JPH01168286A - ラットＩＬ−１α及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新しいラットＩＬ−１α（ｒａｔｌＬ−１α）
及びその遺伝子に関する。

従来の技術 第２回国際リンホカインワークショップにおいて、かつ
てリンパ球活性化因子（Ｌ　ｙｍｐｈｏｃｙｔｅＡｃｔ
ｉｖａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　　；　ＬＡＦ）　、　
？イトジエ０ツク　プロティン（Ｍｉｔｏｇｅ、ｎｉｃ
　　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　、へルバービーク−１（Ｈｅｌ
ｐｅｒ　ｐｅａｋ　−１）　、Ｔリンパ球代替因子［Ｔ
−Ｃｅ１１　ｒｅｐｌａｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ｍ（
Ｔ　ＲＦ　−ｍ）　、Ｔ−ｃｅｌｌ　　ｒｅｐｌａｃｌ
ｎｇ　ｆａｃｔｏｒＭφ（ＴＲＦＭ）］　、Ｂセルアク
チベーティングファクター（Ｂ−ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖ
ａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ
　−ｅｅｌ　Ｉ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａ
ｃｔｏｒ　）等の呼称で報告されてきた生理活性物質は
、いずれもＩＬ−１（インターロイキン−１）なる呼称
に統一されることが決定された［Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、４８．４３３−４３６（１９７９）］
。この決定は、上記各生理活性物質は物質として区別で
きず生理活性を異なる角度から把えて表現していたにす
ぎないとの理由に基づいている。

上記ＩＬ−１は、更に例えば１９２３球やＢリンパ球を
活性化し、ＩＬ−２（インターロイキン２）の産生を冗
進する作用や抗体の産生を冗進する作用を有し、また肝
細胞に作用して蛋白質合成を冗進させる作用、プロスタ
グランデイン産生を冗進させる作用等を有することも報
告されている［Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ　ｌ　ｎｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｖｏｌ、６゜Ｎｏ、１．
　５１−５９　（１９８４）　、Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ。

Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、、３１１．１４１３　（１９８４
）等参照］。

しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に関しては現在
尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活性を有するポ
リペプチドもしくはその前駆体をコードする異なる２種
の遺伝子の存在がようや（報告された。　［Ｐ　ｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｖｏｌ、８１　。

７９０７−７９１１　（１９８４）　、Ｎａｔｕｒｅ、
Ｖｏｌ。

３１５、６４１　（１９８５）　、Ｎｕｃｌｃｉｃ　、
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　、　Ｖｏｌ、１３　（１
６）　、　　５８６９（１９８５）］。これらの報告は
ヒトの２種の遺伝子の塩基配列から推定される１５９個
のアミノ酸配列を有する「ヒトＩＬ−１α」と１５３個
のアミノ酸からなる「ヒトＩＬ−１β」を記している。

またヒト以外でも、ラビット及びマウスにおいてＩＬ−
１α及びＩＬ−１βの遺伝子が報告されるに至り、ＩＬ
−１の生物学的意義の解明が次第に理解されつつある。

しかしながら、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での上記Ｉ
Ｌ−１の役割については、いまだ未解決の問題が多く残
されている。

発明が解決しようとする問題点 上記問題解決の一つの手段としては、動物モデルでのＩ
Ｌ−１の検討が考えられ、病態モデルを考慮したラット
のＩＬ−１遺伝子及びその利用による組換えラットＩＬ
−１の製造技術の確立が要望されているが、現在、物質
としてのラットＩＬ−１についての報告はなく、その遺
伝子もいまだ単離されるに至っていない。

本発明の目的は、上記ラットＩＬ−１遺伝子、殊にラッ
トＩＬ−１α遺伝子及びその利用による組換えラットＩ
Ｌ−１αを提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、ラットＩＬ−１αの発現をコードする
遺伝子を含むラットＩＬ−１α遺伝子゛及び組換えラッ
トＩＬ−１αが提供される。

以下の本明細書におけるアミノ酸及びポリペプチドの表
示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢによる命名法
又は規則における略号乃至当該分野で慣用されている略
号による表示法に従うものとし、また塩基配列における
核酸の表示も同様とする。

本発明遺伝子は、より詳しくは式 ％式％ で表わされるアミノ酸配列のラットＩＬ−１αをコード
する遺伝子、及び式 ％式％ ＧＩｕ−Ｇｌｎ−８ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ−）１１ｓ−
Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ａｒｇ−ＧＩｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−８
ｅｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−１１
ｅ−８ｅｒ−で表わされるアミノ酸配列のラットＩＬ−
１α前駆体をコードする遺伝子を包含する。

また、本発明遺伝子には、ＩＬ−１α産生能を有するラ
ットの免疫担当細胞（ラットＩＬ−１α産生細胞）より
分離されるメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）より調製
されたものが含まれる。

本発明のラットＩＬ−１α遺伝子は、その利用によって
、遺伝子工学的手法によるう・ソトＩＬ−１αの容易且
つ大量製造を可能とする。また、上記遺伝子工学的手法
により得られる組換えう・ノドＩＬ−１αは、ＩＬ−１
のインビボにおける本来の役割解明に役立つのみならず
、ＩＬ−１自体の、例えば免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、サ
イトカイン産生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等
の医薬品としての応用研究、開発等にも大きく貢献する
ものである。

本発明遺伝子の製造方法は、特に制限はなく、以下に示
す各種の方法に従うことができる。即ち、該方法として
は例えば上記ラットＩＬ−１α産生細胞から得られるｍ
ＲＮＡより調製されたＤＮＡをエシェリヒア　コリー（
Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）のプラスミドベク
ター等の適当なベクターに接続して、微生物細胞内で増
幅させ、ラットＩＬ−１αを発現し得るクローンを単離
し、この単離されたクローンが有するプラスミド中に挿
入されているＤＮＡを分離する方法、本明細書に開示さ
れたラットＩＬ−１αの発現をコードする遺伝情報に基
づいて、例えばホスホアミダイト法〔ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、３１０，１０５　（１９８４）Ｅ等の常法
に従って、核酸の化学合成を行なう方法、或いは上記各
方法を併用する方法等を例示できる。

本発明遺伝子の製造法において、上記ｍＲＮＡを経る方
法につき、より詳細に説明すれば次の通りである。

本発明遺伝子の入手のためのラットの免疫担当細胞とし
ては、ＩＬ−１α生産能を有する各種細胞を利用できる
。代表的な上記免疫担当細胞には、例えばＴ−細胞、Ｂ
−細胞、ヌル細胞、ナチュラル　キラー細胞等のリンパ
球細胞、単核細胞、マクロファージ等の単核球細胞及び
それらの細胞系統（ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅ）が含まれ、
特に本発明ではラットの腹腔マクロファージを好ましく
利用できる。

ラットＩＬ−１αをコードするｍＲＮＡを含むＲＮＡは
、上記免疫担当細胞から常法に従い抽出される。該抽出
は、より詳しくは例えば次のごとくして行ない得る。

即ち、まずラットの腹腔に予めプロテオース、ペプトン
等の誘導蛋白溶液を注射し、数日後、ラットを脱血し、
該ラットの腹腔外に、ハンクス液（Ｈａｎｋ’Ｓ液）、
タイロード液等の平衡塩類溶液、好ましくは閉鎖系培養
に適したハンクス液を注射し、腹腔の浸出細胞を回収す
る。次いで、上記で得られる浸出細胞を通常の培地で培
養する。ここで用いられ培地としては、例えばＣＥＭ培
地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イー
グルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ）　、
オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャーの培地（Ｆ　
１ｓｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ　−１０培地
、Ｆ−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地
、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を例示できる。また必要に
応じて２等培地に牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）等の血清やア
ルブミン等の血清成分を添加した培地もまた同様に利用
することができる。上記培地には、更にＩＬ−１αｍＲ
ＮＡを誘導する適当な試薬、例えば細菌ポリサッカライ
ド（ＬＰＳ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３
−アセテート（ＰＭＡ）等の適当量、例えばＬＰＳでは
１　ｎｇ／鵬〜１００μｇ／戒、好ましくは１０μｇ／
戒前後の濃度を添加することができる。免疫担当細胞の
上記培地に対する使用量は、通常Ｉ　Ｘ　１０４〜１×
１０７個／或程度とするのが好ましい。培養は、通常の
方法、例えば炭酸ガス培養法により実施でき、３０〜４
０℃程度、好ましくは３７℃程度で１０〜２４時間程度
を要して行なわれる。

次いで上記培養後に該培養細胞より全ＲＮＡを抽出する
。この抽出操作は上記培養により培養上清中にラットＩ
Ｌ−１αが生産蓄積される時期に行なわれるのがよく、
これは、例えば上記培養細胞を、グアニジン・イソチア
ネート混合液又は適当な界面活性剤、例えばＳＤＳ、Ｎ
Ｐ−４０、トリトン×１００、デオキシコール酸等を用
いて、或いはホモジナイザーや凍結融解等の物理的方法
によって、部分的又は完全に破壊、可溶化した後、染色
体ＤＮＡを、ポリトロン等のミキサーもしくは注射筒を
用いである程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画と
を分別することにより行なわれる。この操作には、特に
フェノール・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用いる
ＣｓＣ１２重層法〔チルブラインら（Ｃｈｌｒｇｗｉｎ
、Ｊ、　Ｍ、、ｅｔ　ａｔ、、）。

バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅ［ｌｌ１ｓｔｒｙ　
）　、　　１８゜５２９４　（１９７９））等が一般に
採用される。

また上記各方法においては、ＲＮａｓｅによるＲＮＡの
分解を防ぐために、ＲＮａｓｅインヒビター、例えばヘ
パリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネート、
バナジウム複合体、ベントナイト、マカロイド等を添加
使用することもできる。

上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからのｍＲＮＡの分
離、精製は、例えばオリゴｄＴ−セルロース［コラボレ
イティプ　リサーチ社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｉｎｃ、　）コ、ポリＵ−セフ
ァ０−ス［ファルマシｙ　（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）社
］等の吸着カラムを用いる方法により又はバッチ法によ
り実施できる。

かくして得られるｍＲＮＡからの、Ｉ　Ｌ−１αに対応
する目的のｍＲＮＡの精製濃縮及び同定は、次の如くし
て行ない得る。即ち、例えば上記で得られるｍ　ＲＮ　
Ａを蔗糖密度勾配遠心等によって分画し、その分画につ
き、蛋白質の翻訳系、例えばアフリカッメガエルの卵母
細胞への注入やウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚
芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＩＬ
−１α活性を調べることにより実施でき、かくして目的
のＩＬ−１αｍＲＮＡの存在を確認できる。また目的ｍ
ＲＮＡの確認は、上記ＩＬ−１α活性測定に代えて、Ｉ
Ｌ−１αに対する抗体を用いる免疫法によっても行ない
得る。

上記で得られる精製ｍ　ＲＮ　Ａは、通常不安定である
ため、これを安定な相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）に変換し
、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のレ
プリコンに接続する。インビトロでの、上記ｍＲＮＡの
ｃＤＮＡへの変換、即ち本発明の目的遺伝子の合成は、
一般に次のようにして行なうことができる。

即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとしくこのプライマ
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクタープライマー
に付加されたオリゴｄＴのいずれでもよい）　、ｍＲＮ
Ａを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰＳｄＣＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用いてｍＲ
ＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次のステッ
プは、」−記において遊離のオリゴｄＴを用いたか、ベ
クタープライマに付加されたオリゴｄＴを用いたかによ
り、各々以下の如く異なる。

前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカリ処理等によ
り分解して除去し、その後−本鎖ＤＮＡを鋳型として逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ
を作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエキソ
ヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ−
ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付加
し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミドベ
フタ−（ストリンジェント型もしくはリラックス型のい
ずれでもよい）やλｇｔ系ファージベクターに組込む。

また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを残存させたま
ま、上記と同様のリンカ−を付与した開環状プラスミド
と、リンカ−ＤＮＡ　（Ｌばしば動物細胞で自立複製で
きる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が用いられる）とを、アニーリングさせて閉環状
とした後、ｄＮＴＰの存在下で、ＲＮａｓｅＨとＤＮＡ
ポリメラーゼＩとを共存させて、ｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に
置換し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。

上記のごとくして得られるＤＮＡは、これをベクターの
宿主内に導入され、これを形質転換できる。上記宿主と
しては、エシェリヒア　コリが代表的であるが、特にこ
れに限定されず、その他にバチルス　サブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サツカロミセス　
セレビシア−Ｉ−（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）等も使用できる。

上記ＤＮＡの宿主への導入及びこれによる形質転換の方
法としては、一般に用いられている各種方法、例えば王
として対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣＱ２処理し
て自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミ
ドを取り込ませる方法等を採用できる。上記方法におい
ては、通常知られているように形質転換の効率を一層向
上させるためにＭｇＣＱ２やＲｂＣＱを更に共存させる
こともできる。また、宿主細胞をスフ二口プラスト又は
プロトプラスト化してから形質転換させる方法も採用で
きる。

上記により得られる形質転換株から、目的のラットＩＬ
−１αのｃＤＮＡを有する株を選出する方法としては、
例えば以下に示す各種方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５Ｓでラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。

（２）他の動物細胞でラットＩＬ−１αを産生させてス
クリーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でｍＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミドも
しくは動物細胞染色体にインチグレートするようなプラ
スミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白
質を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のラッ
トＩＬ−１α活性を測定するか、又はラットＩＬ−１α
に対する抗体を用いてラットＩＬ−１αを検出すること
により、元の形質転換株より目的のラットＩＬ−１αを
コードするｃＤＮＡを有する株を選出する。

（３）ラットＩＬ−１αに対する抗体を用いて選出する
方法 予め、ｃＤＮＡを、形質転換株内で蛋白質を発現し得る
ベクターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、
ラットＩＬ−１αに対する抗体及び該抗体に対する第二
抗体を用いて、所望のラットＩＬ−１α産生株を検出し
、目的株を得る。

（４）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニトロセルロース
フィルター等にプロットし、ラットＩＬ−１α産生細胞
からのｍＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃ
ＤＮＡに対応するｍ　ＲＮ　Ａを回収する。回収された
ｍＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカッメガエルの卵
母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦
胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のラ
ットＩＬ−１α活性を調べるか又はラットＩＬ−１αに
対する抗体を用いて検出して、目的株を得る。

得られた目的の形質転換株よりラットＩＬ−１αをコー
ドするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法に従い実施
できる。例えば細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する両
分を分離し、該プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切
り出すことにより行ない得る。

上記各方法に従い本発明遺伝子、即ちラットＩＬ−１α
のｃＤＮＡを収得できる。

かくして得られる本発明遺伝子の一具体例は、前記式（
２）に示される２７０のアミノ酸配列で特定されるラッ
トＩＬ−１α前駆体をコードするものであり、そのＤＮ
Ａ塩基配列は、第２図に示す通りである。

しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子工学的手法に
より得られる物質が、ラットＩＬ−１αの生物活性を発
現するためには、該遺伝子は必ずしも上記ＤＮＡ配列、
即ちラットＩＬ−１α前駆体のアミノ酸配列のすべてを
コードするＤＮＡ配列、を有するものである必要はなく
、例えばその部分配列であって、それがラットＩＬ−１
αの生物活性発現を可能とする限り、それらのＤＮＡ配
列もまた本発明遺伝子に包含される。かかるラットＩ　
Ｌ−１αの生物活性発現を可能とする遺伝子の一具体例
としては、例えば上記式（２）のアミノ酸配列の１１５
番目のＳｅｒをアミノ末端とし、前記式（１）に示され
る１５６のアミノ酸配列で特定され、成熟ラットＩＬ−
１αと考えられるポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
配列を有するものを例示できる。該ＤＮＡ塩基配列は、
第１図に示される通りである。

更に本発明遺伝子には、上記ラットＩＬ−１αの発現を
可能とするＤＮＡ塩基配列を基本として、これによりコ
ードされるアミノ酸配列の任意の一部、例えばＮ末端部
又はＣ末端部のアミノ酸配列の一部、を欠失するか、或
いは之等を他のアミノ酸配列に置換させた改変されたア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列であって、ラッ
トＩＬ−１αの発現を可能とする点で上記式（１）及び
式（２）に示されるＤＮＡ塩基配列と実質的に均等なり
ＮＡ塩基配列も包含される。

かかる各種の本発明遺伝子は、上記ラットＩＬ−１αの
情報に基づいて、例えばホスファイトトリエステル法［
Ｎａｔｕｒｅ、３１０．　１０５（１９８４））等の常
法に従い、核酸の化学合成により製造することもでき、
また上記式（１）又は式（２）に示されるアミノ酸配列
のポリペプチドをコードするＤＮＡを原料として、上記
化学合成手段を含む通常の方法に従い製造することもで
きる。特に後者の方法は簡便であり好適である。

上記後者の方法において、一部ＤＮＡ塩基配列の化学合
成やＤＮＡ鎖の切断、削除、付加乃至結合、リン酸化等
を目的とする各種の制限酵素処理、ＤＮＡリガーゼ処理
、ポリヌクレオチドキナーゼ処理、ＤＮＡポリメラーゼ
処理等は常法に従い実施でき、それら酵素は市販品とし
て容易に入手できる。また所望ＤＮＡの単離、精製乃至
複製、選別等の各種操作乃至手段も、いずれも常法に従
うことができる。例えば上記ＤＮＡの単離精製は、アガ
ロースゲル電気泳動法等に従うことができ、得られるＤ
ＮＡの複製は、一部後述するように通常のベクターを利
用する方法に従えばよい。また、所望のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡ断片や合族リンカ−は、上記した化学
合成により容易に製造できる。なお、上記において所望
アミノ酸に対応するコドンはそれ自体公知であり、その
選択も任意でよく、例えば利用する宿主のコドン使用頻
度等を考慮して常法に従い決定できる（Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、９．４３−７４　（１９８１）
）。

更に、２等核酸配列のコドンの一部の改変は、常法に従
い、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドか
らなるプライマーを利用したサイト−スペシフィック　
ミュータジエネシス（ｓｔｔｅ−３ｐｅｃｉｆｉｃＭｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　　［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、、８１．５６６２−５６６６　（１９８４））
等に従うことができる。

また、上記方法に従い得られる本発明遺伝子のＤＮＡ配
列の決定及び確認は、例えばマキサム−ギルバートの化
学修飾法（Ｍａｘａｍ　−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ。

Ｍｃｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　、　　６５．４９９−５６０
（１９８０））やＭ１３ファージを用いるジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　　Ｊ、　ａｎ
ｄＶｉｃｉｒａ、Ｊ、、Ｇｃｎｅ、１９．２６９−２７
６（１９８２）Ｅ等により行なうことができる。

かくして得られる本発明遺伝子の利用によれば、遺伝子
組換え技術により、ラットＩＬ−１αを容易に且つ大量
に製造、収得することができ、本発明はかかるラッ）Ｉ
Ｌ−１αの製造技術及びかくして得られる組換えラット
ＩＬ−１αをも提供するものである。

本発明のラッ）ＩＬ−１αの製造方法は、上記特定の本
発明遺伝子（ＤＮＡ）を利用することを除いて、従来公
知の一般的な遺伝子組換え技術に従うことができる［５
ｃｉｅｎｃｅ、　　２２４．　１４３１（１９８４）　
　；　Ｂｉｏｃｈｅ［Ｉｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ
ｓ。

Ｃｏｍｍ、、１３０，６９２　（１９８５）；　Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　８０．、５
９９０（１９８３）；ＥＰ特許公開第１８７９９１号公
報等参照〕。

より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現できる
ような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも用いることができる。該真核生物の細胞には、を
推動物、酵母等の細胞が含まれ、を推動物細胞としては
、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞［Ｙ、　Ｇｌｕｚ
ｍａｎ、　Ｃｅ１１．７３．１７５−１８２　（１９８
１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ
葉酸レダクターゼ欠損株（Ｇ、　Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ
　Ｌ、　Ａ、Ｃｈａｓｉｎ　、　　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７７．４２１
６−４２２０　（１９８０））等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。を推動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流
に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポ
リアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを
使用でき、これは更に必要により複製起点を保有してい
てもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初
期プロモーターを保有するｐ　Ｓ　Ｖ　２ｄｈｆｒ　［
８，Ｓａｂｒａｍａｎｉ。

Ｒ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ｂｅｒｇ、Ｍｏ１
．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、１．８５４−７６４）等を例示できるが、
これに限定されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用でき
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターと・しては、
例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つｐＡＭ８２　（Ａ。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　ａｔ　、、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、８０．１−５　（１９８３）３等を好ましく利
用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発
明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモー
ター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）塩基配
列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発現プ
ラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌とし
ては、エシェリヒア壷コリ　（Ｅ　５ｃｈｅｒ１ｃｈｉ
ａ　　ｃｏｌｔ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクター
としては一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これ
に限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれ
も利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプト
ファン舎プロモーター、ｐＤプロモーター、Ｉａｃプロ
モーター、Ｉｐｐプロモーター等を使用することができ
、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させることがで
きる。

宿主細胞として、ＣＯ８細胞を用いる場合を例にあげる
と、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を保有し
、ＣＯ８細胞において自律増殖が可能であり、更に転写
プロモーター、転写終結シグナル及びＲＮＡスプライス
部位等を備えたものを用いることができる。例えば後記
実施例に示すＤＮＡの取り込みによる形質転換可能な状
態（コンピテント）のエシェリヒア・コリＨ８１０１株
に、本発明遺伝子を取り込ませることにより、目的とす
る発現プラスミドを得ることができる。

かくして得られる所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導
入及びこれによる形質転換の方法としては、一般に用い
られている方法が採用でき、例えば目的遺伝子が導入さ
れた上記エシェリヒア・コリＨＢＩＯ−１株中の発現プ
ラスミドは、アルカリ溶菌法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｔｏｎｉｎｇ　−Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　。

ｐ３６８．１９８２年〕等により調製され、ＤＥＡＥ−
デキストラン法やリン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈共沈等
法より、ＣＯ８細胞に取込ませることができ、かくして
所望の形質転換細胞を容易に得ることができる。

上記で得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養す
ることができ、該培養により生物活性のラットＩＬ−１
αが生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記ＣＯ８細胞であればＲＰＭＩ
−１６４０培地、ダルベツコの修正イーグル最小必須培
地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌ
ｅ’ｓ　ＭＥＭ）等の培地に必要に応じ牛胎児血清（Ｆ
　ＣＳ’）等の血清成分を添加したものを使用できる。

上記により、形質転換体の細胞内又は細胞外に生産され
るラットＩＬ−１αは、該ラットＩＬ−１αの物理的性
質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（「生化学
データーブック■」、１１７５〜１２５９頁、第１版第
１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発
行参照）により、それらより分離、精製することができ
る。

該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤に
よる処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（
ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体ク
ロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を例示でき
る。

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、例
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜
、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等により行なわれ
る。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法
のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
等に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより、
目的物質の活性が認められる両分を収得し、かくして目
的物質を均質な物質として単離することができる。

上記方法により、容易に高収率、高純度で所望のラット
ＩＬ−１αを工業的規模で製造できる。

かくして得られる本発明の組換えラットＩＬ−１αの諸
性質は、下記実施例に詳述する通りであり、これはその
有する生物活性より、前記した各種の分野で有用である
。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳細に説明するため、実施例を挙げ
る。尚、各側における生物活性は、以下の方法により測
定した。

細胞増殖阻害活性（Ｇ　Ｉ　Ｆ活性）の測定９６ウエル
マイクロプレート（コーニング社製）に種々の濃度に希
釈した供試液０．１戒を入れ、次に各ウェルにヒトメラ
ノーマ細胞Ａ３７５を２×１０４個／或の濃度で含有す
る１０％ＦＣ８を含むイーグルスＭＥＭ浮遊液０．１脱
を加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）内で４日間培養
する。

培養終了後、０．０５％ニュウトラルレッド（和光紬薬
社製’）０．０５ｍｆ２を各ウェルに加え、３７°Ｃで
２時間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝生理
食塩水０．３戒を各ウェルに静かに加えてウェルを洗浄
する。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１ナトリ
ウム−エタノール尊貴混合液０．１鵬を加え、マイクロ
ミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色素ｎを
、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレート用光
度計（タイターチエツクマルチスキャン、フロララボラ
トリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて測定し
、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール群）の
細胞増殖の５０％抑制を示す試験群、即ち対照群の吸光
度測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群、の希釈
倍数の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とする。従っ
て例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、この供試液
は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制する活性
を有する。

リンパ球活性化因子（ＬＡＦ活性）の測定リンパ球活性
化因子の測定は、オッペンハイムらの方法（Ｊ、　　Ｊ
、　Ｏｐｐｅｎｈｅｌｍ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１１６．１４６６　（１９７６））
を参考にして、次のごとく行なった。

即ち、４〜５週齢の雄性Ｂａ１ｂ／ｃマウスから採取し
た胸腺細胞を１０％ＦＣ８を含むＲＰＭ１１６４０培地
でＩ　Ｘ　１０７個／Ｔ１１２の濃度となるように調整
した後、２００μｇ／ｍｉ２のフィトヘムアグルチニン
（Ｐ　ＨＡ　、　Ｂ　ｕｒｒｏｕｇｈｓ−Ｗｅｔ　ｌｃ
ｏｍｅ社製）を１／１００容量加え、最終濃度を２μｇ
／脱になるように調整する。この細胞懸濁液を、予め１
００μＱの試料溶液を加えである９６ウエルプレートの
各ウェルに１００μΩづつ加え、５％ＣＯ２下、３７℃
で培養する。４８時間後、〔３Ｈ〕−チミジンを０．５
μＣｉ／ウェル加え、更に２４時間培養した後、細胞を
集め、取込まれた〔３Ｈ〕−チミジンの量を液体シンチ
レーションカウンターにより測定する。

ＬＡＦ活性は、組換えヒトＩＬ−１βを用いてそれによ
る最大取り込み量の５０％値を１単位とする。

実施例１ （１）ｍＲＮＡの調製 ラット腹腔マクロファージの調製を、免疫実験操作法１
１第１０７−１２２頁（１９７０年）及び免疫実験操作
法■、第２５８３−２５８７頁（１９７９年）（いずれ
も日本免疫学会編）を参考にして、以下の通り行なった
。

即ち、日本チャールス・リバー社より購入したスフラー
クダウリュラット（Ｓ　ｐｒａｑｕ−Ｄ　ａｗｌｅｙＲ
ａｔ）３５匹の腹腔内に１０％プロテオース・ペプトン
溶液を３０１１１Ｑ／　ｂｏｄｙの割合で注射した。４
ロ後にエーテル麻酔下に各ラットの頚動脈を切断して脱
血後、２０単位／鵬のヘパリンを含むハンクス（Ｈａｎ
ｋ’ｓ　）液の２０戒ずつを腹腔内に注射した。その後
、そのハンクス液を腹腔内より回収し、再度同様に新し
いハンクス液を腹腔内注入及び回収した。得られたハン
クス液を遠心（４°ＣＣ１１２００ｒｐ、５分間）し、
ハンクス液を除去して、腹腔浸出細胞を得た。

上記腹腔浸出細胞を、ハンクス液で２回洗浄し、次いで
ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄後、１０％ＦＣ３を含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、２Ｘ１０６個／戒
に細胞濃度を調整した。

この細胞懸濁液に、細菌リポポリサッカライド［ＬＰＳ
、デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製］を１０　Ｉｔ　ｇ／ｗ
Ｑ及びインドメタシン（協和醗酵製コを０．１μｇ／脱
の濃度となるようにそれぞれ加え、得られた液を直径９
ｃｍのシャーレ１１０枚に１０戒ずつ分注し、５％ＣＯ
２下に３７℃で１３．５時間培養し、シャーレに付着し
た細胞をｍ　ＲＮ　Ａ調製用材料とした。

次に、上記細胞より全Ｒ・Ｎ　Ａをグアニジウム／セシ
ウムクロライド法（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｌｓ、Ｅ、　　
Ｆ。

Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ａｎｄ　　Ｊ　、　　Ｓ　ａｍｂｒ
ｏｏｋ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ、　　ｐ　
　１　９４　　（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒ
ｂｏｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　１９８２年〕に従
い抽出した。即ち、シャーレ−枚当たりに、６Ｍグアニ
ジン・イソチオシアネート混合液［６Ｍグアニジン・イ
ソチオシアネート（フルカ社製）、５ｍＭクエン酸ナト
リウム（ｐＨ’ｌ　　Ｏ）　、Ｏ，１Ｍβ−メルカプト
エタノール及び０．５％ラウロイルザルコシン酸ナトリ
ウム］　　１．０ｍｆ２を加えて細胞を溶解させ、この
溶解液を１８Ｇ注射針をっけた５０戒注射筒に通過させ
て染色体ＤＮＡをせん断した。得られた溶液に、塩化セ
シウム（ＣｓＣＱ）を０．２ｇ／ｎ＋Ｑの割合で添加し
て溶解させた後、その２６脱ずつを５．７Ｍ　　Ｃ５Ｃ
Ｑ及び０．ＩＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）１０或に重層
し、ベックマンローター（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　
２８　ｒｏｔｏｒ　）にて、２５℃で２３００　Ｏｒｐ
ｍで２０時間遠心して、全ＲＮＡを分取した。

次に、上記で得た全ＲＮＡからｍＲＮＡを取得するため
に、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ
ｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、　）を用いて
カラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は、１０ｍ
ＭｈリスーＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）　、０．５ＭＮａ
Ｃ（１！及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡにて行ない、溶出は１
０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（ｐＨ７，５）及び１ｍＭ　　
ＥＤＴＡにて行なった。この操作により得られたポリ（
Ａ）”　ｍＲＮＡ量は、４７μｇであった。

（２）ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、ｃＤＮＡが動物細胞に
おいて発現可能なオカヤマーバーグ法［Ｈ，Ｏｋａｙａ
ｍａ　ａｎｄ　　Ｐ、　　Ｂｅｒｇ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖ
ｏｌ、３．　　ｐ２８０（１９８Ｂ））にて行なった。

即ち、ｃＤＮＡクローニングに用いるｄＴ鎖を付加した
ベクター・プライマーを、プラスミドｐｃＶｌより調製
し、またｄＧ鎖を付加したリンカ−ＤＮＡを、プラスミ
ドｐＬ１から上記オカヤマらの方法に従い調製し、之等
を用いて、以下の通り、ｃＤＮＡライブラリーを調製し
た。

上記（１）で得られたポリ（Ａ）”　ｍＲＮＡの１０μ
ｇを、５ｍＭトリス−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）溶液１
０μＱに溶解させ、６５℃で５分間インキュベートした
後、氷水中で急冷した。その後、反応液の全量２０μＱ
に、５０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ８，３）　、８ｍＭ
　　Ｍｇ（１！２．３０ｍＭＫ　ＣＱ　、　０　、　３
　ｍ　Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰＳｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各２　ｍ　Ｍ　、ベ
クター・プライマーＤＮＡ１．４ｔｔｇＳＲＮａｓｅイ
ンヒビター（アメジャム社製）２６．６単位、並びに逆
転写酵素（バイオラッド社製）２０単位を加え、混合物
を４２℃にて１時間反応させた。その後０．５ＭＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ７，５）１μＱ及び１０％５ＤＳ１μＱを加
えて反応を停止させた。得られた反応液より、フェノー
ル−クロロホルム（１：　１）　抽出、次いでクロロホ
ルム抽出を行なって、エタノール沈澱としてベクター・
プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。

更に、これを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍ
Ｍトリス・ＨＣＱ　（ｐＨ６，８）　、１ｍＭＣｏＣＱ
２．０．１ｍＭ　　ＤＴＴ、０．３μｇポリ（Ａ）　、
６６μＭ　　ｄＣＴＰ及びターミナルデオキシヌクレオ
シドトランスフェラーゼ（ＴＴａｓｅ、ファルマシア社
製）１９．２単位からなる反応液１５μΩ中で、３７℃
にて５分間反応させた後、反応液に０．５Ｍ　　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ７，５）０．７５μＱ及び１０％５ＤＳ０．
７５μＱを加えて反応を停止させ、フェノール−クロロ
ホルム抽出及びクロロホルム抽出を行ない、エタノール
沈澱として、オリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ　：　ｍＲＮＡ
−ベクター・プライマーを回収した。

次に、上記で得た反応物を、７ｍＭ）リス・ＨＣＱ　（
ｐＨ７，５）　、７ｍＭ　　ＭｇＣＱ２．６０ｍＭ　　
ＮａＣＱ、１００μｇ／ｍ１２ＢｓＡ及び制限酵素Ｈｉ
ｎｄｍ１２単位からなる反応液１゜μＱ中で、３７°Ｃ
にて９００分間反応せた後、１０ｍＭトリス・ＨＣＱ　
（ｐＨ７，５）及び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５
）３０μΩを加え、更に０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ
７，５）２μＱ及び１０％Ｓ　Ｄ　Ｓ　２　ｔｔ　Ｑを
加えて反応を停止させ、反応液をフェノール−クロロホ
ルム抽出及びクロロホルム抽出し、エタノール沈澱とし
て反応物を回収し、これを１０ｍＭ）リス−Ｈ（１（ｐ
Ｈ７，５）及び１　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐ　
Ｈ７、５）１０μＱに溶解させた。このうち１μＱを１
０ｍＭトリス・Ｈ（１１！　　（ｐＨ７，５）　、１ｍ
ＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）　、Ｏ，ＩＭ　　ＮａＣＱ
。

オリゴ（ｄＴ）鎖付加リンカ−ＤＮＡ１４ｎｇからなる
反応液１０μΩ中で、６５℃にて２分間インキュベート
して反応させた後、さらに４２℃で３００分間反応せ、
その後０℃に冷却した。

この反応液を用いて、更に２０ｍＭトリス・ＨＣＲ（ｐ
Ｈ７，５）　、４ｍＭ　　ＭｇＣＱ２．１０ｍＭ　（Ｎ
Ｈａ　）２　ＳＯ４，０，１Ｍ　　ＫＣ４＋。

５０μｇ／ＴＩＩＱＢＳＡ、０．１ｍＭβ−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド［β−ＮＡＤ、ファルマシ
ア社製）］及び００．６２ｇエシェリヒアコリＤＮＡリ
ガーゼ（ファルマシア社製）を含む反応液１００μＱを
調整し、これを１２９Ｃで一夜反応させた。

上記で得られた反応液に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを各々４０μＭとなるように、ま
たβ−ＮＡＤを０．１５ｍＭとなるように加えた後、エ
シェリヒア・コリＤＮＡリガーゼ０．４μｇ１エシェリ
ヒア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハ
イム社製）５単位及びエシェリヒア・コリＲＮａｓｅ　
Ｈ（ファルマシア社製）１単位を加え、１２°Ｃで１時
間、更に２５°Ｃで１時間反応させた。

かくして得られた反応液を、エシェリヒア・コリＨ８１
０１株のコンピテントセル（宝酒造社製）に対して形質
転換させて、ｃＤＮＡライブラリーを得た。

（３）ラットＩＬ−１（１ＩＣＤＮＡクローンノ単離ラ
ツトＩＬ−１αｃＤＮＡクローンのスクリーニングは、
ハナハンらの方法（Ｄ、　　Ｈａｎａｈａｎ　ａｎｄＭ
、　Ｍｃｓｃｌｓｏｎ、Ｇｅｎｅ、１０．　６３　（１
９８０）　）に従い、コロニーΦハイブリダイゼーショ
ン法にて行なった。またプローブとしては、ヒトＩＬ−
１ａ　ｃ　ＤＮＡを釘するプラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−
２０７［Ｔ、　　Ｎ１５ｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅａ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、　
　１４３．　３４５（１９８７））を、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＢａ１ｌにて切断して得られる４００ｂｐのＤ
ＮＡ断片を、更に制限酵素ＭｖａＩにて切断して得られ
た２８５ｂｐのＤＮＡ断片を、ニックトランスレーショ
ン法ＣＰ、　Ｗ、　　Ｊ、　　Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１１３．２３７−２５１　（１９７７））にて［３２Ｐ
］でラベルしたものを用いた。このプローブの比活性は
、５　Ｘ　１０８ｃｐｍ　／μｇＤＮＡ以上である。

アンピシリン５０μｇ　／　ｍＱを含むＬＢ寒天培地［
１％バクトドリプトン、０．５％バクトイ−スト抽出物
、１％ＮａＣＲ１１，５％バクトアガー、ｐＨ７，５］
上に、径８０　ｍｍのニトロセルロースフィルター（ミ
リポアＨＡＩＦＯ８２５０、ミリポア社製）を置き、こ
の上にフィルター当り約１５００コロニーになるように
希釈した上記（２）で得られたｃＤＮＡライブラリー菌
液をまき、これを３７°Ｃにて一夜培養した。フィルタ
ーは、合計４５枚を作製し、これをマスターフィルター
とした。

上記マスターフィルターに新しいニトロセルロースフィ
ルターを載せることによって、レプリカフィルターを作
製し、マスターフィルターを４°Ｃにて保存し、レプリ
カフィルターを上記寒天培地上で３７℃で６時間培養後
、クロラムフェニコール２００μｇ／ｍ１２を含有する
ＬＢ寒天培地上に移し替え、３７°Ｃで一夜培養した。

上記培養フィルターを、０．５Ｎ　　ＮａＯＨ及び１．
５Ｍ　　ＮａＣΩで５分間処理した後、０．５Ｍ）リス
・ＨＣΩ（ｐＨ７，５）及び１．５Ｍ　　ＮａＣＱにて
５分間処理し、風乾後、８０℃真空下で２時間ベーキン
グを行なった。

ベーキング済フィルターを、４ＸＳＳＣ［ｌＸ５ＳＣ＝
０．１５Ｍ　　ＮａＣＱ−０，０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウム溶液］及び０．１％ＳＤＳ溶液中で、６０°Ｃで３
０分間保温し、フィルター上のコロニーを除去した。

このフィルターを、２０％ホルムアルデヒド、５０ｍＭ
リン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）　、５ＸＳＳＣ１２ｍ
ｇ／脱フィコール、２　Ｂ／　ｍＱポリビニルピロリド
ン、２ｍｇ／ｍｆ２ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及びＯ，１
ｍｇ／ｒｌｌＱ熱変性サケ精子のＤＮＡからなる溶液中
にて、３７℃で４時間プレハイブリダイゼーションを行
なった。

次にこのプレハイブリダイゼーションと同組成の溶液中
に１０”ｃｐｍ／戒となるように［３２Ｐ］でラベルし
たプローブを加え、３７℃で一夜を要してハイブリダイ
ゼーションを行なった。

上記でハイブリダイゼーションを行なったフィルターを
取り出し、２ＸＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ溶液にて室温
で３回洗浄し、その後、更に０．４ＸＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳ溶液で５０℃で３０分間洗浄し、フィルターを
風乾後、増感紙を用いてＸ線フィルム（ＲＸ５、コダッ
ク社製）に、−７０℃にて２日間オートラジオグラフィ
ーを行なった。

フィルムを現像後、シグナル領域に符合するコロニーを
マスターフィルターよりかき取り、上記の方法を繰返し
てポジティブシグナルを有するコロニーの純化を行ない
、最終的に２個のクローン単離した。之等はそれぞれ組
換え体プラスミドｒｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−４ａ　（３）
Ｊ及び［ｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α（６）」と命名した
。

（４）ラットＩＬ−１αｃＤＮＡの制限酵素地図の作成 上記（３）で得られたプラスミドｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−
１ａ　（３）及びｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α（６）を種
々の制限酵素で切断して、之等のｃＤＮＡの制限酵素地
図を作製した。

その結果を第３図に示す。

上記両プラスミドのｃＤＮＡの長さは、共に約２．　１
ｋｂｐであり、その中にＢａ１ＩＳＥｃｏＲＶ、Ｎｄｅ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、５ａｃＩにより切断される個所がそれ
ぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその順序でこれら
制限酵素による認識部位が存在していることが確認され
た。

（５）ラットＩＬ−１αｃＤＮＡの塩基配列の決定 プラスミドｐ　ｃ　Ｄ−ＲＴ　−Ｉ　Ｌ　−１ａ　（６
）のｃＤＮＡ断片を、クローニングベクターｐＶＣ１１
８（宝酒造社製）にサブクローニング後、キロシーフェ
ンス用デレージョンキット及びＭ１３シークエンスキッ
ト（共に宝酒造社製）を用いて、ｃＤＮＡ領域の塩基配
列を決定した。

その塩基配列及び塩基配列から推測されるアミノ酸配列
は、第４図に示す通りである。

このアミノ酸配列を、ヒトＩＬ−１αｃ　ＤＮＡからの
アミノ酸配列（Ｔ、　Ｎ１５ｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅａ、　
　Ｃｏｍｍｕｎ、、　　１４３゜３４５　　（１９８７
）　　；　Ｃ，Ｊ、Ｍａｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、３１５．６４１　　（１９８５）　　；
Ｙ。

Ｆｕｒｕｔａｎｉ　　ｅｔ　　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　　　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１　３゜５８６９　（
１９８５））と比較すると、６６％のホモロジーが認め
られた。またマウスＩＬ−１αｃＤＮＡからのアミノ酸
配列（Ｐ、Ｔ。

Ｌｏｍｅｄｉｃｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　、
　　３１２．４５８（１９８４））と比較すると８３％
のホモロジーが認められた。

（６）ＣＯ３細胞へのトランスフェクションこの例に利
用したＣＯ３−１細胞とは、増殖開始点（Ｏｒｉ）欠損
の５Ｖ４０ＤＮＡで、サルの腎細胞ＣＶＩをトランスフ
オームさせることによって、ＳＶ４０初期遺伝子を発現
し、Ｔ抗原陽性となった細胞である〔セル（Ｃｅｌｌ）
、２３，１７５−１８２　（１９８１）参照〕。

上記（５）で得られた組換え体プラスミドｐｃＤ−ＲＴ
−ＩＬ−４ａ　（３）及びｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α（
６）を用いて、アルカリ溶菌法［Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
　ＣＩｏｎｉｎｇ　−Ａ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　＋ｐｐ３６８．１９８２年
〕に従ってプラスミドを調製した。

上記で得たプラスミドを、Ｃ０８−１細胞に、ＤＥＡＥ
−デキストラン法（Ｔ、　Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、
。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、ＵＳＡ、　
Ｖｏｌ、８１．　ｐ。

１０７０　（１９８４）及びＴ、　Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ
　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　
ｖｏｌ、８２．　ｐ。

６８　（１９８５））に従って、トランスフェクトし、
Ｃ０８−１細胞における組換えラットＩＬ−１αの生産
を以下の通り試験した。

即ち、先ずＣＯ３−１細胞を、トリプシン処理後、１０
％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、細
胞数をＩ　Ｘ　１０６細胞／脱に調整後、１０％ＦＣ３
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍｆ２／ウェルを加え
た６ウエルプレートに、それぞれ５００μＱずつ分注し
た。これを３７°Ｃで一夜、５％ＣＯ２下に培養した。

その後、培養上清を除き、無血清培地で細胞を洗浄し、
上記プラスミドＤＮＡｌ０μｇ／ｍＱと共に０．４ｍｇ
／ｍＱＤＥＡＥ−デキストラン（ファルマシア社製）、
５０ｍＭトリス−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，４）及び１０％
ＦＣ３を含むＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培地を１ｍＱ／ウ
ェル加えて、５％ＣＯ２下に、３７℃で４．５時間培養
した。その後、培養上清を除き、血清を含まない培地で
細胞を洗浄し、１５０μＭクロロキン（シグマ社製）及
び１０％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を、各ウ
ェルに２戒ずつ加えて、３７℃で３時間培養した。次に
上清を除去し、血清を含まない培地で細胞を洗浄後、１
０％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ−１６４０培地３ｍ１２／ウ
ェルを各ウェルに加えて、３７°Ｃで７２時間、５％Ｃ
Ｏ２下に培養した。

かくして得られた細胞培養物より培養上清を回収し、こ
の上清につき、前述したＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性を測
定した。

その結果、サルＣＯ３−１細胞へのトランスフェクショ
ンにより得られたプラスミドｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α
（３）により生産された培養上清中のＧＩＦ活性は５３
．８単位／ｍＱであり、同プラスミドｐｃＤ−ＲＴ−，
ＩＬ−４ａ　（６）により生産されたＧＩＦ活性は４６
．９単位／或であることが確認された。

また、サルＣ０８−１細胞へのトランスフェクションに
より得られたプラスミドｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α（３
）により生産されたＬＡＦ活性は１０単位／脱であり、
同プラスミドｐｃＤ−ＲＴ−ＩＬ−１α（６）により生
産されたＬＡＦ活性は８単位／脱であることが確認され
た。

実施例２ ■　ラットＩＬ−１αｃＤＮＡを有するプラスミドｐｃ
Ｄ−ＲＴ−ＩＬ−１ａ　（３）を、制限酵素ＡｃｃＩ及
びＨｉｎｃＩＩで切断し、ラットＩＬ−１ａｃＤＮＡを
含む８７０ｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
電気泳動法にて単離、精製した。

このＤＮＡフラグメントを更に制限酵素ＨａｅＩＩＩで
切断し、５３０ｂｐの）（ａｅｍ　−Ａ　ｃｃ　Ｉ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　７ラグメントをアガロースゲル電気泳動法に
て単離、精製した。

上記ＤＮＡフラグメント及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで
切断したトリプトファン会プロモーターを有するベクタ
ーｐＴＭｌ　（今本文男、代謝、第２３巻、第２８９頁
、１９８５年〕を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ
ウ・フラグメント［宝酒造社製］を用いて平滑末端とし
た後、両ＤＮＡフラグメントをＤＮＡライゲーションキ
ット［宝酒造社製］を用いて連結させ、次に大腸菌ＨＢ
　１０１コンピテント・セルに形質転換させて、プラス
ミドｐＴＭｌ−ＲＴ−Ｉ　Ｌ−１α（ｐ）を有する形質
転換体を得た。

得られた形質転換体より、アルカリ溶菌法［Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　　Ｅ、　　Ｆ、　　Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ　ａｎｄ　　Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ＣＩｏ
ｎｌｎｇ−ＡＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　
、　３６８　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）ｌａｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２年〕に従い、上記
プラスミドを取り出し、これを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び
ＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法にてト
リプトファン・プロモーター及びラットＩＬ−１αｃＤ
ＮＡを含む１．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを単離、
精製した。

一方、プラスミドｐＵｃ１１９　［宝酒造社製］を、制
限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、このＥｃｏ
ＲＩ−Ｂａｍ）（Ｉ切断部位間に、上記１．２ｋｂｐの
ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡライゲーションキット［
宝酒造社製］を用いて連結させ、これを大腸菌ＭＶ１１
８４株に形質転換して、目的のプラスミドｐｔｒｐ　−
ＲＴ　−Ｉ　Ｌ　−１ａ　（Ｐ）を有する形質転換株を
得た。

得られた形質転換株及びヘルパーファージＭ１３ＫＯ７
を用いて、−本鎖ＤＮＡファージを調製し、フェノール
抽出を行なうことによって、−本鎖ＤＮＡｐｔｒｐ　−
ＲＴ　−Ｉ　Ｌ　−１ａ　（Ｐ）を回収した。

なお、上記操作は全て宝酒造社のマニュアルに従った。

上記で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、以下に示す合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれ用い
て、インビトロ　ミュークジエネシス法により、余分の
塩基の除去及びＡＴＧの挿入を行なった。プライマーの
塩基配列は次の通りである。

５’　−ＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＧＣＡＣ
ＣＴ　−３゜上記インビトロ　ミュータジエネシスは、
アマジャム社製のオリゴヌクレオチドーダイレクテッド
　インビトロ　ミュータジエネシス　システム（０１１
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　
ｖｌｔｒ。

ｍｕｔａｇｃｎｃｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、同
社のマニュアルに従って実施した。最終的に合成された
二本鎖ＤＮＡの形質転換は、大腸菌ＪＭ１０９株を用い
て行なった。得られた形質転換株よりアルカリ溶菌法に
よりプラスミドＤＮＡを調製し、その制限酵素地図の作
成及び　ＤＮＡ塩基配列の確認を行ない、目的とする変
異プラスミドｐｔｒｐ　−ＲＴ　−ＩＬ−１αの同定を
行なった。

以上の概略は第５図に示す通りである。

■　上記で得られた形質転換株ＪＭ１０９／ｐｔｒｐ　
−ＲＴ　−Ｉ　Ｌ　−１ａを、アンピシリン５０μｇ／
ｍＱ及びＬ−）リプトファン２０μｇ／ｍＱを含むＬＢ
培地［１％トリプトン（デイフコ社製）、０．５％酵母
エキス（デイフコ社製）及び１％ＮａＣＱコ２０脱中で
、３７°Ｃ下に一晩振盪培養した。

この培養液１０脱を１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地
［０，６％Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４，０、３％ＫＨ２Ｐ
Ｏ４，０，０５９６ＮａＣＱ、ｏ、１％ＮＨ４ＣＱ、２
ｍＭ　　ＭｇＳＯ４，０，２％グルコース及び０．１ｍ
Ｍ　　ＣａＣＯ２コ　５００脱中に植菌し、３７℃にて
８時間振盪培養した。集菌後、得られた菌体をＩＭ　　
Ｎａ２　ＨＰＯ４に懸濁させ、−晩低温室（４°Ｃ）に
放置した後、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
に対して２日間透析した。

得られた透析液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分
間）し、上清と沈澱物とを分離した。

■　上記で得られた上清について、ＬＡＦ活性を測定し
た結果、１脱培養液中の大腸菌抽出物に換算して、約２
Ｘ１０６ユニツトの活性が認められた。また、同上清の
ＧＩＦ活性を測定した結果は、約５．６Ｘ１０６ユニツ
トであった。

■　上記■に従い得られた培養上清を、以下の精製操作
に供した。

即ち、まずＧＴｉウルトロクロムハイパフォーマンスリ
キッドクロマトグラフィーシステム（ＬＫＢ社製）によ
るイオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−ＨＰＬＣ）を
、以下の条件により実施した。

カラム：　ＴＳＫゲル５Ｐ−５ＰＷ　（７，５Ｘ７５＋
ｎｍ、）−ソー社製） 溶離液：Ａ＝５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５） Ｂ＝０．５Ｍ　　ＮａＣＱ含有５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐ　Ｈ５，５） 流速：１脱／分 フラクション容積：１脱／分／チューブ濃度勾配二　　
時間（分）　　　％Ｂ 上記５Ｐ−ＨＰＬＣによるフラクションＮｏ。

２０〜２５を集め、これをＹＭ−５メンブランフィルタ
−を用いて限外濾過濃縮し、濃縮物につき、以下の条件
で高速ゲルクロマトグラフィー（ＧＦ−ＨＰＬＣ）を行
なった。

カラム：　ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷ　（２１，５Ｘ６
００ｎｖ＋、トーソー社製） 溶離液：ＰＢＳ（−） 流　速＝３脱／分 フラクション容積＋１２１７ＩＱ／４分／チューブ上記
ＧＦ−ＨＰＬＣによるフラクションＮｏ。

１６として、目的のラットＩＬ−１αを得た。

■　」−記■で得られた精製ラットＩＬ−１αについて
、以下の通りその諸性質を調べた。

（１）アミノ酸配列 精製ラットＩＬ−１αの１８０ピコモル相当量を用いて
、気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシ
ステムズ社製、４７０Ａ型）にてそのＮ末端より１０ア
ミノ酸残基までの配列を決定した。各反応サイクルで得
られるＰＴＨ−アミノ酸溶液は、真空遠心乾燥後、３３
％アセトニトリル水溶液に溶解させ、ＰＴＨ−アミノ酸
分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ベックマン社
製）にて分離同定した。

上記により決定されたアミノ酸配列は次の通りであり、
Ｎ末端はＳｅｒのみが検出され、翻訳開始コシトン由来
のＭｅｔは検出されなかった。

Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｉａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｈｉｓ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　＝（２）アミノ酸分析 精製ラットＩ　Ｌ−１α溶液１０μＱ　（約２．５μｇ
相当量）を硬質ガラスサンプル管（日型理化ガラス社製
、６Ｘ５０ｍｍ）にとり、加水分解用反応バイアル（ウ
ォーターズ社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ塩酸（含１
％フェノール）２ｏｏ１．ＩＱを該反応バイアルに入れ
、減圧密封し、１３０’Ｃで４時間加水分解を行なった
。

反応後、バイアルのまま減圧乾固し、サンプル管に０．
０２Ｎ塩酸４００μＱを加え、アミノ酸分析用サンプル
管に移し、その２５０μＱを日立高速アミノ酸分析計（
日立社製）に自動注入してアミノ酸組成の分析を行なっ
た。なお、検出法としてはオルトフタルアルデヒド法を
用いた。この方法ではプロリン及びシスチンは検出され
ない。

また、加水分解によりトリプトファンは検出されない。

分析同定された各アミノ酸を、三点の濃度の標準アミノ
酸（各５０ピコモル、２５０ピコモル及び１２５０ピコ
モル）にて作成した検量線により定量し、フェニルアラ
ニンを９個含むものとして、それらの組成比を算出した
。

結果は下記第１表に示す通りであった。

第１表 アミノ酸　組成比　　　アミノ酸　　組成比Ａｓｐ　　
２０．３（１９）　　　Ｌｅｕ　　１７．２（１７）Ｇ
ｌｕ　　１９．１（１８）　　　Ｌｙｓ　　１２．　１
０２）Ａｌａ　　　９．　３（９）　　　Ａｒｇ　　　
４．０（４）ｌｉｅ　　１１．０（１２）　　　Ｓｅｒ
　　１４．２（１５）Ｐｈｅ　　　９．　　Ｏ（９）　
　　Ｇｌｙ　　　５．４（５）Ｔｒｐ　　　−（１）　
　　Ｍｅｔ　　　３．８（４）Ｔｈｒ　　　６．９（７
）　　　Ｔｙｒ　　　５．７（６）Ｐｒｏ　　　−（７
）　　　Ｈｉｓ　　　２．８（３）Ｖａｔ　　　７．７
（８） 尚、０内数値はｃＤＮＡより予想される値を示し、−は
決定していないことを示す。

（３）分子量 精製ラットＩＬ−１αの分子量を、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）
電気泳動法に従い算出した。該方法は、レムリの方法（
Ｌａｅｍｕｌｉ、Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ。

２２７．６８０−６８５　（１９７０））を一部改変し
て実施した。

ポリアクリルアミドゲルとしては、濃縮用に３．９％の
ものを、分離用に１５％のものをそれぞれ用いた。また
染色はクマーシーブリリアントブル−（ＣＢＢ）を用い
て行なった。

上記５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果、精製ラットＩＬ−１αの
分子量は約１７．３ｋｄと認められた。尚、アミノ酸組
成から計算した分子量は１７．８ｋｄである。

（４）等電点 等電点電気泳動により求めた精製ラットＩＬ−１αの等
電点は、約６．１であると認められた。

（５）生物活性（ＧＩＦ活性） 精製ラッ）ＩＬ−１αのＧＩＦ活性は、約１×１０７Ｕ
／ｌｌ１ｇ蛋白であった。尚、この活性の測定は、前記
方法に従うものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラットＩＬ−１αをコードするＤＮＡ塩基配
列を示す。 第２図は、ラットＩＬ−１α前駆体をコードするＤＮＡ
塩基配列を示す。 第３図はラットＩＬ−１αをコードする遺伝子を含むプ
ラスミドの制限酵素地図である。 第４図（第４−１図及び第４−２図）は、ラットＩＬ−
１αｃＤＮＡ領域の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。 第５図は、本発明実施例２に従うラットＩＬ−１α発現
プラスミド構築の概略図を示す。 （以　上） ７・“°＼ 代理人　弁理士　三　枝　英　二′″　′１目１瑚騎目
ギ墓ワ番葺Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ［１］ラットＩＬ−１αの発現をコードする遺伝子を含
   むラットＩＬ−１α遺伝子。 ［２］式 【遺伝子は配列があります】 で表わされるアミノ酸配列のラットＩＬ−１αをコード
   する請求項［１］記載の遺伝子。［３］式 【遺伝子配列があります】 で表わされるアミノ酸配列のラットＩＬ−１α前駆体を
   コードする請求項［１］記載のラットＩＬ−１α遺伝子
   。 ［４］以下の性質を有するラットＩＬ−１α。 （１）次のＮ末端域アミノ酸配列を有する、Ｓｅｒ−Ａ
   ｌａ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ− （２）等電点電気泳動法による等電点は、約６．１であ
   る、 （３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により決定された分子
   量は約１７．３ｋｄである。