DE69837601T2

DE69837601T2 - Neuer hemmer der differentierung

Info

Publication number: DE69837601T2
Application number: DE69837601T
Authority: DE
Inventors: Seiji Fuji-shi SAKANO
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-05-14
Also published as: AU7236598A; JP4171528B2; DK1004669T3; US6664098B1; US20030049788A1; WO1998051799A1; EP1004669A1; JP4714235B2; JP2008260773A; EP1004669B1; CA2288218C; CA2288218A1; JP2008260772A; DE69837601D1; AU730782B2; EP1004669A4; JP4801695B2; ES2284205T3; US7022499B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine neue bioaktive Substanz.
Stand der Technik
Blut und Lymphe des Menschen enthalten verschiedene Typen von Zellen, und jede Zelle spielt bedeutende Rollen. Zum Beispiel trägt der Erythrozyt Sauerstoff; Blutplättchen besitzen hämostatische Wirkung; und Lymphozyten verhindern bzw. schützen vor Infektion. Diese verschiedenen Zellen stammen von hämatopoietischen Stammzellen im Knochenmark ab. Kürzlich wurde es aufgeklärt, dass die hämatopoietischen Stammzellen durch die Stimulation durch verschiedene Cytokine in vivo und Umweltfaktoren zu verschiedenen Blutzellen, Osteoklasten und Mastzellen differenziert werden. Unter den Cytokinen hat man beispielsweise Erythropoietin(EPO) für die Differenzierung zu Erythrozyten; Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor(G-CSF) für die Differenzierung zu Leukozyten; und Plättchenwachstumsfaktor(mpl-Ligand) für die Differenzierung zu Megakaryozyten, welche Blutplättchenproduzierende Zellen sind, gefunden, und die beiden Erstgenannten sind bereits klinisch angewandt worden.
Die undifferenzierten Blutzellen werden im Allgemeinen in zwei Gruppen klassifiziert, die aus Blutvorläuferzellen, welche dazu bestimmt sind, zu spezifischen Blut-Reihen zu differenzieren, und hämatopoietischen Stammzellen, welche Differenzierungsvermögen zu allen Reihen und Selbstreplikations-Aktivität besitzen, bestehen. Die Blutvorläuferzellen können durch verschiedene Kolonie-Assays identifiziert werden, allerdings ist ein Identifizierungsverfahren für die hämatopoietischen Stammzellen nicht etabliert worden. In diesen Zellen stimulieren Stammzell-Faktor(SCF), Interleukin-3(IL-3), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor(GM-CSF), Interleukin-6(IL-6), Interleukin-1(IL-1), Granulozyten- Kolonie-stimulierender Faktor(G-CSF) und Onkostatin M berichtetermaßen die Zelldifferenzierung und -proliferation.
Versuche zur Expansion von hämatopoietischen Stammzellen in vitro sind erprobt worden, um eine Knochenmarktransplantation durch Anwenden einer hämatopoietischen Stammzell-Transplantationstherapie oder Gentherapie zu ersetzen. Wenn jedoch die hämatopoietischen Stammzellen in Gegenwart der oben genannten Cytokine kultiviert werden, verschwinden die Mehrfach-Differenzierungs-Aktivitäten und Selbstreplikations-Aktivitäten, die ursprünglich auf der Ebene der hämatopoietischen Stammzellen vorliegen, schrittweise, und sie werden zu den Blutzellvorläufern umgeändert, welche nach 5 Wochen Kultivierung nur zu spezifischen Serien differenzieren können, und die Mehrfach-Differenzierungs-Aktivität, die eines der spezifischen Merkmale der hämatopoietischen Stammzellen ist, geht verloren (Wagner et al., Blood 86, 512–523, 1995).
Für die Proliferation der Blutvorläuferzellen ist ein einzelnes Cytokin nicht ausreichend, um zu wirken, sondern die synergistische Wirkung mehrerer Cytokine ist bedeutend. Folglich ist es, um die hämatopoietischen Stammzellen unter Beibehaltung der spezifischen Merkmale der hämatopoietischen Stammzellen zu proliferieren, notwendig, Cytokine zuzusetzen, welche die Differenzierung unterdrücken, zusammen mit den Cytokinen, welche die undifferenzierten Blutzellen proliferieren und differenzieren. Im Allgemeinen sind viele Cytokine, welche die Proliferation oder Differenzierung von Zellen stimulieren, bekannt, aber man kennt nur eine kleine Zahl von Cytokinen, welche die Zelldifferenzierung unterdrücken. Zum Beispiel besitzt der Leukämie-inhibitorische Faktor(LIF) eine Wirkung auf die Proliferation von embryonalen Stammzellen der Maus ohne Differenzierung, aber er besitzt keine Wirkung gegenüber den hämatopoietischen Stammzellen oder Blutvorläuferzellen. Transformierender Wachstumsfaktor (TGF-β) besitzt eine unterdrückende Wirkung hinsichtlich der Proliferation gegenüber verschiedenen Zellen, aber keine festgelegten Wirkungen gegenüber den hämatopoietischen Stammzellen oder Blutvorläuferzellen.
Man nimmt an, dass nicht nur Blutzellen sondern auch undifferenzierte Zellen, speziell Stammzellen, an der Geweberegeneration beteiligt sind. Diese Regeneration von Geweben und Proliferation von undifferenzierten Zellen in jedem Gewebe können auf verschiedenen Wegen angewandt werden; zur Bezugnahme sei auf die bekannte Literaturstelle verwiesen (Katsutoshi Yoshizato, Regeneration – a mechanism of regeneration, 1996, Yodosha Publ. Co.).
"Notch" ist ein Membranprotein vom Rezeptortyp, welches an der Regulierung der Nervenzelldifferenzierung beteiligt ist und welches in Drosophila gefunden wird. Homologe von "Notch" werden in verschiedenen Tierarten gefunden, was bis zu den Wirbellosen und Wirbeltieren reicht, einschließlich Nematoden (Lin-12), Xenopus laevis (Xotch), Maus (Motch) oder Mensch (TAN-1).
Der Ligand von Notch in Drosophila ist bekannt. Bei diesen handelt es sich um Drosophila Delta (Delta) und Drosophila Serrate (Serrate). Homologe der Notch-Liganden werden in verschiedenen Tierarten gefunden, wie es in ähnlicher Weise auch bei Notch-Rezeptoren der Fall ist (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995).
Das humane Notch-Homolog, TAN-1, wird in weitem Umfang in Geweben in vivo vorgefunden (Ellisen et al., Cell 66, 649–661, 1991). Drei Notch-analoge Moleküle, welche von TAN-1 verschieden sind, wurden beschrieben (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995). Man stellte auch eine Expression von TAN-1 in CD34-positiven Zellen in Blutzellen mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) fest (Milner et al., Blood 83, 2057–2062, 1994). Allerdings sind, in Hinsicht auf den Menschen, Gen- und Aminosäuresequenzen von humanem Delta und humanem Serrate, bei welchen es sich angenommenerweise um den Notch-Liganden handelt, als wissenschaftliche Berichte bis zum April 1997 nicht aufgeführt worden.
Für Drosophila-Notch wurde die Bindung mit dem Liganden ausführlich untersucht und erforscht, und es wurde festgestellt, dass Notch an den Liganden mit Ca++ an der Bindungsregion gebunden werden kann, welche eine wiederholte Aminosäuresequenz Nr. 11 und Nr. 12 in der Aminosäuresequenz-Wiederholung der zu epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) ähnlichen Wiederholungseinheit ist (Fehon et al., Cell 61, 523–534, 1990, Rebay et al., ebenda 67, 687–699, 1991, und die Internationale Veröffentlichung WO 92/19734). EGF-ähnliche, wiederholte Sequenzen sind in Notch-Homologen von anderen Spezies konserviert. Folglich wird der gleiche Mechanismus bei der Bindung mit einem Liganden angenommen. Eine Aminosäuresequenz, welche als DSL (Delta-Serrate-Lag-2) bezeichnet wird, nahe dem Aminosäure-Terminus, und EGF-ähnliche, wiederholte Sequenz, wie in dem Rezeptor, sind in dem Liganden konserviert (Artavanis-Tsakonas et al., Science 268, 225–232, 1995).
Eine EGF-ähnliche Sequenz ist in Thrombomodulin (Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8834–8838, 1986), Niedrigdichte-Lipoprotein(LDL)-Rezeptor (Russell et al., Cell 37, 577–585, 1984) und Blut-Gerinnungs-Faktor (Furie et al., Cell 53, 505–518, 1988) gefunden worden, und von ihr wird angenommen, bedeutsame Rollen bei der extrazellulären Coagulation und Adhäsion zu spielen.
Kürzlich wurden die Wirbeltier-Homologe des klonierten Drosophila-Delta im Huhn (C-Delta-1) und in Xenopus laevis (X-Delta-1) gefunden, und es wurde berichtet, dass X-Delta-1 über Xotch bei der Erzeugung des Protoneurons wirkt (Henrique et al., Nature 375, 787–790, 1995, und Chitnis et al., ebenda, 375, 761–766, 1995). Das Wirbeltier-Homolog von Drosophila Serrate wurde in der Ratte als Ratten-Jagged (Jagged) gefunden (Lindsell et al., Cell 80, 909–917, 1995). Gemäß Lindsell et al. wird mRNA von Ratten-Jagged im Rückenmark von fötalen Ratten nachgewiesen. Als ein Ergebnis der Cokultivierung einer Myoblasten-Zelllinie, welche gezwungen wurde, Ratten-Notch im Überschuss zu exprimieren, mit einer Ratten-Jagged-Expressionszelllinie wird eine Unterdrückung der Differenzierung der Myoblasten-Zelllinie festgestellt. Allerdings weist Ratten-Jagged keine Wirkung gegenüber der Myoblasten-Zelllinie ohne erzwungene Expression von Ratten-Notch auf.
Ich bzw. Erfinder habe/hat die Hypothese aufgestellt, dass Notch und sein Ligand die Wirkung der Differenzierungs- bzw. differenziellen Regulation nicht nur für Neuroblasten und Myoblasten aufweisen, sondern auch für verschiedene undifferenzierte Zellen, insbesondere undifferenzierte Blut-Zellen. Allerdings bestehen im Fall der klinischen Anwendung im Menschen bei den früher bekannten Liganden vom Notch-Typ verschiedener Spezies, wie Huhn oder Xenopus laevis, Probleme hinsichtlich der Speziesspezifitäten und der Antigenizitäten. Folglich ist der Erhalt eines vormalig unbekannten, humanen Notch-Liganden grundlegend erforderlich. Ich hatte eine Vorstellung bzw. die Idee, dass ein Molekül, welches eine DSL-Domäne und eine EGF-ähnliche Domäne aufweist, die den Notch-Ligandenmolekülen und einem Liganden des humanen Notch (TAN-1 etc.) gemeinsam sind, welcher ein humanes Delta-Homolog (hierin nachstehend bezeichnet als humanes Delta) und humanes Serrate-Homolog (hierin nachstehend bezeichnet als humanes Serrate) ist, gefunden werden kann. Des Weiteren hatte ich eine Idee, dass diese Feststellungen bzw. Befunde ein Kandidat für ein Arzneimittel sein können, das für die differenzielle Regulierung von undifferenzierten Zellen nützlich ist. Daher habe ich versucht, selbiges herauszufinden.
Als ein Ergebnis habe ich, in der vorangehenden Patentanmeldung, eine Genklonierung von drei Typen von Molekülen, einschließlich humanen Delta-1-, humanen Serrate-1- und humanen Serrate-2-Molekülen, als den humanen Notch-Ligandenmolekülen, durchgeführt und festgestellt, dass diese Moleküle eine Wirkung auf undifferenzierte Blutzellen aufweisen (vergleiche die WO 97/19172 Differenzierungs-unterdrückendes Polypeptid, und die WO 98/02458 Differenzierungs-Inhibitor).
Hinsichtlich des humanen Notch-Ligandenmoleküls sind, gemäß eines vor Kurzem verfassten Berichts, partielle Gen- und partielle Aminosäure-Sequenzen des humanen Delta-1-ähnlichen Moleküls, welche allerdings unvollständig und Sequenzen von nicht vollständiger Länge sind, in der Internationalen Veröffentlichung WO 97/01571 offenbart worden. Ferner offenbart die WO 96/27610 Volllängen-Gen- und Volllängen-Aminosäure-Sequenzen von humanem Serrate-1 (humanes Jagged-1). Des Weiteren offenbart die WO 96/27610 Gensequenzen von partieller Länge und Aminosäuresequenzen von partieller Länge von humanem Serrate-2 (humanes Jagged-2). Diese Gensequenz könnte unrichtige Sequenzen aufweisen, und diese Gensequenz erzeugt eine Rasterverschiebung, der zu einer völlig verschiedenen Aminosäuresequenz von unserer WO 98/02458, "Differenzierungs-Inhibitor", führt. Darüber hinaus offenbarte der besagte Stand der Technik keine Genklonierung von Amino-Termini bzw. Amino-Enden. Folglich sind die Gensequenzen und Aminosäuresequenzen unvollständig. Als ein Ergebnis der Durchsuchung der Gensequenz-Datenbank Genebank, Ausgabe 98 (Dezember 1996), finden sich vier Einträge über humanes Serrate-1, d.h. die Registrierungs-Nr. HSU61276, HSU73936, HSU77720 und HSU77914, wobei jedoch keine anderen humanen Notch-Ligandenmoleküle in der Datenbank aufzufinden sind.
Von der Erfindung zu lösende Probleme
Die Probleme der vorliegenden Erfindung bestehen darin, die Gensequenz und Aminosäuresequenz der neuen Notch-Ligandenmoleküle, welche verschieden von den drei oben genannten Molekülen sind, aufzuklären und das neue Notch-Ligandenmolekül bereitzustellen und ein neues therapeutisches Verfahren unter Verwendung der Moleküle vorzusehen.
Methoden zur Lösung der Probleme
Um nach neuen humanen Notch-Liganden zu suchen, habe ich eine Kreuzhybridisierung unter Verwendung des oben erwähnten humanen Delta-1-Gens durchgeführt.
Um das humane Delta-1-Gen zu erhalten, können die in den Referenzbeispielen 1 und 2 und in der WO 97/19172 angewandten Verfahren eingesetzt werden. Transformierte Zellen, bei welchen ein Vektor pUCDL-1, welcher cDNA enthält, die für die gesamte Aminosäuresequenz von humanem Delta-1 codiert, d.h. DNA, welche die Sequenz von Nr. 179 bis Nr. 2347 in SEQ ID Nr. 8 enthält, in E. coli JM109 eingebracht ist, sind beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, als Dauer-Kultur-Sammlung E. coli: JM109-pUCDL-1F hinterlegt worden. Das Hinterlegungsdatum war der 28. Oktober 1996, als Hinterlegungs-Nr. FERM BP-5728.
Ich habe verschiedene Längen von partiellen Genen dieses humanen Delta-1-Gens hergestellt. Unter Verwendung dieser partiellen Längen von Genen als Sonden, habe ich versucht, viele cDNA-Bibliotheken unter verschiedenen Hybridisierungsbedingungen zu screenen, um einen neuen Notch-Liganden durch das Kreuzhybridisierungs-Verfahren zu finden.
Als ein Ergebnis umfangreicher Untersuchungen gelang mir die Isolierung von cDNA, welche die Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 codiert, einem neuen Molekül, welches die DSL-Domäne aufweist, die den Notch-Ligandenmolekülen aus humaner fötaler Lungen-cDNA-Bibliothek gemeinsam ist, und ich habe die Expressionssysteme für das Protein mit verschiedenen Formen unter Verwendung der cDNA hergestellt. Des Weiteren haben wir ein Aufreinigungsverfahren für die Proteine etabliert, welche gereinigt und isoliert wurden.
Die Aminosäuresequenzen von neuem humanem Delta-2 sind in den Sequenzauflistungen, SEQ ID Nr. 1–3, gezeigt. Die DNA-Sequenz, welche diese Sequenzen codiert, wird in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 gezeigt.
Physiologische Wirkungen dieser hergestellten Proteine wurden unter Verwendung vieler Typen von Zellen, zum Beispiel undifferenzierter Nervenzellen, Prä-Adipozyten, Hepatozyten, Myoblasten, undifferenzierter Hautzellen, undifferenzierter Blutzellen und undifferenzierter Immunzellen, gesucht. Als ein Ergebnis habe ich festgestellt, dass neues humanes Delta-2 eine differenzierungsunterdrückende Wirkung gegen undifferenzierte Blutzellen aufwies und eine physiologische Wirkung zur Beibehaltung des undifferenzierten Zustands hatte. Ferner habe ich festgestellt, dass das Molekül das Wachstum von Gefäß-Endothelzellen unterdrückt.
Es wurden keine signifikanten toxischen Wirkungen in den Toxizitätsuntersuchungen an Mäusen bemerkt, und nützliche pharmazeutische Effekte wurden nahegelegt. Folglich sind die pharmazeutischen Präparate, welche das Molekül der vorliegenden Erfindung enthalten, Medium, welches das Molekül der vorliegenden Erfindung enthält, und die Vorrichtung, an der das Molekül der vorliegenden Erfindung immobilisiert ist, neue Arzneimittel und medizinische Materialien, welche die undifferenzierten Blutzellen im undifferenzierten Zustand halten können. Antikörper gegen humanes Delta-2 wird durch Verwenden von Antigen des humanen Delta-2 hergestellt, und ein Aufreinigungsverfahren der Antikörper wird etabliert. Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung vervollständigt worden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid, das wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls umfasst, und ein Polypeptid, das wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Polypeptide, welche eine differenzierungsunterdrückende Wirkung gegen undifferenzierte Blutzellen aufweisen, und die Unterdrückung des Wachstums von Gefäßzellen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Polypeptide umfasst, und die pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine differenzierungsunterdrückende Wirkung gegen Zellen aufweist, die pharmazeutische Zusammensetzung, wobei die Zellen undifferenzierte Blutzellen sind, und die pharmazeutische Zusammensetzung, welche das Wachstum von Gefäßzellen unterdrückt. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Zellkulturmedium, das die Polypeptide umfasst, das Zellkulturmedium, wobei die Zellen undifferenzierte Blutzellen sind, und ein Material, an dem das Polypeptid immobilisiert ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen unter Verwendung des Zellkulturmediums oder des Materials, und das Verfahren, wobei die Zellen undifferenzierte Blutzellen sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine DNA, die wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls codiert, eine DNA, die wenigstens die Aminosäure[sequenz] von SEQ ID Nr. 3 des Sequenzprotokolls codiert, eine DNA, die eine Basensequenz von 355 bis 1854 von SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls aufweist, und eine DNA, die eine Basensequenz von 355 bis 2331 von SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner des Weiteren eine rekombinante DNA, die eine DNA umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus den DNAs, an die eine Vektor-DNA ligiert ist, welche die DNA in der Wirtszelle exprimieren kann, eine Zelle, die mit der rekombinanten DNA transformiert ist, ein Verfahren zum Kultivieren von humanen Zellen mit den Zellen, und ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids durch Kultivieren der Zellen und Isolieren der in der Kulturmasse erzeugten Verbindung. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner außerdem noch einen Antikörper, der ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 3 aufweist, spezifisch erkennt.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden in Einzelheiten erläutert.
Die Herstellung von cDNA, welche für Genmanipulationen notwendig ist, die Expressionsanalyse durch Northern-Blotting, das Screening durch Hybridisierung, die Herstellung von rekombinanter DNA, die Bestimmung der DNA-Basensequenz und das Herstellen einer cDNA-Bibliothek, welche alle Abfolgen molekularbiologischer Experimente sind, können gemäß einer Beschreibung im herkömmlichen Lehrbuch für die Experimente durchgeführt werden. Bei dem oben genannten herkömmlichen Lehrbuch für die Experimente handelt es sich zum Beispiel um Maniatis et al., Hrsg., Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Hrsg.: Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist mindestens Polypeptide von SEQ ID Nr. 2 oder 3 des Sequenzprotokolls auf. Eine Mutante und ein Allel, welche in der Natur natürlicherweise vorkommen, sind im Polypeptid der vorliegenden Erfindung beinhaltet, außer die Polypeptide der Sequenzauflistung, SEQ ID Nr. 1–3, verlieren ihre Eigenschaften. Modifikation und Substitution von Aminosäuren werden ausführlich beschrieben in der Patentanmeldung im Namen von Benntt et al. (Nationale ungeprüfte Veröffentlichung WO 96/2645) und können gemäß der Beschreibung darin hergestellt werden.
Eine DNA-Sequenz, welche Polypeptide von SEQ ID Nr. 2 oder 3 des Sequenzprotokolls codiert, wird in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls, zusammen mit deren Aminosäuresequenzen, gezeigt. In diesen DNA-Sequenzen kann, selbst wenn eine Mutation auf Aminosäure-Ebene nicht herbeigeführt wird, natürlich isolierte chromosomale DNA oder cDNA davon die Möglichkeit haben, hinsichtlich der DNA-Basensequenz als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes zu mutieren, ohne dass die von der DNA codierte Aminosäuresequenz verändert wird. Eine 5'-untranslatierte Region und eine 3'-untranslatierte Region beinhalten keine Aminosäuresequenz-Bestimmung des Polypeptids, weshalb DNA-Sequenzen dieser Regionen leicht mutiert werden können. Die durch diese Degeneriertheiten des genetischen Codes erhaltene Basensequenz ist in der DNA der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Undifferenzierte Blutzellen sind in der vorliegenden Erfindung als Zellen, welche durch spezifische Stimulation wachsen können, und Zellen, welche zu Zellen mit spezifischen Funktionen als ein Ergebnis der spezifischen Stimulation differenziert werden können, definiert.
Diese Zellen schließen die Zellen mit Selbstreplikations-Aktivität, welche als Stammzellen bezeichnet werden, und die Zellen, welche eine Fähigkeit aufweisen, die Zellen dieser Linien hervorzubringen, ein. Die differenzierungsunterdrückende Wirkung bedeutet eine unterdrückende Wirkung auf die autonome oder heteronome Differenzierung der undifferenzierten Zellen, und ist eine Wirkung zur Aufrechterhaltung des undifferenzierten Zustands.
Die undifferenzierten Blutzellen in der vorliegenden Erfindung können als Zellgruppen definiert werden, welche aus den Blutvorläuferzellen, die zu den spezifischen Blut-Reihen differenziert werden, welche durch Blut-Kolonie-Assay identifiziert werden, und hämatopoietischen Stammzellen, die eine Differenzierung zu jeder Reihe und Selbstreplikations-Aktivitäten aufweisen, bestehen. Ferner sind in der vorliegenden Erfindung Gefäßzellen als allgemeine Benennung für Zellen, die Blutgefäße aufbauen, definiert, wobei es sich bei dem Hauptanteil bzw. Großteil dieser Zellen um Gefäß-Endothelzellen handelt.
Die Aminosäuresequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 1 ist eine Sequenz des aktiven Zentrums des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung, von welchem das Signalpeptid deletiert ist, d.h. die Aminosäuresequenz vom Amino-Terminus bis zur DSL-Domäne, und entspricht den Aminosäuren Nr. 1 bis 191 in SEQ ID Nr. 3 der gereiften Volllängen-Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung.
Die Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 2 ist die Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung, aus welcher das Signalpeptid deletiert ist, und entspricht Aminosäure Nr. 1 bis 500 in SEQ ID Nr. 3 der gereiften Volllängen-Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung.
Die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 ist die gereifte Volllängen-Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung.
Die Sequenz von SEQ ID Nr. 4 ist die cDNA-Sequenz und Gesamt-Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung, welche der codierenden Region der cDNA entspricht.
Die Sequenz von SEQ ID Nr. 5 ist eine DNA-Sequenz, welche das FLAG-Peptid codiert, und die Aminosäuresequenz von FLAG-Peptid, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die Sequenzen von SEQ ID Nr. 6 und 7 sind DNA-Sequenzen von im Referenzbeispiel 1 verwendeten Primern.
Die Sequenz von SEQ ID Nr. 8 ist die cDNA-Sequenz und Gesamt-Aminosäuresequenz von humanem Delta-1, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
Die Sequenzen von SEQ ID Nr. 9, 10, 12 und 13 sind DNA-Sequenz. von im Beispiel 1 verwendeten Primern.
Die Sequenz von SEQ ID Nr. 11 ist eine DNA-Sequenz einer in Beispiel 1 verwendeten Sonde.
Die Sequenz von SEQ ID Nr. 14 ist eine DNA-Sequenz einer in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Sonde.
Die Sequenzen von SEQ ID Nr. 15 bis Nr. 24 sind DNA-Sequenzen von im Beispiel 3 verwendeten Primern.
Die linken und rechten Enden der Aminosäuresequenzen in den Sequenzauflistungen geben den Amino-Terminus (hierin nachstehend bezeichnet als N-Terminus) bzw. den Carboxyl-Terminus (hierin nachstehend bezeichnet als C-Terminus) an, und die linken und rechten Enden der Nukleotidsequenzen sind der 5'-Terminus bzw. 3'-Terminus.
Die Klonierung von unbekanntem humanem Notch-Liganden-Gen kann durch das folgende Verfahren durchgeführt werden. Während der Evolution der Organismen ist ein Teil der Aminosäuresequenzen und Gensequenzen des humanen Notch-Liganden konserviert worden. Eine Klonierung kann theoretisch durch Verwenden eines anderen Notch-Ligandenmoleküls als Sonde möglich sein. Allerdings bestehen in einer derartigen Kreuzhybridisierung viele Probleme, zum Beispiel welcher Teil für die Sonde zu bevorzugen ist, oder wie die Hybridisierungsbedingungen angesetzt werden, und diese sind nicht so einfach. Ferner wird viel Zeit für die Gensequenz-Analyse in Anspruch genommen, da das Kreuzhybridisierungs-Verfahren dazu neigt, eine Klonierung großer Zahlen von ähnlichen Genen gleichzeitig auszuführen, und folglich ist die Identifizierung der Ziel-Moleküle aus den klonierten Genen ziemlich schwierig.
Ich habe mehr als 10 Genfragmente aus dem humanen Delta-1-Gen hergestellt. Unter Verwendung der Sonden wurden Screenings von cDNA-Bibliotheken, welche aus mehr als zehn unterschiedlichen Organen stammten, unter einer großen Anzahl von Hybridisierungsbedingungen und Waschbedingungen durchgeführt. Es wurde versucht, ein neues Deltaähnliches Molekül zu finden.
In der Plaque-Hybridisierung können Klone durch Isotopen-Markierung und Nicht-Isotopen-Markierung mit der Sonde erhalten werden. Eine Isotopen-Markierung kann zum Beispiel durchgeführt werden durch terminales Markieren unter Verwendung von [³²P]γ-ATP und T4-Polynukleotidkinase, oder es können andere Markierungsverfahren, wie die Nick-Translation oder das Primer-Verlängerungs-Verfahren, angewandt werden.
Als Ergebnis wurde, in Beispiel 1, ein Screening einer humanen fötalen Lungen-cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines partiellen Gens des Volllängen-Gens von humanem Delta-1, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 8 in dem Sequenzprotokoll, d.h. der Gensequenz, welche in SEQ ID Nr. 11 in dem Sequenzprotokoll gezeigt wird, als Sonde durchgeführt. Als Resultat des ersten Screenings wurden etwa 120 positive Plaques isoliert, und im zweiten Screening wurden etwa 80 positive Plaques kloniert, und dann wurden Gensequenzen dieser Klone bestimmt. Bei den meisten dieser klonierten Gene handelte es sich um das als Sonde verwendete, humane Delta-1-Gen. Unter ihnen wurden fünf Klone als das neue humane Delta-2-Gen, welches ähnlich zum humanen Delta-1-Gen ist, ermittelt, und das angezielte neue Notch-Ligandenmolekül wurde festgestellt.
Unter den oben genannten fünf Klonen, da es keine Signalsequenz und keine aminoterminale Sequenz gab, habe ich eine neue Sonde hergestellt, welche die Gensequenz, wie gezeigt in SEQ ID Nr. 14, aufweist, um das Volllängen- Gen zu erhalten. Ferner wurde erneut ein Screening der humanen fötalen Lungen-cDNA-Bibliothek mit dieser Sonde durchgeführt. Als Ergebnis gelang die Klonierung der cDNA, welche für die volle Länge des Gens codiert.
Diese Sequenz wurde mit der Datenbank (Genbank, Ausgabe 89, Dezember 1996) verglichen, und es wurde festgestellt, dass es sich bei ihnen um eine neue Sequenz handelte.
Von dem in Beispiel 1 beschriebenen pBluescript KS verschiedene Beispiele von Plasmiden, welche mit cDNA integriert werden, sind beispielsweise die aus E. coli stammenden pBR322, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 (Takara Shuzo Co., Japan), aber andere Plasmide können verwendet werden, wenn sie in den Wirtszellen replizieren und proliferieren können. Beispiele von mit cDNA integrierten Phagenvektoren sind zum Beispiel λgt10 und λgt11, aber andere Vektoren können verwendet werden, wenn sie in den Wirtszellen wachsen können. Die so erhaltenen Plasmide werden in geeigneten Wirtszellen, wie Gattung Escherichia und Gattung Bacillus, unter Anwendung des Calciumchlorid-Verfahrens, transduziert. Beispiele für die oben genannte Gattung Escherichia sind Escherichia coli K12HB101, MC1061, LE392 und JM109. Ein Beispiel für die oben genannte Gattung Bacillus besteht in Bacillus subtilis MI114. Ein Phagenvektor kann in das proliferierte E. coli durch das in vitro-Verpackungsverfahren (Enquist und Sternberg, Meth. Enzymol., 68, 281-, 1979) eingebracht werden.
Die Aminosäuresequenz wurde hinsichtlich des hydrophoben Anteils und des hydrophilen Anteils gemäß des Verfahrens von Kyte-Doolittle (J. Mol. Biol. 151: 105, 1982) von der Aminosäuresequenz her analysiert. Als Ergebnis wird das neue humane Delta-2 der vorliegenden Erfindung auf Zellen als Zellmembranprotein mit einer Transmembran-Domäne exprimiert.
Gemäß der Analyse der Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 besteht die Aminosäuresequenz eines Vorläufers des neuen humanen Delta-2 aus 685 Aminosäureresten, welche in der Sequenzauflistung, SEQ ID Nr. 4, gezeigt werden, und die Signalpeptid-Domäne entspricht schätzungsweise einer Aminosäuresequenz von 26 Aminosäureresten von Nr. -26, Methionin, bis zu Nr. -1, Glycin, des Sequenzprotokolls; extrazelluläre Domäne: 500 Aminosäurereste von Nr. 1, Serin, bis zu Nr. 500, Serin; Transmembran-Domäne: 26 Aminosäurereste, von Nr. 501, Phenylalanin, bis zu Nr. 526, Valin; und intrazelluläre Domäne: 133 Aminosäurereste von Nr. 527, Arginin, bis zu Nr. 659, Valin. Bei diesen Domänen handelt es sich um den aus Aminosäuresequenzen geschätzten bzw. vermuteten Domänenaufbau, und die tatsächlich vorhandene Form auf den Zellen und in Lösung kann möglicherweise von der oben genannten Struktur abweichen, und konstitutionelle Aminosäuren jeder Domäne, welche hier oben definiert wird, können möglicherweise um 5 bis 10 Aminosäuren in der Sequenz abweichen.
Die N-terminate Aminosäuresequenz des humanen Delta-2-Polypeptids, welches von COS-7-Zellen exprimiert wird, und wie beschrieben in Beispiel 5 hergestellt und gereinigt wird, weist mindestens die Aminosäuresequenz, die ab Nr. 1, Serin, in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2 beginnt, auf. In ähnlicher Weise kann ein identischer N-Terminus erwartet werden, wenn das Peptid in den anderen tierischen Zellen exprimiert wird.
Nach einem Vergleich der Volllängen-Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung mit anderen Notch-Ligandenmolekülen, über welchen bis zum April 1997 berichtet wurde, beläuft sich die Homologie mit humanem Delta-1 (Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 8 in dem Sequenzprotokoll) als ein aus Menschen stammendes Molekül auf 48,5%; mit humanem Serrate-1 (Genbank HSU61276 und HSU73939) auf 40,3%; und mit humanem Serrate-2 (Japanische Patentanmeldung Nr. 8-18622, "Differentiation-suppressive polypeptide", im Namen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung) auf 42,7%. Die Homologien mit Delta aus anderen Vertebraten sind: Maus-Delta-1 (D111, Genbank MMDELTAI) 48,7%; Frosch-Delta-1 (Genbank XELXDEL) 47,0%; Frosch-Delta-2 (Genbank XLU70843) 49,7%, und Delta-1 aus Huhn (Genbank GGU26590) 47,9%.
Als Ergebnis ist das humane Delta-2 der vorliegenden Erfindung ein neues Molekül, über das nicht nur beim Menschen, sondern auch in anderen biologischen Homologen, niemals berichtet wurde, und ist die neue Substanz, welche eine neue Aminosäuresequenz, die von diesen Substanzen verschieden ist, aufweist, und ist eine neue Substanz, welche erstmalig vom Erfinder der vorliegenden Anmeldung aufgeklärt wurde. Darüber hinaus ist kein Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das neue humane Delta-2 durch eine Homologiesuche in allen Arten von Organismen gefunden worden.
Die Homologe von Notch-Ligand weisen eine evolutionär konservierte gemeinsame Sequenz auf, d.h. die DSL-Sequenz und wiederholte EGF-ähnliche Sequenz. Als ein Ergebnis des Vergleichs mit dem neuen humanen Delta-2 und humanem Delta-1 sind diese konservierten Aminosäuresequenzen des neuen humanen Delta-2 eingeschätzt worden.
Die DSL-Sequenz entspricht nämlich 43 Aminosäureresten von Nr. 149, Cystein, bis Nr. 191, Cystein, der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 in dem Sequenzprotokoll. Eine EGF-ähnliche Sequenz liegt mit 8 Wiederholungen vor, wobei, in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 in dem Sequenzprotokoll, die erste EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 196, Cystein, bis Nr. 224, Cystein, entspricht; die zweite EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 227, Cystein, bis zu Nr. 255, Cystein, entspricht; die dritte EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 262, Cystein, bis Nr. 295, Cystein, entspricht; die vierte EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 302, Cystein, bis Nr. 333, Cystein, entspricht; die fünfte EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 340, Cystein, bis Nr. 373, Cystein, entspricht; die sechste EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 380, Cystein, bis Nr. 411, Cystein, entspricht; die siebte EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 418, Cystein, bis Nr. 449, Cystein, entspricht; und die achte EGF-ähnliche Sequenz der Sequenz von Nr. 458, Cystein, bis Nr. 491, Cystein, entspricht.
Ein Abschnitt mit angehefteter Zuckerkette wird aus der Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 abgeschätzt und kann bei Nr. 82, 157, 179 und 367 sein, Asparagin-Rest(e), in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, als eine mögliche Bindungsstelle mit N-Glykosid-Anheftung von N-Acetyl-D-glucosamin. Die O-Glykosid-Bindung von N-Acetyl-D-galactosamin liegt schätzungsweise bei einem Abschnitt vor, der reich an Serin- oder Threoninresten ist. Von Protein, an welchem Zuckerkette(n) gebunden ist/sind, wird im Allgemeinen angenommen, in vivo stabil zu sein und eine starke physiologische Aktivität aufzuweisen. Folglich sind in der Aminosäuresequenz von Polypeptid, welches die Sequenz SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 des Sequenzprotokolls aufweist, Polypeptide, die N-Glucosid- oder O-Glucosid-Bindung mit einer Zuckerkette N-Acetyl-D-glucosamin oder N-Acetyl-D-galactosamin aufweisen, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Wie in Beispiel 5 gezeigt, werden, wenn das humane Delta-2 der vorliegenden Erfindung durch COS-7-Zellen mit Gen-Insertion bzw. Gen-Einbringung exprimiert wird, mindestens mehr als zwei Formen exprimiert, und zwar wegen der angehefteten Zuckerkette, da die Proteine unterschiedliches Molekulargewicht aufweisen.
Als ein Ergebnis von Untersuchungen über die Bindung von Drosophila-Notch und seinem Liganden, reicht die Aminosäureregion, die für die Bindung zwischen dem Liganden von Drosophila-Notch mit Notch notwendig ist, vom N-Terminus bis zur DSL-Sequenz des gereiften Proteins, in welchem das Signalpeptid entfernt ist (Internationale Veröffentlichung WO 92/19734). In ähnlicher Weise zeigen Untersuchungen unter Verwendung von Nematode(n) durch Fitzgerald und Greenwald (Development, 121, 4275–4282, 1995) ferner in deutlicher Weise, dass Notch-Ligand-ähnliches Molekül APX-1, welches für die Aktivierung des Notch-ähnlichen Rezeptors erforderlich ist, vom Aminoterminus bis zur DSL-Domäne in der Volllängen-Sequenz ausreichend ist.
Diese Tatsache weist darauf hin, dass eine Domäne, die zur Expression von Liganden-Wirkung von humanem Notch-Ligandenmolekül notwendig ist, mindestens die DSL-Domäne ist, d.h. eine Domäne, welche die Aminosäuresequenz vom Cystein Nr. 149 bis zum Cystein Nr. 191 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 1 enthält, und eine Domäne, welche zur Expression von Liganden-Wirkung von humanem Delta-2 mindestens notwendig ist, die in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 1 gezeigte neue Aminosäuresequenz ist, und ferner eine Domäne, die zur Expression von Liganden-Wirkung von humanem Delta-2 mindestens notwendig ist, die in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2 gezeigte neue Aminosäuresequenz ist.
Wie gezeigt im Beispiel 2, kann mRNA des humanen Delta-2 nachgewiesen werden durch Verwendung von DNA, welche einen Teil oder die vollständige Gensequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 codiert. Zum Beispiel kann ein Verfahren zum Nachweis der Expression dieser Gene erzielt werden durch Anwenden bei Hybridisierung oder PCR unter Verwendung komplementärer Nukleinsäuren von oben genanntem 12mer oder oben genanntem 16mer, vorzugsweise oben genanntem 20mer, aufweisend die Nukleinsäuresequenz oder einen Teil der Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, d.h. Antisense-DNA oder Antisense-RNA, ihrer methylierten, methylphosphatierten, desaminierten oder thiophosphatierten Derivate. Unter Anwendung des gleichen Verfahrens kann die Detektion von Homologen des Gens von anderen Organismen, wie Mäusen, oder eine Genklonierung erzielt werden. Ferner kann eine Klonierung von Genen im Genom, einschließlich Menschen, vorgenommen werden. Unter Verwendung dieser Gene, die durch derartige Verfahren kloniert wurden, können weitere detaillierte Funktionen des humanen Delta-2 aufgeklärt werden. Zum Beispiel kann man, unter Verwendung der modernen Genmanipulierungs-Techniken, sämtliche Verfahren, einschließlich transgener Maus, Gen-Targeting-Maus oder Doppel-Knockout-Maus, in welchen Gene im Zusammenhang mit dem Gen der vorliegenden Erfindung inaktiviert sind, anwenden. Wenn Abnormalitäten im Genom für das vorliegende Gen festgestellt werden, kann eine Anwendung für Gendiagnose und Gentherapie vorgenommen werden.
Eine Transformante, in welcher der Vektor pBSDL-2, der cDNA enthält, welche die gesamte Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung codiert, in E. coli JM109 transformiert ist, ist beim "National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry", 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Japan, als E. coli: JM109-pBSDL-2 hinterlegt worden. Das Hinterlegungsdatum war der 9. Mai 1997, und die Hinterlegungsnummer ist FBRM BP-5941.
Ein Verfahren zur Herstellung des neuen humanen Delta-2-Polypeptids kann durchgeführt werden, wie gezeigt im Beispiel 3, durch Verwendung des Expressionsvektors pcDNA 3. Die Erzeugung und Reinigung verschiedener Formen des neuen humanen Delta-2-Polypeptids unter Verwendung von cDNA, welche die Aminosäuresequenz des neuen humanen Delta-2 codiert, das durch das oben genannte Verfahren isoliert wurde, sind in den Literaturbezugsstellen bekannt (Kriegler, Gene Transfer and Expression – A Laboratory Manual, Stockton Press. 1990, und Yokota et al., Biomanual Series 4, Gene Transfer and Expression and Analysis, Yodosha Co., 1994). Eine cDNA, welche die Aminosäuresequenz des isolierten humanen Delta-2 codiert, wird an den bevorzugten Expressionsvektor ligiert, und es wird in den Wirtszellen von eukaryotischen Zellen, wie tierischen Zellen und Insektenzellen, oder prokaryotischen Zellen, wie Bakterien, produziert.
Für die Expression des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung kann für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende DNA das Translationsinitiations-Codon im 5'-Terminus und das Translationsterminations-Codon im 3'-Terminus aufweisen. Das besagte Translationsinitiations-Codon und das Translationsterminations-Codon können durch Verwenden eines bevorzugten synthetischen DNA-Adaptors angefügt werden. Ferner wird für die Expression der DNA ein Promotor stromaufwärts der DNA-Sequenz ligiert. Beispiele für den Vektor sind Plasmide, welche aus dem oben genannten E. coli stammen bzw. abgeleitet sind, ein Plasmid, welches aus Bacillus abgeleitet ist, ein Plasmid, welches aus Hefe abgeleitet ist, oder Bakteriophagen, wie λ-Phage, und Tierviren, wie Retrovirus und Vaccinia-Virus.
Beispiele für in der vorliegenden Erfindung verwendete Promotoren sind jedwede Promotoren, welche entsprechend zu den in der Genexpression verwendeten Wirtszellen bevorzugt sind.
In dem Fall, dass die Wirtszelle in der Transformation der Gattung Escherichia angehört, werden der tac-Promotor, trp-Promotor und der lac-Promotor bevorzugt, und im Fall eines Wirts von der Gattung Bacillus werden der SP01-Promotor und der SP02-Promotor bevorzugt, und im Fall, dass der Wirt Hefe ist, werden der PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor bevorzugt.
In dem Fall, dass die Wirtszelle eine Tierzelle ist, können ein aus SV40 stammender Promotor, ein Promotor eines Retrovirus, der Metallothionein-Promotor und ein Hitzeschock-Promotor angewandt werden.
Die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann vorgenommen werden, indem lediglich DNA verwendet wird, welche die Aminosäuresequenz der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 codiert. Allerdings kann das Protein, welchem eine spezifische Funktion hinzugefügt wurde, hergestellt werden durch Verwenden von DNA, in welcher hinzugefügte cDNA, die ein bekanntes Antigen-Epitop, für einen leichteren Nachweis des produzierten Polypeptids, codiert, oder hinzugefügte cDNA, welche das Immunglobulin-Fc zur Bildung eines Multimers codiert, vorliegt.
Wie in Beispiel 3 gezeigt wird, haben wir Expressionsvektoren, die extrazelluläre Proteine des neuen humanen Delta-2 exprimieren, wie folgt hergestellt:

1) DNA, codierend die Aminosäuren von Nr. 1 bis 500 in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 in dem Sequenzprotokoll;
2) DNA, codierend ein chimäres Protein, an welches ein Polypeptid mit 8 Aminosäuren, d.h. eine Aminosäuresequenz, bestehend aus Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (hierin nachstehend bezeichnet als FLAG-Sequenz, ein Beispiel einer DNA-Sequenz, welche für selbiges codiert, ist in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 5 gezeigt), am C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 500 in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 in dem Sequenzprotokoll hinzugefügt wurde; und
3) DNA, codierend ein chimäres Protein, an welches eine Fc-Sequenz aus der Gelenkregion von humanem IgG1 an den C-Terminus der Aminosäuren von Nr. 1 bis 500 in der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 in dem Sequenzprotokoll hinzugefügt wurde, wird jeweils separat mit dem Expressionsvektor pcDNA 3 (INVITROGEN Corp., USA) ligiert, wonach der Expressionsvektor, der die extrazelluläre Region des neuen humanen Delta-2 exprimiert, hergestellt bzw. präpariert wird.

Der Expressionsvektor für die Expression der Volllängenform des neuen humanen Delta-2 kann wie folgt hergestellt werden:

4) DNA, welche die Aminosäuren von Nr. 1 bis 659 in dem Sequenzprotokoll SEQ ID Nr. 3 codiert, und
5) DNA, welche ein chimäres Protein codiert, an welches ein Polypeptid, das die FLAG-Sequenz aufweist, an den C-Terminus von Aminosäuren von Nr. 1 bis 659 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 3 hinzugefügt wurde, werden einzeln mit dem Expressionsvektor pcDNA ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen, welcher die Volllängenform des neuen humanen Delta-2 exprimieren kann.

Die Transformanten werden durch Verwenden dieser Expressionsplasmide hergestellt, welche DNA enthalten, die das so konstruierte humane Delta-2 codiert.
Beispiele des Wirts sind die Gattung Escherichia, Gattung Bacillus, Hefe und Tierzellen. Beispiele für Tierzellen sind die Affen-Zellen COS-7 und Vero, Chinesische-Hamster-Zellen CHO und Seidenraupen-Zellen SF9.
Wie im Beispiel 4 gezeigt wird, werden die Expressionsvektoren der oben genannten Punkte 1)–5) einzeln transduziert; das neue humane Delta-2 wird in COS-7-Zellen (erhältlich vom Institute of Physical and Chemical Research, Cell Development Bank, RCB0539) exprimiert, und die Transformanten, welche mit diesen Expressionsplasmiden transformiert sind, können erhalten werden. Ferner kann das neue humane Delta-2-Polypeptid durch Kultivieren der Transformanten unter bevorzugten Kulturbedingungen in Medium durch ein bekanntes Kulturverfahren produziert werden.
Wie es im Beispiel 5 gezeigt wird, kann das neue humane Delta-2-Polypeptid aus der oben genannten Kulturmasse isoliert und aufgereinigt werden, und zwar im Allgemeinen durch die folgenden Verfahren.
Für die Extraktion der Substanz aus kultivierten mikrobiellen Zellen oder Zellen, werden mikrobielle Zellen oder Zellen durch bekannte Verfahren, wie Zentrifugation, nach dem Kultivieren abgesammelt, in einer bevorzugten Pufferlösung suspendiert, und dann werden die mikrobiellen Zellen oder Zellen mittels Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Einfrieren-Auftauen aufgebrochen, und Rohextrakt wird durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen. Die Pufferlösung kann proteindenaturierende Mittel, wie Harnstoff und Guanidinhydrochlorid, oder oberflächenaktive Mittel, wie Triton-X, enthalten. Im Fall einer Sekretion in die Kulturlösung wird die Kulturmasse durch ein bekanntes Verfahren, wie Zentrifugation, aufgetrennt, um eine Abtrennung aus mikrobiellen Zellen oder Zellen vorzunehmen, und die Überstandslösung wird aufgefangen.
Das so erhaltene neue humane Delta-2, welches in den Zellextrakten oder Zellüberständen enthalten ist, kann durch bekannte Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden. Während des Reinigungsverfahrens können, zur Bestätigung des Vorhandenseins des Proteins, im Fall der fusionierten Proteine, wie dem oben genannten FLAG und humanem IgGFc, diese durch einen Immuno-Assay unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bekanntes Antigen-Epitop nachgewiesen werden, und sie können gereinigt werden. In dem Fall, dass keine Expression in Form eines derartigen Fusionsproteins vorgenommen wird, kann der Antikörper in Beispiel 6 für den Nachweis verwendet werden.
Antikörper, welche spezifisch humanes Delta-2 erkennen, können hergestellt werden, wie es in Beispiel 6 gezeigt wird. Antikörper können hergestellt werden durch die Verfahren, welche in der Literaturbezugsstelle (Antibodies a laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory) beschrieben sind, oder rekombinante Antikörper werden in Zellen exprimiert, indem man Immunoglobulingene verwendet, die durch ein Genklonierungsverfahren isoliert wurden. Die so hergestellten Antikörper können für die Reinigung des neuen humanen Delta-2 verwendet werden. Das humane Delta-2 kann nachgewiesen und durch einen Assay bestimmt werden unter Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch neues humanes Delta-2 erkennen, wie im Beispiel 6 gezeigt, und kann für diagnostische Agentien für Krankheiten verwendet werden, welche von einer abnormalen Differenzierung von Zellen begleitet werden, wie bösartige Tumore.
Ein noch nützlicheres Reinigungsverfahren ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung von Antikörpern. In diesem Fall verwendete Antikörper sind Antikörper, die im Beispiel 6 beschrieben sind. Für ein Fusionsprotein [verwendet man] Antikörper gegen FLAG, im Fall von FLAG, und Protein G oder Protein A im Fall von humanem IgGFc, wie gezeigt im Beispiel 5.
Physiologische Funktionen des so gereinigten humanen Delta-2-Proteins können durch verschiedene Assay-Verfahren identifiziert werden, zum Beispiel Assay-Verfahren hinsichtlich der physiologischen Aktivität, welche Zelllinien und Tiere, wie Mäusen und Ratten, verwenden, Assay-Verfahren hinsichtlich der intrazellulären Signaltransduktion, welche auf molekularbiologischen Methoden beruhen, Bindung mit Notch-Rezeptor etc.
Ich habe Wirkungen für undifferenzierte Blutzellen durch Verwenden von IgG1-Chimärenproteinen des neuen humanen Delta-2 beobachtet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass, wie im Beispiel 7 gezeigt wird, in undifferenzierten Blutzellen, welche aus Nabelschnurblut abgeleitet wurden, in welchen die CD34-positive Zellfraktion konzentriert ist, das neue humane Delta-2 eine unterdrückende Wirkung auf die Koloniebildungs-Aktion gegenüber undifferenzierten Blutzellen aufweist, welche eine Koloniebildung in Gegenwart von Cytokinen zeigen.
Ferner, wie im Beispiel 8 gezeigt, habe ich festgestellt, dass als ein Ergebnis der Auswertung von LTC-IC ("Long-Term Culture"-initiierende Zellen), zu welchen die meisten undifferenzierten Blut-Stammzellen in den humanen undifferenzierten Blutzellen zählen (positioniert sind), nach der Kultivierung der aus Nabelschnurblut abgeleiteten undifferenzierten Blutzellen, in welchen die CD34-positive Zellfraktion konzentriert ist, in Gegenwart des humanen Delta-2 mit verschiedenen Cytokinen in serumfreiem Medium, das humane Delta-2 eine Aktivität zur Aufrechterhaltung der Anzahl von LTC-IC aufweist. Ferner habe ich festgestellt, dass, wie im Beispiel 9 gezeigt, das humane Delta-2 mit humanen undifferenzierten Blutzellen gebunden ist.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das humane Delta-2 Differenzierung von undifferenzierten Blutzellen unterdrückt, und diese Wirkung ist offensichtlich für Zellen von Blutstammzellen bis zu koloniebildenden Zellen effektiv. Diese physiologischen Wirkungen sind wesentlich für die In-vitro-Proliferation von undifferenzierten Blutzellen. Insbesondere sind Zellen, welche in einem Medium, das humanes Delta-2 enthält, kultiviert werden, wirksam zur Wiederherstellung der Suppression von Knochenmark nach Verabreichen von Antitumormitteln, wobei folglich eine In-vitro-Expansion von hämopoietischen Stammzellen möglich sein kann, wenn andere Bedingungen erfüllt sind. Ferner weisen Pharmazeutika, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthalten, schützende Wirkung und reduzierte Auswirkungen gegen die Knochenmark-unterdrückende Wirkung durch Nebeneffekte von Antitumormitteln auf.
In diesen Experimenten sind die LTC-IC-aufrechterhaltende Aktivität und die Bindungswirkung für Blutzellen des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung stärker als diejenigen des humanen Delta-1 (WO 97/19172), welches die gleiche Wirkung aufweist, wie von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung gezeigt wurde.
Wie im Beispiel 9 gezeigt, ist das IgG1-Chimärenprotein des humanen Delta-2 mit CD34-positiven undifferenzierten Blutzellen gebunden. Durch diese Bindungsaktivität kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung für die Isolierung und Detektion von Zellen verwendet werden. Obwohl das Isolierungsverfahren durch ein Verfahren unter Verwendung eines Durchflusszytometers durchgeführt werden kann, wie beschrieben im Beispiel 9, kann ein Verfahren unter Verwendung von Materialien, an welchen Polypeptid der vorliegenden Erfindung immobilisiert ist, wie beschrieben im Beispiel 11, zweckmäßiger sein. Folglich ist ein Zellisolierungsverfahren unter Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in der vorliegenden Erfindung beinhaltet. Ferner sind ebenfalls ein Zellisolierungsverfahren unter Verwendung eines Materials, an welchem Polypeptid der vorliegenden Erfindung immobilisiert ist, und eine Vorrichtung zur Zellisolierung, welche mit dem Isolationsverfahren angewandt wird, in der vorliegenden Erfindung beinhaltet. Jedwedes Zellisolierungsverfahren unter Verwendung von Antikörpern, welches in den Literaturbezugstellen beschrieben ist, ist auf diese Isolierungsvorrichtungen und Isolierungsmethoden anwendbar. Zum Beispiel können Dynabeads von Dynal Corp., Norwegen, verwendet werden, bei welchen es sich um ein Verfahren unter Verwendung einer Kombination von magnetischen Kügelchen und Antikörpern handelt.
Ferner, wie gezeigt im Beispiel 12, weist IgG1-Chimärenprotein des neuen humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung eine unterdrückende Wirkung gegen die Proliferation von intravaskulären endothelialen Zellen auf und besitzt inhibitorische Aktivität gegen die Gefäßbildung bzw. Vaskularisierung. Folglich kann das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Form therapeutischer Mittel für Krankheiten und Krankheitszustände verwendet werden, welche durch Unterdrücken der Vaskularisierung geheilt werden können, wie vorgeschlagen von Folkman und Klagsbrun (Sciene 235, 442–447, 1987). Konkrete Anwendungsbeispiele werden in der oben genannten Literaturbezugstelle beschrieben und sind zum Beispiel Krankheiten, einschließlich bösartiger Tumoren.
Man erwartet eine unterdrückende Wirkung auf die Differenzierung von Zellen in von Blutzellen verschiedenen undifferenzierten Zellen, und eine stimulierende Wirkung für Geweberegeneration kann erwartet werden.
In der pharmazeutischen Anwendung werden Polypeptide der vorliegenden Erfindung unter Zugabe von bevorzugten Stabilisierungsmitteln, wie humanem Serumalbumin, lyophilisiert, und werden im aufgelösten oder suspendierten Zustand mit destilliertem Wasser zur Injektion verwendet, wenn sie zur Anwendung kommen. Zum Beispiel kann eine Präparation zur Injektion oder Infusion bei der Konzentration von 0,1–1000 μg/ml bereitgestellt werden. Eine Mischung von 1 mg/ml Verbindung der vorliegenden Erfindung und 1 mg/ml humanem Serumalbumin, abgeteilt in ein Gefäß, könnte die Aktivität der Verbindung für eine lange Zeitdauer aufrechterhalten. Für die Kultivierung und Aktivierung von Zellen in vitro wird eine lyophilisierte Präparation oder eine flüssige Präparation des Polypeptids der vorliegenden Erfindung hergestellt und wird zu dem Medium zugesetzt oder im Gefäß für die Kultur immobilisiert. Die Toxizität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung wurde getestet. Jedes Polypeptid, 10 mg/kg, wurde intraperitoneal an Mäuse verabreicht, aber es wurde kein Tod von Mäusen beobachtet.
Die physiologische Aktivität des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in vitro kann durch Verabreichung an Krankheitsmodell-Mäuse, oder dazu ähnlichen Krankheits-Ratten oder -Affen, und Untersuchung der Erholung bzw. Zurückgewinnung von körperlichen und physiologischen Funktionen und abnormalen Befunden ausgewertet werden. Zum Beispiel, im Fall der Suche einer Abnormalität in Bezug auf hämopoietische Zellen, werden Knochenmark-Unterdrückungs-Modellmäuse hergestellt durch Verabreichen der 5-FU-Reihe von Antitumormitteln, und Knochenmarkszell-Zählungen, Zählungen der peripheren Blutzellen und die physiologischen Funktionen werden in der Verabreichungs-Gruppe oder der Nicht-Verabreichungs-Gruppe von Mäusen untersucht. Ferner, im Fall des Anstrebens von In-vitro-Kultivierung und -Wachstum hämopoietischer undifferenzierter Zellen, einschließlich hämopoetischer Stammzellen, werden die Knochenmarkszellen von Mäusen in den Gruppen mit oder ohne Zugabe der Verbindung der vorliegenden Erfindung kultiviert, und die kultivierten Zellen werden in die mit einer letalen Dosis bestrahlten Mäuse überführt. Das Ergebnis der Erholung wird unter Angabe der Überlebensrate und der Variation bei den Blutzählungen ermittelt. Diese Ergebnisse können auf den Menschen extrapoliert werden, und folglich kann man nützliche Wirksamkeits-Daten für die Auswertung der pharmakologischen Aktivitäten der Verbindung der vorliegenden Erfindung erhalten.
Anwendungen der Verbindung der vorliegenden Erfindung für Pharmazeutika schließen Krankheiten mit einer abnormalen Differenzierung von Zellen, zum Beispiel Leukämie und bösartige Tumoren, ein. Bei jenen handelt es sich um Zelltherapie, welche durchgeführt wird mittels Kultivieren von aus Menschen abgeleiteten Zellen in vitro unter Beibehaltung ihrer ursprünglichen Funktionen oder Hinzufügung neuer Funktionen, und eine Therapie, welche durchgeführt wird durch Regenerieren ohne Beschädigung der Funktionen, welche ursprünglich in den Geweben existierten, durch Verabreichen der Verbindung der vorliegenden Erfindung bei der Regeneration nach einer Gewebeverletzung. Die Menge der Verabreichung kann gemäß dem Typ der Präparation variieren und liegt im Bereich von 10 μg/kg bis 10 mg/kg.
Eine weitere starke physiologische Aktivität kann durch Expression zur Bildung eines Multimers des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erzielt werden.
Humanes Delta-2 mit einer Multimer-Struktur kann hergestellt werden durch das Verfahren der Expression von Chimärenprotein mit einer humanen IgG-Fc-Region, wie beschrieben in den Beispielen 3 und 4, und Exprimieren des Multimers, welches die Disulfidbindung mit der Gelenkregion des Antikörpers aufweist, oder ein Verfahren zur Expression von Chimärenprotein, wobei die Antikörpererkennungsregion im C-Terminus oder N-Terminus exprimiert wird, und Umsetzung mit dem Polypeptid, das den extrazellulären Teil des so exprimierten humanen Delta-2 enthält, und dem Antikörper, welcher spezifisch die Antikörpererkennungsregion im C-Terminus oder N-Terminus erkennt. Unter den anderen Verfahren kann ein Verfahren, in dem ein Fusionsprotein mit lediglich der Gelenkregion des Antikörpers exprimiert wird, und das Dimer durch eine Disulfidbindung gebildet wird, erwähnt werden. Ein Multimer von humanem Delta-2, welches eine höhere spezifische Aktivität als das Dimer aufweist, kann erhalten werden. Das Multimer wird konstruiert durch ein fusioniertes Protein, welches zur Expression des Peptids in der C-terminalen, N-terminalen oder einer anderen Region hergestellt wird. Das Protein wird hergestellt in der Form unter Ausbildung der Disulfid-Bindung, ohne Beeinflussung jedweder Aktivitäten des übrigen humanen Delta-2. Die Multimerstruktur kann auch durch serielles oder paralleles Anordnen eines Peptids oder mehrerer Peptide, welches) aus Polypeptiden, welche die Aminosäuresequenzen der Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 enthalten, gewählt werden (wird), mittels gentechnischer Verfahren exprimiert werden. Andere bekannte Verfahren zur Bereitstellung einer Multimerstruktur, welche ein Dimeres oder mehr aufweist, können angewandt werden. Folglich beinhaltet die vorliegende Erfindung jedwede Polypeptide, die Aminosäuresequenzen enthalten, welche in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 und 3 beschrieben werden, in der Form einer dimeren oder höheren Struktur, welche durch gentechnische Verfahren hergestellt werden.
Ferner kann, in anderen Verfahren, ein Multimerisierungsverfahren unter Verwendung eines chemischen Vernetzers erwähnt werden. Zum Beispiel können Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid zur Vernetzung von Lysin-Resten, N-(γ-Maleimidbutyryloxy)succinimid zur Vernetzung der Thiolgruppe eines Cystein-Rests, und Glutaraldehyd zur Vernetzung zwischen Aminogruppen genannt werden. Das dimere oder höhere Multimer kann durch Anwendung dieser Vernetzungsreaktionen synthetisiert werden. Folglich beinhaltet die vorliegende Erfindung jedwede Polypeptide, welche Aminosäuresequenzen, beschrieben in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3, in der Form einer Dimer- oder Multimer-Struktur enthalten, die durch chemische Vernetzungsmittel hergestellt wird.
Bei der Anwendung einer medizinischen Behandlung, worin Zellen in vitro proliferiert und aktiviert und in den Körper zurückgeführt werden, kann humanes Delta-2 der hierin oben genannten Form direkt in das Medium zugesetzt werden, aber eine Immobilisierung kann ebenfalls vorgenommen werden. Das Immobilisierungsverfahren schließt das Anwenden von einer Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Peptid, unter Verwendung geeigneter Spacer oder der oben erwähnten Vernetzer, ein, und das Polypeptid kann kovalent an die Kulturgefäße gebunden werden. In Beispiel 11 werden ein Verfahren zur Herstellung des immobilisierten Materials und der Effekt davon veranschaulicht. Folglich schließt die vorliegende Erfindung jedwede Polypeptide, welche die in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 beschriebenen Aminosäuresequenzen enthalten, in einer auf der festen Oberfläche vorliegenden Form ein.
Da es sich beim natürlichen humanen Delta-2 um Zellmembranproteine handelt, kann die differenzierungsunterdrückende Wirkung in Beispiel 7, 8 und 12 durch Cokultivieren mit Zellen, welche diese Moleküle exprimieren, und undifferenzierten Blutzellen exprimiert werden. Folglich schließt diese Erfindung ein Verfahren zur Cokultivierung von undifferenzierten Zellen mit Zellen, welche unter Verwendung von DNA transformiert wurden, welche die Aminosäuresequenz in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 codiert, ein. Ein Beispiel wird in Beispiel 10 veranschaulicht. Die exprimierende Zelle bzw. Expressionszelle kann eine Affen-COS-7-Zelle oder Maus-Balb-3T3-Zelle sein, wie gezeigt in den Beispielen, aber Zellen von menschlichem Ursprung werden bevorzugt, und ferner können die Expressionszellen jedwede von menschlichen In-vivo-Blutzellen und somatischen Zellen anstatt von Zelllinien sein. Folglich kann das Polypeptid in vivo durch Integration in Vektoren für Gentherapie exprimiert werden. Beispiele für Vektoren für die Gentherapie sind ein Retrovirus-Vektor, Adenovirus-Vektor oder Adeno-verwandter Virus-Vektor.
Diese Tatsache legt nahe, dass die Inhibition der Bindung des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 an diese Rezeptoren angewandt werden kann, um Moleküle und Verbindungen zur Stimulierung von Zelldifferenzierung zu ermitteln. Die Methoden schließen Bindungsexperimente unter Verwendung von radioaktiven Isotopen, Luciferase-Assay unter Verwendung von Transkriptionssteuerungsfaktoren, ein Stromabwärts-Molekül des Notch-Rezeptors und die Computer-Simulation durch Röntgenstrukturanalyse ein. Folglich schließt die vorliegende Erfindung ein Screening-Verfahren für Pharmazeutika unter Verwendung des Polypeptids in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3 ein.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1: Northern-Blot-Analyse der Expression der humanen Delta-2-mRNA in menschlichen Organen.
2: Bindung von HD2EXIG der vorliegenden Erfindung und von HDIEXIG als einer Kontrolle an die aus Menschen stammende Jurkat-Zelllinie vom T-Zelltyp.
3: Bindung von HDIEXIG der vorliegenden Erfindung und von HDIEXIG als einer Kontrolle an CD34-positive Zellen von mononukleären Zellen des humanen Nabelschnurbluts.
Ausführungsformen der Erfindung
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, sollten aber nicht als diese Beispiele einschränkend ausgelegt werden.
Referenzbeispiel 1
Klonierung von PCR-Produkten unter Verwendung von humanem Delta-1-Primer und Bestimmung der Basensequenz.
Gemischte Primer, entsprechend der Aminosäuresequenz, konserviert in C-Delta-1 und X-Delta-1, d.h. Sense-Primer DLTS1 (Sequenzauflistung, SEQ ID Nr. 6) und Antisense-Primer DLTA2 (Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 7) wurden verwendet.
Ein synthetisches Oligonukleotid wurde hergestellt durch Verwenden eines automatischen DNA-Synthesizers mit dem Prinzip der immobilisierten Methodik. Der verwendete automatische DNA-Synthesizer war ein 391PCR-MATE von Applied Biosystems Inc., USA. Nukleotide, Träger mit immobilisiertem 3'-Nukleotid, Lösungen und Reagenzien wurden gemäß den Anweisungen von der gleichen Firma eingesetzt. Oligonukleotid wurde von dem Träger nach Beenden der vorgesehen Kopplungsreaktion und Behandeln des Oligonukleotidträgers, von welchem die Schutzgruppe des 5'-Terminus entfernt wurde, mit konzentriertem flüssigem Ammoniak bei Raumtemperatur während einer Stunde, isoliert. Zur Entfernung der Schutzgruppen von Nukleinsäure und Phosphorsäure wurde die Reaktantenlösung, welche Nukleinsäure enthielt, in der konzentrierten Ammoniaklösung im verschlossenen Gefäß bei 55°C über 14 Stunden lang stehen gelassen. Jedes Oligonukleotid, von welchem der Träger und die Schutzgruppen entfernt worden waren, wurde durch Verwendung von OPC-Patronen von Applied Biosystems Inc. gereinigt und durch Verwenden von 2% Trifluoressigsäure detrityliert. Primer wurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Endkonzentration von 100 pmol/μl für die PCR nach der Reinigung einzustellen.
Die Amplifikation dieser Primer mittels PCR wurde wie folgt durchgeführt. Aus humanem fötalem Gehirn stammende cDNA-Gemischlösung (QUICK-Clone cDNA, CLONTECH Inc., USA.), 1 μl, wurde verwendet. 5 μl 10 × Pufferlösung [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine], 4 μl dNTP-Mischung (Takara Shuzo Co., Japan), 5 μl Sense-Primer DLT51 (100 pmol/μl), welcher spezifisch für die oben genannten Wirbeltiere war, und 5 μl Antisense-Primer DLTA2 (100 pmol/μl) und 0,2 μl TagDNA-Polymerase (AmpliTaq, Takara Shuzo Co., Japan, 5 U/μl) wurden dazugegeben, und schließlich wurde entionisiertes Wasser zum Einstellen auf insgesamt 50 μl zugesetzt. Die PCR wurde ausgeführt durch 5 Zyklen eines Zyklus, bestehend aus Behandlung bei 95°C während 45 Sekunden, bei 42°C während 45 Sekunden und 72°C während 2 Minuten, ferner 35 Zyklen eines Zyklus, bestehend aus Behandlung bei 95°C während 45 Sekunden, bei 50°C während 45 Sekunden und 72°C während 2 Minuten, und schließlich 7 Minuten lang bei 72°C stehen gelassen. Ein Teil der PCR-Produkte wurde einer 2%-igen Agarosegelelektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid (Nippon Gene Co., Japan) gefärbt und unter Ultraviolettlicht beobachtet, um die Amplifikation von etwa 400 bp DNA zu bestätigen.
Die Gesamtmenge an PCR-Produkt wurde einer Elektrophorese mit 2%-igem Agarosegel, hergestellt mittels Agarose von niedrigem Schmelzpunkt (GIBCO BRL Inc., USA), unterzogen, mittels Ethidiumbromid gefärbt, wonach die etwa 400 bp großen Banden von PCR-Produkten mit dem Delta-Primer unter UV-Licht ausgeschnitten wurden, destilliertes Wasser mit dem gleichen Volumen wie das Gel zugegeben wurde, bei 65°C während 10 Minuten erwärmt wurde, und das Gel vollständig aufgelöst wurde. Das gelöste Gel wurde bei 15000 U/min während 5 Minuten zentrifugiert, um die Überstandslösung zu entfernen, nach Zugeben eines gleichen Volumens an TE-gesättigtem Phenol (Nippon Gene Co., Japan), und die gleiche Trennungs-Verfahrensweise wurde nach Zugeben von TE-gesättigter Phenol:Chloroform(1:1)-Lösung und Chloroform durchgeführt. DNA wurde aus der letztendlichen Lösung mittels Ethanolfällung zurück gewonnen.
Ein Vektor, pCRII-Vektor (Invitorogen Inc., USA, hierin nachstehend bezeichnet als pCRII) wurde verwendet. Der Vektor und die oben erwähnte DNA wurden in einem Molverhältnis von 1:3 vermischt, und die DNA wurde durch Verwenden von T4-DNA-Ligase (Invitorogen Inc., USA) in den Vektor ligiert. Der pCRII, in welchen die DNA integriert wurde, wurde einer Gentransduktion in "one shot"-kompetente E. coli-Zellen (Invitorogen Inc., USA) unterzogen, und diese wurden auf einer halbfesten Mediumplatte von L-Nährmedium bzw. "L-Broth" (Takara Shuzo Co., Japan), welche 50 μg/ml Ampicillin (Sigma Corp., USA) enthielt, ausplattiert und etwa 12 Stunden lang bei 37°C stehen gelassen. Die aufgetretenen Kolonien wurden statistisch ausgewählt, in 2 ml L-Broth-Flüssigmedium, das dieselbe Konzentration an Ampicillin enthielt, angeimpft bzw. inokuliert und etwa 18 Stunden lang bei 37°C auf Schüttelkultur wachsen gelassen. Die kultivierten Bakterienzellen wurden gewonnen, und das Plasmid wurde unter Verwendung von Wizard Miniprep (Promega Inc., USA) gemäß dem beigelegten Erläuterungsblatt abgetrennt. Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Die Integration des PCR-Produkts wurde durch Inzision bzw. Einschneiden von etwa 400 bp großer DNA bestätigt. Die Basensequenz der eingebauten DNA in dem bestätigten Klon wurde mittels des Fluoreszenz-DNA-Sequenzierers (Modell 373S, Applied System Inc., USA) bestimmt.
Referenzbeispiel 2
Klonierung von humanem Volllängen-Delta-1 und Analyse davon
Ein Screening von Klonen mit Volllängen-cDNA wurde durchgeführt durch Hybridisierung einer aus humaner Plazenta stammenden cDNA-Bibliothek (insertierte cDNA in λgt-11, CLONTECH Inc., USA) in Plaques, entsprechend 1 × 10⁶ Plaques. Die erzeugten Plaques wurden auf Nylonfilter (HybondN+: Amersham Inc., USA) überführt. Der transkribierte Nylonfilter wurde einer alkalischen Behandlung unterzogen [7 Minuten langes Stehenlassen auf Filterpapier, welches mit einer Mischung von 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH permeiert bzw. getränkt war], gefolgt von zweimaligen Neutralisierungsbehandlungen [Stehenlassen während 3 Minuten auf dem Filterpapier, getränkt mit einer Mischung von 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2) und 1 mM EDTA]. Anschließend wurde der Filter 5 Minuten lang in der 2-fach konzentrierten SSPE-Lösung [0,36 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat (pH 7,7) und 2 mM EDTA] geschüttelt, gewaschen und an der Luft getrocknet. Dann wurde der Nylonfilter 20 Minuten lang auf dem Filterpapier gelassen, welches mit 0,4 M NaOH getränkt war, und wurde 5 Minuten lang geschüttelt und mit 5-fach konzentrierter SSPE-Lösung gewaschen, und wurde dann erneut an der Luft getrocknet. Das Screening wurde mittels der humanen Delta-1-Sonde, die mit dem Radioisotop ³²P markiert war, unter Verwendung dieser Filter durchgeführt.
Die im Referenzbeispiel 1 hergestellte DNA-Sonde wurde wie folgt mit ³²P markiert. Ein DNA-Fragment wurde mittels EcoRI aus pCRII ausgeschnitten, wobei es sich um eine Insertion eines gereinigten PCR-Produkts (etwa 400 bp) durch den humanen Delta-1-Primer handelte, und die Gensequenz bestimmt war, und es wurde aus einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt isoliert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde durch einen DNA-Markierungs-Kit (Megaprime DNA labeling system: Amersham, USA) markiert. 5 μl Primer-Lösung und entionisiertes Wasser wurden zu den 25 ng DNA zugegeben, um das Gesamtvolumen von 33 μl zu erreichen, welches 5 Minuten lang in einem siedenden Wasserbad behandelt wurde. 10 μl Reaktionspufferlösung, welche dNTP enthielt, 5 μl α-³²P-dCTP und 2 μl T4-DNA-Polynukleotidkinase-Lösung wurden dazugegeben, und 10 Minuten lang im Wasserbad bei 37°C behandelt. Anschließend wurde die Mischung mittels einer Sephadex-Säule (Quick Spin Column Sephadex G-50: Boehringer Mannheim Inc., Deutschland) gereinigt und dann 5 Minuten lang in dem siedenden Wasserbad behandelt und für die Anwendung 2 Minuten lang auf Eis gekühlt.
Die Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt. Der hierin oben hergestellte Filter wurde in die Vorhybridisierungslösung, welche aus SSPE-Lösung, wobei die Endkonzentration jedes Bestandteils davon bei 5-facher Konzentration eingestellt war, der 5-fachen Konzentration an Denhardt'scher Lösung (Wako Pure Chemicals, Japan), 0,5% SDS (Natriumdodecylsulfat, Wako Pure Chemicals, Japan) und 10 μg/ml, durch siedendes Wasser denaturierter Lachssperma-DNA (Sigma, USA) bestand, eingetaucht und bei 65°C während 2 Stunden geschüttelt, und dann wurde der Filter in die Hybridisierungslösung mit der gleichen Zusammensetzung wie die oben genannte Vorhybridisierungslösung, welche ³²P-markierte Sonde enthielt, durch das oben beschriebene Verfahren eingetaucht und 16 Stunden lang bei 65°C geschüttelt, um die Hybridisierung durchzuführen.
Der Filter wurde dann in 0,1% SDS enthaltende SSPE-Lösung eingetaucht, bei 55°C geschüttelt und zweimal gewaschen, ferner in eine 10-fache Verdünnung von SSPE-Lösung, welche 0,1% SDS enthielt, eingetaucht und viermal bei 55°C gewaschen. Eine Autoradiografie des gewaschenen Filters wurde unter Verwendung von Verstärker-Folie durchgeführt. Klone des stark exponierten Anteils wurden abgesammelt, und die erhaltenen Plaques wurden erneut ausplattiert und durch dasselbe Verfahren, wie hier oben genannt, gescreent, um einzelne Klone vollständig zu separieren.
Die so isolierten Phagenklone waren sieben Klone. Phage von allen diesen Klonen wurde bei etwa 1 × 10⁹ pfu hergestellt, die Phagen-DNA wurde unter Verwendung von Withered Lambda Rep (Promega Corp., USA) gereinigt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und in pBluescript KS (Stratagene Inc., USA) inseriert, welcher mit EcoRI in der gleichen Weise verdaut worden war. DNA-Sequenzen der beiden Enden dieser Klone wurden mit einem DNA-Sequenziergerät analysiert. Bei den drei Klonen D5, D6 und D7 handelte es sich um den Klon, welcher die DNA-Sequenz von Nr. 1 bis 2244 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 enthält. Ein Klon D4 war ein Klon, der DNA-Sequenz von Nr. 999 bis 2663 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 enthält. Aus den Klonen D5 und D4 wurde die Deletionsmutante durch Verwendung des Kilosequenz-Deletions-Kits (Takara Shuzu Co., Japan) gemäß einer Beschreibung in der beiliegenden Anleitung erzeugt. Die Volllängen-cDNA-Basensequenz der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung des DNA-Sequenziergeräts aus beiden Richtungen, der 5'-Richtung und der 3'-Richtung, bestimmt.
Durch Anwenden der XhoI-Stelle bei Nr. 1214 in der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 wurden D4 und D5 mit dem Restriktionsenzym XhoI verdaut, um das Plasmid pBSDel-1 herzustellen, welches die volle Länge der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 enthält.
Beispiel 1
Klonierung von cDNA des neuen humanen Delta-2.
Die Genklonierung des neuen humanen Delta-Homologs wurde unter Verwendung der Sonde des humanen Delta-1-Gens in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 durchgeführt.
Die Sonde wurde mittels PCR unter Verwendung einer Matrize des humanen Delta-1-Volllängen-Gens pBSDel-1, in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8, welche im Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, oder des Vektors pUCDL-1F, welcher bei der oben beschriebenen Institution hinterlegt worden war, hergestellt. Ein Sense-Primer in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 9 (DNA-Sequenz, welche einer Sequenz von Nr. 636 bis 655 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 entspricht) und ein Antisense-Primer in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 10 (eine komplementäre Kette von DNA-Sequenz, entsprechend einer Sequenz von Nr. 1332 bis 1351 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8) wurden als Primer verwendet.
Eine Lösungszusammensetzung für die Amplifikation mittels PCR war eine Lösungszusammensetzung, wie sie im Referenzbeispiel 1 beschrieben wurde, mit Ausnahme des Primers und der Matrize. Die PCR wurde bei den folgenden Bedingungen durchgeführt: Ein Zyklus, bestehend aus Zyklieren bei 95°C während 45 Sekunden, bei 55°C während 45 Sekunden und bei 72°C während 2 Minuten, wobei ein Zyklus davon über 30 Zyklen ausgeführt wurde, und schließlich wurde die Mischung bei 72°C 7 Minuten lang stehen gelassen. Ein Teil des PCR-Produkts wurde einer 1%-igen Agarosegelelektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid (Nippon Gene Corp., Japan) gefärbt und mittels UV-Licht beobachtet, um die Amplifikation von etwa 700 bp großer cDNA zu bestätigen.
Das PCR-Produkt wurde aus dem Agarosegel herausgeschnitten, und die DNA-Sonde wurde gemäß einer Beschreibung auf dem beigelegten Anleitungsblatt im Geneclean II-Kit (Bio101 Corp., USA) gereinigt und mit destilliertem Wasser auf 25 ng/μl verdünnt, um eine DNA-Sonde herzustellen, welche die in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 11 gezeigte Sequenz aufweist.
Eine humane fötale Lungen-cDNA-Bibliothek, hergestellt mittels λ gt10 (Clontech Corp., USA), wurde unter Anwendung der oben genannten Sonde gemäß einem in dem Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren gescreent. Beim Screening wurde eine Hybridisierung bei 55°C 16 Stunden lang ausgeführt, mit Waschbedingungen zum Eintauchen in 1% SDS enthaltende SSC-Lösung, Schütteln bei Raumtemperatur und sechsmaligem Waschen. Ferner wurden ein Konditionierungs-Eintauchen in SSC-Lösung, welche 3-fach verdünnt war und 0,1% SDS enthielt, und ein Waschen bei 55°C ausgeführt.
Es wurden etwa 120 Millionen Plaques beim ersten Screening unter der oben genannten Bedingung gescreent, und als Ergebnis wurden etwa 120 als positiv bestimmte Plaques einem zweiten Screening durch ein ähnliches Verfahren unterzogen, um jeden Phagen zu trennen.
Die isolierte Phagen-DNA wurde gemäß einem Verfahren im Referenzbeispiel 2 gereinigt, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, an pBluescript KS ligiert, und die DNA-Sequenz wurde durch ein DNA-Sequenzierungsgerät durch das gleiche Verfahren, wie es im Referenzbeispiel 1 beschrieben wurde, analysiert.
Bei etwa mehr als der Hälfte der Zahl an Klonen handelte es sich um humanes Delta-1, welches die Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 8 aufwies. Unter diesen wurden fünf Klone festgestellt, die ähnlich zu humanem Delta-1 waren, aber eine dazu unterschiedliche Gensequenz aufwiesen und neue Sequenzen enthielten, welche nicht in Genbank Release 98 durch die Computer-Software Genetyx CD Ver 36 (Software Development Corp.) gefunden wurden. Eine Deletionsmutante der DNA-Sequenz dieser Klone wurde unter Anwendung des Kilosequence-Deletions-Kits (Takara Shuzo Co., Japan) gemäß dem beigefügten Anleitungs-Handbuch hergestellt. Die Basensequenz von Volllängen-cDNA der vorliegenden Erfindung wurde aus beiden Richtungen, der 5'-Richtung und 3'-Richtung, durch Kombinieren mit einem Primer-"Walking"-Verfahren unter Verwendung des DNA-Sequenziergeräts ermittelt.
Als ein Ergebnis codiert der Klon 4A die Gensequenz von Nr. 526 bis 3339 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 (mit der Maßgabe, dass die Sequenz von Nr. 1296 bis 1515 deletiert war); der Klon 22 codiert die Gensequenz von Nr. 1029 bis 3213 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4; Klon 65 codiert die Gensequenz von Nr. 754 bis 3228 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4; der Klon 90 codiert die Gensequenz von Nr. 552 bis 2618 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4; und der Klon 105 codiert die Gensequenz von Nr. 669 bis 3339 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 (mit der Maßgabe, dass bei dem Klon 105, da viele Insertionen unbekannter Sequenzen, welche in den anderen Klonen nicht gefunden wurden, in vielen Regionen beobachtet wurden, dieser aus einer unreifen mRNA vor dem Splicen abstammen könnte). Darüber hinaus war im Klon 65 das Cytosin der DNA-Sequenz Nr. 2294 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 durch Thymin ersetzt. Deshalb war das Serin der DNA-Sequenz Nr. 647 in dem Sequenzprotokoll durch Threonin ersetzt.
Diese Klone enthielten jedoch keine Gensequenz, welche die Volllängen-Aminosäuresequenz codiert, weshalb eine weitere neue Sonde hergestellt wurde, und das Screening wiederholt wurde.
Eine neue Sonde wurde hergestellt durch PCR unter Verwendung der Matrize von Klon 4A, welcher im oben genannten Verfahren isoliert worden war. Eine Sonde wurde durch Verwenden des Sense-Primers der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 12 (welcher der Sequenz von Nr. 526 bis 545 der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 entspricht) und eines Antisense-Primers der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 13 (welcher der Sequenz von Nr. 918 bis 937 von DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 entspricht), und auf die gleiche Weise, wie vorangehend beschrieben, hergestellt. Die DNA-Sequenz dieser Sonde ist in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 14 gezeigt.
Das Screening der cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Sonde wurde in der gleichen Weise wie beim ersten Screening-Vorgehen ausgeführt. Vorausgesetzt, dass die Hybridisierung bei 65°C während 16 Stunden durchgeführt wurde, wurde das Waschen durch Eintauchen in 0,1% SDS enthaltende SSC-Lösung mit Schütteln bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei weiterhin eingetaucht wurde in 10-fach verdünnte SSC-Lösung mit 0,1% SDS, und wobei zweimal bei 65°C gewaschen wurde.
Neue Klone wurden durch das Screening identifiziert. Als ein Ergebnis der Gensequenzbestimmung wurden der Klon P mit einer identischen Sequenz zu DNA in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, und der Klon RA mit der DNA-Sequenz von Nr. 263 bis 2768 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, ermittelt. Diese zwei Klone wurden isoliert und als Klone identifiziert, welche die Volllänge des neuen humanen Delta-2-Proteins codieren. Ein Vektor, welcher Klon P enthält, der in die EcoRI-Stelle von pBluescript KS ligiert ist, wird als pBSDL-2 bezeichnet.
Beispiel 2
Organe, welche neues humanes Delta-2 exprimieren
Um nach der Expression der neuen humanen Delta-2-mRNA zu suchen, wurden Filter von "Human Multiple Tissue Northern Blot", "Human Multiple Tissue Northern Blot II", "Human Multiple Tissue Northern Blot III" und "Human Fetal Multiple Tissue Northern Blot II" (Clontech Corp., USA), für welche mRNA vorausgehend transkribiert wurde, verwendet und DNA, welche die Sequenz der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 14 aufwies, beschrieben im Beispiel 1, wurde als Sonde eingesetzt. Die ³²P-Markierung wurde durch das oben erwähnte Vorgehen unter Verwendung des vorangehend erwähnten DNA-Markierungs-Kits (Megaprime DNA-Markierungssystem: Amersham Corp., USA) durchgeführt, und die Hybridisierung wurde gemäß dem Anleitungs-Handbuch durchgeführt, welches den oben genannten Filtern beilag, um die Expression nachzuweisen. Das Ergebnis wird in 1 gezeigt.
Als Ergebnis wurden zwei Typen der exprimierten mRNA mit einer Länge von etwa 3,8 kb und 5 kb festgestellt. Die stärkste Expression in humanen adulten Geweben als Expressionsort war das Herz. Relativ starke Expressionen wurden in der Plazenta, den Eierstöcken, im Dünndarm, der Schilddrüse und dem Rückenmark beobachtet. Offensichtliche Expressionen wurden beobachtet in Skelettmuskulatur, Lunge, Leber, Pankreas, Thymus, Prostata, Lymphknoten, Luftröhre, Nebennieren-Drüse und dem Knochenmark. Äußerst schwache Expressionen wurden beobachtet im Magen, in der Milz und im Dickdarm. Fernerhin wurde keine Expression beobachtet im Gehirn, in den Nieren, den Hoden und in Lymphozyten des peripheren Bluts. Eine hohe Expression wurde, unter den humanen fötalen Geweben, in fötaler Lunge beobachtet. Eine starke Expression wird in der fötalen Niere beobachtet, und schwache Expressionen wurden in der fötalen Leber und im fötalen Gehirn beobachtet.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das neue humane Delta-2 der vorliegenden Erfindung eine Funktion in Bezug auf das Herz im Erwachsenen aufweisen könnte. Ferner könnte es eine Funktion gegenüber Gefäßzellen aufweisen, auf Grund der Feststellung einer Expression in der fötalen Lunge.
Beispiel 3
Herstellung von Expressionsvektoren des neuen humanen Delta-2
Unter Verwendung des Vektors pBSDL-2 von Beispiel 1, welcher das neue humane Volllängen-Delta-2 codiert, wurden die in den folgenden Punkten 1)–5) erwähnten Expressionsvektoren für humane Delta-2-Proteine hergestellt. Die Addition von Restriktionsenzym-Stellen und die Insertion von kurzer Gensequenz wurden unter Verwendung des "ExSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis"-Kits (Stratagene Inc., USA) bzw. PCR-Basierten ortsgerichteten Mutagenese-Kits gemäß dem Anweisungs-Handbuch durchgeführt.
1) Expressionsvektor von sekretorischem neuen humanen Delta-2-Protein (HD2EX).
Die cDNA, welche das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 500 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2 aufweist, codiert, wurde in den Expressionsvektor pcDNA3 ligiert, welcher den Cytomegalovirus-Promotor und das Neomycin-Resistenz-Gen enthielt, um den Expressionsvektor herzustellen.
Für die Herstellung von Expressionsvektor des neuen humanen Delta-2 wurde, zur Herbeiführung einer stabilen Expression des Genprodukts, eine EcoRI-Stelle in den 20 bp stromaufwärts, für die 5'-Richtung, des Initiations-Codons hinzugefügt (Gensequenz Nr. 277 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4). Unter Anwendung des obenstehenden Mutagenese-Kits wurde in ein Plasmid pBSDL-2, welches die DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, und Volllängen-cDNA von humanem Delta-2 enthielt, als die Matrize eingesetzt, und Oligonukleotide mit den Gensequenzen in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 15 und SEQ ID Nr. 16 wurden als die Primer eingesetzt. Dann wurde DNA zur Hinzufügung einer EcoRI-Stelle 20 bp stromaufwärts, für die 5'-Richtung, hergestellt. Hierin nachstehend wird dieses Plasmid als pBSEco-DL-2 bezeichnet.
Als Nächstes, um das Terminations-Codon und eine Stelle für das Restriktionsenzym NotI nach der extrazellulären C-terminalen Position, d.h. nach DNA-Sequenz, codierend die Aminosäuresequenz bis zu Nr. 500, Serin-Rest, in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2, durch die Anwendung des Mutagenese-Kits in ähnlicher Weise hinzuzufügen, wurde unter Verwendung von pBSEco-DL-2 als Matrize und unter Einsatz von Oligonukleotiden mit den Gensequenzen der Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 17 und SEQ ID Nr. 18 als Primer die Addition des Terminations-Codons und der NotI-Stelle durchgeführt. Dann wurde der resultierende Vektor mit EcoRI und NotI verdaut, und ein etwa 1600 bp großes herausgespaltenes Genfragment wurde in pcDNA3 ligiert, welcher mit den gleichen Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHD2EX bezeichnet.
2) Expressionsvektor von FLAG-Chimärenprotein von sekretorischem neuen humanen Delta-2 (HD2EXFLAG)
Die cDNA, die das Chimärenprotein mit der Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 500 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2, und an diesem C-Terminus die FLAG-Sequenz codiert, wurde in den Expressionsvektor pcDNA3 ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Unter Verwendung von pBSEco-DL-2 als Matrize, wurde die FLAG-Sequenz in dem extrazellulären C-Terminus hinzugefügt, d.h. nach dem Serinrest an der Aminosäure Nr. 500 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2. Danach, um das Terminations-Codon und die Restriktionsenzym-Stelle NotI unter Verwendung des Mutagenese-Kits zu addieren, und unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Gensequenzen in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 19 und SEQ ID Nr. 18 als Primer, wurden ein die FLAG-Sequenz codierendes Gen, das Terminations-Codon und die NotI-Stelle im C-Terminus hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mit EcoRI und NotI verdaut, und ein etwa 1600 bp großes herausgespaltenes Genfragment wurde an, in ähnlicher Weise mit Restriktionsenzym behandelten, pcDNA3 ligiert, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHD2EXFLAG bezeichnet.
3) Expressionsvektor von IgG1Fc-Chimärenprotein von sekretorischem humanen Delta-2 (HD2EXIg).
Eine Gensequenz, codierend Polypeptid mit Aminosäuresequenz gemäß Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 2, und an diesem C-Terminus wurde eine Aminosäuresequenz einer Fc-Region, stromabwärts der Gelenkregion von humanem IgG1, in den Expressionsvektor pcDNA3 ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Die Herstellung von fusioniertem Protein mit Immunoglobulin-Fc-Protein wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren von Zettlmeissl et al. (Zettlmeissl et al., DNA cell Biol., 9, 347–354, 1990). Ein Gen unter Verwendung von Genom-DNA, mit Intron, wurde angewandt, und das Gen wurde unter Verwendung von PCR präpariert bzw. hergestellt.
Humane Genom-DNA wurde als eine Matrize verwendet, und eine genomische Gensequenz, codierend die humane IgG1Fc-Region, wurde einer PCR unterzogen durch Verwenden von Primern eines Oligonukleotids mit der Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 23, mit einer Stelle für das Restriktionsenzym BamHI, und eines Oligonukleotids mit der Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 24, mit einer Stelle für das Restriktionsenzym Xbal. Die so erhaltene etwa 1,4 kbp große Bande wurde gereinigt und mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI (Takara Shuzo Co., Japan) verdaut, und die Gene wurden in pBluescript, welcher in ähnlicher Weise durch Restriktionsenzym behandelt worden war, durch Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, wodurch man die Subklonierung ausführte.
Später wurde die Plasmid-DNA gereinigt, und die Gensequenz wurde unter Verwendung eines Sequenziergeräts bestätigt, wonach die Gensequenz als genomische DNA in der Gelenkregion der Schwerkette des humanen IgG1 bestätigt wurde (Auf die Sequenz wird Bezug genommen bei Kabat et al., Sequence of Immunological Interest, NIH-Veröffentlichung Nr. 91–3242, 1991). Dieses Gen weist nämlich die Stelle für das Restriktionsenzym BamHI am 5'-Terminus und eine XbaI-Stelle am 3'-Terminus auf, und wird mit Hilfe der BamHI-Stelle und der XbaI-Stelle von pBluescript KS kloniert. Hierin nachstehend wird dieses Plasmid als pBShIgFc bezeichnet.
Unter Verwendung des pBSEco-DL-2 als Matrize und unter Verwendung des Mutagenese-Kits, wurde die Restriktionsenzym-BamHI-Stelle in dem extrazellulären C-Terminus hinzugefügt, d.h. nach Serin bei Nr. 500 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 3. Weiterhin wurden, um die Restriktionsenzym-NotI-Stelle an den stromabwärts gelegenen [Bereich] zum Ligieren von DNA, welche das oben genannte humane Immunoglobulin IgG1Fc codiert, hinzuzufügen, diese Stellen durch Verwenden von Oligonukleotiden mit den Gensequenzen in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 20 und SEQ ID Nr. 18 und unter Verwendung des Mutagenese-Kits hinzugefügt. Während dieses Verfahrens wurde, damit das Aminosäurecodierende Leseraster nicht als Ergebnis der Addition der BamHI-Stelle verschoben wird, AGC in der DNA-Sequenz, codierend für das Serin Nr. 500, in der DNA-Sequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4, durch TCG ersetzt.
Der so hergestellte Vektor wurde mit NotI und BamHI verdaut, und ein etwa 1200 bp großes Genfragment, welches verdaut und herausgespalten wurde aus dem oben genannten pBShIgFc mittels NotI und BamHI, wurde in den verdauten Vektor ligiert, um letztendlich den Vektor herzustellen, der die Genfragmente enthält, welche das angezielte sekretorische humane Delta-2-IgG1Fc-Chimärenprotein codieren. Schließlich wurde dieser Vektor mit EcoRI und NotI verdaut, und ein etwa 3000 bp großes herausgespaltenes Genfragment wurde in pcDNA3 ligiert, welches in ähnlicher Weise mit den Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHD2EXIg bezeichnet.
4) Expressionsvektor von humanem Volllängen-Delta-2-Protein (HD2F)
Die cDNA, welche das Polypeptid von Nr. 1 bis 659 der Aminosäuresequenz in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 4 codiert, wurde in den Expressionsvektor pcDNA3 ligiert, wodurch der Expressionsvektor hergestellt wurde.
Um das Terminations-Codon und eine Restriktionsenzym-NotI-Stelle im C-Terminus der Volllängen-Sequenz zu addieren, d.h. nach Val bei Nr. 659 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 3, unter Verwendung von pBSEco-DL-2 als Matrize und unter Anwendung des Mutagenese-Kits, wurden in ähnlicher Weise Oligonukleotide mit den Gensequenzen in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 21 und SEQ ID Nr. 18 als Primer eingesetzt, und das Terminations-Codon und die NotI-Stelle wurden im C-Terminus hinzugefügt. Dieser Vektor wurde mittels EcoRI und NotI verdaut, und ein etwa 2200 bp großes herausgespaltenes Genfragment wurde in pcDNA3 ligiert, welcher ähnlich mit Restriktionsenzymen behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHD2F bezeichnet.
5) Expressionsvektor von FLAG-Chimärenprotein (HD2FLAG) von neuem humanem Volllängen-Delta-2.
Die cDNA, welche für das Chimärenprotein mit einer Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 659 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 3, und an diesem C-Terminus für die FLAG-Sequenz, codiert, wurde in den Expressionsvektor pcDNA3 ligiert, um den Expressionsvektor herzustellen.
Um die FLAG-Sequenz, das Terminations-Codon und die Stelle für das Restriktions-Enzym NotI im C-Terminus, unter Verwendung von pBSEco-DL2 als Matrize, hinzuzufügen, wurden die Oligonukleotide mit den Gensequenzen in den Sequenzauflistungen SEQ ID Nr. 22 und SEQ ID Nr. 18 als Primer verwendet, und ein die FLAG-Sequenz codierendes Gen und das Terminations-Codon sowie die NotI-Stelle wurden im C-Terminus hinzugefügt.
Dieser Vektor wurde mittels EcoRI und NotI verdaut, und etwa 2100 bp große herausgespaltene Genfragmente wurden in pcDNA3 ligiert, welcher in ähnlicher Weise mit Restriktionsenzym behandelt worden war, um den Expressionsvektor zu konstruieren. Dieser Vektor wurde als pHD2FLAG bezeichnet.
Beispiel 4
Gentransfer von Expressionsvektoren in Zellen und Expression
Die im Beispiel 3 hergestellten Expressionsvektoren wurden in COS-7-Zellen überführt (welche erhalten wurden von RIKEN Cell Bank, Physical and Chemical Research Institute, Japan, RCB0539).
Eine Zellkultur vor dem Gentransfer wurde durchgeführt mittels Kultivieren in D-MEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium, GIBCO-BRL Inc., USA), 10% FCS. Einen Tag vor dem Gentransfer wurde das Medium der Zellen ausgewechselt, um die Zellzählung auf 5 × 10⁵ Zellen/ml einzustellen, und es wurde über Nacht kultiviert. Am Tag des Gentransfers wurden die Zellen mittels Zentrifugation sedimentiert, zweimal mit PBS(–) durch Zentrifugation gewaschen und zu 1 × 10⁷ Zellen/ml in 1 mM MgCl₂ und PBS(–) hergestellt. Der Gentransfer wurde durchgeführt mittels Elektroporation unter Verwendung der Gentransfer-Vorrichtung "Gene-Pulsar" (BioRad Inc., USA). Die oben genannte Zellsuspension, 500 μl, wurde in einer Kammer gesammelt, die exklusiv für Elektroporation bestimmt war (0,4 cm), 20 μg Expressionsvektor wurden zugegeben, und dies wurde 5 Minuten lang auf Eis stehen gelassen. Danach wurde zweimal Spannung unter der Bedingung von 3 μF, 450 V, angelegt, und zwischen den zwei Stromstößen wurde die Zellmischung 1 Minute lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach 5 Minuten Stehenlassen auf Eis wurden die Zellen im Kulturmedium bei einem Durchmesser von 10 cm ausplattiert, wobei zuvor 10 ml Medium zugesetzt wurden, und bei 37°C in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator kultiviert.
Am nächsten Tag wurde die Kultur- Überstandslösung entfernt, und die an der Schale adhärierten Zellen wurden zweimal mit 10 ml PBS(–) gewaschen. In den Fällen der Expressionsvektoren pHD2EX, pHD2EXFLAG und pHD2EXIg, wurden 10 ml serumfreies D-MEM zugegeben, und es wurde 7 Tage lang weiter kultiviert. Die Kultur- Überstandslösung wurde gewonnen und der Puffer wurde durch Centricon 30 (Amicon Inc., USA) gegen PBS(–) ausgetauscht, und gleichzeitig wurde die Lösung 10-fach konzentriert, um die Zellkultur-Überstandlösung zu erhalten.
In den Fällen von pHD2F und pHD2FLAG wurde das Medium durch D-MEM, enthaltend 10% FCS, ausgewechselt und weitere 3 Tage lang kultiviert, um Zell-Lysat herzustellen. Somit wurden 2 × 10⁶ Zellen in 200 μl Zell-Lysis-Puffer [50 mM Hepes (pH 7,5), 1% Triton X100, 10% Glycerol, 4 mM EDTA, 50 μg/ml Aprotinin, 100 μM Leupeptin, 25 μM Pepstatin A und 1 mM PMSF] suspendiert, 20 Minuten lang auf Eis stehen gelassen und bei 14000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert, um die Überstandslösung zu entfernen, wodurch man das Zell-Lysat erhielt.
Unter Verwendung der so erhaltenen Proben wurde die Expression von Proteinen mittels Western-Blotting nachgewiesen.
Konzentrierte Kultur-Überstände oder Zell-Lysate wurden nämlich einer SDS-PAGE unter Verwendung eines Elektrophorese-Reservoirs und eines Polyacrylamidgels für SDS-PAGE (Gradienten-Gel von 5–20%) (ACI Japan Inc., Japan) gemäß dem beiliegenden Anweisungs-Handbuch unterzogen. Proben wurden durch Behandlung in siedendem Wasser während 5 Minuten mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) zur Reduktion, sowie im nicht-reduzierenden Zustand ohne Anwenden der oben genannten Behandlung, vorbereitet. Als Marker wurde der Rainbow-Marker (höheres Molekulargewicht, Amersham Inc.) verwendet. Probenpuffer-Lösung und Elektrophoresepuffer wurden unter Bezug auf das beiliegende Anweisungsblatt hergestellt. Als die SDS-PAGE abgeschlossen war, wurde das Acrylamid-Gel auf PVDF-Membranfilter (BioRad Inc., USA) unter Anwendung der "Mini Trans Blot Cell" (BioRad Inc.) überführt.
Der so hergestellte Filter wurde über Nacht bei 4°C in Blockace (Dainippon Pharm. Co., Japan) oder TBS-T [20 mM Tris, 137 mM NaCl (pH 7,6) und 0,1% Tween 20], enthaltend 5% Rinderserumalbumin (Sigma Co., USA) zur Blockierung, geschüttelt. Danach wurde, gemäß den Erläuterungen des beiliegenden Anweisungsblatts des ECL-Western-Blotting-Detektionssystems (Amersham Inc., USA), monoklonaler Anti-humanes Delta-2-Maus-Antikörper, welcher im Beispiel 6 beschrieben wurde, oder monoklonaler Anti-FLAG-Maus-Antikörper M2 (Kodak Inc., USA) für die FLAG-Chimäre (HD2EXFLAG und HD2FLAG) als primärer Antikörper verwendet, und mit Peroxidase markierter Anti-Maus-Ig-Schaf-Antikörper (Amersham Corp., USA) wurde als der sekundäre Antikörper in die Reaktion eingebracht. Im Fall der IgG-Chimäre wurden mit Peroxidase markierte Anti-Human-Ig-Schaf-Antikörper (Amersham Inc., USA) in die Reaktion eingebracht.
Die Reaktionszeit für Antikörper belief sich auf 1 Stunde bei Raumtemperatur, und nach einer Zeitdauer jeder Reaktion wurde das Waschen durch Schütteln in TBS-T bei Raumtemperatur während 10 Minuten dreimal durchgeführt. Nach dem letzten Waschen wurde der Filter in die Reaktionslösung des ECL-Western-Blotting-Detektionssystems (Amersham Inc., USA) während 5 Minuten eingetaucht und dann zur Exposition an Röntgenfilm in Polyvinylidenchlorid-Einwickelfolie eingepackt.
Als Ergebnis, in der Probe mit Reduktions-Behandlung, wurden Banden, welche ein Protein zeigten, das durch den Transfer von pHD2EX und pHD2EXFLAG erhalten worden war, bei einer Bandengröße von etwa 65 kD nachgewiesen, und ein Protein, das durch den Transfer von pHD2EXIg erhalten worden war, wurde bei einer Bande von etwa 95 kD nachgewiesen. In der nicht-reduzierten Probe wurden die Banden, welche durch Transfer von pHD2EXIg erhaltenes Protein zeigten, als leicht unscharfe Banden bei 150 kD bis 200 kD, hauptsächlich etwa 180 kD, nachgewiesen, was das etwa 2-Fache des Reduktions-Schritts zeigte, weshalb folglich ein Dimer gebildet worden war.
In diesen Experimenten, obwohl Zell-Lysat und Kultur-Überstand von COS-7-Zellen, in welche pcDNA3-Vektor als Kontrolle transferiert worden war, getestet wurden, wurden jedoch keine Banden, die gegen monoklonalen Antihumanes Delta-2-Maus-Antikörper, Anti-FLAG-Antikörper, und Anti- Human-Ig-Antikörper reagierten, nachgewiesen.
Deshalb können diese fünf Expressionsvektoren die Ziel-Polypeptide herstellen.
Beispiel 5
Reinigung von sekretorischen neuen humanen Delta-2-Proteinen aus Gentransfer-Zellen
Kulturüberstände von COS-7-Zellen, enthaltend HD2EXFLAG oder HD2EXIg, für die beide eine Expression durch das Verfahren im Beispiel 4 nachgewiesen worden war, wurden in großem Maßstab hergestellt, und jedes Chimärenprotein wurde mittels Affinitätssäule(n) gereinigt.
Im Fall von HD2EXFLAG wurden 2 Liter des durch das Verfahren in Beispiel 4 erhaltenen Kultur-Überstands durch eine Säule hindurchgeleitet, welche mit Anti-FLAG-M2-Affinitätsgel (Eastman Kodak, USA) gepackt war, und das Chimärenprotein wurde in der Säule durch die Wirkung der Affinität zwischen der FLAG-Sequenz des Chimärenproteins und des Anti-FLAG-Antikörpers des Gels adsorbiert. Bei der Säule handelte es sich um eine Einweg-Säule (BioRad Inc., USA) mit einem Innendurchmesser von 10 mm, welche mit einer Packung von 5 ml des oben genannten Gels verwendet wurde. Ein Kreislaufsystem, welches aus Mediumflasche -> Säule -> peristaltische Pumpe -> Mediumflasche bestand, wurde aufgestellt. Der Kreislauf wurde mit einer Strömung von 1 ml/min während 72 Stunden laufen gelassen. Danach wurde die Säule mit 35 ml PBS(–) gewaschen und mit 50 ml 0,5 M Tris-Glycin (pH 3,0) eluiert. Das Eluat von 25 Fraktionen von jeweils 2 ml wurde in den Röhrchen gesammelt, und jede Fraktion wurde mit 200 μl 0,5 M Tris-HCl (pH 9,5), welches zuvor in jedes Röhrchen zugesetzt worden war, neutralisiert.
Jeweils 10 μl Eluat-Fraktion des sekretorischen FLAG-Chimären-Proteins, welches durch das oben genannte Verfahren gereinigt worden war, wurde der im Beispiel 4 beschriebenen Reduktionsbehandlung unterzogen. Eine SDS-PAGE-Elektrophorese durch 5-10%-Gradienten-Polyacrylamidgel wurde durchgeführt. Nach Fertigstellen der Elektrophorese wurde eine Silberfärbung durch Verwendung des Wako-Silver-Stain-Kit II (Wako Pure Chemicals, Japan) gemäß den Erläuterungen des beigelegten Anweisungsblatts durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Bande von HS2EXFLAG in den Eluat-Fraktionen Nr. 4 bis 8 nachgewiesen. Das Molekulargewicht davon war identisch mit dem im Beispiel 4 erhaltenen Ergebnis des Western-Blottings mit Anti-FLAG-Antikörper. Deshalb wurde gereinigtes HD2EXFLAG erhalten.
Beim IgG1Fc-Chimärenprotein, d.h. HD2EXIg, wurden 2 Liter Kultur-Überstand an eine Protein A-Sepharose-Säule (Pharmacia Inc., Schweden) gemäß des gleichen Verfahrens wie beim FLAG-Chimärenprotein, adsorbiert, um die Eluat-Fraktionen aufzufangen. Unter Verwendung eines Teils des Eluats, in gleicher Weise wie beim FLAG-Chimären-Protein, wurden eine Bestimmung der Eluat-Fraktion, eine Identifizierung der Größe und der Nachweis der Reinheit durch SDS-PAGE-Elektrophorese und eine Silberfärbung im reduzierten Zustand durchgeführt. Als ein Ergebnis wurden Banden in der Eluat-Fraktion Nr. 4 bis 15 nachgewiesen. Die Größe davon ist identisch mit dem Ergebnis des Western-Blottings unter Verwendung von Anti- Human-Ig. Daher hat man gereinigtes HD2EXIg erhalten.
Das Molekulargewicht des so gereinigten HD2EXFLAG wurde weiter ausführlich durch SDS-PAGE analysiert. Das Molekulargewicht wurde als zwei Banden bestätigt, von denen eine 65,8 kD und die andere 61,7 kD groß war. Diese unterschiedlichen zwei Banden, welche unterschiedliche Molekulargewichte aufwiesen, wurden auf PVDF gemäß des Verfahrens in Beispiel 4 überführt, und zehn Aminosäuren der N-terminalen Aminosäuresequenz wurden durch einen Aminosäure-Sequenzierer (ABI Corp., USA) ermittelt. Als Ergebnis war jede Aminosäuresequenz identisch mit der Aminosäuresequenz von Nr. 1 bis 10 in der Sequenzauflistung SEQ ID Nr. 1. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Unterschied im Molekulargewicht auf einen Unterschied hinsichtlich angehängter Zuckerketten beruhen könnte. In ähnlicher Weise wurden, beim gereinigten HD2EXIg, zwei Banden mit geringfügig verschiedenem Molekulargewicht bestätigt, und es wurde angenommen, dass dies auf dieselbe Ursache zurückzuführen war.
Beispiel 6
Herstellung von neues humanes Delta-2 erkennendem Antikörper
HD2EXFLAG, das durch das Verfahren im Beispiel 5 gereinigt wurde, wurde als Immunogen verwendet, und Kaninchen wurden immunisiert. Nach Assay des Antikörper-Titers, wurde Gesamtblut abgenommen, und das Serum wurde erhalten. Polyklonaler Anti-humanes Delta-2-Kaninchen-Antikörper wurde durch Anwendung des Econopack-Serum-IgG-Reinigungs-Kits (BioRad Inc., USA) unter Bezugnahme auf das beiliegende Anweisungs-Handbuch hergestellt.
Durch ein im Beispiel 5 beschriebenes Verfahren gereinigtes HD2EXFLAG wurde als Immunogen verwendet, und monoklonaler Maus-Antikörper wurde gemäß den Erläuterungen im Lehrbuch hergestellt. Das gereinigte HD2EXFLAG wurde mit 10 μg/Maus an Balb/c-Mäuse (Nippon SLC CO., Japan) verabreicht, wobei diese intrakutan und subkutan immunisiert wurden. Nach der zweiten Immunisierung wurde ein erhöhter Serum-Titer durch ophthalmologisches Abnehmen von Blut bestätigt. Die dritte Immunisierung wurde durchgeführt. Anschließend wurden die Milzen der Mäuse entnommen und mit Maus-Myelomzellen P3X63Ag8 (ATCC TIB9) unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert. Hybridome wurden mittels HAT-Medium (Immunological and Biological Research Institute, Japan) selektiert, und die Hybridomstämme, welche Antikörper herstellten, der spezifisch die extrazelluläre Region des neuen humanen Delta-2 im Medium erkannte, wurden durch Enzym-Immuno-Assay isoliert. Die Hybridomstämme, welche monoklonalen Maus-Antikörper herstellten, der spezifisch neues humanes Delta-2 erkannte, wurden etabliert.
Der neue monoklonale humane Anti-humanes Delta-2-Antikörper wurde durch Anwendung von Mab Trap GII (Pharmacia Inc., Schweden) gemäß der Erläuterung des beiliegenden Anleitungs-Handbuchs, aus dem Überstand des so etablierten Hybridoms gereinigt und hergestellt.
Unter Verwendung der monoklonalen Antikörper wurde eine Affinitäts-Säule hergestellt. Die Herstellung der Affinitäts-Säule wurde durchgeführt gemäß dem Anleitungs-Handbuch, das dem CNBr-aktivierten Sephadex 4B beilag (Pharmacia Inc., Schweden). Eine Säule, 2 cm² × 1 cm, welche 2 ml Gel enthielt, wurde hergestellt. Eine konzentrierte Lösung des Überstands der kultivierten COS-7-Zellen, in welche ein Gentransfer von pHD2EX durchgeführt worden war, wurde bei 20 ml/Stunde durch die Säule geleitet, in welcher monoklonaler Anti-humanes Delta-2-Antikörper gebunden worden war, wonach 15 ml PBS(–) bei der gleichen Fließgeschwindigkeit hindurchgeleitet wurden und die Säule gewaschen wurde. Schließlich wurde das Produkt mit einer Mischung von 0,1 M Natriumacetat und 0,5 M NaCl (pH 4,0) eluiert. Das Eluat, in Fraktionen von jeweils 1 ml, wurde aufgefangen und wurde durch Zugeben von 200 μl 1M Tris-HCl (pH 9,1) für jede Fraktion neutralisiert.
Eine SDS-PAGE jedes gereinigten Proteins wurde unter reduzierenden Bedingungen gemäß dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt, woran sich Silber-Färbung und Western-Blotting anschlossen, um das Molekulargewicht einzuschätzen. Als Ergebnis wurde HD2EX von etwa 65 kD aus konzentriertem Überstand der kultivierten COS-7-Zellen gereinigt, bei welchen ein Gentransfer von pHD2EX durchgeführt worden war. Folglich kann man das neue humane Delta-2-Protein durch die Affinitätssäule reinigen.
Beispiel 7
Effekte von HD2EXIg auf die Koloniebildung von undifferenzierten Blutzellen
Um die physiologische Wirkung von HD2EXIg auf undifferenzierte Blutzellen zu beobachten, wurden CD34-positive Zellen in serumfreiem Halbfest-Medium in Gegenwart von HD2EXIg und bekannten Cytokinen kultiviert, und die Anzahl von koloniebildenden Zellen wurde beobachtet.
Blut aus der menschlichen Nabelschnur oder Blut von adultem menschlichem normalem Knochenmark wurde mit der Siliciumdioxid-Lösung (Immunological and Biological Research Institute, Japan) gemäß dem beiliegenden Anleitungs- Handbuch behandelt, wonach die zelluläre Fraktion mit niedriger Dichte (< 1,077 g/ml) durch densitometrische Zentrifugation in einer Ficoll-Packung (Pharmacia Inc., Schweden) fraktioniert bzw. abgetrennt wurde, um mononukleäre Zellen zu präparieren, und CD34-positive Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut oder menschlichem normalem Knochenmark-Blut aus den mononukleären Zellen isoliert wurden.
Die Trennung von CD34-positiven Zellen wurde unter Verwendung von Dynabeads M-450 CD34 und DETACHaBEADS CD34 (Dynal Inc., Norwegen) gemäß dem beiliegenden Anleitungs-Handbuch durchgeführt. Nach der Trennung wurde die Reinheit wie folgt gemessen: Zellen wurden mittels FITC-markiertem CD34-Antkörper HPCA2 (Becton Dickinson Inc., USA) gefärbt und mithilfe der Durchfluss-Zytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson. USA) untersucht. Eine Reinheit von über 85% wurde für die Anwendung bestätigt.
Die so isolierten CD34-positiven Zellen wurden homogen suspendiert, um 400 Zellen/ml des hierin nachstehenden Mediums zu erhalten, und in einer 35-mm-Schale (Falcon Inc., USA) ausplattiert, und danach 2 Wochen lang im Kohlendioxid-Inkubator bei 37°C unter 5% Kohlendioxid, 5% Sauerstoff, 90% Stickstoff und 100% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die so gebildeten Blutkolonien wurden unter dem Invert-Mikroskop gezählt.
Ein verwendetes Medium ist α-Medium (GIBCO-BRL., USA), welches 2% entionisiertes Rinderserumalbumin (BSA., Sigma, USA), 10 μg/ml humanes Insulin (Sigma, USA), 200 μg/ml Transferrin (Sigma, USA), 10^–5M 2-Mercaptoethanol (Nakarai Tesk Co., Japan), 160 μg/ml Sojabohnen-Lecithin (Sigma, USA), 96 μg/ml Cholesterin (Sigma, USA) und 0,9% Methylzellulose (Wako Pure Chemicals, Japan) enthält.
Zu dem oben stehenden Medium wurde das neue humane Extrazellulär-Delta-2-Ig-Chimärenprotein (HD2EXIg) zur Endkonzentration von 1 μg/ml zugegeben. Zur Kontrolle wurde humanes IgG1 (Athens Research and Technology Inc., USA) mit der gleichen Konzentration zugegeben, um den Effekt der IgGFc-Region zu beobachten.
Die Bedingungen der gleichzeitig zugegebenen Cytokine waren wie folgt: 100 ng/ml humanes SCF (Intergen Inc., USA), 10 ng/ml humanes IL-3 (Intergen Inc., USA) und 100 ng/ml humanes IL-6 (Intergen Inc., USA).
Als ein Ergebnis belief sich in der Kontrollgruppe die Anzahl der Koloniebildung auf 42 ± 5 je 400 Zellen, und in der Gruppe mit HD2EXIg-Zugabe belief sich die Anzahl der Koloniebildung auf 21 ± 3, was die signifikante Unterdrückung der Koloniebildung zeigte. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das neue humane Delta-2 der vorliegenden Erfindung eine Wirkung auf die undifferenzierten Blutzellen aufweist.
Beispiel 8
Wirkung von HD2EXIg auf LTC-IC von undifferenzierten Blutzellen in serumfreier Flüssigkeitskultur
Zur Bestätigung der physiologischen Wirkung von HD2EXIg auf die undifferenzierten Blutzellen in der Flüssigkeitskultur wurden mononukleäre CD34-positive Zellen des Nabelschnurbluts in serumfreiem Medium in Gegenwart von HD2EXIg und bekannten Cytokinen kultiviert. Die Kultur wurde 2 Wochen lang fortgesetzt, und am aktuellen Tag nach 2 Wochen Kultur wurden Änderungen der LTC-IC, bei welchen es sich angenommenermaßen um die (am) meisten undifferenzierten Blutzellen handelt, bestätigt.
Für Vergleichsuntersuchungen wurde ein Kontrollexperiment ohne Zugabe von HD2EXIg und ein Experiment mit Zugabe von HD1EXIg, welches das IgG-Chimärenprotein (HD1EXIg) war, und von welchem befunden wurde, LTC-IC-Aktivität in dem ähnlichen Experiment aufzuweisen, welches offenbart wird in WO 97/19172 im Namen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung, durchgeführt. Die Herstellung von HD1EXIg wurde gemäß der Beschreibung von WO 97/19172 ausgeführt.
Sechszehntausendzweihundert CD34-positive Zellen von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut, welche durch das im Beispiel 7 beschriebene Verfahren isoliert wurden, wurden im nachstehenden Medium kultiviert. Die Zahlen an LTC-IC wurden in den vier experimentellen Gruppen der Vor-Kultur-Gruppe, Gruppe mit HD2EXIg-Zugabe, Gruppe mit HD1EXIg-Zugabe und der Kontrollgruppe, gezählt. Die Zahl der Zellen und die Zahl von koloniebildenden Zellen wurden ebenfalls gezählt.
Die Kultur wurde durchgeführt im Basalmedium von α-Medium, zu welchem 2% BSA, 10 μg/ml humanes Insulin, 200 μg/ml Transferrin, 40 μg/ml Niedrigdichte-Lipoprotein, 10^–5M 2-Mercaptoethanol, 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3 und 100 ng/ml humanes IL-6 zugegeben worden waren. Zu der Gruppe mit HD2EXIg-Zugabe wurde gereinigtes 1 μg/ml HD2EXIg zugegeben; zu der Gruppe mit HD1EXIg-Zugabe wurde gereinigtes 1 μg/ml HD1EXIg zugesetzt; und zur Kontrollgruppe wurde das oben genannte humane IgG1 zugegeben. Der Mediumwechsel wurde zweimal je Woche unter Auswechseln des halben Volumens durchgeführt.
LTC-IC wurde gemäß des Verfahrens von Sutherland et al. (Blood, 74, 1563-, 1989; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 3584-, 1990) gemessen. Für Einzelheiten nehme man Bezug auf die WO 97/18172 im Namen der Erfinder der vorliegenden Anmeldung.
Gesamt-Zellzählungen wurden gemessen durch Zählen der Anzahl von lebenden Zellen unter dem Mikroskop unter Verwendung von Trypan-Blau (Gibco BRL, USA). Die Anzahl koloniebildender Zellen wurde gemäß eines Verfahrens in Beispiel 7 unter Verwendung des folgenden Mediums bestimmt. Bei dem Medium handelt es sich um α-Medium, wozu 30% fötales Kälberserum (FCS, ICN Biomedical Japan, Japan), 1% BSA, 10^–5M 2-Mercaptoethanol, 0,9% Methylzellulose (Wako Pure Chemicals, Japan), 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3, 100 ng/ml humanes IL-6, 2 U/ml humanes EPO (Chugai Seiyaku Co., Japan) und 10 ng/ml humaner G-CSF (Intergen Inc., USA) zugesetzt wurden.
Das Ergebnis ist in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Effekt des humanen Delta-2 der vorliegenden Erfindung auf Flüssigkultur
Das Ergebnis weist darauf hin, dass HD2EXIg eine Aufrechterhaltungs-Aktivität für die Anzahl von LTC-IC, im Vergleich mit der Kontrollgruppe, aufweist. Ferner ist die Aktivität stärker als HD1EXg.
Beispiel 9
Bindung und Trennung von HD2EXIg für undifferenzierte Blutzellen.
Die Bindung von gereinigtem HD2EXIg mit dem humanen Jurkat-Blutzellstamm vom T-Zell-Typ und mononukleären CD34-positiven Zellen aus humanem Nabelschnurblut wurde untersucht. In dem Bindungsexperiment wurde humanes Delta-1-Chimärenprotein (HD1EXIg), von welchem die Erfinder der vorliegenden Anmeldung festgestellt hatten, dass es eine ähnliche Aktivität aufweist, als Vergleichsexperiment auf die gleiche Weise wie im Beispiel 8 verwendet.
Jurkat-Zellen, 1 × 10⁶ Zellen, wurden in Hank'scher balancierter Salzlösung (Gibco BRL, USA) suspendiert, welche 2% FCS und 10 mM Hepes enthielt. Jeweils 1 μg/ml HD2EXIg, HD1EXIg oder humanes IgG1 wurden darin zugesetzt und bei 4°C 3 Stunden lang stehen gelassen. Die Zellen wurden mit der Hank'schen Lösung durch Zentrifugation gewaschen, und mit PE (Phycoerythrin) markierter, monoklonaler Schaf-Anti- Human-IgG-Antikörper, 1 μg/ml, wurde zugesetzt, wonach die Mischung bei Eis-Kühlung 30 Minuten lang stehen gelassen wurde. Danach wurde die Mischung zweimal mit der Hank'schen Lösung gewaschen. Die Analyse wurde unter Verwendung des Durchflusszytometers FACScalibur (Becton and Dickinson, USA) durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die vertikale Achse gibt die Zellzählungen an, und die horizontale Achse gibt die Fluoreszenzintensität an. Oben wird das Ergebnis mit Kontroll-HD1EXIg gezeigt, und unten wird das Ergebnis von HD2EXIg der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Färbung mit HD1EXIg oder HD2EXIg wird mittels einer durchgezogenen Linie angezeigt, und die Färbung mit humanem IgG1, einer Kontrollgruppe, wird durch eine unterbrochene Linie gezeigt. In allen Fällen wurde eine Bindung mit Jurkat-Zellen beobachtet. Bei der Beobachtung der Bindungsaktivitäten war die Fluoreszenzintensität von HD2EXIg der vorliegenden Erfindung stärker als diejenige von HD1EXIg, oben. Die mittlere Fluoreszenzintensität von HD2EXIg war etwa zweifach stärker als diejenige von HD1EXIg. Als Ergebnis wird HD2EXIg mit Jurkat-Zellen stärker gebunden als HD1EXIg.
Die Bindungsaktivität an die mononukleären CD34-positiven Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut, welche durch das im Beispiel 7 beschriebene Verfahren isoliert worden waren, wurde mittels des gleichen Färbungsverfahrens bestimmt. In diesem Fall wurde die Färbung mit FITC-markiertem Anti-human-CD34-Antikörper HPCA-2 (Becton and Dickinson Corp., USA) gleichzeitig in der Zweit-Antikörper-Färbung durchgeführt. Daten werden nur für die CD34-positive, d.h. FITC-positive Fraktion gezeigt.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Das Resultat weist darauf hin, dass HD2EXIg und HD1EXIg in ähnlicher Weise mit CD34-positiven Zellen binden, und die Bindungsaktivität von HD2EXIg zweimal stärker ist als jene von HD1EXIg.
HD2EXIg-gefärbte Zellen wurden mittels des Zellsortierers FACSvantage (Becton and Dickinson Corp., USA) gemäß dem beigelegten Anleitungs-Handbuch behandelt, um Zellen der HD2EXIg-positiven Fraktion abzutrennen.
Beispiel 10
Effekt von Kokultivierung mit den Expressionszellen für neues humanes Delta-2 auf undifferenzierte Blutzellen
Der FLAG-Chimärenprotein-Expressionsvektor pHD2FLAG des neuen humanen Volllängen-Delta-2, hergestellt im Beispiel 3, wurde durch Gentransfer in den Mauszellen-Stamm Balb3T3 (Physical and Chemical Institute, Cell Development Bank RCB0005) gemäß eines im Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens eingebracht, und eine Selektion wurde mittels G418 (Gibco BRL Inc., USA) gemäß des bekannten Verfahrens durchgeführt, um Klone zu erhalten. Die so erhaltenen Klone wurden hinsichtlich ihrer Expression des FLAG-Chimärenproteins des humanen Volllängen-Delta-2 gemäß dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren bestätigt, und Klone, für die eine Expression bestätigt worden war, wurden in den folgenden Experimenten verwendet. Der Klon wird als Balb/HD2FLAG bezeichnet.
Die mononukleären, CD34-positiven Zellen aus Nabelschnurblut, welche durch das Verfahren im Beispiel 7 erhalten wurden, und Balb/HD2FLAG wurden kokultiviert. Die Kokultivierung mit Balb3T3, bei welchem kein Gentransfer vorgenommen wurde, wurde als eine Kontrolle durchgeführt.
Die Kulturbedingungen waren wie folgt:

1) Balb3T3 ohne Gentransfer und kein hämatopoietischer Faktor,
2) Balb/HD2FLAG und kein hämatopoietischer Faktor,
3) Balb3T3 ohne Gentransfer mit hämatopoietischem Faktor, und
4) Balb/HD2FLAG mit hämatopoietischem Faktor.

Das verwendete Medium ist α-Medium, zu welchem 10% FCS und 10^–5M 2-Mercaptoethanol zugegeben wurden. In der Gruppe mit Zugabe von hämatopoietischem Faktor wurden 100 ng/ml humanes SCF, 10 ng/ml humanes IL-3 und 100 ng/ml humanes IL-6 zugegeben. Die Kultivierung wird 2 Wochen lang fortgesetzt, und ein Mediumwechsel wurde dreimal die Woche für ein halbes Volumen ausgeführt. Vor der Kokultivierung mit humanen Blutzellen wurden zuvor kultivierte Balb3T3-Zellen mit 250 KV Spitzen-Röntgenstrahlung bestrahlt, um Zellwachstum zu unterdrücken.
Die Anzahl von koloniebildenden Zellen und LTC-IC wurden in der Vor-Kultivierung und den experimentellen Gruppen 1) bis 4) gemessen.
Die Ergebnisse waren wie folgt.
In der Vor-Kultivierung belief sich die Gesamt-Zellzählung auf 20000 Zellen. Unter diesen beliefen sich die koloniebildenden Zellen auf 3200 Zellen, und die LTC-IC beliefen sich auf 220 Zellen.
In 1) waren die Zählungen der koloniebildenden Zellen und LTC-IC sehr gering und unmöglich zu messen.
In 2) war die Zahl an koloniebildenden Zellen sehr gering und unmöglich zu messen. Die LTC-IC-Zählung belief sich auf 105 Zellen.
In 3) war die Zahl an koloniebildenden Zellen 26500, und die LTC-IC-Zählung belief sich auf 90.
In 4) war die Zahl an koloniebildenden Zellen 38000, und die Zählung der LTC-IC belief sich auf 120.
Eine Analyse des Abbaus von koloniebildenden Zellen in 3) und 4) zeigte, dass in 3) nur Granulozyten-Kolonien beobachtet wurden, wohingegen in 4) auch Erythroblasten beobachtet wurden. Folglich beruhte der Unterschied in der Zahl koloniebildender Zellen auf dem Unterschied in der Anzahl von Erythroblasten-Kolonien.
Als ein Ergebnis wies die Balb/HD2FLAG-Zelle eine Koloniebildungs-Wirkung, speziell eine Erythroblasten-Koloniewachstums-Wirkung, sowie eine Wirkung zur Beibehaltung der LTC-IC auf. Das Ergebnis zeigt, dass unter Verwendung des humanen Delta-2-Expressionsvektors der vorliegenden Erfindung Zellen, die eine Aktivität zur Aufrechterhaltung hämatopoietischer Zellen aufweisen, produziert werden können.
Beispiel 11
Herstellung von Material, an welchem das neue humane Delta-2 immobilisiert ist, und dessen Effekt
Sepharose-Gel, an welchem im Beispiel 5 hergestelltes HD2EXIg immobilisiert war, wurde hergestellt. Das verwendete Sepharose-Gel war CNBr-aktiviertes Sepharose-Gel (Pharmacia Inc., Schweden). HD2EXIg wurde gemäß dem beigelegten Anleitungs-Handbuch immobilisiert.
Das so hergestellte Gel und die mononukleären CD34-positiven Zellen des Nabelschnurbluts, welche durch das Verfahren im Beispiel 7 isoliert worden waren, wurden 24 Stunden lang kultiviert. Die Kultivierung wurde im gleichen Medium wie im Beispiel 10 durchgeführt. In der Kontrollgruppe wurde Sepharose-Gel, an welchem BSA immobilisiert war, hergestellt. Nach der Kultivierung wurden die Zahlen an koloniebildenden Zellen gemäß des Verfahrens in Beispiel 8 gemessen. Als ein Ergebnis waren, in dem Gel, an welchem HD2EXIg immobilisiert worden war, die Zahlen von koloniebildenden Zellen um etwa 40% verringert.
Folglich hatte das Material, an welchem humanes Delta-2 der vorliegenden Erfindung immobilisiert worden war, eine Wirkung gegen hämatopoietische Zellen.
Beispiel 12
Effekt des neuen humanen Delta-2 auf Gefäß-Endothelzellen
Eine vierte Subkultur von Gefäß-Endothelzellen, d.h. normalen menschlichen Aorta-Endothelzellen und normalen menschlichen Lungenarterien-Endothelzellen (Kurabo Co., Japan), wurde verwendet. Die Zellen wurden bei 5000 Zellen/Vertiefung in einer 96er-Vertiefungsplatte für Zellkultur (Falcon Inc., USA) bei der Kultur der dritten Subkultur ausplattiert, und wurden in dem Niedrigserum-Medium für Endothelzellwachstum (HuMedia-EG2, Kurabo Co., Japan) kultiviert, welches 10 ng/ml humanes rekombinantes EGF (Kurabo Co., Japan) und 5 ng/ml humanes rekombinantes FGF-B enthielt. Zur gleichen Zeit wurde das extrazelluläre, neue humane Delta-2-Chimärenprotein (HD2EXIg) bei einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugesetzt. In der Vergleichsexperiment-Gruppe wurde die gleiche Konzentration an humanem IgG1 (Athens Research and Technology Corp., USA) zugegeben, um den Effekt der IgGFc-Region zu beobachten. In der Kontrollgruppe wurde die Kultivierung durchgeführt, ohne Zugeben von Protein, mit Ausnahme von HuMedia-EG2. Die Kultivierung wurde bei 37°C unter 5% Kohlendioxidgas und bei 100% Feuchtigkeit 3 Tage lang durchgeführt, und die Zahl an Zellen wurde ausgezählt.
Das Zählen der Anzahlen von Gefäß-Endothelzellen wurde unter Verwendung des NR-Reagenz-Sets (Kurabo Co., Japan) durchgeführt, dessen Prinzip von Borenfreund und Purerner (Journal of Tissue Culture Methods 9 (1), 7–9, 1984) entwickelt worden war, d.h. eine Neutralrot-Methode, welche das Phänomen nutzt, dass das Vitalfärbungs-Pigment Neutralrot (3-Amino-7-dimethylamino-2-methylphenazin) nur durch die Zellmembran lebender Zellen permeieren kann, um sich im Lysosom zu akkumulieren. Die Absorption bei 540 nm wurde mittels Immunoreader (NJ-2000, Nippon Intermed Co., Japan) gemessen. Als ein Ergebnis, im Fall von Aorta-Endothelzellen, belief sich die optische Dichte (OD) in der Kontrollgruppe auf 0,18 ± 0,02, und die OD in der Gruppe mit Zusatz von humanem IgG1 war ungefähr von derselben Größenordnung, 0,17 ± 0,02, wobei allerdings die OD in der Gruppe mit HD2EXIg-Zusatz von signifikant niedriger Größenordnung, 0,11 ± 0,01, war. Im Fall von Lungenarterien-Endothelzellen belief sich die optische Dichte (OD) in der Kontrollgruppe auf 0,16 ± 0,02, und die OD in der Gruppe mit Zusatz von humanem IgG1 war von beinahe derselben Größenordnung, 0,16 ± 0,02, wobei jedoch die OD in der Gruppe mit HD2EXIg-Zusatz von signifikant niedriger Größenordnung, 0,08 ± 0,01, war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass HD2EXIg das Wachstum von Gefäß-Endothelzellen unterdrückt.
Beispiel 13
Herstellung einer Arzneimittelformulierung
1 mg von jedem in Beispiel 5 gezeigten Polypeptid und 5 mg humanes Serumalbumin (Midori Juji Co.) wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde aseptisch durch einen 0,22-μm-Filter zur Sterilisierung hindurchgeleitet, in ein Gefäß abgefüllt und lyophilisiert, um eine Arzneimittelformulierung herzustellen.
Effekt der Erfindung
Das neue humane Delta-2-Molekül der vorliegenden Erfindung kann für wirksame Chemikalien zur Unterdrückung des Wachstums und der Differenzierung von undifferenzierten Zellen, wie undifferenzierten Blutzellen, verwendet werden, und kann für Pharmazeutika und Materialien für eine medizinische Behandlung eingesetzt werden.
SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, das wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 umfasst.
Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, das eine differenzierungsunterdrückende Wirkung gegen undifferenzierte Blutzellen aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, das das Wachstum von Gefäßzellen unterdrückt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, die eine differenzierungsunterdrückende Wirkung gegen undifferenzierte Blutzellen aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, die das Wachstum von Gefäßzellen unterdrückt.
Zellkulturmedium, das das Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 umfasst.
Zellkulturmedium gemäß Anspruch 8, wobei die Zellen undifferenzierte Blutzellen sind.
Material, an dem das Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 immobilisiert ist.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen unter Verwendung des Zellkulturmediums von Anspruch 8 oder des Materials von Anspruch 10.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Zellen undifferenzierte Blutzellen sind.
DNA, die wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codiert.
DNA gemäß Anspruch 13, die wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 codiert.
DNA gemäß Anspruch 13, die eine Basensequenz von Nr. 355 bis 1854 von SEQ ID Nr. 4 aufweist.
DNA gemäß Anspruch 14, die eine Basensequenz von Nr. 255 bis 2331 von SEQ ID Nr. 4 aufweist.
Rekombinante DNA, die eine DNA umfasst, die aus den DNAs gemäß Anspruch 13 oder 14 ausgewählt ist und an die eine Vektor-DNA ligiert ist, die die DNA in der Wirtszelle exprimieren kann.
Zelle, die mit der rekombinanten DNA gemäß Anspruch 17 transformiert ist.
Verfahren zum Kultivieren von humanen Zellen mit den Zellen gemäß Anspruch 18.
Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 2, das das Kultivieren der Zellen gemäß Anspruch 18 und das Isolieren der in der Kulturmasse erzeugten Verbindung umfasst.
Antikörper, der ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 aufweist, spezifisch erkennt.