KR100382628B1

KR100382628B1 - 인터페론α/β결합단백질과이의제조및용도

Info

Publication number: KR100382628B1
Application number: KR1019950002041A
Authority: KR
Inventors: 바타야코헨; 다니에라노빅크; 메나쳄루벤스타인
Original assignee: 에다 리서치 앤드 디벨럽먼트 컴퍼니 리미티드
Priority date: 1994-02-07
Filing date: 1995-02-06
Publication date: 2004-02-25
Also published as: NO318912B1; KR950032620A; CA2141747C; CN1109505A; EP0676413B1; RU2004106773A; DE69533905T2; JP3670045B2; JP2005200422A; RU2004106774A; DK0676413T3; RU2363705C2; PT676413E; IL108584A0; FI950516A; RU2232811C2; EP0676413A3; RU2362781C2; AU1141695A; FI950516A0

Abstract

본 발명에서 제공된 인터페론 α/β 결합단백질은 인터페론 α와 β의 활성을 조절할 수 있다. 이들 단백질을 인코드하는 DNA 분자 클로닝, 숙주세포에서의 발현, 단백질에 대한 항체를 제공한다.

Description

인터페론 α/β 결합 단백질과 이의 제조 및 용도

발명의 분야

본 발명은 다양한 IFN-α 서브형의 활성을 조절하고 IFN-β 활성을 조절하는 신규한 인터페론-α/β 결합 단백질에 관계한다. 좀더 구체적으로는 본 발명은 이들 단백질을 인코드하는 DNA 분자의 클로닝, 숙주세포에서 이의 발현 그리고 이들 단백질에 대한 항체등에 관계한다.

이스라엘 특허출원 No. 103052 에서는 단클론 항-IFN-α 수용체 항체로 웨스턴 블랏에 의해 확인된 분자량이 45,000 인 가용성 IFN-α 수용체 단백질에 대해 상술하고 청구한다. 이 출원에서는 또한 125I-IFN-α2 교차연결시키고 항-IFN-α 단클론 항체로 면역 침전하여 확인된 분자량이 40,000 인 상이한 가용성 IFN-α 결합단백질에 대해 상술하고 청구한다. 혈청에서 수득할때 이종은 약 50K 의 분자량을 가진다. 이스라엘 특허출원 No. 106591 에서는 균질한 상태에서 뇨에서 수득하고, 다른 공지의 단백질과는 상이한 배열을 가지는 전술한 40,000 IFN-α 결합단백질(이하 "IFNAB-BP" 또는 "IFNAB-BPII")를 상술하고 청구한다. IFNAB-BP 는 다양한 IFN-α 형의 활성을 차단한다. 이에 대해 IFNAB-BP 의 결합특성은 사람 인터페론 알파B에만 상응하는 세포표면 인터페론 수용체의 것과는 상당히 다르다.

본 발명에 따르면 IFNAB-BP 의 전구체를 코딩하는 두개의 cDNA 분자를 클론하고, 그리고 그 서열을 확인하였다. 이는 동일유전자에서 또다른 절단에 의해 유도될 수 있다. 포유류와 다른 숙주세포에서 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII로 지정된 두가지 재조합 단백질의 생산에 대해 상술하고 있다. IFNAB-BP 에 대한 다클론과 단클론항체 그리고 IFN 수용체를 차단시키는데 유용한, IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 의 면역검사와 면역침전에 대해 상술하고 있다.

IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 는 인터페론 α의 다양한 소형태와 인터페론 β와 같은 타입 I 인터페론의 활성을 조절할 수 있다. 따라서 타입I 인터페론의 부작용을 저해시킬 수 있다.

발명의 배경

타입I 인터페론(IFNs)(IFN-α, IFN-β 와 IFN-W)은 바이러스 감염에 대한 저항성을 제공하는 능력에 의해 통상적으로 정의되는 구조적으로 관련된 사이토킨으로 구성된다. 타입 I IFNs 의 많은 다른 생물학적 활성은 세포증식의 저해, MHC I 항원유도와 몇가지 다른 면역-제어활성(1)의 유도를 포함한 것이 보고되었다. IFN-α 와 IFN-β 는 감염-C (2,3)와 바이러스 워트(4,5)와 모발세포 백혈병(6), 만성 골수발생 백혈병(7)와 카포시 육종(8)과 같은 특정 악성종양을 포함한 몇가지 바이러스 질환의 치료에 유용하다.

IFN-α는 조직적 낭창 홍반(9)과 AIDS 환자(10)와 같은 자가 면역질환을 가지는 다양한 환자의 혈청에서 감지된다. IFN-α 는 청소년 당뇨병(11)의 진행에 연루되어 있다. 마이크로글리아에서 IFN-γ 의 증가된 발현은 알즈마이어 질환에 공헌되는 것으로 보고된다 (51). 또한, IFN-α 치료요법은 몇가지 경우에 발열과 신경성 질환(12)을 포함하는 부작용을 유도한다. 여기에서 IFN-α 활성의 중화는 환자에게 유익한 것으로 나타났다.

다른 사이토킨의 경우에, IFN-α 는 모든 IFN-α 서브타입과 IFN-β (13)에 특이적인 세포 표면 수용체에 결합함으로써 이의 생물학적 활성을 나타낸다. 사람 IFN-α 수용체(IFNAR) 을 확인하고 Daudi 세포(14)에서 클론시킨다. 클론된 수용체는 하나의 막통과 도메인 세포와 세포내 도메인으로 구성된다. 쥐세포에서 발현될 경우 이의 수용체는 사람 IFN-α β에 반응성이 있으나 다른 IFN-α 와 IFN-β 중에는 중요하지 않으며 이는 추가성분이 IFN-β 와 다양한 IFN-α 서브타입의 반응성에 관계된다.

몇가지 다른 연구에서 IFN-α 와 IFN-β(15-17)의 결합과 연관된 추가성분 또는 수용체 소단위가 있음을 나타낸다. 또한, 이미 상술한 수용체(14)는 모든 IFN-α 와 IFN-β 종(18)의 결합에 연관된다.

사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)는 세포표면 사이토킨 수용체의 세포의 리간드 결합 도메인에 상응한다. 이는 세포 표면수용체의 pre-mRNA 절단 또는 세포표면 수용체의 단백질 분해성 절단에 의해 유도될 수 있다. 이와 같은 가용성 수용체는 IL-6 와 IFN-γ 의 가용성수용체(19-21), INF(22-24), IL-1(25-27), IL-4(25,28), IL-2)29,30), IL-7(31)와 IFN-알파(32)를 포함하여 이미 상술되었다.

발명의 요약

본 발명은 공지의 IFN-α/β 결합단백질(IL106591)을 인코드 하는 DNA 분자를 제공한다. 이와 같은 DNA 분자는 실제로 두개의 단백질 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 를 인코드하는데 이는 다른 방식의 절단에 의해 동일한 pre-mRNA 에서 유도되어 두개의 mRNA 준자를 만드는데 하나는 1.5kb, 또다른 하나는 4.5kb 크기가 되며 각각은 결합단백질의 하나를 인코드하는데 1.5kb mRNA 는 IFNAB-BPI 을 인코드하고 4.5kb mRNA 는 IFNAB-BPII 를 인코드한다. IFNAB-BP 는 IFNAB-BPI 과 IFNAB-BPII 에 상응한다. 뇨 IFNAB-PB 는 IFNAB-BPII 로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 IFNAB-BPI, IFNAB-BPII 융합 단백질 그리고 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 의 돌연변이 단백질, 이의 기능적 유도체와 활성단편에서 선택된 IFN-α/β 결합단백질을 인코드하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명은 상기 DNA 분자를 포함하는 복제가능한 발현벡터, 이를 포함하는 형질전환된 숙주 그리고 형질변환된 숙주에 의해 생산된 단백질을 제공한다. "DNA 분자"에는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 와 이의 복합체를 포함한다.

본 발명은 엄격한 조건하에 상기 DNA 분자에 하이브리드하고 IFNAB-BPs 로써 동일한 생물학적 활성을 가지는 단백질을 인코드하는 DNA 분자를 제공한다.

본 발명은 기능적 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 융합된 단백질, 뮤테인 또는 이의 활성단편을 생산할 수 있는 숙주세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 재조합 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII, 융합된 단배질, 뮤테인 또는 이의 활성단편 그리고 이들의 염, IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII, 융합된 단백질, 뮤테인, 이의 활성단편 또는 염을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.

IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 는 자연 사람 백혈구와 섬유아세포 인터페론 그리고 재조합 사람 IFN-α2, IFN-αβ, IFN-αC 와 IFN-β 의 생물학적 활성을 저해한다. IFNAB-BPI 은 리간드-결합 IFN-α/β 수용체인 신규한 막통과 단백질에 상응한다. IFNAB-BPII 는 가용성 수용체로써 특히 세포의 IFNAB-BPI 의 리간드 결합 도메인에 상응한다.

도면의 설명

제1도에서:

(A) 중간줄 : 뇨 40,000 IFNAB-BP 에서 수득한 중간 CNBr 펩티드(27 아미노산 잔기, cb7)의 서열이다.

위와 아래줄 : 합성센스(위)와 안티센스(아래), 변성 올리고핵산 혼합물은 역전사효소(안티센스 중합효소)와 PCR 을 이용하여 펩티드 서열에 기초하여 만든다.

(B) 센스와 안티센스 프라이머로 만든 PCR 생성물의 아가로스겔 전기영동이다. 다음의 RNAs 와 프라이머는 PCR 의 주형으로 사용되는 cDNA 를 만드는데 사용한다: (1) 폴리 A + RNA (도우디세포), 인티센스 프라이머. (1) 폴리 A + 도우디세포 RNA, 올리고 d(T) 프라이머, (3) WISH 세포의 tRNA 안티센스 프라이머, DNA 마커의 크기(dp)는 좌측에 표시한다.

(C) 상측줄 : 101bp PCR 산물의 pBlue스크립트 클론에서 수득한 서열의 비변성부위이다.

아래줄 : 펩티드 cb7 의 서열의 일부(9-20)인 예상서열로 생성 비-변성 DNA 서열의 해독.

제2도에서 이와 같은 클론은 도면1(C)의 비-변성 DNA 서열에 상응하는 합성된 올리고핵산으로 선별하여 사람 Hela 세포의 cDNA에서 만들어진 람다 gt11 라이브러리에서 분리한 것이다. 뇨 IFNAB-BP 의 N-단부와 이의 CNBr 펩티드에 상응하는 서열을 밑줄을 하고 이에 상응하는 서열이름은 밑줄아래에 표시한다(n1, N-단부 1; n2, N-단부 2; cb3, CNBr 펩티드 3; cb6, CNBr 펩티드 6; cb7, CNBr 펩티드 7).

시그날 펩티드와 막통과 도메인(tm)에 상응하는 소수성 서열은 두줄을 그었따. 우측의 굵은 문자는 아미노산 잔기수이다. 보통수는 핵산에 상응하는 것으로 No. 1 와 같이 ATG 에 A 에서 시작한다.

제3도에서 IFNAB-BPI 의 핵산 218-614 에 상응하는 397 bp 프로브는 무작위 프라이머 라벨링에 의해 라벨된 32P 와 적절한 프라이머로 PCR 에 의해 준비된다. 사람 다우디 세포에서 폴리 A + RNA 는 아가로스(1.5%)에서 전기영동하고, 니트로셀룰로오스에 블랏시키고 특이 프로브로 하이브리드한다. rRNA 의 크기는 우측에 표시하였다.

제4도에서 단일 문자 코돈의 아미노산 잔기는 해독-개시코돈에서 시작하여 굵은숫자로 표시하였다. 소수성 리더와 막통과 부분은 밑줄을 한다. 뇨 IFNAB-BP N-단부 단백질 서열(코돈27부터)와 중간 CNBr 펩티드는 점선 밑줄해 놓았다(그러나 Cys 와 N-글리코실화된 Asn 잔기는 감지되지 않음). N-글리코실화 시그날은 * 해놓고 폴리아데닐화 시그날은 두줄로 표시해놓았다.

제5도에서 단일 문자 코돈의 아미노산 잔기는 해독-개시코돈에서 시작하여 굵은숫자로 표시하였다. 소수성 리더와 막통과 부분은 밑줄을 한다. 뇨 IFNAB-BP N-단부 단백질 서열(코돈27부터)와 중간 CNBr 펩티드는 점선 밑줄해 놓았다(그러나 Cys 와 N-글리코실화된 Asn 잔기는 감지되지 않음). N-글리코실화 시그날은 * 해놓고 폴리아데닐화 시그날과 종료 코드는 * 해놓는다.

제6도에서:

(A) PCR 에 의해 IFNAB-BPI 의 세포의 리간드-결합 도메인을 인코드하는 DNA 를 만드는데 센스와 안티센스 합성 올리고핵산이 사용된다.

(B) 클론 g10의 센스와 안티센스 프라이머로 만들어진 PCR 의 ~850bp 생성물의 겔 전기영동.

(C) 가용성 IFNAB-BPI 의 생성을 위한 포유류 발현벡터인 pEF-BOS-sABR 의 구조.

제7도에서 다양한 세포에서 IFNAB-BPI 의 발현은 변성 세포추출물의 SDS-PAGE(7.5% 아크릴아미드, 비-변성조건)을 하고, 토끼 항 IFNAB-BPII 항체와 125I-단백질 A 로 면역블랏팅시킨다. 클론 369.11 은 IFNAB-BPI 을 발현하는 NIH-3T3 세포이고; 클론 470.6 은 IFNAR 을 발현하는 NIH-3T3 세포이고; 클론 508.12 는 두 단백질을 모두 발현시킨다. 콘트를 NIH-3T3 세포와 사람 도우디 세포로 나타낸다. IFNAB-BPI 의 51KDa형(쥐세포)와 102KDa형 (도우디세포)를 화살표로 나타낸다. 분자량 마커는 좌측에 표시한다.

제8도에서:

(A) IFNAB-BPI 을 발현하는 NIH-3T3 세포(클론 369.11, ■)와 IFNAB-BPI 와 IFNAR(클론 508.12, ●) 그리고 IFNAR 만을 발현하는 세포의 결합력이 부족한 (클론 470.6, △)을 나타낸다. (B) 전술한 세포의 125I-IFN-α2-결합의 분석. 다음세포는 높은 친화성 포화결합을 나타낸다. 사람 도우디세포(△),IFNAB-BPI-양성세포(클론 369.11, ●)와 IFNAR와 IFNAB-BPI(■)을 발현하는 클론 508.12

제9도에서는 IFN-α는 센서칩에서 고정시키고 다양한 농도의 뇨 IFNAB-BPII를 센서칩으로 통과시킨다. "시간에 대한 반응"은 결합과 분해과정을 나타낸다. 분해상수는 3.12x10-*9M 이다.

제10도에서는 순수한 뇨 IFNAB-BPII는 지적한 농도로 연속하여 2배 희석시키고, mab 항-IFNAB-BPII 항체로 미리 코팅된 마이크로 ELISA 플레이트에 첨가한다. 플레이트는 토끼 항 IFNAB-BPII 항체와 반응시키과 염소 항-토끼 양고추냉이 과산화효소 공액과 ABTS/H2O2 기질과 반응시킨다. 플레이트는 405/630nm 에서 읽는다. 감지의 최저한계는 30pg/ml 이다.

발명의 설명

이스라엘 특허출원 106591 에 따르면 분자량이 40,000 인 IFN-α/β 결합 단백질(IFNAB-BP)은 두가지 크로마토그래프 단계에 의해 뇨에서 분리시킨다. 뇨단백질은 아가로즈에 결합된 IFN-α2 컬럼에 얹는다. 컬럼은 비-관련 단백질을 제거하기 위해 세척하고, 결합 단백질은 낮은 pH 에서 용출시킨다. 용출된 단백질은 크기별 분리 HPLC 에 의해 해상시켜 몇가지 단백질 피크가 나타나고 이중 하나는 125I-IFN-α2 와 특이적으로 결합하고, IFN-α 와 -β의 항바이러스 활성을 차단하는 능력이 있다. 이 단백질은 N-단부 마이크로서열 분석하여 특정화하고 이의 N-단부의 주요서열은 다음과 같다:

Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg.

주서열에 상응하는 상기서열의 N단부에 3개의 추가 아미노산 잔기(Ile-XXX-Tyr)을 가지는 폴리펩티드 부서열이 감지된다(XXX 는 미확인 a.a). 생성서열은 공지된 IFN-αβ 수용체의 것과 비교하여 완전히 상이함을 밝혔다(14). 또한 다른 공지 단백질과도 상이했고 그리고 FastA 프로그램을 사용하여 Swissprot 와 Genebank data libraries 의 것과 비교하여 공지된 서열에 의해 코드되지 않음을 밝혔다.

뇨 IFNAB-BP 의 시료는 CNBr 로 분해시키고 SDS-PAGE 에서 분리하고 PVDF 막에 전기블랏시킨다음 생성분해 단편은 단백질 마이크로 서열화시킨다. 이들 단편중 하나는 분자량이 10K 이하이고, 중간서열은 다음과 같다. Met 는 실제서열 앞에 있다:

Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu-Gly-Ile (27 residues).

이와 같은 중간서열은 적절한 제한효소 부위를 첨가할 수 있는 센스와 안티센스 프라이머로 역 전사시킬 수 있다. tRNA 는 사람세포에서 정제시키고 그리고 프라이머로써 안티센스 올리고 헥산 혼합물 또는 올리고 d(T)를 사용하여 역전사효소로 제1가닥 cDNA 를 합성한다. 3% 아가로스 겔에서의 PCR 산물은 특이적 101bp 올리고핵산 밴드를 나타낸다. 이 DNA 는 제한효소 절단시키고, pBluescript(Stratagene)으로 클론시키고, 대장균에 이 벡터를 감염시킨다. 몇가지 독립 클론은 서열화시킨다. 센스와 안티센스 변형 프라이머에 인접한 서열은 불변하며, 뇨 IFNAB-BP의 전술한 CNBr 펩티드(cb7)에서 예상서열을 인코드한다. 비-변성 중간서열에 상응하는 올리고핵산은 합성하고, 단부 라벨시켜 cDNA 라이브러리의스크린에 사용한다.

사람 HeLa 세포의 람다 gt11 cDNA 라이브러리 선별은 몇가지 양성클론을 제공한다. 이들 클론중 하나인 g10 은 하나의 펩티드인 세포의 도메인 막통과 도메인과 짧은 세포혈장 도메인에 상응하는 오프리딩 프레임을 가진다. 뇨 IFNAB-BP 에서 수득한 펩티드 서열은 g10 에 인코드된 세포의 도메인내에 모두 존재한다. 펩티드 서열의 몇가지 아미노산 잔기는 단백질 서열화 기술의 한계(주로 Cys 확인능력의 부족과 Ser 에 상응하는 피크의 크기가 적음)로 인하여 부정확하다.

클론 g10 의 핵산 219-613 의 단부에 상응하는 헨스와 안티센스 프라이머(도면2)는 DNA 주형으로 클론 g10 을 이용하여 PCR 에 의해 특이적 프로브를 준비하는데 이용된다. 생성 DNA 는 32P 로 라벨시키고 두가지 사람 세포주에서 폴리 A+ mRNA 의 노던 블럿 하이브리드에 사용된다. 두가지 경우에 두가지 특이적 밴드가 나타나는데 하나는 1.5kb mRNA 에 상응하고, 다른 하나는 4.5kb mRNA 에 상응한다. 1.5kb mRNA 의 주요 해독산물은 IFNAB-BPI 전구물질로 지정한다. 4.5kb mRNA 의 주요 해독산물은 IFNAB-BPII 전구물질로 지정한다.

전술한 특이적 프로브는 추가의 사람 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 사용되고 cDNA 클론 두집단이 확인되었다. 한집단(약 20개 클론)은 길이가 1.5kb 로써 클론 g10 에 의해 인코드된 막통과 단백질의 동일한 전구물질을 코드한다. 제2집단(2개의 개별클론)은 길이가 4.5kb 이다. 이들 크기는 두개 mRNA 종의 것과 동일하고 따라서 1.5kb cDNA 클론은 IFNAB-BPI 을 인코드하고 4.5kb cDNA 클론은 IFNAB-BPII 를 인코드한다. 4.5kb 클론의 서열화에서 클론 g10 의 코돈 1-239 에상응하는 절단된 가용성 수용체의 전구체를 인코드하는 것으로 나타난다. 그러나 코돈 238과 239는 상이하고 이다음에는 종료코돈이 있다. 뇨 40,000 IFNAB-BP 의 c-단부 단백질 서열분석에서 마지막 두개 아미노산 잔기에 의해 결정될때 4.5kb cDNA 에 의해 인코드되어 뇨 IFNAB-BP 는 IFNAB-BPII 로 확인되었다. 여기에서 사용된 "전구물질"은 단일 펩티드를 포함하는 주요 해독 산물로써 확인된다.

IFNAB-BPI 의 절단형 가용성 형태의 전구물질에 대한 DNA 코딩은 PCR 에 의해 발생된다. 생성된 PCR 산물은 포유류 발현 백터내로 삽입되고 이는 원숭이 COS 세포와 같은 다양한 포유류 세포의 전이감염에 사용된다. 이와 같은 세포는 생물학적 활성 재조합 가용성 IFNAB-BPI 다량이 발현된다.

유사하게 IFNAB-BPII 의 전구물질에 대한 DNA 코딩도 PCR 에 의해 발생된다. 생성된 PCR 산물은 포유류 발현 벡터내로 삽입하고 원숭이 COS 세포와 같은 다양한 포유류 세포의 전이 감염에 사용된다. 이와 같은 세포는 생물학적 활성 재조합 IFNAB-BPII 다량을 발현시킨다.

유사하게, IFNAB-BPI 의 전체 전구물질에 대한 DNA 코딩은 PCR에 의해 발생된다. 생성된 PCR 산물은 포유류 발현벡터내로 삽입하고 쥐 NIH-3T3 세포와 같은 다양한 포유류 세포의 전이감염에 사용된다. 이와 같은 세포는 사람 IFNAB-BPI 을 다량 발현시킨다. 세포는 사람 IFN-α2 에 높은 친화력 (kd=3.6x10-9M)로 결합한다. 사람 IFNAB-BPI 와 이전의 클론된 사람 IFN-α2 수용체 IFNAR(14)는 쥐 NIH-3T3 세포에서 공동 발현될때 성분 수용체의 친화력은 약 10배 증가한다(Kd=4x10-10M). 대조적으로 사람 IFNAR 은 쥐세포에서 발현되어 사람 IFN-α2 의 결합이 설명되지 않는다. 따라서 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 의 리간드 결합 도메인을 가지는 제1폴리펩티드와 IFNAR 의 세포의 도메인을 가지는 제2폴리펩티드를 가지는 조성 단백질은 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-PBII 단독의 것과 비교하면 IFN-α 의 높은 친화력을 나타낸다.

사람 IFN-α2 에 대한 뇨 IFNAB-BPII 의 친화력이 BIAcore 시스템(Pharmacia, Sweden)에 의해 결정된다. IFN-α2 는 센서칩에 고정시키고, IFNAB-BPII 에 결합을 허용한다. Kon 와 Koff 값에 기초하여 Kd 3.12x10-9 M 값을 얻는다. 이값은 IFNAB-BPI 을 발현시키는 NIH-3T3 세포에서 얻은값과 매우 유사하다.

전술한 클로닝, 클론분리, 확인, 특징화와 서열화 과정은 다음의 실시예에서 상술한다.

IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 는 대장균과 같은 원핵세포 또는 CHO, 이스트 또는 곤충세포와 같은 진핵세포의 재조합 세포에 의해 생성될 수 있다. IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 를 인코드하는 DNA을 가지는 적절한 벡터의 제조와 재조합 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII 를 생산하기 위해 곤충세포에 감염 또는 형질도입(가령 대장균과 이스트 세포) 방법은 공지되어 있다(Ausubel et al., eds. "Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols, 1993; and Sambrook et al., eds. "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989).

본 발명은 IFNAB-BPI 과 -BPII 의 활성단편과 활성돌연변이 단백질에 관계하고, 인터페론 α/β 수용체를 공유하는 다른 사이토킨 또는 IFN-α, -β의 생물학적 활성을 차단시키는 유사 능력을 나타내고, 또다른 폴리펩티드 또는 단백질에 융합된 야생형 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 또는 이들의 활성 돌연변이 또는 활성단편으로 구성되 융합된 단백질에 관계한다.

IFNAB-BPI 또는 -BPII 이들의 활성단편, 돌연변이 단백질 또는 융합된 단백질과 작동식으로 연결된 전사와 해독 시그날을 인코드하는 DNA 는 숙주세포 염색체내로 소요의 유전자 서열을 결합시킬 수 있는 진핵세포 벡터내로 삽입된다. 숙주 염색체내로 도입된 DNA 가 안전하게 결합된 세포를 선별하기 위해 발현 벡터를 포함하는 숙주세포 선별을 위한 하나이상의 표식이 사용된다. 표식은 영양요구성 숙주에 대한 원영양성, 항생제와 같은 살균저항성 또는 구리등의 중금속 저항성을 제공한다. 선택성 표식은 발현될 또는 도입될 DNA 유전자 서열에 직접 연결되어 동세포에 동시 감염된다. 단일 사슬 결합 단백질 mRNA 의 적절한 합성에 다른 요소가 필요할 수 있다. 이들 요소는 절단시그날과 전사프로모터, 강화제와 종료시그날(34)을 포함한다.

IFNAB-BPI, -BPII 단백질, 이의 활성 단편 또는 유도체를 발현시키기 위한 목적으로 선택된 세포내로 유도될 DNA 분자는 수용숙주내로 자가 복제할 수 있는 라스미드 또는 바이러스 벡터내로 삽입되는 것이 적절하다.

특정 플라스미드 또는 바이러스 벡터 선택에 중요한 인자는; 벡터를 수용하는 수용세포의 인지와 벡터를 포함하지 않는 세포의 선택이 용이해야 하고; 특정 숙주내에서 원하는 정도의 벡터가 복제해야 하고; 상이한 종의 숙주세포 사이에서벡터를 "이동" 시킬 수 있는지 등이 포함된다. 적절한 원핵베터에는 복제가능한 플라스미드 가령, 대장균의 pBR322, ColE1, pSC101, pACYC184 (35); 바실러스 플라스미드 pC194, pC221, pT127 (36); 스트렙토마이세스 플라스미드 pIJ101 (37), 스트렙토마이세스 박테리오파아지 C31 (38)와 슈도모나스 플라스미드 (39,40)등이 포함된다.

적절한 진핵 플라스미드에는 BPV, 백시니아, SV40, 2-아미크론 서클등이 포함된다. 이와 같은 플라스미드는 공지되어 있다(41-45).

발현을 위해 구조를 포함하는 벡터 또는 DNA 서열이 준비되면 발현벡터는 형질도입, 전이감염, 리포펙션, 결합, 원형질융합, 전기적 투여, 인산칼슘침전, 직접적인 주입등과 같은 적절한 방법에 의해 적절한 숙주내로 도입된다.

본 발명에 사용되는 숙주세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 적절한 원핵숙주에는 대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스, 슈도모나스, 살모넬라, 세라티스등과 같은 박테리아가 포함된다. 가장 적절한 원핵세포 숙주는 대장균이다. 특히 관심이 있는 박테리아 숙주는 대장균 K12 균주 294(ATCC 31446), 대장균 X1776(ATCC 31537), 대장균 W3110(F-, 람다-, 빛요구성 (ATCC 27325)), 그리고 살모넬라 티피뮤리움 또는 세라티아 나르세시스와 다양한 슈도모나스 종과 같은 다른 내장 박테리아등이 포함된다. 이와 같은 상황하에서 단백질은 글리코실화되지 않는다. 원핵숙주는 레플리콘과 발현 플라스미드의 콘트롤 서열과 상응한다.

그러나 IFNAB-BPI, -BPII 가 글리코실화된 단백질이기 때문에 진핵숙주가 원핵숙주 보다 적절하다. 적절한 원핵세포 숙주는 사람, 원숭이, 쥐 그리고 CHO 세포와 같은 포유류 세포인데 그 이유는 정확한 꼬임, 정확한 이황화결합 형성, 정확한 부위에서의 글리코실화를 포함하는 단백질에 후 해독 변형을 제공하기 때문이다. 또한 이스트 세포와 곤충세포는 만노스 글리코실화가 높은 후-해독 펩티드 변형을 실행할 수 있다. 강력한 프로모터 서열과 다수의 플라스미드를 이용한 재조합 DNA 전력이 있는데 이는 이스트와 곤충세포에서 소요의 단백질을 생산하는데 이용될 수 있다. 이스트세포는 클론된 포유류 유전자 산물에서 리드서열을 인지하고 리드서열을 가지는 펩티드를 배출한다. 벡터도입후에 숙주세포는 벡터를 포함하는 세포성장을 선택하는 선택성 배지에서 성장시킨다. 클론된 유전자 서열의 발현은 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 융합단백질 또는 돌연변이 단백질 또는 이의 활성단편의 생성결과이다. 발현된 단백질은 분리시켜, 추출, 침전, 크로마토그래피, 전기영동 또는 컬럼내에 포함된 겔 메트릭스에 고정시킨 항-IFNAB-BPI 단클론 항체를 이용하여 친화력 크로마토그래피와 관련된 통상의 과정에 의해 정제될 수 있다. 상기 재조합 IFNAB-BPI 또는 -BPII, 이의 활성 단편 또는 유도체를 포함하는 준비물이 불순물이 통과하는 동안에 특이적 항체에 의해 컬럼에 결합될 수 있다. 세척후에, 단백질은 이 목적을 위해 이용된 조건 가령, 높은 또는 낮은 pH, pH 11 또는 pH 2 하에서 겔로부터 용출시킨다.

여기에서 사용된 "돌연변이 단백질(muteins)"은 IFNAB-BPI, -PBII 의 유사체로써 고유의 활성에 상당한 변화없이 고유 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성부분의 아미노산 잔기중 하나이상의 상이한 아미노산으로 대체되거나 또는 결실되거나 또는 고유 IFNAB-BPI, -BPII 의 서열에 첨가되는 것을 말한다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 또는 부위 직접적인 돌연변이 기술 또는 다른 공지의 적절한 수단에 의해 만들어질 수 있다.

이와 같은 뮤테인은 IFNAB-BPI, -BPII 와 이의 활성부분에 유사한 활성을 가지도록 IFNAB-BPI, -BPII 의 아미노산에 충분히 반복되는 아미노산 서열을 가진다. IFNAB-BPI 와 -BPII 의 활성중 하나는 자연 사람 백혈구 세포와 섬유아세포 인터페론과 같은 하나이상의 타입I 인터페론 그리고 재조합 사람 IFN-α2, -αβ, -C 와 IFN-β 에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 하나이상의 이와 같은 인터페론에 결합하는 능력을 보유하는한, 친화력 크로마토그래피 수단에 의해 인터페론의 정제에 사용될 수 있고, 따라서 IFNAB-BPI, -BPII 에 유사한 활성을 가지는 것으로 본다. 따라서 이와 같은 뮤테인이 방사능 면역검사 또는 ELISA 검사와 같은 적절한 라벨된 인터페론에 결합하는지를 결정하기 위한 간단한 샌드위치 경쟁검사에 뮤테인이 해당되는지 실험하여 IFNAB-BPI 또는 -PBII 와 동일한 합성을 가지는지를 결정한다. 이 테스트는 타입I 인터페론의 몇가지 종으로 반복시키고 이때 IFNAB-BPI-BPII 의 충분한 활성을 보유하는 타입I 인터페론에 결합하는 뮤테인은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 의 이용을 가지고 따라서 이와 유사한 활성을 가진다.

구체예에서, 이와 같은 뮤테인은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 의 서열고 적어도 40% 동일하거나 유사하다. 적절하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 가장 적절하게는 90%의 동일성을 가진다.

IFNAB-BPI 또는 BPII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 활성부분 또는 이를 인코드하는 핵산의 뮤테인은 본 발명에 따라 이용될 수 있는데 이때 핵산은 폴리펩티드에 상응하는 서열이 된다(Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; and Creightoon, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983), 코돈과 같은 핵산서열 치환은 Ausubel et al. supra, at SS A.1.1-A.1.24, and Sambrook et al, supra, at Appendices C and D에 제시되어 있다.

본 발명에 따른 뮤테인에서 적절한 변화는 "보존성" 치환으로 공지된 것이다. IFNAB-BPI, -BPII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 활성부분의 보존 아미노산 치환은 분자의 아미노산 기능을 보호할 수 있도록 아미노산 기사이의 치환이 유사한 생화학적 특징을 보유하도록 집단내에 유사아미노산으로 된다(Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974). 아미노산의 삽입과 결실은 이들 기능의 변화없이 전술한 서열에서 만들 수 있는데 특히 삽입 또는 결실이 일부 아미노산 가령, 30개 이하 적절하게는 10개 이하로 관계하고, 이는 기능적으로 중요한 아미노산 가령 시스테인의 제거 또는 치환이 없는 것이다(Anfinsen, "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp. 223-230 (1973). 이와 같은 삽입 또는 결실에 의해 생성된 단백지리과 뮤테인은 본 발명의 목적내에 포함된다.

적절하게는 동류 아미노산은 표1과 같이 정의한다. 더 적절하게는 동류 아미노산은 표2와 같이 정의한다. 그리고 가장 적절하게는 표3과 같다.

본 발명에 따라 이용하기 위한 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 활성부분의 뮤테인을 수득하기 위해 사용되는 단백질에서 아미노산 치환물 생성의 예로는 공지 방법 단계가 포함되는데 가령 미국특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585 및 4,737,462, to Mark et al; 5,116,943 to Koths et al., 4,965,195 to Namen et al; 4,879,111 to Chong et al; and 5,017,691 to Lee et al; and 리신 치환 단백질 US patent No. 4,904,584 (Shaw et al).

본 발명에 또다른 구체예에서 IFNAB-BPI, -BPII 또는 이의 활성부분의 뮤테인은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 에 기본적으로 상응하는 아미노산 서열을 가진다. "기본적으로 상응하는"은 고유단백질의 기본특징에 영향을 주지않고 따라서 자연형 인터페론 수용체에 타입I 인터페론이 현장 결합하는 것을 저해시키는 고유단백질의 서열에 최소의 변화를 가지는 단백질로 이해된다. "기본적으로 상응하는"내에 포함되는 일반적인 변화는 이들 단백질을 인코드하는 DNA 의 통상적인 돌연변이 기술에서 나타나며, 이는 최소한의 변화로 전술한 것과 같이 소요의 활성을 선별하는 것이다.

본 발명에 따른 뮤테인에는 엄격한 조건하에 본 발명의 IFNAB-BPI, -BPII 를인코드하는 DNA 또는 RNA 에 하이브리드하는 DNA 또는 RNA 와 같은 핵산에 의해 인코드된 단백질이 포함된다. 본 발명은 소요의 핵산의 확인과 정제에 프로브 유용한 핵산을 포함한다. 또한 이와 같은 핵산은 본 발명의 IFNAB-BPI 또는 -BPII 의 기능활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드하는지를 결정하는데 프라임으로 사용될 수 있다. "엄격한 조건"은 통상의 기술분야에서 하이브리드화와 연속한 세척조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, NY, SS6.3 and 6.4 (1987, 1992), and Sambrook et al., supra). 제한없이 엄격한 조건의 예로는 하이브리드의 계산된 Tm 아래에서 12-20℃ 세척조건을 포함하는데 가령 2xSSC 와 0.5% SDS 5분, 2xSSC 와 0.1% SDS 15분; 0.1xSSC 와 0.5% SDS 68℃ 30-60분이 된다. 본 기술에 통상의 기술을 가진자는 이와 같은 엄격한 조건이 DNA 서열, 올리고핵산 프로브(10-40 염기) 또는 혼합된 올리고핵산 프로브의 길이에 따라 달라짐을 이해할 것이다. 혼합형 프로브가 이용되는 경우에 SSC 대신에 테트라메틸 암모니움 클로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 적절하다.

"융합된 단백질"은 IFNAB-BPI 또는 BPII 또는 이의 활성부분 또는 체액에 잔류시간이 연장된 또다른 단백질과 융합된 것으로 구성된 폴리펩티드를 말한다. IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성부분은 이뮤노글로블린 또는 이의 단편등의 또다른 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 유사체와 융합될 수 있다.

여기에서 "염"은 IFNAB-BPI, -BPII 이의 활성부분, 뮤테인 또는 이외 융합된 단백질의 아미노기의 산첨가염 그리고 카르복시기의 염을 의미한다. 카르복시기염은 공지기술의 수단으로 형성될 수 있는데 가령, 나트륨, 칼슘, 암모니움, 철 또는아연염과 같은 무기염이 포함되고 그리고 유기염기로 형성된 염 가령 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인등과 같은 아민염이 포함된다. 산첨가염에는 가령, 염산 또는 황산과 같은 미네랄산의 염 그리고 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산염이 포함된다.

물론 이와 같은 염은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성부분에 유사한 활성을 가진다.

여기에서 사용하는 "기능적 유도체"는 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성부분 그리고 이의 뮤테인과 융합된 단백질의 유사체를 포함하는데 이는 공지의 기술을 이용하여 잔기 또는 N 또는 C 단부기의 곁사슬에서 있는 기능기에서 만들어질 수 있고 그리고 제약학적으로 수용가능한 발명에 포함되는데 가령 IFNAB-BPI, -BPII 에 유사한 단백질 활성을 파괴시키지 않고 그리고 이를 포함하는 조성물의 독성특징을 제공하지 않는다. 가령, 이들 유도체는 항원부위를 차단하고, 체액에서 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성부분의 잔기를 연장시키는 폴리에틸렌 글리콜 곁사슬이 포함된다. 또다른 유도체에는 암모니아 또는 1차 또는 2차아민과의 반응에 의한 카르복시기 아미드, 카르복시기 지방족 에스테르, 아실부분과 형성된 자유 하이드록시기의 0-아실 유도체(가령, 세릴 또는 트레오닐 잔기) 또는 아실부분(가령 알카노일 또는 카르보사이클 아로일기)와 형성된 아미노산 잔기의 자유 아미노기의 N-아실 유도체등이 포함된다.

IFNAB-BPI 또는 -BPII 돌연변이와 융합된 단백질의 "활성 부분"으로써 본 발명은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 당 또는 인산유도체에 연결된 분자 또는 전술한단백질 분자의 응집체를 포함하는 단백질 분자 또는 융합된 단백질의 전구체 또는 단편을 포함하나 단 이 단편에는 IFNAB-BPI 또는 -BPII 에 대한 유사한 활성을 가진다.

본 발명은 제약학적으로 수용가능한 담체와 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 활성 뮤테인, 융합된 단백질 그리고 이의염, 기능적 유도체 또는 이의 활성부분으로 구성된 제약학적 조성물에 관계한다.

본 발명은 IFNAB-BPI 또는 -BPII 또는 이의 유도체, 생리학적으로 수용가능한 담체 그리고 안정제 또는 부형제를 혼합하여 약량 바이알에서 냉동건조에 의해 적합한 형으로 투여할 수 있도록 준비한다. 투여방법은 유사물질의 투여방식으로 실시될 수 있으나 이는 치료될 상황에 따라 달라질 수 있는데 가령 정맥내, 근육내, 피하내, 국소 또는 국부주사 또는 주입에 의해 실시할 수 있다. 투여될 활성 조성물의 량은 투여경로, 치료할 질병 그리고 환자의 상태에 따라 달라질 수 있는데, 가령 국소주사의 경우 정맥주사보다는 체중에 기초하여 더 적은 량의 단백질이 요구된다.

이스라엘 특허출원 No. 106591 에서 언급된 것과 같이, IFN-α/β 결합단백질(또는 IFNAB-BPII)는 IFN-α2, -αβ, -αC 와 -β 의 항바이러스 활성을 저해시키고 IFN-γ 의 활성을 저해시키지는 않는다. 이는 IFNAB-BPI 와 BPII 가 타입 I IFN 결합단백질을 의미한다. 따라서, 이들은 타입 I 당뇨병, 다양한 자가면역 질환, 이석거부, AIDS, 유사질병과 같은 IFN-α 부형태와 IFN-β 의 생물학적 활성을 차단시키거나 또는 조절시키는데 유용한데 가령, IFN-α 또는 IFN-β 의 내생 생산또는 외부 투여와 같은 조건에서 IFNAB-BPI 와 -BPII 와 같은 것이 사용될 수 있다.

따라서, IFNAB-BPI 와 -BPII, 이의 활성부분, 뮤테인, 융합된 단백질 그리고 이의 염, 기능적 유도체 그리고 이의 활성부분은 자가면역 질환, 포유류에서 염증, 인터페론 α 또는 β의 투여에 의한 독성치료, 청소년 당뇨병 또는 낭창홍반 또는 AIDS 등의 치료를 나타낸다.

전술한 것과 같이, 본 발명의 단백질은 타입 I 인터페론종의 정제와 같은 비-치료요법적 이용성을 가진다.

본 발명은 IFNAB-BPI, -BPII 이들의 돌연변이 융합된 단백질, 염, 기능적 유도체 그리고 활성부분에 대한 항체를 포함한다.

여기에서 "항체"는 용해된 또는 결합형으로 라벨된 항체에 다클론성 항체, 단클론성 항체(Mabs), 키메라항체, 항-인자형 (항-Id) 항체와 펩티드 합성, 효소절단 또는 재조합 기술과 같은 공지기술에 의해 준비된 이의 활성부분이 포함된다.

다클론 항체는 항원이 고정된 동물 혈청에서 유도한 이형발생 집단 항체 분자이다. 단클론 항체에는 항원에 특이적인 동형 발생 집단항체를 포함하고, 이 집단에는 유사한 에피토프 부위를 포함하고 있다. MAbs 는 공지의 방법으로 수득할수 있다.

이와 같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgE, IgA, GILD 와 이의 부집단을 포함하는 이뮤노글로블린 집단이 될수 있다. 본 발명의 Mab 를 생산하는 하이브리도마는 생체 또는 시험관에서 배양할 수 있다. 생체내에서 높은 역가의 Mabs 의 생산은 본 발명에 있어서 적절한 생산방법이 된다.

키메라 항체는 쥐 Mab 와 사람 이뮤노글로블린 동일부위에서 유도한 가변부위를 가지는 상이한 종에서 유도된 상이한 부분을 가지는 분자이다, 키메라 항체는 생산량은 증가시키고 면역성은 감소시키는데 이용되는데 가령, 쥐 Mabs 는 하이브리도마에서 더많이 생산되나 사람에서는 더큰 면역성을 나타내는 사람/쥐 키메라Mabs 가 사용될 수 있다. 키메라 항체의 생산방법은 공지되어 있다.

항-인자형(항-Id) 항체는 항체의 항원결합 부위와 일반적으로 연관된 독특한 항원 결정부위를 인지하는 항체이다. Id 항체는 항-Id 를 만들때 Mab 의 원으로써 유전자형(가령 쥐균주)와 동종동물에 면역화하여 만들 수 있다. 면역화된 동물은 이들 유전형 결정인자에 대한 항체를 생산함으로써 면역화된 항체의 유전형 결정부위를 인지하고 반응한다. 미국특허 4,699,880 에 상술되어 있다.

항-Id 항체는 소위 항-항-Id 항체를 생산하는 또다른 동물에서 면역반응을유도하기 위한 "면역원"으로 이용될 수 있다. 항-항-Id 는 항-Id 를 유도하는 고유 Mab 와 동일하다. 따라서 Mab 의 유전형 결정부위에 대한 항체를 이용하여 동일한 특이성의 항체를 발현하는 다른 클론을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 IFNAB-BPI, -BPII 와 관련 단백질에 대한 Mabs 는 BALB/c 쥐와 같은 적절한 동물에서 항-Id 항체를 유도하는데 이용될 수 있다. 면역화된 쥐에서 쥐라세포는 항-Id Mabs 를 분비하는 항-Id 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한 항 Id Mabs 는 KLH 와 같은 담체에 결합되어 추가의 BALB/c 쥐를 면역화시키는데 사용될 수 있다. 이들 쥐로부터의 혈청에는 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII 에피토프에 대한 공유 Mab 특이적인 결합 특징을 가지는 항-항-Id 항체를 포함한다.

항-Id Mabs 는 IFNAB-BPI 또는 -BPII 와 같은 고유의 유전자 결정부위 또는 결정부위와 유사한 "유전형"을 가진다.

여기에서 "항체"는 항원에 결합할 수 있는 fab 와 F(ab')2 와 같은 활성단편과 고유분자를 모두 포함한다. Fab 와 F(ab')2 단편은 고유항체의 Fc 단편이 부족하여 순환시에 더빨리 제거되고 그리고 고유항체보다 비-특이적 조직 결합을 한다(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983).

본 발명에 유용한 Fab 와 F(ab')2 그리고 항체의 단편은 IFNAB-BPI, -BPII 그리고 고유 항체 분자를 위해 공지된 방법에 따른 관련 단백질의 정량과 감지에 유용하다. 이와 같은 단편은 파파인(Fab 단편 생산) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생산)과 같은 효소를 이용하여 단백질 분해성 절단에 의해 생성된다.

항체는 "결합가능한" 분자로 이야기되는데 항체에 분자를 결합시키기 위해 분자와 특이적으로 반응한다. "에피토프"는 항체에 의해 인지되고 이 항체가 결합할 수 있는 특정 분자의 부분을 의미한다. 에피토프 또는 "항원 결정부위"는 통상적으로 아미노산 또는 당곁사슬과 같은 분자의 화학적 활성 표면 집단으로 구성되고, 3차구조 특징과 특이적 전하를 가진다.

"항원"은 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체생산을 동물에서 유도할 수 있는 항체가 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 하나이상의 에피토프를 가진다. 특이적 반응은 다른 항원에 의해서는 야기되지 않는 항체와의 매우 선택적으로 반응하는 것을 의미한다.

본 발명에 유용한 항체의 단편을 포함하는 항체는 본 발명의 단백질을 발현시키는 세포의 존재를 감지하거나 또는 시료내에 IFNAB-BPI, -BPII 또는 관련 단백질을 정량적으로 감지하는데 사용된다. 이는 광현미경, 흐름 혈구계산기 또는 형광감지기가 결합된 형광라벨된 항체(하기)를 이용하는 면역형광 기술에 의해 실시된다.

본 발명에 유용한 항체(또는 이의 단편)은 본 발명의 IFNAB-BPI, -BPII 와 관련 단백질의 감지를 위한 면역형광 또는 면역전자 현미경으로 사용될 수 있다. 현장감지는 환자에서 조직적 시료를 떼어내고 이와 같은 시료에 본 발명의 라벨된 항체를 제공하여 실시된다. 항체(또는 단편)은 생물학적 시료에 라벨된 항체(또는 단편)을 제공하거나 덮음으로써 가능하다. 이와 같은 과정을 통하여 IFNAB-BPI, BPII 또는 관련 단백질의 존재와 검사된 조직에서 이의 분포를 확인할 수 있다. 본발명을 이용하여 본 발명에 숙지된 자는 현장감지를 실행하기 위해 이와 같은 방법에 변화가 있을 수 있음을 인지할 것이다.

본 발명의 IFNAB-BPI, -BPII 또는 관련 단백질의 검사는 공지된 기술을 이용하여 IFNAB-BPI, -BPII 또는 관련 단백질을 확인하고, 항체를 감지하는 능력이 있는 감지가능한 라벨된 항체존재하에 조직배양물에서 배양된 세포 또는 임파세포 또는 백혈구세포와 같이 새로 수득한 세포, 조직추출물, 생물학적 유체와 같은 생물학적 시료를 배양하는 것으로 구성된다.

생물학적 시료는 니트로셀룰로오스와 같은 고형상 서포트 또는 담체 또는 세포, 세포입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고형상 서포트 또는 담체로 처리될 수 있다. 서포트 또는 담체는 본 발명에 따라 적절한 완충액으로 세척후에 적절한 감기 가능한 라벨된 항체처리한다. 고형상 서포트 또는 담체는 결합안된 항체를 제거하기 위해 두번째 완충액으로 세척한다. 고형상 서포트 또는 담체에 결합된 라벨량은 통상의 수단에 의해 감지할 수 있다.

"고형상 서포트", "고형상 담체", "고형 서포트", "고형 담체" 또는 "서포트" 또는 "담체"는 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있는 서포트 또는 담체를 의미한다. 공지된 서포트 또는 담체로는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 아밀라제, 천연과 변형된 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드와 가브로스와 마그네타이트등이 포함된다. 담체의 특징은 본 발명의 목적에 맞게 가용성 또는 비가용성일 수 있다. 서포트 물질은 실제로 결합된 분자가 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있는한 가능한 구조모양을 가진다. 따라서, 서포트 또는 담체모양은비드와 같이 구형 또는 테스트 튜브의 내면 또는 막대의 외면과 같은 실린더형이 된다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 스트립과 같이 편평할 수 있다. 적절한 서포트 또는 담체에는 폴리스티렌 비드가 포함된다. 본 기술에 숙지된 자는 항체 또는 항원의 결합을 위한 다른 적절한 담체를 알고 있으며 또는 이는 동일실험에 이용될 수 있음도 인지할 것이다.

본 발명에 따라 주어진 양의 항체 결합활성은 공지된 방법에 따라 결정된다. 본 기술에 숙지된자는 지속적인 실험을 이용하여 각 결정에서 적절한 검사조건을 결정할 수 있다.

세척, 교반, 혼합, 여과와 같은 단계는 특정상황에 필요한 또는 습관적인 검사에 추가할 수 있다.

본 발명에 따라 라벨된 항체를 감지하는 방법은 효소에 항체를 연결시키고 효소 생검(EIZ)에 이용하는 것이다. 이 효소가 적절한 기질에 노출된후에는 분광광도계적, 형광측정 또는 눈으로 확인하는 등의 화학적 부분을 감지하기 위한 이와같은 방식으로 기질과 반응할수 있다. 항체에 감지가능한 라벨로 이용될수 있는 효소에는 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 핵산분해효소, 델타-5-스테로이드 이성화 효소, 이스트 알코올 탈수소효소, 알파 글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 인산 이성화효소, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 인산화효소, 아스파라기나제, 포도당 산화효소, 베타 갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 촉매효소, 포도당-6-인산 탈수소효소, 글루코아밀라제와 아세틸콕린에스테라제등이 포함되나 이에 한정시키지 않는다. 감지는 효소에 대한 발색성 기질을 이용하는, 발색성 방법에의해 가능하다. 감지는 비슷하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응 정도를 눈으로 비교하여 실행할수 있다.

다른 면역검사를 이용하여 감지할수 있다. 가령, 항체 또는 항체단면의 방사능활성 라벨에 의해 RIA를 이용하여 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII를 감지할수 있다. RIA의 설명은 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) with particular reference to the chapter entitled "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" by Chard, T.에 상술되어 있다. 방사능 활성 동위원소는 r-카운터 또는 신틸레이션 카운터 도는 자가방사를 이용하여 감지할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 형광 화합물을 이용하여 라벨시킬수 있다. 형광 라벨된 항체를 적절한 파장의 광에 노출시킬때 이의 존재는 형광물질로 인하여 감지될수 있다. 가장 흔히 이용되는 형광 라벨된 화합물은 플로로레신 이소시오시아네이트, 로도마인, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데이드와 플로로카민등이 된다.

항체는 125Eu와같은 형광 발생 금속 또는 다른 란탄족을 이용하여 감지가능하도록 라벨시킬수 있다. 이와같은 금속은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (ETPA)와 같은 금속 킬레이트기를 사용하여 항체에 부착될수 있다.

항체는 바이오틴을 결합시켜 라벨시킬수 있다. 바이오틴화된 항체는 형광 화합물 또는 과산화효소와 같은 효소 또는 방사능활성 동위원소 그리고 이의 유사체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타아비딘에 의해 감지될수 있다.

항체는 화학적발광 화합물에 결합시켜 감지할수 있다. 화학적 발광물이 붙은 항체의 존재는 화학적 반응과정 동안에 발생하는 발광물 존재의 감지에 의해 결성된다. 특히 유용한 발광물질로는 루미놀, 이소루미놀, 테로메틱 아크리디니움 에스테르,이미다졸, 아크리디니움 염과 욜살레이트 에스테르등이 된다.

유사하게, 생물학적 발광화합물은 본발명의 항체를 라벨하는데 사용될수 있다. 생물학적 발광물질은 화학적 발광반응의 효과를 증가시키는 촉매 단백질이 되는 생물학적 시스템에서 발견되는 것이된다. 화학적 발광물의 존재는 발광물의 존재를 감지하여 결정한다. 라벨목적의 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시페라제, 에이퀴로린이된다.

본 발명의 항체분자는 "두부위" 또는 "샌드위치 검사"와 같이 공지된 면역량적 검사의 이용에 이용되기에 적합하다. 일반적인, 면역광적 검사에서 라벨안된 항체의 양은 고형서포트 또는 담체에 결합되고, 감지가능한 라벨된 가용성 항체량은 고형상 항체, 항원 그리고 라벨된 항체사이에 형성된 4차 복합체의 감지와 적량을 위해 첨가될수 있다.

일반적으로 그리고 적절하게는 면역량적 검사에는 "전방" 검사로써 고형상에 결합된 항체는 테스트할 시료와 1차적으로 접촉시키고 이중 고형성 항체-항원 복합체의 형성에 의해 항원-시료형을 추출한다. 적절한 배양 시간뒤에 고형상 담체는 반응안된 항원을 포함하여 유체 시료 잔류물을 제거하기위해 세척하고, 그다음 미지양의 라벨된 항체를 포함하는 용액과 첩촉시킨다 (라벨된 항체는 "리포터 분자로기능한다). 라벨안된 항체를 통하여 고형 서포트 또는 담체에 결합된 항원과 라벨된 항체와의 복합체 형성을 허용하기위해 제2 배양기간후에 고형 서포트 또는 담체는 라벨안된 항체를 제거하기 위해 2회 세척한다.

"샌드위치" 검사의 또다른 형태로는 본 발명의 항원으로 유용하며, 소위 "동시" 그리고 "역" 검사가 이용될수 있다. "동시" 검사는 고형 서포트 또는 담체에 결합된 항체와 라벨된 항체는 동시에 테스트할 시료에 첨가하는 한단계 배양 과정과 관계한다. 배양이 완료된 뒤에 고형상 서포트 또는 담체는 유체 시료 잔유물과 복합체 형성안된 라벨된 항체를 제거하기위해 세척한다. 고형상 서포트 또는 담체와 연관된 라벨된 항체의 존재는 통상적인 "전방" 샌드위치 검사로 결정할수 있다. "역" 검사에서 유체시표에 라벨된 항체의 용액의 제1 첨가 다음에 적절한 배양시간뒤에 고형 서포트 또는 담체에 결합하는 라벨안된 항체의 첨가이다. 제 2 배양뒤에, 고형상은 반응안된 라벨된 항체용액과 테스트할 시료의 잔유물을 제거하기 위해 통상적인 방식으로 제거할 수 있다. 소형 서포트 또는 담체와 연관된 라벨된 항체의 결정은 "동시" 그리고 "전방" 검사로써 결정할수 있다.

본 발명은 전술한 것과 같이, 본 발명의 단백질을 인코드하는 DNA분자를 제공하는데, 이와같은 DNA분자로 구성된 복제 가능한 발현벡터, 진핵세포와 원핵세포, 적절하게는 원숭이 COS세포를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포등도 제공한다.

본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 세포의 배양과 DNA분자에 의해 인코드된 단백질을 회수하고 그리고 형질전환된 숙주세포내에 발현벡터를 회수함으로써본 발명의 단백질을 생산하는 과정을 포함한다.

본 발명은 다음의 실시예에 따라 설명하나 이에 한정시키지 않는다.

실시예 1: 뇨 IFNAB-BP의 단백질 서열분석

이스라엘 특허출원 106591에서 상술한것과 같이 수득한 순수한

본 출원인은:

IFNAB-BP는 PVDF막 (Prospin, Applied Biosystems, USA)에 흡수시키고 막은 Model 475 마이크로시퀀서 (Applied Biosystems, USA)에서 단백질 서열분석한다. 다음과 같은 주요 서열이 벌어진다.

또한 주서열의 N단부에서는 3개의 추가 아미노산 진기 (Ile-xxx-Tyr)가 있는 2차 폴리 펩티드가 감지된다 (xxx는 미확인 아미노산이다). 생성 서열은 이미 공지된 IFN-αβ수용체 (IFNAR, 14)와는 완전히 다르며 그리고 다른 공지 단백질과도 상이하다. 그리고, 공지된 DNA서열에 의해 코드되는 다른 단백질과도 상이하다 (Swissprot and Genebank databases by the program FastA (33)). 이 단백질이 신규한 IFN-α 결합 단백질이다. cDNA클론의 분리시에 10번은 Cys이고 Arg이 아니며 15번은 Arg이 아닌 Ser이 분명하다 또한 xxx는 Ser으로 확인되었다. Cys는 단백질 마이크로시퀀서에 의해 확인되지 않고 때때로 Ser는 분석과정에서 파괴되어 확인되지 않는다.

다른 목적BP의 시료는 CNBr로 분해시키고, SDS-PAGE로 해리하고 그리고 PVDF막에 블랏시킨다. cb1 - cb7인 7개 분명한 펩티드 밴드는 코마시 블루로 착색하여 막에서 감지된다. 각 밴드는 절단하고 단백질 마이크로 시퀀싱한다. 이중 하나인 cb7은 10,000 보다는 적고 다음과 같은 중간 서열을 가진다. (Met이 실제 서열에 앞서있다).

또다른 펩티드 cb3은 다음과 같다 (Met이 실제 서열에 앞에 있다).

13번 잔기는 Cys으로 확인되었다. Cys는 단백질 아미크로씨퀀싱에 의해서는 확인되지 않는다.

또다른 펩티드 cbb은 다음과 같다 (Met이 실제 서열앞에 있다).

4번 잔기는 Asn으로 확인되었다. Asn잔기는 강력한 글리코실화 시그날 서열 (Asn-Phe-Thr)의 일부이고, 단백질 서열에서 Asn 시그날이 없음을 글리코실화된것을 나타낸다.

다른 펩티드밴드는 CNBr로 불완전한 절단 산물로써 서열화에 의해 확인되었다. 이는 IFNAB-BP에서 발견된 N-단부 도메인 서열 또는 cb3, cbb 또는 cb7의 동일한 내서열이다.

실시예 2: 뇨 IFNAB-BP의 c-단부 펩티드의 단백질 서열분석

뇨 IFNAB-BP 시료 (0 ug)은 DTT에 의해 환원시키고, 인도아세크아미드로 알킬레이트시키고 효소대 기질의 비가 1:50에서 내단백질 분해효소 Lys C (Boehringer Mannheim, Germany)로 절단시킨다. 생성된 펩티드 혼합물은 0.1% 트리플로로아세트산에서 아세토니트릴 농도를 이용하여 RP-HPLC로 해리시킨다. 개별 펩티드 피크는 Sequalon AA막 (Millipore, Bedford MA)에 공유적으로 부착시키고 그리고 전술한 것과같이 N-단부 시퀀스시킨다. 펩티드중 하나가 다음과 같은 서열을 가지는 C-단부 펩티드로써 확인되었다.

C-단부서열은 4.5kb cDNA클로에 상응하고 (하기와 같이) 그리고 마지막 두개 아미노산 (Ser-Ala 대신에 Phe12-Ser13)에 의해 1.4kb cDNA에 의해 인코드된 단백질의 것과는 구분된다. 뇨에서 분리된 가용성 수용체는 IFNAB-BPII로써 확인되었다. 특이적인 4.5kb mRNA에서 독립적으로 해독되고, 세포-표면 수용체의 쏟음에 의해 형성되지는 않는다.

실시예 3: 변성 센스와 안티센서 프라이머 제조와 IFNAB-BP c-DNA의 비-변성서열 확인

펩티드 cb7의 서열은 센스 (아미노산1-8)와 안티센스 (아미노산27-20) 프라이머로써 역-해독될수 있다. BamH HI과 Sal 앤도핵산분해 효소 서열을 각각 포함하는 데카뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드는 프라이머 올리고핵산의 5' 단부에 첨가한다 (도면 1A) 총 RNA는 도우디와 WISH 세포에서 추출하고 제 1가닥 cDNA는 안티센스 올리고뉴클레오티드 혼합물 또는 프라이머로써 올리고 d(T)를 이용하여 역전사효소로 만든다. 생성된 cDNA단편은 복합된 센스와 안티센서 프라이머를 이용하여 PCR에서 증폭될수 있다. 3% 아가로스 겔에서 PCR 산물의 분석에서는 예상된 101BP밴드가 도우디가 WISH세포의 cDNA에서 수득됨을 나타내었다 (도면 1B). 101bp 단편은 BamH I와 Sa1 I으로 절단하고 pBluescript II KS+ 에 클론시키고 5클론을 서열화시킨다. 센스와 안티센스에 인접한 부위는 불변하고 펩티드 cb7의 아미노산 잔기 9-19의 예상서열을 인코드한다 (도면 1C). 비-변성내 서열에 상응하는 36bp 올리고핵산은 합성하고 그리고 cDNA 라이브러리의 스키리닝에 이용된다.

실시예 4: IFNAB-BPI의 부분적인 cDNA 클론의 확인

실시예 2의 합성된 35bp 비-변성 올리고핵산은 [32P] 라벨시켜 사람 HeLa 세포의 람다 gt11 cDNA 라이브러리의 스크린에 이용된다 (Clontech). 다섯개의 양성 클론이 확인되었다. 이들 클론중 q10을 1.4kb 삽입체를 포함한다. 수득된 클론 q10의 서열은 시그날 펩티드, 세포의 도메인, 막통과 도메인 그리고 세포내 도메인 일부로 확인된 오프 리딩 프레임을 가지는 서열을 생산한다 (도면 2). 뇨 IFNAB-BP의 세게 INBr 펩티드 cb3, cb6, cb7의 서열과 N-단부 단백질 서열을 인코드하는 DNA 서열이 클론 q10의 DNA에 의해 코드되는 세포의 도메인내에서 확인되었다. 일부 Cys와 Ser 잔기 (점선, 도면 2)는 단백질 서열화에 의해 정확하게 확인되지는 않는다. 그러나, 단백질 서열화에 사용된 방법은 모든 cys를 부르는 것이 아니고 때때로 Ser 잔기를 잃을수도 있다. 펩티드 cb6에서 Asn이 감지되지 않음은 이미 글리코실화 되었다는 것을 나타낸다. Genebank database로 클론 q10의 DNA 서열비교에서는 공지된 서열의 어떤것과도 동일하지 않았다. 따라서 이클론은 신규 DNA 서열을 포함한다.

실시예 5: 사람 mRNA의 노던 블랏팅

방사능 라벨된 DNA 프로브는 클론 q10에서 준비되고, Daudi와 WISH의 두가지 사람 세포주로부터 폴리 A+ mRNA의 노던 블랏 하이브리드에 사용되었다. 두 경우에서 두가지 특이적 밴드가 관찰되는데 하나는 1.5kb, 나머지 하나는 4.5kb mRNA는 4.5kb mRNA의 양에 두배가 된다. WISH 세포에서 RNA로 수득된 시그날이 보기 힘들고, Daudi 세포에서의 RNA 시그날은 감지된다. 1.5kb mRNA은 세포 표면 인터페론 수용체인 IFNAB-BPI의 전구체로 해독된다. 긴 mRNA는 IFNAB-BPI과 적어도 100개 아미노산을 공유하는 상이한 단백질을 코드하는 상이한 전사체를 나타낸다. 단백질을 IPNAB-BPII의 전구체이고 이는 인터페론 α/β 수용체의 용해된 형이된다.

실시예 6: IFNAB-PII, -BPII의 완전한 cDNA클론의 확인

파지 hpCEV9에서 만들어진 사람 단세포 cDNA 라이브러리 (Gutkind, J. S.,et al., Molec. Cell, Biol. 11, 1500-1507, 1991)는 클론 q10의 코딩부위에서 PCR에 의해 397bp 프로브로 스크린한다. 105kb 삽입체가 있는 22 클론과 4.5kb 삽입체가 있는 2개 클론을 106개 파아지에서 분리하였다. 두개 1.5kb 클론 (hpCEV9-m6와 hpCEV9-m27)의 서열분석이 실행된다. 1.5kb 클론은 331 코드의 오픈 리딩프레임과 세포표면 수용체인 IFNAB-BPI의 완전한 전구체를 인코드한다 (도면 4). 뇨 IFNAB-PI (접선, 도면 4)에서 수측한 단백질과 CNBr 펩티드 서열은 해독된 DNA 서열내에서 모두 확인되었다. 두개 4.5kb 클론의 부분적인 서열화에서는 1.5kb 클론에 동일한 5' 237 코돈이 있고 이어서, 코돈 239 뒤에 종료서열이 포함된 상이한 서열이 나타난다 (도면 5). 또한, 다음의 코돈이 상이하다; 코돈 13(His 대신에 Leu); 코돈 108(Ile 대신에 Thr) 그리고 코돈 238-240 (Ser-Ala-Ser대신에 Phe-Ser stop). 4.5kb 클론에 세개의 리딩프레임중 종로코돈을 넘어선 오픈 리딩 프레임은 볼수 없다. 4.5kb cDNA클론은 뇨에서 분리한 C-단부 서열과 동일한 IFNAB-BPII인 절단된 가용성 수용체의 전구체를 코드한다. IFNAB-BPI와 -BPII의 전구체 단백질을 코드하는 두개 mRNA는 동일한 유전자에서 아마도 상이한 절단에 의해 유도된 것이다.

실시예 7: 재조합 가용성 IFNAB-BPI와 -BPII의 포유류 발현 벡터 제조와 생산

IFNAB-BPI의 시그날 서열과 세포의 도메인을 코드하는 DNA는 주형으로 q10 DNA를 이용하고 Xba I 제한효소부위 (도면 6A)가 있는 VENT DNA 중합효소 (Stratagene)으로 PCR에 의해 발생된다. 생성된 PCR 산물(도면 6B)는 Xba I으로 절단시키고, 벡터 PEF-BOS 발현 벡터에 연결시켜 pEF-BOS-IFNAB-BP-I (도면 6C, 56)을 만들다. 이 구조는 DNA 서열화에 의해 확인된다. 컴피턴트 대장균은 형질전환되고 IFNAB-PII 서열을 가지는 클론은 불리한다. pEF-BOS-SABR구조는 원숭이 COS세포의 전이 감염에 사용된다. 이들 세포는 세포 배양 상층액에서 멀어지는 12 nb/ml 재조합 가용성 IFNAB-BPI으로 발현되고 이는 ELISA와 사람 인터페론 알파와 베타의 생물학적 활성 (항 바이러스성) 활성을 저해시키는 능력에 의해 확인한다. 분석시에, 4.5kb 클론에 IFNAB-BPII을 인코드하는 DNA부분은 포유류 발현 벡터내로 삽입하고 이는 IFNAB-BPI의 세포의 도메인을 설명하고 세포의 형질변환에 사용된다. 이와같은 세포는 세포의 배양배지로 분비되는 활성 IFNAB-BPII를 생산한다.

실시예 8: 쥐세포에서 진핵세포 발현벡터의 제조와 IFNAB-BPI와 IFNA의 발현

IFNAB-BPI의 전체를 코드하는 DNA는 주형으로 플라스키드 pCEV9-m6을 이용하고 그리고 Xba I 제한효소를 가지는 합성 센스와 안티센스 프라이머를 이용하여 VENT DNA 중합효소(Stratagene)으로 PCR에 의해 만든다. 생성된 PCR 생성물은 Xba I 으로 절단하고, 발현벡터 pEF-BOS로 연결하고 pEF-BOS-IFNABR을 만든다. IFNAR에 상응하는 cDNA에 의해 특이적 올리고핵산을 사용하여 RT-PCR (48)에 의해 만든다. 증폭된 생성물은 발현 벡터의 pEF-BOS의 Xba I 제한효소로 클론시켜 pEF-BOS-IFNAR을 만든다. 이구조는 DNA 서열화에 의해 확인된다. 컴피턴트 대장균은 형질전환되고 IFNAB-BPI와 IFNAR 선열을 가지는 클론을 분리하였다.

적절한 방식으로 클론된 IFNAB-BPI cDNA를 발현시키는 쥐세포를 발생시킨다. 지수적으로 성장된 NIH-3T3세포 (1.5X10⁶/ 10cm 플레이트)는 pSV2neo (2 ㎍), pEF-BOS-IFNABR (10㎍ DNA)로 인산칼슘 침전 방법(49)으로 공동 전이감염 시킨다. 독립적인 G418-저항 클로니는 확인하고 부-클론시킨다. 다량의 IFNAB-BPI을 발현하는 클론은 뇨 IFNAB-BPI에 대한 항체 결합과 125I-IFN-α 결합에 의해 확인된다 (표 IV).

항 IFNAB-BPII 항체 결합에서 세포 (1X10⁶)은 35mm웰에 접종시키고 (6웰 플레이트, Costar)그리고 서로 접하도록 배양시킨다 (20시간). 세포는 2% FBS와 0.1% 소륨 아지드 (Wash medium)을 포함하는 DMEM으로 세척하고 20분간 Wash 배지로 배양시킨다. 토끼 항-IFNAB-BPII 항체 (2ml, 1:500/wash medium)은 세척된 세포에 첨가하고 세포는 실온에서 2시간 배양한다. 세포는 3회 세척시키고 125I-단백질 A (2ml, 250,000 cpm/Wash medium)을 첨가히키고 45분간 추가 배양시킨다. 세포는 3회 세척하고 트림신으로 처리한다음 헤아린다.

125I-IFN-α2의 결합을 위해, 세포 (1x106)을 35mm웰 (6웰 플레이트, Costar)에 접종시키고, 접하도록 성장시킨다 (30시간). 세포는 2% FBS와 0.1% 소듐 아지드를 포함하는 DMEM으로 세척하고 20분간 Wash 배지로 배양시킨다. 125I-IFN-α2(2-3x105 cpm, 108u/mg, 5x107 cpm/ug)을 첨가하고 실온에서 2시간 배양시킨다. 세포는 3회 세척시키고, 트립신 처리후 카운트한다.

포지티브클론 (클론 369.11)의 계면활성제 추출물의 비-환원 조건하에 SDS-PAGE와 전술한 항체로 이뮤노블랏팅하면 약 51kDa의 강한 밴드가 나타난다 (도면 7).

IFNAR을 발현시키는 쥐세포는 플라스미드 pEF-BOS-EFNAR로 감염시켜 만든다. 클론 470.6은 IFNAR-포지티브로써 이들 세포에 항-바이러스 븐응을 효과적으로 유도하는 huIFN-β의 능력으로 결정한다. 기대한것과 같이, 다른형 IFNs I (huIFN-β)는 클론 470.6에서는 활성이 없었다.

IFNAB-BPI와 IFNAR을 발현하는 클론 369.11와 470.6은 상호적인 수용체 단백질 (pEF-BOS-IFNAR와 pEF-BOS-IFNABR)로 감염시킨다. 안정된 공 발현을 위해서 IFNAR 또는 IFNAB-BPI을 발현하는 G418-저항 클론은 상기와 같이 pEF-BOS-IFNABR 또는 pEF-BOS-IFNAR와 항체 pSV2hygro (2 ug)으로 감염시킨다. IFNAR와 IFNAB-BPl을 공동발현 시키는 하이그로마이신과 G418-저항성 클론은 분리하고 서브클론시킨다. 클론 369.11에서 유도된 IFNAR-포지티브 클론은 huIFN-α β의 결합에의해 확인된다. 클론 369.11에서 유도된 IFNAR-포지티브 클론은 huFIN-αβ의 항바이러스 반응에의해 확인하고, 클론 470.6에서 유도된 IFNAB-BPI-양성클론은 항 IFNAB-BPII 항체와 125I-IFN-α2의 결합에의해 확인된다. 클론 369,11에서 유도된 클론 508.12와 470.6에서 유도된 클론 1306은 125I-IFN-α2와 IFN-α/βR 항체 모두에 결합한다 (표 IV). 또한, 항바이러스 검사에서 huIFN-αB에 반응한다. 따라서 이들 클론은 IFNAB-BPI와 기능적 IFNAR을 발현시킨다는 결론을 얻는다.

실시예 9: 쥐세포에서 발현 또는 IFNAB-BPI와 IFNAR의 친화력 결정

IFNAR 또는 IFNAB-BPl을 발현하는 클론은 125I-huIFN-α2의 결합을 위해 검사하고 그리고 결합 데이타는 스케차트 분석에 의해 평가한다. 세포 (1x10 )는 35mm웰에 접촉하고 (6웰 플레이트 (Costar) 20시간동안 성장시킨다. 세포는 2% FBS와 0.1% 소듐 아지트 (Wash medium)을 포함하는 DMEM으로 세척하고 동일 배치로 20분간 배양시킨다. 125I-IFN-α2(2-3CX10 cpm, 10 u/mg, 5x10 cpm/ug)을 라벨안된 IFN-α2의 지정 농도와 함께 첨가하여 실온에서 2시간 동안 지속적으로 배양시킨다. 세포는 Wash배치로 3외 세척시키고 트립신으로 처리후 카운트한다. 결합 데이타는 LIGAND 프로그램에 의해 분석한다(50).

IFNAR만을 발현하는 세포 (클론 470.6)은 125I-IFN-α2의 특이적 결합을 나타내지 않으며 (도면 8A) 따라서, 예상 결합 부위의 Kd값이 유도되지 않았다. 클론470.6와는 대조적으로 고친화성, 특이적 포화 결합은 IFNAB-BPI만을 발현하는 세포 (크론 369.11)에서 얻어진다. 이 결합의 Kd는 23 C에서 3.6x10 M이다 (표 V).

508.12 세포 (IFNAB-BPI와 IFNAR의 발현)에 대한 125I-IFN-α2 결합은 스캐챠트 분석에 의해 평가되고 그 결과는 클론 369.11 (IFNAB-BPI만을 발현)의 것과 비교한다. IFNAB-BPI와 IFNAR의 공동 발현시에 포화 결합이 얻어지고 IFN-α2의 친화력은 도우디 세포에서 수용체의 것 (Kd=4.0x10 M vs. 1.6x10 M 각각 표 V)에 근접한 IFNAB-α2의 친화력이 약 10배 증가된다. 이 결과는 IFNAR와 IFNAB-BPI이 리간드 결합에 협력한다는 것을 나타낸다.

실시예 10. 뇨 IFNAB-BPII의 친화력 결정.

사람 IFN-α2는 제조업자에 의해 제공된 자동과정에 의해 BIAcore의 센서 칩에 고정시킨다. IFN-α2의 30fmol를 고정시킨다. 몇가지 농도 (28-112 nM) 인산 완충액 염 (PBS)로 희석된 뇨 IFNAB-BPII는 센소그람 칩을 통하여 통과시키고 연합과 해리정도 (PBS)를 기록한다. 나타난 데이타에 기초하여 kd값 (3.12x10-9 M)을 계산한다 (도면 9). 따라서, 뇨 IFNAB-BPII의 친화력은 숙주세포에서 발현된 IFNAB-BPI과 유사하다.

실시예 11. 대장균, 이스트와 곤충 세포에서 IFNAB-BPI와 IFNAB-BPII의 발현.

IFNAB-BPI와 IFNAB-BPII는 대장균과 같은 원핵세포 도는 이스트와 곤충세포와 같은 다른 진핵세포와 같은 재조합 세포에 의해 생산된다. 재조합 IFNAB-BPI와 IFNAB-BPII를 생산하기위해 대장균과 이스트세포를 형질변환 시키고, 곤충세포에 감염시키는데 적합한 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII와 이의 활성 단편을 인코드하는 DNA를 가지는 적절한 벡터를 만드는데 공지된 방법이 이용된다. 이스트 세포에서 발현시키기위해 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII (실시예 5와 6)을 코드하는 DNA를 절단시키고 이스트 세포의 감염에 적합한 발현 벡터내로 삽입시킨다. 곤충세포에서의 발현은 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII를 코드하는 DNA를 바큘로바이러스에 삽입하고 곤충세포는 재조합 바큘로바이러스로 감염시킨다. 대장균에서 발현을 위해 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII를 코드하는 DNAS는 적절한 올리고 핵산으로 완전한 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII (도면 2)의 제 1 코돈앞에 ATG 개시코돈을 삽입시키기 위해 부위 직접적인 돌연변이를 시킨다. 또는 이와같은 DNA는 적절한 센스와 안티센스 프라이머로 PCR에 의해 준비한다. 생성된 cDNA 구조는 공지된 기술을 사용하여 적절히 만들어진 원핵발현벡터로 삽입시킨다.

실시예 12: IFNAB-PIB 와 IFNAB-BPII의 재조합 융합 단백질의 제조.

IgG1 중사슬의 일정부위에 융합된 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-PITT의 리간드 결합단백질로 구성된 단백질 생산은 다음과 같이 실행된다. IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII DNA는 유일한 제한 효소부위를 리간드 결합 세포의 도메인의 코딩서열 전후에 즉각적으로 도입 시키기위해 적절한 올리고 핵산과 부위 직접 돌연 부위시킨다. 또는 이와같은 DNA는 제한효소를 가지는 특정 모양의 프라이머로 PCR에의해 만들어질수도 있다. IgG1 중사슬의 일정부위를 가지는 또다른 플라스미드 가령 pRKCO42Fc1(47)을 가지는 융합된 단백질의 해독을 허용하는 방식에서 IgG1 중사슬의 Asp 216에서 가능한 근접한 부위 직접적인 돌연변이를 하지된다. IFNAB-BPII 또는IFNAB-BPI의 리간드 결합 도메인의 인코딩하는 그리고 5'- 비해독 서열로 이루어진 dsDNA 단편은 유일한 제한효소부위에서 절단하여 만든다. 돌연변이된 pRKCD42Fc1은 플라스미드와 IgG1 서열을 포함하는 거대한 단편을 만들도록 유사하게 절단한다. 두개 단편은 IFNAB-BPII 또는 IFNAB-BPI의 리간드 결합 도메인과 IgG1 중사슬의 227 C-단부 (힌지부분과 CH2와 CH3 도메인)으로 구성된 폴리펩티드 전구물을 인코드하는 신규의 플라스미드를 만들기위해 연결시킨다. 융합된 단백질을 인코드하는 DNA는 적절한 제한효소로 절단하여 플라스미드에서 분리시키고 그리로 효과적인 원핵 또는 진핵발현 백터내로 삽입시킨다.

실시예 13: IFNAR와 함께 IFNAB-BPI와 IFNAB-BPII의 재조합 융합단백질의 제조.

IgG1 중사슬의 일정부위에 융합된 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII의 세포의 도메인으로 구성된 단백질 생산은 실시예 12에서와 같이 실시한다. IgG1 경사슬의 일정 부위에 융합된 IFNAR의 세포의 도메인으로 구성된 단백질 생산도 유사하게 실행된다. IgG1 중사슬의 일정부위에 융합된 IFNAB-BPI 또는, IgG1 중사슬의 일정부위에 융합된 IFNAB-BPII의 리간드 결합 도메인을 인코드하는 원핵발현벡터는 IgG1 경사슬의 일정부위가 융합된 IFNAR의 세포외도메인을 코드하는 진핵발현벡터와 함께 적절한 포유류 숙주세포와 공동-전이감염시키는데 사용된다. 양성 전이감염체는 IgG1 일정부위로 구성된 복합 단백질을 분비하고, IFNAR의 세포의 도메인은 IgG 경사슬의 가변부분을 대체하고 그리고 IFNAB-BPII 또는 IFNAB-BPI의 리간드 결합도메인은 IgG1 중사슬의 가변부분을 대체한다.

또다른 실시예에서, 중사슬과 경사슬의 일정부위가 전환될때 즉, IFNAR의 세포의 도메인이 IgG2 중사슬의 일정 부위와 융합하고, IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII의 리간드 결합 도메인이 IgG2 곁사슬의 일정부분과 융합한다.

실시예 9를 기초하여 이와같은 융합된 단백질을 IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII와 비교할때 약 10배 이상의 높은 친화력을 나타낸다.

실시예 14: IFNAB-BP에 대한 다클론항체의 준비.

컴플리트 풀루운트 어쥬번트로 유화시킨 뇨 IFNAB-BP의 순수준비물 5ug을 토끼의 피하내로 주입시킨다. 3주뒤에 인컴플리트 플루운트 어쥬번트 5ug을 다시 피하내로 주입한다. PBS 용액으로 10일 간격으로 4회 추가 주사한다. 토끼는 최종 면역화후 10일뒤에 출현시킨다. 항체량 발생은 인산-완충염(PBS)에서 IFNAB-BP (1ug/ml)로 4 C 24시간동안 피복된 96웰 PVC 판을 이용하여 고형상 방사능 면역검사 (SPIA)에 의해 실시한다. 플레이트는 4 C에서 24시간동안 PBS에서 BSA(0.5%); 트윈 20 (시그마 USA, 0.05%)로 차단시킨다. 플레이트는 실온에서 4시간동안 5배희석된 토끼항 혈청으로 반응시키고 세척시킨후 그리고 45분간 실온에서 PBS 125I-단백질 A(105 cpm/웰)로 반응시킨다. 플레이트는 세척하고; 개별웰을 절단하고 카운터시킨다. 역가는 최대희석의 역수로써 계산되고 이는 콘트롤 혈청보다 약 10배 높았다. 5회주사후 역가는 1:60,000 이상이었다.

항체양 발생은 사람 IFN-α2의 항바이러스 활성을 차단시키는 항혈청의 능력에 의한 것이다. 96웰 플레이트에서 사람 WISH 세포의 단층은 37℃에서 1시간동안 no. 1의 웰에서 1:250 희석으로 시작한 항혈청의 2배 희석으로 배양시킨다. IFN-α2 (10um/ml, 최종)을 첨가하고 37℃ 1시간 뒤에 세포는 베스큘라 스토마타이 티스 바이러스에 감염시킨다. 7회 면역화 뒤의 중화 역가는 120,000 항바이러스 u/ml이다.

실시예 15: IFNAB-BP에 대한 단클론 항체의 준비.

암컷 Balb/C 쥐 (3개월)을 컴플리트 플루언트 어쥬번트 액에서 2ug 정제된 IFNAB-BP로 주사한다. 3주뒤에 인컴플리트 플루언트 어쥬번트로 피하내 주사한다. 3번의 추가 접종은 10일 간격으로 PBS로 피하로 주사한다. 1:60,000의 결합 역가는 sRIA에서 얻는다 (실시예 9). 최종 후원도 융합전 3 내지 4일에 복막내로 실사하는데 이때 최대 결합 역가를 나타낸다. 융합은 NSO/1 육종 세포주와 융합짝인 동물의 지라와 임파 노드에서 준비한 임파세포를 이용하여 실행한다. 융합된 세포는 미량 배양 플레이트에 분포시키고 하이브리도마는 HAT와 15% 말형청이 보충된 DMEM에서 선택한다. IFNAB-BP에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마는 제한된 희석방법을 사용하여 서브클론시키고, 복수 생산을 위해 프리스탄스로 프라임된 Balb/C 쥐에 주사한다. 항체의 복기준표본은 상업적으로 이용가능한 ELISA 키느(Amersham, UK)을 사용하여 정의한다.

항-IFNAB-BP 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 스크린은 다음과 같이 실행한다: 하이브리도마 상층액은 역상 고형상 방사선 면역검사 (IRIA)에 의해 항-IFNAB-BP 항체존재하에 검사한다. PVC 마이크로 적정판 (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA)은 친화력 정제된 염소 항-쥐 혈청 F(ab)2 항체 (Jackson Labs, USA)(10ug/ml, 100ul/well)로 코팅한다. 4℃에서 24시간 배양후에 판은 BSA(0.5%)와 트윈 20(0.05%)를 포함하는 PBS 로 2회 세척하고 37℃에서 적어도 2시간동안 세척용액으로 차단시킨다. 하이브리도마 배양 상층액 (100ul/웰)을 첨가하고 플레이트는 37℃에서 4시간 배양시킨다. 플레이트는 세척총액으로 3회 세척하고 125I-IFNAB-BP (100ul, 10 cpm)을 첨가하고 4℃에서 16시간동안 추가 배양시킨다. 플레이트는 3회 세척시키고 개별웰은 절단하고 감마 카운터한다. 카운터된 시료는 네가티브 콘트롤보다 약 5배가 높아 포지티브로 간주한다 (표 VI). 5개 포지티브 클론은 선택하고 추가의 연구를 위해 서브클론시키고 특징화 시킨다. 모든 클론은 IgGl의 복기준이다.

실시예 16: 단클론 항체와 IFNAB-BP의 친화성 크로마토그래피.

IFNAB-BP에 대한 항체는 친화성 크로마토그래피에의해 IFNAB-BP의 정제에 사용된다. 단클론 항체 No. 5.73은 친화성 크로마토그래피에 사용된다. 하이브리도마 No. 5.73에의해 분비되는 단클론 항체를 포함하는 상성액은 50% 포화로 암모늄 설페이트 침전에의해 정제되고 PBS에 대해 투석시킨다. 10ng 이뮤노글로블린이 1ml Affigel 10 (Bio-Rad USA)에 결합된다.

260ml 사람 뇨 단백질 (뇨의 250:1에 상응)을 유속 0.25ml/min에서 4℃에서 항 IFNAB-BP 항체 컬럼 0.5ml에 얹는다. 컬럼은 단백질에 세척에서 감지안될때가지 PBS로 세척한다. IFNAB-BP는 25mM 시트로산 완충액, pH 2.2 (8x1 컬럼)에 의해 용출시키고 1M Na2CO3로 즉시 중화시킨다. 용출된 부분의 SDS PAGE의 실버착색분석에서 주요 밴드가 40,000 MW로 나타났다. 주가 정제는 크기 분별 크로마토그래피로 실시한다.

실시예 7: IFNAB-BPII의 ELISA 테스트.

마이크로적정판 (Dynatech or Maxisorb, by Nunc)는 4℃에서 24시간동안 항-IFNAB-BP 단클론항체 No. 46.10 (Ig 단편, 120ul/웰, 10ul/ml PBS)로 피복시킨다. 플레이트는 BSA (0.5%), 트윈 20 (0.05%)와 NaN3 (0.02%)(차단액)을 포함하는 PBS로 세척하고 37℃에서 등용액으로 24시간동안 차단시킨다. 테스트한 시료는 0.1% NP40와 0.65M NaCl를 포함하는 차단액으로 연속적으로 2배 희석 (시작은 1:4)하고 4시간동안 37℃에서 웰에 첨가한다 100 ul/웰), 플레이트는 0.0% 트윈 20 (PBS/트윈)을 포함하는 PBS로 3회 희석하고 토끼 항-IFNAB-BPII 혈청 (1:1000 차단액, NaN3 없이, 100 ul/웰)으로 4℃에서 추가 배양시킨다. 플레이트는 PBS/트윈 (100 ul/웰)로 3회 추가 세척하고, 염소-항-토끼 양고추냉이 과산화효소 (HRP, Jackson Labs, 1:10,000, PBS/트윈, 100 ul/웰_)은 실온에서 2시간동안 첨가한다. 플레이트는 PBS/트윈으로 3회 세척하고 기질로써 각 웰에 새로만든 ABTS 용액 (2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산, 시그마, 10ml; 6.4ml H20; 2.2ml 0.2 M Na2HPO4; 1.4ml 0.2 M 시트르산; 1ul H2O2) 색은 30분간 발색한다. 반응은 0.2M 시트르산 100 ul/웰 첨가하여 종료시킨다. 플레이트는 405nm에서 자동 ELISA 리드에의해 읽고, 640 nm 에서 비특이적 반응으로 보정한다. 이 검사의 최저 한계 감지는 30 pg/ml (도면 10)이다.

특정구체예의 설명은 본 발명의 일반적인 특징이나, 현행 다른 기술을 응용하여 본 발명의 범위내 벗어나지 않고 다양하게 응용할수 있다. 따라서, 이와같은 변형은 본 기술분야에 속함을 인지할 것이다. 여기에 사용된 기술적 용어와 문구는본 발명의 설명을 위함이나 이에 한정시키지 않는다.

제 1 도는 IFNAB-BPII 와 IFNAB-BPII 의 클로닝 방법을 나타내고;

제 2 도는 IFNAB-BPI 을 가지는 클론 g10의 cDNA 와 해독된 폴리펩티드 서열을 나타내고;

제 3 도는 IFNAB-BPI 와 IFNAB-BPII의 서열에 상응하는 특이적 프로브로 노던 블럿한 mRNA 감지를 나타내고;

제 4 도는 IFNAB-BPI 에 상응하는 완전한 1.5kb cDNA 의 뉴클레오티드와 아미노산 서열을 나타내고;

제 5 도는 IFNAB-BPII 에 상응하는 4.5kb cDNA 클론의 부분적인 뉴클레오트와 아미노산 서열을 나타내고;

제 6 도는 IFNAB-BPI 의 세포의 리간드 결합 도메인의 발현을 위한 포유류 발현 벡터구조를 나타내고;

제 7 도는 다양한 세포에서 IFNAB-BPI 와 IFNAR 의 발현을 나타내고;

제 8 도는 다양한 숙주세포에 125I-IFN-α2 의 결합을 나타내고;

제 9 도는 IFN-α2 에 대한 뇨 IFNAB-BPII 의 친화력을 결정하기 위해 BIAcore 시스템의 연구결과를 나타내고;

제 10 도는 뇨 IFNAB-BPII 의 ELISA 를 나타낸다.

Claims

도 4에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPI과 도 5에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPII에서 선택되는 IFN-α/β 결합단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
IFNAB-BPI 또는 IFNAB-BPII와 생물학적 활성이 동일한 단백질을 인코드하고 제 1항에 따른 DNA와 하이브리드할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 1항에 있어서 전사되는 경우 1.5kb mRNA 분자 및 4.5kb mRNA 분자에서 선택되는 mRNA 분자가 만들어지고, 이들 각각은 IFNAB-BPI 전구체 및 IFNAB-BPII 전구체로 해독되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, IFNAB-BPI 단백질을 인코드하는 하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 4항에 있어서, 도2에서 제시한 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
도4에 제시된 서열을 가지는 성숙 IFNAB-BPI를 코딩하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, IFNAB-BPII 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
도 5에 제시된 서열을 가지는 성숙 IFNAB-BPII를 코딩하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
형질전환된 숙주세포에서 도4에 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPI과 도 5에 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPII에서 선택되는 IFNAB-BP를 발현할 수 있는 제 1항에 따른 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제가능한 발현벡터.
제 9항에 있어서, 형질전환된 숙주세포에서 도4에 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPI과 도5에 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPII에서 선택되는 IFNAB-BP를 발현할 수 있는 제 3항에 따른 DNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제가능한 발현벡터.
제 9항에 있어서, 형질전환된 숙주세포에서 IFNAB-BPI 분자를 발현할 수 있는 플라스미드 pEF-BOS-IFNAB-BPI인 것을 특징으로 하는 복제가능한 발현벡터.
제 9항에 따른 발현벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 인체를 제외한 숙주세포.
제 12항에 있어서, 원핵 숙주세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 12항에 있어서, 진핵 숙주세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 14항에 있어서. 원숭이 COS 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 15항에 있어서, 원숭이 COS 세포는 제 11항에 따른 발현벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
IFNAB-BPI, IFNAB-BPII, 융합단백질, 뮤테인, 기능적 유도체, 이의 활성단편에서 선택되는 재조합 IFNAB-BP를 생산하는 공정에 있어서,

제 12항에 따른 형질전환된 숙주세포를 배양하고 IFNAB-BP를 회수하고, 이때, IFNAB-BPI는 도 4에서 제시된 서열을 가지고, IFNAB-BPII는 도 5에서 제시된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 공정.
도 4에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPI과 도 5에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPII에서 선택되는 것을 특징으로 하는 IFN-α/β 결합단백질.
제 18항에 있어서, 제 1항에 따른 DNA 분자에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 IFN-α/β 결합단백질.
제 18항에 있어서, 제 9항에 따른 복제가능한 발현벡터내에 포함된 DNA 서열에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 IFN-α/β 결합단백질.
제 18항에 있어서, 제 12항에 따른 숙주세포에서 발현 및 생산되는 것을 특징으로 하는 IFN-α/β 결합단백질.
도 4에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPI과 도 5에서 제시된 서열을 가지는 IFNAB-BPII에서 선택되는 IFNAB-BP에 대한 항체.
제 22항에 있어서, 다클론항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 22항에 있어서, 단클론항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 22항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서, IFNAB-BPI에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 23항 또는 24항에 있어서, 제 18항의 IFN-α/β 결합단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 23항 또는 24항에 있어서, 제 19항의 IFN-α/β 결합단백질에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 24항에 있어, IFNAB-BPII에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 22항에 있어서, 면역 검사에 사용되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 22항에 있어서, 면역 정제에 사용되는 것을 특징으로 하는 항체.