Expressionsplasmid pCEPOCIF, das im BEISPIEL 13 i) erhalten wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII (Takara Shuzo) verdaut. Abschnitt 5' der Kodierregion in der OCIF cDNA wurde entfernt. Der Rest des Plasmids mit pCEP-Vektor und Abschnitt 3' der Kodierregion von OCIF cDNA wurde pCEPOCIF-3' genannt. pCEPOCIF-3' wurde durch Agarosegelelektrophorese separiert und von dem Gel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Das OCIF5 cDNA HindIII-Fragment und pCEPOCIF-3' wurden mit dem DNA-Ligationskit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. E. coli. DH5α (Gibco BRL) wurde mit dem Ligationsgemisch transformiert.
Die erhaltenen Transformanten wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen und die OCIF-Varianten-Expressionsplasmide (pCEPOCIF2, pCEPOCIF3, pCEPOCIF4 und pCEPOCIF5) wurden mit einer QIAGEN-Säule (QIAGEN) gereinigt. Diese OCIF-Varianten-Expressionsplasmide wurden mit Ethanol präzipitiert, in sterilem destilliertem Wasser gelöst und in den nachfolgend beschriebenen Beispielen verwendet.
ii) Vorübergehende Expression von OCIF-Varianten-cDNAs und Analyse der biologischen Aktivität von rekombinanten OCIF-Varianten
Rekombinante OCIF-Varianten wurden mit dem Expressionsplasmid pCEPOCIF2, pCEPOCIF3, pCEPOCIF4 und pCEPOCIF5 wie in BEISPIEL 21 i) beschrieben gemäß dem in BEISPIEL 13 ii) beschriebenen Verfahren präpariert. Die biologischen Aktivitäten von rekombinanten OCIF-Varianten wurden analysiert. Den Ergebnissen zufolge hatten diese OCIF-Varianten (OCIF2, OCIF3, OCIF4 und OCIF5) eine schwache Aktivität.
22. BEISPIEL
Präparation von OCIF-Mutanten
i) Konstruktion eines Plasmidvektors zum Subklonieren von cDNAs, die OCIF-Mutanten kodieren
Der im 11. BEISPIEL beschriebene Plasmidvektor (5 μg) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI (Takara Shuzo) verdaut. Die verdaute DNA wurde einer präparativen Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 1,6 Kilobasenpaaren (kb), das die gesamte Kodiersequenz für OCIF enthielt, wurde von dem Gel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese Lösung wurde DNA-Lösung 1 genannt. pBluescript II SK+ (3 μg) (Stratagene) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI (Takara Shuzo) verdaut. Die verdaute DNA wurde einer präparativen Agarosegelelektrophorese unterzogen. Das DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 3,0 kb wurde von dem Gel mit dem QIAEX-DNA-Extraktionskit (QIAGEN) gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde DNA-Lösung 2 genannt. Ein Mikroliter der DNA-Lösung 2, 4 μl DNA-Lösung 1 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 (Takara Shuzo) wurden vermischt und 30 Minuten lang bei 16°C inkubiert. (Das Ligationsgemisch wurde für die Transformation von E. coli in der nachfolgend beschriebenen Weise verwendet). Es folgt eine Beschreibung der Bedingungen zur Transformation von E. coli. Einhundert Mikroliter von kompetenten E. coli DH5α Zellen (GIBCO BRL) und 5 μl des Ligationsgemischs wurden in einem sterilen 15-ml-Röhrchen (IWAKI Glass) vermischt. Das Röhrchen wurde 30 Minuten lang auf Eis gehalten. Nach einer 45-sekündigen Inkubation bei 42°C wurden 250 μl L-Nährlösung (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) zu den Zellen gegeben. Die Zellsuspension wurde dann 1 Stunde lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Fünfzig Mikroliter der Zellsuspension wurden auf eine L-Agar-Platte plattiert, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Platte wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
Sechs auf der Platte wachsende Kolonien wurden individuell in jeweils 2 ml L-Nährlösung, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, über Nacht bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Struktur der Plasmide in den Kolonien wurde analysiert. Es wurde ein Plasmid erhalten, in dem das 1,6 kb DNA-Fragment, das die gesamte OCIF cDNA enthielt, zwischen den Verdauorten von BamHI und XhoI von pBluescript II SK+ eingesetzt war, und pSK+ -OCIF genannt.
ii) Präparation von Mutanten, in denen einer der Cys-Reste in OCIF durch einen Ser-Rest ersetzt ist
1) Einführung von Mutationen in OCIF cDNA
Es wurden OCIF-Mutanten präpariert, in denen einer der fünf Cys-Reste, die in OCIF an den Positionen 174, 181, 256, 298 und 379 (in SEQUENZ Nr. 4) vorliegen, durch einen Ser-Rest ersetzt war, und jeweils OCIF-C19S (174 Cys bis Ser), OCIF-C20S (181 Cys bis Ser), OCIF-C21S (256 Cys bis Ser), OCIF-C22S (298 Cys bis Ser) und OCIF-C23S (379 Cys bis Ser) genannt.
Zum Präparieren der Mutanten wurden Nucleotide, die die entsprechenden Cys-Reste kodierten, durch solche ersetzt, die Ser kodierten. Eine Mutagenese wurde durch eine Zweistufen-Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. Die erste Stufe der PCR bestand aus zwei Reaktionen, PCR 1 und PCR 2.
Für jede Mutation wurden bestimmte Primer-Sets verwendet, die anderen Komponenten blieben unverändert. Die in den Reaktionen verwendeten Primer sind in Tabelle 10 aufgeführt. Die Nucleotidsequenzen der Primer sind in den SEQUENZEN Nr. 20, 23, 27 und 30–40 dargestellt. Die PCR wurden unter den folgenden Bedingungen wie folgt durchgeführt. Einem anfänglichen 3-minütigen Denaturierungsschritt bei 97°C folgten 25 Zyklen der Denaturierung bei 95°C (1 Minute), Annealing bei 55°C (1 Minute) und Extension bei 72°C (3 Minuten). Nach diesen Amplifikationszyklen fand die letzte Extension 5 Minuten lang bei 70°C statt. Die Größe der PCR-Produkte wurde durch Agarosegelelektrophorese unter Verwendung der Reaktionslösung bestätigt. Nach der ersten PCR wurden überschüssige Primer unter Verwendung von Amicon Microcon (Amicon) entfernt. Das Endvolumen der Lösungen, die die PCR-Produkte enthielten, wurde mit sterilem destilliertem Wasser auf 50 μl gebracht. Diese gereinigten PCR-Produkte wurden für die zweite PCR (PCR 3) verwendet.
Tabelle 10
Die Reaktionsbedingungen waren exakt die gleichen wie bei PCR 1 oder PCR 2. Die Größe der PCR-Produkte wurde durch 1,0% oder 1,5% Agarosegel-Elektrophorese bestätigt. Die DNA-Fragmente wurden mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 40 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die Lösungen, die DNA-Fragmente mit Mutation C19S, C20S, C21S C22S und C23S enthielten, wurden jeweils DNA-Lösung A, DNA-Lösung B, DNA-Lösung C, DNA-Lösung D und DNA-Lösung E genannt.
Das in Lösung A (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und SphI (Takara Shuzo) verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 400 Basenpaaren (bp) wurde von einem präparativen Agarosegel extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 3 genannt. Zwei Mikrogramm pSK+ -OCIF wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und SpHI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 4,2 kb wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit gereinigt und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 4 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 3, 3 μl der DNA-Lösung 4 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon gescreent, der eine Plasmid-DNA enthielt. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltende Plasmid wurde pSK-OCIF-C19S genannt.
Das in Lösung B (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und SpHI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 400 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 5 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 5, 3 μl der DNA-Lösung 4 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon gescreent, der eine Plasmid-DNA enthielt. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltende Plasmid wurde pSK-OCIF-C20S genannt.
Das in Lösung C (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und SpHI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 400 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX- Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 6 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 6, 3 μl der DNA-Lösung 4 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon gescreent, der eine Plasmid-DNA enthielt. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltende Plasmid wurde pSK-OCIF-C21S genannt.
Das in Lösung D (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und BstPI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 600 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 7 genannt. Zwei Mikrogramm psK+ -OCIF wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und BstPI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 4,0 kb wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 8 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 7, 3 μl der DNA-Lösung 8 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, in der das 600 bp NdeI-BstPI Fragment mit der Mutation (die C22S Mutation) das 600 bp NdeI-BstPI Fragment von psK+ -OCIF ersetzte, durch Analysieren der DNA-Struktur gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-C22S genannt.
Das in Lösung E (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BstPI und EcoRV verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 120 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 9 genannt. Zwei Mikrogramm psK+ -OCIF wurden mit den Restriktionsenzymen BstEII und EcoRV verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 4,5 kb wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit gereinigt und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 10 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 9, 3 μl der DNA-Lösung 10 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon gescreent, der eine Plasmid-DNA enthielt. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-C23S genannt.
2) Konstruktion von Vektoren zur Expression der OCIF-Mutanten
pSK-OCIF-C19S, pSK-OCIF-C20S, pSK-OCIF-C21S, pSK-OCIF-C22S und pSK-OCIF-C23S wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Das 1,6 kb BamHI-XhoI DNA-Fragment, das die jeweiligen OCIF-Mutanten kodiert, wurde isoliert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Die DNA-Lösungen, die 1,6 kb cDNA-Fragmente enhielten, die von pSK-OCIF-C195, pSK-OCIF-C20S, pSK-OCIF-C21S, pSK-OCIF- C22S und pSK-OCIF-C23S stammten, wurden jeweils C19S DNA-Lösung, C20S DNA-Lösung, C21S DNA-Lösung, C22S DNA-Lösung und C23S DNA-Lösung genannt. Fünf Mikrogramm eines Expressionsvektors pCEP4 (Invitrogen) wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 10 kb wurde gereinigt und in 40 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde pCEP4 DNA-Lösung genannt. Ein Mikroliter pCEP4 DNA-Lösung und 6 μl der C19S DNA-Lösung, C20S DNA-Lösung, C21S DNA-Lösung, C22S DNA-Lösung oder C23S DNA-Lösung wurden unabhängig mit 7 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 vermischt und es fanden Ligationsreaktionen statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen (100 μl) wurden mit 7 μl jedes Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf Klone, die ein Plasmid enthielten, in dem ein 1,6 kb cDNA-Fragment zwischen den Erkennungsstellen von BamHI und XhoI von pCEP4 eingesetzt war, durch Analysieren der DNA-Struktur gescreent. Die erhaltenen Plasmide, die die cDNA enthielten, die OCIF-C19S, OCIF-C20S, OCIF-C21S, OCIF-C22S und OCIF-C23S kodierte, wurden jeweils pCEP4-OCIF-C19S, pCEP4-OCIF-C20S, pCEP4-OCIF-C21S, pCEP4-OCIF-C22S und pCEP4-OCIF-C23S genannt.
ii) Präparation von Domänen-Deletionsmutanten von OCIF
(1) Deletionsmutagenese von OCIF cDNA
Es wurde eine Reihe von OCIF-Mutanten mit Deletionen von Thr 2 bis Ala 42, von Pro 43 bis Cys 84, von Glu 85 bis Lys 122, von Arg 123 bis Cys 164, von Asp 177 bis Gln 251 und von Ile 252 bis His 326 präpariert (die Positionen der Aminosäurereste sind in SEQUENZ Nr. 4 dargestellt). Diese Mutanten wurden jeweils OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1 und OCIF-DDD2 genannt. Eine Mutagenese erfolgte durch die im BEISPIEL 22 (ii) beschriebene Zweistufen-PCR. Die Primer-Sätze für die Reaktionen sind in Tabelle 11 dargestellt und die Nucleotidsequenzen der Primer sind in den SEQUENZEN Nr. 19, 25, 40–53 und 54 dargestellt.
Tabelle 11
Die endgültigen PCR-Produkte wurden mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 40 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Lösungen von DNA-Fragment, das die Abschnitte OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1 and OCIF-DDD2 kodierte, wurden jeweils DNA-Lösungen F, G, H, I, J und K genannt.
Das in Lösung F (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 500 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 11 genannt. Zwei Mikrogramm psK+ -OCIF wurden mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 4,0 kb wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit gereinigt und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 12 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 11, 3 μl der DNA-Lösung 12 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligation statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillinresistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DCR1 genannt.
Das in Lösung G (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 500 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 13 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 13, 3 μl der DNA-Lösung 12 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligation statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillinresistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DCR2 genannt.
Das in Lösung H (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 500 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 14 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 14, 3 μl der DNA-Lösung 12 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DCR3 genannt.
Das in Lösung I (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und SpHI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 900 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 15 genannt. Zwei Mikrogramm pSK+ -OCIF wurden mit den Restriktionsenzymen XhoI und SphI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 3,6 kb wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit gereinigt und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 16 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 15, 3 μl der DNA-Lösung 16 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DCR4 genannt.
Das in Lösung J (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BstPI und NdeI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 400 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 17 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 17, 3 μl der DNA-Lösung 8 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA- Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DDD1 genannt. Das in Lösung K (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und BstPI verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 400 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 18 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 18, 3 μl der DNA-Lösung 8 und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon, der eine Plasmid-DNA enthielt, gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-DDD2 genannt.
2) Konstruktion von Vektoren zur Expression der OCIF-Mutanten
pSK-OCIF-DCR1, pSK-OCIF-DCR2, pSK-OCIF-DCR3, pSK-OCIF-DCR4, pSK-OCIF-DDD1 und pSK-OCIF-DDD2 wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Das BamHI-XhoI DNA-Fragment, das die gesamte Kodiersequenz für jede OCIF-Mutante enthielt, wurde isoliert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösungen, die das BamHI-XhoI Fragment enhielten, das von pSK-OCIF-DCR1, pSK-OCIF-DCR2, pSK-OCIF-DCR3, pSK-OCIF-DCR4, pSK-OCIF-DDD1 und pSK-OCIF-DDD2 stammte, wurden jeweils DCR1 DNA-Lösung, DCR2 DNA-Lösung, DCR3 DNA-Lösung, DCR4 DNA-Lösung, DDD1 DNA-Lösung und DDD2 DNA-Lösung genannt. Ein Mikroliter der pCEP4 DNA-Lösung und 6 μl der DCR1 DNA-Lösung, DCR2 DNA-Lösung, DCR3 DNA-Lösung, DCR4 DNA-Lösung, DDD1 DNA-Lösung oder DDD2 DNA-Lösung wurden unabhängig mit 7 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 vermischt und es fanden Ligationsreaktionen statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen (100 μl) wurden mit 7 μl jedes Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf Klone, die eine Plasmid-DNA enthielten, in der das DNA-Fragment mit Deletionen zwischen den Erkennungsstellen von BamHI und XhoI von pCEP4 eingesetzt war, durch Analysieren der DNA-Struktur gescreent. Die Plasmide, die die cDNA enthielten, die OCIF-DCR1, OCIF-DCR2, OCIF-DCR3, OCIF-DCR4, OCIF-DDD1 und OCIF-DDD2 kodierte, wurden jeweils pCEP4-OCIF-DCR1, pCEP4-OCIF-DCR2, pCEP4-OCIF-DCR3, pCEP4-OCIF-DCR4, pCEP4-OCIF-DDD1 und pCEP4-OCIF-DDD2 genannt.
iii) Präparation von OCIF mit C-terminaler Domänen-Verkürzung
(1) Mutagenese von OCIF cDNA
Es wurde eine Reihe von OCIF-Mutanten mit Deletionen von Cys am Aminosäurerest 379 bis Leu 380, von Ser 331 bis Leu 380, von Asp 252 bis Leu 380, von Asp 177 bis Leu 380, von Arg 123 bis Leu 380 und von Cys 86 bis Leu 380 präpariert. Die Positionen der Aminosäurereste sind in der SEQUENZ Nr. 4 dargestellt. Diese Mutanten wurden jeweils OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 und OCIF-CCR3 genannt.
Die Mutagenese für OCIF-CL wurde mit der im BEISPIEL 22 (ii) beschriebenen Zweistufen-PCR durchgeführt. Der Primer-Satz für die Reaktion ist in Tabelle 12 dargestellt. Die Nucleotidsequenzen der Primer sind in den SEQUENZEN Nr. 23, 40, 55 und 56 dargestellt. Die endgültigen PCR-Produkte wurden mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 40 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde Lösung L genannt.
Das in Lösung L (20 μl) enthaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BstPI und EcoRV verdaut. Ein DNA-Fragment mit einer ungefähren Größe von 100 bp wurde von einem präparativen Agarosegel mit dem QIAEX-Gelextraktionskit extrahiert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde DNA-Lösung 19 genannt. Zwei Mikroliter der DNA-Lösung 19, 3 μl der DNA-Lösung 10 (im BEISPIEL 22 (ii) beschrieben) und 5 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 wurden vermischt und es fand eine Ligationsreaktion statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen wurden mit 5 μl des Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf einen Klon gescreent, der eine Plasmid-DNA enthielt. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSK-OCIF-CL genannt. Es fand eine Mutagenese von OCIF cDNA zur Herstellung von OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 und OCIF-CCR3 durch eine Einstufen-PCR statt. PCR-Reaktionen zur Mutagenese, um OCIF-CC, OCIF-CDD2, OCIF-CDD1, OCIF-CCR4 und OCIF-CCR3 herzustellen.
Tabelle 12
Für jede Mutagenese wurden spezifische Primer verwendet, andere Komponenten blieben unverändert.
Die für die Mutagenese verwendeten Primer sind in Tabelle 13 dargestellt. Ihre Nucleotidsequenzen sind in den SEQUENZEN Nr. 57–61 dargestellt. Die Komponenten jeder PCR wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen vermischt und die PCR wurde wie folgt durchgeführt. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden 3 Minuten lang bei 97°C behandelt und dann nacheinander 30 Sekunden lang bei 95°C, 30 Sekunden bei 50°C und 3 Minuten bei 70°C inkubiert. Dieses Dreistufen-Inkubationsverfahren wurde 25 Mal wiederholt, woraufhin die Röhrchen 5 Minuten lang bei 70°C inkubiert wurden. Ein aliquoter Teil des Reaktionsgemischs wurde aus jedem Röhrchen entfernt und durch Agarosegelelektrophorese analysiert, um die Größe jedes Produktes zu bestätigen.
Die Größe der PCR-Produkte wurde auf einem Agarosegel bestätigt. In den PCR überschüssige Primer wurden mit Amicon Microcon (Amicon) nach Abschluss der Reaktion entfernt. Die DNA-Fragmente wurden mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 40 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Das DNA-Fragment in jeder DNA-Lösung wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI verdaut. Nach den Reaktionen wurde DNA mit Ethanol präzipitiert, unter Vakuum getrocknet und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst.
Die Lösungen, die DNA-Fragmente mit der CC-Deletion, der CDD2-Deletion, der CDD1-Deletion, der CCR4-Deletion und der CCR3-Deletion enthielten, wurden jeweils CC-DNA-Lösung, CDD2-DNA-Lösung, CDD1-DNA-Lösung, CCR4-DNA-Lösung und CC-R3-DNA-Lösung genannt.
Tabelle 13
(2) Konstruktion von Vektoren zur Expression der OCIF-Mutanten
pSK-OCIF-CL wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Das BamHI-XhoI DNA-Fragment, das die gesamte Kodiersequenz für OCIF-CL enthielt, wurde isoliert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösung wurde CL DNA-Lösung genannt. Ein Mikroliter der pCEP4 DNA-Lösung und 6 μl der CL-DNA-Lösung, CC-DNA-Lösung, CDD2-DNA-Lösung, CDD1-DNA-Lösung, CCR4-DNA-Lösung oder CCR3-DNA-Lösung wurden unabhängig mit 7 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 vermischt und es fanden Ligationsreaktionen statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen (100 μl) wurden mit 7 μl jedes Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf Klone, die Plasmide mit den erwünschten Mutationen in OCIF cDNA enthielten, durch Analysieren der DNA-Struktur gescreent. In jedem Plasmid waren OCIF cDNA-Fragmente mit einer Deletion zwischen den Erkennungsstellen von XhoI und BamHI von pCEP4 eingesetzt. Die Plasmide, die die cDNA enthielten, die OCIF-CL, OCIF-CC, OCIF-CDD1, OCIF-CDD2, OCIF-CCR4 und OCIF-CCR3 kodierten, wurden jeweils pCEP4-OCIF-CL, pCEP4-OCIF-CC, pCEP4-OCIF-CDD2, pCEP4-OCIF-CDD1, pCEP4-OCIF-CCR4 und pCEP4-OCIF-CCR3 genannt.
iv) Präparation von OCIF-Mutanten mit C-terminaler Verkürzung
(1) Einführung einer C-terminalen Verkürzung in OCIF
Es wurde eine Reihe von OCIF-Mutanten mit C-terminaler Verkürzung präpariert. Die OCIF-Mutante, in der 10 Reste von Gln bei 371 bis Leu bei 380 durch 2 Reste Leu-Val ersetzt waren, wurde OCIF-CBst genannt. Die OCIF-Mutante, in der 83 Reste von Cys 298 bis Leu 380 durch 3 Reste Ser-Leu-Asp ersetzt waren, wurde OCIF-CSph genannt. Die OCIF-Mutante, in der 214 Reste von Asn 167 bis Leu 380 entfernt waren, wurde OCIF-CBsp genannt. Die OCIF-Mutante, in der 319 Reste von Asp 62 bis Leu 380 durch 2 Reste Leu-Val ersetzt waren, wurde OCIF-CPst genannt. Die Positionen der Aminosäurereste sind in der SEQUENZ Nr. 4 dargestellt.
Jeweils zwei Mikrogramm von pSK+ -OCIF wurden mit dem Restriktionsenzym BstPI, SphI, PstI (Takara Shuzo) oder BspEl (New England Biolabs) verdaut, woraufhin eine Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation folgte. Die präzipitierte DNA wurde in 10 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Blunt-Enden der DNAs in 2 μl der jeweiligen Lösungen wurden mit einem Blunting-Kit in Endvolumen von 5 μl gebildet. Zu den Reaktionsgemischen wurden 1 μg (1 μl) Amber-Codon-haltiger XbaI Linker (5'-CTAGTCTAGRCTAG-3') und 6 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 gegeben.
Im Anschluss an die Ligationsreaktionen wurden jeweils 6 μl der Reaktionsgemische zum Transformieren von E. coli DH5α verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf plasmidhaltige Klone gescreent. Die DNA-Struktur wurde durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung analysiert. Die so erhaltenen Plasmide wurden jeweils pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp und pSK-OCIF-CPst genannt.
(2) Konstruktion von Vektoren zur Expression von OCIF-Mutanten
pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp und pSK-OCIF-CPst wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und XhoI verdaut. Das 1,5 kb DNA-Fragment, das die gesamte Kodiersequenz für jede OCIF-Mutante enthielt, wurde isoliert und in 20 μl sterilem destilliertem Wasser gelöst. Diese DNA-Lösungen, die das BamHI-XhoI Fragment enthielten, das von pSK-OCIF-CBst, pSK-OCIF-CSph, pSK-OCIF-CBsp und pSK-OCIF-CPst stammte, wurden jeweils CBst DNA-Lösung, CSph DNA-Lösung, CBsp DNA-Lösung und CPst DNA-Lösung genannt. Ein Mikroliter der pCEP4 DNA-Lösung (im BEISPIEL 22 ii) beschrieben) und 6 μl der CBst DNA-Lösung, CSph DNA-Lösung, CBsp DNA-Lösung oder CPst DNA-Lösung wurden unabhängig mit 7 μl Ligationspuffer I des DNA-Ligationskits Ver. 2 vermischt und es fanden Ligationsreaktionen statt. Kompetente E. coli DH5α Zellen (100 μl) wurden mit 7 μl jedes Ligationsgemischs transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden im Hinblick auf Klone, die Plasmide enthielten, in denen cDNA-Fragment zwischen den Erkennungsstellen von BamHI und XhoI von pCEP4 eingesetzt war, durch Analysieren der DNA-Struktur gescreent. Die Plasmide, die die cDNA enthielten, die OCIF-CBst, OCIF-CSph, OCIF-CBsp und OCIF-CPst kodierte, wurden jeweils pCEP4-OCIF-CBst, pCEP4-OCIF-CSph, pCEP4-OCIF-CBsp und pCEP4-OCIF-CPst genannt.
v) Präparation von Vektoren zur Expression von OCIF-Mutanten
E. coli Klone, die die Expressionsvektoren für OCIF-Mutanten beinhalteten (insgesamt 21 Klone), wurden wachsen gelassen und die Vektoren wurden mit einer QIAGEN-Säule (QIAGEN) gereinigt. Alle Expressionsvektoren wurden mit Ethanol präzipitiert und in angemessenen Volumen von sterilem destilliertem Wasser gelöst und für weitere, nachfolgend dargestellte Manipulationen verwendet.
vi) Vorübergehende Expression der cDNAs für OCIF-Mutanten und biologische Aktivität der Mutanten
OCIF-Mutanten wurden mit den im BEISPIEL 22 v) präparierten Expressionsvektoren produziert. Das Verfahren entsprach im Wesentlichen dem im BEISPIEL 13 beschriebenen. Im Folgenden werden nur geänderte Aspekte beschrieben. Für die DNA-Transfektion wurde eine 24-Well-Platte verwendet. 2 × 10⁵ Zellen von 293/EBNA, suspendiert in IMDM mit 10% fötalem Rinderserum wurden in die jeweiligen Wells der Platte geimpft. Für jede Transfektion wurden 1 Mikrogramm der gereinigten Vektor-DNA und 4 μl Lipofectamin verwendet. Ein Gemisch aus einem Expressionsvektor und Lipofectamin in OPTI-MEM (GIBCO BRL) in einem Endvolumen von 0,5 ml wurde zu den Zellen in einem Well gegeben. Nachdem die Zellen 24 Stunden lang bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert worden waren, wurde das Medium durch 0,5 ml Ex-cell 301 Medium (JSR) ersetzt. Die Zellen wurden in dem CO₂-Inkubator weitere 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Das konditionierte Medium wurde aufgefangen und für eine Prüfung der In-vitro-Bioaktivität verwendet. Die Nucleotidsequenzen von cDNAs für die OCIF-Mutanten sind in den SEQUENZEN NR. 83–103 dargestellt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die OCIF-Mutanten sind in den SEQUENZEN Nr. 62–82 dargestellt. Die Prüfung der In-vitro-Bioaktivität fand wie im BEISPIEL 13 beschrieben statt. Die Antigenkonzentration von jedem konditionierten Medium wurde durch ELISA wie im BEISPIEL 24 beschrieben bestimmt. In Tabelle 14 ist die spezifische Aktivität der Mutanten relativ zu der des unveränderten OCIF dargestellt.
Tabelle 14
vi) Western-Blot-Analyse
Zehn Mikroliter des endgültigen konditionierten Mediums wurden für eine Western-Blot-Analyse verwendet. Zehn Mikroliter der Probe wurden mit 10 μl SDS-PAGE Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl, 20% Glycerol, 4% SDS, 20 μg/ml Bromphenolblau, pH 6,8) vermischt, 3 Minuten lang gekocht und einer 10% SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die separierten Proteine mit einem Semi-dry Elektroblotter (BIO-RAD) auf eine PVDF-Membran (ProBlott^®, Perkin Elmer) übertragen. Die Membran wurde bei 37°C mit Meerrettichperoxidase-markierten Anti-OCIF-Antikörpern 2 Stunden lang inkubiert. Nachdem die Membran gewaschen worden war, wurden mit dem ECL-System (Amersham) Proteinbanden, die mit den markierten Antikörpern reagierten, nachgewiesen. Zwei Proteinbanden mit einer ungefähren Molekülmasse von 60 kD und 120 kD wurden für den unveränderten OCIF nachgewiesen. Für OCIF-C23S, OCIF-CL und OCIF CC wurde hingegen fast ausschließlich eine 60 kD Proteinbande nachgewiesen. Für OCIF-CDD2 und OCIF-CDD1 wurden hauptsächlich Proteinbanden mit einer ungefähren Masse von jeweils 40 kD–50 kD und 30 kD–40 kD nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cys bei 379 für die Dimerbildung verantwortlich ist; sowohl die Monomere als auch die Dimer behalten die biologische Aktivität bei und eine Deletion der Reste von Asp bei 177 bis Leu bei 380 hebt nicht die biologische Aktivität von OCIF auf (Positionen der Aminosäurereste sind in der SEQUENZ Nr. 4 dargestellt).
23. BEISPIEL
Isolierung eines humanen genomischen OCIF-Gens
i) Screenen einer humanen Genombibliothek
Eine amplifizierte humane Plazenta-Genombibliothek in Lambda FIX II Vektor von STRATAGENE wurde hinsichtlich des Gens, das humanen OCIF kodiert, unter Verwendung der humanen OCIF cDNA als Sonde gescreent. Das Screening-Verfahren fand im Wesentlichen gemäß der mit der Genombibliothek gelieferten Bedienungsanleitung statt. Außerdem wurden die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual beschriebenen Grundprotokolle zur Manipulation von Phagen, E. coli und DNA verwendet.
Die Bibliothek wurde getitert und 1 × 10⁶ pfu Phage wurden mit XL1-Blue MRA E. coli Wirtszellen vermischt und auf 20 Platten (9 cm × 13 cm) mit 9 ml je Platte Deckagarose plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Filter-Plaque-Lifts wurden mit Hybond-N Nylonmembranen (Amersham) präpariert. Die Membranen wurden durch Denaturierung in einer Lösung mit 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH 1 Minute lang bei Raumtemperatur bearbeitet. Anschließend wurden die Membranen neutralisiert, indem sie jeweils nacheinander eine Minute lang in 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und eine Lösung mit 1,5 M NaCl und 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) gegeben wurden. Die Membranen wurden dann auf ein mit 2 × SSC befeuchtetes Filterpapier übertragen. Phagen-DNA wurde auf die Membranen mit 1200 μ Joules UV-Energie im STRATALINKER UV Crosslinker 2400 (STRATAGENE) fixiert, und die Membranen wurden an der Luft getrocknet. Die Membranen wurden in Rapid Hybridization Puffer (Amersham) eingetaucht und eine Stunde lang bei 65°C vor der Hybridisierung mit ³²P-markierter cDNA-Sonde in dem gleichen Puffer über Nacht bei 65°C inkubiert. Eine Screening-Sonde wurde durch Markieren der OCIF cDNA mit ³²P unter Verwendung des Megaprime DNA-Markierungssystem (Amersham) präpariert. Eine etwa 5 × 105 cpm Sonde wurde pro ml Hybridisierungspuffer verwendet. Nach der Hybridisierung wurden die Membranen fünf Minuten lang in 2 × SSC bei Raumtemperatur abgespült. Die Membranen wurden dann vier Mal, jeweils 20 Minuten lang, in 0,5 × SSC mit 0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Nach der letzten Wäsche wurden die Membranen getrocknet und einer Autoradiographie bei –80°C mit einem SUPER HR-H Röntgenfilm (FUJI PFOTO FILM CO., Ltd.) und einem Verstärkerschirm unterzogen. Bei der Untersuchung der Autoradiogramme wurden sechs positive Signale entdeckt. Agarstopfen wurden von den Regionen, die diesen Signalen entsprachen, zur Phagenreinigung abgenommen. Jeder Agarstopfen wurde über Nacht in 0,5 ml SM Puffer mit 1% Chloroform eingeweicht, um Phagen zu extrahieren. Jeder phagenhaltige Extrakt wurde 1000fach mit SM Puffer verdünnt und ein aliquoter Teil von 1 ml oder 20 ml wurde mit dem oben beschriebenen E. coli Wirt vermischt. Das Gemisch wurde auf Agarplatten mit Deckagarose wie oben beschrieben plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und es wurden Filter-Lifts präpariert, vorhybridisiert, hybridisiert, gewaschen und einer Autoradiographie wie oben beschrieben unterzogen. Dieser Prozess der Phagenreinigung wurde bei allen sechs positiven Signalen angewendet, die anfänglich auf den Autoradiogrammen entdeckt wurden, und so lange wiederholt, bis alle Phagenplaques auf Agarplatten mit der cDNA-Sonde hybrisierten. Nach der Reinigung wurden Agarstopfen von jedem Phagenisolat in SM Puffer mit 1 Chlorofom eingeweicht und bei 4°C aufbewahrt. Die sechs individuellen Phagenisolate wurden jeweils λ0IF3, λ0IF8, λ0IF9, λ0IF11, λ0IF12 und λ0IF17 genannt.
ii) Analyse der genomischen Klone durch Restriktionsenzymverdau und Southern-Blot-Hybridisierung
DNA wurde von jedem Phagenisolat mit dem in Molecular Cloning: A Laboratory Manual beschriebenen Plattenlysatverfahren präpariert. Von den jeweiligen Phagen präparierte DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut und die von dem Verdau gewonnenen Fragmente wurden auf Agarosegelen separiert. Die Fragmente wurden dann auf Nylonmembranen übertragen und mit OCIF cDNA als Sonde einer Southern-Blot-Hybridisierung unterzogen. Den Ergebnissen der Analyse zufolge waren die sechs Phagenisolate individuelle Klone. Von diesen von dem Restriktionsenzymverdau stammenden Fragmenten wurden solche Fragmente in Plasmidvektoren subkloniert, die mit der OCIF cDNA-Sonde hybridisierten, und der nachfolgend beschriebenen Nucleotidsequenzanalyse unterzogen.
iii) Subklonierung von Restriktionsfragmenten, die von genomischen Klonen stammen, in Plasmidvektoren und Bestimmung der Nucleotidsequenz
λ0IF8 DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI verdaut und die davon gewonnenen DNA-Fragmente wurden auf einem 0,7% Agarosegel separiert. Das 5,8 Kilobasenpaar-(kb)-EcoRI/NotI-Fragment wurde mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren von dem Gel extrahiert. Das 5,8 kb EcoRI/NotI Fragment wurde mit pBluescript II SK+ Vektor (STRATAGENE), der mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NotI linearisiert worden war, unter Verwendung von Ready-To-Go T4 DNA Lipase (Pharmacia) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren ligiert. Kompetente DH5α E. coli Zellen (Amersham) wurden mit dem rekombinanten Plasmid transformiert und die Transformanten wurden auf L-Platten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, selektiert. Es wurde ein Klon isoliert, der das rekombinante Plasmid mit dem 5,8 kb EcoRI/NotI Fragment beinhaltete, und dieses Plasmid wurde pBSG8-5.8 genannt. pBSG8-5.8 wurde mit HindIII verdaut und 0,9 kb DNA-Fragment, das von diesem Verdau stammte, wurde in der gleichen Weise wie oben beschrieben isoliert. Dieses 0,9 kb Fragment wurde dann in pBluescript II SK– am HindIII Ort wie oben beschrieben kloniert. Dieses rekombinante Plasmid mit 0,9 kb HindIII Fragment wurde pBS8H0.9 genannt.
λ0IF11 DNA wurde mit EcoRI verdaut und 6 kb, 3,6 kb, 2,6 kb EcoRI Fragmente wurden in der gleichen Weise wie oben beschrieben isoliert und in pBluescript II SK+ Vektor am EcoRI Ort wie oben beschrieben kloniert. Diese rekombinanten Plasmide wurden jeweils pBSG11-6, pBSG11-3.6 und pBSG11-2.6 genannt. pBSG11-6 wurde mit HindIII verdaut und der Verdau wurde auf ein 0,7% Agarosegel aufgebracht. Drei Fragmente mit einer Länge von 2,2 kb, 1,1 kb und 1,05 kb wurden von dem Gel extrahiert und unabhängig in pBluescript II SK– Vektor am HindIII Ort in der gleichen Weise wie oben beschrieben kloniert. Diese rekombinanten Plasmide wurden jeweils pBS6H2.2, pBS6H1.1 und pBS6H1.05 genannt.
Die Nucleotidsequenz der klonierten genomischen DNA wurde mit dem ABI Dyedeoxy Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PERKIN ELMER) und dem 373A DNA-Sequenzierungssystem (Applied Biosystems) bestimmt. Die Plasmide pBSG8-5.8, pBS8H0.9, pBSG11-6, pBSG11-3.6, pBSG11-2.6, pBS6H2.2, pBS6H1.1 und pBS6H1.05 wurden gemäß dem in Molecular Cloning: A Laboratory Manual beschriebenen alkalischen SDS-Verfahren präpariert und als Matrizen für die DNA-Sequenzanalyse verwendet. Die Nucleotidsequenz des humanen OCIF-Gens ist in der Sequenz Nr. 104 und der Sequenz Nr. 105 präsentiert. Die Nucleotidsequenz der DNA zwischen Exon 1 und Exon 2 wurde nicht vollständig bestimmt. Es gibt ein Stück von etwa 17 kb Nucleotiden zwischen den in Sequenz Nr. 104 und Sequenz Nr. 105 dargestellten Sequenzen.
24. BEISPIEL
Quantitative Bestimmung von OCIF durch EIA
i) Präparation von Anti-OCIF-Antikörpern
Männliche JW-Kaninchen (Kitayama LABES Co., LTD) mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,0 kg wurden zur Immunisierung für die Herstellung von Antisera verwendet. Drei männliche JW-Kaninchen (Kitayama LABES Co., LTD) mit einem Gewicht von 2,5 bis 3,9 kg wurden zur Immunisierung verwendet. Zur Immunisierung wurde eine Emulsion durch Vermischen eines gleichen Volumens von rOCIF (200 μg/ml) und komplettem Freundschem Adjuvans (Difco, Cat. 0638-60-7) hergestellt. Die Kaninchen wurden sechs Mal im Abstand von einer Woche mit 1 ml Emulsion je Injektion subkutan immunisiert. Die Kaninchen erhielten sechs Mal im Abstand von sieben Tagen eine subkutane Injektion. Vollblut wurde zehn Tage nach der letzten Immunisierung erhalten und Serum wurde getrennt. Antikörper wurden von dem Serum wie folgt gereinigt. Antiserum wurde zweifach mit PBS verdünnt. Nach der Zugabe von Ammoniumsulfat auf eine Endkonzentration von 40% (w/v) ließ man das Antiserum 1 Stunde lang bei 4°C stehen.
Präzipitat, das durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 8000 × g erhalten wurde, wurde in einem kleinen PBS-Volumen gelöst und gegen PBS dialysiert. Die resultierende Lösung wurde auf eine Protein-G-Sepharose-Säule (Pharmacia) geladen. Nach einer Wäsche mit PBS wurde absorbiertes Immunglobulin G mit 0,1 M Glycin-HCL-Puffer (pH 3,0) eluiert. Eluate wurden sofort mit 1,5 M Tris-HCL-Puffer (pH 8,7) neutralisiert und gegen PBS dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde durch Absorbanz bei 280 nm bestimmt (E¹³ 13.5).
Meerrettichperoxidase-markierter Antikörper wurde mit dem ImmunoPure Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Pierce, Cat. 31494) präpariert. Kurz, 1 mg IgG wurde mit 80 μg N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetat 30 Minuten lang inkubiert. Nach einer Deacetylierung mit 5 mg Hydroxylamin HCl wurde modifiziertes IgG mit einer Polyacrylamid-Entsalzungssäule getrennt. Der mit 1 mg Maleimidaktivierter Meerrettichperoxidase vermischte Protein-Pool wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.
ii) Quantitative Bestimmung von OCIF durch Sandwich-EIA
Mikrotiterplatten (Nunc MaxiSorp Immunoplate) wurden mit Kaninchen-Anti-OCIF-IgG durch Inkubieren von 0,2 μg in 100 μl 50 mM Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Blockieren der Platten durch 1-stündiges Inkubieren bei 37°C mit 300 μl 25% BlockAce/PBS (Snow Brand Milk Products) wurden 100 μl der Proben 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen der Platten mit PBST (PBS mit 0,05% Tween 20) wurden 100 μl von 1 : 10000fach verdünntem Meerrettichperoxidase-markiertem Anti-OCIF-IgG zugegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die OCIF-Menge wurde durch Inkubieren mit 100 μl einer Substratlösung (TMB, Scy Tek Lab., Cat. TM4999) und Messen der Absorbanz bei 450 nm mit einem ImmunoReader (Nunc NJ2000) bestimmt. Gereinigter rekombinanter OCIF wurde als Standardprotein verwendet; eine typische Standardkurve ist in 13 dargestellt.
25. BEISPIEL
Monoklonaler Anti-OCIF-Antikörper
i) Präparation von Hybridomen, die monoklonalen Anti-OCIF-Antikörper erzeugen
OCIF wurde mit dem im Beispiel 11 beschriebenen Reinigungsverfahren aus Kulturmedium von humanen Fibroblasten, IMR-90, auf Homogenität gereinigt. Gereinigter OCIF wurde in PBS mit einer Konzentration von 10 μg/100 μl gelöst. BALB/c Mäuse wurden durch dreimaliges intraperitoneales Verabreichen dieser Lösung im Abstand von zwei Wochen immunisiert. Im Rahmen der ersten und zweiten Immunisierung wurde die Emulsion, die aus einem gleichen Volumen von OCIF und komplettem Freundschem Adjuvans bestand, verabreicht. Drei Tage nach der letzten Verabreichung wurde die Milz entfernt, Lymphozyten wurden isoliert und mit Maus-Myelom-p3x63-Ag8.653-Zellen gemäß dem konventionellen Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert. Anschließend wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium kultiviert, um Hybridome zu selektieren. Zur Prüfung, ob die selektierten Hybridome Anti-OCIF-Antikörper produzierten, wurden anschließend Anti-OCIF-Antikörper in jedem Kulturmedium von Hybridomen durch Festphasen-ELISA bestimmt, der durch Beschichten jedes Wells von 96-Well-Immunoplatten (Nunc) mit 100 μl gereinigtem OCIF (10 μg/ml in 0,1 M NaHCO₃) und durch Blockieren jedes Wells mit 50% BlockAce (Snow Brand Milk Products Co. Ltd.) präpariert wurde. Die Anti-OCIF-Antikörper sekretierenden Hybridomklone wurden durch 3–5maliges Klonieren durch Grenzwertverdünnung und durch Screenen mit dem obigen Festphasen-ELISA ermittelt. Von den so erhaltenen Hybridomklonen wurden mehrere Hybridomklone mit hoher Anti-OCIF-Antikörper-Produktion ausgewählt.
ii) Produktion von monoklonalen Anti-OCIF-Antikörpern
Jeder Anti-OCIF-Antikörper sekretierende Hybridomklon, der im BEISPIEL 25 i) erhalten wurde, wurde intraperitoneal in Mäuse, denen Pristane (Aldrich) verabreicht worden war, mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/Maus transplantiert. Die akkumulierten Ascites wurden 10–14 Tage nach der Transplantation aufgefangen und es wurden Ascites erhalten, die monoklonalen anti-OCIF-spezifischen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung enthielten. Gereinigte Antikörper wurden durch Affigel-Protein-A-Sepharose-Chromatographie (BioRad) gemäß Herstelleranweisungen erhalten. Das heißt, die Ascites wurden mit einem gleichen Volumen eines Bindepuffers (BioRad) verdünnt und auf eine Protein-A-Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit einem ausreichenden Volumen des Bindepuffers gewaschen und mit einem Elutionspuffer (BioRad) eluiert. Nach dem Neutralisieren wurde das erhaltene Eluat in Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert. Die Reinheit des erhaltenen Antikörpers wurde durch SDS/PAGE analysiert und es wurde eine homogene Bande mit einer relativen Molekülmasse von etwa 150.000 nachgewiesen.
iii) Selektion von monoklonalem Antikörper mit hoher Affinität zu OCIF
Jeder im BEISPIEL 25 ii) erhaltene Antikörper wurde in PBS gelöst, und die Proteinkonzentration in der Lösung wurde durch das Verfahren von Lowry bestimmt. Jede Antikörperlösung mit der gleichen Konzentration wurde präpariert und dann seriell verdünnt mit PBS. Monoklonale Antikörper, die OCIF selbst bei hoch verdünnter Lösung erkennen können, wurden durch den im BEISPIEL 25 ii) beschriebenen Festphasen-ELISA selektiert. Folglich können drei monoklonale Antikörper A1G5, E3H8 und D2F4 selektiert werden.
iv) Bestimmung der Klasse und Unterklasse von Antikörpern
Die Klasse und Unterklasse der erfindungsgemäßen Antikörper, die im BEISPIEL 25 iii) erhalten wurden, wurde mit einem Immunglobulin-Klasse- und Unterklasse-Analysekit (Amersham) analysiert. Das Verfahren fand gemäß dem in der Bedienungsanleitung beschriebenen Protokoll statt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 enthalten. Die erfindungsgemäßen Antikörper E3H8, A1G5 und D2F4 gehören jeweils zu IgG₁, IgG_2a und IgG_2b.
Tabelle 15
v) Bestimmung von OCIF durch ELISA
Drei Arten von monoklonalen Antikörpern, A1G5, E3H8 und D2F4, die im BEISPIEL 25 iv) erhalten wurden, wurden jeweils als Festphasenantikörper und enzymmarkierte Antikörper verwendet. Der Sandwich-ELISA wurde durch die jeweilige Kombination von Festphasenantikörper und markiertem Antikörper konstruiert. Der markierte Antikörper wurde mit dem ImmunoPure Maleimide Activated Horseradish Peroxidase Kit (Pierce, Cat. No. 31494) präpariert. Jeder monoklonale Antikörper wurde in 0,1 M NaHCO₃ mit einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst und 100 μl der Lösung wurden in jedes Well von 96-Well-Immunoplatten (Nunc, MaxiSorp Cat. No. 442404) gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde jedes Well in den Platten mit 50% Blockace (Snow Brand Milk Products, Co., Ltd) bei Raumtemperatur 50 Minuten lang blockiert und dann dreimal mit PBS mit 0,1% Tween 20 (Waschpuffer) gewaschen.
Eine Reihe von OCIF-Konzentrationen wurde durch Verdünnen von OCIF mit einem 1. Reaktionspuffer (0,2 M Tris-HCl Puffer, pH 7,4, mit 40% Blockace und 0,1% Tween 20) hergestellt. Jedes Well von 96-Well-Immunoplatten wurde mit 100 μl der jeweiligen Konzentrationen der hergestellten OCIF-Lösung gefüllt, 3 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen und anschließend dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Zur Verdünnung von POD-markiertem Antikörper wurde ein 2. Reaktionspuffer (0,1 M Tris-HCl Puffer, pH 7,4, mit 25% Blockace und 0,1% Tween 20) verwendet. POD-markierter Antikörper wurde 400fach mit dem 2. Reaktionspuffer verdünnt und 100 μl der verdünnten Lösung wurden in jedes Well der Immunoplatten gegeben. Jede Immunoplatte wurde 2 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen und anschließend dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Nach der Wäsche wurden 100 μl einer Substratlösung (0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,5, mit 0,4 mg/ml o-Phenylendiamin-HCl und 0,006% H₂O₂) in jedes Well der Immunoplatten gegeben, und die Immunoplatten wurden 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 6 N H₂SO₄ zu jedem Well beendet. Die optische Dichte jedes Wells wurde bei 492 nm mit einem Immunoreader (ImmunoReader NJ 2000, Nunc) bestimmt.
Unter Verwendung von drei Arten monoklonaler Antikörper in der vorliegenden Erfindung führt jede Kombination von Festphasen- und POD-markierten Antikörpern zu einer genauen OCIF-Bestimmung. In der vorliegenden Erfindung wurde jeder monoklonale Antikörper bestätigt, um ein anderes Epitop von OCIF zu erkennen. Eine typische Standardkurve von OCIF unter Verwendung einer Kombination von Festphasenantikörper A1G5 und POD-markiertem Antikörper E3H8 ist in 14 dargestellt.
vi) Bestimmung von OCIF in Humanserum
Die OCIF-Konzentration wurde in fünf Proben von normalem Humanserum mit dem im BEISPIEL 25 v) beschriebenenen EIA-System bestimmt. Die Immunoplatten wurden mit A1G5 wie im BEISPIEL 25 v) beschrieben beschichtet und 50 μl des 1. Reaktionspuffers wurden in jedes Well der Immunoplatten gegeben. Anschließend wurden 50 μl jedes Humanserums in die jeweiligen Wells der Immunoplatten gegeben. Die Immunoplatten wurden 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert und dann dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Nach der Wäsche wurde jedes Well der Immunoplatten mit 100 μl POD-E3H8 Antikörper befüllt, der 400fach mit dem 2. Reaktionspuffer verdünnt war, und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dem dreimaligen Waschen der Immunoplatten mit dem Waschpuffer wurden 100 μl der im BEISPIEL 25 v) beschriebenen Substratlösung in die jeweiligen Wells gegeben und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 6 N H₂SO₄ zu den jeweiligen Wells der Immunoplatten beendet. Die optische Dichte jedes Wells wurde bei 492 nm mit einem Immunoreader (ImmunoReader NJ 2000, Nunc) bestimmt.
Der 1. Reaktionspuffer, der die bekannte OCIF-Menge enthielt, wurde in der gleichen Weise behandelt, und es wurde die in 2 dargestellte Standardkurve von OCIF erhalten. Mit der Standardkurve von OCIF wurde die OCIF-Menge in der Humanserumprobe ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt.
Tabelle 14
26. BEISPIEL
Therapeutische Wirkung auf Osteoporose
(1) Verfahren
Bei männlichen Fischer-Ratten im Alter von 6 Wochen wurde das linke Vorderglied denerviert. Diese Ratten wurden vier Gruppen (10 Ratten/Gruppen) zugeordnet und wie folgt behandelt; Gruppe A, Ratten-Sham-Gruppe ohne Verabreichung; Gruppe B, denervierte Ratten mit intravenöser Vehikel-Verabreichung; Gruppe C, denervierte Ratten, denen OCIF intravenös in einer Dosis von 5 μg/kg zweimal pro Tag verabreicht wurde; Gruppe D, denervierte Ratten, denen OCIF intravenös in einer Dosis von 50 μg/kg zweimal pro Tag verabreicht wurde. Nach der Denervierung wurde OCIF 14 Tage lang täglich verabreicht. Nach 2 Wochen der Behandlung wurden die Tiere geopfert und ihre Vordergliedmaßen wurden seziert. Anschließend wurden die Knochen hinsichtlich der mechanischen Festigkeit getestet.
(2) Ergebnisse
Bei den Tieren der Kontrollgruppen wurde im Vergleich zu den Tieren der normalen Gruppen ein Rückgang der Knochenfestigkeit beobachtet, wohingegen die Knochenfestigkeit in den Gruppen der Tiere, die 50 mg OCIF je kg Körpergewicht erhielten, zunahm.
Industrielle Verfügbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Protein, das die Bildung von Osteoklasten inhibiert, sowie ein effizientes Verfahren zur Herstellung des Proteins bereit. Das erfindungsgemäße Protein hat eine Aktivität zur Hemmung der Osteoklastenbildung. Das Protein ist zur Behandlung vieler Krankheiten in Verbindung mit Knochenverlust, wie Osteoporose, und als ein Antigen nützlich, das für die immunologische Diagnose solcher Krankheiten verwendet werden kann.
Bezugnahme auf den hinterlegten Mikroorganismus Name und Adresse der Hinterlegungsstelle
(Er wurde von Bikkoken Nr. P-14998 übertragen (Hinterlegungsdatum 21. Juni 1995). Übertragungsdatum: 25. Oktober 1995.)
Beitrittsnummer: FERM PB-5267

Claims

OCIF-Protein, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften: a) eine relative Molekülmasse nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE): von etwa 60 kD unter reduzierenden Bedingungen; von etwa 60 kD und 120 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen; b) eine hohe Affinität zur Kationenaustauschsäule und Heparinsäule; c) eine biologische Aktivität zur Hemmung einer Osteoklastendifferenzierung und/oder -maturation, wobei die Aktivität durch 10-minütiges Erwärmen auf 70°C oder 30-minütiges Erwärmen auf 56°C verringert wird; die Aktivität bei einer 10-minütigen Erwärmung auf 90°C verloren geht; d) interne Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 1, 2 und 3.
Protein nach Anspruch 1 mit N-terminalen Aminosäuresequenzen aus SEQ ID Nr. 7.
In humanen Fibroblasten produziertes Protein nach Anspruch 1.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, 2 oder 3, umfassend den folgenden Prozess: Kultivieren humaner Fibroblasten; und Reinigen des Proteins durch eine Kombination aus Ionenaustauschsäulen-, Affinitätssäulen- und Umkehrphasensäulenchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 4, umfassend das Kultivieren humaner Fibroblasten auf Tonerde-Keramik-Stücken.
OCIF-Protein mit einer Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 4.
OCIF cDNA, die eine Aminsäuresequenz aus SEQ ID Nr. 4 kodiert.
OCIF cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 5 kodiert.
OCIF cDNA, die in einen Vektor als 1,6 Kb Fragment eingesetzt ist, das von transformiertem Escherichia coli pBK/01F10 (FERMBP-5267) getragen wird.
OCIF cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr: 6.
OCIF cDNA, die mit cDNA der SEQ ID Nr. 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
OCIF-Protein, exprimiert von cDNA, die eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 kodiert.
OCIF-Protein mit einer biologischen Aktivität zur Hemmung einer Osteoklastendifferenzierung und/oder -maturation, das als aminosäureexprimierte cDNA erhalten wird, die zu wenigstens 80% identisch mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 ist.
Gentechnisches Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 unter Verwendung von cDNA nach einem der Ansprüche 7 bis 11.
Protein nach Anspruch 1, wobei das genannte Protein mit dem Verfahren aus Anspruch 14 erhältlich ist.
Gentechnisches Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 12 unter Verwendung von Säugetierzellen als Wirtszellen.
Gentechnisches Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 16 unter Verwendung von 293/EBNA-Zellen oder CHO-Zellen als Säugetierwirtszellen.
Protein nach Anspruch 6 oder 12, wobei das genannte Protein mit dem Verfahren aus Anspruch 16 oder 17 erhältlich ist.
OCIF-Variante, Mutante oder verkürzte cDNA, ausgewählt aus: einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 8; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 10; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 12; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 14; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 83; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 84; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 85; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 86; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 87; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 88; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 89; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 90; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 91; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 92; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 93; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 94; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 95; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 96; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 97; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 98; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 99; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 100; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 101; einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 102; und einer cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 103.
Protein, das durch eine cDNA kodiert ist, die aus den in Anspruch 19 genannten ausgewählt ist.
OCIF-Variante, Mutante oder verkürzte cDNA, ausgewählt aus: cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 9 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 11 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 13 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 15 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 62 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 63 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 64 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 65 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 66 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 67 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 68 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 69 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 70 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 71 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 72 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 73 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 74 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 75 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 76 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 77 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 78 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 79 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 80 kodiert; cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 81 kodiert; und cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 82 kodiert.
Genomische OCIF DNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 5 kodiert.
Genomische DNAs nach Anspruch 22 mit der Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 104 oder 105.
OCIF-Variante, Mutante oder verkürztes Protein, ausgewählt aus: einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 373 der SEQ ID Nr. 9; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 341 der SEQ ID Nr. 11; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 133 der SEQ ID Nr. 13; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 124 der SEQ ID Nr. 15; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 380 der SEQ ID Nr. 62; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 380 der SEQ ID Nr. 63; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 380 der SEQ ID Nr. 64; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 380 der SEQ ID Nr. 65; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 380 der SEQ ID Nr. 66; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 339 der SEQ ID Nr. 67; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 338 der SEQ ID Nr. 68; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 342 der SEQ ID Nr. 69; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 338 der SEQ ID Nr. 70; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 305 der SEQ ID Nr. 71; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 306 der SEQ ID Nr. 72; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 378 der SEQ ID Nr. 73; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 330 der SEQ ID Nr. 74; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 251 der SEQ ID Nr. 75; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 176 der SEQ ID Nr. 76; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 122 der SEQ ID Nr. 77; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 85 der SEQ ID Nr. 78; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 372 der SEQ ID Nr. 79; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 300 der SEQ ID Nr. 80; einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 166 der SEQ ID Nr. 81; und einem Protein mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurezahlen 1 bis 63 der SEQ ID Nr. 82.
OCIF DNA, die ein Protein nach Anspruch 24 kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 1–3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 und 24.
Antikörper mit spezifischer Aktivität für ein Protein nach einem der Ansprüche 1–3, 6, 12–13, 15, 18, 20 und 24.
Antikörper nach Anspruch 27, der ein polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 27, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 29, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften: relative Molekülmasse von etwa 150.000 und der Unterklasse IgG₁, IgG_2a oder IgG_2b.
Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des OCIF-Proteins unter Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 27 bis 30.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1–3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 und 24 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von Osteoporose.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1–3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 und 24 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von Knochenschwund.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1–3, 6, 12, 13, 15, 18, 20 und 24 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von abnormem Knochenmetabolismus.
Vektor, in den eine der folgenden cDNA (a) bis (d) eingesetzt ist: (a) OCIF cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 4 kodiert; (b) OCIF cDNA mit einer Nucleotidsequenz aus SEQ ID Nr. 6; (c) OCIF cDNA, die eine Aminosäuresequenz aus SEQ ID Nr. 5 kodiert; (d) OCIF cDNA, die in einen Vektor als 1,6 Kb Fragment eingesetzt ist, das vom transformierten Escherichia coli pBK/01F10 (FERM BP-5267) getragen wird und ein Protein mit einer biologischen Aktivität zur Hemmung von Osteoklastendifferenzierung und/oder Maturation kodiert.
Vektor nach Anspruch 35, wobei der genannte Vektor vom transformierten Escherichia coli pBK/01F10 (FERM BP-5267) getragen wird.
Wirtszelle, in die der Vektor nach Anspruch 35 oder 36 eingeführt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren die Schritte (I) bis (II) umfasst: (I) Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 37; (II) Wiedergewinnen des genannten Proteins aus der erhaltenen Kultur.
Protein nach Anspruch 1, wobei das genannte Protein mit dem Verfahren aus Anspruch 38 erhältlich ist.
Transformiertes Escherichia coli pBK/01F10 (FERM BP-5267).