DK168048B1 - Renset human interleukin-1, dets fremstilling og anvendelse i farmaceutiske praeparater - Google Patents

Description

i DK 168048 B1

Den foreliggende opfindelse angår interleukin 1 (i det følgende "IL-1") og nærmere bestemt en proteinsammensætning i det væsentlige bestående af human interleukin-1, som anført i krav 1, en fremgangsmåde til fremstilling af renset human interleukin-1 ud fra en rå opløsning af 5 human interleukin 1, som anført i krav 2, interleukin-1, som anført i krav 6, et farmaceutisk præparat, som anført i krav 7, og anvendelsen af interleukin-1 ved fremstilling af et lægemiddel, som anført i krav 12.

IL-1, der i litteraturen kendes formelt som " lymfocytakti verings-faktor" eller "LAF", er et hormon, der fremstilles af makrofager, mens 10 de undergår en immunreaktion. Denne proteinfaktor regulerer et bredt spektrum af immunologiske og ikke-immunologiske reaktioner. F.eks. tænker man sig, at IL-1 formidler aktiviteter, der omtales som endogen eller leukocytisk pyrogen, B-celleaktiveringsfaktor (BAF), epidernriscelle-thymocytaktiveringsfaktor (ETAF), leukocytendogenformidler (LEM), knog-15 leresorptionsfaktor, der er aktiv ved rheumatoid arthritis, og forskellige andre aktiviteter. Som sådant virker IL-1 lovende med hensyn til terapeutisk formidling af immunreaktion, der her defineres således, at de tidligere nævnte aktiviteter indbefattes.

Selv om forskere har identificeret mange af IL-1's biologiske 20 egenskaber, er den kemiske natur af dette hormon ikke godt kendt. Indtil nu er dette i det mindste delvis blevet hæmmet af den manglende tilgængelighed af tilstrækkelige mængder IL-1 i renset form til udførelse af nødvendige undersøgelser.

Der har tidligere været gjort forsøg på at rense og delvis karakte-25 risere IL-1 hidrørende fra både human og murin kilde. F.eks. rapporterede Mizel, 122 J.Immunol. 2167-2172 (1979) om fremstilling af murin IL-1 ud fra makrofagcellelinie P388Dj. IL-1 fra kulturfluidet underkastedes ammoniumsulfatfældning, diethylaminoethyl ("DEAE") cellulosesøjlekroma-tografi, ultrafiltrering og "Sephacryl S200"-søjlekromatografi. De re-30 suiterende aktive fraktioner fandtes at have en molekylvægt i intervallet fra 12.000 til 16,000 dalton. Ved isoelektrofokusering ("IEF") i poly acryl amidgel er fandtes IL-17s pi at være i intervallet fra 5,0 til 5,4.

I en senere kommunikation diskuterede Mizel et al., 126 J. Immunol.

35 834-837 (1981) rensning af IL-1 fra samme P388Dj-cellelinie, som anvendtes i Mizel, supra, til "tilsyneladende homogenitet" ved ammoniumsulfatfældning, phenyl "Sepharose" kromatografi, "Ultrogel AcA54"-gel-fil treringskromatografi og præparativ IEF i fladt leje. Det resulterende DK 168048 B1 2 IL-1 fandtes at have et pi på ca. 4,9 til 5,1 og en molekylvægt på ca.

14.000 dalton.

Blyden et al., 118 J. Immunol. 1531-1638 (1977) beskrev en protokol over koncentrering af IL-1 fremstillet ud fra leukocyter fra humant pe-5 rifert blod ved "Sephadex G-100"-søjlekromatografi. Denne procedure rapporteredes at resultere i en fire-til-fem fold koncentrering af det rå IL-1. "DEAE-Bio-Gel A"-anionbytningskromatografi anvendtes til at fjerne albuminet fra det til fremstilling af det rå IL-1 anvendte serum. Derefter absorberedes de opsamlede aktive fraktioner på en hydroxyapatitsøjle 10 og overførtes herefter til en "CM-Bio-Gel A"-kationbytterharpiks. Forskerne rapporterede, at der ved disse procedurer blev genvundet ca. 20% af det oprindelige IL-1. Det resulterende IL-1 fandtes at have en molekylvægt på ca. 13.000 dalton og et pi på ca. 6,8 til 7,2.

Råt IL-1 fremstillet ud fra humane leukocyter af Togawa et al., 122 15 J. Immunol. 2112-2118 (1979) behandledes indledningsvis ved membranfiltrering og overførtes derefter til en "Bio-Gel P-100"-kromatografisøjle, som viste to hovedaktivitetstoppe, en i området fra 12.000 til 22.000 dalton og en anden i området fra ca. 50.000 til 70.000 dalton. Aktive fraktioner i det nedre molekylvægtsområde sammenblandedes og overførtes 20 til en "Blue Sepharose"-søjle, en DEAE-celluloseionbytningskromatografi-søjle og en hydroxyapati tkromatograf i søjle. Togawa et al. opdagede, at der, hvis IL-1 aktiviteten med den nedre molekylvægt, som stammede fra hver af disse procedurer, rekonstitueredes med 2% human serum, koncentreredes og rekromatograferedes på "Bio-Gel P-100", viste sig en signi-25 fi kant del af aktiviteten med højere molekylvægt.

Lachman 42 Federation Proceedings 2639-2645 (1983) rapporterede fremstilling af IL-1 ud fra monocyter fra perifert blod eller leukæmiske celler opnået fra patienter med akut monocytleukæmi eller akut myelomo-nocytisk leukæmi. Hul fiberdi afiltrering og ultrafiltrering anvendtes til 30 at adskille en aktivitet med lavere molekylvægt fra de fleste af serumproteinerne. Denne aktivitet med lavere molekylvægt underkastedes IEF i en "Ampholine"- og saccharosegradient. Ud fra denne procedure fandtes IL-l-aktiviteten at have et pi på ca. 6,8 til 7,2 og en molekylvægt på ca. 11.000 dalton. Lachman rapporterede, at den samlede genvinding af 35 IL-1 aktivitet ved ovenstående procedure var ringe, omkring ca. 4%.

Tilgængeligheden af passende mængder homogent human IL-1 ville være værdifuld ved undersøgelser og mulig behandling af autoimmune lidelser, såsom arthritis og lupus erythematosus. Human IL-1 i større renhed og DK 168048 B1 3 større mængder end, hvad der hidtil har været tilgængeligt, vil også kunne vise sig værdifuldt med hensyn til opnåelse af vellykket heling af sår og forbrændinger.

En potentiel metode at tilvejebringe forholdsvis store mængder ho-5 mogent human IL-1 på er ved hjælp af rekombinant DNA-teknikker. Rekombi-nant DNA-teknikker er blevet udviklet til økonomisk fremstilling af et ønsket protein, når først det gen, der koder for proteinet er blevet isoleret og identificeret. En omtale af sådanne rekombinant DNA-teknikker til proteinfremstilling er anført i de redaktionelle og underbyggen-10 de afhandlinger i Science, bind 196 (April 1977). For at drage fordele af de i denne henvisning diskuterede rekombinant DNA-teknikker må det gen, der koder for human IL-1, imidlertid først isoleres.

Den foreliggende opfindelse angår IL-1, rensning af human IL-1 til homogenitet og bestemmelse af aminosyresammensætningen og den delvise 15 aminosyresekvens af det homogene IL-1. I overensstemmelse med opfindelsen rensedes rå præparater af IL-1 ved en kombination af ionbytningskromatografi og affinitetskromatografi. Til affinitetskromatografidelen af rensningsprocessen anvendtes en farvestofligand koblet til en uopløselig matrix. På grundlag af den kendte teknik forventes det, at samme rens-20 ningsproces kan anvendes til IL-1 fra andre pattedyrsarter, såsom IL-1 af murin, bovin eller porcin oprindelse.

Efter at rensningen til homogenitet var foretaget analyseredes ΚΙ -molekylets aminosyresammensætning og -sekvens. Molekylets aminosyre-sammensætning blev fastslået ved anvendelse af en aminosyreanalysator.

25 Aminosyresekvensen af IL-1-molekylets N-terminal afsnit bestemtes ved direkte Edman-nedbrydningsteknik og også ved indledningsvis fraktionering af molekylet, adskillelse af fragmenterne ved højtryksvæskekromatografi ("HPLC") og efterfølgende analyse af HPLC-fraktionerne, der fandtes at indeholde IL-l-peptider ved Edman-nedbrydningsmetoden.

30 Et gen, der koder for human IL-1, isoleredes fra et cDNA-bibliotek med en syntetisk oligonukleotidprobe, der svarer til en del af aminosyresekvensen i human IL-1, som bestemt ovenfor. Alt human RNA ekstrahere-des fra celler, der mentes at producere forholdsvis store mængder af IL- 1. Polyadenyleret mRNA isoleredes fra den totale RNA-ekstrakt. Et cDNA-35 bibliotek konstrueredes ved revers transkription af polyadenyleret mRNA adskilt efter størrelse med revers transkriptase. DNA'et gjordes dobbeltstrenget med DNA polymerase I og inførtes i en passende kloningsvektor. Resulterende rekombinante kloningsvektorer anvendtes til transfor- DK 168048 B1 4 i ! mation af en passende vært.

Transformerede værter identificeredes og grupperedes i forråd.

Plasmid DNA fremstillet ud fra disse forråd hybridiceredes med oligonu-kleotidproben, som var blevet radiomærket. Det eller de forråd af klo-5 ner, som gav et positivt signal over for proben identificeredes, og det formodede forråd underinddeltes, og hybridiceringsscreeningen gentoges.

Ved denne procedure identificeredes til sidst en enkelt transformant. Plasmid DNA fremstilledes ud fra denne transformant og karakteriseredes ved restriktionsendonukleasenedbrydning. IL-1 genet underkastedes se-10 kvensbestemmelse for at fastslå dets nukleinsyre- og aminosyresammensæt-ninger. IL-1 genet klonedes også i et E. coli/gærcellesystem for at udtrykke fuldt udviklet IL-1, og biologiske analyser gennemførtes derefter for at bekræfte, at det udtrykte proteinprodukt var IL-1.

Detaljerne ved typiske udførelsesformer af opfindelsen beskrives i 15 forbindelse med tegningen, hvor fig. 1 illustrerer en delvis strukturel formel for blåt farvestof-ligand, fig. 2 illustrerer en delvis strukturel formel for rødt farvestof-ligand, 20 fig. 3 illustrerer et delvis restriktionskort for IL-l-genet, fig. 4, der består af to ark, illustrerer nukleotidsekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens for IL-l-genet, som er indeholdt i nukleo-tidfragmentet i fig. 3, med nukleotiderne nummereret fra begyndelsen af den i fig. 4 viste sekvens og aminosyrerne nummereret fra den modne Nl·^-25 terminal af proteinet d.v.s. Ala-resten, som vist ved en pil, til termi-neringskodonet ATT ved rest nummer 153, og fig. 5 illustrerer den strategi, der er anvendt til at klone kodningsområdet af IL-l-genet i en shuttlevektor anvendt til at transformere gærværter for at udtrykke funktionel IL-1.

30

Fremstilling af IL-1 Rå præparater af IL-1 fremstilles ud fra leukocyter fra perifert blod. Leukocyterne adskilles fra fuldblod ved hjælp af velkendte teknikker såsom ved centrifugering over et volumen Ficoll/Hypaque-opløsning.

35 De fra blodet fjernede leukocyter dyrkes in vitro i et dyrkningsmedium indeholdende et passende stimuleringsmiddel for at inducere IL-l-sekre-tion. Efter en optimal dyrkningperiode udvindes supernatanten ved centrifugering og opbevares indtil brug.

DK 168048 B1 5 I stedet for at blive opnået ud fra leukocyter fjernet fra fuldblod, kan IL-1 fremstilles ud fra monocyter hidrørende fra en hvilken som helst monocytrig kilde. Blandt sådanne monocytkilder er monocytisk leukæmiske miltceller, lymfeceller og alevolar makrofager.

5 Mediet, der anvendes til at dyrke leukocyterne fra perifert blod, kan bestå af i handelen tilgængelige medier, såsom Eagle's Minimum Essential Medium ("MEM") eller Roswell Park Memorial Institute ("RPMI") medium. Blandt additiver, som individuelt eller i kombination kan sættes til dyrkningsmediet, er glutamin, HEPES-puffer og forskellige anti bioti -10 ka, såsom gentamycin, penicillin og streptomycin. Tidligere har serum også været almindeligt anvendt som additiv. Ansøgerne har imidlertid opdaget, at ved procedurerne ifølge opfindelsen lettes rensningen af IL-1 fra kultursupernatanten, hvis der ikke anvendes serum i kulturen. Selv om dét ikke at anvende serum har vist sig at resultere i en tre-til-fem 15 fold reduktion af den i kulturen producerede mængde IL-1, resulterer fraværet af serum også i en 100-fold reduktion af det samlede producerede protein, hvilket mindsker de komplikationer, der er forbundet med rensningen af IL-1.

Blandt foretrukne stimuleringsmidler til anvendelse i forbindelse 20 med opfindelsen er Staphylococcus aureus eller lipopolysaccharid ("LPS") ekstraheret fra Escherichia col i ("E. coli"). Desuden kan phorbolestre, såsom phorbal-myristrat-13-acetat, anvendes som stimuleringsmiddel.

Fremgangsmåden til dyrkning af leukocyterne for at inducere sekretion af IL-1 kan udføres under forskellige miljømæssige betingelser.

25 Kulturerne holdes imidlertid fortrinsvis i et temperaturområde på ca. 35 til 38°C i en fugtet atmosfære af ca. 5 til 10% i luft. Den mængde IL-1, der frigøres ved stimulering af leukocyter fra perifert blod med et aktiveringsmiddel, varierer med tiden. Ansøgerne har fundet ud af, at optimale IL-l-ekspressionsniveauer nås ca. 24-72 timer efter stimule-30 ring.

Analyse

En thymocytproliferationsanalyse, en IL-l-omdannelsesanalyse og en proteinanalyse anvendes i forbindelse med opfindelsen til at overvåge 35 IL-l-aktivitetsniveauet og proteinindholdet i prøverne under rensnings-, klonings- og IL-l-ekspressionsprocedurerne ifølge opfindelsen. Endvidere anvendes natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese ("SDS-PAGE") og to-dimensionel gelelektroforese til analysering af IL-l-aktiviteten DK 168048 B1 6 under rensningsprocessen.

Thymocytproliferationssanalyse

Denne analyse involverer konstatering af en IL-l-prøves kapacitet 5 til at inducere proliferation af thymocyter hidrørende fra CD-l-mus. Ved denne analyse podes ca. 1 x 106 thymocyter opnået fra 10 til 12 uger gamle CD-I mus (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) i rundbundede mikropladefordybninger (Corning Plastics, Corning, New York) i nærvær af trefold seriefortyndinger af IL-l-holdige prøver. Thymocy-10 terne dyrkes i 150 mikroliter ("ul") MEM indeholdende 50 enheder/milli-liter ("U/ml") penicillin, 50 mikrogram/milliliter ("ug/ml") streptomycin, 2 millimol ("mM") glutamin, 0,2 mM gentamycin, 10 mM HEPES-puffer (tilsammen omtalt som "Suppleret MEM"), pH 7,4, sammen med 3 vol/vol% -5 human serum og 10 molær ("M") 2-mercaptoethanol. Prøverne dyrkes ved 15 37°C i 72 timer i en atmosfære af 5% CO^ i luft. Derefter underkastes kulturerne impulsbehandling i ca. 4 timer med 0,5 mi krocurie ("uCi") tritieret thymodin ("3H-Tdr"), (New England Nuclear, Boston, Massachusetts, 2 Ci/mM specifik aktivitet), hvorefter kulturerne udvindes på glasfiberfilterstrimler f.eks. ved hjælp af en såkaldt "multipie-20 automated sample harvester". Derefter måles 3H-Tdr-inkorporering ved væskescintillationstælling. Detaljer vedrørende denne procedure beskrives i Gili is et al., 120 J. Immunol. 2027 (1978).

Ved denne thymocytproliferationsanalyseprocedure inkorporerer kun de CD-I-thymocyter, som er dyrket i nærværelse af IL-1, 3H-Tdr på do-25 sisafhængig måde. CD-l-celler dyrket i fravær af IL-1 inkorporerer kun baggrundsniveauer af 3H-Tdr. IL-1-aktivitet beregnes ud fra den lineære del af 3H-Tdr-inkorporeringsdata på lignende måde som ved den af Gill is et al., supra, anvendte procedure til bestemmelse af inter!eukin- 2-aktivitet. Enheder IL-1 aktivitet bestemmes som den reciprokke for-30 tynding af en prøve, som i forhold til en laboratoriestandard generer 50% af den maksimale thymocyt 3H-Tdr-inkorporering. Hvis f.eks. en prøve generer 50% af den maksimale thymocyt 3H-Tdr-inkorporering ved en fortynding på 1:15, så findes en enhed ("U") IL-1 i en 1/15 af analysevolumenet på 150 ul, eller 10 ul siges at indeholde én U aktivitet.

35 Den samlede prøve vil derfor indeholde 100 U [1,000 (ul/ml):10 ul (per U)] IL-l-aktivitet/ml. Se Gillis et al., supra.

DK 168048 B1 7 IL-1-omdannelsesanalyse

Der kan anvendes en anden alternativ analyse for IL-1-aktivitet, som drager fordel af den kendsgerning, at IL-1 af ansøgerne blev fundet at omdanne en murin tumorcellelinie, LBRM-33-145, som ikke producerer 5 interleukin 2 ("IL-2"), til en IL-2-producent. Ved denne analyse inakti-veres LBRM-33-lA5-celler, ATCC nr. CRL-8079 ved tilsætning af 50 ug/ml mitomycin C og inkuberes ved 37eC i 1 time. 100 ul af de inaktiverede LBRM-33-lA5-celler (5 x 105 celler/ml) dyrkes i fladbundede plader med 96 fordybninger i nærvær af et lige stort volumen af mitogenet, phytohe-10 magglutinin ("PHA") (1% slutkoncentration) sammen med seriefortyndinger af IL-l-holdige fluidumprøver. Efter 6-24 timer fastslås eksistensen af IL-2-aktivitet udviklet af IL-1 udløste, mitomycin C inhiberede LBRM-33-lA5-celler (og således IL-1 aktivitet), direkte ved tilsætning af 50 ul IL-2 afhængige CTLL-2 celler (8 x 104 celler/ml). Derefter inkuberes 15 mi krofordybningskul turerne i yderligere 20 timer efterfulgt af en 4 timers impulsbehandling med 0,5 uCi af 3H-Tdr (New England Nuclear,

Boston, MA, 2 Ci/mM specifik aktivitet). Derefter udvindes thymidinim-pulsbehandlede kulturer på glasfiberfilterstrimler ved hjælp af en "multiple automated samlpe harvester" (MASH II, Microbiological 20 Associates, Bethesda, MD). 3H-Tdr inkorporering måles ved væskescin-tillationstælling. Detaljer vedrørende denne procedure er anført i Gili is et al., supra, og i US-patent nr. 4.411.992. Ved denne analyse inkorporerer kun de i nærvær IL-2 dyrkede CTLL-2 celler 3H-Tdr på en dosisafhængig måde. CTLL-2-celler dyrket i fravær af IL-2 (og dermed IL-25 1) inkorporerer kun baggrundsniveauer af 3H-Tdr. Denne "omdannelses"-analyse har den fordel, at den er hurtigere (færdig inden for 24 timer) og ca. 1.000 til 10.000 gange mere følsom end den ovenfor omtalte thymo-cytproliferationsanalyse. Ikke desto mindre kan både "omdannelses"- og "proliferations"-analysen anvendes i forbindelse med opfindelsen.

30

Proteinanalyse

Proteinindholdet i rensningsprøverne bestemmes ved Biorad proteinanalyse, som er en kommercielt tilgængelig metode fra Biorad, Richmond, California. Denne analyse benytter bovinserumalbumin som standard. Prin-35 cipperne og detaljerne vedrørende denne analyse er omtalt i Bradford, 72 Anal. Biochem. 248 (1976).

DK 168048 B1 8

Gelelektroforese

Kultursupernatanten og kromatografi søjlefraktionerne analyseres ved SDS-PAGE for at overvåge rensingsprocedurerne iføgle opfindelsen. Denne analyse gennemføres i henhold til gelstablingsproceduren ifølge Laemmli, 5 227 Nature (London) 680 (1970). Til analysen benyttes 0,7 mm SDS-plade- geler under anvendelse af en 10-20% gradient polyacrylamidgel. Gelerne drives ved en konstant strøm på 30 mA. De resulterende gelprøver farves med sølv, f.eks. ved den i Oakley et al., 105 Anal. Biochem 361 (1980) beskrevne metode.

10 De særlige analyseprøver, som indeholder en høj saltkoncentration, dialyseres indledningsvis over for 0,001% SDS i 0,1 mM NH^HCOg og tørres derefter under vakuum. Den tørrede rest opløses i en reducerende puffer (2% SDS), 1% 2-mercaptoethanol før SDS-PAGE processen.

15 To-dimensionel polyacrylamidqelelektroforese

Efter afslutning af rensningsproceduren ifølge opfindelsen analyseres IL-1 ved to-dimensionel polyacrylamidgel elektroforese ved den i Sammons et al., 2 Electrophoresis 135 (1981) beskrevne metode. Ved denne procedure lyofiliceres IL-1 prøver og resuspenderes i 20 ul SDS opløs-20 ningspuffer sammensat af 1 vægt/vol% cyklohexylaminoethan, 2 vægt/vol% SDS, 2% 2-mercaptomethanol, 10% glycerol i vand. Prøverne opvarmes til 100°C i 10 minutter. Efter to timers præfokusering overføres prøver (opløst i 10 min. i SDS ved 100°C) til første dimensionsgelen og fokuseres i 20 timer ved en konstant spænding på 600 volt. Første dimensionsfoku-25 seringsgelerne scannes direkte med en pH gradientgel scanner. Derefter skylles gelerne i ligevægtspuffer [9,3 vol/vol% glycerol, 50 vol/vol% Tris-SDS-puffer (30 g Tris, 2 g DSD per liter indstillet til pH 6,8 med koncentreret HC1), 1 vægt/vol% SDS, 0,8 vol/vol% 2-mercaptoethanol i vand] i 2 minutter, anbringes oven på anden dimensionsgelen og dækkes 30 derefter med lavtsmeltende agarose. Anden dimensionselektroforesen (10-20% lineær gradient af acrylamid) gennemføres ved en konstant strøm på 40 mA/gel, indtil farvestoffronten når gelens bund. Efter fiksering i 50 vol/vol% ethanol og 10 vol/vol% iseddikesyre farves gelerne ved sølvni-tratfarvemetoden ifølge Sammons et al., supra.

35

Rensning af IL-1

Supernatanten opnået ud fra blodleukocytkulturen fremstillet ved ovenstående procedure renses ved kationsbytningskromatografi, anionbyt- DK 168048 B1 9 ningskromatografi og affinitetskromatografi under anvendelse af en farvestofligand koblet til en søjlematrix. Alle kromatografi fraktioner analyseres for IL-l-aktivitet og proteinkoncentration. Hvor det er hensigtsmæssigt, måles pH og ledningsevne. Efter hvert kromatografitrin 5 analyseres prøver ved SDS-PAGE. Endvidere analyseres aktive fraktioner efter afslutning af affinitetskromatografien ved to-dimensionel poly-acrylamidgel elektroforese, som omtalt ovenfor.

En passende søjle til kationbytningskromatograf ^i processen er opbygget af sulfopropyl "Sephadex C-25" (Pharmacia Fine Chemicals, 10 Piscataway, New Jersey). Før IL-l-prøven tilsættes, bringes søjlen fortrinsvis i ligevægt med puffer og vaskes derefter med denne eller en anden puffer, efter at IL-l-prøven er overført til søjlen, for at fjerne ikke-bundet protein uden eluering af IL-l-aktivitet. Eluering af IL-1 fra søjlen udføres med et puffer-tilsat elueringsmiddel med tilstrække-15 ligt pH til at disassociere IL-1 fra søjlen.

De sammenblandede aktive fraktioner fra kationbytningskromatografi-proceduren renses yderligere ved anionbytningskromatografi. Ansøgerne har fundet, at et passende søjlemateriale til dette formål er "DEAE-Sephacel". "DEAE-Sephacel"-søjlen bringes i ligevægt med en puffer, og 20 prøvekoncentratet overføres til søjlen. Eluering udføres indledningsvis med samme puffer og derefter med en lineær saltgradient i samme puffer. Fraktioner opsamles og analyseres som diskuteret ovenfor.

IL-1 i de sammenblandede aktive fraktioner fra "DEAE-Sephacel"-søjlen renses yderligere ved affinitetssøjlekromatografi under anvendelse 25 af en syntetisk triazinyl-tekstilfarvestof-ligand koblet til en bærema-trix. Forskellige farver kan anvendes, herunder blåt og rødt. Farvestoffet kobles til en passende søjlematrix, f.eks. opbygget af agarose, po-lyacrylamid, cellulose eller silica-baserede uorganiske materialer, via en etherbinding til trazinringen eller alternativt via en primær amin-30 eller en anthraquinongruppe i farvestoffet. Fremfor at være bundet direkte til en bærematrix kan farvestoffet være bundet til en dextran med høj molekylvægt, som derefter immobiliseres til en søjlematrix. Delvise kemiske strukturer af blå og røde farvestof-ligander koblet til en matrix vises i henholdsvis fig. 1 og 2. Det må forstås, at visse farve-35 stofstrukturer kan modificeres til dannelse af analoge strukturer, f.eks. ved at ændre positionerne af den sulfonerede anthraquinongruppe i forhold til triazinringen eller ved at anvende et sulfonatsalt i stedet for sulfonsyresubstituenterne. Se Fulton, Dye-Ligand Chromatography, DK 168048 B1 10

Lexington, MA: Studio 6, Inc. (1980).

Før de IL-l-holdige fraktioner, som er renset over "SP-Sephadex" og " DEAE-Sephacel" sættes til farvestof-ligandsøjlen, kan det være nødvendigt at sænke de sammenblandede aktive fraktioners ionstyrke. Endvidere 5 kan tilstedeværelsen af en di valent kation, såsom Mg++ eller Ca++ forstærke bindingen af IL-1 til farvestof-liganden. Søjlen 1igevægtsind-stilles med en passende puffer, såsom Tris-HCL og de sammenblandede DEAE-fraktioner, der indeholder IL-l-aktivitet, overføres derefter til søjlen. Så vaskes søjlen med samme udgangspuffer, og eluering udføres 10 derefter med en lineær saltgradient i samme puffer eller en specifik opløselig ligand. Fraktioner opsamles og analyseres som omtalt ovenfor.

Ansøgerne har opdaget, at rødt triazinyltekstil farvestof, når det anvendes under de angivne søjlebetingelser, er særlig stærkt specifikt til at binde IL-1. En kommerciel version af dette røde farvestof, som 15 svarer til fig. 2, er "Procion"-rødt (reaktiv rød 120) (Imperial

Chemical Industries). Ansøgerne har også opdaget, at blåt triazinylteks-tilfarvestof, når det anvendes under de anførte søjlebetingelser, også er stærkt specifikt til at binde IL-1, d.v.s. ca. 80% så specifikt som rødt triazinyltekstil farvestof. En kommerciel version af det blå farve-20 stof er "Cibacron® Blue 36A" (Ciba AG).

Ved den førnævnte rensningsproces har ansøgerne renset human IL-1-protein til en renhed på mere end 99% under opretholdelse af et højt udbytte på ca. 53% ud fra udgangssupernatanten. Ved den ovenfor beskrevne analyseprocedure har ansøgerne bestemt, at human IL-1 er opbygget af en 25 enkelt molekylvægttype med en molekylvægt på ca. 17.500 dalton. Denne molekylvægt er væsentligt højere end den der tidligere er rapporteret for såvel human som murin IL-1 oprindelse. Endvidere fandt ansøgerne, i modsætning til hvad andre iagttagere har rapporteret, ingen andre molekylvægttyper af IL-1. Se Lachman, supra; Togawa et al., supra; Mizel et 30 al., supra; og Blyden et al., supra. På grund af de høje udbytter af IL-1, som ansøgerne har opnået ved anvendelse af opfindelsen, er det imidlertid usandsynligt at nogen væsentlige mængder af andre IL-l-typer med lavere molekylvægt blev tabt under den førnævnte rensningsprocess. Den virkelige molekylvægt for homogent human IL-1 er derfor 17.500 dalton.

35

Analyse af aminosyresammensætning

Udover at muliggøre den biologiske undersøgelse af IL-1 fri for kontaminering med andre proteiner har muligheden for at fremstille homo- DK 168048 B1 11 gent IL-1 sat ansøgerne i stand til at bestemme IL-1-molekylets aminosyresammensætning, Denne information kan hjælpe med ved kloningen af IL-1-genet og fremstillingen af store mængder rent IL-1 til kliniske forsøg og i sidste instans til klinisk brug.

5 Prøver af renset IL-1 fra affinitetskromatografiproceduren analyse res for aminosyresammensætning med en automatiseret analysator under anvendelse af ninhydrinpåvisning. Observerede toppe integreres med en i handelen tilgængelig registreringsintegrator. Ved hjælp af denne teknik har ansøgerne bestemt den aminosyresammensætning af IL-l-molekylet, som 10 er summeret i tabel I i eksempel 4 nedenfor.

Da cysteinaminosyreresten (Cys) ikke er stabil over for hydrolyse, påvises denne rest ikke ved automatiseret ninhydrinanalyse. Tilstedeværelsen af Cys-resten påvistes ved den nedenfor omtalte aminosyresekvens-analyse. Automatiseret ninhydrinanalyse skelner heller ikke mellem aspa-15 raginsyrerester og asparaginrester og ikke mellem giutaminsyrerester og giutaminrester. Imidlertid påvistes der ud fra den nedenfor omtalte aminosyre sekvensanalyse en asparaginrest og 6 giutaminrester i et N-termi-nalafsnit af IL-l-molekylet (bestående af 42 aminosyrerester). I tabel I er asparaginsyre- og asparaginresterne således anført sammen, og det 20 samme er giutaminsyre- og giutaminresterne.

Aminosyresekvensanalyse af N-terminal afsnit af IL-l-molekyle

Ansøgerne har også undersøgt IL-1-molekylets aminosyresekvens. Ansøgerne har opdaget, at i det ved de ovenfor anførte procedurer frem-25 stillede rensede IL-1 er molekylets N-terminal delvis blokeret. I sig selv kan molekylet ikke umiddelbart underkastes den kemiske analyseteknik, der anvendes i automatiserede aminosyresekvensbestemmelsesapparater, og aminosyresekvensen af hele molekylet kunne således ikke bestemmes ved standardanalyseprocedurer. Som resultat deraf anvendte ansøgerne 30 en kombination af teknikker til at analysere sekvensen af proteinmolekylets N-terminal afsnit.

Som en første teknik underkastede ansøgerne en forholdsvis stor prøve på mere end 11 ug IL-1, renset til homogenitet ved de før omtalte metoder, aminoterminal Edman nedbrydningssekvensanalyse med et automati-35 seret sekvensbestemmelsesapparat. Ved denne teknik fandtes de første 20 rester af N-terminal afsnittet af IL-l-molekylet at være opbygget af følgende sekvens: NHg-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met.

DK 168048 B1 12

Den 8'ende rest sluttedes at være Cys. I den ottende cyklus af den automatiserede sekvensbestemmelsesprocedure opnåedes der ingen anden rest i højt udbytte, hvilket leder til den konklusion, at den ottende rest er opbygget af Cys (som ikke påvises bekræftende ved Edman nedbryd-5 ning), en glycosyleret threoninrest eller en glycosyleret serin(Ser)-rest. De to sidstnævnte muligheder elimineredes, da der som omtalt nedenfor ikke iagttoges noget glycosamin eller galactosamin fra aminosyre-sammensætningsanalysen. Dette fører til den konklusion, at den ottende rest er opbygget af Cys.

10 Som en anden aminosyresekvensanalyseteknik fraktionerede ansøgerne molekylet ved argi nresterne med enzymet trypsin. For at hindre trypsinet i også at spalte IL-l-molekylet på lysinstederne beskyttedes lysinmole-kylets sidekæder med et specifikt blokeringsmiddel. Fortrinsvis behandles trypsinet med ("TPCK") for at deaktivere andre kontaminerende enzy-15 mer, såsom chymotrypsin, som også kan være til stede, for derved at minimere muligheden for, at IL-l-proteinet vil blive spaltet ved andre rester. Det må forstås, at der i stedet for at anvende trypsin også kan anvendes andre enzymer til at spalte IL-l-molekylerne ved andre rester.

Efter spaltning af IL-l-molekylet adskiltes de resulterende pepti-20 der ved HPLC på grundlag af hydrofobicitet. Den HPLC-teknik, der anvendes i forbindelse med opfindelsen, gør fortrinsvis brug af en revers fase, octadecylbundet silicasøjle med en porestørrelse, som er tilstrækkelig stor til at blive anvendt optimalt sammen med de proteinagtige IL-1-peptider, d.v.s. en porestørrelse på mindst 300 A.

25 Egnede reversfase-HPLC-søjler til brug ved udøvelse af opfindelsen findes i handelen. En foretrukket søjle til dette formål er reversfase-søjlen "Vydac 218 TP", som kan fås i handelen fra Separations Group, Hesperia, California. Denne søjle består af octadecylsilangrupper, som ved hjælp af en siloxan (silican-oxygen-silicaon) binding er bundet co-30 valent til overfladen af en silicagel med en porediameter på 300 A, som er klassificeret til en middel parti kel størrelse på 5 pm. Det må forstås, at opfindelsen også omfatter anvendelse af andre reversfasesøjler.

De IL-1 peptider, som bindes til octadecylsøjlen elueres ved anvendelse af en lineær gradient af acetonitril. En foretrukket gradient 35 til dette formål er en 0 til 95 vol/vol% acetonitrilgradient i trifluor-eddikesyre (TFA), pH 2,0.

De eluerede peptider kan bekvemt overvåges ved i handelen tilgængelige påvisningsystemer. F.eks. kan den relative proteinkoncentration i DK 168048 B1 13 de fra HPLC-søjlerne eluerede fraktioner bestemmes ved at måle absorban-sen af det eluerede materiale med et automatiseret ultraviolet lys spektrofotometer ved en bølgelængde på 230 nanometer. Et egnet automatiseret ultraviolet-lys-absorbanspåvisningsapparatur fås fra Waters 5 Associates, Millford, Maine. Som alternativ kan proteinelueringen overvåges med et automatiseret fluorescencepåvisningssystem, som beskrevet af Stein og Moschera, 78 Meth. Enzylmol. 435 (1981).

De eluerede HPLC-fraktioner analyseres i sekvens ved gelelektrofo-rese som omtalt ovenfor for at bestemme antallet af peptider indeholdt i 10 hver af HPLC-fraktionerne.

Derefter koncentreres peptiderne i vakuum og analyseres derefter for aminosyresekvens. Dette foretages fortrinsvis med et automatiseret sekvensbestemmelsesapparat, som forefindes i handelen. Ved hjælp af denne teknik har ansøgerne opdaget, at en større del af IL-l-molekylet nær 15 N-terminalafsnittet af human IL-l-molekylet er opbygget af følgende sekvens af aminosyrerester: -Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-A1a-Leu-Hi s-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Gl u-Gln-Gln-Val-Val-Phe.

De fire første rester af aminoterminalafsnittet af dette aminosyre-fragment svarer til de sidste fire rester af C-terminalafsnittet af den 20 sekvens, der bestemtes ovenfor ved automatiseret Edman-nedbrydningstek-nik, hvilket fører til den konklusion, at de første 42 rester i N-termi-nalafsnittet af IL-l-molekylet er opbygget af følgende sekvens: Nl^-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Gl u-Leu-Lys-Al a-Leu-Hi s-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-25 Gin-Val-Val-Phe.

Fremstilling af RNA ud fra human IL-l-producerende celler

Total RNA fra human IL-l-producerende celler ekstraheres ved hjælp af standardmetoder f.eks. som beskrevet af Chirgwin et al., 18 Bio-30 chemistry 5294 (1979) og Maniatis et al., Molecular Cloning, a

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York (1982).

Som det er velkendt, er det ved ekstraktion af RNA fra celler vigtigt at minimere ribonuklease (’'RNase") aktivitet under de indledende 35 trin af ekstraktionen. En måde hvorpå dette opnås er ved at denaturere celleproteinet herunder RNasen med en hastighed, som overstiger hastigheden for RNA-hydrolyse med RNase. Ved procedurerne ifølge Chirgwin et al., supra, og Maniatis et al., supra, ved 196 udføres dette ved anvend- DK 168048 B1 14 else af guanidiniumthiocyanat sammen med et reduktionsmiddel, såsom 2-mercaptoethanol (for at bryde proteindisulfidbindingerne). RNA'et isoleres fra proteinet ved standardteknikker, såsom phenol/chloroformekstrak-tion, ethanol fældning eller sedimentation med cæsiumchlorid.

5 Derefter adskilles polyadenyleret mRNA fra det ekstraherede pro tein. Selv om der er udviklet flere teknikker til udførelse af denne adskil! 1 el sesproces, er en foretrukket metode at kromatografere det poly-adenylerede mRMA på oligo (dT)-cellulose som beskrevet af Edmonds et al., 68 Proc. Natl. Acad. Sci. 1336 (1971), Aviv and Leder, 69 Proc.

10 Natl. Acad. Sci. 1408 (1972), og Maniatis et al., supra, ved 197. Oligo (dT)-cel!ulosesøjlen præpareres med en belastningspuffer, hvorefter mRNA'et sættes til søjlen. Derefter vaskes søjlen først med pufferopløsning for at fjerne upolyadenyleret mRNA, og det polyadenylerede mRNA elueres fra søjlen med et puffertilsat elueringsmiddel med lav ionstyr-15 ke. Integriteten af det polyadenylerede mRNA bekræftes ved gelelektrofo-rese.

Det polyadenylerede mRNA størrelsesopdeles derefter ved elektrofo-rese gennem methyl kviksølvagarosegelfraktioner svarende til forskellige størrelseskategori er af mRNA og transiateres derefter in vitro ved an-20 vendel se af kaninreticulocytlysat-standardteknik som beskrevet af Pal mi -ter, 248 J. Biol. Chem. 2095 (1973), Pelham and Jackson, 67 Eur. J. Bio-chem. 246 (1976), og , Lee et al., 253 J. Biol. Chem. 3494 (1978). Udstyr til kaninreticulocytanalyse kan fås i handelen fra mange kilder, f.eks. fra Bethesda Research laboratories, Gaithersburg, Maryland. Som 25 alternativ kan mRNA translationen udføres ved mikroinjektion af mRNA'et i frø Xenopus laevis ("X. laevis") oocyter under anvendelse af standardteknikker f.eks. som beskrevet af Stoma et al., 79 Meth. Enzym. 68 (1981). Fluider frigjort enten ved hjælp af reticulocytlysat-transla-ti oner eller ved hjælp af mRNA mi kroinjicerede oocyter testes derefter 30 for tilstedeværelse af IL-1-aktivitet ved anvendelse af de ovenfor omtalte analyser. mRNA-gelfraktioner, som translateret in vitro gav anledning til IL-l-aktivitet, udvælges som kilde for mRNA til cDNA-konstruk-tion.

Ved X. laevis oocyttranslationsproceduren injiceres ca. 50 nanoli-35 ter ("ni") mRNA (opløst i sterilt f^O til en koncentration på 0,5-1 mg/ml) i hver oocyt. Oocyterne udvindes fra X. laevis (Nasco, Fort Atkinson, Wisconsin) og inkuberes i 150 ml oocytinkubati onsmedium (88 mM NaCl, 1 mM KC1, 2,4 mM NaHC03, 0,82 mM MgS04«7 HgO, 0,33 mM

DK 168048 B1 15 0,41 mM Cadg^^O, 7,5 mM Tris-base, 18 enheder/ml (11 ug/ml) penicillin G kalium, og 18 ug/ml streptomycin). Mediets slut-pH indstilles til 7,6 med HC1, og mediet steriliseres derefter ved filtrering. Efter injektion anbringes oocyterne i 0,1 ml frisk oocytinkuba-5 tionsmedium og inkuberes i 18 timer ved 23eC i et 1,5 ul sterilt konisk polypropylenrør. Efter inkubation udvindes det fluidum, hvori oocyterne dyrkedes og testes for tilstedeværelse af IL-l-aktivitet ved anvendelse af de ovenfor omtalte analyser.

10 Fremstilling af cDNA fra mRNA

Et bibliotek af dobbelststrenget cDNA svarende til det ovenfor fremstillede og analyserede mRNA konstrueres ved hjælp af kendte teknikker under anvendelse af enzymet revers transkriptase. En sådan procedure, som kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, er 15 beskrevet detaljeret af Maniatis et al., supra, ved 230. I korte træk reverstranskriberes det polyadenylerede mRNA ved anvendelse af oligo-dT, som er blevet hybridiseret til den polyadenylerede hale af mRNA'et, som primer for en første cDNA-streng. Dette resulterer i en "hårnåle"-løkke ved 3'-enden af den indledende cDNA-streng, der tjener som en integreret 20 primer for den anden DNA-streng. Derefter syntetiseres den anden cDNA-streng under anvendelse af enzymet DNA-polymerase I, og hårnåleløkken spaltes med SI nuklease til frembringelse af dobbeltstrengede cDNA-mole-kyler. Det dobbeltstrengede cDNA fraktioneres på en hvilken som helst bekvem måde for at fjerne de kortere strenge, hvorved den unødvendige 25 kloning af små cDNA-fraktioner undgås.

Det må forstås, at alternative standardprocedurer kan anvendes til fremstilling af dobbeltstrenget cDNA ud fra mRNA. En sådan alternativ teknik er beskrevet af Land et al., 9 Nucl. Acids Res. 2251 (1981). I Land et al. protokollen anvendes hårnåleløkken ikke som primer for den 30 anden cDNA-streng. I stedet forsynes 3'-enden af den første cDNA-streng med hale med dCMP-rester under anvendelse af terminal deoxynukleotidyl-transferase ("TdT"). Dette frembringer en 3'-hale af poly-C-rester.

Derefter primes syntesen af den anden streng med oligo-dG-hybridi-seret til 3'-halen. Denne teknik siges at hjælpe til at undgå tab af af-35 snit af 5'-halen på den anden cDNA-streng, som ville kunne indtræffe, hvis hårnålen spaltes med SI nuklease som i Maniatis et al. protokollen.

DK 168048 B1 16

Kloning af cDNA

Derefter indføres det dobbeltstrengede cDNA i en kloningsvektor, som anvendes til at transformere kompatible prokaryotiske eller eukaryo-tiske værtsceller for repli kation af vektoren. Derefter identificeres 5 transformanterne og deraf fremstillet plasmid DNA.

Forskellige kloningsvektorer kan anvendes. Selv om plasmider indtager en fortrinsstilling, kan vektoren være en bakteriofag eller et cosmid. Hvis kloning finder sted i pattedyrsceller, kan viruser også anvendes som vektorer.

10 Hvis der anvendes et plasmid, kan det fås fra en naturlig kilde el ler syntetiseres kunstigt. Det specielle plasmid, der vælges, bør være kompatibelt med den påtænkte transformationsvært, uanset om den er bakterie, såsom E. coli, gær, eller en anden enkeltcellet mikroorganisme. Plasmidet bør have det rette repli kationsområde for den særlige værts-15 celle, som skal anvendes. Endvidere bør plasmidet have en phenotypeegen-skab, som vil gøre det muligt let at identificere de tranformerede værtsceller og adskille dem fra celler, som ikke undergår transformation. Sådanne phenotypeegenskaber kan indbefatte gener, der tilvejebringer resistens overfor vækstinhi berende stoffer, såsom et antibioti-20 kum. Der kan i handelen fås plasmider, som indkoder gener, der er resistente overfor forskellige antibiotika herunder tetracyclin, streptomycin, sulfapræparater, penicillin og ampicillin.

Hvis E. coli anvendes som værtscelle, findes der i handelen mange mulige kloningsplasmider, som kan anvendes i forbindelse med opfindel-25 sen. Et foretrukket plasmid for udøvelse af opfindelsen er pBR322. Dette plasmid er blevet fuldstændigt sekvensbestemt som anført i Sutcliffe, 43 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 77 (1979). En signifikant fordel ved dette plasmid er, at det har 11 kendte enestående restriktionssteder herunder Pst I stedet i ampici11 i nresi stensgenet. Denne egenskab er spe-30 cielt værdifuld ved kloning ved homopolymer haledannelsesmetoden.

Hvis der i stedet for et plasmid anvendes en bakteriofag, bør sådanne fager i det væsentlige have samme egenskaber som anført ovenfor med hensyn til udvælgelse af plasmider. Blandt disse er forekomsten af en phenotypemarkør og ligerbare terminaler for tilknytning af fremmede 35 gener.

Det dobbelstrengede cDNA med stumpe ender indføres fortrinsvis i en plasmidvektor ved homopolymer haledannelse. Som det er velkendt inden for området, føjes der ved denne teknik komplementære homopolymerspor DK 168048 B1 17 til strengene af cDNA'et og til plasmid DNA'et. Vektoren og det dobbelt-strengede cDNA sammenføjes derefter ved hydrogenbinding mellem komplementære homopolymere haler til dannelse af åbne, cirkulære hybridmolekyler, som er i stand til at transformere værtsceller, såsom E. coli.

5 Ved en fremgangsmåde til homopolymer haledannelse sættes ca. 50 til 150 dA nukleotidrester til 3'-enderne af lineariseret plasmid DNA. Et lignende antal dT-nukleotidrester føjes til 3'-enderne af det dobbeltstrengede cDNA, hvorefter cDNA'et og plasmidet sammenføjes.

Ved en alternativ og foretrukket metode føjes dG-halerne til 3'-10 enderne af kloningsvektoren, som er blevet spaltet med et passende restriktionsenzym. Hvis f.eks. pBR322-plasmidet anvendes, kan restriktionsenzymet Pst I anvendes til at nedbryde plasmidet ved ampici11 i nresi stensgenet. Komplementære dC-haler føjes til 3'-enderne af det dobbeltstrengede cDNA før indføring af cDNA-segmentet i plasmidet med en 15 passende normaliseringspuffer.

Det må forstås, at det dobbeltstrengede cDNA kan indføres i plas-midkloningsvektorer ved hjælp af forskellige andre standardmetoder. En sådan alternativ teknik indbefatter fastgørelse af syntetiserede nukleo-tidlinkere til enderne af cDNA-strengene ved anvendelse af DNA-ligase.

20 Linkerne spaltes med et restriktionsenzym for at udvikle cohesive terminaler for indføring i et plasmid spaltet med samme restriktionsenzym. Scheller et al., 196 Science 177-180 (1077), Maniatus et al., supra, ved 219.

De ovenfor fremstillede rekombinant DNA-plasmider anvendes til 25 transformering af værtsceller. Selv om værten kan være en hvilken som helst passende prokaryotisk eller eukaryotisk celle, er den fortrinsvis en veldefineret bakterie, såsom E. coli eller en gærstamme. Sådanne værter transformeres let og er i stand til at gro hurtigt i kultur. Andre former for bakterier, såsom salmonella eller pneumococcus, kan anvendes 30 i stedet for E. coli. I stedet for bakterier kan andre enkeltcellede mikroorganismer, f.eks. fungi og algae, anvendes. Uanset hvilken vært der vælges, bør den ikke indeholde et restriktionsenzym, som ville spalte rekombi nantplasmi det.

Hvis E. coli anvendes som vært, er MM294 og RR1 foretrukne stammer.

35 Protokoller over transformation af MM294-værten med en plasmidvektor er velkendte som anført i Maniatis et al., supra, ved 255; og Hanahan, 166 J. Mol. Biol. 557 (1983). Protokoller over transformation af RRl-værten med en plasmidvektor er også velkendte som anført i Bolivar et al., 2 DK 168048 B1 18

Gene 95 (1977) og Peacock et al., 655 Biochem, Biophys. Acta. 243 (1981). Andre E. coli-stammer, som også kunne tjene som passende værter, indbefatter DH1 (ATCC nr. 33849) og C600. Disse stammer og MM294 og RR1-stammerne er kommercielt tilgængelige i vid udstrækning.

5 I transformationsprotokoller indbefattende protokollerne beskrevet af Mani atis et al., supra, og Hanahan, supra, er det kun en lille del af værtscellerne, som faktisk transformeres, på grund af cellernes begrænsede plasmidoptagning. De celler, der er blevet transformeret, kan identificeres ved at anbringe cellekulturen på agarplader indeholdende pas-10 sende vækstmedium og en phenotypeidentifikator, såsom et antibiotikum.

Kun de celler, der har det korrekte resistensgen (f.eks. over for antibiotikummet) vil overleve. Hvis rekombinant pBR322 pi asmidet anvendes til transformation af E. coli stamme MM294, kan transformerede celler identificeres ved anvendelse af tetracyclin som phenotypeidentifikator.

15

Fremstilling af en syntetisk oliqonukleotidscreeningsprobe

Et radiomærket syntetisk oligonukleotid svarende til en del af N-terminal afsnittet af aminosyresekvensen i human IL-l-molekylet, som ovenfor bestemt, anvendes som probe til screening af cDNA-biblioteket.

20 Hybridiseringen af den syntetiske oligonukleotidprobe med plasmid cDNA fremstillet ud fra biblioteksklonerne identificeres derefter ved autoradiografi.

N-terminal afsnittet af IL-1 molekylets aminosyresammensætning bestemtes ovenfor som værende opbygget af resterne: NH2-Ala-Pro-Val-Arg-25 Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gly-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val. Denne information om sekvensen anvendes som grundlag for den syntetiske oligonukleotidprobe.

Ansøgerne har udviklet et syntetisk oligonukleotid ud fra ovenstå-30 ende aminosyresekvens til anvendelse som probe til screening af plasmid DNA, der formodes at indeholde IL-l-genet. Proben er opbygget af følgende sekvens, som svarer til antisense-sekvensen, der kodes for af ovenstående aminosyresekvens nedenstrøms for den første Met-rest: 5'-AC TTG TTG TTC CAT GTC TTG GCC TTG CAG GTG CAG GGC TTT CAG TTC GTA GGG GCC GGA 35 CAT-3'. Denne probe har den fordel at være tilstrækkelig kort til let at kunne syntetiseres samtidig med, at den er lang nok til at indeholde tilstrækkelig information til at kunne anvendes som probe for IL-l-genet. Selv om den beskrevne oligonukleotidsekvens er en foretrukket sam- DK 168048 B1 19 mensætning af den syntetiske probe ifølge opfindelsen, må det forstås, at prober med andre sammensætninger svarende til andre segmenter af IL- 1-molekylets N-terminalaminosyresekvens kan anvendes inden for opfindelsens rammer.

5 De syntetiske oligonukleotidprober kan syntetiseres kemisk ved hjælp af velkendte teknikker såsom ved phosphodiester- eller triestermetoder. Detaljer vedrørende triestersynteseteknikken er anført i Sood et al., 4 Nucl. Acid Res. 2557 (1977), og Hi rose et al., 28 Tet. Lett. 2449 (1978). Efter syntese mærkes oligonukleotidproben med T4-polynukleotid-10 kinase og 32P-ATP. En standardprotokol over mærkningsproceduren er anført i Maniatis et al., supra, ved 122. Oligonukleotidproberne kan med fordel syntetiseres med OH 5'terminaler, hvorved den phosphataseprocedu-re, der typisk kræves, undgås.

15 Screening af cDNA-bibliotek

Ved screeningsproceduren ifølge opfindelsen sammenblandes transformanterne i grupper, der hver består af ca. 2.000 transformanter. De re-pli kerede pi asmider ekstraheres fra transformanterne under anvendelse af en hvilken som helst af flere velkendte teknikker, såsom ved alkalisk 20 lyse. Plasmid DNA fremstilles ved spaltning af plasmiderne ved Pvu II og Hind III restriktionsstederne, der begge er enestående steder på hybrid-plasmidet. De resulterende DNA-segmenter fraktioneres ved elektroforese på agarosegel og analyseres derefter direkte ved Southern-blotting, som beskrevet i Southern, 98 J. Mol. Biol. 503 (1975). Det DNA, som bindes 25 til nitrocellulosefiltret ved Southern blotting proceduren, er hybridi-seret med den mærkede olionukleotidprobe. De specifikke DNA-fragmenter, der hybridiserer til proben, identificeres ved autoradiografi.

Det eller de specielle forråd af kloner, som giver et signal efter autoradiografi, udstryges og anvendes til direkte bakteriekolonihybridi-30 sering på et mi krocellul osefilter med samme oligonukleotidprober, som identificeres ovenfor. Efter afslutning af hybridiseringen undersøges nitrocellulosefiltret ved autoradiografi for at identificere den største koloni. I forbindelse med opfindelsen har ansøgerne iagttaget en sådan koloni. Plasmid DNA betegnet som IL-l-X-14 fremstilles ud fra den særli-35 ge identificerede koloni.

Karakterisering af screenet cDNA

Det ovenfor fremstillede plasmid DNA karakteriseres ved restrik- DK 168048 B1 20 tionsenzymkortlægning. Forskellige strategier for restriktionsenzymkort-lægning omtales af Mani atis et al., supra, ved 374. En standardteknik involverer delvis nedbrydning af endemærkede fragmenter af lineær DNA. Denne teknik blev udviklet af Smith og Birnstiel, 3 Nucl. Acids Res.

5 2387 (1976). Et delvist restriktionsenzymkort over IL-1 X-14 plasmidet i området af IL-l-genet vises i fig. 3. Afstanden mellem restriktionssteder er angivet i basepar ("bp"). De i parenteserne viste Pst I restriktionssteder er dem, der skabes ved kloningsprocedurerne.

Det i fig. 3 illustrerede kortlagte plasmid cDNA sekvensbestemtes 10 under anvendelse af kædetermineringsmetoden. Denne metode til nukleotid-sekvensbestemmelse hidrører fra Sanger et al., 70 Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 5463 (1977). Se også US-patentskrift nr. 4.322.499. Metoder til kædetermineringssekvensbestemmelse anføres i Amersham Handbook entitled, M13 Cloning and Sequencing, Blenheim Cresent, London (1983) (herefter 15 "Amersham Handbook"); Messing, 2 Recombinant DNA Techinacal Bulletin, NIH Publication nr. 79-99, 2, 43-48 (1979); Norrander et al., 26 Gene 101 (1983); Cerretti et al., 11 Nucl. Acids Res. 2599 (1983) og Biggin et al., 80 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 3963 (1983). M13-filamentfag anvendes som vektorer til kloning af de interessante DNA-sekvenser. Disse 20 fagvektorer giver enkeltstrengede DNA-tempi ater, som let sekvensbestemmes ved kædetermineringsmetoden, der indbefatter priming af et enkelt-strenget tempiatmolekyle med en kort primerstreng med en fri 3'-hydroxyl gruppe efterfulgt af anvendelse af DNA-polymerase til at kopiere tempi at-strengen i en kædeudvidelsesreaktion under anvendelse af alle 25 fire deoxyribonukleotidtriphosphater, d.v.s. dATP, dCTP, dGTP og dTTP (der kollektivt omtales som "dNTP"er), med det ene af dem radiomærket.

Ved syntesereaktionen anvendes en nukleotidspecifik kædeterminator, som mangler en 3'-hydroxylterminal f.eks. et 2',3'-dideoxynukleotidtriphos-phat ("ddNTP") til at frembringe en række kædeforlængelser af forskellig 30 længde. Terminatoren har en normal 5'-terminal, således at den kan inkorporeres i en voksende DNA-kæde, men mangler en 3'-hydroxylterminal.

Når først terminatoren er blevet integreret i DNA-kæden, kan der ikke tilføjes yderligere deoxynukleotidtriphosphater, således at kædens vækst stopper. Fire separate syntesereaktioner udføres hver med et ddNTP af et 35 af de fire nukleotid-dNTPér, d.v.s. dATP, dCPT, dGTP og dTTP. Et af de normale dNTPér radiomærkes, således at de syntetiserede strenge kan autoradiograferes efter at være blevet sorteret efter størrelse på en polyacrylamidgel. Kædeforlængelserne fra de fire reaktioner anbringes DK 168048 B1 21 side ved side i separate gel baner, således at mønsteret af fragmenterne fra autoradiografien svarer til DNA-sekvensen af det klonede DNA.

DNA- og tilsvarende aminosyresekvenser for plasmid cDNA i fig. 3 bestemt ved ovenstående teknikker illustreres i fig. 4. Nukleotiderne er 5 nummereret fra begyndelsen af den i fig. 4 viste sekvens. Aminosyrerne er nummereret begyndende fra den fuldt udviklede NHg-terminal af IL-1-proteinet, d.v.s. Ala-resten, mærket med en pil, og strækker sig til Ser-resten (nr. 153), der befinder sig ved siden af termineringskodonet TAA. Kodningsområdet af IL-l-genet, der strækker sig fra Ala-kodonet til 10 TAG-termineringskodonet vises som et indrammet afsnit i fig. 3. De restriktionsenzymsspaltningssteder, som er identificeret i fig. 3, er også vist i fig. 4.

Ved forberedelse til sekvensbestemmelsesprocedurerne nedbrydes den i fig. 3 viste plasmid cDNA-sektion med forskellige restriktionsendonu-15 kleaser, og de resulterende DNA-fragmenter klones derefter i M13-fagvek-torer til dannelse af enkeltstrengede DNA-tempi ater. En universal primer anvendes til sekvensbestemmelse ovenstrøms og nedenstrøms for mellemliggende områder af de direkte og modsatte strenge, sense og antisense strengene. Fremfor at stole på de sekvensbetemmelsesresul tater, der op-20 nås ved sekvensbestemmelse af hele længden af fragmenterne med en enkel tkædetermi ner i ngsprocedure anvendes yderligere syntetisk fremstillede primere til at initiere kædetermineringsproceduren ud fra andre mellemliggende områder langs strengene. Ved denne fremgangsmåde sekvensbestemmes begge strenge af det i fig. 3 viste plasmid cDNA på overlappende må-25 de, hvorved sekvenserne bekræftes yderligere.

Det må forstås, at fremfor at anvende den ovenfor skitserede kæde-termineringsteknik kan andre kendte metoder anvendes til at sekvensbestemme IL-l-genet. F.eks. kan Maxam and Gilbert's kemiske nedbrydningsmetode som anført i 74 Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 560 (1977) anvendes.

30 Aminosyresekvensundersøgelser af IL-1 fremstillet som ovenfor og renset gennemførtes i overensstemmelse med metoden ifølge Stern et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 871 (1984). Endopeptidasen, cyanogenbromid anvendtes til at spalte IL-1 ved methioni nresterne, og de resulterende fragmenter analyseredes derefter ved Edman-standardnedbrydningsmetode.

35 Ved denne procedure har ansøgerne bekræftet at IL-l-proteinets C-termi-nal er opbygget af følgende aminosyresekvens: Gln-Phe-Val-Ser-Ser. Dette fastslår, at det "naturlige" IL-1 ikke behandles ved fjernelse af aminosyrer fra denne ende af molekylet efter translation fra mRNA. Dette er DK 168048 B1 22 vigtigt, da det er klart, at meget af det kodede protein fjernes fra 5'-enden af IL-l-genets åbne læseramme under modning af IL-1 fra dets præ-kursor.

5 Ekspression af funktionel IL-1 fra cDNA-klon

For at bestemme om cDNA-kodningsområdet af IL-1 X-14 klonen kan indkode funktionel IL-1 udtrykkes klonen i et prokaryotisk/eukaryotisk værtssystem. Et hybrid cDNA-fragment indeholdende kodningsområdet for IL-1 X-14 klonen indføres i en shuttleekspressionsvektor med to sæt re-10 pi i kationssekvenser, en første sekvens til forstærkning af vektoren i prokaryotiske værtsceller og en anden sekvens til ekspression på højt niveau af det fremmede strukturelle protein, d.v.s. IL-1, i eukaryotiske værtsceller. De transformerede eukaryotiske værtsceller udvindes og analyseres for ekspression af modent IL-1 ved anvendelse af den ovenfor ud-15 dybede thymocytproliferationsanalyse og IL-2-omdannelsesanalyse.

Forskellige typer shuttlevektorer er blevet udviklet. En almindelig type indbefatter et replikationsområde og promotorsekvenser, der signalerer DNA-repli kation i prokaryotiske celler, typisk E. coli og et sammenligneligt replikationsområde og promotorsekvenser, som signalerer 20 DNA-repli kation i eukaryotiske celler, som oftest gærceller. Shuttlevek-toren indbefatter også en phenotypemarkør, såsom et medikamentresi stens-gen til udvælgelse af de transformerede prokaryotiske celler. Shuttle-vektoren har en dermed sammenlignelig phenotypemarkørændring til udvælgelse af transformerede eukaryotiske celler. Ideelt med henblik på eks-25 pression af IL-1 på højt niveau fjernes alle proteinkodningssekvenser fra den eukaryotiske promotorsekvens for at undgå ekspression af et uønsket protein. Til dette formål knyttes også en naturlig eller syntetisk initiatorkodonsekvens, d.v.s ATG til 5'-enden af det indførte kodningsområde for IL-1-genet.

30 En foretrukket shuttlevektor for udøvelse af opfindelsen betegnes pY ADH. Som illustreret skematisk i fig. 5 indbefatter pY ADH-plasmidet et replikati onsområde (fra plasmid pBR322) af hensyn til høj kopi DNA- p ekspression i E. coli og et ampici11 in ("Amp ) resistensgen af hensyn til udvælgelse af transformerede E. coli-celler. Shuttlevektoren indbe-35 fatter også 2u cirkel området for repli kation og et gær Trp I gen af hensyn til udvælgelse af transformerede gærværter i gær (trp minus) auxo-trofer. Shuttlevektoren indbefatter yderligere gærpromotorsekvensen fra al koholdehydrogenasegenet ("ADH") af hensyn til propagering af plasmidet DK 168048 B1 23 i både gær- og E. coli-værter. Denne promotorsekvens er specielt fordelagtig til anvendelse ifølge opfindelsen på grund af det høje niveau af ekspression af dette gen i gær, og fordi den fuldstændige DNA-sekvens af dette gen er kendt. Alle proteinkodningssekvenser, herunder initiator 5 ATG-kodonet, er blevet fjernet fra ADH-promotorfragmentet. pY ADH shuttlevektoren indbefatter et antal enestående substratsteder for spaltning med restriktionsenzymer, d.v.s. Eco RI og Stu I.

Som illustreret i fig. 5 fremstilles pY ADH IL-1 plasmidet som en ekspressionsvektor for ekspression af IL-1 gen ved indføring af kod-10 ningsområdet af IL-1 genet i plasmid pY ADH. Prøver af denne shuttlevek-tor er deponeret ved American Type Culture Collection ("ATCC") 12361 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, under accessions nr. 39967.

IL-1 genets kodningsområde fjernes fra det ovenfor fremstillede cDNA plasmid. På grund af fraværet af et enestående restriktionsenzymsspalt-15 ningssted præcist ved 5'-enden af IL-1 genets kodningsområde spaltes et større afsnit af kodningsområdet fra plasmid cDNA'et med restriktionsenzymerne Hpa II og Pst I. Hpa II stedet befinder sig en lille smule ne-denstrøms for 5'-enden af genkodningsområdet. Derefter syntetiseres et syntetisk oligonukleotid indeholdende den spaltede 5'-ende af genet ke-20 mi sk med en Hpa II kohesiv 3'-terminal af hensyn til bekvem ligering til det "naturlige" hoved IL-1 cDNA-fragment. Da alle proteinkodningssekvenserne nedenstrøms for ADH-promotorsekvensen fjernedes som anført ovenfor, syntetiseres det syntetiske oligonukleotid med en ATG-initierings-kodon ved 5'-enden.

25 IL-1 cDNA-fragmentet indføres sammen med det syntetiske oligonukleotid i shuttlevektor pY ADH, som tidligere er nedbrudt med passende restriktionsenzymer svarende til konfigurationerne af det syntetiske oligonukleotids 5'-terminal og hoved IL-1 cDNA-fragmentets 3'-terminal.

Den resulterende rekombinant shuttlevektor pY ADH IL-1 anvendes til 30 transformation af en prokaryotisk vært, f.eks. E. coli, af hensyn til høj kopi forstærkning af shuttlevektoren. Efter denne indledende transformationsproces isoleres rekombinant shuttlevektoren fra E. coli værten og anvendes derefter til at transformere en eukaryotisk vært, f.eks. gærceller, for ekspression af IL-1 på højt niveau. De transformerede 35 gærceller udvindes, og den resulterende supernatant analyseres for biologisk aktivitet under anvendelse af de ovenfor beskrevne thymocytproli-ferations- og/eller IL-1 omdannelsesanalyser.

Fremgangsmåder og produkter ifølge opfindelsen illustreres nærmere DK 168048 B1 24 i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af IL-1 5 Leukocytkoncentrater med et volumen på 350-400 ml, opnået ud fra humant fuldblod (blanding fra Portland, Oregon Røde Kors), blandedes med og fortyndedes med Ca++, Mg++ frit phosphatpuffer tilsat saline ("PBS) anbragt som lag på "Histopaque" (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) og centrifugeredes derefter ved 600 x g i 30 minutter ved stuetempera-10 tur. Grænsefladelaget bestående af leukocyterne fjernedes, vaskedes med PBS og centrifugeredes ved 200 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Cellerne vaskedes yderligere to gange i Ca++, Mg++ frit PBS og centrifugeredes ved 200 x g i 10 minutter efter hver vask.

De resulterende enkeltkernede celler dyrkedes i en koncentration på 15 2 x 106 celler/ml i rotationskolber i MEM medium. Mediet suppleredes med 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, 2 mM glutamin, 0,2 mM gentamycin, 10 mM HEPES, pH 7,4. Cellerne stimuleredes til IL-l-produk-tion ved tilsætning af 0,01 mg/ml varmeinaktiveret formalinfikseret Staphylococcus aureus (Igsorb, The Enzyme Center, Inc., Malden, MA). For 20 at reducere produktionen af kontaminerende proteiner sattes der ikke serum til dyrkningsmediet. Efter inkubation i 24 timer ved 35eC i en fugtet atmosfære af 5% C02 i luft centrifugeredes kulturen ved 7.000 x g i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter supernatanten fjernedes og opbevaredes ved -20°C i polypropylenflasker indtil brug.

25

Eksempel 2

Ionbytningskromatografi IL-l-holdige supernatanter, som fremstillet i eksempel 1, rensedes ved kationbytningskromatografi og anionbytningskromatografi. Disse kro-30 matografiske procedurer udførtes ved 4°C, og de derved anvendte geler forbehandledes med 0,1% "Triton-X" og 10 vol/vol% kalvefosterserum for at reducere ikke-specifik absorption af IL-l-aktivitet i harpikserne.

Før de kromatografiske procedurer analyseredes kultursupernatanten som beskrevet ovenfor. De rå IL-l-opløsninger fandtes at have en typisk sam-35 let aktivitet på 1,98 x 107 U, en specifik aktivitet 6,37 x 104 U/mg prøve og et samlet proteinindhold på 3,11 x 105 ug.

DK 168048 B1 25 ( A. Kationbytningskromatograf!

Kultursupernatantens ionstyrke indstilledes ved tilsætning af 1 M natriumcitritpuffer, pH 4,0, til en slutkoncentration på 10 mM citrit og reduceredes også til et pH på 4,0 med koncentreret HC1. Den således ind-5 stillede supernatant overførtes til en 30 x 1,6 cm søjle af "sulfopropyl Sephadex ("SPS") C-25" (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), som forud var ligevægtsindstillet med samme puffer sammen med 150 mM NaCl, pH 4,0. Kultursupernatanten fyldtes på søjlen med en hastighed på 400 ml/time.

10 Efter afslutning af opfyldningen vaskedes søjlen med 10 søjlevolumener 10 mM 2-N-morpholinoethansulfonsyre("MES")puffer, pH 5,0, for at fjerne ubundet protein. Derefter elueredes det bundne protein fra søjlen med fire søjlevolumener 10 mM Tris-HCl, pH 8,1, fyldt på søjlen med en hastighed på 50 ml/time. En søjles pH fandtes at stige efter tilførsel 15 af ca. tre søjlevolumener af elueringsmidlet med eluering af IL-l-toppen som resultat. Søjlefraktioner opsamledes og analyseredes som diskuteret ovenfor.

Ansøgerne fandt, at det fra kationbyttersøjlen eluerede IL-1 udviste en aktivitet på ca. 1,1 x 107 U og en specifik aktivitet på ca.

20 2,10 x 105 U/mg, hvorved der omtrent opnåedes en tre-fold forøgelse i IL-l-aktivitet under bibeholdelse af ca. 56% af det oprindelige IL-1. Endvidere fjernedes ca. 80% af de kontaminerende proteiner ved kation-bytni ngskromatografi proceduren.

25 B. Anionbytningskromatografi

Det sammenbl åndede koncentrat fra kationbytningssøjlen rensedes yderligere ved anionbytningskromatografi på en søjle af "DEAE-Sephacel" (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ). "DEAE-Sephacel"-søjlen lige-vægtsindstilledes med 10 mM Tris-HCl, pH 8,1. Da IL-1 elueredes fra SPS-30 søjlen med samme ligevægtsindstillingspuffer fyldtes SPS-forrådet direkte på "DEAE-SephaceT'-søjlen med en hastighed på 20 ml/time, hvorved eventuelt aktivitetstab ved dialyse blev undgåedet. Efter opfyldning vaskedes søjlen med fem søjlevolumener af samme ligevægtsindstillingspuffer, hvorefter eluering udførtes med en lineær gradient af fire søj-35 levolumener 0-400 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,1.

Ansøgerne fandt, at IL-l-aktiviteten eluerede i en skarp top ved 0,08-0,12 M NaCl. SDS-PAGE analyse af de eluerede fraktioner afslørede nogle kontaminanter med høj molekylvægt samt tre større molekylvægtsbånd DK 168048 Bl 26 på ca. 17.500, 15.000 og 12.000 dalton. Analyse af søjleeluatet afslørede en samlet aktivitet på 7,75 x 106 U, en specifik aktivitet på 2,58 x 10® U/mg, totalprotein på 3 x 103 ug og et udbytte på ca. 39%.

5 Eksempel 3

Affinitetskromatoqrafi

De aktive fraktioner fra eksempel 2 sammenblandedes for yderligere rensning ved affinitetskromatografi under anvendelse af en 10 x 1,6 cm søjle og farvestof-liganden "Procion" rødt farvestof koblet til en aga-10 rose matrix (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD, Cat. nr. 5926 SA), som forud var ligevægtsindstillet i 10 mM Tris-HCl puffer, pH 8,1.

For at optimere bindingen af IL-1 til farvestofligandsøjlen sænkedes "DEAE-Sephacel"-forrådets ionstyrke til under 40 mM ved fortynding af forrådet i forholdet 1:4 i 10 mM Tris-HCl puffer, pH 8,1. Farvestof-li-15 gandsøjlen vaskedes først med 4 søjlevolumener af samme udgangspuffer for at fjerne ubundet protein, hvorefter eluering udførtes med en lineær gradient bestående af femten søjlevolumener 0 til 1,0 M NaCl i 10 mM Tris-HCl puffer, pH 8,1. Ansøgerne har fundet, at IL-1 aktiviteten typisk elueredes i en skarp top ved 0,50 til 0,55 M NaCl. Søjlefraktioner 20 opsamledes og analyseredes som beskrevet ovenfor.

SDS-PAGE-analyse af de IL-1 aktive fraktioner afslørede et enkelt proteinbånd med en molekylvægt på ca. 17.500 dalton. De ovenfor anførte højmolekylvægtsbånd elueredes i gennemløbet fra søjlen, og lavmolekylvægtsbåndene på 15.000 og 12.000 dalton elueredes ved en højere saltkon-25 centration. Analyser udført på de aktive IL-1 fraktioner afslørede en samlet IL-1 aktivitet på ca. 6,2 x 106 U, en specifik aktivitet på ca.

9,5 x 10® U/ml og et samlet proteinindhold på ca. 6,5 ug. Dette svarer til en samlet renhed af IL-1 på mere end 99% og et udbytte på ca. 31% ud fra udgangssupernatanterne. Det fremgår klart af det enkelte protein-30 bånd, der opnåedes ved SDS-PAGE og sølvfarvning af de efter farvestof-ligandaffinitetskromatografi opsamlede fraktioner, og også af de specifikke aktiviteter af de analyserede fraktioner, at der ved den foreliggende opfindelse i det væsentlige opnåedes homogenitet af IL-1 molekylet samtidig med at et højt udbytte af IL-1 bi beholdtes.

35 Det homogene IL-1 opnået ved farvestofigandaffinitetskromatografien analyseredes også ved to-dimensionel polyacrylamidgel elektroforese kombineret med sølvfarvning som anført ovenfor. Denne procedure gav konsekvent fire farvningspletter ved nøjagtig samme molekylvægt d.v.s. 17.500 i > DK 168048 B1 27 dalton og gav samme farve ved sølvfarvning. Pletterne befandt sig altid i samme position og i samme relative mængder, uanset hvilket parti ud-gangsupernatant der anvendtes. Den mest intense plet har vist et pi på 6,3 til 5,9. De andre tre pletter farves mindre intenst, da pH gradien-5 ten bliver mere sur. Disse resultater indikerer, at human IL-1 eksisterer in vivo i forskelligt ladede stadier muligvis forårsaget af forskellige amideringsstadier. Det forhold, at sølvfarvningen giver nøjagtig samme farve for hver plet, indikerer, at det samme grundprotein sandsynligvis farves i alle tilfælde.

10

Eksempel 4

Affinitetskromatografi-blåt farvestof

Som en alternativ procedure til eksempel 3 sammenblandes aktive fraktioner fra eksempel 2 og renses derefter yderligere i det væsentlige 15 ved samme affinitetskromatografiteknik, som anvendt i eksempel 3 bortset fra, at farvestofliganden bestod af "Cibacron® Blue 36A"-farvestof tværbundet til en agarose matrix (Bethesda Research Laboratories,

Bethesda, MD, Cat. nr. 50'904 SA). Analyser udført på de aktive fraktioner afslørede en samlet aktivitet af IL-1 på ca. 5,0 x 106 U og en 20 specifik aktivitet på ca. 7,6 x 10® U/mg, hvilket er ca. 80% af den aktivitet, der er til stede i det fra det røde farvestof hidrørende IL- 1. For at opnå større renhed kan de aktive fraktioner fra blåt-farve-stof-ligandaffinitetskromatografien opsamles, og processen gentages.

25 Eksempel 5

Aminosyresammensætningsanalyse

Renset IL-1 fra eksempel 3 eller 4 kogtes i vakuum i 5,7 N HC1 (gendestilieret fra koncentreret HC1 (Kodak, Rochester, NY)) i 24 og 48 timer for at fremkalde hydrolyse af peptidbindinger og frigøre frie ami-30 nosyrer. Efter hydrolyse tørredes prøver under vakuum og suspenderedes så igen i 0,2 N natriumcitrat, pH 2,2. Prøverne injiceredes så i en en-keltsøjlet aminosyreanalysator af typen "LKB Model 4150 Alpha" (Cambridge, England), der anvender ninhydrinpåvisning. Arealerne af ud-gangs-"toppene" svarende til mængderne af specielle tilstedeværende ami-35 nosyrer integreredes med en registrerende integrator af typen "LKB Model 2220".

Aminosyresammensætningen af human IL-1 bestemt ved den nuværende teknik er anført i tabel I nedenfor. Som angivet i tabel I, iagttoges DK 168048 B1 28 der intet glucosamin eller galactosamin ved ovenstående aminosyreanaly-se, hvilket svarer til ansøgernes tidligere iagttagelser, at human IL-1 migrerer som en enkelt molekylvægtstype på polyacrylamidgel er. Den ene af disse iagttagelser eller begge ville sandsynligvis være modsat, hvis 5 human IL-1 indbefattede tilknyttede carbohydratgrupper. Det er således usandsynligt, at human IL-1 er et glycoprotein.

Tabel 1 10 Aminosyreanalyse af human IL-1

Aminosyre Antal rester per molekyle

Asp/Asn 14 15 Thr 8

Ser 11

Glu/Gln 22

Pro 6

Gly 11 20 Ala 8

Cys 1*

Val 11

Met 4

Ile 6 25 Leu 11

Tyr 4

Phe 11

His 3

Lys 13 30 Arg 3 * Bestemt ved aminosyresekvensanalyse.

35 Eksempel 6

Aminosyresekvensanalyse af N-terminal afsnit af molekyle

Fraktioner indeholdende homogent IL-1 fra farvestof-ligandaffini-tetskromatografi procedurerne i eksempel 3 eller 4 fortyndedes først 10- DK 168048 Bl 29 fold med afioniseret destilleret vand, indstillet til pH 4,0 med 1 N HC1 og overførtes derefter til en "SPS C-25"-kromatografisøjle med et lejevolumen på 0,5 ml. Før tilsætningen af IL-1 ligevægtsindstilledes søjlen med en puffer bestående af 0,1 M natriumcitrat, 0,05 M NaCl, pH 4,0. Ef-5 ter påfyldning af IL-1 vaskedes søjlen med 10 ml af samme ligevægtsindstillingspuffer efterfulgt af 20 ml afioniseret destilleret vand. Derefter elueredes IL-1 med 10 mM natriumborat, pH 9,0.

Til en første sekvensbestemmelsesanalyseprocedure tørredes 11,1 ug homogent IL-1 koncentreret som ovenfor og underkastedes derefter direkte 10 automatiseret aminoterminal-Edman-nedbrydning under anvendelse af et proteinsekvensbestemmelsesapparat af typen "Applied Biosystems Model 470". Ved denne procedure iagttog ansøgerne, at IL-1-molekylets N-termi-nalafsnit var opbygget af følgende sekvens af aminosyrerester: NH^-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-15 Met

Ved en anden sekvensbestemmelsesanalyseprocedure fraktioneredes det homogene IL-1 med enzymet trypsin og underkastedes derefter automatiseret sekvensbestemmelsesanalyse. Før fraktionering af IL-l-molekylerne med trypsin blokeredes lys i nresternes sidekæder med det specifikke mid-20 del citraconsyreanhydrid. Til dette formål koncentreredes fraktioner fra "SPS C-25"-søjleeluatet i vakuum til et slutvolumen på 1 ml. En ul citraconsyreanhydrid (Pierce) sattes til det koncentrerede IL-1, og pH indstilledes derefter til 8,3 med 5 N NaOH. Reaktionsblandingen omrørtes i 15 minutter og henstilledes ved stuetemperatur i 1 time. På dette 25 tidspunkt tilsattes endnu 1 ul citraconsyreanhydrid, reaktionsblandingen omrørtes i yderligere 15 minutter, og blandingen indstilledes derefter til et slut-pH på 8,3 med 5 N NaOH. Efter henstand ved stuetemperatur i yderligere 1 time tilsattes 100 ul 1 M Tris-HCl, pH 7,4 og 100 ul 1 M NH^HCOg, pH 7,8 til reaktionsblandingen for at fuldende blokeringspro-30 cessen.

Derefter sattes 2 ug TPCK-behandlet trypsin (Worthington) (i 10 ul 10 mM HC1, pH 2,0) til reaktionsblandingen for at spalte IL-1-molekylet ved argininresterne. Efter trypsinti Isætningen omrørtes blandingen forsigtigt 5 sekunder og inkuberedes derefter ved 37°C i 2 timer. Efter af-35 slutning af inkubationsperioden tilsattes yderligere 2 ug TPCK-behandlet trypsin, og blandingen inkuberedes ved 37°C i yderligere 2 timer. Så køledes blandingen til stuetemperatur og indstilledes til pH 2,5 med 90% myresyre (Baker). Efter henstand ved stuetemperatur i 4 timer fortynde- DK 168048 B1 30 des den surgjorte blanding ved tilsætning af 0,5 ml 6 M guanidin-HCl og injiceredes derefter i en 4,6 x 250 mm "Vydac 218 TP"-søjle, som på forhånd var ligevægtsindstillet med 0,1 vol/vol% TFA i vand ved en strømningshastighed på ca. 1 mm/min. ved hjælp af en pumpe af typen "Beckman 5 Model 112" (Beckman Instruments, Division of Smith Kline Beckman). Den opfyldte søjle vaskedes først med 0,1 vol/vol% TFA i vand for at fjerne ikke-bundne komponenter, hvorefter IL-l-peptiderne elueredes fra søjlen med en lineær gradient af 0-100% acetonitril i 0,1 vol/vol% TFA med en hastighed på 0,5%/min ved en strømningshastighed på 1 mm/min. Elueringen 10 af peptiderne påvistes ved spektrofotometri med ultraviolet lys ved en bølgelængde på 230 nanometer.

Individuelle fraktioner eller forråd bestående af to eller flere fraktioner indeholdende IL-l-peptider underkastedes sekvensbestemmelse ved automatiseret aminoterminal-Edman-nedbrydning. Før sekvensbestemmel-15 sen analyseredes HPLC-fraktionerne indeholdende IL-1 ved gelelektrofore-se for at bestemme antallet af peptider i hver fraktion. Derefter koncentreredes peptiderne i vakuum til slutvolumener på ca. 30 ul, anbragtes som pletter på et konditioneret filter og tørredes derefter i et varmekammer ved 44°C. Det tørrede filter anbragtes i et automatiseret 20 proteinsekvensbestemmelsesapparat af typen "Applied Biosystems Model nr. 470A". Ved denne procedure iagttog ansøgerne, at et hovedfragment af human IL-1-molekylet nær dets N-terminalafsnit er opbygget af følgende sekvens af aminosyrerester: Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-A1a-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe. De første 25 fire rester ved N-terminal-enden af denne sekvens falder sammen med de sidste fire rester ved C-terminal enden af den sekvens, der bestemtes ovenfor ved direkte automatiseret proteinsekvensbestemmelse, hvilket fører til den konklusion, at denne mellemliggende sekvens er en fortsættelse af den ovenfor anførte N-terminal sekvens.

30

Eksempel 7 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene)

Enkeltkernede celler fremstillet som omtalt ovenfor i det første afsnit af eksempel 1 sattes til plastdyrkningskolber i "RPMI-1640"-me-dium sammen med 10 vol/vol% bovinfosterserum. Efter to timers inkubation 35 ved 37°C fradekanteredes ikke-vedhæftende celler, og kolberne fyldtes igen med yderligere serum-suppleret "RPMI-1640"-medium indeholdende 20 ug/ml E. coli LPS ved 20 ug/ml. 16 timer senere blev vedhæftende LPS-stimulerede celler udvundet til RNA.

> DK 168048 B1 31

Alt RNA ekstraheredes fra de vedhæftende enkeltkernede celler ved den af Chirgwin et al., supra, beskrevne metode. Ved denne procedure anvendtes guanidiniumthiocyanat til denaturering af celleproteinet indbefattende RNasen ved en hastighed, der overstiger hastigheden af RNA-hy-5 drolyse med RNase. mRNA'et fjernedes fra celleproteinet ved ultracentri-fugering gennem en tæt pude af cæsiumchlorid.

Derefter adskiltes polyadenyleret mRNA fra det ekstraherede protein på en oligo (dT)-cel!ulosekromatografi søjle under anvendelse af den af Maniatis et al., supra, ved 197 beskrevne metode. I korte træk præpare-10 redes søjlen med applikationspuffer bestående af 20 mM Tris-Cl (pH 7,6), 0,5 M NaCl, 1 mM ethylendiamintetraacetat ("EDTA") og 0,1% SDS. Proteinpillen opløstes i vand og applikationspuffer og fyldtes derefter på søjlen. Det ikke-adsorberede materiale elueredes ved indledende vask med applikationspuffer efterfulgt af yderligere vask flere gange med appli-15 kationspuffer indeholdende 0,1 M NaCl. Det tilbageholdte polyadenylerede mRNA elueredes med puffere af reduceret ionstyrke bestående af 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 1 mM EDTA og 0,05% SDS. Det eluerede polyadenylerede mRNA fældedes ved -20°C med 1/10 volumen natriumacetat (3 M, pH 5,2) og 2,2 volumener ethanol. Efter eluering af det polyadenylerede mRNA fra 20 oligo (dT)-cel!ulosesøjlen bekræftedes det polyadenylerede mRNA's integritet ved elektroforese gennem agarosegeler som beskrevet i detaljer i Maniatis et al., supra, ved 199.

De polyadenylerede mRNA opdel tes efter størrelse ved elektroforese gennem methyl kviksølvagarose. Gelfraktioner svarende til forskellige 25 størrelseskategorier af mRNA tranlateredes derefter in vitro enten ved anvendelse af kaninretikulocytlysater eller ved injektion i frø X. lae-vis oocyter som ovenfor beskrevet. Fluider frigjort ved enten retikulo-cyttranslationer eller ved hjælp af mRNA-injicerede oocyter testedes derefter for tilstedeværelse af IL-l-aktivitet under anvendelse af de 30 ovenfor anførte analyser. mRNA gel fraktioner, som translateret in vitro forårsagede IL-l-aktivitet, udvalgtes som kilde for mRNA til cDNA-kon-struktion.

Eksempel 8 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene) 35 Konstruktion af cDNA-bibliotek

Et bibliotek af dobbeltstrenget cDNA svarende til mRNA'et fremstilledes ud fra det rensede mRNA i eksempel 7 ved anvendelse af den af Maniatis et al., supra, ved 229 beskrevne standardprocedure. 01igo-dT

DK 168048 B1 32 hybridiseredes til den polyadenylerede hale af mRNA for at tjene som primer for den reverse transkription af den første cDNA-streng. Enzymet aviær myeloblastosis virus ("AMV") revers transkriptase syntetiserede den første DNA-streng ved anvendelse af mRNA'et som tempi at. Denne pro-5 cedure resulterede i, at der dannedes en hårnåleløkke ved 3'-enden af den indledende cDNA-streng, der tjente som integreret primer for den anden cDNA-streng. Efter at mRNA-strengen var blevet nedbrudt med NaOH, syntetiseredes den anden cDNA-streng med DNA-polymerase I. Hårnålen fjernedes så med nuklease SI til frembringelse af dobbeltstrengede cDNA-10 molekyler.

Det dobbeltstrengede cDNA fraktioneredes i større!seskategorier ved "Sephacryl S-400” (Pharmacia Fine Chemicals) søjlekromatografi og overvågedes ved analyse under anvendelse af alkalisk agaroseelektroforese, hvortil der benyttedes endemærkede fragmenter af pBR322 DNA som molekyl-15 vægtsmarkører. DNA-strenge med en længde på mindre end 500 bp frasorteredes for at undgå unødvendig kloning af disse for små cDNA-fragmenter.

De ovenfor fremstillede dobbeltstrengede cDNA-fraktioner indførtes på Pst I stedet i pBR322 plasmidet (Pharmacia Fine Chemicals) ved den af Maniatis et al., supra, begyndende, ved 239 beskrevne metode. Ved denne 20 procedure forsynedes det dobbeltstrengede cDNA med hale med poly (dC) ved 3'-enderne. Plasmidet pBR322 blev nedbrudt med Pst I endonuklease og forsynedes derefter med hale med poly (dG) ved 3'-enderne. Det med hale forsynede plasmid DNA og det med hale forsynede cDNA underkastedes annealing med anneal ingspuffer 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-Cl (pH 7,8) og 10 25 mM ETDA) til dannelse af hidtil ukendte rekombinant plasmider. Alle heri beskrevne restriktionsenzymer kan fås i handelen fra New England Biolabs, Beverly, MA.

Rekombinant-plasmiderne transformeredes i E. coli stamme MM294 ved anvendelse af proceduren ifølge Hanahan, supra, hvorved E. coli cellerne 2+ 30 behandledes ved vækst ved forhøjet indhold af Mg . Transformationsværterne pletteredes, og transformanterne identificeredes derefter ved anvendelse af tetracyclin som phenotype identifikator. Ved anvendelse af denne teknik opnåede ansøgerne ca. 2 x 106 uafhængige tranformanter.

35 Eksempel 9 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene) Fremstilling af syntetiske oligonukleotidscreeninqsprober

Et syntetisk oligonukleotid anvendtes som probe ved screening af cDNA-biblioteket fremstillet som anført ovenfor i eksempel 8. Proben var DK 168048 B1 33 opbygget som følger: 5' AC TTG TTG TTC CAT GTC TTG GCC TTG CAG GTG CAG GGC TTT CAG TTC GTA GGG GCC GGA CAT 3'. Oligonukleotidproben syntetiseredes kemisk ved triestermetoden som beskrevet nærmere af Sood et al., supra, og Hirose et al., supra.

5 Efter afslutning af kemisk syntese mærkedes 5'-enderne af oligonu- kleotidproberne med 32P. For at lette mærkning syntetiseredes oligo-nukleotidets 5'-ender med OH-terminaler, hvorved den phosphatase-behand-ling, som typisk må anvendes ved mærkning af DNA-fragmenter, eliminere des. Mærkningsprotokollen indbefattede tilsætning af 1 ul af de synteti-10 ske oligonukleotider til 16 ul 32P-ATP (3000 ci/mM), 1 ul (10 U) T4-polynukleotidkinase og 2 ul 10 x kinasepuffer I. Denne 10 x kinasepuffer I bestod af 0,5 M Tris-Cl (pH 7,6), 0,1 M MgClg, 50 mM dithiothreitol, 1 mM spermidin og 1 mM EDTA. Reaktionen udførtes ved 37°C i 30 min., hvorefter de syntetiserede oligonukleotider ekstraheredes med phenol/chloro-15 form. De mærkede prober adskiltes fra umærkede oligonukleotider ved kromatografi på eller centrifugering gennem "Sephadex G-50"søjler (Pharmacia Fine Chemicals).

Eksempel 10 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene) 20 Screening af cDNA bibliotek

For at lette indledende screening af det i eksempel 9 ovenfor fremstillede cDNA-bibliotek sammenblandedes de transformerede bakteriekulturer i grupper hver med ca. 2.000 tranformanter forskellige kloner. Plasmid DNA fjernedes fra prøver af værtsbakterien ved standardmetode til 25 alkalisk lyse som beskrevet nærmere af Ish-Horowicz and Burke, 9 Nucl. Acids. Res. 2989 (1981). De isolerede plasmider adskiltes i to fragmen ter. Dette opnåedes ved indledende fuldstændig nedbrydning af pi asmiderne med Pvu II og Hind III. Til dette formål genopløstes pi asmiderne i 20 ul 1 x Hind III puffer (7 mM Tris, (pH 7,4), 7 mM magnesiumchlorid, 60 30 mM NaCl), og 1 ul Pvu II og 1 ul Hind III restriktionsendonuklease tilsattes derefter. Denne blanding inkuberedes ved 37eC i to timer.

Derefter fraktioneredes plasmidnedbrydningsprodukterne ved elektro-forese gennem 0,8% agarosegel med markører af passende størrelse. Agaro-segelen overførtes ved blotting til nitrocellulosefil tre under anvendel-35 se af den af Southern, supra, beskrevne standardmetode. Efter overføringsprocessen lufttørredes filtret og bagtes to timer ved ca. 80°C under vakuum for at binde DNA-fragmenterne til nitrocellulosen.

Derefter hybridi seredes det bundne DNA med de mærkede oligonukleo- DK 168048 B1 34 tidprober. I korte træk udbi ødtes den bagte nitrocellulose igen i 6 x salinenatriumcitrat ("SSC") (20 x SSC er sammensat af 175,3 g NaCl og 88,3 g natriumcitrat i 800 ml f^O, med pH indstillet til 7,0 med ION NaOH) og inkuberedes derefter ved 50eC i 2 til 4 timer i præhybridise-5 ringspuffer bestående af 6 x SSC, 0,5% "NP40" detergent, 0,1% sareosyl, 5 x Denhardt's opløsning (0,02% "Ficoll", 0,02% polyvinyl pyrrol i don, 0,02% BSA) og 100 mg/ml denatureret laksesperma DNA (Sigma Type III, natriumsalt). Så inkuberedes filtret natten over ved 50eC med den 32P-mærkede oligonukleotidprobe (106 cpm/ug) (fra eksempel 3) i 10 hybridiseringsopløsning som ovenfor anført. Efter hybridisering natten over vaskedes filteret grundigt med 6 x SSC ved stuetemperatur og derefter i 5 min. ved 50'C med 6 x SSC. Efter lufttørring underkastedes filteret autoradiografi ved -70°C.

Ved autoradiografien fandt ansøgerne flere hybridiseringsbånd. For-15 rådet af kloner fra hvilke plasmid DNA'et producerede hybridiserings-båndene pletteredes ud og anvendtes derefter til direkte bakteriekoloni-hybridisering på nitrocellulose papir med den mærkede oligonukleotidprobe under samme hybridiseringsbetingelser som ovenfor. Ved denne proces identificeredes en enkelt positiv koloni.

20

Eksempel 11 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene) Restriktionsenzymkortlægning af screenet cDNA

Plasmid, betegnet IL-1 X-14, fremstilledes ud fra den identificerede positive koloni ved de i eksempel 10 anførte procedurer. Prøver af 25 IL-1 X-14 plasmidet transformeret i E. coli stamme RR1 er deponeret ved ATCC under accessions nr. 39925. Derefter analyseredes IL-1 X-14 plasmidet ved restriktionsenzymkortlægning under anvendelse af den af Smith og Birnstiel, supra, udviklede teknik, der involverer delvis nedbrydning af endemærkede fragmenter af det lineariserede DNA. DNA-fragmenterne mærkes 30 ved deres 5'-terminaler med 32P-phosphorylgrupper under anvendelse af phosphorkinase og 32P - ATP. De mærkede DNA-strenge spaltedes derefter asymmetrisk med et passende restriktionsenzym til frembringelse af to fragmenter, som hver kun var mærket ved den ene ende. Disse mærkede fragmenter i soleredes ved gelelektroforese. Hvert af de to fragmenter 35 blev delvis nedbrudt ved hjælp af passende restriktionsenzymer. Selv om der kan fremstilles et stort spektrum af nedbrydningsfragmenter, danner de mærkede fragmenter en simpel overlappende serie, som hver har en fælles mærket terminal. Disse fragmenter fraktioneredes ved gel elektrofore- DK 168048 B1 35 se og undersøgtes derefter ved autoradiografi. Fragmenternes placering på gelen svarer direkte til rækkefølgen af restriktionsstederne langs plasmid DNA'et.

Ved denne fremgangsmåde har ansøgerne delvis kortlagt IL-1 X-14 5 plasmidets restriktionssteder i IL-1 genets område som vist i fig. 3. Tallene, der er vist mellem restriktionsstederne i genet, svarer til de omtrentlige afstande mellem stederne i basepar.

Eksempel 12 (ikke et eksempel ifølge opfindelsen som angivet i kravene)

10 Sekvensbestemmelse af screenet cDNA

Det i fig. 3 viste DNA-segment sekvensbestemtes ved dideoxykædeter-mineringsmetoden i det væsentlige som beskrevet i Amersham Handbook, supra, med de nedenfor anførte variationer. DNA-segmentet blev nedbrudt med Hind III og Pst I restriktionsendonukleaser, og de resulterende DNA-15 fragmenter blev derefter klonet i stammer mpl8 og mpl9 af den enkeltstrengede M13 filament fagvektor (Amersham, Arlington Heights,

Illinois). mpl8 og mpl9 fagvektorerne indeholder, som anført i Norrander et al., supra, følgende enestående kloningssteder: Hind III, Sph I; Pst I; Sal I; Acc I; Hine II; Xba I; BamHI; Xma I; Sma I; Κρη I; Sst I; og 20 EcoRI. Sammensætningen af mpl8 og mpl9 vektorerne er identisk bortset fra at rækkefølgen af de ovenfor anførte restriktionssteder er modsat i mpl9 vektoren, således at begge strenge i et DNA-segment bekvemt kan sekvensbestemmes med de to vektorer. mpl8 og mpl9 vektorerne med fragmenter af cDNA-segmentet ifølge fig. 3 indført deri anvendtes til trans-25 formation af E. coli JM103 og JM105 af stamme K12 (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) til frembringelse af replikerede enkeltstrengede DNA-templater indeholdende enkeltstrengede indskud af sense og antisense strengene.

Den syntetiske universal primer: 5'-CCCAGTCACGACGTT-3' (P-L Bio-30 Chemicals, Milwaukee, Wisconsin) anneal edes til de enkeltstrengede DNA-templater og anvendtes til priming af DNA-syntese ovenstrøms og ne-denstrøms for et sted mellem nukleotiderne 476 og 477 (fig. 4) som beskrevet ovenfor på side 22. Derefter adskiltes udvidelsesfragmenterne efter størrelse ved gelelektroforese og autoradiograferedes, og nukleo-35 tidsekvenserne for fragmenterne udi edtes af disse resultater. Tre yderligere primere anvendtes til at prime syntese fra mellemliggende områder langs sense strengene i DNA-segmentet ifølge fig. 4. En primer med sammensætningen 5'CTGGAGAGTGTAGATCC-3' svarende til nukleotiderne 671 til DK 168048 B1 36 688 (fig. 4) anvendtes til at prime syntese af sense strengen i neden-strøms retning fra nukletid nr. 688. Sammensætningen af denne primerstreng blev fastslået ud fra den sekvensinformation, der var opnået tidligere ved anvendelse af universalprimeren. En anden syntetisk primer af 5 sammensætnigen: 5'-GATATAACTGACTTCAC-3' (svarende til nukleotiderne 851 til 868 i fig. 4) anvendtes til sekvensbestemmelse af sense strengen i nedenstrøms retning fra nukleotid nr. 868. En tredie primer med sekvens 5'-GATTCGTAGCTGGATGC-3' (svarende til nukleotiderne nr. 235 til nr. 218) anvendtes til at sekvensbestemme antisense strengen i ovenstrøms retning 10 fra nukleotid nr. 218.

Ved ovenstående "vandrings"-metode sekvensbestemtes begge strenge af plasmid cDNA'et i fig. 3 på overlappende rigelig måde, hvorved deres nukleotidsekvens bekræftedes. Det må forstås, at andre syntetiske prime-re kunne være blevet anvendt til at initiere kædeudvidelser fra andre 15 steder langs strengen inden for opfindelsens rammer. Ovenstående primerstrenge syntetiseredes kemisk ved tri estermetoden, som beskrevet af Sood et al., supra, og Hirose et al., supra. Det må imidlertid forstås, at andre velkendte teknikker såsom phosphodiestermetoden kan anvendes til at syntetisere primerstrengene.

20 Deoxyadenosin 5' (alpha-[35S] thio) triphosphat (herefter "dATP [alpha-35S]") anvendtes som radioaktiv markør ved dideoxysekvensbe-stemmelsesreaktionerne. Desuden anvendtes i stedet for den på side 36 i Amersham Handbook anførte gel en 6% polyacrylamidgel (6% polyacrylamidgel, 0,4 mm tyk, indeholdende 7 M urinstof, 100 mM Trisborat (pH 8,1) og 25 2 mM EDTA).

Som nævnt ovenfor illustreres nukleotidsekvensen af plasmid DNA'et i fig. 3 i fig. 4. Dette DNA-segment fandtes at indbefatte det område af IL-l-genet, som koder for modent IL-1. Nukleotiderne er nummeret fra begyndelsen af DNA-segmentet i fig. 4. De tilsvarende aminosyrer bestemt 30 ved nukleotidsekvens- og ved proteinsekvensanalysen er anført oven over de passende kodoner. Aminosyresammensætningen af IL-l-genet strækker sig fra den modne NHg-terminal af IL-1-molekylet, d.v.s Ala-resten vist ved en pil i fig. 4 (hvorfra nummeringen af aminosyreresterne begynder) til Ser-resten (nr. 153) umiddelbart forud for terminenngskodonet TAA. For-35 skellige restriktionsenzymspaltningssteder er også vist i fig. 4. Kodningsområdet af IL-l-genet i fig. 4 er illustreret som et indrammet afsnit i fig. 3.

Aminsyresekvensundersøgelser af IL-1 udførtes i henhold til metoden DK 168048 B1 37 ifølge Stern et al., supra, ved hvilken cyanogenbromid anvendtes til at spalte IL-1 ved methioninresterne. De resulterende fragmenter adskiltes efter størrelse ved standardionbytningsmetoder. De isolerede peptidfragmenter underkastedes derefter sekvensbestemmelse ved automatiseret 5 aminoterminal-Edman-nedbrydning under anvendelse af et protein-sekvens-bestemmelsesapparat af typen "Applied Biosystems Model 470". Ved denne proces har ansøgerne bekræftet de resultater, der opnåedes ved nukleo-tidsekvensbestemmelse, nemlig at C-terminalen af IL-l-proteinet er opbygget af aminosyresekvensen: Gln-Phe-Val-Ser-Ser. Dette godtgør, at det 10 "naturlige" IL-1 ikke behandles ved fjernelse af aminosyrer fra denne ende af molekylet efter translation fra mRNA. Dette er signifikant, da det ud fra nukleotidsekvensen af IL-l-genet i fig. 4 er klart, at en signifikant mængde RNA-sekvens fjernes fra N-terminalen af IL-l-genet under modningen af IL-1 ud fra prækusorerne derfor.

15

Eksempel 13

Ekspression af modent IL-1

Kodningsområdet af IL-l-genet fjernedes fra cDNA-klonen i fig. 3 og indførtes derefter i pY ADH shuttlevektoren til dannelse af rekombinant 20 ekspressionsplasmidet pY ADH IL-1. Restruktureringsskemaet for fremstilling af pY ADH IL-1 shuttleekspressionsvektoren vises i fig. 5. Dette plasmid forstærkedes i E. coli værtsceller og anvendtes derefter til transformation af gærværtsceller for ekspression af modent IL-1 på højt niveau. Funktionaliteten af det udtrykte IL-1 bekræftedes ved anvendelse 25 af de ovenfor beskrevne thymocytprol i ferations- og IL-2 omdannelsesanalyser.

En hoveddel af kodningsområdet af IL-l-genet fra Hpa II stedet (base nr. 457 i fig. 4) til 3' flankeområdet af genet fjernedes fra det i fig. 3 og 4 illustrerede cDNA plasmid segment ved anvendelse af Hpa II 30 og Pst I restriktionsenzymerne ved den i Maniatis et al., supra, ved 104 anførte standardprotokol. IL-l-gensegmentet spaltedes fra cDNA-klonen ved Hpa II stedet, som befinder sig 29 nukleotider nedenstrøms for 5'-enden af genet, fordi der ikke fandtes noget bekvemt restriktionssted, som svarede nøjagtigt til genets 5'-terminal. 3'-Pst I stedet i det ud-35 skårne IL-l-gensegmet opfyldtes med T4 DNA polymerase for at skabe en stump ende, der var kompatibel med Stu I stedet i den nedenfor omtalte shuttlevektor.

Et syntetisk oligonukleotid syntetiseredes kemisk for igen at til- DK 168048 B1 38 føje 5'-terminalafsnittet af IL-l-genets kodningsområde og også for at skabe et tranlationsinitieringskodon ved S'-enden af kodningsområdet. Sammensætningen af oligonukleotidet, som er vist i tabel II nedenfor, indbefatter en Eco RI kohesiv 5'-terminal efterfulgt af et ATG-initie-5 ringskodon og derefter 5'-enden af kodningsområdet af IL-l-genet (til Hpa II stedet). Selv om det i tabel II viste oligonukleotid syntetiseredes kemisk ved tri esterteknik som beskrevet af Sood et al., supra, og Hirose et al., supra, må det forstås, at oligonukleotidet kan fremstilles ved andre metoder, såsom ved phosphodiestermetoden.

10

Tabel II

ECO RI Met Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu 5'-AATTCAAC ATG GCA CCT GTA CGA TCA CTG AAC TGC ACG CCT -3'

15 GTTG TAC CGT GGA CAT GCT AGT GAC TTG ACG TGC GAGGC

Hpa II

I stedet for at spalte kodningsområdet af IL-l-genet ved Hpa II 20 stedet kan plasmid cDNA'et i fig. 4 også spaltes ved et restriktionsenzymsted i genets 5'-flankeområde. Derefter kan nukleotiderne i flankeområdet fjernes sekventielt ved standardteknikker.

pY ADH shuttlevektoren fremstilledes med henblik på ligering til det syntetiske oligonukleotid og den udskårne hoveddel af IL-l-genets 25 kodningsområde ved fuldstændig nedbrydning af vektoren med restriktions-endonukleaserne Eco RI og Stu I ved standardteknikker som anført i Maniatis et al., supra, ved 104. Det ønskede større fragment fra nedbrydningen af pY ADH plasmidet isoleredes ved elektroforese på 0,7% agarose gel ved 100 volt og 22°C i 2 timer.

30 Som vist i fig. 1 ligeredes den syntetiske DNA-oligomer, det udskårne hovedafsnit af IL-l-genets kodningsområde og det ønskede lineari-serede pY ADH fragment sammen i en reaktionsblanding sammensat af 100 ug af pY ADH vektorfragmentet (Eco RI - Stu I), 40 ug af IL-l-cDNA hovedfragmentet (Hpa II - Pst I [stump]), 5 ug syntetisk oligonukleotid ( 35 Eco R I - Hpa II), 1 ul T4 DNA-ligase og tilstrækkelig T4-ligasepuffer (0,4 M Tris [pH 7,4], 0,1 M MgC12, 0,1 M dithiothreitol, 10 mM spermi-din, 10 mM ATP og 1 mg/ml BSA) til dannelse af et reaktionsvolumen på 20 ul. Reaktionen udførtes ved inkubation ved 15°C i 15 timer.

DK 168048 B1 39

Det resulterende rekombinant plasmid betegnet pY ADH IL-1 transformeredes derefter i E. coli stamme RRj under anvendelse af standardtransformationsteknikker, f.eks. som anført i Bolivar et al., supra, og Peacock et al., supra. Værtscellerne dyrkedes for at forstærke pY ADH IL-1-5 plasmidet, hvorefter pi asmiderne fjernedes fra værtsbakterien ved alkalisk standardmetode, som beskrevet af Maniatis et al., supra, ved 368 og Ish-Horowicz og Burke, supra. Plasmid DNA'et rensedes ved centrifugering til ligevægt i cæsiumchloridethidiumbromid densitetsgradienter som anført i Maniatis et al., supra, ved 93. Det må forstås, at andre teknik-10 ker til ekstraktion/koncentrering af det forstærkede plasmid DNA fra E. coli kan anvendes inden for opfindelsens rammer.

Det forstærkede pY ADH IL-1 plasmid, der fremstilledes ovenfor anvendtes derefter til transformering af den protasemanglende gærstamme 20B-12 (alpha, pep 4,3, Trp 1) af S. Cerevisiae ved standardteknikker.

15 Før transforamtion dyrkedes 20B-12 stammen i kultur i YP-glucosemedium (200 ml) til kulturer med 2 x 107 celler/ml. Disse celler blev udvundet ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min. ved 22°C, og den resulterende pille vaskedes derefter med sterilt destilleret vand.

Så koncentreredes gærcellerne ved resuspendering i 20 ml SED (1 M 20 sorbitol, 25 mM EDTA [pH 8,0], og 50 mM dithiothreitol) og inkuberedes ved 30°C i 10 minutter. Cel!e-pufferblandingen centrifugeredes derefter i 5 minutter ved 300 x g. Pillen vaskedes en gang med 200 ml 1 M sorbitol, og cellerne resuspenderedes i 20 ml SCE (1 M sorbitol, 0,1 M natriumcitrat [pH 5,8], 0,1 M ETDA). For at nedbryde cellevæggene sattes glu-25 sulase til opløsningen i en mængde på 0,2 ml, hvorefter opløsningen inkuberedes ved 30*C i 30 minutter under lejlighedsvis mild rystning.

Tilstedeværelsen af spheroplaster analyseredes ved fortynding af 10 ul gærceller i en dråbe 5% natriumdodecylsul fat (SDS) (vægt/vol) på et mikroskopobjektglas, idet der ledtes efter "skygger" ved 400 x fasekon-30 trast.

Derefter centrifugeredes celleblandingen ved 300 x g i 3 min. Den resulterende pille vaskedes to gange med 20 ml 1 M sorbitol. Pillen vaskedes så en gang med STC (1 M sorbitol, 10 mM CaCl, 10 mM Tris HC1 [pH 7,5]).

35 Gærspheroplasterne tranformeredes derefter med den tidligere fremstillede plasmidvektor ved en procedure tilrettelagt efter Beggs, 275 Nature (London) 104 (1978). De pelletiserede protoplaster suspenderedes i 1,0 ul STC og deltes derefter i 100 ml portioner i 10 ul engangsrør DK 168048 B1 40 ("Falcon nr. 2059"). Derefter sattes fra 1 til 10 ul af DNA-plasmiderne til hver portion (0,5 til 5 ug). Blandingen henstilledes ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorefter 1 ml PEG (20% PEG 4000, 10 mM CaCl^» 10 mM Tris-HCl [pH 7,4]) sattes til hver portion for at fremme DNA-optagel-5 se. Efter 10 minutter ved stuetemperatur centrifugeredes blandingen ved 350 x g i 5 minutter. Den resulterende pille eller pellet resuspendere-des i 150 ul SOS (10 ml 2 M sorbitol, 6,7 ul YEP [0,13 ml 1 M CaCl, 27 ul 1% leucin, og 3,7 ml H^O]). Denne blanding inkuberedes ved 30°C i 20 minutter.

10 Derefter pletteredes protoplast/DNA-blandingen i nærvær af minimalt gærmedium indeholdende 1,2 M sorbitol og 3% agar ved 45eC og uden tryptophan. Den minimale medium var sammensat af 0,67 "Difco" gær, nitrogen base, 0,5% casaminosyrer, 2% glucose. Ved at opbevare protoplast/DNA-blandingen i dette medium overlevede kun transformanter, d.v.s. sådanne 15 som indeholdt Trp 1 genet.

Før biologisk analyse inokuleredes transformanterne fra det minimale medium i rigt medium (1% gærekstrakt, 2% pepton, 2% glucose) og dyrkedes ved 30°C i 15-20 timer indtil den sene eksponentielle fase. På udvindingstidspunktet tilsattes proteaseinhi bitoren phenylmethyl sulfonyl-20 fluorid (PMSF) til 1 mM. Derefter centrifugeredes kulturen ved 400 x g for at pelleti sere cellerne. Derefter vaskedes cellerne 1 gang i 0,1 vol. koldt HgO. Med henblik på brydning resuspenderedes cellerne i 0,01 vol. koldt H2O indeholdende 1 mM PMSF og hvirvledes med glaskugler (1/3 vol.) i 2 minutter. Celleresterne og glaskuglerne pelletiseredes ved 25 centrifugering. Den resulterende supernatant fandtes at udvise IL-l-ak-tivitet. Dette blev fastslået ved anvendelse af supernatanten fra såvel de ovenfor omtalte thymocytproliterations- som IL-l-omdannelsesanalyser.

?

Claims (12)

1. Proteinsammensætning, KENDETEGNET ved, at den i det væsentlige består af human interleukin-1 med 5 a) en molekylvægt på ca. 17.500 dalton bestemt ved SDS-PAGE, b) et pi på 5,9-6,3, når det er opløseliggjort i en puffer omfattende 2 vægt/vol% SDS og 2 vol/vol% 2-mercaptoethanol forud for elektro-forese, og c) en aminosyresekvens omfattende rækken Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en renset human interleukin-1 som defineret i krav 1 ud fra en rå opløsning af human interleukin-1, KENDETEGNET ved, at man a) eksponerer den rå opløsning af human interleukin-1 for en rødt 20 triazinylfarvestof1 igand bundet til en bærematrix, b) udvasker ubundne komponenter af den rå opløsning fra bærematrixen og eluerer et renset humant interleukin-1 fra farvestof!iganden med en saltgradient. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at rødt triazinyl farvestofliganden omfatter en første og en anden s-triazinring, som er sammenkædet med en aminobenzenringbro, hvor den første og den anden s-triazinring hver har en sulfoneret naphthalensubstituent, hvor hver 30 sulfoneret naphthalengruppe har en substituent, der omfatter en sulfoneret benzenring, som er bundet dertil med en azobro.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at triazinylfarvestofliganden har den i fig. 2 viste struktur. 35

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, KENDETEGNET ved, at den rå opløsning af human interleukin-1 er fremstillet ud fra celler, der er perifere blodleukocyter eller monocyter. DK 168048 B1

6. Interleukin-1 som defineret i krav 1 og/eller fremstilleligt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 2-5 til brug som lægemiddel. 5

7. Farmaceutisk præparat, KENDETEGNET ved, at det som aktiv ingrediens omfatter et protein som defineret i krav 1 og/eller fremstilleligt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 2-5.

8. Farmaceutisk præparat ifølge krav 7 til terapeutisk formidling af en immunologisk reaktion.

9. Farmaceutisk præparat ifølge krav 7 til terapeutisk formidling af en ikke-immunologisk reaktion. 15

10. Farmaceutisk præparat ifølge krav 7 til behandling af autoim-munsygdomme såsom artriti s eller lupus erythematosis.

10 Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val- Val-Phe nær proteinets N-terminal afsnit, hvor proteinsammensætningen påvises som et enkelt bånd ved SDS-PAGE og sølvfarvning og er tilstrækkeligt homogen til at have den ovenfor anførte aminosyresekvens bestemt ved Edman-nedbrydning. 15

11. Farmaceutisk præparat ifølge krav 7 til heling af sår eller 20 forbrændinger.

12. Anvendelse af interleukin-1 som defineret i krav 1 og/eller fremstilleligt ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 2-5 ved fremstilling af et lægemiddel til brug ved 25 i) terapeutisk formidling af en immunologisk reaktion, ii) terapeutisk formidling af en ikke-immunologisk reaktion, iii) behandling af autoimmunsygdomme såsom artritis eller lupus erythematosis eller iv) heling af sår eller forbrændinger. 30 35