JP2804237B2 - 組換えリンホトキシンをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術的背景 本発明はリンホカイン類をコードするＤＮＡに関するも
のである。更に詳しくは、本発明はリンホトキシンおよ
びその誘導体をコードするＤＮＡに関するものである。
リンホトキシンは当初、新生細胞系統(ネオプラスチッ
ク・セルライン)に対して抗細胞活性を有する生物学的
因子として確認された。ミトゲン刺激−リンパ細胞から
得られ、リンホトキシンと命名された活性体は、ある種
の腫瘍細胞系統に対する細胞抑制作用から、他の形質転
換細胞に対する著しい細胞溶解作用に至る範囲の細胞毒
活性スペクトルを有する。しかしながら、リンホトキシ
ン活性は、一次細胞培養および正常な細胞系統に関する
試験では、殆どまたは全く、抗細胞活性を示さないとい
う特徴を有する。この様に、リンホトキシンは識別性の
ある抗細胞特性を有すると予測されることから、リンホ
トキシンが強力な抗腫瘍活性を有しているかも知れない
ことを示唆するインビボ実験が行われる様になった。

【０００２】リンホトキシンという語句は一連の分子の
呼称に用いられてきた。リンホトキシン分子は、分子量
に基づいて５つのクラスに分けられる糖蛋白質類であ
り、各クラスはその電荷に関してヘテロジーニアス(異
質)である。ヒト−アルファ(ＭＷ７０−９０,０００)お
よびベータ(ＭＷ２５−５０,０００)クラスのものは、
ほとんどのリンパ球上澄液中に優勢に存在している様で
ある。このアルファＭＷクラスは電荷に基づいて少なく
とも７つのサブクラスに分けることができるが、ベータ
クラスは２つの明確に区別し得るサブクラスに分けられ
ている[Ｇ．グランガー(Ｇranger)ら、モーゼ(Ｍozes)
ら編、１９８１、セルラー・レスポンスイズ・トウ・モ
レキュラー・モジュレーターズ(Ｃelluler Ｒesponses
to Ｍoleculer Ｍodulators)pp２８７−３１０]。
更に、コンプレックス(ＭＷ＞２００,０００)およびガ
ンマ(ＭＷ１０−２０,０００)リンホトキシン形も確認
されている。様々なリンホトキシン形やクラスは、安定
性や培養中の出現動力学において互いに異なっている。
さらに、それらは低イオン強度条件下にコンプレックス
・クラスのものと凝集することもある。リンホトキシン
の内、低分子量クラスのものは高分子量クラスのものに
比べて比較的不安定であり、細胞溶解作用が弱いとされ
ている[ヒセロット(Ｈiserodt)ら、１９７６、“セルラ
ー・イムノロジィ(Ｃell．Ｉmmun．)"２６:２１１;グラ
ンガー(Ｇranger)ら、ドウエック(Ｄe Ｗeck)ら編、１
９８０、バイオケミカル・キォラクタリゼイション・オ
ブ・リンホカインズ(Ｂiochemical Ｃharacterization
of Ｌymphokines)pp２７９−２８３]。ガンマ・クラ
スは不安定なので、その活性について広範な研究はなさ
れていない[Ｇ．グランガーら、１９７８“セルラー・
イムノロジィ"３８:３８８−４０２]。ベータ・クラス
も不安定であると報告されている[ウォーカー(walker)
ら、“ジャーナル・オブ・イムノロジィー(Ｊ．of Ｉm
mun．)"１１６[３]:８０７−８１５[１９７６、３
月]]。

【０００３】リンホカインに関する用語は一定でないこ
とを理解しておく必要がある。今日では、細胞培養産物
に対する命名は、この産物を生成すると思われる細胞、
および生物学的分析における該産物の示す性質に基づい
てなされている。しかしながら、大多数の研究が部分的
に純粋な標品を使用しており、また、産物を特徴づける
ために採用された分析法が分子特異的でないために、十
分な特徴づけがなされているとは言えず、いずれにして
もかなり変動しやすい。種々の細胞毒性因子類の真の同
定は、アミノ酸配列や免疫エピトープ(抗原決定基)の如
き明確に分析し得る識別可能な特性に基づいた標準的な
用語がないとわからないままにおかれることになるであ
ろう。細胞毒性を有する細胞培養産物に付されたその他
の名称としては、例えば、腫瘍壊死因子、ＮＫ細胞細胞
毒性因子、出血性壊死因子およびマクロファージ細胞毒
素またはマクロファージ細胞毒性因子を挙げることがで
きる。

【０００４】同時係属出願のＵ．Ｓ．Ｎ．６０８,３１
６(１９８４年５月７日出願)、およびＥＰ１００,６４
１Ａ(１９８４年２月１５日公開)には、ヒト−リンパ芽
球(様)細胞系統(セルライン)ＲＰＭＩ−１７８８から単
離されたヒト−リンホトキシンのアミノ酸配列が示され
ている。

【０００５】ハヤシらは、ウサギの細網内皮系を刺激し
た後、該ウサギから単離されるタンパク質について述べ
ている(ＥＰ１３２,１２５Ａ、１９８５年１月２３日公
開)。このタンパク質は抗腫瘍活性を有し、そのＮ−末
端アミノ酸配列は、式:Ｓer−Ａla−Ｓer−Ａrg−Ａla
−Ｌeu−Ｓer−Ａsp−Ｌys−Ｐro−Ｌeu−Ａla−Ｈis−
Ｖal−Ｖal−Ａla−Ａsn−Ｐro−Ｇln−Ｖal−Ｇlu−Ｇ
ly−Ｇln−Ｓer−Ｔrp−Ｌeuで示されることを報告して
いる。

【０００６】また、同時係属出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６
２８,０５９(１９８４年７月５日出願)には、腫瘍壊死
因子として確認され、式:Ｖal−Ａrg−Ｓer−Ｓer−Ｓe
r−Ａrg−Ｔhr−Ｐro−Ｓer−Ａsp−Ｌys−Ｐro−Ｖal
−Ａla−Ｈis−Ｖal−Ｖal−Ａla−Ａsn−Ｐroで示され
るＮ末端アミノ酸配列を有する細胞毒性活性を持ったヒ
ト−ポリペプチドの精製およびその組換え合成法が開示
されている。

【０００７】オオニシらは、ＢＡＬＬ−１細胞培養か
ら、ヒト−腫瘍細胞の増殖を抑制し、Ａla−Ａla Ｎ末
端を有する７−９１０００ＭＷの物質(ＣＢ×３と命名)
を得たことを開示している(アメリカ特許第４,４８１,
１３７号)。

【０００８】トスおよびグランガー(Ｔoth and Ｇran
ger)[“モレキュラー・イムノロジィ(Ｍol．Ｉmmun．)"
１６:６７１−６７９(１９７９)]によると、ノイラミノ
ダーゼ処理によってリンホトキシン含有リンパ球上澄液
からシリアル酸を除去しても、あるいは該上澄液にＮ−
アセチル−グルコサミン、ガラクトース・ラクトース、
マンノース、α−メチルマンノシッドまたはフコースを
加えても、インビトロでの細胞溶解活性になんら影響を
及ぼさないことが報告されている。従って、トスらは、
単糖類がこれらのリンホトキシン活性に寄与していると
は思われないと結論している。しかしながら、トスらは
また、他のリンホカイン類の作用には糖類が重要な役割
を果たしていることを観察しており、従って、それら糖
類がリンホトキシンの細胞毒性において、より複雑なオ
リゴ糖の形で関与している、という説を排除し得ない、
と結論している。

【０００９】次いで、プロクター(Ｐroctor)、クロスタ
ーガード(Ｋlostergaard)およびグランガー(Ｇranger)
は、ツニカマイシン(tunicamycin)の存在下(Ｎ−結合炭
水化物部分がリンホトキシン分子に付加されるのを避け
るため)、ＰＨＡでヒト−リンパ球を刺激すると、生物
学的に不活性なリンホトキシンが放出される、というこ
とを報告している(“クリニカル・リサーチ(Ｃlinical
Ｒesearch)"、１９８２、３０(１):５５Ａ)。彼らはま
た、免疫化学的研究により、リンホトキシンの炭水化物
部分は、活性化されたリンパ細胞からその上澄液中への
リンホトキシンの移送および放出、にとって必須の部分
ではないが、該炭水化物部分は、リンホトキシン分子
(類)が適切な立体配座をとるのに寄与していることか
ら、標的細胞を効果的に破壊する上では必須の部分であ
る、ということを明らかにした。

【００１０】本発明との関係において検討されるべき他
の文献には、エバンス(Ｅvans)、“カンサー・イムノロ
ジィ・アンド・イムノセラピイ"１２:１８１−１９０
(１９８２);リー(Ｌee)ら、“セル・イムノロジィ"４
８:１６６−１８１(１９７９);ドウエック(Ｄe Ｗeck)
ら編(１９８０)、バイオケミカル・キャラクタリゼーシ
ョン・オブ・リンホカインズpp２７９−３１２;カーン
(Ｋhan)ら編(１９８２年６月３０日)ヒューマン・リン
ホカインズ(Ｈuman Ｌymphokines)pp４５９−４７７;
アガーワル(Ａggarwal)ら、第３回国際リンホカイン学
会[(ハバーフォード(Ｈaverford)、ＰＡ．にて、１９８
２年８月１日〜５日)]における発表;ランソム(Ｒansom)
ら、“カンサー・リサーチ"４３:５２２２−５２２７
(１９８３年１１月);カル(Ｋull)ら、“ジャーナル・オ
ブ・イムノロジィ"１２６(４):１２７９−１２８３(１
９８１年４月);Ｊ．サワダら“ジャパン・ジャーナル・
オブ・エクスペリメンタル・メディソン(Ｊpn．Ｊ．Ｅx
p．Ｍed．)"４６:２６３−２６７(１９７６):Ｇ．グラ
ンガーら、“セルラー・イムノロジィー"３８:３８８−
４０２(１９７８);Ｊ．ランデル(Ｊ．Ｒundell)ら、
“イムノファーマコロジイ(Ｉmmunopharmacology)"３:
９−１８(１９８１);Ｇ．グランガーら“ジャーナル・
オブ・リンホカイン・リサーチ(Ｊ．Ｌymphokine Ｒe
s．)"１:４５−４９(１９８２);Ｎ．ラッデル(Ｎ．Ｒud
dle)ら、“リンホカイン・リサーチ(Ｌymphokine Ｒe
s．)"２:２３−３１(１９８３);Ｍ．ミツハシら(イギリ
ス特許出願第２,１０６,１１７号);Ｈ．エノモト(ヨー
ロッパ特許出願第８７,０８７Ａ号);Ｂ．ウイリアムソ
ン(Ｂ．Ｗilliamson)"ら、“Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ"
８０:５３９７−５４０１(１９８３)およびＳ．ライト
(Ｓ．Ｗright)ら、“ジャーナル・オブ・イムノロジィ
ー"１２６:１５１６−１５２１(１９８１)が含まれる。

【００１１】これまでにリンパ球培養物から得られたリ
ンホトキシン(またはリンホトキシンであると同定され
た物質)は、ＲＰＭＩ−１７８８細胞または一次リンパ
細胞の上澄液中に０．０５−２×１０⁶単位／l程度の低
濃度で含まれているにすぎない。収穫量にはかなりの開
きがあり、また一次リンパ細胞は高価である。従って、
リンホトキシンの経済的な製造方法が求められている
(ヤマモトら、“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
レスポンス・モディファイヤース(Ｊ．of Ｂiological
Ｒesponse Ｍodifiers)"３:[１]７６−８７[１９８
４])。

【００１２】また、先行技術は、薬物の有用性にとって
重要な点である。アミノ酸配列に関してホモジーニアス
(均質)なリンホトキシンを得ることに成功を収めていな
い。細胞系統(セルライン)の培養物から回収されたリン
ホトキシンは、多分タンパク質分解的なプロセッシング
に起因して、そのアミノ末端が不均質である(前記Ｕ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０８,３１６参照)。一次リンパ細胞
(例、アデノイドまたは末梢血液から得たもの)の培養物
は、経済上の理由から、必然的に様々な供給源の細胞を
含有することになる。しかしながら、これらの細胞の産
物は供給源間の遺伝的な変動を反映しているので、得ら
れた“リンホトキシン"は事実上、アレイック(対立遺伝
子)性の種(species)の混合物となる。その様なアレル
(対立遺伝子)の比率を知り、同定することは、ロットご
とに異なるので、明らかに不可能である。従って、アミ
ノ酸配列に関して均質なリンホトキシンを製造する方法
が求められている。

【００１３】先行技術の方法は、天然に見出される物質
の、一次アミノ酸配列に相当する配列を有するリンホト
キシンの生産に限定されている。これらの配列中のアミ
ノ酸を置換または欠失させ、あるいは別のアミノ酸をそ
の中に挿入することは、それがかりに達成されたにして
も、広範囲に及ぶ、高価な化学的修飾を必要とする。従
って、リンホトキシンのアミノ酸配列中に、容易に変異
を導入する方法が求められている。

【００１４】リンホトキシン活性の抗腫瘍効果、および
その明白な治療的価値は１９６８年から文献中に報告さ
れているにもかかわらず、従来法で得られたリンホトキ
シンが少量であることと、ヘテロジーニアス性を有して
いることから、広範囲に及ぶ臨床的なプロトコールにお
いて研究がなされておらず、また商業化もされていな
い。従って、臨床研究が適切な量のリンホトキシンを経
済的に製造する方法が求められている。

【００１５】リンホトキシンとして同定された物質をも
含めて、種々の細胞毒の細胞溶解活性を中和し得るウサ
ギの抗血清が文献に記載されている(ヤマモトら“セル
ラー・イムノロジィー"３８:４０３−４１６(１９７
８);ゲイトリィ(Ｇately)ら、“セルラー・イムノロジ
ィー"２７:８２−９３(１９７６);ヒセロット(Ｈiserod
t)ら、“ジャーナル・オブ・イムノロジィ"１１９(２):
３７４−３８０(１９７７);ザカルチャック(Ｚacharchu
k)ら、“Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ"８０:６３４１−６３
４５(１９８３年);ラッドルら“リンホカイン・リサー
チ"２(１)２３−３１(１９８３);マンネル(Ｍannel)
ら、“インフェクション・アンド・イムニティー(Ｉnfe
ction and Ｉmmunity)"３３(１):１５６−１６４(１
９８１);ワラック(wallach)ら、Ｅ．ドウメイヤー(Ｅ．
Ｄe Ｍaeyer)ら編(ザ・バイオロジィー・オブ・ザ・イ
ンターフェロン・システム(Ｔhe Ｂiology of the
Ｉnterferon Ｓystem)pp２９３−３０２(１９８３年９
月発行);およびストン−ウォルフ(Ｓtone−Ｗolff)ら、
“ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディソ
ン"１５９:８２８−８４３(１９８４年３月))。この抗
血清はポリクローナルであるので、免疫原であるリンホ
トキシンに対する多種多様の抗体を含有している。これ
らの抗体のどれか１つまたはそれ以上が“リンホトキシ
ン"活性を中和するのに働いている。また、一般的に、
これらの文献報告は、免疫原として用いられたリンホト
キシン活性に係る物質の分子としての同定が不明確であ
る。診断および免疫親和性(イムノアフィニティ)精製法
においては、明確かつ明瞭に同定されたリンホトキシン
分子に対する単一特異性抗体が必要とされる。本発明の
目的は、その様な抗体を提供することにある。

【００１６】本発明の他の目的は、実質的に全てのリン
ホトキシン分子の一次アミノ酸配列が同じである様なリ
ンホトキシン形の組成物の経済的な製造方法を提供する
ことにある。さらにまた本発明は、リンホトキシン形の
アミノ酸配列中に所定の変化をもたらす方法、特に、ア
ミノ酸の欠失、挿入、置換またはそれらを組合わせて行
う方法を提供せんとするものである。

【００１７】発明の要約 本発明者らは、組換え法によってリンホトキシン活性を
有するタンパク質を発現させることに成功し、上記の目
的を達成した。本明細書において、その活性および天然
のあるいは変異型のアミノ酸配列によって示されるリン
ホトキシン種は、以降リンホトキシンと称する。驚くべ
きことに、ホモローガスな細胞内では微少レベルのリン
ホトキシンしか発現されず、また、どの時点でリンホト
キシンを暗号化したメッセンジャーＲＮＡがホモローガ
ス細胞中に現れるかが不確かであるにもかかわらず、リ
ンホトキシンを暗号化しているＤＮＡが同定された。さ
らに驚くべきことに、リンホトキシンをグリコシル化し
ない組換え細胞(あるいは、ホモローガス細胞と同様に
その様な作用を持たないだろうと考えられる組換え細
胞)内で、生物学的に活性なリンホトキシンを発現させ
ると共に、この様にして発現された、実質的に均一なア
ミノ酸配列を有するリンホトキシンを、Ｎ末端の酵素的
加水分解を伴うことなく、回収することができた。リン
ホトキシンを暗号化しているＤＮＡは、細胞培養内で、
培養リゼイト(溶菌液)１l中に０．１〜１×１０"単位以
上というおびただしい量で発現される。

【００１８】組換え宿主細胞によるリンホトキシンの発
現は、リンホトキシンまたはその前駆体を暗号化するの
に用いたＤＮＡ、並びに選択した宿主細胞によって左右
される。本発明においてリンホトキシンの合成に用いた
核酸配列は新規である。それらのヌクレオチド配列は、
固有の、または天然の配列から、以下に示す相違点の１
またはそれ以上において異なることを特徴としている:
ＤＮＡ中にイントロンが含まれていない(ヒト−リンホ
トキシンの場合、ヌクレオチド２８４と２８５の間にイ
ントロンが存在する(図４および図５)）;ＤＮＡ中に、
該ＤＮＡの起源である生物の他のタンパク質を暗号化し
ている核酸が含まれていない;リンホトキシンを暗号化
している核酸がベクター内にライゲートされている;そ
して／またはこの核酸は、リンホトキシンを暗号化して
いる核酸と雑種形成(ハイブリダイズ)することができる
(ただしこのハイブリダイズする核酸は、リンホトキシ
ンを暗号化している天然のＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレ
オチド配列を持ってはいない。)。

【００１９】リンホトキシンを暗号化している核酸突然
変異体は組換え操作によって生産される。リンホトキシ
ンの５’非翻訳または翻訳核酸に於けるサイレント突然
変異を行なう。例えばmＲＮＡの核酸の５’領域にステ
ム・アンド・ループ構造が生じる可能性を減少させた
り、天然の核酸単離体中に見出されるコドンを宿主にと
って好ましいコドンで置換したりすることにより、選択
した宿主内での発現を促進することができる。

【００２０】サイレントではなくて、発現される核酸の
突然変異により、固有のリンホトキシンのアミノ酸配列
を持つリンホトキシン種、または固有のリンホトキシン
と異なるアミノ酸配列を有する、その一次配列変異体を
生成させることができる。突然変異体リンホトキシンは
そのまま回収するか、または宿主細胞内でさらに加工さ
れ、所望のリンホトキシンを得る。

【００２１】これらの核酸またはそれとハイブリダイズ
する核酸、あるいはそれらのフラグメントを標識化し、
リンホトキシンを暗号化している遺伝的物質の同定また
は確認のためのハイブリダイゼーション・アッセイに用
いる。

【００２２】リンホトキシンの合成法は、リンホトキシ
ンを暗号化しているＤＮＡをベクターにライゲートし、
このベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、この宿主
細胞を培養し、その培養からリンホトキシンを回収する
ことからなる。この一般的な方法を用い、ベクターの組
立ておよび形質転換のための宿主の選択に応じて、固有
のリンホトキシンのアミノ酸配列を有するリンホトキシ
ンを合成するか、あるいは、新規なリンホトキシン変異
体を組立てる。本発明に従って得ることができるリンホ
トキシン種には、ロイシル(ロイシン)−アミノ末端リン
ホトキシン、ヒスチジル(ヒスチジン)−アミノ末端リン
ホトキシン、プレーリンホトキシン、並びに以下に示す
種々のリンホトキシン変異体が含まれる:(a)ヘテロロー
ガスなタンパク質またはポリペプチドがペプチド結合に
よってリンホトキシンのアミノ末端および／またはカル
ボキシ末端に結合してなる融合タンパク質、(b)リンホ
トキシンフラグメントであって、特に、そのフラグメン
トのアミノ末端アミノ酸がプレリンホトキシンの−３４
から＋２３までのアミノ酸のいずれかである様な、プレ
リンホトキシンのフラグメント、(c)１または１以上の
アミノ酸残基が置換、挿入または欠失しているリンホト
キシン突然変異体、(d)メチオニルアミノ末端誘導体、
または修飾されたメチオニル(ホルミルメチオニル、そ
の他の保護されたメチオニル基)アミノ末端誘導体、お
よび／または(e)以上全てについて、グリコシル化され
ていないものおよび様々にグリコシル化されたもの。

【００２３】真核性の分泌性リーダー配列(リンホトキ
シン固有の分泌型リーダーを含む)に機能的にライゲー
ト(結合)したリンホトキシン暗号化核酸によって哺乳類
細胞を形質転換するか、あるいはリンホトキシンを暗号
化している核酸を、ベクター内の原核性または酵母性の
分泌リーダー配列であって形質転換しようとしている宿
主細胞が認識し得るリーダー配列(通常、宿主細胞は、
リーダー配列の供給源微生物である)に機能的にライゲ
ートし、このベクターで形質転換した宿主を培養する
と、その培養物からアミノ末端がメチオニル化されてい
ないリンホトキシン種を常法通り回収することができ
る。

【００２４】また、リンホトキシンを暗号化しているＤ
ＮＡを分泌リーダー配列を含んでいないベクターに機能
的にライゲートさせ、これを用いて宿主細胞を形質転換
する場合は、通常合成されるリンホトキシン種は、アミ
ノ末端メチオニル残基またはホルミルメチオニルの如き
修飾されたメチオニル残基で置換される。

【００２５】本発明は、これまでは入手することができ
なかったリンホトキシン変異体を発現させる様、インビ
トロにおいてリンホトキシンを暗号化している核酸に突
然変異を起こす方法を提供するものである。第一の方法
は、リンホトキシンを暗号化しており、直接的に発現さ
れる(即ち、分泌リーダー配列と機能的に結合していな
い)核酸で形質転換した宿主細胞により、Ｎ末端メチオ
ニル、または修飾メチオニルリンホトキシンを発現させ
る方法である。

【００２６】第二の方法は、インビトロにおいて、部位
特異的に、所定のまたはランダムな突然変異を誘発し、
リンホトキシンを暗号化している核酸に、欠失、置換お
よび／または挿入を行なう。この様にしてリンホトキシ
ン融合物を生成させる。突然変異した核酸の発現によっ
て得られるリンホトキシンは、改良された特徴を示す。

【００２７】最後の方法では、新規なリンホトキシン種
である、グリコシリル化されていないまたは異様にグリ
コシリル化されたリンホトキシンを得る。非−グリコシ
リル化リンホトキシンは、リンホトキシンを暗号化して
いるＤＮＡの原核生物内での発現によって生産される。
異様にグリコシリル化されたリンホトキシン種は、より
高等な真核細胞(通常、哺乳類の細胞）の形質転換体の
組換え培養により、生産される。

【００２８】本発明方法で生産されたリンホトキシン
は、培養物の上澄みまたはリゼイト(溶解物)から、不溶
化されたリンホトキシン中和抗体を使用したイムノアフ
ィニティ吸着法により精製することができる。モノクロ
ーナル細胞培養中で最も効率良く生産されるこの抗体
は、明ばん(アルム)に吸着させたリンホトキシンで免疫
化したマウスで生成させる。

【００２９】本発明に係るリンホトキシンは、生理学的
に無毒な安定剤や賦形剤と混合し、投薬ビン内で凍結乾
燥して滅菌投与剤形にするか、安定化した水剤の形で保
存し、治療に用いることができる。あるいは、このリン
ホトキシンをポリマー・マトリックスの中に組込ませ、
腫瘍部位または腫瘍切除に係る術後部位に埋め込むこと
により、リンホトキシンが局所的に高い濃度勾配で、好
機に放出される様にすることもできる。

【００３０】本発明に係る治療用組成物は、その治療有
効量を、悪性腫瘍を有する動物、特に人間の患者に、埋
め込み、注射または注入することにより、投与し得る。

【００３１】図面の解説 図１はリンホトキシンフラグメントを暗号化しているＤ
ＮＡ配列および推定のアミノ酸配列の模式図である。図
２および図３は図１に示したフラグメントを暗号化して
いる合成ＤＮＡの組立て模式図である。図４および図５
はプレリンホトキシンの全アミノ酸配列、並びに、５'
および３'非翻訳領域をも含めた、その暗号ＤＮＡの模
式図である。図６はメチオニル・ロイシル−アミノ末端
リンホトキシンおよびそのアミノ末端メチオニル誘導体
のための発現ベクターの組立て方法を示す模式図であ
る。図７および図８は、メチオニル・ヒスチジル−アミ
ノ末端リンホトキシンのための発現ベクターの組立て方
法を示す模式図である。図９、図１０、図１１および図
１２はヒト、ネズミおよびウシのリンホトキシンアミノ
酸配列、並びにこれらの哺乳類におけるリンホトキシン
共通(コンセンサス)塩基配列を示す模式図である。図１
３、図１４、図１５および図１６は、リンホトキシンと
細菌性シグナル配列の融合物を暗号化しているプラスミ
ドの組立て模式図である。

【００３２】詳細な説明 本明細書中では、リンホトキシンを、実質上、図４およ
び図５に示したリンホトキシンのアミノ酸配列の少なく
とも１部分とホモロジイ(相同)な構造アミノ酸領域を有
する、生物学的に活性なポリペプチドと定義する。生物
学的活性は以下に述べる選択的な細胞毒活性、細胞毒リ
ンホトキシンとの免疫交差反応活性、あるいは細胞表面
のリンホトキシン受容体に対する細胞毒リンホトキシン
との競合能力に基づいて定められる。後二者の場合にお
いては、リンホトキシンがそれ自体、細胞毒性であるこ
とを要しない。免疫学的交差反応性を有する突然変異体
は動物の体内に抗リンホトキシンを生成させるための免
疫原として有用であり、例えばイムノアッセイ用試薬を
製造する上で有用であり、一方非−細胞毒性の競合的突
然変異体は、生物学的に活性なリンホトキシンの競合的
なイムノアッセイにおいて、標識化した試薬として用い
ることができる。

【００３３】選択的細胞毒活性とは、インビボまたはイ
ンビトロにおいて、同じ条件下にある正常細胞と比較し
た場合に、腫瘍細胞を優先的に破壊するかまたはその増
殖を阻害する様な活性である、と定義する。活性の測定
においては、インビトロでは溶解、インビボでは壊死に
よる腫瘍細胞の破壊を終末点に用いるのが好ましいが、
細胞性塞栓活性または増殖阻害活性を利用してもよい。

【００３４】リンホトキシンの抗細胞活性を検出するの
に好適な測定法はＢ．アガーワル(Ｂ．Ａggarwal)ら
“ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリィ"２
５９(１)、６８９−６９１およびＥ．カースウェル
(Ｅ．Ｃarswall)ら、１９７５、“プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエン
スイズ・オブ・ザ・ＵＳＡ"７２、３６６６−３６７０
によって示されている。

【００３５】本明細書中では、リンホトキシンの特異活
性を、細胞塞栓活性ではなく標的細胞の溶解に基づいて
定義する。リンホトキシン１単位は、実施例１に記載す
る如く、各ウエルにプレートした標的細胞の５０％を溶
解させるのに必要な量である、と定義する。しかしなが
ら、他の細胞毒活性の測定方法も可能である。

【００３６】実質的に構造上ホモロジィ(相同)である、
とは、通常、そのポリペプチド中のアミノ酸残基の内約
６０％以上、一般的には約７０％以上が図４および図５
に示した対応する残基と同じであるかまたは保存的置換
であることを意味する。

【００３７】リンホトキシンポリペプチドの全配列が図
４および図５に示した配列とホモローガスである必要は
ない。そのものが所望の生物学的活性を示す限り、一部
分だけが図４および図５の配列中のどこかとホモローガ
スであってもよい。通常、ホモロジィ領域は、ホモロジ
ィを最大にするために時折ギャップを導入する必要があ
るということをふまえた上で、約２０〜１００アミノ酸
残基の領域について証明されることが必要である。図４
および図５に示した配列とホモロジィである領域がリン
ホトキシンの鍵(key)領域(即ち、細胞毒活性にとって重
要な領域)の１つでない場合は、この定義の範囲に入る
ポリペプチドに要求されるホモロジィはもっと少なくて
よい。図４および図５の配列中の鍵領域は残基約１６２
〜１７１、５２〜８３および１２７〜１４８の領域であ
ると思われる。

【００３８】リンホトキシンは、具体的にヒトの腫瘍の
壊死因子、または天然の動物におけるその類似体を除く
と定義されている(Ｄ．ペニカ(Ｄ．Ｐennica)ら、“ネ
イチャー"３１２:２０／２７ １９８４年１２月号、p
p．７２４−７２９、およびＢ．アガーワルら“ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリィ"２６０
[４]:２３４５−２３５４[１９８５])。

【００３９】構造上の類似性とは、アミノ酸側鎖の主要
な特性、例えば塩基性、中性または酸性、親水性または
疎水性、あるいは立体的な大きさがあるか無いか等の性
質についての類似性をいう。構造上類似であるアミノ酸
の一方を他方と置換することは、当該技術分野で通常、
保存的置換として知られている。

【００４０】あるポリペプチドがリンホトキシンである
と同定する上で重要なファクターは、実質的にホモジー
ニアスなリンパ芽球様(または天然の)リンホトキシンを
実質上中和し得る抗血清が、該ポリペプチドの細胞毒活
性をも実質上中和することができる、ということであ
る。しかしながら、免疫学的な同定と細胞毒に基づく同
定とは必ずしも同じ幅を持っている訳ではないことは理
解されよう。例えば、図４および図５のリンホトキシン
に対する中和抗体は、該中和抗体がたまたまリンホトキ
シンの細胞毒活性にとって必要な領域に隣接した領域に
結合するものである、という理由で(ただしこの中和抗
体はリンホトキシン活性部位に対する立体障害作用を介
して中和作用を奏する)、リンホトキシン候補のタンパ
ク質とは結合しないかもしれない。この様な無関係な領
域に突然変異を生じた候補タンパク質はもはや中和抗体
とは結合しないが実質的なホモロジィおよび生物学的活
性、という観点からは依然、リンホトキシンである。

【００４１】リンパ芽球様細胞系統(セルライン)の培養
によって得られたリンホトキシンは次の特徴を有する:
分子量はグリコシル化およびＮ末端の変化の程度に応じ
て、２０,０００または２５,０００である:Ａsn＋６２
(図４および図５参照)がグリコシル化されている;凝集
し易く、特にマルチマー(重合体)を形成し易い;等電点
は約５．８である;pＨ変化に不安定である(重炭酸アン
モニウム緩衝液(濃度１０μg／ml)中、pＨレベル約５以
下または約１０以上で２４時間保つと、細胞毒活性が５
０％以上失われる);水溶液中で、８０℃において５分間
インキュベートすると実質的に活性が消失する。２種類
の分子量のリンパ芽球様リンホトキシン種が同定されて
いる。それらリンパ芽球様リンホトキシンの内、２５,
０００da種はアミノ末端にロイシン残基を有している。
この２５,０００da種の一次アミノ酸配列を有するポリ
ペプチドはロイシル(ロイシン)−アミノ末端リンホトキ
シンと呼ばれる。リンパ芽球様リンホトキシンの内、２
０,０００da種はアミノ末端にヒスチジンを有すること
が特徴であり、相当する配列をヒスチジル(ヒスチジン)
−アミノ末端リンホトキシンと称する。これらの特徴が
リンパ芽球様細胞培養から得られた天然の、あるいは野
性型のヒト−リンホトキシンを表わしているということ
を認識することは重要なことである。本明細書で定義し
たリンホトキシンには天然の、グリコシル化されたリン
ホトキシンが含まれるが、その他の関連の細胞毒性ポリ
ペプチドも定義の範囲内に含まれる。例えば、動物のリ
ンホトキシンに一般に付随しているグリコシル化部分
は、ヘテロローガスな真核性の組換え宿主細胞内で発現
される場合には修飾されるかもしれず、その結果、ヒト
−リンパ芽球様リンホトキシンについて確立されている
分子量あるいは等電点と異なる性質の、修飾されたリン
ホトキシンが生成されることになる。組換え細菌培養中
では、それ相応の修飾を受けた分子量、等電点、および
その他の特性を持った、全くグリコシル化されていない
リンホトキシンが生産される。さらに、ある動物種(第
１番目の動物)から得られた細胞系統内で他種動物(第２
番目の動物)のプレリンホトキシンが翻訳後プロセッシ
ングを受けると、その第２番目の動物種の場合において
通常であるものとは異なるアミノ末端残基が得られるか
もしれない。同様に、本発明の突然変異誘発方法によっ
て、例えばリンホトキシンのアミノ酸配列やＮ末端を変
化させ、そうすることにより、pＨ安定性や等電点を改
良することができる。

【００４２】翻訳されたヒト−リンホトキシンのアミノ
酸配列を図４および図５に示した。この配列中には３４
残基からなるプレ−配列が含まれており(その突然変異
体を含めて、ここでは“プレ−リンホトキシン"と称す
る)、これはヒト−細胞内での翻訳された転写体の正常
なプロセッシング過程で除去され、その結果ロイシル
(ロイシン)−アミノ末端種が得られる、という点に留意
すべきである。ヒスチジル(ヒスチジン)−アミノ末端種
は、このロイシル−アミノ末端種の最初の２３個のアミ
ノ酸を有しないことを除いて、該ロイシル−アミノ末端
種とホモローガスである。これらの３種、即ち、プレ−
リンホトキシン、ロイシル−アミノ末端リンホトキシ
ン、およびヒスチジル−アミノ末端リンホトキシンは全
て、そのメチオニル突然変異体、修飾されたメチオニル
突然変異体、および非−グリコシル化体と共に、本発明
のリンホトキシンの範囲内に包含される。非−グリコシ
ル化体およびヒスチジル−アミノ末端種は、前記のリン
パ芽球様細胞からのホモローガスな種よりも低分子量で
あろう。

【００４３】プレ−リンホトキシンは前述の定義の範囲
内に含まれるリンホトキシンの一種である。その特徴
は、分子のアミノ末端にシグナル(またはリーダー)ポリ
ペプチドが存在することにある。一般に、リンホトキシ
ンの天然のシグナル(信号)ポリペプチドは、このタンパ
ク質が細胞から分泌される際の分泌プロセスの一プロセ
スとして、リンホトキシンからタンパク分解的に開裂さ
れる。この信号ペプチドは微生物あるいは哺乳動物(天
然の、この３４残基からなるプレ−配列をも含む)のい
ずれのものであってもよいが、宿主細胞にとってホモロ
ーガスな信号であることが好ましい。ある種の信号−リ
ンホトキシン融合物は宿主細胞によって認識されず、Ｎ
−末端のメチオニン不含リンホトキシンに加工“プロセ
ス"されない。微生物性の信号を含有する融合物は、例
えばリンホトキシン免疫源として用いることができる。
“細胞毒活性を有する"という語句は、例えば酵素的加
水分解を受けて、酵素原に似た不活性な状態から、所望
の生物学的活性を現すポリペプチドフラグメントへと変
換され得るポリペプチドを含むリンホトキシンを示すこ
とに注目されたい。インビトロまたはインビボで“細胞
毒性活性を有する"という語句は、例えば酵素的加水分
解により、酵素原に似た不活性な状態から明確な生物学
的活性を現すポリペプチドフラグメントに変換され得
る、非−細胞毒性ポリペプチドを包含する。一般に、不
活性な前駆体は、リンホトキシンのカルボキシ末端に他
のタンパク質またはポリペプチドがペプチド結合を介し
て結合している融合タンパク質である。インビボで、あ
るいはまたインビトロにおける製造工程の一段階とし
て、タンパク分解的加水分解を受け易くしてリンホトキ
シンを放出させるために、このポリペプチド結合または
その近くの配列を選択する。代表的な結合配列はlys−l
ysまたはarg−lysである。その様なプロリンホトキシン
中の非リンホトキシン成分は、該融合物の免疫原性を最
少限度にするため、ホモローガスなタンパク質であるこ
とが好ましい。このホモローガスなタンパク質は無毒で
あり、かつ細胞表面と結合しないものであることを要す
る。この様にして生成したリンホトキシンは、明確な、
所望の細胞毒活性を現す。

【００４４】通常、リンホトキシンとはヒト−リンホト
キシンを表わすが、ネズミ、ブタ、ウマまたはウシの様
な他の供給源から得られたリンホトキシンも、それが、
ホモローガス領域および生物学的活性に関して述べた前
の基準に合致する限り、リンホトキシンの定義内に含ま
れる。例えば、ウシおよびネズミのリンホトキシンはヒ
ト−リンホトキシンと高度(約８０％)のホモローガス性
を有する。リンホトキシンは種特異的でなく、例えばヒ
ト−リンホトキシンはマウスの腫瘍および新生細胞系統
に対して活性である。従って、ある種から得たリンホト
キシンを他の種の治療に用いることができる。

【００４５】リンホトキシンには重合形も含まれる。リ
ンホトキシンは自然に凝集し、通常、二重体またはそれ
以上のマルチマーに重合する。マルチマーは細胞毒性を
有するのでインビボでの治療に用い得る。組換え宿主内
で発現されるリンホトキシンはモノマーである。しかし
ながら、その後、リンホトキシンは自然にマルチマーを
形成する傾向がある。均質なマルチマー、あるいは種々
のマルチマーの混合物は治療上有用である。

【００４６】変異型リンホトキシンには、図４および図
５に示した分子の予め定められた、または標的をしぼっ
た変異体、即ち、部位特異的突然変異体またはそのフラ
グメントが含まれる。変異型リンホトキシンとは、その
アミノ酸配列が、残基の欠損、置換または挿入のいずれ
かによって図４および図５に示した配列と異なっている
ことを特徴とする、という点を除けば、リンホトキシン
について定義した特性を有するポリペプチドを意味す
る。本明細書中に述べる非−ヒトリンホトキシン、およ
びヒト−リンホトキシンのアレル体は、天然の対応物を
持たない部位指定性突然変異リンホトキシンであるとい
える。突然変異変異型誘発の目的は、上に定義したリン
ホトキシンをコードしており、かつ、天然のリンホトキ
シンの生物学的活性を改良し、あるいは、リンホトキシ
ンの製造を容易ならしめるという特性を示すＤＮＡを組
立てることにある。例えば、リジン残基の代わりにヒス
チジン残基を発現させるためにリジン⁺８９コドンを突
然変異させる。このヒスチジン⁺８９はもはやトリプシ
ンで加水分解されない(トリプシンは、通常、arg−Ｘま
たはlys−Ｘ結合の位置でタンパク質を開裂する)。かく
してプロテアーゼ耐性を得たこの突然変異体は、図４お
よび図５の配列を有するリンホトキシン(またはそのフ
ラグメント)よりも長い生物学的半減期を有することに
なる。その他のリンホトキシン内のリジンまたはアルギ
ニン残基(例、リジン⁺２８、リジン⁺１９またはアルギ
ニン⁺１５)もヒスチジンに変異させることができる。

【００４７】前記の如く、リンホトキシン分子のある領
域は腫瘍壊死因子と呼ばれる類似した活性を有するタン
パク質と実質上ホモロジィである。この様な、実質的に
ホモロジィな領域またはそのすぐ両隣りの領域のアミノ
酸残基は、様々な生物活性、および細胞毒活性を示すリ
ンホトキシン突然変異体を同定することを目的として突
然変異を誘発するのに好都合である。その様な突然変異
体は自体既知の方法で生成させることができ、所望の生
物学的活性、例えば治療すべき特定の新生物に対して増
強された細胞毒性、あるいは動物の免疫化を目的とする
リンホトキシン種の場合ならば、より強力な免疫応答を
惹起させる能力等に関してスクリーニングする。その様
なリンホトキシン変種の例を次下に示す:Ａla⁺１６８を
分枝鎖アミノ酸(val、ileまたはleu)に変異させる;thr⁺
１６３とval⁺１６４の間に疎水性アミノ酸(例、phe、va
l、ileまたはleu)を挿入する;thr⁺１６３をチロシンで
置換する;ser⁺８２をリジンで置換する;ser⁺４２をイソ
ロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリンまたは
ヒスチジンで置換する;lys⁺８４をグルタミン、トリプ
トファン、セリンまたはヒスチジンで置換する;ser⁺８
２を欠失させる;leu⁺１７１に疎水性のジーまたはトリ
ペプチドを融合させる;thr⁺１６３をアスパラギン酸ま
たはリジンで置換する;glu⁺１２７とpro⁺１２８との間
にala−lysを挿入する;ser⁺７０をリジンまたはグリシ
ンで置換する;thr⁺６９をチロシンで置換する;lys⁺２８
をアルギニンまたはヒスチジンで置換する;his⁺３２を
アルギニンまたはリジンで置換する;asp⁺３６をプロリ
ン、セリン、スレオニン、チロシンまたはグルタミン酸
で置換する;ser⁺３８をチロシン、メチオニンまたはグ
ルタミン酸で置換する;ser⁺６１をスレオニン、チロシ
ン、ヒスチジンまたはリジンで置換する;gly⁺１２４を
アスパラギン酸、セリンまたはチロシンで置換する;his
⁺１３５をアルギニン、リジン、チロシン、トリプトフ
ァンまたはプロリンで置換する;thr⁺１４２をアスパラ
ギン酸で置換する;そしてgln⁺１４６をリジンまたはス
レオニンで置換する。

【００４８】ヒト−リンホトキシン残基の⁺２０、⁺１２
０および⁺１３３におけるメチオニン残基が欠失してい
る突然変異体が特に望ましく、あるいは、更に好ましく
は、それらが本明細書中に記載した他の種のリンホトキ
シン中に見出される、対応する残基で置換されている突
然変異体が特に好ましい。例えば、met⁺２０、⁺１２０
および⁺１３３をそれぞれスレオニン、セリンおよびバ
リンで置換する。これらはウシ−リンホトキシン中の対
応残基である。置換は、自体既知の方法に従い、更にＭ
１３Ｍp８ファージを用いた突然変異誘発工程を経てmet
⁺１３３をvalに変異させることを除けば、実施例９に示
した方法によって行うことができる。この突然変異体で
ある、動物種ハイブリッドリンホトキシンＤＮＡを実施
例７におけるロイシル−アミノ末端ＤＮＡの代わりに用
い、融合物として発現させる。既知の方法に従い、臭化
シアンを用いてこのハイブリッドリンホトキシンからＳ
ＴＩＩシグナル(信号)を開裂させ、成熟ロイシル−アミ
ノ末端リンホトキシン変種を回収する。

【００４９】その他の有用なリンホトキシン変種は、腫
瘍壊死因子中の残基対応するリンホトキシン残基が置換
されて形成されたハイブリッド・腫瘍壊死因子−リンホ
トキシン変異体である。その代表例は、成熟腫瘍壊死因
子の最初の８、９または１０個の残基(例、val−arg−s
er−ser−ser−arg−thr−pro−ser−asp−)でロイシル
・アミノ末端リンホトキシンの最初の２７残基が置換さ
れたものである。この変種は大腸菌(Ｅ．coli)内での直
接発現に際して、Ｎ末端の脱メチオニル化をより起こし
易いと思われる。

【００５０】突然変異誘発部位は予め定めておくが、突
然変異そのものを予め定めておく必要はない。例えばヒ
スチジン⁺８９での適切なリンホトキシン突然変異体を
得るためには、リジン⁺８９に関するコドンに無作為な
変異誘発を行い、発現されたリンホトキシン突然変異体
を、細胞毒活性とタンパク分解酵素耐性の適当な組合わ
せについてスクリーニングする。

【００５１】リンホトキシンには、通常、アミノ酸残基
数約１〜１０程度の挿入、または約１〜３０残基の欠失
も含まれる。置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、
等を組合わせて最終的な組立てを行う。挿入には、アミ
ノ末端またはカルボキシ末端の融合、例えばカルボキシ
末端に疎水性の延長部分を付加すること、も含まれる。
しかしながら、置換的突然変異誘発だけを行うことが好
ましい。言うまでもなく、暗号ＤＮＡ内における突然変
異は、その配列をリーディングフレーム外に位置せしめ
るようなものであってはならず、また、mＲＮＡの二次
構造を形成させる可能性のある相補領域をつくらないこ
とが好ましい。ロイシル−アミノ末端リンホトキシンの
後部１６個のカルボキシ末端アミノ酸、または前部約３
３個のアミノ末端残基が欠失されたリンホトキシン突然
変異体を暗号化しているＤＮＡを含有するベクターで形
質転換された大腸菌の抽出液は細胞毒活性を示さない。
しかしながら、この活性の欠如の原因は不明であり、後
述の実施例１に示した理由のいづれかによるものであろ
う。

【００５２】リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡに
於ける突然変異の全てが組換え細胞培養内で最終的な生
産物として発現されるわけではない。例えば、置換型の
ＤＮＡ突然変異体の主なものは、図４および図５の分泌
リーダーが、その３４個のリーダー残基内での欠失、ま
たは置換のいずれかにより、固有のリーダー配列の全部
または大部分を所望の宿主によって一層認識され易いリ
ーダーに置き換え、別のリーダー配列に変えたものであ
る。例えば、原核性の発現ベクターを組立てるには、図
４および図５の分泌リーダーを細菌性のアルカリ性ホス
ファターゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダ
ーに有利な様に欠失させ、酵母のための発現ベクターを
組立てるには、図４および図５のリーダー配列を酵母イ
ンベルターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼ
・リーダーに好都合な様に置換する。しかしながら、こ
のことはヒト分泌リーダーがヒト細胞系統以外の宿主で
は認識されない、ということを意味するものではない。
宿主によって分泌リーダーが“認識"されると、通常、
リンホトキシンとリーダーからなる融合タンパク質はリ
ーダー−リンホトキシン間のペプチド結合の位置で切り
開かれ、通常リンホトキシンが分泌される。この様に、
宿主の形質転換に突然変異ＤＮＡを用いても、得られる
リンホトキシン生産物は、融合物のプロセッシングに関
する宿主の機能に応じて、融合型、または固有のリンホ
トキシンのいずれかとなる。

【００５３】リンホトキシン変異体として発現されない
もう一つの主要なＤＮＡ突然変異体は、発現を促進する
様にヌクレオチド置換を行なうものであり、(それは、
主として転写されたmＲＮＡ内でステム・アンド・ルー
プ構造が生じることを避ける(同時出願係属中のＵ．
Ｓ．Ｓ．Ｎ．３０３,６８７号参照)ことにより行な
う)、かもう１つは選択した宿主内で、より転写され易
いコドンを与える(例えば、大腸菌内で発現させるに
は、よく知られている大腸菌にとって好ましいコドンが
ある)ためにヌクレオチド置換を行なうものである。

【００５４】突然変異した核酸は、自体周知の方法によ
って製造される[Ａ．フイ(Ａ．Ｈui)ら、１９８４、
“ＥＭＢＯジャーナル(Ｔhe ＥＭＢＯ Ｊournal)３
(３):６２３−６２９;Ｊ．アデルマン(Ｊ．Ａdelman)
ら、１９８３“ＤＮＡ"２(３):１８３−１９３;イギリ
ス特許出願第２,１３０,２１９Ａ;Ｇ．ウインター(Ｇ．
Ｗinter)ら、１９８２、“ネイチャー"２９９:７５６−
７５８;およびＲ．ワラス(Ｒ．Ｗallace)ら、１９８
１、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucleic
Ａcids Ｒesearch)"９(１５):３６４７−３６５６]。
これらの方法には、Ｍ１３ファージ突然変異誘発、実施
例１およびそれ以降に述べ、突然変異体リンホトキシン
遺伝子の合成、あるいはその他の、当該技術分野での既
知の、または既知となるであろう方法が含まれている。

【００５５】リンホトキシンを暗号化している核酸に
は、そのヌクレオチド配列が天然に見い出される配列に
相当するか否かに係らず、本発明のリンホトキシンの定
義内に含まれるポリペプチドを暗号化しているあらゆる
ＤＮＡまたはＲＮＡ配列が含まれる。更に、少なくとも
低いストリッジェンシィ(stringency)条件下に、リンホ
トキシンを暗号化している核酸とハイブリダイズし得る
核酸は、例えそのハイブリダイズし得る核酸が、それ以
外の点ではリンホトキシンの明確な定義にかなうタンパ
ク質をコード(暗号化)していなくても、本発明の範囲内
に含むものとする。後者の例としてプローブがある。何
故ならば、それが暗号化している短いポリペプチドは、
生物学的に活性なリンホトキシンを発現しないからであ
る。リンホトキシンを暗号化している核酸、またはそれ
とハイブリダイズし得るものは、実質上、実施例１に示
した有機合成法に従って製造するか、あるいは本明細書
中の実施例に示した如く、ゲノムまたはcＤＮＡライブ
ラリィをプロープすることにより、天然起源のものから
得ることができる。

【００５６】本発明のリンホトキシンは、一般に、所望
のリンホトキシンを暗号化している核酸を担ったベクタ
ーによる宿主細胞の形質転換を必要とする方法によって
得られる。ベクターとは、複製可能なＤＮＡ組立て物で
ある。本発明においては、リンホトキシンを暗号化して
いるＤＮＡの増幅、あるいは発現のためにベクターを用
いる。発現ベクターとは、その内部で、リンホトキシン
を暗号化しているＤＮＡ配列が、適当な宿主内でリンホ
トキシンを発現させ得る適当なコントロール配列と機能
的に結合している、ＤＮＡ組立て物である。その様なコ
ントロール配列には転写プロモーター、転写をコントロ
ールするための任意のオペレーター配列、適切なmＲＮ
Ａリボゾーム結合部位をコードしている配列、および転
写および翻訳の終止をコントロールするための配列が含
まれる。

【００５７】ベクターはプラスミド、ウイルス(ファー
ジを含む)、または組込み可能なＤＮＡフラグメント(即
ち、組換えによって宿主のゲノム内に組込まれ得るも
の)であってよい。適当な宿主に導入(トランスフォー
ム)されると、ベクターは宿主ゲノムとは独立に複製、
機能し、または、ある場合にはゲノムそのものの中に組
込まれる。プラスミドは、今日最も普通に用いられるベ
クターであるため、本明細書中では、時に“プラスミ
ド"と“ベクター"とを相互変換可能な用語として用いる
こととする。しかしながら、同等の機能を有し、当該技
術分野で知られており、またはいずれ知られるであろ
う。その他の形のベクターも全て、本発明方法に用いる
のに好適である。

【００５８】好適なベクターは、発現させようとする宿
主と適合し得る種から導かれたレプリコンおよびコント
ロール配列を含んでいる。形質転換された宿主細胞と
は、組換えＤＮＡ技術を用いて組立てられたリンホトキ
シンベクターで形質転換され、もしくはトランスフェク
トされた細胞である。形質転換された宿主細胞は、通
常、リンホトキシンを発現する。発現されたリンホトキ
シンは、選択された宿主細胞により、細胞内に止まる
か、あるいはペリプラスミック空間、または培養液の上
澄に分泌される。

【００５９】ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に
関連している場合は、機能的に結合している。例えば、
プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それが
ポリペプチドの分泌に与るプレタンパク質として発現さ
れるならば、該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に
結合している;プロモーターは、それが結合している暗
号配列の転写をコントロールするならば、該配列と機能
的に結合している;リボゾーム結合部位は、それが結合
している暗号配列を翻訳され得る位置に置くならば、該
配列と機能的に結合している。一般に、機能的に結合し
ている、ということは近接(コンティギュアス)している
ことを意味し、特に分泌リーダー配列の場合には、近接
し、かつ解読相内にあることを意味する。

【００６０】適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞お
よびより高等な真核細胞である。原核生物にはグラム陽
性またはグラム陰性の微生物、例えば、大腸菌やバチル
ス(桿菌、Ｂacilli)が含まれる。より高等な真核細胞に
は、以下に述べる如く哺乳類動物起源から得られた細胞
系統(セルライン)が含まれる。好適な宿主細胞は実施例
に記載した、ファージ耐性のＥ．coli Ｗ３１１０(Ａ
ＴＣＣ ２７,３２５)株であるが、他の原核生物、例え
ばＥ．coli Ｂ、Ｅ．coli Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１,
５３７)、Ｅ．coli ２９４(ＡＴＣＣ３１,４４６)、シ
ュードモーナス(pseudomonas)種、あるいはセラシア・
マーセサンス(Ｓerratia Ｍarcesans、霊菌)等も適す
る。

【００６１】リンホトキシンの発現には原核性宿主−ベ
クター系が好ましい。適当な微生物系ベクターは、多数
手に入れることができる。一般に、微生物類のベクター
は所望の宿主が認識し得る複製起源、宿主内で機能し得
るプロモーター、並びに表現型の選択性遺伝子(例えば
抗生物質耐性を付与する遺伝子、または栄養要求変異種
の要求を与える様な遺伝子)を含む。他の宿主に関して
も、同様な組立て物を作ることができる。大腸菌は、通
常、Ｅ．coli種から得られるプラスミドpＢＲ３２２を
用いて形質転換される(ボリバー(Ｂolivar)ら、１９７
７、“ジーン(Ｇene)"２:９５)。pＢＲ３２２はアンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含
有しており、これらは形質転換細胞を容易に同定し得る
手段となる。

【００６２】発現ベクターは宿主微生物によって認識さ
れ得るプロモーターを含有する必要があるが、クローニ
ングベクターにはその必要がない。一般にプロモーター
は所望の宿主にとってホモローガスである。組換えＤＮ
Ａの組立てに最も普通に用いられるプロモーターには、
β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプ
ロモーター系(チャン(Ｃhang)ら、１９７８“ネイチャ
ー"、２７５:６１５;およびゲッデル(Ｇoeddel)ら、１
９７９“ネイチャー"２８１：５４４)、トリプトファン
(trp)プロモーター系(ゲッデル(Ｇoeddel)ら、１９８０
“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"３:４０５７およ
びＥＰＯ出願公開番号第３６,７７６)、並びにsacプロ
モーター[Ｈ．ドゥボエル(Ｈ．Ｄe Ｂoer)ら、“プロ
シーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・
オブ・サイエンスイズ、Ｕ．Ｓ．Ａ．”８０:２１−２
５(１９８３)]が含まれる。これらが最も普通に用いら
れているが、その他の微生物プロモーターも使用し得
る。それらの詳しいヌクレオチド配列は公開されてお
り、それによって当業者は、それらをプラスミドベクタ
ー内のリンホトキシン暗号化ＤＮＡ(シーベンリスト(Ｓ
iebenlist)ら、１９８０、“セル"２０:２６９)、およ
びリンホトキシンを暗号化しているＤＮＡと、機能的に
ライゲート(結合)させることができる。現在のところ好
ましいベクターは、大腸菌アルカリ性ホスファターゼプ
ロモーターとtrpシャイン−ダルガノ配列を有するpＢＲ
３２２誘導体である。このプロモーターおよびシャイン
−ダルガノ配列を、リンホトキシンを暗号化しているＤ
ＮＡと機能的に結合させる(即ち、ＤＮＡからのリンホ
トキシンmＲＮＡの転写を促進する様に位置せしめる)。

【００６３】この原核生物に加えて、酵母培養の如き真
核性微生物もリンホトキシン−暗号ベクターにより、形
質転換される。下等な真核性微生物宿主の内、サッカロ
ミケス・セレビシエ(Ｓaccharomyces cereviciae)また
は通常のパン酵母が最も一般的に用いられるが、その他
多数の菌株も普通に用い得る。酵母ベクターは、通常、
２ミクロン酵母プラスミドからの複製起源または自律的
複製配列(ＡＲＳ)、プロモーター、リンホトキシン(特
にヒト−プレリンホトキシンを含む)を暗号化している
ＤＮＡ、並びにポリアデニル化、転写終止、および選択
遺伝子のための配列を含有している。酵母内でリンホト
キシンを発現させるのに好適なプラスミドはＹＲp７で
ある(ステインチコム(Ｓtinchcnmb)ら、１９７９、“ネ
イチャー"２８２:３９;キングスマン(Ｋingsman)ら、１
９７９、“ジーン"、７:１４１;チェンパー(Ｔschempe
r)ら、１９８０“ジーン"１０:１５７)。このプラスミ
ドは既にtrp１遺伝子を含有しているので、トリプトフ
ァン中で増殖する能力を持たない、酵母の突然変異株
(例えばＡＴＣＣＮo．４４０７６またはＰＥＰ４−１
(ジョーンズ(Ｊones)、１９７７、“ジェネテックス"８
５:１２)に選択マーカーを与える。この酵母宿主細胞ゲ
ノムにtrp１障害があるので、形質転換体をトリプトフ
ァンの非存在下で増殖させることによって、形質転換体
を検出する際の有効な環境を提供することになる。

【００６４】酵母用ベクターの好適なプロモーティング
配列には、以下のものに対するプロモーターが含まれ
る:メタロチオナイン(metallothionein)、３−ホスホグ
リセレート・キナーゼ(ヒッツマン(Ｈitzeman)ら、１９
８０“ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ィ"２５５:２０７３)またはエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルベート・デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート・イソ
メラーゼ、３−ホスホグリセレート・ムターゼ、ピルベ
ート・キナーゼ、トリオセホスフェート・イソメラー
ゼ、ホスホグルコース・イソメラーゼ、グルコキナーゼ
等の他の解糖酵素類(ヘス(Ｈess)ら、１９６８、“ジャ
ーナル・オブ・アドバンスイズ・イン・エンザイム・レ
グ(Ｊ．Ａdv．Ｅnzyme Ｒeg．)"７:１４９;およびホラ
ンド(Ｈolland)ら、１９７８、“バイオケミストリィ"
１７:４９００)。更に、酵母内で発現させる上で好適な
ベクターおよぴプロモーターはＲ．ヒッツマン(Ｒ．Ｈi
tzeman)により、ＥＰＯ公開番号第７３,６５７号の中に
記述されている。

【００６５】その他、増殖条件によって転写がコントロ
ールされるという利点をさらに有するプロモーターとし
て、アルコール・デヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する減成酵
素、前記メタロチオナイン、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、並びにマルトースお
よびラクトースの利用に与る酵素類等に関するプロモー
ター領域が含まれる。適当な発現プラスミドを組立てる
には、これらの遺伝子に伴った終止配列を、発現ベクタ
ー内の、リンホトキシン暗号配列の３'側にライゲート
し、mＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供する。

【００６６】微生物に加えて、多核生物からの細胞培養
を宿主として用いることもできる。しかしながら、リン
ホトキシン発現は、これまで微生物によって卓越した成
果が得られているので、それが好ましいとは言えない。
原則として、脊椎動物であるか無脊椎動物であるかに拘
わらず、あらゆる高等な真核細胞培養を使用し得る。し
かしながら、最近では脊椎動物細胞に大きい関心が寄せ
られており、培養(組織培養)で脊椎動物細胞を増殖させ
ることは日常的な操作となっている[ティッシュ・カル
チャー(Ｔissue Ｃulture)アカデミック・プレス、ク
ルスおよびパターソン(Ｋrus and Ｐatterson)編、
(１９７３)]。有用な宿主細胞系統の例には、ＶＥＲＯ
およびＨeＬa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨ
Ｏ)細胞系、並びにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およ
びＭＤＣＫ細胞系等が含まれる。その様な細胞のための
発現ベクターには、通常(必要ならば)複製起源および発
現されるべき遺伝子の前方に位置しているプロモーター
が、リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位(イン
トロン含有ゲノムＤＮＡを用いる場合)、ポリアデニル
化部位および転写終止配列と共に含有されている。

【００６７】形質転換される脊椎動物細胞内で使用する
ための発現ベクター用の転写およびコントロール配列
は、しばしばウイルス性起源によって供給される。例え
ば、普通用いられているプロモーターはポリオーマ、ア
デノウイルス２、および最も頻繁にはシミアンウイルス
４０(ＳＶ４０)から導かれる。このさきのおよびあとの
プロモーターは、いずれも該ウイルスから、ＳＶ４０の
ウイルス性複製起源含有フラグメントとして容易に得ら
れるので特に有用である(ファイヤーズ(Ｆiers)ら、１
９７８“ネイチャー"２７３:１１３)。ＳＶ４０のより
小さい、またはより大きいフラグメントも、それらがウ
イルス性複製起源内に位置するＨindＩＩＩ部位からＢg
lＩ部位に至る約２５０bpの配列を含有している限り用
いることができる。更に、正常な状態でリンホトキシン
と関連しているヒト−ゲノムプロモーター、コントロー
ルおよび／または信号配列も、その様なコントロール配
列が宿主系に適合し得ることを条件として用いることが
でき、またしばしば好ましいことである。

【００６８】複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウイ
ルス性起源(例えばポリオーマ、アデノウイルスＶＳ
Ｖ、ＢＰＶ等)から得られるものの様に、外来性の起源
を含む様にベクターを組立てるか、あるいは宿主細胞の
染色体複製機構によって与えられる。もしもベクターが
宿主細胞染色体に組込まれるのなら、その様な染色体で
もよい。リンホトキシンは、高等動物の真核細胞をヒト
−プレリンホトキシンＤＮＡで形質転換することによ
り、アミノ末端のメチオニル化なしにつくられる。

【００６９】リンホトキシンとデヒドロ葉酸還元酵素
（ＤＨＦＲ)の両者を暗号化しているＤＮＡ配列を含む
ベクターでトランスフェクトするのに好適な哺乳類宿主
細胞を選択するに際しては、用いるＤＨＦＲタンパク質
のタイプに従って宿主を選択するのが適当である。野性
型ＤＨＦＲタンパク質を用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損
宿主細胞を選択するのが好ましく、そうすることによ
り、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選
択用培地内で、満足のいくトランスフェクションを選択
するためのマーカーとしてＤＨＦＲ暗号配列を用いるこ
とができる。この場合、好ましい宿主細胞はＤＨＦＲ活
性を欠くチャイニーズハムスターの卵巣(ＣＨＯ)細胞系
統であり、これは、ウーラウブおよびチャッシン(Ｕrla
ub and Ｃhasin)(１９８０、“プロシーディングス・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
イズ"(ＵＳＡ)７７:４２１６)の述べた如くにして調製
し、増殖させることができる。

【００７０】他方、メトトレキセート(ＭＴＸ)に対する
結合親和性の低いＤＨＦＲタンパク質をコードしている
ＤＮＡをコントロール配列に用いる場合には、ＤＨＦＲ
耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然変異ＤＨ
ＦＲはＭＴＸ耐性であるので、宿主細胞自身がＭＴＸ感
受性であるならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段として
用いることができるからである。ＭＴＸを吸着すること
のできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート感受性
であると思われる。その様な、有用な細胞系統の１つは
ＣＨＯ系、ＣＨＯＫ１(ＡＴＣＣＮo．ＣＣＬ６１)であ
る。

【００７１】形質転換された宿主細胞とは、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて組立てられたリンホトキシンベクターで
形質転換またはトランスフェクトされた細胞である。形
質転換された細胞は通常、リンホトキシンを発現する。
発現されたリンホトキシンは、一般に細胞内に保持され
る。

【００７２】リンホトキシンは、非分泌細胞での組換え
培養物から、これを溶解し、次いで遠心分離する等によ
って顆粒成分を除去することにより回収される。リンホ
トキシン分泌細胞の場合は、遠心によって培養上澄液か
らこれを分離する。不純物を含むリンホトキシン溶液
を、上で示した方法、または後述の実施例４に示すイム
ノアフィニティ法より、精製する。薬学的な使用に適す
る程度に精製した後、リンホトキシンを通常の使用形
態、例えば投薬ビンや注射器に入れる。リンホトキシン
の混合物、例えば一連の細胞毒性を示すリンホトキシン
突然変異体を用いる。リンホトキシンの長期保存には凍
結乾燥が適しており、あるいは安定剤や賦形剤を入れた
水溶液(例えば等張食塩水)に入れ、Ｂ．アガーワル
(Ｂ．Ａggarwal)らがヨーロッパ特許出願第１００６４
１号で開示している様に患者に対して投与することがで
きる。

【００７３】リンホトキシン組成物は、腫瘍を有する動
物に投与することができる。投与経路は、静脈内、腹腔
内、皮下、筋肉内投与、滅菌リンホトキシン溶液の病巣
内注入または注射の如き既知の方法により、あるいは以
下に述べる如き放出時間調節系により投与することもで
きる。リンホトキシンは病巣内投与(即ち、固状の腫瘍
内に直接注射する)し得る。白血病の様な播種性腫瘍の
場合には、静脈内またはリンパ系への投与が好ましい。
卵巣腫瘍の様な腹部器官の腫瘍は、腹膜透析器を使用
し、腹膜適合性の溶液で腹腔内に注入することにより、
有効に治療できる。ボーラス注入も可能であるが、通
常、リンホトキシンは連続注入法で投与する。

【００７４】リンホトキシンは、埋め込み可能な、時間
調節製品を介して投与することができる。リンホトキシ
ンの二量体または三量体の分子量を有するタンパク質に
対する適当な系の例には、Ｌグルタミン酸とγ−エチル
−Ｌ−グルタマートとのコポリマー(Ｕ．シドマン(Ｕ．
Ｓidman)ら、１９８３、“バイオポリマーズ(Ｂiopolym
ers)"２２(１):５４７−５５６)、ポリ(２−ヒドロキシ
エチル−メタクリレート)[Ｒ．ランガー(Ｒ．langer)
ら、１９８１“ジャーナル・オブ・バイオメディカル・
マテリアルズ・リサーチ(Ｊ．Ｂiomed．Ｍater．Ｒe
s．)"１５:１６７−２７７、およびＲ．ランガー、１９
８２“ケミカル・テクノロジィ(Ｃhem．Ｔech．)"１２:
９８−１０５]またはエチレングリコール(Ｒ．ランガー
ら、同)が含まれる。リンホトキシン含有製品は腫瘍が
切除された後の外科的部位に埋め込まれる。別法とし
て、リンホトキシンを半透膜のマイクロカプセルまたは
リポゾーム内に封入し、腫瘍内部へ注射してもよい。こ
の方法は、脳腫瘍の如き外科的な切除術を適用できない
腫瘍に対して特に有用である。

【００７５】リンホトキシンの投与量は、例えば、投与
経路、問題となっている腫瘍、および患者の症状等によ
って左右される。治療を施す者は、標的腫瘍に対して適
切な細胞毒性を奏す様に、例えば腫瘍の生検、または胎
生期がん抗原の如き推定の腫瘍マーカーの診断学的測
定、等により、用量の増加に伴う組換え体の毒性を考慮
しながら用量を検討して定め、投与経路を改良する必要
がある。通常、マウスに対しては、組換えリンホトキシ
ン約５０〜２００μg／kg体重／日の静注投与が実質
上、非毒性であり、インビボで有効であることが分かっ
ている。もちろん、この投与計画は動物が異なれば変化
する。

【００７６】本発明はまた、リンホトキシン中和抗体の
製造法をも提供するものである。本明細書中では中和抗
体を、ここで定義したリンホトキシンと免疫学的に結合
し、その活性を、後に述べるネズミＬ９２９アッセイの
様な細胞抑制または細胞溶解性リンホトキシン活性の測
定法において、実質上減少させることができる抗体であ
る、と定義する。この抗体がリンホトキシンの活性を中
和し得るということは、必ずしも該抗体がリンホトキシ
ンの活性部位または受容体結合部位に結合しなければな
らない、という意味ではない。抗体は、その様な臨界的
な部位に隣接した領域(即ち、これは立体配座の上で隣
接していることを意味し、アミノ酸配列という観点か
ら、隣接していることは必須でない)に立体的(ステリカ
リー)に結合している場合にも、実質上、リンホトキシ
ン活性を中和し得る。

【００７７】リンホトキシンに対する中和モノクローナ
ル抗体を調製する試みにおいて、マウスの体内でリンホ
トキシン中和抗体を生成させ、あるいは高めるように該
動物を免疫することが困難であるということが分かっ
た。リンパ芽球様リンホトキシン、あるいはグルタルア
ルデヒドと交差結合したリンホトキシンのいずれで免疫
した場合にも、免疫化されたマウス中に酵素免疫法で検
出可能な非中和性の抗−リンホトキシン抗体は生成して
いるにも拘らず、該動物の血清中には、検出可能な中和
抗体は生成されなかった。しかしながら、リンホトキシ
ン−明ばん(alum、水酸化アルミニウムまたはアルミ
ナ、Ａl₂Ｏ₃・３Ｈ₂Ｏ)吸着コンプレックスで免疫すれ
ば、この明ばんコンプレックスで免疫する前には活性な
抗体を生成し得なかった動物においても中和抗体を惹起
させ得る。明ばんの製造方法および抗血清製造のための
その使用についてはＣ．ウイリアムス(Ｃ．Ｗilliams)
らが開示している(Ｃ．ウイリアムス編、１９６７、メ
ソッズ・イン・イムノロジィ・アンド・イムノケミスト
リィ(Ｍethods in Ｉmmunology and Ｉmmunochemis
try)Ｉ、pp１９７−２２９)。

【００７８】中和抗体を産生する動物の脾細胞とネズミ
骨髄腫細胞との融合物を調製する。中和抗体を合成する
１個のクローンを同定するためには、平均、約５０〜１
００個のクローンをスクリーニングする必要がある。所
望の活性を有するクローンののスクリーニング法は当該
技術分野において日常的に、容易に行なわれており、極
く僅かな実験作業で再現することができる。

【００７９】免疫された動物から得た血清、血漿、また
はＩgＧフラクションは、免疫動物の脾臓またはリンパ
細胞から得られたハイブリドーマによって分泌される免
疫グロブリンと同様、本発明において使用することがで
きる。本発明の好ましい態様では、中和抗体は実質上、
ハイブリドーマ培養物中の他の抗−リンホトキシン抗体
を含まない状態で得られる。

【００８０】中和抗体を、ポリスチレンの様な熱プラス
チック等の表面に吸着させるか、臭化シアン活性化セフ
ァロースの如きマトリックス構造と共有結合的に結合さ
せることにより、固定化する。次いで、これをイムノア
ッセイまたはイムノアフィニティ精製法に用いる。この
抗体は中和抗体なので、生物学的に活性なリンホトキシ
ンまたはそのフラグメントのみを吸着しやすく、それら
を検出しやすい。この抗体は、非中和性の抗−リンホト
キシン・モノクローナル抗体または非中和性の抗−リン
ホトキシンを含有するポリクローナル抗血清に関するイ
ムノラジオメトリック・イムノアッセイ(“サンドイッ
チ法")に用いるのに、特に有用である。この免疫検定
(イムノアッセイ)は、蛍光、化学発光、または放射性同
位元素等の検出可能な物質により、当業者周知の標識化
法で有効に標識した中和抗体または非中和抗体を、標識
化成分として用いて行なう。リンホトキシンのための競
合型のイムノアッセイにおいては、同様にしてリンホト
キシンを標識する。リンホトキシンおよびリンホトキシ
ン抗体トレーサーの製造にはクロラミン−Ｔラジオアイ
オディネーション(放射性沃素化)が好適であり、あるい
はＪ．クロスターガード(Ｊ．Ｋlostergaard)らの方法
(“モレキュラー・イムノロジィ(Ｍol．Ｉmmun．)"１
８:４５５(１９８０))も採用することができる。

【００８１】実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用
いられる方法を短い熟語に略して示す。ブラスミドは小
文字のpを先頭にし、そして／または大文字および／ま
たは数字を続けることによって表わされる。本発明の出
発物質であるプラスミドは市販されているか、または非
制限的な施設から一般に入手可能であり、あるいはこの
様にして入手し得るプラスミドから、公知の方法に従っ
て組立てることができる。更に、その他の同等なプラス
ミドも当業者には知られており、通常の技術者にとって
は自明であろう。

【００８２】ＤＮＡの“消化"とは、ＤＮＡを、該ＤＮ
Ａのある位置に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂
することを指す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵
素にとって特異的な部位を制限部位(サイト)と称する。
“部分"消化とは、制限酵素による不完全な消化であ
り、与えられたエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質
中の部位の全てでなく、そのうちのいくつかを開裂する
様な条件を選ぶことをいう。本発明において用いる様々
な制限酵素は市販品されており、その反応条件、コファ
クター、およびその他必要なものは、酵素の供給業者の
指示に従って使用した。制限酵素類は、各制限酵素が最
初に得られた微生物を表示する大文字、次いで他の文
字、更に、通常、数字からなる略号で表わされる。一般
に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメント
は、約２０μｌの緩衝液中、約１単位の酵素と共に使用
する。特定の酵素について適当な緩衝液および基質の量
は、製造業者によって明示されている。通常、インキュ
ベーション時間は３７℃で１時間とするが、供給者の指
示に従ってかえてもよい。インキュベーションした後、
フェノールおよびクロロホルムでタンパク質を抽出して
回収し、水性のフラクションからエタノール沈澱によっ
て消化された核酸を回収する。制限酵素による消化の
後、５'末端のホスフェートを細菌性アルカリホスファ
ターゼで加水分解することが多い。これは、ＤＮＡフラ
グメントの２つの制限的開裂末端が“閉環(サーキュラ
イディング)"したり、閉じたループを形成することによ
り、該制限部位に他のＤＮＡフラグメントが挿入されに
くくなるのを防止するためである。明示しない限り、プ
ラスミドの消化には、５'末端の脱りん反応は伴わない
ものとする。脱りんの方法および試薬は常法に従う
(Ｔ．マニアティス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、１９８２、モレ
キュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)pp．１
３３−１３４)。

【００８３】制限酵素による消化によって得られたＤＮ
Ａフラグメントの“回収"または“単離"とは、この消化
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて分離し、
フラグメントの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフ
ラグメントのそれと比較して所望のフラグメントを同定
し、該フラグメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲ
ルからＤＮＡを分離することを意味する。この方法は一
般的に知られている。例、Ｒ．ローン(Ｒ．Ｌawn)ら、
１９８１、“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"９:６
１０３−６１１４およびＤ．ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)
ら、１９８０“ヌクレイック・アシッズ・リサーチ"８:
４０５７参照。

【００８４】“サザーン分析"とは、消化物またはＤＮ
Ａ含有組成物中のＤＮＡ配列の存在を、既知の標識した
オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイ
ブリダイゼーションによって確認する方法である。本明
細書中では、特に断らない限り、サザーン分析という時
は、Ｅ．サザーン(Ｅ．Ｓouthern)、１９７５“ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジィ(Ｊ．Ｍol．
Ｂiol．)"９８:５０３−５１７、の方法に従って消化物
を１％アガロース上で分離し、変性し、そしてニトロセ
ルロース上に移し、Ｔ．マニアティスらの方法(１９７
８、“セル"１５:６８７−７０１)に従ってハイブリダ
イゼーションを行なうことを意味する。

【００８５】“形質転換"とは、ＤＮＡを生物内に導入
することを意味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分とし
て、あるいは染色体内に組込まれて複製されることを意
味する。特に明示しない限り、本発明における大腸菌の
形質転換法にはマンデル(Ｍandel)らのＣaＣl₂法(１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ィ"５３:１５４)を採用した。

【００８６】“ライゲーション(結合)"とは、２個の二
重鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形
成する工程を言う(Ｔ．マニアティスら、前掲p１４
６)。特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩
衝液と条件を使用し、略等モル量のライゲートすべきＤ
ＮＡ０．５μg当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ(“リガーゼ")
１０単位を用いて行う。

【００８７】形質転換体からＤＮＡを“調製する"と
は、プラスミドＤＮＡを微生物培養物中から単離するこ
とを意味する。明示しない限り、マニアティスらのアル
カリ性／ＳＤＳ法(同上)を採用する。

【００８８】“オリゴヌクレオチド"とは、短い一本鎖
または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、実施
例１に記載の引用文献の方法によって化学的に合成さ
れ、次いでポリアクリルアミドゲル上で精製されたもの
である。

【００８９】引用した文献は全て参照例として示した。

【００９０】実施例１ リンホトキシンの精製および配
列決定 ヒトのリンパ芽球様セルラインＲＰＭＩ−１７８８(Ａ
ＴＣＣ ＮＯ．ＣＣＬ−１５６)を、１５Ｌのスピナー
(撹拌)フラスコ中、血清不含培養培地(ＲＰＭＩ−１６
４０)を使って、４×１０⁵細胞／mlの細胞密度になるま
で増殖させた。血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培地中にフ
ォルボール(phorbol)ミリステートアセテート２０ng／m
lを含ませることによってリンホトキシンを基礎レベル
の１０〜２０倍生成させた(下記の方法で測定した場
合、５００〜１０００リンホトキシン単位／ml)。培養
６５時間後に細胞を濾取回収し、５mＭリン酸緩衝液(p
Ｈ７．４)で平衡化した、５cm×２０cmのカラム中の、
孔径を調節したガラスビーズ(Ｅlectronucleonics)に、
濾液中のリンホトキシン活性物を吸収させ、５mＭリン
酸緩衝液(pＨ７．４)中の５０％エチレングリコールで
溶出した。この精製中、微生物の増殖を阻止するため
に、全ての緩衝液に０．１mＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド(ＰＭＳＦ)、プロテアーゼ阻害剤および
１mＭのアジ化ナトリウムを含ませた。ガラスビーズか
らの溶出液は８４,０００単位のリンホトキシン／mgタ
ンパク質を含んでいた。次いで、アガルウォール(Ｂ．
Ａggarwal)らの方法[ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)、２５９、
(１):６８６−６９１]に従い、ＤＥＡＥセルロースクロ
マトグラフィー、レンチル(Ｌentil)レクチンセファロ
ースクロマトグラフィーおよびプレパラティブ天然ＰＡ
ＧＥを行なった。細胞毒性活性に関与しているタンパク
質であるかどうかは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、リクロソルブ
(Ｌichrosorb)ＲＰ−１８カラムでの逆相ＨＰＬＣおよ
びアミノ末端配列決定により調べた。

【００９１】このリンホトキシン標本は、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにおいて約２５,０００の分子量を示すロイシンア
ミノ末端リンホトキシンを９５重量％以上含んでいた。
このＮ−末端ロイシン種のタンパク成分の理論分子量は
１８,６６４ダルトンであり、残りの約６,５００ダルト
ンはＡsn⁺６２のグリコシル側鎖と、多分、その他のＯ
−結合糖残基によるものである。組織培養の上清は、こ
の種類の推定上のマルチマー(多量体)を含んでいた(Ｔ
ＳＫ−ＨＰＬＣにより６０,０００Ｄa、あるいはセファ
デックスＧ−１００クロマトグラフィーにより６４,０
００Ｄa)。

【００９２】このリンホトキシン混合物の残りの５％
は、分子量約２０,０００のＮ末端ヒスチジン種であっ
た。この両種の物質は、少なくとも、下に述べるネズミ
線維芽細胞溶解分析法に由来する偏差の限度内で、実質
的に同じ細胞溶解活性を示す。

【００９３】無傷のリンホトキシン分子をトリプシン消
化すると、ほんの少数のフラグメントが得られた。ヒス
チジン・アミノ末端リンホトキシンは、８９位および９
０位のアミノ酸間で２個のフラグメントに消化され、一
方、ロイシン・アミノ末端体は、トリプシン消化によ
り、１５位と１６位、１９位と２０位、および８９位と
９０位間で切断された４個のフラグメントを生成した。

【００９４】エドマン(Ｅdman)の分解法によってミクロ
配列決定を行なうことにより、無傷の分子およびトリプ
シン開裂により生成したフラグメントについての配列情
報が得られた。

【００９５】カルボキシペプチダーゼＰおよびキモトリ
プシン消化、酢酸消化および臭化シアン開裂により生成
したリンホトキシンフラグメントにより、更に配列情報
を得た。この方法により、ヒトリンホトキシンのほとん
ど全配列を決定した。１５６個の隣接残基群はアミノ末
端から決定した。この配列情報により、２つのリンホト
キシン種間の違いは、ヒスチジンアミノ末端種には存在
しない２３個のアミノ末端残基をロイシンアミノ末端種
には存在するという事実であることが明らかになった。
最初の３個の残基の先のカルボキシ末端配列は、この領
域に、ある種のペプチド結合が存在すること、およびそ
の残基が疎水性であることから、決定するのが困難であ
ることがわかった。

【００９６】ミクロ配列決定により測定したタンパク質
の配列をコードする様に合成遺伝子を設計した。この遺
伝子設計には、一般的な大腸菌のコドンバイアス(性癖)
を採用した。即ち、めったに使われない大腸菌コドン
は、この配列に使用しなかった。大腸菌コドンバイアス
が明らかでない場合は、ヒトにとって好ましいコドンで
代用した。このバイアスは、大腸菌における発現に役立
つ様に、そしてまた、この合成遺伝子がヒトcＤＮＡま
たはゲノムライブラリーからの天然のＤＮＡ配列を同定
するためのプローブとして役立つ様に選択した。フラグ
メントの組立てに役立つ様に、そしてその後の遺伝子操
作を可能にするために、特異な制限部位ＸbaＩ、ＢamＨ
Ｉ、ＨindＩＩＩおよびＢglＩＩを配列内にデザインし
た。

【００９７】マテウシ(Ｍ．Ｍatteucci)らの方法[ジャ
ックス(Ｊ．Ａmer．Ｃhem．Ｓoc．)、１０３: ３１８５
−３１９０、１９８１]およびボイカーゲ(Ｓ．Ｂeaucag
e)らの方法[テトラヘドロンレタース(Ｔet．Ｌetter
s)、２２: １８５９−１８６２、１９８１]である固相
ホスファイト法により、合成リンホトキシン遺伝子のた
めに設計された５８オリジナルオリゴマーを合成した。
１６塩基から２０塩基の範囲のこれらのオリゴマーの寸
法を図１に示す。オリゴマー間の重複は長さが６塩基で
あり、特異的である様に設計した。全遺伝子を図２およ
び図３に示した様に組立てた。

【００９８】この遺伝子は３個の断片にして組立てた。
最初の断片、セグメントＡは、長さ１１７の塩基対であ
り、ロイシンアミノ末端種のアミノ末端の５'暗号領域
を表している。セグメントＢはリンホトキシン分子の中
央部をコードしている長さ１４５塩基対のＤＮＡであ
る。長さ２１７塩基対のセグメントＣは、リンホトキシ
ンカルボキシ末端の、１６アミノ酸残基を除く全てをコ
ードしていると考えられるものである。各セグメントを
合成するのに必要なオリゴマーは、電気泳動により精製
してプールした。合成の誤りを減らすために、比較的寸
法の小さいオリゴマー(即ち、１６〜２０塩基)を選ん
だ。

【００９９】５０μl中に２０mＭトリス−ＨＣl(pＨ
７．５)、１０mＭ ＭgＣl₂、２０mＭジチオトレイッ
ト、０．５mＭ ＡＴＰ、および１５単位のＴ₄ポリヌク
レオチドキナーゼを含んでいる反応系で、各グループの
オリゴマーをリン酸化した。この反応系には約５０ピコ
モルの各オリゴマーを含ませた。３７℃で３０分間反応
させた後、反応物を６５℃に加熱してキナーゼ活性を失
活させ、１時間かけて２０℃まで徐々に冷却した。リン
酸化したオリゴマーに１０単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼを
添加し、２０℃で２時間反応させて結合させた。ＤＮＡ
リガーゼを加熱して失活させ、連結したオリゴマーを、
設計した末端部位を認識する制限酵素(エンドヌクレア
ーゼ)例えばセグメントＡについてはＸbaＩおよびＢam
ＨＩ)によって３７℃で３時間消化した。各セグメント
のフラグメントを、７％ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動により分離した。正しい移動率のフラグメント
を、各セグメントについて、エチジウムブロミド染色法
で同定し、ゲルから電気溶出した。pＦＩＦ trp６９[ゲ
ッデル(Ｇoeddel)らのネーチャー(Ｎature)、２８７:
４１１−４１６(１９８０)、またはクレア(Ｃrea)らの
ヨーロッパ特許出願第００４８９７０号参照]をＸbaＩ
およびＢamＨＩで消化し、大きいベクターフラグメント
を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し
た。セグメントＡ約５０ngをpＦＩＦtrp６９フラグメン
トに結合させた。同様にして、セグメントＢをＢamＨＩ
およびＨindＩＩＩ消化pＢＲ３２２に、そしてセグメン
トＣをＨindＩＩＩおよびＢglＩＩ消化pＬeＩＦＡ−１
２５−１に結合した[ゲッデル(Ｄ．Ｇoeddel)ら、ヌク
・アシッド・レス(Ｎuc．Ａcids Ｒes．)、８: ４０５
７−４０７３、１９８０参照]。

【０１００】このライゲーション(結合、連結)混合物を
使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換し、得られ
た組換えプラスミドの特性を、制限酵素分析およびマキ
サムおよびギルバート(Ｍaxam and Ｇilbert)の化学分
解法によるＤＮＡの配列決定法により決定した。６個の
セグメントＡクローンの内５個が正しい配列を含んでい
た。４個のセグメントＢおよび４個のセグメントＣプラ
スミドを分離した。これらの全ての挿入物は正しい配列
を持っていた。各セグメントを、末端部位を認識する制
限エンドヌクレアーゼで消化して分離し、ＸbaＩおよび
ＢglＩＩで消化したプラスミドベクターpＦＩＦtrp６９
に結合させた。得られた組換えプラスミド、pＬＴＸＢ
１を、挿入したＸbaＩ−ＢglＩＩフラグメントを配列化
することにより特性化した。これは図１に示された配列
を含んでいた。

【０１０１】この合成遺伝子が生物学的に活性なリンホ
トキシンを実際に生産するかどうかを調べるために、大
腸菌pＬＴＸＢ１形質転換体を、trpプロモーターを脱抑
制し合成リンホトキシン遺伝子を発現し得る条件下、最
小培地中で増殖させた。５５０nmにおける光学密度が
１．０になるまで培養し、遠心分離により回収した。細
胞ペレットを１／１０容に懸濁し、音波破壊により溶菌
した。

【０１０２】リンホトキシン活性は、スポフォード
(Ｂ．Ｓpofford)の改良細胞溶解法[ジャーナル・イミユ
ノロジー(Ｊ．Ｉmmunol．)、１１２: ２１１１、１９８
４]に従って測定した。簡単に説明すると、マウスのＬ
−９２９線維芽細胞を、アクチノマイシンＤの存在下、
マイクロタイター平板で増殖させる。１２〜１８時間
後、リンホトキシンを分析しようとする順次希釈した試
料を各ウエルに加える。１８時間後、平板を洗浄し、リ
ンホトキシンによって惹起された細胞の溶解(菌)性を、
メタノール:水(１:４v／v)中の１％クリスタル・バイオ
レット溶液で平板を染色し、平板に付着したものを検出
することにより検出した。染色の強さを肉眼およびダイ
ナテク(Ｄynatech)分光器を使って４５０nmおよび５７
０nm透過率の吸収により、分光光度学的に測定した。培
地のみと一緒にマイクロタイターウエルに入れた細胞を
０％溶菌と定め、３Ｍグアニジン塩酸塩溶液を入れたも
のを１００％溶菌の終末点とした。各ウエルに入れた１
２,０００細胞の内の５０％の細胞を溶菌するのに必要
な量をリンホトキシン１単位と定義する。

【０１０３】細胞毒性活性を分析するためのその他の方
法も使用し得ることに留意すべきである[アガルウオル
(Ｂ．Ａggarwall)らの「チミックホルモンとリンホキン
(Ｔhymic Ｈormones and Ｌymphokines)」、１９８
３、編者、ゴールドシュタイン(Ａ．Ｇoldstein)、スプ
リング・シンポジウム・オン・ヘルス・サイエンス、ジ
ョージ・ワシントン・ユニバーシティ・メディカル・セ
ンター(Ｓpring Ｓymposium on Ｈealth Ｓcience
s, Ｇeorge Ｗashington Ｕniv．Ｍedical Ｃente
r)](ここでＡ５４９セルライトと呼ばれているものは、
ＡＴＣＣから、ＣＣＬ１８５として入手可能)。培養溶
菌液は、上記のネズミの細胞分析において、検出不能の
細胞溶解活性を示した。ガンマーインターフェロンを発
現する培養物からの対照溶菌液は、ガンマーインターフ
ェロン活性を含んでいた。この結果は、合成遺伝子が活
性リンホトキシンをコードづけていなかったことを示唆
していた。これにはいくつかの説明が成り立つ。例えば
(１)大腸菌がリンホトキシンを分解した、(２)リンホト
キシン遺伝子は大腸菌では転写されなかった、(３)リン
ホトキシンの情報(メッセージ)が大腸菌内で翻訳されな
かった、(４)タンパク質配列決定の誤りにより、タンパ
ク質が適切な配列を持っていなかった、または(５)リン
ホトキシン分子の活性または適切な立体配置には、１６
の残基カルボキシ末端配列またはその一部が実際に必要
である。

【０１０４】実施例２ リンホトキシンをコードしてい
るcＤＮＡの入手法 ホルボールミリステートアセテート(１０ng／ml)、スタ
フィロコッカルエンテロトキシンＢ(１μg／ml)および
チモシンα−１[ベルガー(Ｓ．Ｂerger)らのバイオケミ
ストリー(Ｂiochemistry)、１８: ５１４３−５１４
９、１９７９]で誘導した４８時間後に、ヒトの末梢血
液リンパ球の非粘着(付着)細胞フラクションの培養物は
４００単位のリンホトキシン活性／上清１mlを生産して
いた。このmＲＮＡを固定化オリゴdＴに吸着させて濃縮
し、溶出し、逆転写[グレイ(Ｐ．Ｇray)らのネーチヤー
(Ｎature)、２９５: ５０３−５０８、１９８２参照]に
よりcＤＮＡを調製した。メッセンジャーＲＮＡのcＤＮ
Ａコピーを作成するために逆転写酵素を使用し、第２の
鎖をクレノー(Ｋlenow)処理により常法通り調製し、そ
のcＤＮＡをＳ−１ヌクレアーゼで処理してヘアピンル
ープを除去した。このcＤＮＡをベクターに挿入するた
めに、その末端をアダプターまたはリンカーと結合さ
せ、予定の制限酵素部位のための５'および３'制限酵素
部位、または好ましくは粘着末端を作成した。この目的
に式:

【化３】 ５'ＨＯ−ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＴＴＡＣＡＧ ＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＡＴＧＴＣ−Ｐ５' のオリゴヌクレオチドを使用した。このオリゴヌクレオ
チドをcＤＮＡに結合させ、そのcＤＮＡをポリアクリル
アミドゲル電気泳動法によって再び分離した。一般に入
手可能なファージλgt１０(またはその実質的な等価
物、λgt１１、これはＡＴＣＣから入手できる)をＥco
ＲＩで消化し、線状フラグメントを回収した[ウイッケ
ンズ(Ｍ．Ｗickens)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．)、２５３: ２
４８３−２４９５、１９７８]。リンカーを付けた逆転
写体とこのλgt１０消化物をライゲート(結合)させ、こ
のライゲーション混合物を使って、大腸菌Ｃ−６００ま
たはその他のλファージ感染に感受性のある既知の宿主
をトランスフェクト(ＤＮＡ感染)した。約１０,０００
の組換えファージを１５cmのプレートにまき、低ストリ
ンジエンシーのプラーク・ハイブリダイゼーション法
[マニアテイス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、セル(Ｃell)、１５:
６８７−７０１、１９７８、およびグレイ(Ｐ．Ｇray)
ら、プナス(ＰＮＡＳ)、８０: ５８４２−５８４６]に
より、図１のセグメントＡから調製した³²Ｐ−標識プロ
ーブを使ってスクリーニグした[この標識プローブは、
テイラー(Ｊ．Ｔaylor)らの方法(バイオケミック・バイ
オフィジク・アクタ(Ｂiochem．Ｂiophys．Ａcta)、４
４２: ３２４−３３０、１９７６)に従って調製した。
ここで牛胸線ＤＮＡプライマーを使用した(ＰＬ Ｂioc
hemicals)]。２０％ホルムアミド中の５×１０⁷cpmのプ
ローブを使用し、低ストリンジエンシー法により２重の
ニトロセルロースフィルターをハイブリダイズさせた。
フィルターを、０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０３Ｍク
エン酸ナトリウムおよび０．１％トデシル硫酸ナトリウ
ム(ＳＤＳ)中３７℃で２回洗浄した。

【０１０５】２個のファージがこのプローブとハイブリ
ダイズし、プラーク精製を行なった。精製したファージ
は、セグメントＡプローブとセグメントＢから調製した
プローブの両者とハイブリダイズした。２個のハイブリ
ダイズファージ、λＬＴ１およびλＬＴ２のcＤＮＡ挿
入物をＭ１３mp８にサブクローンし、ジデオキシ鎖ター
ミネーション法[スミス(Ａ．Ｓmith)、メソッド・イン
・エンザイモロジー(Ｍethods in Ｅnzymology)、１
９８０、６５: ５６０−５８０]により配列決定した。
λＬＴ２の挿入体は僅か６００bpであり、リンホトキシ
ンのための全３'暗号領域を含んでいなかった。λＬＴ
１の挿入体はロイシンアミノ−末端リンホトキシンのた
めの全暗号領域および６５０bp３'非翻訳領域(一致した
ポリアデニル化信号を含む)およびロイシン末端への１
８アミノ酸アミノ末端のためのコドンを含んでいた。こ
れは全リンホトキシン暗号領域を構成していなかったの
で、λＬＴ１のcＤＮＡ挿入体から、更に³²Ｐ−標識プ
ローブを調製し、非常に厳密に追加の２５,０００組換
えλgt１０ファージのスクリーニングに使用した[フィ
ーン(Ｔ．Ｈuynh)ら、プラクチカル・アプローチ・イン
・バイオケミストリィ(Practical Ａpproaches in
Ｂiochemistry)、ＩＲＬプレス、オックスホード]。１
２の追加のハイブリダイズファージを分離し、最も長い
挿入体の配列を(λＬＴ１１から)、図４および図５に示
した。最も長いオープン・リーディング・フレームは、
最初に観察されたＡＴＧから出発して翻訳された。各列
の上の番号はアミノ酸の位置、各列の下の番号はヌクレ
オチドの位置を表している。１の記号を付したロイシン
残基は、ロイシンアミノ末端リンホトキシン(図１)の配
列決定された最初の残基であり、多分、成熟リンホトキ
シン種の最初のアミノ末端残基である。最初の３４残基
はシグナル配列である。１５６−１７１残基はリンホト
キシンのタンパク配列決定法により決定できなかったの
でヌクレオチド配列から転用した。

【０１０６】実施例３ ロイシンアミノ末端リンホトキ
シンのためのハイブリッド合成遺伝子／天然のcＤＮＡ
発現ベクターの組立て

【０１０７】この組立ては図６に示した。pＬＴＸＢ１
(非活性合成遺伝子を含む)をＥcoＲＩとＰstＩで部分消
化し、リンホトキシンの１２５Ｎ−末端残基をコードし
ているＤＮＡを含んでいる６８５bpフラグメントを回収
した。部分的ＰstＩ消化を行った理由は、残基１０にも
う１つのＰstＩ部位が存在するからである(図１)。リン
ホトキシンのＣ−末端の５１個のアミノ酸をコードして
いるＤＮＡを含んでいる３０１bpフラグメントを、λＬ
Ｔ１のサブクローンしたcＤＮＡをＥcoＲＩとＰstＩで
消化することにより分離した(これらの部位は、図４お
よび図５において、５５４および８５５ヌクレオチド位
に示されている)。これらのフラグメントを、５％ポリ
アクリルアミド上の電気泳動および電気溶出により分離
した。このフラグメントを、バックグランド形質転換体
を減らすために、ＥcoＲＩで消化し細胞性アルカリホス
ファターゼで脱リン酸化したpＢＲ３２２に結合させ
た。得られた発現プラスミド、pＬＴtrp１の適切な方向
性および配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびＤ
ＮＡ配列決定法により特徴づけた。ロイシンアミノ末端
リンホトキシンは、大腸菌３１４４６をpＬＴtrp１で形
質転換し、その形質転換体をテトラサイクリン含有培地
中、ＯＤが１．０になるまで３７℃で４〜６時間培養す
ることにより発現させた。細胞溶解液は細胞毒性活性を
持っていた。発現されたリンホトキシン種のロイシンア
ミノ末端は、保護されたメチオニン残基で置換されるこ
とがわかった。この合成の生成物はメチオニン残基では
なくホルミルメチオニンであると考えられる。

【０１０８】実施例４ リンホトキシンの免疫アフィニ
ティーによる精製 抗リンホトキシンを分泌するネズミのモノクロナールセ
ルラインをマウス中で増殖させ、イオン交換クロマトグ
ラフィーにより、腹水から精製した。イオン交換溶出物
を、臭化シアン活性化セファロースに、２mg／ml(樹脂)
の濃度でカップリングさせた。２０mlのカラムをＴＢＳ
(０．０５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ７．０)、０．１５Ｍ塩
化ナトリウムおよび２mＭ ＥＤＴＡを含有している)、
次いで溶出緩衝液(０．１Ｍ酢酸(pＨ４．５)、１５０m
Ｍ塩化ナトリウム)、および最後にＴＢＳで順次平衡化
させた。pＬＴtrp１−形質転換大腸菌の音波処理溶菌液
(先に遠心分離により清澄化したもの)の４０％飽和硫酸
アンモニウム沈澱物を０．１Ｍトリス塩酸(pＨ７．４)
および５mＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、１時間当たり１カラ
ム容量の割合でカラムに入れた。０．０５％のツウイー
ン２０を含んでいるＴＢＳでよく洗浄した後、溶出用緩
衝液で特異的に結合した物質を溶離し、直ちにpＨを、
０．１容量の１Ｍトリス−ＨＣl(pＨ８．５)で７．８に
調節し、４℃で保存した。この精製したリンホトキシン
の比活性は、上記のネズミＬ−９２９分析法で測定した
ところ、２−１０×１０⁷単位／mgであった。

【０１０９】この溶出液は、カラムに入れた活性の大部
分を含んでいた。全溶出タンパクの大部分は、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法において、還元条件下
でも、非還元条件下でも、単一のバンド(帯)として泳動
した。このバンドの移動率は、約１８,０００ＭＷに相
当し、これは、推定したアミノ酸配列に基づくグリコシ
ル化されていないロイシン−アミノ末端リンホトキシン
の予想値、１８,６６４ＭＷに合致している。その生物
活性を更に特性化するために、精製した組換えリンホト
キシンを、インビトロにおける細胞溶解活性、およびイ
ンビボにおける抗腫瘍活性について試験した。

【０１１０】実施例５ 組換えリンホトキシンのインビ
ボにおける生物活性 組換えのおよびリンパ芽球のリンホトキシンをインビボ
における腫瘍壊死分析法で試験した。ＭethＡ(a)肉腫を
感受性マウス[ＢＡＬＢ／ＣＸＣ５７Ｂ１／６f１または
ＣＢ６f１]中で７〜１０日間増殖させ、その腫瘍に、実
験例４のリンホトキシン、リンパ芽球のリンホトキシン
(既述の方法で調製し、精製)、または対照試料を直接注
射した。２０〜２４時間後にマウスを殺し、腫瘍を摘出
し、壊疽(ネクローゼ)の程度を組織学的に評価した。表
１に示した様に、組換えおよびリンパ芽球のリンホトキ
シンは、共に、インビボにおけるＭethＡ(a)肉腫に著し
いネクローゼを生ぜしめた。対照試料は、ＭethＡ(a)肉
腫のネクローゼを惹起しなかった。

【０１１１】

【表１】 組換えおよび天然のリンホトキシンによるインビボでのＭethＡ(a)肉腫のネク ローゼ 処置 肉腫ネクローゼ評価(マウス数) ＋＋＋ ＋＋ ＋ − 緩衝液１対照 − − − ３ リンパ芽球のＬ＊ ４ − − − (２５,０００単位) リンパ芽球のＬ ４ − − − (１０,０００単位) 組換えＬ １４ ２ ２ − (２００,０００単位) 組換えＬ ３ − − １ (２５,０００単位) 組換えＬ ３ − １ − (１０,０００単位)緩衝液２対照 − − − ９ ＊ Ｌ＝リンホトキシン

【０１１２】リンパ芽球のリンホトキシンは緩衝液１
（０．０１Ｍトリス−ＨＣl、０．０５Ｍ(ＮＨ₄)₂ＨＣ
Ｏ₃、pＨ８．０)に溶解して注射し、組換えリンホトキ
シンは緩衝液２(０．１５Ｍ ＮaＣl、０．１Ｍ酢酸ナト
リウム、および０．１Ｍトリス−ＨＣl、pＨ７．８)に
溶かして注射した。

【０１１３】組換え体の培養物(２−１０×１０⁷単位／
mg)によって調製されたリンホトキシン活性は、リンパ
芽球のリンホトキシン(４×１０⁷単位／mg)について報
告されているものと同じであったので、組換えリンホト
キシンに炭水化合が存在しないことは生物活性に影響を
与えない様である。

【０１１４】組換えリンホトキシン活性は天然のリンホ
トキシンに似た非耐熱性を示した。即ち、水溶液中、８
０℃で１時間加熱すると不活性化する。

【０１１５】実施例６ メチオニン・ヒスチジンアミノ
末端リンホトキシンのための発現ベクターの組立て メチオニン・ヒスチジンアミノ末端リンホトキシンを大
腸菌で発現するプラスミドの組立てを図７および図８に
示す。ヒスチジンアミノ末端リンホトキシンのヒスチジ
ンコドン(図４および図５の残基２４)に隣接して開始メ
チオニンコドンをコードする様に、発現プラスミドに合
成オリゴヌクレオチドを挿入した。これは、pＬＴtrp１
からＸbaＩおよびＣlaＩ消化によって４６３０bpベクタ
ーフラグメントを分離し、プレパラティブ１％アガロー
スゲル電気泳動および電気溶出により行った。リンホト
キシン暗号配列の大部分を含んでいる５７０bpＢamＨＩ
−ＣlaＩフラグメントを、同様にしてpＬＴtrp１から分
離した。先に述べた方法で２個の合成オリゴヌクレオチ
ドを合成し、図１のオリゴヌクレオチド６、７、５２お
よび５３と混合した。各オリゴヌクレオチド約５０ピコ
モルを、実施例１に記載した様にポリヌクレオチドキナ
ーゼで処理した。このオリゴヌクレオチドをアニーリン
グし、５７０bp ＢamＨＩ−ＣlaＩフラグメントおよび
４６３０bp ＸbaＩ−ＣlaＩベクターフラグメントの混
合物と結合させた。この結合混合物で大腸菌ＡＴＣＣ３
１４４６を形質転換し、組換え体を、テトラサイクリン
耐性に基づいて選択した。１個の形質転換体からプラス
ミドp２０ＫＬＴを回収した。プラスミドp２０ＫＬＴは
制限酵素およびＤＮＡ配列分析により特性化した。

【０１１６】実施例７ 細胞毒性性リンホトキシン融合
変異体の調製 リンホトキシンと細菌タンパク質との融合物をコードし
ているＤＮＡを含有しているプラスミドを、リンホトキ
シンの構造遺伝子に隣接した細菌性シグナル配列をコー
ドしている配列をクローニングすることにより組立て
た。大腸菌の熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)
のための遺伝子配列は特性化されており[ピッケン(Ｒ．
Ｎ．Ｐicken)ら、１９８３、インフェクション・アンド
・イミユニィティ(Ｉnfection and Ｉmmunity)、４
２: ２６９−２７５]、大腸菌のペリプラスム間隙へＳ
ＴＩＩを排泄させる２３個のアミノ酸シグナル配列をコ
ードしている。

【０１１７】プラスミドpＷＭ５０１[ピッケン(Ｐicke
n)ら、１９８３、インフェクション・アンド・イミユニ
ィティ、４２[１]: ２６９−２７５]は熱安定性エンテ
ロトキシン(ＳＴＩＩ)遺伝子を含んでいる。このＳＴＩ
Ｉ遺伝子をコードしているＤＮＡ部分を、以下の方法で
pＷＭ５０１から回収した。pＷＭ５０１をＲsaＩで消化
し、５５０bp ＤＮＡフラグメントを分離した。この遺
伝子フラグメントを、予めＳmaＩで消化したファージＭ
１３mp８[メッシング(Ｊ．Ｍessing)ら、“巨大分子に
ついての第３回クリーブランド・シンポジウム"、: 組
換えＤＮＡ、編者: ワルトン(Ａ．Ｗalton)、エルスビ
ール、アムステルダム[１９８１]、１４３−１５３頁]
に結合させた。結合したＤＮＡを使って大腸菌ＪＭ１０
１(Ｍ１３ファージと共に使用するための市販株)を形質
転換した。澄明なプラークを回収した。標準的な方法
[メッシングら、上記]を使い、このファージで感染させ
た大腸菌ＪＭ１０１から、２本鎖Ｍ１３mp８ ＳＴＩＩ
Ｒsa誘導体を分離した。今述べたＭ１３mp８サブクロー
ニング法を使うことにより、ＳＴＩＩリーダー遺伝子を
含んでいる約５５０塩基対フラグメントは今や、ファー
ジによって提供された一連の異なった制限エンドヌクレ
アーゼで囲まれている。次いで、このＭ１３mp８ ＳＴ
ＩＩ Ｒsa 誘導体をＥcoＲＩおよびＰstＩで消化し、５
５０bpＤＮＡフラグメントより少し大きいＤＮＡフラグ
メントを分離した。

【０１１８】このＥcoＲＩ−ＰstＩフラグメントをpＢ
Ｒ３２２にサブクローンした。これは、pＢＲ３２２を
ＥcoＲＩとＰstＩで消化し、このベクターを単離するこ
とにより行った。単離したベクターをＥcoＲＩ−ＰstＩ
ＤＮＡフラグメントに結合させた。このＤＮＡ混合物
を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換し、テト
ラサイクリン耐性コロニーを選択した。耐性大腸菌コロ
ニーからプラスミドを分離し、pＳＴＩＩ−部分体と命
名した。

【０１１９】pＳＴＩＩ−部分体をＭnlＩおよびＢamＨ
Ｉで消化し、ＳＴＩＩシャイン−ダルガルノ(Ｓhine−
Ｄalgarno)配列、ＳＴＩＩシグナル配列、および成熟Ｓ
ＴＩＩ遺伝子の最初の３０コドンを含んでいる１８０bp
フラグメントを分離した。１８０bpＤＮＡフラグメント
を、trpプロモーターを含んでいるプラスミドに結合さ
せた。この様にプラスミドの１つ、pＨＧＨ２０７−１
は既に記載されている[ボイアー(Ｈ．de Ｂoer)ら、１
９８２、“プロモーター: 構造および機能"、編者: ロ
ドレゲッツ(Ｒ．Ｒodreguez)ら、Ｃhambrlin, Ｐraeger
出版、ニューヨーク、ＮＹ、４６２−４８１頁] 本実施
例では、このプラスミドの誘導体、pＨＧＨ２０７−１
＊[これはtrpプロモータの５'へのＥcoＲＩ部位が、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩ(ＤＮＡ polＩ)による充填および
平滑末端のライゲーションによる結合によりＥcoＲＩ＊
に変換されている(キャビリィ(Ｓ．Ｃabilly)ら、１９
８４、プロナス(Ｐroc．ＮaＨ．Ａcad．Ｓci．)、ＵＳ
Ａ、８１: ３２７３−３２７７)]を使用した。このtrp
プロモータ含有プラスミドをＸbaＩで消化し、ＤＮＡpo
lＩおよび全ての４個のdＮＴＰで処理して突出配列を満
たした。このＤＮＡ標品をＢamＨＩで消化し、ベクター
含有フラグメントを分離した。このベクターフラグメン
トを、上で分離した１８０bpＳＴＩＩシグナル−含有Ｄ
ＮＡフラグメントと結合させた。この結合混合物を使っ
て大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形質転換してアンピシリ
ン耐性とした。ＳＴＩＩ−リーダー命名したプラスミド
を、アンピシリン耐性コロニーから分離した。

【０１２０】ＳＴＩＩ暗号領域を含んでいるＭ１３ファ
ージを、pＳＴＩＩ−リーダーの１８０bpＸbaＩ−Ｂam
ＨＩフラグメントを、ＸbaＩおよびＢamＨＩ消化Ｍ１３
mp１０に結合させることにより、先づ組立てた。得られ
たファージＤＮＡ、pＳＴＩＩ−シャトル、を制限エン
ドヌクレアーゼ分析およびヌクレオチド配列決定により
特性化した。次いでpＬＴtrp１のＨpaＩ−ＥcoＲＩ７０
０bpフラグメントをＳmaＩ−ＥcoＲＩ消化pＳＴＩＩ−
シャトル複製可能形(ＲＦ．２本鎖)ＤＮＡに結合させる
ことにより、ＬＴ暗号領域をこのベクターに導入した;
ＳmaＩおよびＨpaＩ部位を両者共に平滑末端化し、互い
に結合させた(両部位を失うことになる)。得られたファ
ージＤＮＡ、Ｍ１３−ＳＴＩＩ−ＬＴを特性化し、以下
のごとくして突然変異誘発に使用した: プライマー５'p
ＣＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧ
ＴＡＧＧをキナーゼ処理し、リガーゼ緩衝液およびＸba
Ｉ−ＥcoＲＩ消化Ｍ１３mp１０ ＲＦ ＤＮＡ(ＤＮＡの
プライム化を促進するため、アデルマン(Ｊ．Ｐ．Ａdel
man)ら、１９８３、「ＤＮＡ」２: １８３−１９３頁参
照)の存在下で鋳型(Ｍ１３−ＳＴＩＩ−ＬＴ)と混合し
た; この混合物を９５℃に加熱し、室温で３０分間アニ
ーリングさせ、氷上に３０分間放置した。ＡＴＰ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
の大きいフラグメント(Ｋlenow)と共に、全ての４個の
デオキシヌクレオチド・トリホスフェートを添加した。
この混合物を１４℃で１時間インキュベートし、これを
使って市販株であるコンピテントな大腸菌ＪＭ１０１、
またはその他のＭ１３ファージ宿主をトランスフェクト
した。プローブとして³²Ｐ−標識プライマーを使って、
正しく突然変異したファージをハイブリダイゼーション
・スクリーニング法で同定した。得られたファージＳＴ
−ＬＴ−mutを、ＤＮＡ配列分析により特性化した。こ
のファージから複製型ＤＮＡを調製し、ロイシン−アミ
ノ末端リンホトキシンの暗号配列に隣接したＳＴＩＩシ
グナル配列のためのＤＮＡを含んでいる７６１bpＸbaＩ
−ＥcoＲＩフラグメントの分離に使用した。このＤＮＡ
を、ＸbaＩ−ＢamＨＩ消化p２０ＫＬＴ(大きい４２８５
bpベクターフラグメント)およびpＢＲ３２２の３７５bp
ＥcoＲＩ−ＢamＨＩフラグメントと結合させた。得られ
たプラスミド、pＳＴ１８ＬＴを制限地図およびＤＮＡ
配列決定により特性づけた。同様にして、ＳＴＩＩシグ
ナルアミノ末端とヒスチジンアミノ末端リンホトキシン
のヒスチジン残基の融合物をコードしている組立て物を
調製した。得られたプラスミドで大腸菌３１４４６を形
質転換した。プラスミドpＳＴＬＴ１８とpＳＴＬＴ１６
を回収した。制限酵素分析およびジデオキシ配列決定法
により、それらがＳＴＩＩ融合物をコードしていること
を確認した。プラスミドpＳＴＬＴ１８またはpＳＴＬＴ
１６で形質転換した大腸菌は、ゲル電気泳動により計算
された分子量と一致することにより決定される様に、ロ
イシンアミノ−末端およびヒスチジンアミノ−末端リン
ホトキシンとのＳＴＩＩシグナル配列融合体を合成す
る。これらの融合タンパク質を含んでいるこの大腸菌溶
解物は細胞毒性活性を示した。

【０１２１】実施例８ リンホトキシン中和能を有する
モノクロナールネズミ抗体の調製法 実施例１で得た、純化したリンパ芽球リンホトキシン
を、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)に対して透析した。透析
物には２００μgのリンホトキシン／mlが含まれてい
た。グルタルアルデヒドを、７０mＭグルタルアルデヒ
ドの濃度になるまで透析物に加え、この混合物を室温で
２時間インキュベートし、更にグルタルアルデヒドを加
えてその全添加濃度を１４０mＭとし、更に６時間イン
キュベートを続け、この混合物をＰＢＳに対して再び透
析した。グルタルアルデヒドで交叉結合したリンホトキ
シン(以降、「ポリリンホトキシン」という)５０μgとフ
ロインドの完全アジュバント０．５mlをマウス(ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ株)に皮下注射した。１週間後、このマウスに、
ポリリンホトキシン５０μgおよびフロインドの不完全
アジュバント０．５を、半分は筋肉内に、そして半分は
腹腔内に注射してブースター(促進)免疫した。７日後に
血清をとり、ＥＬＩＳＡ分析により抗−リンホトキシン
活性を調べた。

【０１２２】ＥＬＩＳＡ分析は次の様にして行った: 純
化リンホトキシンの緩衝溶液をマイクロタイター・ウエ
ルに入れ、約１００ngのリンホトキシンで各ウエルが覆
われる様にした。吸着しなかったリンホトキシン溶液
を、アスピレターでウエルから除去した。適当に希釈し
た被験試料５０μlを、５mg／mlの牛血清アルブミンを
含むＰＢＳ１００μl(ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液)と混合
し、各ウエルに加え、室温で２時間インキュベートし、
０．０５％のツウイーン２０を含んでいるＰＢＳで洗浄
し、西洋ワサビペルオキシダーゼ−標識化山羊−マウス
ＩgＧ(ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液中)１００μlを各ウエルに
加え、１時間インキュベートした。各ウエルを０．０５
％のツウイーン２０を含んでいるＰＢＳ、次いで０．１
mgのオルトフェニレンジアミン／ml(基質溶液)を含んで
いるクエン酸リン酸緩衝液(pＨ５)で洗浄し、３０％Ｈ₂
Ｏ₂水溶液(基質溶液１０ml当たり３０％(v／v)Ｈ₂Ｏ₂溶
液４μlの割合)を各ウエルに加えた。ウエルを３０分間
インキュベートし、２．５Ｍ硫酸５０μlで反応を停止
させ、４９２nmにおける吸光度を測定した。１０．０以
上の吸光度を示したウエルを抗−リンホトキシン陽性と
みなした。

【０１２３】ネズミＬ９２９における、リンホトキシン
の細胞溶解活性の中和能についても被験試料を分析し
た。免疫動物から採取した血清またはハイブリドーマ上
澄液を、１０％の牛胎児血清および約１００リンホトキ
シン単位／mlを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に入れて任
意に希釈し、その他は細胞溶解分析の常法に従い、培養
したＬ９２９細胞を含んでいるマイクロタイターウエル
に入れた。対照では、全ての細胞が溶解した。リンホト
キシンがＬ９２９細胞を溶解しないことをもって中和抗
体を検出した。

【０１２４】グルタルアルデヒド−ポリメリ化リンホト
キシンで免疫した動物は、ＥＬＩＳＡ分析で活性を示す
抗体を生成したが、血清中和活性(活性中和血清)は検出
されなかった。

【０１２５】１００μgのリンホトキシンおよび水酸化
アルミニウム[Ａl(ＯＨ)₃]の１．６４％(w／v)懸濁液１
mlを含む懸濁液を調製し、同じマウスを免疫するのに使
用した。マウスには、この懸濁液の１００μlを筋肉内
注射し、４００μlを腹腔内投与した。１週間後、ＰＢ
Ｓ１００μlに入れた、ポリメリ化していない、吸着し
なかったリンパ芽球リンホトキシン１０μgを静脈内注
射した。３日後、この動物の血清の１／８０希釈液を試
験すると、リンホトキシン中和抗体の存在することがわ
かった。

【０１２６】この動物の脾臓を摘出した。３×１０⁷の
脾臓細胞を５×１０⁷のネズミミエローマ細胞と融合さ
せ、ファゼカス(Ｓ．Ｆazekas)らの方法に従って、ＨＡ
Ｔ培地および約３０００個の腹膜マクロファージ／マイ
クロタイターウエルを含んでいるマイクロタイタウエル
に入れた[ファゼカスおよびグロス(Ｓt．Ｇroth)、１９
８０、ジャーナル・オブ・イミユノロジカル・メソッド
(Ｊ．Ｉmmunol．Ｍeth．)、３５: １−２１]。上記のＥ
ＬＩＳＡ分析で陽性であった上澄液を含んでいるウエル
からのハイブリドーマを、２０％の牛胎児血清、１０％
のＮＣＴＣ−１３５培地、５×１０^-5Ｍのβ−メルカプ
トエタノールおよびＨＡＴを含んでいるＤＭＥＭ培地１
ml中で増殖させ、統計学的にウエル当たり平均細胞数が
１となる様に、マイクロタイターウエルに分配し、同じ
培地１mlまたは５ml中で培養した。次いで上澄液を中和
抗体について分析した。統計学的に、水酸化アルミニウ
ム免疫法からのＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマの約２％
が中和抗体を合成した。高親和性リンホトキシン抗体
は、所望により、このグループのハイブリドーマから選
択した。

【０１２７】実施例９ リンホトキシンの部位特異的突
然変異誘発 合成オリゴヌクレオチドのセグメント６が、配列: ５'
ＣＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡ３'を持つ様に修飾
し、その相補鎖(セグメント５３)が配列: ３'ＡＧＡＣ
ＧＴＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴ５'を持つ様に修飾するほか
は実施例３と全く同様の操作を行った。

【０１２８】修飾したオリゴヌクレオチドを残りのオリ
ゴヌクレオチドとアニーリングさせ、実施例６に述べた
如く発現ベクターに結合させた。このベクターは２bp置
換を含んでおり、これがリシン⁺２８コドンをリシンか
らヒスチジンに変換した。このヒスチジン突然変異体
は、大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６の形質転換により発現さ
れる。

【０１２９】その他の部位指向的突然変異体も、同様の
方法で調製される。この場合、ＥcoＲＩ制限部位を導入
しない様にコドンを選択するのが好ましい。さもない
と、実施例３で必要となるpＬＴＸＢ１の消化におい
て、部分的ＥcoＲＩ制限消化を用いなければならなくな
る。この突然変異は、フラグメントＡ(図２および図３)
に更にＸbaＩまたはＢamＨＩ部位を導入しない様に、フ
ラグメントＢにＢamＨＩまたはＨindＩＩＩ部位を導入
しない様に、そしてフラグメントＣにＨindＩＩＩまた
はＢglＩＩ部位を導入しない様にしなければならない。
さもないと、pＬＴＸＢ１突然変異体を適切に組み合わ
せるのに部分消化が必要となる。完全に消化してしまう
と、このケースにおいて目的とする置換変異体よりも欠
落変異体が生成することになる。

【０１３０】実施例１０ ネズミおよびウシのリンホト
キシンをコードしているゲノムＤＮＡの同定: ネズミお
よびウシのリンホトキシンのアミノ酸配列 ネズミおよびウシのリンホトキシン遺伝子をゲノム−λ
ライブラリーから分離した。ヒトのリンホトキシンcＤ
ＮＡフラグメント(Ｐvu−ＥcoＲＩ、６００bp)を、ニッ
クトランスレーションにより３２pを用いて放射標識
し、ネズミのゲノムＤＮＡ−λライブラリー(λシャロ
ン４Ａ中のＭ６００株ネズミゲノムＤＮＡ、マニアティ
ス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、モレキュラー・クローニング(Ｍ
olecularＣloning)、３１頁、１９８２)および、別々
に、ウシゲノムＤＮＡライブラリー(ＥＰ８８６２２Ａ)
をスクリーニングするためのプローブとして使用した。
ハイブリダイゼーションは、２０％ホルムアミド中、低
いストリンジエンシーで行い[グレイ(Ｇray)およびゲッ
デル(Ｇoeddel)、Ｐ.Ｎ.Ａ.Ｓ．ＵＳＡ８０: ５８４２
−５８４６(１９８３)]、０．３Ｍ塩化ナトリウム、
０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ
の水溶液中で２回洗浄した。ヒトのリンホトキシンプロ
ーブとハイブリダイズした数個のファージをプラーク精
製した[マニアティス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、細胞(Ｃel
l)、１５: ６８７−７０１、１９７８]。ファージＤＮ
Ａをつくり[マニアティスら、細胞、１５: ６８７−７
０１(１９７８)]、制限エンドヌクレアーゼで消化し、
サウザン・ハイブリダイゼーション法で分析した。３５
００bpのＥcoＲＩネズミＤＮＡフラグメントおよび２２
００bpＥcoＲＩウシＤＮＡフラグメントが、それぞれヒ
トのリンホトキシンプローブとハイブリダイズした。こ
れらのＤＮＡフラグメントをプラスミドpＢＲ３２２に
サブクローンし、ジデオキシ鎖−末端法[スミス(Ａ．
Ｊ．Ｈ．Ｓmith)、メソッド・イン・エンザイモロジー
(Ｍethods in Ｅnzymology)、６５: ５６０−５８
０、１９８０]で配列決定した。この推論されたネズミ
および牛リンホトキシンのタンパク質配列を、比較のた
めのヒトリンホトキシンの配列と共に図９、図１０、図
１１および図１２に示す。

【０１３１】実施例１１ ＡＤＨプロモータのコントロ
ール下にある酵母におけるリンホトキシンの発現 プラスミドpＬＴtrp１を、リンホトキシンの開始コドン
にすぐ近接しているＸbaＩ部位でプラスミドを開裂する
ために、ＸbaＩで消化した。このＸbaＩ粘着末端を大腸
菌ＤＶＡポリメラーゼＩのクレナウフラグメントによ
り、４個のdＮＴＰを用いて平滑化した。以下の式:

【化４】 で示されるＥcoＲＩアダプターを平滑化したプラスミド
フラグメントと結合させ、突出している５'ヒドロキシ
末端をポリヌクレオチドキナーゼを使ってリン酸化し、
この結合混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６を形
質転換し、リンホトキシン開始コドンに近接した追加の
ＥcoＲＩ部位を持っているプラスミドpＬＴtrp１Ｒ１を
同定した。プラスミドpＬＴtrp１Ｒ１を分離し、ＥcoＲ
Ｉで消化し、リンホトキシンＤＮＡ含有フラグメントＳ
Ｐを回収した。

【０１３２】プラスミドpＦＲＰn(ＥＰ６０,０５７Ａ)
をＥcoＲＩで消化し、再環化を防ぐためにアルカリホス
ファターゼで処理し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを使ってＳＰ
リンホトキシンフラグメントに結合させ、その結合混合
物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１,４４６を形質転換し
た。アガロース電気泳動ゲル上で制限分析によって決定
したところ、アンピシリン耐性コロニーから、ＳＰ挿入
物を互いに反対方向に持っている２種のプラスミドが得
られた。プラスミドを大腸菌形質転換体から純化し、こ
れを使ってtrp１突然変異を持った酵母(例えば酵母株Ｒ
Ｈ２１８、非制限的ＡＴＣＣ寄託Ｎo．４４０７６)を形
質転換し、trp⁺表現型にした。セグメントＳＰの開始コ
ドンがアルコールデヒドロゲナーゼ・プロモータフラグ
メントに隣接して存在する様に配向しているプラスミド
は、リンホトキシンを発現する様に酵母を形質転換する
ことがわかった。酵母形質転換体の抽出物からリンホト
キシンを回収する。pＦＲＰn染色体複製起源(ars１)の
代わりに２ミクロン複製起源を含有している発現プラス
ミド、および適合し得る宿主株[ベッグス(Ｊ．Ｂegg
s)、１９７８、ネーチャー(Ｎature)、２７５: １０４
−１０９]を用いることにより、大規模な発酵における
プラスミドの安定性を改良することができる。

【０１３３】実施例１２ 哺乳動物細胞内でのリンホト
キシンの発現 λＬＴ１１(実施例２)をＥcoＲＩで消化し、リンホトキ
シン含有ＤＮＡフラグメント(逆転写体)を回収する。プ
ラスミドpＥＨＥＲ(ＥＰ１１７,０６０Ａ)をＥcoＲＩで
消化し、牛腸内性アルカリホスファターゼで処理し、λ
ＬＴ１１のＥcoＲＩ−リンカー処理逆転写体と結合させ
た。得られたプラスミドを大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６
(ＥＰ１１７,０６０Ａ)を使って増殖させ、pＥＨＥＲＬ
Ｔ ＩおよびpＥＨＥＲＬＴ ＩＩと命名した。ポリアク
リルアミドゲル上で制限分析した結果、これらは互いに
逆方向のリンホトキシンＤＮＡを含有していた。これら
のプラスミドを使ってトランスフェクトを行い、ＣＨＯ
ＤＨＦＲ−ＤＵＸ−Ｂ１１,ＣＨＯ１およびＬtＫ^-細胞
を選択する。

【０１３４】上で調製したpＥＨＥＲＬＴ ＩまたはpＥ
ＨＥＲＬＴ ＩＩ １μgを１０μgのラットのキャリアー
ＤＮＡ(２５０μlの容量中、０．２５Ｍ ＣaＣl₂)と混
合し、次いで２５０μlのＨＥＰＥＳ緩衝食塩水(２８０
mＭ ＮaＣl、１．５mＭ Ｎa₂ＰＯ₄、５０mＭ ＨＥＰ
ＥＳ、pＨ７．１)を滴加することにより組織培養細胞を
トランスフェクトした。室温で３０分間放置した後、６
０mmのプラスチック製組織培養皿中で増殖している組織
培養細胞にこの溶液を加える。ＣＨＯ１、ＣＨＯ ＤＨ
ＦＲ−ＤＵＸ−Ｂ１１およびＬtＫ^-細胞を使用する。皿
は宿主細胞に適した３mlの培養培地を含んでいる。

【０１３５】ＣＨＯ１およびＣＨＯ ＤＨＦＲ−ＤＵＸ
−Ｂ１１細胞についての培地は、１０％の牛血清、１０
０μ／mlのペニシリン、１００μg／mlのストレプトマ
イシンおよび２μmＭのＬ−グルタミンを補充したＨam
Ｆ−１２培地(Ｇibco)であり、ＬtＫ^-セルラインにつ
いての培地は、上と同様の補充を行ったドルベッコ(Ｄu
lbecco)の改良イーグル(Ｅagle)培地である。

【０１３６】３〜１６時間後、培地を除去し、リン酸緩
衝食塩水中の２０％グリセロールで洗浄する。各プレー
トに新しい培地を加え、更に２日間細胞をインキュベー
トする。

【０１３７】２日間増殖させた後、細胞をトリプシン処
理し(これは、０．２mg／mlのＥＤＴＡを含有している
滅菌トリプシン０．５mg／mlで細胞を処理することから
なる)、約３×１０⁵細胞を、選択性培地を有する１０mm
の組織培養プレートに加えることによりトランスフェク
トした宿主細胞を選択する。dhfr^-細胞のための培地
は、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まな
い(Ｆ−１２ ＧＩＢＣＯ)培地(ＧＨＴ^-培地)の系統で
ある。ＤＨＦＲ⁺宿主細胞については、正常な増殖培地
にメトトリキセート(１００−１０００nＭ)を添加す
る。プラスミドを使用しないか、正常なＤＨＦＲを含有
しているプラスミドpＦＤ−１１(ＥＰ１１７,０６０Ａ)
を使って、トランスフェクションの条件下で対照実験を
行う。ＤＨＦＲを取り込み、これを発現する細胞から生
じるコロニーは１〜２週間以内に観察される。成熟リン
ホトキシンを発現する形質転換体を同定する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 リンホトキシンを暗号化しているＤＮＡ配列
および推定のアミノ酸配列を示す模式図である。

【図２】 組換えプラスミドpＬＴＸＢ１の組立てを示
す模式図である。

【図３】 組換えプラスミドpＬＴＸＢ１の組立てを示
す模式図である。

【図４】 プレリンホトキシンの全アミノ酸配列並びに
５'および３'非翻訳領域をも含めた暗号ＤＮＡ配列を示
す模式図である。

【図５】 プレリンホトキシンの全アミノ酸配列並びに
５'および３'非翻訳領域をも含めた暗号ＤＮＡ配列を示
す模式図である。

【図６】 発現ベクターpＬＴtrp１の組立てを示す模式
図である。

【図７】 発現ベクターp２０ＫＬＴの組立てを示す模
式図である。

【図８】 発現ベクターp２０ＫＬＴの組立てを示す模
式図である。

【図９】 ヒト、ネズミ、ウシのリンホトキシン、およ
び哺乳類に共通したリンホトキシンの塩基配列を示す模
式図である。

【図１０】 ヒト、ネズミ、ウシのリンホトキシン、お
よび哺乳類に共通したリンホトキシンの塩基配列を示す
模式図である。

【図１１】 ヒト、ネズミ、ウシのリンホトキシン、お
よび哺乳類に共通したリンホトキシンの塩基配列を示す
模式図である。

【図１２】 ヒト、ネズミ、ウシのリンホトキシン、お
よび哺乳類に共通したリンホトキシンの塩基配列を示す
模式図である。

【図１３】 プラスミドpＳＴ１８ＬＴの組立てを示す
模式図である。

【図１４】 プラスミドpＳＴ１８ＬＴの組立てを示す
模式図である。

【図１５】 プラスミドpＳＴ１８ＬＴの組立てを示す
模式図である。

【図１６】 プラスミドpＳＴ１８ＬＴの組立てを示す
模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 パトリック・ウィリアム・グレイ アメリカ合衆国カリフォルニア94127、 サン・フランシスコ、サン・ファーナン ド・ウェイ219番 (72)発明者 グレン・エバン・ネドウィン アメリカ合衆国コネチカット06437、ギ ルフォード、エス・フープ・ポール・ロ ード429番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｓｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記アミノ酸配列： 【化１】 を含むヒトリンホトキシンを暗号化している核酸。 ２．ヌクレオチド２８４と２８５との間に介在配列を含
   有していないＤＮＡである請求項１に記載の核酸。 ３．下記アミノ酸配列： 【化２】 の少なくとも一つのアミノ酸残基が、(ａ)欠失、(ｂ)置
   換、または(ｃ)挿入された変異型リンホトキシンを暗号
   化している核酸であって、該変異型リンホトキシンはリ
   ンホトキシンの活性を有し、上記アミノ酸配列において
   アミノ末端がＬｅｕ⁺１またはＨｉｓ⁺２４である配列を
   含まないものである核酸。 ４．検出可能な物質によって共有結合的に標識されてい
   る請求項１または３に記載の核酸。 ５．請求項１または３に記載の核酸を含有する複製可能
   なベクター。 ６．リンホトキシンを暗号化している核酸と機能的に結
   合した細菌性プロモーターを含有する請求項５に記載の
   ベクター。 ７．図６に示されている発現プラスミドpＬＴtrp１を含
   有する請求項５に記載のベクター。 ８．図８に示されている発現プラスミドp２０ＫＬＴを
   含有する請求項５に記載のベクター。 ９．核酸が細菌性分泌リーダーとリンホトキシンとの融
   合物を暗号化しているものである請求項５に記載のベク
   ター。 １０．原核生物内で複製可能な請求項５に記載のベクタ
   ー。 １１．請求項５に記載のベクターを含有する宿主細胞。 １２．大腸菌である請求項１１に記載の宿主細胞。 １３．請求項１１に記載の宿主細胞を培養してリンホト
   キシンを培地中に蓄積させ、ついで培地からリンホトキ
   シンを回収することを特徴とするリンホトキシンの製造
   方法。 １４．宿主細胞が酵母または哺乳動物の非ヒト細胞であ
   り、核酸がヒトプレリンホトキシンを暗号化しており、
   ヒトリンパ球からの対応の天然のリンホトキシン種に対
   して異様にグリコシル化されたリンホトキシンが培地か
   ら回収される、請求項１３に記載の方法。