JPS59140897A - インタ−ロイキン−２の製造方法 - Google Patents
インタ−ロイキン−２の製造方法Info
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- JPS59140897A JPS59140897A JP57230371A JP23037182A JPS59140897A JP S59140897 A JPS59140897 A JP S59140897A JP 57230371 A JP57230371 A JP 57230371A JP 23037182 A JP23037182 A JP 23037182A JP S59140897 A JPS59140897 A JP S59140897A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明はインターロイキン−２の製造法ｔこ関し、詳し
くは遺伝子組換え技術により創製した真核生物細胞Ｖこ
よるメンクーロイキン−２１こ関する。 インターロイキン−２はその特異な免疫応答作用から医
薬への応用が注目され、ヒトインターロイキン−２を産
生ずるヒ）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告され
ている（ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、、 １
５２＠ ｒ １７０９頁、１９８０年）。 しかし、このヒトＴ白血病細胞株ｔこよるヒトインター
−イキンー２の生産危は微量であり、しかも生産には細
胞を大量に培養することが必要となり、解決されなけれ
ばならない新たな問題が生じる。 本発明者らは、イ／ターロイキン−２の生産方法につい
て研究を重ねてきたが、インターロイキン−２活性を持
つポリペプチドをコニドしているＤＮＡを調製すること
ｒこ成功した。さらｒこ、このようにして得たＤｌｊ、
Ａを真核生物細胞内で発現せしめることｒこよって目的
とするヒトインターロイキン−２を製造できることを見
出′した。 すなわち本発明は、インターロイキン−２活性を持つポ
リペプチドをコードしている遺伝子が挿入されている真
核生物細胞を培養することを特徴とするインターロイキ
ン−２の製造法である。ここでインターロイキン−２と
してはヒトインターロイキン−２があり、インターロイ
キン−２活性を持つポリペプチドをコードしうる遺伝子
としてはショ糖密度勾配遠心法１こよる分画［こより１
１〜１２Ｓ画分として得られ、ヒトリンパ球由来細胞よ
り分離されるメンセンジャーＲＮＡ （以下、ｍ ＲＮ
Ａと略称する。）より調製されたもの、そのＤＮＡ鎖
中に制限酵素Ｂｓｔ 、 Ｘｂａ ｌおよびＢｓｔＮＮ
で切断される個所がこの順序で配置されている部分を含
むものであるもの等がある。本発明を説明する。 ｍＲＮＡは、インターロイキン−２ｒ一対応し、ＳＤＧ
遠心法やゲル濾過法等による分画ならびにアガロースゲ
ル電気泳動法ｔこより１１〜１２３画分として得られる
ものであり、このｍＲＮＡはインｐ−レイキ・ソー２産
生能を有するリンパ球由来細胞より抽出、分離すること
によって製造できる。 インターロイキン−２産生能を有するリンパ球由来細胞
として末梢血、扁桃腺、牌臓等より得られるリンパ球そ
のものも含まれる。また、これらのリンパ球をナイロン
カラム処理、抗血清−補体処理、密度勾配分画および酵
素（ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素等）処理
などの前処理をしたもの並びにＸ線等による変異処理お
よびトリプシン等の酵素処理等？こよりインターロイキ
ン−２の産生能が付饗されたものも本発明のリンパ球由
来細胞に含まれる。さらＶこ、これらリンパ球由来細胞
を、たとえばＴリンパ球をＴリッツ球成長因子等の存在
下にクローン化したように、クローン化したものも好ま
しいリンパ球由来細胞である。 また、白血病細胞およびＴリンパ腫細胞のようなリンパ
球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞を上記の
ような前処理もしくは変異処理したものまたは悪性化細
胞をクローン化したものがより好ましいリンパ球由来細
胞として用いることができる。特にりｐ−ン化細胞株は
親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い。 さらに、上記のリンパ球由来細胞とＣＥＭ 。 Ｍｏ１ｔ４Ｆ 等のヒｌ−腫瘍細胞とを細胞融合せしめ
て得られる、いわゆるハイブリドーマも好適なリンパ球
由来細胞として使用できる。 これらリンパ球由来細胞？こけ＋１１自発的ンこインタ
ーロイキン−２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在
下または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激する
ことｒこよりインターロイギン−２を産生するものがあ
る。 リンパ球由来細胞ｒこインターロイキン−２〆 ｍＲ
ＮＡを生成せしめるＶこあたり、インターロイキン−２
自発産生株を用いる場合には、これら細胞を通鹿の方法
で培養すればよい。マイトゲン刺激？こよりインターロ
イキン−２を産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十
分に洗浄後、ローズウェル・バーク・メモリアル・イン
スチチュート１６４’０（以下、ＲＰＭ１１６４０と略
記する。）培地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ）培
地、クリック培地などの通常の細胞用培地（血清や血清
成分は含有しても含有しなくてもよい）や合成無血清培
地ｔこ０．５〜４×１０６個／ ａｌの細胞密度で懸濁
し、ここｔこマイトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクト
ース酸化酵素；塩化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ
１ストレプトリジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成
分を添加した後、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。 マイトゲン刺激の際にマクロファージやデンドリテイン
ク細胞を共存させるとインターロイキン−２を産生しう
る細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ＋
Ｄａｕｄｉｎ Ｋ５６２ 、 ＢＡＬＬ −１細胞
を共存させると同様にインターロイキン−２の産生能が
みられるような細胞があり、これらの細胞を用いてイン
ターロイキン−２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、
これらの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。この
ようにすると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。 インターロイキン−２産生能を有するリンパ球由来細胞
は、通常の条件で試験管内もしくは動物種中で継代、増
殖させる。試験管内での培養継代は通常の細胞培養用培
地を用いて行なうことが可能であり、哺乳動物由来の血
清、血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている
培地でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地で
も、これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、
ｍＲＮＡを抽出するための細胞材料として用いることが
できる。 リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン−２のｍ ＲＮ Ａが生成される時
間であり、この時間は細胞の培養上清にインターロイキ
ン−２が産生され始めた頃１こ相当する。具体的には通
常、刺激剤添加後３〜１２時「＃Ｉノである。徒らＶこ
培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン−２の
ｍＲＮＡが分解されてしまう゛。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭＡやＴＰＡなどのホルボールニスｆル’ｆ
Ａ’ｋ １０〜５０ ｎ Ｗ ７ｍｌ添加することもあ
る。培養温度は３２〜３７ｃの範囲が望ましい。 イア １− Ｒイ＋ンー２産生能を有するリンパ球由来
細胞よりインターロイキン−２に対応するｒｒｉＲＮＡ
を抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行な
えばよい。たとえば、ＮＰ−４０゜ＳＤＳ＋ Ｔｒｉ
ｔｏｎＸｌｏｏ デオキシコール酸などの界面活性剤
を使用するが、ボモゲナイザーや凍結融解などの物理的
方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶
化する方法を行なう。 抽出の際１こＲＮａｓｅｒ−よるＲＮＡの分解を防ぐた
めに、抽出液中１こＲＮａｓｅインヒビター、たとえば
ヘパリン、ポリビニル硫酸、ベントナイト、マヵロイド
、ジエチルビルカーボネイト、バヵジウム複合体などを
添加しておくのが好ましい。また、場合に応じては、イ
ンターロイキ／−２に対応する抗体を用いてインターｐ
イキンー２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これよ
りｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行なうこ
とができる。 また、本発明に用いるｍＲＮＡの精製についてはオリゴ
ｄＴ−セルロース、ポリビーセファロース、セファ０−
ス２Ｂなどの吸着カラムあるいはパン バチ法による精
製法、ＳＤＧ遠心法Ｖこよる分画等によって行なうこと
ができる。このような精製操作Ｖこよりインターロイキ
ン−２に対応するｍＲＮＡは１ｌ−１２Ｓ画分として得
られる。 上記の如くして得られたｍ ＲＮ Ａが目的とするイン
ターロイキン−２に対応するものであることを確認する
ためＦこは、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を
調べるか、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法
を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するの
ｒこよく用いられる系であるアフリカ７メガエル（Ｘｅ
ｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ ） の卵母細胞ｔこｍＲ
ＮＡを注入して翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球
ライゼート、小麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させ
ることが行なわれている。 ここに用いたインターロイキンー２の活性検定法は次の
通りである。即ち、検体１００μｔを９６穴マイクロタ
イタープレートの１列目ｒこ添加し、２チの牛脂児血清
を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に２倍希釈を繰り返し
て、９６穴マイクロプレート上ｔこおいて各１００μｔ
の希釈系列を作成する。そこｔこギリスら（Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２６８巻。 １５４Ｊｊ（１９７７））によって教示された方法？こ
従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４×ｌＯ”個／
１００１１ｔの細胞密度として１００μを宛各くばみに
添加する。３７Ｃ，５％炭酸ガスインキュベーター中２
０時間静置培養後、トリチウム化チミジン０．５μＣｉ
を加え、４時間パルスを行なった後、この分野で良く知
られた方法ｒこ従って細胞を採取し、細胞内？ことり込
まれた放射線量を測定する。インターロイキン−２活性
の高い培養上清はど活性化Ｔリンパ球内にとり込まれる
トリチウムチミジン搦、が多いことから、検体中ｔこ含
有されるインターロイキン−２肴を容易ｒこ知ることが
できる。 また、インターロイキン−２はＴリンパ球分裂増殖せし
める作用がありこの作用によるＴリッツ球増殖活性の検
定法は次の通りである。 検体１０’０７１ｔを９６穴マイクロタイタープレート
の１列目に添加し、２％の牛脂児血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地ｒこ２倍希釈を繰り返して９′６穴マイクロプレ
ート上ｔこおいて各１００μｔの希釈系列を作成する。 そこｒこ上述活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μｔの
細胞密度として１００μを宛各くぼみｔこ添加する。３
７ ｒ、 ５ ％！酸酸ガスインキュベクター中７２時
間しくは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡ｔこ
て生存する活性化Ｔす７２球数をカウント□する。この
際、１０”’Ｏｕ ／ｍｌ、 ｌ Ｏｕ ／ｍｌの活
性を有するインターロイキン＝２をポジティブ・コント
ロールとして用い、検体添加群におけるＴリッツ球の増
殖数と比較し、検体のインターロイキン−２活性を算出
する。 かくして得られたインターロイキン−２＋ｎＲＮＡより
インぎトロで相補的なりＮＡ’（ｃＤＮＡ ）を合成
し、微生物のベクターなどに組込んで微生物等でインタ
ーロイキン−２を生産することを可能ならしめる。 このようなｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。 ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰＩ ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下で
逆転写酵１号によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃＤＮＡを
合成し、アルカリ処理で鋳型ｍ ＲＮ Ａを分解、除去
した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型ｔこして、逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ｃＤＮＡ
を合成する。 本発明において単離され、インターロイキン−２活性を
もつポリペプチドが発現されたＤＮＡ は以下ｒこ示
すものである。 上記塩基配列の内、分子量が１５，０００ダルトンであ
ると報告されているインターロイキ′７−２をフードで
きるフレ、−ムは、上記塩基配、列に示されているもの
だけである。蛋白合成の開始は、ｍ ＲＮ’Ａ上の最初
のＡＴＧコドンがら始まることが殆んどであるから、最
初のイニシェーションコドンＡＴＧよりターミネーショ
ンコドンＴＧＡの前のＡＣＴ （スレオニン）迄パイン
ターロイキン−２ポリペプチド（ポリペプチド１）ツこ
対応する塩基配列（ＤＮＡ Ｉ ）と考えられる。また
インク−ロイキン−２のような分泌蛋白においては、疎
水性アミノ酸に富んだいわゆるシグナルペプチドが存在
し、このペプチドは分泌の際切断され、成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から考えると疎水性アミノ酸に
とんだＮ−末端部シグナルペプチドに相当すると考えら
れ、る。従って、例えばＡＴＧＩＦンより２１番目のコ
ドンＧＣＡ （７ラニン）よりターミネーションコド
ンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するポリペプチド（ポリ
ペプチドＩＩ ）であってもインターロイキン−２活性
を有するものと考えられる（ ＤＮＡ−ＩＩ ）。更に
上記アラニン早後の又は上記スレオニン以前のいくつか
のアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基配列
部であってもインターロイキン−２蛋白の活性部位、を
保持しているようなポリペプチドであるならインターロ
イキン−２活性を有することが充分に考えられる。 又、本発明のＤＮＡの５１−末端に、インターロイキン
−２遺伝子の情報発現のため？こ有害でない １又は
複数の塩基が配列されていてもよい。又５１−末端１こ
１又は複数のアミノ酸を発現しうるような塩基が、配列
さｉていても、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドが
インターロイキン−２活性を有するために有害でないも
のであったり、又有害なものであっても容易に脱゛離で
きるようなものであれば、問題はない。、 ３Ｉ−末端についても同様、ポリペプチドがインターロ
イキン−２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。又、
ＤＮＡの化学合成など？こより本発明の遺伝子の一部又
は本発明のｊ１子構造から推論されるポリペプチドの一
部を改
くは遺伝子組換え技術により創製した真核生物細胞Ｖこ
よるメンクーロイキン−２１こ関する。 インターロイキン−２はその特異な免疫応答作用から医
薬への応用が注目され、ヒトインターロイキン−２を産
生ずるヒ）Ｔ白血病細胞株が見出されたことが報告され
ている（ギリスら、Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、、 １
５２＠ ｒ １７０９頁、１９８０年）。 しかし、このヒトＴ白血病細胞株ｔこよるヒトインター
−イキンー２の生産危は微量であり、しかも生産には細
胞を大量に培養することが必要となり、解決されなけれ
ばならない新たな問題が生じる。 本発明者らは、イ／ターロイキン−２の生産方法につい
て研究を重ねてきたが、インターロイキン−２活性を持
つポリペプチドをコニドしているＤＮＡを調製すること
ｒこ成功した。さらｒこ、このようにして得たＤｌｊ、
Ａを真核生物細胞内で発現せしめることｒこよって目的
とするヒトインターロイキン−２を製造できることを見
出′した。 すなわち本発明は、インターロイキン−２活性を持つポ
リペプチドをコードしている遺伝子が挿入されている真
核生物細胞を培養することを特徴とするインターロイキ
ン−２の製造法である。ここでインターロイキン−２と
してはヒトインターロイキン−２があり、インターロイ
キン−２活性を持つポリペプチドをコードしうる遺伝子
としてはショ糖密度勾配遠心法１こよる分画［こより１
１〜１２Ｓ画分として得られ、ヒトリンパ球由来細胞よ
り分離されるメンセンジャーＲＮＡ （以下、ｍ ＲＮ
Ａと略称する。）より調製されたもの、そのＤＮＡ鎖
中に制限酵素Ｂｓｔ 、 Ｘｂａ ｌおよびＢｓｔＮＮ
で切断される個所がこの順序で配置されている部分を含
むものであるもの等がある。本発明を説明する。 ｍＲＮＡは、インターロイキン−２ｒ一対応し、ＳＤＧ
遠心法やゲル濾過法等による分画ならびにアガロースゲ
ル電気泳動法ｔこより１１〜１２３画分として得られる
ものであり、このｍＲＮＡはインｐ−レイキ・ソー２産
生能を有するリンパ球由来細胞より抽出、分離すること
によって製造できる。 インターロイキン−２産生能を有するリンパ球由来細胞
として末梢血、扁桃腺、牌臓等より得られるリンパ球そ
のものも含まれる。また、これらのリンパ球をナイロン
カラム処理、抗血清−補体処理、密度勾配分画および酵
素（ノイラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素等）処理
などの前処理をしたもの並びにＸ線等による変異処理お
よびトリプシン等の酵素処理等？こよりインターロイキ
ン−２の産生能が付饗されたものも本発明のリンパ球由
来細胞に含まれる。さらＶこ、これらリンパ球由来細胞
を、たとえばＴリンパ球をＴリッツ球成長因子等の存在
下にクローン化したように、クローン化したものも好ま
しいリンパ球由来細胞である。 また、白血病細胞およびＴリンパ腫細胞のようなリンパ
球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性化細胞を上記の
ような前処理もしくは変異処理したものまたは悪性化細
胞をクローン化したものがより好ましいリンパ球由来細
胞として用いることができる。特にりｐ−ン化細胞株は
親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通常多い。 さらに、上記のリンパ球由来細胞とＣＥＭ 。 Ｍｏ１ｔ４Ｆ 等のヒｌ−腫瘍細胞とを細胞融合せしめ
て得られる、いわゆるハイブリドーマも好適なリンパ球
由来細胞として使用できる。 これらリンパ球由来細胞？こけ＋１１自発的ンこインタ
ーロイキン−２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在
下または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激する
ことｒこよりインターロイギン−２を産生するものがあ
る。 リンパ球由来細胞ｒこインターロイキン−２〆 ｍＲ
ＮＡを生成せしめるＶこあたり、インターロイキン−２
自発産生株を用いる場合には、これら細胞を通鹿の方法
で培養すればよい。マイトゲン刺激？こよりインターロ
イキン−２を産生ずる細胞を用いる場合には、細胞を十
分に洗浄後、ローズウェル・バーク・メモリアル・イン
スチチュート１６４’０（以下、ＲＰＭ１１６４０と略
記する。）培地、ダルベツコのイーグルス変形（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ）培
地、クリック培地などの通常の細胞用培地（血清や血清
成分は含有しても含有しなくてもよい）や合成無血清培
地ｔこ０．５〜４×１０６個／ ａｌの細胞密度で懸濁
し、ここｔこマイトゲン；ノイラミニダーゼ、ガラクト
ース酸化酵素；塩化亜鉛等の亜鉛化合物；プロティンＡ
１ストレプトリジン−〇等の菌体由来リンパ球活性化成
分を添加した後、細胞を洗浄、刺激剤を除去する。 マイトゲン刺激の際にマクロファージやデンドリテイン
ク細胞を共存させるとインターロイキン−２を産生しう
る細胞やＢリンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ＋
Ｄａｕｄｉｎ Ｋ５６２ 、 ＢＡＬＬ −１細胞
を共存させると同様にインターロイキン−２の産生能が
みられるような細胞があり、これらの細胞を用いてイン
ターロイキン−２のｍＲＮＡを生成せしめる場合には、
これらの細胞の存在下にマイトゲン刺激を行なう。この
ようにすると、ｍＲＮＡの収量は上昇することがある。 インターロイキン−２産生能を有するリンパ球由来細胞
は、通常の条件で試験管内もしくは動物種中で継代、増
殖させる。試験管内での培養継代は通常の細胞培養用培
地を用いて行なうことが可能であり、哺乳動物由来の血
清、血清成分もしくは血清アルブミンが含有されている
培地でも血清アルブミンすら含まない合成無血清培地で
も、これらの細胞株は培養、増殖させることが可能で、
ｍＲＮＡを抽出するための細胞材料として用いることが
できる。 リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、インターロイキン−２のｍ ＲＮ Ａが生成される時
間であり、この時間は細胞の培養上清にインターロイキ
ン−２が産生され始めた頃１こ相当する。具体的には通
常、刺激剤添加後３〜１２時「＃Ｉノである。徒らＶこ
培養時間を延ばすと、生成したインターロイキン−２の
ｍＲＮＡが分解されてしまう゛。また、リンパ球活性化
に際し、ＰＭＡやＴＰＡなどのホルボールニスｆル’ｆ
Ａ’ｋ １０〜５０ ｎ Ｗ ７ｍｌ添加することもあ
る。培養温度は３２〜３７ｃの範囲が望ましい。 イア １− Ｒイ＋ンー２産生能を有するリンパ球由来
細胞よりインターロイキン−２に対応するｒｒｉＲＮＡ
を抽出するには、細胞の種類を問わず常法によって行な
えばよい。たとえば、ＮＰ−４０゜ＳＤＳ＋ Ｔｒｉ
ｔｏｎＸｌｏｏ デオキシコール酸などの界面活性剤
を使用するが、ボモゲナイザーや凍結融解などの物理的
方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊、可溶
化する方法を行なう。 抽出の際１こＲＮａｓｅｒ−よるＲＮＡの分解を防ぐた
めに、抽出液中１こＲＮａｓｅインヒビター、たとえば
ヘパリン、ポリビニル硫酸、ベントナイト、マヵロイド
、ジエチルビルカーボネイト、バヵジウム複合体などを
添加しておくのが好ましい。また、場合に応じては、イ
ンターロイキ／−２に対応する抗体を用いてインターｐ
イキンー２合成途上のポリゾームを沈降せしめ、これよ
りｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行なうこ
とができる。 また、本発明に用いるｍＲＮＡの精製についてはオリゴ
ｄＴ−セルロース、ポリビーセファロース、セファ０−
ス２Ｂなどの吸着カラムあるいはパン バチ法による精
製法、ＳＤＧ遠心法Ｖこよる分画等によって行なうこと
ができる。このような精製操作Ｖこよりインターロイキ
ン−２に対応するｍＲＮＡは１ｌ−１２Ｓ画分として得
られる。 上記の如くして得られたｍ ＲＮ Ａが目的とするイン
ターロイキン−２に対応するものであることを確認する
ためＦこは、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を
調べるか、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法
を行なえばよい。たとえばｍＲＮＡを蛋白に翻訳するの
ｒこよく用いられる系であるアフリカ７メガエル（Ｘｅ
ｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ ） の卵母細胞ｔこｍＲ
ＮＡを注入して翻訳させる、あるいはウサギ網状赤血球
ライゼート、小麦胚芽などの無細胞系で蛋白に翻訳させ
ることが行なわれている。 ここに用いたインターロイキンー２の活性検定法は次の
通りである。即ち、検体１００μｔを９６穴マイクロタ
イタープレートの１列目ｒこ添加し、２チの牛脂児血清
を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に２倍希釈を繰り返し
て、９６穴マイクロプレート上ｔこおいて各１００μｔ
の希釈系列を作成する。そこｔこギリスら（Ｎａｔｕｒ
ｅ、 ２６８巻。 １５４Ｊｊ（１９７７））によって教示された方法？こ
従って作成した活性化Ｔリンパ球株を、４×ｌＯ”個／
１００１１ｔの細胞密度として１００μを宛各くばみに
添加する。３７Ｃ，５％炭酸ガスインキュベーター中２
０時間静置培養後、トリチウム化チミジン０．５μＣｉ
を加え、４時間パルスを行なった後、この分野で良く知
られた方法ｒこ従って細胞を採取し、細胞内？ことり込
まれた放射線量を測定する。インターロイキン−２活性
の高い培養上清はど活性化Ｔリンパ球内にとり込まれる
トリチウムチミジン搦、が多いことから、検体中ｔこ含
有されるインターロイキン−２肴を容易ｒこ知ることが
できる。 また、インターロイキン−２はＴリンパ球分裂増殖せし
める作用がありこの作用によるＴリッツ球増殖活性の検
定法は次の通りである。 検体１０’０７１ｔを９６穴マイクロタイタープレート
の１列目に添加し、２％の牛脂児血清を含有するＤＭＥ
Ｍ培地ｒこ２倍希釈を繰り返して９′６穴マイクロプレ
ート上ｔこおいて各１００μｔの希釈系列を作成する。 そこｒこ上述活性化Ｔリンパ球株を５個／１００μｔの
細胞密度として１００μを宛各くぼみｔこ添加する。３
７ ｒ、 ５ ％！酸酸ガスインキュベクター中７２時
間しくは９６時間静置培養してその後、倒立顕微鏡ｔこ
て生存する活性化Ｔす７２球数をカウント□する。この
際、１０”’Ｏｕ ／ｍｌ、 ｌ Ｏｕ ／ｍｌの活
性を有するインターロイキン＝２をポジティブ・コント
ロールとして用い、検体添加群におけるＴリッツ球の増
殖数と比較し、検体のインターロイキン−２活性を算出
する。 かくして得られたインターロイキン−２＋ｎＲＮＡより
インぎトロで相補的なりＮＡ’（ｃＤＮＡ ）を合成
し、微生物のベクターなどに組込んで微生物等でインタ
ーロイキン−２を生産することを可能ならしめる。 このようなｃＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のよう
な方法で行なうことができる。 ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをブライマーとして、
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰＩ ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下で
逆転写酵１号によりｍＲＮＡと相補的な単鎖ｃＤＮＡを
合成し、アルカリ処理で鋳型ｍ ＲＮ Ａを分解、除去
した後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型ｔこして、逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二重鎖ｃＤＮＡ
を合成する。 本発明において単離され、インターロイキン−２活性を
もつポリペプチドが発現されたＤＮＡ は以下ｒこ示
すものである。 上記塩基配列の内、分子量が１５，０００ダルトンであ
ると報告されているインターロイキ′７−２をフードで
きるフレ、−ムは、上記塩基配、列に示されているもの
だけである。蛋白合成の開始は、ｍ ＲＮ’Ａ上の最初
のＡＴＧコドンがら始まることが殆んどであるから、最
初のイニシェーションコドンＡＴＧよりターミネーショ
ンコドンＴＧＡの前のＡＣＴ （スレオニン）迄パイン
ターロイキン−２ポリペプチド（ポリペプチド１）ツこ
対応する塩基配列（ＤＮＡ Ｉ ）と考えられる。また
インク−ロイキン−２のような分泌蛋白においては、疎
水性アミノ酸に富んだいわゆるシグナルペプチドが存在
し、このペプチドは分泌の際切断され、成熟蛋白が知ら
れている。上記塩基配列から考えると疎水性アミノ酸に
とんだＮ−末端部シグナルペプチドに相当すると考えら
れ、る。従って、例えばＡＴＧＩＦンより２１番目のコ
ドンＧＣＡ （７ラニン）よりターミネーションコド
ンＴＧＡの前のＡＣＴ迄に対応するポリペプチド（ポリ
ペプチドＩＩ ）であってもインターロイキン−２活性
を有するものと考えられる（ ＤＮＡ−ＩＩ ）。更に
上記アラニン早後の又は上記スレオニン以前のいくつか
のアミノ酸がないものであって連続した複数の塩基配列
部であってもインターロイキン−２蛋白の活性部位、を
保持しているようなポリペプチドであるならインターロ
イキン−２活性を有することが充分に考えられる。 又、本発明のＤＮＡの５１−末端に、インターロイキン
−２遺伝子の情報発現のため？こ有害でない １又は
複数の塩基が配列されていてもよい。又５１−末端１こ
１又は複数のアミノ酸を発現しうるような塩基が、配列
さｉていても、付加されたアミノ酸が、ポリペプチドが
インターロイキン−２活性を有するために有害でないも
のであったり、又有害なものであっても容易に脱゛離で
きるようなものであれば、問題はない。、 ３Ｉ−末端についても同様、ポリペプチドがインターロ
イキン−２活性を持つために有害でないアミノ酸がポリ
ペプチドＣ−末端に付加されるような塩基配列が３′−
末端に付加されていてもよいし、有害なものであっても
容易に脱離できるようなものであれば問題はない。又、
ＤＮＡの化学合成など？こより本発明の遺伝子の一部又
は本発明のｊ１子構造から推論されるポリペプチドの一
部を改
【することも可能である。更に実施例に記載した
ヒト細胞以外の細胞よＦ）得たｒｎ ＲＮ Ａを用いて
本発明の遺伝子を得ることもできる。従って、要は、イ
ンターロイキン−２活性をもつポリペプチドをコードす
るＤＮＡであれば本発明の遺伝子に含ｆれる０ １）ＮＡ （Ｉ） ＡＴＧ ＴＡＣＡＧＧ ＡＴＧ ｃＡＡ ｃＴｃ ｃＴ
Ｇ ＴｃＴＴＧＣＡＴＴ ＧＣＡ ’ＣＴ、Ａ ＡＧ−
ｒ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴ’ＴＧＴＣＡＣＡ ＡＡＣＡ
ＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ′ＡＣＴ ＴＣＡＡＧＴ Ｔ
ＣＴ ＡＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ Ｃ１−Ａ、ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ｃＡＴ
ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴＴＴＡ ＣＡ、Ｇ
ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＧＡ
’ＡＴＴＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣＡＡＧ ＡＡＴ ｃ
ｃｃ ＡＡＡ ｃＴｃＡＣＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴ
’ＣＡＣＡ ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＴＴｉＡｃ
ＡＴＧ ＣＣＣＡＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣＡＣＡ
ＧＡＡＣＴＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＣＴＴ Ｃ
ＡＧ 王ＧＴ ｃＴＡ ＧＡＡＧＡＡ ＧＡＡ
ｃ−ｒｃ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ｂＡＧ
ＧＡＡＧＴＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣ
Ｔ 、ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴ
ＴＡ ＡＧＡ ＣＣＣＡＧＧ ＣＡＣ丁−ｒＡ ＡＴ
ＣＡＧＣＡＡＴ ＡＴＣＡＡＣＧＴＡ ＡＴＡＧＴ
’Ｔ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＡ ＡＡＧ Ｇ
ＧＡ ＴＣＣＧＡＡＡＣＡ ＡＣＡ ＴＴＣＡＴ
Ｇ ＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＣＴＧＡ’Ｔ
ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＡＣＣＡＴＴ
ＧＴＡ ＧＡＡＴＴＴ ＣＴＧ ＡＡＣＡＧＡ
ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＣＣ，ＴＴＴＴＧＴ ＣＡＡ
ＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＡＣ
Ｔ ［）ＮＡ（、ｎ） ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ
ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＡＧＡＡＡ ＡＣＡ ＣＡ
Ｇ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡ・Ｇ Ｃ
ＡＴＴｌ”Ａ ＣＴＧ ’ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＴ
Ａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴＴＴＧ ＡＡ’Ｔ
ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡ、
、ＣＡＡＧＡＡＴ ＣＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＣＣＡ
ＧＧ ＡＴＧ ＣＴＣＡＣＡ ’１−ＴＴ Ａ
ＡＧ １−ＴＴ ＴＡＣＡＴＧ ＣＣＣＡＡＧ△
ＡＧ ＧＣＣＡＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ
ＣＡＴ ＣＴＴＣＡＧ ＴＧＴ Ｃ”ｒＡ
ＧＡＡ ＧＡＡ’ ＧＡＡ ＣＴＣＡＡＴＣＣＴ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ｃｒＡ
ＡＡＴ ＴＴＡＧＣｒ ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＡ Ａ
ＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴＴＡＡＧＡ ＣＣＣＡＧＧ
ＧＡＣＴｒＡ ＡＴＣＡＧＣＡＡＴΔＴＣＡＡＣＧＴ
Ａ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＡ、Ａ Ｃ
ＴＡＡΔａ ＧＧＡ ｒｃｃ ＧＡＡ ＡＣＡ
ＡＣＡ １−ＴＣＡＴＧｌＧｒ ＧＡＡ ＴＡＴ Ｇ
ＣＴ ＧＡＩ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＣＡΔＣＣＡＴＴ
ＧＴＡ ＣＡＡ １−ＴＴ ＣＴＧ ＡＡＣＡ
ＧＡｒＧＧ Ａ’ＴＴ ＡｃＣＴＴＴ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＡＧＣＡＴＣ△１’Ｃ’１−ＣＡ ＡＣ
Ａ ＣＴＡ ＡＣＴアＳノ酸曲乙列（１） Ｍｅｔ ｖｙｒ ＡｒｇＭｅｔ ＧＩ Ｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ’Ｉ Ｉｅ
Ａｌａ １−ｅｕ ３ｅｒ １−ｅｕ Ｖａｌ
１−ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＡＳＮ ３ｅ
ｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｔ１１ｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔｊｌｒ Ｌｙｓ ’Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒＧＩ Ｎ Ｌｅｕ ＧＩ Ｎ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ ｅｕ
ＡｓｐＬｅｕ ＧＩ Ｎ Ｍｅｔ ｌｌｅ １
−ｅｕ ＡＳＮ ＧＩＶ Ｐｌ＋ｅ ＡＳＮ
ＨｙｒＩＪｓ ＡＳ Ｎ ＰｒＯＬＪＳ Ｌｅ
Ｕ Ｔｈｒ Ａｒ（ｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ、Ｐｂｅ Ｌ ｙｓ Ｐｈｅ 丁ｙｒ Ｍ
ｅｔ ｐｒｏ １−ｙｓ ｌｙｓ Ａｌａ
７＋１ｒ （３１０ＬｅＬＩ Ｌｙｓ １−（ｉ
ｓ １−ｅｕ ＧＩ Ｎ ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ ＧＩＵ Ｑｌｕｌ−ｅｕ Ｌｙｓ ｐ
ｒｏ ｌｅｕ Ｑｌｕ Ｑｌｕ Ｖａｌ １
−ｅｕ ＡＳＮ １−ｅｕＡｌａ ＧＩ Ｎ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓ’Ｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｒｑ Ｐｒ。 ＡｒｇＡｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓ
Ｎ Ｉｌｅ ＡｓＮ Ｖａｌ ｌ１ｅＶａｔ
ＬｅＬＩ Ｑｌｕ １−ｅｕ ｃｙｓ ａｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅＭｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ 、Ｔｈｒ
ｌ１ｅＶａｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １−ａｕ Ａ
ＳＮ Ａｒａ Ｔｒｐ ｌｌｅ Ｔｈｒ ｐ
ｈｅｃｙｓ ＧＩ Ｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ｌｅｕ Ｔｈｒアミノ西
変何乙列（ＩＬ） Ａｌａ Ｐｒｏ １−１１ｒ Ｓｃｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔ１１ｒ Ｌｙｓ Ｌ ｙｓ Ｔ
ｈｒＧＩ Ｎ Ｌｅｕ ＧＩ Ｎ ｌｅｕ Ｑ
ｌｕ Ｈｉｓ １−ｅｕ １−ｃｕ、ｌｅｕ
ＡＳＩ）Ｌｅｕ’ＧＩ Ｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ ｌ
ｅｕ Ａｓ Ｎ Ｇｌｙ ｐＨｅ ＡＳ ＮＴ
ｙｒＩＪｓ Ａｓ Ｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ ’Ｔ−ｈｒ Ａｒｏ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
ＴｈｒＰｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ７ｙｒ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ 月１ｒ
Ｇｌｕｌｅｕ ｌｙｓ １ｌｉｓ １−ｅｕ
（３１Ｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｑｌｕ ＧＩ
ＬＩ ＧｌｕＬｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ １−ｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｑｌｕ Ｖａｔ ｌｅｕ ＡＳ
Ｎ １ｅｕＡｌａ ＧＩ Ｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ａｓ Ｎ ＰＩ）ｅ １−（ｉｓ １−ｅｕ
ＡｒｇＰｒ。 Ａｒ（ｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
ＡｓＮ ｌｉｅ ＡｓＮ Ｖａｌ ｌ１ｅＶ
ａｌ １−ｅｕ Ｑｌｕ １−ｅｕ ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ｌｈｒ
ＰｈｅＭｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａ
ｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ １
−ｈｒ １ｌｅＶａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｃ Ｌｅ
ｕ ＡｓＮ ＡｒｇＴｒｐ Ｉｌｅ ｌ’ｈｒ
ＰｌｅａＣｙｓ ＱＩ Ｎ ３ｅｒ’ｌｌｅ
Ｉｌｅ ３ｅｒ 刊）ｒ ｌｅｕ １−ｈｒ
インターロイキン−２活性をもつポリペプチドをコード
しているＤＮＡは、ついで、自律り製できるベクターＤ
ＮＡＩこ組込んで真核生物細胞内１こ挿入してもよいが
、一旦例えばエシェリヒア・フリ内で自ｆ４を複製でき
るベクターに組込み、エシェリヒア・コリ内でＤＮＡを
増巾せしめた後、真核生物細胞内に挿入してもよい。 イスレの場合にもＤＮＡをベクターＤＮＡ に接続す
るンこは、例えばＤＮＡ両端を必要によりエキン又りレ
エースで処理し、それぞれ１こ適当なリンカ−ＤＮＡを
接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複
数個重合せしめる。しかる後、これを、真核生物細胞内
で自律複製できるベクター又はＤＮＡを増１１］せしめ
るために用いられるエシェリヒア・コリ等の宿主細胞内
で自律複製できるべ′フタ−ｒこ組込む。組込む方法は
、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により適当
なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基を複
数個重合せしめる。′このように加工した二重鎖ＤＮＡ
とベクターＤＮＡを混合し、 リガーゼな用いて接続せ
しめる。 得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主、即ち、真核生
物細胞又はＤＮＡの増＋ｉＪのためｔこ用いられる微生
物細胞内ｔこ挿入する。 真核生物細胞として、を推動物、酵ｔＵ等が含まれる。 具体的には、Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ＋ Ｃｅ１１＋
２３ ＋１７５−１８２（１９８１） に開示されて
いるところの、サル培養細胞ＣＶ−１のオリジン欠損変
異株（ｏｒｉｇｉｎ −ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａ
ｎｔ ）を５Ｖ−４０で形質転換したものでＴ抗原を表
現しているＣＯ８細胞、Ｏｎｏ Ｓｒ Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉ Ｔｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒ
ｃｈ、 １０． ９６７−９７７、’（１９
８２） ＃こ開示されているマウス細胞、インタ
ーフェロンの遺伝子発現の例がある。Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎ ｅｔ ａＬ＋Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．
７１７−７’２２．（＋９’８１）’ｒこ（−され
ている酵ｆｔｔの宿主−ベクター系等がある。 ＤＮＡを一旦増巾せしめるときは、宿主として、エシェ
リヒア・コリが使用されることが多いが、他の微生物細
胞であってもよい。エシェリヒア・つりが用いられると
きは、ベクターＤＮＡとじてはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５等が通常用いられるが、他のベクターであってもよ
い。 ベクターｒこｃＤＮＡを組込んだ組換えＤＮＡを用いて
宿主細胞を形質転換する方法としては、宿主が微生物で
ある場合には、主として対数増殖期？こある細胞を集め
てＣａＣ１ｇ処理して自然ンこＤＮＡを取込みやすい状
態にしてプラスミドを取込ませる方法が採用されており
、ＭｇＣ＋２あるいはＲｈ ＣＩ をさらに共存させる
ことｒこより形質転換の効率が一層増すことも知られて
いる。また、微生物細胞をスフェロプラストあるいはプ
ロトプラスト化してから形質転換させてもよい。 宿主が動物細胞である場合には、マイクロインジェクシ
ョン等の機械的方法、赤血球ゴースト、リポゾーム等に
包み込み挿入する方法、リゾホスファチジルコリン等の
薬剤で細胞を処理する方法、ウィルスベクターを使用す
る方法等がある。 形質転換株からインターロイキン−２遺伝子が組込まれ
ている株を選別する？こけ、以下のような方法がある。 （１） すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法
と称されるもので、まずｃｏｎＡ ｒこよって刺激した
ジュルカット細胞よりｍにＮＡを抽出し一５ＤＧ遠心法
によってインターロイキン−２＋ｎ ＲＮ Ａを部分精
製したのち（はぼ１１〜１２ＳｍＲＮＡ）、このｍＲＮ
Ａを用いて３２ｐによりラベルした１本鎖ｃＤＮＡを合
成する。ついでｃ ＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡ
をアルカリ処理１こよって除いた後、このｃＤＮＡとｃ
ｏ、ｎＡで刺激していないジュルカット細胞より抽出し
た１１−１２８ ｍＲＮＡの部分精製ｍＲＮＡの過剰と
ハイブリダイズさせた。そしてこのｃｏｎＡ刺激してい
ないｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハ
イブリッドを形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイ
トカラム１こまって分画し、それぞれプローブＡおよび
プローブＢとする。 次Ｆこ、前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ
２枚のニトロセルロースフィルターに生育させておき、
アルカリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定
しておく。そしてさきｒこ調製したプローブＡとプロー
ブＢを用いてそれぞれ別々ｔこフィルターにハイブリダ
イズさせた後、オートラジオグラフィーを行ない、プロ
ーブＡ１こはポジティブに反応する（プラス）がプロー
ブＢＦこけ弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）
コロニーを検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔ ａｌ
、＋ Ｐａｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、、 ｖｏｌ
５５ Ｂ 。 ４６４−４ａ９（＋９７９））。 （２） あるいは形質転換株、たとえば１０００〜１
０．０００クロ一ンヲ数士ないし数百のクローンの集団
ｅこ分け、集団毎に形負転換株を混合培養しく常法によ
って）、ベクターに接続されたＤＮＡを調製する。次ケ
こ、これらＤＮＡを熱変性等により単鎖ＤＮＡ ｒこし
てニトロセルロースフィルターに固定して、これらＤＮ
Ａ Ｆこ相補的な、前述したようなインターロイキン−
２ｍＲＮＡを含むヒ）Ｔ白血球細胞より調製し亮゛ｍＲ
ＮＡをハイブリダイズさせる。あるいはＤＮＡ を熱
変性させた後、先ｔこインターロイキン−２ｍＲＮＡを
含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後ｔこ、ＤＮＡ−
ｍＲＮＡ ハイブリッドをニトロセルロースフィルタ
ーに固定スル方法モある。 次ｒこ、このフィルターを１ｍＭビペス、１０ｍＭ Ｎ
ａＣ１のような低塩溶液でよく洗滌した後、０．５ｍＭ
ＥｐＴＡ、０．１％５ＤＳＯような溶液で、例えば
９５ｃ、１分間程度の熱処理を行なってフィルターに吸
着したｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ
−セルロースカラムｔこかけるなどの操作を行なってｍ
ＲＮＡを回収する。次ｒこ、この＋ｎ ＲＮ Ａをアフ
リカッメガエルの卵／Ｑ細胞に注入して蛋白に翻訳させ
てインターロイキン−２活性を測定する。あるいはウサ
ギ網状赤血球ないしは小麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒ。 翻訳系で蛋白ｒこ翻訳させた後、インターロイギン−２
抗体でインターロイキン−２を検定する。 かくしてインターロイキン−２活性の検出された集団が
見出されれば、この集団の混合クロー、ンの数を細分化
してより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終
的には単数のクローンに細分化し、インターロイキン−
２ＤＮＡをには、インターロイキン−２遺伝子が組込ま
れている組換え体微生物は常法ｔこまって培養すればよ
い。かくしてインターロイキン−２の遺伝子を有する組
換え体微生物菌体内にインターロイキン−２の遺伝子が
増１１Ｊ、生産され、インターロイキン−５２遺伝子を
大量？こ調製することができる。 増１１】されたＤＮＡはそのまま真核生物細胞内に挿入
してもよいが、通常使用する真核生物ンこ適したベクタ
ーに組込んだ後、真核生物細胞にこ挿入する。以下ｃｃ
ｏｓ細胞な真核生物を用い゛るときの騙す。 す各由塙円インターｐイキンー２ ＤＮＡをもつエンエ
リヒア・コリのプラスミドよりＰａｔ １で挿入された
ｃＤＮＡを切り出し、ＰＣＢ−１ぺ／ｌ−＋７）Ｐｓｔ
１ ＋イトｔこ挿入する。このＰＣＢ−１ベクター
はｐＢＲ３２８プラスミドベクターＹｐＫＣＲベクター
のＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のプロモーターを含む
領域を組み込んで造成する。ＰＣＢ−１ベクターのＰｓ
ｔｌサイトへの挿入ジョンコドンＡＴＧが接続されてい
るものである。このベクターをサル培養細胞のＣ０８−
７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ＋ Ｙ、 Ｃｅ１ｌ＋ ｖｏｌ
２３＋ Ｐ１７５−１８２． ｔ９ｓｔ）’ｒこ
感染させ、この感染ＣＯ３−７細胞を通常の呻ａ動物細
胞培養培地他の噛ｉＬ動物細胞の場合も同様Ｐこ各細胞
ｒこ適したベクターを用い、本ベクターＶこ上述のエシ
ェリヒア−コリより切り出之れたｃＤＮＡを挿入し感染
させて同様に培養すればよい。 インターロイキン−２活性を持つポリペプチドをコード
しているＤＮＡを有する真核生物細胞を培養する方法は
通常の方法でよい。例えば必要によりビタミン、アミノ
酸等の有機微量栄養素を含む培地を用い、好ましくは２
７ないし３７Ｃの範囲の適当な温度、ｐＨ４ないし７の
範囲の適当なｐＨに調節しつつ、好気的条件下で培養す
る。 次ｔこ、培養物からインター−イキンー２活性を持つポ
リペプチドを単離、精製する。この操作も当該技術Ｖこ
おいて知られている手段Ｖこより行なえばよく、たとえ
ば塩析、濃縮、真空透析、ゲル間過クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、調製用等電点電気泳
動、ゲル電気泳動法、高速液クロマトグラフイー等の種
々の方法を単独ｔこ、あるいは適宜組合せて用いて行な
うことができる。 次ｔこ、本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例１ ｆｌｌ インターロイキン−２生産能を有するジェル
カット１１１細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ８１２９ ）゛
をＩ Ｘ １０’個／−の細胞密度で無血清合成培地Ｒ
ＩＴＣ５５−９１，０００ｍ／’ｒこ懸濁し、ファルコ
ン社製回転培養瓶ｔこ入れ、３７Ｃで４日間培養し、遠
沈操作により細胞を集めた。この細胞を４Ｘ１０’個／
Ｎｔｌの細胞密度ｔごて上述の培地中に懸濁し、ここ
にＣｏＤＡ２５μ２／肩ｌを添加し、」二記ファルコン
社製回転培養瓶（４本）に１、 ＯＯＯ肩１で張り込み
６時間回転培養した。 （２） このようにして得たＣｏｎＡ ２５ ｐｆ／
ｍｌで６時間誘導したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０
” 細胞）をＰＢβ溶液８００ ｍｌに懸濁し、細胞を
遠心ｒこよって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤
であるＲ４ｂｏｎｏｃｌｅｏｓｉｄｅｓ −Ｖａｎａｄ
ｙｌＣｏｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ３Ｂ溶
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，５、１
０ｍＭＮａＣ１、１，５ｍＭ ＭｇＣ１，−、） ８
００ ｍｌＫ懸濁した。 次に、ＮＰ−４０を０．０５ ％ ｒこなるように加え
−た後、ゆるやかに攪拌後３．００ Ｏｒｐｍで５分遠
心して核を除去し、その上清液ＥＳＤＳ（０，５％）と
ＥＤＴＡ（５ｍＭ ） を加えた後、ただちｔこフェ
ノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰返してから２容エタノールでＲＮＡを
沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＬ 、 ｐＨ７，５で溶解した。このようにして
ジュルヵット細胞から得られたＲＮＡ量は１９６＊ｙで
あった。 次に、このＲＮＡ量１らｍＲＮＡを取得するため′ｔこ
オリゴ（ｄＴ ）−セルロース（ｐ、 Ｌ。 Ｂ１ｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ＋ ’ｒ３’ｌ）ｅ ７
）を用い、カラムクロマトグラフィーを行なった。吸着
は２０ｍＭは緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ
、 ｐＨ７，５。 ０．５ Ｍ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）で洗浄
後、水と１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，
５）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。 この結果、溶出されたｍＲＮＡ量は３．６ｍ１７であっ
た。 さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４１１ｇ）をＳＤＧ
遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ 、 ｐＨ７，
６。 １ ｍＭ ＥＤＴＡ ！ ０．２ Ｍ ＮａＣ１を含む
５〜２５チシミ糖密度勾配。Ｈｉｔａｃｈｊ ＲＰＳ
２８ ｐ−タ−で２６．００Ｏｒｐｍ、２４時間、４
Ｃ）して分画し、１１−１２ＳのｍＲＮＡ画分を分画番
号１２．１３．１４としてそれぞれ５９μ２゜４６ｐ？
、６０ｐ？得た。 （３） ここｔこ得られた分画番号１３のｍＲＮＡヲ
ｆｌｆｉ出の検定法に従い、アフリカツメガニＩしの卵
Ｉｔ） ４＋１胞Ｅ１個当り５０ ｎＷをマイクロイン
ジエクンヨン法により注入して得られた卵Ｉｎ ！１１
１抱培養上清をインターロイキン−２の活性検定１こ供
したところ、次表に示すトリチウム化チミジンの取り込
みおよび活性化Ｔリン／′＋球数の増加力ｔみられ、こ
れら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロイキン−
２ｍＲＮＡ を含有すること力′−山ト明された。 表 −１ （イ） ※ 各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃ
ｐｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン
−２（ｌＯ単位／ ｍｌ ）と比較して求めた。 （４） 次ｒこ、ここで得られたインターロイキン−２
ｍＲＮＡを含む１１〜１２ Ｓ ｍＲＮＡ分画１３より
ｃＤＮＡをインビトロで合成し、プラスミドベクターＰ
ＢＲ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒ
ア争フリにトランスホームしてインターロイキン−２ｃ
ＤＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。 （４−１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７，５）、３０ ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、 ０．５
ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ１ ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（
ｄＣＴＰは＄２ｐラベルしたものを含む）、０．７５μ
２オリゴ（ｄＴ）＋。、１ＯμｆｍＲＮＡおよび１５ユ
ニツ）ＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、 Ｗ、 Ｂｅａｒｄ ）
を混ぜ、４１Ｃに９０分間保った。反応終了後、フェノ
ール処理１回を行ない、エタノール沈澱としてＤＮＡを
回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ７，５溶液に溶解した。これｔこより約２．５μ
２の１水銀ｃＩ）ＮＡが合成された。この溶液からｍＲ
ＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加えて０．３８ Ｎ
ＮａＯＨとし室（Ｋｔ＝て１５時間置き、次いで溶液
をｌ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ 、 ｐＨ７，５の等量で
中和し「セファデックスＧ−５ＯＪ力うムンこ通した。 これ」こより１．８μ２のｃＡＴＰｌｄＧＴＰ、、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰ −は３Ｈでラベルさ
れたものを含む）、１．８μ２１ 水銀ｃ Ｄ Ｎ Ａ
Ｘ ８ユニツトポリメレース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
） Ｉ （米国ＢＲＬ製）を混ぜ、１５ｎで１５時間
反応を行なった。反応終了後、フェノール処理１回、ク
ロロホルム処理１回を行ない、エタノール沈澱としてＤ
ＮＡを回収した。この反応により１．１Ｏμｆの二重鎖
ｃＤＮＡを得た。 次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、０．
２ Ｍ ＮａＣｌ 、 １ ｍＭ ＺｎＣｌ、、１
．１０ ｐｔ二重釦ｃＤＮＡを混ぜて３７ｃで２０分間
インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアー
ゼＳ１（玉共■製）全加工、さらｒ−１５分間インキュ
ベートした。反応終了後、フェノール処理２回行ない、
［セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通し、０．５５μ
２の二重鎖ｃＤＮＡを回収した。 （４−３） Ｏ，’１４Ｍカコジル酸カリウム、３０
ｍＭ）リス塩基、０．１ ｍＭ ＤＴＴ ５１ｍＭ
ＣｏＣ１，、０，６４ｍＭ ”Ｐ −ｄＣＴＰ（Ｓｐｃ
。 ａｃｔ、 ２．７ Ｘ １０’ ｃｐｍ／ ｎｍｏｌ
）、 ０．５５μＶ二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツト
のターミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７
Ｃで７分間インキュベートし、反応終了後、フェノール
処理１回を行ない、［セファデックスＧ−５ＯＪカラム
に通しエタノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０ ｐｆを
回収したところ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加
された。 ＰＢＲ３２２ＤＮＡ １０ｐ？を制限酵素Ｐｓｔ■で
切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡｔこｄＣＭＰ鎖を
付加したのと全く同じ条件でｄＣＴＰの代りにｄＧＴＰ
を用いて両３１末端にｄＣＭＰ鎖を付加した。かくして
約５０個のｄＧＭＰが両３“末端ｔこ付加された。 （４−４） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７
，５）、０．１ Ｍ ＮａＣ１、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０５ ｐｆのｄＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２２，
０，０１μ２のｄＣＭＰが付加されたｃＤＮＡをまず６
５Ｃで２分間、次いで４６ｒで１２０分間、さらｔこ３
′７Ｃで６０分間、そして室温で６０分間保持した。 エシェリヒアΦコリχ１’７７６ヲ５０ｍ１ｆ）Ｌ培地
（１００μｙ／ａｔのジアミノピメリン酸と５０μｆ７
’ｒｌのチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣ１および０．１チグルコースを含む
）ｔこ接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がお
よそ０．３になるまで３７Ｃで振とう培養した。培養終
了後、培養液をＯＣで３０分間放置し、次ｔこ菌体を遠
心分離により集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（１
）Ｈ７，６）、０．１ Ｍ ＮａＣ１ｓ ５ ｍＭ ’
ＭｇＣｌ２．１０ｍＭＲｂＣ１の溶液２５ｍ１で２回洗
浄した。 得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ
７，６）、０．２５ Ｍ ＫＣＩ’、 ５ ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ、、０．１ Ｍ ＣａＣｌ、１および１’ＯｍＭ
ＲｂＣｌを含む溶液２０ｍ１に懸濁し、ｏｒｅこて２５
分間静置後、遠心分離により菌体な集めた。上記と同じ
溶液１ ｗｔｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁
液の０．２＋＋＋／に上記組換えＤＮＡを入れ、ＯＣで
４０分間静置した。さらｔこ、３７１１”で２分間保っ
たのち、再びＯＣで６０分間静置した。次？こ、これｒ
こ前記り培地０．７−を加えて３７Ｃで３０分間振とう
培養した。この培４液ｏ、ｘｍｅを１００μｙ／ｍｅジ
アミノピメリン酸、５０６ｆ／ａｔチミジンと１５ ｐ
ｔ／ｍｅテトラサイクリンを含むし培地の１．５％寒天
培地上ｒこ−面しこ塗抹し、３７Ｃにて２日間インキュ
ベートした。 （４−５） 上記において出現したコロニー４３２個
をそれぞれ２４コロニーを１集団とする】８集団の混合
体として１００ ｐｆ／ｍ１ｆ）ジアミノピメリン酸、
５ｏμｙ／ｌｌｌ１０チミジンと１０μｆ／ｒｎｌのテ
トラサイクリンを含むし培地２００ｍ／に接種し、３７
ｒで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコールを最
終濃度で１７０１ｔｆ／肩ｌになるようｔこ加えた新鮮
な上記し培地２００ｄを追加し、さらｒこ一晩振盪培養
する。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法
に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。、：ｌのＤＮＡ
を用いてＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法でインターロイキン−２ｃＤＮ
Ａをもつクローンをスクリーニングした。ここで用いた
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ −ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎ ａｓｓａｙは以下のようにして行なった。 精製したＤＮＡ２５μ２を制限酵素Ｈｉｎｄ■で切断し
、フェノール処理３回、フェノール−ｐ ロロホルム処
理１回およびりｐロホル入処理１回を行なってＤＮＡを
エタノール沈澱１．て８０％エタノールで洗浄したのち
回収し、これを８０ｔＩ）ホルムアミド溶液４σμｔに
溶解し、９０Ｃで５分間熱変性させた。その後、１０
Ｘ ＳＳＣ（１’、５ Ｍ ＮａＣｌ 、 ０．１５Ｍ
クエン酸３ナトリウム）で１．３ｍ１Ｖｒこ希釈した。 こｈをニトロセルロースフィルターに固定し、８０Ｃで
３時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムア
ミド、２０ｍＭビペス、ｐｉ−ｔ ６．５．０．７５
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．２％ＳＤＳおよ
び２５０μｆｍＲＮＡを含む溶液中で３７ｔＺ’、１８
時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡとインタ
ーロイキン−２ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。次
い−で、このフィルターを１０ｍＭビペスｐＨ６，ｓ、
０．１５ Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％％
ＳＤＳ溶液で６５Ｕで３回洗浄した後、さらＥ １
ｍＭ ビペス、１０ｍＭＨａＣＩ 溶液で３回洗浄し、
次いで０．５ｍ’ＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ溶液で９
５Ｃで１ｍ１ｎ処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡ
を溶出した。これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロー
ス力ラムにかけて回収した。この回収したｍＲＮＡを
アフリカンメガエルの卵母細胞に注入し、蛋白ｒこ翻訳
させ、インターロイキン−２活性を測定した。この結果
、１８集団の中の１集団ｔこ前述のトリチウム化チミジ
ンの取り込み危ンこよる活性検定法により４８単（Ｖｍ
ｅのインターロイキノ−２の活性が検出された。そこで
、さらにこの集団ｒこ属する２４コロニーを今度は単独
ｒこそれぞれ前述したようｔこ１００μｆ／ｍｅのジア
ミノピメリン酸、５０μり／／ＩｌｌのチミジンとｌＯ
μ？ ／ｍｌのテトラサイクリンを含むし培地２００ｍ
１に接種し、３７Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラム
フェニフールを最終濃度で１７０μｆ ／ｍｌ ｔこな
るようｔこ加えた新鮮な上記し一培地２００ｍ／を追加
シ、すらンこ一夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを増幅
しておいて常法１こ従ってプラスミドＤＮＡ を精製
した。そして各Ｄ’ＮＡ５μ２をＨｉｎｄ ■で切断
した後、前回と同様にニトロセルロースフィルターに固
定してインターロイキン−２＋ｎＲＮＡとハイブリダイ
ズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカ７メガエルの卵ｆ
Ｂ細胞ｔこ注入して蛋白ｒ−翻訳しインターロイキン−
２活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーに
インターロイキン−２クローンが存在するか検定したと
ころｌコロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ１
プラスミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを
卵母細胞に翻訳させたものにインターロイキンー２活性
が見出され（表２）、本クローンがインターロイキン−
２ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア中コリχ１７
７６／３−１６ＡＪ１１９３−１６ＡＪ１１９９５（Ｆ
ＥＲであると同定された。即ちプラスミドｐａ−１６の
ｃＤＮＡはインターロイキン−２ｍＲＮＡ と特異的
ンこハイブリッドを形成するＤＮＡ （インターロイキ
ン−２遺伝子）をもつことが証明され゛た。 された。 次ｔこプラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡ の制限酵素切
断個所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢＲＬ社
）で１ケ所、ＢｓｔＮｌ（米国ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（Ｘｂａ ｉ切断個所の
上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡは約
６５０塩基対よりなり、１１−１２８のインターロイキ
ン−２ｍＲＮＡの一部ンこ対応するものとわかったので
、再び同様にして調製したヒトインターロイキン−２ｍ
ＲＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄｅｔ
ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋
ｖｏｌ、 ９ ＋１）２５５１（１９８１））ｒこよ
り前述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐ Ｂ
Ｒ：３’ ２２に挿入した。このプラスミドを用いて
Ｅ、 ｃｏｌｔχ１７７６を形質転換させ、約２０００
個の転換株のなかから、プラスミドｐａ−１ａのｃＤＮ
Ａ と同じ配列を持っｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約
８５０塩基対のｃＤＮＡインサートを持つブラスミド、
ｐｌＬ２−５０Ａを持つ転換株（エシェリヒア・コリχ
１７７６／ＩＬ２−５０ ＡＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ
−ＢＰ２２６））を得た。 このｐＩＬ２−５０ＡのｃＤＮＡの制限酵素切断地図を
図−１に示す。 表−２ （イ） 対 照 Ｉ ＋１ プラスミ ドｐａ−１６のｃ Ｄ Ｎ Ａ ｔ
コハイブリダイズしたｍＲＮＡ 次に図−２ａ 、ｂに示すように、ＰＢＲ３２８プラス
ミドベクターｔこｐＫＣＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ＋ ｖｏｌ
７８＋Ａ３ １５２７−１６３１．１９８１）のＳＶ４
０ウイルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組
み込んだＰＣＢ−１ベクターを造成した。そしてプラス
ミドル３−１６−５０ＡクローンのプラスミドよりＰｓ
ｔｌで挿入された、ｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１ベ
クターのＰｓｔ ｌサイトに挿入した（プラスミドｐｃ
ＥＩＬ−２）。このときの挿入様式は図−２ｔこ示すよ
うにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流ニインタ
ーロイキンー２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＣ
が接続されているものである（図の１）。このベクター
をサル培養細胞のＣＯ３−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ＋
Ｙ。 Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２３ ｐ１７５−１８２（＋
９８１ ））に感染せしめた（ Ｍｅ Ｃｕｔｃｈａｎ
ｅｔ ａｌ Ｊ。 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ｖｏｌ、 ４
１ ｐ ３５１−３５７、（１９６Ｂ））。 すなわちＣＯ３−７細胞 ６ Ｘ １０’ ７ｍＭを５
俤のＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁し、この０．５ｍＭを
２４穴のヌンク培養プレートにまぎ、３７ｔｒで４時間
培養したのち０．１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテ
ートを含む１ｍＭ−トリス塩酸緩衝液１７．６μｔと２
Ｍ ＋７） ＣａＣ４ｇ液２．４ｆｉｌ及び２倍濃縮
ハンクス・バランスド生理食塩水（２ＸＨＢＳ ）（５
０ｍＭピペス、２８０ ｍＭ Ｍａｃｌ、１．５ ｍＭ
ＮａＪ（ＰＯ４・１２Ｈ，Ｏを含む、ｐＨ７，１０）
２０１１ｔの混合液４０μｔＦこ上記ベクター１μり
を溶解したものを添加する。３７ｔ？、４時間培養後、
培地を吸引除去し、ＰＢ３１ｍ／で洗浄し、更ｔｎ Ｐ
Ｂ Ｓ中２０％のグリセｑ−ルｏ、５ｒｒｅを添加し
、３分間室温に放置したのち、水液を吸引除去し、更ｔ
こ１ ｍｌ ＋７）Ｐ Ｂ Ｓで洗浄し、５チＦＢＳを
含むグルベツコの変形培地１ ｍｌ中にて３７ｒで培養
を続け、２４時間毎に培地５００ｍ／を新鮮培地と交換
する。 このよう？こして得られた培養液中のインターロイキン
−２活性を検討した。 培養」二清ｒこ出てくるインターロイキン−２活性を検
討した。対照としてベクタープラスミドｐＣＥ−１を用
いて同様の方法で実験を行ないインターロイキン−２活
性を調べた。 結果を表−３に示す。 表−３ 更ｔここのインターロイキン−２活性は、マウス抗ヒト
インターロイキン−２モノクロ一ナル抗体によって中和
され、インターロイキン−２活性は１ ｕ ／ ｍｅ以
下となった。
ヒト細胞以外の細胞よＦ）得たｒｎ ＲＮ Ａを用いて
本発明の遺伝子を得ることもできる。従って、要は、イ
ンターロイキン−２活性をもつポリペプチドをコードす
るＤＮＡであれば本発明の遺伝子に含ｆれる０ １）ＮＡ （Ｉ） ＡＴＧ ＴＡＣＡＧＧ ＡＴＧ ｃＡＡ ｃＴｃ ｃＴ
Ｇ ＴｃＴＴＧＣＡＴＴ ＧＣＡ ’ＣＴ、Ａ ＡＧ−
ｒ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＴ’ＴＧＴＣＡＣＡ ＡＡＣＡ
ＧＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ′ＡＣＴ ＴＣＡＡＧＴ Ｔ
ＣＴ ＡＣＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＡ Ｃ
ＡＧ Ｃ１−Ａ、ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ｃＡＴ
ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴＴＴＡ ＣＡ、Ｇ
ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＧＡ
’ＡＴＴＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＣＡＡＧ ＡＡＴ ｃ
ｃｃ ＡＡＡ ｃＴｃＡＣＣＡＧＧ ＡＴＧ ＣＴ
’ＣＡＣＡ ＴＴＴ ＡＡＧ ＴＴＴｉＡｃ
ＡＴＧ ＣＣＣＡＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣＡＣＡ
ＧＡＡＣＴＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＣＴＴ Ｃ
ＡＧ 王ＧＴ ｃＴＡ ＧＡＡＧＡＡ ＧＡＡ
ｃ−ｒｃ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＴＧ ｂＡＧ
ＧＡＡＧＴＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣ
Ｔ 、ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴ
ＴＡ ＡＧＡ ＣＣＣＡＧＧ ＣＡＣ丁−ｒＡ ＡＴ
ＣＡＧＣＡＡＴ ＡＴＣＡＡＣＧＴＡ ＡＴＡＧＴ
’Ｔ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＡ ＡＡＧ Ｇ
ＧＡ ＴＣＣＧＡＡＡＣＡ ＡＣＡ ＴＴＣＡＴ
Ｇ ＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＣＴＧＡ’Ｔ
ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＣＡ ＡＣＣＡＴＴ
ＧＴＡ ＧＡＡＴＴＴ ＣＴＧ ＡＡＣＡＧＡ
ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＣＣ，ＴＴＴＴＧＴ ＣＡＡ
ＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＡＣ
Ｔ ［）ＮＡ（、ｎ） ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＣＴ ＴＣＡ ＡＧＴ
ＴＣＴ ＡＣＡ ＡＡＧＡＡＡ ＡＣＡ ＣＡ
Ｇ ＣＴＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡ・Ｇ Ｃ
ＡＴＴｌ”Ａ ＣＴＧ ’ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＴ
Ａ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴＴＴＧ ＡＡ’Ｔ
ＧＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡ、
、ＣＡＡＧＡＡＴ ＣＣＣＡＡＡ ＣＴＣＡＣＣＡ
ＧＧ ＡＴＧ ＣＴＣＡＣＡ ’１−ＴＴ Ａ
ＡＧ １−ＴＴ ＴＡＣＡＴＧ ＣＣＣＡＡＧ△
ＡＧ ＧＣＣＡＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ
ＣＡＴ ＣＴＴＣＡＧ ＴＧＴ Ｃ”ｒＡ
ＧＡＡ ＧＡＡ’ ＧＡＡ ＣＴＣＡＡＴＣＣＴ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＧＴＧ ｃｒＡ
ＡＡＴ ＴＴＡＧＣｒ ＣＡＡ ＡＧＣＡＡＡ Ａ
ＡＣＴＴＴ ＣＡＣＴＴＡＡＧＡ ＣＣＣＡＧＧ
ＧＡＣＴｒＡ ＡＴＣＡＧＣＡＡＴΔＴＣＡＡＣＧＴ
Ａ ＡＴＡ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＡ、Ａ Ｃ
ＴＡＡΔａ ＧＧＡ ｒｃｃ ＧＡＡ ＡＣＡ
ＡＣＡ １−ＴＣＡＴＧｌＧｒ ＧＡＡ ＴＡＴ Ｇ
ＣＴ ＧＡＩ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＣＡΔＣＣＡＴＴ
ＧＴＡ ＣＡＡ １−ＴＴ ＣＴＧ ＡＡＣＡ
ＧＡｒＧＧ Ａ’ＴＴ ＡｃＣＴＴＴ ＴＧＴ
ＣＡＡ ＡＧＣＡＴＣ△１’Ｃ’１−ＣＡ ＡＣ
Ａ ＣＴＡ ＡＣＴアＳノ酸曲乙列（１） Ｍｅｔ ｖｙｒ ＡｒｇＭｅｔ ＧＩ Ｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ’Ｉ Ｉｅ
Ａｌａ １−ｅｕ ３ｅｒ １−ｅｕ Ｖａｌ
１−ｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ ＡＳＮ ３ｅ
ｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｔ１１ｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔｊｌｒ Ｌｙｓ ’Ｌｙｓ Ｔ
ｈｒＧＩ Ｎ Ｌｅｕ ＧＩ Ｎ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌ ｅｕ
ＡｓｐＬｅｕ ＧＩ Ｎ Ｍｅｔ ｌｌｅ １
−ｅｕ ＡＳＮ ＧＩＶ Ｐｌ＋ｅ ＡＳＮ
ＨｙｒＩＪｓ ＡＳ Ｎ ＰｒＯＬＪＳ Ｌｅ
Ｕ Ｔｈｒ Ａｒ（ｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｔ
ｈｒ、Ｐｂｅ Ｌ ｙｓ Ｐｈｅ 丁ｙｒ Ｍ
ｅｔ ｐｒｏ １−ｙｓ ｌｙｓ Ａｌａ
７＋１ｒ （３１０ＬｅＬＩ Ｌｙｓ １−（ｉ
ｓ １−ｅｕ ＧＩ Ｎ ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ ＧＩＵ Ｑｌｕｌ−ｅｕ Ｌｙｓ ｐ
ｒｏ ｌｅｕ Ｑｌｕ Ｑｌｕ Ｖａｌ １
−ｅｕ ＡＳＮ １−ｅｕＡｌａ ＧＩ Ｎ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓ’Ｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ａｒｑ Ｐｒ。 ＡｒｇＡｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓ
Ｎ Ｉｌｅ ＡｓＮ Ｖａｌ ｌ１ｅＶａｔ
ＬｅＬＩ Ｑｌｕ １−ｅｕ ｃｙｓ ａｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅＭｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ 、Ｔｈｒ
ｌ１ｅＶａｔ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １−ａｕ Ａ
ＳＮ Ａｒａ Ｔｒｐ ｌｌｅ Ｔｈｒ ｐ
ｈｅｃｙｓ ＧＩ Ｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｉｌ
ｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ｌｅｕ Ｔｈｒアミノ西
変何乙列（ＩＬ） Ａｌａ Ｐｒｏ １−１１ｒ Ｓｃｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｔ１１ｒ Ｌｙｓ Ｌ ｙｓ Ｔ
ｈｒＧＩ Ｎ Ｌｅｕ ＧＩ Ｎ ｌｅｕ Ｑ
ｌｕ Ｈｉｓ １−ｅｕ １−ｃｕ、ｌｅｕ
ＡＳＩ）Ｌｅｕ’ＧＩ Ｎ Ｍｅｔ Ｉｌｅ ｌ
ｅｕ Ａｓ Ｎ Ｇｌｙ ｐＨｅ ＡＳ ＮＴ
ｙｒＩＪｓ Ａｓ Ｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ ’Ｔ−ｈｒ Ａｒｏ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
ＴｈｒＰｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ７ｙｒ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ 月１ｒ
Ｇｌｕｌｅｕ ｌｙｓ １ｌｉｓ １−ｅｕ
（３１Ｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｑｌｕ ＧＩ
ＬＩ ＧｌｕＬｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ １−ｅ
ｕ Ｇｌｕ Ｑｌｕ Ｖａｔ ｌｅｕ ＡＳ
Ｎ １ｅｕＡｌａ ＧＩ Ｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ａｓ Ｎ ＰＩ）ｅ １−（ｉｓ １−ｅｕ
ＡｒｇＰｒ。 Ａｒ（ｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
ＡｓＮ ｌｉｅ ＡｓＮ Ｖａｌ ｌ１ｅＶ
ａｌ １−ｅｕ Ｑｌｕ １−ｅｕ ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ｌｈｒ
ＰｈｅＭｅｔ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａ
ｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｌａ １
−ｈｒ １ｌｅＶａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｃ Ｌｅ
ｕ ＡｓＮ ＡｒｇＴｒｐ Ｉｌｅ ｌ’ｈｒ
ＰｌｅａＣｙｓ ＱＩ Ｎ ３ｅｒ’ｌｌｅ
Ｉｌｅ ３ｅｒ 刊）ｒ ｌｅｕ １−ｈｒ
インターロイキン−２活性をもつポリペプチドをコード
しているＤＮＡは、ついで、自律り製できるベクターＤ
ＮＡＩこ組込んで真核生物細胞内１こ挿入してもよいが
、一旦例えばエシェリヒア・フリ内で自ｆ４を複製でき
るベクターに組込み、エシェリヒア・コリ内でＤＮＡを
増巾せしめた後、真核生物細胞内に挿入してもよい。 イスレの場合にもＤＮＡをベクターＤＮＡ に接続す
るンこは、例えばＤＮＡ両端を必要によりエキン又りレ
エースで処理し、それぞれ１こ適当なリンカ−ＤＮＡを
接続し、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複
数個重合せしめる。しかる後、これを、真核生物細胞内
で自律複製できるベクター又はＤＮＡを増１１］せしめ
るために用いられるエシェリヒア・コリ等の宿主細胞内
で自律複製できるべ′フタ−ｒこ組込む。組込む方法は
、ベクターを適当な制限酵素で切断し、必要により適当
なリンカ−またはアニーリング可能な組合せの塩基を複
数個重合せしめる。′このように加工した二重鎖ＤＮＡ
とベクターＤＮＡを混合し、 リガーゼな用いて接続せ
しめる。 得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主、即ち、真核生
物細胞又はＤＮＡの増＋ｉＪのためｔこ用いられる微生
物細胞内ｔこ挿入する。 真核生物細胞として、を推動物、酵ｔＵ等が含まれる。 具体的には、Ｙ、 Ｇｌｕｚｍａｎ＋ Ｃｅ１１＋
２３ ＋１７５−１８２（１９８１） に開示されて
いるところの、サル培養細胞ＣＶ−１のオリジン欠損変
異株（ｏｒｉｇｉｎ −ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａ
ｎｔ ）を５Ｖ−４０で形質転換したものでＴ抗原を表
現しているＣＯ８細胞、Ｏｎｏ Ｓｒ Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉ Ｔｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒ
ｃｈ、 １０． ９６７−９７７、’（１９
８２） ＃こ開示されているマウス細胞、インタ
ーフェロンの遺伝子発現の例がある。Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎ ｅｔ ａＬ＋Ｎａｔｕｒｅ、 ２９３．
７１７−７’２２．（＋９’８１）’ｒこ（−され
ている酵ｆｔｔの宿主−ベクター系等がある。 ＤＮＡを一旦増巾せしめるときは、宿主として、エシェ
リヒア・コリが使用されることが多いが、他の微生物細
胞であってもよい。エシェリヒア・つりが用いられると
きは、ベクターＤＮＡとじてはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５等が通常用いられるが、他のベクターであってもよ
い。 ベクターｒこｃＤＮＡを組込んだ組換えＤＮＡを用いて
宿主細胞を形質転換する方法としては、宿主が微生物で
ある場合には、主として対数増殖期？こある細胞を集め
てＣａＣ１ｇ処理して自然ンこＤＮＡを取込みやすい状
態にしてプラスミドを取込ませる方法が採用されており
、ＭｇＣ＋２あるいはＲｈ ＣＩ をさらに共存させる
ことｒこより形質転換の効率が一層増すことも知られて
いる。また、微生物細胞をスフェロプラストあるいはプ
ロトプラスト化してから形質転換させてもよい。 宿主が動物細胞である場合には、マイクロインジェクシ
ョン等の機械的方法、赤血球ゴースト、リポゾーム等に
包み込み挿入する方法、リゾホスファチジルコリン等の
薬剤で細胞を処理する方法、ウィルスベクターを使用す
る方法等がある。 形質転換株からインターロイキン−２遺伝子が組込まれ
ている株を選別する？こけ、以下のような方法がある。 （１） すなわちこの選別方法はプラス・マイナス法
と称されるもので、まずｃｏｎＡ ｒこよって刺激した
ジュルカット細胞よりｍにＮＡを抽出し一５ＤＧ遠心法
によってインターロイキン−２＋ｎ ＲＮ Ａを部分精
製したのち（はぼ１１〜１２ＳｍＲＮＡ）、このｍＲＮ
Ａを用いて３２ｐによりラベルした１本鎖ｃＤＮＡを合
成する。ついでｃ ＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡ
をアルカリ処理１こよって除いた後、このｃＤＮＡとｃ
ｏ、ｎＡで刺激していないジュルカット細胞より抽出し
た１１−１２８ ｍＲＮＡの部分精製ｍＲＮＡの過剰と
ハイブリダイズさせた。そしてこのｃｏｎＡ刺激してい
ないｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮＡとハ
イブリッドを形成したｃＤＮＡとをヒドロキシアパタイ
トカラム１こまって分画し、それぞれプローブＡおよび
プローブＢとする。 次Ｆこ、前もって形質転換株を全く同じようにそれぞれ
２枚のニトロセルロースフィルターに生育させておき、
アルカリ処理をしてそれぞれフィルターにＤＮＡを固定
しておく。そしてさきｒこ調製したプローブＡとプロー
ブＢを用いてそれぞれ別々ｔこフィルターにハイブリダ
イズさせた後、オートラジオグラフィーを行ない、プロ
ーブＡ１こはポジティブに反応する（プラス）がプロー
ブＢＦこけ弱く、もしくは全く反応しない（マイナス）
コロニーを検索する（ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉｅｔ ａｌ
、＋ Ｐａｏｃ、 Ｊｐｎ、 Ａｃａｄ、、 ｖｏｌ
５５ Ｂ 。 ４６４−４ａ９（＋９７９））。 （２） あるいは形質転換株、たとえば１０００〜１
０．０００クロ一ンヲ数士ないし数百のクローンの集団
ｅこ分け、集団毎に形負転換株を混合培養しく常法によ
って）、ベクターに接続されたＤＮＡを調製する。次ケ
こ、これらＤＮＡを熱変性等により単鎖ＤＮＡ ｒこし
てニトロセルロースフィルターに固定して、これらＤＮ
Ａ Ｆこ相補的な、前述したようなインターロイキン−
２ｍＲＮＡを含むヒ）Ｔ白血球細胞より調製し亮゛ｍＲ
ＮＡをハイブリダイズさせる。あるいはＤＮＡ を熱
変性させた後、先ｔこインターロイキン−２ｍＲＮＡを
含むｍＲＮＡをハイブリダイズさせた後ｔこ、ＤＮＡ−
ｍＲＮＡ ハイブリッドをニトロセルロースフィルタ
ーに固定スル方法モある。 次ｒこ、このフィルターを１ｍＭビペス、１０ｍＭ Ｎ
ａＣ１のような低塩溶液でよく洗滌した後、０．５ｍＭ
ＥｐＴＡ、０．１％５ＤＳＯような溶液で、例えば
９５ｃ、１分間程度の熱処理を行なってフィルターに吸
着したｍＲＮＡを溶出する。そして、これをオリゴｄＴ
−セルロースカラムｔこかけるなどの操作を行なってｍ
ＲＮＡを回収する。次ｒこ、この＋ｎ ＲＮ Ａをアフ
リカッメガエルの卵／Ｑ細胞に注入して蛋白に翻訳させ
てインターロイキン−２活性を測定する。あるいはウサ
ギ網状赤血球ないしは小麦胚芽のｉｎ ｖｉｔｒ。 翻訳系で蛋白ｒこ翻訳させた後、インターロイギン−２
抗体でインターロイキン−２を検定する。 かくしてインターロイキン−２活性の検出された集団が
見出されれば、この集団の混合クロー、ンの数を細分化
してより小さな集団に分け、前述の方法を繰返して最終
的には単数のクローンに細分化し、インターロイキン−
２ＤＮＡをには、インターロイキン−２遺伝子が組込ま
れている組換え体微生物は常法ｔこまって培養すればよ
い。かくしてインターロイキン−２の遺伝子を有する組
換え体微生物菌体内にインターロイキン−２の遺伝子が
増１１Ｊ、生産され、インターロイキン−５２遺伝子を
大量？こ調製することができる。 増１１】されたＤＮＡはそのまま真核生物細胞内に挿入
してもよいが、通常使用する真核生物ンこ適したベクタ
ーに組込んだ後、真核生物細胞にこ挿入する。以下ｃｃ
ｏｓ細胞な真核生物を用い゛るときの騙す。 す各由塙円インターｐイキンー２ ＤＮＡをもつエンエ
リヒア・コリのプラスミドよりＰａｔ １で挿入された
ｃＤＮＡを切り出し、ＰＣＢ−１ぺ／ｌ−＋７）Ｐｓｔ
１ ＋イトｔこ挿入する。このＰＣＢ−１ベクター
はｐＢＲ３２８プラスミドベクターＹｐＫＣＲベクター
のＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のプロモーターを含む
領域を組み込んで造成する。ＰＣＢ−１ベクターのＰｓ
ｔｌサイトへの挿入ジョンコドンＡＴＧが接続されてい
るものである。このベクターをサル培養細胞のＣ０８−
７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ＋ Ｙ、 Ｃｅ１ｌ＋ ｖｏｌ
２３＋ Ｐ１７５−１８２． ｔ９ｓｔ）’ｒこ
感染させ、この感染ＣＯ３−７細胞を通常の呻ａ動物細
胞培養培地他の噛ｉＬ動物細胞の場合も同様Ｐこ各細胞
ｒこ適したベクターを用い、本ベクターＶこ上述のエシ
ェリヒア−コリより切り出之れたｃＤＮＡを挿入し感染
させて同様に培養すればよい。 インターロイキン−２活性を持つポリペプチドをコード
しているＤＮＡを有する真核生物細胞を培養する方法は
通常の方法でよい。例えば必要によりビタミン、アミノ
酸等の有機微量栄養素を含む培地を用い、好ましくは２
７ないし３７Ｃの範囲の適当な温度、ｐＨ４ないし７の
範囲の適当なｐＨに調節しつつ、好気的条件下で培養す
る。 次ｔこ、培養物からインター−イキンー２活性を持つポ
リペプチドを単離、精製する。この操作も当該技術Ｖこ
おいて知られている手段Ｖこより行なえばよく、たとえ
ば塩析、濃縮、真空透析、ゲル間過クロマトグラフィー
、イオン交換クロマトグラフィー、調製用等電点電気泳
動、ゲル電気泳動法、高速液クロマトグラフイー等の種
々の方法を単独ｔこ、あるいは適宜組合せて用いて行な
うことができる。 次ｔこ、本発明を実施例により詳しく説明する。 実施例１ ｆｌｌ インターロイキン−２生産能を有するジェル
カット１１１細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ８１２９ ）゛
をＩ Ｘ １０’個／−の細胞密度で無血清合成培地Ｒ
ＩＴＣ５５−９１，０００ｍ／’ｒこ懸濁し、ファルコ
ン社製回転培養瓶ｔこ入れ、３７Ｃで４日間培養し、遠
沈操作により細胞を集めた。この細胞を４Ｘ１０’個／
Ｎｔｌの細胞密度ｔごて上述の培地中に懸濁し、ここ
にＣｏＤＡ２５μ２／肩ｌを添加し、」二記ファルコン
社製回転培養瓶（４本）に１、 ＯＯＯ肩１で張り込み
６時間回転培養した。 （２） このようにして得たＣｏｎＡ ２５ ｐｆ／
ｍｌで６時間誘導したジュルカット細胞（１，２Ｘ１０
” 細胞）をＰＢβ溶液８００ ｍｌに懸濁し、細胞を
遠心ｒこよって２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤
であるＲ４ｂｏｎｏｃｌｅｏｓｉｄｅｓ −Ｖａｎａｄ
ｙｌＣｏｍｐｌｅｘ （１０ｍＭ ）を含んだＲ３Ｂ溶
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、 ｐＨ７，５、１
０ｍＭＮａＣ１、１，５ｍＭ ＭｇＣ１，−、） ８
００ ｍｌＫ懸濁した。 次に、ＮＰ−４０を０．０５ ％ ｒこなるように加え
−た後、ゆるやかに攪拌後３．００ Ｏｒｐｍで５分遠
心して核を除去し、その上清液ＥＳＤＳ（０，５％）と
ＥＤＴＡ（５ｍＭ ） を加えた後、ただちｔこフェ
ノールを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３回フ
ェノール抽出を繰返してから２容エタノールでＲＮＡを
沈澱し、遠心でこの沈澱を集め１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＬ 、 ｐＨ７，５で溶解した。このようにして
ジュルヵット細胞から得られたＲＮＡ量は１９６＊ｙで
あった。 次に、このＲＮＡ量１らｍＲＮＡを取得するため′ｔこ
オリゴ（ｄＴ ）−セルロース（ｐ、 Ｌ。 Ｂ１ｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ＋ ’ｒ３’ｌ）ｅ ７
）を用い、カラムクロマトグラフィーを行なった。吸着
は２０ｍＭは緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ
、 ｐＨ７，５。 ０．５ Ｍ ＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）で洗浄
後、水と１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ （ｐＨ７，
５）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより行なった。 この結果、溶出されたｍＲＮＡ量は３．６ｍ１７であっ
た。 さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４１１ｇ）をＳＤＧ
遠心（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ 、 ｐＨ７，
６。 １ ｍＭ ＥＤＴＡ ！ ０．２ Ｍ ＮａＣ１を含む
５〜２５チシミ糖密度勾配。Ｈｉｔａｃｈｊ ＲＰＳ
２８ ｐ−タ−で２６．００Ｏｒｐｍ、２４時間、４
Ｃ）して分画し、１１−１２ＳのｍＲＮＡ画分を分画番
号１２．１３．１４としてそれぞれ５９μ２゜４６ｐ？
、６０ｐ？得た。 （３） ここｔこ得られた分画番号１３のｍＲＮＡヲ
ｆｌｆｉ出の検定法に従い、アフリカツメガニＩしの卵
Ｉｔ） ４＋１胞Ｅ１個当り５０ ｎＷをマイクロイン
ジエクンヨン法により注入して得られた卵Ｉｎ ！１１
１抱培養上清をインターロイキン−２の活性検定１こ供
したところ、次表に示すトリチウム化チミジンの取り込
みおよび活性化Ｔリン／′＋球数の増加力ｔみられ、こ
れら分画のｍＲＮＡは本発明のヒトインターロイキン−
２ｍＲＮＡ を含有すること力′−山ト明された。 表 −１ （イ） ※ 各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み量（ｃ
ｐｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキン
−２（ｌＯ単位／ ｍｌ ）と比較して求めた。 （４） 次ｒこ、ここで得られたインターロイキン−２
ｍＲＮＡを含む１１〜１２ Ｓ ｍＲＮＡ分画１３より
ｃＤＮＡをインビトロで合成し、プラスミドベクターＰ
ＢＲ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、これをエシェリヒ
ア争フリにトランスホームしてインターロイキン−２ｃ
ＤＮＡクローンを持つ菌体を以下の方法で選択した。 （４−１） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ緩衝液（
ｐＨ７，５）、３０ ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、 ０．５
ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ１ ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ（
ｄＣＴＰは＄２ｐラベルしたものを含む）、０．７５μ
２オリゴ（ｄＴ）＋。、１ＯμｆｍＲＮＡおよび１５ユ
ニツ）ＡＭＶ逆転写酵素（Ｊ、 Ｗ、 Ｂｅａｒｄ ）
を混ぜ、４１Ｃに９０分間保った。反応終了後、フェノ
ール処理１回を行ない、エタノール沈澱としてＤＮＡを
回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ７，５溶液に溶解した。これｔこより約２．５μ
２の１水銀ｃＩ）ＮＡが合成された。この溶液からｍＲ
ＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶液を加えて０．３８ Ｎ
ＮａＯＨとし室（Ｋｔ＝て１５時間置き、次いで溶液
をｌ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ 、 ｐＨ７，５の等量で
中和し「セファデックスＧ−５ＯＪ力うムンこ通した。 これ」こより１．８μ２のｃＡＴＰｌｄＧＴＰ、、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ （ｄＣＴＰ −は３Ｈでラベルさ
れたものを含む）、１．８μ２１ 水銀ｃ Ｄ Ｎ Ａ
Ｘ ８ユニツトポリメレース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
） Ｉ （米国ＢＲＬ製）を混ぜ、１５ｎで１５時間
反応を行なった。反応終了後、フェノール処理１回、ク
ロロホルム処理１回を行ない、エタノール沈澱としてＤ
ＮＡを回収した。この反応により１．１Ｏμｆの二重鎖
ｃＤＮＡを得た。 次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）、０．
２ Ｍ ＮａＣｌ 、 １ ｍＭ ＺｎＣｌ、、１
．１０ ｐｔ二重釦ｃＤＮＡを混ぜて３７ｃで２０分間
インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌクレアー
ゼＳ１（玉共■製）全加工、さらｒ−１５分間インキュ
ベートした。反応終了後、フェノール処理２回行ない、
［セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通し、０．５５μ
２の二重鎖ｃＤＮＡを回収した。 （４−３） Ｏ，’１４Ｍカコジル酸カリウム、３０
ｍＭ）リス塩基、０．１ ｍＭ ＤＴＴ ５１ｍＭ
ＣｏＣ１，、０，６４ｍＭ ”Ｐ −ｄＣＴＰ（Ｓｐｃ
。 ａｃｔ、 ２．７ Ｘ １０’ ｃｐｍ／ ｎｍｏｌ
）、 ０．５５μＶ二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツト
のターミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７
Ｃで７分間インキュベートし、反応終了後、フェノール
処理１回を行ない、［セファデックスＧ−５ＯＪカラム
に通しエタノール沈澱としてＤＮＡ ０．５０ ｐｆを
回収したところ約５０個のｄＣＭＰが両３′末端に付加
された。 ＰＢＲ３２２ＤＮＡ １０ｐ？を制限酵素Ｐｓｔ■で
切断したのち、前述の二重鎖ｃＤＮＡｔこｄＣＭＰ鎖を
付加したのと全く同じ条件でｄＣＴＰの代りにｄＧＴＰ
を用いて両３１末端にｄＣＭＰ鎖を付加した。かくして
約５０個のｄＧＭＰが両３“末端ｔこ付加された。 （４−４） ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７
，５）、０．１ Ｍ ＮａＣ１、５ｍＭ ＥＤＴＡ、
０．０５ ｐｆのｄＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２２，
０，０１μ２のｄＣＭＰが付加されたｃＤＮＡをまず６
５Ｃで２分間、次いで４６ｒで１２０分間、さらｔこ３
′７Ｃで６０分間、そして室温で６０分間保持した。 エシェリヒアΦコリχ１’７７６ヲ５０ｍ１ｆ）Ｌ培地
（１００μｙ／ａｔのジアミノピメリン酸と５０μｆ７
’ｒｌのチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣ１および０．１チグルコースを含む
）ｔこ接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がお
よそ０．３になるまで３７Ｃで振とう培養した。培養終
了後、培養液をＯＣで３０分間放置し、次ｔこ菌体を遠
心分離により集め、５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１（１
）Ｈ７，６）、０．１ Ｍ ＮａＣ１ｓ ５ ｍＭ ’
ＭｇＣｌ２．１０ｍＭＲｂＣ１の溶液２５ｍ１で２回洗
浄した。 得られた菌体を５ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ （ｐＨ
７，６）、０．２５ Ｍ ＫＣＩ’、 ５ ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ、、０．１ Ｍ ＣａＣｌ、１および１’ＯｍＭ
ＲｂＣｌを含む溶液２０ｍ１に懸濁し、ｏｒｅこて２５
分間静置後、遠心分離により菌体な集めた。上記と同じ
溶液１ ｗｔｌに菌体を再び懸濁し、得られた菌体懸濁
液の０．２＋＋＋／に上記組換えＤＮＡを入れ、ＯＣで
４０分間静置した。さらｔこ、３７１１”で２分間保っ
たのち、再びＯＣで６０分間静置した。次？こ、これｒ
こ前記り培地０．７−を加えて３７Ｃで３０分間振とう
培養した。この培４液ｏ、ｘｍｅを１００μｙ／ｍｅジ
アミノピメリン酸、５０６ｆ／ａｔチミジンと１５ ｐ
ｔ／ｍｅテトラサイクリンを含むし培地の１．５％寒天
培地上ｒこ−面しこ塗抹し、３７Ｃにて２日間インキュ
ベートした。 （４−５） 上記において出現したコロニー４３２個
をそれぞれ２４コロニーを１集団とする】８集団の混合
体として１００ ｐｆ／ｍ１ｆ）ジアミノピメリン酸、
５ｏμｙ／ｌｌｌ１０チミジンと１０μｆ／ｒｎｌのテ
トラサイクリンを含むし培地２００ｍ／に接種し、３７
ｒで５〜７時間振盪培養後、クロラムフェニコールを最
終濃度で１７０１ｔｆ／肩ｌになるようｔこ加えた新鮮
な上記し培地２００ｄを追加し、さらｒこ一晩振盪培養
する。こうしてプラスミドＤＮＡを増幅しておいて常法
に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。、：ｌのＤＮＡ
を用いてＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ ａｓｓａｙ法でインターロイキン−２ｃＤＮ
Ａをもつクローンをスクリーニングした。ここで用いた
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ −ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎ ａｓｓａｙは以下のようにして行なった。 精製したＤＮＡ２５μ２を制限酵素Ｈｉｎｄ■で切断し
、フェノール処理３回、フェノール−ｐ ロロホルム処
理１回およびりｐロホル入処理１回を行なってＤＮＡを
エタノール沈澱１．て８０％エタノールで洗浄したのち
回収し、これを８０ｔＩ）ホルムアミド溶液４σμｔに
溶解し、９０Ｃで５分間熱変性させた。その後、１０
Ｘ ＳＳＣ（１’、５ Ｍ ＮａＣｌ 、 ０．１５Ｍ
クエン酸３ナトリウム）で１．３ｍ１Ｖｒこ希釈した。 こｈをニトロセルロースフィルターに固定し、８０Ｃで
３時間加熱乾燥した。このフィルターを５０％ホルムア
ミド、２０ｍＭビペス、ｐｉ−ｔ ６．５．０．７５
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．２％ＳＤＳおよ
び２５０μｆｍＲＮＡを含む溶液中で３７ｔＺ’、１８
時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡとインタ
ーロイキン−２ｍＲＮＡとをハイブリダイズさせた。次
い−で、このフィルターを１０ｍＭビペスｐＨ６，ｓ、
０．１５ Ｍ ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％％
ＳＤＳ溶液で６５Ｕで３回洗浄した後、さらＥ １
ｍＭ ビペス、１０ｍＭＨａＣＩ 溶液で３回洗浄し、
次いで０．５ｍ’ＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ溶液で９
５Ｃで１ｍ１ｎ処理してフィルターに吸着したｍＲＮＡ
を溶出した。これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロー
ス力ラムにかけて回収した。この回収したｍＲＮＡを
アフリカンメガエルの卵母細胞に注入し、蛋白ｒこ翻訳
させ、インターロイキン−２活性を測定した。この結果
、１８集団の中の１集団ｔこ前述のトリチウム化チミジ
ンの取り込み危ンこよる活性検定法により４８単（Ｖｍ
ｅのインターロイキノ−２の活性が検出された。そこで
、さらにこの集団ｒこ属する２４コロニーを今度は単独
ｒこそれぞれ前述したようｔこ１００μｆ／ｍｅのジア
ミノピメリン酸、５０μり／／ＩｌｌのチミジンとｌＯ
μ？ ／ｍｌのテトラサイクリンを含むし培地２００ｍ
１に接種し、３７Ｃで５〜７時間振盪培養後、クロラム
フェニフールを最終濃度で１７０μｆ ／ｍｌ ｔこな
るようｔこ加えた新鮮な上記し一培地２００ｍ／を追加
シ、すらンこ一夜振盪培養してプラスミドＤＮＡを増幅
しておいて常法１こ従ってプラスミドＤＮＡ を精製
した。そして各Ｄ’ＮＡ５μ２をＨｉｎｄ ■で切断
した後、前回と同様にニトロセルロースフィルターに固
定してインターロイキン−２＋ｎＲＮＡとハイブリダイ
ズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカ７メガエルの卵ｆ
Ｂ細胞ｔこ注入して蛋白ｒ−翻訳しインターロイキン−
２活性を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーに
インターロイキン−２クローンが存在するか検定したと
ころｌコロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ１
プラスミドｐ３−１６にハイブリダイズするｍＲＮＡを
卵母細胞に翻訳させたものにインターロイキンー２活性
が見出され（表２）、本クローンがインターロイキン−
２ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア中コリχ１７
７６／３−１６ＡＪ１１９３−１６ＡＪ１１９９５（Ｆ
ＥＲであると同定された。即ちプラスミドｐａ−１６の
ｃＤＮＡはインターロイキン−２ｍＲＮＡ と特異的
ンこハイブリッドを形成するＤＮＡ （インターロイキ
ン−２遺伝子）をもつことが証明され゛た。 された。 次ｔこプラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡ の制限酵素切
断個所を検討したところ、Ｘｂａｌ （米国ＢＲＬ社
）で１ケ所、ＢｓｔＮｌ（米国ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏ Ｌａｂ、社）で２ケ所（Ｘｂａ ｉ切断個所の
上流及び下流）切断された。しかし、このｃＤＮＡは約
６５０塩基対よりなり、１１−１２８のインターロイキ
ン−２ｍＲＮＡの一部ンこ対応するものとわかったので
、再び同様にして調製したヒトインターロイキン−２ｍ
ＲＮＡを鋳型にしてＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄｅｔ
ａｌ、 Ｎｕｃｌｅｉｉ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、＋
ｖｏｌ、 ９ ＋１）２５５１（１９８１））ｒこよ
り前述同様にしてｃＤＮＡを合成し、プラスミドｐ Ｂ
Ｒ：３’ ２２に挿入した。このプラスミドを用いて
Ｅ、 ｃｏｌｔχ１７７６を形質転換させ、約２０００
個の転換株のなかから、プラスミドｐａ−１ａのｃＤＮ
Ａ と同じ配列を持っｃＤＮＡクローンをＧｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓの方法を用いて選別し、約
８５０塩基対のｃＤＮＡインサートを持つブラスミド、
ｐｌＬ２−５０Ａを持つ転換株（エシェリヒア・コリχ
１７７６／ＩＬ２−５０ ＡＡＪ１１９９６（ＦＥＲＭ
−ＢＰ２２６））を得た。 このｐＩＬ２−５０ＡのｃＤＮＡの制限酵素切断地図を
図−１に示す。 表−２ （イ） 対 照 Ｉ ＋１ プラスミ ドｐａ−１６のｃ Ｄ Ｎ Ａ ｔ
コハイブリダイズしたｍＲＮＡ 次に図−２ａ 、ｂに示すように、ＰＢＲ３２８プラス
ミドベクターｔこｐＫＣＲベクター（Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ＋ ｖｏｌ
７８＋Ａ３ １５２７−１６３１．１９８１）のＳＶ４
０ウイルスの初期遺伝子のプロモーターを含む領域を組
み込んだＰＣＢ−１ベクターを造成した。そしてプラス
ミドル３−１６−５０ＡクローンのプラスミドよりＰｓ
ｔｌで挿入された、ｃＤＮＡを切り出し、ｐＣＥ−１ベ
クターのＰｓｔ ｌサイトに挿入した（プラスミドｐｃ
ＥＩＬ−２）。このときの挿入様式は図−２ｔこ示すよ
うにＳＶ４０初期遺伝子のプロモーターの下流ニインタ
ーロイキンー２遺伝子のイニシエイションコドンＡＴＣ
が接続されているものである（図の１）。このベクター
をサル培養細胞のＣＯ３−７細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ＋
Ｙ。 Ｃｅ１ｌ ｖｏｌ、 ２３ ｐ１７５−１８２（＋
９８１ ））に感染せしめた（ Ｍｅ Ｃｕｔｃｈａｎ
ｅｔ ａｌ Ｊ。 Ｎａｔｌ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、 ｖｏｌ、 ４
１ ｐ ３５１−３５７、（１９６Ｂ））。 すなわちＣＯ３−７細胞 ６ Ｘ １０’ ７ｍＭを５
俤のＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁し、この０．５ｍＭを
２４穴のヌンク培養プレートにまぎ、３７ｔｒで４時間
培養したのち０．１ｍＭエチレンジアミンテトラアセテ
ートを含む１ｍＭ−トリス塩酸緩衝液１７．６μｔと２
Ｍ ＋７） ＣａＣ４ｇ液２．４ｆｉｌ及び２倍濃縮
ハンクス・バランスド生理食塩水（２ＸＨＢＳ ）（５
０ｍＭピペス、２８０ ｍＭ Ｍａｃｌ、１．５ ｍＭ
ＮａＪ（ＰＯ４・１２Ｈ，Ｏを含む、ｐＨ７，１０）
２０１１ｔの混合液４０μｔＦこ上記ベクター１μり
を溶解したものを添加する。３７ｔ？、４時間培養後、
培地を吸引除去し、ＰＢ３１ｍ／で洗浄し、更ｔｎ Ｐ
Ｂ Ｓ中２０％のグリセｑ−ルｏ、５ｒｒｅを添加し
、３分間室温に放置したのち、水液を吸引除去し、更ｔ
こ１ ｍｌ ＋７）Ｐ Ｂ Ｓで洗浄し、５チＦＢＳを
含むグルベツコの変形培地１ ｍｌ中にて３７ｒで培養
を続け、２４時間毎に培地５００ｍ／を新鮮培地と交換
する。 このよう？こして得られた培養液中のインターロイキン
−２活性を検討した。 培養」二清ｒこ出てくるインターロイキン−２活性を検
討した。対照としてベクタープラスミドｐＣＥ−１を用
いて同様の方法で実験を行ないインターロイキン−２活
性を調べた。 結果を表−３に示す。 表−３ 更ｔここのインターロイキン−２活性は、マウス抗ヒト
インターロイキン−２モノクロ一ナル抗体によって中和
され、インターロイキン−２活性は１ ｕ ／ ｍｅ以
下となった。
図−１はインターロイキン−２活性を持つポリペプチド
をコードしうる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐｃＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 団−２Ｌａ） 図−２（ｂ） 〉 手続補正書（方式） 昭和５８年４月１３日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、 事件の表示 特願昭５７−２３０５７１ 、発明の名称 インターロイキン−２の製造方法 ＆ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 癌研 究 会 （ｏ ｏ ６）味の素株式会社 ４、代理人 ＆ 補正命令の日付 昭和５８年３月９日 昭和５８年３ 月２９日（発送日）
をコードしうる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２は、ｐｃＥＩＬ−２の造成経過の説明図である。 団−２Ｌａ） 図−２（ｂ） 〉 手続補正書（方式） 昭和５８年４月１３日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、 事件の表示 特願昭５７−２３０５７１ 、発明の名称 インターロイキン−２の製造方法 ＆ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 癌研 究 会 （ｏ ｏ ６）味の素株式会社 ４、代理人 ＆ 補正命令の日付 昭和５８年３月９日 昭和５８年３ 月２９日（発送日）
Claims (8)
- （１）インターロイキン−２活性を持つポリペプグ・ド
をコードしている遺伝子が挿入されている真核生物細胞
を培養することを特徴とするインターロイキン−２の製
造法。 - （２） インターロイキン−２がヒトインターロイキ
ン−２である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （３） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドをコードしている遺伝子がインターロイキン−２？こ
対応し、ショ糖密度勾配遠心法による分画Ｖこより１１
〜１２Ｓ画分として得られ、ヒトリンパ球由来細胞より
分離されるメンセンジーヤーＲＮＡより調製されたＤＮ
Ａである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （４） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドをコードしている遺伝子が、その鎖中Ｖこ制限酵素Ｂ
ｓｔＮ ｌ、 Ｘｂａ ＩおよびＢｓｔＮ １で切断
される個所がこの順序で配置されている部分を含むもの
である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （５） インターロイキン−２活性を持つポリペプチ
ドをコードしている←拍弁宍彷畿伽剰琥倉ν莢廻陰字賽
考遺伝子ｙ 下記Ｄ Ｎ Ａ （１）の塩基配列その鎖中しこ含むも
のである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （６） インターロイキン−２活性をもつポリペプチ
ドをフードしている遺伝子力ゞ 下記ＤＮ Ａ’（Ｉｆ）の塩基配列をその鎖中に含むも
のである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - （７） インターロイキン−２活性をもつポリペプチ
ドが下記のアミノ酸配列（１）を有するものである特許
請求の範囲第１項記載の製造法。 - （８） インタ、−ロイキン−２活性をもつポリペプ
チドが、下記のアミノ酸配列（１１）を有するものであ
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。 明細書の浄書（内容に変更なし） ＤＮＡ（ｉ） Ａ’［’Ｇ ＴＡＯＡＧＧ Ａ’ｌ’Ｇ ＯＡＡ
ＣＴＣＯＴＧ ’［’ＯＴ’Ｉ’ＧＯＡＴＴ
ＧＯＡ Ｃ’ｌ”Ａ ＡＧＴ ＯＴＴ ＧＯＡ
０ＴＴＧ’ｌ’ＯＡＯＡ ＡＡＣＡＧＴ ＧＯ
Ａ ＯＯＴ ＡＣＴ ＴＧＴＡＡＧＴ ＴＧＴ
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ＧＧＡ ＡＴＴＡＡＴ ＡＡＴ ＴＡＯＡＡ
Ｇ ＡＡＴ Ｃｏｏ ＡＡＡ ０ＴＯＡＯＯＡ
ＧＧ ＡＴＧ ＯＴＯムＯＡ ＴＴＴ ＡＡＧ
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Ｇ ＧＯ（ｊ ＡＯＡ ＧＡＡＣＴＧ ＡＡＡ
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ＧＣ！ ＡＡＡＡＡＯＴＴ’ｌ’ ＣＩＡＯＴＴＡ
ＡＧＡ ０００ ＡＧＧ ＧＡＯＴＴＡ
ＡＴＯＡＧＯＡＡＴ ＡＴＯＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ
ＧＴＴ ＯＴＧ ＧＡＡ ＯＴＡ ＡＡＧ
ＧＧＡ Ｔｏｏ ＧＡＡＡＯＡ ＡＯＡ ＴＴ
ＯＡＴＧ ’［’ＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＯ
ＴＧＡＴ ＧＡＧ ＡＯＡ ＧＯＡ ＡＯＯＡ
ＴＴ ＧＴＡ ＧＡＡＴＴＴ−ＯＴＧ ＡＡＧ
ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＴ ＡＯＯＴＴＴＴＧＴ
ＣＡＡ ＡＧＯＡＴＩＯＡＴＯＴＯＡ ＡＯＡ
ＯＴＡＯＴ 明細書の汀１声（内容に変更なし） ＩｌＮＡＱＩ） ＧＯＡ ＯＯＴ ＡＯＴ ＴＣ！λ ＡＧＴ
ＴＣＴ ＡＯＡ ＡＡＧＡＡＡ ＡＯＡ ａＡ
ｅ ＯＴＡ ＯＡＡ ＯＴＧ ＧＡ、Ｇ ０
ＡＴＴＴＡ ＯＴＧ Ｃ’ＦＧ ＧＡＴ ＴＴ
Ａ ＯＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴＴＴ（） ＡＡＴ
ＧＧＡ Ａ’Ｉ”Ｉ’ ＡＡＴ ＡＡＴ
ＴＡＯＡＡＧＡＡＴ ０００ ＡＡＡ ＣＴＣＡ
ＯＯＡｔ）Ｇ ＡＴＧ Ｏ’ｒ、０ＡＯＡ Ｔ’
Ｉ’Ｔ ＡＡＧ ＴＴＴ ＴＡＯＡＴＧ Ｃｏ
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金Ｇ ＡＡＡ ｏｆＴ ａ’ｆ”Ｉ’ＯＡＧ Ｔ
ＧＴ ＯＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ Ｃ
ＴＣＡＡＴｏｏＴ ＯＴＧ ＧＡＧ ＧＡＡ
ＧＴＧ ＯＴＡ ＡＡＴ ’１”ＴＡＧＯＴ
ＯＡＡ ＡＧＯＡＡＡ ＡＡＯ！ｒＴＴ ＯＡＯ
ＴＴＡＡＧＡ Ｃｏｏ ＡＧＧ ＧＡＧ ＴＴＡ
ＡＴＯＡＧＯＡＡＴＡＴＯＡＡＯＧＴＡ ＡＴＡ Ｇ
ＴＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＣＴＡＴＧＴ ＧＡＡ ＴＡＴ
ＧＯＴ ＧＡＴＧＡＧ’ ＡＣ＋Ａ ＧｃＡＡＯＯＡ
ＴＴ ＧＴＡ ＧＡＡ ＴＴ’ｌ” ＯＴ・Ｎ
ＡＡＯＡＧＡＴＧＧ ＡＴＴ ＡＯＯＴＴＴ
ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＧＯＡＴＯＡＴ（！ ＴＯＡ
ＡＯＡ ＣＴＡ ＡＯＴ明細書の浄書（内容に
変更なし） アミノ酸配列（Ｉ） Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｍ＠ｔ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｏｙｓ工１ｅＡｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ’
Ｌｅｕ Ｖａｌ １Ｌｅｕ ’Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓ
Ｎ ８ｅｒＡｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｂｅｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉ＋７８ Ｌｙｅ ＴｈｒＧＩＮ Ｌ
ｅｕ ＧＩＮ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｌｓ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｌｅｕ ＡｓｐＬｅｕ ＧＩＮ Ｍｅｔ工ｌｅ Ｌ
ｅｕ ＡｓＮ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＡｅＮ ＴｙｒＬｙｓ
ＡｓＮ Ｐｒｏ Ｌ３ｒｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ
Ｍｅｔ Ｉ＋ｅｕ ＴｈｒＰｈｅ Ｌｙ’Ｌ Ｐｈｅ
Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ
ＴｈｒＧｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｈｌｓ Ｌｅｕ ＧＩ
Ｎ Ｃ！ｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ ＧｌｕＧｉｎ Ｌｅｕ
Ｌ７ｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｌｅｕ ＡｓＮＬｅｕ Ａｌａ ＧＩＮ’Ｓｅｒ Ｌｙ
ｓ ＡｓＮ Ｐｈｅ Ｈｌｓ Ｌｅｕ ＡｒｇＰｒｏ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ工ｌｅ Ｓｅｒ ＡｓＮ工ｌｅ
ＡｓＮ Ｖａｌ工ｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌ
ｅｕ Ｌｙ８Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ＴｈｒＴｈｒ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ ＣＪｙｔｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｕ ＴｈｒＡｌａ Ｔｈｒ工ｌｅ ’Ｖ
ａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ ＡｓＮ Ａｒｇ Ｔｒ
ｐ１１６ Ｔ’ｈｒ Ｐｈｅ Ｏ’ｙｓ ＧＩＮ Ｓｅ
ｒ工１ｅ工ｌｅ Ｓｅｒ ＴｈｒＬ＠ｕ Ｔｈｒ 明４■１書の汀１書（内容に変更なし）アミノ醸配列（
２） Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｏｒ Ｔ
ｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｅ ＴｈｒＧＩＮ Ｌｅｕ ＧＩＮ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
ＡｓｐＬｅｕ ＧＩＮ Ｍｅｔ工ｌｅ Ｌｅｕ ＡｅＮ
Ｇｌｙ Ｐｈｅ ＡｓＮ Ｔ７ｒＬｙｓ ＡｓＮ Ｐ
ｒａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｌｅ
ｕ ＴｈｒＰｈθＬｙｓ ＰｈθＴｙｒ Ｍｅｔ Ｐｒ
ｏ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ ＴｈｒＧｌｕ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｈｌｓ Ｌｅｕ ＧＩＮ Ｏｙｓ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｇ１．ｕＧｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙ８Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＡｓＮＬｅｕ Ａ
ｌａ ＧＩＮ Ｓｅｒ Ｌｙｇ ＡｓＮ Ｐｈｅ Ｈｌ
ｓ Ｉ＋ｅｕ ＡｒｇＰｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ
工ｌｅ Ｓｅｒ Ａ８Ｎ工１ｅ ＡｓＮ ’Ｖａｌ工ｌ
ｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ ＴｈｒＴｈｒ Ｉ’ｈｅ Ｍｅｔ
Ｏｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔ
ｈｒＡｌａ Ｔｈｒ工ｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ ＡｅＮ Ａｒｇ Ｔｒｐ工ｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｏｙｓ ＧＩＮ Ｓｅｒ工１θ工ｌｅ Ｓｅｒ Ｔ
ｈｒＬｅｕ Ｔｈｒ
Priority Applications (20)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57230371A JPS59140897A (ja) | 1982-12-29 | 1982-12-29 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| US06/463,496 US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| DE8383101035T DE3377363D1 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| CA000424401A CA1341562C (en) | 1982-03-31 | 1983-03-24 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| AU21472/83A AU556353B2 (en) | 1982-12-15 | 1983-11-17 | Interleukin-2 polypeptide |
| DD25780883A DD218632A5 (de) | 1982-12-15 | 1983-12-12 | Verfahren zur herstellung von interleukin-2 |
| HU426383A HU197938B (en) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Process for producing gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the gene, living cell line having the recombinant dna and process for producing interleukin-2 with such cells |
| DK577283A DK173788B1 (da) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | DNA-fragment, som koder for et polypeptid med interleukin-2-aktivitet, rekombinant DNA omfattende dette DNA-fragment, cellelinie transformeret med det rekombinante DNA og fremgangsmåde til fremstilling af interleukin-2 ved anvendelse af denne cellelinie |
| AT435083A AT392082B (de) | 1982-12-15 | 1983-12-14 | Das polypeptid interleukin-2 kodierendes gen, rekombinante, dieses gen enthaltende dna, diese rekombinante dna aufweisende zellinien und verfahren zur herstellung von interleukin-2 unter verwendung der genannten zellen |
| EP83112661A EP0118617B1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| BE0/212058A BE898473A (fr) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Gène codé pour polypeptide d'interleukine-2, ADN recombinant portant ce gène, cellules vivantes contenant l'ADN recombinant et production d'interleukine-2 |
| CA 443333 CA1341633C (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2 polypeptides |
| DE8383112661T DE3382383D1 (en) | 1982-12-15 | 1983-12-15 | Interleukin-2-polypeptide. |
| US07/814,049 US5620868A (en) | 1982-03-31 | 1991-12-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US08/096,842 US5399669A (en) | 1982-03-31 | 1993-07-26 | Interleukin-2 polypeptides |
| US08/331,146 US5700913A (en) | 1982-12-15 | 1994-10-28 | Unglycosylated human interleukin-2 polypeptides |
| US08/516,563 US5795769A (en) | 1982-03-31 | 1995-08-18 | Gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the gene, a living cell line possessing the recombinant DNA and method for producing interleukin-2 using the cell |
| US08/621,097 US5795777A (en) | 1982-03-31 | 1996-03-22 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US09/769,396 US20010041362A1 (en) | 1982-03-31 | 2001-01-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57230371A JPS59140897A (ja) | 1982-12-29 | 1982-12-29 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140897A true JPS59140897A (ja) | 1984-08-13 |
Family
ID=16906808
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57230371A Pending JPS59140897A (ja) | 1982-03-31 | 1982-12-29 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59140897A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5964288A (ja) * | 1982-10-06 | 1984-04-12 | 株式会社日立製作所 | ロボツト |
-
1982
- 1982-12-29 JP JP57230371A patent/JPS59140897A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5964288A (ja) * | 1982-10-06 | 1984-04-12 | 株式会社日立製作所 | ロボツト |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986006405A1 (en) * | 1985-05-02 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel transformant and its use |
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