JP2866706B2 - 腫瘍壊死因子結合蛋白 - Google Patents
腫瘍壊死因子結合蛋白Info
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Description
害する能力、及び/又はその有益な作用を長期間維持す
る能力を有する、腫瘍壊死因子(TNF)結合蛋白II(以
後TBP−IIと表示する)と呼ばれる新規蛋白、その塩、
官能基誘導体、前駆体、活性画分、及びこれらの任意の
混合物に関する。本発明はまた、TBP−IIの精製法、実
質的に精製された蛋白、そのクローニング及び組換えDN
A法による産生法に関する。本発明はまた、TBP−IIとそ
のF(ab)断片に対する抗体に関する。さらに本発明
は、TNFの有害作用に拮抗するための、及び/又はその
有益な作用を長期間維持するための、TBP−II、その
塩、官能基誘導体、前駆体又はこれらの活性画分、及び
これらの任意の混合物の使用、診断測定法における抗体
の使用、そして細胞に対するTNFの効果を阻害又は模倣
するための物質としての抗体の使用に関する。
−β)(以後TNFとはTNF−αとTNF−βの両方を意味す
る)は細胞に対して多くの作用を有するサイトカインで
ある(ディー・ワラーシュ(Wallach,D.)、(1986年)
のインターフェロン7(Interferon 7)(イオングレッ
サー(Ion Gresser)編)、83−122頁、アカデミックス
プレス社(Academic Press)、ロンドン、及びビー・ボ
イトラーとエー・セラミ(Beutler,B.and Cerami,
A.)、(1987年)、ニューイングランドジャーナルオブ
メディシン(New England J.Med.)、第316巻:379−385
頁。TNF−α及びTNF−βはともに特異的細胞の表面リセ
プターに結合してその作用を開始する。その作用は生物
に対して有益なこともある:例えばそれらは腫瘍細胞や
ウイルス感染細胞を死滅させたり、顆粒球の抗細菌性作
用を増強させたりする。このようにTNFは生物の感染体
に対する防御や毒性からの回復に貢献している。しかし
明らかにTNF−α及びTNF−βはともに、非常に有害な作
用をすることもある。いくつかの疾患でTNF−αの過剰
産生が主要な病因になっているという証拠がある。例え
ば主に脈巻構造に対するTNF−αの作用が、敗血症ショ
ックの主要原因であることが知られている(ケー・ジェ
イ・トレーシー(Tracy,K.J.)ら、サイエンス(Scienc
e)第234巻、470−474頁、(1986年))。ある疾患では
TNFは含脂肪細胞の活性を抑制して食欲不振を引き起こ
すことにより、極度の体重減少を引き起こし(悪液
質)、そのためTNF−αはカヘクチン(cachectin)と呼
ばれている。TNFはまたリウマチ疾患において組織毒性
のメディエーターとされており(ボイトラー(Beutle
r)、前述)、対宿主移植片反応で見られる毒性の主要
なメディエーターであるとされている。
Fを除去又は拮抗する方法を見つける必要がある。この
方向の最初の試みは、ヒト尿からのTBP−Iと呼ばれる
最初のTNF結合蛋白の単離である、これはTNFの作用に拮
抗することが証明される。この拮抗作用は、TNFの細胞
毒性活性の減少を測定することにより、そしてTNFのリ
セプターへの結合の妨害を測定することにより証明され
た。
88号(1988年9月12日に出願)に記載されており、この
特許には、CM−セルロースのクロマトグラフィーの次
に、モノQとモノ8カラムでの高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)、そして逆相高速液体クロマトグラフィー
により、ヒト尿からこの蛋白を均一になるまで精製する
方法が記載されている。こうして得られたTBP−Iは、
還元化条件及び非還元化条件のいずれにおいてもドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動(PAGE)で、見かけの分子量は約27,000であっ
た。精製蛋白の均一性はマイクロ配列解析により確認さ
れ、単一のN末端配列: Asp−Ser−Var−Cys−Pro−を示した。
NF−α及びTNF−βとともに適用するとき、これらのサ
イトカインの細胞への結合を妨害することが証明され
た。TBP−Iの作用機構をさらに調べることにより、TBP
−Iは標的細胞とは相互作用をせず、TNFに特異的に結
合することによりTNFの機能を阻止する(即ちTNFリセプ
ターに対してTNFと競合する)ことがわかった。
製法では、尿性蛋白又はその画分をTNFを固定したカラ
ムにかけ、結合しない蛋白を除去し、pHを下げることに
よりカラムに結合した蛋白を生物活性のある形で溶出し
た。SDS−PAGEでは、溶出液中のほとんどの蛋白は、見
かけの分子量約30,000±2,000の単一の広いバンドとし
て移動した。
体クロマトグラフィーで分画すると、2つの活性成分が
証明された:1つは予想されたようにアセトニトリル27%
で溶出するTBP−Iであり、もう1つは少し高いアセト
ニトリル濃度(31%)で溶出する第2のTNF結合蛋白で
ある。このTNF結合蛋白は新規であり、ここではTBP−II
と呼ぶ。両方の蛋白ともインビトロ(試験管内)でTNF
の細胞毒性作用に対する防御を与え、いずれもTNF−β
に対する結合はTNF−αに対する結合より弱かった。SDS
−PAGE分析では、この2つの蛋白は分子量がよく似てい
るが、免疫的交差反応性がないこと、N−末端アミノ酸
配列が異なり、アミノ酸組成が異なることにより明瞭に
区別される。
ことができ、及び/又はその有益な作用を長期間維持す
るTNF結合蛋白(ここでTBP−IIと表示する)、その塩、
官能基誘導体、前駆体、活性画分、及びこれらの任意の
混合物を与える。TNFに対する拮抗作用は、TNFの細胞毒
性作用は減少せせるが、ある程度TNFの作用を模倣する
他の化合物(例えばヒトインターロイキン−1(IL−
1))の細胞毒性作用は減少させないことを選択的に測
定することにより証明される。
含まず逆相高速液体クロマトグラフィーで単一のピーク
として移動する、TBP−IIに関する。
の精製法に関する。
同一の蛋白をコードするDNA配列の調製、それらを含む
発現ビヒクル(vehicle)、そしてその発現ビヒクルに
より形質転換された宿主細胞の作成、組換えTBP−II又
はこれと実質的に同一の蛋白を産生させるための、この
形質転換細胞の適当な培地中での培養よりなる、組換え
DNA法によるTBP−IIの産生である。
の毒性作用を阻害し、またTNFと類似の細胞に対して有
用な作用をさせるための医薬品として使用される、TBP
−IIとそのF(ab)断片に特異的な抗体を与えることで
ある。
活性画分、及びこれらの任意の混合物は、TNFと共に使
用するとき、TNFの有害作用から哺乳動物を防御し、及
び/又はその有益な作用を長期間維持する薬剤組成物を
活性成分として使用できる。
尿性TNF結合蛋白の溶出パターンを示す。
S−PAGE分析の結果を示す。
チドの配列を示す。
対する抗血清の結合のELISAを示す。
異なる細胞株に対するTNFの結合の阻害を示す。
E)患者の血清中のTBP−II濃度を示す。
としてのTNFの有益な作用を長期間維持させることに対
する、TBP−IIの異なる濃度の影響を示す。
時的影響を示す。
び/又はその有益な作用を長期間維持するTNF結合蛋白I
I、その塩、官能基誘導体、前駆体、活性画分、及びこ
れらの任意の混合物を与える。
きることが発見され、従って本発明はTBP−IIによるTNF
の細胞毒性作用の阻害を包含する。さらにTBP−IIはTNF
に結合する特異的担体として追加的な役割をはたし、そ
の有益な作用を長期間維持させることもわかった。従っ
てTBP−II結合TNF複合体は、活性TNFの標的細胞に対す
る持続的放出(除放性)を与える貯蔵場所として働くこ
とができる。この点も本発明により包含され、TNFの有
益な作用(例えば、抗腫瘍活性、抗ウイルス活性、抗細
菌活性、抗菌性、又は繊維芽細胞増殖刺激活性)を長期
間維持させるために、TNFと共にTBP−IIを低濃度で使用
することも含む。この場合、この混合物はいくつかの臨
床的応用(例えば傷の治癒の促進)が可能である。
精製された形の蛋白(実質的に蛋白性不純物を含まな
い)はSDS−PAGEにより還元化条件で分析するとき、約3
0kDaの分子量を有し、逆相高速液体クロマトグラフィー
上で単一のピークとして移動する。その活性は、マウス
A9細胞に対するTNF−αの細胞毒性作用の阻害能力によ
り測定できる。
記の配列により特徴づけられる: 実際、TBP−IIの試料にはN末端配列の不均一性が見
られ、すべての実験でこの配列の末端が切れた形が見ら
れた。末端の切れた異なる配列の量と互いの比率はバッ
チ毎に異なっていた。従って上記の配列と共に5個のア
ミノ酸が少ない配列、 及び末端のアミノ酸の4個がない配列、 も認められるであろう。
呼ぶ)、及びヒトTBP−II活性を有する限り、他のポリ
ペプチド(ここでは天然のTBP−IIの構造の1つ又はそ
れ以上のアミノ酸が欠失しているか、又は他のアミノ酸
で置換されているか、又は1つ又はそれ以上のアミノ酸
が付加されている)も含む。
単離法と精製法に関する。1つの好適な態様において、
本発明の実質的に精製された蛋白は以下の段階よりなる
方法により産生される: a) 健常人の尿の透析濃縮物から粗蛋白画分を回収
し; b) 段階(a)の粗蛋白画分を、TNFを固定したアフ
ィニティクロマトグラフィーにかけて; c) 段階(b)のアフィニティ精製した活性TNF結合
蛋白を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にか
けて、TNF結合蛋白の実質的に精製された活性画分(TNF
の細胞毒性作用を阻害する能力により規定する)を得
て; d) SDS−PAGEにより還元化条件で分析するとき、約3
0kDaの分子量を有し、逆相高速液体クロマトグラフィー
で単一ピークとして移動し、TNFの細胞毒性作用を阻害
する能力を有する、段階(c)の実質的に精製されたTB
P−II蛋白を分離し; e) アセトニトリル31%で溶出し実質的に精製された
TBP−IIを含有する画分を回収する。
関し、この方法に使用される全ての手段を含む。即ち本
発明は、TBP−II又は実質的にそれと同一の蛋白をコー
ドするヌクレオチド配列よりなるDNA分子に関する。こ
れらのDNA配列はゲノムDNA、cDNA、合成DNA、及びそれ
らを組み合わせたものでのよい。
る。1つの方法は、TBP−IIに対する特異的抗体(ポリ
クローナル抗体又はモノクローナル抗体)を産生し、こ
れを用いて免疫蛍光法又はウェスタンブロット法により
TBP−IIを産生する細胞を捜すことである。次にTBP−II
産生細胞からmRNAを抽出し、cDNAを作成するのに適した
時間及び条件で、リバーストランスクリプターゼと接触
させてcDNAに変換する。このcDNAをラムダgt11のような
発現ベクター中でクローン化し、抗体を用いてスクリー
ニングする。ラムダgt11発現ベクターは、ベータガラク
トシダーゼ停止コドンの53塩基上流にある単一のEcoR I
部位に、7kdまでの長さのDNAを挿入するのに使用され
る。従って外来DNA配列はこの部位に挿入され、適当な
条件で融合蛋白として発現される。ラムダgt11発現ベク
ターは、抗体プローブを用いてスクリーニングされるcD
NAの作成に特に有用である(ティー・ブイ・ヒュー(Hu
ynh,T.V.)ら、デービッドグローバー(David Glover)
編、DNAクローニング法:プラクティカルアップローチ
(DNA Cloning Techniques:A Prractical Approach)、
アイアールプレス(IRL Press)、オックスフォード、4
9−78頁(1984年))。
ミノ酸配列)より得られた配列である、合成オリゴヌク
レオチド、又はその混合物を産生し、cDNA又はTBをコー
ドするゲノムDNAのクローニング用プローブとして使用
する。ヒトゲノムDNAのような適当なDNA調製物を制限酵
素により酵素的に切断するか又はランダムに切断し、断
片を適当な組換えベクターに挿入し遺伝子ライブラリー
を作成する。次にTBP−IIをコードする配列を同定する
ために、このようなベクターを合成オリゴヌクレオチド
でスクリーニングすることができる。
後上記したようにcDNAに変換する。cDNAは公知の方法に
より二本鎖DNAに変換し、クローン化し、得られるクロ
ーンを、所期の配列をコードするcDNAの適当なプローブ
でスクリーニングする。目的のcDNAを単離した後は、ゲ
ノムDNAと実質的に同様の方法でcDNAを操作する。しか
しcDNAにはイントロンや介在配列はない。
ーブとして使用される合成オリゴヌクレオチドに関す
る。これらはTBP−IIの断片のアミノ酸配列に基づき公
知の方法で合成される。この目的のために、TBP−IIの
配列を完全に解析するか、又はそのペプチド断片を得て
アミノ酸配列を解析することができる。このペプチド断
片は当業者に公知の方法で、トリプシン、キモトリプシ
ン、又はパパインなどのプロテアーゼで消化することに
より、精製された蛋白調製物を断片化することにより得
られる(ワイ・オイケ(Oike,Y.)ら、ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー(J.Biol.Chem.)第257
巻、9751−9758頁(1982))。これらは逆相高速液体ク
ロマトグラフィーで分離し、自動アミノ酸配列解析法で
配列を決定する。
該断片の部分的配列が解析されたら、それらをコードす
ることができるDNA配列を調べる。遺伝子コードは分解
していくために、1つのアミノ酸をコード化するのに1
つ又はそれ以上のコドンが使用されることもあり、その
各々がTBP−IIペプチド断片をコードすることができる
1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを産生すること
もできる、(ジェイ・ディー・ワトソン(J.D.Watoso
n)、遺伝子の分子生物学(Molecular Bioloby of the
Gene)、第3版、ダブリュー・エー・ベンジャミン社
(W.A.Bemjamin)、メンロパーク(Menlo Park)、カリ
フォルニア,356−357頁(1977年))。しかし遺伝子の
ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するの
は、この集団のうち1つのみである。集団の中にこのヌ
クレオチド配列が存在すること、及びたとえこの集団に
他のものが存在してもDNAをハイブリダイズすることが
できることにより、ペプチドをコードする遺伝子をクロ
ーン化するのに1つのオリゴヌクレオチドを使用するの
と同じ方法で、このオリゴヌクレオチドの分画していな
い集団を使用することができる。TBP−II遺伝子断片を
コードすることができる「最も可能性の高い」オリゴヌ
クレオチド又はオリゴヌクレオチドの集団(アール・ラ
ーセ(Lathe,R.)ら、ジャーナルオブモレキュラーバイ
オロジー(J.Mol.Biol.)第183巻、1−12頁(1983年)
に記載されている「コドン使用規則」(“codon usage
rules"))を使用することにより、TBP−II又は少なく
ともその一部をコードする「最も可能性の高い」配列、
又はこのような配列の集団をハイブリダイズすることが
できる相補的オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチ
ドの集団の配列を同定することができる。次にこのよう
な相補的配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成し、
プローブとして使用して、DNAライブラリーから本発明
のTBP−IIをコードするDNA分子を同定し単離する(ティ
ー・マニアティス(Maniatis,T.)ら、モレキュラーク
ローニング:実験室マニュアル(Molecular cloning:A
Laboratory Manual)、コールドスプリングハーバー出
版(Cold Spring Harbor Press)、コールドスプリング
ハーバー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク(1982
年))。
トリンジャント(stringent)な条件下のコロニーハイ
ブリダイゼーション法により単離される。核酸のハイブ
リダイゼーション法は公知であり、例えばティー・マニ
アティス(Maniatis,T.)ら、モレキュラークローニン
グ:実験室マニュアル(Molecular cloning:A Laborato
ry Manual)(前述)や、ビー・ティー・ハイムズ(Hay
mes B.T.)ら、核酸ハイブリダイゼーション:プラクテ
ィカルアプローチ(Nucleic Acid Hybridization:A Prr
actical Approach)、アイアールプレス(IRL Pres
s)、オックスフォード、イングランド(1985年)に開
示されている。上記ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチ
ドプローブの集団とハイブリダイズさせることにより、
cDNA又はゲノムライブラリー中のこのようなハイブリダ
イゼーションが可能なDNA配列を同定することができ、
次にこれを解析して、これらがどの程度まで本発明のTB
P−IIのコード配列を含有しているかを決定することが
できる。
ら、前述)で適当に作成した発現ベクター中に陽性のク
ローンのDNAを挿入する。二本鎖DNAは、ホモポリメリッ
クテイリング法(homopolimeric tailing)、又は合成D
NAリンカー又はブランド末端結合法を用いる制限結合法
により、プラスミッドベクターに結合される。DNA分子
を結合させるのにDNAリガーゼが使用され、アルカリ性
ホスファターゼで処理して好ましくない結合を避ける。
発現と蛋白の産生を可能にするために、目的の蛋白をコ
ードするDNAに結合した、転写及び翻訳制御情報を含む
特異的なヌクレオチド配列を含有していなければならな
い。まず第一に遺伝子が転写されるために、ポリメラー
ゼが結合しており従って転写過程を開始させる、RNAポ
リメラーゼに認識されるプロモーターが先行していなけ
ればならない。このようなプロモーターは種々のものが
使用されており、これらは異なる効率(強いプロモータ
ーと弱いプロモーター)で機能し、原核生物と真核生物
で異なる。シャイン−ダルガルノ(Shine−Dalgarno)
配列(SD配列)のようなリボゾーム結合部位を使用する
ことにより、原核成分において高レベルの遺伝子発現を
達成することができる。真核生物宿主細胞では、宿主細
胞の性質により、異なる転写及び翻訳制御配列を使用す
ることができる。これらはウイルス(例えばアデノウイ
ルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルス(Si
mian virus)など)由来のこともあり、調節シグナル
は、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連してい
る。その例としてはヘルペスウイルスのTKプロモータ
ー、SV40アーリープロモーター、酵母のgal4遺伝子プロ
モーターなどがある。遺伝子の発現が調節できるよう
に、抑制と活性化ができる転写開始調節シグナルを選択
することもできる。
訳調節シグナルのヌクレオチド配列が先行する、本発明
のTBP−IIのアミノ酸配列を含む蛋白をコードするヌク
レオチド配列よりなるDNA分子を、目的の遺伝子配列を
宿主細胞染色体に取り込むことができるベクター中に挿
入する。発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能
にする1つ又はそれ以上のマーカーを導入することによ
っても、染色体中にDNAを安定的に取り込んだ細胞を選
択することができる。
主細胞中で自己複製可能なプラスミッド又はウイルスベ
クターの中に取り込まれる。原核生物及び真核生物プラ
スミッドは文献中で公知である。特定のプラスミッドや
ウイルスベクターの選択に重要な因子は、ベクターを含
まない受容細胞からベクターを含む受容細胞を認識し選
択することの容易性;特定の宿主細胞中での目的のベク
ターのコピー数;そして異なる種間でベクターを「シャ
トル」(行き来)させることが好ましいか否かというこ
とである。
NA配列が発現用に調製されたら、DNA作成物を任意の方
法で適当な宿主細胞中に導入することができる:形質転
換、トランスフェクション(transfection)、結合(co
njugation)、原形質融合、エレクトロポレーション(e
lectro poration)、リン酸カルシウム沈澱、直接マイ
クロインジェクション(direct microinjection)な
ど。本発明で使用する宿主細胞は、原核生物でも真核生
物でもよい。好適な原核生物宿主細胞としては、大腸
菌、バシルス、放線菌、シュードモナス、サルモネラ
菌、セラチア菌などがある。最も好適な原核生物宿主細
胞は大腸菌である。このような条件では、蛋白はグリコ
シル化されない。原核生物宿主細胞は発現プラスミッド
中のレプリコンや調節配列に対して融和性がなければな
らない。蛋白分子に対する翻訳後の改変(正しい折り畳
み(folding)と正しい部位でのグリコシル化)を可能
にするため、哺乳動物細胞(例えばヒト、サル、マウ
ス、チーズハムスター卵巣細胞(CHO))は、好適な真
核生物宿主細胞である。酵母細胞もグリコシル化などの
翻訳後の改変が可能である。
ベクター含有細胞の増殖を選択する。クローン化遺伝子
DNA配列の発現により、目的のTBP−II又はその断片が産
生される。次に本明細書に記載の精製法又は他の従来法
(例えば抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動な
ど)により、発現蛋白を単離し精製する。
ゲルマトリックス中に固定化された抗TBP−IIモノクロ
ーナル抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィー
である。組換え蛋白を含む不純物調製物をこのカラムに
通す。特異的抗体により蛋白はカラムに結合し、不純物
は通過していく。洗浄後pH又はイオン強度を変えてゲル
から蛋白を溶出する。
手段で形成された蛋白分子のカルボキシル基の塩及びア
ミノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩とし
ては、無機塩(例えばナトリウム、カルシウム)、及び
有機塩基(例えばトリエタノールアミン、アルギニン、
リジン)との塩がある。酸付加塩としては例えば無機酸
との塩や有機酸との塩がある。
知の方法で、残基の側鎖又はN末端又はC末端上に存在
する官能基から調製される誘導体を意味し、薬剤として
許容される限り(即ち蛋白の活性を破壊せず、これを含
有する組成物に毒性を与えない限り)本発明に含まれ
る。これらの誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族
エステル又はアミド、及びアシル分子(例えばアルカノ
イル基又はカルボサイクリックアロイル基)と形成され
る遊離アミノ基のN−アシル誘導体、又は遊離ヒドロキ
シ基のO−アシル誘導体がある。
にあってTBP−IIに変換される化合物である。実質的に
精製された蛋白の「活性画分」としては、本発明は蛋白
分子のみのポリペプチド鎖の断片又は前駆体、又はその
画分がTNFの細胞に対する細胞毒性作用を阻害する能力
があり、及び/又はその長期の有益な効果を維持する能
力がある限り、そこに結合した残基(例えば糖残基又は
リン酸塩残基、蛋白分子又は糖分子自身の凝集物)を含
む。
塩、官能基誘導体、及び/又は活性画分(前記で定義し
たもの)に対する抗体に関する。これらの抗体はTNFの
活性の調節のための新しい手段を与え、細胞の特異的サ
ブセットに対するTNFの作用(抗体の分子型により異な
り、具体的には抗体の結合価により異なる)を阻害した
りTNFの効果を模倣するために使用される。1価の抗体
(例えばF(ab)断片)は阻害作用を示し、多価のもの
はTNFの作用の少なくとも一部を模倣することができ
る。従ってこれらは細胞に対するTNFの作用を模倣した
り阻害したりするのに使用する薬剤として適当である。
疾患における生体中の細胞によるTBP−IIの過剰又は過
小な産生の検出のための免疫測定法(例えば放射免疫定
量法、ELISAなど)の新規な診断手段を与える。即ち異
なるタイプの癌又は自己免疫疾患(例えば全身性エリテ
マトーデス(SLE))の患者の血清中のTBP−IIの濃度は
こうして測定される。逆の方法により生体中で内因性に
産生されるTBP−IIに対する抗体は、精製TBP−IIを使用
して測定できる。抗体がTNFの作用を模倣したり阻害し
たりできることはある種の疾患の病態に非常に深い関係
があるため、このような疾患で産生される自己抗体を検
出することは、非常に重要である。
もよい。またそれらはウサギ、マウス、又は他の動物、
又はそれらに由来する培養組織細胞、又はヒトの細胞由
来の産生物でもよい。これらは天然の抗体と同じ形か又
はキメラ分子(ヒトの抗体と動物の抗体の組換えにより
作成される)の形、又は抗体を治療に最も適した形にし
て、組換えDNA法により産生される。
えばN末端蛋白配列)の既知の配列と同一の、1つ又は
それ以上の合成ペプチドを使用して動物を免疫する。別
の可能性はTBP−IIの断片の配列をコードするヌクレオ
チド配列の1つを、プロティンAをコードする遺伝子と
融合させて、融合プロテインA−TBP−II遺伝子を大腸
菌中で発現させ、融合蛋白をIgGセファロースカラムの
アフィニティクロマトグラフィーで精製し、これを用い
て動物を免疫することである。
技術により調製される(コーラー(Kohler)ら、ネーチ
ャー(Nature)、第256巻、495頁(1975年)、コーラー
(Kohler)ら、ヨーロピアンジャーナルオブイミュノロ
ジー(Eur.J.Immunol.)、第6巻、511頁、(1976
年))。免疫後脾臓細胞を単独で又は免疫動物のリンパ
節細胞と共に単離し、適当なミエローマ細胞株と融合さ
せる。融合後得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地中
で選択的に維持した後クローン化する。次にこの選択に
より得られたハイブリドーマ細胞を測定して、TBP−II
に結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。同定
後、目的のクローンを、浮遊培養液として、又は適当な
宿主マウスの腹膜に注射して腹水として大量に増殖させ
る。次にハイブリドーマから産生されるモノクローナル
抗体を単離し精製する。
免疫吸着カラムを使用するアフィニティクロマトグラフ
ィー精製法でのTBP−IIの精製に使用できる。
活性画分、及びこれらの任意の混合物は、哺乳動物にお
けるTNFの有害作用に拮抗する(即ち内因性に産生され
たか外因性に投与されたか又は過剰のTNFのある状態の
治療に使用できる)ことが示唆されている。これらはま
た低濃度で及びTNFとの混合物として、TNFの有益な作用
を長期間に持続させる担体として使用できることも示唆
されている。
活性成分として本発明のTBP−IIとその塩、これらの官
能基誘導体、前駆体、活性画分、及びこれらの任意の混
合物を含有する薬剤組成物に関する。この組成物は内因
性TNFの過剰産生がある状態(例えば敗血症ショック、
悪液質、対宿主移植片反応、リウマチ様関節炎などの自
己免疫疾患)に使用できる。その投与法は類似の薬剤に
ついて一般的に受け入れられている方法を使用すること
ができ、治療すべき状態により異なる(例えば敗血症シ
ョックの場合は静脈内に、リウマチ様関節炎の場合は、
例えば膝に局所注射で、又は注入により連続的に投与さ
れる)。この組成物はまた、過剰量のTNFの外因性の投
与によるTNF中毒に使用することもできる。該組成物はT
NFを含有してもよく、この場合TNFは長期にわたって調
節された速度で放出される。
して許容される担体、安定化材、賦形剤と混合し、服用
される形(例えば服用バイアル中で凍結乾燥)で、投与
用に調製される。投与される活性化合物の量は、投与方
法、治療すべき疾患、及び患者の状態により異なる。リ
ウマチ様関節炎の炎症性状態で局所投与に使用する量
は、敗血症ショックで静脈内注入する量より、体重当り
の量は少なくてすむ。
ットルの尿のプールを、孔径0.45μmのペリコン(Pell
icon)膜でマイクロ濾過した。分子量カットオフが10kD
aのペリコン(Pellicon)膜を用いて濾液を限外濾過
し、最終液量を500mlとした。1mMのベンズアミジンと0.
1%のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食
塩水で濃縮物を透析した。
ティ精製 組換えてTNF−αを7.2mg/mlにした後、0.02%のアジ
化ナトリウムを含むPBSと平衡化させ、アフィゲル10
(3.6から0.5mlのビーズ)に結合させた。段階1.1の尿
蛋白の濃縮試料250mlを、4゜で流速0.2−0.3ml/分で、
TNFを固定したビーズから作成したカラムにかけた。PBS
で洗浄して結合しなかった蛋白を除去し、次に25mMクエ
ン酸、100mM Nacl、0.02のアジ化ナトリウムの溶液(pH
2.5)を流して、結合した蛋白を溶出させた。溶出した
蛋白の特異的生物活性(TNF毒性の阻害)は、尿の粗蛋
白の約200倍であった(表1)。SDS−PAGE分析では溶出
液中のほとんどの蛋白は、見かけの分子量約30,000±2,
000の単一の広いバンドとして移動した。
(Aquapore)RP300カラム(4.6×30mm、ブラウンリーラ
ボズ(Brownlee Labs))の逆相高速液体クロマトグラ
フィーでさらに分画した:0.3%トリフルオロ酢酸水溶液
(緩衝液F)でまず平衡化させた後、フルオレスカミン
検出系で安定なベースラインが得られるまで洗浄した。
段階1.2のアフィニティTNFカラムから溶出した活性画分
のプールをこのカラムにかけ、緩衝液F中のアセトニト
リルの直線濃度勾配を用いて0.5mg/mlの流速で3分間溶
出させた後、80%アセトニトリルでカラムを15分間洗浄
した。0.5mlの画分を集め、図1に示すように蛋白含量
(−)、生物活性(■)について調べた(…は緩衝液F
中のアセトニトリルの濃度勾配による溶出を示す)。
活性を測定した。これはシクロヘキシミド(CMI)感作
細胞に対するTNFの細胞毒性作用と、ニュートラルレッ
ド摂取法(neutral−red uptake method)(ディー・ワ
ラシュ(Wallach,D.)、ジャーナルオブイミュノロジー
(J.Immunol.)第132巻、2464−2469頁(1984年))に
よる定量法に基づく。これは本発明においてTBP−IIの
活性を追跡するのに使用される。
の改変イーグル最小基本培地(Dulbecco's Modified Ea
gle's Minimal Essential Medium)(DMEM)で連続的に
2倍希釈し、40U/mlのTNF−αと400μg/mlのシクロヘキ
シミド(CMI)を含有する同じ培地を等量加えた。細胞
に対するTNF−αの最終濃度は、5U/mlでCHIのそれは50
μg/mlであった。
MEM−CS(5%ウシ胎児血清と5%子ウシ血清を含むDME
M)と共にマウスA9細胞を添加した(ウェル1個当り1.5
×104個の細胞)。
各ウェルに入れ、細胞をさらに14時間インキュベートし
た。
て、過剰の色素を洗い流し、ソレンセン(Sorensen)の
クエン酸緩衝液−エタノール混合液で細胞が取り込んだ
ニュートラルレッドを抽出し、これをマイクロエライザ
オートリーダーで570nmで比色定量した。
与える希釈率を、1U/mlのTNF阻害活性と定義した。
ル(TBP−I)と約31%のアセトニトリル(TBP−II)に
対応する画分に2つの明瞭な蛋白のピークとして、HPLC
カラムから溶出されることが明らかになった。両方の蛋
白ともTNF毒性に対して防御効果があったが、TBP−IIの
非活性はTBP−Iの非活性よりも低かった(表1)。
ジャーナルオブヘマトロジー(Eur.J.Hematol.)第42
巻、270−275頁(1989年))に従い、放射標識TNFの細
胞への結合に対するTBP−IIの阻害効果について調べ
た。TBP−Iと同様に、TBP−IIは125I−TNF−αと共に
細胞に適用した時のみ125I−TNF−αの細胞への結合を
減少させ、TBP−IIをまず細胞に適用しTNF−αの適用前
に除去した時は効果がなかった。これは、細胞へのTNF
−αの結合の阻害はTBP−IIの細胞への作用によるもの
ではなく、TBP−IIとTNF−αのなんらかの相互作用を反
映するものであることを示している。
−IとTBP−IIの結合活性について調べた。いずれもTNF
−αに結合し、この結合は過剰量のTNF−αで競合さ
れ、効率は低いがTNF−βとも競合した。しかしこれは
試験した他のいくつかのサイトカイン(Il−1、Il−
6、IFN−ガンマ、表2)とは競合しなかった。
ー(Nature)第227巻、680頁(1970年))の方法に従
い、精製の結果を追跡するために、ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を
行った。図2Aでは、アフィニティ精製段階の還元条件下
での分析結果が示してある:レーン1−末分画尿性蛋
白;レーン2−低pH緩衝液によりTNFカラムから溶出し
た蛋白。図2Bでは、逆相高速液体クロマトグラフィーか
ら溶出する活性画分の還元条件下での分析結果が示して
ある。試料を、6%SDS(W/V)と15%V/Vβ−メルカプ
トエタノールを含有する3×濃縮試料用緩衝液と混合
し、12%アクリルアミドゲルにかけた(レーン1−4:TB
P−I:レーン5−9:TBP−II)。分子量の標準品として分
子量マーカーの混合物(αラクトアルブニン14.4kDa、
大豆トリプシンインヒビター20.1kDa、カルボニックア
ンヒドラーゼ30kDa、オバルミン43kDa、ウシ血清アルブ
ミン67kDa、ホスホリラーゼb 94kDa)を使用した。試料
用緩衝液のブランクをレーン10に入れた。ゲルに160ボ
ルトの電圧をかけ、蛋白バンドを銀染色により視覚化し
た(ビー・アール・オークレイ(Oakley,B.R.)ら、ア
ナリティカルバイオケミストリー(Anal.Biochem.)第1
05巻、361頁)。
g、各50−200pmol)を、前処理した、ビオブレン(bio
bene)−被覆ガラスファイバーディスクに適用した。乾
燥ディスクを、オンラインHPLC PTH−アミノ酸分析機
(モデル120)とデータ取得処理装置モデル900を備えた
自動パルス化液体気体相マイクロシークエンサー(モデ
ル475)(いずれもアプライドバイオシステムズ社(App
lied Biosystems Inc.)、フォスター(Foster)市、カ
リフォルニア、米国)中で、反復サイクルエドマン分解
を行った。コンピュターより得られた配列を生データと
比較し、必要な場合は補正した。配列データを確認する
ために全部で3回異なる実験を行った。最初の収率は40
%以上であり、調製物中の主要蛋白(30kDaバンド)は
得られた配列に関連していることを示していた。
列が得られた: と、より多量のアミノ酸3個分短い配列: そしてさらに多量の、末端アミノ酸が2個欠如した配列 一方画分28では、配列、Val−Ala−Phe−Thr−Pro
−...が主要なものであり、さらに低濃度で短い配列Phe
−Thr−Pro−...が、そしてさらに低濃度で配列Thr−Pr
o−...が得られた。
の切れ方の最も少ない配列は以下のものであった: 実施例2:TBP−IIのトリプシン分解ペプチドの調製 精製TBP−II(180μg)をピー・シー・アンドリュー
スとジェイ・イー・ディクソン(Andrews,P.C.and Dixo
n,J.E.)の方法(アナリティカルバイオケミストリー
(Anal.Biochem.)第161巻、524−528頁(1987年))に
従い、還元しアルキル化した。次に還元アルキル化試薬
の残渣を除去するためにアクアポア(Aquapore)RP300
カラム(実施例1.3を参照)にかけた。次に精製TBP−II
を、pH8.0でトリプシンで一晩消化(基質/酵素比は20:
1)して断片化した。得られたペプチドをC−18シンク
ロパック(SynchropakR)RP−Pカラムの逆相高速液体
クロマトグラフィーで精製した。画分44,50,53,53′,6
0,84の6個のペプチド配列を、実施例1.5のように決定
し、それを図3に示してある。
懸濁液として20μgのTBP−IIを皮下に注射した。3週
後、不完全フロイントアジュバントの懸濁液としてもう
一度筋肉内に注射し、次に1週置きにPBSの溶液として
2回皮下に投与した。最後の免疫後10日後にウサギを放
血させた。
10mlの血清に飽和硫酸アンモニウムを最終濃度が50%飽
和になるように加えた。4℃で一晩インキュベート後、
遠心分離により免疫グロブリンを沈澱させた。ペレット
を50%飽和硫酸アンモニウムで2回洗浄した後、0.02%
のアジ化ナトリウムを含有する10mMホウ酸ナトリウム
(pH9)で可溶化させた。次に溶液をホウ酸アザイド溶
液で充分透析した。そしてこれをHPLCモノーQカラムで
クロマトグラフィーをして、上記ホウ酸アザイド溶液中
の0−500mM Naclの濃度勾配により、蛋白を溶出した。
免疫グロブリンは塩濃度約70mM NaClで溶出した。
に対する125I−TNFの結合を約50%抑制した。同じ条件
でウサギでTBP−Iの抗血清を産生させ、ウェスタンブ
ロット分析により両抗血清の交差反応性を調べた。その
結果TBP−IとTBP−IIは免疫学的に異なっていた:各抗
血清は、抗血清の作成に使用したTBPのみを有意に認識
した。
BP−Iの抗血清は1:25,000までの希釈でTBP−Iと反応
するが、TBP−IIとは1:100の希釈でも反応しなかった。
図4はTBP−IとTBP−IIの抗血清の2つのTBPに対する
結合のELISAの結果を示している。TBP−Iに対するTBP
−I抗血清の結合( )TBP−IIに対するTBP−I抗血清
の結合( )、TBP−Iに対するTBP−II抗血清の結合
( )、TBP−IIに対するTBP−IIの抗血清の結合( )
を、西洋ワサビペルオキシダーゼ定量法の着色生成物の
吸光度で示してある。BSAで被覆したウェルに抗体を適
用した対照試験の読みを引いてある。(図2で見られる
TBP−Iに対するTBP−II抗血清の若干の結合は、免疫に
使用したTBP−IIの調製物中に少量のTBP−Iが存在して
いたことによる、少量のTBP−I抗血清による抗血清の
汚染に起因していることが証明されるであろう。) 実施例4:TNFの細胞への結合に対するポリクローナル抗
体の影響 TBP−IとTBP−IIに対する抗血清を、0.5%BSAと0.1
%のアジ化ナトリウムを含有するダルベッコーのバラン
ス塩溶液(PBS+)(PBS/BSA)で希釈した後、直接、又
は競合実験でTBPの試料と共にインキュベートした後、H
ela、MCF7、K562及びU937細胞株の試験細胞に2時間適
用した。次に細胞を洗浄しTNFの結合について調べた。
の結合に対する、TBP−I(○)とTBP−II(□)の抗血
清による阻害を示している。抗血清が存在しない場合の
真の結合(100%)はU937細胞は2500cpm、K562細胞は15
00cpm、Hela細胞は2400cpm、MCF7細胞は1100cpmであっ
た。この結果はTBP−IとTBP−IIの抗血清はTNFの細胞
への結合を妨害し;それぞれ細胞株により程度が異なる
ことを示している。TBP−Iに対する抗血清はHela細胞
とMCF7細胞に対するTNFの結合を有効に阻害するが、TNF
のU937細胞への結合には全く効果がなく、TNFのK562細
胞への結合にはほとんど効果がない。逆にTBP−IIの抗
血清はK562細胞とU937細胞に対TNFの結合を有効にブロ
ックするが、Hela細胞とMCF7細胞へのTNFの結合は高濃
度でのみ阻害する。後者の細胞に対するTBPの抗血清の
効果は、血清に純粋のTBP−Iと純粋のTBP−IIを加える
競合実験で、TBP−IIの抗血清調製物中のTBP−Iに対す
る抗体の汚染に起因することが証明できた。
抗体の産生 完全フロイントアジュバントの懸濁液として1μgの
精製TBP−IIを、メスのBALB/Cマウス(8週令)の後ろ
足に注射し、3週後不完全フロイントアジュバントで背
中の皮下に注射した。別にPBS中で皮下に1週置きに別
の注射をした。PBS中9.0μgのTBP−Iで融合する前4
日(i.p.)と3日(i.v.)に最後の追加免疫を行った。
脾臓と融合パートナーとしての後ろ足の局所リンパ球か
ら調製したNSO/Mr細胞とリンパ球を使用して融合を行っ
た。HAT、15%ウマ血清及び2μgのゲンタマイシンを
加えたDMEMでバイブリドーマを選択した。TBP−Iの抗
血清を産生するハイブリドーマを限界希釈法でサブクロ
ーニングし、腹水産生のためにプリスタン(pristane)
でプライムしたBALB/Cマウスに注射した。硫酸アンモニ
ウム沈澱(50%飽和)により免疫グロブリンを単離した
後、0.02%のアジ化ナトリウムを含有するPBSで透析し
た。SDS−PAGE分析とクマシーブルー(Commassie blu
e)による染色で推定した純度は約60%であった。抗体
のイソタイプは市販のELISAキット(アマーシャム社(A
mersham)、英国)を用いて規定した。
析するためにサブクローニングした。単離したいくつか
のサブクローンのイソアイプと逆RIAでのTBP−IIの結合
を表3に示す。
スツール研究所のコレクションナショナナール・ド・ク
リティール・ド・ミクロオルガニスム(Collection Nat
ionale de Curtures de Microorganismes,CNCM)(リ・
ド・ドクテールル、75724パリ、CEDEX15、フランス(2
5.ru du Docteur Roux,75724 Paris cedex 15,Franc
e)、1990年3月12日、寄託番号はそれぞれI−929とI
−928)に、ブダペスト条約に基づき国際寄託した。
量法(iRIA) 免疫したマウスの血清中の抗TBP抗体の濃度を推定す
るためと、ハイブリドーマによる抗体の産生をスクリー
ニングするために、この測定を行った。アフィニティ精
製したヤギ抗マウスF(ab)免疫グロブリン(バイオマ
コール(Biomakor)、イスラエル、0.02%アジ化ナトリ
ウムを含有するPBS中10μg/mg)で、PVC 96穴マイクロ
タイタープレート(ダイナテック社(Dynatech)、1−
220−25)を、4℃で12時間被覆した後、0.05%ツイー
ン20(シグマ社)と0.02%のアジ化ナトリウムを含むPB
S中の0.5%BSA(ブロキング緩衝液)で、37℃で2時間
ブロックした。次に0.05%ツイーン20と0.02%のアジ化
ナトリウムを含むPBS(洗浄用緩衝液)で3回洗浄し
た。連続希釈した血清試料とハイブリドーマ増殖培地の
試料(50μ)を37℃で2時間添加した。洗浄用緩衝液
でプレートを洗い、穴に125I標識TBP−I(ブロッキン
グ緩衝液中10000CPM)を加えた。37℃でさらに2時間イ
ンキュベートした後、プレートを洗浄し各穴に結合した
標識物の量をガンマカウンター中で測定した。
P−II抗体の使用 以下の方法に従い、アフィニティクロマトグラフィー
になるTBP−IIの精製のために、TBP−IIに対する抗体が
使用できる。固相放射免疫定量法で放射標識抗原の結合
量を試験することにより、アフィニティクロマトグラフ
ィー用のモノクローナル抗体が選択できる。すべてのハ
イブリドーマの腹水を、50%飽和で硫酸アンモニウム沈
澱した後、PBSで充分透析しで精製した。PVC 96穴プレ
ートを精製したモノクローナル抗体で被覆し、0.5%BS
A、0.05%ツイーン20(シグマ社)と0.02%のアジ化ナ
トリウムを含むPBSでブロッキングの後、ウェル(穴)
を50,000CPM125I−TNFを用いて37℃で2時間インキュベ
ートした。次にプレートを洗浄し、各ウェルに結合した
放射能をガンマカウンターで測定した。結合能の最も高
い抗体について免疫アフィニティクロマトグラフィーで
性能を調べた。
て抗体を固定した。半精製した免疫グロブリンを濃縮
し、ウィルシェックとミロン(Wilchek and Miron)の
方法(メソッズインエンザイモロジー(Methods in Enz
ymology)第34巻、72−76頁(1979年))で樹脂に結合
させた。この実験でTBP−I(クローン16,20,34)に対
する3種類のモノクローナル抗体を試験した。1mlベッ
ドの抗体カラムを作成した。使用前に溶出緩衝液でカラ
ムを10回洗浄した(毎回洗浄後にPBSで中和した)。次
にカラムに0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS中の濃
縮尿蛋白120mlをかけた。カラムの流速は毎分0.2から0.
3mlに調節した。次に下を50mlのPBSで洗浄した後、50mM
クエン酸、pH2.5、100mM Nacl、0.02%のアジ化ナトリ
ウムを含有する溶液で溶出した。1mlの画分を集めた。
のせた尿蛋白、洗浄後の最後の部分(1ml)を取って、
蛋白濃度と、バイオアッセイによるTBP−IIの活性を調
べた。ヒドラジドアガロースに結合した前後の蛋白の測
定から、カラムに結合した免疫グロブリンの両派7から
10mg/mlアガロースの範囲であった。全ての蛋白の測定
は、100μgBSA/mlを含有する標準溶液と比較してマイク
ロフルオレスカミンの方法で行った。(エス・スタイン
とジェイ・モシェラ(Stein,S and Moschera,J)、メド
ッズインエンザイモロジー(Methods in Enzymology)
第79巻、7−16頁(1981年) 実施例8:抗TBP−II抗体を用いるTBP−IIの測定 健常人、癌患者、全身性エリテマトーデス患者そして
妊娠満期の妊婦の血清中のTBP−IIの濃度を、TBP−IIの
モノクローナル抗体を被覆したプレートを用いるELISA
で測定した。各試料50μを添加し、37℃で2.5時間イ
ンキュベートした後、ウェルをPBS、0.05%ツイーン2
0、0.02%のアジ化ナトリウムで洗浄し、ウサギ抗TBP−
IIポリクローナル抗体を37℃で2.5時間加えた。次にウ
ェルを洗浄し(アジ化ナトリウムなし)、ヤギ抗ウサギ
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を2時間加えた。
このインキュベート、洗浄の後、ABTS緩衝液を加え、30
分後600nmで光学密度(O.D.)を測定した。
度は、1.48±0.46ng/mlである。
濃度は、4.04±3.75ng/mlであり、正常値と比べて高度
に有意であった(p<0.001)。SLE患者46人のうち29人
はTBP−II値が正常値+2SDより高かった。われわれはTB
P−II濃度とディー・ピー・エム・シモンズの開発した
疾患活性インデックス(クオータリージャーナルオブメ
ディシン(Quarterly J.of Med.)第69巻、927−937頁
(1988年))の間に高度に有意の相関があることを見い
だした:r=0.62,p<0.001。TBP−IIとSLE活性の古典的
マーカーである、抗DNA抗体との間(r=0.64,p<0.00
1)にも、またSLE活性の主要な臨床症状である関節痛と
TBP−IIの間(r=0.54,p<0.001)にも同様の相関が見
られた。
ーカーとして、そしてSLE患者の病状の悪化の予知でき
るものとして使用可能であり、従ってSLEの患者や対す
るの自己免疫疾患の患者の免疫活性度を測定するのに有
用である。
濃度を調べた。種々の癌患者34人のうち20人(58.8%)
でTBP−II濃度は正常値±2SDの外であった。癌患者(4.
16±0.83ng/ml)と健常人(1.48±0.46ng/ml)のTBP−I
Iの差は統計的に高度に有意であった(P<0.001)。
遍的なマーカーであり、癌の早期検出に応用できること
を示唆している。癌切除語TBP−II濃度の標準化は疾患
の治療のマーカーになり得る。最初の標準化の後のTBP
−IIの増加は、疾患再発の早期及び感度の高い普遍的マ
ーカーである。
±0.96ng/ml)は16人の血圧正常の婦人(1.58±0.52ng/
ml)よりTBP−IIが統計的に有意に高かった(P<0.00
1)。
ため以下の実験を行った: FS11繊維芽細胞(9回継代培養)を最初の濃度10000
細胞/ウェルでマイクロウェル(96穴プレート)中で培
養した。24時間後一定濃度(5ng/ml)のrTNFと異なる濃
度のTBP−II(3から10ng/ml)を各ウェルに加えた。対
照ウェルにはTNFは加えず、培地、rTNFのみ、又は各TBP
−II濃度液を加えた。培養7日後に細胞の上清を集め、
残存TNF細胞毒性作用と残存TBP−IIの測定のために直ち
に−20℃に凍結した。上清を除去した後FS11プレートH3
−ミチジンを8時間加え、「ツイーン」プレートにはニ
ュウートラルレッドダイを加えた。
在下でTBP−II濃度が増加していく場合、繊維芽細胞の
増殖は有意に上昇する(ニュウートラルレッドダイ摂
取、又はH3−チミジン取り込み(F)により測定)こと
を示している。凍結FS11上清のバイオアッセイ(A9マウ
ス細胞株)による残存TNF細胞毒性の測定結果は、残存
細胞毒性はTBP−II濃度の増加に平衡しており(E)、T
BP−IIがこの系におけるTNF分解を防いでいることを示
唆している。
各対照を異なるプレートの培養FS11繊維芽細胞に2時
間、2、5、7、9日間加えた。次に上清を除去し直ち
にTNF細胞毒性を測定した。
ものの2時間目に0.6ngのみが生物活性があり、残りはT
BP−IIに結合され中和された。しかし2日と9日の間は
rTNF「単独」では生物活性を急速に失ったが、TBP−II
の存在下におけるrTNFの細胞毒性は10倍高かった。即ち
TBP−IIは最初高TNF濃度を中和したが、残りの生物活性
TNFがその生物活性を加速的に失うのを防いだ。これら
の結果はTBP−IIはTNFに結合してその天然の分解又は活
性の喪失を防ぐため、TNFの有益な作用を延長させる担
体として有用であることを示している。
交差競合分析によるTBP−IIのエピトープマッピング PVC 96穴マイクロタイタープレートをTBP−IIに対す
る精製したモノクローナル抗体(25μg/ml)で前述した
ように被覆した。洗浄とブロッキングの後、TBP−IIに
対する同じか又は異なるモノクローナル抗体(1μg/m
l)でプレインキュベートした125I標識TBP−II(100,00
CPM/ウェル)の試料をウェルに入れた;プレートは4℃
で一晩インキュベートし、洗浄し各ウェルに結合した放
射能をガンマカウンティングで測定した。結果は対照値
(競合モノクローナル抗体がない場合のTBP−IIの結
合)のパーセントとして表示してある。
行と左側の列にクローン番号で示してある。結合パーセ
ント値が低いものは、2つの抗体がTBP−IIの各エピト
ープに競合し、この値が高いものはエピトープが異なる
ことを示している。非競合抗体にはドブルサンドイッチ
ELISAが適当である(例えばクローン13とクローン7
0)。
性TNF結合蛋白の溶出パターンを示す。 第2図は、分析結果を示す写真であり、TBP−IとTBP−
IIの粗調製物と精製物のSDS−PAGE分析の結果を示す。 第3図は、TBP−IIのいくつかのトリプシン分解ペプチ
ドの配列を示す。 第4図は、2種のTBPについて、TBP−IとTBP−IIに対
する抗血清の結合のELISAを示す。 第5図は、TBP−IとTBP−IIに対する抗血清による、異
なる細胞株に対するTNFの結合の阻害を示す。 第6図は、健常人及び全身性エリテマトーデス(SLE)
患者の血清中のTBP−II濃度を示す。 第7図は、線維芽細胞のスティムレーター(刺激物)と
してのTNFの有益な作用を長期間維持させることに対す
る、TBP−IIの異なる濃度の影響を示す。 第8図は、TNFの生物活性に対するTBP−IIの効果の経時
的影響を示す。
Claims (6)
- 【請求項1】腫瘍壊死因子(TNF)結合蛋白II(TBP−I
I)であって、 (a) TNFの細胞毒性作用を阻害する、及び/又はそ
の有益な作用を長期間維持する; (b) 以下のアミノ酸配列 Thr−Pro−Tyr−Ala−Pro−Glu−Pro−Gly−Ser−Thrを
含む; (c) 実質的に精製された形態である; (d) 逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で単
一のピークとして移動する; 及び (e) ヒト由来である; という特徴を有するTNF結合蛋白TBP−II、その塩、その
官能基誘導体、その前駆体、TNFの細胞に対する細胞毒
性作用を阻害する及び/又はその有益な作用を長期間維
持する能力を有するその活性画分、及びこれらの混合
物。 - 【請求項2】実質的に精製された蛋白をSDS−PAGEによ
り還元化条件で分析するとき、約30kDaの分子量を有す
る、特許請求の範囲第1項に記載のTNF結合蛋白TBP−I
I。 - 【請求項3】マウスA9細胞に対するTNF−αの細胞毒性
作用を阻害する能力を有する、特許請求の範囲第1項又
は第2項に記載のTNF結合蛋白TBP−II。 - 【請求項4】下記のアミノ酸配列: 又はその末端が切れた形態を有する、特許請求の範囲第
1項から第3項のいずれかに記載のTNF結合蛋白TBP−I
I。 - 【請求項5】実質的に精製されたTNF結合蛋白TBP−IIの
単離法において; (a) ヒトの尿の透析濃縮物から粗蛋白画分を回収
し; (b) 段階(a)の粗蛋白画分を、TNFを固定したカ
ラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけ
て、TNF結合蛋白の精製されたTNFの細胞毒性作用を阻害
する能力により規定される活性画分を得て; (c) 段階(b)のTNF結合蛋白の精製された活性画
分を、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にかけ
て、TNF結合蛋白の実質的に精製された、TNFの細胞毒性
作用を阻害する能力により規定される活性画分を得て; (d) 段階(c)の実質的に精製されたTBP−II蛋白
であって、SDS−PAGEにより還元化条件で分析すると
き、約30kDaの分子量を有し、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーでアセトニトリル約31%に相当する画分で単一
のピークとして移動し、TNFの細胞毒性作用を阻害する
能力を有し、以下のアミノ酸配列Thr−Pro−Tyr−Ala−
Pro−Glu−Pro−Gly−Ser−Thrを含むTBP−II蛋白を回
収することよりなる上記方法。 - 【請求項6】特許請求の範囲第5項に記載の方法により
生産される、特許請求の範囲第1項から第4項のいずれ
かに記載のTNF結合蛋白TBP−II。
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