NO318912B1 - Interferon alfa/beta - bindingsprotein, samt fremstilling og anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår DNA-molekyl som koder for et IFN-a/p-bindende protein som angitt i krav 1 samt slike interferon a/p bindingsproteiner kodet av dette DNA og som er i stand til å modulere aktiviteten av forskjellige IFN-a subtyper, så vel som aktiviteten av IFN-p. Mer spesielt angår denne oppfinnelse kloning av DNA-molekyler som koder for disse proteiner, deres ekspresjon i vertsceller samt antistoff mot disse proteiner. Oppfinnelsen angår også m-RNA-molekyler som er et transkripsjonsprodukt fra DNA-molekylet nevnt ovenfor.

Israelsk patentsøknad nr. 103052 beskriver og krever et oppløselig IFN-a reseptorprotein med molekylvekt på omkring 45.000, identifisert ved Western blotting med monoklonalt anti-IFN-a-reseptor antistoff. Ovennevnte søknad beskriver også og krever et forskjellig oppløselig IFN-a bindingsprotein som har en molekylvekt på omkring 40.000, som ble identifisert ved kryssbinding med<125>I-IFN-a2 og immunout-felling med anti-IFN-a monoklonale antistoff. Når fremskaffet fra serum hadde denne type en molekylvekt på 50K. Israelsk patentsøknad nr. 106591 beskriver og krever det tidligere nevnte 40.000 IFN-a bindingsprotein (heretter "IFNAB-BP" eller "IFNAB-BPII") fremstilt fra urin i homo-gentilstand, og som har en sekvens som er forskjellig fra ethvert annet kjent protein. IFNAB-BP binder til og blokke-rer aktiviteten av en mengde IFN-a subtyper så vel som IFN-p. I dette henseende er bindingskarakteristikaene for IFNAB-BP signifikant forskjellige fra dem for en tidligere beskrevet celleoverflateinterferonreseptor som responderer kun til human interferon alfa B.

I DNA-molekylet ifølge foreliggende oppfinnelse er to cDNA-molekyler, som koder for forstadier for IFNAB-BP, klonet og deres sekvens er bestemt. Begge er sannsynligvis avledet fra det samme gen, f.eks. ved alternativ spleising. De

■ aktuelle rekombinante proteiner, betegnet IFNAB-BPI og

IFNAB-BPII, er også beskrevet. Proteinene kan benyttes til fremskaffelse av polyklonale og monoklonale antistoffer rettet mot IFNAB-BP som er anvendelige for å blokkere IFN-reseptoren for immunoassays og immunoopprensing av IFNAB-BPI og IFNAB-BPII.

IFNAB-BPI og IFNAB-BPII er i stand til å modulere aktiviteten av type 1 interferoner, dvs. de forskjellige subtyper av interferon-a, så vel som interferon-p. Således kan de hemme uønskede effekter av type I interferoner.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Type 1 interferoner (IFNs) (IFN-a, IFN-p og IFN-co) utgjør en familie av strukturelt beslektede cytokiner, vanligvis definert ved sin evne til å gi motstandsdyktighet mot virale infeksjoner. Mange andre biologiske aktiviteter av type 1 IFN har blitt beskrevet, innbefattende hemming av celleproliferasjon, induksjon av klasse I MHC antigener og flere andre immunoregulatoriske aktiviteter (1). IFN-a og IFN-fJ er nyttige for behandling av flere virale sykdommer, innbefattende hepatitt-C (2,3) og virale vorter (4,5), så vel som visse sykdommer som hårcelleleukemi (6), kronisk myelogen leukemi (7) og Kaposis sarkom (8).

IFN-a ble påvist i serum hos forskjellige pasienter med autoimmune sykdommer, så som systemisk lupus erythematosis (9), så vel som AIDS-pasienter (10). IFN-a ble implisert i utviklingen av ungdomsdiabetes (11). Det er også blitt ut-gitt en rapport om at øket IFN-a i hvitsubstans-microglia kan fremme Alzheimers sykdomspatologi (51). Videre har IFN-a-terapi i enkelte tilfeller vist seg å føre til uønskede bivirkninger, innbefattende feber, og nevrologiske lidelser (12). Således finnes det patologiske situasjoner hvor nøy-tralisering av IFN-a-aktivitet kan være gunstig for en pasient.

Som det er tilfelle med andre cytokiner, oppviser IFN-a sine biologiske aktiviteter ved å binde til en celleover-flatereseptor som er spesifikk for alle IFN-a subtyper, så vel som for IFN-(3 (13) . En human IFN-a-reseptor (IFNAR) ble identifisert og klonet fra Daudi-celler (14). Den klonede reseptor har ett enkelt transmembrandomene, et ekstracellulært og et intracellulært domene. Når uttrykt i murine celler gir denne reseptor mottaksdyktighet for human IFN-a(3, men ikke signifikant til andre IFN-a og IFN-fi-typer, noe som indikerer at ytterligere komponenter kan være involvert i responsen til IFN-|3 og til forskjellige IFN-a-subtyper.

Flere andre studier indikerer at det finnes ytterligere komponenter av reseptorsubenheter involvert i bindingen av IFN-a og IFN-p (15-17). Videre blir det rapportert at den allerede beskrevne reseptor (14) er involvert i binding av alle IFN-a og IFN-p-typer (18).

Cytokinbindende proteiner (oppløselige cytokinreseptorer) tilsvarer de ekstracellulære ligandbindende domener av sine respektive celleoverflatecytokinreseptorer. De er avledet enten ved alternativ spleising av et pre-mRNA som er felles for celleoverflatereseptoren eller ved proteolytisk spaltning av celleoverflatereseptoren. Slike oppløselige reseptorer har tidligere blitt beskrevet, bl.a. innbefattende de oppløselige reseptorer av IL-6 og IFN-(y) (19-21), TNF (22-24), IL-1 (25-27), IL-4 (25,28), 11-2 (29,30), IL-7 (31) og IFN-alfa (32).

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer DNA-molekyler som angitt i krav 1, og som koder for det kjente IFN-a/p bindingsprotein (IL106591). Slike DNA-molekyler koder faktisk for to forskjellige proteiner, IFNAB-BPI og IFNAB-BPII, sannsynligvis avledet fra samme pre-mRNA ved alternativ spleising, for å gi to mRMA-molekyler, hvor ett har en størrelse på omkring 4,5 kb, og det andre en størrelse på omkring 4,5 kb, hvor hvert koder for ett av de bindende proteiner, idet 1,5 kb mRNA koder for IFNAB-BPI og 4,5 kb mRNA koder for IFNAB-BPII. Uttrykket IFNAB-BP tilsvarer både IFNAB-BPI og IFNAB-BPII. IFNAB-BP fra urin er identifisert som IFNAB-BPII.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse et DNA-molekyl som koder for et IFN-a/p-bindende protein valgt fra IFNAB-BPI, IFNAB-BPII, fuserte proteiner samt deres prekursorer.

Oppfinnelsen fremskaffer videre replikerbare ekspresjonsvektorer innholdende nevnte DNA-molekyler, vertsorganismer transformert med disse og proteiner fremstilt av slike tranformerte vertsorganismer. Uttrykket "DNA-molekyler" innbefatter genomisk DNA, cDNA, syntetisk DNA og kombina-sjoner derav.

Også DNA-molekyler som hybridiserer under stringente betingelser til de ovennevnte DN-molekyler og koder for proteiner som har samme biologiske aktivitet som IFNAB-BP er aktuelle.

Foreliggende oppfinnelse angår også vertceller som er i stand til å produsere et funksjonelt IFNAB-BPI og IFNAB-BPII og fuserte proteiner.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også rekombinant IFNAB-BPI og IFNAB-BPII og fuserte proteiner, samt salter av alle disse og farmasøytiske blandinger inneholdende IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII og fuserte proteiner.

IFNAB-BPI og IFNAB-BPII hemmer de biologiske aktiviteter av naturlige human leukocytt- og fibroblastinterferoner, så vel som rekombinant human IFN-ck2, IFN-aB, IFN-aC og IFN-p. IFNAB-BPI tilsvarer et nytt transmembranprotein som er den ligandbindende IFN-a/p-reseptor. IFNAB-BPII er en oppløse-lig reseptor i hovedsak tilsvarende det ekstracellulære ligandbindende domene av IFNAB-BPI.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 viser kloningsstrategien for IFNAB-BPI og IFNAB-BPII: (A) Midtre rekke: Sekvensen av et innvendig CNBr peptid (27 aminosyreresider, cb7), erholdt fra 40.000 IFNAB-BP i

urin.

Topp- og bunnrekker: Syntetiske sens (topp) og antisens (bunn), degenererte oligonukleotidblandinger, dannet på basis av peptidsekvensen og brukt for revers transkripsjon (antisens primer alene) og for polymerase kjedereaksjon

(PCR).

(B) Agarosegel-elektroforese av PCT-produkter, dannet med de ovennevnte sens- og antisensprimere. De følgende RNA og

primere ble brukt for å danne cDNA som ble brukt som templat for PCR: (1) Poly A + RNA fra Daudiceller, antisens primer. (2) Poly A + RNA fra Daudiceller, oligo d(T) primer. (3) Totalt RNA av WISH-celler, antisens primer. Størrelsen (bp) av DNA-markørene er angitt på venstre side. (C) Topprekke: Den ikke-degenererte del av sekvensen, fremskaffet fra pBluescript-kloner av 101 bp PCR-produktet.

Bunnrekke: Translasjon av den resulterende ikke-degenererte DNA-sekvens i den uttrykte sekvens som er en del av sekvensen av peptid cb7 (residuer 9-20).

Figur 2 viser cDNA- og translatert polypeptidsekvens av klon qlO, som bærer cDNA IFNAB-BPI:

Denne klon ble isolert fra et lambda gtll-bibliotek dannet fra cDNA av humane HeLa-celler, ved å velge ut med et syntetisk oligonukleotid som tilsvarer den ikke-degenererte DNA-sekvens av figur 1(C). Sekvenser som tilsvarer N-terminalen av IFNAB-BP fra urin og dets CNBr-peptider er understreket, og det tilsvarende sekvensnavn er gitt under lin-jen (ni, N-terminus 1; n2, N-terminus 2; cb3, CNBr peptid 3; cb6, CNBr-peptid 6; cb7, CNBr-peptid 7). Hydrofobe sekvenser, tilsvarende signalpeptidet eller signalpeptidene og det transmembrane domene (tm) er dobbelt understreket. Ut-hevede tall på høyre side er de for aminosyreresiduene, Enkle tall tilsvarer nukleoidresiduer, idet initiatoren A av ATG er tatt som nr. 1. Figur 3 viser påvisning av mRNA ved Northern blotting med en spesifikk probe som er felles for sekvensen av IFNAB-BPI og IFNAB-BPII: En 397 basepar (bp) probe, tilsvarende nukleotider 218-614 av IFNAB-BPI ble fremstilt ved polymerasekjedereaksjon med passende primere og [<32>P]-merket ved tilfeldig primermer-king. Poly A+ RNA fra humane Daudiceller ble analysert ved elektroforese på agarose (1,5%), blottet på nitrocellulose og hybridisert med den spesifikke probe. Størrelsen av det ribosomale RNA er angitt på høyre side. Figur 4 viser nukleotid- og aminosyresekvenser av en fullstendig 1,5 kb cDNA-klon som tilsvarer IFNAB-BPI. Aminosyreresiduer i enkle bokstavkoder er uthevet nummerert, star- tende ved translasjonsinitieringskodonet. Hydrofobiske lederområder og transmembrane områder er understreket. N-terminale proteinsekvenser av IFNAB-BP fra urin (fra kodon 27) og de innvendige CNBr-peptider er understreket med stiplet linje (imidlertid er Cys og N-glykosylerte ASN-residuer ikke påviselige). N-glykosyleringssignaler er angitt med asterisker og polyadenyleringssignalet er dobbelt understreket. Figur 5 viser delvise nukleotid- og aminosyresekvenser av en 4,5 kb cDNA-klon tilsvarende IFNAB-BPII. Aminosyreresiduer med enkle bokstavkoder er uthevet nummerert, utgående fra translasjonsinitieringskodonet. Det hydrofobiske leder-område er understreket. N-terminale proteinsekvenser av IFNAB-BP fra urin (fra kodon 27) og de innvendige CNBr-peptider er stiplet understreket (Cys og N-glykosylerte Asn-residuer er ikke påviselige). N-glykosyleringssignaler og stoppkodet er angitt med asterisker. Figur 6 viser konstruksjonen av et pattedyr-ekspresjonsvektor for ekspresjon av det ekstracellulære ligandbindende domene av IFNAB-BPI. (A) Sens og antisens syntetiske oligonukleotider anvendt for fremstilling av det DNA som koder for det ekstracellu— lære, ligandbindende domene av IFNAB-BPI ved polymerase kjedereaksjon.

(B) Agarosegel-elektroforese av ca. 850 bp-produktet av en polymerase kjedereaksjon (PCR), dannet med de ovennevnte

sens- og antisensprimere og DNA av klon qlO.

(C) Strukturen av pEF-BOS-IFNAB-BPI, en pattedyr-ekspresjonsvektor for fremstilling av et oppløselig IFNAB-BPI. Figur 7 viser ekspresjonen av IFNAB-BPI og IFNAR i forskjellige celler: Ekspresjon av IFBAB-BPI i forskjellige celler er vist med SDS-PAGE (7,5% akrylamid, ikke-reduserende betingelser) av detergentcelleekstrakter, fulgt av immunoblotting med kanin anti IFNAB-BPII-antistoff og125I-protein A. Klon 369.11 er NIH-3T3-celler, som uttrykker IFNAB-BPI. Klon 470.6 er NIH-3T3-celler som uttrykker IFNAR, og klon 508.12 uttrykker begge proteiner. Kontroll NIH-3T3-celler og humane Daudi-celler er også vist. 51 kDa-formen (i murine celler) og

102 kDa-formen (i Daudiceller) av IFNAB-BPI er angitt med piler. Markører for molekylmasse er vist på venstre side.

Figur 8 viser binding av125I-IFN-a2 til forskjellige vertsceller. (A) Metningsbinding av125I-IFN-a2 til NIH-3T3-celler som uttrykker IFNAB-BPI (klon 369.11, (■) og celler som uttrykker både IFNAB-BPI og IFNAR (klon 508.12, •) og mangel på binding til celler som uttrykker IFNAR alene (klon 470.6, A). (B) Scatchard analyse av12<5>I-IFN-a2-binding til de ovennevnte celler. Bindingsdatene ble analysert med LIGAND-programmet. De følgende celler viste høyaffinitets mettbar binding: huDaudi (A), IFNAB-BPI-positive celler (klon 369.11, •) og klon 508.12, som uttrykker både IFNAR og IFNAB-BP (■). Figur 9 oppsummerer resultatene av et studium i et BIAcore system som bestemmer affiniteten av IFNAB-BPII fra urin til IFN-a2: IFB-a2 ble immobilisert på sensordelen og forskjellige konsentrasjoner av IFNAB-BPII fra urin ble passert gjennom sensordelen. "Relativ respons mot tid" viser bindingen og

dissosiasjonsprosessen. Den observerte dissosiasjonskon-stant er 3,12xl0"<9>M.

Figur 10 viser et ELISA av IFNAB-BPII fra urin:

Ren IFNAN-BPII fra urin ble fortynnet to ganger serielt til de angitte konsentrasjoner, tilsatt til mikroELISA-plater som var forbelagt med mab anti IFNAB-BPII-antistoff. Platene ble så omsatt med kanin anti IFNAB-BPII antistoff, fulgt av geit antikanin pepperrot peroksydasekonjugat og ABTS/H202-substrat. Platene ble avlest ved 405/630 nm. Den nedre grense for påvising er 30 pg/ml.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til israelsk patentsøknad nr. 106591 ble et IFN-a/(J-bindende protein med en molekylvekt på 40.000 (IFNAB-BP) isolert fra normal urin ved to kromatografiske trinn. Grovproteiner fra urin ble påsatt en kolonne bestående av IFN-a2 bundet til agarose. Kolonnen ble vasket for å fjerne ikke-relevante proteiner, og de bundne proteiner ble så eluert ved lav pH. Eluerte proteiner ble så atskilt med størrelsesatskillende HPLC for å gi flere proteintopper, hvorav én var særpreget ved sin egenskap å reagere spesifikt med<125>I-IFN-a2 og å blokkere den antivirale aktivitet av IFN-a og IFN-fS. Dette protein ble viderekarakterisertved N-terminal mikrosekvensanalyse, noe som gav en hovedsekvens ved dets N-terminale domene: Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg.

En mindre polypeptidsekvens, tilsvarende hovedsekvensen, men som har tre ekstra aminosyreresiduer {Ile-XXX-Tyr) ved N-terminalen av den ovennevnte sekvens, ble påvist (XXX betegner en uidentifisert aminosyre). Den resulterende sekvens ble sammenlignet med og funnet å være fullstendig forskjellig fra den til den kjente IFN-aB-reseptor (14). Den var også forskjellig fra ethvert annet kjent protein og den var ikke kodet for av noen kjent DNA-sekvens som bestemt ved å sammenligne den med Swissprot og Genebank data-bibliotekene, under anvendelse av FastA-programmet (33).

En prøve av IFNAB-BP fra urin ble spaltet med CNBr, atskilt på SDS-PAGE, elektroblottet på en PVDF-membran og de resulterende spaltningsfragmenter ble underkastet proteinmikrosekvensering. Ett av fragmentene hadde en molekylvekt på mindre enn 10K og en innvendig sekvens som følger (Met ligger foran den faktiske sekvens): Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-VAl-Ile-Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile (27 residuer).

Den innvendige sekvens ble reverstranslatert til sens- og antisensprimere til hvilke egnede restriksjonsseter ble tillagt. Totalt RNA ble renset fra humane celler og første-kjede cDNA ble dannet med revers transkriptase ved å bruke enten antisens olignukleotidblandingen eller oligo d(T) som primer. Det resulterende cDNA-fragment ble så amplifikert i en polymerase kjedereaksjon (PCR) ved å bruke de kombinerte sens og antisensdegenerte primere. Analyse av PCR-produktene på en 3% agarosegel viste et spesifikt 101 bp oligonu-kleotidbånd. Dette DNA ble restriksjonsspaltet, klonet i pBluescript (Stratagene) og kompetente E. coli ble transfektert med denne sektor. Det ble sekvensert flere uavhengige kloner. Sekvensen av området flankert av de sens- og antisens degenererte primere var invariant og kodet for den ventede sekvens fra det ovennevnte CNBr-peptid (cb7) av IFNAB-BP fra urin. Et oligonukleotid som tilsvarer denne ikke-degenererte innvendige sekvens ble syntetisert, ende-merket og benyttet for utvelgelse av cDNA-biblioteker. Utvelgelse av et lambda gt11 cDNA-bibliotek av humane HeLa-celler (Clontech) ga flere positive kloner. En av disse kloner betegnet qlO, hadde en åpen leseramme som tilsvarte et signalpeptid, et ekstracellulært domene, et transmembrandomene og et kort cytoplasmisk domene. Peptidsekvensene fremskaffet fra IFNAB-BP fra urin var alle til stede inne i det ekstracellulære domene kodet for av qlO. Enkelte aminosyreresiduer av peptidsekvensene var ukorrekte, på grunn av proteinsekvensteknologiens begrensninger (i hovedsak mang-lende evne til å identifisere Cys og lave nivåer av topper tilsvarende Ser).

Sens og antisens primere tilsvarende ender av nukleotid-sekvensen 219-613 av klon qlO (figur 2) ble brukt for å fremstille en spesifikk probe med PCR, ved å bruke klon qlO som et DNA-templat. Det resulterende DNA ble merket med [<32>P] og brukt for Northern blot-hybridisering av poly A+ mRNA fra to humane cellelinjer. I begge tilfeller ble to spesifikke bånd observert, ett tilsvarende 1,5 kb mRNA og et annet tilsvarende 4,5 kb mRNA. Det primære translasjonsprodukt på 1,5 kb mRNA blir betegnet som IFNAB-BPI-prekursor. Det primære translasjonsprodukt på 4,5 kb mRNa blir betegnet som IFNAB-BPII-prekursor.

Den tidligere nevnte spesifikke probe ble brukt for utvelgelse av et ytterligere humant cDNA-bibliotek og to grupper av cDNA-kloner ble identifisert. En gruppe (omkring 20 enkelte kloner) hadde en lengde på 1,5 kb og koder for den samme prekursor av transmembranproteinet som ble kodet for av klon qlO. Den andre gruppe (2 enkelte kloner) hadde en lengde på 4,5 kb. Disse størrelser var de samme som stør-relsene for de to mRNA-typer, og følgelig kodet 1,5 kb cDNA-klonene for IFNAB-BPI, mens 4,5 kb cDNA-klonene kodet for IFNAB-BPII. Sekvensering av 4,5 kb-klonene indikerte at de koder for en prekursor av en avkortet oppløselig reseptor tilsvarende kodoner 1-239 av klon qlO. Imidlertid var kodon 238 og 239 forskjellige og ble fulgt av et stopp-kodon. Proteinsekvensanalyse av C-terminalen av 40.000 IFNAB-BP fra urin indikerte at det blir kodet for av 4,6 kb cDNA, som bestemt ved de siste to aminosyreresiduer, og således ble IFNAB-BP fra urin identifisert som IFNAB-BPII. "Prekursor" som brukt heri, er definert som det primære translasjonsprodukt som inkluderer signalpeptidet.

DNA som koder for prekursoren av en avkortet oppløselig form av IFNAB-BPI ble dannet med PCR. Det resulterende PCR-produkt ble satt inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor og brukt for transfeksjon av forskjellige pattedyrceller, så som ape COS-celler. Slike celler uttrykte høye nivåer av biologisk aktivt rekombinant oppløselige IFNAB-BPI.

På samme måte ble DNA som koder for pekursoren av IFNAB-BPII generert ved PCR. Det resulterende PCR-produkt ble satt in i en pattedyr-ekspresjonsvektor og brukt for transfeksjon av forskjellige pattedyrceller så som ape COS-celler. Slike celler uttrykte høye nivåer av biologisk aktivt rekombinant IFNAB-BPII. På lignende måte ble DNA som koder for hele prekursoren av IFNAB-BPI dannet med PCR. Det resulterende PCR-produkt ble satt inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor og brukt for transfeksjon av forskjellige pattedyrceller så som muse-NIH-3T3-celler. Slike celler uttrykte høye nivåer av human IFNAB-BPI. Cellene var i stand til å binde human IFN-a2 med høy affinitet (Kd = 3,6xl0<-9>M). Når både human IFNAB-BPI og den tidligere klonede humane IFN-ctB-reseptor IFNAR (14) ble uttrykt samtidig i muse NIH-3T3-celler, ble affiniteten av den sammensatte reseptor øket med omkring 10 ganger (Kd = 4xl0~<10>M) . I motsetning til dette kunne, når human IFNAR ble uttrykt i museceller, ingen binding av human IFN-a2 kunne påvises. Derfor vil et sammensatt protein inneholdende to festede polypeptider, hvorav ett har det ligandbindende domene til IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII, og det andre polypeptid har det ekstra cellulære domene til IFNAR, oppvise en høyere affinitet for IFN-a sammenlignet med IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII alene.

Affiniteten av IFNAB-BPII fra urin for human IFN-a2 ble bestemt ved hjelp av BIAcore-systemet (Pharmacia, Sverige). IFN-a2 ble immobilisert på en sensorplate og fikk binde IFNAB-BPII. Basert på Kon- og Koff-verdier ble en Kd-verdi på 3,12xl0~<9>M oppnådd. Denne verdi er meget nær den som oppnås med NIH-3T3-celler som uttrykker IFNAB-BPI.

Den ovenfor nevnte kloning, klonisolering, identifisering, karakterisering og påfølgende prosedyrer er beskrevet i større detalj nedenfor i eksemplene.

IFNAB-BPII kan også fremstilles ved andre typer av rekombinante celler, så som prokaryote celler, f.eks. E. coli, eller andre eukaryote celler, så som CHO- gjær- eller insektceller. Metoder for å konstruere passende vektorer som bærer DNA som koder for enten IFNAB-BPI celler IFNAB-BPII og som er egnet for transformering (f.eks. E. coli og gjærceller) eller infisering av insektceller for å danne rekombinant IFNAB-BPI og IFNAB-BPII, er velkjent i faget. Se f.eks. Ausubel et al., red."Current Protocols in Molecular Biology" Current Protocols, 1993; og Sambrook et al., red. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. utgave, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Oppfinnelsen angår videre fuserte proteiner omfattende villtype IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII, og som oppviser en lignende egenskap å blokkere de biologiske aktiviteter av IFN-a og IFN-p eller andre cytokiner som også har interferon alfa/beta-reseptoren.

DNA som koder for IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII eller fuserte proteiner, og de operasjonsdyktig tilknyttede transkrip-sjonene og translasjonene regulatoriske signaler, er satt in i eukaryote vektorer som er i stand til å integrere de ønskede gensekvenser i vertscellekromosomet. For å kunne være i stand til å velge ut cellene som har stabilt inte-grert den innførte DNA i sine kromosomer, blir én eller flere markører som tillater utvelgelse av vertsceller som inneholder ekspresjonsvektoren benyttet. Markøren kan gi prototrofi til en auxotrop vertsorganisme, biocid resistens, f.eks. antibiotika, eller resistens mot tungmetal-ler, så som kobber eller lignende. Det utvelgbare markøren kan enten være direkte bundet til DNA-gensekvensene som skal uttrykkes eller bli innført i samme celle ved kotrans-feksjon. Ytterligere elementer kan også være nødvendig for optimal syntese av enkeltkjedet bindende protein mRNA. Disse elementer kan innbefatte spleisesignaler så vel som transkripsjonspromotorer, forøkende sekvenser og avslut-ningssignaler (34).

For formålet ekspresjon av IFNAB-BPI- og IFNAB-BPII-proteinene, vil DNA-molekylet som skal innføres i cellene som ble valgt fortrinnsvis inkorporeres i et plasmid eller en viral vektor som er i stand til autonom replikasjon i den mottagende vertsorganisme.

Faktorer av viktighet i utvelgelse av et spesielt plasmid eller viral vektor innbefatter: hvor lett mottagende celler som inneholder vektoren kan gjenkjennes og utvelges fra de mottagende celler som ikke inneholder vektoren; antallet kopier av vektoren som er ønsket i en spesiell vertsorganisme og hvorvidt det er ønskelig å være i stand til å "skytle" vektoren mellom vertsceller av forskjellige arter. Foretrukne prokaryote vektorer innbefatter plasmider så som de som er i stand til replikasjon i E. coli, f.eks. PBR322, ColEl, pSClOl, pACYC 184 osv. (35); Bacillus-plasmider så som pC194, pC221, pT127 osv. (36); Streptomyces-plasmider innbefattende pIJlOl (37); Streptomyces-bakteriofager så som <t>31 (38) og Pseudomonas-plasmider (39,40). Foretrukne eukaryote plasmider innbefatter BPV, vaccinia, SV40, 2-mi-kronsirkel osv. eller deres derivater. Slike plasmider er velkjent i faget. (41-45).

Når vektoren eller DNA-sekvensen inneholdende konstruksjonen (ene) har blitt fremstilt for ekspresjon, kan ekspresjonsvektoren bli innført i en passende vertscelle ved enhver av en mengde passende metoder, så som transforma-sjon, transfeksjon, lipofeksjon, konjugasjon, protoplast-fusjon, elektroporering, kalsiumfosfatutfelling, direkte mikroinjeksjon osv.

Vertsceller som kal brukes i foreliggende oppfinnelse, kan enten være prokaryote eller eukaryote. Foretrukne prokaryote vertsorganismer innbefatter bakterier, så som E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, osv. Den mest foretrukne prokaryote vertsorganisme er E. coli. Bakterielle vertsorganismer av spesiell interesse innbefatter E. coli K12 stamme 294 (ATCC31446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F", lambda", fototropisk (ATCC 27325)), og andre enterobakterier så som Salmonella typhimurium eller Serratia narcescens og forskjellige Pseudomonas-arter. Under slike betingelser vil proteinet ikke være glykosylert. Den prokaryote vertsorganisme må være kompatibel med replikonet og kontrollsekvensene i ekspresj onsplasmidet.

Imidlertid, siden IFNAB-BPI og IFNAB-BPII er glykosylerte proteiner, blir eukaryote vertsorganismer foretrukket for prokaryote vertsorganismer. Foretrukne eukaryote vertsorganismer er pattedyrceller, f.eks. humane, ape-, mus- og ki-nesisk hamster ovarie (CHO)-celler, fordi de gir posttranslasjonelle modifikasjoner til proteinmolekyler innbefattende korrekt folding, korrekt disulfidbindingsdannelse, samt glykosylering på korrekte steder. I tillegg kan gjærceller og insektceller utføre posttranslasjonelle peptid- modifiseringer, innbefattende høy mannoseglykosylering. Et antall rekombinante DNA-strategier finnes som anvender sterke promotersekvenser og høyt kopiantall av plasmid, som kan utnyttes for produksjon av de ønskede proteiner i gjær og i insektceller. Gjærceller gjenkjenner ledersekvenser på klonede pattedyrgenprodukter og utskiller peptider som bærer ledersekvenser. Etter innføring av vektoren blir vertscellene dyrket i et selektivt medium, som utvelger for vekst av de vektorinneholdende celler. Ekspresjon av de(n) klonede gensekvens(er) resulterer i fremstilling av IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII eller fusjonsproteiner eller muteiner, eller aktive fraksjoner derav. De uttrykte proteiner blir så isolert og renset ved en hvilken som helst konvensjonell prosedyre, innbefattende ekstraksjon, utfelling, kromato-grafi under anvendelse av anti-IFNAB-BPI monoklonalt antistoff immobilisert på en gelmatriks inneholdt i en kolonne. Grovpreparater inneholdende nevnte rekombinante IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII, deres aktive fraksjoner eller derivater, blir passert gjennom kolonnen, hvorved IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII, deres aktive fraksjoner eller derivater vil bli bundet til kolonnen av det spesifikke antistoff, mens uren-hetene vil passere gjennom. Etter vask blir proteinet eluert fra gelen under betingelser som vanlig anvendes for dette formål, f.eks. ved høy eller lav pH, f.eks. pH 11 eller pH 2.

Foretrukket er de synonyme aminosyregrupper de som er definert i Tabell I. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregrupper de som er definert i Tabell II og mest foretrukket er de synonyme aminosyregrupper de som er definert i Tabell

III.

Uttrykket "fusert protein" refererer til et polypeptid omfattende IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII fusert med et annet protein som f.eks. har en forlenget oppholdstid i kropps-væsker. IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII eller deres aktive frak sjoner kan således være fusert til et annet protein, polypeptid eller lignende, f.eks. et immunoglobulin eller et fragment derav.

Uttrykket "salter" heri refererer til både salter av kar-boksylgrupper og syreaddisjonssalter av aminogrupper av IFNAB-BPI, IFNAB-BPII eller fuserte proteiner derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved metoder kjent innen faget og innbefatter uorganiske salter, f.eks. natrium-, kalsium-, ammonium-, jern- eller sinksalter og lignende, og saltene med organiske baser som de som dannes f.eks. med aminer så som trietanolamin, arginin eller lysin, piperi-din, procain og lignende. Syreaddisjonssaltet innbefatter f.eks. salter med mineralsyrer så som saltsyre eller svo-velsyre, og salter med organiske syrer som f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Selvfølgelig må ethvert slikt salt ha i hovedsak samme aktivitet som IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII.

Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere farmasøytiske blandinger omfattende et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel og IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII ifølge oppfinnelsen eller deres fuserte proteiner og deres salter derav.

De farmasøytiske blandinger ifølge forbindelsen blir fremstilt for tilføring ved blanding med IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII med fysiologisk akseptable bæremidler og/eller stabi-lisatorer og/eller eksipienser, og fremstilles i doserings-form, f.eks. ved frysetørking i dosekapsler. Fremgangsmåten for tilføring kan være via enhver av de aksepterte tilfør-ingsmåter for lignende midler og vil avhenge av tilstanden som skal behandles, f.eks. intravenøst, intramuskulært, subkutant, ved lokal injeksjon eller topisk påføring eller kontinuerlig ved infusjon osv. Mengden av aktiv forbindelse som skal tilføres vil avhenge av tilføringsmåten, sykdommen som skal behandles og pasientens tilstand. Lokal injeksjon vil for eksempel avhenge av en lavere mengde protein på kroppsvektbasis enn intravenøs infusjon.

Som nevnt i israelsk patentsøknad nr. 106591, inhiberte det IFN-ot/<p->bindende protein (eller heri betegnet IFNAB-BPII)

den antivirale aktivitet av IFN-a2, IFN-aB, IFN-ctC og IFN-p og ikke IFN-y, noe som indikerer at IFNAB-BPI og IFNAB-BPII er generelt type I IFN-bindende proteiner. Således er disse anvendelige for å modulere eller blokkere de biologiske

aktiviteter av forskjellige IFN-a-subtyper og IFN-p, f.eks. i type I diabetes, forskjellige autoimmune sykdommer, transplantatavstøtninger, AIDS og lignende sykdommer, hvor det er en avvikende ekspresjon av IFN-a eller IFN-p, dvs. IFNAB-BPI og IFNAB-BPII kan bli brukt ved enhver tilstand hvor et overskudd av IFN-a eller IFN-p blir produsert en-dogent eller tilført eksogent.

Følgelig er IFNAB-BPI og IFNAB-BPII, deres fuserte proteiner og deres salter, derav indikert for behandling av autoimmune sykdommer, for eksempel inflammasjoner i pattedyr, for behandling av toksisitet forårsaket av tilføring av interferon alfa eller beta, for ungdomsdiabetes, for lupus erythematosus og for AIDS.

Som angitt ovenfor, har proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også ikke-terapeutisk anvendelighet så som ved rensing av type I interferontyper.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også DNA-molekyler som koder for ethvert av proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse som definert ovenfor, replikerbare ekspresjonsvektorer omfattende ethvert slikt DNA-molekyl, vertsceller transformert med enhver slik ekspresjonsvektor innbefattende prokaryote og eykaryote celler og vertsceller, fortrinnsvis ape COS-celler.

Oppfinnelsen skal nå bli illustrert med de følgende eksempler.

Eksempel 1: Proteinsekvensanalyse av IFNAB- BP fra urin

Ren IFNAB-BP, fremskaffet som beskrevet i israelsk patent-søknad nr. 106591 ble adsorbert på en PVDF-membran (Pro-Spin, Applied Biosystems, USA), og membranen ble underkastet proteinsekvensanalyse og en modell 475 mikrosekvensator (Applied Biosystems, USA). Den følgende hovedsekvens ble erholdt:

Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-

1 5 1 0 Arg-Leu-Arg

15

I tillegg ble et sekundært polypeptid med tre ytterligere aminosyreresiduer (Ile-xxx-Tyr) ved N-terminalen av hovedsekvensen påvist (xxx betegner en uidentifisert aminosyre). Den resulterende sekvens er fullstendig forskjellig fra den til den allerede kjente IFN-aB-reseptor (IFNAR, referanse 14) og er forskjellig fra ethvert annet kjent protein. Det er også forskjellig fra ethvert protein kodet for av en kjent DNA-sekvens, som bestemt ved å undersøke Swissprot og Genebank databaser med programmet FastA (33). Således er dette protein et nytt IFN-a-bindende protein. Ved isolering av cDNA-kloner (se nedenfor) blir det klargjort at residuum 10 er Cys og ikke Arg og at residuum 15 er Ser og ikke Arg. Videre ble xxx identifisert som Ser. Det er kjent at Cys ikke kan bli identifisert med proteinsekvensatoren, mens Ser enkelte ganger blir ødelagt i den analytiske prosess og følgelig ikke blir identifisert.

En prøve av IFNAB-BP fra urin ble spaltet med CNBr, oppløst på SDS-PAGE og blottet på en PVDF-membran. Syv atskilte peptidbånd, betegnet cbl - cb7, ble oppløst og påvist på membranen ved farging med Coomassie blue. Hvert bånd ble skåret ut og underkastet proteinmikrosekvensering. Ett av peptidene, cb7, var mindre enn 10.000, og gav den følgende innvendige sekvens {Met går foran den faktiske sekvens):

Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-

5 • • ■ • 10 • • • ■ Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile.... 15 ... 20 25 . 27

Et annet peptid, cb3, hadde den følgende sekvens (Met går foran den faktiske sekvens): Met-Ser-Lys-Pro-Glu-Asp-Leu-Lys-Val-Val-Lys-Asn-XXX-Ala-* * #5* • * » 10 • ■ • » Asn-Thr-Thr-Arg....

15 .18

Residuum 13 ble senere identifisert som Cys, som bestemt fra cDNA-sekvensen (se nedenfor). Cys-residuer kan ikke bli identifisert med proteinmikrosekvensering.

Et annet peptid, cb6, hadde den følgende sekvens (Met går foran den faktiske sekvens):

Met-Ser-Gly-XXX-Phe-Thr-Tyr-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Ile-Pro-

1 « ■ * 5 ■ * * alO* * « • Asn-Thr-Asn-Tyr.... 15 .. 18

Residuum 4 ble senere identifisert som Asn, som bestemt fra cDNA-sekvensen (se nedenfor). Dette Asn-residuum er en del av en potensiell glykosyleringssignalsekvens (Asn-Phe-Thr), og fraværet av Asn-signal i proteinsekvensen indikerer at det faktisk er glykosylert.

Det andre peptidbånd ble ved sekvensering identifisert som produkter av ufullstendig spaltning med CNBr. De gav enten den N-terminale endesekvens som tidligere funnet for IFNAB-BP eller den samme innvendige sekvens av cb3, cb6 eller cb7.

Eksempel 2: Proteinsekvensanalyse for det C- terminale peptid av IFNAB- BP fra urin

En prøve av IFNAB-BP fra urin (ca. 10 ug) ble redusert med DTT, alkylert med iodoacetamid og spaltet med endoprotein-ase Lys C (Boehringer Mannheim, Tyskland) ved et 1:50 - forhold enzym til substrat. Den resulterende peptidblanding ble atskilt med RP-HPLC på en PRl8-kolonne (Aquapore RP18, Applied Biosystems Inc.) under anvendelse av en gradient av acetonitril i aq. 0,1% trifluoreddiksyre. Individuelle pep-tidtopper ble kovalent bundet til Sequalon AA-membraner Millipore, Bedford MA) og utsatt for N-terminal sekvensering som ovenfor. Ett av peptidene ble identifisert som det C-terminale peptid med den følgende sekvens:

Cys-Thr-Leu-Leu-Pro-Pro-Gly-Gln-Glu-Ser-Glu-Phe-Ser

1 ... 5 .... 10 .. 13

Den C-terminale sekvens tilsvarer den til 4,5 kb cDNA-klonen (se nedenfor) og kunne bli skjelnet fra sekvensen til det forsøksvise protein kodet for av det 1,5 kb store cDNA ved minst to aminosyreresiduer (Phel2-Serl3) i stedet for Ser-Ala). Således er den oppløselige reseptor isolert fra urin identifisert som IFNAB-BPII. Den blir translatert uavhengig av et 4,5 kb mRNA og blir ikke dannet ved utstøt-ning av celleoverflatereseptoren.

Eksempel 3: Konstruksjon av degenererte sens- og antisensprimere og identifisering av en ikke- degenerert sekvens av

IFNAB- BPCDNA

Sekvensen av peptid cb7 ble reverstranslatert til sens (aminosyrer 1-8)- og antisens (aminosyrer 27-20)-primere.Decanukleotider og nonanukleotider, inneholdende hhv BamH I og Sal I endonuklease restriksjonssekvensene, ble lagt til de 5' ender av primeroligonukleotidene (figur IA). Totalt RNA ble ekstrahert fra Daudi- og WISH-celler og førstekjede cDNA ble dannet med revers transkriptase, ved å anvende enten antisens oligonukleotidblandingen eller oligo d(T) som primer. Det resulterende cDNA-fragment ble så amplifikert i en polymerase kjedereaksjon (PCR), under anvendelse av de kombinerte sens og antisens degenererte primere. Analyse av PCR-produktene på en 3% agarosegel viste det ventede 101 bp-bånd, fremskaffet med cDNA fra både Daudi- og WISH-celler (figur IB). 101 bp-fragmentet ble spaltet med BamH I og Sal I, klonet i pBluescript II KS+ (Strata-gene) og 5 kloner ble sekvensert. Sekvensen av området flankert av sens- og antisensprimerne var invariant og kodet for den ventede sekvens av aminosyreresiduer 9-19 av peptid cb7 (figur 1C). En 35 pb oligonukleotid tilsvarende den ikke-degenererte innvendige sekvens ble så syntetisert og brukt for utvelgelse av cDNA-biblioteker.

Eksempel 4: Identifisering av partielle cDNA- kloner av

IFNAB- BPI

Det syntetiske 35 pb ikke-degenererte oligonukleotid fra eksempel 2 ble [<32>P]-merket og brukt for utvelgelse av et lambda gt11 cDNA-bibliotek av humane HeLa celler (Clontech). Fem positive kloner ble identifisert. En av disse kloner, betegnet qlO, inneholdt et innskudd på 1,4 kb. Sekvensering av klon qlO gav en sekvens med en åpen leseramme hvor et signalpeptid, et ekstracellulært domene, et transmembrandomene og deler av det intracellulære domene ble identifisert (figur 2). DNA-sekvenser som koder for den N-terminale proteinsekvens, så vel som sekvensen av de tre CNBr-peptider cb3, cb6 og cb7 av IFNAB-BP fra urin ble identifisert inne i det ekstracellulære domene kodet for av DNA fra klon qlO. Noen Cys- og Ser-residuer (stiplet understreket, figur 2) ble ikke korrekt identifisert ved prote-insekvenseringen. Imidlertid er det kjent at metoden brukt for proteinsekvensering ikke finner Cys-residuer og til tider hopper over Ser-residuer. I tillegg ble et Asn-residuum i peptid cb6 ikke påvist, noe som indikerer at det er glykosylert. Sammenligning av DNA-sekvensen av klon qlO med Genebank database viste ikke noen identitet med noen kjent sekvens. Således inneholder denne klon en ny DNA-sekvens.

Eksempel 5: Northern blotting av human mRNA

En radiomerket DNA-probe ble fremstilt fra klon qlO og brukt for Northern blot hybridisering av poly A+ mRNA fra to humane cellelinjer: Daudi og WISH. I begge tilfeller ble to spesifikke bånd observert, ett som tilsvarer 1,5 kb og et annet tilsvarende 4,5 kb. Basert på intensiteten av båndene ble det beregnet at 1,5 kb mRNA er omkring to ganger så hyppig som 4,5 mRNA. Signalet fremskaffet med RNA fra WISH-celler var knapt synlig, mens signalet av RNA fra Daudi-deller (figur 3) var påviselig. 1,5 kb mRNA blir translatert til en prekursor av IFNAB-BPI som er en celle-overf lateinterf eronreseptor . Det lengre mRNA representerer et forskjellig transkript, som koder for et forskjellig protein som deler minst omkring 100 amihosyreresiduer med IFNAB-BPI. Dette protein er prekursoren til IFNAB-BPII, som senere viste seg å være en oppløselig form av interferon a/p-reseptoren.

Eksempel 6. Identifisering av fullstendige cDNA- kloner av

IFNAB- BPI og IFNAB- BPII

Et humant monocytt cDNA-bibliotek, konstruert i fag XpCEV9 (Gutkind, J.S. et al., Molec. Cell. Biol. 11, 1500-1507, 1991) ble så utvalgt med en 397 bp probe dannet med PCR fra det kodende område av klon qlO. 22 kloner ble isolert med et 1,5 kb innskudd og 2 kloner med et 4,5 kb innskudd fra IO<6>uavhengige fager. DNA sekvensanalyse av to 1,5 kb kloner (ApCEV9-m6 og ApCEV9-m24), så vel som den fullstendige åpne leseramme av de to 4,5 kb-kloner (XpCEV9-ml9 og

ApCEV9-m27) ble utført. 1,5 kb klonene kodet for en fullstendig prekursor til IFNAB-BPI, som er en celleoverflate-reseptor, med en åpen leseramme på 331 kodoner (figur 4). Proteinet og CNBr-peptidsekvensene fremskaffet fra IFNAB-BP fra urin (stiplet understreket, figur 4), ble alle identifisert innen den translaterte DNA-sekvens. Partiell sekvensering av de to 4,5 kb kloner viste at samme 5' sekvens av 237 kodoner var til stede i 1,5 kb klonene, fulgt av en forskjellig sekvens som inkluderte et avslutningssignal etter kodon 239 (figur 5). Totalt var de følgende kodoner forskjellige: kodon 13 (Leu i stedet for His); kodon 108 (Thr i stedet for Ile) og kodonene 238-240 (Phe-Ser-Stop i stedet for Ser-Ala-Ser). Ingen åpen leseramme ble observert forbi stoppkodonet i noen av de tre leserammer i begge 4,5 kb-klonene. Således koder det 4,5 kb store cDNA for en prekursor av avkortet oppløselig reseptor som er IFNAB-BPII, identisk i sin C-terminale sekvens med den isolert fra urin. De to mRNA som koder for prekursorproteinene av både IFNAB-BPI og IFNAB-BPII er avledet fra samme gen, sannsynligvis ved alternativ spleising.

Eksempel 7: Konstruksjon av en pattedyr ekspresjonsvektor og produksjon av rekombinant oppløselig IFNAB- BPI og IFNAB-BPII

Et DNA som koder for signalsekvensen og det ektracellulære domene av IFNAB-BPI ble dannet med PCR med VENT DNA polymerase (Stratagene) under anvendelse av syntetiske sens og antosens primere som bærer Xba I restriksjonsseter (figur 6A) ved å bruke qlO DNA som et templat. Det resulterende PCR-produkt (figur 6B) ble spaltet med Xba I og ligert i ekspresjonsvektoren pEF-BOS for å gi pEF-BOS-IFNAB-BPI (figur 6C, referanse 46). Konstruksjonen ble bekreftet med DNA-sekvensering. Kompetente E.coli ble transformert og kloner som hadde IFNAB-BPI-sekvensen i korrekt orientering, ble isolert. pEF-BOS-sABR-konstruksjonen ble brukt for transfeksjon av ape COS-celler. Disse celler uttrykte 12 ng/ml rekombinant oppløselig IFNAB-BPI som ble fremskaffet i cellekultursupernatanten, som bestemt ved ELISA og ved evnen til å inhibere den biologiske (antivirale) aktivitet av humane interferon alfa og beta. Analogt blir DNA-området som koder for IFNAB-BPII i 4,5 kb-klonen satt inn i en pattedyr-ekspresjonsvektor som beskrevet for det ektracellulære domene av IFNAB-BPI og brukt for transformering av celler. Slike celler danner aktiv IFNAB-BPII, som blir skilt ut til kulturmediet av nevnte celler.

Eksempel 8: Konstruksjon av eukaryote ekspresjonsvektorer og ekspresjon av IFNAB- BPI og IFNAR i murine celler

Et DNA som koder for det fullstendige IFNAB-BPI ble dannet ved PCR med VENT DNA polymerase (Stratagene), under anvendelse av syntetiske sens og antisens primere som bærer Xba I restriksjonsseter og ved å bruke plasmid pCEV9-m6 som templat. Det resulterende PCR-produkt ble spaltet med Xba I og ligert i ekspresjonsvektoren pEF-BOS for å gi pEF-BOS-IFNABR. Det cDNA som tilsvarer IFNAR (14) ble dannet med RT-PCR (48) ved å bruke spesifikke oligonukleotider. Det amplifikerte produkt ble klonet i Xba I restriksjonssetet av pEF-BOS-ekspresjonsvektoren (46) og gav pEF-BOS-IFNAR. Disse konstruksjoner ble bekreftet med DNA-sekvensering. Kompetente E.coli ble transformert og kloner som hadde IFNAB-BPI- og IFNAR-sekvenser i korrekt orientering ble isolert.

Murine celler som uttrykker det klonede IFNAB-BPI cDNA på stabil måte, ble utviklet. Eksponensielt voksende NIH-3T3-celler (l,5xl0<6>i 10 cm plater) ble kotransfektert med kalsiumfosfat utfellingsmetoden (49) med pSV2neo (2 ug), sammen med pEF-BOS-IFNAR (10 ug DNA). Uavhengige G418-resistente kolonier ble identifisert og subklonet. Kloner som uttrykte høye nivåer av IFNAB-BPI ble identifisert ved binding av et antistoff rettet mot IFNAB-BPI fra urin og ved binding av<125->IFN-a2 (tabell IV) .

For binding av anti-IFNAB-BPII-antistoff, ble celler (1 x 10<6>) utsådd i 35 mm brønner (6 brønners plater, Costar) og dyrket til konfluens (20 timer). Cellene ble vasket med DMEM inneholdende 2% FBS og 0,1% natriumazid (Wash medium), fulgt av en inkubering i 20 minutter med Wash-mediet. Kanin anti-IFNAB-BPII-antistoff (2 ml, 1:500 i Wash-medium) ble tilsatt til de vaskede brønner og cellene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Cellene ble vasket tre ganger,<125>I-protein A (2 ml, 250.000 cpm i Wash-mediet) ble tilsatt, og cellene ble videre inkubert i 45 minutter. Cellene ble vasket tre ganger, innhøstet med trypsin og opptelt.

For binding av125I-IFN-a2, ble celler (lxlO<6>) utsådd i 35 mm brønner (6 brønners plater, Costar) og dyrket til konfluens (20 timer). Cellene ble vasket med DMEM inneholdende 2% FBS og 0,1% natriumazid (Wash-medium), fulgt av en inkubering på 20 minutter med Wash-mediet.12<5>I-IFN-a2 (2-3xl0<s>) cmp, IO<8>enheter/mg, 5xl0<7>cpm/ug) ble tilsatt og inkube ring fortsatt i 2 timer ved romtemperatur. Cellene ble vasket 3 ganger, innhøstet med trypsin og opptelt. SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser av et detergentekstrakt av positive kloner (f.eks. klon 369.11), fulgt av immunoblotting med det ovennevnte antistoff gav et sterkt bånd på omkring 51 kDa (figur 7).

Murine celler som uttrykker IFNAR ble på lignende måte utviklet ved transfeksjon med plasmid pEF-BOS-IFNAR. Klon nr. 470.6 var IFNAR-positiv, som bestemt ved huIFN-aB's evne til effektivt å indusere en antiviral respons i disse celler. Som ventet var andre type I IFN (f.eks. huIFN-p) ikke aktive i klon 470.6.

Klon 369.11 og 470.6, som uttrykker IFNAB-BPI og IFNAR, ble så transfektert med det komplementære reseptorprotein (hhv. pEF-BOS-IFNABR og pEF-BOS-IFNAR). For stabil koekspresjon ble G418-resistente kloner som uttrykte enten IFNAR eller IFNAB-BPI transfektert med pSV2hygro (2 ug), sammen med enten pEF-BOS-IFNABR eller pEF-BOS-IFNAR som ovenfor. Hygromycin og G418-resistente kloner, som samtidig uttrykker både IFNAR og IFNAB-BPI, ble isolert og subklonet. IFNAR-positive kloner avledet fra klon 369.11, ble identifisert ved sin antivirale respons mot huIFN-aB, mens IFNAB-BPI-positive kloner avledet fra klon 470.6, ble identifisert ved binding til både anti-IFNAR-BPII antistoff og<1>25I-IFN-o2. Klon 508.12, avledet fra klon 369.11, og klon 1306, avledet fra klon 470.6, bandt både12<5>I-IFN-a2 og IFN-a/pR antistoff (tabell IV). I tillegg reagerte de på huIFN-aB i et antiviralt assay. Således konkluderte oppfinnerne med at disse kloner uttrykker både IFNAB-BPI og et funksjonelt

IFNAR.

Eksempel 9: Bestemmelse av effektiviteten av IFNAB- BPI og IFNAR uttrykt i murine celler

Kloner som uttrykker enten IFNAR eller IFNAB-BPI ble under-søkt for binding av<125>I-huIFN-a2, og bindingsdataene ble evaluert ved hjelp av en Scatchard-analyse. Celler (lxlO<6>) ble utsådd i 35 mm brønner (6 brønners plater, Costar) og dyrket til konfluens (20 t). Cellene ble vasket med DMEM inneholdende 2% FBS og 0,1% natriumazid (Wash-medium), fulgt av en inkubering på 20 minutter med samme medium.<125>I-IFN-a2 (2-3xl0<5>cpm) , 10e enheter/mg, 5xl0<7>cpm/ug) ble tilsatt sammen med de indikerte konsentrasjoner av ikke-merket IFN-a2 og inkubering ble fortsatt i 2 timer ved romtemperatur. Cellene ble vasket tre ganger med Wash-mediet, innhøstet med trypsin og opptelt. Bindingssdata ble analysert ved LIGAND-programmet (50).

Celler som uttrykker kun IFNAR (klon 470.6) oppviste ingen spesifikk binding av<125>I-IFN-a2 (figur 8A) og således kunne ingen Kd-verdi for slike forsøksvise bindingsseter bli ut-ledet. I motsetning til klon 470.6, ble det oppnådd høy-affinitets, spesifikk og mettbar binding med celler som uttrykte IFNAB-BPI alene (klon 369.11). Kd av denne binding var 3,6xl0"<9>M ved 23°C (tabell V).

Binding av<125>I-IFN-or2 til 508.12-celler (som uttrykker både IFNAB-BPI og IFNAR) ble vurdert ved en Scatchard-analyse, og resultatene ble sammenlignet med dem til klon 369.11 (som uttrykker kun IFNAB-BPI). Etter koekspresjon av IFNAB-BPI og IFNAR ble en mettbar binding oppnådd og affiniteten for IFN-a2 øket med omkring 10 ganger (figur 8), som nærmer seg affiniteten for reseptoren i Daudi-celler (henholdsvis Kd = 4,0xl0~<10>M mot l,6xl0"<10>M, tabell V). Dette resultat indikerer at IFNAR og IFNAB-BPI samarbeider i ligandbin-ding.

Eksempel 10. Bestemmelse av affiniteten av IFNAB- BPII fra urin

Human IFN-a2 ble immobilisert på en sensorplate av BIAcore (Pharmacia, Sverige) ved en automatisk prosedyre skaffet fra produsenten. Omkring 30 fmol IFN-a2 ble immobilisert. IFNAB-BP2 fra urin fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) til flere konsentrasjoner (28-112 nM) ble passert gjennom sensogrambrikken og utstrekningen av assosiasjon og disso-siasjon (i PBS) ble nedtegnet. Basert på de resulterende data ble en KD-verdi på 3,12xl0"<9>M regnet ut (figur 9). Således er affiniteten til IFNAB-BPII fra urin meget lik den til IFNAB-BPI uttrykt i vertceller.

Eksempel 11. Ekspresjon av IFNAB- BPI og IFNAB- BPII i E. coli, gjær og insektceller

IFNAB-BPI og IFNAB-BPII blir også fremstilt av andre rekombinante celler, så som prokaryote celler, f.eks. E. coli eller andre eukaryote celler, så som gjær- og insektceller. Velkjente metoder er tilgjengelige for å konstruere passende vektorer, som bærer DNA som koder for enten IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII og deres aktive fraksjoner og som er egnet for å transformere E. coli og gjærceller eller infisere insektceller for å danne rekombinant IFNAB-BPI og IFNAB-BPII. For ekspresjon i gjærceller blir det DNA som koder for IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII (eksempel 5 og 6) spaltet ut og satt inn i ekspresjonsvektorer som er egnet for transfeksjon av gjærceller. For ekspresjon i insektceller blir det DNA som koder for IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII satt inn i baculovirus, og insektcellene blir infisert med det rekombinante baculovirus. For ekspresjon i E. coli blir det DNA som koder for enten IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII utsatt for seterettet mutagenese med passende oligonukleotider, slik at et initierings ATG-kodon blir satt inn like før første kodon av ferdigutviklet IFNAB-BPI (figur 2) eller IFNAB-BPII. Alternativt kan slikt DNA bli fremstilt med PCR med passende sens- og antisensprimere. De resulterende cDNA-konstruksjoner blir så satt inn i passende kontruerte prokaryote ekspresjonsvektorer med teknikker velkjent i faget (35).

Eksempel 12: Konstruksjon av rekombinante fusjonsproteiner av IFNAB- BPI og IFNAB- BPII

Produksjonen av proteiner omfattende enten det ligandbindende domene av IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII fusert til den konstante region av IgGl tung kjede kan bli utført som følger: DNA av IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII utsettes for seterettet mutagenese med passende oligonukleotider slik at et enestående restriksjonssete blir innført umiddelbart før og etter sekvenser som koder for de ligandbindende ekstracellulære domener. Alternativt kan slikt DNA fremstilles ved PCR med spesifikt utformede primere som bærer restrik-sjonssetene. Et annet plasmid som bærer det konstante område av IgGl tung kjede, f.eks. pRKC042Fcl (47) underkas-tes lignende seterettet mutagenese for å innføre det samme enestående restriksjonssete så nær som mulig Asp 216 av IgGl tung kjede på en måte som muliggjør translasjon i fase av det fuserte protein. Et dsDNA-fragment, betående av 5' ikke-translaterte sekvenser og som koder for enten IFNAB-BPII eller det ligandbindende domene av IFNAB-BPI fremstilles ved spaltning ved de enestående restriksjonsseter. Det muterte pRKCD42Fcl blir på lignende måte spaltet for å danne et stort fragment inneholdende plasmidet og IgGl-sekvensene. De to fragmenter blir så ligert for å danne et nytt plasmid som koder for en polypeptidprekursor bestående av enten IFNAB-BPII eller det ligandbindende domene av IFNAB-BPI og omkring 227 C-terminale aminosyrer av IgGl tung kjede (hengselsområde og CH2- og CH3-domener). Det DNA som koder for de fuserte proteiner kan bli isolert fra plasmidet ved spaltning med passende restriksjonsenzymer og så satt inn i effektive prokaryote eller eukaryote ekspresj onsvektorer.

Eksempel 13: Konstruksjon av rekombinante fusjonsproteiner av IFNAB- BPI og IFNAB- BPII sammen med IFNAR

Produksjonen av proteiner omfattende enten det ekstracellulære domene av IFBAB-BPI eller IFNAB-BPII fusert til det konstante område av IgGl tung kjede kan utføres som beskrevet i eksempel 12. Produksjonen av et protein omfattende det ekstracellulære domene av IFNAR, fusert til det kon stante område av IgGl lett kjede, blir utført på lignende måte. Eukaryote ekspresjonsvektorer som koder for enten det ligandbindende domene av IFNAB-BPI fusert til det konstante område av IgGl tung kjede eller IFNAB-BPII, fusert til det konstante område av IgGl tung kjede, blir brukt for ko-transfeksjon av passende pattedyrvertsceller sammen med en eukaryot ekspresjonsvektor som koder for det ekstracellulære domene av IFNAR, fusert til det konstante område av IgGl lett kjede. Positive transfektanter vil skille ut et sammensatt protein bestående av de IgGl konstante områder, det ekstracellulære domene av IFNAR som erstatter de variable områder av IgGl lette kjeder og enten IFNAB-BPII eller det ligandbindende domene av IFNAB-BPI som erstatter de variable områder av IgGl tunge kjeder.

I et annet eksempel blir de konstante områder av de tunge og lette kjeder byttet, nemlig det ekstracellulære domene av IFNAR blir fusert til de konstante områder av IgG2 tunge kjeder, mens enten det ligandbindende domene av IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII blir fusert til de konstante områder av IgG2 lett kjede.

Basert på eksempel 9 blir disse fuserte proteiner ventet å oppvise omkring 10 ganger høyere affinitet for IFN-a sammenlignet med den til IFNAB-BPI eller IFNAB-BPII.

Eksempel 14: Fremstilling av polyklonale antistoff mot

IFNAB- BP

Kaniner ble initielt injisert subkutant med 5 ug av et rent preparat av IFNAB-BP fra urin emulgert i fullstendig Freunds adjuvant. Tre uker senere ble de injisert subkutant med 5 ug av preparatet i fullstendig Freunds adjuvant. Fire ytterligere injeksjoner som oppløsning i PBS ble gitt ved 10 dages intervaller. Kaninene ble tappet for blod 10 dager etter siste immunisering. Utviklingen av antistoffnivå ble fulgt med et fastfase-radioimmunoassay (sRIA) under anvendelse av 96 brønners PVC-plater belagt over natten ved 4°C med IFNAB-BP (1 ug/ml), i fosfatbufret saltvann (PBS). Platene ble så blokkert med bovin serum albumin (BSA, 0,5%), Tween (Sigma USA, 0,05%) i PBS over natten i 4°C. Platene ble omsatt med 5 ganger ' fortynninger av kanin antiserumet i 4 timer ved romtemperatur, vasket og omsatt med<125>I-protein A (IO<5>cpm/brønn) i PBS i 45 min ved romtemperatur. Platene ble så vasket, individuelle brønner ble skåret ut og opptelt. Titeren blir regnet ut som den resi-proke verdi av den maksimale fortynning som gav tellinger som var 10 ganger høyere enn kontrollantiserum. Titeren etter 5 injeksjoner var større enn 1:60.000.

Utviklingen av antistoffnivå ble også fulgt ut fra anti-serumets evne til å blokkere antiviral aktivitet av human IFN-a2. På forhånd dannede monolag av humane WISH-celler i 96-brønners plater ble inkubert med to gangers fortynninger av antiserumet ved å starte ved en fortynning på 1:250 i brønn nr. lii time ved 37°C. IFN-a2 (10 u/ml, endelig) ble så tilsatt, og etter 1 time ved 37°C ble cellene til-ført vesikulært stomatitis virus. Den nøytraliserende titer etter 7 immuniseringer var 120.000 antivirale u/ml.

Eksempel 15: Fremstilling av monoklonale antistoff mot

IFNAB- BP

Balb/C hunnmus (3 måneder gamle) ble først injisert med 2 Vig renset IFNAB-BP i en emulsjon av fullstendig Freunds adjuvant, og tre uker senere subkutant i ufullstendig Freunds adjuvant. Tre ytterligere injeksjoner ble gitt ved 20 dagers intervaller, subkutant i PBS. En bindingstiter på 1:60.000 ble fremskaffet med sRIA (se eksempel 9). Endelige forsterkninger ble gitt intraperitonealt 4 og 3 dager før fusjonen til musen som viste den høyeste bindingstiter. Fusjon ble utført ved å bruke NSO/1 myelomcellelinje og lymfocytter fremstilt fra både milt- og lymfeknuter hos dyret som fusjonspartnere. De fuserte celler ble fordelt i mikrokulturplater og hybridomene ble valgt ut i DMEM supp-lementert med HAT og 15% hesteserum. Hybridomer som ble funnet å danne antistoff mot IFNAB-BP, ble subklonet ved den begrensende fortynningsmetode og injisert i Balb/C-mus som hadde blitt gjort følsomme med pristan for fremstilling av bukvæske. Isotypene av antistoffene ble definert med bruk av et kommersielt tilgjengelig ELISA kit (Amersham,

UK) .

Utvelgelsen av hybridomer som dannet anti-IFNAB-BP monoklonale antistoff ble utført som følger: Hybridomsupernatanter ble undersøkt for tilstedeværelse av anti-IFNAB-BP-antistoff med et omvendt fastfase radioimmunoassay (IRIA). PVC mikrotitetplater (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) ble belagt med affinitetsrenset geite anti-mus-serum F(ab)2antistoff (Jackson Labs, USA) (10 ug/ml, 100 ul/brønn). Etter inkubering over natten ved 4°C ble platene vasket to ganger med PBS inneholdende BSA (0,5%) og Tween 20 (0,05%) og blokkert i vaskeoppløsning i minst 2 timer ved 37°C. Hybridomkultursupernatanter (100 ul/brønn ble tilsatt, og platene ble inkubert i 4 timer ved 37°C. Platene ble så vasket tre ganger med vaskeoppløsningen og12<5>I-IFNAB-BP (100 ul, 105 cpm) ble tilsatt for ytterligere inkubering i 16 timer ved 4°C. Platene ble vasket tre ganger og individuelle brønner ble skåret ut og opptelt i en gammateller. Prøver som gav tellinger som var minst 5 ganger høyere enn den negative kontrollverdi, ble betraktet som positive (tabell VI). Fem positive kloner ble utvalgt, subklonet for ytterligere studier ogkarakterisert. Alle kloner var av IgGl isotype.

Eksempel 16: Affinitetskromatografi av IFNAB- BP med monoklonale antistoff

Antistoff mot IFNAB-BP ble anvendt for opprensing av IFNAB-BP med affinitetskromatografi. Det monoklonale antistoff nr. 5.73 ble brukt i dette eksempel for affinitetskromatografi. Bukvæske inneholdende det monoklonale antistoff utskilt av hybridom nr. 5.73 ble renset med ammoniumsulfat-utfelling ved 50% metning, fulgt av utstrakt dialyse mot PBS. Omkring 10 mg immunoglobuliner ble bundet til 1 ml Affigel 10 (Bio-Rad USA), som angitt av fabrikanten.

250 ml humane urinproteiner (ekvivalent med 250 1 urenset urin) ble satt på 0,5 ml anti-IFNAB-BP antistoffkolonnen

ved 4°C ved en strømningshastighet på 0,25 ml/min. Kolonnen ble vasket med PBS inntil det ikke ble påvist noe protein i vaskingene. IFNAB-BP ble eluert med 25 mM sitronsyrebuffer, pH 2,2 (8x1 kolonnevolumfraksjoner) og umiddelbart

nøytralisert med 1 M Na2C03. Sølvfargeanalyse av SDS-PAGE av de eluerte fraksjoner viste et hovedbånd med MW på 40.000. Videre opprensing av dette preparat ble foretatt med gelkromatografi.

Eksempel 17: ELISA- test med IFNAB- BPII

Mikrotiterplater (Dynatech eller Maxisorb, fra Nunc) ble belagt med anti-IFNAB-BP monoklonalt antistoff nr. 46.10 (Ig-fraksjon, 120 ul/brønn, 10 ug/ml i PBS) over natten ved 4°C. Platene ble vasket med PBS inneholdende BSA (0,5%), Tween 20 (0,05%) og NaN3(0,02%) (Blokkerende oppløsning) og blokkert i samme oppløsning over natten ved 37°C. De undersøkte prøver ble serielt fortynnet to ganger (ved å starte med 1:4) i blokkeringsoppløsningen inneholdende 0,1% NP40 og 0,65 M NaCl og tilsatt til brønnene (100 yl/brønn) i 4 timer ved 37°C. Platene ble så vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (PBS/Tween), fulgt av tilsetning av kanin anti-IFNAB-BPII-serum (1:1000 i blokkerende oppløsning, men uten NaN3, 100 ul/brønn) for ytterligere inkubering over natten ved 4°C. Platene ble vasket tre ganger med PBS/Tween (100 ul/brønn), og et konjugat av geite-anti-kanin pepperotperoksydase (HRP, Jackson Labs, 1:10,000 i PBS/Tween, 100 ul/brønn) ble tilsatt over 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket tre ganger med PBS/Tween og fargen ble fremkalt ved å tilsette til hver brønn 100 ul av en ferskt fremstilt oppløsning av ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfonsyre, Sigma, 10 mg; 6,4 ml H20: 2,2 ml 0,2M Na2HP04; 1/4 ml 0,2 M sitronsyre; 1 ul H2O2) som substrat. Det utvikler seg farge etter 30 minutter, og reaksjonen kan bli stoppet ved tilsetning av 100 ul/brønn av 0,2 M sitronsyre. Platene ble avlest med en automatisk ELISA-avleser ved 405 nm, ved å korrigere for ikke-spesifikk avlesning ved 630 nm. Denne grense for på-påvisning i dette assay var 30 pg/ml (figur 10).

Referanser

1. Taylor, J. L. and Grossberg, S.E. (1990). Recent progress in interferon research: molecular mechanisms of regulation, action and virus circumvention. Virus Research 15:1-26. 2. Bisceglie A.M., Martin, P., Kassianides, C, Lisker-Melman, M., Murray, L., Waggoner, J., Goodmann, Z., Banks, M.S. and Hoofnagle, J.H. (1989). Recombinant interferon alpha therapy for chronic hepatitis C. A randomized, double-bind, placebo-controlled trial. New Eng. J. Med. 321:1506-1510. 3. McDonnell, W.M. and Elta G.H. (1992). Acute heptatitis C infection: interferon finally succeeds. Gastroenterology (US) 103:1359-1360. 4. Friedman-Kien, A.E., Eron, L.J., Conant, M., Growdon, W., Badiak, H., Bradstreet, P.W., Fedorczyk, D., Trout, R. and Plesse, T.F. (1988). Natural interferon alpha for treatment of condylomata acuminate. J. Am. Med. Assn., 259:533-538. 5. Mains, J. and Handley, J. (1992). Interferaon: current and future clinical uses in infectious disease practice. Int. J. Stud. AIDS 3:4-9. 6. Berman, E., Heller, G., Kempin, S., Gee, T., Tran, L. and Clarkson, B. (1990). Incidence of response and long term follow up in patients with hairy cell leukemia treated with recombinant interferon Alpha-2a, Blood 75:839-845. 7. Talpaz M., Kantarjian, H.M., McCredie, K.B., Keating, M.J., Trujillo, J. and Gutterman, J. (1987), Clinical investigation of human alpha interferon in chronic myelogenous leukemia. Blood 69:1280-1288. 8. De Wit, R., Schattenkrek, J.K.M.E., Boucher, C.A.B., Bakker, P.J.M., Veenhof, K.H.N. and Danner, S.A. (1988). Clinical and virological effects of high-dose recombinant-interferon-a in disseminated AIDS-related Kaposi's sarcoma. Lancet 2: 1214-1222. 9. Klippel, J.H., Carrete, S., Preble, D.T., Friedman, R.M. and Grimley P.M. (1985). Serum alpha interferon and lymphocyte inclusions in systemic lupus erythematosus. Annals of the Rheumatic Diseases 44:104-108. 10. Lau, A.S., Der, S.D., Read, S.E., and Williams, B.R. (1991). Regulation of tumor necrosis factor receptor expression by acid-labile interferon-alpha from AIDS sera. AIDS Res. Hum. Retroviruses 7:545-552. 11. Stewart, T.A. (1993). Induction of type I diabetes by interferon-a in transgenic mice. Science 260:1942-1946. 12. Tsavaris, N., Mylonakis, N., Bacoyiannis, C, Tsoutsos, H., Karabelis, A., and Kosmidis, P. (1993). Treatment of renal cell carcinoma with escalating doses of alpha-interferon. Chemotherapy (Switzerland) 39:361-366. 13. Branka, A.A. and Baglioni, C. (1981). Evidence that types I and II interferons have different receptors. Nature 294:768-770. 14. Uze G., Lutfalla, G. and Gresser, I. (1990). Genetic transfer of a functional human interferon a receptor into mouse cells: cloning and expression of its cDNA. Cell 60:225-234. 15. Colamonici, O.R. et al. (1990). Characterization of three monoclonal antibodies that recognize the interferon-a2 receptor. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:7230-7234. 16. Platanias, L.C. et al. (1992). Expression of the IFN-a receptor in hairy cell leukemia, Brit. J. Haematology 82:541-546. 17. Colaminici, O.R. et al. (1993). Identification of a novel subunit of the type I Interferon receptor localized to human chromosome 21. J. Biol. Chem. 268:10895-10899. 18. Benoit, P. et al. (1993). A monoclonal antibody to recombinant human IFN-a receptor inhibits biologic activity of several species of human IFN-a, IFN-b and IFN-omega. J. Immunol. 150:707-716. 19. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D. and Rubinstein, M. (1989). Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J. Exp. Med. 170:1409-1414. 20. Novick, D., Engelmann, H., Wallach, D., Leitner, 0., Revel, M. and Rubinstein, M. (1990). Purification of soluble cytokine- receptors from normal human urine by ligand-affinity and immuno-affinity chromatography. J. Chromatography 510: 331-337. 21. Novick, D., Engelmann, H., Revel, M., Leitner, 0. and Rubinstein M. (1991). Monoclonal antibodies to the soluble IL-6 receptor: affinity purification, ELISA, and inhibition of ligand binding. Hybridoma 10:137-146. 22. Engelmann, H., Novick, D. and Wallach D. (1990). Two tumor-necrosis-factor binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross reactivity with cell surface tumor-necrosis-factor receptors. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536. 23. Engelmann, H., Aderka, D., Rubinstein, M., Rotman, D. and Wallach, D. (1989). A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity. J. Biol. Chem. 264:11974-11980. 24. Seckinger, P., Isaaz, S. and Dayer, J.M. (1988) A human inhibitor of tumor necrosis factor alpha. J. Exp. Med. 167:1511-1516. 25. Maliszewski, CR. and Fanslow, W.C. (1990). Soluble receptors for IL-1 and IL-4. Biological activity and therapeutic potential. Trends in Biotechnol. 8:324-329. 26. Eastgate, J.A., Symons, J.A. and Duff G.W. (1990). Identification of an interleukin-1 beta binding protein in human plasma. FEBS Letters 260:213-216. 27. Fanslow, F.W., Sims, J.E., Sasenfield, H., Morrisey, P.J., Gillis, S., Dower, S.K. and Widmer, M.B. (1990), Regulation of alloreactivity in vivo by soluble form of the interleukin-1 receptor. Science 248:739-742. 28. Mosley, B., Beckman, M.P., March, C, J., Idzerda, R.L., Gimpel, S-, D., VandenBos, T., Friend, D., Alpert, A., Anderson, D., Jackson, J., Wignall, J.M.

Smith C, Gallis, B., Sims, J.E., Urdal, D., Widmer, M.B., Cosman, D. and Pari, L.S. (1989). The murine interleukin-4 receptor: molecular cloning and characterization of secreted and membrane forms. Cell 59:335-348. 29. Marcon, L., Fritz, M.E., Kurman, CC, Jensen, J.C and Nelson, D.L. (1988). Soluble TAC peptide is present in the urine of normal individuals and at elevated levels in patients with adult T-cell leukemia. Clin. Exp. Immunol. 73:29-33. 30. Josimovic-Alasevic, 0., Hermann, T. and Diamanstein, T. (1988). Demonstration of two distinct forms of released low-affinity type interleukin-2 receptors. Eur. J. Immunol. 18:1855-1857. 31. Goodwin, R.G., Friend, D., Ziegler, S.F., March. C.J., Nåmen, A.E. and Park, L.S. (1990). Cloning of the human and murine interleukin-7 receptors: demonstration of a soluble form and homology to a new receptor superfamily. Cell 60:941-951. 32. Novick, D., Cohen, B. and Rubinstein, M. (1992). Soluble IFN-a receptor molecules are present in Body Fluids, FEBS Letters, 314:445-448. 33. Pearson, W.R. and Lipman, D.G. (1988), Improved tools for biological sequence comparison, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:2444-2448. 34. Okayama, H. and Berg, P. (1983) AcDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3:280-289. 35. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982. 36. Gryczan, T., "The Molecular Biology of the Bacilli", Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). 37. Kendall, K.J. et al. (1987) J. Bacteriol. 169:4177-4183). 38. Chater, KF. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). 39. John, J.F., et al. (1986) Rev. Infect. Dis. 8:693-704) .

40. Izaki, K. (1978) Jph. J. Bacteriol. 33:729-742).

41. Botstein, D., et al. (1982) Miami Wint. Symp. 19:265-274. 42. Broach, JR., in "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470 (1981). 43. Broach, J.R., (1982) Cell 28:203-204. 44. Bollon, D.P., et al. (1980) J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48. 45. Maniatis, T., in "Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression", Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980). 46. Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 18:5322-5328. 47. Byrn R.A. et al., 1990, Nature (London) 344:667-670. 48. Frohman, M.A., Dush, M.K. and Martin, G.R. (1988) Proe. Nat' l. Acad. Sei. USA, 85, 8998-9002. 49. Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973) Virology, 52, 456-467^50. Munson, P.J. and Rodbard, D. (1980) Anal. Biochem., 107, 220-239. 51. Yamada, T. et al., Neurosci. Lett., 181:61-64 (1994).

Claims (16)

1. DNA-molekyl, karakterisert vedat det koder for et IFN-a/il-bindende protein valgt fra (a) IFNAB-BP I som har aminosyresekvensen vist i Fig. 2; (b) IFNAB-BP II som har aminosyresekvensen vist i Fig. 5; (c) prekursorer eller fusjonsproteiner av proteinene ifølge (a) eller (b).

2. mRNA-molekyl, karakterisert vedat det er transkrip-sjonsproduktet fra DNA-molekylet ifølge krav 1.

3. mRNA-molekyl ifølge krav 2,karakterisert vedat det er valgt fra (a) et mRNA-molekyl på omkring 1,5 kb som, når translatert, gir en IFNAB-BP I prekursor; og (b) et mRNA-molekyl på omkring 4,5 kb som, når translatert, gir et IFNAB BP II.

4. Replikerbar ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter DNA-molekylet ifølge krav 1.

5. Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 4,karakterisert vedat den er plasmidet pEF-BOS-IFNAB-BP I hvis konstruksjon er beskrevet i figur 6c.

6. Vertscelle, karakterisert vedat den er transformert med den replikerbare ekspresjonsvektor ifølge krav 4 eller 5.

7. Verstcelle ifølge krav 6, karakterisert vedat den er en prokaryot celle.

8. Vertscelle ifølge krav 6, karakterisert vedat den er en eukaryot celle.

9. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert vedat den er en COS-celle fra aper.

10. IFN-a/ii-bindende protein, karakterisert vedat det er kodet av DNA-sekvensen ifølge krav 1 eller RNA-sekvensen ifølge krav 2 eller 3 eller som er dannet av vertscellen ifølge ethvert av kravene 6 til 9, eller et salt av nevnte bindende protein .

11. IFN-a/Ii-bidende protein ifølge krav 10,karakterisert vedat det er et ferdigutviklet protein eller et salt derav.

12. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter det IFN-a/ii-bindende protein ifølge krav 10 eller 11 eller et salt derav, eventuelt i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

13. Anvendelse av det IFN-a/fi-bindende protein ifølge krav 10 eller 11 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for modulering av IFN-a- eller IFN-ft-aktivitet.

14. Anvendelse av det IFN-a/IJ-bindende protein ifølge krav 10 eller 11 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for inhibering av IFN-a- eller IFN-(i-aktivitet.

15. Fremgangsmåte ved fremstilling av det IFN-a/JS-bindende protein ifølge krav 10 eller 11,karakterisert vedat den omfatter å dyrke vertscellen ifølge ethvert av kravene 6 til 9 og gjenvinne nevnte IFN-a/A-bindende protein.

16. Diagnostisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter DNA-molekylet ifølge krav 1 og/eller det IFN-a/fi-bindende protein ifølge krav 10 eller 11.