UA46694C2 - IFN- a/b -ЗВ'ЯЗУЮЧИЙ БІЛОК, МОЛЕКУЛА ДНК, ЕКСПРЕСУЮЧИЙ ВЕКТОР, ЩО РЕПЛІКУЄТЬСЯ, КЛІТИНА-ХАЗЯЇН, ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ INF-a /b -ЗВ'ЯЗУЮЧОГО БІЛКА, ДІАГНОСТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ - Google Patents

Abstract

Заявляються білки, що зв’язуються з інтерфероном α/β та можуть модулювати активність субтипів α-інтерферону, а також β-інтерферону. Описано також клонування молекул ДНК, що кодують зазначені білки, їхня експресія в клітинах реципієнта та антитіла проти цих білків.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение касается нового связьівающего интерферон - о/р белка, способного модулировать 2 активность различньїх субтипов интерферона - о, (ІЕМ - о), а таюке активность интерферона - Д. Изобретениеє, в частности, касается клонирования молекул ДНК, кодирующих указаннье белки, их зкспрессии в хозяйских клетках и антителам против указанньїх белков.

В патентной заявке Израиля 103052 описьівается и заявляется растворимьїй белок рецептора интерферона - «я с молекулярньм весом около 45000, идентифицированньій вестерн-блоттинг методом с помощью то моноклональньїх антител к рецептору интерферона - ож. В указанной заявке описьівается и заявляется также другой растворимьїй связьівающий интерферон - о белок, имеющий молекулярньій вес около 40000, которьй идентифицирован методом сшивки с 7125 ІЕМ - 42 и иммуноосаждением с помощью анти- ІЕМ - 9 моноклональньх антител. Если их вьіделяют из сьіворотки, то указанньіе соединения имеют молекулярньй вес 75 5ОК. В патентной заявке Израийля 106591 описьіваєтся и заявляется указанньій вьіше связьівающий интерферон - ж белок с молекулярньм весом 40000 (далее обозначаєтся "ІЕМАВ - ВР" или "ІЕМАВ - ВРІЇ!"), которьй вьіделяется из мочи в гомогенном виде и имеет первичную структуру, которая отличается от любого известного белка. ІЕМАВ - ВР связьшваєт и блокирует активность различньхх субтипов интерферона - о, а также интерферона - р. По зтой причине характеристики связьівания ІЕМАВ - ВР значительно отличаются от ранее описанньїх рецепторов интерферона на поверхности клеток, которье соответствуют лишь интерферону альфа

В человека.

В осоответствий с о настоящим оизобретением две комплементарнье молекульй ДНК, кодирующие предшественники ІЕМАВ - ВР, клонируются и определяется последовательность их аминокислотньїх остатков.

Вероятно обе они получаются из одного и того же агента, например путем альтернативного сплайсинга. с Описьіваєтся также продукция двух рекомбиналтньїх белков, обозначаемьх ІРМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ, в о клетках млекопитающих и других клетках - реципиентах. Заявляются также поликлональнье и моноклональнье антитела, направленнье против ІЕМАВ - ВР, полезнье для блокирования рецептора интерферона, для проведения иммуноанализов и иммуноочистки ІЕМАВ - ВРІ и ІЕМАВ - ВРІЇ.

ІЕМАВ - ВРІ и ІЕМАВ - ВРІЇ способньі модулировать активность интерферонов типа І, т.е. различньїх субтипов Ж интерферона - о, а также интерферона- др. Таким образом, они могут подавлять нежелательное воздействие Фо интерферонов типа |.

Интерферонь! типа І (ІЕМ - о, ІЕМ - р и ІЕМ - 5) составляют семейство близких по своей структуре цитокинов, со которье обьічно вьіделяют по их способности придавать устойчивость по отношению к вирусньмм инфекциям. «я

Сообщалось о разнообразной биологической активности интерферонов типа І включая - подавление 32 пролиферации клеток, индукцию антигенов МНС класса І и некоторьїх других иммунорегулирущих активностей в (І). Интерферон - о и интерферон - Д полезньї для лечения различньїх вирусньїх заболеваний, в том числе гепатита - С (2,3) и бородавок (4,5), а также некоторьїх злокачественньїх заболеваний, таких как лейкоз волосяньх клеток (6), хронических злокачественньй лейкоз (7) и саркома Капоши (8). «

Мнтерферон - со бьл ообнаружен в сьіворотках различньх пациентов, страдающих аутоиммуньми З 70 заболеваниями, такими как системная красная волчанка (9), а таюке больньїх СПИДОоОм (10). Интерферон- «с, с принимает участие в развитии ювенильного диабета (ІІ). Кроме того сообщалось, что повьиішенная зкспрессия о, :з» - интерферона в белом веществе микроглий может вносить вклад в патологию болезни Альцгеймера. Далее, бьіло показано, что терапия с использованием интерферона о - приводит в ряде случаев к нежелательньм побочньім зффектам, в том числе к лихорадке и неврологическим заболеваниям (12). Следовательно, їз существуют патологические состояния, в которьїх нейтрализация активности интерферона может принести пользу пациенту. ме) Как и в случаеє других цитокинов, интерферон о - проявляет свою биологическую активность путем б связьшвания с рецептором на поверхности клетки, которьій является специфическим для всех субтипов во Мнтерферона - о, а таюке для интерферона - р (13). Рецептор интерферона - о человека (ІЄМАВ) бьіл о идентифицирован и клонирован из клеток Дауди (14). Клонированньій рецептор имеет одну трансмембранную

Та» область, внеклеточную и внутриклеточную область. При зкспрессии в мьішиньїх клетках указанньій рецептор придает восприйимчивость по отношению к интерферону - 5 В человека, однако оказьівает незначительное воздействие по отношению к другим видам интерферона - о и интерферона- р, указьвая на то, что в реагирований на воздействие интерферона - о и различньїх субтипов интерферона - ВД могут принимать участие о дополнительнье компоненть.

В других исследованиях: показано, что дополнительнье компонентьї или субединиць! рецептора їмо) вовлекаются в связьшваниеє интерферона - о и интерферона - В (15 - 17). Более того, сообщалось, что уже описанньйй рецептор (14) принимаєт участие в связьіваний всех видов интерферона - о и интерферона р - (18). 60 Связьвающие цитокин белки (растворимье рецепторь! цитокина) соответствуют областям связьівания внеклеточного лиганда соответствущих рецепторов цитокина на поверхности клетки. МИх получают либо альтернативньім сплайсингом пре-мРНК, общей для рецептора на поверхности клетки, либо протеолитическим расщеплением рецептора поверхноститк клетки. Подобнье растворимье рецепторь! ранее бьіли описань, в том числе среди прочих растворимье рецепторь! Ії - б и ІРМ- у (19 - 21), ТМЕ (22 - 24) 1-1 (25 - 27), І. - 4 бо (25, 283,11 - 2 (29 - 30), І. - 7 (31) и ІЕМ - о, (32).

В настоящем изобретений заявляются молекуль! ДНК, кодирующие известньсе белки, связьівающие ІЕМ о, / р (11106591). Указаннье молекуль! ДНК на самом деле кодируют два различньїх белка, ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ, получаемье, вероятно, от той же пре-мРНК путем альтернативного сплайсинга, которьій приводит к образованию двух молекул мРНК, одна из которьх имеет размер приблизительно 1,5тьс. оснований, а другая имеет размер приблизительно 4,5тьіс. оснований, при зтом каждая из них кодирует один из связьвающих белков - МРНК размером 1,5тьіс. оснований кодирует ІЕМАВ - ВРІ, а Мрнк размером 4,5тьіс. оснований кодирует

ІРМАВ - ВРІЇ. Термин ІЕМАВ - ВР относится как к ІРМАВ - ВРІ, так и к ІРМАВ - ВРІЇ, ІРМАВ - ВР, вьіделенньй из мочи, обозначают как ІЕМАВ - ВРІЇ. 70 Таким образом, в настоящем изобретений заявляется молекула ДНК, кодирующая белки, связьівающие ІЕМ - о / р вьібраннье из ІЕМАВ - ВРІ, ІРМАВ - ВРІЇ, слитьїх белков и мутантних ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ, их функциональньх производньмх и их активньїх фракций.

В изобретеним также заявляются реплицируемье зкспрессирующие векторьї, включающие указаннье молекульї ДНК, трансформированньюе клетки - хозяева и белки, продуцированнье воспроизводимьсе 75 указанньми трансформированньми клетками. Термин/"молекуль ДНК" включаєт геномнье ДНК, комплементарньсе ДНК, синтетические ДНК и их комбинации.

Изобретение относится также к молекулам ДНК, которье гибридизуются в жестких условиях с указанньіми вьше молекулами ДНК и кодируют белки, обладающие той же биологической активностью, что и молекуль!

ІРМАВ - ВР.

В настоящем изобретении заявляются также способьі! получения слитьїх белков, мутантов или их активньх фракций в хозяйских клетках способньїх продуцировать функционально активньсе ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ.

В настоящем изобретениий заявляются также рекомбинантнье ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ, слитье белки, мутантьії или их активнье фракции, а также соли указанньїх соединений, и фармацевтические композиции, содержащие ІЕМАВ - ВРІ или ІРМАВ - ВРІЇ, слитье белки, мутеинь, их активнье фракции, а также соли су указанньїх соединений.

ІРМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ подавляют биологическую активность природньїх лейкоцитов человека и і) интерферонов фибробластов, а также рекомбинантньїх интерферонов ІЕМ - о2, ІЕМ о-В, ІЕМ - оС и ІЕМ - В ІРМАВ - ВРІ способствует новому трансмембранному белку, которьій является связьівающим лиганд рецептором

ІЕМ -о/ Д ІЕМАВ - ВРІЇ представляет собой растворимьй рецептор, которьій в основном соответствует «І внеклеточной связьівающей лиганд области ІРМАВ - ВРІ. б

Описание рисунков

На фиг.1 показана стратегия клонирования ІЄМАВ - ВРІ и ІЕМАВ - ВРІЇ: (Се) (А) Средний ряд, Последовательность внутренних СМВг пептидов (27) аминокислотньх остатков, ср7), ІЕМАВ со - ВРІЇ с молекулярньїм весом 40000, вьіделенной из мочи.

Верхний и средний рядьі: синтетические смьісловьіе (вверху) и антисмьсловье (внизу) с вьірожденньм « кодом олигонуклеотидньюе смеси, полученнье на основе пептидной последовательности и используемье для обратной транскрипции (лишь антисмьісловой праймер) и для цепной полимеразной цепной реакции (РСК). (В) Злектрофорез на агарозе продуктов РСК, полученньїх с использованием указанньїх вьіше смьІсловьмх и « антисмьісловьїх праймеров. Для генерирования комплементарной ДНК, играющей роль матриць в РСК, используют следующие молекуль! РНК и праймерь!: (1) Поли Ах РНК клеток Дауди, антисмьісловой праймер. (2) - с Поли Ак РНК клеток Дауди, олиго-4(Т) праймер. (3) Общая РНК клеток УМІЗН, антисмьісловой праймер. Размер ч (кр) ДНК - маркеров приведен в левой части. » (С) Верхний ряд: Невьірожденная часть последовательности, полученной из клонов рВіпезсгірі продукта

РСК с размером 101 кр.

Нижний ряд: Трансляция полученной невьрожденной последовательности ДНК в ожидаемую ї последовательность, которая представляет собой часть последовательности пептидов сб7 (остатки 9 - 20). б На фиг.2 показана кКДНК транслированная полипептидная последовательность клона 910 несущего кКДНК

ІРМАВ - ВРІ: (о) Указанньй клон вцделяют из библиотеки лямбда ді11, полученной из: кКДНК клеток Неї а человека, со 50 скринингом с синтетическим олигонуклеотидом, соответствующим последовательности невьірожденной ДНК, приведенной на фиг.1(С). Последовательность, соответствующая М- концу ІЕМАВ - ВРІ, вьіделенного из мочи, и їз» ее СМВг -пептидам, подчеркнута, а под чертой приведено название соответствующей последовательности (пі,

М- край 1, п2, М- край 2, сЬ3, СМВг пептид 3, сЬб, СМВг пептид 6, сб7, СМВг пептид 7). Гидрофобная последовательность, соответствующая сигнальньм пептидам и трансмембранной области (іт) подчеркнута двакцьі. Жирнье цифрь! с правой стороньї указьівают на количество аминокислотньїх остатков. Обьічнье цифрь!

Ге! соответствуют нуклеотицньїм остаткам, принимая инициатор А в АТО за номер 1.

На фиг.3 оказано определение МРНК методом нозерн- блоттинга с использованием специфического зонда, ко общего для последовательности ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ:

Зонд, содержащий 397 пар оснований, соответствующих нуклеотидам 218 - 614 ІЕМАВ - ВРІ, получают 60 полимеразной цепной реакцией, используя подходящие праимерь и стохастическую метку праймеров с помощью (ЗР. Поли Ах РНК из клеток Дауди человека, нанесенную на нитроцеллюлозу и гибридизованную со специфическим зондом, анализируют методом злектрофореза на агарозе (1,595). Размер рибосомной РНК указан с правой сторонь.

На фиг.4 показана последовательность нуклеотидов и аминокислот полного клона комплементарной ДНК с бо размером 1,5тьс. оснований, соответствующего ІЕМАВ - ВРІ. Аминокислотнье остатки, в однобуквенньїх кодах нумеруются жирньми цифрами, начиная с кодона трансляции-инициации. Подчеркнуть! области гидрофобного лидера и трансмембраннье области. Последовательность М- концевьїх белков ІЕМАВ - ВР, вьіделенного из мочи (из кодона 27), и внутренние СМВг-пептидь! подчеркнутьї пунктирной линией (однако остатки Суз и

М-гликозилированньсе остатки двп не обнаруживаются). Сигналь! М-гликозилирования помечень! звездочками, а сигналь! полизденилирования подчеркнуть! дваждь!.

На фиг.5 показаньї частичнье последовательности нуклеотидов и аминокислот клона комлементарной ДНК размером 4,5тьіс. оснований, соответствующего ІЕМАВ - ВРІЇ. Аминокислотнне остатки в однобуквенньїх кодах нумеруются жирньми цифрами, начиная с кодона трансляции-инициации. Подчеркнута область гидрофобного 7/0 лидера. Последовательность М- концевьх белков ІРМАВ - ВР, вьіделенного из мочи (из кодона 27), и внутренние

СМВг пептидьй подчеркнутьь пунктирной линией (остатки Суз и М-гликозилированнье остатки Авп не обнаруживаются). Сигналь! М-гликозилирования и кодонь! остановки помеченьї звездочками.

На фиг.б показана генная конструкция вектора зкспрессий млекопитающих для зкспрессии внеклеточной области ІЕМАВ - ВРІ для связьівания лиганда. (А) Смьісловье и антисмьісловье олигонуклеотидьі, используемье для получения ДНК, которая кодирует внеклеточную область ІЕМАВ - ВРІ для связьівания лиганда, путем полимеразной цепной реакции. (В) Злектрофорез на агарозе продукта с массой приблизительно 850 пар оснований полимеразной цепной реакции полученньїй с помощью указанньх вьіше смьісловьїх и антисмьісловьїх праймеров и ДНК клона 910. (С) Структура рег-ВО5-ІЕМАВ - ВР - 1 вектора зкспрессиийи млекопитающих для получения растворимого

ЕМАВ - ВРІ.

На фиг.7 показана зкспрессия ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАР в различньїх клетках:

Зкспрессия ІРМАВ - ВРІ Д различньх клетках показана в виде 5ОБ-РАСЕ (7,590) акриламида, невосстанавливающие условия) зкстрактов из оклеток с помощью детергентов с последующим иммуноблоттингом анти- ІЕМАВ - ВРІЇ антителом кролика и 125|-белка А. Клон 369,11 представляет собой клетки см

МІН-З3ТЗ3, зкспрессирующие ІРМАВ - ВРІ, клон 470,6 представляет собой клетки МІН-3ТЗ3 зкспрессирующие (5)

ІЕРМАР, а клон 508,12 зкспрессирует оба белка. Показаньі также контрольнье клетки МІН-3Т3 и клетки Дауди человека. Формь! ІЕМАВ - ВРІ с массой 51 кДа (в муриновьїх клетках) и 102 кДа (в клетках Дауди) указань стрелками. Указатели молекулярной массь! приведень с левой сторонь.

На фиг.8 представлень даннье по связьванию 122І- І|ЕМ- 42 с различньіми клетками-реципиентами: - (А) Насьіщениє связьшвания //1292І-ЕН - 42 с клетками МІН-3Т3, зкспрессирующими ІЕМАВ - ВРІ (клон Ге»! 369,11 щ), и клетками, зкспрессирующими как ІЕМАВ - ВРІ, так и ІЕМАР (клоньі 508,12 Ф) и отсутствие, со связьшания с оклетками, зкспрессирующими лишь ІБЕМАР (клон 470,6 ЛА). (8) Анализ Скатчарда связьввания 7251І-ІЄМ- 92 к указанньім вьіше клеткам. Данньсе по связьіванию бьли обработань! с использованием о программь! ГІСАМО. Следующие клетки показьівают вьісокое сродство насьіщения: клетки Дауди человека (Л), «Її позитивньсе клетки ІЕМАВ - ВРІ (клон 369,11 Ф), и клон 508,12, зкспрессирующий как ІЕМАВ - ВРІ, так и ІЕРМАР (щ)

На фиг.9 обобщень результать! исследований системь! ВІіАсоге, которне определяют сродство ІЕМАВ - ВРІЇ,

Дьіделенного из мочи, к ІЕМ- щ2: «

ІЕМ- 2 иммобилизуют на чувствительном злементе и пропускают через него различньіе концентрации ІЕМАВ - ВРІЇ, вьіделенного из мочи. Кривье "Относительная величина отклика в зависимости от времени" - с характеризуют процесс связьівания и диссоциации. Кажущаяся константа диссоциации составляет 3,12 х 10 М. "з На фиг.10 приведень результать ЕЇ ІЗА анализа ІРНАВ-ВРІЇ, вбіделенного из мочи: " Чистьій ІРМАВ - ВРІЇ, вьіделенньій из мочи, последовательно разбавляют в два раза до указанной концентрации, помещают на микропластиньь для проведения анализа ЕЇІЗА, которне предварительно покриівают моноклональньми анти- ІЕМАВ - ВРІЇ антителами/ те Пластиньї затем реагируют с кроличьими анти- ІРМАВ - ВРІЇ антителами, и за которьіми следует коньюгат

Ф козьи анти-кроличьи антитела пероксидазьі хрена и субстрат АВТ /НьО. Считьмшвание пластин проводят на длине волньї 405/630нм. Минимальньй предел обнаружения составляет ЗОпг/мл.

Ме. В соответствии с патентной заявкой Израиля 106591, белок связьивания ІЕМ- о/р имеющий молекулярньй (Те) 20 вес 40000 ІЕМАВ - ВР), вьіделяют хроматографически в две стадии из обьічной мочи. Неочищеннье белки,

І» вьіделеннье из мочи, помещают в колонку, содержащую ІБМ- о2, присоединенньй Кк агарозе. Колонку промьівают для удаления не представляющих интерес белков, а затем связаннье белки злюируют при низком значений рН. Проводят разрешение злюийрованньх белков с помощью хроматографии с определением размеров и получают несколько пиков белков, один из которьїх отличается своей способностью специфично 99 взаймодействовать со 1251-ІЕМ- 042 и блокировать антивирусную активность интерферона - оФиии

ГФ) интерферона р-. Зти белки далее охарактеризовьвают микроанализом последовагеельности аминокислотньх г) остатков М- конца, с помощью которого получена общая последовательность М- концевой области:

Авр-Зег-Рго-Авр-Туг- Гпг-Авр-СІиш-Зег- Агу - Гиг-РНе-І ув-ІГе-Аго-І еи-Ага. во Бьіла вьіделена минорная полипептидная последовательность, соответствующая / основной последовательности, но содержащая дополнительно три аминокислотньїх остатка (Пе-ХХХ-Туг) со сторонь! М- конца приведенной вьше последовательности (ХХХ обозначает не идентифицированную аминокислоту).

Полученную последовательность сравнивают и вьясняеєется, что она полностью оотличаєтся от последовательности известного ІЕМ- рецептора (14). Она отличаєтся от другого известного белка и не в Кодируется ни одной известной последовательностью ДНК, что показано при сравнений с данньми библиотек

Зугіззргої и СеперапкК при использований программь! РавзіА (33).

Образец ІЕМАВ - ВРІЇ вьіделенного из мочи, ферментируют с помощью СМВг, разделяют с помощью

ЗО5-РАСЕ, наносят методом злектроблоттинга на мембрану из поливинилдифторида и полученньюе при ферментации фрагменть! подвергают операции микроопределения первичной структурьі. Один из фрагментов Ммеет молекулярньій вес менее 10К и следующую внутреннюю последовательность (Меї предшествует действительной последовательности):

Меї-Ма1!-Гув-РПпе-Рго-Зег-Пе-МаІ-СІи-с1Ш-о1ш-І ен-СІп-РНе-Авр-І еш-Зег-І еи-Ма1-Пе-с1и-с1и-01Іп-Зег-СтТи-(о1Ш-ЇЇ е (27 остатков).

Зта внутренняя последовательность обратно транслируется в смьісловьіе и антисмьісловье праймерь, к 7/0 Которьм добавлень! подходящие сайть! рестрикции. Полная РНК очищается от клеток человека и первую цепь комплементарной ДНК генерируют с помощью обратной транскриптазьі, используя в качестве праймера либо смесь антисмьісловьїх олигонуклеотидов, либо олиго-о(Т).

Полученньій фрагмент комплементарной ДНК размножают полимеразной цепной реакцией, используя комбинацию смьісловьїх и антисмьісловьіх вьірожденньїх праймеров. Анализ продуктов РСК на З-Уоном геле 7/5 агарозьі показьіваєт специфическую олигонуклеотидную полосу. Зту ДНК подвергают рестрикции-ферментации, клонируют на рВішпезсирі ("Зігапіадепе") и "заражают" зтим вектором способную трансформироваться Е.соїЇ.

Определяют последовательность аминокислотньїх оостатков нескольких независимьх //-клонов.

Последовательность участка, ограниченного смьісловьіми и антисмьісловьіми вьірожденньми праймерами, инвариантна и кодируется ожидаемой последовательностью указанного вбьіше СМВг пептида (сб7) из ІЕМАВ-ВР, го Ввіделенного из омочи. М синтезируют олигонуклеотид, соответствующий невьіровденной внутренней последовательности, делают метку на конце и используют для скрининга библиотек комплементарньх ДНК.

Скрининг лямбда д4/11 библиотеки комплементарньїх ДНК-клеток Неї! а человека ("Сіопіесп") дает несколько положительньх клонов. Один из зтих клонов обозначенньй как 910, имеет открьтую рамку, считьівания генетической информации, которая соответствует сигнальному пептиду, внеклеточной области, с

Ттрансмембранной области и короткой цитоплазматической области. Пептиднье последовательности, полученнье из ІЕМАВ-ВР, вьіделнного из мочи, все находятся внутри внеклеточной области, обозначенной как і) 910. Небольшое количество аминокислотньїх остатков пептидной последовательности бьіли неправильньіми вследствие ограничений технологии определения первичной структурь! (в основном вследствие невозможности идентифицировать Суз и низкие уровни пиков, соответствующие 5ег). «І

Смьісловьне и антисмьісловне праймерьі, соответствующие концам нуклеотидной последовательности 219 - 613 клона 910 (фиг.2) используют для получения с помощью РСК специфической пробь, используя клон 910 в іа качестве ДНК матриць. Полученную ДНК метят | З2Р)| и ииспользуют для гибридизации по методу (Се)

Нозерн-блоттинга поли А мРНК из двух клеточньїх линий человека. В обоих случаях наблюдаются две специфические полосьі, одна соответствует МРНК с длиной 1,5 оснований, обозначают как предшественник ї-о |ІЕМАВ-ВРІ. Первичньїй продукт трансляции мРНК с длиной 4,5тьіс. оснований, обозначают какпредшественник «Ж

ІРМАВ-ВРІЇ.

Указанная вьше специфическая проба используют для скрининга дополнительной библиотеки комплементарньхх ДНК человека и идентифицируют две группьі клонов комплементарньїх ДНК. Одна группа « (около 20 индивидуальньїх клонов) имеет длину 1,5тьІс. оснований и кодирует тот же самьій предшественник трансмембранного белка, которьій кодирует клон 910. Вторая группа (2 индивидуальньх клонов) имеет длину /-щ- с 4,5тьіс, оснований. Зти размерьї совпадают с размерами двух образцов мРНК, а потому мРНК с размером ц 1,Бтьіс. оснований кодирует ІРМАВ-ВР, а мРНК с размером 4,5Бтьісє. оснований кодирует ІЄМАВ-ВРІЇ. "» Определение последовательности аминокислотньїх остатков клонов с размером 4,5тьІіс. оснований показало, что они кодируют предшественник усеченного растворимого рецептора, соответствующего кодонам 1 - 239

Кклона 4910. Однако кодоньі 238 и 239 бьли отличньії и за ними следовал кодон остановки. Анализ с» последовательности аминокислотньїх остатков белка, проведенньій для С-конца 40000 ІЕМАВ-ВР, вьіделенного о из мочи, показьівает, что он кодируется комплементарной ДНК с размером 4,5тьс. оснований, что определяется последними двумя аминокислотньіми остатками, и таким образом ІЕМАВ-ВР, вьіделенньій из мочи, определен (є) как ІЕМАВ-ВР. Термин "предшественник" в контексте настоящего изобретения используется для обозначения со 50 первичного продукта трансляции, которьій включаєет сигнальньй пептид.

ДНК, кодирующая предшественник усеченной растворимой формьї ІЕМАВ-ВРІ синтезируют с помощью РОК. т» Полученньій продукт РСК вводят в вектор зкспрессий млекопитающего и используют для трансфекции различньїх клеток млекопитающих, таких как СО5 - клетки. Указанньюе клетки зкспрессируют вьісокие уровни, биологически активного рекомбинантного растворимого ІЕМАВ-ВРІ.

Аналогично с помощью РСК, синтезируют ДНК, кодирующую предшественник ІРМАВ-ВРІЇ "Полученньй продукт РСК вводят в вектор зкспрессиий млекопитающего и используют для трансфекции различньїх клеток о млекопитающих, таких как клетки СО обезьянь». Указаннье клетки зкспрессируют вьсокие уровни ко биологически активного рекомбинантного ІЕМАВ-ВРІЇ.

Аналогично с помощью РСК синтезируют ДНК, кодирующую полньій предшественник ІРМАВ-ВРІ. бо Полученньй продукт РСК вводят в вектор зкспрессий млекопитающего и используют для трансфекции различньїх клеток млекопитающих, таких как клетки МІН-3ТЗ мьіши. Указаннье клетки зкспрессируют вьісокие уровни ІЕМАВ-ВРІ человека. Клетки способнь! связьівать интерферон ІЕМ- у2 человека с вьісоким сродством (Ка - 3.6 х 109М). Если совместно зкспрессируют ІЕМАВ-ВРІ человека и ранєе клонированньій рецептор ІЕМАР интерферона ІЄМ- В человека (14) в клетках МІН-3ТЗ мьіши, то сродство комплексного рецептора возрастаєт бо приблизительно в 10 раз (Ка - 4 х 1079М). Маоборот, если в клетках мьіши зкспрессируются лишь ІЕМАР человека, то сродство к ІЕМ - 52 человека не проявляется. Таким образом, составной белок, содержащий два присоединенньх полипептида, один из которьїх имеет область связьівания лиганда ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ, а второй полипептид имеет внеклеточную область ІЕМАР, будет проявлять большее сродство к ІЕМ- о по сравнению с одним ІЕМАВ-ВРІ или одним ІЕМАВ-ВРІЇ.

Сродство ІЕМАВ-ВРІЇ, вьіделенного из мочи, к ІЕМ- 52 человека определяют в системе ВіАсоге ("Рпагтасіа",

Швеция) ІЕМ- 92 иммобилизуют на чувствительньїйй злемент и дают связьввать ІЕМАВ-ВРІЇ. На основе значений

Коп и Коїї получают значение Ка, равное 3,129М. Зто значение очень близко к величине, полученной с клетками

МІН-З3ТЗ3, зкспрессирующими ІЕМАВ-ВРІ.

Рассмотреннье вьше операции клонирования, вьіделения клона, идентификации характеристики и определения первичной структурь! более подробно рассмотрень! далее в Примерах.

ІРЕМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ могут бьїть полученьії из других типов рекомбинантньїх клеток, таких как клетки прокариотов, в частности, Е.сої или клетки зукариотов, таклие как СНО, дрожжевье клетки или клетки насекомьїх. Методьі конструирования подходящих векторов, несущих ДНК, которая кодирует полньій ІЕМАВ-ВРІ и ІЕМАВ-ВРІЇ и пригодная для трансформирования (в частности, Е.соїї и дрожжевье клетки) или инфицирования клеток насекомьїх, с целью получения рекомбинантного ІЕМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ, хорошо известньі из области техники. См. например, А!йзире! ей а). "Ситепі Ргоїосоіїв іп Моіесцшіаг Віоіоду" Сигтепі РгоїосоїЇв, 1993, и затргоок еї аї. едв. "МоЇІесшаг Сіопіпо: А. І арогаїюгу Мапиаї!", 2па ад, Соїа 5ргіпд Нагрог Ргезз, 1989.

Изобретение таюке касаєется активньїх мутеинов и активньїх фракций ІРЕМАВ-ВРІ и ІЕМАВ-ВРІЇ и слитьїх белков, включающих дикие ІЕМАВ-ВРІ и ІЕМАВ-ВРІЇ или их активнье мутейньї или их активньіе фракции, слитье с другим полипептидом или белком и проявляющие похожую способность блокировать биологическую активность ІЕМ- о; и ІЕМ- Д или других цитокинов, которье участвуют во взаймодействиий с рецептором интерферона альфа/бета.

ДНК, кодирующая ІЕМАВ-ВРІ или ІРЕМАВ-ВРІЇ , их активнье фракции, мутеийньії или слитье белки или с операбельно присоединеннье сигналь! транскрипции или трансляции, вводят в векторь! зукариотов, которье о способньі встраиваться в нужную последовательность гена в хромосоме клетки-реципиента. Чтобьі можно бьло вьіделить клетки, которне устойчиво интегрировали введенную ДНК в свои хромосомь!і, используют один или два маркера, которне позволяют провести отбор клеток- реципиентов, содержащих вектор зкспрессии. Маркер может вносить прототрофию в ауксотрофнье клетки, биоцидную резистентность, например, по отношению к - антибиотикам, или сопротивляемость по отношению к тяжельм металлам, таким как медь и т.п. б

Селективньй ген-маркер может бьіть либо непосредственно присоединен к ДНК последовательностям гена, которье нужно зкспрессировать, либо введен в ту же клетку путем совместной трансфекции. Для оптимального ісе) синтеза одноцепоченого белка связьвшания мРНК могут потребоваться дополнительнье злементь!. Зти «о злементьі могут включать сигнальй сплайсинга, а также промоторь! транскрипции, усилители и сигналь

Зо терминации (34). «

С целью зкспрессии белков ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, их активньїх фракций или производньїх, молекула

ДНК, которую необходимо ввести и вьібраннье клетки, преимущественно встрайваєтся в плазмиду или вирусньй вектор, способньійй автономно осуществлять репликацию в клетке- реципиенте. «

Важньми факторами при вьіборе конкретной плазмидьй или вирусного вектора являются: простота распознавания клеток-реципиентов, содержащих вектор, и их селекции из клеток, не содержащих вектор, З с количество копий вектора, которье должнь! бьть воспроизведеньй в данном реципиенте, и в случае "» необходимости, возможность осуществления "челночного" перемещения вектора между " клетками-реципиентами и другими обьектами. Предпочтительньми прокариотньми векторами являются плазмидьї, такие как плазмидь, способньсе к репликации в Е.соїї, например рВР322, СОІЕ1, Рес101 РАСУС, 184 и т.д. (35), плазмидь! Васіїйй5, такие как рС194, рС221І, рТ127 и т.д. (36), плазмидь! Зігеріотусев, в том числе о РіЇ101 (37), бактериофаги Зігеріотусез, такие как ФСЗ31 (38) и плазмидьі! Рзсидотопазг (39,40).

Ге» Предпочтительньми зукариотними плазмидами являются ВРМ вирус основакцинь! ЗМ 40, 2- микронная плазмида и т.д. или их активнье производнье. Указаннье плазмидь! хорошо известнь! из области техники (41 -

Ме, 45). со 50 Как только вектор или последовательность ДНК, содержащие генно-инженернье конструкции, подготовлень для зкспрессии, вектор зкспрессиий можно ввести в соответствующую клетку-реципиент различньіми ї» подходящими способами, такими как трансформация, трансфекция, липофекция, коньюгация, слияние клеток, злектропортация, осаждение фосфатом кальция, непосредственная микроиньекция и т.п.

Клетки-реципиенть, которье следует использовать по настоящему изобретению могут бьть как прокариотньми, так и зукариотньми. Предпочтительньми прокариотньми клетками-реципиентами являются

ГФ) бактерии, такие как Е.соїї, Васійи5, Зігеріотусев, Рзсидотопаз, ЗаІтопеїІа, Зегайа и т.п. и т.п. Найболее предпочтительньми прокариотньіми клетками-реципиентами являются клетки Е.соїї. Бактериями-реципиентами, де представляющими особьй интерес, являются Е.соїї КІ2 штамм 294 (АТСС 31446), Б.соїї Х1776 (АТСС 31537),

Е.соїї МУ3110 (РХ, прототрофнье (АТСС. 27325) и другие кишечньсе бактерии, такие как ЗаІтопеїІа (УуУпітигішт бо или Зеїтайа пагезсепз, а также различнье видьі Рзепдотопавз. В зтих условиях белки не гликозилируются.

Прокариотная клетка-реципиент должна бьіть в совместима с репликоном и контрольной последовательностью в плазмиде зкспрессии.

Однако поскольку ІЕМАВ-ВРІ 6 ІЕМАВ-ВРІЇ являются гликозилированньїми белками, зукариотнье реципиенть! дв йМмеют предпочтение перед прокариотньми реципиентами. Предпочтительньми зукариотними реципиентами являются клетки млекопитающих, в частности, клетки человека, обезьяньі, мьіши и клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО), поскольку они вносят модификации после трансляции в молекуль! белков, включая правильную укладку цепи, правильное образование дисульфидньх связей, а также гликозилирование в нужньх местах. Модификацию пептидов после трансляции, в том числе вьісокую степень гликозилирования маннозь,

Могут осуществлять таюке дрожжевье клетки и клетки насекомьх. Существует ряд стратегий проведения рекомбинации ДНК, в которьїх используются последовательности сильньїх промоторов и плазмид, дающих большое количество копий, которьіе могут бьіть примененьії для воспроизведения нужньїх белков в дрожжевьх клетках и клетках насекомьїх. Дрожжевье клетки узнают последовательность лидира в продуктах подвергнутого клонированию гена млекопитающих и вьіделяют пептидьї, содержащие лидирующую последовательность. 7/0 После введения вектора клетки реципиента вьіращивают в селективной среде, которая вьіборочно способствует росту клеток, содержащих вектор. Зкспрессия подвергнутьїх клонированию последовательностей гена приводит к воспроизводству ІЕМАР-РРІ или ІЕМАР-РРІЇ, слитьїх белков, или мутеийнов или их активньїх фракций.

Зкспрессированнье белки затем вьіделяют и очищают по любой известной методике, включая зкстракцию, осаждение, хроматографию, злектрофорез и т.п. или с помощью аффинной хроматографии с использованием /5 анти- ІРМАВ-ВРІ моноклокальньх антител, иммобилизованньх на гель-матрице, помещенной в колонку.

Неочищеннье препаратьі, содержащие указаннье рекомбинантнье ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, их активнье фракции или производньюе, пропускают через колонку, в которой ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, их активнье фракции или производньюе присоединяются в колонке к специфическому антителу, в то время как примеси прохожят сквозь колонку. После промьівки белок злюируют их геля в условиях, которье обьічно используются для зтой цели, т.е. при вьісоком или низком значений рн, в частности рН им рН 2.

В контексте настоящего изобретения термин "мутейиньі" обозначает аналоги ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, в которьїх один или несколько аминокислотньїх остатков природного ІЕМАВ-ВРІ или ІЕРМАВ-ВРІЇ или их активньх фракций замещень! другими аминокислотами, или удаленьї, или один или несколько аминокислотньїх остатков добавленьі к природной последовательности ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ, не изменяя существенно активность сч ов полученньїх продуктов, по сравнению с диким типом ІРМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ! бли их активньіми фракциями.

Указаннье мутеиньі: получают известньмми синтетическими способами и/или сайт- направленньім мутагенезом о или другими подходящими способами.

Любой подобньійй мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, практически удвоенную по сравнению с последовательностью ІЕМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ, так что они имеют в значительной степени «І напоминающую активность ІЕМАВ-ВРІ и ІЕМАВ-ВРІЇ или их активньїх фракций. Один тип активности ІЕМАВ-ВРІ и

ІЕРМАВ-ВРІЇ заключаєтся в способности связьуваться с одним или большим количеством интерферонов типа І, іа таких как природнье интерфероньй лейкоцитов и фибропластов человека, а также с рекомбинантньми «(о интерферонами человека ІЄМ- о2, ІБМ- оВ, ІЕМ- об и ІБМ- ВД. Поскольку мутеин обладаєт способностью к связьиванию с одним или большим количеством указанньїх интерферонов, его можно использовать для очистки іш зтих интерферонов, например, с помощью аффинной хроматографии, а потому монжо считать, что они «Ж обладают практически аналогичной активностью по отношению к ІЕЄМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ. Таким образом, можно установить, обладаєт ли данньій мутеин практически тойже активностью, что ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ, проведя обьічнье исследования, которье заключаются в тестированиим указанного мутеина с помощью, « например, простого конкурентного анализа с целью определить, присоединяется он или нет к интерферону, содержащему подходящую метку, в частности с помощью радисиммуноанализа или анализа ЕГІЗА. Указанньй с анализ следует повторить с несколькими образцами интерферона типа |, поскольку мутеин, которьй ц связьмваєтся с любьмм образцом интерферона типа І и сохраняет значительную активность ІЕМАВ-ВРІ или "» ІРМАВ-ВРІЇ, обладаєт по крайней мере одной из указанньїх полезностей ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ и, таким образом, обладает по отношению к ним аналогичной активностью.

В настоящем описаний любой подобньій мутеин обладает по крайней мере 40956-ной идентичностью или ьч гомологичностью по оотношению ок последовательности либо ІЕМАВ-ВРІ либо ІЄМАВ-ВРІЇ. Более предпочтительно он обладает 5090-ной по крайней мере 6б090о-ной, по крайней мере 7090-ной, по крайней мере б 80956-ной, а наийболее предпочтительно 9095-ной идентичностью или гомологичностью по отношению к

Ге») указанньім последовательностям.

Мутейиньії полипептидов ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ, или белков, или их активньїх фракций, которье могут шо использоваться в соответствий с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновье кислоть, с» включают ограниченньй набор практически соответствующих последовательностей в качестве пептидов замещения или полинуклеотидов, которье могут бьіть легко полученьї любьім специалистом без проведения большого количества зкспериментов, если взять за основу методики и рекомендации, представленнье в настоящем изобретений. Для подробного описания химийи и структур белков см. 5. Е. Зспціг еї аї, Ргіпсіріев ої

Ргоївеіп Бігисішге, Зргіпдег-Мегпад, Мем Мої 978 и Т.Е. Огеідніоп, Ргоїеіпев: Бігисішге апа Моїіесшаг

Ф, Ргорепіев, МУ. Н. Егеетап 5 Со, Зап Егапвзізсо, 1983, которне приводятся здесь для справки. Для примеров іме) замещений нуклеотидньїх последовательностей, таких как предпочтительнье кодонь,см.А!Їзирбеї еї аї, см,вьіше, в параграфах, А.1.1 - А.1.24, и Затьгоок еї а), см. вьіше, в Приложениях Си Ю. во Предпочтительньми изменениями для мутеинов, в соответствии с настоящим изобретением, являются так назьваемье "консервативнье" замещения. Консервативнье замещения аминокислот в полипептидах, или белках, или активньїх фракциях ІЕМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ могут включать синонимичнье аминокислоть! внутри группьі, которая в значительной степени обладает похожими физико-химическими свойствами, так что замещение между членами группьі приведет к сохранению биологической функции молекуль! (Сгапіпат, 65 Зсіепсе 1974, Мої 185, рр. 862 - 864).

Очевидно, что в указанньїх вьіше последовательностях могут бьїть осуществленьі инсерции или делеции аминокислот, которье не изменяют функции последовательностей, особенно в том случае, если инсерции или делеции затрагивают лишь несколько аминокислот, в частсности, в пределах тридцати, преимущественно менее десяти, и не приводят к перемещению аминокислот, которье являются критическими для функциональной конформации, в частности, остатков цетейина (Апіїпзеп, "Ргіпсіріеєв їТтеї Сомегп Ше Роїаїіпа ої

Ргоївіп СНаіпв", Зсіепсе, 1973, Мої. 181, рр 223 - 230). Белки или мутейиньї, получаемье в результате указанньйх делений и/или инсерции, входят в обьем притязаний по настоящему изобретению.

Предпочтительнье группьї синонимичньїх аминокислот приведеньі в Таблице І. Более предпочтительнье группьї синонимичньїх аминокислот приведеньі в Таблице І, и наийболее предпочтительнье группь 7/0 бинонимичньх аминокислот приведень! в Таблице ПІ.

Таблица 3. Прадпочтительнне груші синонимичних аминокислот

Аминокислота Синонимичнне группн

Бех бек, Тіх, 51у, АБ І

Аха Ага, б1іп, був, сі, Ні

БПеч 112, Рпе, Тук, Меї, Уа1, ГПец

РгО біу, А1а, Тпг, Ркго твЕ Рко, бег, А1а, с1у, Нів, зіп, ТЕ с

Аа с1у, ТПг, Рко, АТа о

Уаї Мес, Рух, Рпе, Ії, Гечп, Уаї сіу А1їа, Тіт, Рго, Бек, сіу 11е Меж, Туг, Рпе, Уа1ї, їецп, І1е

Ре ТтІр, Меє, Тук, І1е, Уа1, цем, Ре чІ

Тук Тир, Меї, Рпе, Т1е, Уа1і, ПБец, Тук

Сув бег, Тік, Сув Ме)

Нів Сі, цув, біп, Тік, Аку, Нів сіп Сі, Був, Ап, Нів, Тік, Ака, Сбіп (Те)

Авт біп, АБр, Бек, Авп

Ту сій, біп, Нів, Ак, Гуз Ге

Авр б1п, АБп, АБЮр с1и АБр, Пув, АБп, сіп, Ніз, АкчЧч, б1ц «Її

Мес РПпе, І1ї1е, Уаї, Печ, Меб

Тер Тер

Таблица ТІ. Болов предпочтительннце групли синонимичньх аминовислот « - с "з Аминокислота Сиконоймичнне гГоУптВ п

ЧК» век век

Ге) Аха Нів, Був, АкЧ

Бен Теч, І1е, Ре, Меє

Ге») Рго діа, рго 20 ТЕ тТЬг се) А1а Рго, А1а

Ууаї Уа1, Меє, І1е

Я» 1У с1у

Іїе Іїе, Меє, Рпе, Ма1ї, Пец

Рпе Мех, Тук, Т1е, Пем, Ре тук Ре, Туг 25 Сув Сув, Бег

Ф! Нів Нів, сіп, АхО ств січ, Сіп, Нів вп Авр, Авп о Ту Ппув, АкФЧ

АвБр Авр, Ап во сій біз, сіл

Мес Меє, Рпе, Ії, уа1ї, гец

Ттр Тер б5

Таблица Ш. Найболеве предпочтительнне группн синономичнихХ аминокислот

Аминокислота Синономи чне Гоуп

Бех вег

Ага Ага

Те Без, Іїе, Меї

РКО РКО тТпг те

А1а то чаї Уа1ї віу ву 11е т11е, Меє, Пец

Рре Рпе 20

Сх тус 5 ме Сув, бех с біп 7 Авт лет і9)

Ту Тув

Азр Ар січ сти тер Ма ІТ1е, Без - е 30 Фо

Примерьї проведения замещения аминокислот в белках, которьіе могут бьіть использованьії для получения мутеийнов полипептидов, или белков, или активньїх фракций ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ для использования по шо настоящему изобретению, включают любье известнье стадии, такие как представленнье в Патентах США РЕ (00 33653,4959314,4588585 и 4737462, вьіданньїх Марку и др., 5116943, вьіданному Котсу и др., 4965195, вьіданном 35 Намену и дрю, 4879111, вьіданном Чонгу и дрю, и 5017691, вьіданном Ли и др., и лизинзамещеннье белки, т приведеннье в Патенте США 4904584 (Шоу и др.).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения любой мутеин ІЕМАВ-ВРІ и

ІЕМАВ-ВРІЇ или их активнье фракции содержат аминокислотную последовательность, практически « соответствующую аминокислотной последовательности ІРМАВ-ВРІ бли ІРМАВ-ВРІЇ. Термин "практически з 79 соответствующий" оотносится Кк белкам включения с небольшим изменениями опо сравнению с с последовательностью природного белка, которне не оказьівают воздействия на основнье свойства природного, :з» белка, особенно если зто касается их способности присоединять один или несколько интерферонов типа І, а следовательно, к способности ингибкровать іп зйш связьивание интерферона типа | с природньім рецептором интерферона типа І. Типом изменений, которье обьчно могут рассматриваться как подпадающие под ї» определение "практически соответствующий", являются такие, которье приводят при использований обьічньїх методик мутагенеза ДНК, копирующей указаннье белки, к незначительньм модификациям и отбору по (22) требуемой активности, как зто описано ранее.

Фу Мутеинь!ї в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемье нуклеийновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которье в строго контролируемьх условиях, гибридизуются в ДНК или РНК, (Се) кодирующую ІРМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение включаєт и

Т» такие нуклеийновье кислоть!ї, которье также полезньі в качестве пробьі для идентификации и очистки нужньх аминокислот. Более того, такие нуклейновьіе кислотьї являются первьіми кандидатами для установления, кодируют ли они полипептид, которьій сохраняет функциональную активность ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІ! по вв настоящему изобретению. Термин "строгие условия" относится к условиям гибридизации и условиям последующей промьівки, которье специалистьі назьвают "жесткими" См. А!йзибреї еї аІ. Ситепі Ргоосоїв іп (Ф) Моїіесшціа Віоіоду, см. вьіше .)піегзсіепсе, МУ, параграф 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и ЗатргоокК еї аї, см. вьіше. Не

Ге внося ограничений в настоящее изобретение, примерь! строго контролируемьх условий включают условия промьівки на 12 - 20"С ниже вьічисленного значения Тт изучаемого гибрида, например, 2 х З5С и 0,595 во додецилсулфоната натрия (505) в течение 5 минут, 2 Х З5С и 0,190 в течение 15 минут, 0,1 х 5С и 0,596 505 при температуре 37"С в течение 30 - 60 минут, а затем 0,1 х 55С и 0,595 505 при температуре 687С 30 - 60 минут. Для специалиста очевидно, что строгость условий зависит также от длиньі! последователькостей ДНК, олигонуклеотидньїх проб (таких как содержащие 10 - 40 оснований) или смешанньїх нуклеотидньїх проб. Если используются пробьї, то предпочтительно применять тетраметиламмонийхлорид, а не 55С, См. А!йзибеї! см. в5 вьіше. Термин "слитьїй белок" относится к полипептидам, включающим ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, или активньсе фракции, или их мутейнь, слитье с другим белком, которьій, например, более длительное время сохраняется в жидкостях, содержащихся внутри тела. ІЕМАВ-ВРІ или ІРЕМАВ-ВРІЇ или их активнье фракции могут, таким образом, бьть слитьі с другими белком, подипептидом и т.п., например, иммуногообулином или его фрагментом.

Термин "соли" в контексте настоящего изобретения относится как к солям по карбоксильной группь,т ак и кислотно-аддитивньїм солям по амино-группе ІЕМАВ-ВРІ, ІРМАВ-ВРІЇ, их активньїх фракции, мутеийнов или их слитьіх белков. Соли по карбоксильной группе могут бьіть полученьі известньми из данной области техники способами и включаютІОнеорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, в частности, образованнье, например, с аминами, такими как 7/0 тризтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокайн и т.п. Кислотно-аддитивнье соли включают, например, соли с минеральньми кислотами, такими как, например, соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Конечно, любье такие соли должньі! обладать практически одинаковой активностью, что и ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ или их активнье фракции. "Функциональнье производньюе", которье используются по настоящему изобретению, охватьвают производнье ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ или производньсе, их активньїх фракций и их мутеинов и слитьїх белков, которье могут бьіть полученьі из функциональньїх групп, встречающихся в виде боковьїх цепочек в остатках либо М- либо С-концевьїх групп, по способам, известньім из области техники, и включаются в обьем притязаний по настоящему изобретению до тех пор, пока они остаются фармацевтически приемлемьми, т.е. они не 2о нарушают активность белка, которая практически аналогична активности ІЕМАВ-ВРІ, ІЕМАВ-ВРІЇ и не вносит токсичньїх свойств в содержащие их композиции. Указаннье композиции могут, например, включать боковье цепочки полизтиленгликоля, которьіе могут маскировать антигеннье сайть! и приводить к увеличению времени пребьівания ІРЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ или их активньїх фракций в жидкостях, содержащихся в теле. Другие производнье включают алифатчческие сложнье зфирь по карбоксильной группе, амидь! по карбоксильной с ов Ггруппе, получаемье по реакции с аммиаком или первичньми или вторичньми аминами, М- ацильнье производнье по свободной амино-группе аминокислотньїх остатков с ацилькьми фрагментами (например, і) алканоильньмми или карбоксильньми ароильньми группами) или О-ацильнье производнье по свободньм гидроксильньїм группам (например, остатков серила или треонила), образованнье с ацильньіми фрагментами.

В качестве "активньїх фракций" ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ, мутеинов или слитьїх белков в настоящем «г зо Мзобретений рассматриваются любье фрагменть! или предшественники полипептидной цепи молекуль! белка, или слитьіе фрагментьї, содержащие любье указаннье фрагменть! ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, самостоятельно Ме или в сочетании с молекулами или присоединенньіми к ним остатками, или агрегать! любьх указанньїх вьіше (ду молекул белка, при условии, что указаннье фракции обладают практически такой же активностью, что

ІРМАВ-ВРІ или ІЕРМАВ-ВРІЇ. ісе)

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим фармацевтически «г приемлемьїй носитель и ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ по настоящему изобретению или их активнье мутейнь, слитье белки и их соли, функциональнье производньсе или их активнье фракции.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению получают для назначения путем смешения

ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ или их производньмх ос о физиологически приемлемьм носителем и/или « стабилизирующей добавкой, и/или наполнителем, и готовят в виде дозировочной формь), например, в с лиофилизацией дозь из пузьірька. Метод назначения может бьіть любьїм, известньім для аналогичньїх средств, и зависит от состояния, лечение которого проводится, в частности, путем внутривенной, внутримьішечной, ;» пОодКожнНОой или местной иньекцией или местньмм использованием или продолжительньм вливанием и т.п.

Количество назначаемого активного соединения будет зависеть ст пути назначения, болезни, лечение которой проводят, и состояния пациента. Местная иньекция, например, требует меньшее количество белка по ї5» отношению к весу тела, чем внутривенное вливание.

Как указьівается в патентной заявке Израйля 106591, белок связьвающий ІЕМ- о/р (или как обозначено іа здесь и ІРМАВ-ВРІЇ) бнгибирует антивирусную активность ІЄМ- о2, ІЄМ- оВ, ІЕМ- оС и ІЕМ- Д, хо не ІЕМ- у, что

Ге) указьіваєт на то, что ІЕМАВ-ВРІ 6 ІРЕМАВ-ВРІЇ являются белками, связьівающими интерферонь!ї общего типа |. с 50 Таким образом, они полезньь для модулирования или блокирования биологической активности различньх субтипов ІЕМ- о; и ІЄМ- Д, например, при диабете І типа, различньїх аутоиммунньїх заболеваниях, при отторжений ї» трансплантантов, СПИДе и аналогичньїх заболеваниях, в которьїх наблюдается ненормальная зкспрессия

ІЄМ- о; или ІЄМ- Д т.е. ІЕМАВ-ВРІ и ІЕМАВ-ВРІЇ могут использоваться в любьїх состояниях, где избьток ІЕМ- о, или ІЕМ- Д либо зндогенно воспроизводится либо вводится зкзогенно. 29 Таким образом, ІЕМАВ-ВРІ и ІРМАВ-ВРІЇ, их активнье фракции, мутеиньї, слитье белки, функциональнье

Ге) производнье и их активнье фракции предназначеньь для лечения аутоиммунньх болезней, других воспалительньїх заболеваний у млекопитающих, для устранения токсичности, вьззванной назначением о интерферона альфа или бета, для лечения ношесткого диабета, красной волчанки и СПИДа.

Как указано ранее, белки по настоящему изобретению могут найти и нетерапевтическое применение, такое 60 как очистка образцов интерферона типа І.

Изобретение включаєт также антитела против ІЕМАВ-ВРІ, ІРЕМАВ-ВРІЇ, их мутеинов, слитьїх белков, солей, функциональньх производньїх и активньїх фракций.

Под термином "антитело" подразумеваются поликлональнье антитела, моноклональнье антитела, химерньсе антитела, актигенотипнье антитела вплоть до антител, которніе могут бьіть помеченьї в растворимой бо или связанной форме, а такке их активнье фракции, полученнье по известньмм методикам, которне включают, однако ими не ограничиваются, ферментативное расщепление, синтез пептидов или рекомбинантнье методь!.

Поликлональнье антитела представляют собой гетерогенную популяцию молекул антител, вбіделяемьх из сьіворотки животньїх, которьім введена вакцина антигена. Мойоклокальное антитело включает практически гомогенную популяцию антител, специфичньїх антигену, при зтом указанная популяция содержит практически одинаковье участки связьвания зпитопа. Моноклональнье антитела могут бьїть получень! по методам, известньім специалистам в данной области техники. См. например, публикацию Копіег апа Міївівїп, Майге 256,: 495 - 497 (1975) Патент США 4376110, монографии А!Їзирбеї еї аї, едз см. вьіше Нагіомжм апа І апе, АМТІВООІЕ5: А

ГАВОКАТОКУ МАМИАЇ, Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу (1988) и Соїйдеп еї аїЇї, ед5», Ситепі Ргоїосоїв іп

Уттпоіоду, Сгееп Рибіїзпіпуд Аввос. апа МУйеу Опіегсіепсе, М. М. (1992, 1993), которне приводят здесь в /о качестве справочного материала. Указаннье антитела могут бьть представителями любого класса иммуноглобулинов, в том числе Ідс, ІМ, ЧЕ, ЗА, СІ О и любого их подкласса. Гибридома, воспроизводящая моноклональньсе антитела по настоящему изобретению, может бьїіть вніращена в условиях іп мігго, іп зйи, или іп мімо. Воспроизводство моноклональньїх антител, с большим титром в условиях іп зйи или іп мімо представляет собой предпочтительньй способ воспроизводства.

Химерньми антителами являются молекульі, разнье части которьїх составленьі из разньїх образцов животного происхождения, таких как имеющие изменяемьій участок, полученньій из муриновьїх моноклональньх антител,и нейзменяемьй участок иммуноглобулина человека. Химернье антитела в основном используют, для снижения иммуногенности и для увеличения вьїхода воспроизводства, например, в том случає, когда муриновье моноклональнье антитела могут бьіть с большим вьіїходом полученьі из гибридом, но обладают большей иммуногенностью в организме человека, так что используют химернье моноклональнье антитела человек/мурин. Химернье антитела и способьі! их воспроизводства из области техники (Сабіїу еї аї, Ргос. Маї).

Асад, сі. ОБА 81: 3273 - 3277 (1984), Моїтівоп еї аї, Ргос. Май. Асад, Зсі ОБА 81: 6851 - 6855 (1984),

Вошіаппе еї аї, Майте 312: 643 - 646 (1984) Кабилли и др., Европейская патентная заявка 125023 (опубликована 14 ноября 1984), Мейрегдег еї аі, Майте 314: 268 - 270 (1985) Танигути и др. Европейская сч об патентная заявка 171496 (опубликована 19 февраля 1985) Моррисон и др. Европейская патентная заявка 125023 (опубликована 5 марта 1986) Нойбергер и др. Международная патентная заявка МУО 8601533 і) (опубликована 13 марта 1986) Кудо и др. Европейская: патентная заявка 184187 (опубликована 11 июня 1986)

Моррисон и др., Европейская патентная заявка 173494 (опубликована 11 марта 1986) Занадап еї аї, 9. дттипої 137: 1066 - 1074 (1986) Робинсон и др., Международная патентная заявка УУО 9702671 (опубликована 7 мая «г зо 1987) Ци еї аЇ, Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 84: 3439 - 3443 (1987), Б!п еї аї, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 84: 214 - 218 (1987), Вецег еї аї, Зсіепсе 240: 1041 - 1043 (1988), и Напом апа І апе, АМТІВООСІЕ5: А ГАВОКАТОКУ б»

МАМОАГ. см. вьіше. Ге

Указанньсе ссьілки на литературнье источники приведень! здесь для справки.

Антигенное идиотипическое антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальнье ісе) з5 детерминанть, в основном связаннье с местом связьвания антигена антитела. Идиотипическое антитело «г может бьіть получено путем вакцинации животного того же вида и генетического типа (например, штамм мьІши), что и Источник моноклонального антитела, с использованиегм моноклонального антитела, для которого приготовлено антигенотипное антитело. Животноє, подвергнутое вакцинации, распознает и реагирует на идиотипические детерминанть! содержащегося в вакцине антитела, вьіделяя антитело по отношению к зтим «

Мдиотипическим детерминантам (антигенное идиотипическое антитело). См. например, Патент США 4699880, ев) с которьїй приводится здвсь для справки.

Антигенное идиатипическое антитело может использоваться также в качестве "иммуногена" с целью вьізвать ;» иммунньй ответ у другого живетного, при зтом воспроизводится так назьшваемое акти-антигенное идиотипическое антитело. Анти-антигенное идиотипическое антитело мокет бьть зпитопно идентично

Мсходному моноклональному антителу, которое вьзвало воспроизводство антигенного идиотипического ї5» антитела. Так, используя антитела по отношению к идиотипическим детерминантам моноклонального антитела, можно определить другие клоньї, зкспрессирующие антитела с идентичной спецдифичностью.

Ме, Таким образом, моноклональньсе антитела, генерированнье против ІЕМАВ-ВРІ, ІЕМАВ-ВРІЇ и родственньйх им б белков по настоящему изобретению, могут использоваться для введения антигенньїх идиотипических антител в организм подходящих животньх, таких как мьіши ВАЇІВ/с. Клетки селезенки, взятье у таких мьішей, подвергнутьсх і, вакцинации, используются для воспроизводства антиидиотипических гибридом, секретируощих ї» антиидиотипические моноклональнье антитела. Более того, антиидиотипические моноклональнье антитела можно связать с носителем, таким как хемоцианин КІН и дополнительно использовать для вакцинации мьішей

ВАЇВ/с. Сьіворотка, взятая у зтих мьішей, будет содержать анти-антиидиотипические моноклональнье антитела, в специфичнье для зпитопа ІРМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ.

Антиидеотипические моноклональнье антитела имеют, таким образом, идиотипические зпитопь, или

Ф) "идиотопь!" структурно похожие на исследуемьй зпитоп, такой как ІЕМАВ-ВРІ или ІЕМАВ-ВРІЇ. ка Также подразумевается, что термин "антитело" включает как неизмененнье молекуль, так и их активнье фракции, такие как, например, Раб и К(аб)2, которне способнь! связьівать антиген. У фрагментов Раб и К(ав)2 бо отсутствуют фрагмент ГРс неизмененного антитела, они бьістрее очищаются при циркуляции и могут обладать меньшим неспецифическим связьіванием тканей, чем неизмененное антитело (умапі еї а! .). Маеї. Меа. 24: 316 - 325 (1983).

Очевидно, что Бар и К(абв)2 и другие фрагменть! антител полезньїх по настоящему изобретению, могут использоваться для определения и качественной оценки ІРЕМАВ-ВРІ, ІЕМАВ-ВРІЇ и родственньїх белков в б5 Соответствимй со способами, приведенньмми в настоящем описаний для неизмененньїх молекул антител.

Указаннье фрагменть! обьічно получают протеолитическим расщеплением, используя такие фрагменть, как папайин (для получения фрагментов Еаос) или пепсин (для получения фрагментов К(аб)2).

Как указьівается, антитело "способно связьівать" молекулу, если оно может специфично взаймодействовать с молекулой, связьіувая тем самьім молекулу с антителом. Под термином "зпитоп" подразумеваєтся та часть любой молекульі, способной связьіваться антителом, которая может бьіть распознана указанньім антителом.

Зпитопьї или "антигеннье детерминанть!" обьічно состоят из аминокислот или боковьїх цепей сахаров и имеют трехмернье пространственнье струкгурнье характеристики, а также специфические зарядовне характеристики. "Антиген" - зто молекула или часть молекуль, способная связьіваться антителом, которая дополнительно может индуцировать у животного воспроизводство антитела, способного связьшваться с зпитопом зтого 70 антигена. Антиген может иметь один или больше зпитопов. Специфическая реакция, о которой сказано вьіше, свидетельствует о том, что антиген будет реагировать вьісоко селективно с соответствующим ему антителом, а не с большинством других антител, которье могут индуцироваться другими антигенами.

Антитела, включая фрагменть! антител, полезньїх по настоящему изобретению, могут использоваться для качественного или количественного определения ІЕМАВ-ВРІ, ІЕМАВ-ВРІЇ или родственньх белков в образце или 75 для детектирования меток, которье зкспрессируют указанньюе белки по настоящему изобретению. Зто может бьїть достигнуто методами иммунофлюоресценции с использованием флуоресцентно меченого антитела (см. далее) в сочетаний с оприменением ооптического микроскопа, с цитометрическими измерениями и флюорометрическими измерениями.

Антитела (или их фрагментьї), полезньіе по настоящему изобретению, могут применяться гистологически, как при иммуфлуоресцентной или иммунозлектронной спектроскопии, для определения ІЕМАВ-ВРІ, ІРМАВ-ВРІЇ или родственньїх белков по настоящему изобретению. .п зіш определение можно провести, взяв гистологический образец у пациента и введя меченное антитело по настоящему изобретению в зтот образец.

Антитело (или фрагмент) преймущесгвенно вводят, присоединяя меченое антитело (или фрагмент) к биологическому образцу. При использований зтой процедурь! становится возножньм определить не только с присутствие ІЕМАВ-ВРІ, ІРЕМАВ-ВРІЇ или родственньїх белков, но и их распределение в исследуемьїх тканях.

Используя настоящее изобретение, специалист должен понимать, что любье гистологические методь (такие і) как процедура окрашивания) могут бьіть модифицировань, с целью провести указанное определение.

Указаннье методьї анализа для ІЕМАВ-ВРІ, ІЕМАВ-ВРІЇ бли родственньїх белков по настоящему изобретению обьічно заключаются в инкубации биологического образца, такого как биологическая жидкость, зкстракт ткани, чу свежевьращеннье клетки, такие как лимфоцить! или лейкоцить, или клетки, которне подвергают инкубации в культуре ткани, в присутствий надежно меченого антитела, способного идентифицировать ІРЄМАВ-ВРІ Ф

ІЕРМАВ-ВРІЇ или родственнье белки, и в детектирований антитела любьм из многочисленньїх методов, хорошо «о известньїх из областе техники.

Биологический образец можно нанести на твердую основу или носитель, такой как нитроцеллюлоза или ї-о другую твердую основу или носитель, которьій способен иммобилизовать клетки, частицьй клеток или «Ж растворимье белки. Основу или носитель затем можно промьїть подводящим буфером, а затем обработать надежно меченьїм антителом в соответствии с настоящим изобретением. Твердая основа или подложка может бьіть промьта буфером во второй раз, с целью удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки « на указанной основе или носителе можно затем определить обьічньіми способами.

Под терминами "твердофазная основа", ""вердофазньій носитель", "твердая основа", "твердьій носитель", - с "основа" или "носитель" подразумевается любая основа или носитель, способнье связьівать антиген или ц антитела. Хорошо известньми основами или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, "» полизтилен, декстран, найлон-амилаза, природная и модифицированная целлюлоза, полиакриламид, габр и магнетит. Для целей настоящего изобретения носитель по своем природе может бьть как частично растворимьм, так и не растворимьм. Материал основьі может иметь практически любую структурную щ» конфигурацию, лишь бьї связанная молекула могла присоединяться к антигену или антителу. Так, конфигурация о основьі или носителя может бьїть сферической, как шарик, или цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки, или внешняя поверхность стержня. Или же поверхность может бьіть плоской, такой как лист бумаги,

Ге») индикаторная бумага и т.п. Предпочтительньіми основами или носителями являются полистирольнье шарики. Специалистам в данной области техники известньь многие другие подходящие носители или связьівания і антитела или антигена, либо же они могут подьсскать подходящий носитель, используя рутиннье зксперименть. т» Способность к связьванию для данной серии антител в соответствии с настоящим изобретением может бьїть определена в соответствии с хорошо известньми способами. Специалистьі в данной области техники смогут вьібрать оперативнье и оптимальнье условия проведения анализа для каждого определения, применяя рутиннье способь!ї зксперимента.

При проведений анализа могут бьіть добавленьі другие операции, такие как промьівка, перемешивание, о встряхивание, фильтрование и т.п., что является обьічньім или необходимь!м в каждой конкретной ситуации. іме) Одним из способов, позволяющих надежно пометить антитело по настоящему изобретению, является связьівание его с ферментом и применение ферментативного иммуноанализа (ЕЇІА). В свою очередь, указанньй бо сегмент, нанесенньй на подходящую основу, будет взаймодействовать с субстратом так, что образуется химический фрагмент, которьій может бьіть обнаружен, например, спектрофотометрически, флюоронетрически или визуальньми методами. Ферментом, которьій может бьть использован, с целью надежно пометить антитело, является, но им не ограничивается, малат-дегидрогеназа, стафилококк-нуклеаза, дельта -5- стероид-изомераза, дрожжевая, алкоголь-дегидрогеназа, альфа-глицерофосфат-дегидрогеназа, 65 триозафосфат-изомераза, пероксидаза Ххрена, алкалиндосфатаза, аспа-рагиназа, глокозооксидаза, бета-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо- 6- фосфатдегидрогеназа, глюксоамилаза и ацетилхолиностераза. Детектирование можшо провесги колориметрическими способами, в которьїх используют хромогенньй субстрат для фермента. Детектированиег можно также провести визуальньм сопоставлением степени протекания ферментативной реакции субстрата по сравнению с аналогично приготовленньіми стандартами.

Детектированиеге можно осуществить, используя многие другие иммуноанализь. Например, с помощью радисактивной метки антител или фрагментов антител можно определить ІЕМАВ-ВРІ или ІРМАВ-ВРІЇ, используя радисиммуноанализ. Хорошую методику проведения радисиммуноанализа можно найти в монографии Т. 5.

МУогКк еї а! Іарогаїогу Тесптдцевз апа Віоспептівігу іп МоїІесшіаг Віоіоду, Могій НоПйапд Сотрапу, МУ (1978), в /о частности в главе под названием "Ап .пігодисіоп о Кадіоїттипе Авззау апа Кеїатєй Теспідцев", которая приводится здесь для справки. Радиоактивньй изотоп может бьть определен с помощью счетчика гамма-излучения или сцинтилляционного счетчика или методом авторадиографии.

Можно также пометить антитело по настоящему изобретению с помощью флюоресцентного соединения.

Если содержащее флюоресцентную метку антитело освещают светом с нужной длиной волньі), то его /5 присутствие можно определить благодаря флюоресценции. Среди найболее часто используемьх для метки флюоресцентньїх соединений можно назвать изотиоцианат флюоресцеина, родамин, фикозритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фгалевьй альдегид и флюоресцамин.

Антитело можно также надежно пометить, используя флюоресцентнье металль, такие как 122Еи или другие лантанидь. Зти металль! могут бьігь присоединень к антителу с использованием таких хелатирующих металль! групп, как дизтилентриамин-пентауксусная кислота.

Антитело можно также надежно пометить, путем присоединения к биотину. Биотинилированное антитело можно затем обнаружить авидином или стрептоавидином, связянньмм с флюоресцентньім соединением или с ферментом, таким как пероксидаза, или с радисактивнь/м изотопом и т.п.

Антитело можно также надежно пометить, связьввая его с хемилюминесцентньмм соединением. Присутствиє су хемилюминисцентно меченного соединения определяют, обнаруживая появление люминесценции, которая возникает при протеканий химической реакции. Примерами найболее полезньїх соединений для і) хемилюминесцентной метки являются люминол, изолюминол, тероматический акридиновьй зфир, имидазол, соль акридина и сложньй зфир щавелевой кислоть.

Аналогично, для метки антитела по настоящему изобретению можно использовать биолюминесцентное «Її соединение. Биолюминесценция является разновидностью хемилюминесценции, которая проявляется в биологических системах, в которьїх каталитически активньй белок увеличивает зффективность б хемилюминесцентной реакции. Присутствие биолюминесценткого белка определяют, обнаруживая появление Ге) люминесценции. Важньми биолюминесцентньми соединениями, используемьми для нанесения метки, являются люциферин, людифераза и акворин. і-й

Молекула антитела по настоящему изобретению может бьть адаптирована для использования в «І иммунометрическом анализе, известном также как "двухсайтньй" или "сзндвичевьй" анализ. В обьічном иммунометрическом анализе некоторое количество не содержащего метку антитела (или фрагмента антитела) наносится на твердую основу или носитель и добавляют некоторое количество надежно меченного « растворимого антитела, с целью осуществить детектирование и/или количественную оценку тройного 70 Комплекса, образованного между антителом на твердой фазе, антигеном и меченьїм антителом. - с Типичньій и предпочтительньй, иммунометричзский анализ включает "прямье" анализь, в которьх й антитело, присоединенное к твердой фазе, вначале контактирует с исследуемь!м образцом, с целью зкстракции "» антигена из образца за счет образования бинарного комплекса антитело на твердой фазе-антиген. По истечениимй необходимого инкубационного периода твердую основу или носитель промьшвают для удаления остатков жидкого образца, в том числе непрореагировавший антиген, если он остался, а затем она «» взаймодействует с раствором, содержащим неизвестное количество меченого оантитела (которьй

Ф функционирует как "молекула-репортер"). После второго инкубационного периода, в течение которого меченное антитело образует комплекс с антигеном, связанньм с твердом основной или носителем с помощью не б содержащего метку антитела, твердая основа или носитель промьівается второй раз, с целью удаления не прореагировавшего меченого антитела. ї-о В другом типе "сзндвичего" анализа, которьій может бьіть также полезен для антигенов по настоящему

Чл» изобретению, используется так назьіваемье "одновременньй" или "обратньій" анализьі. "Одновременньй" анализ включаєт проведение одной стадии инкубации, во время которой антитело, связанное с твердой основой или носителем, и меченое антитело одновременно добавляются к исследуемому образцу. По завершения инкубации твердую основу или носитель промьтявают для удаления остатков жидкого образца и меченого антитела, не образовавшего комплекс. Присутствие содержащего метку антитела, связавшегося с о твердой, основой или носителем, затем определяют как и в обьічном "прямом" сзндвичевом анализе. ко "В обратном" анализе последовательно добавляют к жидкому образцу вначале раствор содержащего метку антитела, а затем не содержащее метку антитело, нанесенное на твердую основу или носитель после бо соответствующего инкубационного периода. После второй инкубации твердую фазу промьвают обьічньм образом, чтобь! освободить его от остатков исследуемого образца и раствора не прореагировавшего меченого антитела. Определение содержащего метку антитела, связанного с твердой основой или носителем, затем проводят также, как и в "одновременном" и "прямом" анализе.

В настоящем изобретении заявляются также молекульї ДНК, кодирующие любье белки по настоящему 65 Мзобретению, как указано ранеє, способнье реплицироваться носители зкспрессии, содержащим любую из указанньїх молекул ДНК, клетки-реципиентьі, трансформированнье с помощью любого из указанньїх носителей,

зкспрессии, включая прокариотнье и зукариотнье клетки и клетки- реципиентьі, преимущественно клетки СО5 обезьянь.

В изобретении описьюваєтся также способ получения любого белка по настоящему изобретению путем Вращивания трансформированньх клеток в соответствий с настоящим изобретением и вьіделения кодируемого молекулой ДНК и вносителем озкспрессии внутри указанньїх трансформированньх клеток-реципиентов.

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими настоящее изобретение. 70 Пример 1. Определение последовательности аминокислот в ІЕМАВ - ВРІЇ, вьіделенном из мочи.

Чистьй ІРМАВ - ВР, полученньй, как указано в патентной заявке Израиля 106591, наносят на мембрану из поливинилдифторида (Рго-Зріп, "Аррієй Віозузіетв", США), и подвергают мембрану анализу с целью определения первичной структурьі да микроанализаторе модели 475 ("Арріїед Віозузвіетв", США). Получена следующая главная последовательность:

Авр-Бек-Рго-Авр-Тук-Тпх-Азр-б1ц-Бех-Агу-Твг-Рре-руз-Т1е-Ака-ьео-

Ага 108580и.и1666155:.

Далее, определяют второй полипептид, содержащий три дополнительньх аминокислотньїх остатка (Пе-ххх-Туг) на М-конце основной последовательности (ххх обозначает неидентифицированную аминокислоту). Полученная последовательность полностью отличается от уже известного рецептора ІЄМ- В (ІЕМАВ-, ссьілка 14) и она отлична от любого известного белка. Она отличается также от любого белка, кодируемого известной ДНК последовательностью, что установлено поиском в базах данньїх Зм/іззргої и Сеперапк с использованием программь! РавзіА (33). Таким образом, зтот белок является новьім белком, связьівающим ІЕМ- у. Методом изолирования клонов комплементарной ДНК (см. далее) бьіло установлено, что остаток 10 представляет собой с

Сув, а не Аго, а остаток 15 представляет собой Зег, а не Аг4. Более того, ххх идентифицирован как зег. Го)

Известно, что Суз нельзя определить с помощью микроанализатора аминокислотной последовательности, а Зег иногда разрушается при проведений анализа, а потому его нельзя определить.

Образец ІРМАВ - ВР, вьіделенного из мочи, ферментируют с помощью СМВг, разделяют на 505 - РАОЕ и наносят в виде пятна на мембрану из поливинилендифторида. На мембране после окрашивания с помощью З

Соотазззге Біе вьіделяют смесь отдельньїх пептидньїх полос, обозначенньіїх как сб1 -сб7. Каждую полосу Ф иссекают и подвергают микроанализу для определения первичной структурь! молекуль!. Один из зтих пептидов, сЬ7, имеет размер меньше 10000 и дает следующую внутреннюю последовательность (реальная о последовательность начинаєтся с Ме): Ге)

Меє-Уа1-рув-Ріе-Рко-бЗек-І1е-Уа1-611-611-61:-Беп-бі1п-Рае-Азр- рец- « 1 . . - 5 - . . . 10. . - - 15 .

Фек-Пец-Уа1-І1е-с13-б14-б1йп-5ек-51ч-51у-11е..., « 4900и20и11.0025. 21 - с Другой пептид, ср3, имеет следующую последовательность (реальная последовательность начинается с :з» Мед: Й

Мес-Зек-рув-Рко-б611-Азр-цец-Був-Ма1-ЧУа1-Був-Авп-ХХХ-А1а-Авп- й 145 1003400300я500015 ї ТтіПЕ-ТВЕ-Акгкд....

Ге) «0018

Остаток 13 позднее идентифицирован как Суз, что определяют в процессе установления первичной

Фо структурьі комплементарной ДНК (см. ниже). Остатки Суз невозможно идентифицировать при проведений

Те) 20 микроанализа для определения первичной структурь! белка.

Другой пептид, срб, имеет следующую последовательность (реальная последовательность начинается с

Т» Мед):

Мек-бек-с1у-ХХХ-Ріпе-Тіпг-Тук-І1е-І1е-Азр-Пувз-Гец-112а-Рго-Авіп- 1 . . . 5 . . . . 18 . - . . 15

Ф) ТВк-Авп-тТук...-- іме) 6.18

Остаток 4 позднее идентифицирован как Авзп, что определяют в процессе установления первичной бо структурьі комплементарной ДНК (см. ниже). Зто остаток Азп является частью потенциальной сигнальной последовательности гликозилирования (Азп-РПе-ТНг) и отсутствие Азп в последовательности белка указьіваєт на то, что он действительно подвергнут гликозилированию.

В другом пептиде полось! бьіли идентифицированьі в процессе определения первичной структурь! как продуктьї неполной ферментации под действием СМВг. Они имеют последовательность либо М- концевого бо участка, ранее определенного для ІЄМАВ - ВР, или ту же самую внутреннюю последовательность,что и сб3, соб или сбр7.

Пример 2. Анализ первичной структурь! белка С-концевого пептида ІЕМАВ - ВРІЇ, вьіделенного из мочи.

Образец ІРМАВ - ВРІЇ, вьіделенного из мочи (приблизительно 1Омкг) восстанавливают с помощью ДДТ, алкилируют ийодацетамидом и подвергают ферментации с зндопротеийназой Гуз С ("Воейгіпдег Мапппіет,

Германия) в соотношении фермент-субстрат, равном 1:50. Полученную смесь пептидов разрешают с помощью жидкостной хроватоградии вьісокого давления с обращенной фазой на колонке с КРІ18 (Адиароге КРІВ, "Віозузіетв пс"), применяя градиент ацетонитрила в 0,196-ном водном растворе трифторуксусной кислоть.

Индивидуальнье пики пептидов связьівают ковалентне с мембраной из Зедиаіоп АА ("Міїїроге, Бедфорд, штат 7/0 Массачусетс) и подвергают анализу на определение М- концевой последовательности, как указано ранее. Один из пептидов идентифицирован как С- концевой пептид, имеющий следующую последовательность: ор. Тіх, Ди. іди. Ро. Рао. фу. Сби. Ци. Ге». він. ре. беь нн КО А А 19 С-концевая последовательность соответствует последовательности клона комплементарной ДНК размером 4,5тьіс. оснований (см. далее) и ее можно отличить от предлагаемого белка, кодируемого комплементарной ДНК размером 1,5бтьісє. оснований с последними двумя аминокислотньіми остатками (Рпе12-Зег13 вместо Зег-Аїа).

Таким образом, растворимьій рецептор, вьіделенньій из мочевиньі, идентифицирован как ІЕМАВ - ВРІЇ. Он независимо транслируеєтся из специфической мРНК размером 4,Ббтьісє. оснований и не образуется при распространений рецептора поверхности клетки.

Пример 3. Конструкция смьіслового и антисмьслового праймеров и идентификации невьрожденной последовательности ІЕМАВ - ВР комплементарной ДНК.

Последовательность пептида сб7 обратно транслируют в смьісловой (аминокислоть 1 - 8) и антисмьісловой (аминокислотьі 27 - 20 праймерь). Декануклеотидьь и нонануклеотидь, включающиє последовательности /-ЄМ рестрикции зндонуклеазьі, соответственно, Ватн І и За! І добавляют к 5' концам олигонуклеотидов праймера г) (фиг1А). Полную РНК зкстрагируют из клеток Дауди и клеток УУМІЗН и первую цепочку комплементарной ДНК генерируют ообратной транскриптазой, используя з качестве праймера либо смесь антисмьісловьх олигонуклеотидов либо -олиго-4(Т). Полученньій фрагмент амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакцией (РСР) используя совместно. Смьісловье и антисмьісловье праймерь. Анализ продуктов РСР на в

З395-ном геле агарозьі показьіваєт ожидаємую полосу размером 101 пар оснований, полученную с помощью Ге»! комплементарной ДНК как из клегок Дауди, так и клеток УМІЗН (фиг.18). Фрагмент размером 101 пар основаній отрезают с помощью Ватн І! и зЗаї І. клонируют на рВішпевзсгірі І К5 ("Зігаїадепе") и определяют первичную о структуру 5 клонов. Последовательность участка, фланкированного смьсловьми и оантисмьісловьми «(о праймерами, инвариантна и кодирует ожидаемую последовательность аминокислотньх остатков 9 - 19 пептида сь7 (фиг.1С). Затем синтезируют олигонуклеотид размером 85 пар оснований, соответствующий в невьірожденной внутренней последовательности и используют его для скрининга библиотек комплементарньх

ДНК.

Пример 4. Идентификация частичньїх клонов комплементарной ДНК ІРМАВ - ВРІ. «

Синтетический невьірожденньйй олкгонуклеотид размером 35 пар оснований по Примеру 2 метят с помощью З 70 ГРІ и используют для скрининга библиотеки лямбда дії комплементарной ДНК клеток человека Не/ а с ("Сіопіесп"). Идентифицированьі пять клонов. Один из зтих клонов, обозначенньй 910, содержит вставку "з размером 1,4тьісє. оснований. Определение первичной структурь клона 910 опозволяет вьіделить последовательность, содержащую открьтую рамку считьвания генетической информации, в которой идентифицировань сигнальньй пептид, внеклеточная область, трансмембранная область и часть, 75 внутриклеточной области (фиг.2). Последовательность ДНК, кодирующая М-концевую последовательность е белка, а также первичную структуру трех СМВг пептидов сб3, соб, и ср7, ІЕМАВ - ВР, вьіделенного из мочи, (є) идентифицируют с помощью внеклеточной области, кодируемой ДНК клона 910. Некоторье остатки Суз и Зег (не подчеркнуть, фиг.2) не бьіли корректно определень! в процессе установления первичной структурьі. Тем не

Ф менее известно, что методьї, используемье при установлений первичной структурь! белка не позволяют назвать (се) 20 остатки Суз, а часто теряются и остатки Зег. Не бьіли также определеньі остатки Азп в пептиде сбб, что

І» указьівает на то, что подвергнут гликозилированию. Сравнение последовательности ДНК клона 910 о базой данньїх Сепеграпк не вьіявляет идентичности с какой-либо последовательностью. Таким образом, клон содержит новую последовательность ДНК.

Пример 5. Нозерн-блоттинг анализ мРНК человека. 59 Пробу ДНК, содержащую радиоактивную метку, получают из клона 910 и используют для гибридизации по

ГФ) методу нозерн-блоттинга поли - А ї- мРНК от двухклеточньїх линий человека: Дауди и УУІЗН. В обоих случаях 7 наблюдают две специфические линии, одну, соответствующую 1,5тьіс. оснований, и вторую, соответствующую 4,5тьіс. оснований. На основе интенсивности полос оценивают, что количество мРНК лазмером 1,5тьс. во оснований приблизительно вдвое превьшаєт количество мРНК размером 4,Ббтьісє. оснований. Сигнал, полученньй от РНК из клеток МУІЗН едва различим, в то время как сигнал РНК из клеток Дауди (фиг.3) хорошо заметен. мРНК размером 1,5тьіс. оснований транслируют в предшественние ІЕМАВ - ВРІЇ, которьій является рецептором интеферона на поверхности клетки. Более длинная мРНК представляет собой другую матрицу, кодирующую отличньй белок, у которого совпадаєт с ІЕМАВ - ВРІ оо крайней мере 100 аминокислотньх дв остатков. Указанньїйй белок является предшественником ІЕМАВ - ВРІЇ, которьй, как позднее показано, является рецептором интеферона - о/р.

Пример 6. Идентификация клонов полной комплементарной ДНК ІРЕМАВ - ВРІ 6 ІЕМАВ - ВРІЇ.

Библиотека моноцитньїх комплементарньїх ДНК, сконструированная в фаге рРСЕМО (У. 5. СцКкіпд ейаї. Сеїі.

Віої. 1991, Мої. І. рр. 1500 -1507), подвергается затем скринингу пробой размером 397 пар оснований, полученной с помощью РСР от кодирующего фрагмента клона 910. Нами вьіделено 22 клона со вставкой размером 1,5тьс. оснований и два клона со вставкой размером 4,5тьс. оснований от 109 независимьх фагов.

Проводят анализ последовательности ДНК двух клонов размером 1,5тьіс. оснований (РСЕМО9-тб и рРСЕМО-т24), а также полной открьітой рамки считьіївания генетической информации двух клонов размером 4,5тьіс. оснований (ХРСЕМО9-т19 и ХрСЕМО-т27). Клоньії размером 1,5тьісє. оснований, кодируют полньій предшественник ІЕМАВ - 70 ВРІ, которьій является рецептором на поверхности клеток, с открьїтой рамкой считьівания генетической информации размером 331 кодонов (фиг.4). Белок и пептидную последовательность СМВг, полученную из

ІРЕМАВ - ВР, вьіделенного из мочи (подчеркнут пунктиром, фиг.4) идентифицируют транслированной последовательностью ДНК. Частичное определение первичной структурьі двух клонов размером 4,5тьс. оснований вьіявило ту же 5' последовательность из 237 клонов, что и содержащаяся в клонах размером 1,5тьс. 75 оснований, за которой следует другая последовательность, включающая сигнал терминации после кодона 239 (фиг.5). В общем, различаются следующие кодоньі: кодон 13 (Іеи вместо НІЗ), кодон 108 (ТАг вместо Пе) и кодоньі 238 - 240 (РПпе-Зег-Зіор вместо Зег -Аіа-бег). Ни в одной из трех рамок считьївания генетической информации в обоих клонах размером 4,5тьіс. оснований после стоп-кюодона не бьло найдено ни одной открьітой рамки считьівания генетической информации. Следовательно, клоньї комплементарной ДНК размером 4,5тьіс. оснований кодируют предшественник усеченного растворимого рецептора, которьій представляет собой

ІРМАВ - ВРІЇ, идентичньій по своей С-концевой последовательности рецептору, вбіделенному из мочи. Две

МРНК, кодирующие предшественники обоих белков, как ІЕМАВ - ВРІ, так и ІРМАВ - ВРІЇ, получают из того же гена, вероятно путем альтернативного сплайсинга.

Пример 7. Конструкция вектора зкспрессиий человека и воспроизводство рекомбинантньїх ІЕМАВ - ВРІ и Ге |ЕМАВ - ВРІЇ ДНК, кодирующую сигнальную последовательность и внеклеточную область ІЕМАВ - ВРІ, (5) генерируют путем РОК с помощью МЕМТ ДНК полимеразь! ("5ігаїадепе"), используя синтетические смьІісловье и антисмьісловье праймерьї, содержащие сайть! рестрикции Хба І (фиг.бА) и используя в качестве матриць! 4910

ДНК. Полученньій в результате РСК продукт (фиг.6В) разрезают с помощью Хра | и сшивают с вектором зкспрессиий рЕЕ-ВО5, получая реєЕ-ВО5-І-ІЕМАВ-ВР-Ї (фиг.бС, ссьілка 46). Генетическая конструкция, «І подтверждается определением последовательности ДНК. Способнье к трансформации Е.соїї трансформируют б и получают клоньї, содержащие последовательность ІЕМАВ - ВРІ р нужной ориентации. Для трансфекции клеток обезьяньї используют генетическую конструкцию рРЕЕ-ВО5-5АВК. Указаннье клетки зкспрессируют 12нг/мл (Се) рекомбинантного растворимого ІЕМАВ - ВРІ, которьій получают из жидкости над клеточной культурой, что с определяют методом анализа ферментного иммуносорбентного анализа ЕЇІ5А и по его способности ингибировать биологическую (антивирусную) активность альфа и бета интерферона человека. Аналогично Ж фрагмент ДНК, кодарущий ІРМАВ - ВРІЇ в клоне размером 4,5бтьісє. оснований, вводят в вектор зкспрессий млекопитающего, как зто описано для внеклеточной области ІЕМАВ - ВРІ, и используют для трансформации клеток. Зти клетки воспроизводят активньій ІРМАВ - ВРІЇ, которьій секретируется в среду вьіращивания « указанньїх клеток.

Пример 8. Конструкция зукариотического зкспрессирующего вектора и зкспрессия ІРМАВ - ВРІ и ІРЕМАР р ші с мьішиньїх клетках ДНК, кодирующую полньй ІРМАВ - ВРІ, генерируют путем РСК с помощью МЕМТ ДНК "» полимеразь! ("Зігаїадепе"), используя синтетические смьісловье и антисмьсловье праймерьі, содержащие " сайть! рестрикции Хба | и используя в качестве матриць плазмиду РСЕМО-тб. Полученньй в результате РСР продукт разрезают с помощью Хра | и сшивают с вектором зкспрессиий РЕЕ-ВО5, получая РЕЕ-ВО5-ІЕМАР.

Комплементарную ДНК, соответствующая ІЕМАР (14) генерируют с помощью КТ-РСК (48), используя пи специфические олигонуклеотидь. Размноженньй продукт клонируют в сайт рестрикции ХБра | вектора

Ф зкспрессий РЕЕ-ВО5 (46), получая РЕЕ-ВО5-ІЕМАК. Указанная генетическая конструкция подтверждается определением последовательности ДНК. Способнье к трансформации Е.соїї трансформируют и получают

Ме, клоньї, содержащие последовательности ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАР в нужной ориентации. со 50 Получают муриновье клетки, устойчиво зкспрессирующие клонированнье комплементарнье РНК ІЄМАВ -

ВРІ. Зкспоненциально растущие клетки МІН-ЗТЗ (1,5 х 109) на пластинах размером 1Осм подвергают ї» совместной трансфекции методом осаждения фосфатом кальция (49) вместе с реМ2пео (2мг) и

РЕЕ-ВО5-ІРМАР (ТОцкг ДНК). Независимо идентифицируют и субклонируют колоний, резистентнье к 6418.

Клоньі, зкспрессирующие вьісокие уровни ІЕМАВ - ВРІ, идентифицируют путем связьшвания антитела против

ІЕМАВ - ВРІ, вьіделенного из мочи и путем связьівания 122І-ІЕМ-а2 (Таблица ІМ). (Ф, Для связьвания анти ІЕМАВ - ВРІЇ антител клетки (1 х 10927) вьісевают в ячейки размером З5мм (пластинь! с 6 ка ячейками, ("Созіаг") и вниіращивают до слияния (20час.). Клетки промьівают с помощью модифицированной по способу Дульбекко средой Игла, содержащей 2905 сьіворотки плода коровь и 0,195 азида натрия (среда Воша) с бо последующей инкубацией в течение 20 минут со средой Воша. Антитела анти ІРМАВ - ВРІЇ кролика (2мл, 1:500 в среде Воша) добавляют к промьтьм клеткам и вьідерживают клетки в течение 2 часов при комнатной температуре. Клетки промьівают З раза, добавляют 122|-белок А (2мл, 250000 отсчетов в минуту в среде Воша) и клетки вбідерживают еще в течение 4 - 5 минут. Клетки промьввают З раза, собирают с помощью трипсина и проводят подсчет. бБ Для связьшвания 122І-ІЄМ-у2 клетки (1 х 10727) внісевают в ячейки размером Збмм (пластинь с б ячейками, "Созіаг") и вьиіращивают до слияния (20час.). Клетки промьівают с помощью модифицированной по способу

Дульбекко средой Игла, содернащей 295 сьіворотки плода коровьі и 0,195 азида натрия (среда Воша) с последующей инкубацией в течение 20 минут со средой Воша. Добавляют 1291-ІЕМ-а2 (2 - З х 109 отсчетов в минуту, 109 единиц/мг, 5 х 10 отсчетов в минуту) и вьідерживают еще в течение 2час. при комнатной температуре. Клетки промьівают З раза, собирают с помощью трипсина и проводят подсчет.

После озкстрагирования позитивньх клонов (в частности, клона 369.11) с помощью детергента в невосстанавливающих условиях из ЗОЗ-РАСЕ с последующим иммуноблоттингом с указанньім вьіше антителом получают сильную полосу с массой приблизительно 51кДа (фиг.7).

Мьішинькюе клетки, зкспрессирующие ІЕМАР, получают аналогично путем трансфекции плазмидов 70 рРЕЕ-ВО5-ІЕМАК. Клон Мо470.6 является ІРМ АР- позитивньїм, что определяют по способности ІЕМ- 5В человека зффективно привносить антивирусную ответную реакцию в указаннье клетки. Как и ожидалось, другие интеферонь! типа І (в частности, ІЕМ- у) не активнь в клоне 470.6.

В клоне 369.11 и 470.6, зкспрессирующие ІЕМАВ - ВРІ и ІЕМАК, методом трансфекции вводят белок комплементарного рецептора (РЕЕ-ВО5-ІЕМАК и рЕЕ-ВО5-ІЕМВК, соответственно). С целью достижения 75 устойчивой совместной зкспрессии в клоньї, резистентнье к 6418, зкспрессирующие либо ІЕМАЕВ либо ІЕМАВ -

ВРІ, методом трансфекции вводят реМ2 уейдго (2мкг) совместно с РЕЕ-ВО5-ІЕМАВК или рЕЕ-ВО5-ІЕМАК, как указано ранее. Вьіделяют и субклонируют клоньі, резистентнье к гигромицину и 6418, которье совместно зкспрессируют как ІЕМАК, так и ІРМАВ-ВР. ІРМАК- позитивнье клонь), полученнье из клона 369.11, идентифицируют по их антивирусному отклику по отношению к ІЕМ- В человека, в то время как ІЕМАВ - ВРІ- позитивнье, полученнье из клона 470.6, идентифицируют путем связьшвания антител анти- ІЕМАВ - ВРІЇ и 125І-ІЕМ- 42. Клон 508.12, полученньій из клона 369.11 и клон 1306, полученньій из клона 470.6, связьуівают как 125І-ІЕМ- у2, так и антитело ІЄМ- о/р К (Таблица ІМ). Далее, они откликаются на интерферон ІЕМ- оВ з антивирусном тесте. Таким образом, мьї делаем вьівод, что зти клонь! зкспрессируют как ІЕМАВ - ВРІ, так сч ов ЕМАК. о ч зо Сюеямя 10101000 6ю

Ф

Ф

Фо

З

Пример 9. Определение сродства ІЕМАВ - ВРІ, зкспресспрованньх в мьішиньх клетках.

Клонь, зкспрессирующие либо ІЕМАР либо ІЕМАВ - ВРІ, исследуют не связьіваниє 129РІ-пи ІРМ- 42 и даннье « по связьіванию оценивают по анализу Скзтчарда. Клетки (1 х 109) внісевают в ячейки размером З5мм (пластинь с в'ячейками, "Созіаг") и вніращивают до слияния (20час.). Клетки промьівают с помощью модифицированной по не) с способу Дульбекко средой Игла, содержащей 295 сьіворотки плода коровьі 0,190 азида натрия (среда Воша) с "з последующей инкубацией в течение 20 минут с той же средой. Добавляют 7292І-ІЄМ- у2 (2 - З х 102 отсчетов в минуту, 109 единиц/мг, 5 х 10! отсочетов в минуту) вместе с указанньіми концентрациями не содержащего метку

ІЕМ- 92 и вьідерживают еще в течение 2час. при комнатной температуре. Клетки промьівают З раза, собирают с ї» помощью трипсина и проводят подсчет. Результать! теста по связьіванию обрабатьвают, используя программу

ПОАМО (50).

Ме Клетки, зкспрессирующие лишь ІЕМАК (клон 470.5) не ообладают способностью специфически

Ге») связьваться со 125)-ДІЕМ- «2 (фиг.8) и, следовательно нельзя получить значений Ко зтих предполагаємьх мест связьвания. Напротив, для клонов 470.6 наблюдаєется сильное, специфическое связьшшание вплоть до і насьіщения с клетками, зкспрессирующими лишь ІЄМАВ - ВРІ (клон 369.11). Значения Ка для зтого связьівания

ЧТ» составляет 3,6 х 10М ори температуре 23"С (Таблица М).

Связьвание 7292І-ІЕМ- 42 к клеткам 508.12 (зкспрессирующим как ІЕМАВ - ВРІ, так и ІЕМАЕК) оценивают по методу Скоатчарда и результать! сравнивают с результатами, полученньіми для клона 369.11 (зкспрессирущего 22 лишь ІЕМАВ - ВРІ). При совместной зкспрессии ІЕМАВ - ВРІ и ІЕМАК получают связьівание до насьіщения и

ГФ) сродство по отношению к ІЕМ- 92 увеличиваеєтся приблизительно в 10 раз (фиг.8), достигая значения для т рецептора клеток Дауди (Ка - 4,0 х 1079М по сравнению с 1,6 х 1079М, соответственно, Таблица М).

Полученньєе результать указьівают, что ІЕМАК и ІЕМАВ - ВРІ взаймодействуют при связьіваниий лиганда. бо вв ові 01111110 369.11 (ІЕМАВ-ВРІ) 80,000 ж 1196 3,6вх 109

Пример 10. Определение сродства ІРМАВ - ВРІЇ, вьіделенного из мочи.

ІЕМ- оа2 человека иммобилизуют на чувствительном злементе ВіАсоге ("Рпагтасіа" Швеция) по автоматизированной методике, разработанной поставщиком. Иммобилизуют приблизительно 30 фмол ІЕМ- о2.

Вьіделенной из мочи ІЕМАВ - ВРІЇ и разбавленньй солевьм раствором, содержащим фосфатньій буфер, с целью получения несколько концентраций (28 - 112нМ), пропускают через сенсограмньій чип и регистрируют степень ассоциации и диссоциации (в солевом растворе, содержащем фосфатньй буфер). Из полученньх 7/0 результатов вьічисляют значение Ко, равное 2,12 х 10М З (фиг.9). Таким образом сродство ІЕМАВ - ВРІЇ, вьіделенного из мочи, весьма напоминаєет сродство ІЕМАВ - ВРІ, зкспрессированного в клетках-реципиентах.

Пример 11. Зкспрессия ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ в Е.соїї, дрожжевиьїх клетках и клетках насекомьїх.

ІРМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ воспроизводятся также дополнительньмми рекомбинантньїми клетками, такими как клетки прокариотов, в частности, Е.соїїЇ или другими клетками зукариотов, такими как дрожжевье клетки и клетки 75 насекомьїх. Хорошо известнье способь! вполне подходят для конструирования подходящих векторов, несущих

ДНК, которая кодирует либо ІЕМАВ - ВРІ либо ІЕМАВ - ВРІЇ или их активнье фракции, пригодньїх для трансформирования клеток Е.соїї и дрожжевьх клеток или для инфицирования клеток насекомьх, с целью воспроизводства рекомбинантного ІЕМАВ - ВРІ или ІЕМАВ - ВРІЇ. Для зкспрессии в дрожжевьїх клетках внірезают

ДНК, кодирующую ІЕЄМАВ - ВРІ или ІЕМАВ - ВРІЇ (примерьі 5 и 3), и вводят в вектор зкспрессии подходящий для трансфекции дрожжевьїх клеток. Для зкспрессии в клетках насекомьїх ДНК, кодирующую ІЕМАВ - ВРІ или ІЕМАВ - ВРІЇ, вставляют в бакуловирус и инфицируют клетки насекомьїх указанньмм рекомбинантньім бакуловирусом.

Для зкспрессии в Е.соїї ДНК, кодирующую как ІРМАВ - ВРІ, так и ІЕМАВ - ВРІЇ подвергают сайт- направленному мутагенезу, используя подходящие олигонуклеотидь, так что инициирующий кодон АТО вводится непосредственно перед первьім кодоном зрелого ІЕМАВ - ВРІ (фиг.2) или ІЕМАВ - ВРІЇ. По другому способу СМ такую ДНК можно получить методом РСК, используя подходящие смьісловье и антисмьісловье праймерь!. о

Полученньій конструкциий комплементарньїх ДНК затем вставляют в подходящим образом сконструированнье векторьі зкспрессии прокариотов, применяя методь, хорошо известнье из области техники (35).

Пример 12. Конструирование рекомбинантньїх белков слияния ІЕМАВ - ВРІ и ІРМАВ - ВРІЇ.

Воспроизводство белков, содержащих либо лиганд-связьвающую область ІЕМАВ - ВРІ либо ІЕМАВ - ВРІЇ, «І слитье с постоянньмм участком тяжелой цепочки ІдДО1, может бьїть осуществлено следующим образом: ДНК

ІЕМАВ - ВРІ или ІРМАВ - ВРІЇ подвергают сайт-направленному мутагенезу, используя подходящие Ф олиго-нуклеотидь, так что уникальньм сайт-рестрикциий вводится непосредственно до и после (Се) последовательностей, кодирующих внеклеточнье лиганд-связьівающие области. По другому способу такая ДНК может бьіть приготовлена методом РСК при использовании специально подготовленньїх праймеров, несущих і участок тяжелой цепочки Ідс1, в частности РРКСО42 Рсі (47) подвергается аналогичному сайт-направленному «І мутагенезу, с целью введения того же уникального сайта рестрикции как можно ближе к Авзр 216 тяжелой цепочки ІдС1, так что он позволяет осуществить согласованную по фазе трансляцию слитого белка. Фрагмент двухцепочечной ДНК, включающей нетранслированную последовательность в 5 направлений и кодирующей « либо ІРМАВ - ВРІЇ либо лиганд-связьівающую область ІЕМАВ - ВРІ, получают ферментацией по уникальному сайту рестрикции. Подвергнутая мутации рРКСО42Ес!І ферментируется аналогичньм образом, с целью - с получения большого фрагмента, содержащего плазмиду и последовательность ІдС1. Два зтих фрагмента затем а связьшвают, получая новую плазмиду, кодирующую предшественник полипептида, включающий либо ІРМАВ - "» ВРІЇ либо лиганд "-связьівающую область ІЕМАВ - ВРІ 9 приблизительно 227 С-концевьїх аминокислот тяжелой цепочки Іде1 (участок петли и области СН2 и СНЗ) ДНК, кодирующая слитье белки, может бьіть вьіделена из плазмидь и подвергнута ферментации с помощью подходящего фермента зукариотньсе векторь! зкспрессии. т. Пример 13. Конструирование рекомбинантньх белков слияния ІРМАВ - ВРІ 9 ІРМАВ - ВРІЇ совместно с ІЕМАК.

ФО Воспроизводство белков, содержащих либо внеклеточную область ІЕМАВ - ВРІ либо ІЄМАВ - ВРІЇ, слитьх с постоянньм участком тяжелой цепочки 951, может бьть осуществлено как описано в Примере 12.

Ме, Воспроизводство белка, содержащего внеклеточную область ІЕМАР, слитую с постоянньм участком легкой о 50 цепочки ІдСт1, может бьть осуществлено аналогично. Зукариотньй вектор зкспрессии, кодирующий либо лиганд-связьіваюцую область ІЕМАВ - ВРІ, слитую с постоянньім участком тяжелой цепочки Ідс1, либо ІЕМАВ - їз» ВРІЇ, слитьій с постоянньім участком тяжелой цепочки ІдС1, используют для совместной франсфекции подходящих клеток-реципиентов млекопитающих вместе с зукариотньм вектором зкспрессии, кодирующим внеклеточную область ІЕМАР, слитую с постоянньім участком легкой цепи Ід01. Положительнье трасфектанть 2о секретируют сложньій белок, включающий постояннье участки ІДО1, внеклеточную область ІЕМАР, которая о замещает изменяемье участки легких цепей Ідс1, и либо ІЕМАВ - ВРІЇ либо лиганд-связьівающую область

ІРМАВ - ВРІ, замещающую изменяемье участки тяжельїхх цепей Ідс1. о В другом примере постояннье области тяжельїх и легких цепей переключаются, а именно: внеклеточная область ІРМАР сливаєтся с постоянной областью тяжелой цепочки Ідс2, в то время как либо 60 лиганд-связьиваюцая область ІЕМАВ - ВРІ либо ІРМАВ - ВРІЇ сливаются с постоянньіми участками легких цепочек

Ід2.

Мсходя из результатов Примера 9, можно ожидать, что указаннье слитье белки будут проявлять приблизительно в 10 раз большее сродство по отношению к ІЕМ- од, по сравнению с ІЕМАВ - ВРІ или ІЕМАВ - ВРІЇ.

Пример 14. Получение поликлональньїхх антител ІЕМАВ - ВР. бо Кроликам первоначально вводят подкожно бмкг чистого препарата ІЕМАВ - ВР, вьіделенного из мочи, которьій змульгируют в полном адьюванте Фрейнда. Через три недели им снова подкожно вводят 5Бмкг препарата в неполном адьюванте Фрейнда. Через интерваль! в 10 дней вводят дополнительно 4 иньекции в виде раствора в содержащем фосфатньй буфер солевом растворе.

Чзрез 10 дней после последней иммунизации у кроликов берут кровь на анализ. За изменением уровня бодержания антител следят с методом твердофазного радисиммунного анализа, ислользуя пластинь! из поливинилхлорида с 98 ячейками, покрьїтьмми в течение ночи при 47С с помощью ІЕМАВ - ВР (мкг/мл) в солевом растворе, содержащем фосфатньй буфер. Пластиньі затем в течение ночи при температуре С блокируют бьічьим сьівороточньмм альбумином (0,595), Тмееп 20 ("Зідта", США, 0,0590) в солевом растворе, содержащем фосфатньй буфер. Пластиньі взаимодействуют с пятикратно разбавленной сьівороткой кролика в 70 течение 4час. при комнатной температуре, промьіваются и взаймодействуют с 125|- белком А (10? распадов в минуту на ячейку) в течение 35 минут при комнатной температуре с солевьм раствором, содержащим фосфатньій буфер. Затем пластиньї промьшают, отдельнье ячейки отрезают и проводят подсчет. Титр вьічисляют как обратную величину максимального разбавления, которое дает величину распадов, в десять раз большую, чем контрольная сьіворотка. Титр после 5 иньекций составляет более 1:60000.

За развитием уровня содержания антитела следят также по способности актисьмворотки блокировать антивирусную активность ІЕМ- 2 человека. Предварительно приготовленнье монослои клеток Н человека на пластинах, содержащих 95 ячеек, вбідерживают в инкубаторе с вдвое разбавленньми растворами сьіворотки, начиная с 1:250 в ячейке с номером1, в течение 1 часа при температуре 37"С. ІЕМ- 42 (1Оед./мл, конечная) затем добавляют и через 1 час при температуре 37"С в ячейки вводят вирус везикулярного стоматита. Титр нейтрализации после 7 иммунизаций составляет 120000 антивирусньх ед./мл.

Пример 15. Получение моноклональньх антител ІЕМАВ - ВР

Женским особям мьішей Ваї!р/С (в возрасте З месяца) вначале подкожно вводят 2мкг очищенного ІЕМАВ - ВР в виде змульсиий в полном адьюванте Фрейнда, а позднее через три недели - подкожно в неполном адьюванте

Фронда. Через интерваль! в 10 дней вводят подкожно дополнительно З иньекции в содержащем фосфатньй Ге буфер солевом растворе. Методом твердофазного радисиммунного анализа определяют титр связьівания, о равньй 1:50000 (см. Пример 9). Конечньіе повторнье вакцинации проводят внутрибрюшинно за 4 и З дня до вливания мьіши, показьівающей найбольший титр связьівания. Слияние проводят с использованием клетки

М5ЗО/1 миеломь и лимфоцитов, полученньїх как из селезенки, так и лимфатических узлов животного, являющегося партнером при осуществлений вливания. Слитье клетки распределяют в микроструктурньсх чу пластинах и отбирают гибридомьї в модифицированной по способу Дульбекко среде МИгла, в которую дополнительно добавлен гипоксантин-аминоптерин-тимидин и 1595 сьіворотки лошади. Гибридомь, которье как Ф бьіло вніявлено, воспроизводят антитела ІЕМАВ - ВР, субклонируют по методу ограниченного разбавления и (Се) вводят мьішам ВаїрБ/С, которьїх примируют пристаном для воспроизводства асцитов. Изотипь! антител определяют, используя имеющийся в продаже набор для проведения ферментного иммуносорбентного анализа ї-о ЕП5А ("АтегзПаїп", Великобритания). ч;Е

Отбор гибридом, воспроизводящих анти- ІЕМАВ - ВР моноклональньїх антител, проводят следующим образом: жидкости над гибридомами исследуют не присутствие анти- ІЕМАВ - ВР антител методом обращенного твердофазного радисиммунного анализа (ІКІА). Полихлорвиниловье пластиньії для микротитрования ("Оипаїесп «

І арогаюгіев", Александрия, штат Вирджиния) покрьівают очищенньми методом аффинной хроматографми антителами анти-мьішь сьіворотки Е(аб)2 козла ("Часквоп І арв", США) (1Омкг/мл, 10О0мкл на ячейку). После - с вьідерживания в инкубаторе при температуре 4"С в течение ночи пластиньі промьівают дваждь! солевьм ц раствором, содержащим фосфатньй буфер, бьчий сьівороточньій альбумин (0,595) и Тмееп 20 (0,0595) и ,» блокируют в промьівочном растворе при температуре 37"С в течение по крайней мерз 2час. Добавляют жидкость над культурой гибрядомь! (100мкл на ячейку) и пластиньі! вбідерживают в инкубаторе в течение 4час. при температуре 37"С. Затем пластинь!ї три раза промьівают промьівочньім раствором и добавляют І - ІЕМАВ - т. ВР (10Омкл, 109 отсчетов в минуту), вновь оставляя в термостате на 16бчас. при температуре 4"С. Пластинь

Фу промьівают З раза и индизидуальнье ячейки отрезают и проводят подсчет, используя счетчик гамма-частиц.

Образцьі, которне дают количество отсчетов, которье по крайней мере в 5 раз больше, чем значения для (о) отрицательного контрольного образца, считаются положительньми (Таблица МІ). Отбирают пять с 50 положительньїх клонов, подвергают субклонированию для проведения дальнейших исследований и охарактеризовьізают.

Я» Все клоньї представляют собой изотип Ідс1. зв щі ю во б5

Пример 16. Аффинная хропатография ІЕМАВ - ВР с моноклональньми антителами.

Антитела против ІЕМАВ - ВР используют для очистки ІЕМАВ - ВР путем аффинной хроматографии. В данном примере для аффинной хроматографии используют моноклональное тело Мо5.73. Асцитная жидкость, содержащая моноклональное тело, секретируемое гибридомой Мо5.73, очищают осаждением сульфатом аммония при 5090-ном насьіщений с последующим интенсивньім диализом по отношению к солевому раствору, содержащему фосфатньй буфер. Около 10мг иммуноглобулинов связьвают с мл Айіде! 10 ("Віо - Кад, США) по методике, рекомендованной изготовителем. 25Омл белков, вьіделенньїх из мочи человека (зквивалентно 250л неочищенной мочи), наносят на 0,б5мл колонку с антителом анти- ІЕМАВ - ВР при температуре 47С со скоростью протока 0,25мл/мин. Колонку 7/0 промьвают солевьм раствором, содержащим фосфатньй буфер, до тех пор пока в промьівньїх водах обнаруживаєтся белок. ІЕМАВ - ВР злюируют 25мМ буферного раствора, содержащего лимонную кислоту, с рн 2,2 (8 х 1 фракции обьема колонки) и немедленно нейтрализуют ІМ раствором карбоната натрия. Анализ

ЗОБРАСЕ по окрашиванию серебром злюированньїх фракций вьіявляет основную полосу с молекулярньім весом 40000. Дальнейшую очистку зтого препарата проводят с помощью хроматографиий по размеру молекул.

Пример 17. Ферментньйй иммуносорбентньй анализ ІЕМАВ - ВРІЇ.

Пластиньії для микротитрования (ЮОипаїесп или Махівогв) покрьівают анти- ІЕМАВ - ВР моноклональнь!м антителом Мо46.10 (Ід фракция, 120мкл на ячейку, ТОмкг/мл в солевом растворе, содержащем фосфатньй буфер) в течение ночи при температуре 4"С. Пластиньі промьівают солевьм раствором с фосфатньім буфером, содержащим бьічий сьівороточньій альбумин (0,595). Тмееп 20 (0,0595) и азид натрия (0,0295) (блокирующий го раствор) и блокируют в том же растворе в течение ночи при температуре 37"С. Тестированнье образць последовательно розбавляют вдвое (начиная с 1:4) в блокирующем растворе, содержащем 0,195 МР40 и 0,65М хлорида натрия, и добавляют к ячейкам на 4час. при температуре 37"С (100мкл на ячейку). Затем пластинь промьавют З раза солевьім раствором с фосфатньм буфером /Гмееп (100мкл на ячейку) и в течение 2чабс. добавляют коньюгат анти-кролик сьіворотки пероксидазь! хрена козла (НКР, "УЧаскгоп І арзг", 1:10000 в солевом сч ов растворе с фосфатньм буфером /Гмжмееп, 100мкл на ячейку) в течение 2час. при комнатной температуре.

Пластиньї промьувают З раза солевьім раствором с фосфатньм буфером /Гжмееп и окрашивают, добавляя в і) каждую ячейку, содержащую в качестве субстрата 100мкл свежеприготовленного раствора, включающего 2,2- азино-бис- (З3-зтилбензтиазолин-б6-сульфоновой кислоть! ("Зідта" 1Омг) б4мл водь, 22мл 02М динатрийфосфата натрия, 1,4мл 0,2 лимонной кислотьії, їмкг перекиси водорода). Цвет появляется Через 30 «г зр минут, а остановить реакцию можно добавлением 70О0мкл на ячейку 0,2М лимонной кислотьі. Пластинь считьявают с помощью автоматического анализатора по ферментному иммуносорбентному методу на длине б» волньі 405нм, проводя коррекцию относительно неспецифического считьівания при б6З3Онм. Найменьший предел Ге обнаружения по указанному анализу составляет ЗОпг/мл (фиг.10).

Приведенное описание специфических вариантов осуществления изобретения вьіявляют общую сущность ісе) з5 Мзобретения, так что остальнье исследователи могут, используя полученнье сведения, легко модифицировать «г и/или адаптировать их для различного применения специфических вариантов осуществления изобретения, не вьходя за рамки основной концепции, а потому подразумевается, что указаннье адаптации и модификации соответствуют сущности изобретения и входят в обьем притязаний описанньїх вариантов его осуществления.

Следует понимать, что приведенная в настоящем описаний фразеология и терминология используется в целях « 70 описания, а не ограничения настоящего изобретения. в с Литература /Кеїегепсев/ . 1. Тауюг, У. апа ОСгоззрегу, 5.Е. (1990). Кесепі ргодгезв іп іпФіепбегоп гезеагсй: тоіесціаг теспапізтв и? ої гедшіайоп, асіоп апа мігив сігситмепііоп. Мігиз Кезеагсі 15:1-26. 2. Вівседі А.М., Магіп, Р., Кавзвіапідев, С., І івКег-МеІтап, М. Мигтау, Ї., МУаддопег, 9., бСоодтапп, 5. Вапкв, М.5. апа Нооїпадіє, У.Н. (1989). Кесотрбріпапі іпіепегоп аїрпа (Шегару їог спгопіс Пераціз С. А їх гапдотігед, доциріе-ріпа, ріасеро-сопігоЇей (гіаї. Мем Епа. У). Мед. 321:1506-1510.

З. МеОоппеїЇ, МУ. М. апа ЄЕнМна с.Н. (1992). Асше Пераїйіз С іпїесіоп: іпіепегоп їПпаПйу зиссееав.

Ме, Савзігоепіегоїосду (05) 103:1359-1360.

Ге» 4. Епедтап-Кіеп, А.Е., Егоп, Ї.)., Сопапі, М., ОСгомждоп, МУ. , Вадіак, Н., Вгадзігееії, Р.МУ., Редогсгук, 5о 0. То К. апа Ріеззе, Т.Г. (1988). Маїшга! іпіепегоп арпа ог ігеайтепі ої сопауютаїйа аситіпай(а. /. се) Ат. Мед. Агвп., 259:533-538. ї» 5. Маїпв, у. апа Напаїєу, У. (1992). Іпіепегоп: сипепі апа їшіге сіїпісаї вев іп іптесіоив аізеазе ргасіїсе. Іпі. У. іа. АІЮО5 3:4-9., б. Вептап, Е., Неїег, О., Кетріп, 5., Сее, Т., Тгтап, Її. апа Сіагквоп, В. (1990). Іпсідепсе ої гезропзе ов апа опо фегпт оПом/ Пр іп райепів м/йй аїгу сеї ІеиКетіа ігеафйей м/йп гесотбіпапі іпіепегоп АІрпа-2а,

Віоса.75:839-845. (Ф) 7. Тара; М., Капіагіап, Н.М., МесСгедіє, К.В., Кеаїййпо, М.)., ТгшійШо, У. апа СиШептап, 9. (1987), ка Сіїпіса! іплезіїдайоп ої питап аїрна іпіепегоп іп спгопіс туеіодепошз ІеоКетіа. Віоса 69:1280-1288. 8. Ое УМ, К., ЗспацепКетк, 9У.К.М.Е., Воиспег, С.А.В., ВакККег, Р.).М., Меепрпої, К.Н.М. апа Ваппег, 5.А. 6о (1988). Сіїпісаї апа мігоіюодіса!І ейесіз ої Нідп-дозе гесотБіпапі-іпіепегоп-а іп діззетіпаєєй АЮЗз-геїіа(еа

Карозів загсота. І апсеї 2:1214-1222. 9. Кіїрреї, 9У.Н., Сатейфе, 5., Ргеріє, О.Т., Епедтап, К.М. апа Огітіеу Р.М. (1985). Зегит аїрна іптепегоп апа Іутрпосуїе іпсіивіопе іп зувіетіс Іприв егуїпета(йзив. Аппаїв ої (пе Кпештаїйс Оізеазез 44:104-108. 10. їац, А.5., Оег, 5.0., Кеай, 5.Е., апа УМійШате, В.К. (1991). Кедшайоп ої їШтог песговів Тасіог 65 гесеріог ехргезвіоп Бу асіа-Іабііе іпепегоп-аІрна їтот АІО5З зега. АІО5 Кев. Нит. Кеїгомігизев 7:545-552. 11. ема, Т.А. (1993). Іпдисіоп ої (уре І аіаре(ез Бу іпіепегоп-а іп (гапздепіс тісе. Зсіепсе 260:1942-1946.

12. Твамагів, М., МуїопакКівз, М., Васоуіїаппі5, С., Твоцівов5, Н., Кагабреїїв, А., апа Козтіадів, Р. (1993).

Тгеаітепі ої гепаї сеї сагсіпота м/йА езсаїЇайпд дозез ої аІрпа-іпіепегоп. СпетоїПегару (Зм йгепіапа) 39:361-366. 13. ВгапКка, А.А. апа Вадійопі, С. (1981). ЄЕмідепсе (аг! їурез !/ апа | іпіепегопз Паме аййегепі гесеріоге. Майшге 294:768-770. 14. Ое с., І шбаМа, С. апа Огевзвег, І. (1990). Сепеїйїс ігапеїег ої а Тшпсіопа! питап іпіепегоп а гесеріог іпіо тоизе сеїІв: сіопіпд апа ехргезвіоп ої їз СОМА. СеїЇ 60:225-234. 15. СоІатопісі, О.К. еї аїЇ. (1990). СНагасіегігайоп ої (Шйгее топосіопа! апіїбодіев (паї гесодпіге (Ше іпіепегоп-а2 гесеріог. Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА 87:7230-7234. 70 16. Ріафапіаз, І.С. еї аЇ. (1992). ЄЕхргевзвіоп ої (Ше ШЕМ-а сгесеріог іп паїгу сеїЇ ІеиКетіа, Вгй. ..

Наетайоіоду 82:541-546. 17. Соіатіпісі О.К. еї аїЇ. (1993). Ідепійісайоп ої а поме! звИирипії ої (Ше їуре | Іпіепегоп гесеріог

Іосаїїгейд юЮ питап спготозоте 21. 9. Віої. Спет. 268:10895-10899. 18. Вепої, Р. еї аїЇ. (1993). А топосіопа! апіроду о гесотбріпапі питап ІРМ-а гесеріог іппіріїв бБіоіодіс /5 асімну ої земега! зресіез ої пПитап ІРМ-а, ІЕМ-5 апа ІРМ-отеда. у. Іттипої. 150:707-716. 19. Моміск, О., Епдеітапи, Н., МУаПйаси, О. апа Кибіпвівїпй, М. (1989). ЗоЇшріе суїоКіпе гесеріоге аге ргезепі іп погта! питап игіпе. У. Ехр. Меа. 170:1409-1414. 20. Моміск, О., ЄЕподеітапп, НН. МУМаїйаси, 0О., Іейпег, О., Кемеі), М. апа Кибіпвівіп, М. (1990).

Ригійсайоп ої воЇШбіе суїокКіпе- гесеріоге йот погта! НПитап шгіпе Бу Іідапа-айіпйу апа іттипо-айіпну спготайодгарну. /. Спготайюдгарну 510:331-337. 21. Моміск, ОЮО., Епдеітапп, Н., Кемеї, М., Іейпег, О. апа Кибіпвівїп М. (1991). Мопосіопа! апііродіев юю пе зоїцбіе ІІ -6 гесеріог: апйіпну ригітісайоп, ЕГІЗА, апа іпрібікоп ої Ідапа бБіпаїпо. Нубгідота 10:137-146. 22. ЕпдеІтапп, Н., Моміск, Ю. апа МУайаспи 0. (1990). Тмо (Штог-песговів-Тасіог Біпаіїпу ргоїеіпв ригійей їот питап цигіпе. Емідепсе бог іттипо|одісаІ! остов геасімйу м/йй о сеї! вупасе (Штог-песговів-Тасіог сч ов Тесеріогв. 3. Віої. Спет. 265:1531-1536. 23. ЕпдеІтапп, Н., Адегка, О., Кибіпвівїп, М., Коїтап, ОО. апа МУМУайаси, О. (1989). А Штог песговів (8)

Тасіог-ріпаіпуо ргоївіп ригйей (о ПпПотодепейу їт Питап гіпе ргоїесів сеїЇв їйот (Штог песговів Тасіог іохісіку. У. Віої. Спет. 264:11974-11980. 24. ЗесКіпдег, Р., Ізаалг, 5. апа Оауег, О.М. (1988) А Ппитап іппірйог ої (Шштог песговів Тасіог аїрна. 3. «г зо Ехр. Мед. 167:1511-1516. 25. Маїївлемувкі, С.К. апа Рапвіому, МУ.С. (1990). БоЇШріе гесеріоге їТог 1/-1 апа 1-4. Віоіодіса! асімну Ме апа Інегареціїс роїгепійа!|. Тгепаз іп Віогеснпої. 8:324-329. Ге 26. Еавзідайе, 9У.А., Бутопв, УА. апа ЮОшй МУ. (1990). Ідепійісайоп ої ап іпіепеиКіп-1ї бБейфа бБіпаіпд ргоївіп іп питап ріазта. РГЕВЗ І ецЦеге 260:213-216. ісе) 27. БРапвіому, Б.МУ., Зітв, 9У.Е., Зазепіеій, Н., Могтізеу, Р.)., Сів, 5., Юомег, 5.К. апа МУідтег, М.В. «Е (1990). Кедшайоп ої аПогеасіїміну іп мімо Бу зоЇцбіе Тогт ої (пе іпіепеикіп-1 гесеріог. Зсіепсе 248:739-742. 28. Мозігеу, В., ВесКтап, М.Р., Магсп, С., 9У., Ідгегаа, К.Ї., Сітреї, 5., ОЮО., МапдепВовз, Т., Егіепа, 0.,

АїІреп, А., Апдегзоп, ЮО., дасквоп, .)., МУідпа!й, 9У.М. тій С., Саїйїв, В., бітв, 9У.Е., Огаа!ї, О., УММідтег,

М.В., Совзтап, 0. апа Рагі, 1.5. (1989). Тпйе тигіпе іпіегіеикіп-4 гесеріог: тоіІесцаг сіопіпд апа « сПпагасіегіганоп ої зесге(ей апа тетбгапе їюгтв. Сеї! 59:335-348. з с 29. Магсоп, Ї., Ей», М.Е., Киптап, С.С., Уепвеп, .).С. апа Меївоп, О.Г. (1988). Боїшбіе ТАС рерійде ів . ргезепі іп (Ше шгіпе ої погтаї! іпаїмідцаівє апа аї еїемайей Іемеів іп райепів м/ййп айдий Т-сеїЇ ІеоКетіа. и?» Сііп. Ехр. Іттипої. 73:29-33.

З0. довітоміс-АіІаземіс, О., Нептапп, Т. апа Оіатапвівіп, Т. (1988). Юетопвігайоп ої їмо дівііпсі тгтв

ОЇ геівазей Іому-айіпку (уре іпіегпецйкіп-2 гесеріогв. Ешг. У). Іттипої. 18:1855-1857. їх З1. боодміп, К.О., Егіепа, О., Аедіег, 5.Е., Магсй. С.)., Матеп, А.Е. апа Рак, ІЇ.5. (1990). Сіопіпд ої

Ше питап апа тигіпе іпіегіеиКіп-7 гесеріоге: детопвігайоп ої а зоЇШріе Тогт апа потоіоду о а пем/ гесеріог

Ме, зирепатіу. Сеї! 60:941-951.

Ге» 32. Моміск, Ю., Сопеп, В. апа Кибіпвівіп, М. (1992). Боїшріє ІЕМ-а гесеріог тоіесціев аге ргезепі іп Воду

Річідв, РЕВЗ І еЦегв, 314:445-448. ік 33. Реаггоп, МУК. апа Гіртап, 0.0. (1988), Ітргомейд (ооів їТог БіоіодісаІ зедоепсе сотрагізоп, Ргос. Маї!. ї» Асай. сі. ОБА, 85:2444-2448. 34. ОКауата, Н. апа Вего, Р. (1983) АсОМА ріопіпд месіог (Шаї регтіїв ехргеззіоп ої СОМА іпзегів іп таттаїіап сеїЇІв. Мої. Сеї|. Вісі. 3:280-289. 35. Мапіаїз еї аіІ., МоіІесціаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагброг І арогаюгу, Мем МогКк, 1982 36. Сгусгап, Т., "пе МоіІесшціаг Віоіоду ої пе Васіїї", Асадетіс Ргезв, МУ (1982), рр. 307-329. (Ф, 37. Кепааї, К.. еї аі!. (1987) 9. Васіегіої. 169:4177-4183. ка 38. СПайег, КЕ. еї аї., іп "5Біхій Іпіегпайопа! Зутрозішт оп Асііпотусеїйаіез Віоіоду", АКадетіаії Каїдо,

Видаревзі, Нипдагу (1986), рр. 45-54. во 39. допп, У.Р., еї а). (1986) Кему. Іптесі. Оів. 8:693-704. 40. Ігакі, К. (1978) Орп. 9. Васіегіої. 33:729-742. 41. Воївіеїйп, О., еї а. (1982) Міаті ММіпі. Зутр. 19:265-274. 42. Вгоаси, ОК., іп "Те Моїесшаг Віоіоду ої (Ше Меаві Засспаготусев: І Ше Сусіе апа Іпнепіапсе", Соїа

Зргіпд Нагброг І арогаюгу, Соїд Зргіпд Нагрог, МУ, рр. 445-470 (1981). 65 43. Вгоаси, У.К., (1982) СеїІ 28:203-204. 44. ВоїІоп, О.Р., еї аі. (1980) 9. Сііп. Нетайі|. Опсої. 10:39-48.

45. Мапіайів, Т., іп "СеїІ! Віоїюду: А Сотргепепвіме Тгеайзе, МоІЇ. З: Сепе Ехргезвіоп", Асадетіс Ргевзв,

МУ, рр. 563-608 (1980). 46. Мігизпіта, 5. апа Мадаїа, 5. (1990) рЕР-ВО5, а рожепи! таттаїйап ехргезвіоп месіог. Мисіевїс Асій

Кев. 18:5322-5328. 47. Вут К.А. еї а!., 1990, Майшге (І опаоп) 344:667-670. 48. Егоптап, М.А., бив, М.К. апа Магііп, О.К. (1988) Ргос. Ма!1. Асад. Зсі. ОБА, 85, 8998-9002. 49. Сганат, Б.І. апа Мап дег ЕБ, А.). (1973) Мігоіоду, 52, 456-467. 50. Мипзоп, Р.). апа Кодбага, 0. (1980) Апаї!. Віоспет., 107, 220-239. 70 51. Хатада Т. еї аІ., Мейговсі. Гек. 181:61-64 (1994).

Claims (18)

Формула винаходу

1.1ЕМ-ей й -связьівающий белок, включающий следующую аминокислотную последовательность: МІТ5ОМАНАЕКВІМ М.М ХІМ ЕО15У Ю5РОУТОЕЗСТЕКІВІ КМЕКУП У УЕ ІКМНЗІУРТНУТУТІМУКРЕОТ КУУКМСАМТТКЗЕСО ТОЕМКУТНЕА ТУ М ТУГЕСЕ5ОМТТІЕ5СЗНМЕМАІЮМУЕЕРРЕЕВІУ СЕТМНІМУМУКЕРБІУ ЕЕ ГОБОСЯ МЛЕЕОЗЕСТУККНКРЕЇІКСОММ5ОМЕТУ ПОКТІРМТМУСУВУУГЕНЬ ПЕОАМІКЗРІ.ЖСТІ 1 РРООБ5Е. с или производнье, предшественники, мутеинь! указанного белка, обладающие ІЕМ. ях й В -связьиівающей о активностью, активная фракция или соль указанного ІЕМ- щі 8 -связьівающего белка.

2.1ЕМ- ті й -связьівающий белок по п. 1, отличающийся тем, что слит с иньім полипептидом. «І

З. Молекула ДНК, кодирующая ІЄМ- щі й -связьивающий белок или предшественники, слитье белки, б» мутеинь), функциональнье производнье или активную фракцию указанного связьшвающего белка, о охарактеризованньсе в любом из п.п. 1-2. іс),

4. Молекула ДНК по п. 3, кодирующая белок, обладающий следующей аминокислотной « последовательностью:

МІ1.5ОМАБІЕКВІМІ МІ МУ ХІ51 МЕОІ15 У О5РОУТОЕЗСТЕКІХ ЕМЕКЗП.О МЕ ІКМНОУРТНУТІГСУТІМ5КРЕВРІКУУКМСАМІ ТКС ТОЕМЖКОТНЕА УМ « є т30. ТУ ЕСЕ5ОМТТІ ЕЗСЗНМЕМІАІЮМ5ЕЕРРЕЕЕГУСЕТМНІМУ МУ КЕРОІУЕЕЕ не ч» ГОБОГЗГМІЕЕО5БЕСІУККНКРЕЇКОММЗОМЕТУ ШІ ІРМТМУСУВУ У СЕН ПЕОАМІКЗРІКСТІ ДЛ. РРООЕБЕЗАЕЗАКТОСИ ТУ РІЛАГЛМІТЗТУТІК

5. Молекула ДНК по п. 3, кодирующая белок, обладающий следующей аминокислотной ве последовательностью: ФО МІЛ.5ОМАРІЕКВІ МІОМІ МУ Х 151. М ЕСІЗУ ОБРОУТОВЕВСТЕКІВІ КМЕКВИ ЗУ ме) ІХМНЗІУРТНУТ І ХТІМ5КРЕПІ КУУКМСАМТТКЕЗЕСТЯТОЕЖКВТНЕД У ї-о ТУГЕСЕ5ОМТТЕЗСЗНМЕМАІЮМУРЕРРЕЕЕІУ СЕТМНІМУМУКЕРБІМЕЕЕ с» СОБОГЗІМЕБОЗЕСІУККНЕРЕІКОММ5ОИМЕТУПОКІІРМТМУСУВУ МЕН ІЙ УБЕОАМІКУРІ КСП РРООБ5ЕБЕ5

6. Молекула ДНК по п. 3, которая транскрибируеєется в молекулу МРНК длиной приблизительно 1,5 т.п.н., (Ф) которая транслируется в предшественник ІЕМАВ-ВРІ. ГІ

7. Молекула ДНК по п. 3, которая транскрибируеєется в молекулу МРНК длиной приблизительно 4,5 т.п.н., которая транслируется в ІЕМАВ-ВРІЇ. во

8. Реплицируемьй зкспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК, охарактеризованную в любом из пп. 3-7.

9. Реплицируемьй зкспрессирующий вектор по п. 8, которьй опредставляет собой плазмиду РЕЕ-ВО5-ІЕМАВ-ВРІ.

10. Клетка-хозяин, трансформированная реплицируемьм зкспрессирующим вектором, охарактеризованньім ви В любом из пп. 8-9.

11. Клетка-хозяйин по п. 10, которая представляет собой прокариотическую клетку.

12. Клетка-хозяийн по п. 10, которая представляет собой зукариотическую клетку.

13. Клетка-хозяийн по п. 12, которая представляет собой клетку СОЗ обезьянь!.

14. Фармацевтическая композиция для модулирования активности ІРМ- ж или ІРМ- й, содержащая ІРМ- М - є! й -связьвающий белок или предшественник, слитьій белок, мутеин, функциональное производное, активную фракцию или соль указанного связьівающего белка, охарактеризованньсе в любом из п. п. 1-2.

15.Фармацевтическая композиция по п. 14 для модулирования активности ІРМ- б или ІРМ- Я , содержащая 70 фармацевтически приемлемьйй носитель.

16. Фармацевтическая композиция по п. 14 для ингибирования активности ІРМ- сх или ІЄМ- Я.

17. Способ получения ІЕЄМ- єх /Д -связнівающего белка или предшественников, слитьїх белков, мутеинов, функциональньхх производньїх или активньїх фракций указанного связььвающего белка, охарактеризованньх в п.

15.1, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, охарактеризованной в любом из пп. 10-13, и вьіделение указанного ІЕМ-є/ й -связьнивающего белка.

18. Диагностическая композиция, содержащая молекулу ДНК, охарактеризованную в любом из пп. 3-7, или ІРМ-«е/й -связьвающий белок или предшественники, слитье белки, мутеиньі, функциональнье производньє, гр Вктивная фракция или соль указанного связььвающего белка, охарактеризованньсе в любом из п.п. 1-2. с щі 6) « (о) (Се) (Се) «

- . и? щ» (о) (о) се) с» іме) 60 б5