FI118084B - Interferoni-alfa/beta-sitojaproteiini, sen valmistus ja käyttö - Google Patents

Description

118084

Interferoni-a/B-sitojaproteiini, sen valmistus ja käyttö

Interferon-α/Β bindande protein, dess framställning och användning .

Keksintö koskee uusia interferoni-a/B-sitojaproteiineja, jotka pystyvät muuntamaan useiden eri IFN-a-alatyyppien aktiivisuuksia samoin kuin IFN-B:n aktiivisuutta. ]i

Yksityiskohtaisemmin keksintö koskee näitä proteiineja koodaavien DNA-molekyylien kloonausta sekä niiden ilmentämistä isäntäsoluissa.

Israelilainen patenttihakemus no. 103052 kuvaa ja esittää vaatimuksenaan liukoisen, molekyylipainoltaan noin 45 000, IFN-a-reseptoriproteiinin, joka on tunnistettu Western blot -analyysillä monoklonaalisilla anti-IFN-a-reseptorivasta-aineilla. Edellä mainittu :i hakemus kuvaaja esittää vaatimuksenaan myös erilaisen liukoisen IFN-a-sitojaproteiinin, jonka molekyylipaino on noin 40 000, tämä identifioitiin ristisilloittamalla se " I-IFN- a2:n kanssa ja immunosaostamalla monoklonaalisilla anti-IFN-a-vasta-aineilla. Tämän proteiinilajin molekyylipaino oli 50K seerumista saatuna. Israelilainen patenttihakemus no. 106591 kuvaa ja esittää vaatimuksenaan edellä mainitun 40 000:n IFN-a- sitojaproteiinin (jäljempänä "IFNAB-BP" tai "IFNAB-BPII"), joka on saatu virtsasta homogeenisessa tilassa ja jolla on jokaisesta muusta tunnetusta proteiinista eroava sekvenssi. IFNAB-BP sitoutuu useisiin eri IFN-a-alatyyppeihin samoin kuin IFN-B:aan ja ;; . estää niiden aktiivisuuksia. Tässä suhteessa IFNAB-BP:n sitomisominaisuudet eroavat .· · · • · · merkittävästi aikaisemmin kuvatun solun pinnan interferonireseptorin • ♦ ; sitomisominaisuuksista, joka reagoi vain ihmisen interferoni-alfa-B:hen.

• · · .

* · · * • · · • · ·#···· ··· _ : Keksinnön mukaisesti kloonataan kaksi IFNAB-BP:n esiasteita koodaavaa cDNA- • · · .

• · · · molekyyliä ja niiden sekvenssit määritetään. Molemmat on todennäköisesti saatu samasta ΐ geenistä, esim. vaihtoehtoisella silmukoinnilla. Lisäksi kuvataan kahden * yhdistelmäproteiinin, joita nimetään IFNAB-BPI:ksi ja IFNAB-BPII:ksi, tuotanto nisäkäs- ’ ;***; ja muissa isäntäsoluissa.

• « · • * • · ...

* · · • · · · _____ ,···, IFNAB-BPI ja IFNAB-BPII pystyvät muuntamaan tyyppi I:n interferonien, so. i * · * · · j • . interferoni-a:n eri alatyyppien samoin kuin interferoni-B:n, aktiivisuuksia. Ne voivat näin • · · · * • · , , ollen estää B-interferoni tyyppi I;n ei-toivottuja vaikutuksia.

• » » • ·· • · ιϋΜΜϋίΡ’' 118084 2 , “f

Tyyppi I:n interferonit (IFN:t) (IFN-a, IFN-β ja IFN-co) muodostavat rakenteellisesti läheisesti yhteen kuuluvien sytokiinien perheen, jolle on tavallisesti ominaista kyky antaa resistenssi virusinfektioita vastaan. Monia muita tyyppi I:n IFN:ien biologisia toimintoja on selostettu, mukaan lukien solujen lisääntymisen estäminen, luokan I MHC-antigeenien indusointi ja useita muita immuunisäätelytoimintoja (1). IFN-a ja IFN-β ovat hyödyllisiä 1 useiden virustautien hoitoon, mukaan lukien hepatiitti C (2,3) ja virusperäiset syylät (4,5), kuten myös tiettyjen pahanlaatuisten kasvainten, kuten karvasoluleukemian (6), kroonisen myelogeenisen leukemian (7) ja Kaposin sarkooman, hoitoon (8).

• -.'e.

lFN-a:aa havaittiin useiden sellaisten eri potilaiden seerumeissa, joilla oli : autoimmuunisairauksia, kuten esimerkiksi punahukkaa (systeeminen lupus erythematosus) f (9), samoin kuin AIDS-potilailla (10). IFN-a oli mukana nuoruusiän diabeteksen etenemisessä (11). On myös esitetty, että IFN-a:n kohonnut ilmentyminen valkean aineen mikrogliasoluissa saattaa osaltaan edistää Alzheimerin taudin patologiaa (51). Lisäksi IFN-a-terapian on osoitettu joissain tapauksissa johtavan ei-toivottuihin sivuvaikutuksiin, joihin kuuluvat kuume ja neurologiset häiriöt (12). Sen vuoksi on olemassa patologisia tilanteita, joissa IFN-a-aktiivisuuden tekeminen tehottomaksi saattaa olla potilaalle hyödyllistä.

, .·. Kuten muidenkin sytokiinien tapauksessa, IFN-α käynnistää biologiset toimintonsa | • * · • · · sitoutumalla solun pinnan reseptoriin, joka on spesifinen kaikille IFN-a-alatyypeille : .·. samoin kuin IFN-B:lle (13). Ihmisen IFN-a-reseptori (IFNAR) tunnistettiin ja kloonattiin · · · .

Daudin soluista (14). Kloonatulla reseptorilla on yksittäinen kalvonläpäisevä domeeni, j ♦ ekstrasellulaarinen ja intrasellulaarinen domeeni. Hiiren soluissa ilmennettynä tämä -i ··· * :*·*: reseptori antaa reagointikyvyn ihmisen IFN-aB:tä kohtaan, mutta ei merkittävästi muita f IFN-a- ja IFN-h-tyyppejä kohtaan, mikä osoittaa sen, että vasteessa IFN-β:aa ja eri IFN-a-alatyyppejä kohtaan voi olla mukana lisätekijöitä.

·· • · • · · ♦ _ : .·. Useat muut tutkimukset osoittavat, että TFN-a:n ja IFN-β:n sitoutumiseen osallistuu · .·**. lisätekijöitä tai reseptorin alayksiköitä (15-17). Lisäksi selostettiin jo kuvatun reseptorin j ·«* (14) osallistuvan kaikkien IFN-a-ja IFN-B-tyyppien sitoutumiseen (18).

* · • · • · · *· *·

Sytokiinin sitojaproteiinit (liukoiset sytokiinireseptorit) sopivat yhteen niitä vastaavien 4 118084 3 ' :/ . ,, solun pinnan sytokiinireseptorien ekstrasellulaaristen ligandin sitojadomeenien kanssa. Ne : saadaan joko solun pinnan reseptorin yleisen esi-mRNA:n vaihtoehtoisella silmukoinnilla tai solun pinnan reseptorin proteolyyttisellä lohkomisella. Sellaisia liukoisia reseptoreita on kuvattu aikaisemmin, mukaan lukien muiden muassa IL-6:n ja IFN-γιη (19-21), TNF:n (22-24), IL-l:n (25-27), IL-4:n (25, 28), lL-2:n (29, 30), IL-7:n (31) ja IFN-alfan (32) liukoiset reseptorit.

Keksintö koskee DNA-molekyylejä, jotka koodaavat tunnettua IFN-a/B-sitojaproteiinia (IL106591). Tällaiset DNA-molekyylit koodaavat oikeastaan kahta eri proteiinia, IFNAB- BPI:tä ja IFNAB-BPII:ta, jotka on todennäköisesti saatu samasta esi-mRNA:sta vaihtoehtoisella silmukoinnilla, jolloin muodostuu kaksi mRNA-molekyyliä, joista toisen koko on noin 1,5 kb ja toisen koko on noin 4,5 kb, joista kumpikin koodaa yhtä sitojaproteiinia, 1,5 kb:n mRNA koodaa IFNAB-BPI:tä ja 4,5 kb:n mRNA koodaa IFNAB-BPII:ta. Termi 1FNAB-BP edustaa sekä IFNAB-BPI:tä että IFNAB-BPII:ta. "f

Virtsan IFNAB-BP on tunnistettu IFNAB-BPII:na. -

Niinpä tämä keksintö koskee DNA- ja RNA-molekyyliä, joka koodaa IFN-a/B-sitojaproteiinia, joka on valikoitu ryhmästä 1FNAB-BPI, IFNAB-BPII, IFNAB-BPI:n ja IFNAB-BPII:n esiasteet ja fuusioproteiinit.

• * * • * · * · ·

Edelleen keksintö koskee replikoituvia, mainittuja DNA-molekyylejä sisältäviä

: ilmentymisvälineitä, näillä transformoituja isäntiä sekä tällaisilla transformoiduilla I

• · · * isännillä tuotettuja proteiineja. Termiin "DNA-molekyylit" sisältyvät genominen DNA, • · · • cDNA, synteettinen DNA sekä näiden yhdistelmät.

«·· · * · • * * • · · . · Tämä keksintö koskee myös valmistusmenetelmiä isäntäsoluissa, jotka pystyvät : *.. tuottamaan funktionaalista IFNAB-BPI:tä ja IFNAB-BPII:ta, esiasteita tai • · · fuusioproteiineja.

• ·

• * · -V

• « · ** ··· ♦ i***; Keksintö koskee myös yhdistelmä-IFNAB-BPI:tä ja -IFNAB- BPTT:ta, esiasteita ja / • ♦ · fuusioproteiineja, ja kaikkien näiden suoloja sekä farmaseuttisia koostumuksia, jotka • · ,·, ; sisältävät IFNAB-BPI:tä tai IFNAB-BPII:ta, esiasteita tai fuusioproteiineja tai kaikkien « *· • · näiden suoloja.

118084

.: ' 4 "S

, - -Sj IFNAB-BPI ja IFNAB-BPII inhiboivat luontaisen ihmisen leukosyytin ja fibroblastin interferonien biologisia aktiivisuuksia samoin kuin ihmisen yhdistelmä-IFN-a2:ta, -IFN-aB:tä,-IFN-aC:tä ja-IFN-b:aa. 1FNAB-BPI vastaa uutta kalvonläpäisevää proteiinia, joka on ligandia sitova IFN-a/B-reseptori. IFNAB-BPII on liukoinen reseptori, joka vastaa suuressa määrin IFNAB-BPI:n ekstrasellulaarista ligandin sitojadomeenia.

Kuva 1 esittää IFNAB-BPI:n ja IFNAB-BPII:n kloonaussuunnitelman: 1 "•yi (A) Keskimmäinen rivi: Sisäisen CNBr-peptidin (27 aminohappotähdettä, cb7) sekvenssi, - joka on saatu virtsan 40 000:n painoisesta IFNAB-BP:stä.

Ylä- ia alarivit: Synteettinen sense-aluke (yllä) ja antisense-aluke (alla), degeneroidut oligonukleotidiseokset, jotka on tehty peptidisekvenssin pohjalta ja käytetty käänteistranskriptioon (vain antisense-aluke) ja polymeraasiketjureaktioon (PCR). ; ‘4- y (B) Edellä mainituilla sense- ja antisense-alukkeilla tehtyjen PCR-tuotteiden agaroosigeelielektroforeesi. Seuraavia RNA-molekyylejä ja alukkeita käytettiin sellaisen » cDNA;n muodostamiseen, jota käytettiin templaattina PCR:lle: (1) Poly-A + RNA Daudin soluista, antisense-aluke. (2) Poly-A + RNA Daudin soluista, oligo(dT)-aluke. (3) . .·, Kokonais-RNA WISH-soluista, antisense-aluke. DNA-markkerien koko (bp) osoitetaan • * · ... ; vasemmalla puolella. ; • « . . ·\ * · · • ♦ · • * ♦ · (C) Ylärivi: Sekvenssin ei-degeneroitunut osa, joka on saatu 101 emäsparin (bp:n) PCR- ** * • tuotteen pBluescript-klooneista.

* · · ·

Alarivi: Tuloksena saadun ei-degeneroidun DNA-sekvenssin translaatio odotetuksi > sekvenssiksi, joka on cb7-peptidin sekvenssin osa (tähteet 9-20). ‘ • · ' • ·

Kuva 2 esittää cDNA:n ja IFNAB-BPI:n cDNA:n kantavan qlO- kloonin transloidun ; .·. polypeptidisekvenssin: , • * * · • · · • » * · • · * Tämä klooni eristettiin ihmisen HeLa-solujen cDNA:sta tehdystä lambda gtll-kirjastosta • · seulomalla synteettisellä oligonukleotidilla, joka vastaa kuvan 1(C) ei-degeneroitua DNA- · *Φ ** sekvenssiä. Virtsan lFNAB-BP:n N-terminaalia ja sen CNBr-peptidejä vastaavat 5 118084 sekvenssit on alleviivattu, ja vastaava sekvenssinimi on annettu viivan alapuolella (nl, N- terminaali 1; n2, N-terminaali 2; cb3, CNBr-peptidi 3; cb6, CNBr-peptidi 6; cb7, CNBr- peptidi 7). Yhtä tai useampaa signaalipeptidiä ja kalvonläpäisevää domeenia (tm) vastaavat hydrofobiset sekvenssit on alleviivattu kaksoisviivalla. Oikealla puolella olevat lihavoidut numerot ovat aminohappotähteiden numeroita. Yksinkertaiset numerot ti vastaavat nukleotiditähteitä numeron 1 edustaessa ATG:n A-initiaattoria.

Kuva 3 esittää mRNA:n toteamisen Northern blot -menetelmällä spesifisen koettimen avulla, joka on yhteinen IFNAB-BPI:n ja IFNAB-BPII:n sekvensseille: IFNAB-BPI.n nukleotideja 218-614 vastaava 397 emäsparin (bp) koetin valmistettiin polymeraasiketjureaktiolla sopivien alukkeiden avulla ja leimattiin [ P]:llä satunnaisella alukeleimauksella. Poly-A+-RNA ihmisen Daudin soluista analysoitiin elektroforeesilla agaroosilla (1,5 %), siirrettiin nitroselluloosalle ja hybridisoitiin spesifisen koettimen kanssa. Ribosomaalisen RNA:n koko on osoitettu oikealla puolella. y

Kuva 4 esittää IFNAB-BPI:tä vastaavan täydellisen 1,5 kb:n cDNA-kloonin nukleotidi- ja aminohapposekvenssit. Yhdellä kirjainkoodilla merkityt aminohappotähteet on numeroitu ‘ lihavoituina aloittamalla translaation aloituskodonista. Hydrofobiset johto- ja , . .·. kalvonläpäisyalueet on alleviivattu. Virtsan lFNAB-BP:n N-terminaaliset ; • · · * · ... : proteiinisekvenssit (kodonista 27 lähtien) ja sisäiset CNBr-peptidit on alleviivattu f pisteviivalla (Cys- ja N-glykosyloidut Asn-tähteet eivät kuitenkaan ole todettavissa). N- *·· { glykosylaatiosignaalit on osoitettu tähdillä ja polyadenylaatiosignaali on alleviivattu ** 9 : kaksoisviivalla.

• · « · • · « • · · • · *

Kuva 5 esittää IFNAB-BPII:ta vastaavan 4,5 kb:n cDNA-kloonin osittaiset nukleotidi- ja *· • aminohapposekvenssit. Yhdellä kirjainkoodilla merkityt aminohappotähteet on numeroitu • ·« ·..,· lihavoituina aloittamalla translaation aloituskodonista. Hydrofobinen johtoalue on .5 • alleviivattu. Virtsan IFNAB-BP:n N-terminaaliset proteiinisekvenssit (kodonista 27 *·· · :***; lähtien) ja sisäiset CNBr-peptidit on alleviivattu pisteviivalla (Cys- ja N-glykosyloidut ....: Asn-tähteet eivät ole todettavissa). N-glykosylaatiosignaalit ja lopetuskodoni on osoitettu -.s • · * ; tähdillä.

• ·· it ;.t • -1 : If 1 1 8084 6 :j

Kuva 6 esittää nisäkäsperäisen ilmentymisvektorin konstruktion IFNAB-BPI:n ekstrasellulaarisen ligandinsitojadomeenin ilmentämiseksi, (A) IFNAB-BPI:n ekstrasellulaarista ligandin sitojadomeenia koodaavan DNA:n valmistamiseen polymeraasiketjureaktiolla käytetyt synteettiset sense- ja antisense-oligonukleotidit.

(B) Polymeraasiketjureaktion (PCR) noin 850 bp:n tuotteen agaroosigeelielektroforeesi, joka PCR on tehty edellä mainituilla sense- ja antisense-alukkeilla ja qlO-kloonin DNA :11a.

•f! (C) peF-BOS-IFNAB-BP-I:n, nisäkäsperäisen ilmentymisvektorin, rakenne liukoisen IFNAB-BPI:n tuottamiseen.

Kuva 7 esittää IFNAB-BPI:n ja IFNAR.n ilmentymisen eri soluissa: IFNAB-BPI.n ilmentyminen eri soluissa esitetään detergentillä valmistettujen solu- uutteiden SDS-PAGE:lla (7,5%:inen akryyliamidi, ei-pelkistävät olosuhteet), jota seuraa immunoblottaus kanin anti-IFNAB-BPII-vasta-aineella ja 125I-proteiini A:lla. Klooni . .·. 369.11 on IFNAB-BPI:tä ilmentäviä NIH-3T3-soluja; klooni 470.6 on IFNAR:ia ä ♦ * * • · » ilmentäviä NIH-3T3-soluja; ja klooni 508.12 ilmentää molempia proteiineja. Myös J .·. kontrolli-NIH-3T3-solut ja ihmisen Daudin solut esitetään. IFNAB-BPI:n 51 kDa:n muoto »»( · .*··. (hiiren soluissa) ja 102 kDa:n muoto (Daudin soluissa) osoitetaan nuolilla. Vasemmalla ·*♦ • puolella esitetään molekyylipainomerkit.

«·· · -fi ♦ · · -1:

• · · V

• « ·

Kuva 8 esittää ,25I-IFN-a2:n sitoutumisen eri isäntäsoluihin: • · ·* ♦ ·· • --Γ ί,.,ί (A) l25l-IFN-a2:n kyllästyssitoutuminen EFNAB-BPF.tä ilmentäviin NIH-3T3-soluihin j .·. (klooni 369.11, ) ja sekä IFNAB-BPI:tä että IFNAR:ia ilmentäviin soluihin (klooni ·»· « :***. 508.12, ·) sekä sitoutumisen puuttuminen vain IFNAR:ia ilmentäviin soluihin (klooni »t» 470.6, Δ). (B) 125I-IFN-a2:n edellä mainittuihin soluihin sitoutumisen Scatchard-analyysi.

• · '-V

; Sitoutumistiedot analysoitiin LIGAND-ohjelmalla. Seuraavat solut osoittivat korkean :i • ·· . -j· • » . . r affiniteetin kyllästyssitoutumista: ihmisDaudi (Δ), IFNAB-BPI-positiiviset solut (klooni | 118084 7 .

369.11 (·) Ja klooni 508.12Joka ilmentää sekä IFNAR:ia että TFNAB-BPT:tä ().

Kuvassa 9 esitetään yhteenveto tutkimuksen tuloksista BIAcore-systeemillä, joka määrittää virtsan IFNAB-BPIIm affiniteetin !FN-a2:lle: IFN-a2 immobili soitiin sensorin anturille (chip) ja sensorin anturin läpi johdettiin virtsan IFNAB-BPlI:n eri konsentraatioita. "Suhteellinen vaste vs. aika" osoittaa sitoutumis- ja dissosiaatiotapahtuman. Näennäinen dissosiaatiovakio on 3,12 x 10'9M.

Kuva 10 esittää virtsan IFNAB-BPIIm ELISA-määrityksen:

Puhdasta virtsan IFNAB-BPII:ta sarjalaimennettiin kahteen kertaan osoitettuihin konsentraatioihin, pantiin mikroELISA-levyille, jotka oli esipäällystetty mab-anti-IFNAB-BPII-vasta-aineella. Sitten levyt pantiin reagoimaan kanin anti-IFNAB-BPII-vasta-aineen kanssa, jota seurasi vuohen anti-kani-pipaijuuri-peroksidaasikonjugaatti ja ABTS/H2O2-substraatti. Levyt luettiin 405/630 nm:ssä. Toteamisen alaraja on 30 pg/ml.

IFN-a/B-sitojaproteiini, jonka molekyylipaino on 40 000 (IFNAB-BP), eristettiin israelilaisen patenttihakemuksen 106591 mukaisesti normaalista virtsasta kahdella . kromatografiavaiheella. Virtsan puhdistamattomat proteiinit syötettiin pylvääseen, joka • * · ·*· ... ; koostui agaroosiin sitoutuneesta IFN-a2:sta. Pylväs pestiin epätarkoituksenmukaisten • · : .·. proteiinien poistamiseksi ja sen jälkeen sitoutuneet proteiinit eluoitiin alhaisessa pH:ssa.

• M ·

Sitten eluoidut proteiinit eroteltiin kokoekskluusio-HPLOllä, jolloin saatiin useita • · · • proteiinipiikkejä,joista yksi karakterisoitiin sen kyvyn perusteella reagoida spesifisesti 125I-IFN-a2:n kanssa ja estää IFN-a:n ja IFN-β.η virustenvastainen aktiivisuus. Tämä · proteiini karakterisoitiin edelleen N-terminaalisella mikrosekvensointianalyysillä, jolla saatiin suuri sekvenssi sen N-terminaalisessa domeenissa: • · _ ·_ • · · * « * · ♦ · · : Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile- Arg-Leu-Arg.

·*« • · · * ♦ * · ·

Todettiin pieni polypeptidisekvenssi, joka vastasi suurta sekvenssiä muutoin, mutta sillä ? * · ,·, . oli kolme ylimääräistä aminohappotähdettä (lle-XXX-Tyr) edellä mainitun sekvenssin N- terminaalissa (XXX tarkoittaa tunnistamatonta aminohappoa), Tuloksena saatua I 8 118084 sekvenssiä verrattiin tunnettuun IFN-aB-reseptoriin (14) ja sen havaittiin eroavan tästä täydellisesti. Se erosi myös jokaisesta muusta tunnetusta proteiinista, eikä sitä koodannut '·*: mikään tunnettu DNA-sekvenssi, mikä määritettiin vertaamalla sitä Swissprot- ja Genebank-tietokiijastoihin FastA-ohjelmaa (33) käyttämällä.

Virtsan IFNAB-BP-näyte pilkottiin CNBr.llä, eroteltiin SDS-PAGE:lla, elektroblotattiin PVDF-kalvolle ja tuloksena saaduille pilkkomispaloille tehtiin proteiinin mikrosekvensointi. Yhden palan molekyylipaino oli alle 10K ja sen sisäinen sekvenssi oli seuraavanlainen (Met edeltää varsinaista sekvenssiä):

Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-

Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile (27 tähdettä).

Tämä sisäinen sekvenssi käänteistransloitiin sense-ja antisense-alukkeisiin, joihin lisättiin sopivat restriktiokohdat. Kokonais-RNA puhdistettiin ihmisen soluista ja yksisäikeinen cDNA muodostettiin käänteiskopioijaentsyymillä käyttämällä alukkeena joko antisense- | oligonukleotidiseosta tai oligo(dT):tä. Tuloksena saatu cDNA-fragmentti monistettiin sitten polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttämällä yhdistettyjä degeneroituja sense- ja antisense-alukkeita. PCR-tuotteiden analyysi 3%:isella agaroosigeelillä osoitti spesifisen . 101 bp:n oligonukleotidivyöhykkeen. Tämä DNA pilkottiin restriktioentsyymeillä, • · * ··· ... : kloonattiin pBluescript-vektori in (Stratagene) ja tämä vektori siirrettiin • · ; transfektointikykyisiin £.co/z-soluihin. Sekvensoitiin useita itsenäisiä klooneja.

• * · · ····* .***. Degeneroitujen sense- ja antisense-alukkeiden reunustaman alueen sekvenssi oli 5 *·· ! .*. muuttumaton ja koodasi odotettua sekvenssiä edellä mainitusta virtsan IFNAB-BP:n 1 • * · * ri **« · :*·*: CNBr-peptidistä (cb7). Tätä ei-degeneroitua sisäistä sekvenssiä vastaava oligonukleotidi syntetisoitiin, sen päät leimattiin ja sitä käytettiin cDNA-kirjastojen seulomiseen.

• · • · • · ·

Ihmisen HeLa-solujen (Clontech) lambda gtll cDNA-kiijaston seulonta tuotti useita : positiivisia klooneja. Yhdellä näistä klooneista, joka nimettiin qlO:ksi, oli avoin ··« · .***. lukukehys, joka vastasi signaalipeptidiä, ekstrasellulaarista domeenia, kalvonläpäisevää • « · . domeenia ja lyhyttä soluliman domeenia. Virtsan IFNAB-BP:stä saadut peptidisekvenssit • M* *?· . olivat kaikki läsnä qlO:n koodaamassa ekstrasellulaarisessa domeenissa. Muutamat | • ·· • · peptidisekvenssin aminohappotähteet olivat vääriä proteiinin sekvensointi tekniikan • .i 9 118084 rajoituksen vuoksi (pääosin kyvyttömyys tunnistaa Cys ja Ser-tähdettä vastaavien piikkien alhaiset tasot).

Kloonin qlO nukleotidisekvenssin 219-613 (kuva 2) päitä vastaavia sense- ja antisense-alukkeita käytettiin spesifisen koettimen valmistamiseen PCR:llä käyttämällä qlO-kloonia DNA-templaattina. Tuloksena saatu DNA leimattiin [32P]:llä ja käytettiin kahdesta ihmissolulinjasta peräisin olevan poly A+ mRNA:n Northern blot -hybridisaatioon.

Molemmissa tapauksissa havaittiin kaksi spesifistä vyöhykettä, joista yksi vastasi 1,5 kb:n mRNA:ta, ja toinen vastasi 4,5 kb:n mRNA.ta. 1,5 kb:n mRNA:n primaarista translaatiotuotetta nimetään IFNAB- BPI:n esiasteeksi. 4,5 kb:n mRNA:n primaarista translaatiotuotetta nimetään IFNAB-BPir.n esiasteeksi.

Edellä mainittua spesifistä koetinta käytettiin lisäksi ihmisen cDNA-kiijaston seulontaan ϊ ja kaksi cDNA- klooniryhmää tunnistettiin. Yksi ryhmä (noin 20 yksittäistä kloonia) oli pituudeltaan 1,5 kb:tä ja koodasi samaa kalvonläpäisevän proteiinin esiastetta, jota qlO- klooni koodasi. Toinen ryhmä (2 yksittäistä kloonia) oli pituudeltaan 4,5 kb:tä. Nämä koot olivat samat kuin kahden mRNA-tyypin koot, ja sen vuoksi 1,5 kb:n cDNA-kloonit koodasivat IFNAB-BPhtä, kun taas 4,5 kb:n cDNAkloonit koodasivat IFNAB-BPII:ta.

Kooltaan 4,5 kb:n kloonien sekvensointi osoitti, että ne koodaavat qlO-kloonin kodoneita , .·, 1-239 vastaavaa typistetyn liukoisen reseptorin esiastetta. Kodonit 238 ja 239 olivat - # · · • · · : kuitenkin erilaisia ja niitä seurasi lopetuskodoni. Virtsan 40 000:n IFNAB- BP:n Οι terminaalin proteiinisekvenssianalyysi osoitti, että sitä koodaa 4,5 kb:n cDNA, kuten **· * ·**'. kahdesta viimeisestä aminohappotähteestä oli määritetty, ja sen vuoksi virtsan IFNAB-BP • · • ·*: tunnistettiin IFNAB-BPII:ksi. Tässä käytettynä "esiaste" määritetään primaarisena ··· · translaatiotuotteena, joka sisältää signaalipeptidin. * 1 • · • IFNAB-BPI:n typistetyn liukoisen muodon esiastetta koodaava DNA tuotettiin PCR:llä.

• * :1(>! Tuloksena saatu PCR-tuote insertoitiin nisäkäsperäiseen ilmentymisvektoriin ja käytettiin • transfektoimaan eri nisäkässoluja, kuten esimerkiksi apinan COS-soluja. Sellaiset solut § * *· · '% :***. ilmensivät runsaita tasoja biologisesti aktiivista liukoista yhdistelmä-IFNAB-BPI:tä.

• · · * >i • · Φ · #

• · .-S

.·, ; Samalla tavoin PCR.llä tuotettiin IFNAB-BPII:n esiastetta koodaava DNA. Tuloksena " • * · • · saatu PCR-tuote insertoitiin nisäkäsperäiseen ilmentymisvektoriin ja käytettiin 1 1 8084 ,·ΐο :, transfektoimaan eri nisäkässoluja, kuten esimerkiksi apinan CÖS-soluja. Sellaiset solut ilmensivät runsaita tasoja biologisesti aktiivista yhdistelmä-IFNAB-BPII:ta. f

Samalla tavoin PCR:llä tuotettiin DNA, joka koodaa kokonaista IFNAB-BPI:n esiastetta.

Tuloksena saatu PCR-tuote insertoitiin nisäkäsperäiseen ilmentymisvektoriin ja käytettiin transfektoimaan eri nisäkässoluja, kuten esimerkiksi hiiren NIH-3T3-soluja. Sellaiset solut ilmensivät runsaita tasoja ihmisenlFNAB-BPhtä. Solut pystyivät sitomaan ihmisen IFN- a2:ta korkealla affiniteetilla (¾ = 3,6 x 10“9 M). Kun sekä ihmisen IFNAB-BPI:tä että aikaisemmin kloonattua ihmisen IFN-aB-reseptoria IFNAR (14) ilmennettiin yhdessä > hiiren NIH-3T3-soluissa, yhdistelmäreseptorin affiniteetti kohosi 10- kertaisesti (K<j = 4 x 10"10 M). Sitä vastoin silloin, kun hiiren soluissa ilmennettiin vain ihmisen IFNAR:ia, | ihmisen IFN-a2:n sitoutumista ei voitu osoittaa. Sen vuoksi yhdistelmäproteiinilla, joka sisältää kaksi liittynyttä polypeptidiä, joista yhdellä on IFNAB-BPI:n ligandin sitojadomeeni tai IFNAB-BPII ja toisella polypeptidillä on IFNAR:n ekstrasellulaarinen domeeni, on korkeampi affiniteetti IFN-a:aa kohtaan verrattuna yksin IFNAB-BPI:een tai IFNAB-BPII :een.

Virtsan IFNAB-BPII:n affiniteetti ihmisen IFN-a2:ta kohtaan määritettiin BIAcore-systeemillä (Pharmacia, Ruotsi). IFN-a2 immobilisoitiin sensorin anturille ja annettiin , t·' sitoutua IFNAB-BPII:een. Kon- ja Koff-arvojen perusteella saatiin K^-arvo 3,12 x 10'9 M.

• · » • · · ... · Tämä arvo on hyvin lähellä sitä, joka saatiin IFNAB-BPI:tä ilmentävillä NIH-3T3-soluilla.

* · • · • * * • · * • * · · ' ,···. Edellä mainittu kloonaus-, kloonin eristämis-, tunnistamis-, karakterisointi- ja ? • · * * * · ' » : sekvensointimenetelmät kuvataan jäljempänä yksityiskohtaisemmin esimerkeissä.

···’ * * ··· i • · · • * « * >: IFNAB-BPI:tä ja IFNAB-BPII.ta voidaan tuottaa myös muun tyyppisillä :*·„ yhdistelmäsoluilla, kuten prokaryoottisoluilla, esim. E.colilla, tai muilla f 9 ; eukaryoottisoluilla, kuten esim. CHO-, hiiva- tai hyönteissoluilla. Menetelmät sellaisten * * * .i • ___ : .·, sopivien vektorien konstruoimiseksi, jotka kantavat joko IFNAB-BPI:tä tai EFNAB- • » · »M · ,·*·. BPITta koodaavaa DNA:ta ja ovat sopivia transformoimaan (esim. E.coli- tai hiivasoluja) ·«· * , tai infektoimaan hyönteissoluja yhdistelmä-IFNAB-BPI:n ja -IFNAB-BPII:n * · "Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols. 1993; ja Sambrook et ah, % . . tuottamiseksi, ovat alalla hyvin tunnettuja. Katso esimerkiksi Ausubel et ah, toim. > • * · · 11 118084 toim. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. painos, Cold Spring Harbor Press, 1989. 1

Keksintö koskee edelleen IFNAB-BPI:n ja iFNAB-BPILn fuusioproteiineja, jotka koostuvat villityypin IFNAB-BPI:stä tai IFNAB-BPII:sta, jotka on fuusioitu toiseen ' polypeptidiin tai proteiiniin ja joilla on samanlainen kyky estää IFN-a:n ja IFN-β.η tai muiden sytokiinien, joilla on interferonin alfa/beeta-reseptori, biologiset aktiivisuudet.

DNA, joka koodaa IFNAB-BPI:tä tai IFNAB-BPILta, esiasteita tai fuusioproteiineja, ja toiminnallisesti kytketyt transkription ja translation säätelysignaalit insertoidaan 1 eukaryoottivektoreihin, jotka pystyvät liittämään halutut geenisekvenssit isäntäsolun 1 kromosomiin. Jotta pystytään valikoimaan ne solut, jotka ovat stabiilisti integroineet sisääntuodun DNA:n omiin kromosomeihinsa, käytetään yhtä tai useampaa markkeria, ' jotka mahdollistavat ilmentymisvektorin sisältävien isäntäsolujen valikoimisen. Markkeri c voi antaa auksotrofiselle isännälle prototrofian, biosidiresistenssin, esim. antibiooteille, tai resistenssin raskasmetalleille, kuten kuparille tai vastaaville. Valikoitava markkerigeeni voi olla liittyneenä joko suoraan DNA-geenisekvenssiin tullakseen ilmennettäväksi tai se voi olla viety samaan soluun kotransfektion avulla. Yksiketjuisen sitojaproteiinin mRNA:n optimaaliseen synteesiin voidaan tarvita lisätekijöitä. Näitä tekijöitä voivat olla , silmukointisignaalit samoinkuin transkription promoottorit, vahvistajat ja lopetussignaalit ♦ · · • · (34).

• · * * i • · · • · ·** · .·*·. IFNAB-BPI- ja IFNAB-BPII-proteiinien, ilmentämistarkoituksiin valittuihin soluihin ··· : .·. sisäänpantava DNA-molekyyli on edullisesti sisällytetty sellaiseen plasmidiin tai « ;*·*· virusvektoriin, joka pystyy itsenäiseen rephkaatioon vastaanottajaisännässä.

;**„ Tärkeisiin tekijöihin tietyn plasmidin tai virusvektorin valitsemisessa kuuluvat: helppous, jolla vektorin sisältävät vastaanottajasolut voidaan tunnistaa ja valikoida niistä ; .·. vastaanottajasoluista, jotka eivät sisällä vektoria; tietyssä isännässä haluttujen vektorin ’ • · · '' '^1 .··*, kopioiden lukumäärä; ja se, halutaanko vektorin pystyvän "sukkuloimaan" eri lajeista ··· m peräisin olevien isäntäsolujen välillä. Edullisiin prokaryoottivektoreihin kuuluvat • · t._ . plasmidit, kuten sellaiset, jotka pystyvät rephkaatioon E.colissa, esimerkiksi pBR322, • ··

ColEl, pSCIOI, pACYC 184, jne. (35); Roc/Z/ui-plasmidit, kuten pC194, pC221, pT127, -2-¾ 12 1 1 8084 l jne. (36); Streptomyces-'gXzsm idit, mukaan lukien pIJIOl (37), Streptomyces-bakteriofaagit, kuten OC31 (38), ja Psewc/owoMas-plasmidit (39, 40).

'i

Edullisiin eukaryoottiplasmideihin kuuluvat BPV, lehmänrokkovirus (vaccinia), SV40, 2-mikronin rengas, jne. tai niiden johdannaiset. Tällaiset plasmidit ovat alalla hyvin tunnettuja (41-45).

Kun yhden tai useamman konstruktion sisältävä vektori tai DNA-sekvenssi on valmistettu ilmentämistä varten, ilmentymisvektori voidaan panna sopivan isäntäsolun sisään millä f tahansa monista sopivista tavoista, kuten esim. transformaatiolla, transfektiolla, j1 . ti, lipofektiolla, konjugaatiolla, protoplastifuusiolla, elektroporaatiolla, kalsiumfosfaattisaostuksella, suoralla mikroinjektiolla, jne. .- Tässä keksinnössä käytettävät isäntäsolut voivat olla joko prokaryoottisia tai eukaryoottisia. Edullisiin prokaryootti-isäntiin kuuluvat bakteerit, kuten esimerkiksi E.coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, jne. E.coli on edullisin prokaryootti-isäntä. Erityisen kiinnostaviin bakteeri-isäntiin kuuluvat E.coli K12 -kanta -

294 (ATCC 31446), E.coli Xl776 (ATCC 31537), E.coli W3110 (F-, lambda-, fototrooppinen (ATCC 27325), ja muut enterobakteerit, kuten esimerkiksi Salmonella . .·. typhimurium tai Serratia narcescens sekä eri Pseudomonas-]&jit. Sellaisissa olosuhteissa S

• * t 4 · · proteiinia ei glykosyloidu. Prokaryootti-isännän tulee sopia yhteen ilmentymisplasmidissa : olevien replikoni- ja säätelysekvenssien kanssa. j • · ... ;n • » · * • · · 'V4 • * vfj • · * * * • Koska IFNAB-BPI ja IFNAB-BPII ovat kuitenkin glykosyloituja proteiineja, eukaryootti- j «vt· :**; isännät ovat edullisempia kuin prokaryootti-isännät. Edullisia eukaryootti-isäntiä ovat nisäkässolut, esim. ihmisen, apinan, hiiren ja kiinanhamsterin munasolut (CHO), koska ne • · : *.. tekevät proteiinimolekyyleille translation jälkeisiä modifikaatioita, mukaan lukien oikean ··* ϊ : laskostuksen, oikean disulfidisillan muodostuksen samoin kuin oikeissa kohdissa ·*· 9 j tapahtuvan glykosylaation. Myös hiivasolut ja hyönteissolut voivat suorittaa peptidin ♦ · · · translation jälkeisiä modifikaatioita, mukaan lukien runsaan mannoosin glykosylaation.

• · v

Haluttujen proteiinien tuottamiseen hiivassa ja hyönteissoluissa voidaan käyttää useita ; yhdistelmä-DNA-menetelmiä, joissa käytetään voimakkaita promoottorisekvenssejä ja • «» • · plasmidien korkeita kopiolukuja. Hiivasolut tunnistavat johtosekvenssit kloonatuilla ';k 13 118084 nisäkäsgeenituotteilla ja erittävät johtosekvenssejä kantavia peptidejä. Vektorin sisäänviemisen jälkeen isäntäsoluja kasvatetaan valikoivassa elatusaineessa, joka valikoi j vektorin sisältävien solujen kasvun suhteen. Kloonat(t)u(je)n geenisekvenssi(e)n f ilmentäminen johtaa IFNAB-BPl:n tai IFNAB-BPII:n, esiasteiden tai fuusioproteiinien ^.

tuotantoon. Sitten ilmentyneet proteiinit eristetään ja puhdistetaan millä tahansa ' tavanomaisella menetelmällä, mukaan lukien uuttaminen, saostus, kromatografia, elektroforeesi tai vastaava, tai affiniteettikromatografialla käyttäen monoklonaalisia anti-IFNAB-BPI-vasta-aineita, jotka on immobilisoitu pylväässä olevalle geelimatriisille.

Raakavalmisteet, jotka sisältävät mainittua yhdistelmä-IFNAB-BPI:tä tai -IFNAB-BPiI:ta, tai niiden esiasteita, johdetaan pylvään läpi, jossa IFNAB-BPI tai IFNAB-BPII, tai niiden esiasteet sitoutuvat pylvääseen spesifisen vasta-aineen toimesta, kun taas epäpuhtaudet kulkeutuvat läpi. Pesun jälkeen proteiini eluoidaan geelistä tähän tarkoitukseen tavallisesti “ käytetyissä olosuhteissa, so. korkeassa tai matalassa pH:ssa, esim. pH 11 tai pH 2. £

Termi "fuusioproteiini" tarkoittaa polypeptidiä, joka sisältää IFNAB-BPI:tä tai IFNAB- BPILta, joka on fuusioitu sellaisen toisen proteiinin kanssa, jolla esimerkiksi on f pidentynyt viipymäaika ruumiinnesteissä. IFNAB-BPI tai IFNAB-BPII voivat siten olla fuusioituneina toiseen proteiiniin, polypeptidiin tai vastaavaan, esim. immunoglobuliiniin tai sen fragmenttiin.

* · · • · · * 1 2

Termi "suolat" tarkoittaa tässä sekä karboksyyliryhmien suoloja että IFNAB-BPI:n, j ,·, IFNAB-BPII:n, esiasteisen tai näiden fuusioproteiinien aminoryhmien «M « :3: happoadditiosuoloja. Karboksyyliryhmän suoloja voidaan muodostaa millä tahansa alalla • V · ;’· tunnetulla tavalla ja niihin kuuluvat epäorgaaniset suolat, esimerkiksi natrium-, kalsium-, 2 • · 1 · > ammonium-, rauta(3)- tai sinkkisuolat ja vastaavat sekä suolat orgaanisten emästen kanssa, | kuten sellaiset, jotka on muodostettu esimerkiksi amiinien, kuten trietanoliamiinin, j arginiinin tai lysiinin, piperidiinin, prokaiinin ja vastaavien, kanssa.

• · ·

Happoadditiosuoloihin kuuluvat esimerkiksi suolat mineraalihappojen, kuten esimerkiksi • . 1 : .1. kloorivetyhapon tai rikkihapon, kanssa sekä suolat orgaanisten happojen, kuten » 3 · esimerkiksi etikkahapon tai oksaalihapon, kanssa. Kaikilla sellaisilla suoloilla tulee • · · \t.

tietenkin olla olennaisilta osiltaan samanlainen aktiivisuus kuin IFNAB-BPI:llä tai * · . . IFNAB-BPII:lla tai niiden aktiivisilla fraktioilla. ! • · · • · · • · . ifl 118084 14

Keksintö koskee edelleen farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa ja keksinnön mukaista IFNAB-BPI.tä tai IFNAB-BPII:ta tai niiden esiasteita tai fuusioproteiineja ja niiden suoloja.

Keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset valmistetaan annettavaksi sekoittamalla IFNAB-BPI:tä tai IFNAB-BPIFta tai niiden johdannaisia fysiologisesti hyväksyttävien 5 kantajien ja/tai stabilisaattorien ja/tai täyteaineiden kanssa ja valmistetaan annosmuotoon esim. lyofilisoimalla annoslääkepulloissa. Antomenetelmä voi tapahtua hoidettavasta tilasta riippuen minkä tahansa samanlaisille aineille hyväksytyn antotavan kautta, esim.

laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, paikallisella injektiolla tai topikaalisella applikaatiolla, tai jatkuvalla infuusiolla jne. Annettavan aktiivisen yhdisteen määrä riippuu antotavasta, hoidettavasta sairaudesta ja potilaan tilasta. Paikallinen injektio | vaatii esimerkiksi alhaisemman proteiinimäärän kehon painoon nähden kuin ' laskimonsisäinen infuusio.

Kuten israelilaisessa patenttihakemuksessa 106591 mainitaan, IFN-a/B-sitojaprotciini (tai tässä IFNAB-BPII:ksi nimetty) inhiboi IFN-a2:n, IFN-aB:n, IFN-aC:n ja IFN-B:n mutta ei IFN-y:n viruksen vastaista aktiivisuutta, mikä osoittaa sen, että IFNAB-BPI ja IFNAB- BPII ovat yleisiä tyyppi I:n lFN:n sitojaproteiineja. Ne ovat siten hyödyllisiä eri IFN-α- 1 . .·, alatyyppien ja IFN-B:n biologisten aktiivisuuksien muuntamiseen ja estämiseen, esim.

• · · * · · -¾ tyyppi l:n sokeritaudissa, eri autoimmuunisairauksissa, siirrännäisen hyljinnässä, .* : AIDS:ssa ja samankaltaisissa sairauksissa, joissa esiintyy IFN-a:n tai IFN-B:n : • · * · ;***; epänormaalia ilmentymistä, so. IFNAB-BPI.tä ja IFNAB-BPII:ta voidaan käyttää missä j • · · .. j, • ;*: tahansa tilassa, jossa IFN-a:n tai IFN-B:n ylimäärää tuotetaan endogeenisesti tai annetaan *!!·* ί eksogeenisesti. ! • ··

I *.. Niinpä IFNAB-BPI ja IFNAB-BPII, niiden esiasteet tai fuusioproteiinit ja niiden suolat, H

♦ * * osoitetaan autoimmuunisairauksien hoitoon, muiden tulehdussairauksien hoitoon : nisäkkäillä, interferoni-alfan tai -beetan antamisesta aiheutuvan myrkyllisyyden hoitoon, f • · · · ·"*: nuoruusiän sokeritaudin, lupus erythematosuksen ja AIDS:n hoitoon. : ' ··· • · .·. i Kuten edellä on osoitettu, keksinnön mukaisilla proteiineilla on myös ei-terapeuttinen ; • »· • · käyttökelpoisuus, kuten esimerkiksi tyyppi I:n interferoniluokan puhdistuksessa. ^ . : , ri 15 118084

Keskintö koskee myös DNA-molekyylejä, jotka koodaavat mitä tahansa edellä määriteltyä ; keksinnön mukaista proteiinia, mitä tahansa sellaisia DNA-molekyylejä sisältäviä replikoitavia ilmentymisvälineitä, millä tahansa sellaisella ilmentymisvälineellä transformoituja isäntäsoluja, mukaan lukien prokaryoottiset ja eukaryoottiset isäntäsolut, edullisesti apinan COSsoluja.

Keksintö sisältää myös menetelmän minkä tahansa keksinnön mukaisen proteiinin valmistamiseksi viljelemällä transformoitua solua keksinnön mukaisesti ja ottamalla talteen proteiini, jota koodaa DNA-molekyyli ja ilmentymisväline sellaisen transformoidun isäntäsolun sisällä.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä sitä rajoittamatta: ' # ESIMERKKI 1: Virtsan IFNAB-BP:n nroteiinisekvenssianalvvsi Puhdas IFNAB-BP, joka saatiin, kuten israelilaisessa patenttihakemuksessa 106591 on kuvattu, adsorboitiin PVDF- kalvolle (ProSpin, Applied Biosystems, USA), ja kalvolle tehtiin proteiinisekvenssianalyysi mikrosekvensorilla Model 475 (Applied Biosystems, USA). Saatiin seuraavapääsekvenssi: - .V.

. Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg ^ 1 ... 5 .... 10 .... 15 .

• · • · • · · • · · ·*· • · • · • · * • :*j Lisäksi todettiin vähäisempi polypeptidi, jolla oli lisäksi kolme aminohappotähdettä (Ile- ·♦· ·

: xxx-Tyr) pääsekvenssin N-terminaalissa (xxx tarkoittaa tunnistamatonta aminohappoa). I

Tuloksena saatu sekvenssi on täysin erilainen kuin jo tunnetun IFN-aB-reseptorin i «· • sekvenssi (IFNAR, viite 14) ja erilainen kuin mikään muu tunnettu proteiini. Se on myös \..ϊ erilainen kuin mikään proteiini, jota koodaa tunnettu DNA-sekvenssi, mikä määritettiin * « • etsimällä Swissprot- ja Genebank-tietokannat FastA-ohjelmalla (33). Tämä proteiini on ··· · siis uusi IFN-α- sitojaproteiini. Eristettäessä cDNA-klooneja (katso jäljempänä),

• · · A

selvitettiin, että tähde 10 on Cys eikä Arg, ja tähde 15 on Ser eikä Arg. Lisäksi xxx I

• · .·, ; tunnistettiin Ser-tähteeksi. Tiedetään, että Cys-tähdettä ei voida tunnistaa : • · proteiinimikrosekvensoijalla, kun taas Ser tuhoutuu joskus analyyttisessä prosessissa eikä ) 16 1 1 8084 sitä sen vuoksi tunnisteta.

Näyte virtsan IFNAB-BP:tä pilkottiin CNBr:llä, eroteltiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Coomassie- sinivärillä väsättäessä membraanilla erotettiin ja todettiin seitsemän erillistä peptidivyöhykettä, joita merkittiin cbl - cb7. Kukin vyöhyke leikattiin irti ja sille tehtiin proteiinimikrosekvensointi. Yksi peptideistä, cb7, oli pienempi kuin 10 000 ja sille saatiin seuraava sisäinen sekvenssi (Met edeltää varsinaista sekvenssiä):

Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe- Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile- 1 ... 5 .... 10 .... 15 .... 20

Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile...

.... 25 . 27 ·*

Toisella peptidillä, cb3:lla, oli seuraava sekvenssi (Met edeltää varsinaista sekvenssiä): ;;

Met-Ser-Lys-Pro-Glu-Asp-Leu-Lys-Val-Val-Lys-Asn-XXX-Ala- Asn-Thr-Thr-Arg.... ‘ 1 ... 5 .... 10 . . . 15 . . 18 | Tähde 13 tunnistettiin myöhemmin Cys-tähteeksi cDNA-sekvenssistä määritettynä (katso jäljempänä). Cys-tähteitä ei voida tunnistaa proteiinimikrosekvensoinnilla.

• k * • · ·

Ml ... ί Toisella peptidillä, cb6:lla, oli seuraava sekvenssi (Met edeltää varsinaista sekvenssiä): • Met-Ser-Gly-XXX-Phe-Thr-Tyr-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Ile-Pro-Asn-Thr-Asn-Tyr...

*·* ·

1 . . . 5 .... 10 .... 15 . . 18 J

* * * • « ♦ * · *·· · :T: Tähde 4 tunnistettiin myöhemmin Asn-tähteeksi cDNA-sekvenssistä määritettynä (katso jäljempänä). Tämä Asn-tähde on osa mahdollista glykosylaation signaalisekvenssiä (Asn- • · • ’·· Phe-Tyr), ja Asn-signaalin puuttuminen proteiinin sekvenssistä osoittaa, että se todella on

Ml glykosyloitu.

• · • · · .··..« • · · ···*.

Muut peptidivyöhykkeet tunnistettiin sekvensoimalla epätäydellisen CNBrdlä tehdyn * · · pilkkomisen tuotteina. Niistä saatiin joko N-terminaalinen domeenisekvenssi, kuten * · .·. j IFNAB-BP:lle aikaisemmin havaittiin, tai samat cb3:n, cb6:n tai cb7:n sisäiset sekvenssit.

♦ ·· • f

- I

17 118084 ESIMERKKI 2: Virtsan IFNAB-BP:n C-tertninaalisen peptidin proteiinisekvenssianalvvsi Näyte virtsan IFNAB-BP:tä (noin 10 μg) pelkistettiin DTT:llä, alkyloitiin jodiasetamidilla ja pilkottiin endoproteinaasi Lys C:llä (Boehringer Mannheim, Saksa) entsyymi-substraattisuhteella 1:50. Tuloksena saatu peptidiseos eroteltiin RP-HPLC:llä RP18-pylväällä (Aquapore RP18, Applied Biosystems Inc.) käyttämällä asetonitriiligradienttia aq. 0,l%:isessa trifluorietikkahapossa. Yksittäiset peptidipiikit liitettiin kovalenttisesti Sequalon AA -kalvoille (Millipore, Bedford MA) ja niille tehtiin N-terminaalinen sekvensointi kuten edellä. Yksi peptideistä tunnistettiin C-terminaaliseksi peptidiksi, jolla on seuraava sekvenssi:

Cys-Thr-Leu-Leu-Pro-Pro-Gly-Gln-Glu-Ser-Glu-Phe-Ser 1 5 10 13 C-terminaalinen sekvenssi vastasi 4,5 kb:n cDNA-kloonin sekvenssiä (katso jäljempänä) * ja se voitiin erottaa 1,5 kb:n cDNA:n koodaaman oletetun proteiinin sekvenssistä kahden | viimeisen aminohappotähteen perusteella (Ser-Ala:n sijasta Phel2-Serl3). Siten liukoinen % virtsasta eristetty reseptori tunnistetaan IFNAB-BPII:ksi. Se transloidaan itsenäisesti ΐ spesifisestä 4,5 kb:n mRNA:sta eikä sitä muodosteta pienentämällä (shedding) solun pinnan reseptoria.

• · · * 1 · • « · ·:·· ESIMERKKI 3: Degeneroitujen sense- ia antisense-alukkeiden konstruointi ia IFNAB- : BP:n cDNA:n ei-degeneroidun sekvenssin tunnistaminen :2: Peptidin cb7 sekvenssi käänteistransloitiin sense- (aminohapot 1-8) ja antisense • · , , | : (aminohapot 27-20) -alukkeiksi. Alukeoligonukleotidien 5-päihin lisättiin | • · ·

ν' i dekanukleotideja ja nonanukleotideja, jotka sisälsivät BamH I ja vastaavasti Sal I

Ψ endonukleaasirestriktiosekvenssit (kuva IA). Kokonais-RNA uutettiin Daudin ja WISH:n .1 ·· ; *·· soluista ja yksisäikeinen cDNA muodostettiin käänteiskopioijaentsyymin avulla *·· käyttämällä alukkeena joko antisense-oligonukleotidiseosta tai oligo(dT):tä. Tuloksena * j saatu cDNA-fragmentti monistettiin sitten polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttämällä yhdistettyjä sense ja antisense degeneroituja alukkeita. PCR-tuotteiden analyysi 3%:isella | agaroosigeelillä osoitti odotetun 101 bp:n vyöhykkeen, joka saatiin sekä Daudin että WISH:n solujen cDNAdla (kuva IB). 101 bp:n fragmentti pilkottiin restriktioentsyymeillä • ·

BamH I ja Sal I, kloonattiin pBluescript II KS+ plasmidiin (Stratagene) ja 5 kloonia t i· 2 ; . f.

118084 18 ' _ sekvensoitiin. Sense- ja antisense-alukkeiden reunustaman alueen sekvenssi oli muuttumaton ja koodasi odotettua peptidin cb7 aminohappotähteiden 9-19 sekvenssiä >'! (kuva 1C). Sen jälkeen syntetisoitiin ei-degeneroitua sisäistä sekvenssiä vastaava 35 bp:n oi i gonukleo ti di ja sitä käytettiin cDNA-kiijastoj en seulontaan.

ix\ ESIMERKKI 4: IFNAB-BPI:n osittaisten cDNA-kloonien tunnistaminen ^

Esimerkin 2 synteettinen 35 bp:n ei-degeneroitu oligonukleotidi [32P]-leimattiin ja sitä käytettiin ihmisen HeLa-solujen lambda gtll cDNA-kiijaston (Clontech) seulontaan.

Tunnistettiin viisi positiivista kloonia. Yksi näistä klooneista, jota nimettiin qlO:ksi, sisälsi 1,4 kb:n insertin. Kloonin qlO sekvensointi tuotti sekvenssin, jossa oli avoin lukukehys, jossa tunnistettiin signaalipeptidi, ekstrasellulaarinen domeeni, kalvonläpäisevä domeeni ja intrasellulaarisen domeenin osa (kuva 2). Kloonin qlO DNA:n koodaamassa ekstrasellulaarisessa domeenissa tunnistettiin DNA- sekvenssit, jotka koodaavat N-terminaalista proteiinisekvenssiä samoin kuin virtsan IFNAB-BP:n kolmen CNBr-peptidin, cb3:n, cb6:n ja cb7:n, sekvenssejä. Joitain Cys- ja Ser-tähteitä (alleviivattu pisteviivalla, kuva 2) ei tunnistettu oikein proteiinisekvensoinnilla. On kuitenkin Ϊ tunnettua, että proteiinin sekvensointiin käytetty menetelmä ei tavoita Cys-tähteitä ja silloin tällöin se ohittaa Ser-tähteet. Myöskään cb6-peptidissä ei todettu Asn-tähdettä, mikä osoittaa sen olevan glykosyloitu. Kloonin qlO DNA-sekvenssin vertaaminen . Genebankin tietokantaan ei tuonut esille mitään yhtäläisyyttä minkään tunnetun «Il sekvenssin kanssa. Näin ollen tämä klooni sisältää uuden DNA-sekvenssin.

:1·ί • 1 ♦ · · • · ♦ ·2 · :3; ESIMERKKI 5: Ihmisen mRNA:n Northern blot * · 1

Radioleimattu DNA-koetin valmistettiin qlO-kloonista ja käytettiin kahdesta ihmisen : solulinjasta, Daudi ja WISH, peräisin olevan polyA+-mRNA:n Northern blot - ! hybridisaatioon. Molemmissa tapauksissa havaittiin kaksi spesifistä vyöhykettä, joista i ·· • 2·· toinen vastasi 1,5 kb:tä ja toinen vastasi 4,5 kb.tä. Vyöhykkeiden voimakkuuden ··· ·...· perusteella arvioitiin, että 1,5 kb:n mRNArta on noin kaksi kertaa runsaammin kuin 4,5 * ί kb:n mRNAita. WlSH:n soluista peräisin olevan RNA:n kanssa saatu signaali oli tuskin 2 • 1 · · 3 :3: havaittavissa, kun taas Daudin soluista peräisin olevan RNA:n signaali (kuva 3) oli todettavissa. 1,5 kb:n mRNA transloidaan IFNAB-BPIrn esiasteeksi, joka on solun pinnan ♦ ♦

.·. : interferonireseptori. Pidempi mRNA edustaa eri transkriptia koodaten eri proteiinia, jolla I

• 1 · f on vähintään 100 samaa aminohappotähdettä IFNAB-BPI:n kanssa. Tämä proteiini on 118084 19 " IFNAB-BPII:n esiaste, jonka osoitetaan myöhemmin olevan interferoni-α/β-reseptorin liukoinen muoto.

ESIMERKKI 6: IFNAB-BPI:n ia IFNAB-BPIEn täydellisten cDNA-kloonien tunnistaminen

Ihmisen monosyytti-cDNA-kiijasto, joka oli rakennettu XpCEV9-faagiin (Gutkind, J.S., et ai., Molec. Cell. Biol. 11: 1500-1507, 1991), seulottiin sitten qlO-kloonin koodaavasta alueesta PCR:Ilä tehdyllä 397 bp:n koettimella. Eristimme 22 kloonia 1,5 kb:n inserlillä ja kaksi kloonia 4,5 kb:n insertillä 106 itsenäisestä faagista. DNA-sekvenssin analyysi suoritettiin kahdelle 1,5 kb:n kloonille ^pCEV9-m6 ja λρΟΕν9-ηι24) samoin kuin kahden 4,5 kb:n kloonin (XpCEV9-ml9 ja XpCEV9-m27) koko avoimelle lukukehykselle.

1,5 kb:n kloonit koodasivat IFNAB-BPI:n kokonaista esiastetta, joka on solun pinnan reseptori, 331 kodonia käsittävällä avoimella lukukehyksellä (kuva 4). Transloidussa : | DNA-sekvenssissä tunnistettiin kaikki virtsan IFNAB-BP:stä (alleviivattu pisteviivalla, kuva 4) saadut proteiini- ja CNBr-peptidisekvenssit. Kahden 4,5 kb:n kloonin osittainen sekvensointi paljasti saman 237 kodonia käsittävän 5'- sekvenssin kuin 1,5 kb:n klooneissa, jota sekvenssiä seurasi erilainen sekvenssi, jolla oli lopetussignaali kodonin 239 jälkeen (kuva 5). Kaiken kaikkiaan seuraavat kodonit olivat erilaisia: kodoni 13 (Leu

His:n sijasta); kodoni 108 (Thr lle:n sijasta) ja kodonit 238-240 (Phe-Ser-Lopetus Ser-Ala-

Ser:n sijasta). Missään kolmesta lukukehyksestä ei havaittu avointa lukukehystä ♦ · · .!!!; lopetuskodonin jälkeen kummassakaan 4,5 kb:n kloonissa. Näin ollen 4,5 kb:n cDNA • · ; koodaa typistetyn liukoisen reseptorin esiastetta, jokaon IFNAB-BPII, jonka C- > • * · * * » · 1? .·*·. terminaalinen sekvenssi on samanlainen kuin sen, joka eristettiin virtsasta. Kaksi • · ·· · : mRNA:ta, jotka koodaavat sekä IFNAB-BPI:n että IFNAB-BPII:n esiasteproteiineja, ovat • « · · peräisin samasta geenistä, todennäköisesti vaihtoehtoisella silmukoinnilla.

* ·*·,. ESIMERKKI 7: Nisäkäsperäisen ilmentvmisvektorin konstruointi ia liukoisten ft ’i :***; vhdistelmä-IFNAB-BPI:n ia -IFNAB-BPII:n tuotanto • « e

: ]·. IFNAB-BPI:n signaali sekvenssiä ja ekstrasellulaarista domeenia koodaava DNA

• · ♦ • · * · .*··. muodostettiin PCR:llä VENT-DNA- polymeraasilla (Stratagene) käyttämällä synteettisiä • * · * * , sense- ja antisense-alukkeita, joissa oli Xba I -restriktiokohdat (kuva 6A), ja käyttämällä • · · · · • * . . templaattina ql0:n DNA:ta. Tuloksena saatu PCR-tuote (kuva 6B) pilkottiin • *! 2 restriktioentsyymillä Xba 1 ja liitettiin ilmentymi s vektoriin pEF-BOS, jolloin saatiin peF- 20 118084 BOS- IFNAB-BP-I (kuva 6C, viite 46). Rakenne varmistettiin DNA- sekvensoinnilla.

Kompetentit ^.co/z-solut transformoitiin ja kloonit, joissa oli IFNAB-BPI:n sekvenssi oikeassa orientaatiossa, eristettiin. pEF-BOS-sABR-rakennetta käytettiin apinan COS-solujen transfektioon. Nämä solut ilmensivät 12 ng/ml liukoista yhdistelmä-IFNAB-BPI:tä, joka saatiin soluviljelmän supematantista, joka määritettiin ELIS Ailia ja sen kyvyn perusteella inhiboida ihmisen alfa- ja beetainterferonien biologista (virustenvastaista) aktiivisuutta. IFNAB-BP11 :ta koodaava DNA-alue 4,5 kb:n kloonissa insertoidaan analogisesti nisakäsperäiseen ilmentymisvektoriin, kuten IFNAB-BPI.n ekstrasellulaariselle domeenille kuvattiin, ja käytettiin solujen transformoimiseen.

Sellaiset solut tuottavat aktiivista IFNAB-BPII:ta, jonka mainitut solut erittävät vi lj elyelatusaineeseen.

ESIMERKKI 8: Eukarvootti-ilmentvmisvektorien konstruointi ia IFNAB-BPI:n ia

IFNAR:n ilmentäminen hiiren soluissa I

Kokonaista IFNAB-BPI:tä koodaava DNA muodostettiin PCR:llä VENT-DNA- ; ,.j¥

polymeraasilla (Stratagene) käyttämällä synteettisiä sense- ja antisense-alukkeita, joissa oli Xba I -restriktiokohdat, ja käyttämällä templaattina plasmidia pCEV9-m6. Tuloksena saatu PCR-tuote pilkottiin restriktioentsyymillä Xba I ja liitettiin ilmentymisvektoriin pEF-BOS, jolloin saatiin peF-BOS-IFNABR. IFNAR:ia (14) vastaava cDNA

t muodostettiin RT- PCR:llä (48) käyttämällä spesifisiä oligonukleotideja. Monistettu tuote » · · .

• · · ... : kloonattiin pEF-BOS-ilmentymisvektorin Xba I -restriktiokohtaan (46), jolloin saatiin • · : .·. pEF-BOS-IFNAR. Nämä rakenteet varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Kompetentit • · 1 • · · · .·2 3 4. A. co//-solut transformoitiin ja kloonit, joissa oli IFNAB-BPI:n ja IFNAR:n sekvenssit • · · ϊ oikeassa orientaatiossa, eristettiin.

« 1 · ’ 1 · • · · • · ♦ , ]! 2 9 1

Kehitettiin kloonattua IFNAB-BPI:n cDNA:ta pysyvällä tavalla ilmentävät hiiren solut. Eksponentiaalisesti kasvavat NIH-3T3-solut (1,5 x 106 10 cm:n maljoilla) kotransfektoitiin f kalsiumfosfaattisaostusmenetelmällä (49) pSV2neo:lla (2 μ%) yhdessä pEF-BOS- 3 • . .

: .·. IFNABRm (10 /xg DNA:ta) kanssa. Tunnistettiin ja alikloonattiin itsenäiset G418- A

4 -' .·2. resistentit pesäkkeet. IFNAB-BPl:n runsaita tasoja ilmentävät kloonit tunnistettiin virtsan • · · IFNAB-BPl:tä vastaan suunnatun vasta-aineen sitoutumisella ja 125I-IFN- a2:n * · ,t . sitoutumisella (taulukko IV).

• · · • φ 21 118084

Anti-IFNAB-BPII-vasta-aineiden sitoutumiseksi solut (1 x 106) siirrostettiin 35 mm:n koloihin (6 kololevyä, Costar) ja kasvatettiin yhtenäiseksi (20 tuntia). Solut pestiin ^ DMEM:llä, joka sisälsi 2 % FBS:ää ja 0,1 % natriumatsidia (Wash-väliaine), jota seurasi 20 minuutin inkubointi Wash-väliaineessa. Kanin anti-IFNAB-BPII-vasta-aineita (2 ml, ' 1:500 Washin väliaineessa) lisättiin pestyihin koloihin ja soluja inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kolme kertaa, l25l-proteiini A:ta (2 ml, 250 000 cpm

Washin väliaineessa) lisättiin ja soluja inkuboitiin edelleen 45 minuutin ajan. Solut pestiin 3 kertaa, otettiin talteen trypsiinillä ja laskettiin.

125I-IFN-a2:n sitoutumiseksi solut (1 x 106) siirrostettiin 35 mm:n koloihin (6 kololevyä,

Costar) ja kasvatettiin yhtenäiseksi (20 tuntia). Solut pestiin DMEM:llä, joka sisälsi 2 „ %FBS:ää ja 0,1 % natriumatsidia (Wash-väliaine), jota seurasi 20 minuutin inkubointi Wash-väliaineen kanssa. l25I-IFN-a2:ta (2-3 x 105 cpm, 108 yksikköä/mg, 5 x ΙΟ7 cpm^g) lisättiin ja inkubointia jatkettiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kolme 4 kertaa, otettiin talteen trypsiinillä ja laskettiin.

Positiivisten kloonien (esim. kloonin 369.11) deter gentti uutteiden ei-pelkistävissä olosuhteissa suoritettu SDS-PAGE, jota seurasi immunoblottaus edellä mainitun vasta-aineen kanssa, tuotti voimakkaan, noin 51 kDa:n, vyöhykkeen (kuva 7). 5 * • · • φ * $ • ♦ · $ * ‘f*: IFNAR:ia ilmentävät hiiren solut kehitettiin samalla tavalla transfektoimalla ne pEF-BOS- • * 4: · IFNAR-plasmidilla. Klooni 470.6 oli IFNAR-positiivinen, mikä määritettiin huIFN-aB:n * · · kyvyn perusteella indusoida tehokkaasti virustenvastainen reaktio näissä soluissa. Kuten • · ί.ί : odotettua oli, muut tyyppi I:n IFN:t (esim. huIFN-B) eivät olleet aktiivisia kloonissa 470.6.

• * * • · · * * · :« • " .¾

Sitten transfektoitiin kloonit 369.11 ja 470.6, jotka ilmentävät IFNAB-BPI:tä ja IFNARiia, • · komplementaarisella reseptoriproteiinilla (pEF-BOS-IFNAR:lla ja vastaavasti pEF-BOS- • · *·;·* IFNABR:IIa). Joko IFNAR:ia tai lFNAB-BPI:tä ilmentävät G418-resistentit kloonit ; * * * transfektoitiin pysyvää yhteisilmentymistä varten pSV2hygrolla (2 μ§) yhdessä joko pEF- * * * ·ϊ BOS-IFNABR:n tai pEF-BOS-IFNAR:n kanssa kuten edellä. Hygromysiini- ja G418- ; ·;··· resistentit kloonit, jotka ilmensivät yhdessä sekä IFNAR:ia että IFNAB-BPI:tä, eristettiin ja alikloonattiin. Kloonista 369.11 peräisin olevat IFNAR-positiiviset kloonit tunnistettiin niiden huIFN-aB:tä kohtaan osoittaman virustenvastaisen reaktion perusteella, kun taas | 22 118084 kloonista 470.6 peräisin olevat IFNAB-BPI-positiiviset kloonit tunnistettiin sekä anti-IFNAB-BPII-vasta-aineiden että 12SI-IFN-a2:n sitoutumisen perusteella. Kloonista 369.11 r peräisin oleva klooni 508.12 ja kloonista 470.6 peräisin oleva klooni 1306 sitoivat sekä , 125I-IFN-a2:ta että IFN-a/BR-vasta-ainetta (taulukko IV). Lisäksi ne reagoivat huIFN- f- aB:tä kohtaan virustenvastaisessa määrityksessä. Senvuoksi me päättelimme näiden kloonien ilmentävän sekä IFNAB-BPl:tä että toiminnallista IFNAR:ia. .4

Taulukko IV. IFNAB-BPI:n ilmentyminen eri soluissa.

Sitoutunut Sitoutunut IFNAB-BPII- 125I-IFN-a2 | vasta-aine

Solut (cpm) (cpm) 470.6 (IFNAR) 236 90 " 369.11 (IFNAB-BPI) 4243 12 500 508.12 (IFNAB-BPI & IFNAR)a 7728 70 240 1306 (IFNAR &IFNAB-BPI)b 3369 32 000 'it

*.i.: a Peräisin kloonista 369.11 J

*:**: b Peräisin kloonista 470.6 ? • f • · · · • · · A.' • · « · · , ~- • · · > *...· ESIMERKKI 9: Hiiren soluissa ilmennettyjen IFNAB-BPI:n ia IFNAR:n affiniteetin • · • * · ί" ϊ määrittäminen « · * *·* * Joko IFNAR:ia tai IFNAB-BPEtä ilmentävät kloonit tutkittiin niiden l25I-huIFN-a2:n £ sitomisen suhteen ja sitoutumisaineistoa arvioitiin Scatchardin analyysin perusteella. Solut ..** (1 x 106) siirrostettiin 35 mm:n koloihin (6 kololevyä, Costar) ja kasvatettiin yhtenäiseksi • · "* (20 tuntia). Solut pestiin DMEM:llä, joka sisälsi 2 % FBS:ää ja 0,1 % natriumatsidia * · • · A ti· I ^ f :.: : (Wash-väliaine), jota seurasi 20 minuutin inkubointi saman väliaineen kanssa. I-IFN- * * * ’···* a2:ta (2-3 x 105 cpm, 108 yksikköä/mg, 5 x 107 cpm//tg) lisättiin yhdessä osoitettujen "**: konsentraatioiden kanssa leimaamatonta IFN-a2:ta ja inkubointia jatkettiin 2 tunnin ajan 1 • * huoneenlämpötilassa. Solut pestiin kolme kertaa Wash-väliaineella, otettiin talteen trypsiinilläja laskettiin. Sitoutumisaineisto analysoitiin LIGAND-ohjelmalla (50). \] 118084 23 .* , Vi

Vain IFNAR:ia ilmentävät solut (klooni 470.6) eivät osoittaneet mitään spesifistä 125I- |l IFN-a2:n sitomista (kuva 8A) ja sen vuoksi sellaisten oletettujen sitoutumiskohtien Ka- · arvoa ei voitu saada. Sitävastoin kloonilla 470.6 saatiin korkean affiniteetin spesifinen ja kyllästävä sitoutuminen soluilla, jotka ilmensivät vain IFNAB-BPI:tä (klooni 369.11).

Tämän sitoutumisen Kd-arvo oli 3,6 x 10'9 M 23 °C:ssa (taulukko V).

125I-IFN-a2:n sitoutumista 508.12-soluihin (ilmentävät sekä IFNAB-BPI:tä että IFNAR:ia) arvioitiin Scatchardin analyysillä ja tuloksia verrattiin niihin, jotka saatiin kloonilla 369.11 | (ilmentää vain IFNAB-BPI:tä). Ilmennettäessä IFNAB-BPI:tä ja IFNAR:ia yhtäaikaa, saatiin kyllästetty sitoutuminen ja affiniteetti IFN-a2:ta kohtaan kohosi noin 10-kertaisesti (kuva 8) läheten reseptorin affiniteettia Daudin soluissa (IQ = 4,0 x 10‘10 M vs. vastaavasti 1.6 x 10'10 M, taulukko V). Tämä tulos osoittaa, että IFNAR ja IFNAB-BPI toimivat ligandin sitomisessa yhdessä.

Taulukko V. Eri isäntäsolujen sitomisominaisuudet (ligandi= l25I-IFN-a2).

;·ι

Solu (reseptori) Sitoutumiskohtia/solu Kd (M) 20 °C:ssa " * · * • · · ___________ - • · φ '' ~ - " ' ·:··: ihmisen Daudi 4900 ±11% 1,6 xl O'10 470.6 (IFNAR) 0 (-) | 369.11 (IFNAB-BPI) 80 000 ±11% 3,6 xl0‘9 I.:*: 508.12 (IFNAB-BPI & O - IFNAR) 59 000 ±10 % 4,07 xl0‘10 * * * ·

• · * J

• • · · ’···* ESIMERKKI 10: Virtsan IFNAB-BPII:n affiniteetin määrittäminen * . „ „ ·,· · Ihmisen IFN-a2 immobilisoitiin BIAcoren (Pharmacia, Ruotsi) sensorin anturille »*« valmistajan varustamalla automaattisella menetelmällä. Noin 30 imol IFN-a2:ta • immobilisoitiin. Virtsan IFNAB-BPII:ta, jota oli laimennettu fosfaattipuskuroidussa | ;*·,· suolaliuoksessa (PBS) useisiin konsentraatioihin (28-112 nM), johdettiin sensogrammm anturin läpi ja assosiaation ja dissosiaation laajuus (PBS:ssä) rekisteröitiin. Tuloksena t • - * 24 118084 saatujen tietojen perusteella laskettiin IQ-arvo 3,12 x 10'9 M(kuva 9). Virtsan IFNAB-BPII:n affiniteetti on näin ollen hyvin samanlainen isäntäsoluissa ilmennettyyn EFNAB-BPI:een verrattuna.

ESIMERKKI 11: IFNAB-BPI:n ia IFNAB-BPII:n ilmentäminen E.colissa, hiiva- ia hvönteissoluissa.

IFNAB-BPI:tä ja IFNAB-BPII:ta tuotetaan myös muilla yhdistelmäsoluilla, kuten esimerkiksi prokaryoottisoluilla, esim. E.colilla, tai muilla eukaryoottisoluilla, kuten hiiva- ja hyönteissoluilla. Hyvin tunnettuja menetelmiä on saatavilla sellaisten sopivien vektorien konstruoimiseksi, jotka kantavat DNA:ta, joka koodaa joko IFNAB-BPI:tä tai V1 IFNAB-BPII:ta ja niiden aktiivisia fraktioita, ja jotka ovat sopivia transformoimaan E. coli- ja hiivasoluja tai infektoimaan hyönteissoluja yhdistelmä-IFNAB-BPI:n ja-IFNAB-BPII:n tuottamiseen. Hiivasoluissa ilmentämistä varten IFNAB-BPI:tä tai lFNAB-BPII:ta koodaava DNA (esimerkit 5 ja 6) leikataan pois ja insertoidaan ilmentymisvektoreihin, jotka sopivat hiivasolujen transfektioon. Hyönteissoluissa ilmentämistä varten IFNAB- BPI:tä tai IFNAB-BPII:ta koodaava DNA insertoidaan bakulovirukseen ja hyönteissolut 1 infektoidaan mainitulla yhdistelmä-bakuloviruksella. E.colissa ilmentämistä varten joko IFNAB-BPI:tä tai IFNAB- BPII:ta koodaavalle DNA:lle tehdään kohdennettu mutageneesi sopivilla oligonukleotideilla niin, että aloitus-ATG-kodoni insertoidaan juuri : ennen kypsän IFNAB-BPI:n (kuva 2) tai IFNAB-BPII:n ensimmäistä kodonia.

*:**: Vaihtoehtoisesti sellainen DNA voidaan valmistaa PCRillä sopivilla sense- ja antisense- ' ·.· j alukkeilla. Tuloksena saadut cDNA-rakenteet insertoidaan sitten sopivasti konstruoituihin ! • * · *...· prokaryoottisiin ilmentymisvektoreihin alan hyvin tuntemilla tekniikoilla (35).

* · * · · • * · • ·* * ESIMERKKI 12: IFNAB-BPI:n ia IFNAB-BPTTm vhdistelmäfuusionroteiinien [ konstruointi * * • · : ** Sellaisten proteiinien tuotanto, jotka sisältävät joko IFNAB-BPI:n ligandinsitojadomeenin • m *·”* tai IFNAB-BPII:n IgGl :n raskaan ketjun vakioalueeseen fuusioituneena, voidaan suorittaa Ä ·.· · seuraavalla tavalla: IFNAB-BPI:n tai IFNAB-BPlI:n DNA:lle tehdään kohdennettu * * * mutageneesi sopivilla oligonukleotideilla niin, että ainutlaatuinen restriktiokohta pannaan s ·;··· välittömästi ennen ja jälkeen sekvessejä, jotka koodaavat ligandia sitovia ;- :*·.· ekstrasellulaarisia domeeneita. Vaihtoehtoisesti sellainen DNA voidaan valmistaa PCR:llä ’ * « r* spesifisesti suunniteltujen restriktiokohtia sisältävien alukkeiden avulla. Toiselle " ' 25 4 118084 plasmidille, jolla on IgGl:n raskaan ketjun vakioalue, esim. pRKC042Fcl:lle (47), tehdään samanlainen kohdennettu mutageneesi, jonka avulla sama ainutlaatuinen j restriktiokohta pannaan niin lähelle kuin mahdollista IgGlm raskaan ketjun Asp-216:tta sellaisella tavalla, joka samanaikaisesti mahdollistaa translaation fuusioproteiiniin.

Kaksisäikeinen DNA-fragmentti, joka koostuu 5'-transloitumattomista sekvensseistä ja joka koodaa joko IFNAB-BPII:ta tai IFNAB-BPI:n ligandinsitojadomeenia, valmistetaan ainutlaatuisia restriktiokohtia pilkkomalla. Mutatoitu pRKCD42Fcl pilkotaan samalla tavoin sellaisen suuren fragmentin saamiseksi, joka sisältää plasmidin ja IgGl-sekvenssit.

Sitten kaksi fragmenttia liitetään yhteen, jolloin muodostuu uusi plasmidi, joka koodaa f

polypeptidin esiastetta, joka koostuu joko IFNAB-BPII:sta tai IFNAB-BPI:n ligandinsitojadomeenista sekä IgGl :n raskaan ketjun noin 227 C-terminaalisesta G

aminohaposta (sarana-alue ja CH2- ja CH3-domeenit). Fuusioproteiineja koodaava DNA voidaan eristää plasmidista pilkkomalla sopivilla restriktioentsyymeillä ja insertoida sen jälkeen tehokkaisiin prokaryoottisiin tai eukaryoottisiin ilmentymisvektoreihin. - ESIMERKKI 13: IFNAB-BPI:n ia IFNAB-BPII:n vhdistelmäfuusioproteiinien konstruointi yhdessä IFNAR:n kanssa

Sellaisten proteiinien tuotanto, jotka sisältävät joko IFNAB-BPIm ekstrasellulaarisen domeenin tai IFNAB-BPU.n IgGl:n raskaan ketjun vakioalueeseen fuusioituneena, ·,·,ί voidaan suorittaa kuten esimerkissä 12 on kuvattu. Samalla tavoin suoritetaan sellaisen 4 proteiinin tuotanto, joka sisältää IFNARrn ekstrasellulaarisen domeenin IgGl:n · kevytketjun vakioalueeseen fuusioituneena. Eukaryoottisia ilmentymisvektoreita,jotka 4 4 * • 4 koodaavat joko IgGl :n raskaan ketjun vakioalueeseen fuusioitua IFNAB-BPI:n « 4 ··· : ligandinsitojadomeenia tai IgGlm raskaan ketjun vakioalueeseen fuusioitua IFNAB- • * 4 • * 4 *·* BPII:ta, käytetään sopivien nisäkäsperäisten isäntäsolujen kotransfektioon yhdessä :: eukaryoottisen ilmentymisvektorin kanssa, joka koodaa IgGlm kevytketjun • 4 vakioalueeseen fuusioitua IFNARrn ekstrasellulaarista domeenia. Positiiviset • *4 • 4 transfektantit erittävät yhdistelmäproteiinia, joka koostuu IgGlm vakioalueista, IFNARrn ϊ 4 * 4 >·' : ekstrasellulaarisesta domeenista, joka korvaa IgGl m kevytketjujen vaihtelevat alueet, sekä 4 4 4 4 • * *··.* joko IFNAB-BPII:sta tai IFNAB-BPIm ligandinsitojadomeenista, joka korvaa IgGlm « *"*: raskaiden ketjujen vaihtelevat alueet.

• 4 * * · * ·· * *

Toisessa esimerkissä raskaiden ja kevyiden ketjujen vakioalueet vaihdetaan, nimittäin : ' .·* ·' ' "%

' ' ' I

26 118084 IFNARrn ekstrasellulaarinen domeeni fuusioidaan IgG2:n raskaan ketjun vakioalueisiin samalla kun joko IFNAB-BPI:n ligandinsitojadomeeni tai IFNAB-ΒΡΠ fuusioidaan IgG2:n kevytketjun vakioalueisiin.

Esimerkin 9 perusteella näiden fuusioproteiinien odotetaan osoittavan noin 10 kertaa ^ ν' korkeampaa affiniteettia IFN-a:aa kohtaan verrattuna IFNAB-BPI:een tai IFNAB-BPILeen.

ESIMERKKI 14: Polvklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen IFNAB-BP:lle

Kanit injektoitiin aluksi ihonalaisesti 5 /Kg:lla puhdasta valmistetta täydelliseen Freundin adjuvanttiin emulgoitua virtsan IFNAB-BP:tä. Kolme viikkoa myöhemmin ne injektoitiin jälleen ihonalaisesti 5 /£g:lla valmistetta epätäydellisessä Freundin adjuvantissa. Neljä lisäinjektiota liuoksena PBSrssä annettiin 10 päivän välein. Kaneista otettiin verta 10 päivää viimeisen immunisoinnin jälkeen. Vasta-ainetason kehittymistä seurattiin kiinteän faasin radioimmuunimäärityksellä (sRIA) käyttämällä 96-koloisia PVC-levyjä, joita oli päällystetty IFNAB-BP:llä (1 jug/ml) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) yli yön 4 °C:ssa. Sen jälkeen levyt suljettiin (blocked) naudan seerumin albumiinilla (BSA, 0,5 %), Tween 20:11a (Sigma USA, 0,05 %) PBSrssä yli yön 4 °C:ssa. Levyt pantiin reagoimaan kanin antiseerumin 5-kertaisilla laimennoksilla 4 tunnin ajan | huoneenlämpötilassa, pestiin ja pantiin reagoimaan 125I- proteiini A:n (105 cpm/kolo) | kanssa PBSrssä 45 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen levyt pestiin; ΐ • * :.i ! yksittäiset kolot leikattiin ja laskettiin. Tiitteri lasketaan maksimilaimennoksen, joka antoi 1 ·**. . . 1 10 kertaa korkeammat luvut kuin kontrolliantiseerumi, käänteisarvona. Tiitteri oli 5 / • · : injektion jälkeen korkeampi kuin 1:60 000. t • · · * · »

Vasta-ainetason kehittymistä seurattiin myös antiseerumin kyvystä estää ihmisen IFN- I

• · . ,r o2:n virustenvastainen aktiivisuus. Ihmisen WISH-soluista ennaltamuodostettuja • · ···* yksikerrosviljelmiä 96-koloisissa levyissä inkuboitiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa antiseerumin f • · :.· · kaksinkertaisten laimennosten kanssa aloittaen laimennoksella 1:250 kolossa no. 1. Sen • * · *...* jälkeen lisättiin IFN-a2:ta (10 u/ml, lopullinen) ja 1 tunnin jälkeen 37 °C:ssa solut • ;! *:**: altistettiin rakkulamaisen suutulehduksen (vesicular stomatitis) virukselle. Neutraloiva | Ί t ·.: tiitteri oli 7 immunisoinnin jälkeen 120 000 virustenvastaista u/ml.

t • '' · ·’ *ΐ . Λ • s ·· ;s 27 118084 ESIMERKKI 15: Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen IFNAB-BP:lle

Naaraspuoliset Balb/C-hiiret (3 kuukauden ikäiset) injektoitiin ensin 2 /xg:lla puhdistettua ΐ IFNAB-BP:tä täydellisen Freundin adjuvantin emulsiossa ja kolme viikkoa myöhemmin ihonalaisesti epätäydellisessä Freundin adjuvantissa. Kolme lisäinjektiota annettiin 10 "1-1

päivän välein ihonalaisesti PBS:ssä. Sitoutumistiitteriksi saatiin 1:60 000 sRIAdla (katso T

esimerkki 9). Lopulliset tehosteet annettiin intraperitoneaalisesti 4 ja 3 päivää ennen V

fuusiota hiireen, joka osoitti korkeimman sitoutumistiitterin. Fuusio suoritettiin käyttämällä fuusion osapuolina N SO/1 -myeloomasolulinj aa ja lymfosyyttejä, jotka oli A

"r valmistettu sekä pernasta että eläimen imusolmukkeista. Fuusiosolut jaettiin mikroviljelylevyille ja hybridoomat valikoitiin DMEM-elatusaineella, johon oli lisätty HAT:tä ja 15 % hevosen seerumia. Hybridoomat, joidenhavaittiin tuottavan vasta-aineita IFNAB-BP:lle, ahkioonattiin rajoittavalla laimennosmenetelmällä (limiting dilution method) ja injektoitiin Balb/C-hiiriin, jotka oli esikäsitelty pristaanilla askiteksen tuottamiseksi. Vasta-aineiden isotyypit määritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa i ELISA-pakkausta (Amersham, Yhdistynyt kuningaskunta). ;

Monoklonaalisia anti-IFNAB-BP-vasta-aineita tuottavien hybridoomien seulonta suoritettiin seuraavalla tavalla: Hybridoomasupematantit tutkittiin anti-IFNAB-BP-vasta-aineiden esiintymisen suhteen invertoidulla kiinteän faasin radioimuunimäärityksellä N

^j.·’ (IRIA). PVC-mikrotiitterilevyt (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) päällystettiin J

: affiniteettipuhdistetulla vuohen anti-hiiri-seerumin F(ab)2-vasta-aineilla (Jackson Labs, • 0 i USA) (10 /Xg/ml, 100 μΐ/kolo). Sen jälkeen, kun levyjä oli inkuboitu yli yön 4 °C:ssa, ne ··» *...* pestiin kahdesti PBS:llä, joka sisälsi BSA:ta (0,5 %) ja Tween 20:ta (0,05 %) ja suljettiin • * ' Λ 0 · · ί·: : (blocked) pesuliuokseen vähintään 2 tunniksi 37 °C:ssa. Hybridoomaviljelmän • · » * · * ’·* * supernatantit (100 μΐ/kolo) lisättiin ja levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sen ä jälkeen levyt pestiin kolme kertaa pesuliuoksella ja 12SI-IFNAB-BP:tä (100 μΐ, 105 cpm) . ..... , '1 *... lisättiin vielä 16 tunnin mkubointim 4 °C:ssa. Levyt pestiin kolme kertaa ja yksittäiset • * • · *" kolot leikattiin ja laskettiin gammalaskimella. Positiivisina pidettiin näytteitä, joille saatiin # · ,'j': • * * . ,

: vähintään 5 kertaa korkeammat luvut kuin negatiivinen kontrolliarvo (taulukko VI), Viisi T

* · · , k * · *·..* positiivista kloonia valikoitiin, alikloonattiin myöhempiä tutkimuksia varten ja *:**: karakterisoitiin. Kaikki kloonit olivat IgGl-isotyyppiä.

• * .* * · · · ? • ·· · • · t

Taulukko VI. Monoklonaalisia vasta-aineita IFNAB-BP:lle tuottavat kloonit 28 118084

Klooni no. Laimennus IRIA - CPM

2.1 1:1 2140 5.73 1:1 3292 30.24 1:1 5548 46.10 1:1000 29 818 70.6 1:1 1214

Kontrollivasta-aine 1:1 20 ESIMERKKI 16: IFNAB-BP:n affiniteettikromatoerafia monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa IFNAB-BP:n puhdistamiseen affiniteettikromatografialla käytettiin vasta-aineita IFNAB- BP:tä kohtaan. Tässä esimerkissä affiniteettikromatografiaan käytettiin monoklonaalista *

• I

vasta-ainetta no. 5.73. Hybridooman no. 5.73 erittämä monoklonaalisia vasta-aineita - sisältävä vatsaonteloneste (ascitic fluid) puhdistettiin ammoniumsulfaattisaostuksella 50 %:n kyllästetyllä, mitä seurasi perusteellinen dialysointi PBS:ää vastaan. Noin 10 mg immunoglobuliineja sidottiin 1 ml:aan Affigel 10:tä (Bio-Rad USA) valmistajan tietojen j mukaan.

: -i * * • · .-:¾ : 250 ml ihmisen virtsan proteiineja (vastaa 250 Iraa raakavirtsaa) syötettiin 0,5 ml:n anti- t • · φ • * *.··* IFNAB-BP-vasta-ainepylväälle 4 °C:ssa virtausnopeudella 0,25 ml/min. Pylväs pestiin • · • · ·

:·ί ! PBS:llä kunnes proteiinia ei pesuissa enää todettu. IFNAB-BP eluoitiin 25 mM

* · · * * * ·>'

*·’ * sitruunahappopuskurilla, pH 2,2 (8 x 1 pylvästilavuusfraktiot) ja neutraloitiin välittömästi J

IM Na2C03:lla. Eluoitujen fraktioiden SDS-PAGE;n hopeavärianalyysi paljastaa suuren • · vyöhykkeen, jonka molekyylipaino on 40 000, Tämän valmisteen lisäpuhdistus • · '** aikaansaatiin kokoekskluusiokromatografialla.

• · • · · • · · »M · • · · ESIMERKKI 17: iFNAB-BPII.n ELISA-testi *ϊ**ί Mikrotiitterilevyjä (Dynatech tai Maxisorb, Nunc) päällystettiin monoklonaalisella anti- | '•f ί/·ϊ IFNAB-BP-vasta-aineella no. 46.10 (Ig-fraktio, 120 μΐ/kolo, 10 Mg/ml PBS.ssä) yli yön 4 °C:ssa. Levyt pestiin PBSfllä, joka sisälsi BSA:ta (0,5 %), Tween 20:ta (0,05 %) ja NaN3 | .

29 118084 (0,02 %) (Blocking Solution) ja ne suljettiin (blocked) samaan liuokseen yli yöksi 37 f' °C:ssa. Tutkittavat näytteet saijalaimennettiin kaksinkertaisesti (aloitettiin laimennoksella f 1:4) Blocking Solution -liuoksessa, joka sisälsi 0,1 % NP40:ää ja 0,65 M NaCl, ja lisättiin koloihin (100 μΐ/kolo) 4 tuntia 37 °C:ssa. Sitten levyt pestiin kolme kertaa PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:ta (PBS/Tween), minkä jälkeen lisättiin kanin anti-IFNAB-BPII- ^ seerumia (1:1000 Blocking Solution -liuoksessa ilman NaN3, 100 μΐ/kolo) r lisäinkuboimista yli yön 4 °C:ssa varten. Levyt pestiin 3 kertaa PBS/Tween-liuoksella (100 μΐ/kolo) ja vuohi-anti-kani-pipaijuuri-peroksidaasikonjugaattia (HRP, Jackson Labs, 1 : 10 000 PBS/Tween-liuoksessa, 100 μΐ/kolo) lisättiin 2 tumiin ajan huoneenlämpötilassa. Levyt pestiin 3 kertaa PBS/Tween-liuoksella ja väri kehitettiin lisäämällä jokaiseen koloon substraattina 100 μΐ juuri valmistettua ABTS-liuosta (2,2-atsino-bis(3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihappo, Sigma, 10 mg; 6,4 ml H20; 2,2 ml 0,2 l M NaiHPOii 1,4 ml 0,2 M sitruunahappoa; 1 μΐ H2O2). Väri kehittyy 30 minuutissa ja reaktio voidaan lopettaa lisäämällä 0,2 M sitruunahappoa 100 μΐ/kolo. Levyt luettiin automaattisella ELISA-lukijalla 405 nmtssä kolaamalla ei-spesifinen lukema 630 nm.ssä.

Tämän määrityksen toteamisen alaraja oli 30 pg/ml (kuva 10).

Edellä oleva spesifisten suoritustapojen kuvaus paljastaa keksinnön yleisen luonteen niin, | että muut voivat vallitsevaa tietoa soveltamalla helposti muuttaa ja/tai sopeuttaa eri sovellutuksiin sellaisia spesifisiä suoritustapoja yleiskäsitteestä poikkeamatta, ja sen f * 1 ·1 · vuoksi sellaiset sopeutukset ja muunnokset tulee ja niiden tarkoitetaan sisältyvän • · I « « , !·ϊ ί esitettyjen suoritustapojen tarkoitukseen ja piiriin. Tässä käytetyn fraseologian ja • · *···1 terminologian on ymmärrettävä olevan kuvaamista eikä rajoittamista varten.

• 1

• · · ' : I

• · · . i ··· · • 1 ♦ • · • Φ • · · .“l • ···' • « • · • · · • / * · • · #

• · · I

··· ♦ . -f • · · • · '1 • · M1 • : • ' « 1 . . ' '1 • · • · · 30 '"h 118084

Kiri allisuusviitteet : ' ' ·. 1 -tl 1. Taylor, J.L. ja Grossberg, S.E. (1990). Recent progress in interferon research: molecular mechanisms of regulation, action and virus circumvention. Virus Research 15: 1-26.

2. Bisceglie, A.M., Martin, P., Kassianides, C., Lisker- Melman, M., Murray, L.,

Waggoner, J., Goodmann, Z., Banks, M.S. ja Hoofnagle, J.H. (1989). Recombinant interferon alpha therapy for chronic hepatitis C. A randomized, double-bind, placebo-controlled trial. New Eng. J. Med. 321: 1506-1510.

3. McDonnell, W.M. ja Eitä, G.H. (1992). Acute hepatitis C infection: interferon finally succeeds. Gastroenterology (US) 103: 1359-1360.

4. Friedman-Kien, A.E., Eron, L.J., Conant, M., Growdon, W., Badiak, H., Bradstreet, ' . . ^ P.W., Fedorczyk, D., Trout, R. ja Plesse, T.F. (1988). Natural interferon alpha for treatment of condylomata acuminata. J. Am. Med. Assn., 259: 533-538.

5. Mains, J. ja Handley, J. (1992). Interferon: current and future clinical uses in infectious disease practice. Int. J. Stud. AIDS 3; 4-9. . i 6. Berman, E., Heller, G., Kempin, S., Gee, T., Tran, L. ja Clarkson, B. (1990). Incidence of response and long term follow up in patients with hairy cell leukemia treated with 4 recombinant interferon Alpha-2a, Blood 75: 839-845.

7. Talpaz, M., Kantaijian, H.M., McCredie, K.B., Keating, M.J., Trujillo, J. ja Gutterman, -f : J. (1987), Clinical investigation of human alpha interferon in chronic myelogenous « *“*: leukemia. Blood 69: 1280-1288.

j.f: 8. De Wit, R., Schattenkerk, J.K.M.E., Boucher, C.A.B., Bakker, P.J.M., Veenhof, K.H.N. 1 • · * ja Danner, S.A. (1988). Clinical and virological effects of high-dose recombinant- 9 m :.: : interferon-a in disseminated AIDS-related Kaposi's sarcoma. Lancet 2: 1214-1222.

· * V : 9. Klippel, J.H., Carrete, S., Preble, D.T., Friedman, R.M.ja Grimley, P.M. (1985). Serum alpha interferon and lymphocyte inclusions in systemic lupus erythematosus. Annals of ί • · :·5 t ** the Rheumatic Diseases 44: 104-108.

• ♦ · --( *···* 10. Lau, A.S., Der, S.D., Read, S.E., ja Williams, B.R. (1991). Regulation of tumor j * * . -j :.: : necrosis factor receptor expression by acid-labile interferon-alpha from AIDS sera. AIDS :

Res. Hum. Retroviruses 7:545-552. ? ♦

•j··· 11. Stewart, T.A. (1993). Induction of type I diabetes by interferon-a in transgenic mice. J

Science 260: 1942-1946.

• ·

12. Tsavaris, N., Mylonakis, N., Bacoyiannis, C., Tsoutsos, H., Karabelis, A., ja Kosmidis, I

: . -7- 31 } 118084 P. (1993). Treatment of renal cell carcinoma with escalating doses of alpha-interferon.

Chemotherapy (Sveitsi) 39: 361-366.

13. Branka, A.A. ja Baglioni, C. (1981). Evidence that types I and II interferons have different receptors. Nature 294: 768-770.

14. Uze, G., Lutfalla, G. ja Gresser, I. (1990). Genetic transfer of a functional human interferon a receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA. Cell 60: 225-234.

15. Colamonici, O.R. et al. (1990). Characterization of three monoclonal antibodies that recognize the interferon-a2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7230-7234.

16. Platanias, L.C. et al. (1992). Expression of the IFN-a receptor in hairy cell leukemia,

Brit. J. Haematology 82: 541-546. s 17. Colaminici, O.R. et al. (1993). Identification of a novel subunit of the type I Interferon receptor localized to human chromosome 21. J. Biol. Chem. 268:10895-10899.

18. Benoit, P. et al. (1993). A monoclonal antibody to recombinant human IFN-a receptor inhibits biologic activity of several species of human IFN-a, IFN-b and IFN- omega. J.

Immunol. 150: 707-716. I

19. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. ja Rubinstein, M. (1989). Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J. Exp. Med. 170: 1409-1414.

20. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D., Leitner, 0., Revel, M. ja Rubinstein, M.

• . I* (1990). Purification of soluble cytokine-receptors from normal human urine by ligand- *“*: affinity and immuno-affinity chromatography. J, Chromatography 510: 331-337.

:.· * 21. Novick, D., Engelmann, H., Revel, M., Leitner, O. ja Rubinstein, M. (1991).

• · *

Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA, and .( * · : inhibition of ligand binding. Hybridoma 10: 137-146.

• · · ,'/ • * * ' '";ΐ *·* * 22. Engelmann, H., Novick, D, ja Wallach, D. (1990) Two tumor-necrosis-factor binding *.

proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross reactivity with cell • · . ;:v surface tumor-necrosis-factor receptors. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536. ! • ·

*···’ 23. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. ja Wallach, D. (1989) A

* · · Λ :,· · tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects j • · * cells from tumor necrosis factor toxicity. J. Biol. Chem. 264: 11974-11980.

*:··· 24. Seckinger, P., Isaaz, S. ja Dayer, J.M. (1988). A human inhibitor of tumor necrosis ; factor alpha. J. Exp. Med. 167: 1511-1516.

25. Maliszewski, C.R. ja Fanslow, W.C. (1990). Soluble receptors for IL-1 and IL-4. ^ 32 118084

Biological activity and therapeutic potential. Trends in Biotechnol. 8: 324-329.

26. Eastgate, J.A., Symons, J.A. ja Duff, G.W. (1990). Identification of an interleukin-1 beta binding protein in human plasma. FEBS Letters 260: 213-216.

27. Fanslow, F.W., Sims, J.E., Sasenfeld, H., Morrisey, PJ., Gillis, S., Dower, S.K. ja :

Widnter, M.B. (1990). Regulation of alloreactivity in vivo by soluble form of the ’ interleukin-1 receptor. Science 248: 739-742.

28. Mosley, B., Beckman, M.P., March, C., J., Idzerda, R.L., Gimpel, S., D., VandenBos, T., Friend, D., Alpert, A., Anderson, D., Jackson, J., Wignall, J.M., Smith, C., Gallis, B.,

Sims, J.E., Urdal, D., Widmer, M.B., Cosman, D, ja Pari, L.S. (1989). The murine interleukin-4 receptor: molecular cloning and characterization of secreted and membrane forms. Cell 59: 335-348.

29. Marcon, L., Fritz, M.E., Kunnan, C.C., Jensen, J.C. ja Nelson, D.L. (1988). Soluble TAC peptide is present in the urine of normal individuals and at elevated levels in patients with adult T-cell leukemia. Clin, Exp. Immunol. 73: 29-33.

30. Josimovic-Alasevic, 0., Hermann, T. ja Diamanstein, T. (1988). Demonstration of two distinct forms of released low-affinity type interleukin-2 receptors. Eur. J. Immunol. 18: ^ i 1855-1857. ; 31. Goodwin, R.G., Friend, D., Ziegler, S.F., March, C.J., Namen, A.E. ja Park, L.S.

(1990). Cloning of the human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a '* soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell 60: 941-951. | *’* ·' 32. Novick, D., Cohen, B. ja Rubinstein, M. (1992). Soluble IFN-a receptor molecules are | • ft *»: present in Body Fluids, FEBS Letters, 314: 445-448.

• · · 33. Pearson, W.R. ja Lipman, D.G. (1988). Improved tools for biological sequence

• * J

:.:: comparison, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448. | * * * -¾ • · W e ’·* * 34. Okayama, H., ja Berg, P, (1983). A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3: 280-289.

• · ft · ,.¾ ·#φ[* 35. Maniatis, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor ' ! • · ’··** Laboratory, New York, 1982. : j • · ..1 : 36. Gryczan, T., "The Molecular Biology of the Bacilli", Academic Press, NY (1982), s. |

**...·* 307-329. I

* · .£ ·:··· 37. Kendall, K.J.,etal. (1987), J. Bacteriol. 169:4177-4183.

:·.! 38. Chater, KF., et ai., teoksessa "Sixth International Symposium on Actinomycetales

Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Unkari (1986), s. 45-54. 7 ': . '1 118084 33 39. John, J.F., et ai. (1986), Rev. Infect. Dis. 8: 693-704.

40. Izaki, K. (1978), Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742. _i, 41. Botstein, D., et al. (1982), Miami Wint. Symp. 19: 265-274. ':Γ 42. Broach, J.R., teoksessa "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, s. 445-470(1981).

43. Broach, J.R., (1982), Cell 28: 203-204.

44. Bollon, D.P., et al. (1980), J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39-48.

45. Maniatis, T., teoksessa "Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Voi. 3: Gene Expression", Academic Press, NY, s. 563-608 (1980).

46. Mizushima, S. ja Nagata, S. (1990), pEF-BOS, a powerful mammalian expression { vector. Nucleic Acid Res. 18: 5322-5328.

47. Bym, R.A., et al., 1990, Nature (London) 344: 667-670.

48. Frohman, M.A., Dush, M.K. ja Martin, G.R. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002.

49. Graham, F.L. ja Van der Eb, A.J. (1973), Virology, 52:456-467.

50. Munson, P.J.ja Rodbard, D. (1980), Anal. Biochem., 107: 220-239.

51. Yamada, T., et al., Neurosci. Lett., 181: 61-64 (1994).

• « · ·· · . . * ···**.

• · J · · ··';· * · * Λ *·· · 5 «·· :: -i • · ♦ • « ·; • · « . .

• · · " • · · ' .3 • * % ·;? • · · «· • · • ·· » ·.····.: ··· :: ··♦ J · * · • · · .-- ·*··: * · · : : : **·♦· ♦ · : • · * i . i ; j , . .

_ j '

Claims (16)

118084

1. DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa IFN-a/p-sitojaproteiinia, joka on valittu seuraavista: (a) IFNAB-BPI, jolla on kuviossa 2 esitetty aminohapposekvenssi (b) IFNAB-BPII, jolla on kuviossa 5 esitetty aminohapposekvenssi; ja (c) kohtien (a) ja (b) mukaisten proteiinien esiasteet tai fuusioproteiinit.

2. mRNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksessa 1 kuvatun DNA- molekyylin transkriptiotuote. i

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen mRNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se on valittu seuraavista: (a) noin 1,5 kb:n mRNA-molekyyli, joka transloituna on IFNAB-BPI:n esiaste (b) noin 4,5 kb:n mRNA-molekyyli, joka transloituna on IFNAB-BPIIm esiaste

4. Replikoituva ilmentymisväline, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin. • · · • · · • · * • 'i· ··*·*.· ·τ:

* ’ 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen replikoituva ilmentymisväline, tunnettu siitä, että se • · « · · V, :·: · on plasmidi pEF-BOS-IFNAB-BPI, jonka rakentaminen on kuvattu esimerkissä 7. J • · * • * • · * · · > • · ·*·

6. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksessa 4 tai 5 * · * » · · * kuvatulla replikoituvalla ilmentymisvälineellä. • · * * · · ( . i * * · . :a

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on prokaryoottisolu. • * • * · • . V'.

• * • · · : 8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on eukaryoottisolu. • * • · ♦ * · ...

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on apinan COS-solu. » · ’? • · · • · · • · ; ? 118084

10. IFN- α/β-sitojaproteiini, tunnettu siitä, että sitä koodaa patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi tai patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen RNA-sekvenssi tai, että se on tuotettu millä tahansa patenttivaatimuksista 6-9 mukaisella isäntäsolulla, tai mainitun sitojaproteiinin suola.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen IFN-a/p-sitojaproteiini, tunnettu siitä, että se on kypsä proteiini tai sen suola.

12. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen IFN- α/β-sitojaproteiinin tai sen suolan, valinnaisesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

13. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen IFN-α/β-sitojaproteiinin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi IFN-α tai IFN-β aktiivisuuden muuntamiseen.

14. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen IFN-a^-sitojaproteiinin käyttö | farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi IFN-α tai IFN-β aktiivisuuden inhiboimiseen. • · · • · ♦ * 1 1 • 'jK ’ 1

15. Menetelmä patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen IFN-a/O-sitojaproteiinin I • · • · ♦ : tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 6 - 9 • · /··1 mukaisen isäntäsolun viljelyn ja mainitun IFN-a^-sitojaproteiinin talteenoton. • · · ♦ · · • · · · . * · · · '"λ • · · • · 1

, * 16. Diagnostinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 .. mukaisen DNA-molekyylinja/tai patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukaisen IFN-α/β- • · • · 1 sitojaproteiinin, ΐ • · * « « • 1 ··· • · · • · · · • · · • · • · 1 * I ·1··1 • 1 · --- -1 • · · ’a * ·· .-2 • · 1 36 /: 118084 > ' ·’/ Patentkrav >'!