JP2865300B2 - ヒトｂ細胞刺激因子２レセプター蛋白質 - Google Patents
ヒトｂ細胞刺激因子２レセプター蛋白質Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒトＢ細胞刺激因子２レセプター活性を有す
る蛋白質（以下BSF2レセプターと略す）および該蛋白質
をコードするDNA配列、さらには該蛋白質を遺伝子工学
的に生産するための手段および方法に関するものであ
る。
る蛋白質（以下BSF2レセプターと略す）および該蛋白質
をコードするDNA配列、さらには該蛋白質を遺伝子工学
的に生産するための手段および方法に関するものであ
る。
Ｂ細胞刺激因子（以下BSF2と略す）はＢ細胞の抗体産
生細胞への分化を誘導する因子として研究されている。
近年になってBSF2をコードするｃ−DNAが単離され、DNA
配列に関する情報および精製されたBSF2の部分的なアミ
ノ酸配列等の情報により、BSF2は28アミノ酸残基のシグ
ナルペプチドを有する、184アミノ酸残基から構成され
ていることが明らかとなった。最近の知見を総合する
と、BSF2はＢ細胞に抗体産生を誘導し、ハイブリドー
マ、プラズマサイトーマ、ミエローマ等を増殖させHLA
クラスＩ抗原の発現を誘導し、血液幹細胞にコロニーを
誘導し、肝臓細胞に急性期蛋白質を誘導し、神経細胞に
突起を誘導すると考えられる。この様に、BSF2は種々の
重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖に関与している
と考えられている（平野ら、第17回日本免疫学会抄録、
p91、1987年等参照）。
生細胞への分化を誘導する因子として研究されている。
近年になってBSF2をコードするｃ−DNAが単離され、DNA
配列に関する情報および精製されたBSF2の部分的なアミ
ノ酸配列等の情報により、BSF2は28アミノ酸残基のシグ
ナルペプチドを有する、184アミノ酸残基から構成され
ていることが明らかとなった。最近の知見を総合する
と、BSF2はＢ細胞に抗体産生を誘導し、ハイブリドー
マ、プラズマサイトーマ、ミエローマ等を増殖させHLA
クラスＩ抗原の発現を誘導し、血液幹細胞にコロニーを
誘導し、肝臓細胞に急性期蛋白質を誘導し、神経細胞に
突起を誘導すると考えられる。この様に、BSF2は種々の
重要な生理活性を有し、広く細胞の増殖に関与している
と考えられている（平野ら、第17回日本免疫学会抄録、
p91、1987年等参照）。
一方、BSF2の異常産生が心房内粘液腫、子宮けい癌、
ミエローマ、慢性関節リューマチ、キャッスルマン症候
群等の疾患における免疫異常の病因因子である可能性が
報告されている（平野ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
4巻、p228 1987年等参照）。従って、BSF2阻害剤の開
発はこれらの疾患の治療薬又は診断薬等の開発につなが
ると期待されている。
ミエローマ、慢性関節リューマチ、キャッスルマン症候
群等の疾患における免疫異常の病因因子である可能性が
報告されている（平野ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
4巻、p228 1987年等参照）。従って、BSF2阻害剤の開
発はこれらの疾患の治療薬又は診断薬等の開発につなが
ると期待されている。
BSF2と特異的に結合する細胞膜上のBSF2レセプター
は、T.Tagaらにより解析され、各細胞上の数、BSF2との
結合定数等が報告されている（J.Exp.Med.,166,p967,19
87年参照）。細胞表層より離脱しているBSF2レセプター
は、前記免疫疾患等の治療薬、診断薬等として期待さ
れ、今後の研究等の進展が注目されている。
は、T.Tagaらにより解析され、各細胞上の数、BSF2との
結合定数等が報告されている（J.Exp.Med.,166,p967,19
87年参照）。細胞表層より離脱しているBSF2レセプター
は、前記免疫疾患等の治療薬、診断薬等として期待さ
れ、今後の研究等の進展が注目されている。
BSF2レセプターのさらなる研究あるいは治療薬、診断
薬等としての利用には、大量の精製品を得る必要がある
が、該レセプターの生体内での生産量は極めて微量であ
る。
薬等としての利用には、大量の精製品を得る必要がある
が、該レセプターの生体内での生産量は極めて微量であ
る。
BSF2レセプターの様な生体内の存在量が極めて微量な
蛋白質を大量に生産するために、遺伝子操作と一般に呼
ばれる遺伝子工学的な手法が用いられる。この手法は一
般的には目的とする蛋白質をコードするDNA配列の平滑
末端もしくは付着末端にたいしてこのDNA配列を発現さ
せるための例えばプロモータ系等のDNA配列を、翻訳時
に該DNA配列から目的蛋白質が生産されるように読取り
可能に結合させ、このDNA配列を宿主として選定された
微生物または培養細胞を形質転換可能なベクターに導入
し、このベクターで宿主を形質転換した後該DNA配列を
発現させるという方法である。この様な蛋白質の遺伝子
工学的手法による生産においては、目的とする蛋白質を
コードするDNA配列を得ることが必要である。しかしな
がら、BSF2レセプターに関してはその様な知見はいまの
ところ報告されていない。
蛋白質を大量に生産するために、遺伝子操作と一般に呼
ばれる遺伝子工学的な手法が用いられる。この手法は一
般的には目的とする蛋白質をコードするDNA配列の平滑
末端もしくは付着末端にたいしてこのDNA配列を発現さ
せるための例えばプロモータ系等のDNA配列を、翻訳時
に該DNA配列から目的蛋白質が生産されるように読取り
可能に結合させ、このDNA配列を宿主として選定された
微生物または培養細胞を形質転換可能なベクターに導入
し、このベクターで宿主を形質転換した後該DNA配列を
発現させるという方法である。この様な蛋白質の遺伝子
工学的手法による生産においては、目的とする蛋白質を
コードするDNA配列を得ることが必要である。しかしな
がら、BSF2レセプターに関してはその様な知見はいまの
ところ報告されていない。
本発明者は、BSF2レセプターについて鋭意研究を行っ
た結果、BSF2レセプターをコードするDNA配列を明らか
にし、この知見を基に遺伝子工学的にBSF2レセプター活
性を有する蛋白質を生産する手段および方法を完成し
た。
た結果、BSF2レセプターをコードするDNA配列を明らか
にし、この知見を基に遺伝子工学的にBSF2レセプター活
性を有する蛋白質を生産する手段および方法を完成し
た。
即ち本発明は、 ヒトBSF2と特異的に結合し得るヒトBSF2レセプター活
性を有する蛋白質： ヒトBSF2レセプター活性を有する蛋白質をコードする
DNA配列； 組換微生物または培養細胞中で前記DNA配列を発現し
得る複製可能な発現ベクター； 前記発現ベクターにより形質転換された微生物または
培養細胞； 前記微生物または培養細胞を培養してBSF2レセプター
活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を発現させる
ことを特徴とするBSF2レセプター活性を有する蛋白質の
製造方法； 前記蛋白質と特異的に結合するポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体；及び 該モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ； を提供するものであり、以下詳細に説明する。
性を有する蛋白質： ヒトBSF2レセプター活性を有する蛋白質をコードする
DNA配列； 組換微生物または培養細胞中で前記DNA配列を発現し
得る複製可能な発現ベクター； 前記発現ベクターにより形質転換された微生物または
培養細胞； 前記微生物または培養細胞を培養してBSF2レセプター
活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を発現させる
ことを特徴とするBSF2レセプター活性を有する蛋白質の
製造方法； 前記蛋白質と特異的に結合するポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体；及び 該モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ； を提供するものであり、以下詳細に説明する。
1. BSF2レセプター 生体内で本来的に生産されるBSF2レセプターは、細胞
膜上に存在し、BSF2と特異的に結合する蛋白質であり、
詳しくは次の式（Ｉ）： （ただし、式中Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asn
はアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリ
シン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロ
イシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニ
ルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはトレ
オニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、そして
Valはバリン残基を示す）で表されるアミノ酸配列を有
するものである。
膜上に存在し、BSF2と特異的に結合する蛋白質であり、
詳しくは次の式（Ｉ）： （ただし、式中Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asn
はアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリ
シン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロ
イシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニ
ルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはトレ
オニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、そして
Valはバリン残基を示す）で表されるアミノ酸配列を有
するものである。
前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列は468アミノ酸
残基から成り、Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシ
ンから第22番目に位置するプロリンにかけてと、第362
番目に位置するバリンから第386番目に位置するロイシ
ンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が位置してい
る。この二つの疎水性領域は、前者がシグナルペプチド
領域、後者が膜貫通領域であると考えられる。なお、本
発明においては該シグナルペプチド領域と膜貫通領域と
の間の領域を細胞外蛋白質（領域）と称し、該膜貫通領
域よりＣ末端側の領域を細胞内蛋白質（領域）と称す
る。
残基から成り、Ｎ末端側から第２番目に位置するロイシ
ンから第22番目に位置するプロリンにかけてと、第362
番目に位置するバリンから第386番目に位置するロイシ
ンにかけての部分に疎水性アミノ酸残基が位置してい
る。この二つの疎水性領域は、前者がシグナルペプチド
領域、後者が膜貫通領域であると考えられる。なお、本
発明においては該シグナルペプチド領域と膜貫通領域と
の間の領域を細胞外蛋白質（領域）と称し、該膜貫通領
域よりＣ末端側の領域を細胞内蛋白質（領域）と称す
る。
本発明の蛋白質は前記アミノ酸配列を有する蛋白質の
他、前記アミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有し、
BSF2と特異的に結合する性質を保持している蛋白質又は
ポリペプチドであれば良い。すなわち、前記アミノ酸配
列中の１個もしくは複数個のアミノ酸残基が他のアミノ
酸残基により置換されており、そして／又は１もしくは
複数個のアミノ酸が欠失しており、そして／又は１もし
くは複数個のアミノ酸が前記アミノ酸配列に付加されて
いるアミノ酸列を有し、且つヒトＢ細胞刺激因子２と特
異的に結合する能力を保持している蛋白質又はポリペプ
チドはすべて本発明のヒトＢ細胞刺激因子２レセプター
の範囲に含まれる。例えば、このような蛋白質として、
前記アミノ酸配列中のBSF2との結合に寄与するアミノ酸
配列及び／又はアミノ酸残基部分以外のアミノ酸配列及
び／又はアミノ酸残基が置換、欠損、挿入等により変化
したもの、さらには前記アミノ酸配列のＮ末端側及び／
又はＣ末端側にアミノ酸配列及び／又はアミノ酸残基等
が追加された蛋白質、あるいは例えばヒト成長ホルモン
等の他の蛋白質等が融合したものであっても良い。
他、前記アミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有し、
BSF2と特異的に結合する性質を保持している蛋白質又は
ポリペプチドであれば良い。すなわち、前記アミノ酸配
列中の１個もしくは複数個のアミノ酸残基が他のアミノ
酸残基により置換されており、そして／又は１もしくは
複数個のアミノ酸が欠失しており、そして／又は１もし
くは複数個のアミノ酸が前記アミノ酸配列に付加されて
いるアミノ酸列を有し、且つヒトＢ細胞刺激因子２と特
異的に結合する能力を保持している蛋白質又はポリペプ
チドはすべて本発明のヒトＢ細胞刺激因子２レセプター
の範囲に含まれる。例えば、このような蛋白質として、
前記アミノ酸配列中のBSF2との結合に寄与するアミノ酸
配列及び／又はアミノ酸残基部分以外のアミノ酸配列及
び／又はアミノ酸残基が置換、欠損、挿入等により変化
したもの、さらには前記アミノ酸配列のＮ末端側及び／
又はＣ末端側にアミノ酸配列及び／又はアミノ酸残基等
が追加された蛋白質、あるいは例えばヒト成長ホルモン
等の他の蛋白質等が融合したものであっても良い。
例えば、前記（Ｉ）のアミノ酸配列から複数個のアミ
ノ酸が欠失している活性蛋白質の例として、該アミノ酸
配列中のＮ末端の近傍が欠失している蛋白質が挙げられ
る。この様な蛋白質の１例として、第28番目のアミノ酸
から第109番目のアミノ酸までが欠失している、次のア
ミノ酸配列（II）： を有する蛋白質が挙げられる。
ノ酸が欠失している活性蛋白質の例として、該アミノ酸
配列中のＮ末端の近傍が欠失している蛋白質が挙げられ
る。この様な蛋白質の１例として、第28番目のアミノ酸
から第109番目のアミノ酸までが欠失している、次のア
ミノ酸配列（II）： を有する蛋白質が挙げられる。
さらにＣ末端側の複数個のアミノ酸が欠失している蛋
白質として、前記の膜貫通領域及び細胞内蛋白質領域が
欠失している蛋白質が挙げられる。この様な蛋白質に
は、例えば324番目から後のアミノ酸が欠失しており、
次のアミノ酸配列（III）： が挙げられる。
白質として、前記の膜貫通領域及び細胞内蛋白質領域が
欠失している蛋白質が挙げられる。この様な蛋白質に
は、例えば324番目から後のアミノ酸が欠失しており、
次のアミノ酸配列（III）： が挙げられる。
さらには、345番目から後のアミノ酸が欠失してお
り、次のアミノ酸配列（IV）： を有するものが挙げられる。
り、次のアミノ酸配列（IV）： を有するものが挙げられる。
2.DNA配列 前記の種々のアミノ酸配列をコードするDNAは種々の
方法で得ることができる。例えば上記のアミノ酸配列に
基いて塩基配列を設計し、常法に従ってDNAを化学合成
することができる。また、BSF2レセプター蛋白質を生産
することができる細胞、例えばナチュラルキラー細胞
（以下NK細胞と略す）、単球細胞、ミエローマ細胞等の
ヒト細胞から常法に従ってメッセンジャーRNA（mRNA）
を抽出し、次にこれに基いて常法に従ってcDNAライブラ
リーを作製し、これを種々の方法によりスクリーニング
して目的の蛋白質のアミノ酸配列をコードするcDNAを選
択することができる。この選択は、例えば実施例におい
て後記する様に、cDNAを動物細胞中で機能し得るベクタ
ーに挿入し、これを動物細胞にトランスフェクトし、動
物細胞表面に発現したBSF2レセプター蛋白質をBSF2との
特異的結合により検出することにより行うことができ
る。この様な方法を用いることによりアミノ酸配列が部
分的にも決定されておらず、従ってオリゴヌクレオチド
プローブを設計することができない場合でも、目的とす
るcDNAを選択することができる。
方法で得ることができる。例えば上記のアミノ酸配列に
基いて塩基配列を設計し、常法に従ってDNAを化学合成
することができる。また、BSF2レセプター蛋白質を生産
することができる細胞、例えばナチュラルキラー細胞
（以下NK細胞と略す）、単球細胞、ミエローマ細胞等の
ヒト細胞から常法に従ってメッセンジャーRNA（mRNA）
を抽出し、次にこれに基いて常法に従ってcDNAライブラ
リーを作製し、これを種々の方法によりスクリーニング
して目的の蛋白質のアミノ酸配列をコードするcDNAを選
択することができる。この選択は、例えば実施例におい
て後記する様に、cDNAを動物細胞中で機能し得るベクタ
ーに挿入し、これを動物細胞にトランスフェクトし、動
物細胞表面に発現したBSF2レセプター蛋白質をBSF2との
特異的結合により検出することにより行うことができ
る。この様な方法を用いることによりアミノ酸配列が部
分的にも決定されておらず、従ってオリゴヌクレオチド
プローブを設計することができない場合でも、目的とす
るcDNAを選択することができる。
この様にして得られた、ヒトBSF2レセプターをコード
するcDNAは次の塩基配列（Ｖ）： を有するものである。
するcDNAは次の塩基配列（Ｖ）： を有するものである。
本発明のDNA配列は、式（Ｖ）のDNA配列の他、このDN
A配列中の１個もしくは複数個のヌクレオチドが他のヌ
クレオチドにより置換されており、そして／又は１個も
しくは複数個のヌクレオチドが欠失しており、そして／
又は１個もしくは複数個のヌクレオチドが前記DNA配列
に付加されているDNA配列を有し、且つBSF2と特異的に
結合する能力を有する蛋白質をコードしているDNA配列
をも包含する。例えば、前記１において記載した種々の
アミノ酸配列、例えば式（II）、（III）、又は（IV）
で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする
DNA配列が挙げられる。
A配列中の１個もしくは複数個のヌクレオチドが他のヌ
クレオチドにより置換されており、そして／又は１個も
しくは複数個のヌクレオチドが欠失しており、そして／
又は１個もしくは複数個のヌクレオチドが前記DNA配列
に付加されているDNA配列を有し、且つBSF2と特異的に
結合する能力を有する蛋白質をコードしているDNA配列
をも包含する。例えば、前記１において記載した種々の
アミノ酸配列、例えば式（II）、（III）、又は（IV）
で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする
DNA配列が挙げられる。
例えば、前記のごとく、短縮されたBSF2レセプター蛋
白質をコードするDNAは、前記の塩基配列（Ｖ）を有しB
SF2レセプター蛋白質の全体をコードするcDNAを、適当
な制限酵素で切断して塩基配列の一部分を除去した後、
必要であれば適当なリンカーを介して、再連結すること
により得られる。
白質をコードするDNAは、前記の塩基配列（Ｖ）を有しB
SF2レセプター蛋白質の全体をコードするcDNAを、適当
な制限酵素で切断して塩基配列の一部分を除去した後、
必要であれば適当なリンカーを介して、再連結すること
により得られる。
例えば、前記（Ｖ）の塩基配列を有するcDNAを含有す
るベクターを実施例６に記載する方法で操作することに
より、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列の内のアミノ酸
配列１〜123とアミノ酸配列343〜468とから成る蛋白質
をコードするDNAを含有するベクターを作製することが
できる。また、前記ベクターを実施例７に記載する方法
で操作することにより、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配
列の内のアミノ酸配列１〜27とアミノ酸配列110〜468と
から成る蛋白質をコードするDNAを含有するベクターを
作製することができる。
るベクターを実施例６に記載する方法で操作することに
より、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列の内のアミノ酸
配列１〜123とアミノ酸配列343〜468とから成る蛋白質
をコードするDNAを含有するベクターを作製することが
できる。また、前記ベクターを実施例７に記載する方法
で操作することにより、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配
列の内のアミノ酸配列１〜27とアミノ酸配列110〜468と
から成る蛋白質をコードするDNAを含有するベクターを
作製することができる。
また、DNA点突然変異法により前記ベクターの任意の
塩基を他の塩基に変換することができる。この方法を用
いてBSF2レセプター蛋白質をコードするcDNAの任意の位
置に終止コドンを挿入することができる。この方法を用
いることにより、例えば、式（Ｉ）のアミノ酸配列の中
のアミノ酸配列１〜344を有する蛋白質をコードするDNA
を含有するベクターを得ることができる。同様にして、
アミノ酸配列１〜323を有する蛋白質をコードするDNAを
含有するプラスミドを得ることができる。
塩基を他の塩基に変換することができる。この方法を用
いてBSF2レセプター蛋白質をコードするcDNAの任意の位
置に終止コドンを挿入することができる。この方法を用
いることにより、例えば、式（Ｉ）のアミノ酸配列の中
のアミノ酸配列１〜344を有する蛋白質をコードするDNA
を含有するベクターを得ることができる。同様にして、
アミノ酸配列１〜323を有する蛋白質をコードするDNAを
含有するプラスミドを得ることができる。
遺伝子工学的にBSF2レセプター活性を有する蛋白質を
生産するには、前記した様なDNA配列にこのDNA配列を発
現させ得るDNA配列を結合させることが必要である。BSF
2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
組換微生物または培養細胞中で発現させ得るDNA配列は
選定された微生物または培養細胞等の宿主との関係にお
いて適宜選定して使用すれば良い。この様なDNA配列と
して、例えばプロモータ系、開始コドン、終止コドン等
のDNA配列が知られている。この様なDNA配列をBSF2レセ
プター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列に結合
させるには、例えば結合させようとするDNA配列間に相
補的な付着末端を形成せしめるなどして行う公知の方法
等を用いれば良い。DNA配列を発現させ得るDNA配列の結
合は、本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する
蛋白質をコードするDNA配列に対し、その読取りが可能
な様に、即ちDNA配列が翻訳された場合に目的とするBSF
2との結合に必要なアミノ酸配列あるいはアミノ酸残基
を有する蛋白質が生産される様であれば良い。
生産するには、前記した様なDNA配列にこのDNA配列を発
現させ得るDNA配列を結合させることが必要である。BSF
2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
組換微生物または培養細胞中で発現させ得るDNA配列は
選定された微生物または培養細胞等の宿主との関係にお
いて適宜選定して使用すれば良い。この様なDNA配列と
して、例えばプロモータ系、開始コドン、終止コドン等
のDNA配列が知られている。この様なDNA配列をBSF2レセ
プター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列に結合
させるには、例えば結合させようとするDNA配列間に相
補的な付着末端を形成せしめるなどして行う公知の方法
等を用いれば良い。DNA配列を発現させ得るDNA配列の結
合は、本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する
蛋白質をコードするDNA配列に対し、その読取りが可能
な様に、即ちDNA配列が翻訳された場合に目的とするBSF
2との結合に必要なアミノ酸配列あるいはアミノ酸残基
を有する蛋白質が生産される様であれば良い。
DNA配列を発現させ得るDNA配列を結合させる以外にも
本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する蛋白質
をコードするDNA配列を他の、例えばヒト成長ホルモン
を生産させるために作製されたDNA配列の下流（３′
側）に読取り可能に結合させても良い。
本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する蛋白質
をコードするDNA配列を他の、例えばヒト成長ホルモン
を生産させるために作製されたDNA配列の下流（３′
側）に読取り可能に結合させても良い。
DNA配列を発現させるためのDNA配列の中でも、プロモ
ータ系は重要であり、しかも選定した宿主との関係にお
いて適宜選定する必要がある。例えば近年の遺伝子工学
で良く使用される大腸菌等の細菌菌株を用いる場合に
は、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系、トリ
プトファンプロモーター系等、さらにはこれらのハイブ
リッドプロモーター系等の公知のプロモーター系を用い
れば良い。また例えば宿主として酵母を用いる場合等に
は、GAL4プロモーター系等が知られている。
ータ系は重要であり、しかも選定した宿主との関係にお
いて適宜選定する必要がある。例えば近年の遺伝子工学
で良く使用される大腸菌等の細菌菌株を用いる場合に
は、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系、トリ
プトファンプロモーター系等、さらにはこれらのハイブ
リッドプロモーター系等の公知のプロモーター系を用い
れば良い。また例えば宿主として酵母を用いる場合等に
は、GAL4プロモーター系等が知られている。
なお、本発明のDNA配列を発現させ得るDNA配列と読取
り可能に結合したBSF2レセプター活性を有する蛋白質を
コードするDNA配列は、プロモーター系、開始コドン、
終止コドン等の他の選定した宿主でのBSF2レセプター活
性を有する蛋白質をコードするDNA配列の発現のために
必要な例えばリボゾーム結合部位等を含んでいても良
い。
り可能に結合したBSF2レセプター活性を有する蛋白質を
コードするDNA配列は、プロモーター系、開始コドン、
終止コドン等の他の選定した宿主でのBSF2レセプター活
性を有する蛋白質をコードするDNA配列の発現のために
必要な例えばリボゾーム結合部位等を含んでいても良
い。
3. 発現ベクター 本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する蛋白
質をコードするDNA配列を発現、即ち生産し得る複製可
能な発現ベクターは、前記２で説明された様なDNA配列
を発現させ得るDNA配列と読取り可能に結合している。B
SF2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列
および宿主中でベクターDNAを複製するための複製起点
等を有し、選定した宿主を形質転換出来るものであれば
制限なく適宜選定して使用できる。例えば宿主として大
腸菌等の再菌菌株を用いる場合には、pBR322,pBR337等
のプラスミド等を例示出来るが、これら以外のものであ
っても特別の制限はない。また例えば哺乳動物等の培養
細胞を宿主として用いる場合には、例えばSV40ウイルス
由来のDNA複製オリジン等を有するベクター等を用いれ
ば良い。またこれらベクターは、これらベクターを用い
て選定された宿主を形質転換させる操作にあたり、ベク
ターが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別
を可能にするため例えばアンピシリン等の薬剤に対する
耐性を宿主に付与するためのDNA配列を含んでいること
が好ましい。
質をコードするDNA配列を発現、即ち生産し得る複製可
能な発現ベクターは、前記２で説明された様なDNA配列
を発現させ得るDNA配列と読取り可能に結合している。B
SF2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列
および宿主中でベクターDNAを複製するための複製起点
等を有し、選定した宿主を形質転換出来るものであれば
制限なく適宜選定して使用できる。例えば宿主として大
腸菌等の再菌菌株を用いる場合には、pBR322,pBR337等
のプラスミド等を例示出来るが、これら以外のものであ
っても特別の制限はない。また例えば哺乳動物等の培養
細胞を宿主として用いる場合には、例えばSV40ウイルス
由来のDNA複製オリジン等を有するベクター等を用いれ
ば良い。またこれらベクターは、これらベクターを用い
て選定された宿主を形質転換させる操作にあたり、ベク
ターが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別
を可能にするため例えばアンピシリン等の薬剤に対する
耐性を宿主に付与するためのDNA配列を含んでいること
が好ましい。
4. 宿主 本発明では、特別の制限なしに通常の遺伝子工学的に
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。例えばＫ−12,x−1776,w−3110,MC 10
09等の種々の大腸菌類、枯草菌類、好熱菌属細菌類さら
にはサルモネラ・チフィリウム、セラチア・マンセサン
ス等の種々の腸内細菌類またさらにはシュードモナス等
の微生物あるいは酵母等を例示することが出来る。哺乳
動物等の培養細胞としては、例えばCOS細胞（猿の腎臓
繊維芽細胞）、CHO細胞（チァイニーズハムスターの卵
巣細胞）等の細胞系さらにはWI 38,BHK,3T3,VERO,HeLa
等の種々の細胞系を例示することが出来る。
蛋白質を生産するために用いられる微生物または培養細
胞が使用できる。例えばＫ−12,x−1776,w−3110,MC 10
09等の種々の大腸菌類、枯草菌類、好熱菌属細菌類さら
にはサルモネラ・チフィリウム、セラチア・マンセサン
ス等の種々の腸内細菌類またさらにはシュードモナス等
の微生物あるいは酵母等を例示することが出来る。哺乳
動物等の培養細胞としては、例えばCOS細胞（猿の腎臓
繊維芽細胞）、CHO細胞（チァイニーズハムスターの卵
巣細胞）等の細胞系さらにはWI 38,BHK,3T3,VERO,HeLa
等の種々の細胞系を例示することが出来る。
5. 形質転換された宿主を用いたBSF2レセプター活性を
有する蛋白質の生産 前記３で説明したベクターにより形質転換された前記
４で説明された様な宿主を培養し、ベクターDNA中のBSF
2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
発現させることによりBSF2レセプター活性を有する蛋白
質を生産することが出来る。これはBSF2レセプター活性
を有する蛋白質をコードするDNA配列と結合した該DNA配
列を発現させ得るDNA配列中のプロモーター系の活性化
により実現される。プロモーター系の活性化は、使用し
たプロモーター系により異なった条件下で起こる。通常
の遺伝子工学的な蛋白質の生産においては、形質転換し
た宿主を目的蛋白質を生産しない状態、即ちプロモータ
ー系を不活性化した状態で培養し、宿主当りのベクター
DNA量および総宿主量（総菌体数あるいは総細胞数）を
増加させた後、プロモーター系を活性化して蛋白質生産
を開始させる。このため、通常プロモーター系は例えば
IPTG,IAA等の発現誘導剤の添加等の公知の操作により人
為的に活性化可能なものを選定するが、本発明において
も、人為的に制御可能なプロモーター系を用いることが
好ましい。
有する蛋白質の生産 前記３で説明したベクターにより形質転換された前記
４で説明された様な宿主を培養し、ベクターDNA中のBSF
2レセプター活性を有する蛋白質をコードするDNA配列を
発現させることによりBSF2レセプター活性を有する蛋白
質を生産することが出来る。これはBSF2レセプター活性
を有する蛋白質をコードするDNA配列と結合した該DNA配
列を発現させ得るDNA配列中のプロモーター系の活性化
により実現される。プロモーター系の活性化は、使用し
たプロモーター系により異なった条件下で起こる。通常
の遺伝子工学的な蛋白質の生産においては、形質転換し
た宿主を目的蛋白質を生産しない状態、即ちプロモータ
ー系を不活性化した状態で培養し、宿主当りのベクター
DNA量および総宿主量（総菌体数あるいは総細胞数）を
増加させた後、プロモーター系を活性化して蛋白質生産
を開始させる。このため、通常プロモーター系は例えば
IPTG,IAA等の発現誘導剤の添加等の公知の操作により人
為的に活性化可能なものを選定するが、本発明において
も、人為的に制御可能なプロモーター系を用いることが
好ましい。
6. BSF2レセプターに対する抗体 BSF2レセプターに対する抗体とは、前記１で説明した
生体内で生産されるBSF2レセプターまたは前記５で説明
した遺伝子工学的に生産されるBSF2レセプターの少なく
ともいずれか一方と特異的に結合する抗体である。該抗
体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の両方を
含み、生産する生物種は、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギなど種々の生物種を例示することができる。該
抗体、あるいは、該抗体がモノクローナル抗体である場
合には、これを産生するハイブリドーマを作成するため
の免疫原としては、BSF2レセプターを発現している細
胞、前記５で説明したBSF2レセプター、前記１で説明し
たアミノ酸配列（Ｉ）に基づく合成ペプチド等を例示す
ることができる。
生体内で生産されるBSF2レセプターまたは前記５で説明
した遺伝子工学的に生産されるBSF2レセプターの少なく
ともいずれか一方と特異的に結合する抗体である。該抗
体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の両方を
含み、生産する生物種は、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギなど種々の生物種を例示することができる。該
抗体、あるいは、該抗体がモノクローナル抗体である場
合には、これを産生するハイブリドーマを作成するため
の免疫原としては、BSF2レセプターを発現している細
胞、前記５で説明したBSF2レセプター、前記１で説明し
たアミノ酸配列（Ｉ）に基づく合成ペプチド等を例示す
ることができる。
以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を示す
が本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1. BSF2レセプターの存在の確認 BSF2レセプターは、BSF2と特異的に結合する（T.Taga
ら、J.Exp.Med.,166,p967,1987年参照）。この性質を利
用してNK細胞YT株、単球細胞U937株、ミエローマ細胞U2
66株、Ｔ細胞Jurkat株、Ｂ細胞CESS株、およびＢ細胞BL
29株についてBSF2レセプターの存否を確認した。これら
の細胞株の培養は10％牛胎児血清（FCS）を含むＤ−MEM
（Dulbecco's Modified Eagle's Medium,Dulbe−ccos社
製）を用いて常法に従って行った。
ら、J.Exp.Med.,166,p967,1987年参照）。この性質を利
用してNK細胞YT株、単球細胞U937株、ミエローマ細胞U2
66株、Ｔ細胞Jurkat株、Ｂ細胞CESS株、およびＢ細胞BL
29株についてBSF2レセプターの存否を確認した。これら
の細胞株の培養は10％牛胎児血清（FCS）を含むＤ−MEM
（Dulbecco's Modified Eagle's Medium,Dulbe−ccos社
製）を用いて常法に従って行った。
BSF2をNature 324（６）73−76,1986に記載されてい
る方法に従って調製した。なお、これは特開昭61−2469
7に記載されている方法によっても得られることができ
る。
る方法に従って調製した。なお、これは特開昭61−2469
7に記載されている方法によっても得られることができ
る。
次に、このBSF2に125IラベルをT.Tagaら（J.Exp.Me
d.,166,p967（1987）に記載されている方法により結合
せしめた。この125IラベルBSF2（以下125I BSF2と略
す）を前記の培養細胞と、前記Taga等の方法に従って反
応せしめた。細胞に非特異的に結合した125I BSF2を洗
浄により除去した後、細胞に結合している125Iをシンチ
レーションカウンターを用いて分析したところ、Ｂ細胞
BL29株及びＴ細胞Jurkat株以外の全ての細胞においてBS
F2レセプターの存在が検出された。
d.,166,p967（1987）に記載されている方法により結合
せしめた。この125IラベルBSF2（以下125I BSF2と略
す）を前記の培養細胞と、前記Taga等の方法に従って反
応せしめた。細胞に非特異的に結合した125I BSF2を洗
浄により除去した後、細胞に結合している125Iをシンチ
レーションカウンターを用いて分析したところ、Ｂ細胞
BL29株及びＴ細胞Jurkat株以外の全ての細胞においてBS
F2レセプターの存在が検出された。
実施例2. mRNAの単離 mRNAの単離はマニアティスらの方法（Molecular Clon
ing,Cold Spring Harbor Laboratory 1982年）を参考に
行った。
ing,Cold Spring Harbor Laboratory 1982年）を参考に
行った。
実施例１の様にして得た単球細胞U937（ATCCCRL−159
3）を生理食塩水で洗浄後、50％グアニジンイソチオシ
アネート溶液に懸濁し、この懸濁液を5.7Mと2.7Mの塩化
セシウム濃度勾配を用いた32000rpm、20時間の遠心分離
にかけ、沈澱に種々のmRNAを得た。これらmRNAを塩化ラ
ウリルシリコン液に懸濁し、フェノール抽出、そしてエ
タノール沈澱を行って精製した。
3）を生理食塩水で洗浄後、50％グアニジンイソチオシ
アネート溶液に懸濁し、この懸濁液を5.7Mと2.7Mの塩化
セシウム濃度勾配を用いた32000rpm、20時間の遠心分離
にかけ、沈澱に種々のmRNAを得た。これらmRNAを塩化ラ
ウリルシリコン液に懸濁し、フェノール抽出、そしてエ
タノール沈澱を行って精製した。
実施例3. cDNAライブラリーの作製 前記IIの様にして得た種々のmRNAを鋳型としてそれら
mRNAに相補的なcDNAを合成した。合成は、DNA合成キッ
ト（アプライド・バイオシステム）を用いて行った。
mRNAに相補的なcDNAを合成した。合成は、DNA合成キッ
ト（アプライド・バイオシステム）を用いて行った。
実施例4. cDNAのクローニングおよびBSF2レセプターを
コードするcDNAの選択 宿主にはCOS細胞（COS−７細胞）を使用した。COS細
胞に適合するベクターとして、Brian Seed（Nature,32
9,p840,1987年参照）に示されたCDM8ベクターを使用し
た。CDM8ベクターはサイトメガロウイルスのプロモータ
ー系およびSV40の複製オリジンを有している。このCDM8
ベクターのサイトメガロウイルスのプロモーター系の下
流には制限酵素BstX1の制限部位が存在する。
コードするcDNAの選択 宿主にはCOS細胞（COS−７細胞）を使用した。COS細
胞に適合するベクターとして、Brian Seed（Nature,32
9,p840,1987年参照）に示されたCDM8ベクターを使用し
た。CDM8ベクターはサイトメガロウイルスのプロモータ
ー系およびSV40の複製オリジンを有している。このCDM8
ベクターのサイトメガロウイルスのプロモーター系の下
流には制限酵素BstX1の制限部位が存在する。
前記実施例３において得られた種々のcDNAをBstX1の
制限部位に挿入したCDM8ベクターを用いてデアエデキス
トラン法によりCOS細胞を形質転換した。なお、COS細胞
は10％FCSを含むＤ−MEM倍地にて培養した。形質転換し
たCOS細胞をその後２日間培養した。こうして得られたC
OS細胞にビオチン化したBSF2の入った染色緩衝液（RPMI
1640,2％FCS,0.1％NaN3）を添加し、２時間インキュベ
ートした。COS細胞を該染色緩衝液で２回洗浄し、FITC
（フルオレセインイソシアネート）を結合させたアジビ
ンを添加しさらに該染色緩衝液で３回洗浄した。
制限部位に挿入したCDM8ベクターを用いてデアエデキス
トラン法によりCOS細胞を形質転換した。なお、COS細胞
は10％FCSを含むＤ−MEM倍地にて培養した。形質転換し
たCOS細胞をその後２日間培養した。こうして得られたC
OS細胞にビオチン化したBSF2の入った染色緩衝液（RPMI
1640,2％FCS,0.1％NaN3）を添加し、２時間インキュベ
ートした。COS細胞を該染色緩衝液で２回洗浄し、FITC
（フルオレセインイソシアネート）を結合させたアジビ
ンを添加しさらに該染色緩衝液で３回洗浄した。
死亡細胞をPI（ヨウ化プロピジウム）を添加して除去
した後、蛍光ラベルされたCOS細胞をFACS（蛍光活性化
細胞選択装置、Becton Dickinson社製）により選択分離
した。
した後、蛍光ラベルされたCOS細胞をFACS（蛍光活性化
細胞選択装置、Becton Dickinson社製）により選択分離
した。
比較のため、前記形質転換COS細胞をビオチン化BSF2
により、過剰のBS下２の存在下で処理した後に前記と同
様FITC−アビジン処理したものもFACSにより分析した。
さらにネガティブなプラスミドDNAによりトランスフェ
クトされた細胞についても同様の処理を行った。この結
果を第１図に示す。この図において横軸に蛍光強度を示
し、縦軸に相対細胞数を示す。図中、Ａはネガティブな
プラスミドによりトランスフェクトした細胞からの結果
を示し、Ｂは本発明の方法によるcDNAを含有するベクタ
ーによりトランスフェクトした細胞からの結果を示し、
そしてＣは前記Ｂの細胞のビオチン化BSF2による処理を
過剰のBSF2の存在下で行った場合の結果を示す。
により、過剰のBS下２の存在下で処理した後に前記と同
様FITC−アビジン処理したものもFACSにより分析した。
さらにネガティブなプラスミドDNAによりトランスフェ
クトされた細胞についても同様の処理を行った。この結
果を第１図に示す。この図において横軸に蛍光強度を示
し、縦軸に相対細胞数を示す。図中、Ａはネガティブな
プラスミドによりトランスフェクトした細胞からの結果
を示し、Ｂは本発明の方法によるcDNAを含有するベクタ
ーによりトランスフェクトした細胞からの結果を示し、
そしてＣは前記Ｂの細胞のビオチン化BSF2による処理を
過剰のBSF2の存在下で行った場合の結果を示す。
Ｂにおいては高い蛍光強度を有する細胞の存在が観察
され、本発明の方法に従って調製したcDNAを含有するベ
クターによりトランスフェクトした細胞群中にBSF2と結
合する物質を産生している細胞が有意の比率で存在する
ことが示された。また、Ｃに示すように、過剰のBSF2と
の競争条件下でビオチン化BSF2により処理した細胞群中
には高い蛍光強度を有する細胞が観察されず、この結合
はBSF2−特異的であることが確認された。
され、本発明の方法に従って調製したcDNAを含有するベ
クターによりトランスフェクトした細胞群中にBSF2と結
合する物質を産生している細胞が有意の比率で存在する
ことが示された。また、Ｃに示すように、過剰のBSF2と
の競争条件下でビオチン化BSF2により処理した細胞群中
には高い蛍光強度を有する細胞が観察されず、この結合
はBSF2−特異的であることが確認された。
前記の方法において高い蛍光強度を有するCOS細胞の
クローンよりベクターを抽出し、大腸菌MC1009株（ATCC
33760）を形質転換し、そしてBSF2レセプターをコード
するDNA配列を含むcDNAを有するベクターを大量に得
た。このベクタープラスミドをpBSF2R.236と称する。
クローンよりベクターを抽出し、大腸菌MC1009株（ATCC
33760）を形質転換し、そしてBSF2レセプターをコード
するDNA配列を含むcDNAを有するベクターを大量に得
た。このベクタープラスミドをpBSF2R.236と称する。
このプラスミドpBSF2R.236を制限酵素Xho Iで部分消
火し、BSF2レセプターをコードする塩基配列をすべて含
有するDNA断片を得、これを市販のベクターpIBI76（IBI
社）のSal 1部位に挿入してプラスミドpIBIBSF2Rを作製
した。このプラスミドpIBIBSF2Rを含有する大腸菌HB101
−pIBIBSF2Rは、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第2232号（FERM BP−2232）として寄託されて
いる。
火し、BSF2レセプターをコードする塩基配列をすべて含
有するDNA断片を得、これを市販のベクターpIBI76（IBI
社）のSal 1部位に挿入してプラスミドpIBIBSF2Rを作製
した。このプラスミドpIBIBSF2Rを含有する大腸菌HB101
−pIBIBSF2Rは、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研条寄第2232号（FERM BP−2232）として寄託されて
いる。
このプラスミドから、常法に従って適当な制限酵素に
よりBSF2レセプター蛋白質をコードするDNA断片を切り
出し、種々のプラスミドを作製することができる。
よりBSF2レセプター蛋白質をコードするDNA断片を切り
出し、種々のプラスミドを作製することができる。
実施例5. BSF2レセプターをコードするcDNAの解析 前記の様にして得られたベクターDNAよりBSF2レセプ
ターをコードするDNA配列を抽出し、制限酵素による制
限部位地図および塩基配列をM13法（J.Messing,Methods
Enzymol.101巻、p20,1983年参照）により決定した。そ
の結果を第２図及び第３図に示す。BSF2レセプターをコ
ードするDNA配列は1404塩基対から成り、５′末端には
開始コドン３′末端には終止コドンが位置していた。
ターをコードするDNA配列を抽出し、制限酵素による制
限部位地図および塩基配列をM13法（J.Messing,Methods
Enzymol.101巻、p20,1983年参照）により決定した。そ
の結果を第２図及び第３図に示す。BSF2レセプターをコ
ードするDNA配列は1404塩基対から成り、５′末端には
開始コドン３′末端には終止コドンが位置していた。
前記実施例１で用いたNK細胞YT株、単球細胞U937株、
ミエローマ細胞U266株、Ｔ細胞Jurkat株、Ｂ細胞CESS
株、およびＢ細胞BL29株について前記実施例２で示した
様な方法により種々のmRNAを得た。続いてそれぞれの細
胞から得た種々のmRNAについて以下に示す操作を行っ
た。
ミエローマ細胞U266株、Ｔ細胞Jurkat株、Ｂ細胞CESS
株、およびＢ細胞BL29株について前記実施例２で示した
様な方法により種々のmRNAを得た。続いてそれぞれの細
胞から得た種々のmRNAについて以下に示す操作を行っ
た。
まず精製したmRNAをオリゴdt樹脂（ベーリング社製）
を用いて濃縮した後、１μｇずつホルムアミド法で変性
させ、0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロース膜にノザンブロッティングした。
を用いて濃縮した後、１μｇずつホルムアミド法で変性
させ、0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセ
ルロース膜にノザンブロッティングした。
続いて前記実施例４の様にして得たベクターDNAよりB
SF2レセプターをコードするDNA配列を抽出し、α32P−C
TPでニックトランスレーションした後、これをプローブ
としてノザンブロティングした各種細胞の種々のmRNAと
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズは、50％ホルム
アルデヒド、５倍濃度のデンハルト液（１倍濃度のデン
ハルト液は100ml中にフィコールポリビニルピロリド
ン、牛血清アルブミンをそれぞれ0.02g含む水溶液であ
る）、５倍濃度のSSC液（１倍濃度のSSCは１中にNaCl
8.77g、クエン酸ナトリウム4.41gを含むpH7の水溶液で
ある）、10μg/mlのサケ精子DNAにプローブを１×107cp
m/ml添加した溶液中で42℃にて24時間反応させて行っ
た。
SF2レセプターをコードするDNA配列を抽出し、α32P−C
TPでニックトランスレーションした後、これをプローブ
としてノザンブロティングした各種細胞の種々のmRNAと
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズは、50％ホルム
アルデヒド、５倍濃度のデンハルト液（１倍濃度のデン
ハルト液は100ml中にフィコールポリビニルピロリド
ン、牛血清アルブミンをそれぞれ0.02g含む水溶液であ
る）、５倍濃度のSSC液（１倍濃度のSSCは１中にNaCl
8.77g、クエン酸ナトリウム4.41gを含むpH7の水溶液で
ある）、10μg/mlのサケ精子DNAにプローブを１×107cp
m/ml添加した溶液中で42℃にて24時間反応させて行っ
た。
ハイブリダイズ終了後、ニトロセルロース膜を0.1％
ドデシル硫酸ナトリウムを含む1/10濃度のSSC液中で50
℃にて２回、各20分間の洗浄を行い、非特異的にmRNAに
結合したプローブを分離させ、乾燥させた後Ｘ線フィル
ムを用いてプローブの結合を調べた結果を第４図に示
す。他方、前記T.Tagaらによると各種細胞のBSF2レセプ
ターの数は次の表の通りである。
ドデシル硫酸ナトリウムを含む1/10濃度のSSC液中で50
℃にて２回、各20分間の洗浄を行い、非特異的にmRNAに
結合したプローブを分離させ、乾燥させた後Ｘ線フィル
ムを用いてプローブの結合を調べた結果を第４図に示
す。他方、前記T.Tagaらによると各種細胞のBSF2レセプ
ターの数は次の表の通りである。
その結果、前記実施例に示された様なBSF2レセプター
を有すると考えられる細胞群から得られたmRNA中には、
単球細胞U937株のBSF2レセプターをコードするDNA配列
と相補的なものが存在することが確認された。前記実施
例１においてBSF2レセプターの存在が確認されなかった
Ｔ細胞Jurkat株およびＢ細胞BL29株から得たmRNA中には
単球細胞U937株のBSF2レセプターをコードするDNA配列
と相補的なものは検出できなかった。この結果は第３図
に示されたDNA配列がヒトBSF2レセプターをコードして
いるDNA配列であることを支持している。
を有すると考えられる細胞群から得られたmRNA中には、
単球細胞U937株のBSF2レセプターをコードするDNA配列
と相補的なものが存在することが確認された。前記実施
例１においてBSF2レセプターの存在が確認されなかった
Ｔ細胞Jurkat株およびＢ細胞BL29株から得たmRNA中には
単球細胞U937株のBSF2レセプターをコードするDNA配列
と相補的なものは検出できなかった。この結果は第３図
に示されたDNA配列がヒトBSF2レセプターをコードして
いるDNA配列であることを支持している。
第３図に示したDNA配列が発現、即ち翻訳された場合
に生産される蛋白質のアミノ酸配列は同じく第３図に示
した様な468アミノ酸残基からなると考えられる。Ｎ末
端には開始コドンに対応するメチオニンが位置してい
る。このアミノ酸配列は２つの疎水性アミノ酸領域を有
しているが、Ｎ末端側の領域はシグナルペプチド部分、
Ｃ末端側の領域は細胞膜貫通部分であると考えられる。
この様な領域を有することも、末端が細胞膜を貫通して
細胞内部に到達するBSF2レセプターの特徴を支持してい
る。BSF2との特異的結合に寄与する部分は、これら２つ
の疎水性アミノ酸領域に挟まれた部分に存在すると考え
られる。
に生産される蛋白質のアミノ酸配列は同じく第３図に示
した様な468アミノ酸残基からなると考えられる。Ｎ末
端には開始コドンに対応するメチオニンが位置してい
る。このアミノ酸配列は２つの疎水性アミノ酸領域を有
しているが、Ｎ末端側の領域はシグナルペプチド部分、
Ｃ末端側の領域は細胞膜貫通部分であると考えられる。
この様な領域を有することも、末端が細胞膜を貫通して
細胞内部に到達するBSF2レセプターの特徴を支持してい
る。BSF2との特異的結合に寄与する部分は、これら２つ
の疎水性アミノ酸領域に挟まれた部分に存在すると考え
られる。
実施例6. プラスミドｐΔBSF2R I.1の作製（第５図） 中央部分が失欠したBSF2レセプター蛋白質をコードす
るDNAを含有するプラスミドを作製するため、実施例４
において得た、BSF2レセプター蛋白質の全領域をコード
するcDNAを含有するプラスミドpBSF2R.236を用いた。
るDNAを含有するプラスミドを作製するため、実施例４
において得た、BSF2レセプター蛋白質の全領域をコード
するcDNAを含有するプラスミドpBSF2R.236を用いた。
プラスミドpBSF2R.236をHind III及びMro Iにより切
断し、生成した断片をKlenow断片により平滑末端化し、
次にXho Iにより切断して、DNA断片Ａを得た。またpBSF
2R.236をSsp I及びPst Iにより切断して800bpのDNA断片
Ｂを得た。他方、CDM8ベクターをXho I及びPst Iにより
切断し、そしてBAPにより処理することによりベクター
断片Ｃを得た。次に、前記DNA断片A,B、及びＣをリガー
ゼにより連結し、この反混混合物を用いて大腸菌MC1061
/P3を形質転換し、125μg/mlアンピシリン及び75μg/ml
テトラサイクリンに対して耐性のコロニーを選択するこ
とにより目的とするクローンを選択した後プラスミドを
得、これをｐΔBSF2R I.1と命名した。
断し、生成した断片をKlenow断片により平滑末端化し、
次にXho Iにより切断して、DNA断片Ａを得た。またpBSF
2R.236をSsp I及びPst Iにより切断して800bpのDNA断片
Ｂを得た。他方、CDM8ベクターをXho I及びPst Iにより
切断し、そしてBAPにより処理することによりベクター
断片Ｃを得た。次に、前記DNA断片A,B、及びＣをリガー
ゼにより連結し、この反混混合物を用いて大腸菌MC1061
/P3を形質転換し、125μg/mlアンピシリン及び75μg/ml
テトラサイクリンに対して耐性のコロニーを選択するこ
とにより目的とするクローンを選択した後プラスミドを
得、これをｐΔBSF2R I.1と命名した。
このプラスミドは、式（Ｉ）のアミノ酸配列中のアミ
ノ酸124〜342をコードするDNA部分を欠き、アミノ酸１
〜123とアミノ酸343〜468とから成る蛋白質をコードす
るDNAを含有している。
ノ酸124〜342をコードするDNA部分を欠き、アミノ酸１
〜123とアミノ酸343〜468とから成る蛋白質をコードす
るDNAを含有している。
実施例7. プラスミドｐΔBSF2R II.5の作製（第６図） Ｎ−末端近傍が欠失したBSF2レセプター蛋白質をコー
ドするDNAを含有するプラスミドを作製するため、実施
例４において得た、BSF2レセプター蛋白質の全領域をコ
ードするcDNAを含有するプラスミドpBSF2R.236を用い
た。
ドするDNAを含有するプラスミドを作製するため、実施
例４において得た、BSF2レセプター蛋白質の全領域をコ
ードするcDNAを含有するプラスミドpBSF2R.236を用い
た。
プラスミドpBSF2R.236をXho I及びFsp Iにより切断し
て450bpのDNA断片Ｄを単離した。また、pBSF2R.236をAp
aL I及びXba Iにより切断し、1.5kbpのDNA断片を単離
し、これをMung beanヌクレアーゼにより処理し、さら
にPst Iにより切断してDNA断片Ｅを得た。他方、CDM8ベ
クターをXho I及びPst Iにより切断し、そしてBAPで処
理することによってベクターDNA断片Ｆを得た。次に前
記DNA断片D,E、及びＦ及びリガーゼにより連結し、この
反応混合物を用いて大腸菌MC1061/P3を形質転換し、125
μg/mlアンピシリン及び75μg/mlテトラサイクリンに対
して耐性のコロニーを選択することにより目的とするク
ローンを選択した後プラスミドを得、これをｐΔBSF2R
II.5と命名した。
て450bpのDNA断片Ｄを単離した。また、pBSF2R.236をAp
aL I及びXba Iにより切断し、1.5kbpのDNA断片を単離
し、これをMung beanヌクレアーゼにより処理し、さら
にPst Iにより切断してDNA断片Ｅを得た。他方、CDM8ベ
クターをXho I及びPst Iにより切断し、そしてBAPで処
理することによってベクターDNA断片Ｆを得た。次に前
記DNA断片D,E、及びＦ及びリガーゼにより連結し、この
反応混合物を用いて大腸菌MC1061/P3を形質転換し、125
μg/mlアンピシリン及び75μg/mlテトラサイクリンに対
して耐性のコロニーを選択することにより目的とするク
ローンを選択した後プラスミドを得、これをｐΔBSF2R
II.5と命名した。
このプラスミドは、式（Ｉ）のアミノ酸配列中アミノ
酸28〜109をコードするDNA部分を欠き、アミノ酸１〜27
とアミノ酸110〜468とから成る蛋白質をコードするDNA
を含有する。
酸28〜109をコードするDNA部分を欠き、アミノ酸１〜27
とアミノ酸110〜468とから成る蛋白質をコードするDNA
を含有する。
実施例8. BSF2レセプター蛋白質の発現の確認（第７〜
９図） 実施例４において作製したプラスミドpBSFSR.236、実
施例６において作製したプラスミドｐΔBSF2R I.1、及
び実施例７において作製したプラスミドｐΔBSF2R II.5
を、DEAE−デキストラン法（Secd,B.及びAruffo,A.,PNA
S 84:3365）によりマウスCOP細胞（C.Tyndall等、Nucle
ic Acid Res.,９ 6231,1981）に形質導入し、これらの
細胞を20％ウシ胎児血清（FCS）を含有するDMEM培地中
で培養した。培養細胞が目的の蛋白質を発現しているか
否かを実施例４に記載したのと同様にして蛍光染色細胞
分別機（FACS440）により調べた。この結果を第７図（p
BSF2R.236）、第８図（ｐΔBSF2R I.1）、及び第９図
（ｐΔBSF2R II.5）に示す。これらの図から明らかなご
とく、pBSF2R.236により形質導入されたCOP細胞（第７
図Ｂ）及びｐΔBSF2R II.5により形質導入されたCOP細
胞（第９図Ｂ）は染色されたが、ｐΔBSF2R I.1により
形質導入されたCOP細胞（第８図Ｂ）は染色されなかっ
た。また、これらの染色は過剰の組換えBSF2の添加によ
り阻害された（第７図Ｃ及び第９図Ｃ）。この結果pBSF
2R.236及びｐΔBSF2R II.5はいずれもBSF2レセプター活
性を有する蛋白質を生産していることが確認され、Ｎ末
端近傍のアミノ酸配列が除去された蛋白質もBSF2レセプ
ター活性を有することが確認された。
９図） 実施例４において作製したプラスミドpBSFSR.236、実
施例６において作製したプラスミドｐΔBSF2R I.1、及
び実施例７において作製したプラスミドｐΔBSF2R II.5
を、DEAE−デキストラン法（Secd,B.及びAruffo,A.,PNA
S 84:3365）によりマウスCOP細胞（C.Tyndall等、Nucle
ic Acid Res.,９ 6231,1981）に形質導入し、これらの
細胞を20％ウシ胎児血清（FCS）を含有するDMEM培地中
で培養した。培養細胞が目的の蛋白質を発現しているか
否かを実施例４に記載したのと同様にして蛍光染色細胞
分別機（FACS440）により調べた。この結果を第７図（p
BSF2R.236）、第８図（ｐΔBSF2R I.1）、及び第９図
（ｐΔBSF2R II.5）に示す。これらの図から明らかなご
とく、pBSF2R.236により形質導入されたCOP細胞（第７
図Ｂ）及びｐΔBSF2R II.5により形質導入されたCOP細
胞（第９図Ｂ）は染色されたが、ｐΔBSF2R I.1により
形質導入されたCOP細胞（第８図Ｂ）は染色されなかっ
た。また、これらの染色は過剰の組換えBSF2の添加によ
り阻害された（第７図Ｃ及び第９図Ｃ）。この結果pBSF
2R.236及びｐΔBSF2R II.5はいずれもBSF2レセプター活
性を有する蛋白質を生産していることが確認され、Ｎ末
端近傍のアミノ酸配列が除去された蛋白質もBSF2レセプ
ター活性を有することが確認された。
実施例9. 可溶性BSF2レセプター蛋白質の製造（１）
（第10及び11図） 可溶性BSF2レセプター蛋白質を製造するため、BSF2レ
セプター蛋白質のＣ−末端側の膜貫通領域と思われる部
分及び細胞内蛋白質と思われる部分が除去された蛋白質
を製造した。このためプラスミドPUC9を基本ベクターと
し、ヒトβアクチンプロモーター（S.Nakajimaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.,82,6133,1985）とこの下流に配
置された可溶型BSF2レセプターcDNA及びこの下流に付加
された翻訳終止コドンを含んで成る発現ユニット、を含
む発現プラスミドphβABSF2Rを作製した。
（第10及び11図） 可溶性BSF2レセプター蛋白質を製造するため、BSF2レ
セプター蛋白質のＣ−末端側の膜貫通領域と思われる部
分及び細胞内蛋白質と思われる部分が除去された蛋白質
を製造した。このためプラスミドPUC9を基本ベクターと
し、ヒトβアクチンプロモーター（S.Nakajimaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA.,82,6133,1985）とこの下流に配
置された可溶型BSF2レセプターcDNA及びこの下流に付加
された翻訳終止コドンを含んで成る発現ユニット、を含
む発現プラスミドphβABSF2Rを作製した。
まず、プラスミドpBSF2R.236をSph Iにより切断してB
SF2レセプターのＮ−末端側の402個アミノ酸をコードす
る部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベクター
M13mp18のSph I部位に挿入した後、オリゴヌクレオチド
５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′を用いて、「オリゴ
ヌクレオチドを用いた部位特異的invitro変異体作製シ
ステム」（アマーシャム）により、344個のアミノ酸の
コドンの後にTAGの終止コドンを挿入し、変異ファージM
13mp18（345）を得た。このファージの複製形をHind II
I及びSal Iにより切断し、345位のアミノ酸の代りに終
止コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片（Ａ）
を得た。他方、β−グロビンpolyAを含有するプラスミ
ドpECE（L.Ellisら、Cell,45,721,1986）をSal I及びBa
mH Iで切断し、βグロビンpolyAを含むDNA断片（Ｂ）を
得た。さらに、プラスミドPUC9中にヒトβアクチンプロ
モーターを含んで成るプラスミドをHind III及びBamH I
により切断し、ヒトβアクチンプロモーター及びPUC9ベ
クター部分からなる線状化プラスミドを得た。次に、こ
れら三者を市販のDNAリガーゼにより連結して発現プラ
スミドphβABSF2Rを得た。このプラスミドの作製過程及
び構造を第10図に示す。
SF2レセプターのＮ−末端側の402個アミノ酸をコードす
る部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベクター
M13mp18のSph I部位に挿入した後、オリゴヌクレオチド
５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′を用いて、「オリゴ
ヌクレオチドを用いた部位特異的invitro変異体作製シ
ステム」（アマーシャム）により、344個のアミノ酸の
コドンの後にTAGの終止コドンを挿入し、変異ファージM
13mp18（345）を得た。このファージの複製形をHind II
I及びSal Iにより切断し、345位のアミノ酸の代りに終
止コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片（Ａ）
を得た。他方、β−グロビンpolyAを含有するプラスミ
ドpECE（L.Ellisら、Cell,45,721,1986）をSal I及びBa
mH Iで切断し、βグロビンpolyAを含むDNA断片（Ｂ）を
得た。さらに、プラスミドPUC9中にヒトβアクチンプロ
モーターを含んで成るプラスミドをHind III及びBamH I
により切断し、ヒトβアクチンプロモーター及びPUC9ベ
クター部分からなる線状化プラスミドを得た。次に、こ
れら三者を市販のDNAリガーゼにより連結して発現プラ
スミドphβABSF2Rを得た。このプラスミドの作製過程及
び構造を第10図に示す。
phβABSF2Rを用いての可溶性BSF2レセプター蛋白質の
発現を以下の様にして行った。DMEM培地を用いて通常の
方法で培養したマウス繊維芽細胞、Ｌ細胞（ATCC,CCL
1）に、リン酸カルシウム法キット（ファルマシア）を
用いて、100mmペトリ皿あたり20μｇのphβABSF2Rを導
入した。
発現を以下の様にして行った。DMEM培地を用いて通常の
方法で培養したマウス繊維芽細胞、Ｌ細胞（ATCC,CCL
1）に、リン酸カルシウム法キット（ファルマシア）を
用いて、100mmペトリ皿あたり20μｇのphβABSF2Rを導
入した。
翌日培地を交換し、さらに２日後に培養上清を回収し
た。
た。
この培養上清中の可溶性BSF2レセプターの検出は、実
施例11に記載するMT18抗体と実施例１に記載した方法に
基づいて作製した125I−BSF2を用いて行った。すなわち
１μg/mlのMT18抗体を含むPBSを、96穴のマイクロタイ
タープレートに１ウエルあたり、100μを加え、一晩
４℃で放置した。洗浄後、１ウエルあたり100μの１
％BSAを加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μ
のＬ細胞の培養上清を加え、２時間室温で放置した。洗
浄後、100μの125I−BSF2を１ウエルあたり20,000cpm
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、各ウエルを切断
し、γ−カウンターで測定した。また、培養上清のみの
添加の代りに、培養上清と共に200ng/mlのラベルしてな
いBSF2を加えた場合についても測定を行った。
施例11に記載するMT18抗体と実施例１に記載した方法に
基づいて作製した125I−BSF2を用いて行った。すなわち
１μg/mlのMT18抗体を含むPBSを、96穴のマイクロタイ
タープレートに１ウエルあたり、100μを加え、一晩
４℃で放置した。洗浄後、１ウエルあたり100μの１
％BSAを加え、２時間室温で放置した。洗浄後、100μ
のＬ細胞の培養上清を加え、２時間室温で放置した。洗
浄後、100μの125I−BSF2を１ウエルあたり20,000cpm
加え、２時間室温で放置した。洗浄後、各ウエルを切断
し、γ−カウンターで測定した。また、培養上清のみの
添加の代りに、培養上清と共に200ng/mlのラベルしてな
いBSF2を加えた場合についても測定を行った。
比較のため、細胞が接種されていない10％FCSを含有
するDMEM培地、及びプラスミドが導入されていないＬ細
胞の培養上清を同様に処理し、γ−カウンターで測定し
た。測定の結果を第11図に示す。10％FCSを含むDMEM培
地及びphβABSF2Rを導入していないＬ細胞の培養上清と
比較して、phβABSF2Rを導入したＬ細胞の培養上清中に
は、MT18抗体と125I−BSF2の両方に結合する物質が明ら
かに存在することが示された。また、Ｌ細胞の培養上清
に200ng/mlのラベルしていないBSF2を加えると、カウン
トが減少することから、上記物質は可溶性BSF2レセプタ
ーであることが証明された。
するDMEM培地、及びプラスミドが導入されていないＬ細
胞の培養上清を同様に処理し、γ−カウンターで測定し
た。測定の結果を第11図に示す。10％FCSを含むDMEM培
地及びphβABSF2Rを導入していないＬ細胞の培養上清と
比較して、phβABSF2Rを導入したＬ細胞の培養上清中に
は、MT18抗体と125I−BSF2の両方に結合する物質が明ら
かに存在することが示された。また、Ｌ細胞の培養上清
に200ng/mlのラベルしていないBSF2を加えると、カウン
トが減少することから、上記物質は可溶性BSF2レセプタ
ーであることが証明された。
実施例10.可溶性BSF2レセプター蛋白質の製造（２）
（第12〜18図） プラスミドpSVL345の作製 可溶性BSF2レセプター蛋白質をCos−１細胞を用いて
製造するため、BSF2レセプター蛋白質のＣ−末端側の膜
貫通領域と思われる部分及び細胞内蛋白質と思われる部
分が除去された蛋白質の製造を試みた。このためプラス
ミドpSVL（ファルマシア製）を基本プラスミドとし、pS
VLプラスミドに含まれるSV40後記プロモーターの下流に
配置されたSV40後記遺伝子のスプラインシング部位と、
SV40ポリアデニレーションシグナルの間に可溶性BSF2レ
セプター発現ユニットを挿入して、プラスミドpSVL345
を作製した。
（第12〜18図） プラスミドpSVL345の作製 可溶性BSF2レセプター蛋白質をCos−１細胞を用いて
製造するため、BSF2レセプター蛋白質のＣ−末端側の膜
貫通領域と思われる部分及び細胞内蛋白質と思われる部
分が除去された蛋白質の製造を試みた。このためプラス
ミドpSVL（ファルマシア製）を基本プラスミドとし、pS
VLプラスミドに含まれるSV40後記プロモーターの下流に
配置されたSV40後記遺伝子のスプラインシング部位と、
SV40ポリアデニレーションシグナルの間に可溶性BSF2レ
セプター発現ユニットを挿入して、プラスミドpSVL345
を作製した。
まず、プラスミドpBSF2R.236をSph Iにて切断してBSF
−２レセプターのＮ−末端側の402個のアミノ酸をコー
ドする部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベク
ターM13mp18のSph I部位に挿入した後、合成オリゴヌク
レオチド５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′を用いて、
「オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的in vitro変異
体作製システム」（アマシャム製）により、345位のア
ミノ酸のコドンの代りにTAGの終止コドンを挿入し、変
異ファージM13mp18（345）を得た。このファージの複製
形をSph Iにより切断し、345位のアミノ酸の代りに終止
コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片を得た。
これをプラスミドpSP73（プロメガバイオテック製）のS
ph I部位に挿入した後、BSF2レセプター遺伝子の５′側
に制限酵素Xho I部位があり、３′側にBamH I部位とな
る方向に挿入されたプラスミドを選んだ。これをXho I
及びBamH Iにて切断してＮ−末側から344個のアミノ酸
をコードする部分を含む可溶性BSF2レセプター遺伝子断
片Ａを得た。他方、基本プラスミドpSVLをXho I及びBam
H Iにて切断し、アルカリホスファターゼ処理して線状
化プラスミドDNA断片を得た。つぎに、このDNA断片とDN
A断片ＡをT4DNAリガーゼにより連結して発現プラスミド
pSVL345を得た。このプラスミドの作製過程を第12図に
示す。
−２レセプターのＮ−末端側の402個のアミノ酸をコー
ドする部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベク
ターM13mp18のSph I部位に挿入した後、合成オリゴヌク
レオチド５′−ATATTCTCTAGAGAGATTCT−３′を用いて、
「オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的in vitro変異
体作製システム」（アマシャム製）により、345位のア
ミノ酸のコドンの代りにTAGの終止コドンを挿入し、変
異ファージM13mp18（345）を得た。このファージの複製
形をSph Iにより切断し、345位のアミノ酸の代りに終止
コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片を得た。
これをプラスミドpSP73（プロメガバイオテック製）のS
ph I部位に挿入した後、BSF2レセプター遺伝子の５′側
に制限酵素Xho I部位があり、３′側にBamH I部位とな
る方向に挿入されたプラスミドを選んだ。これをXho I
及びBamH Iにて切断してＮ−末側から344個のアミノ酸
をコードする部分を含む可溶性BSF2レセプター遺伝子断
片Ａを得た。他方、基本プラスミドpSVLをXho I及びBam
H Iにて切断し、アルカリホスファターゼ処理して線状
化プラスミドDNA断片を得た。つぎに、このDNA断片とDN
A断片ＡをT4DNAリガーゼにより連結して発現プラスミド
pSVL345を得た。このプラスミドの作製過程を第12図に
示す。
プラスミドのpSVL324の作製 可溶性BSF2レセプター蛋白質を製造するため、BSF2レ
セプター蛋白質のＣ−末端側の膜貫通領域と思われる部
分及び細胞内蛋白質と思われる部分が除去された蛋白質
の製造を試みた。このためプラスミドpSVL（ファルマシ
ア製）を基本プラスミドとし、pSVLプラスミドに含まれ
るSV40後期プロモーターの下流に配置されたSV40後期遺
伝子のスプライシング部位と、SV40ポリアデニレーショ
ンシグナルの間に可溶性BSF2レセプター発現ユニットを
挿入して、プラスミドpSVL324を作製した。
セプター蛋白質のＣ−末端側の膜貫通領域と思われる部
分及び細胞内蛋白質と思われる部分が除去された蛋白質
の製造を試みた。このためプラスミドpSVL（ファルマシ
ア製）を基本プラスミドとし、pSVLプラスミドに含まれ
るSV40後期プロモーターの下流に配置されたSV40後期遺
伝子のスプライシング部位と、SV40ポリアデニレーショ
ンシグナルの間に可溶性BSF2レセプター発現ユニットを
挿入して、プラスミドpSVL324を作製した。
まず、プラスミドpBSF2R.236をSph Iにて切断してBSF
−２レセプターのＮ−末端側の402個のアミノ酸をコー
ドする部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベク
ターM13mp18のSph I部位に挿入した後、合成オリゴヌク
レオチド５′−GTCCTCCAGTCTAGAACGAGGT−３′を用い
て、「オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的in vitro
変異体作製システム」（アマシャム製）により、324位
のアミノ酸のコドンの代りにTAGの終止コドンを挿入
し、変異ファージM13mp18（324）を得た。このファージ
の複製形をSph Iにより切断し、323位のアミノ酸がアラ
ニンからバリンに変わり、324位のアミノ酸の代りに終
止コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片を得
た。これをプラスミドpSP73（プロメガバイオテック
製）のSph I部位に挿入した後、BSF2レセプター遺伝子
の５′側に制限酵素Xho I部位があり、３′側にBamH I
部位が来る方向で挿入されたプラスミドを選んだ。これ
をXho I及びBamH Iにて切断してＮ−末側から323個のア
ミノ酸をコードする部分を含む可溶性BSF2レセプター遺
伝子断片Ｂを得た。他方、基本ベクターpSVLをXho I及
びBamH Iにて切断し、アルカリホスファターゼ処理して
線状化プラスミドDNA断片を得た。つぎに、このDNA断片
とDNA断片ＢをT4DNAリガーゼにより連結して発現プラス
ミドpSVL324を得た。このプラスミドの作製過程を第13
図に示す。
−２レセプターのＮ−末端側の402個のアミノ酸をコー
ドする部分を含むcDNA断片を得た。これをファージベク
ターM13mp18のSph I部位に挿入した後、合成オリゴヌク
レオチド５′−GTCCTCCAGTCTAGAACGAGGT−３′を用い
て、「オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的in vitro
変異体作製システム」（アマシャム製）により、324位
のアミノ酸のコドンの代りにTAGの終止コドンを挿入
し、変異ファージM13mp18（324）を得た。このファージ
の複製形をSph Iにより切断し、323位のアミノ酸がアラ
ニンからバリンに変わり、324位のアミノ酸の代りに終
止コドンTAGを含むBSF2レセプター遺伝子の断片を得
た。これをプラスミドpSP73（プロメガバイオテック
製）のSph I部位に挿入した後、BSF2レセプター遺伝子
の５′側に制限酵素Xho I部位があり、３′側にBamH I
部位が来る方向で挿入されたプラスミドを選んだ。これ
をXho I及びBamH Iにて切断してＮ−末側から323個のア
ミノ酸をコードする部分を含む可溶性BSF2レセプター遺
伝子断片Ｂを得た。他方、基本ベクターpSVLをXho I及
びBamH Iにて切断し、アルカリホスファターゼ処理して
線状化プラスミドDNA断片を得た。つぎに、このDNA断片
とDNA断片ＢをT4DNAリガーゼにより連結して発現プラス
ミドpSVL324を得た。このプラスミドの作製過程を第13
図に示す。
可溶性BSF2レセプター蛋白質の発現 pSVL345及びpSVL324を用いての可溶性BSF2レセプター
蛋白質の発現を以下のようにして行った。DMEM培地に10
％（v/v）牛胎児血清（GIBCO）を加えて通常の方法で培
養したアフリカミドリザル腎由来のCos−１細胞（ATCC,
CRL1650）に、リン酸カルシウム法（Wiglaer et al,Cel
l,14,725−731,1978）を用いて、pSVL345もしくはpSVL3
24、又は比較のために可溶性BSF2レセプター発現ユニッ
トを持っていないプラスミドpSVL（Mock）を導入した。
それぞれのプラスミドについて100mmペトリ皿あたり１
×106の細胞を入れて10mlの培地で１晩培養後、1mlのリ
ン酸カルシウム溶液（Chu,G.＆ Sharp,P.A.,Gene,13,19
7−202,1981）に入った20μｇのプラスミドを導入し
た。翌日培地を交換し、10mlの培地を加えてさらに３日
間培養後に培養上清を回収した。
蛋白質の発現を以下のようにして行った。DMEM培地に10
％（v/v）牛胎児血清（GIBCO）を加えて通常の方法で培
養したアフリカミドリザル腎由来のCos−１細胞（ATCC,
CRL1650）に、リン酸カルシウム法（Wiglaer et al,Cel
l,14,725−731,1978）を用いて、pSVL345もしくはpSVL3
24、又は比較のために可溶性BSF2レセプター発現ユニッ
トを持っていないプラスミドpSVL（Mock）を導入した。
それぞれのプラスミドについて100mmペトリ皿あたり１
×106の細胞を入れて10mlの培地で１晩培養後、1mlのリ
ン酸カルシウム溶液（Chu,G.＆ Sharp,P.A.,Gene,13,19
7−202,1981）に入った20μｇのプラスミドを導入し
た。翌日培地を交換し、10mlの培地を加えてさらに３日
間培養後に培養上清を回収した。
培養上清中の可溶性BSF2レセプター蛋白質の検出 まず、MT18抗体を用いる酵素抗体法による検出を行っ
た。すなわち、上述のようにして得られた培養上清を適
宜希釈し、96穴のマイクロプレートの各ウエルに200μ
宛、注入した。４℃で一夜放置後、洗浄用緩衝液です
すいだ。次に１％BSA溶液を添加し、室温で90分間放置
して各ウエルのブロッキングを行った。さらにプレート
を洗浄後、実施例11に記載するMT18抗体を添加し、室温
で90分間放置した。再びプレートを洗浄し、抗マウスIg
G家兎抗体を添加し、室温で60分間放置した。プレート
を洗浄後、酵素標識した抗家兎1gGヤギ抗体を加え、室
温で60分間放置した。洗浄後、Ｐ−nitrophenyl.phosph
ateを基質として添加して30分間酵素反応を行った。反
応終了後、吸光度（0.D.405−600nm）をマイクロプレー
トリーダー（東ソー社製）を用いて測定した。
た。すなわち、上述のようにして得られた培養上清を適
宜希釈し、96穴のマイクロプレートの各ウエルに200μ
宛、注入した。４℃で一夜放置後、洗浄用緩衝液です
すいだ。次に１％BSA溶液を添加し、室温で90分間放置
して各ウエルのブロッキングを行った。さらにプレート
を洗浄後、実施例11に記載するMT18抗体を添加し、室温
で90分間放置した。再びプレートを洗浄し、抗マウスIg
G家兎抗体を添加し、室温で60分間放置した。プレート
を洗浄後、酵素標識した抗家兎1gGヤギ抗体を加え、室
温で60分間放置した。洗浄後、Ｐ−nitrophenyl.phosph
ateを基質として添加して30分間酵素反応を行った。反
応終了後、吸光度（0.D.405−600nm）をマイクロプレー
トリーダー（東ソー社製）を用いて測定した。
測定の結果を第14図に示す。BSF2レセプター発現ユニ
ットを持っていないプラスミドpSVLを導入したCos−１
細胞の培養上清と比較してpSVL345又はpSVL324を導入し
た培養上清中にはMT18抗体と結合する物質が存在するこ
とが明らかにされた。
ットを持っていないプラスミドpSVLを導入したCos−１
細胞の培養上清と比較してpSVL345又はpSVL324を導入し
た培養上清中にはMT18抗体と結合する物質が存在するこ
とが明らかにされた。
次に実施例９で述べたMT18抗体及び125I−BSF2を用い
る方法により、Cos−１細胞の培養上清中の可溶性レセ
プターの検出を試みた。測定結果を第15図に示す。pSVL
を導入したCos−１細胞の培養上清と比較してpSVL345又
はpSVL324を導入した培養上清中にはMT18抗体と125I−B
SF2の両方に結合する物質が存在することが判明した。
る方法により、Cos−１細胞の培養上清中の可溶性レセ
プターの検出を試みた。測定結果を第15図に示す。pSVL
を導入したCos−１細胞の培養上清と比較してpSVL345又
はpSVL324を導入した培養上清中にはMT18抗体と125I−B
SF2の両方に結合する物質が存在することが判明した。
またこれらの培養上清にラベルしていないBSF2を添加
すると、添加量に依存してカウントが減少することか
ら、上記物質は可溶性のBSF2レセプターであることが証
明された（第16図）。
すると、添加量に依存してカウントが減少することか
ら、上記物質は可溶性のBSF2レセプターであることが証
明された（第16図）。
さらに上記の実験事実を確認する目的で、別法とし
て、MT18抗体、BSF2、及び抗BSF2家兎抗体を用いる方法
を試みた。すなわち、５μg/mlのMT18抗体をマイクロタ
イタープレートの各ウエルに200μづつ添加し、４℃
で一夜放置した。洗浄後、１％BSA溶液でプレートをブ
ロックした（室温で90分間）。洗浄後、適宜希釈した培
養上清を添加し、室温で60分間放置した。洗浄後、10％
FCSを含むBSF2溶液（100ng/ml）を加え、室温で60分間
放置した。洗浄後、抗BSF2家兎IgG抗体を500ng/mlの濃
度で添加し、室温で60分間放置した。洗浄後、酵素標識
した抗家兎IgGヤギIgG抗体を加え、室温で60分間放置し
た。以後実施例10.と同様に行った。結果を第17図に示
す。pSVLを導入したCos−１細胞の培養上清と比較し
て、pSVL345、及びpSVL324を導入したCos−１細胞の培
養上清中には、MT18抗体とBSF2の両方に結合する物質が
存在することが確認された。
て、MT18抗体、BSF2、及び抗BSF2家兎抗体を用いる方法
を試みた。すなわち、５μg/mlのMT18抗体をマイクロタ
イタープレートの各ウエルに200μづつ添加し、４℃
で一夜放置した。洗浄後、１％BSA溶液でプレートをブ
ロックした（室温で90分間）。洗浄後、適宜希釈した培
養上清を添加し、室温で60分間放置した。洗浄後、10％
FCSを含むBSF2溶液（100ng/ml）を加え、室温で60分間
放置した。洗浄後、抗BSF2家兎IgG抗体を500ng/mlの濃
度で添加し、室温で60分間放置した。洗浄後、酵素標識
した抗家兎IgGヤギIgG抗体を加え、室温で60分間放置し
た。以後実施例10.と同様に行った。結果を第17図に示
す。pSVLを導入したCos−１細胞の培養上清と比較し
て、pSVL345、及びpSVL324を導入したCos−１細胞の培
養上清中には、MT18抗体とBSF2の両方に結合する物質が
存在することが確認された。
さらに培養上清をSDS−PAGE電気泳動にかけてからnit
rocellulose膜にtransblottingした後、MT18抗体を添加
して結合させた。次いでビオチン化した抗マウスIgG抗
体を反応させた後に、Streptavidin−alkaline phospha
se結合物を加えた。最後に基質としてNBT/BCIPを添加
し、酵素反応により発色させた。結果を第18図に示した
が、pSVL324を導入したCos−１細胞の上清中には42Kの
所に、又、pSVL345を導入したCos−１細胞の上清中には
50Kの所にバンドが出現し、それぞれ可溶性レセプター
の存在が証明された。
rocellulose膜にtransblottingした後、MT18抗体を添加
して結合させた。次いでビオチン化した抗マウスIgG抗
体を反応させた後に、Streptavidin−alkaline phospha
se結合物を加えた。最後に基質としてNBT/BCIPを添加
し、酵素反応により発色させた。結果を第18図に示した
が、pSVL324を導入したCos−１細胞の上清中には42Kの
所に、又、pSVL345を導入したCos−１細胞の上清中には
50Kの所にバンドが出現し、それぞれ可溶性レセプター
の存在が証明された。
実施例8,9及び10において発現された蛋白質の予想構
造を第19図に示す。図中BSF2R.236はプラスミドpBSF2R.
236により発現される蛋白質であり、天然BSF2レセプタ
ーに相当する。
造を第19図に示す。図中BSF2R.236はプラスミドpBSF2R.
236により発現される蛋白質であり、天然BSF2レセプタ
ーに相当する。
ΔBSF2R I.1はプラスミドｐΔBSF2R I.1に発現される
蛋白質を意味し、ΔBSF2R II.5はプラスミドｐΔBSF2R.
II.5により発現される蛋白質を意味し、SVL−323はプラ
スミドpSVL−324により発現される蛋白質を意味し、SVL
−344はプラスミドpSVL−345により発現される蛋白質を
意味し、そしてｈβABSF2RはプラスミドphβABSF2Rによ
り発現される蛋白質を意味する。BSF2R.236のみならず
ΔBSF2R.II.5、SVL−323、ｈβABSF2R、及びSVL−344も
BSFRレセプター活性を示すことから、全長型BSF2レセプ
ター蛋白質のＮ末端近傍のアミノ酸配列が除去された短
縮型蛋白質、並びに膜貫通領域及び細胞内蛋白質を含む
Ｃ−末端側のアミノ酸配列が除去された短縮型蛋白質は
なおBSF2レセプター活性を維持することが確認された。
蛋白質を意味し、ΔBSF2R II.5はプラスミドｐΔBSF2R.
II.5により発現される蛋白質を意味し、SVL−323はプラ
スミドpSVL−324により発現される蛋白質を意味し、SVL
−344はプラスミドpSVL−345により発現される蛋白質を
意味し、そしてｈβABSF2RはプラスミドphβABSF2Rによ
り発現される蛋白質を意味する。BSF2R.236のみならず
ΔBSF2R.II.5、SVL−323、ｈβABSF2R、及びSVL−344も
BSFRレセプター活性を示すことから、全長型BSF2レセプ
ター蛋白質のＮ末端近傍のアミノ酸配列が除去された短
縮型蛋白質、並びに膜貫通領域及び細胞内蛋白質を含む
Ｃ−末端側のアミノ酸配列が除去された短縮型蛋白質は
なおBSF2レセプター活性を維持することが確認された。
実施例11. BSF2レセプターに対するマウスモノクロー
ナル抗体の作製 BSF2レセプターに対するマウスモノクローナル抗体を
作製する目的で、免疫原として、ヒトBSF2レセプターを
膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方法で作製
した。すなわち、実施例４に記載したpBSF2R.236及びpS
V2neoをマウスＴ細胞株CTLL−２（ATCC,TIB214）に常法
で導入し、Ｇ−418を用いる通常の方法でスクリーニン
グをし、最終的にBSF2レセプターを細胞あたり約30,000
個発現している株を樹立し、これをCTBC3と名づけた。
ナル抗体の作製 BSF2レセプターに対するマウスモノクローナル抗体を
作製する目的で、免疫原として、ヒトBSF2レセプターを
膜面に発現しているマウスＴ細胞株を以下の方法で作製
した。すなわち、実施例４に記載したpBSF2R.236及びpS
V2neoをマウスＴ細胞株CTLL−２（ATCC,TIB214）に常法
で導入し、Ｇ−418を用いる通常の方法でスクリーニン
グをし、最終的にBSF2レセプターを細胞あたり約30,000
個発現している株を樹立し、これをCTBC3と名づけた。
免疫は以下の様に行った。RPMI1640を用いる通常の方
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６回、腹腔内に免疫した。
法で培養後、PBSバッファーで４回洗浄したCTBC3を、C5
7BL6マウス１匹あたり１×107細胞個、１週間に１回で
計６回、腹腔内に免疫した。
前記免疫されたマウスからの脾細胞を、親株としての
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
ミエローマ細胞系P3U1と、ポリエチレングリコールを用
いる通常の方法に従って融合せしめた。
スクリーニングは以下の様に行った。BSF2レセプター
陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBSF2
R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、BSF2レセプターを細胞あたり約100,000個発現して
いる株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可溶
化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認識
しない抗体を産生しているハイブリドーマが１クローン
単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブリ
ドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT18抗
体と称する。第20図のデーターはMT18抗体がBSF2レセプ
ターを特異的に認識することを示している。この図中Ａ
は、フルオレッセインイソシアネートで標識されたMT18
抗体によりJURKAT細胞を染色した場合に蛍光染色された
細胞の分布を示し、Ｂは前記NJBC8細胞を同様に処理し
た場合の結果を示す。
陰性のヒトＴ細胞株JURKAT（ATCC,CRL8163）に、pBSF2
R.236とpSV2neoを常法で導入し、スクリーニングの結
果、BSF2レセプターを細胞あたり約100,000個発現して
いる株を樹立し、これをNJBC8と名づけた。NP40で可溶
化したNJBC8を認識し、NP40で可溶化したJURKATを認識
しない抗体を産生しているハイブリドーマが１クローン
単離され、これをMT18と名づけた。また、このハイブリ
ドーマによって生産されるモノクローナル抗体をMT18抗
体と称する。第20図のデーターはMT18抗体がBSF2レセプ
ターを特異的に認識することを示している。この図中Ａ
は、フルオレッセインイソシアネートで標識されたMT18
抗体によりJURKAT細胞を染色した場合に蛍光染色された
細胞の分布を示し、Ｂは前記NJBC8細胞を同様に処理し
た場合の結果を示す。
本発明で提供されるBSF2レセプター活性を有する蛋白
質をコードするDNA配列、さらには該蛋白質を遺伝子工
学的に生産するための手段、および方法により、自然状
態では極めて微量にしか生産されないBSF2レセプターを
含めてBSF2レセプター活性を有する種々の蛋白質を大量
に生産することが可能である。また本発明で提供される
BSF2レセプターのアミノ酸配列により、該蛋白質の諸性
質等を推測するなどの行為も可能となる。このことはBS
F2レセプターさらには生体の免疫機構等の研究、または
それらを用いた免疫疾患に対する治療薬診断薬等の開発
等に大きな意義をもつものである。
質をコードするDNA配列、さらには該蛋白質を遺伝子工
学的に生産するための手段、および方法により、自然状
態では極めて微量にしか生産されないBSF2レセプターを
含めてBSF2レセプター活性を有する種々の蛋白質を大量
に生産することが可能である。また本発明で提供される
BSF2レセプターのアミノ酸配列により、該蛋白質の諸性
質等を推測するなどの行為も可能となる。このことはBS
F2レセプターさらには生体の免疫機構等の研究、または
それらを用いた免疫疾患に対する治療薬診断薬等の開発
等に大きな意義をもつものである。
第１図は、本発明のcDNA含有ベクターによりトランスフ
ェクトされた細胞（Ｂ）、ネガティブベクターによりト
ランスフェクトされた細胞（Ａ）、及びcDNA含有ベクタ
ーによりトランスフェクトされた細胞のビオチン化BSF2
による処理を過剰のBSF2の存在下で行った場合（Ｃ）
の、BSF2−ビオチン−アビジンを介して蛍光染色された
細胞における蛍光染色強度に対する細胞の分布を示す。 第２図は、本実施例ではNK細胞YT株から得られたBSF2レ
セプターをコードするDNA配列を含むcDNAの制限酵素地
図を示し、cDNA中の開始コドン（ATG）から終止コドン
（AGA）までの範囲を示す。 第３−１図〜第３−５図は、本実施例でNK細胞YT株から
得られたBSF2レセプターをコードするDNA配列について
その塩基配列を解析した結果、及びこのDNA配列が発現
された場合に生産される蛋白質即ちBSF2レセプターの推
定されるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ末端側の疎
水性アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ末端側の疎
水性アミノ酸部分領域を示す。 第４図は、125I−BSF2の結合実験の結果を示す。各種細
胞のBSF2レセプターの有無とハイブリダイゼーションの
シグナルの有無が一致している。 第５図は、プラスミドｐΔBSF2R I.1の作製過程を示
す。 第６図は、プラスミドｐΔBSF2R II.5の作製過程を示
す。 第７図は、プラスミドpBSF2R.236により形質転換された
細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対する細
胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と同じ
意味を有する。 第８図は、プラスミドｐΔBSF2R I.1により形質転換さ
れた細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対す
る細胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と
同じ意味を有する。 第９図は、プラスミドｐΔBSF2R II.5により形質転換さ
れた細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対す
る細胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と
同じ意味を有する。 第10図Ａ及び第10図Ｂは、プラスミドphβABSF2Rの作製
過程及びその構造を示す。 第11図は、プラスミドphβABSF2Rにより生産される蛋白
質がBSF2に特異的に結合することを示すグラフである。 第12図はプラスミドpSVL345の作製過程を示す。 第13図はプラスミドpSVL324の作製過程を示す。 第14図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清の酵素イムノ
アッセイによる可溶性BSF2レセプター蛋白質の検出結果
を示す。 第15図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物がB
SF2に結果的に結合することを示すグラフである。 第16図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物の
125I−BSF2への結合がBSF2により阻害されることを示す
グラフである。 第17図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物がM
T18抗体及びBSF2の両者と結合することを示すグラフで
ある。 第18図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の上清中の生成物がSDS−
PAGEにより分離しMT18抗体により検出した電気泳動図で
あり、比較のためBSF2レセプター生産細胞U266の細胞溶
解物の結果を併わせて示す。 第19図は、BSF2レセプター蛋白質及びその短縮型蛋白質
の構造を模式的に示す。 第20図は、MT18抗体が、BSF2レセプター産生細胞のみに
結合することを示す細胞分布図である。
ェクトされた細胞（Ｂ）、ネガティブベクターによりト
ランスフェクトされた細胞（Ａ）、及びcDNA含有ベクタ
ーによりトランスフェクトされた細胞のビオチン化BSF2
による処理を過剰のBSF2の存在下で行った場合（Ｃ）
の、BSF2−ビオチン−アビジンを介して蛍光染色された
細胞における蛍光染色強度に対する細胞の分布を示す。 第２図は、本実施例ではNK細胞YT株から得られたBSF2レ
セプターをコードするDNA配列を含むcDNAの制限酵素地
図を示し、cDNA中の開始コドン（ATG）から終止コドン
（AGA）までの範囲を示す。 第３−１図〜第３−５図は、本実施例でNK細胞YT株から
得られたBSF2レセプターをコードするDNA配列について
その塩基配列を解析した結果、及びこのDNA配列が発現
された場合に生産される蛋白質即ちBSF2レセプターの推
定されるアミノ酸配列を示す。下線部分はＮ末端側の疎
水性アミノ酸領域を示し、二重下線部分はＣ末端側の疎
水性アミノ酸部分領域を示す。 第４図は、125I−BSF2の結合実験の結果を示す。各種細
胞のBSF2レセプターの有無とハイブリダイゼーションの
シグナルの有無が一致している。 第５図は、プラスミドｐΔBSF2R I.1の作製過程を示
す。 第６図は、プラスミドｐΔBSF2R II.5の作製過程を示
す。 第７図は、プラスミドpBSF2R.236により形質転換された
細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対する細
胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と同じ
意味を有する。 第８図は、プラスミドｐΔBSF2R I.1により形質転換さ
れた細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対す
る細胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と
同じ意味を有する。 第９図は、プラスミドｐΔBSF2R II.5により形質転換さ
れた細胞COPの蛍光染色における、蛍光染色強度に対す
る細胞の分布を示し、図中A,B及びＣは第１図の場合と
同じ意味を有する。 第10図Ａ及び第10図Ｂは、プラスミドphβABSF2Rの作製
過程及びその構造を示す。 第11図は、プラスミドphβABSF2Rにより生産される蛋白
質がBSF2に特異的に結合することを示すグラフである。 第12図はプラスミドpSVL345の作製過程を示す。 第13図はプラスミドpSVL324の作製過程を示す。 第14図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清の酵素イムノ
アッセイによる可溶性BSF2レセプター蛋白質の検出結果
を示す。 第15図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物がB
SF2に結果的に結合することを示すグラフである。 第16図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物の
125I−BSF2への結合がBSF2により阻害されることを示す
グラフである。 第17図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の培養上清中の生成物がM
T18抗体及びBSF2の両者と結合することを示すグラフで
ある。 第18図は、プラスミドpSVL345又はpSVL324によりトラン
スフェクトされたCos−１細胞の上清中の生成物がSDS−
PAGEにより分離しMT18抗体により検出した電気泳動図で
あり、比較のためBSF2レセプター生産細胞U266の細胞溶
解物の結果を併わせて示す。 第19図は、BSF2レセプター蛋白質及びその短縮型蛋白質
の構造を模式的に示す。 第20図は、MT18抗体が、BSF2レセプター産生細胞のみに
結合することを示す細胞分布図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｖ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＢ 5/00 Ｂ 39/395 15/00 Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願平1−7461 (32)優先日 平１(1989)１月14日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２３２
Claims (30)
- 【請求項１】下記の式（Ｉ）： （ただし、式中Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asn
はアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリ
シン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロ
イシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニ
ルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはトレ
オニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、そして
Valはバリン残基を示す）で表されるアミノ酸配列を有
するか、あるいはこのアミノ酸配列中の１個もしくは複
数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸基により置換されて
おり、そして／又は１個もしくは複数個のアミノ酸が欠
失しており、そして／又は１個もしくは複数個のアミノ
酸が上記アミノ酸配列に付加されているアミノ酸配列を
有し、且つヒトＢ細胞刺激因子２と特異的に結合する能
力を保持していることを特徴とする蛋白質。 - 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列の内、Ｎ−
末端の近傍が欠けているアミノ酸配列を有する請求項１
に記載の蛋白質。 - 【請求項３】下記の式（II）： で表されるアミノ酸配列を有する請求項２に記載の蛋白
質。 - 【請求項４】請求項１に記載のアミノ酸配列の内、Ｃ−
末端部分が欠けているアミノ酸配列を有する請求項１に
記載の蛋白質。 - 【請求項５】下記の式（III）： で表わされるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の蛋
白質。 - 【請求項６】下記の式（IV）： で表わされるアミノ酸配列を有する請求項４に記載の蛋
白質。 - 【請求項７】下記の式（Ｉ′）： （ただし、式中Alaはアラニン、Argはアルギニン、Asn
はアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイ
ン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリ
シン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロ
イシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニ
ルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはトレ
オニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、そして
Valはバリン残基を示す）で表されるアミノ酸配列を有
するか、あるいはこのアミノ酸配列中の１個もしくは複
数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸基により置換されて
おり、そして／又は１個もしくは複数個のアミノ酸が欠
失しており、そして／又は１個もしくは複数個のアミノ
酸が上記アミノ酸配列に付加されているアミノ酸配列を
有し、且つヒトＢ細胞刺激因子２と特異的に結合する能
力を保持していることを特徴とする請求項１に記載の蛋
白質。 - 【請求項８】請求項７に記載のアミノ酸配列の内、Ｎ−
末端の近傍が欠けているアミノ酸配列を有する請求項７
に記載の蛋白質。 - 【請求項９】下記の式（II′）： で表されるアミノ酸配列を有する請求項８に記載の蛋白
質。 - 【請求項１０】請求項７に記載のアミノ酸配列の内、Ｃ
−末端部分が欠けているアミノ酸配列を有する請求項７
に記載の蛋白質。 - 【請求項１１】下記の式（III′）： で表わされるアミノ酸配列を有する請求項10に記載の蛋
白質。 - 【請求項１２】下記の式（IV′）： で表わされるアミノ酸配列を有する請求項10に記載の蛋
白質。 - 【請求項１３】請求項１に記載のいずれかのアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項１４】下記の式（Ｖ）： （ただしＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、
Ｔはチミンを有するヌクレオチドを示す）で表されるDN
A配列を有するか、あるいはこのDNA配列中の１個もしく
は複数個のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換
されており、そして／又は１個もしくは複数個のヌクレ
オチドが欠失しており、そして／又は１個もしくは複数
個のヌクレオチドが上記DNA配列に付加されているDNA配
列を有することを特徴とする請求項13に記載のDNA。 - 【請求項１５】請求項２〜６のいずれか１項に記載の蛋
白質をコードするDNA。 - 【請求項１６】DNAを発現させ得るDNAと読取り可能に結
合していることを特徴とする請求項13〜15のいずれか１
項に記載のDNA。 - 【請求項１７】請求項７に記載のいずれかのアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするDNA。 - 【請求項１８】下記の式（Ｖ′）： （ただしＡはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、
Ｔはチミンを有するヌクレオチドを示す）で表されるDN
A配列を有するか、あるいはこのDNA配列中の１個もしく
は複数個のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換
されており、そして／又は１個もしくは複数個のヌクレ
オチドが欠失しており、そして／又は１個もしくは複数
個のヌクレオチドが上記DNA配列に付加されているDNA配
列を有することを特徴とする請求項17に記載のDNA。 - 【請求項１９】請求項８〜12のいずれか１項に記載の蛋
白質をコードするDNA。 - 【請求項２０】DNAを発現させ得るDNAと読取り可能に結
合していることを特徴とする請求項17〜19のいずれか１
項に記載のDNA。 - 【請求項２１】組換微生物または培養細胞中で請求項13
〜16のいずれか１項に記載のDNAを発現し得る複製可能
な発現ベクター。 - 【請求項２２】組換微生物または培養細胞中で請求項17
〜20のいずれか１項に記載のDNAを発現し得る複製可能
な発現ベクター。 - 【請求項２３】請求項21のベクターにより形質転換され
た微生物又は培養細胞。 - 【請求項２４】請求項22のベクターにより形質転換され
た微生物又は培養細胞。 - 【請求項２５】請求項21に記載の発現ベクターにより形
質転換された微生物または培養細胞を培養してＢ細胞刺
激因子２レセプター蛋白質をコードするDNAを発現させ
該蛋白質を生成させ、これを採取することを特徴とする
Ｂ細胞刺激因子２レセプター活性を有する蛋白質の生産
方法。 - 【請求項２６】請求項22に記載の発現ベクターにより形
質転換された微生物または培養細胞を培養してＢ細胞刺
激因子２レセプター蛋白質をコードするDNAを発現させ
該蛋白質を生成させ、これを採取することを特徴とする
Ｂ細胞刺激因子２レセプター活性を有する蛋白質の生産
方法。 - 【請求項２７】請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛋
白質の少なくともいずれか１つと特異的に結合する抗
体。 - 【請求項２８】請求項７〜12のいずれか１項に記載の蛋
白質の少なくともいずれか１つと特異的に結合する抗
体。 - 【請求項２９】請求項27に記載の性質を有するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ。 - 【請求項３０】請求項28に記載の性質を有するモノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ。
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