JPS59140882A - インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 - Google Patents
インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子Info
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- JPS59140882A JPS59140882A JP57229619A JP22961982A JPS59140882A JP S59140882 A JPS59140882 A JP S59140882A JP 57229619 A JP57229619 A JP 57229619A JP 22961982 A JP22961982 A JP 22961982A JP S59140882 A JPS59140882 A JP S59140882A
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- interleukin
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は遺伝子に関し、さらに詳しくはインターロイ
キン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子に関
する。
キン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子に関
する。
インターロイキン２はその特異な免疫応答作用から医薬
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、ＦｘｐｏＭｅｄ、。
への応用が注目され、インターロイキン２を産生ずるヒ
）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告されている（
ギリスら、Ｊ、ＦｘｐｏＭｅｄ、。
１５２巻、１７０９頁、１９８０年）。
しかし、このヒトＴ白血病細胞株によるインターロイキ
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の□方法として、イ
ンターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクター
に組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微
生物により生産させることが考えられる。
ン２の生産量は微量であり、しかもその生産には細胞の
大量培養を必要とし、困難な問題が残されている。イン
ターロイキン２を製造するための他の□方法として、イ
ンターロイキン２に対応するＤＮＡを微生物のベクター
に組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻訳せしめて微
生物により生産させることが考えられる。
本発明者らは微生物により生産させるために必要なイン
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
ターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離
することに成功し、微生物によりインターロイキン２生
産の道をひらいた。
即ちこの発明はインターロイキン２活性をもつポリペプ
チドをコードする遺伝子を提供するものである。このＤ
ＮＡは、そのＤＮＡ 鎖中に制限酵素ＢｓｔＮＩ 、
ＸｂａＩおよびＢｏｔＮＩで切断される個所がこの順序
で配置されている部分を含み、以下のポリペプチド■又
は■をコードするものであり、以下の塩基配列■又は■
を有するものである。
チドをコードする遺伝子を提供するものである。このＤ
ＮＡは、そのＤＮＡ 鎖中に制限酵素ＢｓｔＮＩ 、
ＸｂａＩおよびＢｏｔＮＩで切断される個所がこの順序
で配置されている部分を含み、以下のポリペプチド■又
は■をコードするものであり、以下の塩基配列■又は■
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ポリペプチド■
Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｌ
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Ｔｙｒ ＭｅｔＰｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈ
ｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｉ、ｓ Ｌｅｕ ＧＩ
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Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ８ｅｒ Ｇｌｕ
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Ｔｈｒポリペプチド■ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ８ｅｒ ８ｅｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮＬｅｕ ＧＩＮ
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ｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮＬｅｕ ＧＩＮ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
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Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＴｙｒＭｅｔ
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Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ
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ＡｓＮ Ｌｅｕ Ａｌａ ＧＩＮ ８ｅｒ Ｌｙｓ
ＡｓＮ ＰｈｅＨｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒ
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ｅＡｓＮ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＧｌｕＴｈ
ｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｏｙｓ Ｇｌｕ Ｔ
ｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔ
ｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
ＡｓＮ Ａ、ｒｇ Ｔｒｐ ｌ１ｅＴｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｃｙｓ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ塩基配列■ ＡＴＧ ＴＡＯＡＧＧ ＡＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣＣ！Ｔ
Ｇ ’Ｊ’Ｏ’Ｉ’ ＴＧＯＡＴＴ ＧＯＡＯＴＡ Ａ
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’ ＯＴＴ ０ＡＧＴＧＴ ＯＴＡ ＧＡＡ ６ＡＡＧ
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’ｌ！’Ｉ’ ＯＴＧ ＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ ＧＧ
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ＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＯＴ ＧＡＴ ＧＡＧ ＡＣ
Ａ ＧＯＡＡＯＯＡＴＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴＴ Ｏ
ＴＧ ＡＡＯＡＧＡＴＧＧ ＡＴＴ ＡＯＯＴＴ’［’
ＴＯ’ｌ’ ＯＡＡ ＡＧＯＡＴＯＡＴＯ’Ｉ’ＣＡ
ＡＯＡ ＯＴＡ ＡＣＴ塩基配列■ ＧＯＡ ＯＯＴ ＡＣＴ ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＯＴ Ａ
ＯＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＯＡ ０ＡＧＯＴＡ ＯＡＡ
ＯＴＧ ＧＡＧ ＯＡ’ｌ’ ＴＴＡ ＯＴＧ Ｏ’
ｌ’Ｇ ＧＡＴ ＴＴＡ ０ＡＧＡＴＧ ＡＴＴ ＴＴ
Ｇ ＡＡ’Ｆ ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡ
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ＡＴＧ （３ＴＯＡＯＡ ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＴＴＴ
ＡＯＡＴＧ Ｃｏｏ ＡＡＧ ＡＡＧ Ｇｏｏ ＡＯＡ
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ｌ’ＯＡＡＴ Ｏ（！Ｔ ０ＴＧＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴ
Ｇ ＯＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＯＴ ＯＡＡ ＡＧＯ
ＡＡＡ ＡＡＯＴＴＴ ＯＡＯＴＴＡ ＡＧＡ Ｃｏｏ
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’Ｉ’ＧＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡＴＯＡＴＯＴＯＡ ＡＯ
Ａ Ｏ’Ｉ’ＡＯＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２８画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡと略称する。）より調製される。即
ち、インターロイキン２生産能を有するリンパ球由来細
胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜１２
８画分のｍ ＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えばエ
シェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエシ
ェリヒア・コリ細胞内で増巾せしめ、インターロイキン
２ポリペプチドを発現しうるＤＮＡを有するクローンを
単離し、単・離されたクローンが有するプラスミド中に
挿入されているＤＮＡを分離すればよい。
ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＣＴ ＧＡＴ ＧＡＧＡＯＡ ＧＯ
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Ａ Ｏ’Ｉ’ＡＯＴ このようなりＮＡは、ショ糖密度勾配遠心法による分画
により１１〜１２８画分として得られ、ヒト又はネズミ
リンパ球由来細胞より分離されるメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡと略称する。）より調製される。即
ち、インターロイキン２生産能を有するリンパ球由来細
胞より得られたショ糖密度勾配遠心法による１１〜１２
８画分のｍ ＲＮＡより調製されたＤＮＡを、例えばエ
シェリヒア・コリのプラスミドベクターに接続してエシ
ェリヒア・コリ細胞内で増巾せしめ、インターロイキン
２ポリペプチドを発現しうるＤＮＡを有するクローンを
単離し、単・離されたクローンが有するプラスミド中に
挿入されているＤＮＡを分離すればよい。
本発明のインターロイキン２活性をもつポリペプチドを
コードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに接続し
て得られた組換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に導入すれ
ば、その微生物をインターロイキン２生産能を有するよ
うに形質転換することができる。
コードするＤＮＡは、微生物由来のレプリコンに接続し
て得られた組換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に導入すれ
ば、その微生物をインターロイキン２生産能を有するよ
うに形質転換することができる。
ｍＲＮＡは、上記したように、インターロイキン２に対
応し、Ｓ］追遠心法やゲルｒ過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２８画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出１分離することによって製造できる。
応し、Ｓ］追遠心法やゲルｒ過法等による分画ならびに
アガロースゲル電気泳動法により１１〜１２８画分とし
て得られるものであり、このｍＲＮＡはリンパ球由来細
胞より抽出１分離することによって製造できる。
本発明に用いるインターロイキン２産生能を有するヒト
リンパ球由来細晶として説明すればヒト末梢血、扁桃腺
、ｎ臓等より得られるリンパ球そのものも含まれる。ま
た、これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−
補体処理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ
、ガラクトース酸化酵素等）処理などの前処理をしだも
の並びにＸ綜等による変異処理およびトリプシン等の酵
素処理等によりインターロイキン２の産生能が付与され
たものも本発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる１、
さらに、これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえば１９
７７球をＴリンパ球成長因子等の存在下にクローン化し
たように、クローン化したものも好ましいヒトリンパ球
由来細胞である。
リンパ球由来細晶として説明すればヒト末梢血、扁桃腺
、ｎ臓等より得られるリンパ球そのものも含まれる。ま
た、これらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−
補体処理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ
、ガラクトース酸化酵素等）処理などの前処理をしだも
の並びにＸ綜等による変異処理およびトリプシン等の酵
素処理等によりインターロイキン２の産生能が付与され
たものも本発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる１、
さらに、これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえば１９
７７球をＴリンパ球成長因子等の存在下にクローン化し
たように、クローン化したものも好ましいヒトリンパ球
由来細胞である。
また、ヒト白血病細胞およびＴ ＩＪンパ肺細胞のよう
なヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化
細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したものま
たは悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒ
トリンパ球由来細胞として用いることができる。特にク
ローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常
多い。
なヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化
細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したものま
たは悪性化細胞をクローン化したものがより好ましいヒ
トリンパ球由来細胞として用いることができる。特にク
ローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常
多い。
さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＯＥＭ 。
Ｍｏ１ｔ４Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる、いわゆるハイブリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
られる、いわゆるハイブリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
これらヒトリンパ球由来細胞には（１１自発的にインタ
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ヒトリンパ球由来細胞にインターロイキン２ｍ ＲＮＡ
を生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産生
株を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養す
ればよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を
産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、
ローズウェル・ハーク・メモリアル・インスチチュー）
１６４０（以下、ＲＰＭ１１６４０と略記する。）培
地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓ ）培地、クリック培
地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有して
も含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜４
Ｘ１０’ｉ旬の細胞密度で懸濁し、ここにマイトゲン；
ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；塩化亜鉛等
の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリジン−〇等
の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、細胞を洗
浄、刺激剤を除去する。
を生成せしめるにあたり、インターロイキン２自発産生
株を用いる場合には、これら細胞を通常の方法で培養す
ればよい。マイトゲン刺激によりインターロイキン２を
産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十分に洗浄後、
ローズウェル・ハーク・メモリアル・インスチチュー）
１６４０（以下、ＲＰＭ１１６４０と略記する。）培
地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’
ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓ ）培地、クリック培
地などの通常の細胞用培地（血清や血清成分は含有して
も含有しなくてもよい）や合成無血清培地に０．５〜４
Ｘ１０’ｉ旬の細胞密度で懸濁し、ここにマイトゲン；
ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；塩化亜鉛等
の亜鉛化合物；プロティンＡ、ストレプトリジン−〇等
の菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、細胞を洗
浄、刺激剤を除去する。
マイトゲン刺激の際にマクロファージやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞や１９７７球や３３ リンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ
、 Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６’２． ＢＡＬＬ−１細
胞を共存させると同様にインターロイキン２の産生能が
みられるような細胞があり、これらの細胞を用いてイン
ターロイキン２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、こ
れらの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このよ
うにすると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞や１９７７球や３３ リンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ
、 Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６’２． ＢＡＬＬ−１細
胞を共存させると同様にインターロイキン２の産生能が
みられるような細胞があり、これらの細胞を用いてイン
ターロイキン２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、こ
れらの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。このよ
うにすると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。
ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行なうことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている培地
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることができることが判っ
た。
でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地でも、
これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、かつ
本発明の細胞材料として用いることができることが判っ
た。
リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン２０ｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
、インターロイキン２０ｍＲＮＡが生成される時間であ
り、この時間は細胞の培養上清にインターロイキン２が
産生され始めた頃に相当する。
具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間である。徒
らに培養時間を延ばすと、生成したインク・ −ロイギ
ン２０ｍ ＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球
活性化に際し、ＰＭＡやＴＰＡなどのホルボールエステ
ル類を１０〜５０ ｎ９７ｙ４添加することもある。培
養温度は３２〜３７℃の範囲が望ましい０ 以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒ）
ＩＪンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明
する。
らに培養時間を延ばすと、生成したインク・ −ロイギ
ン２０ｍ ＲＮＡが分解されてしまう。また、リンパ球
活性化に際し、ＰＭＡやＴＰＡなどのホルボールエステ
ル類を１０〜５０ ｎ９７ｙ４添加することもある。培
養温度は３２〜３７℃の範囲が望ましい０ 以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒ）
ＩＪンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明
する。
０） リンホカイン自発産生株の取得
ヒトＴリンパ球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（フレッド・）・ツチンソン・癌研究所／シアトル／ア
メリカ、ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイ
ツ国立癌センター／ノ・イデルベルヒ／西ドイツ等で自
由に手に入る。）を１×１０６個／―の細胞密度でクリ
ック培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速
度で合計ｓ、ｏｏ。
（フレッド・）・ツチンソン・癌研究所／シアトル／ア
メリカ、ソーク研究所／サンジエゴ／アメリカ、西ドイ
ツ国立癌センター／ノ・イデルベルヒ／西ドイツ等で自
由に手に入る。）を１×１０６個／―の細胞密度でクリ
ック培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速
度で合計ｓ、ｏｏ。
レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本細胞を０．
１細胞／２００μｌの細胞密度で９６穴の平底マイクロ
タイ′タープレート（［ファルコン３０７２Ｊ）に添加
し、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で３週間３７
℃にて５％ＣＯ，インキュベーター中にて培養する（限
界希釈法によるクローニング）。
１細胞／２００μｌの細胞密度で９６穴の平底マイクロ
タイ′タープレート（［ファルコン３０７２Ｊ）に添加
し、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で３週間３７
℃にて５％ＣＯ，インキュベーター中にて培養する（限
界希釈法によるクローニング）。
細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ゴのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得られた場合には
、本細胞を２ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度にて血清
も血清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２ゴに
懸濁して２日間培養し、本培養土清を３．００ Ｏｒｐ
ｍ、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次いで０．２２
μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行
なってインターロイキン２を得る。こうして得られるク
ローン細胞よりインターロイキン２産生株が得られる。
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ゴのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得られた場合には
、本細胞を２ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度にて血清
も血清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２ゴに
懸濁して２日間培養し、本培養土清を３．００ Ｏｒｐ
ｍ、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次いで０．２２
μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行
なってインターロイキン２を得る。こうして得られるク
ローン細胞よりインターロイキン２産生株が得られる。
（ロ） ヒト末梢血Ｔリンパ球よりインターロイキン２
産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ Ｘ １０’個／ｄの細胞密度でクリック培
地に懸濁し、各２ｍ１３宛２４穴のヌンクの培−プレー
トに接種する。ここにフィトヘマグルチニン＝Ｍ（ギブ
コ社製）を５μ９／ｍｉｔの終末濃度になるように１０
０μｌ添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで
細胞を培養液で洗浄し、再び１×１０！１個／ゴの細胞
密度で元のヌンクの培養プレートに１ゴ宛まく。各ウェ
ルにヒトの胸腺細胞をコンカナバリンＡ（以下、Ｃｏｎ
Ａと略称する。）２．５μ９／ｍｌで４８時間刺激して
得たコンディショニングした培養液をｌ ｒｎＪｌ添加
し、３日間同様の培養を繰り返し、ヒト末梢血より得た
１９７７球を長期継代培養する。このように長期継代培
養して得たｌｌ’ｌ ＩＪンパ球を、前述と同様の限界
希釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。
産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ Ｘ １０’個／ｄの細胞密度でクリック培
地に懸濁し、各２ｍ１３宛２４穴のヌンクの培−プレー
トに接種する。ここにフィトヘマグルチニン＝Ｍ（ギブ
コ社製）を５μ９／ｍｉｔの終末濃度になるように１０
０μｌ添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで
細胞を培養液で洗浄し、再び１×１０！１個／ゴの細胞
密度で元のヌンクの培養プレートに１ゴ宛まく。各ウェ
ルにヒトの胸腺細胞をコンカナバリンＡ（以下、Ｃｏｎ
Ａと略称する。）２．５μ９／ｍｌで４８時間刺激して
得たコンディショニングした培養液をｌ ｒｎＪｌ添加
し、３日間同様の培養を繰り返し、ヒト末梢血より得た
１９７７球を長期継代培養する。このように長期継代培
養して得たｌｌ’ｌ ＩＪンパ球を、前述と同様の限界
希釈法でクローニングおよび細胞増殖を行なう。
こうして得られたクローン化１９７７球を１×１０６個
／ｍｌの細胞密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、
ここに１０μり／ｍｌの終末濃度になるようにフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ）を添加し、２４時間。
／ｍｌの細胞密度にＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、
ここに１０μり／ｍｌの終末濃度になるようにフィトヘ
マグルチニン（ＰＨＡ）を添加し、２４時間。
３７℃で７．５％ＣＯＱインキュベーター中にて培養し
、本培養土清を３．００ Ｏｒｐｍ、 ５分間の遠心
分離操作で分離し、次いで０，２２μのミリポアフィル
タ−で無菌化を行ないインターロイキン２が得られる。
、本培養土清を３．００ Ｏｒｐｍ、 ５分間の遠心
分離操作で分離し、次いで０，２２μのミリポアフィル
タ−で無菌化を行ないインターロイキン２が得られる。
こうして得られるクローン化細胞よりインターロイキン
２産生株が得られる。
２産生株が得られる。
（ハ） マイトゲン刺激でインターロイキン２を生産す
るヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカッ
ト細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ
−１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地中にて０ｏｎＡ １０ ｔｉ９
／ｍｌやＰＨＡ ２．５μ９ｚＱ’の存在下に２４時間
培養すると、１０〜４．０００単位／ｒｎｌのインター
ロイキン２を産生ずることが判明した。
るヒトリンパ球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカッ
ト細胞や前記した限界希釈法によりクローン化されたＪ
−１１１株は、前記の無血清培地や血清１〜２％を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地中にて０ｏｎＡ １０ ｔｉ９
／ｍｌやＰＨＡ ２．５μ９ｚＱ’の存在下に２４時間
培養すると、１０〜４．０００単位／ｒｎｌのインター
ロイキン２を産生ずることが判明した。
また、塩化亜鉛、プロティンＡ、ビシバニール存在下に
培養しても、インターロイキン２を産生ずる。
培養しても、インターロイキン２を産生ずる。
に）他の細胞もしくはその細胞の産生ずる因子の存在下
にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン２
を産生ずる細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ
４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカッ
ト細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は、上述
のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加えて
２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生し
ない。ところが、この間モノカインの１種であるインタ
ーロイキン１を５〜１０ｕ／１ｍ またはに５６２やラ
ージ（Ｒａｊｉ）細胞をＩ Ｘ １０’細胞／ｍｌ当り
０．５ Ｘ １０’個１ｍｌ相当共存させてクリック培
地中にて３７°Ｃ２２４時間培養すると、インターロイ
キン２を１０〜ｌ ＯＯｕ／ｍｌ！産生ずる。
にマイトゲンで刺激することによりインターロイキン２
を産生ずる細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ１ｔ
４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュルカッ
ト細胞の１つのクローン、ジェルカット９９株は、上述
のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加えて
２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生し
ない。ところが、この間モノカインの１種であるインタ
ーロイキン１を５〜１０ｕ／１ｍ またはに５６２やラ
ージ（Ｒａｊｉ）細胞をＩ Ｘ １０’細胞／ｍｌ当り
０．５ Ｘ １０’個１ｍｌ相当共存させてクリック培
地中にて３７°Ｃ２２４時間培養すると、インターロイ
キン２を１０〜ｌ ＯＯｕ／ｍｌ！産生ずる。
このようにして得られた細胞よりインターロイキン２に
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 ＴｒｉｔｏｎＸ １００ デオキシコール酸
などの界面活性剤を使用するか、ナモゲナイザーや凍結
融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは
完全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮ
ａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲ
’Ｎａ’ｓ ｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリ
ビニル硫酸、ベントナイト。
対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わず
常法によって行なえばよい。たとえば、ＮＰ−４０，Ｓ
ＤＳ、 ＴｒｉｔｏｎＸ １００ デオキシコール酸
などの界面活性剤を使用するか、ナモゲナイザーや凍結
融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは
完全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際にＲＮ
ａｓｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲ
’Ｎａ’ｓ ｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリ
ビニル硫酸、ベントナイト。
フカロイド。ジエチルピロカーボネイト、バナジウム複
合体などに添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２に対応する抗体を用いてイ
ンターロイキン２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、
これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出することがで
きる。ｍ ＲＮＡはオリゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−
セファロース、セファロース２Ｂなどの吸着カラムある
い・はバッチ法による精製法、 ８ＤＧ遠心法による分
画等によって精製することができる。このような精製操
作によりインターロイキン２に対応するｍＲＮＡは１ｌ
−１２Ｓ画分として得られる。
合体などに添加しておくのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２に対応する抗体を用いてイ
ンターロイキン２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、
これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出することがで
きる。ｍ ＲＮＡはオリゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−
セファロース、セファロース２Ｂなどの吸着カラムある
い・はバッチ法による精製法、 ８ＤＧ遠心法による分
画等によって精製することができる。このような精製操
作によりインターロイキン２に対応するｍＲＮＡは１ｌ
−１２Ｓ画分として得られる。
上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするインター
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる糸であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
１ａｅｖｉ’ｓ ）の卵母細胞にｍ ＲＮＡを注入し
て翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、
小麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行な
われている。
ロイキン２に対応するものであることを確認するために
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるか
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる糸であるアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ
１ａｅｖｉ’ｓ ）の卵母細胞にｍ ＲＮＡを注入し
て翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球ライゼート、
小麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させることが行な
われている。
ここに用いたインターロイキン２の活性検定法は次の通
りである。即ち、検体１００μｌを９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６六マイクロプレート上において各１００μｌの希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４Ｘ
１０３（Ｌ’ｌＯＯμｌの細胞密度として１００μｌ宛
各（ぼみに添加する。３７°Ｃ２５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
Ｑ、 ５μＣ１を加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、ａ胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清はど活性化Ｔ１７ンバ球内にと
り込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体
中に含有されるインターロイキン２量を容易に知ること
ができる。
りである。即ち、検体１００μｌを９６穴マイクロタイ
タープレートの１列目に添加し、２％の牛胎児血清を含
有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り返して
、９６六マイクロプレート上において各１００μｌの希
釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒｅ、
２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によって教示さ
れた方法に従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４Ｘ
１０３（Ｌ’ｌＯＯμｌの細胞密度として１００μｌ宛
各（ぼみに添加する。３７°Ｃ２５％炭酸ガスインキュ
ベーター中２０時間静置培養後、トリチウム化チミジン
Ｑ、 ５μＣ１を加え、４時間パルスを行なった後、こ
の分野で良く知られた方法に従って細胞を採取し、ａ胞
内にとり込まれた放射線量を測定する。インターロイキ
ン２活性の高い培養上清はど活性化Ｔ１７ンバ球内にと
り込まれるトリチウムチミジン量が多いことから、検体
中に含有されるインターロイキン２量を容易に知ること
ができる。
またインターロイキン２はＴリンパ球分裂増殖せしめる
作用がありこの作用によるＴリッツ球増殖活性の検定法
は次の通りである。
作用がありこの作用によるＴリッツ球増殖活性の検定法
は次の通りである。
検体１００μｌを９６穴マイクロタイタープレートの１
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地を２倍希釈を繰り返して９６六マイクロプレート上に
おいて各１００μｌの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個７１００μ〕の細胞密度とし
て１００μノ宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭炭
酸ガスインキュベクター中７２間もしくは９６時間静置
培養してその後、倒立顕微鏡にて生存する活性化１９７
７球数をカウントする。この際、１００ ｕ殉ム１０
ｕ／ｄの活性を有するインターロイキン２をポジティブ
・コントロールとして用い、検体添加群における１９７
７球の増殖数と比較し、検体のインターロイキン２活性
を算出する。
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培
地を２倍希釈を繰り返して９６六マイクロプレート上に
おいて各１００μｌの希釈系列を作成する。そこに上述
活性化Ｔリンパ球株を５個７１００μ〕の細胞密度とし
て１００μノ宛各くぼみに添加する。３７℃、５％炭炭
酸ガスインキュベクター中７２間もしくは９６時間静置
培養してその後、倒立顕微鏡にて生存する活性化１９７
７球数をカウントする。この際、１００ ｕ殉ム１０
ｕ／ｄの活性を有するインターロイキン２をポジティブ
・コントロールとして用い、検体添加群における１９７
７球の増殖数と比較し、検体のインターロイキン２活性
を算出する。
かくして得られたインターロイキン２ ｍＲＮＡよりイ
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ンビトロで相補的なりＮＡ （ｃＤＮＡ）を合成し、微
生物由来のレプリコンに接続する。
ｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のような方法で行
なうことができる。
なうことができる。
ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとして、
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ 、 ｄＴＴＰ
の存在下で逆転写酵母によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写
酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ｃＤＮ
Ａを合成する。得られたＤＮＡの両端を必要によりエキ
ソヌクレエースで処理し、それぞれに適当なリンカ−Ｄ
ＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合せしめる。しかる後、これを例えばエシ
ェリヒア・コリ内で自律複製できるレプリコンを含むベ
クターに組込む。
ｄＡＴＰ、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ 、 ｄＴＴＰ
の存在下で逆転写酵母によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、
除去した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、逆転写
酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ｃＤＮ
Ａを合成する。得られたＤＮＡの両端を必要によりエキ
ソヌクレエースで処理し、それぞれに適当なリンカ−Ｄ
ＮＡを接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩
基を複数個重合せしめる。しかる後、これを例えばエシ
ェリヒア・コリ内で自律複製できるレプリコンを含むベ
クターに組込む。
組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必
要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合
せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工した二
重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用い
て接続せしめる。
要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な組合
せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工した二
重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用い
て接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス。
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用したが、バチルス・ズブチリス。
サツカロマイセス・セレビシェ等も使用できる。
エシェリヒア・コリの場合について使用されるベクター
を以下に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９
８１）参照） ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓＣＩＯＩ 、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６ 、
ｐＲＫ２４８ 。
を以下に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９
８１）参照） ＥＫ系プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓＣＩＯＩ 、 ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６ 、
ｐＲＫ２４８ 。
ｐＤＦ４１等、 ＥＫ系プラスミドベクター（リラック
スド型）の０ａｌＦｉｌ、 ｐＶＨ５１，ｐＡＯ１０５
、Ｒ８Ｆ２１２４゜ｐＯＲｌ、 ｐＭＢ９． ｐＢ几３
１３． ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４゜ｐＥＲ３２５
，ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９ 。
スド型）の０ａｌＦｉｌ、 ｐＶＨ５１，ｐＡＯ１０５
、Ｒ８Ｆ２１２４゜ｐＯＲｌ、 ｐＭＢ９． ｐＢ几３
１３． ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２４゜ｐＥＲ３２５
，ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８，ｐＫＹ２２８９ 。
ｐＫＹ２７００． ｐＫＮ８０． ｐＫＯ７，ｐＫＢ１
５８． ｐＭＫ２００４゜ｐＡｃｔＹｃ！１． ｐＡＯ
ＹＯ１８４，λｄｕ１等、λｇｔ糸ファージベクターの
λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢ、λＷＥ８・λＣ１λＷＥ
Ｓ−λＥ’ｌ λＺＪｖｉｒ−λＢ／、λＡＬＯ−λ
Ｅ、 λＷＢＳ−Ｔｓ６２２ 、λＤａｍ等。
５８． ｐＭＫ２００４゜ｐＡｃｔＹｃ！１． ｐＡＯ
ＹＯ１８４，λｄｕ１等、λｇｔ糸ファージベクターの
λｇｔ・λＣ１λｇｔ・λＢ、λＷＥ８・λＣ１λＷＥ
Ｓ−λＥ’ｌ λＺＪｖｉｒ−λＢ／、λＡＬＯ−λ
Ｅ、 λＷＢＳ−Ｔｓ６２２ 、λＤａｍ等。
これらのベクターのうちエシェリヒア・コリについては
一般にｐＥＲ３２２が良く用いられている。
一般にｐＥＲ３２２が良く用いられている。
ｐＢＲ３２２の場合にはｃＤＮＡの組込み場所はＰｓｔ
Ｉサイ） ｒ ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されてい
る。
Ｉサイ） ｒ ＥｃｏＲＩサイトがよく利用されてい
る。
プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＯ１゜処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてフ。
用いて微生物宿主を形質転換する方法としては主として
対数増殖期にある細胞を集めてＣａＯ１゜処理して自然
にＤＮＡを取込みやすい状態にしてフ。
ラスミドを取込ませる方法が採用されており、ＭｇＯ１
ｅあるいはＲｂ０ｊをさらに共存させることにより形質
転換の効率が一層増すことも知られて（・る。
ｅあるいはＲｂ０ｊをさらに共存させることにより形質
転換の効率が一層増すことも知られて（・る。
また、微生物細胞をスフェロプラストある〜・はプロト
プラスト化してから形質転換させてもよ（・。
プラスト化してから形質転換させてもよ（・。
形質転換株からインターロイキン２遺伝子が組込まれて
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
いる株を選別するには、以下のような方法がある。
（１）すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法と称
されるもので、まず０ｏｎＡによって刺激したジュルカ
ット細胞よりｍ ＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によっ
てインターロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（
１１〜１２８ｍ几ＮＡ）、このｒｏｎＮＡを用いて３２
ｐによりラベルした１重鎖ｃＤＮＡを合成する。ついで
ｃＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理に
よって除いた後、このｃＤＮＡと０ｏｎＡで刺激してい
ないジュルカット細胞より抽出した１ １〜１２８ ｍ
ＲＮＡの部分精製ｍＲＮ Ａの過剰とハイブリダイズさ
せる。そしてこの０ｏｎＡ刺激していないｍＲＮＡにノ
・イブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリッドを形
成したｃ ＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによ
って分画し、それぞれプローブＡおよびグローブＢとす
る。
されるもので、まず０ｏｎＡによって刺激したジュルカ
ット細胞よりｍ ＲＮＡを抽出し、ＳＤＧ遠心法によっ
てインターロイキン２ ｍＲＮＡを部分精製したのち（
１１〜１２８ｍ几ＮＡ）、このｒｏｎＮＡを用いて３２
ｐによりラベルした１重鎖ｃＤＮＡを合成する。ついで
ｃＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡをアルカリ処理に
よって除いた後、このｃＤＮＡと０ｏｎＡで刺激してい
ないジュルカット細胞より抽出した１ １〜１２８ ｍ
ＲＮＡの部分精製ｍＲＮ Ａの過剰とハイブリダイズさ
せる。そしてこの０ｏｎＡ刺激していないｍＲＮＡにノ
・イブリダイズしなかったｃＤＮＡとハイブリッドを形
成したｃ ＤＮＡとをヒドロキシアパタイトカラムによ
って分画し、それぞれプローブＡおよびグローブＢとす
る。
次に前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ２枚
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにノ・イブリダイズさ
せた後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡ
にはポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには
弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを
検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｐ
ａ、ｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、。
のニトロセルロースフィルターに生育させておき、アル
カリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定して
おく。そしてさきに調製したプローブＡとプローブＢを
用いてそれぞれ別々にフィルターにノ・イブリダイズさ
せた後、オートラジオグラフィーを行ない、プローブＡ
にはポジティブに反応する（プラス）がプローブＢには
弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）コロニーを
検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ、、 Ｐ
ａ、ｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、。
ｖｏｌ ５５Ｂ 、４６４ ４６９（１９７９））。
あるいは形質転換株、たとえハ１０００〜１０，０００
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
ス老ドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮＡにしてニトロセルロースフィルター
に固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したような
インターロイキン２ｍ ＲＮＡを含むヒトＴ白血球細胞
より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あるい
はＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン２
ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、Ｄ
ＮＡ−ｍ ＲＮＡハイブリッドをニトロセルｐ−スフイ
ルターに固定する方法もある。
クローンを数十ないし数百のクローンの集団に分け、集
団毎に形質転換株を混合培養し、（常法によって）プラ
ス老ドＤＮＡを調製する。次に、これらＤＮＡを熱変性
等により単鎖ＤＮＡにしてニトロセルロースフィルター
に固定して、これらＤＮＡに相補的な、前述したような
インターロイキン２ｍ ＲＮＡを含むヒトＴ白血球細胞
より調製したｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。あるい
はＤＮＡを熱変性させた後、先にインターロイキン２
ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後、Ｄ
ＮＡ−ｍ ＲＮＡハイブリッドをニトロセルｐ−スフイ
ルターに固定する方法もある。
次に、このフィルターを１ ｍＭピペス、１０ｍＭ９５
℃、１分間程度の熱処理を行なってフィルグーに吸着し
たｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セ
ルロースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡ
を回収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカとメガエル
の卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキ
ン２活性を測定する。
℃、１分間程度の熱処理を行なってフィルグーに吸着し
たｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ−セ
ルロースカラムにかけるなどの操作を行なってｍＲＮＡ
を回収する。次に、このｍＲＮＡをアフリカとメガエル
の卵母細胞に注入して蛋白に翻訳させてインターロイキ
ン２活性を測定する。
あるいはウサギ網状赤血球ないしは小麦胚芽のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた後、インク−ロイキ
ン２抗体でインターロイキン２を検定する。
ｉｔｒｏ翻訳系で蛋白に翻訳させた後、インク−ロイキ
ン２抗体でインターロイキン２を検定する。
かくしてインターロイキン２活性の検出された。
集団が見出されれば、この集団の混合りｐ−ンの数を細
分化してより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して
最終的には単数のクローンに細分化し、インターロイキ
ン２ポリペプチドをフードするＤＮＡを含むクローンを
単離する。
分化してより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して
最終的には単数のクローンに細分化し、インターロイキ
ン２ポリペプチドをフードするＤＮＡを含むクローンを
単離する。
得られたクローンよりインターロイキン２ポリペプチド
をコードするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたベクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せばよい。
をコードするＤＮＡを得るには、微生物細胞よりプラス
ミドＤＮＡに相当する区分を常法により分離し、プラス
ミドＤＮＡより、使用されたベクターに挿入されている
ＤＮＡ部分を切り出せばよい。
インターロイキン２ポリペプチドをコードするＤＮＡの
構造は、Ｍａｘａｍ −Ｇｉ １ｂｅｒｔの化学法（Ｍ
ｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍ、 ａｓ 、 ４９９−５６
０ 、 １９８０）およびジデオキシヌクレオチド鎖終
結法（Ｓｍｉｔｈ。
構造は、Ｍａｘａｍ −Ｇｉ １ｂｅｒｔの化学法（Ｍ
ｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍ、 ａｓ 、 ４９９−５６
０ 、 １９８０）およびジデオキシヌクレオチド鎖終
結法（Ｓｍｉｔｈ。
Ａ、 Ｊ、 ｎ、ｌ Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍ、
６５ ｒ ５６０−５８０ 。
６５ ｒ ５６０−５８０ 。
１９８０） 等を用いる常法により決定できる。
本発明において単離され、インターロイキン２活性をも
つポリペプチドが発現さ、５２暫７ｇ、ｃ’；ａ′−訃
−１ 上記塩基配列の中、分子量が１５０００ダルトンである
と報告されているインターロイキン２をコードできるフ
レームは、上記塩基配列に示されているものだけである
。蛋白合成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧコドン
から始まることが殆んどテするからｌ初のイニシエシシ
ョンコドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧＡの
前のＡＣＴ （スレオニン）迄パインターロイキン２ポ
リペプチドｔこ対応する塩基配列と考えられる。また、
インターロイキン２のような分泌蛋白においては疎水性
アミノ酸に富んだ、いわゆるングナルペプチドが存在し
、このペプチドは分泌の際ｔこ切断され成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ
酸に富んだＮ−末端部ゾグナルペブチドｔこ相当するも
のと考えられる。
つポリペプチドが発現さ、５２暫７ｇ、ｃ’；ａ′−訃
−１ 上記塩基配列の中、分子量が１５０００ダルトンである
と報告されているインターロイキン２をコードできるフ
レームは、上記塩基配列に示されているものだけである
。蛋白合成の開始は、ｍＲＮＡ上の最初のＡＴＧコドン
から始まることが殆んどテするからｌ初のイニシエシシ
ョンコドンＡＴＧよりターミネーションコドンＴＧＡの
前のＡＣＴ （スレオニン）迄パインターロイキン２ポ
リペプチドｔこ対応する塩基配列と考えられる。また、
インターロイキン２のような分泌蛋白においては疎水性
アミノ酸に富んだ、いわゆるングナルペプチドが存在し
、このペプチドは分泌の際ｔこ切断され成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から判断すると、疎水性アミノ
酸に富んだＮ−末端部ゾグナルペブチドｔこ相当するも
のと考えられる。
したがって、例えばＡＴＧコドンから２１番目のｊ Ｆ
ｙＧＣＡ （アラニン）よりターミネーションコドンＴ
ＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチドであってもイン
ターロイキン２活性を有するものと考えられる。また、
上記アラニン以後の又は上記スレオニン以前のいくつか
のアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基配列
部であってもインターロイキン２蛋白の活性部位を保持
しているようなポリペプチドであるならばインターロイ
キン２活性を有することが十分に考えられる。
ｙＧＣＡ （アラニン）よりターミネーションコドンＴ
ＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するペプチドであってもイン
ターロイキン２活性を有するものと考えられる。また、
上記アラニン以後の又は上記スレオニン以前のいくつか
のアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基配列
部であってもインターロイキン２蛋白の活性部位を保持
しているようなポリペプチドであるならばインターロイ
キン２活性を有することが十分に考えられる。
本発明の、ＤＮＡの５′−末端に、インターロイキン２
遺伝子の情報発現のために有害でないＩ又は複数の塩基
が配列されていてもよい。また、５°−末端に１又は複
数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列されていて
も、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロ
イキン２活性を持つために有害でないものであったり、
又有害なものであっても容易に脱離できるようなもので
あれば、問題はない。
遺伝子の情報発現のために有害でないＩ又は複数の塩基
が配列されていてもよい。また、５°−末端に１又は複
数のアミノ酸を発現しうるような塩基が配列されていて
も、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドがインターロ
イキン２活性を持つために有害でないものであったり、
又有害なものであっても容易に脱離できるようなもので
あれば、問題はない。
３Ｉ−末端ｔこりいても同様に、ポリペプチドがインタ
ーロイキン２活性を持つためｔこ有害でないアミノ酸が
ポリ、ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が
・３′−末端に付加されていてもよいし、有害なもので
あっても容易に脱離できるようなものであれば問題はな
い。また、ＤＮＡの化学合成などｒこより本発明の遺伝
子の一部又は本発明の遺伝子構造から推論されるポリペ
プチドの一部を改変することも可能である。さらｔこ、
後記する実施例に記載したヒト細胞以外の細胞より得た
ｍＲＮＡを用いて本発明の遺伝子を得ることもできる。
ーロイキン２活性を持つためｔこ有害でないアミノ酸が
ポリ、ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が
・３′−末端に付加されていてもよいし、有害なもので
あっても容易に脱離できるようなものであれば問題はな
い。また、ＤＮＡの化学合成などｒこより本発明の遺伝
子の一部又は本発明の遺伝子構造から推論されるポリペ
プチドの一部を改変することも可能である。さらｔこ、
後記する実施例に記載したヒト細胞以外の細胞より得た
ｍＲＮＡを用いて本発明の遺伝子を得ることもできる。
したがって、要はインターロイキン２活性をもつポリペ
プチドをコードするＤＮＡであれば、本発明の遺伝子に
含まれる。
プチドをコードするＤＮＡであれば、本発明の遺伝子に
含まれる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例１
（１１１０容量／容量係の牛胎児血清を含有するＲＰＭ
Ｉ １’６４０培地で、当分野で良く知られた方法で
培養したヒ）Ｔ白血病細胞ジュルカ７ト細胞（日本、ア
メリカ、西ドイツ等で自由に入手できる）を上記の培地
に、懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
ＳＩ５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲン
の総照射線量を照射した。゛次いで、この照射された細
胞をＩ Ｘ １０′′ 個／ ｍｌの細胞密度で上述の
培地中で５チ炭酸ガス中３７Ｃで５日間培養した。
Ｉ １’６４０培地で、当分野で良く知られた方法で
培養したヒ）Ｔ白血病細胞ジュルカ７ト細胞（日本、ア
メリカ、西ドイツ等で自由に入手できる）を上記の培地
に、懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置ＥＸ
ＳＩ５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲン
の総照射線量を照射した。゛次いで、この照射された細
胞をＩ Ｘ １０′′ 個／ ｍｌの細胞密度で上述の
培地中で５チ炭酸ガス中３７Ｃで５日間培養した。
次に、９６穴マイクロプレ一ト１０枚ＣＯ，２個／ｗｅ
ｌｌ（＜ぼみ）になるように本変異細胞を接種し、５チ
炭酸ガス中３７Ｕにて２１日間培養した。細胞増殖の観
察されたクローンを順次継代増殖させ、次いでｌＸｌ０
’個／ ｙｔｌの細胞密度でＣｏｎＡ ５０ ｐｔ
／ ａｔ存在下に２４時間培養し、培養上清に放出され
るインターロイキン２の産生量を前出の方法で測定し、
原ジュルカノト細胞に比し産生量が４０倍以上ｔこ改善
された変異化クローン細胞ジュルカット１１１株（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ８１２９ ）を得た。本枕は通常の培養方法
で増殖し、その増殖速度はジュルカット細胞と同程度で
あった。
ｌｌ（＜ぼみ）になるように本変異細胞を接種し、５チ
炭酸ガス中３７Ｕにて２１日間培養した。細胞増殖の観
察されたクローンを順次継代増殖させ、次いでｌＸｌ０
’個／ ｙｔｌの細胞密度でＣｏｎＡ ５０ ｐｔ
／ ａｔ存在下に２４時間培養し、培養上清に放出され
るインターロイキン２の産生量を前出の方法で測定し、
原ジュルカノト細胞に比し産生量が４０倍以上ｔこ改善
された変異化クローン細胞ジュルカット１１１株（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ８１２９ ）を得た。本枕は通常の培養方法
で増殖し、その増殖速度はジュルカット細胞と同程度で
あった。
（２） 本ジュルカット１１１細胞株をＩ Ｘ １０
’個／ｄの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ５６−９
１、０００ｍｌに懸濁し、ファルコン社製回転培養瓶に
入れ、３７ｒで４日間培養し、遠沈操作により細胞を集
めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄの細胞密度にて
上述の培地中に懸濁し、ここｔこＣｏｎＡ ２５７１
１ ／ｗＬｌを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶
（４本）？こ１，０００ａ／で張り込み６時間回転培養
した。
’個／ｄの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ５６−９
１、０００ｍｌに懸濁し、ファルコン社製回転培養瓶に
入れ、３７ｒで４日間培養し、遠沈操作により細胞を集
めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄの細胞密度にて
上述の培地中に懸濁し、ここｔこＣｏｎＡ ２５７１
１ ／ｗＬｌを添加し、上記ファルコン社製回転培養瓶
（４本）？こ１，０００ａ／で張り込み６時間回転培養
した。
（８） このようにして得たＣｏｎＡ ２５ μｍ
７ ｍｌで６時間誘導したジュルカット細胞（Ｆ、２
Ｘ １０１０細胞）をＰＢＳ溶液８００ｄに懸濁し、
細胞を遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻
害剤であるＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏａｉｄｅｓ −Ｖａｎ
ａｄｙｌＣｏｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ８
Ｂ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ＋ ｐＨ７，
５、’１０ ｍＭＮａＣｌ 、１．５ｍＭ ＭｇＣ１１
）８００ｍ／ｌこ懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０
５％になるように加えた後、ゆるやかに攪拌後３．００
Ｏｒｐｍで５分遠心して核を除去し、その上清液に５
ＤＳ（０，５％ ）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後
、ただちにフェノールを等儀加え細胞質ＲＮＡを抽出し
た。合計３回フェノール抽出を繰返してから２容エタノ
ールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，６で溶解した。
７ ｍｌで６時間誘導したジュルカット細胞（Ｆ、２
Ｘ １０１０細胞）をＰＢＳ溶液８００ｄに懸濁し、
細胞を遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻
害剤であるＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏａｉｄｅｓ −Ｖａｎ
ａｄｙｌＣｏｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ８
Ｂ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ＋ ｐＨ７，
５、’１０ ｍＭＮａＣｌ 、１．５ｍＭ ＭｇＣ１１
）８００ｍ／ｌこ懸濁した。次に、ＮＰ−４０を０．０
５％になるように加えた後、ゆるやかに攪拌後３．００
Ｏｒｐｍで５分遠心して核を除去し、その上清液に５
ＤＳ（０，５％ ）とＥＤＴＡ （５ｍＭ）を加えた後
、ただちにフェノールを等儀加え細胞質ＲＮＡを抽出し
た。合計３回フェノール抽出を繰返してから２容エタノ
ールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，６で溶解した。
このようにしてジュルカット細胞から得られたＲＮＡ［
は１９６’１９であった。
は１９６’１９であった。
次に、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ ）−セルロース（Ｐ、 Ｌ。
（ｄＴ ）−セルロース（Ｐ、 Ｌ。
Ｂ１ｏｃｈｅｍｌｃａｌ＋ｓ＋ Ｔｙｐｅ ７ ）を
用い、カラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は２
０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，５、０，５Ｍ
ＮａＣ１、１ｍＭ Ｅ’ＤＴＡ ＋０．５％ ＳＤＳ
溶液１こＲＮＡを溶解して行ない、溶出は緩衝液（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ＋ ｐＨ７−５，０，５Ｍ
ＮａＣ１＋ １ ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１
０ ｍＭ Ｔｒｉａ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）で交互
にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。この結果、
溶出されたｍＲＮＡ量は３．６嘘であった。
用い、カラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は２
０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，５、０，５Ｍ
ＮａＣ１、１ｍＭ Ｅ’ＤＴＡ ＋０．５％ ＳＤＳ
溶液１こＲＮＡを溶解して行ない、溶出は緩衝液（２０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ ＋ ｐＨ７−５，０，５Ｍ
ＮａＣ１＋ １ ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄後、水と１
０ ｍＭ Ｔｒｉａ −ＨＣＩ （ｐＨ７，５）で交互
にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。この結果、
溶出されたｍＲＮＡ量は３．６嘘であった。
さらに、このｍＲＮＡの一部（２，，４ｍｇ ）をＳＤ
Ｇ遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｍ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，
５、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．２ Ｍ ＮａＣ＋を含
む５〜２５％シミ糖密度勾配。Ｈ４ｔａｃｈｉ ＲＰ
Ｓ ２８０−ターで２６、００ Ｏｒｐｍ ＋ ２４時
間、４ｔｌ：’）して分画し、１ｌ−１２ＳのｍＲＮＡ
画分を分画番号１２゜１３．１４としてそれぞれ５９μ
？、４６μ２シロ０μ２得た。。
Ｇ遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｍ −ＨＣｌ 、 ｐＨ７，
５、１ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．２ Ｍ ＮａＣ＋を含
む５〜２５％シミ糖密度勾配。Ｈ４ｔａｃｈｉ ＲＰ
Ｓ ２８０−ターで２６、００ Ｏｒｐｍ ＋ ２４時
間、４ｔｌ：’）して分画し、１ｌ−１２ＳのｍＲＮＡ
画分を分画番号１２゜１３．１４としてそれぞれ５９μ
？、４６μ２シロ０μ２得た。。
（４） ここｔこ得られた分画番号１３のｍＲＮＡを
前出ノ検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞１
こ１個当り５０ｎｆをマイクロインジェクション法によ
り注入して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキ
ン２の活性検定ｔこ供したところ、次表に示すトリチウ
ム化チミジンの取り込みおよび活性化Ｔ１１７７球数の
増加がみられ、これら分画のｍ ＲＮ Ａは本発明のヒ
トインターロイキン２ｍＲＮＡを含有することが証明さ
れた。
前出ノ検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞１
こ１個当り５０ｎｆをマイクロインジェクション法によ
り注入して得られた卵母細胞培養上清をインターロイキ
ン２の活性検定ｔこ供したところ、次表に示すトリチウ
ム化チミジンの取り込みおよび活性化Ｔ１１７７球数の
増加がみられ、これら分画のｍ ＲＮ Ａは本発明のヒ
トインターロイキン２ｍＲＮＡを含有することが証明さ
れた。
表 −Ｉ
（イ）
（アッセイ培地） Ｘ１６ ０（ｏ
ｐｍ ） （Ｄ ）ｔ’ピット・プロ′ントをａｌ準
インＩＩ−。
ｐｍ ） （Ｄ ）ｔ’ピット・プロ′ントをａｌ準
インＩＩ−。
イキン２ （１０単位／＝＝ｇ）と比較して求めた。
（５） 次に、ここで得られたインターロイキン２ｍ
ＲＮＡを含む１１〜１２８ ｍＲＮＡ分画１５よシｃＤ
ＮＡをインビトロで合成し、プラスミドベクター ＰＢ
Ｒ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア
拳コリにトランスホームしてインターロイキン２ ａＤ
ＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
ＲＮＡを含む１１〜１２８ ｍＲＮＡ分画１５よシｃＤ
ＮＡをインビトロで合成し、プラスミドベクター ＰＢ
Ｒ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒア
拳コリにトランスホームしてインターロイキン２ ａＤ
ＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。
（５−−１） ５０ ｍＭ Ｔｒｉｏ−ＨＯＬ緩衝液（
ｐＨ７，５）。
ｐＨ７，５）。
５０ ｍＭ Ｎａｃｔ、 ６ ｍＭ Ｍｇ０４ 、
５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ） 、 （Ｌ ５
ｍＭの各ｃｌＡＴＦ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ。
５ ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ） 、 （Ｌ ５
ｍＭの各ｃｌＡＴＦ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＯＴＰ。
ｄＴＴＰ （ｃｌＯＴＰはｌ１１２Ｆラベルしたものを
含む）。
含む）。
α７ｐｆｆオリゴ（ｄＴ ）Ｉ。、１０μｆ ｍＲＮＡ
および１５ユニットＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、 Ｗ、Ｂ
ｅａｒｄ ）を混ぜ、４１°Ｃに９０分間保った。反応
終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノール沈澱
としてＤＮＡを回収し、２０ ｍＭ ’Ｉｒ１ｓ 、
ｍＭ ＥＤＴＭ ｐＨ７，５溶液に溶解した。これに
より約２．５μｍの１重鎮ｏＤＮＡが合成された。この
溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加えて
［Ｌ３５ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次いで
溶液を１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨｏＬ 、 ｐＨ７，５の等
量で中和し「セファテックスＧ−５０」カラムに通した
。これによｊ）１．８μ２゜ｏＤＮＡを回収した。
および１５ユニットＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、 Ｗ、Ｂ
ｅａｒｄ ）を混ぜ、４１°Ｃに９０分間保った。反応
終了後、フェノール処理１回を行ない、エタノール沈澱
としてＤＮＡを回収し、２０ ｍＭ ’Ｉｒ１ｓ 、
ｍＭ ＥＤＴＭ ｐＨ７，５溶液に溶解した。これに
より約２．５μｍの１重鎮ｏＤＮＡが合成された。この
溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加えて
［Ｌ３５ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間置き、次いで
溶液を１Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨｏＬ 、 ｐＨ７，５の等
量で中和し「セファテックスＧ−５０」カラムに通した
。これによｊ）１．８μ２゜ｏＤＮＡを回収した。
（５−２）５０ｍＭリン酸緩衝液（１）Ｈ７，５） 、
１０ｍＭ Ｍｇ０４ 、 １０ ｍＭ ＤＴＴ 、
α７５ ｍＭの各ｃＡＴＰ。
１０ｍＭ Ｍｇ０４ 、 １０ ｍＭ ＤＴＴ 、
α７５ ｍＭの各ｃＡＴＰ。
ｃｌＧＴＰ、 ｄＯＴＰ、 ｄＴＴＰ、 （ｃｉＯ
ＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む）、１．８μ１１
本鎖ｃＤＮＡ 、 ８ユニツトボリメレース（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）を・混ぜ、
１５°Ｃで１５時間反応を行なった。反応後了後、フェ
ノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない、エタ
ノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応によｊ５
１．１’０μ２の二重鎖ＣりＨＡを得た。
ＴＰは３Ｈでラベルされたものを含む）、１．８μ１１
本鎖ｃＤＮＡ 、 ８ユニツトボリメレース（Ｐｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ ） Ｉ （米国ＢＲＬ製）を・混ぜ、
１５°Ｃで１５時間反応を行なった。反応後了後、フェ
ノール処理１回、クロロホルム処理１回を行ない、エタ
ノール沈澱としてＤＮＡを回収した。この反応によｊ５
１．１’０μ２の二重鎖ＣりＨＡを得た。
次いで、５０ ｍＭ ＃ｐルナトリウム（ｐＨ４−５）
＋０、２ Ｍ ＨｈＯＬ 、 １ ｒｃＭ Ｚｎ０４
、１．１０μｆ二重鎖ｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分
間インキュベートシタ後、α２５ユニツトのヌクレアー
ゼＳ１（三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベ
ートした。反応終了後、フェノール処理２回行ない、［
セファデックスＧ−５ＯＪカラムに通し、０．５５μｍ
の二重鎖ｃＤＮＡを回収′した。
＋０、２ Ｍ ＨｈＯＬ 、 １ ｒｃＭ Ｚｎ０４
、１．１０μｆ二重鎖ｃＤＮＡを混ぜて３７℃で２０分
間インキュベートシタ後、α２５ユニツトのヌクレアー
ゼＳ１（三共■製）を加え、さらに１５分間インキュベ
ートした。反応終了後、フェノール処理２回行ない、［
セファデックスＧ−５ＯＪカラムに通し、０．５５μｍ
の二重鎖ｃＤＮＡを回収′した。
（５−５）α１４Ｍカコジル酸カリウム＋５０ｍＭトリ
ス塩基、 （Ｌ １ ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
０ｏ０４ 、α６４ｍＭ ３ｚＰ −ｄＯＴＰ （ＢＰ
ａ、 ａｃｔ、 Ｚ ７ Ｘ １０’ｃｐｍ／ｎｍｏｔ
）。
ス塩基、 （Ｌ １ ｍＭ ＤＴＴ、 １ ｍＭ
０ｏ０４ 、α６４ｍＭ ３ｚＰ −ｄＯＴＰ （ＢＰ
ａ、 ａｃｔ、 Ｚ ７ Ｘ １０’ｃｐｍ／ｎｍｏｔ
）。
０．５５μｍ二重鎮ｃＤＮＡおよび５ユニツトのターミ
ナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）ヲ混ぜ６７℃で７分
間インキユベートシ、反応終了後、フェノール処理１回
を行ない、［セファデックスＧ−５ＱＪカラムに通しエ
タノール沈澱としてＤ）ＪＡα５０μｒを回収したとこ
ろ約５０個のｄＯＭＦが両３′末端に付加された。
ナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）ヲ混ぜ６７℃で７分
間インキユベートシ、反応終了後、フェノール処理１回
を行ない、［セファデックスＧ−５ＱＪカラムに通しエ
タノール沈澱としてＤ）ＪＡα５０μｒを回収したとこ
ろ約５０個のｄＯＭＦが両３′末端に付加された。
ｐＢＲ５２２ＤＮＡ １０μ？を制限酵素Ｐｓｔ １で
切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＯＭＰ ＠を
付加したのと全く同じ条件で（ＬＯＴＰＱ代りにｄＧＴ
Ｐを用いて両３′末端にａＧＭＰ鎖を付加した。かくし
て約５０個のｄＧＭＰが両６゛末端に付加された。
切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡにｄＯＭＰ ＠を
付加したのと全く同じ条件で（ＬＯＴＰＱ代りにｄＧＴ
Ｐを用いて両３′末端にａＧＭＰ鎖を付加した。かくし
て約５０個のｄＧＭＰが両６゛末端に付加された。
（５−４） ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ （ｐＨ７
，５） 、 ０．１ ＭＮａＯｔ、 ５ ｍＭ ＩＤＴ
Ａ 、 ０． ［１５ｐｆｆのａＧＭＰが付加された
ｐＢＲ５２２，α０１μｍのｄＯＭＦが付加されたｃＤ
ＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６°Ｃで１２０分
間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０分間保
持した。
，５） 、 ０．１ ＭＮａＯｔ、 ５ ｍＭ ＩＤＴ
Ａ 、 ０． ［１５ｐｆｆのａＧＭＰが付加された
ｐＢＲ５２２，α０１μｍのｄＯＭＦが付加されたｃＤ
ＮＡをまず６５℃で２分間、次いで４６°Ｃで１２０分
間、さらに３７℃で６０分間、そして室温で６０分間保
持した。
エシェリヒア・コリχ１７７６を５０ｍ／のＬ培地（１
００μｍ／ｄのジアミノピメリン酸と ５０μ５’／−
のチミジン、１％トリプトン、α５％酵母エキス、（１
５％ＮａＧｔおよびα１％グルコースを含む）に接種し
、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそα３にな
るまで５７°Ｃで振とり培養した。培養終了後、培養液
を０°Ｃで６０分間放置し、次に菌体を遠心分離により
集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＬ （ｐＨ７，６）
、αＩ Ｍ ＩＪａＯｔ、 ５ ｍＭ Ｍｇ０４ 。
００μｍ／ｄのジアミノピメリン酸と ５０μ５’／−
のチミジン、１％トリプトン、α５％酵母エキス、（１
５％ＮａＧｔおよびα１％グルコースを含む）に接種し
、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそα３にな
るまで５７°Ｃで振とり培養した。培養終了後、培養液
を０°Ｃで６０分間放置し、次に菌体を遠心分離により
集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＬ （ｐＨ７，６）
、αＩ Ｍ ＩＪａＯｔ、 ５ ｍＭ Ｍｇ０４ 。
１０ ｍＭ Ｒｂ０ｔの溶液２５ゴで２回洗浄した。
得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉａ−ＨＯＬ（ｐＨ７，
６）＊α２５ Ｍ ＫＣＩ、 、 ５ ｍＭ Ｍｇ０４
、 ［１１Ｍ ０ａ０４および１０ ｍＭ Ｒｂ０ｔ
を含む溶液２０ｙｎｌＫ懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた上記と同じ溶液１ｄに
菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液のα２ｄに上記
組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置した。さらに
、５７℃で２分間保ったのち、再び０°Ｃで６０分間静
置した。次に、これに前記り培地ロアーを加えて３７°
Ｃで５０分間振とう培養した。この培養液０．１ ｍを
１００μｆ／ｄジアミノピメリン酸、 ｓ ｏ ｐｆ
ｆ／ｍｌチミジンと１５μｆ／ｗｔｌテトラサイクリン
を含むＬ培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３
７°Ｃにて２日間インキュベートした。
６）＊α２５ Ｍ ＫＣＩ、 、 ５ ｍＭ Ｍｇ０４
、 ［１１Ｍ ０ａ０４および１０ ｍＭ Ｒｂ０ｔ
を含む溶液２０ｙｎｌＫ懸濁し、０℃にて２５分間静置
後、遠心分離により菌体を集めた上記と同じ溶液１ｄに
菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁液のα２ｄに上記
組換えＤＮＡを入れ、０℃で４０分間静置した。さらに
、５７℃で２分間保ったのち、再び０°Ｃで６０分間静
置した。次に、これに前記り培地ロアーを加えて３７°
Ｃで５０分間振とう培養した。この培養液０．１ ｍを
１００μｆ／ｄジアミノピメリン酸、 ｓ ｏ ｐｆ
ｆ／ｍｌチミジンと１５μｆ／ｗｔｌテトラサイクリン
を含むＬ培地の１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３
７°Ｃにて２日間インキュベートした。
（５−５） 上記において出現したコロニー４３２個を
それぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体
として１００μｔ／Ｉｄのジアミノピメリン酸、 ５
０ ｐｆｆ／ｓｌのチミジンと１０ ｐｆ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬ培地２００１１１／に接種し、５
７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコール
を最終濃度で１７０μｍ／ｄになるように加えた新鮮な
上記り培地２００ｄを追加し、さらに−晩振盪培養する
。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法に従
ってプラスミドＤＮＡを精製した。
それぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体
として１００μｔ／Ｉｄのジアミノピメリン酸、 ５
０ ｐｆｆ／ｓｌのチミジンと１０ ｐｆ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬ培地２００１１１／に接種し、５
７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコール
を最終濃度で１７０μｍ／ｄになるように加えた新鮮な
上記り培地２００ｄを追加し、さらに−晩振盪培養する
。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法に従
ってプラスミドＤＮＡを精製した。
このＤＩＮＡを用いてＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ −
ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法でインターロイ
キン２ ｃＤＮＡをもつクローンをスクリーニングした
。ここで用いたＨｙｂｒｌｉｚａｔｉｏｎ −ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａ７は以下のようにして行なっ
たＯ精製したＤＮＡ ２５μ？を制限酵素Ｈ１ｎｄ ■
で切断し、フェノール処理５回、フェノール−クロロホ
ルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なってｂ
ＮＡをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄した
のち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μｔに
溶解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、１０
Ｘ ＳＳＯ（１，５Ｍ Ｎａ０ｔ、０．１５Ｍクエン酸
６ナトリウム）で１．５ｄに希釈した。
ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法でインターロイ
キン２ ｃＤＮＡをもつクローンをスクリーニングした
。ここで用いたＨｙｂｒｌｉｚａｔｉｏｎ −ｔｒａｎ
ｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａ７は以下のようにして行なっ
たＯ精製したＤＮＡ ２５μ？を制限酵素Ｈ１ｎｄ ■
で切断し、フェノール処理５回、フェノール−クロロホ
ルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行なってｂ
ＮＡをエタノール沈澱して８０％エタノールで洗浄した
のち回収し、これを８０％ホルムアミド溶液４０μｔに
溶解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、１０
Ｘ ＳＳＯ（１，５Ｍ Ｎａ０ｔ、０．１５Ｍクエン酸
６ナトリウム）で１．５ｄに希釈した。
コレラニトロセルロースフィルターに固定り、、８０℃
で６時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルム
アミド、２０ｍＭピペス、 ｐＨ６，５，０，７５ＭＭ
ａＯｔ、 ５ ｎ＋Ｍ ＩＣＤＴＡ 、 ０．２％ＳＤ
Ｓおよび２５０ｐｔｍＲＮＡを含む溶液中で５７℃、１
８時間インキュベートしてフィルクー上のＤＮＡとイン
ターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。
で６時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルム
アミド、２０ｍＭピペス、 ｐＨ６，５，０，７５ＭＭ
ａＯｔ、 ５ ｎ＋Ｍ ＩＣＤＴＡ 、 ０．２％ＳＤ
Ｓおよび２５０ｐｔｍＲＮＡを含む溶液中で５７℃、１
８時間インキュベートしてフィルクー上のＤＮＡとイン
ターロイキン２ ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。
次いで、このフィルターをｉＱｍＭピペス ｐＨ＆５．
α１５ＭＮａ０ｔ、 Ｉ ＥＩＩＭＩＤＴＡ 、 ０．
２ ％ ＳＤＳ溶液で６５℃で５回洗浄した後、さらに
１ ｍＭビペス、 １０ ｍＭ Ｎａ０ｔ溶液で５回洗
浄し、次いでＱ、 ５ ｍＭＦｉＤＴＡ 、 Ｑ、１％
ＳＤＳ溶液で９５℃で１ ｍｉｎ処理してフィルターに
吸着したｍＲＮＡを溶出した。これを常法に従ってオリ
ゴｄＴ−セルロースカラムにかけて回収した。
α１５ＭＮａ０ｔ、 Ｉ ＥＩＩＭＩＤＴＡ 、 ０．
２ ％ ＳＤＳ溶液で６５℃で５回洗浄した後、さらに
１ ｍＭビペス、 １０ ｍＭ Ｎａ０ｔ溶液で５回洗
浄し、次いでＱ、 ５ ｍＭＦｉＤＴＡ 、 Ｑ、１％
ＳＤＳ溶液で９５℃で１ ｍｉｎ処理してフィルターに
吸着したｍＲＮＡを溶出した。これを常法に従ってオリ
ゴｄＴ−セルロースカラムにかけて回収した。
この回収したｍＲＮＡをアフリカッメガエルの卵母細胞
に注入し、蛋白に翻訳させインターロイキン２活性を測
定した。この結果、１８集団の中の１集団に前述のトリ
チウム化チミジンの取り込み蹴による活性検定法により
４８単位／ｄのインターロイキン２の活性が検出された
。そこで、さらにこの集団に属する２４コロニーを今度
は単独にそれぞれ前述しプヒように１００μＦｆ／ｌｎ
ｌのジアミノピメリン酸、５０μＦ！／ｌｄのチミジン
と１０μＰ／ｍのテトラサイクリンを含むＬ培地２０
ＯｙＫｍ棟し、３７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロ
ラムフェニコールを最終濃度で１７０μｍ７！／ＩＩ７
！になるように加えた新鮮な上記り一培地２００ ｍｌ
を追加し、さらに−夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを
増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮＡを精製し
た。そして各ＤＮＡ ５μｍをＨｌｎｄ ＩＩＩで切断
した後、前回と同’ＦＭ Ｋニトロセルロースフィルタ
ーに固定してインク−ロイキンＺ ｍＲＮＡとハイブリ
ダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエルの
卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン２活
性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにイン
ターロイキン２クローンが存在するか検足したところ１
コロニーよシ得られた精製プラスミドＤＭＡ、プラスミ
ドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵母細胞
に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見出され
（表−２）、本クローンがインターロイキン２０ＤＮＡ
を持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７６／６−
１６ＡＪ１１９９５（ＦＫＲＭ−ｐ ２２５） ）であ
ると同定された。即ちプラスミドｐ５−１６のｃＤＮＡ
はインターロイキン２ｍＲＭＡと特異的にハイブリッド
を形成するＤＮＡ（インターロイキン２遺伝子）をもつ
ことが証明された。
に注入し、蛋白に翻訳させインターロイキン２活性を測
定した。この結果、１８集団の中の１集団に前述のトリ
チウム化チミジンの取り込み蹴による活性検定法により
４８単位／ｄのインターロイキン２の活性が検出された
。そこで、さらにこの集団に属する２４コロニーを今度
は単独にそれぞれ前述しプヒように１００μＦｆ／ｌｎ
ｌのジアミノピメリン酸、５０μＦ！／ｌｄのチミジン
と１０μＰ／ｍのテトラサイクリンを含むＬ培地２０
ＯｙＫｍ棟し、３７°Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロ
ラムフェニコールを最終濃度で１７０μｍ７！／ＩＩ７
！になるように加えた新鮮な上記り一培地２００ ｍｌ
を追加し、さらに−夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを
増幅しておいて常法に従ってプラスミドＤＮＡを精製し
た。そして各ＤＮＡ ５μｍをＨｌｎｄ ＩＩＩで切断
した後、前回と同’ＦＭ Ｋニトロセルロースフィルタ
ーに固定してインク−ロイキンＺ ｍＲＮＡとハイブリ
ダイズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエルの
卵母細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン２活
性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにイン
ターロイキン２クローンが存在するか検足したところ１
コロニーよシ得られた精製プラスミドＤＭＡ、プラスミ
ドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを卵母細胞
に翻訳させたものにインターロイキン２活性が見出され
（表−２）、本クローンがインターロイキン２０ＤＮＡ
を持つクローン（エシェリヒア・コリχ１７７６／６−
１６ＡＪ１１９９５（ＦＫＲＭ−ｐ ２２５） ）であ
ると同定された。即ちプラスミドｐ５−１６のｃＤＮＡ
はインターロイキン２ｍＲＭＡと特異的にハイブリッド
を形成するＤＮＡ（インターロイキン２遺伝子）をもつ
ことが証明された。
次にプラスミドｐ！１−１６のｃＤＮＡの制限酵素切断
個所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢｌｊＬ社）
で１ケ所、ｎ５ｔｎｌ（米国Ｈｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、祉）で２ケ所（Ｘｂａ）切断個所の上
流及び下流）切断された。しかし、このｃ ＤＮＡは約
６５０塩基対よシなり、１１〜１２Ｈのインターロイキ
ン２ ｍＲＮＡの一部に対応するものとわかったので、
再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍＲ
Ｈｋ ヲ鋳型にしてＬＢｎｄらの方法（Ｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ 、 １ＪｕｃｌｅｉｉＡｏｉｄｓ Ｒｅｓ、、
ｖｏＬ ９． ｐ ２５５１ （１９８１） ）によ
シ前述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢ１
６２２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ・ｃｏｌ
ｊχ１７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株の
なかから、プラスミド１）５−１６のｃＤＮＡと同じ配
列を持つｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈ
ｏｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基χ・
１のｃＤＮＡインサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−
５ＯＡを持つ転換株（エシェリヒア−コリχ１７７６／
工Ｌ−２−５０Ａ ＡＪ１１９９６ （ＩＰＩＲＭ−Ｐ
２２６） ）を得た。
個所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢｌｊＬ社）
で１ケ所、ｎ５ｔｎｌ（米国Ｈｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、祉）で２ケ所（Ｘｂａ）切断個所の上
流及び下流）切断された。しかし、このｃ ＤＮＡは約
６５０塩基対よシなり、１１〜１２Ｈのインターロイキ
ン２ ｍＲＮＡの一部に対応するものとわかったので、
再び同様にして調製したヒトインターロイキン２ ｍＲ
Ｈｋ ヲ鋳型にしてＬＢｎｄらの方法（Ｌａｎｄ ｅｔ
ａｌ 、 １ＪｕｃｌｅｉｉＡｏｉｄｓ Ｒｅｓ、、
ｖｏＬ ９． ｐ ２５５１ （１９８１） ）によ
シ前述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐＢ１
６２２に挿入した。このプラスミドを用いてＥ・ｃｏｌ
ｊχ１７７６を形質転換させ、約２０００個の転換株の
なかから、プラスミド１）５−１６のｃＤＮＡと同じ配
列を持つｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈ
ｏｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約８５０塩基χ・
１のｃＤＮＡインサートを持つプラスミド、ｐＩＬ２−
５ＯＡを持つ転換株（エシェリヒア−コリχ１７７６／
工Ｌ−２−５０Ａ ＡＪ１１９９６ （ＩＰＩＲＭ−Ｐ
２２６） ）を得た。
このｐ工Ｌ２−５０ＡのｃＤＮＡの制限酵素切断地図を
図−１に示す。
図−１に示す。
表−２
（イ）
・エ プラスミドｐ５−１５のｃＤＮＡ にノＡイブリ
ダイズしｆＣｍＲＮ＆ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２Ｂプラスミ
ドベクターにｐＫＯＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｍａｔｈ
Ａｃａ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ｖｏｌ ７Ｂ、 Ａ、３
１５２７−１５３１．１９８１）のＳＶ４０ウィルスの
初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組み込んだｌｌ
０Ｋ−１ベクターを造成した。そしてプラスミドｐ３−
１１＋ −５ＯＡクローンのプラスミドよ１Ｐｓｔ（で
挿入されたｃＤＭＡを切り出シ、ｐＣＥ−１ベクターの
Ｐａｔ ｉサイトに挿入した（プラスミドＤＮＡ部Ｌ−
２）。このときの挿入様式は図−２に示すように８Ｖ４
０初期遺伝子のプロモーターの下流にインターロイキン
２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＧが接続されて
いるものである（図のＩ）。このベクターをサル培養細
胞の００Ｓ −７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ、 Ｃｅ
１ｌ ｖｏｌ、 ２５ ｐ １７５−１８２ （１９８
１））に感染せしめ（Ｍｅ Ｃｕｔｃｈａｎ ａｔａｌ
Ｊ、 Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ工ｎｓｔ、 ｖｏｌ、
４１ ｐ３５１−５５７（１９６８））、培養上清に
出てくるインターロイキン２活性を検討した。対照とし
てベクタープラスミドｐＯＥ −１を用いて同様の方法
で実験を行ないインターロイキン２活性を調べた。結果
を表−３に示す。
ダイズしｆＣｍＲＮ＆ 次に図−２ａ、ｂに示すように、ｐＢＲ３２Ｂプラスミ
ドベクターにｐＫＯＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｍａｔｈ
Ａｃａ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ｖｏｌ ７Ｂ、 Ａ、３
１５２７−１５３１．１９８１）のＳＶ４０ウィルスの
初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組み込んだｌｌ
０Ｋ−１ベクターを造成した。そしてプラスミドｐ３−
１１＋ −５ＯＡクローンのプラスミドよ１Ｐｓｔ（で
挿入されたｃＤＭＡを切り出シ、ｐＣＥ−１ベクターの
Ｐａｔ ｉサイトに挿入した（プラスミドＤＮＡ部Ｌ−
２）。このときの挿入様式は図−２に示すように８Ｖ４
０初期遺伝子のプロモーターの下流にインターロイキン
２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＧが接続されて
いるものである（図のＩ）。このベクターをサル培養細
胞の００Ｓ −７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、 Ｙ、 Ｃｅ
１ｌ ｖｏｌ、 ２５ ｐ １７５−１８２ （１９８
１））に感染せしめ（Ｍｅ Ｃｕｔｃｈａｎ ａｔａｌ
Ｊ、 Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ工ｎｓｔ、 ｖｏｌ、
４１ ｐ３５１−５５７（１９６８））、培養上清に
出てくるインターロイキン２活性を検討した。対照とし
てベクタープラスミドｐＯＥ −１を用いて同様の方法
で実験を行ないインターロイキン２活性を調べた。結果
を表−３に示す。
表 −６
なった。
χ１７７６／工Ｌ−２−５０Ａ、］：＃）インターロイ
キン２活性を持つポリペプチドをコードしているＤＮＡ
は、細胞よシ常法によりプラスミドＤＮＡ部を分離し、
得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐａｔ’（で消化
した後、生成した二つのＤＮＡ ７ラグメントよシ分子
量の小さい７ラグメントを分離することによシ得た。
キン２活性を持つポリペプチドをコードしているＤＮＡ
は、細胞よシ常法によりプラスミドＤＮＡ部を分離し、
得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐａｔ’（で消化
した後、生成した二つのＤＮＡ ７ラグメントよシ分子
量の小さい７ラグメントを分離することによシ得た。
得られたＤｌｉＡの塩基配列は、前記Ｍａｘ師−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔの化学法に阜じて調べたところ、ｆｆ１ｌ述の
とおりの配列を有していることが判明しブ辷０
ｂｅｒｔの化学法に阜じて調べたところ、ｆｆ１ｌ述の
とおりの配列を有していることが判明しブ辷０
図−１はインターロイキン２活性を持つ４ζリペプチド
をコードしうる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＯＥＩＩＬ−２の造成経過の説明図である
。 特許出願人 財団法人 崩研究会 同 味の素株式会社 ＰＳｔｌ ２図 （ａｌ ＥｃｏＲｌ
をコードしうる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐＯＥＩＩＬ−２の造成経過の説明図である
。 特許出願人 財団法人 崩研究会 同 味の素株式会社 ＰＳｔｌ ２図 （ａｌ ＥｃｏＲｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） インターロイキン２活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子。 ・ （２） インターロイキン２活性を持つポリペプチド
をコードしうる遺伝子が、ショ糖密度勾配遠心法による
分画により１１〜１２８画分として得られβヒトリンパ
球由来細胞より分離されるメツセンジャーＡＮＡより調
製されたものである特許請求の範囲第１項記載の遺伝子
。 （３） インターロイキン２活性を持つポリペプチド
をコードしうる遺伝子が、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｂ
ｓｔＮＩ 、 ＸｂａＩおよびＢｓｔＮＩで切断される
個所がこの順序で配置されている部分を含むものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 （４） インターロイキン２活性をコードする遺伝子
が、以下のポリペプチドＩをコードする部分を含むもの
である特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ８ｅｒ Ｏｙｓ Ｉｌｅ ＡｌａＬｅｕ ８ｅ
ｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈ
ｒ ＡｓＮ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒ。 Ｔｈｒ Ｓｅｒ ８ｅｒ ８ｅｒ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌ
ｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮ Ｌｅｕ ＧＩＮＬｅｕ Ｇｌｕ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ
ＧＩＮ Ｍｅｔ ｌ１ｅＬｅｕ ＡｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈ
ｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
ＬｅｕＴｈｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｐ
ｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ、Ｍｅｔ Ｐｒ。 Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ ＧＩＮ ０ｙｓＬｅｕ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ ＶａｌＬｅａ ＡｓＮ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ ＧＩＮ ８ｅｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
ＬｅｕＡｒｇ Ｐｒｏ ＡｒｇｎｌｌＩｐ Ｌｅｕ
ＩＩｓ Ｓｅｒ ＡｓＮ Ｉｌｅ ＡｓＮ Ｖａｌｌｌ
ｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ＴｈｒＰｈｅ Ｍｅｔ Ｃ
ｙｓ Ｇｌｕ ’Ｉ’ｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒｌｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ ＡｓＮ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
’ ＰｈｅＣｙｓ ＧＩＮ ８ｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ（５） インターロイ
キン２活性をもつポリペプチド■をコードする遺伝子が
以下のポリペプチドをコードする部分を含むものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 Ａｌａ Ｐｒｏ ’ｌ’ｈｒ ８ｅｒ ８ｅｒ Ｂａｒ
Ｔ’ｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ ＧＩＮＬｅｕ
ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ ＧＩＮＭｅｔ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ ＡｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＡｓＮ Ｔｙｒ Ｌｙ
ｓ ＡｓＮ Ｐｒ。 Ｌｙｓ ’Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＡｒｇＭｅｔ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＴｙｒＭｅｔ Ｐ
ｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ ＬｅｕＧＩＮ Ｏｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｌｅｕ ＧｌｕＧｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＡｓＮ Ｌ
ｅｕ Ａｌａ ＧＩＮ ８ｅｒ Ｌｙｓ ＡｓＮ Ｐ
ｈｅＨｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ ８ｅｒ ＡｓＮ ｌ１ｅＡ、
ｓＮ Ｖａｌ Ｉｃｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＧｌｕＴｈｒ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｏｙｓ Ｇｌｕ ’［’
ｙｒ Ａｌａ ＡＳｐ Ｇｌｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔ
ｈｒ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ 、Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ ＡｓＮ Ａｒｇ Ｔｒｐ ｌ１ｅＴｈｒ
Ｐｈｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ ８ｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ ８ｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ（６） イン
ターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺
伝子が下記の塩基配列Ｉを有する部分を含むものである
特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ＡＴＧ ＴＡＯＡＧＧ ＡＴＧ ＯＡＡ ＯＴＯＯＴＧ
ＴＯＴ ＴＧＯＡＴＴ ＧＯＡＯＴＡ ＡＧ’ｌ’
０ＴＴＧＯＡ Ｏ’ｌ’Ｔ ＧＴＯＡＯＡ ＡＡＯＡＧ
＋ｌ′（３ＣＡ ０ＯＴＡＣＴ ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＯ
Ｔ ＡＯＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＯＡ ＯＡＧ、 ＯＴ
Ａ ０ＡＡＯＴＧ ＧＡＧ ＯＡ’ｌ” Ｔ”ｌ’Ａ
ＣＴＧ ＯＴＧ ＧＡＴ ＴＴＡ ＯＡＧ ＡＴＧ Ａ
ＴＴ’Ｉ”ｌ”Ｇ ＡＡＴ ＧＧＡ Ａ’ｌ”Ｉ’ Ａ
Ａ’ｌ’ ＡＡ’ＬＩ’ ＴＡＵ ＡＡＧ ＡＡ’ｌ’
０００ Ａハ（！ＴＯＡＣＩＯＡＧＧ Ａ’ｌ’Ｇ
ＯＴ（！ ＡＯＡ ＴＴＴ ＡＡＧ Ｔ’Ｉ’〒’Ｉ’
ＡＯＡＴＧＣｏｏ ＡＡＧ ＡＡＧ Ｇｏｏ ＡＯＡ
ＧＡＡ ＯＴＧ ＡＡＡ ＯＡＴ ＯＴＴ ０ＡＧＴＧ
Ｔ （ＴＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＯＴＯＡＡＴ
ＯＯＴ ＯＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡＧＴＧ Ｏ’Ｉ’Ａ
ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＯＴＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡＡＡ
ＡＡＯＴＴＴ ０ＡＯＴＴＡ ＡＧＡ ０００ ＡＧＧ
ＧＡＯＴＴＡ ＡＴＯＡＧＯＡＡＴ ＡＴＯＡＡＯＧ
ＴＡ ＡＴＡ ＧＴＴ Ｃ’ｌ’Ｇ ＧＡＡ ＣＴＡ
ＡＡＧ ＧＧＡ Ｔｏｏ ＧＡＡ ＡＣＡＡＯＡ ＴＴ
ＯＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡＡ、ＴＡＴ ＧＯＴＴ ＧＡ’
ｌ’ ＧＡＧ ＡＯＡ ＧＯＡＡＣ！ＯＡＴＴ ＧＴＡ
ＧＡＡ ＴＴＴ ＯＴＧ ＡＡＯＡＧＡ ’Ｉ’ＧＧ
ＡＴＴ ＡＯＯＴＴＴＴＧＴ ＯＡＡ ＡＧＣ！ Ａ
ＴＯＡＴＣＴＯＡ ＡＣＡ ＯＴＡ ＡＣＴ（７）
インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードす
る遺伝子が下記の塩基配列■を有する部分を含むもので
ある特許請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ＧＯＡ ＣＯＴ ＡＣＴ ＴＯＡ ＡＧＴ ＴＯＴ Ａ
（！Ａ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＯＡ ０ＡＧＯＴＡ ＯＡ
Ａ ＯＴＧ ＧＡＧ ＯＡＴ ＴＴＡ ＯＴＧ Ｏ’ｌ
’Ｇ ＧＡＴ Ｔ’Ｉ’Ａ ０ＡＧＡＴＧ ＡＴＴ Ｔ
ＴＧ ＡＡＴ ＯＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡ
ＯＡＡＧ ＡＡＴｏｏｏ ＡＡＡ ＣＴＣＡＯＯＡＧＧ
ＡＴＧ ＣＴＣＡＯＡ ’１！ＴＴ ＡＡＧ ＴＴＴ
ＴＡＯＡ’Ｉ’Ｇ Ｃｏｏ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣＡ
ＯＡ ＧＡＡ Ｃ’ｌ’Ｇ ＡＡＡ ＯＡ’ｌ’ＯＴＴ
ＣＡＧ ＴＧＴ ＯＴＡ ＧＡＡ 、ＧＡＡ ＧＡＡ
ＯＴＯＡＡＴ ＯＯＴ ０ＴＧＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴ
Ｇ Ｏ’［’Ａ ＡＡ’Ｉ’ Ｔ’ｌ’Ａ（９）’Ｉ’
ＯＡＡ Ａ叩んμＭ０’Ｉ’ＴＴ ＯＡＯＴＴＡ Ａ
ＧＡ （！００ ＡＧＧ ＧＡＯＴＴＡ Ａ’ｌ！Ｏ
ＡＧＯＡＡＴＡＴＯＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ Ｇ’ｌ’Ｔ
ＯＴＧ ＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ ＧＧＡ ＴＧＴ０
ＧＡＡ ＡＯＡ ＡＯＡ ＴＴＯＡＴＧ ＴＧＴ ＧＡ
Ａ ’Ｉ’Ａ’ｌ’ ＧＯＴ ＧＡＴ ＧＡＧＡＯＡ
ＧＯＡ ＡＯＯＡＴＴ Ｇ、ＴＡ ＧＡＡ ＴＴＩ’
Ｏ’Ｉ’Ｇ ＡＡＯＡＧＡ ＴＧＧＡＴＴ ＡＯＯＴ
Ｔ’ｌ’ ＴＧＴ ＯＡＡ ＡＧＯＡ’ｌ’ＯＡ’
Ｉ’Ｃ！ ＴＯＡ ＡＯＡ Ｏ’ｌ’Ａ０Ｔ （８） インターロイキン２活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子が塩基配列■の中の複数の連続した
塩基配列部分を含むものである特許請求の範囲第７項記
載の遺伝子。 （９） インターロイキン２活性をもつポリペプチド
をコードする遺伝子が微生物由来のレプリコンに接続さ
れたものである特許請求の範囲第１．２゜３．４，５．
６．７又は８項のいずれかに記載の遺伝子。
Priority Applications (21)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57229619A JPS59140882A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
| DE8383101035T DE3377363D1 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| US06/463,496 US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA000424401A CA1341562C (en) | 1982-03-31 | 1983-03-24 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| AU21472/83A AU556353B2 (en) | 1982-12-15 | 1983-11-17 | Interleukin-2 polypeptide |
| DD25780883A DD218632A5 (de) | 1982-12-15 | 1983-12-12 | Verfahren zur herstellung von interleukin-2 |
| DK577283A DK173788B1 (da) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | DNA-fragment, som koder for et polypeptid med interleukin-2-aktivitet, rekombinant DNA omfattende dette DNA-fragment, cellelinie transformeret med det rekombinante DNA og fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af denne cellelinie |
| AT435083A AT392082B (de) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Das polypeptid interleukin-2 kodierendes gen, rekombinante, dieses gen enthaltende dna, diese rekombinante dna aufweisende zellinien und verfahren zur herstellung von interleukin-2 unter verwendung der genannten zellen |
| HU426383A HU197938B (en) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Process for producing gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the gene, living cell line having the recombinant dna and process for producing interleukin-2 with such cells |
| KR1019830005952A KR940002537B1 (ko) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | 인터로이킨-2 폴리펩타이드를 코드화하는 dna 서열, 재조합체 dna, 및 인터로이킨-2의 제조방법 |
| EP83112661A EP0118617B1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| CA 443333 CA1341633C (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| BE0/212058A BE898473A (fr) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombinant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-2 |
| DE8383112661T DE3382383D1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2-polypeptide. |
| US07/814,049 US5620868A (en) | 1982-03-31 | 1991-12-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US08/096,842 US5399669A (en) | 1982-03-31 | 1993-07-26 | Interleukin-2 polypeptides |
| US08/331,146 US5700913A (en) | 1982-12-15 | 1994-10-28 | Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides |
| US08/516,563 US5795769A (en) | 1982-03-31 | 1995-08-18 | Gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the gene, a living cell line possessing the recombinant DNA and method for producing interleukin-2 using the cell |
| US08/621,097 US5795777A (en) | 1982-03-31 | 1996-03-22 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US09/769,396 US20010041362A1 (en) | 1982-03-31 | 2001-01-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57229619A JPS59140882A (ja) | 1982-12-24 | 1982-12-24 | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63292084A Division JPH0832236B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | 組換えヒトインターロイキン２およびその製造法 |
| JP63292085A Division JPH0832237B2 (ja) | 1988-11-18 | 1988-11-18 | ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターおよび該ベクターにより形質転換された真核生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140882A true JPS59140882A (ja) | 1984-08-13 |
| JPH0119879B2 JPH0119879B2 (ja) | 1989-04-13 |
Family
ID=16895021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57229619A Granted JPS59140882A (ja) | 1982-03-31 | 1982-12-24 | インターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59140882A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59220189A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-12-11 | バイオジェン ナームローズ ベンノットシャップ | ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
| WO1986000334A1 (fr) * | 1984-06-20 | 1986-01-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouveau transformant et son utilisation |
| JPS6158590A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Ajinomoto Co Inc | マウスインターロイキン―２活性を有するポリペプチド及びその製造法 |
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
| JPH029388A (ja) * | 1988-03-09 | 1990-01-12 | Ajinomoto Co Inc | 生理活性タンパク質の製造法 |
-
1982
- 1982-12-24 JP JP57229619A patent/JPS59140882A/ja active Granted
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59220189A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-12-11 | バイオジェン ナームローズ ベンノットシャップ | ひとインターロイキン２様ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列を有する発現ベクターおよび該発現ベクターを有する大腸菌 |
| JPH0156757B2 (ja) * | 1983-02-08 | 1989-12-01 | Biogen Nv | |
| WO1986000334A1 (fr) * | 1984-06-20 | 1986-01-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Nouveau transformant et son utilisation |
| JPS6158590A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Ajinomoto Co Inc | マウスインターロイキン―２活性を有するポリペプチド及びその製造法 |
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| JPH029388A (ja) * | 1988-03-09 | 1990-01-12 | Ajinomoto Co Inc | 生理活性タンパク質の製造法 |
| JP2576200B2 (ja) * | 1988-03-09 | 1997-01-29 | 味の素株式会社 | 生理活性タンパク質の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0119879B2 (ja) | 1989-04-13 |
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