JP4042923B2

JP4042923B2 - 免疫関連因子

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Publication number: JP4042923B2
Application number: JP15321897A
Authority: JP
Inventors: 朋之宮林; 誠治坂野
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1996-06-13
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 2008-02-06
Anticipated expiration: 2017-06-11
Also published as: JPH1072495A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫関連因子に関し、更に詳しくは、ヒト由来細胞が発現する新規ポリペプチド、及びその製造方法に関する。本発明はまた、遺伝子工学的技術を用いてクローニングされた該ポリペプチドの遺伝子に関する。また本発明は該ポリペプチドのアミノ酸配列から合成されたＤＮＡ断片並びにＲＮＡ断片に関する。また本発明は遺伝子工学的技術を応用して作製される該ポリペプチドをコードするＤＮＡとベクターＤＮＡからなる組換えＤＮＡ体に関する。本発明はまた、遺伝子工学的技術を応用して作製される該ポリペプチドを発現する形質転換細胞に関する。更に本発明は、遺伝子工学の技術を応用した、該ポリペプチドの製造方法に関する。更にまた本発明は、該ポリペプチドと特異的に結合する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リンパ系はリンパ球、上皮細胞及び支持細胞から成り、器官、或いは組織を形成して免疫反応を担っている。リンパ器官は、リンパ球がリンパ系幹細胞から分化、増殖して機能を持つ効果細胞にまで成熟する場である１次リンパ器官と、リンパ球が相互に或いは抗原と反応し得る環境を作り出し、いったん起こった免疫応答を広める役目を果たす２次リンパ器官とに分類される。
【０００３】
リンパ節は、２次リンパ器官として機能する主要器官の一つであり、皮質、傍皮質（Ｔ細胞領域）及び中心部の髄索から成る。皮質に存在する胚中心（二次濾胞）や濾胞樹状細胞（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ：ＦＤＣ）がＴ細胞依存性抗原刺激特異的なＢ細胞の増殖分化の誘導などに深く関わっていると考えられている。
【０００４】
リンパ球の活性化には細胞間相互作用が重要であると考えられており、リンパ球間での細胞間相互作用においてはサイトカインとともにＣＤ４０／ＣＤ４０ＬやＣＤ８０、ＣＤ８６とそのリガンドであるＣＤ２８などの接着分子を介したシグナルが重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。しかし、リンパ球の支持組織としてリンパ球の活性化に関与するリンパ節については組織、細胞の性状を含めて活性化の機構についてよくわかっていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
免疫応答を制御する上で抗原提示細胞と応答性細胞との細胞間相互作用を解析することは重要である。リンパ節は二次免疫応答において重要な役割を果たしているが、リンパ節組織細胞とリンパ球細胞間の細胞間相互作用に関わる因子についてはまだ明らかになっていない。
従って本発明の目的はリンパ節組織細胞に特異的に発現し、免疫応答に関わる新規ポリペプチドを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
特定の組織細胞に特異的に発現する遺伝子のクローニングは、例えばサブトラクションクローニング法、ディファレンシャルディスプレー法（Ｐ．ＬｉａｎｇａｎｄＡ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７，９６７，１９９２）、ディファレンシャルスクリーニング法、また、適当なプローブを用いたクロスハイブリダイゼーション法などを用いて行われる。
【０００７】
サブトラクションクローニング法は、特定の細胞に特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得し、該ｃＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより遺伝子をクローニングする方法である。即ち、目的とする特定の細胞、つまりリンパ節からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製し、そして対照となる細胞、即ち生物種が同一で異なる系列の細胞、例えば末梢血、胸腺、脾臓などからもＲＮＡを抽出する。
【０００８】
次いで、リンパ節から精製したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時にα−³²ＰｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することができる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりｍＲＮＡのみを分解し一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本鎖ｃＤＮＡと対照細胞から抽出したＲＮＡを混合し、適当な条件下で静置すると塩基配列の相補性に依存して安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【０００９】
即ち、対照細胞でも発現しているｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡはハイブリッドを形成するが、リンパ節に特異的に発現しているｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことで目的とした細胞に特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素で標識されているので、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用することができる。
【００１０】
ディファレンシャルディスプレー法は、ＲＮＡｍａｐＴＭＫｉｔ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行うことができる。即ち、目的の細胞、つまりリンパ節から抽出したＲＮＡからアンカープライマー［Ｔ１２ＭＧ、Ｔ１２ＭＡ、Ｔ１２ＭＴ、Ｔ１２ＭＣ（Ｍ：Ａ，Ｇ，Ｃミクスチュアー）］を用いてｃＤＮＡを合成し、次に、このｃＤＮＡを鋳型としてランダム１０ｍｅｒプライマー（ＡＰ１〜ＡＰ２０）とアンカープライマーにより³⁵Ｓ存在下でＰＣＲを行う。
【００１１】
ここで得たＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。対照となる細胞、例えば末梢血、胸腺、脾臓などから抽出したＲＮＡについて同様の操作を行って得た電気泳動像を前述の電気泳動像と比較し、リンパ節において強く増幅されているバンドを特定し、バンドの位置のゲルを切り出す。切りだしたゲル断片からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲによってバンドを増幅し、適当なベクター、例えばｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、塩基配列を決定することができる。
【００１２】
ディファレンシャルスクリーニング法は、目的の細胞から精製したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、目的の細胞のｍＲＮＡから合成した³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブと対照の細胞のｍＲＮＡから作製したプローブを用いてスクリーニングし、目的細胞のプローブとのみハイブリダイズするクローンを選択する方法である。即ち、リンパ節から精製したｍＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製する。そのライブラリーから２組のレプリカフィルターを作製する。
【００１３】
次に、リンパ節から精製したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時にα−³²ＰｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することができる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡは安定な二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成しているが、アルカリ存在下で高温処理することによりｍＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。同様にして対照の細胞、例えば末梢血、脾臓、胸腺などから精製したｍＲＮＡを鋳型にして³²Ｐで標識された一本鎖ｃＤＮＡを作製する。
【００１４】
両標識ｃＤＮＡをそれぞれプローブとしてリンパ節ライブラリーから作製したフィルターとハイブリダイゼーションを行う。Ｘ線フィルムのオートラジオグラフィー像を比較し、リンパ節ｃＤＮＡプローブにのみハイブリダイズするクローンを選ぶことによりリンパ節に特異的に発現する遺伝子をクローニングすることができる。
【００１５】
クロスハイブリダイゼーション法は、目的の細胞のｃＤＮＡライブラリーを適当なＤＮＡをプローブとしてストリンジェンシーの低い条件でハイブリダイゼーションを行い、陽性クローンを得る。得られたクローンをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションを行い目的細胞にのみ発現しているクローンを選択する。
本発明者らは、本発明のリンパ節特異的に発現する新規なポリペプチド遺伝子を取得するために上述したサブトラクションスクリーニング法、ディファレンシャルディスプレー法を試みたが目的とする遺伝子のクローニングには至らなかった。
【００１６】
次に、下記の理由により、１）ＣＤ４０Ｌ、２）ＶＣＡＭ−１、３）Ｈｔｋリガンド（以下Ｈｔｋ−Ｌという）（国際公開番号ＷＯ９６／１１２１２）、の遺伝子断片をそれぞれプローブとしてリンパ節ｃＤＮＡライブラリーのクロスハイブリダイゼーションによるスクリーニングを試みた。
【００１７】
１）ＣＤ４０ＬはＴＮＦスパーファミリーに属するタイプII型の膜糖蛋白である（Ｄ．Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，１１，４３１３，１９９３）。活性化Ｔ細胞に発現し、成熟Ｂ細胞上に発現するＣＤ４０との相互作用によってＴ細胞依存性のＢ細胞活性化において重要な補助刺激シグナルが伝達され、その結果、Ｂ細胞の増殖並びに抗体産生が誘導されると考えられている。従って、ＣＤ４０Ｌに関連した、リンパ節に特異的に発現し免疫応答に関与する因子が存在する可能性が考えられる。
【００１８】
２）ＶＣＡＭ−１はサイトカイン刺激により血管内皮細胞に発現するリンパ球接着機能をもつ接着分子であり、白血球の再循環や炎症局所への白血球浸潤に関与するとともに、ＦＤＣに恒常的に発現し、活性化Ｂ細胞を結合してリンパ濾胞の形成と胚中心におけるＢ細胞の選択に関与していると考えられている（Ａ．Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１０３０，１９９０）。しかし、一方では当初、生体の炎症反応に重要な役割を果たしていると考えられていたが、炎症部位の血管内皮細胞についての発現が低いことから、炎症部位への浸潤には関係ないとも見られている。従って、ＶＣＡＭ−１に関連した、リンパ節に特異的に発現し免疫応答に関与する因子が存在する可能性が考えられる。
【００１９】
３）Ｈｔｋ−ＬはＥｐｈファミリーに属するチロシンキナーゼのリガンドの一つであり、神経系、造血系の未分化細胞の分化・増殖に関与しているとの知見に基づき、同リガンドファミリーが免疫担当細胞の成熟・分化にも関与している可能性があると考えられる。
【００２０】
上記のＣＤ４０Ｌ、ＶＣＡＭ−１の遺伝子断片をプローブとしたスクリーニングの結果、複数の陽性クローンを得たが新規、かつリンパ節に特異的に発現するクローンを取得することはできなかった。しかし、Ｈｔｋ−Ｌ遺伝子断片の一部をプローブとしてリンパ節ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを試み、４８クローンの陽性クローンを単離し、各々についてノーザンハブリダイゼーションを行って発現組織の解析を行った結果、リンパ節、虫垂に特異的に発現する本発明の新規ポリペプチド遺伝子のクローニングに成功した。
【００２１】
本発明者らは直ちに該ポリペプチド遺伝子の全長を含むｃＤＮＡを取得し、塩基配列を決定し、該ポリペプチドの全長のアミノ酸配列を決定した。次に、該ポリペプチドの全長ｃＤＮＡを用いて該ポリペプチドの発現系を作製し、組換え該ポリペプチドを得た。更に、該組換えポリペプチドを免疫原として抗体を作製し、精製法を確立し本発明を完成した。
【００２２】
即ち本発明によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペプチドが提供される。
また、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有する、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む新規なポリペプチドが提供される。
また、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
また、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。
【００２３】
更に又、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体が提供される。
更に又、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体が提供される。
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供される。
【００２４】
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供される。
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを産生し得る細胞を培地中にて培養し、その培養液中に該ポリペプチドを産生させ、培養液から培養上清を回収し、回収した培養上清から該ポリペプチドを分離・精製することを含む該ポリペプチドの製造方法が提供される。
【００２５】
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを産生し得る細胞を培地中にて培養後細胞を集め、これを破壊した後、細胞抽出液を該ポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体を用いて免疫沈降させることにより、ポリペプチドを分離・精製することを含む該ポリペプチドの製造方法が提供される。
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの少なくとも一部と特異的に結合する抗体が提供される。
【００２６】
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号４の塩基配列の少なくとも１８個の連続した塩基配列を含有するセンスＤＮＡ、該センスＤＮＡに相補的なアンチセンスＤＮＡからなる群より選ばれる単離されたＤＮＡ断片、及び該センスＤＮＡ及び該アンチセンスＤＮＡを、それぞれ、メチル化、メチルフォスフェート化、チオフォスフェート化または脱アミノ化することにより得られる、該センスＤＮＡ及び該アンチセンスＤＮＡの誘導体からなる群より選ばれる単離されたＤＮＡ断片が提供される。
【００２７】
更にまた、本発明の他の態様によれば、配列表の配列番号４の塩基配列に相補的な少なくとも１８個の連続した塩基配列を含有するアンチセンスＲＮＡ、該アンチセンスＲＮＡに相補的なセンスＲＮＡからなる群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片、及び該アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡを、それぞれ、メチル化、メチルフォスフェート化、チオフォスフェート化または脱アミノ化することにより得られる、該アンチセンスＲＮＡ及び該センスＲＮＡの誘導体からなる群より選ばれる単離されたＲＮＡ断片が提供される。
【００２８】
本発明の新規なポリペプチド遺伝子のクローニング方法について以下に詳細に述べる。
本発明の新規なポリペプチドの遺伝子は該ポリペプチドを産生している組織または細胞、例えばリンパ節の遺伝子ライブラリーからクローニングすることができる。遺伝子ライブラリーは目的とする細胞からｍＲＮＡを精製し、該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドで宿主を形質転換することにより作製することができる。
【００２９】
ヒトリンパ節からのＲＮＡは、グアニジンチオシアネート法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ．，１９８９）などによって調製することができる。次に、常法に従ってｍＲＮＡを得る。この際、ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ファルマシア社製）を用いることができる。
この様にして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、例えば岡山バーグの方法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２，１６１，１９８２及び、同誌，３，２８０，１９８３）に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。
【００３０】
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社販）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであればいずれをも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いることができる。
この様にして得られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法などを用いて導入する。
【００３１】
上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒアコリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２、ＪＭ１０５などが挙げられる。上記バチルス属菌の例としては、バチルスサチリスＭＩ１１４などが挙げられる。
またファージベクターは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７１，２４４２］を用いて導入することが出来る。
【００３２】
上記の方法により本発明ポリペプチドのｃＤＮＡを含有する該ポリペプチド産生細胞のｃＤＮＡライブラリーを作製することが出来る。該ｃＤＮＡライブラリーから該ポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばファージベクターλｇｔ１０を用いて作製した該ポリペプチドｃＤＮＡライブラリーとＨｔｋリガンド遺伝子（国際公開番号ＷＯ９６／１１２１２：寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５００８）のＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３）をプローブとして用いたプラークハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
【００３３】
上記ハイブリダイゼーションで陽性となったクローンの発現組織を例えばノーザンブロットハイブリダイゼーションによって解析し、リンパ節に特異的に発現するクローンを得ることができる。このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を例えばサンガーらの方法［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３］によって決定することができる。以上のようにして該ポリペプチドをコードするＤＮＡが得られる。該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号４に示した。
【００３４】
本ＤＮＡ配列には９８番目に始まる開始コドン（ＡＴＧ）から１６９６番目で終わる終止コドン（ＴＧＡ）まで、５３２個のアミノ酸配列をコードし得るオープンリーディングフレームが存在した。該オープンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。
該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のポリペプチドは細胞膜タンパクとして、細胞上に発現されることが予想された。尚、本新規ポリペプチドｃＤＮＡの全塩基配列を含むプラスミドｐ＃５３−４を大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に遺伝子導入して得た形質転換体をＪＭ１０９−ｐＵＣＬＩＣと命名した。この形質転換体株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＥ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＬＩＣとして平成８年１０月３０日に寄託され、受託番号はＦＥＲＭＰ−１５９２１である。
【００３５】
つまり、この解析結果によれば該ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の−１６番から−１番にあたる１６アミノ酸から構成されるシグナルペプチド、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から４３６番にあたる４３６アミノ酸から構成される細胞外部分、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の４３７番から４５９番にあたる２３アミノ酸から構成される細胞膜貫通部分、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の４６０番から５１６番にあたる５７アミノ酸から構成される細胞内部分より構成される。ただし、各部分はあくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、５から１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
【００３６】
配列表の配列番号３に記載したアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の５０番から１５９番に当たるアミノ酸配列であり、後述するポリＩｇレセプターにホモロジーが最も高いドメインのアミノ酸配列を示す。また、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１番から４２８番に当たる部分のアミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドを除く上記の細胞外部分のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
アミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グリコシド結合可能な部分として、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１５１番及び２６０番のアスパラギン残基が挙げられる。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基の頻出する部分が考えられるが、特にその可能性の高い部分として、配列表の配列番号２のアミノ酸配列の１６０番のセリン残基が挙げられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定性であり、また強い生理活性を有していると考えられる。
【００３８】
本発明で明らかにされた該ポリペプチドの遺伝子配列並びにアミノ酸配列をジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ、１９９５年１０月、リリース９１）において検索したところ、最も類似性のある物質として、ポリＩｇレセプター（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）（Ｍｏｓｔｏｖ，Ｋ．Ｅ．ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３０８，３７，１９８４，：Ｋｒａｊｃｉ，Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５８，７８３，１９８９、ジャンピエール、特許公表平５−５０１１１８号参照）が挙げられたが、全長としては有意なホモロジーは見出されず、最も類似性の高い部分は配列表の配列番号２の５０番から１５９番にあたる領域であったが、この部分においても相同性は４５％程度と極めて低いものであった。
【００３９】
従って、本発明のポリペプチドは全く新規な物質である。また、プローブとして用いたＨｔｋ−Ｌ分子のｃＤＮＡとのホモロジーは、配列表の配列番号４の５１１番から７００番に見いだされたが４７％程度しかなく、またアミノ酸としてのホモロジーも１９％しかなかった。
【００４０】
この類似性が見いだされたポリＩｇレセプターは５個の免疫グロブリン様ドメインをもつ膜貫通型タンパク質であり、細胞外の第一ドメインで二量体ＩｇＡと結合し、これを上皮細胞へと取り込む。次に、細胞内輸送小胞として上皮細胞の腸管腔側へ移動し腸管側細胞膜と癒合することによって分泌型ＩｇＡが腸管腔へ分泌される。分泌に際しポリＩｇレセプターは蛋白質分解酵素により細胞膜付近で切断され、分泌成分（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：ＳＣ）としてＩｇＡやＪ鎖とともに分泌型ＩｇＡを構成する。分泌型ＩｇＡは以下に示す機構により腸管粘膜において感染防御機能を発揮する。即ち、分泌型ＩｇＡは特異抗原との間に架橋を起こしやすく、その結果分泌型ＩｇＡが結合した微生物の運動や増殖を著しく抑制する。
【００４１】
また、分泌型ＩｇＡはＳＣをもち親水性に富むため抗原と結合して親水性の高い複合体をつくり粘液層内への抗原親和性を高めると考えられる。これは同時に疎水性に富む細胞膜への抗原の親和性を低下させることにもつながり、細菌などが上皮細胞へ接着することを阻害する。分泌型ＩｇＡは細菌表面分子に対する抗体であることが多く、細菌表面に存在する上皮細胞への接着分子を遮蔽することにより感染防御機能を発揮する。また、分泌型ＩｇＡや分泌型ＩｇＡ抗原複合物はＦｃレセプターを介してリンパ球、マクロファージ、単球などに結合し、抗原特異的ＩｇＡ免疫応答を更に高め、粘膜に於ける二次免疫応答持続に働いていると考えられている（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｃ．Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２，１６６５，１９９０）。
【００４２】
腸管粘膜において二量体ＩｇＡが分泌型ＩｇＡとして上述のような免疫作用を発揮するためにはポリＩｇレセプターが必須であり、粘膜が皮膚同様生体の内外を分ける隔壁であり、外界からの侵襲に対する粘膜の防御機構が生体にとって極めて重要であることから、ポリＩｇレセプターは感染防御の観点から重要な分子の一つである。
【００４３】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と上記のポリＩｇレセプターのアミノ酸配列を詳細に比較したところ、ポリＩｇレセプターの抗体結合ドメインである第一ドメインと本新規ポリペプチドの配列表の配列番号３が最も高いホモロジーを示し約４５％であり、該ポリペプチドが抗体結合活性を有することが示唆された。また、細胞内部分の配列表の配列番号２のスレオニンを含む４６９番から４７２番の４アミノ酸はポリＩｇレセプターのトランスサイトーシスに関わるリン酸化部位である６６４番目のセリンを含む６６２番から６６５番の４アミノ酸（Ｈｉｒｔ，Ｒ．Ｐ．ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，７４，２４５，１９９３）と配列相同性が認められた。
【００４４】
タンパク質における分子間相互作用は、例えば免疫沈降法、酵素免疫測定法、また、表面プラズモン共鳴センサーであるＢＩＡｃｏｒｅ（フアルマシアバイオテク社製）を用いて調べることができる。
免疫沈降法とは抗体を用いて目的のタンパク質を微小なスケールで精製して解析する実験法である。つまり、目的のタンパク質を含む溶液に抗体とプロテインＡビーズを加え、抗原−抗体−プロテインＡビーズ複合体を形成させて、遠心して分離する。この複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットなどを行い、目的のタンパク質と結合しているタンパク質の探索を行うことができる。
【００４５】
ＢＩＡｃｏｒｅでの分子間相互作用の検出は以下のようにして行うことができる。まず、相互作用する分子の一方をリガンドとしてセンサーチップ上に固定し、他方をアナライトとしてセンサーチップ上にインジェクトする。インジェクトされたアナライトは一定の流速でセンサーチップ上に供給され、固定化されたリガンド中に拡散していくことになる。両者にアフイニテイーが存在すればアナライトはリガンドと結合し、アナライトがセンサーチップ上に濃縮される。そのときのセンサーチップのマス変化が光学的に検出されリアルタイムにセンサーグラムが描かれ、結合曲線として観察することができる（実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズタンパク質の分子間相互作用実験法羊土社）。
【００４６】
本発明者らは、本新規ポリペプチドとヒト抗体との分子間相互作用を、実施例１０に記載した酵素免疫測定法を用いて検出した。即ち、実施例８に記載の方法に従って取得した本発明の新規なポリペプチドの細胞外部分蛋白を９６穴のイムノプレート（ヌンク社製）に固定し、次にヒト免疫グロブリンを含む溶液を反応させ、本新規ポリペプチドとヒト免疫グロブリンの複合体を形成させる。次いでヒト免疫グロブリンを特異的に認識するペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体を反応させ、ペルオキシダーゼに対する基質を作用させて吸光度を測定する。本新規ポリペプチドの細胞外部タンパク質の吸光度は対照に比べ有意に高く、本発明の新規ポリペプチドがヒト抗体と結合する活性を有していることが示された。従って、本発明の新規ポリペプチドは、２次リンパ器官であるリンパ節、虫垂において、抗原抗体複合体と結合することによって抗原特異的な二次免疫応答を誘導する因子の一つとして働いている可能性が極めて高いことが示唆された。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを構成成分とし、好ましくは配列表の配列番号１、更に好ましくは配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを構成成分とする。また本発明のポリペプチドは配列表の配列番号１または２または３のアミノ酸配列の一部を欠くもので有り得るし、ポイントミューテーションの手法により部分的に変異させることもできるものであって、いずれにせよ本発明のポリペプチドの配列表の配列番号１または２または３の性質を失わないものは本発明に含まれる。
【００４８】
また、そのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に多少のアミノ酸残基、ペプチド残基が付加されることも有り得る。更にまた、そのアミノ酸配列中にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンやＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖が、Ｎ−グリコシドあるいはＯ−グリコシド結合してなるものも本発明に含まれる。上記の該ポリペプチドの変異体と該ポリペプチドとのアミノ酸配列の相同性は、通常６０％以上であることが好ましく、特に７０％以上が好ましく、さらに８０％以上が好ましく、とりわけ９０％以上である場合が好ましい。
【００４９】
上記のようにしてクローン化された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化して使用することができる。
クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出し、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。
【００５０】
実施例３及び５に記載したように、本発明のポリペプチドの発現させる形態としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡを用いる方法でもよい。しかしながら、この状態では膜結合型であり、精製、製剤化などをより効率的に行うために、実施例４及び６に記載したように、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列、すなわち該ポリペプチドの細胞外部分のみを発現させることができ、またその方が好ましい。したがって、細胞外部分を含有する形態を配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、分泌型で発現、生産させることも可能である。
【００５１】
また、さらにその形態としては単独の化合物でもかまわないが、複合体の形態を有するポリペプチドでも可能である。本発明で使用する”複合体”は２種類以上の物質を単に混ぜ合わせた混合物ではなく、１種類もしくは２種類以上の化合物が共有結合を含む何らかの結合様式を有してなる化合物、コンジュゲート、またはコンプレックスの総称を意味する。そのような例としては、イムノグロブリンとのキメラタンパクのジスルフィド結合による共有結合を介した複合体、または実施例６で作製されたＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドと抗ＦＬＡＧ抗体による抗原抗体反応を介した複合体などの形態が挙げられる。
【００５２】
さらに、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させた該ポリペプチドの細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。
【００５３】
さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他の該ポリペプチドの活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型該ポリペプチドを得ることもできる。
【００５４】
また、さらに配列表の配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをアミノ酸に翻訳するさいにフレームの合う形で２つ以上直列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている２量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により２量体もしくはそれ以上の形態を有す形の該ポリペプチド、もしくは配列表の配列番号３もしくは１に記載のアミノ酸配列の１部もしくは全部を含有してなる化合物に関しても本発明に含まれる。
かくして得られた該複合体を用いれば、研究用試薬として新規免疫関連因子の生理活性探索が可能である。該免疫関連因子はリンパ節、虫垂に特異的に高い発現が認められる。これらの部位の組織を分離し、あるいは各種細胞株を利用して、該複合体を作用させることにより、インビトロの生理活性探索が可能である。さらにこのアッセイ系を応用すれば、該複合体の作用を阻害する化合物のスクリーニングが可能である。
【００５５】
本発明の新規ポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、又３’末端には翻訳終結コドンを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終結コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。
ベクターとしては上記の大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラスミド、或いはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
【００５６】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合はＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合はＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
【００５７】
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどがそれぞれ利用できる。
この様にして構築された該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造する。
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。
動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−１、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
【００５８】
このようにして本発明の新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。
各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって該ポリペプチドを製造することができる。
上記培養物から該ポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行うことができる。
【００５９】
該ポリペプチドを培養菌体或いは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体或いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体或いは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過により該ポリペプチドの粗抽出液を得る方法などを適宜用い得る。緩衝液中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に該ポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体或いは細胞と上清とを分離し上清を集める。
この様にして得られた培養上清、或いは抽出液中に含まれる該ポリペプチドは、実施例９に記載した方法により得た該ポリペプチドに対する抗体により精製することができる。
【００６０】
かくして得られた新規なポリペプチドは、研究用試薬として、また該ポリペプチド単独で、あるいは少なくとも１種の薬剤として投与可能な担体、希釈液または賦型剤を添加して適当な剤型とし、リンパ球の活性化を制御し、免疫関連疾患及び感染症の治療用薬剤としても使用される。対象となる免疫関連疾患としては、例えば重症複合免疫不全症などの免疫不全症、あるいは、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患が挙げられる。本発明のポリペプチドを医薬品として用いる場合には本発明のポリペプチドの凍結乾燥品を、注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用することが望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供することが簡便である。また、マウスに対して本発明のポリペプチド１ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した実験において、マウスの死亡例は確認されなかったことから、医薬品として使用可能であることが確認された。
【００６１】
本発明の新規なポリペプチドの成人１回当りの投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異なるが、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、１日当り１回または必要に応じて数回投与することができる。また本発明の新規なポリペプチドを注射剤として用いる場合、ショ糖、グリセリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加えることができる。
【００６２】
また、本発明の新規なポリペプチド遺伝子を用いて、ゲノムから該ポリペプチド遺伝子の発現を制御し得るプロモーター配列を取得することが可能であり、該プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を連結し、適当な細胞にトランスフェクトし、該細胞を各種の検体、例えば任意の配列を有するペプチド、または各種の化合物、または各種の微生物による発酵生産物などを用いて刺激し、レポーター遺伝子の発現を比較することにより該ポリペプチド遺伝子の発現を誘導する因子、或いは阻害する因子をスクリーニングすることが可能である。
【００６３】
また、本発明の新規なポリペプチドは細胞治療方法への適応として固定化することが可能である。固定化の方法としては該ポリペプチドのアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器に該ポリペプチドを共有結合させることができる。したがって、固体表面に存在する形態を有し、さらに少なくとも新規ポリペプチド活性を有し、さらに配列表の配列番号１及び２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全部のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
【００６４】
また、実施例２に示したように配列表の配列番号４の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ノーザンブロットが可能である。したがって、本遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の配列番号４の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、好ましくは１８ｍｅｒ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体によって行うことが出来る。また、これらのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法でも本遺伝子の発現を調べることが可能である。
【００６５】
さらに、実施例２に示した方法と同様な方法、もしくはＰＣＲ法でマウス、ラット等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝子クローニングができる。また、さらに人を含めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、本ポリペプチドの更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。
【００６６】
また、実施例９に示した本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のポリペプチドの検出、測定が可能であり、本発明のポリペプチドの異常に起因する疾患などの診断薬として使用でき得る。また、本抗体を用いて特定の免疫担当細胞群を分離することが可能である。
また、本発明に述べたあらゆる形態をとった該ポリペプチド、すなわち配列表の配列番号１及び２及び３からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全部のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む化合物およびそれらから構成される複合体を組み合わせてなるものは本発明に含まれるものとする。
【００６７】
尚、本明細書に記載されているＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌の取扱いに必要な一般的な操作は当業者間で通常行われているものであり、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの実験操作書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８２，１９８９）に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いることができ、特に断らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、完全にそれらの目的を達成することができる。
【００６８】
【発明の実施の形態】
本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
実施例１
ｃＤＮＡクローニングと同定
（１）ヒトＨｔｋＬ遺伝子（国際公開番号ＷＯ９６／１１２１２）をＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動を行い約０．２５ｋｂのＤＮＡ断片（配列表の配列番号１３）を含むゲル断片を切りだした。ゲル断片から、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ II （ＢＩＯ１０１社製）を用いて添付のプロトコールに従いＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて放射性同位元素³²Ｐにて標識してｃＤＮＡスクリーニング用プローブとした。
【００６９】
すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
【００７０】
（２）ヒトリンパ節組織のλファージｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のファージ液の一部をとりＳＭバッファー（０．１ＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ₄・７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）で数種の希釈度で希釈したものを、Ｅ．ｃｏｌｉＮＭ５１４から作製したファージプレーティングセルに感染させ、Ｌ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）の寒天プレートにプラークを形成させることによりタイトレーションした結果、タイターは２×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００７１】
上記ライブラリーのλｇｔ１０組換え体約４０万クローンを、（１）で調製したＤＮＡプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、４８個のポジティブクローンを得た。即ち、上記ライブラリーのファージ液２ｍｌをＥ．ｃｏｌｉＮＭ５１４に感染させてＬ培地の寒天プレート上に形成させた４×１０⁵個のプラークを、ナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ＋：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨを染み込ませた濾紙上に７分間放置）し、次いで、中和処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡを染み込ませた濾紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４ＭＮａＯＨを染み込ませた濾紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。
【００７２】
次いで（１）で作製したＤＮＡプローブと以下に述べる条件でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは各々の成分の最終濃度が５倍濃度の（以下５×と示す）ＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び２０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、５０℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で³²Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５０℃にて１６時間振とうして行った。
【００７３】
次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥ溶液に浸し、室温にて１５分間振とうして洗浄し、それを４回行った。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、２４時間オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分に相応する寒天領域よりファージを抽出し、再度上記の工程に従ってプラークハイブリダイゼーションを行い４８種の純化λｇｔ１０組換え体を得た。これら４８種の組換え体からグロスバーガーらの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８７）１５，６７３７）に従ってλｇｔ１０組換え体ＤＮＡを抽出した。
【００７４】
（３）上記（２）で得られたλｇｔ１０組換え体ＤＮＡのひとつをＥｃｏＲＩで切断後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ約２ｋｂのインサートｃＤＮＡが認められ、このｃＤＮＡ断片を含むゲル断片を切りだした。次に、ゲル断片からＧｅｎｅｃｌｅａｎ II （ＢＩＯ１０１社製）を用いて添付のプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。得られた約２ｋｂのＤＮＡ断片をｐｕｃ１８（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐ＃５３−４とした。塩基配列決定のためにディレーションミュータント（ｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔ）を作製した。
【００７５】
ミュータントの作製には、キロシーケンス用ディレーションキット（宝酒造社製）を用いた。各ミュータントの塩基配列をサンガーらの方法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３）によって決定し、２ｋｂｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列表の配列番号４に示した。塩基配列の決定はＤＮＡ蛍光シーケンサー（アプライドバイオシステム社製：ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用い、添付のマニュアルに従って行なった。
【００７６】
本ＤＮＡ配列には９８番目に始まる開始コドン（ＡＴＧ）から１６９６番目で終わる終止コドン（ＴＧＡ）まで、５３２個のアミノ酸配列をコードし得るオープンリーディングフレームが存在した。該オープンリーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示した。プラスミドｐ＃５３−４の遺伝子の方向は、ｐｕｃ１８ベクターのｌａｃＺ遺伝子と逆方向、即ち、配列表の配列番号４に示した５’側がｐｕｃ１８ベクターのマルチクローニングサイトのＨｉｎｄIII 側に存在した。
【００７７】
実施例２
ノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現
本発明の免疫関連因子のｍＲＮＡの発現を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが転写されているフィルターであるＣｌｏｎｔｅｃｈ社ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ II 、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ III、ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔを用い、プラスミドｐ＃５３−４を制限酵素ＰｓｔＩにて消化して、１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、５８８ｂｐの断片（配列表の配列番号４の６１４番目から１２０１番目）を切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ II （ＢＩＯ１０１社製）を用いて精製した遺伝子断片を前掲のＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａＰｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にて前述の方法で³²Ｐ標識し発現を調べた。
【００７８】
その結果、ヒト組織のうちでリンパ節、虫垂で顕著な発現が認められた。また、小腸においても発現が認められ、さらに胃、腎臓、胸腺、脾臓で極めて微弱な発現が認められた。しかしながら、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、大腸、末梢血白血球、甲状腺、脊髄、気管、副腎、骨髄、そして、胎児肝においては全く発現が認められなかった。
以上のことから、本免疫関連因子は免疫担当組織に特異的に発現されており、特にリンパ節に特異的に著明な発現が認められ、また末梢血白血球に発現が認められないことから二次免疫応答に関連し、また、リンパ球自身ではなくリンパ節の組織細胞に特異的な因子であることが考えられた。さらに小腸における発現は腸管における免疫組織であるパイエル板に由来すると推察される。
【００７９】
実施例３
免疫関連因子の全長遺伝子発現プラスミドの作製
実施例１に記載した方法によって得られる該ポリペプチド全長の遺伝子を動物細胞に導入するため、配列表の配列番号４に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびコダック社製ＩＢＩＦＬＡＧを用いて、配列表の配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端に８アミノ酸、すなわちアミノ酸配列としてＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓを持つポリペプチド（以下ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１２）を付加したポリペプチドをコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）のｄｈｆｒ遺伝子部位に各々別々につなぎ、それぞれ免疫関連因子の全長発現プラスミドｐＳＶ２Ｆｕ、ｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧを作製した。
【００８０】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたって、配列表の配列番号４の５’非転写領域を除き制限酵素ＨｉｎｄIII サイトを付加するため、５’−ＡＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー１、配列表の配列番号５）、５’−ＧＧＴＧＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー２、配列表の配列番号６）をプライマーとして用いて、ｐ＃５３−４をテンプレートとして用いてＰＣＲを行った。およそ３１０ｂｐのＤＮＡが増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産物を実施例１（３）記載の方法にて精製して制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIにて処理し、同様に処理したｐｕｃ１８ベクター（宝酒造社製）にサブクローニングした。
【００８１】
その後、４クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９８番から３６７番の配列を持ったフラグメントであることを確認した。以下、本フラグメントを有するプラスミドをｐＬＩＣ−１とする。
【００８２】
次に、配列表の配列番号４の新規ポリペプチド遺伝子の３’非転写領域を除き制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加するため、５’−ＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＡＡＴＴＣＡＧＡＴ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー３、配列表の配列番号７）、５’−ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー４、配列表の配列番号８）をプライマーとして用いて、プラスミドｐ＃５３−４をテンプートとして用いてＰＣＲを行った。およそ１５０ｂｐのＤＮＡが増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産物を実施例１（３）記載の方法にて精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングした。
【００８３】
その後、３クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１５５２番から１６９６番の配列を持ったフラグメントであることを確認した。以下、本フラグメントを有するプラスミドをｐＬＩＣ−２とする。
【００８４】
更に、配列表の配列番号２の新規ポリペプチド全長アミノ酸配列のＣ末端に８アミノ酸、すなわちアミノ酸配列としてＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓを持つポリペプチド（ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１２）を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターの作製にあたって、同様な方法で上記のプライマー３、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー５、配列表の配列番号９）をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングして、４クローンをシークエンスし、遺伝子配列を確認して、目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１５５２番から１６９３番の配列の３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（ＦＬＡＧ：配列表の配列番号１２）がつながった配列を有するフラグメントであることを確認した。以下、本フラグメントを有するベクターをｐＬＩＣ−３とする。
【００８５】
次に、ｐ＃５３−４を制限酵素ＨｉｎｄIII 及び、ＨｉｎｃIIで消化し、実施例１（３）と同様な方法で精製したおよそ４．２ｋｂｐの遺伝子断片に、上記と同様にｐＬＩＣ−１を制限酵素ＨｉｎｄIII 及び、ＨｉｎｃIIで消化して得た３１０ｂｐの断片をＤＮＡＬｉｇａｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結してプラスミドｐＬＩＣ−４とした。さらに、ｐＬＩＣ−４を制限酵素ＨｉｎｄIII 及び、ＥｃｏＲＩで消化して、実施例１（３）と同様の方法にて精製して得た約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＫＳ＋ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＨｉｎｄIII 、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラスミドｐＬＩＣ−５を得た。
【００８６】
このようにして作製されたｐＬＩＣ−５を制限酵素ＢｓｔＰＩとＢａｍＨＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にておよそ４．４ｋｂｐのフラグメント、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の９８番から１５５７番の配列の５’末端の先にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIの制限酵素サイトのＨｉｎｄIII からＢａｍＨＩまでの部分がつながったフラグメントを切り出し、前述の方法で精製した。この遺伝子断片をＦ１とする。同様に、ｐＬＩＣ−２及びｐＬＩＣ−３について制限酵素ＢｓｔＰＩ及びＢａｍＨＩ消化を行い、それぞれ約１５０ｂｐ、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【００８７】
これらの遺伝子断片を各々Ｆ２、Ｆ３とする。そして、Ｆ１とＦ２、Ｆ１とＦ３をおのおの前述の方法でつなぎ、制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで配列表の配列番号２のポリペプチドをコードする部分の遺伝子断片が切り出されるベクターｐＢＳＦｕ１及び制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩで配列表の配列番号２のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする部分に対応する遺伝子断片が切り出されるベクターｐＢＳＦｕ２を作製した。
【００８８】
このようにして作製されたベクターｐＢＳＦｕ１、ｐＢＳＦｕ２を制限酵素ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩにて消化し、電気泳動にておよそ１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち新規ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片部分を含むＤＮＡ断片を分離、精製した。この２種のＤＮＡ断片を前掲のｐＳＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで処理して、ｄｈｆｒ遺伝子を除いたものにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）にて連結し、新規ポリペプチドの発現ベクターを構築した。以上のように作製されたＦＬＡＧ配列を含まないベクターをｐＳＶ２Ｆｕ、ＦＬＡＧ配列を含むベクターをｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧとする。
【００８９】
実施例４
免疫関連因子の細胞外部分遺伝子発現プラスミドの作製
実施例１に記載した方法によって得られる遺伝子がコードするポリペプチドの細胞外部分、つまり配列表の配列番号１に記載のポリペプチドを含有するポリペプチドを動物細胞に産生させる発現プラスミドｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧを構築した。すなわち、配列表の配列番号１のポリペプチド細胞外部分アミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端に８アミノ酸、すなわちアミノ酸配列としてＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓを持つポリペプチド（ＦＬＡＧ：配列表の配列番号１２）を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターの作製にあたって、全長の場合と同様な方法で、５’−ＡＡＡＧＧＴＣＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー６、配列番号１０）、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧ−３’の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー７、配列表の配列番号１１）をプライマーとして、配列表の配列番号４の遺伝子を含むｐ＃５３−４をテンプレートとして用いてＰＣＲを行った。
【００９０】
およそ３６０ｂｐのＤＮＡが増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確認後、このＰＣＲ産物を実施例１（３）記載の方法にて精製して、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにサブクローニングした。その後、５クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１０７８番から１４２９番の配列の３’端に５’−ＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＴＧＡ−３’（配列表の配列番号１２）がつながった配列を有するフラグメントであることを確認し、プラスミドｐＬＩＣ−６とした。
【００９１】
前述のプラスミドｐＬＩＣ−５を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）にて消化し、配列表の配列番号４のＤＮＡ配列の１０８３番以降の配列のＤＮＡ断片を除去した約４ｋｂｐのＤＮＡ断片に、同様に、ｐＬＩＣ−６を制限酵素ＢｌｎＩ及びＢａｍＨＩで消化して得た約３６０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結してプラスミドｐＢＳＥＣを得た。
このようにして作製されたベクターｐＢＳＥＣを制限酵素ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩにて消化し、電気泳動にておよそ１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片、すなわち新規ポリペプチドの細胞外領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を分離し精製した。
【００９２】
このＤＮＡ断片を、前掲のプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒを制限酵素ＨｉｎｄIII 及びＢｇｌIIで処理してｄｈｆｒ遺伝子を除いたものにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）にて連結し、新規ポリペプチド（配列表の配列番号１）のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドを産生しうるプラスミドを作製した。以上のように作製された発現プラスミドをｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧとする。
【００９３】
実施例５
プラスミドによるＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の形質転換
マウス繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３１（理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０００５）を実施例３に記載した方法で得た発現プラスミドｐＳＶ２Ｆｕ、並びにｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧを用いて形質転換させた。即ち、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した上記の細胞を、形質転換前日に培地を交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュあたり５×１０⁶個にして１０ｍｌの上記培地を加え一晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ＰＢＳ（−）に１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。
【００９４】
遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製の遺伝子導入装置を用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターｐＳＶ２ＦｕまたはｐＳＶ２ＦｕＦＬＡＧ及び、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１５０）を各々２０μｇ加え、氷中で５分間放置する。その後、間を１分間室温で放置して、２回の３μＦ、４５０Ｖの電圧をかけた。その後、氷中で５分間放置後、直径１０ｃｍ細胞培養用ディッシュで上記の培地１０ｍｌで３日間培養を行った。
【００９５】
３日後、上記の培地にＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社製）を４００μｇ／ｍｌとなるように加えた培地に交換し、その後、２日おきに培地の１／３を交換して１０日間ほど培養を続けた。１０日後、ディッシュ上に形成されたコロニーをトリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を使ってはがし、クローン化された遺伝子の安定発現細胞株を得た。以降は、このようにして作製されたＢａｌｂ／３Ｔ３の配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢａｌｂ／ＦＵＬＬと示し、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢａｌｂ／ＦＵＬＬＦＬＡＧと示す。また、同時に同じ方法でｐＳＶ２−ｎｅｏのみを遺伝子導入したコントロールの形質転換細胞株を作製しこれをＢａｌｂ／ＣＯＮと示す。
【００９６】
実施例６
プラスミドによるＣＯＳ−７細胞の形質転換
ＣＯＳ−７（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）を実施例４に記載の方法で得たプラスミドｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧを用いて、実施例５に記載の方法と同様の方法にて形質転換させた。
即ち、Ｄ−ＭＥＭ（ダルベッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した上記細胞を、形質転換前日に培地を交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシュあたり５×１０⁶個にして１０ｍｌの上記培地を加え一晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ＰＢＳ（−）に１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製の遺伝子導入装置を用いたエレクトロポレーション法で行った。
【００９７】
上記細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターｐＳＶ２ＥＣＦＬＡＧを２０μｇ加え、氷中で５分間放置する。その後、間を１分間室温で放置して、２回の３μＦ、４５０Ｖの電圧をかけた。その後、氷中で５分間放置後、直径１０ｃｍ細胞培養用ディッシュで上記の培地１０ｍｌで培養を行った。遺伝子導入の翌日、培地を無血清のＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）に置換し、以後４日間おきに交換し、２週間にわたって培養上清を分取した。分取した培養上清を各々セントリコン３０（アミコン社製）にてバッファーを培地からＰＢＳ（−）に交換及び１０倍に濃縮した。
【００９８】
実施例７
組換え型新規ポリペプチドのウェスタンブロットを用いた検出
実施例６に記載の方法で作製した形質転換細胞上清中に配列表の配列番号１に示すポリペプチドを含有するポリペプチドが産生されていることを確認するため、以下のようにウエスタンブロットにて確認した。
すなわち、濃縮した培養上清をＡＣＩジャパン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラディエントゲル５〜２０％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加え加熱処理した還元条件下のサンプルと、その処理を行わなかった非還元条件下のサンプルについて行い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（ＢｉｏＲａｄ社製）にＢｉｏＲａｄ社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
【００９９】
このように作製されたフィルターを５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭＴｒｉｓ、１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に４℃一晩揺すりながらブロッキングした。一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２（コダック社製）、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で揺すり洗浄する操作を３回づつ繰り返した。
【０１００】
最後の洗浄後、フィルターをＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システムの反応液に五分間浸し、サランラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。その結果、還元条件、非還元条件のサンプルともおよそ５０ｋダルトン程度の蛋白が検出できた。以上の結果から、目的の配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドの産生細胞を得ることができた。
【０１０１】
実施例８
新規ポリペプチド細胞外部分蛋白の精製
実施例６に記載した方法で得たＣＯＳ−７形質転換細胞の培養上清を５リットル作製した。これらの培養上清をコダック社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌカラムに通して、組換えポリペプチドをカラムに吸着させた。カラムのサイズは１ｃｍ×３ｃｍで容積はおよそ２ｍｌであり、流速は全て１ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。吸着後、カラムをＰＢＳ（−）２０ｍｌで洗浄し、その後、０．５ＭＴｒｉｓーグリシン（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出画分を２ｍｌずつ分取し、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）２００μｌづつ加えて、各々の画分を上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【０１０２】
泳動が終わった後、和光純薬社製銀染キットワコーIIで添付の説明書に従い染色した。その結果、実施例７に記載したウエスタンブロットの結果と同様の大きさのバンドに精製タンパクが得られていることが確認できた。この結果から、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドを純品で得ることが出来た。より高純度なポリペプチドを得るために、上記の方法で精製された組換えポリペプチドをゲル濾過にて精製を行った。
【０１０３】
アフィニティーカラムからの溶離液をアミコン社製セントリコン３０にて濃縮及びＰＢＳ（−）へのバッファー交換を行い、ゲル濾過はファルマシア社製ＦＰＬＣシステムを用い、同社のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて行った。実施例７のウエスタンブロット結果と同様の分子量の位置に溶離されるメインピークを分取した。以下、このように精製された配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するポリペプチドをＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮと示す。
【０１０４】
実施例９
新規ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体の樹立
精製されたＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。即ち、実施例８で作製した精製組換えポリペプチドＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮをＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。
【０１０５】
ＨＡＴ培地（日本免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にて該ポリペプチドの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、該ポリペプチドを特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株が樹立された。このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をファルマシア社製ＭａｂＴｒａｐＧ II を用いて、添付のプロトコールに従って抗該ポリペプチドモノクローナル抗体を精製し作製した。
【０１０６】
本モノクローナル抗体を用いて実施例８で精製されたポリペプチドを実施例７に記載の条件でウェスタンブロットを行った。その結果、実施例７で示したウェスタンブロット結果と同様の分子量の単一バンドが検出でき、本モノクローナル抗体は該ポリペプチドを特異的に認識できることが明らかになった。
【０１０７】
実施例１０
実施例８に記載の方法で得た本新規免疫関連因子の細胞外部分蛋白であるＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを用いて、ヒト抗体との結合性を確認した。
即ち、９６穴のイムノプレート（ヌンク社製）にＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌ分注した。室温で１時間以上静置した後、溶液をすて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）（以下ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎと略す）で２回洗浄した。次に、１倍濃度のＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬社製）を１００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。溶液をすて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１０００倍に希釈したＨＵＭＡＮＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＳＴＡＮＤＡＲＤ（ＣＡＰＰＥＬ社製）を１００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
【０１０８】
次いで、溶液をすてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで２回洗浄後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体（Ｅ．Ｙラボラトリーズ社製）を１００μｌずつ分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、０．１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．０５Ｍクエン酸からなる緩衝液５ｍｌに１ｍｇのテトラメチルベンジジン（シグマ社製）、５０μｌの３０％過酸化水素水（和光純薬社製）を加えて作製した発色液を５０μｌずつ分注し、室温で５分から１０分静置した。２Ｎ硫酸を５０μｌずつ分注して反応を止めた。対象実験１としてＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮの替わりに牛血清アルブミン（１００ｎｇ／ｍｇ）１００μｌを用い、他は上記の方法に従って操作を行った。また、対照実験２としてＨＵＭＡＮＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＳＴＡＮＤＡＲＤの替わりに牛血清アルブミン（１００ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを用い、他は上記の方法に従って操作を行った。
【０１０９】
対照実験２種を含む上記サンプルについて、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は、ＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮ、対照１、対照２についてそれぞれ１．２、０．９、１．０となり、ＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮは対照に比べ有意に高い吸光度を示した。即ち、本発明の新規免疫関連因子はヒト免疫グロブリンと結合することが示された。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明の免疫関連因子は、リンパ節に特異的に発現することから免疫応答に関連する免疫疾患及び感染症に関わる研究や治療に有用に用いることができる。
【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【０１１９】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】