JP4283891B2 - 分化抑制ポリペプチド - Google Patents
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Description
産業上の利用分野
本発明は、未分化細胞の分化を抑制するための新規生理活性物質に関するものである。
従来の技術
ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球やリンパ球は感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々のサイトカインや環境要因によって刺激されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。このサイトカインとして、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血小板産生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子（ｍｐｌリガンド）が発見されて、前者２つは現在すでに臨床応用がなされている。
血液未分化細胞に関して、特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞とすべての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概念的に分類されている。血液前駆細胞に関してコロニーアッセイによって同定が可能であるが、造血幹細胞の同定方法は確立されていない。これらの細胞に関して、ステムセルファクター（ＳＣＦ）やインターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭなどが細胞の分化増殖を促すことが報告されている。骨髄移植療法に代替される造血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、造血幹細胞を体外で増幅することが検討されている。しかし、この細胞を上記のようなサイトカインを用いて体外で増殖培養させると、造血幹細胞が本来有している多分化能および自己複製能が徐々に失われ、５週間培養後には特定の系列にのみ分化する血液前駆細胞へと変化し、造血幹細胞の特徴の一つである多分化能が失われることが報告されている（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８６，５１２−５２３，１９９５）。
血液前駆細胞の増殖には単独のサイトカインのみでは効果が十分でなく、複数のサイトカインの共同作用（シナジー）が重要であることが明らかになっている。このことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増殖させるためには、血液未分化細胞を増殖、分化させるサイトカインと共に分化を抑制するサイトカインが必要であると考えられている。しかし、一般に細胞の増殖や分化を促進するサイトカインが多数見いだされているのに対して、細胞の分化を抑制するサイトカインは少数しか見いだされていない。例えば、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）はマウス胚幹細胞を分化させずに増殖させる作用が報告されているが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対し、そのような作用は有していない。また、腫瘍細胞増殖因子（ＴＧＦ−β）は多様な細胞に対して増殖抑制の作用をするが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対する作用は一定の見解が得られていない。
血液細胞のみならず、未分化細胞、特に幹細胞に関しては組織再生に強く関与すると考えられている。これらの組織再生、並びに各組織の未分化細胞を増幅させることは成書（吉里勝利著 再生ー甦るしくみ、１９９６、羊土社）を参考にすることからその幅広い用途を知ることができる。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）は、ショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
特にヒトに関して、ヒトノッチホモログであるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に２つのノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３，２０５７−２０６２，１９９４）。しかしながらヒトに関して、ノッチのリガンドと考えられるヒトデルタ、ヒトセレイトの遺伝子のクローニングの報告はない。
ショウジョウバエノッチについて、そのリガンドとの結合性が詳細に調べられ、ノッチの細胞外部分に３６あるＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様繰り返しアミノ酸配列のうち１１番目と１２番目の繰り返し配列を結合領域として、リガンドとＣａ++を介して結合し得ることが示された（文献のＦｅｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１，５２３−５３４，１９９０およびＲｅｂａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６７，６８７−６９９，１９９１および特表平７−５０３１２３）。他種のノッチホモログについてもＥＧＦ繰り返し配列は保存されており、リガンドとの結合に関して同様の機構が類推されている。リガンドにおいてもアミノ酸末端の近くにＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ−２）と呼ばれるアミノ酸配列とリセプターと同様にＥＧＦ様繰り返し配列が保存されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
このＤＳＬドメインはノッチリガンド分子以外にはそのような配列は見いだされておらず、ノッチリガンド分子に固有の構造である。このＤＳＬドメインの共通配列を配列表の配列番号１に一段式として、また本発明のヒトデルター１とヒトセレイトー１と他の既知のノッチリガンド分子との比較を第１図に示す。
一方、ＥＧＦ様配列はトロンボモジュリン（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８８３４−８８３８，１９８６）や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）リセプター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７，５７７−５８５，１９８４）および血液凝固因子（Ｆｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５３，５０５−５１８，１９８９）で見いだされ、細胞外での凝集や接着に重要な役割を果たすと考えられている。
近年、クローニングされたショウジョウバエデルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだされており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生にＸｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７６１−７６６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊椎動物のホモログは、ラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８０，９０９−９１７，１９９５）。この報告によれば、ラットジャグドのｍＲＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャグド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチを強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジャグドが作用しないことが見いだされている。
これらの報告から、ノッチおよびそれに対するリガンドは神経細胞の分化制御に関係していると考えられているが、一部筋芽細胞を除き、血液細胞を含む他の細胞、特にプライマリーな細胞への作用に関しては全く不明であった。
また、ノッチリガンド分子にはこれらの過去のショウジョウバエ、線虫の研究から少なくともノッチリガンド分子以外には見いだされていないＤＳＬドメイン構造を有することが特徴である。したがって、このＤＳＬドメインを有することはノッチリセプターにとってのリガンド分子であることと等価と考えてよい。
発明が解決しようとする課題
上記のように未分化細胞に関して、それらの特徴を保ったまま増殖させる方法は完成されていない。この最大の原因は未分化細胞の分化を抑制する因子が十分に見いだされていないことにある。本発明の課題は、未分化細胞の分化を抑制する新規な因子に由来する化合物を提供することにある。
課題を解決する手段
本発明者らはノッチおよびそのリガンドが神経芽細胞、筋芽細胞の分化制御のみならず、広く未分化な細胞、特に血液未分化細胞の分化制御を行なうとの仮説を立てた。しかしヒトへ臨床応用する際、既知のニワトリ型、アフリカツメガエル型などの異種の生物種のノッチリガンドでは種特異性、抗原性の問題がある。このため、未だ報告のないヒト型のノッチリガンドを取得することは不可欠である。そこで、本発明者らはノッチリガンド分子に共通するＤＳＬドメインとＥＧＦ様ドメインを有する分子で、ヒト型ノッチ（ＴＡＮ−１など）のリガンドであるヒトデルタホモログ（以下ヒトデルタ）及びヒトセレイトホモログ（以下ヒトセレイト）が存在すると考え、これらの発見は未分化細胞の分化制御に有効な医薬品の候補となると考え、それらの発見に努めた。
本発明者らはヒトノッチリガンドの探索のため、ヒト以外の動物で発見されているこれらのホモログの保存されたアミノ酸配列を解析し、対応するＤＮＡ配列の混合プライマーによるＰＣＲによってこの遺伝子を発見すべく進めた。そして、鋭意研究の結果、ノッチリガンド分子に共通するＤＳＬドメインを有している２つの新規分子、新規ヒトデルター１並びに新規ヒトセレイトー１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの単離に各々成功し、これらｃＤＮＡを用いて各種形態を有する蛋白質の発現系を作製した。また、これらの蛋白質の精製法を確立し、精製を行い単離した。
新規ヒトデルター１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２から４に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号８に示した。また、新規ヒトセレイトー１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５から７に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号９に示した。
このようにして作製された蛋白質の生理作用を神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮膚未分化細胞、血液未分化細胞、免疫未分化細胞など、多数の細胞を用いて探索した。その結果、この新規ヒトデルター１及び新規ヒトセレイト−１はプライマリーな血液未分化細胞に対して分化制御作用を有し、かつ未分化な状態に維持する生理作用を有することを見いだした。
血液未分化細胞に対するこのような作用は過去に報告例がなく、全く新しく見いだされた知見である。さらにマウスに対する毒性試験では明らかな毒性は観察されず有効な医薬品となる効果を示し、本発明が完成した。したがって、本発明分子を含む薬剤、本発明分子を含む培地、本発明分子が固定化された器材は、血液未分化細胞を未分化な状態で保つことができる全く新しい医薬品、医療品である。また該ヒトデルター１もしくは該ヒトセレイトー１を各々免疫原として各々に対する抗体を作製し、精製法を確立し、本発明が完成した。
すなわち、本発明はヒト由来遺伝子にコードされる配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、少なくとも配列表の配列番号２もしくは５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、未分化細胞の分化抑制作用を有するポリペプチド、未分化細胞が脳神経、筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞であるポリペプチド、未分化細胞が血液未分化細胞であるポリペプチドい関し、また本発明は上記のポリペプチドを含有する医薬組成物、その用途が造血賦活剤である医薬組成物に関し、また本発明は上記のポリペプチドを含有する細胞培養培地、細胞が血液未分化細胞である細胞培養培地に関し、さらに本発明は少なくとも配列表の配列番号２もしくは５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から８４１番のＤＮＡ配列もしくは配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から１０９５番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から１８０１番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から２３４７番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から３６０９番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から４０６２番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、更に本発明は上記のＤＮＡ群の中から選ばれるＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組み換えＤＮＡ体、組み換えＤＮＡ体により形質転換された細胞、細胞を培養し培養物中より生産された化合物を採取するポリペプチドの製造方法に関し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
本発明のポリペプチドは少なくとも配列表の配列番号１から７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変体も、配列表の配列番号１から７のポリペプチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規ポリペプチドに含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｔｔらの出願（国際公開番号、ＷＯ９６／２６４５号）などに詳しく記載されており、これらを参考にして作製することができる。
また、配列表の配列番号２から４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号８に、配列表の配列番号５から７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号９に各々アミノ酸配列とともに示した。これらの遺伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明において未分化細胞とは、特定の刺激によって増殖可能な細胞であり、かつ特定の刺激によって特定の機能を有する細胞に分化可能な細胞と規定され、これらの中には皮膚組織系の未分化細胞、脳神経系の未分化細胞、筋肉系の未分化細胞、血液系の未分化細胞などが含まれ、各々幹細胞といわれる自己複製能力を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞を含む。また、分化抑制作用とは、これらの未分化細胞が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制する作用であり、具体的には未分化な状態を維持する作用である。また、脳神経系未分化細胞とは、特定の刺激に伴い、特定の機能を有する脳、神経の細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定できる。また、筋肉系未分化細胞とは特定の刺激に伴い、特定の機能を有する筋肉細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定される。また、本発明で記載する血液未分化細胞とは、血液コロニーアッセイで同定が可能な特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞および全ての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細胞群と規定される。
配列表において、配列番号１のアミノ酸配列は、ノッチリガンド分子に共通するドメイン構造であるＤＳＬドメインの共通アミノ酸配列を一般式として示した物であり、少なくともこのドメインの構造はヒトデルタ−１に関しては配列表の配列番号２の１５８番から２００番までに相当し、またヒトセレイト−１に関しては配列表の配列番号５の１５６番から１９８番までに相当する。
配列表の配列番号２のアミノ酸配列は本発明のヒトデルタ−１のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまでのアミノ酸配列であり、配列番号４に示した本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から２００番に相当している。配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルタ−１のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のヒトデルタ−１成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から５２０番に相当している。配列番号４のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列である。
配列番号５のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまでのアミノ酸配列であり、配列番号７に示した本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１９８番に相当している。配列番号６のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号７に示した本発明のヒトセレイト−１成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１０３６番に相当している。配列番号７のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１の成熟型全長アミノ酸配列である。
また、配列番号８の配列は本発明のヒトデルタ−１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列であり、配列表の配列番号９の配列は本発明のヒトセレイト−１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
ヒトノッチリガンドの遺伝子をクローニングするために次の方法が考え得る。ヒトノッチリガンドは生物の進化の過程で一部のアミノ酸配列が保存されていることから、保存されたアミノ酸配列に対応したＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして利用し、ヒト由来のＰＣＲテンプレートをＰＣＲ反応によって増幅することにより、ヒトノッチリガンド遺伝子の断片が得られる可能性がある。またヒト以外の生物のノッチリガンドホモログの既知ＤＮＡ配列情報からＲＴ−ＰＣＲプライマーを作製し、その生物のＰＣＲテンプレートから既知遺伝子断片を取得することは原理的に可能である。
ヒトノッチリガンド断片取得を目的としてＰＣＲを行うのに、ＤＳＬ配列に対するＰＣＲがまず考えられたが、この領域に保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列の組み合わせは膨大であり、ＰＣＲプライマー設計が無理であったため、ＥＧＦ様配列をＰＣＲの対象としなければならなかった。前述のように多数の分子にＥＧＦ様配列は保存されているため、断片取得及び同定は極めて困難であった。
本発明者らは実施例１に示した配列を１例とする５０組程度のＰＣＲプライマーを設計、作製し、ヒト由来の様々な組織のｐｏｌｙＡ+ＲＮＡから作製したｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして各々ＰＣＲを行い、各１０種類以上のＰＣＲ産物をサブクローニングし、合計５００種以上のシークエンスを行い、鋭意努力の結果、目的とする配列を有するクローンを１種類同定できた。すなわち、得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターにクローニングし、このＰＣＲ産物を含む組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質変換し、組換えプラスミドを含む宿主細胞を大量培養し、組換えプラスミドを精製単離し、クローニングベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を調べ、各々について既知の他種デルタのアミノ酸配列と比較し、ヒトデルタ−１の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。その結果、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の１０１２番から１３７５番と同一の配列、すなわちヒトデルタ−１のｃＤＮＡの一部を含む遺伝子断片を見つけだすことに成功した。
同様に、本発明者らは実施例３に示した配列を１例とする５０組のＰＣＲプライマーを設計、作製し、ヒト由来の様々な組織のｐｏｌｙＡ+ＲＮＡから作製したｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして各々ＰＣＲを行い、各１０種類以上のＰＣＲ産物をサブクローニングし、合計５００種以上のシークエンスを行い、鋭意努力の結果、目的とする配列を有するクローンを１種類同定できた。すなわち、得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターにクローニングし、このＰＣＲ産物を含む組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質変換し、組換えプラスミドを含む宿主細胞を大量培養し、組換えプラスミドを精製単離し、クローニングベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を調べ、各々について既知の他種セレイトのアミノ酸配列と比較し、ヒトセレイトー１の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。その結果、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の１２７２番から１７３７番と同一の配列、すなわちヒトセレイトー１のｃＤＮＡの一部を含む遺伝子断片を見つけだすことに成功した。
次に、こうして得られるヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１遺伝子断片を用いて、ヒトのゲノム遺伝子ライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから目的遺伝子の全長を得ることができる。全長のクローニングには、前記の方法にて部分クローニングした遺伝子をアイソトープ標識、及び各種非アイソトープ標識し、ライブラリーをハイブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングすることによって得ることができる。アイソトープの標識法としては、例えば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。また別の方法としてヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、ＣＯＳ−７細胞などで発現させ、目的の遺伝子をスクリーニングする発現クローニングなどの手法でリガンドのｃＤＮＡを分離することもできる。発現クローニングには、ＴＡＮ−１など現在まで４種知られているノッチのアミノ酸配列を含有するポリペプチドの結合を利用したセルソーターによる分画法、ラジオアイソトープを用いたフィルムエマルジョンによる検出法、等の方法が挙げられる。ここではヒトデルタ−１及びセイトセレイト−１の遺伝子取得の方法を述べたが、リガンド作用の解析のために他の生物のノッチリガンドホモログ遺伝子の取得は有用であり、これも同様の手段によって取得できる。得られた目的遺伝子はＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列を推定することができる。
本発明者らは実施例２に示したごとく、ヒトデルタ−１ＰＣＲ産物を含む遺伝子断片をラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、スクリーニングライブラリーとしてヒト胎盤由来ｃＤＮＡを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクローンのＤＮＡ配列を決定したところ、配列表の配列番号８に示すＤＮＡ塩基配列を含むクローンであり、およびそれから推定される配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列をコードすることが明らかとなり、ヒトデルタ−１の全長アミノ酸をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功した。
これらの配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋリリース８９、Ｊｕｎｅ、１９９５）で比較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトデルタ−１は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らかとなった。
同様に本発明者らは実施例４に示したごとく、ヒトセレイト−１ＰＣＲ産物を含む遺伝子断片をラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、スクリーニングライブラリーとしてヒト胎盤由来ｃＤＮＡを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクローンのＤＮＡ配列を決定したところ、配列表の配列番号９に示すＤＮＡ塩基配列を含むクローンであり、およびそれから推定される配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列の一部をコードすることが明らかとなった。このスクリーニングでは全長のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の細胞内部分の一部、すなわち終止コドン周辺に当たる部分がクローニングできなかったため、実施例４に示した如く、ＲＡＣＥ法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ法、Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，８９９８−９００２，１９８８）にて遺伝子クローニングを行い、最終的にヒトセレイト−１の全長アミノ酸をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功した。
この配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋリリース８９、Ｊｕｎｅ、１９９５）で比較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトセレイト−１は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らかとなった。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社製、日本国）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いることができる。このようにして、得られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法等を用いて導入する。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２、ＪＭ１０９などが挙げられる。上記バチルス属菌の例としては、バチルス、サチリスＭＩ１１４等が挙げられる。また、ファージベクターは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏc.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１：２４４２−、１９７８）を用いて導入することができる。
ヒトデルタ−１のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトデルタ−１の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号８のアミノ酸配列に示す７２３アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１番のセリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のセリンから５２０番グリシンにあたる５２０アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の５２１番のプロリンから５５２番のロイシンにあたる３２アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の５５３番のグルタミンから７０２番のバリンにあたる１５０アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
ヒトデルタ−１の他生物のデルタホモログとのアミノ酸配列の比較では、ショウジョウバエデルタ、ニワトリデルタ、アフリカツメガエルデルタとの相同性はそれぞれ４７．６％、８３．３％、７６．２％であり、これらの物質とは異なる新規なアミノ酸配列を有する新規な物質であり、本発明者により初めて明らかにされた物質である。また、上記のデータベース上の全ての生物種の検索においてもヒトデルタ−１と同一配列を有するポリペプチドは見いだされなかった。
ノッチのリガンドホモログは、進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルタ−１とヒト以外の種のデルタホモログとの比較により、ヒトデルタ−１のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１５８番のシステインから２００番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は８回繰り返して存在し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２０５番システインから２３３番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２３６番システインから２６４番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２７１番システインから３０４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３１１番システインから３４２番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３４９番システインから３８１番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は３８８番システインから４１９番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２６番システインから４５７番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６４番システインから４９５番システインに該当した。
ヒトデルタ−１のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の４５６番のアスパラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号２、３または４の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
また、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトセレイト−１の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号９のアミノ酸配列に示す１２１８アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−３１番のメチオニンから−１番のアラニンにあたる３１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のセリンから１０３６番アスパラギン酸にあたる１０３６アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の１０３７番のフェニルアラニンから１０６２番のロイシンにあたる２６アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の１０６３番のアルギニンから１１８７番のバリンにあたる１０６アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
ヒトセレイト−１の他生物のセレイトホモログとのアミノ酸配列の比較では、ショウジョウバエセレイト、ラットジャグドとの相同性はそれぞれ３２．１％、９５．３％であり、これらの物質とは異なる新規なアミノ酸配列を有する新規物質であり、本発明者により初めて明らかにされた物質である。また、上記のデータベース上の全ての生物種の検索においてもヒトセレイト−１と同一配列を有するポリペプチドは見いだされなかった。
ノッチのリガンドホモログは、進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトセレイト−１と他のノッチリガンドホモログとの比較により、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１５６番のシステインから１９８番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は１６回繰り返して存在し、配列表の配列番号７のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２０４番システインから２３１番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２３４番システインから２６２番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２６９番システインから３０２番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３０９番システインから３４０番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３４６番システインから３７８番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は３８５番システインから４１６番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２３番システインから４５３番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６０番システインから４９１番システインまで、第９ＥＧＦ様配列は４９８番システインから５２９番システインまで、第１０ＥＧＦ様配列は５３６番システインから５９５番システインまで、第１１ＥＧＦ様配列は６０２番システインから６３３番システインまで、第１２ＥＧＦ様配列は６４０番システインから６７１番システインまで、第１３ＥＧＦ様配列は６７８番システインから７０９番システインまで、第１４ＥＧＦ様配列は７１７番システインから７４８番システインまで、第１５ＥＧＦ様配列は７５５番システインから７８６番システインまで、第１６ＥＧＦ様配列は７９３番システインから８２４番システインに該当した。但し、第１０ＥＧＦ様配列はシステインを１０残基含む変則的な配列を有していた。
ヒトセレイトー１のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１１２番、１３１番、１８６番、３５１番、５２８番、５５４番、７１４番、１０１４番、１０３３番のアスパラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号５、６または７の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
ショウジョウバエノッチおよびそのリガンドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチのリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている（特表平７−５０３１２１号）。このことから、ヒトノッチリガンド分子のリガンド作用発現に必要な領域は少なくともＤＳＬドメイン、すなわち配列表の配列番号１のアミノ酸配列含む領域であり、また、少なくともヒトデルタ−１のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号２に示した新規アミノ酸配列であり、更に少なくともヒトセレイト−１のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号５に示した新規アミノ酸配列であることがわかる。
また、配列表の配列番号の８の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒトデルター１のｍＲＮＡの検出が可能であり、配列表の配列番号の９の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒトセレイト−１のｍＲＮＡの検出が可能である。たとえば、これらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の配列番号８または９の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが出来る。同様な方法でマウス等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができる。さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。
尚、本発明のヒトデルタ−１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５７２８。また、本発明のヒトセレイトー１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＳＲ−１を大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＳＲ−１として日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭＢＰ−５７２６。
上記の方法にて分離したヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の発現、精製には多数の方法が成書によって知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ，１９９０、および横田ら、バイオマニュアルシリーズ４，遺伝子導入と発現・解析法，羊土社、１９９４）。すなわち、分離した該ヒトデルタ−１、該ヒトセレイト−１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることができる。
本発明のヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
本発明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、実施例に記載したＳＲαプロモーターなどのＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。
以上に示したあらゆる同業者であれば使用可能なプロモーターを有する発現ベクターを用いることにより、本発明のポリペチドを発現することができる。
本発明のポリペプチドを発現させる時、配列表の配列番号２、３、４、５、６もしくは７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもできる。
ヒトデルタ−１に関して本発明者らは実施例５に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、
１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、
２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すなわちＡｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓのアミノ酸配列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号１０）を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および
３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号、ＷＯ９４／０２０３５号参照）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、日本国東京医科歯科大学丸山より入手可能、プロモーターとしてＳＲαを有する）に各々別々につなぎ、ヒトデルタ−１の細胞外部分発現ベクターを作製した。
また、ヒトデルタ−１の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、
４）配列表の配列番号４の１番から７０２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および
５）配列表の配列番号４の１番から７０２番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトデルター１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトデルタ−１をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
また、同様に、ヒトセレイト−１に関して本発明者らは実施例６に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、
６）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、
７）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸のＣ末側に該ＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および
８）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸のＣ末側に該Ｆｃ配列を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトセレイトー１の細胞外部分発現ベクターを作製した。
また、ヒトセレイト−１の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、
９）配列表の配列番号７の１番から１１８７番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および
１０）配列表の配列番号７の１番から１１８７番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトセレイト−１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトセレイト−１をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
実施例７に示したごとく、上記の１）〜１０）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導入し、ヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１をＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒトデルタ−１ポリペプチド、ヒトセレイト−１ポリペプチドを製造することができる。
実施例８に示したごとく、上記の様な培養物からヒトデルタ−１ポリペプチド、ヒトセレイト−１ポリペプチドを分離精製することができる。また、一般的には下記の方法により行うことができる。
すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合には、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１は公知のタンパク質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合には、それら既知抗原エピトープに対する抗体を用いたイムノアッセイで検出して精製を進めることができる。また、このような融合タンパク質として発現させない場合には、実施例９に記載した抗体を用いて検出することができる。
ヒトデルタ−１、セレイト−１を特異的に認識する抗体は実施例９に示したように作製することができる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することができる。このように作製された抗体はヒトデルタ−１、デルタ−１の精製に利用できる。すなわち、実施例９に示したこれらのヒトデルタ−１、セレイト−１を特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のヒトデルタ−１、セレイト−１の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性腫瘍など疾患の診断薬として使用でき得る。
精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。この際に用いる抗体としては実施例９記載した抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合には、実施例８に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いることができる。
これらの融合蛋白としてはここに示した２例以外のあらゆる融合蛋白が可能である。例えば、ヒスチジンＴａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇなどが挙げられるが、現在までの公知の方法以外にも、現在の遺伝子工学的な手法を用いればあらゆる融合蛋白を作製することが可能であり、それらの融合蛋白に由来する本発明ポリペプチドも本発明に含まれる。
このように精製されたヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１タンパクの生理機能を、各種細胞株、マウス、ラットなどの生物個体を用いた各種生理活性アッセイ法、分子生物学的手法に基づく細胞内シグナル伝達の各種アッセイ法、ノッチリセプターとの結合などの色々なアッセイ法にて知ることができる。
本発明者らはヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質を用いて、血液未分化細胞への作用を観察した。
すなわち、実施例１０に示したようにＣＤ３４陽性細胞画分を濃縮した臍帯血由来血液未分化細胞において、各種サイトカイン存在下でコロニー形成する血液未分化細胞に対して本発明ポリペチドがコロニー形成作用の抑制活性を有することを見いだした。また、この抑制活性はＳＣＦ存在下にのみ観察される過去にない活性を有していると考えられた。
また、実施例１１に示したように、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏの各種サイトカイン存在下での長期（８週間）液体培養へのヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質の添加により、有意にコロニー形成細胞の維持が延長される作用が見いだした。さらにコロニー形成細胞の増殖を抑制しない作用を見いだした。一方、血液細胞の遊走、分化抑制作用を有するサイトカインであるＭＩＰ−１α（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，６４３−６４９，１９９４）は血液未分化細胞の未分化維持の作用を有さなかった。
さらに、実施例１２に示したように、サイトカイン存在下での液体培養へのヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質の添加により、ヒト血液未分化細胞に中で最も未分化な血液幹細胞と位置付けられているＬＴＣ−ＩＣ（Ｌｏｎｇ-Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ）の数を有意に維持する活性を有していることを見いだした。
これらの結果から、ヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は血液未分化細胞の分化を抑制し、それらの作用は血液幹細胞からコロニー形成細胞にわたって作用することが明らかである。これらの生理作用は血液未分化細胞の体外増殖に必要な作用であり、特にヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を含有する細胞培養培地で培養した細胞は抗癌剤投与後の骨髄抑制回復に有効であり、他の条件を整えることにより体外での造血幹細胞の増幅を可能とするであろう。さらに、医薬品として用いた場合には、抗癌剤などの副作用で見られる骨髄抑制作用を保護し、軽減する作用がある。
さらに、血液細胞以外の未分化細胞においても、細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、また組織再生を促す作用等が期待できる。
医薬品として用いるならば、本発明のポリペプチドを適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと共に凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供することができる。本発明者らは本発明の化合物１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌとなるようにバイアルに小分けし、長期にわたって該化合物の活性は保持された。さらに、細胞を体外にて培養、活性化させる場合には医薬品同様に、凍結乾燥品、もしくは溶液剤を作製して、培地に加える、もしくは培養に使用する容器に固定化することができる。また、本発明のポリペプチドの毒性については、マウスに対していずれのポリペプチドも１０ｍｇ／Ｋｇを腹腔内投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。
また、本発明のインビトロの生理活性は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデルとして投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、異常を調べることにより可能となる。例えば、造血細胞に関する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌剤を投与して、骨髄抑制モデルマウスを作製し、このマウスに本発明の化合物を投与した群としなかった群の骨髄細胞、末梢血細胞の数、生理的な機能を調べることで明らかになる。また更に、体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培養、増殖を調べる場合には、マウス骨髄細胞を培養器などを利用して、培養を行い、その際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射線照射マウスに細胞移植を行い、その結果の回復の度合いを、生存率、血球数の変動などを指標にすることで調べることが出来る。勿論、これらの結果が人にも外挿できるため、本化合物の薬効としての評価として有効なデータを得ることが出来る。
本発明の化合物を医薬品として利用する場合、その適応として、細胞の分化異常に伴う疾患、例えば白血病、悪性腫瘍の治療があげられ、体外でヒト由来細胞を培養して、その本来の機能を保ったまま増殖させる、もしくは新たな機能を持たせる等を行う細胞治療、組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組織が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法などの応用が可能である。その際の投与量としてはその形態などにもよるが、具体的には１０μｇ／Ｋｇから１０ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。
また、さらに強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。
実施例１０に示したようにヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１の抑制活性は２量体構造を有するＩｇＧキメラ蛋白質の方が高いことから、強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。
多量体構造を有するヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は、実施例に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させた該ヒトセレイトの細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他のヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型ヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１を得ることもできる。また、さらに配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドを遺伝子工学的に２つ以上直列にもしくは並列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている２量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により作製される２量体もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配列番号２、３、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
また、その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リシン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、アミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、２量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される２量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有す形の配列表の配列番号２、３、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
体外において細胞を増殖、活性化し、体内に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のような形態を有したヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を直接培地中に加えることも可能だが、固定化する事も同様に可能である。固定化の方法としてはこれらのポリペプチドのアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器にポリペプチドを共有結合させることができる。したがって、固体表面に存在する形態を有す配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関しても本発明に含まれる。
また、自然界に存在するヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は細胞膜蛋白質であることから、これらの分子を発現する細胞と血液未分化細胞を共培養することによっても、実施例で行った分化抑制作用を発現させることができる。したがって、配列表の配列番号２〜７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞と未分化細胞を共培養する方法についても本発明に含まれる。
発現させる細胞は実施例で示したＣＯＳ−７細胞でもかまわないが、ヒト由来の細胞が望ましく、また更に発現させる細胞は細胞株ではなくヒトの体内の血液細胞でも体細胞でもかまわない。したがって、遺伝子治療用のベクターに組み込んで体内で発現させることもできる。
実施例１０に示したように低濃度の単量体であるヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＦＬＡＧキメラ蛋白質はコロニー形成抑制ではなく、逆にコロニー形成促進作用を示す。この作用は血液未分化細胞が細胞分裂する際に、ノッチリセプターとノッチリガンド分子を発現し、本発明のポリペプチドがその作用のアンタゴニストとして働いたと考えられる。このことから配列表の配列番号１、２、４もしくは５のアミノ酸配列を有するポリペプチドはその作用濃度をコントロールすることによりコロニー形成促進作用も有する。したがって、コロニー形成促進作用を有する配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を有するポリペプチドも本発明に含まれる。
更にこのことから、本発明分子、すなわち配列表の配列番号２〜７のアミノ酸配列を有するポリペプチドとこれらのリセプターとの結合を阻害することは細胞分化を促進する分子、化合物を見つけだす手段として利用できる。その方法としては、ラジオアイソトープなどを用いた結合実験、ノッチリセプターの下流分子である転写調節因子群を用いたルシフェラーゼアッセイ、Ｘ線構造解析を行いコンピューター上でのシュミレーションなどあらゆる方法が応用できる。したがって、配列表の配列番号２〜７のポリペプチドを用いた薬剤スクリーニング方法に関しても本発明に含まれる。
また、次に実施例１３に示したようにヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧキメラタンパクを用いることにより特定の白血病細胞株を分別できる。したがって、このことは白血病の診断薬として使用でき、また特定の血液細胞の分離に応用できる。この結果はヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１分子はそのリセプターであるノッチリセプター分子と特異的な結合をするためと考えられ、例えば上記の細胞外部分とヒトＩｇＧＦｃの融合タンパクを用いれば、ノッチリセプターの発現を検出できる。ノッチはある種の白血病に関連していることが知られており（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６４９−６６１，１９９１）、したがって、配列表の配列番号２、３、５及び６のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは体外もしくは体内の診断薬として使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明分子を含む各種生物で同定されたノッチリガンド分子のＤＳＬドメインのアラインメントである。
第２図は本発明分子の血液未分化細胞のコロニー形成抑制を示すものである。
第３図は本発明分子の血液未分化細胞のコロニー形成抑制作用の濃度依存性を示すものである。
第４図は本発明分子を用いた液体培養後のＬＴＣ−ＩＣの算出を行った際のグラフを示すものである。
第５図は本発明分子によって染色された細胞を示すものである。
発明の実施の形態
以下に発明を実施する形態について例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
実施例１ ヒトデルタ−１プライマーによるＰＣＲ産物のクローニングおよび塩基配列の決定
Ｃ−デルター１およびＸ−デルタ−１に保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＤＬＴＳ１（配列表の配列番号１１に記載）及びアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（配列表の配列番号１２に記載）を用いた。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としては米国アプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３’-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）４μｌ、前述の脊椎動物デルタホモログに特異的なセンスプライマーＤＬＴＳｌ（１００Ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（米国ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて作成した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にてデルタプライマーによるＰＣＲ産物の約４００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとしてｐＣＲII Ｖｅｃｔｏｒ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲIIと示す）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲIIを大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（日本国宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約４００ｂｐのＤＮＡが切れ出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を米国アプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ｓ）にて決定した。
実施例２ 新規ヒトデルター１遺伝子の全長クローニングおよびその解析
ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１にｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。出現したプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトデルタ−１プローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識された実施例１で作製されたＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、遺伝子配列が決定されたヒトデルタ−１プライマーによる精製ＰＣＲ産物（約４００ｂｐ）が組み込まれたｐＣＲIIより、ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
単離されたファージクローンは７クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７の３クローンは共に配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の１番から２２４４番の配列を含むクローンであり、Ｄ４のクローンは配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の９９９番から２６６３番を含むクローンであった。Ｄ５とＤ４の２クローンはキロシークエンス用デリションキット（日本国宝酒造社製）を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
さらに配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の１２１４番にあるＸｈｏＩサイトを利用し、Ｄ４とＤ５を制限酵素ＸｈｏＩによって消化して、配列表の配列番号７のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ−１を作製した。
実施例３ ヒトセレイトー１特異的なＰＣＲ産物のクローニングおよび塩基配列の決定
ショウジョウバエセレイトおよびラットジャグドに保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＳＲＴＳ１（配列表の配列番号１３に記載）およびアンチセンスプライマーＳＲＴＡ２（配列表の配列番号１４に記載）を用いた。作製法は実施例１に記載した方法で行った。
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。該ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液１μｌを使用し、１０×緩衝液（実施例１に記載）５μｌ、該ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ４μｌ、前述のセレイト−１ホモログに特異的なセンスプライマーＳＲＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＳＲＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及び該ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線下で観察し、約５００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
ＰＣＲ産物の全量を該低融点アガロースにて作製した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて約５００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとして該ｐＣＲII Ｖｅｃｔｏｒを用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、実施例１と同様に、ベクターｐＣＲIIにＤＮＡ断片を組み込み、同様に大腸菌に遺伝子導入し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、該ウィザードミニプレップを用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約５００ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を該ＤＮＡシークエンサーにて決定した。
実施例４ 新規ヒトセレイト−１遺伝子の全長クローニングおよびその解析
前述のヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。フィルターの作製は実施例２に記載した方法で作製し、このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトセレイト−１プローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識された先のＤＮＡプローブは実施例２に記載した方法にしたがって作製し、ハイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、クローンの分離は実施例２に記載した方法にて行った。
単離されたファージクローンは２２クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲ１にて消化し、同様にＥｃｏＲ１で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｓ１６およびＳ２０の２クローンは共に配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１番から１８７３番の配列を含むクローンであり、Ｓ５およびＳ１４の２クローンは配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の９９０番から４００５番を含むクローンであった。これらのクローンは該キロシークエンス用デリションキットを用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
さらに、配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１２９３番にあるＢｇｌIIサイトを利用し、Ｓ２０とＳ５を制限酵素ＢｇｌIIによって消化して、配列表の配列番号９の遺伝子配列の１番から４００５番のＤＮＡを大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、このプラスミドをｐＢＳＳＲＴとする。
この結果、Ｃ末端に終止コドンが認められず、細胞内部分のＣ末端のアミノ酸配列をコードしている領域がクローニングできていないことが判明したため、全長遺伝子をクローニングを米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製３’ＲＡＣＥシステムキットを用いて、添付のマニュアルに従って、ヒト胎盤由来ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ（米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）から３’方向の遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行い、遺伝子配列を決定した。
このように遺伝子クローニングした３つの遺伝子断片を配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１２９３番にある制限酵素Ｂｇｌ２サイトと３９４３番にあるＡｃｃ１サイトを利用し、配列表の配列番号５のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドをｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲ１とＸｂａ１の間につなぎ込み、ヒトセレイト−１の全長遺伝子を含むｐＵＣＳＲ−１を作製した。この遺伝子の配列を配列表の配列番号９にアミノ酸配列とともに示す。
実施例５ ヒトデルタ−１発現ベクターの作製
配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター１蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
１）分泌型ヒトデルター１蛋白質（ＨＤＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ヒトデルタ−１の発現ベクターを作製するにあたって、遺伝子産物のより安定的に発現させるために、開始コドン（配列表の配列番号８の遺伝子配列の１７９番）の５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列、ヒトデルタ−１の全長のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ−１をテンプレートとし、配列表の配列番号１５及び配列番号１６の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作成した。以下このプラスミドをｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａと示す。
次に、このｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１７及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１６００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸと命名した。
２）分泌型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号３の５２０番目のＧｌｙの後にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１９及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＦＬＡＧと命名した。
３）分泌型ヒトデルター１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号２０の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素ＸｂａＩサイトのついた配列表の配列番号２１の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、およそ１．４ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（日本国宝酒造社製）で処理をして、同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ４ ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。その後、このプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列が確かにヒトＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ９１−３２４２，１９９１を参照）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。
次に、該ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号３の５２０番目のＧｌｙの後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加するために、配列表の配列番号２２と配列番号２３のオリゴヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイトの付加を行った。このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルタ−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３０００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＩｇと命名した。
４）全長型ヒトデルター１の蛋白質（ＨＤＦ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号４の７０２番目のＶａｌの後に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号２４及び配列番号２５の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦと命名した。
５）全長型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号２６及び配列番号２５の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。
このベクターからヒトデルタ−１の全長をコードするＤＮＡを大腸菌ベクターｐＵＣ１９にクローニングして全長ヒトデルタ−１をコードするベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを作製した。
次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦＬＡＧと命名した。
実施例６ 新規ヒトセレイト−１発現ベクターの作製
配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の６）および１０）に挙げるヒトセレイト−１蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全てＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
６）分泌型ヒトセレイトー１（ＨＳＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸配列を有するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたって、遺伝子産物をより安定的に発現させるために、開始コドン（配列表の配列番号９の遺伝子配列の４０９番）の５’方向に１０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の１番から４００５番のヒトセレイト−１ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＳＲＴをテンプレートとし、配列表の配列番号２７の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２８の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に１０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作成した。
次に、この様にして作成されたベクター（以下ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１と示す）をテンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６のポリペプチドのカルボキシル末端に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号２９の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３０の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン並びにＭｌｕＩサイトを付加した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸと命名した。
７）分泌型ヒトセレイト−１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するＦＬＡＧキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６のポリペプチドのカルボキシル末端にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号３１の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３０の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン及びＭｌｕＩサイトを付加した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸＦＬＡＧと命名した。
８）分泌型ヒトセレイト−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅをテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６の配列を有すポリペプチドの後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加するために、配列表の配列番号３２の遺伝子配列を有すオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３３の配列を有すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイトの付加を行った。このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトセレイト−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約４４００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸＩｇと命名した。
９）全長型ヒトセレイト−１の蛋白質（ＨＳＦ）発現ベクター
配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１番から１１８７番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
全長の発現ベクター作製にあってはｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIにて消化し、切り出されてくる約９００ｂｐの遺伝子断片をｐＵＣＳＲ−１を同様な制限酵素で消化し、ライゲーションしてヒトセレイト−１全長遺伝子をコードするベクターｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１を作製した。
このｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして用い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号７の１１８７番目のＶａｌの後に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号３４及び配列番号３５の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＦと命名した。
１０）全長型ヒトセレイトー１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＳＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１番から１１８７番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号３６及び配列番号３５の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＦＬＡＧと命名した。
実施例７ 各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
実施例５及び６で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（日本国理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ＰＢＳ（−）に１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
その翌日、培養上清を除去し、ディッシュに付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、発現ベクターｐＨＤＥＸ、ｐＨＤＥＸＦＬＡＧ、ｐＨＤＥＸＩｇ、ｐＨＳＥＸ、ｐＨＳＥＸＦＬＡＧ、及びｐＨＳＥＸＩｇの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファーをＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、細胞培養上清を得た。
また、ｐＨＤＦ、ｐＨＤＦＬＡＧ、ｐＨＳＦ、及びｐＨＳＦＬＡＧの場合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわち、２×１０6個の細胞をセルリシスバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％グリセロール、４ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を取り細胞破砕物を得た。
こうして得られたサンプルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発現を確認した。
すなわち、濃縮した培養上清もしくは細胞破砕物を日本国ＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
このように作製されたフィルターをブロックエース（日本国大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）に４℃一晩振盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書に従い、目的の蛋白質がヒトデルタ−１由来の場合には１次抗体として実施例９に記載した抗ヒトデルタ−１マウスモノクローナル抗体を用い、ヒトセレイト−１由来の場合には１次抗体として実施例９に記載した抗ヒトセレイト−１マウスモノクローナル抗体を用い、ＦＬＡＧキメラの場合は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。
その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤＥＸとｐＨＤＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約６５ｋダルトン、ｐＨＤＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約９５ｋダルトン、ｐＨＤＦ、ｐＨＤＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダルトンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプルはｐＨＤＥＸＩｇを導入した場合、１２０ｋから２００ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約１８０ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
また同様に、還元処理を行ったサンプルはｐＨＳＥＸとｐＨＳＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約１４０ｋダルトン、ｐＨＳＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約１７０ｋダルトン、ｐＨＳＦ、ｐＨＳＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約１５０ｋダルトンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプルはｐＨＳＥＸＩｇを導入した場合、２５０ｋから４００ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約３００ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
これらの実験では、コントロールとしてｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルタ−１マウスモノクローナル抗体、抗ヒトセレイト−１マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。
以上の結果から、これら１０種の発現ベクターはいずれも目的のポリペプチドを生産することができた。
実施例８ 遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１蛋白質の精製
実施例７の方法で発現が検出されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＤＥＸＩｇおよびＨＳＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラムによって各々のキメラ蛋白質を精製した。
ＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧに関しては、実施例７に記載した方法によって取得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チューブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、各々の面分を中和した。
上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキメラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは実施例７に記載の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットIIを用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果として、ＨＳＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバンドが検出され、この分子量は実施例６で得られた抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧとも一致した。この結果からＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧの純品が精製された。
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤＥＸＩｇとＨＳＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムに吸着させ、溶出画分を分取した。
ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒトＩｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇとも一致した。この結果からＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの純品が精製された。
実施例９ ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１を認識する抗体作成
実施例８に記載の方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１ウサギポリクローナル抗体、抗ヒトセレイトー１ウサギポリクローナル抗体を各々精製して作製した。
また、実施例８に記載した方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上記のように精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々別々にＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトデルター１もしくはヒトセレイト−１の細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ ＴｒａｐＧIIを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルタ−１モノクローナル抗体、抗ヒトセレイト−１モノクローナル抗体を精製し作製した。
これらモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。このゲルの２ｍｌを２ｃｍ2×１ｃｍのサイズのカラムを作製した。
抗ヒトデルタ−１モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してはｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を、抗ヒトセレイト−１モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してはｐＨＳＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を各々２０ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。
さらに実施例８に記載の方法に従って、各々の精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結果、ｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約６５ｋダルトンのＨＤＥＸが、ｐＨＳＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約１４０ｋダルトンのＨＤＳＥＸが精製されていることが確認され、これらアフィニティーカラムでヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１が精製可能であることが明らかとなった。
実施例１０ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞のコロニー形成に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清半固形培地で培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
ヒト臍帯血もしくはヒト正常骨髄血のＣＤ３４陽性細胞は臍帯血もしくは成人正常骨髄血をシリカ液（日本国免疫生物研究所製）により添付の説明書にしたがって処理し、その後フィコールパック（スエーデン国ファルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞画分（＜１．０７７ｇ／ｍｌ）を分画した単核球より分離した。
ＣＤ３４陽性細胞の分離は米国ＡＩＳ社製マイクロセレクターステムもしくはノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ ＣＤ３４とＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤＳ ＣＤ３４を用い、添付の取扱説明書に従って分離した。分離後、その純度はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体ＨＰＣＡ２（米国ベクトンデッキンソン社製）で染色し、同社のフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）にて検定し、８５％以上の純度を有していることを確認して用いた。
このようにして分離したＣＤ３４陽性細胞４００個が下記の培地１ｍｌ中に存在するように均一に懸濁し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社製）にまき、３７℃、５％炭酸ガス、５％酸素ガス、９０％窒素ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで２週間の培養後、形成された血球コロニーを倒立顕微鏡下で計測した。
培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍ（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に２％Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌ ヒトインスリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、２００μｇ／ｍｌ トランスフェリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール（日本国ナカライテスク社製）、１６０μｇ／ｍｌ ソイビーンレクチン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、９６μｇ／ｍｌ コレステロール（米国Ｓｉｇｍａ社製）、０．９％ メチルセルロース（日本国和光純薬社製）で行った。
上記の培地に下記の３種の条件のサイトカイン存在下に対し、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトデルタ−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）もしくはヒトセレイト−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。
サイトカイン条件下記の通りである。
条件１：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）。
条件２：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３、４ｎｇ／ｍｌ ヒトトロンボポエチン（米国Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）。
条件３：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏ（日本国中外製薬製）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＧ−ＣＳＦ（日本国中外製薬製）。
結果を第２図に示す。第２図のＡはヒトデルタ−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）の場合であり、Ｂはヒトセレイト−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）の場合である。ＡとＢは各々異なった由来のヒト臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた。縦軸はコロニー数を示し、白カラムは比較区、黒カラムは各々ＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを含むデータである。
ＨＤＥＸＩｇとＨＳＥＸＩｇはいずれもコロニー形成を抑制する活性を有していた。これら結果のコロニー形成細胞の種類には違いが認められなかった。したがって、本発明の分子は血液未分化細胞のコロニー形成細胞に対して、コロニー形成抑制作用を有する。すなわち、分化抑制作用を有することが明らかになった。この活性に関してＳＣＦ存在下と非存在下の比較を行ったところ、この抑制活性はＳＣＦ存在下にのみ観察される傾向が見られた。
また、更にこの活性に関して濃度依存性の検討を行った。また、２量体であるＨＳＥＸＩｇと単量体であるＨＳＥＸＦＬＡＧの比較も行った。結果を第３図に示す。この場合の濃度はモル濃度として示すが、２量体と単量体との比較を行うため、２量体のＨＳＥＸＩｇは正確なモル濃度の２倍濃度として示し、ヒトセレイト−１部分のモル濃度が同じとなるようにプロットした。縦軸はコロニー形成数で、横軸はモル濃度である。ノッチリガンドを含まない場合のコロニー形成数は０濃度の縦軸上にプロットした。また比較として行った１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１のコロニー形成数はおよそ１００個であった。
この結果からＨＳＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＦＬＡＧとも濃度依存的にコロニー形成を抑制したが、その活性は明らかに２量体であるＨＳＥＸＩｇの方が強かった。また、単量体のＨＳＥＸＦＬＡＧは低濃度領域で逆にコロニー形成を促進する作用が観察された。
実施例１１ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇのコロニー形成血液未分化細胞の長期液体培養に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清培地で長期液体培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
実施例１０に記載した方法で分離した臍帯血単核球ＣＤ３４陽性細胞を２４ｗｅｌｌ細胞培養プレート（米国ファルコン社製）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで液体培養した。培養は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで行った。液体培養の培地は無血清のイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に２％ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、３Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏを加えたものを用いた。条件によって５００ｎｇ ＨＳＩｇ、もしくは５０ｎｇ／ｍｌ ＭＩＰ−１α（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を加えた。この培地を１ｗｅｌｌあたり１ｍｌを加え、週に３回の半量培地交換を行い、培養２、４、６、８週後にセルスクレイパーを用いてｗｅｌｌからすべての細胞を１．５ｍｌマイクロチューブに回収し、遠心分離によって細胞を沈降させ、新鮮なＩＭＤＭ １ｍｌに再懸濁し、細胞数を血球計算盤を用いてカウントし、５０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで血球コロニー形成アッセイを行った。
血球コロニー形成アッセイはイスコフメチルセルロースコンプリートレディミックス（カナダ国Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社）２枚に各１ｍｌをシリンジを用いて植え付け、炭酸ガスインキュベーターで２週間培養した。血球コロニーは倒立顕微鏡下で顆粒球単球コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）および赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）をカウントし、総数をＣＦＵ−Ｃとした。ここで得られたＣＦＵ−Ｃ数と血球計算盤で求めた細胞数を掛け合わせ、液体培養で植え付けた１０００ｃｅｌｌｓあたりのＣＦＵ−Ｃ数を求めた。この結果をＨＤＥＸＩｇの場合を第１表に、ＨＳＥＸＩｇの場合を第２表に示す。実験はｎ＝３で行い、値は（平均値±ＳＤ）で表した。なお表中のＮＤはコロニーが検出できなかったことを示す。
結果として未分化な状態を維持するサイトカインがない条件、およびＭＩＰ−１α存在下での条件ではＣＦＵ−Ｃは６週までしか観察されなかったが、ＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇ存在下では８週にも観察された。ＭＩＰ−１αとＨＤＥＸＩｇ及びＨＳＥＸＩｇの比較では、ＭＩＰ−１αは培養２週でのコロニー形成を強く抑制すること観察されたが、ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇでの抑制は観察されなかった。また培養６週、８週でのＣＦＵ−Ｃ数の維持はＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇが優れていることが観察された。
実施例１２ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞ＬＴＣ−ＩＣの液体培養に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清培地で２週間液体培養し、現在最も未分化な血液細胞群と考えられるＬＴＣ−ＩＣの増減を観察した。
実施例１０に記載した方法で分離した臍帯血単核球ＣＤ３４陽性細胞を１０００００から２００００個を下記の培地で２週間培養し、培養前区、ＨＤＥＸＩｇ存在区、ＨＳＥＸＩｇ存在区と比較区の４つの実験区に存在するＬＴＣ−ＩＣ数の違いを調べた。
液体培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍに２％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールを加え、更に１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６加えた培地を用い、これにＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを１μｇ／ｍｌ加え、比較区には前述のヒトＩｇＧ１を同濃度加えた。
ＬＴＣ−ＩＣに使用するヒト骨髄ストローマ細胞層の作製、限界希釈法によるＬＴＣ−ＩＣの頻度の定量はＳｕｔｈｅｒｌａｎｄらの方法（Ｂｌｏｏｄ、７４、１５６３−、１９８９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、３５８４−、１９９０）に従って行った。
すなわち、実施例１０で得られた分離前のシリカ液処理しない骨髄単核球を１〜２Ｘ１０7細胞を１μＭハイドロコルチゾン（日本国日本アップジョン社製）添加したＬＴＣ培地（ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ、カナダ国Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）５ｍｌでＴ−２５フラスコ（米国ファルコン社製）にて、３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で培養し、付着細胞層であるストローマ細胞形成が底面積の８０％以上の状態になるまで培養し、その後トリプシンＥＤＴＡ液（日本国コスモバイオ社製）で処理して剥がした。９６穴プレート（米国ベクトンデッキンソン社製）に１ウェルあたり約２×１０4個蒔き、再度培養を同培地にて培養を続け、ストローマ細胞の再構成を行った後、２５０Ｋｉｌｏｖｏｌｔ ＰｅａｋのＸ線を１５Ｇｙ照射して、ストローマ細胞の増殖とストローマ細胞中の血液細胞を除去した物をストローマ細胞層として実験に用いた。
上記の方法で培養した各実験区の細胞をＬＴＣ−ＩＣアッセイに共するにあたって、１ウェルあたり培養前のＣＤ３４陽性細胞細胞は２５〜４００個、培養後の各実験区の細胞は６２５〜２００００個の範囲で６段階希釈し、上記のストローマ細胞形成した９６穴プレートにて、１希釈段階について１６ウェルで共培養行った。培養の培地はストローマ形成で用いた培地、条件は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で５週間にわたって培養を行った。培養後の細胞は１ウェルづつ浮遊細胞、付着細胞とも回収し、α−ｍｅｄｉｕｍに０．９％メチルセルロース、３０％牛胎児血清（ＦＣＳ、日本国ＩＣＮバイオメディカルジャパン）、１％ＢＳＡ、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＧ−ＣＳＦ添加した半固形培地に移し、２週間の培養後、実施例１０、１１同様のコロニー形成細胞の検出を行い、コロニー形成細胞が存在したウェル数を検出した。このデータをもとにＴａｓｗｅｌｌらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６、１６１４−、１９８１）に従ってＬＴＣ−ＩＣの頻度の算出を行った。
算出に用いたグラフを第４図に示す。第４図は液体培養後の算出のグラフで縦軸にコロニーが現れなかったｗｅｌｌの割合を対数で示し、横軸はｗｅｌｌあたりの細胞数を示す。各実験区ごとにコロニーが現れなかったｗｅｌｌ数と細胞数をプロットし、最小自乗法にて回帰直線を求め、コロニーが現れなかったｗｅｌｌ数が０．３７（自然対数の底の逆数）である細胞数を算出し、その細胞数の逆数がＬＴＣ−ＩＣの頻度となる。さらに、はじめの細胞数とＬＴＣ−ＩＣの頻度からＬＴＣ−ＩＣの絶対数を算出した。
その結果、液体培養前は２５，０００細胞中に２４３個のＬＴＣ−ＩＣが存在し、比較区では２週間の培養で細胞数が１，５１０，０００個に増えたが、ＬＴＣ−ＩＣは４９個に減少した。しかしながら、ヒトデルタ−１すなわちＨＤＥＸＩｇもしくはヒトセレイト−１すなわちＨＳＥＸＩｇを含む培地で培養した場合にはそれらの細胞数が各々１，３１０，０００個、１，１４０，０００個とほぼ同様な数を増えていたが、ＬＴＣ−ＩＣはそれぞれ１１５個、５３個とその減少幅を小さくした。この結果から、本発明のポリペプチド、特にヒトデルタ−１は液体培養におけるＬＴＣ−ＩＣの維持作用を有することが明らかとなった。
実施例１３ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液細胞株に対する結合
ノッチリガンド分子はノッチリセプターに特異的に結合する性質を用いて、ノッチリガンド分子の各種血液細胞株に対する結合を調べた。
細胞株は血液細胞株としてＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３２）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６４）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０２）、ＵＴ−７（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１、３４１−３４８、１９９１）、Ｍｏ７ｅ（Ａｖａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、６９、３５９−、１９８８）、ＣＭＫ（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１５、４９５−５０２、１９８７）を調べた。これらの細胞株の培養培地は各々の引用文献、もしくはＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥＳ ＆ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ８ｔｈ ｅｄ（１９９４）に記載の培地で行った。
各種細胞を１×１０6個を２％ＦＣＳ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含むハンクス液で懸濁し、ＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを１μｇ／ｍｌ添加し、４℃一晩放置した。同様なハンクス液で２回洗浄後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌ添加し、３０分間氷中で放置し、ハンクス液で２回洗浄後、最後に１ｍｌのハンクス液に懸濁して解析に供した。測定はフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。また、コントロールとしてＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇのかわりに該ヒトＩｇＧ１で染色したものを用いた。
それらの結果を第５図に示す。縦軸は細胞数で横軸は蛍光強度である。ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇで染色しものは実線で、コントロールのヒトＩｇＧ１で染色したものは破線で示し、左のカラムはＨＤＥＸＩｇ、右のカラムはＨＳＥＸＩｇを各々示す。これらの結果からＪｕｒｋａｔは反応、Ｎａｍａｌｗａは未反応、ＨＬ−６０は未反応、Ｋ５６２は未反応、ＴＨＰ−１は未反応、ＵＴ−７は反応、Ｍｏ７ｅは未反応、ＣＭＫは反応した。また、これらの結果は、ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇとも同一の結果が得られたことから、同一の分子を認識することが明らかであり、またこれらの細胞を分別することができることが明らかになった。
発明の効果
本発明のノッチリガンド分子は未分化細胞の維持、分化抑制にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使用が可能である。
配列表
配列番号１
配列の長さ：４３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列番号２
配列の長さ：２００
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号３
配列の長さ：５２０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号４
配列の長さ：７０２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号５
配列の長さ：１９８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号６
配列の長さ：１０３６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号７
配列の長さ：１１８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号８
配列の長さ：２６６３及び７２３
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号９
配列の長さ：４００５及び１２１８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状及び不明
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列番号１０
配列の長さ：２７及び８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸
起源：化学合成法による
配列：
配列番号１１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１５
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１６
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１７
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１８
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号１９
配列の長さ：５５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２０
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２１
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２２
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２３
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２４
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２５
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２６
配列の長さ：５１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２７
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２８
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号２９
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３０
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３１
配列の長さ：５１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３２
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３３
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３４
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３５
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列番号３６
配列の長さ：５２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
本発明は、未分化細胞の分化を抑制するための新規生理活性物質に関するものである。
従来の技術
ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球やリンパ球は感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々のサイトカインや環境要因によって刺激されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。このサイトカインとして、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血小板産生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子（ｍｐｌリガンド）が発見されて、前者２つは現在すでに臨床応用がなされている。
血液未分化細胞に関して、特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞とすべての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概念的に分類されている。血液前駆細胞に関してコロニーアッセイによって同定が可能であるが、造血幹細胞の同定方法は確立されていない。これらの細胞に関して、ステムセルファクター（ＳＣＦ）やインターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭなどが細胞の分化増殖を促すことが報告されている。骨髄移植療法に代替される造血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、造血幹細胞を体外で増幅することが検討されている。しかし、この細胞を上記のようなサイトカインを用いて体外で増殖培養させると、造血幹細胞が本来有している多分化能および自己複製能が徐々に失われ、５週間培養後には特定の系列にのみ分化する血液前駆細胞へと変化し、造血幹細胞の特徴の一つである多分化能が失われることが報告されている（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８６，５１２−５２３，１９９５）。
血液前駆細胞の増殖には単独のサイトカインのみでは効果が十分でなく、複数のサイトカインの共同作用（シナジー）が重要であることが明らかになっている。このことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増殖させるためには、血液未分化細胞を増殖、分化させるサイトカインと共に分化を抑制するサイトカインが必要であると考えられている。しかし、一般に細胞の増殖や分化を促進するサイトカインが多数見いだされているのに対して、細胞の分化を抑制するサイトカインは少数しか見いだされていない。例えば、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）はマウス胚幹細胞を分化させずに増殖させる作用が報告されているが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対し、そのような作用は有していない。また、腫瘍細胞増殖因子（ＴＧＦ−β）は多様な細胞に対して増殖抑制の作用をするが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対する作用は一定の見解が得られていない。
血液細胞のみならず、未分化細胞、特に幹細胞に関しては組織再生に強く関与すると考えられている。これらの組織再生、並びに各組織の未分化細胞を増幅させることは成書（吉里勝利著 再生ー甦るしくみ、１９９６、羊土社）を参考にすることからその幅広い用途を知ることができる。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）は、ショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
特にヒトに関して、ヒトノッチホモログであるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に２つのノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３，２０５７−２０６２，１９９４）。しかしながらヒトに関して、ノッチのリガンドと考えられるヒトデルタ、ヒトセレイトの遺伝子のクローニングの報告はない。
ショウジョウバエノッチについて、そのリガンドとの結合性が詳細に調べられ、ノッチの細胞外部分に３６あるＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様繰り返しアミノ酸配列のうち１１番目と１２番目の繰り返し配列を結合領域として、リガンドとＣａ++を介して結合し得ることが示された（文献のＦｅｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１，５２３−５３４，１９９０およびＲｅｂａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６７，６８７−６９９，１９９１および特表平７−５０３１２３）。他種のノッチホモログについてもＥＧＦ繰り返し配列は保存されており、リガンドとの結合に関して同様の機構が類推されている。リガンドにおいてもアミノ酸末端の近くにＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ−２）と呼ばれるアミノ酸配列とリセプターと同様にＥＧＦ様繰り返し配列が保存されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
このＤＳＬドメインはノッチリガンド分子以外にはそのような配列は見いだされておらず、ノッチリガンド分子に固有の構造である。このＤＳＬドメインの共通配列を配列表の配列番号１に一段式として、また本発明のヒトデルター１とヒトセレイトー１と他の既知のノッチリガンド分子との比較を第１図に示す。
一方、ＥＧＦ様配列はトロンボモジュリン（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８８３４−８８３８，１９８６）や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）リセプター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７，５７７−５８５，１９８４）および血液凝固因子（Ｆｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５３，５０５−５１８，１９８９）で見いだされ、細胞外での凝集や接着に重要な役割を果たすと考えられている。
近年、クローニングされたショウジョウバエデルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルタ−１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルタ−１）が見いだされており、Ｘ−デルタ−１は原始ニューロンの発生にＸｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７６１−７６６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊椎動物のホモログは、ラットジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）が見いだされている（Ｃｌａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８０，９０９−９１７，１９９５）。この報告によれば、ラットジャグドのｍＲＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノッチを強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャグド発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチを強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジャグドが作用しないことが見いだされている。
これらの報告から、ノッチおよびそれに対するリガンドは神経細胞の分化制御に関係していると考えられているが、一部筋芽細胞を除き、血液細胞を含む他の細胞、特にプライマリーな細胞への作用に関しては全く不明であった。
また、ノッチリガンド分子にはこれらの過去のショウジョウバエ、線虫の研究から少なくともノッチリガンド分子以外には見いだされていないＤＳＬドメイン構造を有することが特徴である。したがって、このＤＳＬドメインを有することはノッチリセプターにとってのリガンド分子であることと等価と考えてよい。
発明が解決しようとする課題
上記のように未分化細胞に関して、それらの特徴を保ったまま増殖させる方法は完成されていない。この最大の原因は未分化細胞の分化を抑制する因子が十分に見いだされていないことにある。本発明の課題は、未分化細胞の分化を抑制する新規な因子に由来する化合物を提供することにある。
課題を解決する手段
本発明者らはノッチおよびそのリガンドが神経芽細胞、筋芽細胞の分化制御のみならず、広く未分化な細胞、特に血液未分化細胞の分化制御を行なうとの仮説を立てた。しかしヒトへ臨床応用する際、既知のニワトリ型、アフリカツメガエル型などの異種の生物種のノッチリガンドでは種特異性、抗原性の問題がある。このため、未だ報告のないヒト型のノッチリガンドを取得することは不可欠である。そこで、本発明者らはノッチリガンド分子に共通するＤＳＬドメインとＥＧＦ様ドメインを有する分子で、ヒト型ノッチ（ＴＡＮ−１など）のリガンドであるヒトデルタホモログ（以下ヒトデルタ）及びヒトセレイトホモログ（以下ヒトセレイト）が存在すると考え、これらの発見は未分化細胞の分化制御に有効な医薬品の候補となると考え、それらの発見に努めた。
本発明者らはヒトノッチリガンドの探索のため、ヒト以外の動物で発見されているこれらのホモログの保存されたアミノ酸配列を解析し、対応するＤＮＡ配列の混合プライマーによるＰＣＲによってこの遺伝子を発見すべく進めた。そして、鋭意研究の結果、ノッチリガンド分子に共通するＤＳＬドメインを有している２つの新規分子、新規ヒトデルター１並びに新規ヒトセレイトー１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの単離に各々成功し、これらｃＤＮＡを用いて各種形態を有する蛋白質の発現系を作製した。また、これらの蛋白質の精製法を確立し、精製を行い単離した。
新規ヒトデルター１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２から４に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号８に示した。また、新規ヒトセレイトー１のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５から７に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号９に示した。
このようにして作製された蛋白質の生理作用を神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮膚未分化細胞、血液未分化細胞、免疫未分化細胞など、多数の細胞を用いて探索した。その結果、この新規ヒトデルター１及び新規ヒトセレイト−１はプライマリーな血液未分化細胞に対して分化制御作用を有し、かつ未分化な状態に維持する生理作用を有することを見いだした。
血液未分化細胞に対するこのような作用は過去に報告例がなく、全く新しく見いだされた知見である。さらにマウスに対する毒性試験では明らかな毒性は観察されず有効な医薬品となる効果を示し、本発明が完成した。したがって、本発明分子を含む薬剤、本発明分子を含む培地、本発明分子が固定化された器材は、血液未分化細胞を未分化な状態で保つことができる全く新しい医薬品、医療品である。また該ヒトデルター１もしくは該ヒトセレイトー１を各々免疫原として各々に対する抗体を作製し、精製法を確立し、本発明が完成した。
すなわち、本発明はヒト由来遺伝子にコードされる配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、少なくとも配列表の配列番号２もしくは５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、未分化細胞の分化抑制作用を有するポリペプチド、未分化細胞が脳神経、筋肉系未分化細胞以外の未分化細胞であるポリペプチド、未分化細胞が血液未分化細胞であるポリペプチドい関し、また本発明は上記のポリペプチドを含有する医薬組成物、その用途が造血賦活剤である医薬組成物に関し、また本発明は上記のポリペプチドを含有する細胞培養培地、細胞が血液未分化細胞である細胞培養培地に関し、さらに本発明は少なくとも配列表の配列番号２もしくは５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から８４１番のＤＮＡ配列もしくは配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から１０９５番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から１８０１番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の２４２番から２３４７番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から３６０９番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の５０２番から４０６２番のＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ、更に本発明は上記のＤＮＡ群の中から選ばれるＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組み換えＤＮＡ体、組み換えＤＮＡ体により形質転換された細胞、細胞を培養し培養物中より生産された化合物を採取するポリペプチドの製造方法に関し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集したＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
本発明のポリペプチドは少なくとも配列表の配列番号１から７のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変体も、配列表の配列番号１から７のポリペプチドがそれらの性質を失わない限り本発明の新規ポリペプチドに含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｔｔらの出願（国際公開番号、ＷＯ９６／２６４５号）などに詳しく記載されており、これらを参考にして作製することができる。
また、配列表の配列番号２から４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号８に、配列表の配列番号５から７のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号９に各々アミノ酸配列とともに示した。これらの遺伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明において未分化細胞とは、特定の刺激によって増殖可能な細胞であり、かつ特定の刺激によって特定の機能を有する細胞に分化可能な細胞と規定され、これらの中には皮膚組織系の未分化細胞、脳神経系の未分化細胞、筋肉系の未分化細胞、血液系の未分化細胞などが含まれ、各々幹細胞といわれる自己複製能力を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞を含む。また、分化抑制作用とは、これらの未分化細胞が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制する作用であり、具体的には未分化な状態を維持する作用である。また、脳神経系未分化細胞とは、特定の刺激に伴い、特定の機能を有する脳、神経の細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定できる。また、筋肉系未分化細胞とは特定の刺激に伴い、特定の機能を有する筋肉細胞にのみ分化する能力を有する細胞と規定される。また、本発明で記載する血液未分化細胞とは、血液コロニーアッセイで同定が可能な特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞および全ての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細胞群と規定される。
配列表において、配列番号１のアミノ酸配列は、ノッチリガンド分子に共通するドメイン構造であるＤＳＬドメインの共通アミノ酸配列を一般式として示した物であり、少なくともこのドメインの構造はヒトデルタ−１に関しては配列表の配列番号２の１５８番から２００番までに相当し、またヒトセレイト−１に関しては配列表の配列番号５の１５６番から１９８番までに相当する。
配列表の配列番号２のアミノ酸配列は本発明のヒトデルタ−１のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまでのアミノ酸配列であり、配列番号４に示した本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から２００番に相当している。配列番号３のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルタ−１のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号４に示した本発明のヒトデルタ−１成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から５２０番に相当している。配列番号４のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列である。
配列番号５のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１のシグナルペプチドを除いた活性中心の配列、すなわちアミノ末端からＤＳＬドメインまでのアミノ酸配列であり、配列番号７に示した本発明のヒトデルタ−１の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１９８番に相当している。配列番号６のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号７に示した本発明のヒトセレイト−１成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１０３６番に相当している。配列番号７のアミノ酸配列は、本発明のヒトセレイト−１の成熟型全長アミノ酸配列である。
また、配列番号８の配列は本発明のヒトデルタ−１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列であり、配列表の配列番号９の配列は本発明のヒトセレイト−１の全アミノ酸配列及びそれをコードしているｃＤＮＡ配列である。
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
ヒトノッチリガンドの遺伝子をクローニングするために次の方法が考え得る。ヒトノッチリガンドは生物の進化の過程で一部のアミノ酸配列が保存されていることから、保存されたアミノ酸配列に対応したＤＮＡ配列を設計し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のプライマーとして利用し、ヒト由来のＰＣＲテンプレートをＰＣＲ反応によって増幅することにより、ヒトノッチリガンド遺伝子の断片が得られる可能性がある。またヒト以外の生物のノッチリガンドホモログの既知ＤＮＡ配列情報からＲＴ−ＰＣＲプライマーを作製し、その生物のＰＣＲテンプレートから既知遺伝子断片を取得することは原理的に可能である。
ヒトノッチリガンド断片取得を目的としてＰＣＲを行うのに、ＤＳＬ配列に対するＰＣＲがまず考えられたが、この領域に保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列の組み合わせは膨大であり、ＰＣＲプライマー設計が無理であったため、ＥＧＦ様配列をＰＣＲの対象としなければならなかった。前述のように多数の分子にＥＧＦ様配列は保存されているため、断片取得及び同定は極めて困難であった。
本発明者らは実施例１に示した配列を１例とする５０組程度のＰＣＲプライマーを設計、作製し、ヒト由来の様々な組織のｐｏｌｙＡ+ＲＮＡから作製したｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして各々ＰＣＲを行い、各１０種類以上のＰＣＲ産物をサブクローニングし、合計５００種以上のシークエンスを行い、鋭意努力の結果、目的とする配列を有するクローンを１種類同定できた。すなわち、得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターにクローニングし、このＰＣＲ産物を含む組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質変換し、組換えプラスミドを含む宿主細胞を大量培養し、組換えプラスミドを精製単離し、クローニングベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を調べ、各々について既知の他種デルタのアミノ酸配列と比較し、ヒトデルタ−１の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。その結果、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列の１０１２番から１３７５番と同一の配列、すなわちヒトデルタ−１のｃＤＮＡの一部を含む遺伝子断片を見つけだすことに成功した。
同様に、本発明者らは実施例３に示した配列を１例とする５０組のＰＣＲプライマーを設計、作製し、ヒト由来の様々な組織のｐｏｌｙＡ+ＲＮＡから作製したｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして各々ＰＣＲを行い、各１０種類以上のＰＣＲ産物をサブクローニングし、合計５００種以上のシークエンスを行い、鋭意努力の結果、目的とする配列を有するクローンを１種類同定できた。すなわち、得られたＰＣＲ産物をクローニングベクターにクローニングし、このＰＣＲ産物を含む組換えプラスミドを用いて宿主細胞を形質変換し、組換えプラスミドを含む宿主細胞を大量培養し、組換えプラスミドを精製単離し、クローニングベクターに挿入されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を調べ、各々について既知の他種セレイトのアミノ酸配列と比較し、ヒトセレイトー１の配列を有すると思われる遺伝子断片の取得に努めた。その結果、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の１２７２番から１７３７番と同一の配列、すなわちヒトセレイトー１のｃＤＮＡの一部を含む遺伝子断片を見つけだすことに成功した。
次に、こうして得られるヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１遺伝子断片を用いて、ヒトのゲノム遺伝子ライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから目的遺伝子の全長を得ることができる。全長のクローニングには、前記の方法にて部分クローニングした遺伝子をアイソトープ標識、及び各種非アイソトープ標識し、ライブラリーをハイブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングすることによって得ることができる。アイソトープの標識法としては、例えば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。また別の方法としてヒト由来のｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、ＣＯＳ−７細胞などで発現させ、目的の遺伝子をスクリーニングする発現クローニングなどの手法でリガンドのｃＤＮＡを分離することもできる。発現クローニングには、ＴＡＮ−１など現在まで４種知られているノッチのアミノ酸配列を含有するポリペプチドの結合を利用したセルソーターによる分画法、ラジオアイソトープを用いたフィルムエマルジョンによる検出法、等の方法が挙げられる。ここではヒトデルタ−１及びセイトセレイト−１の遺伝子取得の方法を述べたが、リガンド作用の解析のために他の生物のノッチリガンドホモログ遺伝子の取得は有用であり、これも同様の手段によって取得できる。得られた目的遺伝子はＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列を推定することができる。
本発明者らは実施例２に示したごとく、ヒトデルタ−１ＰＣＲ産物を含む遺伝子断片をラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、スクリーニングライブラリーとしてヒト胎盤由来ｃＤＮＡを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクローンのＤＮＡ配列を決定したところ、配列表の配列番号８に示すＤＮＡ塩基配列を含むクローンであり、およびそれから推定される配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列をコードすることが明らかとなり、ヒトデルタ−１の全長アミノ酸をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功した。
これらの配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋリリース８９、Ｊｕｎｅ、１９９５）で比較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトデルタ−１は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らかとなった。
同様に本発明者らは実施例４に示したごとく、ヒトセレイト−１ＰＣＲ産物を含む遺伝子断片をラジオアイソトープでラベルし、ハイブリダイゼーションプローブとし、スクリーニングライブラリーとしてヒト胎盤由来ｃＤＮＡを用いてスクリーニングを行い、得られた複数のクローンのＤＮＡ配列を決定したところ、配列表の配列番号９に示すＤＮＡ塩基配列を含むクローンであり、およびそれから推定される配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列の一部をコードすることが明らかとなった。このスクリーニングでは全長のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の細胞内部分の一部、すなわち終止コドン周辺に当たる部分がクローニングできなかったため、実施例４に示した如く、ＲＡＣＥ法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ法、Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，８９９８−９００２，１９８８）にて遺伝子クローニングを行い、最終的にヒトセレイト−１の全長アミノ酸をコードするｃＤＮＡのクローニングに成功した。
この配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋリリース８９、Ｊｕｎｅ、１９９５）で比較したところ、これらは新規な配列であった。該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトセレイト−１は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らかとなった。
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社製、日本国）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いることができる。このようにして、得られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法等を用いて導入する。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２、ＪＭ１０９などが挙げられる。上記バチルス属菌の例としては、バチルス、サチリスＭＩ１１４等が挙げられる。また、ファージベクターは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏc.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１：２４４２−、１９７８）を用いて導入することができる。
ヒトデルタ−１のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトデルタ−１の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号８のアミノ酸配列に示す７２３アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１番のセリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のセリンから５２０番グリシンにあたる５２０アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の５２１番のプロリンから５５２番のロイシンにあたる３２アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の５５３番のグルタミンから７０２番のバリンにあたる１５０アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
ヒトデルタ−１の他生物のデルタホモログとのアミノ酸配列の比較では、ショウジョウバエデルタ、ニワトリデルタ、アフリカツメガエルデルタとの相同性はそれぞれ４７．６％、８３．３％、７６．２％であり、これらの物質とは異なる新規なアミノ酸配列を有する新規な物質であり、本発明者により初めて明らかにされた物質である。また、上記のデータベース上の全ての生物種の検索においてもヒトデルタ−１と同一配列を有するポリペプチドは見いだされなかった。
ノッチのリガンドホモログは、進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルタ−１とヒト以外の種のデルタホモログとの比較により、ヒトデルタ−１のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１５８番のシステインから２００番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は８回繰り返して存在し、配列表の配列番号４のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２０５番システインから２３３番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２３６番システインから２６４番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２７１番システインから３０４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３１１番システインから３４２番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３４９番システインから３８１番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は３８８番システインから４１９番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２６番システインから４５７番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６４番システインから４９５番システインに該当した。
ヒトデルタ−１のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の４５６番のアスパラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号２、３または４の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
また、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトセレイト−１の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号９のアミノ酸配列に示す１２１８アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−３１番のメチオニンから−１番のアラニンにあたる３１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のセリンから１０３６番アスパラギン酸にあたる１０３６アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の１０３７番のフェニルアラニンから１０６２番のロイシンにあたる２６アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の１０６３番のアルギニンから１１８７番のバリンにあたる１０６アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
ヒトセレイト−１の他生物のセレイトホモログとのアミノ酸配列の比較では、ショウジョウバエセレイト、ラットジャグドとの相同性はそれぞれ３２．１％、９５．３％であり、これらの物質とは異なる新規なアミノ酸配列を有する新規物質であり、本発明者により初めて明らかにされた物質である。また、上記のデータベース上の全ての生物種の検索においてもヒトセレイト−１と同一配列を有するポリペプチドは見いだされなかった。
ノッチのリガンドホモログは、進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトセレイト−１と他のノッチリガンドホモログとの比較により、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列からこれらの保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１５６番のシステインから１９８番のシステインにあたる４３アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は１６回繰り返して存在し、配列表の配列番号７のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は２０４番システインから２３１番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２３４番システインから２６２番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２６９番システインから３０２番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３０９番システインから３４０番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３４６番システインから３７８番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は３８５番システインから４１６番システインまで、第７ＥＧＦ様配列は４２３番システインから４５３番システインまで、第８ＥＧＦ様配列は４６０番システインから４９１番システインまで、第９ＥＧＦ様配列は４９８番システインから５２９番システインまで、第１０ＥＧＦ様配列は５３６番システインから５９５番システインまで、第１１ＥＧＦ様配列は６０２番システインから６３３番システインまで、第１２ＥＧＦ様配列は６４０番システインから６７１番システインまで、第１３ＥＧＦ様配列は６７８番システインから７０９番システインまで、第１４ＥＧＦ様配列は７１７番システインから７４８番システインまで、第１５ＥＧＦ様配列は７５５番システインから７８６番システインまで、第１６ＥＧＦ様配列は７９３番システインから８２４番システインに該当した。但し、第１０ＥＧＦ様配列はシステインを１０残基含む変則的な配列を有していた。
ヒトセレイトー１のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１１２番、１３１番、１８６番、３５１番、５２８番、５５４番、７１４番、１０１４番、１０３３番のアスパラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号５、６または７の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グルコシドやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＮ−グルコシドあるいはＯ−グルコシド結合してなるポリペプチドも本発明に含まれる。
ショウジョウバエノッチおよびそのリガンドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチのリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質のＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている（特表平７−５０３１２１号）。このことから、ヒトノッチリガンド分子のリガンド作用発現に必要な領域は少なくともＤＳＬドメイン、すなわち配列表の配列番号１のアミノ酸配列含む領域であり、また、少なくともヒトデルタ−１のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号２に示した新規アミノ酸配列であり、更に少なくともヒトセレイト−１のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号５に示した新規アミノ酸配列であることがわかる。
また、配列表の配列番号の８の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒトデルター１のｍＲＮＡの検出が可能であり、配列表の配列番号の９の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒトセレイト−１のｍＲＮＡの検出が可能である。たとえば、これらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の配列番号８または９の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが出来る。同様な方法でマウス等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができる。さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。
尚、本発明のヒトデルタ−１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５７２８。また、本発明のヒトセレイトー１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＳＲ−１を大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＳＲ−１として日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭＢＰ−５７２６。
上記の方法にて分離したヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の発現、精製には多数の方法が成書によって知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ，１９９０、および横田ら、バイオマニュアルシリーズ４，遺伝子導入と発現・解析法，羊土社、１９９４）。すなわち、分離した該ヒトデルタ−１、該ヒトセレイト−１のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることができる。
本発明のヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
本発明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が動物細胞である場合には、実施例に記載したＳＲαプロモーターなどのＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが利用できる。
以上に示したあらゆる同業者であれば使用可能なプロモーターを有する発現ベクターを用いることにより、本発明のポリペチドを発現することができる。
本発明のポリペプチドを発現させる時、配列表の配列番号２、３、４、５、６もしくは７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもできる。
ヒトデルタ−１に関して本発明者らは実施例５に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、
１）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、
２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すなわちＡｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓのアミノ酸配列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号１０）を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および
３）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の１番から５２０番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（国際公開番号、ＷＯ９４／０２０３５号参照）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山ら、９１年度日本分子生物学会予稿集、日本国東京医科歯科大学丸山より入手可能、プロモーターとしてＳＲαを有する）に各々別々につなぎ、ヒトデルタ−１の細胞外部分発現ベクターを作製した。
また、ヒトデルタ−１の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、
４）配列表の配列番号４の１番から７０２番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および
５）配列表の配列番号４の１番から７０２番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトデルター１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトデルタ−１をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
また、同様に、ヒトセレイト−１に関して本発明者らは実施例６に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして、
６）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、
７）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸のＣ末側に該ＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および
８）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸のＣ末側に該Ｆｃ配列を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトセレイトー１の細胞外部分発現ベクターを作製した。
また、ヒトセレイト−１の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして、
９）配列表の配列番号７の１番から１１８７番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および
１０）配列表の配列番号７の１番から１１８７番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つポリペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏに各々別々につなぎ、ヒトセレイト−１の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトセレイト−１をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
実施例７に示したごとく、上記の１）〜１０）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導入し、ヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１をＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒトデルタ−１ポリペプチド、ヒトセレイト−１ポリペプチドを製造することができる。
実施例８に示したごとく、上記の様な培養物からヒトデルタ−１ポリペプチド、ヒトセレイト−１ポリペプチドを分離精製することができる。また、一般的には下記の方法により行うことができる。
すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合には、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１は公知のタンパク質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合には、それら既知抗原エピトープに対する抗体を用いたイムノアッセイで検出して精製を進めることができる。また、このような融合タンパク質として発現させない場合には、実施例９に記載した抗体を用いて検出することができる。
ヒトデルタ−１、セレイト−１を特異的に認識する抗体は実施例９に示したように作製することができる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することができる。このように作製された抗体はヒトデルタ−１、デルタ−１の精製に利用できる。すなわち、実施例９に示したこれらのヒトデルタ−１、セレイト−１を特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のヒトデルタ−１、セレイト−１の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性腫瘍など疾患の診断薬として使用でき得る。
精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。この際に用いる抗体としては実施例９記載した抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合には、実施例８に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いることができる。
これらの融合蛋白としてはここに示した２例以外のあらゆる融合蛋白が可能である。例えば、ヒスチジンＴａｇ、ｍｙｃ−ｔａｇなどが挙げられるが、現在までの公知の方法以外にも、現在の遺伝子工学的な手法を用いればあらゆる融合蛋白を作製することが可能であり、それらの融合蛋白に由来する本発明ポリペプチドも本発明に含まれる。
このように精製されたヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１タンパクの生理機能を、各種細胞株、マウス、ラットなどの生物個体を用いた各種生理活性アッセイ法、分子生物学的手法に基づく細胞内シグナル伝達の各種アッセイ法、ノッチリセプターとの結合などの色々なアッセイ法にて知ることができる。
本発明者らはヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質を用いて、血液未分化細胞への作用を観察した。
すなわち、実施例１０に示したようにＣＤ３４陽性細胞画分を濃縮した臍帯血由来血液未分化細胞において、各種サイトカイン存在下でコロニー形成する血液未分化細胞に対して本発明ポリペチドがコロニー形成作用の抑制活性を有することを見いだした。また、この抑制活性はＳＣＦ存在下にのみ観察される過去にない活性を有していると考えられた。
また、実施例１１に示したように、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏの各種サイトカイン存在下での長期（８週間）液体培養へのヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質の添加により、有意にコロニー形成細胞の維持が延長される作用が見いだした。さらにコロニー形成細胞の増殖を抑制しない作用を見いだした。一方、血液細胞の遊走、分化抑制作用を有するサイトカインであるＭＩＰ−１α（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，６４３−６４９，１９９４）は血液未分化細胞の未分化維持の作用を有さなかった。
さらに、実施例１２に示したように、サイトカイン存在下での液体培養へのヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧ１キメラ蛋白質の添加により、ヒト血液未分化細胞に中で最も未分化な血液幹細胞と位置付けられているＬＴＣ−ＩＣ（Ｌｏｎｇ-Ｔｅｒｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ）の数を有意に維持する活性を有していることを見いだした。
これらの結果から、ヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は血液未分化細胞の分化を抑制し、それらの作用は血液幹細胞からコロニー形成細胞にわたって作用することが明らかである。これらの生理作用は血液未分化細胞の体外増殖に必要な作用であり、特にヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を含有する細胞培養培地で培養した細胞は抗癌剤投与後の骨髄抑制回復に有効であり、他の条件を整えることにより体外での造血幹細胞の増幅を可能とするであろう。さらに、医薬品として用いた場合には、抗癌剤などの副作用で見られる骨髄抑制作用を保護し、軽減する作用がある。
さらに、血液細胞以外の未分化細胞においても、細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、また組織再生を促す作用等が期待できる。
医薬品として用いるならば、本発明のポリペプチドを適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと共に凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供することができる。本発明者らは本発明の化合物１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍｌとなるようにバイアルに小分けし、長期にわたって該化合物の活性は保持された。さらに、細胞を体外にて培養、活性化させる場合には医薬品同様に、凍結乾燥品、もしくは溶液剤を作製して、培地に加える、もしくは培養に使用する容器に固定化することができる。また、本発明のポリペプチドの毒性については、マウスに対していずれのポリペプチドも１０ｍｇ／Ｋｇを腹腔内投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。
また、本発明のインビトロの生理活性は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデルとして投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、異常を調べることにより可能となる。例えば、造血細胞に関する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌剤を投与して、骨髄抑制モデルマウスを作製し、このマウスに本発明の化合物を投与した群としなかった群の骨髄細胞、末梢血細胞の数、生理的な機能を調べることで明らかになる。また更に、体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培養、増殖を調べる場合には、マウス骨髄細胞を培養器などを利用して、培養を行い、その際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射線照射マウスに細胞移植を行い、その結果の回復の度合いを、生存率、血球数の変動などを指標にすることで調べることが出来る。勿論、これらの結果が人にも外挿できるため、本化合物の薬効としての評価として有効なデータを得ることが出来る。
本発明の化合物を医薬品として利用する場合、その適応として、細胞の分化異常に伴う疾患、例えば白血病、悪性腫瘍の治療があげられ、体外でヒト由来細胞を培養して、その本来の機能を保ったまま増殖させる、もしくは新たな機能を持たせる等を行う細胞治療、組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組織が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法などの応用が可能である。その際の投与量としてはその形態などにもよるが、具体的には１０μｇ／Ｋｇから１０ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。
また、さらに強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。
実施例１０に示したようにヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１の抑制活性は２量体構造を有するＩｇＧキメラ蛋白質の方が高いことから、強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。
多量体構造を有するヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は、実施例に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させた該ヒトセレイトの細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他のヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型ヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１を得ることもできる。また、さらに配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドを遺伝子工学的に２つ以上直列にもしくは並列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている２量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により作製される２量体もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配列番号２、３、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
また、その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リシン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、アミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、２量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される２量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有す形の配列表の配列番号２、３、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
体外において細胞を増殖、活性化し、体内に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のような形態を有したヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を直接培地中に加えることも可能だが、固定化する事も同様に可能である。固定化の方法としてはこれらのポリペプチドのアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器にポリペプチドを共有結合させることができる。したがって、固体表面に存在する形態を有す配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関しても本発明に含まれる。
また、自然界に存在するヒトデルタ−１及びヒトセレイト−１は細胞膜蛋白質であることから、これらの分子を発現する細胞と血液未分化細胞を共培養することによっても、実施例で行った分化抑制作用を発現させることができる。したがって、配列表の配列番号２〜７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞と未分化細胞を共培養する方法についても本発明に含まれる。
発現させる細胞は実施例で示したＣＯＳ−７細胞でもかまわないが、ヒト由来の細胞が望ましく、また更に発現させる細胞は細胞株ではなくヒトの体内の血液細胞でも体細胞でもかまわない。したがって、遺伝子治療用のベクターに組み込んで体内で発現させることもできる。
実施例１０に示したように低濃度の単量体であるヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＦＬＡＧキメラ蛋白質はコロニー形成抑制ではなく、逆にコロニー形成促進作用を示す。この作用は血液未分化細胞が細胞分裂する際に、ノッチリセプターとノッチリガンド分子を発現し、本発明のポリペプチドがその作用のアンタゴニストとして働いたと考えられる。このことから配列表の配列番号１、２、４もしくは５のアミノ酸配列を有するポリペプチドはその作用濃度をコントロールすることによりコロニー形成促進作用も有する。したがって、コロニー形成促進作用を有する配列表の配列番号２、３、５もしくは６のアミノ酸配列を有するポリペプチドも本発明に含まれる。
更にこのことから、本発明分子、すなわち配列表の配列番号２〜７のアミノ酸配列を有するポリペプチドとこれらのリセプターとの結合を阻害することは細胞分化を促進する分子、化合物を見つけだす手段として利用できる。その方法としては、ラジオアイソトープなどを用いた結合実験、ノッチリセプターの下流分子である転写調節因子群を用いたルシフェラーゼアッセイ、Ｘ線構造解析を行いコンピューター上でのシュミレーションなどあらゆる方法が応用できる。したがって、配列表の配列番号２〜７のポリペプチドを用いた薬剤スクリーニング方法に関しても本発明に含まれる。
また、次に実施例１３に示したようにヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１のＩｇＧキメラタンパクを用いることにより特定の白血病細胞株を分別できる。したがって、このことは白血病の診断薬として使用でき、また特定の血液細胞の分離に応用できる。この結果はヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１分子はそのリセプターであるノッチリセプター分子と特異的な結合をするためと考えられ、例えば上記の細胞外部分とヒトＩｇＧＦｃの融合タンパクを用いれば、ノッチリセプターの発現を検出できる。ノッチはある種の白血病に関連していることが知られており（Ｅｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６４９−６６１，１９９１）、したがって、配列表の配列番号２、３、５及び６のアミノ酸配列を含有するポリペプチドは体外もしくは体内の診断薬として使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明分子を含む各種生物で同定されたノッチリガンド分子のＤＳＬドメインのアラインメントである。
第２図は本発明分子の血液未分化細胞のコロニー形成抑制を示すものである。
第３図は本発明分子の血液未分化細胞のコロニー形成抑制作用の濃度依存性を示すものである。
第４図は本発明分子を用いた液体培養後のＬＴＣ−ＩＣの算出を行った際のグラフを示すものである。
第５図は本発明分子によって染色された細胞を示すものである。
発明の実施の形態
以下に発明を実施する形態について例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
実施例１ ヒトデルタ−１プライマーによるＰＣＲ産物のクローニングおよび塩基配列の決定
Ｃ−デルター１およびＸ−デルタ−１に保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＤＬＴＳ１（配列表の配列番号１１に記載）及びアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（配列表の配列番号１２に記載）を用いた。
合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理とする全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動ＤＮＡ合成機としては米国アプライドバイオシステム社３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３’-ヌクレオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離させた。次に、核酸及びリン酸の保護基を遊離させるために、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内において濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置した。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカートリッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリチル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用した。
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液（ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）１μｌを使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）４μｌ、前述の脊椎動物デルタホモログに特異的なセンスプライマーＤＬＴＳｌ（１００Ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＤＬＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（米国ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）にて作成した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にてデルタプライマーによるＰＣＲ産物の約４００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本国日本ジーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとしてｐＣＲII Ｖｅｃｔｏｒ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製、以下ｐＣＲIIと示す）を用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（米国Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたｐＣＲIIを大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（日本国宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約４００ｂｐのＤＮＡが切れ出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を米国アプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサー（モデル３７３Ｓ）にて決定した。
実施例２ 新規ヒトデルター１遺伝子の全長クローニングおよびその解析
ヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ−１１にｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）からプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。出現したプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトデルタ−１プローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識された実施例１で作製されたＤＮＡプローブは以下のように作成した。すなわち、遺伝子配列が決定されたヒトデルタ−１プライマーによる精製ＰＣＲ産物（約４００ｂｐ）が組み込まれたｐＣＲIIより、ＥｃｏＲＩにてベクターより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片を精製回収した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含むＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて振盪し２回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶液に浸し、５５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。
単離されたファージクローンは７クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｄ５、Ｄ６、Ｄ７の３クローンは共に配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の１番から２２４４番の配列を含むクローンであり、Ｄ４のクローンは配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の９９９番から２６６３番を含むクローンであった。Ｄ５とＤ４の２クローンはキロシークエンス用デリションキット（日本国宝酒造社製）を用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
さらに配列表の配列番号８のＤＮＡ配列の１２１４番にあるＸｈｏＩサイトを利用し、Ｄ４とＤ５を制限酵素ＸｈｏＩによって消化して、配列表の配列番号７のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ−１を作製した。
実施例３ ヒトセレイトー１特異的なＰＣＲ産物のクローニングおよび塩基配列の決定
ショウジョウバエセレイトおよびラットジャグドに保存されたアミノ酸配列に対応した混合プライマー、すなわちセンスプライマーＳＲＴＳ１（配列表の配列番号１３に記載）およびアンチセンスプライマーＳＲＴＡ２（配列表の配列番号１４に記載）を用いた。作製法は実施例１に記載した方法で行った。
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。該ヒト胎児脳由来ｃＤＮＡ混合溶液１μｌを使用し、１０×緩衝液（実施例１に記載）５μｌ、該ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ４μｌ、前述のセレイト−１ホモログに特異的なセンスプライマーＳＲＴＳ１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌおよびアンチセンスプライマーＳＲＴＡ２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌ、及び該ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイクル行い、さらに９５℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３５サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線下で観察し、約５００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
ＰＣＲ産物の全量を該低融点アガロースにて作製した２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて約５００ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエタノール沈澱して回収した。
ベクターとして該ｐＣＲII Ｖｅｃｔｏｒを用い、ベクターと先のＤＮＡのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、実施例１と同様に、ベクターｐＣＲIIにＤＮＡ断片を組み込み、同様に大腸菌に遺伝子導入し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、１８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、該ウィザードミニプレップを用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化して、約５００ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列を該ＤＮＡシークエンサーにて決定した。
実施例４ 新規ヒトセレイト−１遺伝子の全長クローニングおよびその解析
前述のヒト胎盤由来のｃＤＮＡライブラリーからプラークハイブリダイゼーションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローンの検索を１×１０6相当のプラークから行った。フィルターの作製は実施例２に記載した方法で作製し、このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識されたヒトセレイト−１プローブにてスクリーニングを行った。
放射性同位元素32Ｐにて標識された先のＤＮＡプローブは実施例２に記載した方法にしたがって作製し、ハイブリダイゼーション、フィルターの洗浄、クローンの分離は実施例２に記載した方法にて行った。
単離されたファージクローンは２２クローンであった。成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０9ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡを精製し、制限酵素ＥｃｏＲ１にて消化し、同様にＥｃｏＲ１で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。これらのクローンの両端のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサーにより解析したところ、Ｓ１６およびＳ２０の２クローンは共に配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１番から１８７３番の配列を含むクローンであり、Ｓ５およびＳ１４の２クローンは配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の９９０番から４００５番を含むクローンであった。これらのクローンは該キロシークエンス用デリションキットを用いて添付の説明書に従ってデリションミュータントを作製し、該ＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
さらに、配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１２９３番にあるＢｇｌIIサイトを利用し、Ｓ２０とＳ５を制限酵素ＢｇｌIIによって消化して、配列表の配列番号９の遺伝子配列の１番から４００５番のＤＮＡを大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、このプラスミドをｐＢＳＳＲＴとする。
この結果、Ｃ末端に終止コドンが認められず、細胞内部分のＣ末端のアミノ酸配列をコードしている領域がクローニングできていないことが判明したため、全長遺伝子をクローニングを米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製３’ＲＡＣＥシステムキットを用いて、添付のマニュアルに従って、ヒト胎盤由来ｐｏｌｙＡ+ＲＮＡ（米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）から３’方向の遺伝子のｃＤＮＡのクローニングを行い、遺伝子配列を決定した。
このように遺伝子クローニングした３つの遺伝子断片を配列表の配列番号９のＤＮＡ配列の１２９３番にある制限酵素Ｂｇｌ２サイトと３９４３番にあるＡｃｃ１サイトを利用し、配列表の配列番号５のＤＮＡ配列全長を含むプラスミドをｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲ１とＸｂａ１の間につなぎ込み、ヒトセレイト−１の全長遺伝子を含むｐＵＣＳＲ−１を作製した。この遺伝子の配列を配列表の配列番号９にアミノ酸配列とともに示す。
実施例５ ヒトデルタ−１発現ベクターの作製
配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター１蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
１）分泌型ヒトデルター１蛋白質（ＨＤＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ヒトデルタ−１の発現ベクターを作製するにあたって、遺伝子産物のより安定的に発現させるために、開始コドン（配列表の配列番号８の遺伝子配列の１７９番）の５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号８に記載のＤＮＡ配列、ヒトデルタ−１の全長のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＤｅｌ−１をテンプレートとし、配列表の配列番号１５及び配列番号１６の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に２０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作成した。以下このプラスミドをｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａと示す。
次に、このｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１７及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１６００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸと命名した。
２）分泌型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１番から５２０番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号３の５２０番目のＧｌｙの後にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号１９及び配列番号１８の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約１７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＦＬＡＧと命名した。
３）分泌型ヒトデルター１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝子配列を制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた配列表の配列番号２０の配列を有するオリゴヌクレオチド、制限酵素ＸｂａＩサイトのついた配列表の配列番号２１の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、およそ１．４ｋｂｐのバンドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（日本国宝酒造社製）で処理をして、同様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＴ４ ＤＮＡリガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。その後、このプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列が確かにヒトＩｇＧ１の重鎖のヒンジ部分にあたるゲノムＤＮＡであることを確認した（その配列はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ９１−３２４２，１９９１を参照）。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。
次に、該ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号３の５２０番目のＧｌｙの後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加するために、配列表の配列番号２２と配列番号２３のオリゴヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイトの付加を行った。このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルタ−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３０００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＥＸＩｇと命名した。
４）全長型ヒトデルター１の蛋白質（ＨＤＦ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして用い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号４の７０２番目のＶａｌの後に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号２４及び配列番号２５の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦと命名した。
５）全長型ヒトデルター１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から７０２番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｄｅｌｔａをテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号２６及び配列番号２５の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。
このベクターからヒトデルタ−１の全長をコードするＤＮＡを大腸菌ベクターｐＵＣ１９にクローニングして全長ヒトデルタ−１をコードするベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを作製した。
次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約２２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤＦＬＡＧと命名した。
実施例６ 新規ヒトセレイト−１発現ベクターの作製
配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列からなる遺伝子を用いて、次の６）および１０）に挙げるヒトセレイト−１蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全てＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
６）分泌型ヒトセレイトー１（ＨＳＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のアミノ酸配列を有するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたって、遺伝子産物をより安定的に発現させるために、開始コドン（配列表の配列番号９の遺伝子配列の４０９番）の５’方向に１０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加した。すなわち、上記のＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号９に記載のＤＮＡ配列の１番から４００５番のヒトセレイト−１ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳＳＲＴをテンプレートとし、配列表の配列番号２７の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２８の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、５’方向に１０ｂｐ上流の部分にＥｃｏＲＩサイトを付加したＤＮＡを作成した。
次に、この様にして作成されたベクター（以下ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１と示す）をテンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６のポリペプチドのカルボキシル末端に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号２９の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３０の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン並びにＭｌｕＩサイトを付加した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸと命名した。
７）分泌型ヒトセレイト−１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号６のアミノ酸配列の１番から１０３６番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するＦＬＡＧキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６のポリペプチドのカルボキシル末端にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号３１の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３０の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン及びＭｌｕＩサイトを付加した。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３２００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸＦＬＡＧと命名した。
８）分泌型ヒトセレイト−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅをテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号６の配列を有すポリペプチドの後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に制限酵素ＸｂａＩおよびＭｌｕＩサイトを付加するために、配列表の配列番号３２の遺伝子配列を有すオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号３３の配列を有すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＭｌｕＩのサイトの付加を行った。このベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトセレイト−１のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約４４００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＥＸＩｇと命名した。
９）全長型ヒトセレイト−１の蛋白質（ＨＳＦ）発現ベクター
配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１番から１１８７番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
全長の発現ベクター作製にあってはｐＢＳ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｇｌIIにて消化し、切り出されてくる約９００ｂｐの遺伝子断片をｐＵＣＳＲ−１を同様な制限酵素で消化し、ライゲーションしてヒトセレイト−１全長遺伝子をコードするベクターｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１を作製した。
このｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして用い、全長のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号７の１１８７番目のＶａｌの後に終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列表の配列番号３４及び配列番号３５の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端に終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＦと命名した。
１０）全長型ヒトセレイトー１のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＳＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１番から１１８７番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、ＳＲαのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴＮｅｏにつなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＵＣ／Ｅｃｏ−Ｓｅｒｒａｔｅ−１をテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＭｌｕＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号３６及び配列番号３５の遺伝子配列を有するをオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＭｌｕＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩにて消化し、切り出されてくる約３７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐＭＫＩＴＮｅｏにつないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＳＦＬＡＧと命名した。
実施例７ 各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
実施例５及び６で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（日本国理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ＰＢＳ（−）に１×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
その翌日、培養上清を除去し、ディッシュに付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、発現ベクターｐＨＤＥＸ、ｐＨＤＥＸＦＬＡＧ、ｐＨＤＥＸＩｇ、ｐＨＳＥＸ、ｐＨＳＥＸＦＬＡＧ、及びｐＨＳＥＸＩｇの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファーをＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、細胞培養上清を得た。
また、ｐＨＤＦ、ｐＨＤＦＬＡＧ、ｐＨＳＦ、及びｐＨＳＦＬＡＧの場合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわち、２×１０6個の細胞をセルリシスバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％グリセロール、４ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を取り細胞破砕物を得た。
こうして得られたサンプルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発現を確認した。
すなわち、濃縮した培養上清もしくは細胞破砕物を日本国ＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
このように作製されたフィルターをブロックエース（日本国大日本製薬社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）に４℃一晩振盪してブロッキングした。ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書に従い、目的の蛋白質がヒトデルタ−１由来の場合には１次抗体として実施例９に記載した抗ヒトデルタ−１マウスモノクローナル抗体を用い、ヒトセレイト−１由来の場合には１次抗体として実施例９に記載した抗ヒトセレイト−１マウスモノクローナル抗体を用い、ＦＬＡＧキメラの場合は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。
その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤＥＸとｐＨＤＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約６５ｋダルトン、ｐＨＤＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約９５ｋダルトン、ｐＨＤＦ、ｐＨＤＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダルトンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプルはｐＨＤＥＸＩｇを導入した場合、１２０ｋから２００ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約１８０ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
また同様に、還元処理を行ったサンプルはｐＨＳＥＸとｐＨＳＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約１４０ｋダルトン、ｐＨＳＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約１７０ｋダルトン、ｐＨＳＦ、ｐＨＳＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約１５０ｋダルトンのバンドを検出した。一方、非還元状態のサンプルはｐＨＳＥＸＩｇを導入した場合、２５０ｋから４００ｋダルトンの若干スメア状のバンドで主に約３００ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
これらの実験では、コントロールとしてｐＭＫＩＴＮｅｏベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルタ−１マウスモノクローナル抗体、抗ヒトセレイト−１マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。
以上の結果から、これら１０種の発現ベクターはいずれも目的のポリペプチドを生産することができた。
実施例８ 遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１蛋白質の精製
実施例７の方法で発現が検出されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＤＥＸＩｇおよびＨＳＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラムによって各々のキメラ蛋白質を精製した。
ＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧに関しては、実施例７に記載した方法によって取得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チューブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、各々の面分を中和した。
上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキメラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは実施例７に記載の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットIIを用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果として、ＨＳＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバンドが検出され、この分子量は実施例６で得られた抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧとも一致した。この結果からＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧの純品が精製された。
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤＥＸＩｇとＨＳＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムに吸着させ、溶出画分を分取した。
ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒトＩｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果とＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇとも一致した。この結果からＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの純品が精製された。
実施例９ ヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１を認識する抗体作成
実施例８に記載の方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター１ウサギポリクローナル抗体、抗ヒトセレイトー１ウサギポリクローナル抗体を各々精製して作製した。
また、実施例８に記載した方法で精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上記のように精製されたＨＤＥＸＦＬＡＧ、ＨＳＥＸＦＬＡＧを各々別々にＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトデルター１もしくはヒトセレイト−１の細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルタ−１もしくはヒトセレイト−１を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ ＴｒａｐＧIIを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルタ−１モノクローナル抗体、抗ヒトセレイト−１モノクローナル抗体を精製し作製した。
これらモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。このゲルの２ｍｌを２ｃｍ2×１ｃｍのサイズのカラムを作製した。
抗ヒトデルタ−１モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してはｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を、抗ヒトセレイト−１モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してはｐＨＳＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を各々２０ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。
さらに実施例８に記載の方法に従って、各々の精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウエスタンブロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結果、ｐＨＤＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約６５ｋダルトンのＨＤＥＸが、ｐＨＳＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約１４０ｋダルトンのＨＤＳＥＸが精製されていることが確認され、これらアフィニティーカラムでヒトデルタ−１、ヒトセレイト−１が精製可能であることが明らかとなった。
実施例１０ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞のコロニー形成に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清半固形培地で培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
ヒト臍帯血もしくはヒト正常骨髄血のＣＤ３４陽性細胞は臍帯血もしくは成人正常骨髄血をシリカ液（日本国免疫生物研究所製）により添付の説明書にしたがって処理し、その後フィコールパック（スエーデン国ファルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞画分（＜１．０７７ｇ／ｍｌ）を分画した単核球より分離した。
ＣＤ３４陽性細胞の分離は米国ＡＩＳ社製マイクロセレクターステムもしくはノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ ＣＤ３４とＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤＳ ＣＤ３４を用い、添付の取扱説明書に従って分離した。分離後、その純度はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体ＨＰＣＡ２（米国ベクトンデッキンソン社製）で染色し、同社のフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）にて検定し、８５％以上の純度を有していることを確認して用いた。
このようにして分離したＣＤ３４陽性細胞４００個が下記の培地１ｍｌ中に存在するように均一に懸濁し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社製）にまき、３７℃、５％炭酸ガス、５％酸素ガス、９０％窒素ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで２週間の培養後、形成された血球コロニーを倒立顕微鏡下で計測した。
培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍ（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に２％Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌ ヒトインスリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、２００μｇ／ｍｌ トランスフェリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール（日本国ナカライテスク社製）、１６０μｇ／ｍｌ ソイビーンレクチン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、９６μｇ／ｍｌ コレステロール（米国Ｓｉｇｍａ社製）、０．９％ メチルセルロース（日本国和光純薬社製）で行った。
上記の培地に下記の３種の条件のサイトカイン存在下に対し、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトデルタ−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）もしくはヒトセレイト−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。
サイトカイン条件下記の通りである。
条件１：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）。
条件２：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３、４ｎｇ／ｍｌ ヒトトロンボポエチン（米国Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社製）。
条件３：１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ ヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏ（日本国中外製薬製）、１０ｎｇ／ｍｌ ヒトＧ−ＣＳＦ（日本国中外製薬製）。
結果を第２図に示す。第２図のＡはヒトデルタ−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤＥＸＩｇ）の場合であり、Ｂはヒトセレイト−１細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＳＥＸＩｇ）の場合である。ＡとＢは各々異なった由来のヒト臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた。縦軸はコロニー数を示し、白カラムは比較区、黒カラムは各々ＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを含むデータである。
ＨＤＥＸＩｇとＨＳＥＸＩｇはいずれもコロニー形成を抑制する活性を有していた。これら結果のコロニー形成細胞の種類には違いが認められなかった。したがって、本発明の分子は血液未分化細胞のコロニー形成細胞に対して、コロニー形成抑制作用を有する。すなわち、分化抑制作用を有することが明らかになった。この活性に関してＳＣＦ存在下と非存在下の比較を行ったところ、この抑制活性はＳＣＦ存在下にのみ観察される傾向が見られた。
また、更にこの活性に関して濃度依存性の検討を行った。また、２量体であるＨＳＥＸＩｇと単量体であるＨＳＥＸＦＬＡＧの比較も行った。結果を第３図に示す。この場合の濃度はモル濃度として示すが、２量体と単量体との比較を行うため、２量体のＨＳＥＸＩｇは正確なモル濃度の２倍濃度として示し、ヒトセレイト−１部分のモル濃度が同じとなるようにプロットした。縦軸はコロニー形成数で、横軸はモル濃度である。ノッチリガンドを含まない場合のコロニー形成数は０濃度の縦軸上にプロットした。また比較として行った１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１のコロニー形成数はおよそ１００個であった。
この結果からＨＳＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＦＬＡＧとも濃度依存的にコロニー形成を抑制したが、その活性は明らかに２量体であるＨＳＥＸＩｇの方が強かった。また、単量体のＨＳＥＸＦＬＡＧは低濃度領域で逆にコロニー形成を促進する作用が観察された。
実施例１１ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇのコロニー形成血液未分化細胞の長期液体培養に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清培地で長期液体培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
実施例１０に記載した方法で分離した臍帯血単核球ＣＤ３４陽性細胞を２４ｗｅｌｌ細胞培養プレート（米国ファルコン社製）に１０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで液体培養した。培養は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで行った。液体培養の培地は無血清のイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に２％ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、５ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、３Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏを加えたものを用いた。条件によって５００ｎｇ ＨＳＩｇ、もしくは５０ｎｇ／ｍｌ ＭＩＰ−１α（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）を加えた。この培地を１ｗｅｌｌあたり１ｍｌを加え、週に３回の半量培地交換を行い、培養２、４、６、８週後にセルスクレイパーを用いてｗｅｌｌからすべての細胞を１．５ｍｌマイクロチューブに回収し、遠心分離によって細胞を沈降させ、新鮮なＩＭＤＭ １ｍｌに再懸濁し、細胞数を血球計算盤を用いてカウントし、５０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌで血球コロニー形成アッセイを行った。
血球コロニー形成アッセイはイスコフメチルセルロースコンプリートレディミックス（カナダ国Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社）２枚に各１ｍｌをシリンジを用いて植え付け、炭酸ガスインキュベーターで２週間培養した。血球コロニーは倒立顕微鏡下で顆粒球単球コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）および赤芽球コロニー（ＢＦＵ−Ｅ）をカウントし、総数をＣＦＵ−Ｃとした。ここで得られたＣＦＵ−Ｃ数と血球計算盤で求めた細胞数を掛け合わせ、液体培養で植え付けた１０００ｃｅｌｌｓあたりのＣＦＵ−Ｃ数を求めた。この結果をＨＤＥＸＩｇの場合を第１表に、ＨＳＥＸＩｇの場合を第２表に示す。実験はｎ＝３で行い、値は（平均値±ＳＤ）で表した。なお表中のＮＤはコロニーが検出できなかったことを示す。
実施例１２ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞ＬＴＣ−ＩＣの液体培養に対する作用
ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、臍帯血ＣＤ３４陽性細胞をＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清培地で２週間液体培養し、現在最も未分化な血液細胞群と考えられるＬＴＣ−ＩＣの増減を観察した。
実施例１０に記載した方法で分離した臍帯血単核球ＣＤ３４陽性細胞を１０００００から２００００個を下記の培地で２週間培養し、培養前区、ＨＤＥＸＩｇ存在区、ＨＳＥＸＩｇ存在区と比較区の４つの実験区に存在するＬＴＣ−ＩＣ数の違いを調べた。
液体培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍに２％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン、４０μｇ／ｍｌ低密度リポプロテイン、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノールを加え、更に１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６加えた培地を用い、これにＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを１μｇ／ｍｌ加え、比較区には前述のヒトＩｇＧ１を同濃度加えた。
ＬＴＣ−ＩＣに使用するヒト骨髄ストローマ細胞層の作製、限界希釈法によるＬＴＣ−ＩＣの頻度の定量はＳｕｔｈｅｒｌａｎｄらの方法（Ｂｌｏｏｄ、７４、１５６３−、１９８９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、３５８４−、１９９０）に従って行った。
すなわち、実施例１０で得られた分離前のシリカ液処理しない骨髄単核球を１〜２Ｘ１０7細胞を１μＭハイドロコルチゾン（日本国日本アップジョン社製）添加したＬＴＣ培地（ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ、カナダ国Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）５ｍｌでＴ−２５フラスコ（米国ファルコン社製）にて、３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で培養し、付着細胞層であるストローマ細胞形成が底面積の８０％以上の状態になるまで培養し、その後トリプシンＥＤＴＡ液（日本国コスモバイオ社製）で処理して剥がした。９６穴プレート（米国ベクトンデッキンソン社製）に１ウェルあたり約２×１０4個蒔き、再度培養を同培地にて培養を続け、ストローマ細胞の再構成を行った後、２５０Ｋｉｌｏｖｏｌｔ ＰｅａｋのＸ線を１５Ｇｙ照射して、ストローマ細胞の増殖とストローマ細胞中の血液細胞を除去した物をストローマ細胞層として実験に用いた。
上記の方法で培養した各実験区の細胞をＬＴＣ−ＩＣアッセイに共するにあたって、１ウェルあたり培養前のＣＤ３４陽性細胞細胞は２５〜４００個、培養後の各実験区の細胞は６２５〜２００００個の範囲で６段階希釈し、上記のストローマ細胞形成した９６穴プレートにて、１希釈段階について１６ウェルで共培養行った。培養の培地はストローマ形成で用いた培地、条件は３７℃、５％炭酸ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーター中で５週間にわたって培養を行った。培養後の細胞は１ウェルづつ浮遊細胞、付着細胞とも回収し、α−ｍｅｄｉｕｍに０．９％メチルセルロース、３０％牛胎児血清（ＦＣＳ、日本国ＩＣＮバイオメディカルジャパン）、１％ＢＳＡ、１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、１００ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６、２Ｕ／ｍｌ Ｅｐｏ、１０ｎｇ／ｍｌヒトＧ−ＣＳＦ添加した半固形培地に移し、２週間の培養後、実施例１０、１１同様のコロニー形成細胞の検出を行い、コロニー形成細胞が存在したウェル数を検出した。このデータをもとにＴａｓｗｅｌｌらの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６、１６１４−、１９８１）に従ってＬＴＣ−ＩＣの頻度の算出を行った。
算出に用いたグラフを第４図に示す。第４図は液体培養後の算出のグラフで縦軸にコロニーが現れなかったｗｅｌｌの割合を対数で示し、横軸はｗｅｌｌあたりの細胞数を示す。各実験区ごとにコロニーが現れなかったｗｅｌｌ数と細胞数をプロットし、最小自乗法にて回帰直線を求め、コロニーが現れなかったｗｅｌｌ数が０．３７（自然対数の底の逆数）である細胞数を算出し、その細胞数の逆数がＬＴＣ−ＩＣの頻度となる。さらに、はじめの細胞数とＬＴＣ−ＩＣの頻度からＬＴＣ−ＩＣの絶対数を算出した。
その結果、液体培養前は２５，０００細胞中に２４３個のＬＴＣ−ＩＣが存在し、比較区では２週間の培養で細胞数が１，５１０，０００個に増えたが、ＬＴＣ−ＩＣは４９個に減少した。しかしながら、ヒトデルタ−１すなわちＨＤＥＸＩｇもしくはヒトセレイト−１すなわちＨＳＥＸＩｇを含む培地で培養した場合にはそれらの細胞数が各々１，３１０，０００個、１，１４０，０００個とほぼ同様な数を増えていたが、ＬＴＣ−ＩＣはそれぞれ１１５個、５３個とその減少幅を小さくした。この結果から、本発明のポリペプチド、特にヒトデルタ−１は液体培養におけるＬＴＣ−ＩＣの維持作用を有することが明らかとなった。
実施例１３ ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇの血液細胞株に対する結合
ノッチリガンド分子はノッチリセプターに特異的に結合する性質を用いて、ノッチリガンド分子の各種血液細胞株に対する結合を調べた。
細胞株は血液細胞株としてＪｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３２）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９６４）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−２０２）、ＵＴ−７（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１、３４１−３４８、１９９１）、Ｍｏ７ｅ（Ａｖａｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、６９、３５９−、１９８８）、ＣＭＫ（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１５、４９５−５０２、１９８７）を調べた。これらの細胞株の培養培地は各々の引用文献、もしくはＡＴＣＣ ＣＥＬＬ ＬＩＮＥＳ ＆ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ ８ｔｈ ｅｄ（１９９４）に記載の培地で行った。
各種細胞を１×１０6個を２％ＦＣＳ、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含むハンクス液で懸濁し、ＨＤＥＸＩｇもしくはＨＳＥＸＩｇを１μｇ／ｍｌ添加し、４℃一晩放置した。同様なハンクス液で２回洗浄後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌ添加し、３０分間氷中で放置し、ハンクス液で２回洗浄後、最後に１ｍｌのハンクス液に懸濁して解析に供した。測定はフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。また、コントロールとしてＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇのかわりに該ヒトＩｇＧ１で染色したものを用いた。
それらの結果を第５図に示す。縦軸は細胞数で横軸は蛍光強度である。ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇで染色しものは実線で、コントロールのヒトＩｇＧ１で染色したものは破線で示し、左のカラムはＨＤＥＸＩｇ、右のカラムはＨＳＥＸＩｇを各々示す。これらの結果からＪｕｒｋａｔは反応、Ｎａｍａｌｗａは未反応、ＨＬ−６０は未反応、Ｋ５６２は未反応、ＴＨＰ−１は未反応、ＵＴ−７は反応、Ｍｏ７ｅは未反応、ＣＭＫは反応した。また、これらの結果は、ＨＤＥＸＩｇ、ＨＳＥＸＩｇとも同一の結果が得られたことから、同一の分子を認識することが明らかであり、またこれらの細胞を分別することができることが明らかになった。
発明の効果
本発明のノッチリガンド分子は未分化細胞の維持、分化抑制にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使用が可能である。
配列表
配列番号１
配列の長さ：４３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
配列の長さ：２００
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：５２０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：７０２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：１９８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：１０３６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：１１８７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：２６６３及び７２３
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：４００５及び１２１８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：二本鎖及び一本鎖
トポロジー：直鎖状及び不明
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸
起源
生物名：ヒト
配列
配列の長さ：２７及び８
配列の型：核酸及びアミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸
起源：化学合成法による
配列：
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：５５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２９
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：５１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：５１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
配列の長さ：５２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ
起源：化学合成法による
配列
Claims (2)
- 以下の何れかのポリペプチドを用いて血液未分化細胞の分化をin vitroで抑制する方法。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有する（１）に記載のポリペプチド。
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有する（１）に記載のポリペプチド。 - 以下の何れかのポリペプチドを含有する、血液未分化細胞の分化を抑制するための分化抑制剤。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド。
（２）配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有する（１）に記載のポリペプチド。
（３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有する（１）に記載のポリペプチド。
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| US5780300A (en) * | 1995-09-29 | 1998-07-14 | Yale University | Manipulation of non-terminally differentiated cells using the notch pathway |
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| US6716974B1 (en) * | 1996-05-31 | 2004-04-06 | Maine Medical Center Research Institute | Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids |
| JP3922726B2 (ja) | 1996-07-16 | 2007-05-30 | 旭化成株式会社 | 分化抑制剤 |
| US6887475B1 (en) | 1996-11-07 | 2005-05-03 | Lorantis Limited | Notch |
| IL129531A0 (en) * | 1996-11-07 | 2000-02-29 | Lorantis Ltd | Ligands to notch proteins |
| ATE342358T1 (de) * | 1997-04-04 | 2006-11-15 | Millennium Biotherapeutics Inc | Neue menschliche delta3-zusammensetzung und deren therapeutische und diagnostische verwendungen |
| US20060122373A1 (en) | 1997-04-04 | 2006-06-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Delta3, FTHMA-070, Tango85, Tango77, SPOIL,NEOKINE, Tango129 and integrin alpha subunit protein and nucleic acid molecules and uses thereof |
| US6121045A (en) * | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Human Delta3 nucleic acid molecules |
| US6664098B1 (en) | 1997-05-14 | 2003-12-16 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Differentiation inhibitory agent |
| CA2295439A1 (en) * | 1997-06-18 | 1998-12-23 | Zymogenetics, Inc. | Mammalian neuro-growth factor like protein |
| US6136952A (en) * | 1997-06-25 | 2000-10-24 | University Of Washington | Human jagged polypeptide, encoding nucleic acids and methods of use |
| US6692919B1 (en) | 1997-07-23 | 2004-02-17 | Yale University | Activated forms of notch and methods based thereon |
| US6436650B1 (en) | 1997-07-23 | 2002-08-20 | Yale University | Activated forms of notch and methods based thereon |
| EP1518930B1 (en) * | 1998-10-13 | 2007-05-30 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth |
| MXPA01005169A (es) * | 1998-12-01 | 2002-07-02 | Genentech Inc | Promocion o inhibicion deangiogenesis y cardiovascularizacion. |
| US7008781B1 (en) * | 1998-12-23 | 2006-03-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of enhancing the biological activity of ligands |
| AU2600800A (en) * | 1999-03-08 | 2000-09-28 | Genentech Inc. | Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization |
| US8084258B2 (en) * | 1999-07-12 | 2011-12-27 | University Of Basel | Manipulation of tissue of organ type using the notch pathway |
| US8044259B2 (en) | 2000-08-03 | 2011-10-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells |
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| CA2420416A1 (en) * | 2000-08-25 | 2003-02-24 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Stem cell culture medium and culture method by using the same |
| US20020151487A1 (en) * | 2000-08-31 | 2002-10-17 | Loyola University Chicago | Method and reagents for epithelial barrier formation and treatment of malignant and benign skin disorders by modulating the notch pathway |
| KR100915483B1 (ko) | 2000-12-06 | 2009-09-03 | 로버트 제이 하리리 | 태반 줄기 세포의 회수 방법 |
| US20080152629A1 (en) * | 2000-12-06 | 2008-06-26 | James Edinger | Placental stem cell populations |
| US7311905B2 (en) * | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| CA3046566A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placental stem cells for use in the treatment of neurological or renal diseases and disorders |
| ES2629155T3 (es) | 2001-02-14 | 2017-08-07 | Anthrogenesis Corporation | Matrices de tejido que comprenden células madre placentarias, y métodos para su preparación |
| NZ579705A (en) | 2002-02-13 | 2011-07-29 | Anthrogenesis Corp | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
| US8460650B2 (en) | 2007-02-12 | 2013-06-11 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells |
| US7498171B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
| MXPA04011851A (es) * | 2002-05-30 | 2005-03-31 | Celgene Corp | Metodos para utilizar inhibidores de jnk o mkk para modular diferenciacion de celula y para tratar desordenes mieloproliferativos y sindromes mielodispl??sticos. |
| KR20050086780A (ko) | 2002-11-26 | 2005-08-30 | 안트로제네시스 코포레이션 | 세포요법제, 세포요법제 단위 및 이를 이용한 치료방법 |
| AU2004212009B2 (en) * | 2003-02-13 | 2010-07-29 | Celularity Inc. | Use of umbilical cord blood to treat individuals having a disease, disorder or condition |
| ITRM20030376A1 (it) | 2003-07-31 | 2005-02-01 | Univ Roma | Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia. |
| US7795404B1 (en) | 2003-08-08 | 2010-09-14 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Human soluble notch receptor ligands |
| GB0321337D0 (en) * | 2003-09-11 | 2003-10-15 | Massone Mobile Advertising Sys | Method and system for distributing advertisements |
| BRPI0417186A (pt) * | 2003-12-02 | 2007-03-06 | Celgene Corp | método de tratamento de um indivìduo tendo uma hemoglobinopatia ou uma anemia, de modulação da diferenciação de uma célula-tronco ou precursora de cd34+ para uma linhagem de eritróides, e, composição farmacêutica |
| US11660317B2 (en) | 2004-11-08 | 2023-05-30 | The Johns Hopkins University | Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy |
| US7794742B2 (en) * | 2005-02-08 | 2010-09-14 | University Of Washington | Devices for promoting epithelial cell differentiation and keratinization |
| CA2624925C (en) | 2005-10-13 | 2014-09-30 | Anthrogenesis Corporation | Immunomodulation using placental stem cells |
| AU2006308870B2 (en) | 2005-10-31 | 2012-08-16 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating cancer |
| US7723477B2 (en) | 2005-10-31 | 2010-05-25 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth |
| EP2412801A1 (en) | 2005-12-29 | 2012-02-01 | Anthrogenesis Corporation | Co-Culture of placental stem cells and stem cells from a second source |
| JP5550235B2 (ja) | 2005-12-29 | 2014-07-16 | アントフロゲネシス コーポレーション | 胎盤幹細胞集団 |
| EP1998785A4 (en) * | 2006-02-21 | 2009-06-17 | Univ Michigan | CANCER TREATMENT USING A HEDGEHOG SIGNALING PATH |
| CN101501185A (zh) * | 2006-06-09 | 2009-08-05 | 人类起源公司 | 胎盘巢(placental niche)及其培养干细胞的用途 |
| MX2009003229A (es) | 2006-09-29 | 2009-06-18 | Oncomed Pharm Inc | Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer. |
| RU2448979C2 (ru) | 2006-12-14 | 2012-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
| US8148147B2 (en) | 2007-01-24 | 2012-04-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing pancreatic cancer |
| US20100172830A1 (en) * | 2007-03-29 | 2010-07-08 | Cellx Inc. | Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof |
| WO2008140826A1 (en) * | 2007-05-15 | 2008-11-20 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating cancer |
| TWM322542U (en) * | 2007-05-23 | 2007-11-21 | Universal Scient Ind Co Ltd | Testing machine |
| WO2009042201A1 (en) * | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Celgene Cellular Therapeutics | Angiogenic cells from human placental perfusate |
| WO2009045360A2 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-09 | Celgene Cellular Therapeutics | Tumor suppression using human placental perfusate and human placenta-derived intermediate natural killer cells |
| KR20160040739A (ko) * | 2007-11-07 | 2016-04-14 | 안트로제네시스 코포레이션 | 조산 합병증의 치료에 있어서의 제대혈의 용도 |
| KR20210010648A (ko) * | 2008-08-20 | 2021-01-27 | 안트로제네시스 코포레이션 | 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법 |
| NZ591294A (en) * | 2008-08-20 | 2012-10-26 | Anthrogenesis Corp | Treatment of stroke using isolated placental cells |
| RU2011110736A (ru) * | 2008-08-22 | 2012-09-27 | Антродженезис Корпорейшн (Us) | Способы и композиции для лечения костных дефектов с помощью плацентарных клеточных популяций |
| AU2009296246B2 (en) | 2008-09-26 | 2015-07-30 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Frizzled-binding agents and uses thereof |
| RU2015130665A (ru) | 2008-11-19 | 2018-12-24 | Антродженезис Корпорейшн | Амниотические адгезивные клетки |
| NZ602569A (en) * | 2008-11-21 | 2014-03-28 | Anthrogenesis Corp | Treatment of diseases, disorders or conditions of the lung using placental cells |
| US8883145B2 (en) | 2009-10-16 | 2014-11-11 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treatment with DLL4 antagonists and an anti-hypertensive agent |
| TWI535445B (zh) | 2010-01-12 | 2016-06-01 | 安可美德藥物股份有限公司 | Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法 |
| KR20120115602A (ko) * | 2010-01-26 | 2012-10-18 | 안트로제네시스 코포레이션 | 태반 줄기 세포를 사용한 골 관련 암의 치료 |
| JP2013530929A (ja) | 2010-04-01 | 2013-08-01 | オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | ｆｒｉｚｚｌｅｄ結合剤およびその使用 |
| TW201703777A (zh) | 2010-04-07 | 2017-02-01 | 安瑟吉納西斯公司 | 利用胎盤幹細胞之血管新生 |
| CN102933221A (zh) | 2010-04-08 | 2013-02-13 | 人类起源公司 | 使用胎盘干细胞治疗结节病 |
| US9249392B2 (en) | 2010-04-30 | 2016-02-02 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells |
| US9845457B2 (en) | 2010-04-30 | 2017-12-19 | Cedars-Sinai Medical Center | Maintenance of genomic stability in cultured stem cells |
| JP5996533B2 (ja) | 2010-07-13 | 2016-09-21 | アントフロゲネシス コーポレーション | ナチュラルキラー細胞を生成させる方法 |
| US8551479B2 (en) | 2010-09-10 | 2013-10-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating melanoma |
| US9259443B2 (en) | 2010-10-25 | 2016-02-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for the generation of platelets and methods of use thereof |
| US20120171161A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Sascha Abramson | Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof |
| WO2012092480A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Anthirogenesis Corporation | Compositions comprising amnion derived adherent cells and platelet-rich plasma |
| AU2011352036A1 (en) | 2010-12-31 | 2013-07-18 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules |
| TWI602570B (zh) | 2011-06-01 | 2017-10-21 | 安瑟吉納西斯公司 | 使用胎盤幹細胞之疼痛治療 |
| WO2013055476A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-04-18 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells |
| PT2758073T (pt) | 2011-09-23 | 2019-02-01 | Oncomed Pharm Inc | Agentes de ligação a vegf/dll4 e utilizações dos mesmos |
| EP2861238A4 (en) | 2012-06-05 | 2016-03-16 | Capricor Inc | OPTIMIZED METHODS FOR GENERATING CARDIAC STEM CELLS FROM CARDIAC TISSUE AND THEIR USE IN CARDIAC THERAPY |
| EP2882445B1 (en) | 2012-08-13 | 2019-04-24 | Cedars-Sinai Medical Center | Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration |
| CA2887711A1 (en) | 2012-10-23 | 2014-05-01 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents |
| CA2889638A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and monitoring of treatment with a dll4 antagonist |
| AU2014212081A1 (en) | 2013-02-04 | 2015-08-13 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and monitoring of treatment with a Wnt pathway inhibitor |
| EP2953635A4 (en) | 2013-02-05 | 2016-10-26 | Anthrogenesis Corp | NATURAL KILLER CELLS FROM PLAZENTA |
| US9168300B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-10-27 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | MET-binding agents and uses thereof |
| AU2015327812B2 (en) | 2014-10-03 | 2021-04-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy |
| ES2808153T3 (es) | 2014-10-31 | 2021-02-25 | Mereo Biopharma 5 Inc | Terapia de combinación para tratamiento de enfermedad |
| WO2017053705A1 (en) | 2015-09-23 | 2017-03-30 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treatment of cancer |
| EP3402543B1 (en) | 2016-01-11 | 2021-09-08 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction |
| US11351200B2 (en) | 2016-06-03 | 2022-06-07 | Cedars-Sinai Medical Center | CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias |
| WO2018057542A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Cedars-Sinai Medical Center | Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders |
| CA3059910A1 (en) | 2017-04-19 | 2018-10-25 | Cedars-Sinai Medical Center | Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy |
| WO2019126068A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Cedars-Sinai Medical Center | Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5011912A (en) * | 1986-12-19 | 1991-04-30 | Immunex Corporation | Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system |
| IL101728A (en) | 1991-05-03 | 2007-08-19 | Univ Yale | Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them |
| WO1993012141A1 (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-24 | Yale University | Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon |
| US5869282A (en) * | 1991-12-11 | 1999-02-09 | Imperial Cancer Research Technology, Ltd. | Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon |
| US5624899A (en) | 1994-07-20 | 1997-04-29 | Genentech Inc. | Method for using Htk ligand |
| WO1996011212A1 (fr) | 1994-10-07 | 1996-04-18 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Nouveau ligand de tyrosine kinase de type recepteur |
| ATE442373T1 (de) * | 1995-06-28 | 2009-09-15 | Imp Cancer Res Tech | Nukleotid- und proteinsequenzen von delta-genen von vertebraten und darauf basierende methoden |
| EP0861894B1 (en) * | 1995-11-17 | 2006-03-08 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Differentiation-suppressive polypeptide |
-
1996
- 1996-11-15 EP EP96938478A patent/EP0861894B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 JP JP51958497A patent/JP4283891B2/ja not_active Expired - Fee Related
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-
2001
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