JPS6363199B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は組換えDNA技術の分野、すなわち組
換えDNA技術で用いられる方法およびこれらの
方法により得られる生成物に関する。 さらに詳細には、本発明はヒト白血球由来の遺
伝子の発現により得ることができる成熟ヒト白血
球インタフエロンであつて、165−166個のアミノ
酸を有し、部分アミノ酸配列Cys−Ala−Trp−
Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−
Arg−Serを含み、かつ114位にアミノ酸Asp、
GluまたはValの一つを有し、このインタフエロ
ンの第一番目のアミノ酸のＮ未端にメチオニンが
結合している場合は、166−167個のアミノ酸を有
し、かつ115位にアミノ酸Asp、GluまたはValの
一つを有する成熟ヒト白血球インタフエロンをコ
ードする配列からなるDNA配列を含有すること
を特徴とする複製しうる発現ビヒクルおよびこの
ビヒクルで形質転換した大腸菌、E.coliに関す
る。 上記成熟ヒト白血球インタフエロンの特定例と
しては成熟ヒト白血球インタフエロン（LeIF）
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪがあげられ
る。これらの成熟ヒト白血球インタフエロンのア
ミノ酸配列は23頁表３および26頁表５に示すとお
りである。すなわち、表３におけるLeIF Ａ、
LeIF Ｂ、LeIF Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF Ｆおよび
LeIF Ｈならびに表５におけるＩおよびＪの各ア
ミノ酸配列からＳを付した番号で示されるシグナ
ルペプチドを除いた165個または166個のアミノ酸
からなるポリペプチドおよびこれらのポリペプチ
ドの第１番目のアミノ酸のＮ末端にさらにメチオ
ニンが結合した166個または167個のアミノ酸から
なるポリペプチドが本発明の成熟ヒト白血球イン
タフエロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪ
である。 本発明の背景についてまず記載する。ヒト白血
球インタフエロン（LeIF）は、最初、アイザツ
クス（Isaacs）およびリンデンマン
（Lindenmann）により、きわめて粗な沈殿物と
して、発見されそして調整された（プロク．アー
ル．ソシ．（Proc.R.Soc.）B147.258−267
〔1957〕：U.S.P.3、699、222）。それを精製し特徴
づける努力は長く続けられ、正常または白血病の
提供者から得た白血球に由来する比較的均一な白
血球インタフエロンの調製にみちびいた（ドイツ
特許公報No.2947134）。これらのインタフエロン
は、それらの標的細胞にウイルス抵抗性の状態を
付与する能力を有することの知られている一群の
蛋白質である。さらに、インタフエロンは、細胞
の増殖を阻止しそして免疫反応を調節するように
作用しうる。これらの性質から、ウイルスの感染
および悪性腫瘍の治療に白血球インタフエロンを
臨床的に用いることが促進された。 白血球インタフエロンは、本質的に均一な状態
に精製され（ルビンステイン（Rubinstein）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）76、640−644〔1979〕；
Zoon等、同上、76、5601−5605〔1979〕）約17500
から約21000の範囲の分子量を有すると報告され
た。これらの調製物の比活性は、きわめて高く、
２×10⁸から１×10⁹単位／mg蛋白質であるが、細
胞培養法よりの収量はおそろしく低い。しかし、
蛋白質の配列をきめる技術の進歩で、部分的アミ
ノ酸配列が決定された〔ゾーン（Zoon）等、サ
イエンス（Science）207、527〔1980〕；レビイ
（Levy）等、プロク．ナトル．アカド．サイ．米
国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）77、5102−
5104〔1980〕）。種々の白血球インタフエロンのグ
リコシル化は、現在完全には明らかでないが、種
類間におけるグリコシル化の差のみでは、観察さ
れている分子量の分布を説明しえない。その代わ
りに、白血球インタフエロンは、種類に従いアミ
ノ酸組成および配列において著しく差があり、ア
ミノ酸の相同性は、場合により80％より低い。 提供者の白血球よりの分離で部分的な特徴付け
および限定された臨床的研究のための十分な量
の、均一な白血球インタフエロンを与えたけれど
も、それだけでは、大規模な臨床試験および広範
な予防的および（または）治療的使用に必要であ
るインタフエロンを提供するにはまつたく不十分
である。まさに、ヒト白血球由来のインタフエロ
ンを抗腫瘍および抗ウイルスに用いる現在の臨床
試験では、粗（１％より低い）調整物を用いてお
り、実際的でない価格においてすら十分な量を生
産するに至らず、広範な領域での研究を遅らせて
来た。 しかし、組換えDNA技術の出現にともなつて、
有用なポリペプチドのきわめて多様な種類を、微
生物により調節生産することが可能になつた。す
でに、この技術により修飾をうけて、ソマトスタ
チン、ヒトインシユリンのＡおよびＢ鎖およびヒ
ト生長ホルモンのようなポリペプチド鎖を生産す
ることが可能となつた細菌が存在するに至つてい
る。 （イタクラ（Itakura）等、サイエンス
（Science）198、1056−1063〔1977〕；ゴデル
（Goeddel）等、ネーチヤ−（Nature）281、544
−548〔1979〕）。より最近になつて、組換えDNA
技術が、プロインシユリンおよびチモシンアルフ
ア−１の生産を可能とし、さらに、なん人かの著
者は、ヒト白血球インタフエロンをコードする
DNAの採取および、その結果得られる、白血球
インタフエロン活性を有する蛋白質の生成につい
て報告している（ナガタ（Nagata）等、ネーチ
ヤー（Nature）284、316−320〔1980〕；ナンテイ
（Nantei）等、ジエイン（Gene）10、１−10
〔1980〕タニグチ（Taniguchi）等、ネーチヤー
（Nature）285、547−549〔1980〕）。 組換えDNA技術の工作室は、細菌および他の
微生物に存在し、しばしば、細胞中に多数のコピ
ーとして存在する、２重鎖DNAの非染色体性の
ループである、プラスミドである。プラスミド
DNA中にコードされる情報には、娘細胞中にプ
ラスミドを再生産するに必要な情報（つまり、
“レプリコン”）および、そして、ふつうは、１種
または１種より多くの選択特性、たとえば、細菌
の場合では、抗生物質に対する抵抗性の情報があ
る。この情報により、対象とするプラスミドを含
有する宿主細胞のクローンを認識し、選択用の培
地中に優先的に発育さすことが可能となる。プラ
スミドが有用なのは、プラスミドDNA上の異な
る部位をそれぞれ認識する、ある種類または別の
種類の制限エンドヌクレアーゼまたは“制限酵
素”により、プラスミドが特異的に切断されうる
ということである。そのあとで、切断部位の両端
か、切断部位に接して再構築した末端をむすびあ
わすことにより、異質の遺伝子または遺伝子断片
をプラスミド中に挿入しうる。DNAの組換えは、
細胞の外部で実施しうるが、生成する“組換え”
プラスミドは、形質転換と称される方法により細
胞内に導入され、その転換細胞を発育さすことに
より、異質の遺伝子を含有する組換えプラスミド
を大量に生産しうる。さらに、その異質遺伝子
が、プラスミド内のコードされるDNA情報の転
写および翻訳を支配する部分に関して正しく挿入
されるならば、生成する発現ビヒクルは、挿入さ
れた遺伝子のコードするポリペプチド配列を実際
の生成つまり発現と称されるプロセスに実際に使
用されうる。 発現は、RNAポリメラーゼにより認識されそ
れが結合する、プロモーターとして知られる領域
において開始される。ある場合には、たとえば、
本発明の実施において有利とされるトリプトフア
ンまたは“trp”プロモーターのような場合には、
プロモーター領域には、“オペレーター”領域が
重なり、結合された、プロモーター−オペレータ
ーとなつている。オペレーターは、特定のプロモ
ーターにおける転写開始の瀕度を調節する役割を
する、いわゆるリプレツサー蛋白質により認識さ
れるDNA配列である。RNAポリメラーゼは、
DNAに沿つて移動し、コード配列に含まれる情
報を、その5′未端から3′未端へと、メツセンジヤ
ーRNAに転写し、ついでそれは、DNAのコード
するアミノ酸配列を有するポリペプチドへと翻訳
される。それぞれのアミノ酸は、ヌクレオチドト
リプレツトまたは“コドン”によりコードされ
る。これらは、本発明の目的に関連して“構造遺
伝子”と称される部分、つまり、発現される生成
物のアミノ酸配列をコードする部分に存在する。
プロモーターに結合したあと、RNAポリメラー
ゼは、まず、リボゾーム結合部位をコードするヌ
クレオチドを転写し、ついで、翻訳開始または
“開始シグナル”（ふつうはATGで、得られるメ
ツセンジヤRNAではAUGとなる）を、ついで、
構造遺伝子自体に存在するヌクレオチドコドンを
転写する。構造遺伝子の端においていわゆる停止
コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼ
が、メツセンジヤーRNAの付加配列を形成する
ことがあつても、停止シグナルが存在するので、
リボゾームにより翻訳されないままとなる。リボ
ゾームは、ふつう、mRNAが形成されつつある
細菌においてはメツセンジヤーRNA上にある特
定の接合部位に結合する。そして、翻訳の開始シ
グナルに始まり、前記した停止したシグナルで終
了する、コードされたポリペプチドを生ずる。リ
ボゾーム結合部位をコードする配列が、AUG開
始コドンに関して適切に位置し、そして、残りの
コドンのすべてが、インフエース（in phase）に
開始コドンに従うならば、所望の生成物が生産さ
れる。得られた生成物は、宿主細胞を融解させ、
適当な精製法により他の細菌蛋白質より生成物を
採取することによりうることができる。 我々は、組換えDNA技術（つまり、インタフ
エロン遺伝子を微生物発現ビヒクルに挿入し、微
生物遺伝子調節要素の制御下にそれらを発現させ
ること）の利用が、大量の白血球インタフエロン
を提供するもつとも有効な方法と考えた。それ
は、ヒト由来の材料に特徴的なグリコシル化の特
性を欠如するけれども、広範囲に及びウイルスお
よび新生物による病気の治療に用いられるであろ
う。 本発明の第１の白血球遺伝子を採取する方法は
次の各段階からなる。 (1) 均一な状態に精製されたヒト白血球インタフ
エロンの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミ
ノ酸配列をコードしうる、可能なヌクレオチド
の組合わせのすべてを表わす、集合体としての
コドンを含む、合成DNAプローブのセツトを
構成する。 (2) 誘導されたメツセンジヤーRNAから相補
DNA（cDNA）を含有する細菌コロニーバンク
を調製する。放射ラベルされた別の誘導
mRNAを、このバンクからのプラスミド
cDNAとハイブリドとする。ハイブリドとした
mRNAを溶出し、卵母細胞分析でインタフエ
ロンへの翻訳について試験する。このようにし
て、インタフエロン活性を誘導することが示さ
れたコロニーよりのプラスミドDNAを、上記
(1)のように製造したプローブに対するハイブリ
ド形成について試験する。 (3) 上記(2)の工程と平行して、プラスミド中の誘
導されたmRNAに由来するcDNAを用いて、
別の形質転換コロニーバンクを用意する。(1)の
プローブをハイブリド化プローブとして用いる
ための放射ラベル１本鎖cDNAの合成を誘起す
るのに用いた。合成プローブは鋳型としての誘
導mRNAとハイブリドを形成し、逆転写によ
り拡大されて、誘導された、放射ラベルcDNA
を形成する。このようにして得られた放射ラベ
ルcDNAに対してハイブリド化されたコロニー
バンクよりのクローンについてさらに調べて、
完全長のインタフエロンコード遺伝子の存在を
確かめる。(1)また(2)で得られる部分長の推定さ
れる遺伝子断片も、それら自体、完全長遺伝子
のプローブに用いうる。 (4) 上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペ
プチドの微生物による発現を妨げるかも知れな
いリーダ（leader）配列があれば、それを除
き、そして、微生物プロモーターの開始シグナ
ルおよびリボゾーム結合部位に関して、発現ビ
ヒクル中に適当に位置することを可能とするよ
うに、合成DNAを用いて、仕立上げられた。
発現されたインタフエロンは精製して、その特
性を確認し、活性を測定する。 (5) 上記の方法で調製したインタフエロン遺伝子
断片それ自体は、他の部分的に相同な白血球イ
ンタフエロン種の、ハイブリド化によるプロー
ブに用いられる。 上記に概要を示した組換えDNA技術を応用す
ることにより、相当する先行配列またはその一部
分を本質的にともなわない、成熟ポリペプチドと
しての１群の相同的な白血球インタフエロン（グ
リコシル化されていない）を、高収量、高純度
で、微生物的に生産することが可能となつた。こ
れらのインタフエロンは、動物およびヒトのウイ
ルスおよび悪性腫瘍疾患に用いるに適当なレベル
まで、直接発現させ、採取し、そして精製するこ
とができる。このように発現された、１群のイン
タフエロンはイン ビトロ試験で有効であること
が示され、そして、微生物的に生産された最初の
白血球インタフエロンとして、イン ビボの試験
でも、始めて、有効なことが示されたのである。 本明細書中で用いられる“成熟白血球インタフ
エロン”の用語は、グリコシル基を欠如する、微
生物的（たとえば、細菌的に）生産されるインタ
フエロンを意味する。本発明の成熟白血球インタ
フエロンは天然生成物の第１のアミノ酸コドンの
すぐ前にある翻訳開始シグナル（ATG）より直
ちに発現される。従つて、この“成熟”ポリペプ
チドはその配列中に第１のアミノ酸としてメチオ
ニン（ATGがコードする）を含有するが、本質
的にその特性は影響されない。他方、微生物宿主
は翻訳生成物を加工して、最初のメチオニンを除
きうる。成熟白血球インタフエロンは、通常のリ
ーダー以外の接合蛋白質と一緒に発現されうる
が、この接合物は、細胞外または細胞内の環境に
おいて特異的に除去しうる（英国特許公報No.
2007676Aをみよ）。最後に、成熟インタフエロン
は、接合物を細胞壁まで輸送する、微生物“シグ
ナル”ペプチドとの接合物として生産されうる。
細胞壁においてシグナルは処理してはづされ、成
熟ポリペプチドが分泌される。 成熟白血球インタフエロンの“発現”とは、ヒ
ト白血球インタフエロンゲノムのmRNA翻訳に
直接に結果する、グリコシル基または先行配列を
含有しないインタフエロン分子の細菌または他の
微生物による生産を意味する。 特定の白血球インタフエロン蛋白質は、ここで
は、決定されたDNA遺伝子（表２および表４）
および演繹的に定められるアミノ酸配列（表３お
よび表５）により定義される。これらの特定のイ
ンタフエロン、実際ここに含まれるすべての群の
白血球インタフエロンタンパク質に対して、天然
の対立遺伝子変異（allelic variation）が存在
し、個体間にもおこりうる。これらの変異は、配
列全体におけるアミノ酸の相異または、配列中の
アミノ酸の欠落、置き代え、挿入、反転または追
加として表われる。本明細書で対象とする各イン
タフエロン、標示されたLeIF ＡからLeIF Ｊに
ついて、そのような、対立遺伝子変異は、標示の
範囲内または、その定義内に含まれ、従つて、本
発明の範囲内に含まれるとする。 つぎに、表および図について説明する。






表１は、Ｔ−１およびＴ−13と称される、ヒト
白血球より分離されそして均一に精製された、す
べての種類のインタフエロンに共通の２つのアミ
ノ酸配列を示す。これらのペプチドをコードする
可能なmRNA配列のすべておよび対応するDNA
配列を示す。Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵの文字は、
それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシ
ンおよびウラシルの塩基を含有するヌクレオチド
を示す。文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよ
びＵのいずれかを示す。ポリヌクレオチドは、
5′（左側）から3′（右側）の方向に読むように記載
されている。そして、２重鎖（“d.s.”）DNAを示
す時には、下側または非コード鎖については、順
序は逆となる。第１図は、可能性のあるLeIFプ
ラスミドと ³²p−ラベル合成デオキシオリゴヌク
レオチドとのハイブリド化を示すオートラジオグ
ラムである。 第２表は、それぞれ、“Ａ”から“Ｈ”までの
記号を付されている、白血球インタフエロンの発
現のために候補として分離された８個の遺伝子断
片のヌクレオチド配列（コード鎖）を示す。それ
ぞれのLeIFについて、ATGの翻訳開始コドンお
よび終止トリプレツトが下線で示されている。停
止コドンまたは終止コドンに続いて3′の未翻訳領
域が示されている。含まれているLeIF Ａの全遺
伝子長には、表２の第３列Ａラインに示されるよ
うに、他のコドンには存在するひとつのコドンが
欠如している。5′非翻訳域がリーダー配列に先行
している。分離したままの断片Ｅには、リーダー
の完全な先行配列は存在しない。しかし、仮定さ
れる成熟LeIF Ｅに対する全遺伝子を含有する。
分離されたままの断片Ｇは、コード配列が完全で
ない。 表３では、ヌクレオチド配列より示される８個
のLeIF蛋白質配列を比較している。IUPAC−
LUBコミツシヨン オン バイオケミカル ノ
ーメンカルチヤー（Commission on
Biochemical Nomenclature）の提案による１文
字省略が用いられている。つまり、アラニンはＡ
で、システインはＣで、アスパラギン酸はＤで、
グルタミン酸はＥで、フエニルアラニンはＦで、
グリシンはＧで、ヒスチジンはＨで、イソロイシ
ンはＩで、リジンはＫで、ロイシンはＬで、メチ
オニンはＭで、アスパラギンはＮで、プロリンは
Ｐで、グルタミンはＱで、アルギニンはＲで、セ
リンはＳ、スレオニンはＴで、バリンはＶで、ト
リプトフアンはＷで、チロシンはＹで表わす。数
はアミノ酸の位置を示す。Ｓはシグナルペプチド
を示す。165個のアミノ酸配列であるLeIF Ａ配
列中の44位のダツシユは、このLeIF Ａ配列を他
のLeIFの166個のアミノ酸配列と一列にそろえる
ために入れてある。LeIF Ｅの配列は、そのコー
ド領域の余分のヌクレオチド（表２の位置187）
を無視して定められている。星印は、インフエー
スにある終止コドンを示す。すべてのLeIFに共
通のアミノ酸（プソイド遺伝子LeIF Ｅを除く）
もまた示されている。アンダーラインした残基
は、ヒト線維芽インタフエロンにも存在するアミ
ノ酸である。 第２図は、LeIFクローン化cDNAの８個の型
（ＡからＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図
を示す。ハイブリドプラスミドは、dC：dGテー
リング法（ゴデル（Goeddel.D.V.）等、ネーチ
ヤー（Nature）287、411−416〔1980〕）により構
築された。 それで、cDNA挿入物は、Pst を用いて切
断しうる。各cDNA挿入物の末端のラインは、側
面に接するホモ重合dC：dGテールを示す。Pvu
、EcoRおよびBgl の制限部位も示し
てある。濃い領域は成熟LeIFのコード配列を示
す。斜線の部分はシグナルペプチドコード配列で
ある。白い部分は3′および5′非コード配列であ
る。 第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成を
コードする遺伝子の構築を示す。制限部位および
残部が示されている（“Pst”等）。“b.p.”は塩
基対を示す。 第４図および第５図は、LeIF Ｂ成熟白血球イ
ンタフエロンを発現するに用いられる２つの遺伝
子断片の制限地図を示す。示したコドン配列は、
示した２つの場合について制限酵素Sau3aで消化
することで生成するコード鎖未端である。 表４および表５は、タイプＩおよびＪを含め
た、５個のLeIF蛋白質の配列のDNAおよびアミ
ノ酸（省略符号については、第３表に同じ）を示
す。第５表において、星印は対応するDNA配列
における終止コドンを示し、ハイフエンは配列に
おける欠落またはギヤツプを示す。 つぎに、本発明を実施するための有利な具体例
を示す。 Ａ 使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つ
まり、米国特許（U.S.P.）4190495記載のイー．
コリ（E.coli）×1776およびイー．コリ（E.
coli）Ｋ−12、294株（エンドＡ、thi^-、hsr^-、
hsm⁺ _k、英国特許公報No.2055382に記載）を用い
ている。それぞれ、ザ アメリカン タイプ
カルチヤー コレクシヨン（the American
Type Culture Collection）に寄託され、
ATCCNo.31537および31446（ブタペスト条約に
よる国際寄託に基づく受託番号31446）が付さ
れている。組換えDNAの実験のすべては、ナ
シヨナル インスチチユート オブ ヘルス
（National Institute of Health）の該当する
ガイドラインに従つて実施された。 本発明のもつとも有利な具体例は、上記定義
の菌株イー．コリ（E.coli）×1776およびイー．
コリ（E.coli）ｋ−12菌株294のみならず、他
の既知のイー．コリ（E.coli）株（以下E.coli
で示す）たとえばE.coli Ｂを含めたE.coliおよ
び他の微生物株に関連して記載してゆくが、こ
れらの多くは、ザ アメリカン タイプ カル
チヤー コレクシヨン（the American Type
Culture Collection）（ATCC）のような、知
られている微生物寄託施設に寄託されており入
手可能である。ドイツ特許2644432もみられた
い。これらの他の微生物には、 バチルス（Bacillus）たとえばバチルス サ
ブチリス（Bacillus Subtilis）および他の腸内
細菌たとえばサルモネラ チフイムリウム
（Salmonella typhimurium）およびセラチア
マルセセンス（Serratia marcescens）があ
り、異質遺伝子配列を発現しうる、複製しうる
プラスミドを使用する。酵母たとえばサツカロ
スマイセスセレビシアエ（Saccharomyces
cerevisiae）もまた、酵母プロモーターの制御
下に、インタフエロンをコードする遺伝子を発
現させることによるインタフエロン蛋白質の製
造に用いて有利でありうる。 Ｂ LeIF mRNAの原料および精製 LeIF mRNAは、ヒト白血球より採取しう
る。ふつうは、ドイツ特許No.2947134に記載の
ように、センダイ（Sendai）ウイルスまたは
ニユーカツスル（Newcastle）病ウイルスでイ
ンタフエロンを生産するように誘導した慢性骨
ずい性白血病患者の白血球より得たものを使用
する。特に有利な、本明細書の仕事に用いられ
る原料は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来
するKG−１と称するセルラインである。この
セルラインは、コフラー（Koeffler、H.P.）お
よびゴルデ（Golde、D.W.、）サイエンス
（Science）200、1153（1978）に記載されている
ように、〔ローズウオル パーク メモリアル
インスチチユートRMPI（Rosewall Park
Memorial Institure）〕1640プラス10％熱不活
化FCS（牛胎児血清）、25mM HEPES緩衝液
（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−
N′−２−エタンスルホン酸）および50μｇ／ml
のゲンタマイシン含有培地に容易に発育し、１
週間に２度、継代培養（１から３スプリツト）
しうる。上記の発育培地に10％ジメチルスルホ
キサイドを加えて、細胞は凍結させうる。KG
−１は、ザ アメリカン タイプ カルチヤー
コレクシヨン（the American Type
Culture Collection）（ATCCNo.CRL8031）に
寄託されている。 KG−１細胞は、ルビンステン
（Rubinstein）等記載の方法プロク．ナトル．
アカド．サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.）76、640−644〔1979〕）により、センダイ
（Sendai）またはニユーカツスル
（Newcastle）病ウイルスを用い、白血球イン
タフエロンmRNAを生産するように誘導され
た。細胞は、誘導後５時間に採取し、グアニジ
ンチオシアネート−グアニジン塩酸塩法（チヤ
ーウイン（Chirgwin）等、バイオケミストリ
イ（Biochemistry）18、5294−5299〔1979〕）
により調製した。誘導しない細胞からのRNA
も同様に調製した。オリゴデオキシチミジン
（dT）−セルローズクロマトグラフイーおよび
フクロースグラジエント超遠心を用いて、ポリ
(A)mRNAの12S分画を得た。方法は、グリーン
（Green）等（アーク．バイオケミ．バイオフ
イス（Arch.Biochem.Biophys.）172、74−89
〔1979〕）およびオクユマ（Okuyuma）等（ア
ーチ．バイオケミ．バイオフイス．（Arch.
Biochem.Biophys.）188、98−104〔1978）〕の
方法を用いた。このmRNAは、アフリカツメ
ガエル卵母細胞分析（カバリーリ（Cavalieri）
等、プロク．ナトル．アカド．サイ．米国
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）74、3287−3291
〔1977〕）で8000−10000単位／マイクログラム
のインタフエロンタイターを示す。 Ｃ LeIF cDNA配列を含有するコロニーバンク
の調製 5μｇのmRNAを用い、標準方法ウイケンス
（Wickens）等、ジエイ．バイオル．ケミ．（J.
Biol.Chem.253、2483−2495〔1978〕およびゴ
デル（Goeddel）等、ネーチヤー（Nature）
281、544−548〔1979〕）により、２重鎖cDNA
を調製した。cDNAは６％ポリアクリルアミド
ゲル上での電気泳動により、大きさに従つて分
画し、500から1500b.p.の大きさの材料230nｇ
を、電気溶出により得た。このcDNAの100n
ｇ分を、デオキシシチジン（dC）残基でテー
リングし（チヤング（Chang）等、ネーチヤー
（Nature）275、617−224（1978）、Pst部位に
おいてデオキシグアノシン（dG）残基でテー
リング（tailing）した470nｇのプラスミド
pBR322とアニーリングし（ボリバー
（Bolivar）等、ジエイン（Gene）２、95−113
〔1977〕）、これを用いてE.coli×1776を形質変
換した。cDNAnｇについて約130個のテトラ
サイクリン抵抗性で、アンピシリン感受性の形
質転換株を得た。 第２の同様の実験では、cDNAnｇについ
て、約1000個のテトラサイクリン抵抗性で、ア
ンピシリン感受性のE.coli Ｋ−12株294の転換
株を得た。この場合、600から1300b.p.の範囲
の、サイズにより分画した、cDNA材料を、電
気溶出により採取し、dCでテーリングするの
に用いた。 Ｄ 合成オリゴヌクレオチドの調製およびその使
用 ヒト白血球インタフエロンのいくつかのトリ
プシン分解断片のアミノ酸配列についての知見
は、LeIF mRNAの種々の領域に対して相補
的な合成デオキシオリゴヌクレオチドのデザイ
ンを可能とした。２つのトリプシンペプチド
T1およびT13を選んだ。その理由は、それら
のアミノ酸配列は、すべての可能なコード配列
（表１）を説明するのに、12個および４個のウ
ンデカマーを合成するだけですむからである。
それぞれの配列について、４組のデオキシオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成した。つまり
各々三つ（Ｔ−1A、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または一つ
（Ｔ−13A、Ｂ、Ｃ、Ｄ）のオリゴヌクレオチ
ドを含有する。示した相補的デオキシオリゴヌ
クレオチド11塩基鎖長は、ホスホトリエステル
法で化学的に合成した（クレア（Crea）等、
プロク．ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.）75、5765−5769
〔1978〕）。Ｔ−13シリーズでは、４個の個々の
プローブを調製した。表１に示すように、３個
のプローブの４プールとして、12個のＴ−１プ
ローブを調製した。 Ｔ−13シリーズの４個のそれぞれのプローブ
および各３個のプライマーの４プールとして調
製した12個のＴ−１プローブを、ハイブリド化
プローブに用いるための放射ラベル１重鎖
cDNAの合成を誘導するために用いた。鋳型
mRNAは、センダイ誘導KG−１細胞（8000単
位IF活性／μｇ）からの12S RNAまたは非誘
導白血球（＜10単位／μｇ）に由来する全ポリ
(A)mRNAである。 ³²p−ラベルcDNAを、既
知の反応条件（ノイズ（Noyes）等、プロク、
ナトル．アカド．サイ．米国（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.）76、1770−1774〔1979〕）を
用いて、これらのプライマーより調製した。
20mMトリス（Tris）（以下Trisで示す）−HCl
（PH8.3）、20mM KCl.8mM MgCl₂.30mM β
−メルカプトエタノール中で60μl容量の反応を
おこなつた。この反応は、各プライマーの1μ
ｇ（つまり、Ｔ−１シリースについては、全部
で12μｇ、Ｔ−13シリースについては全部で4μ
ｇ）、2μｇの“誘導”された12S分画mRNA
（または、非誘導ポリ(A)mRNAの10μｇ）、
0.5mMのdATP、dCTP、dTTP、200μCi（α
³²p）dCTP（アメルシヤム（Amersham）、２
−3000Ci／ｍ mole）および60単位逆転写酵
素〔ベゼスダ リサーチ ラボラトリイス
（Bethesda Research Laboratories）〕であ
る。生成物は、10mlセフアデツクス
（Sephadex （以下Sephadex で示す）Ｇ−
50カラム上のゲル濾過により、結合されなかつ
たラベルより分け、70℃で30分間0.3N NaOH
で処理し、RNAを分解し、HClで中和した。
ハイブリド化は、カフアトス（Kafatos）等、
ヌクレイツク、アシドリサーチ（Nucleic
Acid Res.）７、1541−1552（1979）記載に準
じて実施した。 Ｅ クローンpL1−pL30の同定 500個のE.coli Ｋ−12株294形質転換株（Ｃ
項参照）のそれぞれより、プラスミドDNAの
1μｇを調製するのに、バーンボイム
（Birnboim）等、ヌクレイツク アシド リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）７、1513−1523
（1979）の迅速プラスミド分離操作を用いた。
各DNA試料を変成させ、カフアトス
（Kafatos）等の上記引用の方法に従い、３反
復でニトロセルローズフイルター上につけた。 500個のプラスミド試料を含有するニトロセ
ルロースフイルターの３組は、 (a) プライマーのＴ−１のセツトでプライムさ
れた誘導cDNA、 (b) Ｔ−13でプライムされた誘導cDNAおよび (c) プライマーの両方のセツトを用いて調製さ
れた非誘導cDNAとハイブリダイズした。非
誘導プローブの全体に対するよりも誘導され
た cDNAプローブの一方または両方に対してよ
り強くハイブリド化するならば、クローンは陽
性と考えた。500個より30個の“陽性”クロー
ンpL1−pL30）を選択し、さらに分析した。 F.クローンpL31−pL39の同定、LeIF遺伝子
断片を含有するプラスミド（No.104）の分離 プローブとして ³²p−ラベル誘導mRNAリ
ーレンホーグ（Lillenhaug）等、バイオケミス
トリイ（Biochemistry、）15、1858−1865
〔1976〕）を用いて、グランステイン
（Grunstein）およびホグネス（Hogness）のコ
ロニーハイブリド化法（プロク．ナトル．アカ
ド．サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）
72、3961−3965〔1975〕〕によりE.coli×1776の
形質転換株をスクリーニングした。非誘導細胞
よりの非ラベルmRNAを ³²p−ラベル調製物
中に存在する非誘導mRNAと競合さすために、
プローブに対して200対１に混合した。ラベル
された mRNAのハイブリド化は、誘導された配列
を含有するコロニーに選択的に起るはづであ
る。３つの群の形質転換株が得られた。 (1) コロニーの２から３％が ³²p−mRNAに
非常に強くハイブリド化した。 (2) 10％は、ハイブリド化の程度が、上記(1)群
より著しく低かつた。 (3) 残りは、検出しうる程度のハイブリド化の
シグナルを示さなかつた。 陽性のコロニー（第(1)および第(2)群）につい
ては、インタフエロンmRNAがプラスミド
DNAに特異的にハイブリド化することによる
分析で、インタフエロンに特異的な配列の存在
について調べた。まず、テトラサイクリン
（20μｇ／ml）、ジアミノピメリン酸（100μｇ／
ml）、チミジン（20μｇ／ml）およびｄ−ビチ
オン（1μｇ／ml）を加えたM9培地の100mlに、
60個の強陽性コロニー（第１群）のそれぞれを
個別的に発育させた。M9培地は、１リツトル
について、Na₂HPO₄（６ｇ）、KH₂PO₄（３ｇ）、
NaCl（0.5ｇ）およびNH₄Cl（１ｇ）を含有し、
オートクレーブしたあと、無菌1M MgSO₄の
１mlおよび無菌0.01M CaCl₂の10mlを添加す
る。10個の培養物はプールし、クレベル
（Clewell）等、バイオケミストリイ
（Biochemistry）９、4428−440〔1970〕記載の
ように、６個のプールよりプラスミドDNAを
分離した。各プラスミドDNAプールの10μｇ
は、HindIIIで切断し、変性し、DBM（ジアゾ
ベンジルオキイメチル）紙に共有結合させた。
誘導細胞よりの精製のmRNAの1μｇをそれぞ
れの濾紙にハイブリドさせた。ハイブリドしな
いmRNAは洗つて除去した。。特異的にハイブ
リドされたmRNAは溶出し、アフリカツメガ
エルの卵母細胞中で翻訳させた。この分析で、
６個のプールはすべて陰性であつた。弱陽性の
コロニー（第２群）の59個より、各10コロニー
の５プールと９コロニーの１プールを調製し、
それらのプールよりプラスミドを調製し、上記
のように調べた。試験した６個のプールのう
ち、１個の（K10）は、試験の度に、バツクグ
ラウンドレベルを著しく超えるレベルで、イン
タフエロンmRNAにハイブリドした。特異的
インタフエロンcDNAクローンを同定するため
に、プールK10の９コロニーよりプラスミド
DNAを調製し、個別的に調べた。９個のプラ
スミドのうち２個（No.101およびNo.104）がイン
タフエロンmRNAと、バツクグラウンドレベ
ルを十分に超えて結合した。プラスミドNo.104
より、260b.p.を含有する、独持のBgl制限断
片を分離した。これを、テイラー（Taylor）
等、バイオケミ．バイオフイス．アクタ
（Biochim.Biophys.Acta）442、324−330
（1976）の方法により ³²pでラベルし、コロニ
ースクリーニング法（グランステイン等
（Grunstein and Hogness）、プロク．ナトル．
サイ．米国（Proc.Natl.Sci.U.S.A.）72、3961
−3965〔1975〕）によりE.coli294転換株の400個
を、個別的にスクリーニングするためのプロー
ブを用いた。このプローブと種々の程度にハイ
ブリド化する、９個のコロニー（pL31−pL39）
を同定した。 さらに、ラベルされた260b.p.断片を用いて、
同様にして、4000個のE.coli294転換株を個別
的にスクリーニングした。このプローブと種種
の程度にハイブリドする50個のコロニーを同定
した。ひとつは、LeIF Ｇ断片を、ひとつは、
LeIF Ｈ断片を、ひとつはLeIF HIと称する断
片（みかけ上、LeIF Ｈの対立遺伝子である）
を含有した。生ずるハイブリドプラスミドは、
“pLeIF Ｈ”等と称した。 Ｇ 最初の完全長LeIF遺伝子の分離および配列
の決定 全体で39個の可能性のあるLeIF cDNAクロ
ーンよりプラスミドDNAを調製した。そして、
カフアトス（Kafatos）等（上記引用）のハイ
ブリド化操作により、同じ260b.p.DNAプロー
ブを用い再スクリーニングした。このプローブ
と３個のプラスミド（pL4、pL31、pL34）は
非常に強いハイブリド化シグナルを与え、４個
（pL13、pL30、pL32、pL36）は中程度にハイ
ブリド化し、３個（pL6、pL8、pL14）は、弱
くハイブリド化した。 39個の可能性のあるLeIF cDNA組換えプラ
スミドは、また、 ³²p−ラベル合成ウンデカマ
ー各々３種のプライマーからなるＴ−１プライ
マープールのそれぞれまたはＴ−13プライマー
のそれぞれ）をじかにハイブリド化のプローブ
に用いて検索した。検出しうるハイブリド化の
シグナルを与えるのに完全な塩基間の対が必要
であるように、ハイブリド化の条件を選んだ
（ワランス（Wallace）等、ヌクレイツクアシ
ド リサーチ（Nucleic Acid Res.）６、3543
−3557〔1979〕）。つまり、39個のクローンより
プラスミドDNAを、標準上澄溶液法（プラス
ミドを有する細胞を界面活性剤等を用いてて溶
菌させ、遠心分離後、プラスミドを含む上澄み
を回収し、この上澄みからプラスミドを単離す
る方法である。上澄みからの単離にはエタノー
ル沈澱法が利用される。）（cleared Lysate
procedure；クレベル（Clewell）等、上記）
で調製し、バイオラド アガロース（Biorad
Agarose）Ａ−50（Bio−Rad社製のゲル濾過用
アガロースゲル）カラムクロマトグラフイーで
精製した。各調製物の試料（3μｇ）は、EcoR
で処理して開環し、アルカリで変性させ、２
枚の別々のニトロセルローススフイルターにス
ポツトした。１スポツトについて1.5μｇとす
る。上記引用のアフアトス（Kafatos）等の文
献をみよ。合成デオキシオリゴヌクレオチドＴ
−13プライマーおよびＴ−１プライマープール
のそれぞれは、（γ ³²P）ATPでつぎのように
リン酸化した。50pmoleのオリゴヌクレオチド
および100pmoleの（γ ³²P）ATP（ニユー
イングランド ニユークレアー（New
England Nuclear）、2500Ci／ｍ mole）を、
50mMのTris−HCl、10mMのMgCl₂および
15mMのβ−メルカプトエタノールの混合物の
30μl中で合併した。２単位のT4ポリヌクレオ
チドキナーゼを添加し、37℃で30分後 ³²p−ラ
ベルプライマーは、10mlセフアデツクス
（Sephadex ）Ｇ−50のカラム上でのクロマト
グラフイーで精製した。10⁶cpmのプラライマ
ーＴ−13Cまたは３×16⁶cpmのプライマープー
ルＴ−1Cを用いてハイブリド化した。ハイブ
リド化は、ワランス（Wallace）等の上記引用
の方法に従つて、６×SSC〔１×SSC＝
0.15MNaCl、0.155Mくえん酸ナトリウム、PH
7.2〕、10×Denhardts〔0.2％牛血清アルブミン、
0.2％ポリビニルピロリドン、0.2％Ficoll〕溶
液中で、15℃で14時間ハイブリド化した。フイ
ルターは６×SSC中０℃で５分間宛３度洗つ
た。乾燥し、Ｘ−線フイルムにさらした。結果
は、第１図に、 ³²p−プライマーＴ−13Cおよ
びプライマープールＴ−1Cの場合について示
してある。 クローン104からのプラスミドDNAは、プラ
イマープールＴ−1CおよびプライマーＴ−13C
と顕著にハイブリド化した。しかし、他のウン
デカマーとは、検出しうる程のハイブリド化は
示さなかつた。第１図に示すように、39個の可
能性のあるLeIFプラスミドのうちいくらか
（pL2、４、13、17、20、30、31、34）はこれ
らのプローブの両方とハイブリド化した。しか
し、制限分析から、これらのプラスミドのうち
のひとつだけ、pL31が260b.p.内部Bgl断片
をも含有した。pL31をPstで消化した結果、
cDNA挿入物の大きさは約1000b.p.であつた。 pL31のPst挿入物全体の配列を、マキサム
−ギルバート（Maxam−Gilbert）化学法（メ
ソード エンザイモル．（Methods Enzymol.）
65、499−560〔1980〕）およびジデオキシ鎖末端
化方法（スミス、メソード エンザイモル
（Smith Methods Enzymol）65、560−580
〔1980〕）で決定した。その際、Sau3 ａ断片を
M13ベクター中にサブクローン化しておいた。
DNA配列は表２の“Ａ”に示してある。入手
しうる蛋白質配列についての情報、既知の
LeIF分子量の範囲、３個の可能な読み枠にお
ける停止トリプレツトの相対的な存在より適当
な翻訳読み枠が示唆された。それから、プレー
またはシグナルペプチドを含めてLeIFアミノ
酸全配列が示された。第１のATG翻訳開始コ
ドンは、配列の5′末端より60番目のヌクレオチ
ドに存在し、188コドンあとに、TGA終止トリ
プレツトが存在する。3′末端には342個の非翻
訳ヌクレオチドがあり、ついでポリ(A)配列がつ
づく。仮定されるシグナルペブチド（おそら
く、白血球よりの成熟LeIFの分泌にあづかる
のであろう）は23アミノ酸長である。成熟
LeIFを構成する165アミノ酸の分子量の計算値
は、19390である。我々は、このpL31によりコ
ードされたLeIFを“LeIF Ａ”と称した。表３
の配列データ（“Ａ”）より、トリプシンペプチ
ドT1およびT13は、LeIF Ａの146−150および
58−62にそれぞれ相当することが分る。これら
の２つの領域に見出される実際のDNAコード
配列は、プライマープールT1−Ｃおよびプラ
イマーT13−Ｃに表されるものである（表４を
みよ）。 Ｈ 成熟白血球インタフエロンＡ（LeIFA）の直
接発現 １ 一般的既述 LeIF Ａを成熟インタフエロンポリペプチ
ドとして直接に発現させるための操作は、合
成（Ｎ−末端）および相補的DNAの組合せ
を包含する点でヒト生長ホルモンに用いられ
た方法（ゴデル（Goeddel）等、ネーチヤー
（Nature）281、544−548〔1979〕の一変形で
ある。 第３図に示すように、Sau3a制限エンドヌ
クレアーゼ部位は、便宜なことに、LeIF Ａ
のコドン１および３とのあいだに存在する。
ATG翻訳開始コドンを含有し、アミノ酸１
（システイン）に対するコドンを修復し、
EcoR粘着末端を新しく作製することを包
含する、２つの合成デオキシオリゴヌクレオ
チドをデザインした。これらのオリゴマー
は、pL31の34b.p.Sau 3a−Ava断片に連
結した。生ずる45b.p.生成物は２つの追加の
DNA断片に連結させ、865b.p.合成−天然雑
種遺伝子とした。これは、LeIF Ａをコード
し、EcoRIおよびPstI制限部位によりはさま
れている。この遺伝子は、EcoRIおよびPstI
部位のあいだにおいて、pBR322に挿入し、
プラスミドpleIF Alとした。 ２ トリプトフアン調節要素（E.coli trpプロ
モーター、オペレーターおよびtrpリーダー
リボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始の
ためのATG配列を欠如する）の要素 プラスミドpGMI（ATCC 31622）は、欠
矢△LE 1413を含有するE.coliトリプトフア
ンオペロンを担う（ミオザリ（Miozzari）
等、ジエイ・バクテリオロジイ（J.
Bacteriology）133、1457−1466〔1978〕）。
それゆえに、trpリーダーの最初の６個のア
ミノ酸そしてtrp Ｅポリペプチドのおよそ最
後の1/3（以降、あわせてLE′と称する）な
らびにtrp Ｄポリペプチドの全体を含有する
融合蛋白質を発現する。これはすべてtrpプ
ロモーター−オペレーターシステムの調節下
にある。プラスミドpGM1の代りに容易に入
手可能なその他の同等trpプロモーター（た
とえば、Bennett、J.Mol.Biol.（1978）121、
113−137の135頁Fig.10参照）を用いてもよ
い。このプラスミド20μｇを制限酵素Pvu
で消化した。これは、プラスミドを５個の部
位において切断する。この遺伝子断片はつい
でEcoRリンカー（pCATGAATTCATG
の自己相補性のオリゴヌクレオチドより成立
つ）と結合させ、あとから、EcoR部位含
有プラスミド中にクローン化するための
EcoR切断部位とする。pGMIより得られ
るDNA断片の20μｇを、200pmoleの5′−リ
ン酸化合成オリゴヌクレオチド
pCATGAATTCATGの存在で、
20μlT₄DNAリガーゼ緩衝液（20mM Tris
PH7.6、0.5mM ATP、10mM MgCl₂、5mM
ジチオスレイトール）中で10単位T₄DNAリ
ガーゼで４℃一夜処理した。溶液はついで70
℃で10分間加熱し、連結を停止させた。リン
カーはEcoRI消化で切断し、EcoRI末端を有
する断片を５パーセントポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（以降PAGEと称する）を用い
て分け、大きい方の３個の断片を、エチジウ
ムブロマイドでまず染色し、紫外線で断片の
位置を定め、ゲルより対象となる部分を切り
取る方法で分離した。各ゲル断片（300μl0.1
×TBE）を透析バツグに入れ、そして、0.1
×TBE緩衝液（TBE緩衝液は10.8ｇのTris
塩基、5.5ｇのホウ酸、0.09ｇのNa₂EDTAを
１リツトルのH₂O中に含有）中で100V1時間
電気泳動した。透析バツグより水溶液を採取
し、フエノール抽出、クロロホルム抽出、
0.2M塩化ナトリウム濃度とし、エタノール
沈殿後水中にDNAを採取した。EcoRI粘着
末端を有するtrpプロモータ−ーオペレータ
ー含有遺伝子は、つぎに記載する操作で同定
した。つまり、テトラサイクリン感受性プラ
スミドに断片を挿入し、これは、プロモータ
ーオペレーターの挿入で、テトラサイクリン
抵抗性とした。 プラスミドpBRHI（ロドリゲス
（Rodriguez）等、ヌクレイツク アシド
リサーチ（Nucleic Acids Res.）６、3267
−3287〔1979〕）は、アンピシリン抵抗性を発
現しそして、テトラサイクリン抵抗性遺伝子
を含有する。しかし、それに組合わされたプ
ロモーターが存在しないので、その抵抗性を
発現しない。このプラスミドは従つてテトラ
サイクリン感受性である。このEcoR部位
にプロモーター−オペレーターシステムを導
入することにより、プラスミドをテトラサイ
クリン抵抗性となしうる。 pBRHIをEcoRで消化し、酵素はフエノ
ール抽出クロロホルム抽出で除去し、エタノ
ール沈殿させて水中にうる。別々の反応混合
物中に存在する生成DNA分子は、上記に得
られた３個のDNA断片のそれぞれと合併し、
そして、前記のように、T₄DNAリガーゼで
連結させた。反応混合物中に存在するDNA
を用いて、標準方法（ハーシユフイールド
（Hershfield）等、プロク．ナトル．アカド．
サイ．米国（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）
71、3455−3459〔1974〕）によりDNAとり込
み能のあるE.coli Ｋ−12株294を形質転換
し、この細菌を、20μｇ／mlのシンピシリン
および5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有
するLB（Luria−Bertani）プレートに接触
した。いくつかのテトラサイクリン抵抗性コ
ロニーを選び、プラスミドDNAを分離しそ
して、望む断片の存在を制限酵素分析で確か
めた。生ずるプラスミドをpBRH trpと称す
る。 肝炎ＢのウイルスゲノムのEcoRおよび
BamH消化生成物を常法により採取し、
プラスミドpGH6（ATCC31539）のEcoR
およびBamH部位にクローン化しこのプ
ラスミドpGH6は、GoeddelらのNature281、
544（1979）に示されているように、プラスミ
ドpKB268から単離された285塩基対のEcoR
断片（同断片は、95塩基対の異種DNA断
片を介在させた２つのUV−５ lacプロモ
ータからなり、その構築方法は、Johnsrud
のProc.Natl.Acad.Sci.USA.75(11)5314−5318
（1978）に記載されている）を、プラスミド
pBR322のEcoR部位に挿入することによ
り構築される。なお、UV−５ lacプロモ
ータの塩基配列は、DicksonらのScience
187、27−35（1975）、SimpsonらのCell18、
277−285（1979）、SiebenlistらのCell20、269
−281（1980）等に記載されており、公知であ
る。プラスミドpHS32とする。プラスミド
pHS32をXbaで切断し、フエノール抽出
し、クロロホルム抽出し、エタノール沈殿さ
せた。沈殿は、0.1mM dTTPおよび
0.1mMdCTPを含有する30μlポリメラーゼ緩
衝液（50mMリン酸カリウムPH7.4、7mM、
MgCl₂、1mM β−メルカプトエタノール）
中で、1μlE.coli DNAポリメラーゼ、クレ
ノーKlenow断片〔ベーリンガー−マンハイ
ム（Boehringer−Mannheim）〕で、０℃で
30分、ついで37℃で２時間処理した。この処
理でXbaI切断部位の5′突出末端に相補的な
４個のヌクレオチドのうちの２個がみたされ
る。 5′ CTAGA−5′ CTAGA− 3′ Ｔ− TCT− ２つのヌクレオチドdCおよびdTが組込ま
れて２つの突出する5′ヌクレオチドを有する
末端を与える。プラスミドpHS32（フエノー
ルおよびクロロホルム抽出後エタノール沈殿
させて水に取る）のこの直鎖残基を、EcoR
で切断した。大型プラスミド断片を、
PAGEで、より小さいEcOR−Xba断片
より分け、電気溶出により分離した。
pHS32（0.2μｇ）よりのこのDNA断片は、上
記に類似の条件で、pBRH trpに由来するト
リプトフアンオペロン（約0.01μｇ）のEcoR
−Taq断片に連結した。 上記のpHS32の断片をEcoR−Taq断
片に連結するこの方法において、完全なワト
ソン−クリツク塩基対ではないけれども、
Taqの突出する末端をXbaの残存する突
出末端に連結する。 −Ｔ CTAGA−−TCTAGA− ＋ → −AGC TCH−−AGCTCT− この連結反応混合物の１部はE.coli294細
胞の変換に用い、熱処理し、アンピシリン含
有LBプレート中に塗布した。24個のコロニ
ーを選択し、３mlLB（Luria−Bertani）中
で発育させ、プラスミドを分離した。これら
のコロニーのうちの６個が、E.coliによる
DNA修復および複製により再生されたXba
部位を有することが分つた。 −Ｔ CTAGA−−TCTAGA− ＋ → −AGC TCT−−AGATCT− これらのプラスミドは、EcoRおよび
Hpaの両方で切断せれて、期待される制限
断片を与えることも分つた。pTrp14と称す
るひとつのプラスミドを、つぎに論議するよ
うに異質のポリペプチドを発現さすのに用い
た。 プラスミドpHGH107（ATCC31538）この
プラスミドpHGH107は、Goeddelらの
Nature281、544（1979）に記載の方法（例え
ば同文献のFig.4参照）により、前述の
pGH6のlacプロモータの下流にヒト成長ホ
ルモンをコードするDNA断片を挿入して構
築される。は、合成DNA断片より生成され
た23個のアミノ酸コドンおよびこのヒト生長
ホルモンメツセンジヤーRNAの逆転写で生
成される相補的DNAより得られる163個のア
ミノ酸コドンより成立つヒト生長ホルモンに
対する遺伝子を含んでいる。この遺伝子は、
ヒト生長ホルモンの“先行”配列のコドンを
欠如するけれども、ATG翻訳開始コドンを
含有する。この遺伝子は、10μpHGH107よ
り、EcoRI処理、それに続く、上記のような
E.coliDNAポリメラーゼＩクレノー
（Klenow）（以下Klenowで示す）断片およ
びdTTPおよびdATP処理を経て分離した。
フエノールおよびクロロホルム抽出のあとエ
タノール沈殿させたプラスミドをBamHIで
処理した。 ヒト生長ホルモン（HGH）遺伝子含有断
片は、PAGE、つづいて電気溶出により分離
した。生ずるDNA断片は、テトラサイクリ
ンプロモーター−オペレーターシステムを欠
如するが、テトラサイクリン抵抗性構造遺伝
子の最初の350個のヌクレオチドをも含有す
るので、引きつづき発現プラスミド中にクロ
ーン化したときに、その挿入物を含有するプ
ラスミドは、テトラサイクリン抵抗性の回復
により見定め得る。断片のEcoR末端は、
Klenowポリメラーゼ法でみたされてある
ので、この断片は、ひとつの平滑末端
（blunt end）およびひとつの粘着末端を有す
る。それで、あとから発現プラスミドに挿入
されても正しい配向が確実になる。 発現プラスミドpTrp14を、ついで、上記
調製にHGH遺伝子含有断片を受け入れるよ
うに調製した。すなわち、pTrp14をxba
消化し、生ずる粘着性末端を、dATP、
dTTP、dGTPおよびdCTPを用いる
Klenowポリメラーゼ法でみたした。フエ
ノールおよびクロロホルム抽出およびエタノ
ール沈殿のあと、生ずるDNAはBam HIで
処理し、生ずる大型プラスミド断片をPAGE
および電気溶出で分離した。pTrp14由来の
断片は１個の平滑末端および１個の粘着末端
を有し、前記したHGH遺伝子含有断片と正
しい配向で再結合することを可能とした。 HGH遺伝子断片とpTrp14△Xba−Bam
HI断片とは、上記と類似の条件で、合併し
相互に連結した。みたされたXbaおよび
EcoR末端は、平滑末端による連結で、
Xba部位およびEcoR部位の両方を再構
成した。 【表】 この構築はまたテトラサイクリン抵抗性遺伝
子をも創出する。プラスミドpHGH107は、
HGH遺伝子より上流に存在するプロモーター
（lacプロモーター）よりテトラサイクリン抵抗
性を発現するので、pHGH207と称するこの構
築は、トリプトフアンプロモーター−オペレー
ター調節下でのテトラサイクリン抵抗性遺伝子
の発現を可能とする。ついで、連結混合物でE.
coli294を転換し、5μｇ／mlのテトラサイクリ
ンを含有するLBプレート上でコロニーを選択
した。 プラスミドpHGH207はEcoR消化し、trp
プロモーター−オペレーターおよびtrpリーダ
ーリボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始の
ためのATG配列を欠如する300b.p.断片を、
PAGEそれにつづく電気溶出で採取した。この
DNA断片はpLeIF ＡのEcoR部位にクロー
ン化した。上記の変型trpレギユロン
（regulon）（発現レベルを高めるように調節す
るためにアテニユエータ配列を欠失させたE.
coli trpオペロン）を含有する発現プラスミド
は、プロモーター−オペレーターシステムを抑
制するに十分量のトリプトフアン添加倍地にあ
らかじめ定めたレベルまで発育させうる。つい
で、トリプトフアンを除去しシステムの抑制を
除けば、目的とする生成物が発現されうる。 より具体的に示すと、、第３図を参照にして、
250μｇのプラスミドpL.31をpstで消化し、
1000b.p.の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲ
ル上のゲル電気泳動で分離した。約40μｇの挿
入物をゲルより電気溶出し、３つに分けて、つ
ぎのようにさらに消化した。(a)この断片の16μ
ｇ試料を、37℃で45分間Bglの40単位で部分
的に消化し、反応混合物は６％ポリアクリルア
ミドゲル上で精製した。望む670b.p.の断片約
2μｇを採取した。(b)1000b.p.Pst挿入物の別
の試料（8μｇ）をAvaおよびBglで消化し
た。ゲル電気泳動のあとに、上記の150b.p.の
断片1μｇを得た。(c)1000b.p.片の16μｇを
Sau3aおよびAvaで処理した。10％ポリアク
リルアミドゲル上で電気泳動したあと、約
0.25μｇ（10pmole）の34b.p.断片を得た。２つ
の示したデオキシオリゴヌクレオチド、5′−
dAATTCATGTGT（断片１）および5′−
dGATCACATG（断片２）はホスホトリエス
テル法で合成した。断片２はつぎのようにリン
酸化した。200μl（約40pmole）の（γ ³²P）
ATP（アメルシヤム（Amersham）、5000Ci／
ｍmole）を乾燥し、60mMのTris−HCl（PH
８）、10mMのMgCl₂、15mMβ−メルカプトエ
タノールより成立つ、100pmoleのDNA断片お
よび２単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ含
有溶液30μlに再懸濁した。37℃で15分後、1μl
の10mMのATPを添加し、反応はさらに15分
進行させた。混合物はついで70℃で15分加熱
し、100pmoleの5′−OH断片１および10pmole
の34b.p.Sau 3a Ava断片と合併した。
20mM Tris−HCl（PH7.5）、10mM MgCl₂、
10mMジチオスレイトール、0.5mM ATPおよ
び10単位T4DNAリガーゼの50μl中で５時間４
℃で連結させた。混合物は６％ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動し、45b.p.生成物を電気
溶出で採取した。45b.p.生成物の30ng
（1pmole）を、150b.p.Ava−Bgl断片の
0.5μｇ（5pmole）および670b.p.Bgl−Pst
断片の1μｇ（2pmole）と合併した。20単位の
T4DNAリガーゼを用いて20℃で16時間連結処
理した。65℃で10分間加熱してリガーゼを不活
化した。混合物はEcoRおよびPstで消化し
て遺伝子の重合体を除去した。混合物は６％
PAGEで精製した。約20ng（0.04pmole）の
865b.p.生成物を分離した。これの半分（10ng）
を、pBR322（0.3μｇ）のEcoRおよびPst部
位のあいだに挿入した。E.coli294を形質転換
すると70個のテトラサイクリン抵抗性、アンピ
シリン感受性の転換株を与えた。これらのうち
の18個からプラスミドDNAを分離し、EcoR
およびPstで消化した。18個のプラスミドの
うち、16個が865b.p.長のEcoR−Pst断片
を有した。これらのうちのひとつpLeIF Alの
1μｇをEcoRで消化し、E.coli trpプロモー
ターおよびtrpリーダーリボゾーム結合部位を
有する、上記製造のような300b.p.EcoR断片
（0.1μｇ）に連結させた。trpプロモーターを含
有する転換物は、グランステイン−ホグネス
（Grunstein−Hogness）コロニースクリーニン
グ法と組合わせて、 ³²P−trpプローブを用い
て同定した。trp断片中の非対称的に位置して
いるXba部位は、trpプロモーターが、LeIF
Ａ遺伝子の方向に配向している、組換え生成物
の同定を可能とした。 Ｉ LeIF Ａのインビトロおよびインビボ活性 IF分析のための抽出物をつぎのように調製
した。培養物の１mlを5μｇ／mlのテトラサイ
クリンを含有するＬブロス中で発育させ、A₅₅₀
値を波長550nｍにおける吸光度を約1.0とし、
ついで、5μｇ／mlのテトラサイクリンを含有
するM9培地25ml中に希釈した。A₅₅₀が1.0に達
した時に10mlの試料を遠心採取し、細胞塊を、
15％スクロース、50mMTris−HCl（PH8.0）、
50mM EDTAの１ml中に懸濁させた。１mgの
リゾチームを添加し、０℃５分のあと、細胞は
超音波処理で破壊した。試料は10分間
（15000rpm）で遠心し、上清中のインタフエロ
ン活性を、細胞変性効果（CPE）の阻止分析
により、標準LeIFと比較して測定した。細胞
あたりのIF分子数を測定するためには、４×
10⁸単位／mgのLeIF比活性を用いた。 表６に示すように、trpプロモーターを望む
配向に挿入したクローンpLeIF Ａ trp25は高
い活性（2.5×10⁸単位／１）を示した。表７に
示すように、E.coli Ｋ−12株 294／pLeIF Ａ
trp25の生成するIFは、ヒトLeIF標品と同様
に挙動した。PH２での処理に対し安定で、ウサ
ギ抗ヒト白血球抗体により中和される。このイ
ンタフエロンの見かけの分子量は約20000であ
る。クローンpLeIf Ａ trp25はアメリカンタ
イプカルチヤーコレクシヨン（ATCC）に寄託
されている。 インタフエロンのインビボでの効果には、マ
クロフアージおよびナチユラルキラー（NK）
細胞が必要である。そしてインビボでの作用
は、これらの細胞の刺激を含むようにみえる。
それで、E.coli294／pLeIF A25により生産さ
れるインタフエロンは、細胞培養の分析では抗
ウイルス活性を有するが、感染動物では無効で
ある可能性がある。さらに、細菌より生産され
た、非グリコシレート化LeIF Ａのインビボ・
抗ウイルス作用は、ヒト“バフイーコート
（buffy coat）”白血球に由来するグリコシレー
ト化LeIFとは異なることがありうる。それで
細菌により合成されたLeIF Ａ（２％純度）の
生物活性を、スクイレルモンキー（リスザル）
への致死量の脳心筋炎ウイルス（EMC）感染
において、バフイーコートLeIF（８％純度）と
比較してみた（表８）。 【表】 【表】 ^*表６に記載のE.coli294／pLeIF Ａ trp25
の抽出物mlあたり250000単位を、最小必須培地
で500倍希釈し、500単位／mlの比活性とした。
白血球インタフエロン標準（ワドレイインスチ
チユート（Wadley Institute）〕あらかじめ
NIH白血球インタフエロン標準に対してタイ
ターを求めて、やはり500U／mlの最終濃度に
希釈した。１ml量を1NHClでPH２とし、４℃
で52時間インキユベートし、NaOHを添加中
和し、IF活性を標準CPE阻止分析で測定した。
500単位／ml試料（未処理）の25μ分を25μ
のウサギ抗−ヒト白血球インタフエロンと37℃
で60分インキユベートし、12000×ｇで５分遠
心し、上清を分析した。 【表】 サルはすべて雄（平均体重713ｇ）で、感染
前には、EMCウイルス抗体は有しない。サル
には、100×LD₅₀EMCウイルス（マウスで測
定）を筋肉内感染させた。対照感染サルは、感
染後134、158、164時間に死亡した。10⁶単位イ
ンタフエロン処理は、感染前４時間、感染後
２、23、29、48、72、168および240時間目に静
脈内投与した。細菌性白血球インタフエロン
は、E.coli294／pLeIF A25の融解物よりのカ
ラムクロマト分画で、比活性7.4×10⁶単位／mg
蛋白質であつた。対照細菌蛋白質は、E.
coli294／pBR322融解物よりの相当するカラム
分画で、２倍の全蛋白質量とした。白血球イン
タフエロン標準は、クロマトグラフイーで、32
×10⁶単位／mg蛋白質の比活性に精製した。正
常のヒト“バツフイーコート”細胞よりのセン
ダイ（Sendai）ウイルス誘導インタフエロン
であつた。 対照のサルは、序々に進行する昏睡、バラン
スの消失、後肢の弛緩、まひそして死亡前８時
間頃より開始する涙の流出を示した。インタフ
エロン処理サルは、これらの異常はまつたく示
さず、常時活動的で、ウイルス血症による症状
を示さなかつた。４日までウイルス血症を示さ
なかつた対照中の１頭のサルは、もつとも遅れ
て死んだ（感染164時間後）、しかし、死後、心
臓および脳に高タイターでウイルスを検出し
た。インタフエロン投与サルは、感染後14およ
び21日の検査でEMCウイルスに対する抗体を
生成しなかつた。これらの結果は、感染動物に
おけるLeIF調製物の抗ウイルス効果は、イン
タフエロンのみに帰せられうることを示す。理
由は、爽雑する蛋白質は、細菌とバツフイーコ
ート調製物ではまつたく異なるからである。さ
らに、これらの結果は、LeIF Ａのインビボ抗
ウイルス活性にグリコシル化が不要であること
を示す。 Ｊ その他の白血球インタフエロンに対する
cDNAの分離 完全に特徴づけられたLeIF Ａ cDNA含有
プラスミドよりのDNAをPstで切断し、電気
泳動により分離し、 32pでラベルした。生ず
る放射ラベルDNAをプローブに用い、上記の
グラステイン（Grunstein）およびホグネス
（Hogness）のインジトウ−コロニースクリー
ニング法により、上記Ｃ項におけると同様に得
られた、追加のE.coli294の転換株をスクリー
ニングした。種々の程度にプローブのハイブリ
ド化したコロニーを単離した。これらのコロニ
ーからのプラスミドDNAおよび上記Ｇ項に示
した10個のハイブリド化コロニーからのプラス
ミドDNAを、Pst切断により分離し、３つの
方法で特徴づけた。第１に、これらのPst断片
を、酵素Bg、PvuおよびEcoRIを用いる
制限エンドヌクレアーゼ消化パターンで特徴づ
けた。この分析は、第２図に示した、少なくと
も８種の異なる型（LeIF Ａ、LeIF Ｂ、LeIF
Ｃ、LeIF Ｄ、LeIF Ｅ、LeIF Ｆ、LeIF Ｇお
よびLeIF Ｈ）の分類を可能とした。これは、
これまでに知られているLeIF Ａの先行配列お
よびコード配列に関する、種々の制限切断点の
おおよその位置を示している。これらのうちの
ひとつLeIF Ｄは、ナガタ（Nagata）等がネ
ーチヤー（Nature）284、316−320（1980）に
報告したのと同じと信じられる。 第２に、それらDNAのいくつかについて、
ポリ−Ａ含有KG−１細胞RNAより、LeIF
mRNAを選択的に除去する能力について、ク
リーブランド（Cleveland）等がセル（Cell）
20、95−105（1980）に記載したハイブリツド化
選択分析により調べた。LeIF Ａ、Ｂ、Ｃおよ
びＦはこの分析で陽性であつた。第３に、これ
らのPst断片を発現プラスミドに挿入し、E.
coli294をそのプラスミドで形質転換し、断片
を発現させた。プレインタフエロンと信ぜられ
る発現生成物は、LeIF Ｆ断片がかろうじて陽
性以外は、インタフエロン活性に対するCPE
分析ですべて陽性であつた。上記に加えて、上
記のLeIF型のすべてについて配列を定めた。 Ｋ 第２の成熟白血球インタフエロン（LeIF
Ｂ）の直接発現 成熟LeIF Ｂに対する遺伝子を含有する分離
断片の配列は、型ＡおよびＢの最初の14個のヌ
クレオチドが同じであることを示す。それで、
trp−プロモーター−オペレーター、リボゾー
ム結合部位およびLeIF Ａ（＝Ｂ）遺伝子の第
１コドンを有する断片をpLeIF A25より分離
し、LeIF Ｂの発現プラスミドを構築するため
Ｂ配列の残りの部分と結合させた。この場合、
前記Ｂ配列の残りの部分はLeIF Ｂの第２のコ
ドンから始まる。pL4（第２図に示したLeIF Ｂ
Pst末端遺伝子を含有するプラスミド）のPst
断片およびpLeIF A25の１部に対する顕著な
制限地図を、第４図および第５図にそれぞれ示
す。 第４図の配列によりPst断片に対しておお
よそ950b.p.のSau ３ ａ−Pst断片をうるに
は、１個または１個より多くの介在するSau
３ ａ制限部位が存在するので、単にPstと
Sau3aとを用いて切断する方法は適用できずい
くつかの段階が必要である。つまり、つぎのよ
うになる。LeIF Ｂ発現ベクターおよびこれを
含む形質転換体の製造方法を以下に記載する。 １ つぎの断片を分離した。 (a) Sau ３ ａからEcoRIまでの110bb.p.： (b) EcoRからXbaまでの132b.p. ２ 断片（1a）および（1b）を連結させXba
およびBglで切断して、Sau ３ ａおよび
Xba末端を経由する自己重合を防いだ（関連
するSau ３ ａ部位はBgl部位内にあり；
Bgl切断はSau ３ ａ粘着性末端を残し
た）。242b.p.断片を分離した。 ３ (2)および（1c）の生成物を連結させ、ふた
たび自己重合を防ぐために、Pstおよび
Bglで切断した。Sau ３ ａからPstま
での（第４図）約9500b.p.断片を分離した。
この断片は、LeIF Ａに共通していない、
LeIF Ｂ遺伝子の部分を含有した。 ４ LeIF Ａのtrpプロモーター−オペレータ
ー、リボゾーム結合部位、ATG開始シグナ
ルおよびシステインコドンを含有する約
300b.p.断片（HindからSau ３ ａまで）
を、pLeIF25より分離した。 ５ PstからHindまでの約3600b.p.断片を
pBR322より分離した。レプリコンおよびテ
トラサイクリン抵抗性がコードされている
が、アンピシリン抵抗性は含有しない。 ６ 段階３、４および５で得られた断片をトリ
プル連結し、生ずるプラスミドでE.coli Ｋ
−12株294を転換した。 転換株はミニスクリーニング（バーンボイム
（Birnboim）等、ヌクレイツク アシド リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）７、1513−1523
〔1979〕）に処し、プラスミド試料はEcoRで
消化した。消化物は３個の断片を与えたが、そ
れらの特徴は、(1)EcoR−EcoRI trpプロモ
ーター断片；(2)pL4の内部EcoRI−EcoRI断
片；および(3)pL4の蛋白質翻訳開始シグナル−
EcoR断片。 ウイルスの細胞変性効果に基づく慣用の分析
方法であるCPE分析（The Interferon
System、Springer Verlag、Wien／Austria、
1979、pp17および18参照）で、上記のように
調製したクローンより細菌抽出物は、代表的に
は、A₅₅₀＝１で約10×10⁶単位／のインタフ
エロン活性を与えた。このように調製されたひ
とつの代表的なクローンは、E.coli294／pLeIF
Ｂ trp7である。このクローンはATCCに寄託
されている。 Ｌ さらに別の成熟白血球インタフエロン
（LeIF Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪ）の直接
発現 他のLeIFタイプを含有する追加の完全長遺
伝子断片は、LeIF Ａにおけると同様に、テイ
ラーし発現のための発現ビヒクル中におきう
る。成熟LeIF Ａの発現のための、上記Ｈ項に
記載のようなアプローチ、つまり、制限切断に
より先行配列を除去し、先行配列除去で失なわ
れたＮ−末端アミノ酸コドンを合成DNA断片
の連結でおき代えるという、便利な方法がとれ
るかどうかを決めうるよう、成熟インタフエロ
ンタイプの第１のアミノ酸コドンに十分に近く
制限部位が存在するかどうかは、従来による完
全な配列決定から分るであろう。それがうまく
いかなければ、つぎの操作を用いうる。要する
に、成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸に対す
るコドンの開始する点より正確に前のところで
先行配列含有断片を切断する。つまり １ その点をとりまく領域内において２重鎖
DNAを１重鎖DNAに変える： ２ 段階(1)で生成した１重鎖の領域に目的とす
る切断部位と結合するヌクレオチドと反対側
にプライマーの5′末端が位置するようにし
て、１重鎖DNAの相補的なプライマーをハ
イブリド化する。 ３ プライマーより3′の方向にある、段階１で
除かれた第２の鎖の部分を、アデニン、チミ
ン、グアニンおよびシトシン含有デオキシヌ
クレオチドトリホスフエートの存在での
DNAポリメラーゼを用いる反応で恢復させ
る。 ４ 切断しようとする点をこえて突出してい
る、残存する１重鎖DNAを消化する。 翻訳開始シグナルATGを、コード鎖の3′末
端に有する短鎖長合成DNAを、ついで、得ら
れた成熟インタフエロンのために仕立上げられ
た遺伝子に、たとえば平滑末端連結で連結し、
そしてこの遺伝子を発現プラスミドに挿入し、
プロモーターおよびそれに組合わされたリボゾ
ーム結合部位による調節下におく。 上記のＫ項で用いたのと同様にして、LeIF
ＣおよびLeIF Ｄをコードする遺伝子断片を、
直接的細菌による発現のために適当に配列し
た。これらの追加の白血球インタフエロンの発
現のための戦略として、それぞれの場合につい
て、pLeIF A25よりのLeIF Ａのtrpプロモー
ター−オペレーター、リボゾーム結合部位、
ATG開始シグナルおよびシステインコドンを
含有する、約300b.p.の断片（HindからSau
３ ａまで）を用いる。これに対して、すべて
に共通である最初のシステインより向うの、そ
れぞれのアミノ酸配列をコードするその他のイ
ンタフエロン遺伝子よりの遺伝子断片を結合す
る。得られたそれぞれのプラスミドを用いてE.
coli Ｋ−12株294を転換した。それぞれの遺伝
子を形成するための結合は次のようである。 LeIF Ｃ pLeIF Ｃより次の断片を分離する： (a) Sau ３ ａかSau 96までの35b.p. (b) Sau 96からPstIまでの＞900b.p. (c) 上記Ｋ(4)項におけるように、pLeIF Ａ
−25より約300b.p.の断片（Hind−Sau
３ ａ）を分離する。 (d) 上記Ｋ(5)項の約3600b.p.の断片を分離す
る。 構 築 (1)(a)および(c)を連結する。Bal、Hind
で切断し、約335b.p.の生成物を分離する。 (2)(1)＋(b)＋(d)とトリプル連結し、生ずるプ
ラスミドでE.coliを転換する。 このように調製された代表的なクローンは
E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ctrp 35であ
る。このクローンはATCCに寄託されてい
る。 LeIF Ｄ pLeIF Ｄよりつぎのように分離する： (a) Sau ３ ａからAvaまでの35b.p. (b) AvaよりBglまでの150b.p. (c) BglよりPstまで約700b.p.pLeIF
A25より、つぎの断片を分離する： (d) HindよりSau ３ ａまで300b.p.
pBR322よりつぎの断片を分離する： (e) HindよりPstまで約3600b.p. 構 築 (1)(a)＋(b)を連結し、Bglで切断し、185b.
p.生成物(1)を精製する。 (2)(1)＋(d)を連結し、Hind、Bglで切断
し、そして、約500b.p.生成物(2)を精製する。 (3)(2)＋(c)＋(e)を連結し、生ずるプラスミド
でE.coliを転換する。 このようして調製された代表的クローンは、
E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF Ｄ trp11であ
る。このクローンはATCCに寄託されている。 LeIF Ｆ LeIF Ｆを含有する断片は、LeIF Ｂおよ
びLeIF Ｆの１から13までのアミノ酸が完全
に相同であることを利用する再構成で直接的
に発現するよう仕立上げることができる。上
記のPHGH207より、PstおよびXba消化
を経由し、ついで約1050b.p.の断片を分離す
ることにより、適当な配列末端を有するTrp
プロモーター含有断片(a)をうる。第２の断片
(b)は、プラスミドpHKY10のPstおよび
Bgl消化より生ずる断片の大きい方として
うる。（このPst−Bgl断片はアンピシリ
ン抵抗性遺伝子の一部および組合されたプロ
モータ以外のテトラサイクリン抵抗性遺伝子
のすべてを含有している。従つて、プラスミ
ドpHKY10を用いなくても、その他の入手
可能なプラスミド、たとえば、プラスミド
pBR322（ATCC 31344）からもこの断片を
調製することができる。）断片(a)はアンピシ
リン抵抗性をコードする遺伝子の約半分を含
有し；断片(b)は、その遺伝子の残りを含有
し、また、組合わされたプロモーター以外の
テトラサイクリン抵抗性遺伝子のすべてを含
有する。断片(a)および(b)はT4リガーゼによ
り結合し、生成物を、XbaおよびBalで
処理して、二量化がおこらぬようにし、trp
プロモーター−オペレーターおよびテトラサ
イクリンおよびアンピシリン抵抗性の遺伝子
を含有する断片(c)とする。 約580b.p.の断片(d)はpLeIF ＦのAvaお
よびBglの消化で得られる。これは、LeIF
Ｆの14から166までのアミノ酸に対するコド
ンを含有する。 断片(e)（49b.p.）は、pLeIF ＢのXbaお
よびAva消化で得られる。断片(e)はLeIF
Ｆのアミノ酸１から13をコードする。 断片(c)、(d)および(e)は、T4リガーゼの存
在で、トリプル連結する。それぞれ断片の接
着末端は、複合プラスミドが正しく環状とな
り、テトラサイクリン抵抗性遺伝子が成熟
LeIF Ｆの遺伝子とあわせて、trpプロモー
ター−オペレーターの調節下に入るようにな
つており、それで、望むプラスミドで転換し
た細菌は、テトラサイクリン含有プレート上
で選択しうる。このように調整された代表的
クローンは、E.coli Ｋ−12 株294／pLeIF
Ｆ trp １である。このクローンはATCCに
寄託されている。 LeIF Ｈ 完全LeIF Ｈ遺伝子を、成熟白血球インタ
フエロンとして発現さすために、つぎのよう
に配列しうる。 １ プラスミドpLeIF ＨをHacおよびRsa
消化に処して、シグナルペプチドアミ
ノ酸10から3′非コード領域までに及ぶ
816b.p.断片を分離する。 ２ この断片を変性し、DNAポリメラーゼ
のKlenow断片（クレノー（Klenow）
等、プロク・ナトル．アカド．サイ．米国
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）65、168
〔1970〕）により、合成デオキシリボオリゴ
ヌクレオチドプライマー5′−dATG TGT
AAT CTG TCTを用いて修復合成に処
する。 ３ 得られた生成物をSau ３ ａで切断し、
１から150のアミノ酸を現わす452b.p.断片
を分離する。 ４ Sau ３ ａおよびPstでpLeIF Ｈを
消化し、得られた500b.p.断片を分離し、
150番目のアミノ酸からコード配列の最後
までをコードする遺伝子をうる。 ５ 段階(3)および(4)で分離した断片を連結し
て、断片 １ 166 met cys asp停止 ATG TGT…−−−…GAH TGA−…−
Pst Sau ３ ａ をうる。これはLeIF Ｈの166個のアミノ
酸をコードする。 ６ pLeIF Ａ trp25をXbaで消化し、
DNAポリメラーゼＩを用いて平滑末端と
し、生成物をPstで消化する。得られた
大型断片を分離し、段階(5)の生成物と連結
させて発現プラスミドとしうる。これは、
E.coli Ｋ−12 株294または他の宿主細菌
の転換に用いて、成熟LeIF Ｈを発現しう
る。 LeIF Ｉ ローン（Lawn）等により構成されたヒト
ゲノムの（フアージ）λ Charon 4A組換
えライブラリー（セル（Cell）、15、1157
（1978））を、上記引用のローン（Lawn）等
の方法およびマニアチス（Maniatis）等、
セル（Cell）15、687（1978）の方法により、
白血球インタフエロンに関してスクリーニン
グした。cDNAクローンLeIF Ａに由来する
放射性LeIFプローブを用いて、約500000個
のプラークをスクリーニングした。６個の
LeIFゲノムクローンを選び出した。再スク
リーニングおよびクラーク精製につづいて、
これらのクローンのうちのひとつλHLeIF2
を選びさらに分析した。 上記の方法を用いて、他のプローブも、ヒ
トゲノムからその他のLeIFクローンを分離
するのに有利に用いうる。ついで、これら
は、本発明によるその他の白血球インタフエ
ロン蛋白質を製造するのに用いうる。 １ クローンλHLeIF2の2000b.p.EcoR断
片を、EcoR部位において、pBR325中
へ、サブクローン化した。得られたプラス
ミドLeIF ＩをEcoRで切断し、2000b.p.
断片を分離した。この2000b.p.EcoR断
片にデオキシオリゴヌクレオチド
dAATTCTGCAG（EcoR−PstIコンバ
ーター）を連結した。得られた生成物を
Pstで切断し、Pst未満を有する2000b.
p.断片とした。これをSau 96で切断した。
ひとつのPstおよびひとつのSau 96末端
を有する1100b.p.断片を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｃ trp35をPstお
よびXbaで消化した。大型断片を分離し
た。 ３ pLeIF Ｃ trp 35よりの小型Xba−
Pst断片をXbaおよびSau 96で消化し
た。40b.p.Xba−Sau 96断片を分離し
た。 ４ 段階(1)、(2)および(3)より分離した断片を
連結して、pLeIF Itrp1発現プラスミドと
した。このクローンはATCCに寄託されて
いる。 LeIF Ｊ １ プラスミドpLeIF Ｊは、LeIF Ｊ遺伝
子配列を含有するヒトゲノムDNAの3.8キ
ロベースHind断片を含有する。このプ
ラスミドから760b.p.Dde −Rsa断片
を分離した。 ２ プラスミドpLeIF Ｂ trp ７をHind
およびDdeで切断し、340b.p.Hind−
Dde断片を分離した。 ３ プラスミドpBR322をPst で切断し、
DNAポリメラーゼとインキユベートし、
平滑末端とし、（Klenow断片）、ついで
Hindで消化した。大型（約3600b.p.）断
片を分離した。 ４ 段階(1)、(2)および(3)で分離した断片を連
結して、発現プラスミドpLeIF Ｊ Trp1
とした。このクローンはATCCに寄託され
ている。 Ｍ 精 製 細菌抽出物中の白血球インタフエロン含有量
は、つぎのようにして、増加させうる。 １ ポリエチレン−イミン沈殿。ここで、イン
タフエロンを含めた細胞蛋白質の大部分は上
清に留まる。 ２ 硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフ
エロンは、55％飽和硫酸アンモニウムの溶液
中から析出する。 ３ 硫酸アンモニウムペレツトを0.06Mリン酸
カリウム、10mM Tris−HCl、PH7.2に懸濁
させ、25mM Tris−HCl、PH7.9に対して透
析する。インタフエロン活性は溶液中に残
る。 ４ 上記の上清をPH8.5を調整してDEAE−セ
ルロースカラムでクロマトグラフイーを行う
（25mM Tris−HCl、PH8.5中０から0.2M
NaClの直線勾配で溶出）。 ５ チバクロム−ブルー−アガロース
（Cibachrome Bule−Agarose）またはヒド
ロキシルアパタイト（hydroxylapatite）に
吸着させ、1.5MKClまたは0.2Mリン酸塩で
溶出する（必要により実施）。 ６ セフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−75カ
ラムで分子をサイズ分けする。 ７ PH5.0の25mM酢酸アンモニウム中CM−セ
ルローズ上陽イオン交換クロマトグラフイー
を行う。酢酸アンモニウム勾配（0.2M酢酸
アンモニウムまで）で展開する。 上記の方法で＞95％純度の生成物を得る。 この物質はまた、サイズ排斥クロマトグラフ
イー、逆相（RP−８）高圧液体クロマトグラ
フイー、または固定化抗インタフエロン抗体上
のアフイニテイクロマトグラフイーで精製しう
る。 別法として、上記の段階４よりの物質をミル
ステイン（Milstein）、サイエンテイフイツク
アメリカン（Scientific American）243、66
（1980）記載のように調整したモノクロナル抗
体カラムに加え、0.2M酢酸、0.1％トリトン
（Triton）および0.15MNaClで溶出しうる。 別様の有利な具体例として、上記操作で製造
した白血球インタフエロンをつぎの段階で精製
しうる。 １ 発現された白血球インタフエロンを含有す
る凍結細胞塊を、手作業または適当な粉砕装
置で砕く。部分的にとけた細胞を、PH7.5−
8.0に調整した0.1M Tris、10％（Ｗ／Ｖ）
スクロース、0.2MNaCl、5mM EDTA、
0.1mM PESFおよび10−100mM MgCl₂含
有緩衝液Ａの４容量中に懸濁させる。懸濁液
は約４℃に保つ。 懸濁液は、約6000psiでホモジナイザーを
通し、ついで、1000psi以下で２番目を通す。
両方の通過よりのホモジナイザーからの流出
液は、氷浴中で冷却する。 ２ ホモジネートにポリエチレン−イミンをゆ
つくりと添加して、約0.35％濃度とし、約30
分放置する。固型物は遠心または濾過で除去
する。この段階は、温度を調節するかまた
は、上清（濾液）を10℃より低く保つように
十分にすみやかに実施する。上清（濾液）を
限外濾過で濃縮しても、もとの容量の約1/10
とする。粒状物またはにごりを認めたら、ミ
クロポアメンブレンのような適当なフイルタ
ーで除去しうる。 ３ 澄明化溶液は、５−８cm／時間（たとえ
ば、直径2.6cmのカラムで、25−40ml／時間）
でモノクロナル抗体カラムに直接流す。つい
でこのカラムを約10カラム容量の210mM
Tris−HCl、PH7.5−8.5（NaCl（0.5M）およ
びトリトン（Triton）Ｘ−100（0.2％）また
は同等の表面活性剤含有）で洗う。洗つたあ
と、このカラムに0.15MNaClおよびトリト
ン（Triton）Ｘ−100（0.1％）または同等の
表面活性剤を含有する約10カラム容量の溶液
を通す。このカラムをトリトン（Triton）
Ｘ−100（0.1％）または同等の表面活性剤を
含有する0.2M酢酸て溶出する。モノクロナ
ル抗体カラムよりの蛋白質ピーク（UV吸収
またはその他の方法で測定）を集め、1N
NaOHまたは1.0M Tris塩基でPHを約4.5に
調整する。 ４ プールされたインタフエロンピークを、適
当な緩衝液たとえば酢酸アンモニウムPH4.5
（50mM）で平衡させたホワツトマン
（Whatman）CM52セルロースまたは同等の
陽イオン交換体に加える。加えたあと、カラ
ムを平衡のための緩衝液で洗い、流出液の
UV吸収がたいらとなるに至らせ、カラムか
らはほとんど蛋白質が溶出しない状態とす
る。 カラムをついで、25mM酢酸アンモニウ
ム／0.12M塩化ナトリウムまたはインタフエ
ロンの回収を最高とする組合わせで溶出し、
満足な外観および溶解性を有する凍結乾燥ケ
ーキとする。 上記したこの有利な具体例におけるモノク
ロナル抗体は、スト−ヘリン（Staehelin）
等がプロク．ナトル．アカド．サイ．米国
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）78、1848−52
（1981）に記載した方法で調製しうる。モノ
クロナル抗体は、下記するように、精製し、
アフイゲル（Affigel）−10に共有結合させ
る。 腹水液よりのモノクロナル抗体の調製および精製 雌Balb／ｃマウス５頭のそれぞれに、対数増
殖期の中間でとつたハイブリドーマ
（hybridoma）細胞の５−10×10⁶個を接触した。
マウスの生成する腹水液から得た約５×10⁶個の
生育しうる細胞を、10または10頭より多くのマウ
スのそれそれに腹腔内接種した。この腹水液を各
マウスより反復（２から４回）採取した。ひとつ
の群のマウスからつぎの群のマウスに、３回ま
で、移しかえおよび採取を行なつた。それぞれの
移しかえ毎に、採取復水液をプールした。 低速遠心（500−1000×ｇ）で15分間処理し、
腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで
18000rpmで90分遠心した。上清を凍結させマイ
ナス20℃に貯蔵した。融解させてから、
35000rpmで90分間遠心し、さらにフイブリンお
よび粒状物を除いた。各移しかえごとの腹水液の
バツチについて、固体相抗体結合試験（ストーヘ
リン（Staehelin）等、上記引用文献）により特
異抗体活性を試験し、満足ならばプールした。 プールされた溶液中の蛋白質濃度は、１mgの蛋
白質が1.0cmの厚さのキユベツトで280nｍで1.2の
吸光値を示すという近似法で測定した。高濃度の
抗体を有する腹水液は30−35mg蛋白質／mlを含有
する。これは、４−７mg特異抗体／mlに相当す
る。この液体をPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、
PH7.3、0.15M NaCl）で希釈し、10から12mg／ml
の蛋白質濃度とした。希釈溶液の各100mlに、室
温で飽和した硫酸アンモニウム溶液90mlを、０℃
ではげしくかくはんしながら添加した。懸濁液を
40から60分間永中に保つた。ついで、４℃で、
10000rpmで15分遠心した。上清をけいしやして
除き、十分に液を切つた。蛋白質塊を0.02M
Tris HCl（PH7.9）／0.04M NaCl（緩衝液）に
溶解した。蛋白質溶液を、100容量の緩衝液に
対して、室温で16から18時間透析した。その間、
少なくとも１度緩衝液を交換した。透析溶液を
15000rpmで10分間遠心し、不溶物を除いた。腹
水中の全蛋白質の最初の量の約30から35％が、
280nｍの吸光値より概算して採取された。 次いで、１mlについて30−40mgの蛋白質を含有
する溶液をバツフアー（Buffer）で平衡させ
たDEAE−セルロースカラムに加えた。添加する
蛋白質１グラムについて少なくとも100mlのカラ
ム床容量とした。0.02M Tris HClPH7.9中NaCl
を0.04Mから0.5MNaCl濃度に直線状にNaCl濃度
を変化させて、カラムより抗体を溶出した。0.06
から0.1M NaClのピーク分画をプールし、等容
量の硫酸アンモニウム飽和溶液（室温）を加え沈
殿遠心し、濃縮した。蛋白質塊を0.2M NaHCO₃
（PH約8.0）／0.3M NaCl（緩衝液）に溶解し、
室温で、同じ緩衝液（３度交換）に対して透析し
た。透析した溶液を20000×ｇで15分遠心し、不
溶物を除いた。蛋白質濃度を緩衝液で０から25
mg／mlとした。 免疫吸着剤の調製 アフイゲル（Affigel）−10（バイオラドラボラ
トリイス、リツチモンド カリホルニア（Bio
Rad Laboratories、Richmond、California）を
グラスフイルター上で氷冷イソプロパノールで３
度洗い、ついで氷冷蒸留水で３度洗つた。ゲルス
ラリー（冷水中約50％）をプラスチツクチユーブ
に移し、短時間遠心して沈降させた。上清をアス
ピレーターで除き、パツクされたゲルを等容量の
精製抗体溶液と混合し、４℃で５時間、長軸が円
状に廻転するように回転した。反応後、ゲルを遠
心し、緩衝液（0.1M NaHCO₃／0.15M
NaCl）で２度洗い、非結合抗体を除いた。洗液
を合併し蛋白質を測定すると、90％以上の抗体が
ゲルに結合していた。 未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量の
0.1Mエタノールアミン・HCl（PH８）と混合し、
長軸を円こ状に回転させて室温で60分処理した。
ゲルスラリーよりPBSで洗浄して反応剤を除き、
４℃で0.02％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムの存
在でPBSに貯蔵した。 Ｎ 非経口投与 LeIFは、抗腫瘍または抗ウイルス治療を要
する患者に非経口投与しうる。また、免疫抑制
状態を示す患者にも投与しうる。投与量および
投与割合は、ヒト由来の物質について現在臨床
的に行なわれているのと同様にする。たとえ
ば、約（１−10）×10⁶単位／日で１％より大の
純度の場合には、たとえば５×10⁷単位／日に
及びうる。 非経口投与用の形態とした本質的に均一な細
菌性LeIFの適当な投与形態では、たとえば、
２×10⁸単位／mgの比活性のLeIF3mgを25mlの
5Nヒト血清アルブミンに溶解し、この溶液を
生物学的フイルターを通し、濾過溶液に無菌的
に100本のびんに分けて、非経口投与に適当な
ように、１本が６×10⁶単位純インタフエロン
を含有するようにする。これらのびんは、使用
前は冷所（−20℃）に保つのが望ましい。 本発明の化合物は、医薬として有用な組成物
を調製するための既知の方法に従つて製剤化で
きる。その際、このポリペプチドは、医薬とし
て許容されうる担体ビヒクルと混合する。適当
なビヒクルおよびそれらの製剤化については、
マーチン（E.W.Martin）によるレミントンズ
フアーマセウチカル サイエンス
（Remington′s Pharmaceutical Sciences）に
記載されているとおりである。これを、本明細
書の参考文献として引用する。これらの組成物
では、インタフエロン蛋白質の有効量として適
当な量のビヒクルとをあわせて、宿主に対して
効果的な投与とするに適当な、医薬として許容
されうる組成物とする。ひとつの有利な投与形
態は非経口投与である。

【図面の簡単な説明】

第１図は可能性のあるLeIFプラスミドと 32p
ラベル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリド化を示すオートラジオグラムである。第２
図は、LeIFクローン化 cDNAの８個の型（Ａ
からＨまで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。第３図は、成熟LeIF Ａの直接的微生物合成
をコードする遺伝子の構築を示す。第４図および
第５図はLeIF Ｂ成熟白血球インターフエロンを
発現するために用いられる２つの遺伝子断片の制
限地図を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト白血球由来の遺伝子の発現により得るこ
   とができる成熟ヒト白血球インタフエロンであつ
   て、165−166個のアミノ酸を有し、部分アミノ酸
   配列Cys−Ala−Trp−Glu−Val−Val−Arg−
   Ala−Glu−Ile−Met−Arg−Serを含み、かつ
   114位にアミノ酸Asp、GluまたはValの一つを有
   し、このインタフエロンの第一番目のアミノ酸の
   Ｎ末端にメチオニンが結合している場合は、166
   −167個のアミノ酸を有し、かつ115位にアミノ酸
   Asp、GluまたはValの一つを有する成熟ヒト白
   血球インタフエロン、をコードする配列からなる
   DNA配列を含有することを特徴とする複製しう
   る発現ビヒクル。 ２ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＡ（LeIF Ａ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ３ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＢ（LeIF Ｂ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ４ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＣ（LeIF Ｃ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ５ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＤ（LeIF Ｄ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ６ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＦ（LeIF Ｆ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ７ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＨ（LeIF Ｈ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 ８ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＩ（IeIF Ｉ）である特許請求
   の範囲第１項の発現ビヒクル。 ９ 成熟ヒト白血球インタフエロンが成熟ヒト白
   血球インタフエロンＪ（LeIF Ｊ）である特許請
   求の範囲第１項の発現ビヒクル。 １０ 発現ビヒクルがプラスミドである、特許請
   求の範囲第１項〜第９項のいずれか一つの発現ビ
   ヒクル。 １１ プラスミドpLeIF Ａ trp 25、pLeIF Ｂ
   trp ７、およびpLeIF Ｆ trp １より成立つ
   群から選択した特許請求の範囲第１０項の発現ビ
   ヒクル。 １２ プラスミドpLeIF Ｃ trp 35およびpLeIF
   Ｄ trp 11より成立つ群から選択した特許請求の
   範囲第１０項の発現ビヒクル。 １３ プラスミドpLeIF Ｈである特許請求の範
   囲第１０項の発現ビヒクル。 １４ プラスミドpLeIF Ｉ trp １およびpLeIF
   Ｊ trp １より成立つ群から選択した特許請求の
   範囲第１０項の発現ビヒクル。 １５ ヒト白血球由来の遺伝子の発現により得る
   ことができる成熟ヒト白血球インタフエロンであ
   つて、165−166個のアミノ酸を有し、部分アミノ
   酸配列Cys−Ala−Trp−Glu−Val−Val−Arg
   −Ala−Glu−Ile−Met−Arg−Serを含み、かつ
   114位にアミノ酸Asp、GluまたはValの一つを有
   し、このインタフエロンの第一番目のアミノ酸の
   Ｎ末端にメチオニンが結合している場合は、166
   −167個のアミノ酸を有し、かつ115位にアミノ酸
   Asp、GluまたはValの一つを有する成熟ヒト白
   血球インタフエロン、をコードする配列からなる
   DNA配列を含有することを特徴とする複製しう
   る発現ビヒクルで形質転換した大腸菌。 １６ 大腸菌がE.coli Ｋ−12株294である特許請
   求の範囲第１５項の大腸菌。