JPS63105680A - ヒト・リンホトキシン発現ベクタ−、該発現ベクタ−による形質転換細胞および該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上利用分野］ 本発明はヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用
したヒト・リンホトキシン発現ベクター、該ヒト・リン
ホトキシン発現ベクターによる動物培養細胞の形質転換
細胞および該形質転換細胞を利用したリンホトキシンの
製造方法に関する。

リンホトキシン（ＬＴ）は、癌細胞に対し選択的に毒性
を示し壊死させる作用をもち［エバンス・シイ−・エイ
チ（Ｅｖａｎｓ、Ｃ，Ｈ，）ら（１９７７年）キャンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、３７巻、８
９８頁参照］、制癌剤としての応用が期待されている。

［従来の技術］ ＬＴは、ヒトまたはマウスなどの動物のリンパ球細胞を
フイトヘムアグルチニン、コンカナバリンＡなどのレク
チンまたはフォルボールエステルで刺激することにより
誘導されるリンホカインの一種である［デブリンナジェ
イ・ジエイ（Ｄｅｖｌｉｎｉ、Ｊ、）（１９８４年）リ
ンホカインズ（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ）　、　９巻、
３１３頁参照］　、　ＬＴの蛋白化学的研究はいくつか
のグループで研究されているが、分子量約２０，０００
の成分がその最小単位であり、その単位成分が会合した
ものや他の成分との複合体があるとされている［アガー
ワル・ビー・ビー［（Ａｇｇａｒｗａｌ　、Ｂ、Ｂ、）
ら（１９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２５９巻、６８６頁参照〕。

ＬＴは、フォルボールエステル、マイト−ジエンなどで
刺激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、
このような生産法では生産されるＬＴはきわめて微量で
あり、また大沿の新鮮なリンパ球が必要となり量産には
不向きである。

また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細胞）をマイ
ト−ジエンなどで刺激するとＬＴが誘導的に産生される
ことが知られているが、生産能は用いる細胞の能力に大
きく依存しており、やはり量産に適した系とはいえない
。近年）、ＴのｃＤＮＡがクローニングされ、大腸菌で
ＬＴ様蛋白の生産が可能になった［グレイ・ビー・ダブ
リュ（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、）ら（１９８４年）ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）。

３１２巻、７２１頁参照］。しかし微生物でつくられる
ＬＴ様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多
少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそ
れと異なるばあいが多い。さらに微生物によってつくら
れる１７王様蛋白は、天然のＬＴが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられた］、Ｔ様蛋白と天然の１７
１′とは物質として明らかに異なり、治療薬として長期
間使用したり、頻回使用するばあいには、抗原抗体反応
の問題が懸念される。

［発明が解決しようとする問題点］ 蛋白のアミノ末端が天然のＬＴと同じでかつ糖鎖を有す
るＬＴを生産するためには、動物培養細胞を宿主とした
遺伝子組換えの手法の適用が考えられる。このばあい、
単にＬＴ遺伝子を動物培養細胞に導入しても１、Ｔの産
生をみることはできないと推定される。すなわちＬＴは
誘導蛋白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限され
ているからである。実際に本発明者らは、プロモーター
などの発現の制御領域を含むＬＴ遺伝子を種々の培養細
胞に導入してもきわめて微量し□かＬＴの発現がみられ
ないことを知った。このことはＬＴの遺伝子を細胞に導
入し、細胞に効果的なＬＴ産生能を付与するためには、
ＬＴの遺伝子に何らかの改良を加える必要があることを
示している。

本発明者らはすてにＬＴをコードするＤＮＡ配列に動物
細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡ合成を開始すること
が可能なプロモーター領域のＤＮＡ配列を結合させ動物
培養細胞に導入し、形質転換細胞にＬＴを分泌させるこ
とに成功した（特願昭６０（４７３７１号明細書参照）
。本発明者らがこのＬＴ発現ベクターに利用したプロモ
ーターはＳＶ４０の初期遺伝子、’ｌ’純ヘルペスウィ
ルスのチミジンキナーゼ遺伝子またはＳＶ４０の後期遺
伝子のプロモーターである。この中で比較的強いプロモ
ーターと考えられているＳＶ４０のプロモーターは、Ｓ
Ｖ４０感染細胞中テＳ■４０山来（７）ＩＩＲＮＡを全
ｍ　Ｉ？　Ｎ　Ａ　ノ約１〜４％に蓄積させる能力をも
っている。しかしＳＶ４０感染細胞中でのＳＶ４０のゲ
ノムは細胞あたり致方コピーにもなっているので、ＳＶ
４０のプロモーターがきわめて強いプロモーターである
とはいえない。

アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白であり細胞の蛋
白としてはきわめて含量の高い蛋白のひとつである。し
たがってアクチン遺伝子のプロモーターは動物培養細胞
で強い活性を示す可能性をもっている。このアクチン遺
伝子のプロモーターをＬＴの動物培養細胞での発現に利
用することが本発明が解決しようとする主たる問題点で
ある。

本発明者らはアクチン遺伝子のプロモーターとしてヒト
β−アクチン遺伝子のプロモーターを用いた。ヒトのア
クチン遺伝子のプロモーターを活用したＬＴ発現ベクタ
ーをヒト培養細胞を宿主としてＬＴ生産性の形質転換株
をうるばあいには、基本的にヒト細胞にヒトに由来する
ＤＮＡのみを導入することになりウィルスなどの他の生
物に由来するプロモーターに用いる他のＬＴ生産法にく
らべ安全性が高い。

またヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターは種特異性
があり、ヒト細胞を宿主としたばあいには他の生物由来
の細胞を宿主とするばあいにくらべＬＴ高度生産性の形
質転換株をうる可能性が高い。

ヒトβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡの構造を調べた結果
、蛋白合成開始のメチオニンコドンの５′上流がたがい
にホモロジーを持つ１５ベース長の配列の繰返し配列か
らなることを見出した。またそれらの繰返し配列は１８
Ｓリボゾーマル（以下単に、ｒという）ＲＮＡの３′末
端に見られる配列と高い相補性を持っており、これらの
繰返し配列がヒトβ−アクチン遺伝子ｍＲＮＡの高い翻
訳活性またはｍＲＮＡの安定性に関与している可能性が
ある。この繰返し配列をＬＴの発現ベクターに利用する
ことも本発明が解決しようとする問題点のひとつである
。

［問題点を解決するための手段］ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝
子はナカジマーイイジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ−１ｉｊｉ
ｍａ）らによってクローニングされた［ナカジマーイイ
ジマら（１９８５年）プロシーデインダス・オブφザ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニス
−ｒ−−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、　８２巻、　６１３３頁参照］ヒト
β−アクチン遺伝子の構造を第１図に示した。ヒトβ−
アクチン遺伝子は６つのエクソン（Ｒ）と５つのイント
ロン（１）および５′側と３′側に隣接した配列からな
る。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とはヒ
トβ−アクチン遺伝子の転写に必要な領域をさす。すな
わち第１図に示したヒトβ−アクチン遺伝子の５′末端
のＳｍａ１部位から第２エクソンに存在するＮｃｏ１部
位までの配列のすべてまたは一部を含む配列をさす。ヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とＬＴをコー
ドするＤＮＡ配列との結合は、ＬＴのｎ＋ＲＮＡの合成
がヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターによってコン
トロールされるように結合されておればどのような結合
部位を用いてもよい。たとえばヒトβ−アクチン遺伝子
のｍＲＮＡ合成開始点（キャップ部位）の３′下流にＬ
ＴをコードするＤＮＡ配列を結びつけた発現ベクターを
つくりうる。またヒトβ−アクチン遺伝子の第１イント
ロン中でＬＴをコードするＤＮＡ配列を結びつけるばあ
いには、イントロンのスプライシングが起こるように３
′側のスプライシングシグナルを介してＬＴをコードす
るＤＮＡ配列をヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
に結びつけることが必要である。さらにヒトβ−アクチ
ン遺伝子の第１イントロンの後に１、ＴをコードするＤ
ＮＡ配列を結びつけた発現ベクターもつくりうる。

本発明者らは、ヒトβ−アクチン遺伝子の成熟型ｍＲＮ
Ａの塩基配列を調べた結果５′側非翻訳領域がたがいに
ホモロジーを有する約１５塩基の配列の繰返しからなる
ことを見出した。その配列は、 （ＡＵＧ　：メチオニンコドン） であり、繰り返し配列は枠で囲んだ。メチオニンコドン
に近い２つの１５塩基配列は相同性が高く、これらの配
列は１８ＳｒＲＮＡの３′側に見られる配列（以下＊は
非相同塩基対塩基を示す）零＊ ３’　・・・・ＣＧＣＧＬＩＣＧυＣＣＡＡＧＵＧＧＡ
ＵＧ　・・・・５’と相補性があることを見出した。そ
の相補性（各塩基間を「：」で結び示す。）は ヒトβ−アクチンのｍＲＮＡ １８ＳｒＲＮＡ　　　　　　　：：：：　：：　　：＊
＊：：：：３’　・・−・ＡＵＵＡＣＵＡＧＧＡＡＧＧ
ＣＧＵＣＧＵＣＣＡＡＧＵＧＵＡＵＧ−・−のようであ
った。

動物細胞由来のｍＲＮＡの配列中においては原核生物で
知られるリボゾーム結合部位であるＳＤ（シャイ゛ン・
ダルガノ）配列に相当するコンセンサス配列は知られて
いないが、ヒトβ−アクチン遺伝子のｌｌｌＲＮＡの非
翻訳領域に見られるこの１５塩基繰返し配列がヒトβ−
アクチンｍＲＮＡの高い翻訳活性またいはＩｎＲＮＡの
安定性に関与している可能性がある。この繰り返し配列
をＬＴの発現ベクターに利用するにはヒトβ−アクチン
遺伝子とＬＴをコードするＤＮＡ配列とを両遺伝子の蛋
白合成開始アミノ酸であるメチオニンコドンを介して結
びつけるのがもっとも自然である。

ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したＬＴ
発現ベクターに利用可能なＬＴをコードするＤＮＡ配列
は、１．Ｔの染色体ＤＮＡ配列、染色体ＤＮＡ配列から
一部のイントロンを欠失させたＤＮＡ配列、１、Ｔのｃ
ＤＮＡ配列および変異を有するそれらのＤＮＡ配列など
がある。

遺伝子を細胞に導入したばあい、導入遺伝子は宿主染色
体ＤＮＡに安定に組み込まれるばあいがある。遺伝子が
組み込まれる染色体−にの位置は一見でたらめであり、
また組み込まれるＩ）ＮＡのコピー数も不規則である。

ＬＴ発現ベクターを導入した細胞のＬＴ生産量は、ＬＴ
遺伝子のコピー数に相関があると考えられ、遺伝子数の
増加した細胞はＬＴの生産能が向」二するものと期待さ
れる。

ＬＴ遺伝子のコピー数の多い、すなわちＬＴの生産性の
高い細胞は、増幅可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクタ
ーを導入後、単細胞分離または増幅可能な遺伝子の増幅
した細胞が選択的に増殖する条件で細胞を選択すること
により分離することができた。増幅可能な遺伝子として
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子、アスパラギン酸トラ
ンスカルバミラーゼ遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が
利用できる。またその他の増幅可能な遺伝子［スターク
・ジー・アール（Ｓｔａｒｋ、Ｇ。

Ｒ，）とウオール・ジー・エム（Ｗａｈｌ　、Ｇ、Ｍ、
）（１９８４年）アニュアル・レビュー・オン・バイオ
ケミストリー、５３巻、４７７頁参照］も利用できる。

ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するＬＴ発現ベクタ
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後１ｎＭ以上の濃度のメソト
レキセートを含む培地で選択されうる。選択された細胞
はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、Ｌ丁遺
伝子も増幅しているばあいが多い。同様にメタロチオネ
イン遺伝子は重金属で、またアスパラギン酸トランスカ
ルバミラーゼ遺伝子はＮ−（フォスフオンアセチル）−
Ｌ−（アスパルテート）［Ｎ−（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃ
ｅｔｙｌ）−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｃ（ＰＡＬＡ）］で
遺伝子が増幅した細胞が分割できる。

本発明者らが宿主として試用した動物培養細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）
から入手可能なハムスターおよびヒト由来の細胞である
が、本明細書に示されているＬＴの製造法を用いれば、
少なくともを椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正常お
よび変異細胞、ウィルスによる形質転換細胞などにおい
て活性あるＬＴを生産することが可能である。また宿主
細胞は、生産目標濃度以上のＬＴに対して耐性を示す細
胞であることが望ましい。

発現ベクターを導入し、Ｌ　Ｔを産生ずるようになった
細胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地
ばかりでなく、まったく血清を含まない無血清培地でも
ＬＴを産生ずることを見出した。ＬＴの生産に無血清培
地を用いることはＬＴの培地からの回収精製をより容易
にするばがりでなく、製品への血清成分の混入を防ぐこ
とになる。

［実施例］ 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」にしたがって行
なった。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ
　、種々の酵素、大腸菌等を扱う諸操作は下記の雑誌、
成書を参考とした。

（１）蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号（１９８１年
）臨時増刊　遺伝子操作（共立出版） （２）遺伝子操作実験法、高木康敬編著（１９８０年）
講談社 （３）遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２
年）講談社 （４）モルキュラー・クローニング・ア・ラブラドすφ
マニュアル、ティー・マニアティス（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ
ｎｕａｌ、Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｊｓ）ら編（１，９８２年）コールド・ス
プリング争ハーバ−・ラブラトリ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＩｔ　ａ　ｒ　ｂ　ｏ　ｒ　　Ｌ　ａ　ｂ　ｏ　ｒ
　ａ　ｔ　ｏ　ｒ　ｙ　）（５）メソッズ・イン・エン
ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　ＥｎＺｙｍＯｌｏ
ｇｙ、）８５巻、エル・グロスマン（Ｌ、　Ｇｒｏｓｓ
ＩＩｌａｎ）ら編（１９８０年）アカデミツク・プレス
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ）（６）メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Ｍｃｔｌ＋ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ、１３８巻、アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ）
編（１９７９年）アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃＰｒｅｓｓ） 実施例１ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したＬＴ
発現ベクターｐβＬＴＩ、　ｐβＬＴ１ｄｌ＋１’ｒお
よびｐβＬＴＭＬの作製。

ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用したＬＴ
発現ベクターｐβＬＴＩ、　ｐβＬＴ１．ｄｈｆｒおよ
びｐβＬ　Ｔ　Ｍ　Ｌはつぎの（１）から（１）のステ
ップにより作製した。

（１）ＬＴ遺伝子の蛋白合成開始点へのＮｅｏ　１部位
の導入。

すでに作製されているＬＴ遺伝子およびアンピシリン耐
性遺伝子（Ａｍｐ）を有するプラスミドｐＬＴＥ　２．
３　（特願昭Ｇｏ−２３０７４４号明細書参照）を制限
酵素ＰｓｔｌおよびＡｃｃｌで切断し、ＬＴの蛋白合成
開始アミノ酸であるメチオニンのコドンＡＴＧを含む断
片をファージＭ１ｇ＋＋＋ｐＨ［メシング・ジェイ（Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）（１９８３年）メソッズ・イン・
エンザイモロジー、１０１巻　、２０頁参照］　ＤＮＡ
のＰｓｔｌ−Ａｃｃ１部位に挿入し組換え型ファージ旧
３ＭｅｔＬＴを作製した（第２図参照）。

組換え型ファージ旧３　Ｍ　ｅ　ｔ　Ｌ　Ｔを大腸菌Ｊ
ＭＬＯ８（ファルマシア社製）を宿主として培養し、フ
ァージ粒子から１本鎖ＤＮＡを調整した。この１本鎖Ｄ
ＮＡ　０．４μｍｏｌ　、ホスホトリエステル法［ミヨ
シ・ケイ（旧ｙｏｓｈｉ、に、）ら（１９８０年）ヌク
レイツク・アシッズ・リサーチ、８巻、　５５０７頁参
照］で合成したＮｃｏ１部位を有するオリゴヌクレオタ
イドｐＧｃｉＴｃＧＴＧｃｃＡＴＧＧＧＧ　２０ｐｍｏ
ｌおよび旧３プライマー旧ｐＡＧＴｃＡｃＧＡｃＧＴＴ
ＧＴＡ　　（蜜酒造■製）　１０ｐｍｏｌ、Ｔｒ！５−
ＩＣ＃　８６ｍＭ（ｐＨ７，５）　、ＭｇＣＮ　２Ｂ、
ＢｍＭを含む溶液１６゜５μｇを６５℃、２時間インキ
ュベートし４５℃まで徐冷した。室温で２０分放置後り
、８ｎ＋Ｈの４種のデオキシヌクレオシド三燐酸、ＡＴ
Ｐ２ｍＭ、ジチオスレイト−ル２ｍＭ、０．０２％牛血
清アルブミン、６ユニツｌ−１）ＮＡポリメラーゼ１（
フレノウ（Ｋｌｏｎｏｗ）フラグメンｌ−）、３ユニツ
トＴ４ＤＮＡ　リガーゼ、　Ｔｒｌｓ−１１ｃ（！　０
［ｉｍＭ（ｐＨ７，５）　ＭｇＣｌ　７　６．６ｍＭを
含む溶液Ｌ８．５ｐｆｌを加え１６℃、２．５時間反応
さヒ・、ＤＮＡ鎖を伸長させた後に６５℃、２０分処理
により反応を停市させた。

つぎに制限酵素ＥｃｏＲｌと旧ｎｄｍを加え３７℃、１
時間処理後フェノール抽出を行ないエタノール沈澱によ
りＤＮＡを回収した。

えられたＤＮＡをｐＵｃ９　（ファルマシア社製）のＨ
ｉ　ｎｄ　ｍ　−ＥｃｏＲ１部位に結合させプラスミド
ｐＭｕｔＬＴを作製した（第３図参照）。

（２）ＬＴ発現ベクターｐβ■、Ｔ１の作製プラスミド
ｐＬＴＥ２．３を制限酵素ΔｐａｌとＥｃｏＲＩで切断
しＬＴ遺伝子を有する断片を（１）でえられた１）Ｍｔ
ｌｔＬＴのＡＩ）ａｔ−ＥｃｏＲ１部位に導入しプラス
ミドｐＵｃＬＴＮｃｏを作製した（第４図参照）。

一方すでに作製されているヒトβ−アクチン遺伝子のプ
ロモーター領域を有するプラスミドｐｕβ１１００　（
特願昭６１−１．０７１８１号明細書参照）をＳａｌ　
ｌおよびＰｖｕ　ＩＩで切断し　ｐβ（ヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター領域）を含む断片をすでに作製
されているＬＴ遺伝子を有するプラスミドｐＬＴ’　　
（特願昭［ｉｌ−３４９８２号明細書参照）の５ａｌｔ
−Ｂａ１１部位に結合しｐβΔを作製した（第５図参照
）。ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いたＬ
Ｔ発現ベクターｐβＬＴＩはｐβΔのＮｅｏ　Ｉ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片をｐ　Ｕ　ＣＬ　Ｔ　Ｎ　ｃ　ｏのＬＴ遺伝
子を含むＮｅｏ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片と置きかえること
により作製した（第６図参照）。ｐβＬＴＩはヒトβ−
アクチン遺伝子のプロモーター領域とＬＴ遺伝子が、両
遺伝子の蛋白合成開始アミノ酸であるメチオニンのコド
ンＡＴＧ（Ｎｃｏ１部位）を介して、結合しており、Ｌ
Ｔの転写はヒトβ−アクチンのプロモーターによってコ
ントロールされている。

また転写終結およびＰ（Ａ）　（ポリ（Ａ）付加シグナ
ル）の付加のための必要な配列はＳＶ４０の後期遺伝子
のものを利用している。さらにこのベクターは選択マー
カー遺伝子としてＥｃｏｇｐｔ　（大腸菌のグアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子）［マリガンφ
アール・シー（Ｍｕｌ、ｌｉｇａｎ。

Ｒ，Ｃ，）ら（１９８０年）サイエンス（Ｓｃｌｅｎｃ
ｅ）、２０９巻、１４２２頁参照］を有している。

［３）ＬＴ発現ベクターｐβＬＴＩｄｈｆ’ｒの作製ｐ
ｓＶ２ｄｈｆｒ　［スプラマニ・ニス（Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｊ、Ｓ、）ら（１９８１年）モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー、１巻、８５４頁参照］のＰｖ
ｕ　Ｕ部位とＢａｍｔ１１部位をそれぞれｘ　ｂ　ｏ　
Ｉと５ａｌｌに変換したプラスミドｐｓＶ２ｄｂｒｒＸ
ｓかうｄｂｆ’ｒ（ジヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子をＸ
ｌｌ０＋および５ａｉｌで切り出しこの断片をｐβＬ　
Ｔ　ＩのＳａｌ　１部位に挿入しｐβＬＴ１ｄｈｆｒを
作製した。ｐβＬＴ１ｄｂｆｒは選択可能なマーカーと
して■シｅｏｇｐｔとｄｈｆｒの２種の遺伝子を有して
いる（第７図参照）。

（４）ＬＴ発現ベクターｐβＬＴＭＬの作製発現ベクタ
ーｐβＬＴＭｌ、はｐβＬＴＩ　（７）Ｌ′ｒ遺伝子を
有する旧ｎｄｌｌＩ　−１３ｇ１　ＩＩ断片をｐＵｃ９
のｌｌｌｎｄｍ−Ｂａｍ旧部位に挿入し作製した（第８
図参照）。

ｐβＬＴＭＬは選択マーカー遺伝子を持たないＬＴ発現
ベクターである。

実施例２ ＬＴ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＬＴの生産
。

ＬＴ発現ベクターｐβＬＴＩをＢＨＫ−２１（Ｃ−１３
）　［ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１０１、ＣＨＯ−に１［ＡＴ
ＣＣ，ＣＣＬ−８１］、ＰＬ［ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−８２
コを宿主として、ウィグラー（νｊｇｌｅｒ）らの方法
［ウィグラーら（１９７７年）セル、１１巻、２２３頁
参照］に準じて形質転換を行なった。プラスミド−リン
酸カルシウム共沈澱物をあらかじめ５％ＰＣ８（牛胎児
血清）を含む培地で生育させた細胞（２Ｘ　１０５細胞
／３ｍ１培地／直径６　ａｍ培養皿）に加え、４時間後
に培地を更新し、４８時間後に培地上に含まれるＬＴを
Ｌ９２９細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した
［ラフφエム・アール（Ｒｕｆｆ　、Ｍ、Ｒ，）とギフ
オード・ジー・イー（Ｇｉｆｆｏｒｄ、Ｇ、Ｅ、）、（
１９８１年）リンホカインズ、２巻、２３５頁参照コす
なわち９６穴マルチディツシュ２Ｘ１０４細胞／ｗｅｌ
ｌ／１００μｇ培地で１日培養後、培養液を除き、アク
チノマイシンＤ／μｇ　／　ｍｌ、５％ＦＣ３を含むイ
ーグルＭＥＭ培地で種々の濃度に希釈したサンプルを１
００μｇ加え、２０時間後の細胞の変性致死効果を測定
した。ＬＴＩユニットは５０％の致死率を与える濃度と
した。その結果を第１表に示す。第１表に示すようにヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーターを利用した発現ベ
クターはＳＶ４０の初期プロモーターを利用した発現ベ
クターｐｓＶｅｓ［１ｌａｌＬＴ　（特願昭ＧＯ−１４
７３７１号明細書参照）にくらべ高単位のＬＴを生産し
た。

［以下余白］ 第　　　　１　　　　表 つぎにｐβＬＴＩを導入したＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）
およびＰＬの培地を５％ＦＣ８、２５，ｃｚ　ｇ　／　
ｍ＋ミコフェノール酸、２５０μｇ　／　ｍｌキサンチ
ン、０．１μｇ／ｍ１アミノプテリンを含むＭＥＭ培地
に換え、約３週間培養した。生じたコロニーを分離し、
２４穴マルチウエルプレートに生育させ７２時間後の培
地に含まれるＬＴを前記測定方法と同じ方法によって測
定しその結果を第２表に示す。第２表に示すように分離
した形質転換細胞はＬＴを生産した。

第　　　　２　　　　表 実施例３ 実施例２と同様にＢＩＩＫ−２１，（Ｃ−１３）および
Ｔ’ＬをｐβＬＴ１ｄｈｆｒまたはｐβＬ　Ｔ　Ｍ　Ｌ
に１：１０で形質転換し形質転換株をえた。形質転換株
をそれぞれ直径１０ｃｍのディツシュに１０３〜５Ｘ１
０５細胞を植え、ＩＩＩＩＭ〜５００ｎＭのメントレキ
セート（Ｍｔｘ）を含む培地で約１ケ月培養し、種々の
濃度のＭｔｘに対して耐性を示すコロニーを分離した。

２４穴マルチウエルプレートに生育させ培地を５％ＦＣ
８を含む培地または血清を含まない培地に更新し、７２
時間後の培地に含まれるＬＴを測定し、その結果を第３
表に示す。第３表に示すようにＭｔｘで選択した細胞か
らは親株よりも高いＬＴ生産性を示す株かえられた。

［以下余白］

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトβ−アクチンの遺伝子の構造を示す模式図
である。Ｅ−１からＥ−Ｖ　Ｉは第１エクソンから第６
エクソンを、Ｉ−１からＩ−Ｖは第１イントロンから第
５イントロンを示す。ＣＣＡＡＴ　。 ＴＡＴＡ、　ＡＴＧおよびＴＧＡはそれぞれプロモータ
ー領域」二のＣＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、蛋白
合成開始コドンおよび終止コドンを示す。Ｓｍａｌ。 Ｎｅｏ　ｌまたは５ａｉｌは代表的な制限酵素認識部位
を示す。 第２図はファージＭ１３ＭｅｔＬＴ作製の模式図であり
、第３図はプラスミドｐＭｕｔＬＴ作製の模式図であり
、第４図はプラスミドｐｔｌＣＬＴＮｃｏ作製の模式図
であり、第５図はグラスミ１９８６作製の模式図であり
、第６図はプラスミドｐβＬＴＬ作製の模式図であり、
第７図はプラスミドｐβＬＴ１ｄｈｆ’ｒ作製の模式図
でありまた第８図はプラスミドｐβＬ　Ｔ　Ｍ　Ｌ作製
の模式図である。第２図から第８図中に代表的な制限酵
素による認識部位を示した。 Ａ′２図 一７４図 才５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータＤＮＡ配列と
   ヒト・リンホトキシンをコードする ＤＮＡ配列とを結合したＤＮＡ配列を有するヒト・リン
   ホトキシン発現ベクター。 ２　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータＤＮＡ配列と
   ヒト・リンホトキシンをコードする ＤＮＡ配列が両配列の蛋白合成開始アミノ酸であるメチ
   オニンのコドンを介して結合してなる特許請求の範囲第
   １項記載のヒト・リンホトキシン発現ベクター。 ３　増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列が、前記ヒト・リン
   ホトキシン発現ベクターのＤＮＡ鎖上に配列されてなる
   特許請求の範囲第１項または第２項記載のヒト・リンホ
   トキシン発現ベクター。 ４　増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の遺
   伝子である特許請求の範囲第３項記載のヒト・リンホト
   キシン発現ベクター。 ５　ヒト・リンホトキシンをコードするＤＮＡ配列が、
   正常ヒト染色体のＤＮＡ配列である特許請求の範囲第１
   項、第２項、第３項または第４項記載のヒト・リンホト
   キシン発現ベクター。 ６　ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、プラスミド
   ｐβＬＴ１、ｐβＬＴ１ｄｈｆｒまたはｐβＬＴＭＬで
   ある特許請求の範囲第１項または第２項記載のヒト・リ
   ンホトキシン発現ベクター。 ７　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター配列とヒト
   ・リンホトキシンをコードするＤＮＡ配列とを結合した
   ＤＮＡ配列を有するヒト・リンホトキシン発現ベクター
   による動物培養細胞の形質転換細胞。 ８　ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、ヒトβ−ア
   クチン遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列とヒト・リンホ
   トキシンをコードするＤＮＡ配列が両配列の蛋白合成開
   始アミノ酸であるメチオニンのコドンを介して結合して
   なるものである特許請求の範囲第７項記載の形質転換細
   胞。 ９　ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、増幅可能な
   遺伝子のＤＮＡ配列を同一のＤＮＡ鎖上に有してなるも
   のである特許請求の範囲第７項または第８項記載の形質
   転換細胞。 １０　形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝子
   の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択され
   た細胞である特許請求の範囲第９項記載の形質転換細胞
   。 １１　増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の
   遺伝子である特許請求の範囲第９項記載の形質転換細胞
   。 １２　形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃度
   のメソトレキセートに耐性を示す細胞として選択された
   細胞である特許請求の範囲第１１項記載の形質転換細胞
   。 １３　形質転換細胞の由来が、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３
   ）またはＣＨＯ−Ｋ１である特許請求の範囲第７項、第
   ８項、第９項、第１０項、第１１項または第１２項記載
   の形質転換細胞。 １４　形質転換細胞の由来が、ヒトである特許請求の範
   囲第７項、第８項、第９項、第１０項、第１１項または
   第１２項記載の形質転換細胞。 １５　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータ配列とヒト
   ・リンホトキシンをコードするＤＮＡ配列とを結合した
   ＤＮＡ配列を有するヒト・リンホトキシン発現ベクター
   による動物培養細胞の形質転換細胞を培養し、リンホト
   キシンを生成せしめ、これを採取することを特徴とする
   リンホトキシンの製造方法。 １６　ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、ヒトβ−
   アクチン遺伝子のプロモータＤＮＡ配列とヒト・リンホ
   トキシンをコードするＤＮＡ配列が両配列の蛋白合成開
   始アミノ酸であるメチオニンのコドンを介して結合して
   なるものである特許請求の範囲第１５項記載の製造方法
   。 １７　ヒト・リンホトキシン発現ベクターが、増幅可能
   な遺伝子のＤＮＡ配列を同一のＤＮＡ鎖上に有してなる
   ものである特許請求の範囲第１５項または第１６項記載
   の方法。 １８　形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝子
   の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択され
   た細胞である特許請求の範囲第１７項記載の製造方法。 １９　増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素の
   遺伝子である特許請求の範囲第１７項記載の製造方法。 ２０　形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃度
   のメソトレキセートに耐性を示す細胞として選択された
   細胞である特許請求の範囲第１９項記載の製造方法。 ２１　形質転換細胞の由来が、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３
   ）あるいはＣＨＯ−Ｋ１である特許請求の範囲第１５項
   、第１６項、第１７項、第１８項、第１９項または第２
   ０項記載の製造方法。 ２２　形質転換細胞の由来が、ヒトである特許請求の範
   囲第１５項、第１６項、第１７項、第１８項、第１９項
   または第２０項記載の製造方法。 ２３　培養に用いる培地が無血清培地である特許請求の
   範囲第１５項、第１６項、第１７項、第１８項、第１９
   項、第２０項、第２１項または第２２項記載の製造方法
   。