JP2557053B2 - 腫瘍壊死因子の精製、製造および使用法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術的分野 本発明は、腫瘍壊死因子（TNF）をコードする組換DNA
分子並びに形質転換細胞に対する向上した細胞毒性もし
くは細胞静止活性を有する化合物に関するものである。
さらに詳細には本発明は、腫瘍壊死因子様のポリペプチ
ドを高収率で原核宿主内で産生する方法に関するもので
ある。特に、本発明は、発現制御配列T4もしくはpL−T4
のいずれかに結合したTNF様ポリペプチドをコードするD
NA配列からなる組換DNA分子によって形質転換された原
核宿主によって産生されるこれらペプチドの製造に関す
る。

技術的背景 TNFは大食細胞および単核食細胞によって産生され
る。これはインビトロにおける広範囲の動物およびヒト
癌細胞に対し細胞毒性もしくは細胞静止活性を示し、か
つインビボにおける或る種の動物腫瘍および異種移植ヒ
ト腫瘍にて溶血壊死を誘発する〔K.ハラナカおよびN.サ
トミ、「インビトロにおけるヒト癌細胞に対する腫瘍壊
死因子（TNF）の細胞毒性活性」、ジャパン・ジャーナ
ル・エキスペリメンタル・メソッド、第51巻、第191〜1
94頁（1981）;L.オールド、「カンサー・イミュノロジ
ー：特異性の検討−G.H.A.クロウス・メモリアル・レク
チャー」、カンサー・リサーチ、第41巻、第361〜375頁
（1981）〕。

TNF活性を示す化合物は、バチルス−カルメッテーゲ
ラン（BCG）もしくはコリネバクテリウムが感染しかつ
大腸菌のリポ多糖類（LPS）で処理されたネズミおよび
ウサギの血清から得られている〔E.A.カルスウエル等、
「腫瘍の壊死を生ずるエンドトキシン誘発される血清因
子」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第3666−3670頁（1975）〕。
さらに、これらはBCGを接種したネズミの大食細胞リッ
チな腹腔滲出細胞の培養培地からも得られており、さら
にインビトロにて大食細胞増殖因子を発生させかつLPS
で刺戟した予備処理ネズミの大食細胞様の腫瘍細胞（PU
5−1,8）および腹腔大食細胞からも得られている〔D.マ
ネル、R.ムーアおよびS,メンゲルハーゲン、「殺腫瘍活
性（腫瘍壊死因子）の源泉としての大食細胞」、インフ
ェクション・イミュノロジー、第30巻、第523−530頁
（1980）〕。

さらに、大食細胞の先駆体であるヒト単核細胞をたと
えば健康なヒト供与体の血液から分離してリンホキンお
よび／またはLPSで刺戟すると、これら単核細胞はネズ
ミの標的細胞およびヒト形質転換細胞に対し細胞毒性も
しくは細胞静止作用を有する化学物質を産生する〔N.マ
チュース、「ヒト単核細胞による抗腫瘍細胞毒素の産
生：エンドトキシンとインタフェロンと誘発剤としての
他の薬剤との比較」、ブリティッシュ・ジャーナル・カ
ンサー、第45巻、第615−617頁（1982）;J・ハンマスト
ローム、「ヒト単核細胞から遊離される可溶性の細胞静
止因子:I、産生並びに正常および形質転換されたヒト標
的細胞に対する作用」、スカンジナビア・ジャーナル・
イミュノロジー、第15巻、第311−318頁（1982）〕。し
たがって、TNFは単核細胞由来の細胞によって産生され
るので（適当な処理の後）、この物質はしばしば「単核
細胞サイトトキシン」と呼ばれる〔D.S.ストン−ウルフ
等、「ヒトγ−インタフェロンとリンホトキシンおよび
ヒトサイトトキシンとの相互関係」、ジャーナル・エキ
スペリメンタル・メソッズ、第159巻、第820−843頁（1
984）〕。

正常なヒトの血清から得られるα_１−α_２グロブリン
のフラクションも、ネズミにおける腫瘍に対し毒性であ
りかつインビトロにおけるヒト結腸癌、黒色腫および細
胞芽細胞腫の細胞ラインの増殖を阻止することが示され
ている〔米国特許第4,309,418号;S.グリーン等、「カン
サー・レタース」、第６巻、第235−第240頁（1976）；
ジャーナル・セル・バイオロジー、第79巻、第67頁（19
78）〕。

しかしながら、現在、動物およびヒトのTNFは極めて
少量しか生産されていない。動物TNFの生産方法は、予
備処理した多数のネズミもしくはウサギを殺してその血
清を精製することによりTNFを回収するか、或いはその
大食細胞を集め、インビトロで細胞を刺激し、産生した
TNFを上澄液から回収しかつ精製することからなってい
る。ヒト供与体から細胞を回収してインビトロで培養し
て、TNFを産生させ、かつヒト供与体からの血清のα−
グロブリンフラクションを精製して抗腫瘍剤を回収する
ことも大規模には役立たない。さらに、これらの方法は
全て時間がかかり、高価につきかつ極めて低収量のTNF
しか生成しない。

発明の開示 本発明は、抗癌剤および抗腫瘍組成物，方法および治
療に使用するのに充分な純度のTNF様化合物およびTNFを
工業的に著量で製造する方法を提供することにより、上
記問題を解決する。したがって、本発明は、抗癌剤およ
び抗腫瘍剤並びにその方法に使用するため従来得られな
かったような量および方法でTNFまたはTNF様ポリペプチ
ドの製造を可能にする。

本発明の他の目的は、TNF様ポリペプチドをコードす
るDNA配列の位置決定および同定、T4およびpL−T4より
なる群から選択される発現制御配列に結合したこれらDN
A配列による各種の宿主の形質転換、並びにこれら形質
転換宿主におけるTNFもしくはTNF様ポリペプチドの産生
を包含する。本発明により産生されるTNF様ポリペプチ
ドおよびTNFとしては、たとえばウサギ，ネズミおよび
ヒトTNFのような哺乳動物のTNFが挙げられる。

本願はまた、天然源からのTNFの精製について開示す
る。原TNFが精製された後、そのアミノ酸配列を決定し
て、DNA試料をそのアミノ酸配列に基づき合成すること
ができる。次いで、これらのDNA試料を各種の天然およ
び合成源からのDNA配列の回収物をスクリーニングし
て、TNF関連DNA配列を選択し、次いで本発明の方法によ
りTNFおよびTNF様化合物を発現させることができる。

この精製したTNFも本発明の他の面、すなわち天然も
しくは組換TNFとたとえばアクチノマイシンＤのような
抗生物質との組合せ物を使用することによる腫瘍細胞の
増殖阻止もしくは死滅の向上にも有用である。本発明の
方法によれば、腫瘍を有する哺乳動物を医薬上有効量の
TNFとアクチノマイシンＤとで処理して腫瘍細胞に対す
るTNFの作用を高める。

以下の開示から明らかとなるように、T4またはpL−T4
のいずれかの発現制御配列に結合したDNA配列からなる
本発明の組換DNA分子は、適当な宿主においてTNFもしく
はTNF様ポリペプチドの産生を指示することができる。
適当な宿主におけるこれら組換DNA分子の複製も、これ
らポリペプチドをコードする遺伝子を多量に生産するこ
とを可能にする。これらポリペプチドおよび遺伝子の分
子構造および性質をかくして容易に決定することができ
る。これらポリペプチドおよび遺伝子は、適当な宿主で
産生されたままで或いは適当に誘導化もしくは改変した
後、これら生産物自身の産生を検出しかつ向上させる組
成物および方法に使用することができ、さらに抗癌，抗
腫瘍および抗マラリヤ組成物および治療方法に使用する
ことができる。

以下の記載から明らかとなるように、本発明の基本的
局面は、TNFもしくはTNF様ポリペプチドをコードし或い
は少なくともこの種のDNA配列を発現制御配列に結合さ
れたDNA配列の回収物から選択することを可能にする、D
NA配列からなる組換DNA分子を提供することである。こ
れらDNA配列は、 （ａ） ｐ−mTNF−３のDNA挿入物； （ｂ） ｐ−hTNF−１のDNA挿入物； （ｃ） これらDNA挿入物（ａ）および（ｂ）のいずれ
か一方または両方にハイブリッド化しかつ発現に際しTN
Fの生物学的活性を示すポリペプチドをコードするDNA配
列；並びに （ｄ） 前記DNA挿入物および配列のいずれかと縮重関
係にあるDNA配列よりなる群から選択される。

本発明によれば、DNA配列はT4もしくはpL−T4発現制
御系に作用結合される。

本発明の組換DNA分子はさらに、これで形質転換され
た適当な宿主においてTNFもしくはTNF様ポリペプチドを
高収量で産生しうることを特徴とする。

図面の簡単な説明 第１図はヒト（Ａ）およびネズミ（Ｂ）mRNA調製物の
２種の代表的な蔗糖濃度勾配のOD−経過を示す特性曲線
図であり、第１の濃度勾配においては750μｇのヒトポ
リA⁺mRNAを充填しかつ第２の濃度勾配においては200μ
ｇのネズミポリA⁺RNAを充填し、アフリカ産カエル（Xen
opus laevis）卵母細胞における各フラクションの生物
学的活性を分析し、 第２図は誘発したウサギ血清からのTNF様ポリペプチ
ドの精製についての工程略図であり、 第３図は本発明の精製方法の１例による誘発ウサギ血
清から精製されたウサギTNFのSDS−PAGE（12％）分析を
示し、 第４図および第５図は精製されたウサギTNFの２つの
部分、すなわちTNF断片３および４のアミノ酸配列を示
し、さらに 第４図および第５図はこれらアミノ酸配列部分をコー
ドする各種のヌクレオチド配列並びにこれらDNA配列か
ら合成された各種のDNA試料のヌクレオチド配列を示
し、 第６図はネズミTNF RNAの一般式構造並びにクローン
ｐ−mTNF−１、ｐ−mTNF−２およびｐ−mTNF−３のcDNA
の位置を示し、さらに第６図はこれら３種のクローンの
部分制限マップを示し、また第６図は各種のDNA保存物
を後にハイブリッド化スクリーニングするために使用し
たｐ−mTNF−１の２種の内部Rsa IおよびPvu II制限断
片を示し、 第７図はネズミTNF cDNAのヌクレオチド配列および
これから誘導されたアミノ酸配列を示し、 第８図はヒトTNF RNAの一般的構造およびクローンｐ
−hTNF−１のcDNAの位置を示し、さらに第８図はこのク
ローンの部分制限マップを示し、 第９図はｐ−hTNF−１のcDNA挿入物のヌクレオチド配
列およびこれから誘導されたアミノ酸配列を示し、 第10図は誘発Ｕ−937ヒト細胞の培地から得られたTNF
様ポリペプチドの精製についての略図であり、 第11図は精製されたヒトTNF試料のアミノ酸配列決定
で決定されたＮ−末端アミノ酸配列を示し、 第12図は発現に際しヒトTNFをコードするDNA配列を特
徴とする他の組換発現ベクターの作成方法の他の例を示
し略図であり、 第13図はヒトTNFを発現に際しコードするDNA配列を特
徴とする組換発現ベクター153−PL−T4−hTNF−CA3（1
3）を示し、 第14図はヒトTNFを発現に際しコードするDNA配列を特
徴とする組換発現ベクター153−T4−hTNF−CA5−T4ter
を示し、 第15図は（Ａ）プラスミドp236およびpTAK21△〔K.ゴ
ルスキー等、セル（1985）（印刷中）〕からのプラスミ
ドpL−pTak−21△−CLA⁺の作成；（Ｂ）hTNF（Ｇ）ｎ誘
導体の作成、並びに（Ｃ）T4−terおよび△PL誘導体の
作成を示し、 第16図はDAR I AATTC Eco RI部位からT4−ter hTN
F遺伝子の末端に意味するEco RI部位に到るプラスミド1
53−T4−hTNF−CA5−T4−terのDNA配列および誘導アミ
ノ酸配列を示し、 第17図はPst I部位からEco RI部位に到るプラスミド1
53−pL−−T4−CA3−cts−T4−terのDNA配列および誘導
アミノ酸配列を示し、 第18〜19図はアクチノマイシンＤとTNFとの組合せの
腫瘍増殖に対する作用を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明を充分理解しうるよう以下詳細に説明する。

説明において次の用語を使用する： ヌクレオチド：糖部分（ペントース）と燐酸と窒素含有
複素環式塩基とよりなるDNAもしくはRNAのモノマー単
位。この塩基はグリコシル炭素（ペントースの１′炭
素）を介して糖部分に結合される。塩素と糖との組合せ
をヌクレオシドと呼ぶ。各ヌクレオチドはその塩基を特
徴とする。４種のDNA塩基はアデニン（「Ａ」）、グア
ニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）およびチミン
（「Ｔ」）である。４種のRNAはA,G,Cおよびウラシル
（「Ｕ」）である。

DNA配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素と
の間のホスホジエステル結合により互いに連結されたヌ
クレオチドの線状配管である。

コドン:mRNAを介しアミノ酸，翻訳開始信号または翻訳
停止信号をコードする３種のヌクレオチド（トリプレッ
ト）のDNA配列である。

遺伝子：メッセンジャーRNA（「mRNA」）の雛型を介し
特定ポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードす
るDNA配列である。

転写：遺伝子からmRNAを産生する過程である。

翻訳:mRNAからポリペプチドを産生する過程である。

発現:DNA配列もしくは遺伝子の作用を受けてポリペプチ
ドを産生する過程であり、これは転写と翻訳との組合せ
である。

プラスミド：完全「レプリコン」からなる非染色体二重
鎖DNA配列であって、このプラスミドは宿主細胞内で複
製される。プラスミドが単細胞生物内に存在すると、こ
の生物の特徴はプラスミドのDNAの結果として変化し或
いは形質転換される。たとえば、テトラサイクリン耐性
（Tet^R）に対する遺伝子を有するプラスミドは、テトラ
サイクリンに対し感受性であった細胞をこれに耐性の細
胞に形質転換させる。プラスミドにより形質転換された
細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

ファージもしくはバクテリオファージ：細菌性ウイルス
であって、その多くは蛋白エンベロプもしくはコート中
にカプセル化されたDNA配列よりなっている（「カプシ
ド」）。

クローン化ベヒクル：宿主細胞内で複製することがで
き、たとえば複製コート蛋白の産生のようなDNAの本質
的な生物学的機能の喪失或いはプロモータもしくは結合
部位の喪失を伴うことなくDNA配列を決定可能に切断し
うる１個または少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を特
徴とし、かつたとえばテトラサイクリン耐性もしくはア
ンピシリン耐性などの形質転換細胞の同定に使用するの
に適した標識を有するプラスミド，ファージDNAまたは
その他のDNA配列であり、クローン化ビークルはしばし
ばベクターと呼ばれる。

クローン化：無性増殖によって１種の生物もしくは配列
から誘導される生物もしくはDNA配列の集団を得る過程
である。

組換DNA分子すなわちハイブリッドDNA:互いに末端結合
して或る種の宿主細胞に感染しかつそこに維持される能
力を有する種々異なるゲノムからのDNA断片よりなる分
子である。

発現制御配列：遺伝子に作用結合された際にこれら遺伝
子の発現を制御するヌクレオチドの配列である。これら
はlac系,trp系,tac系,trc系，ファージλの主オペレー
タおよびプロモータ領域,fdコート蛋白の制御領域,SV40
の初期おび後期プロモータ，ポリオーマから誘導された
プロモータ，アデノウイルスおよび猿ウイルス,3−ホス
ホグリセレートキナーゼもしくはその他の糖分解酵素の
プロモータ，酵母酸ホスファターゼのプロモータ、たと
えばPho5,酵母α−結合ファクタのプロモータ、並びに
原核もしくは真核細胞およびそのウイルスの遺伝子の発
現を制御することが知られたその他の配列、或いはその
組合せを包含する。

リンホキン：刺戟したリンパ球を特定抗原と接触させた
際、これらリンパ球により放出される可溶性の液素性媒
体である。リンホキンは、たとえばインタフェロンおよ
び大食細胞活性化因子を包含する。

TNF（腫瘍壊死因子）:TNFは増殖阻止もしくは細胞毒性
リンホキンである。本明細書に使用する場合、「TNF」
は天然もしくは組換TNFまたはその誘導体である全ての
蛋白，ポリペプチドおよびペプチドを包含し、これらは
殺腫瘍活性或いはこれらTNFによる腫瘍生長の阻止を特
徴とする。これらは各種の源泉から得れるTNF様化合
物、たとえば天然TNF,組換TNFおよび合成もしくは半合
成TNFを包含する。

TNF様ポリペプチド:TNFの生物学的活性を示すポリペプ
チドである。これはたとえばウサギ，ネズミおよびヒト
TNFのような哺乳動物TNF並びにTNF様ポリペプチドを包
含する。

腫瘍：本明細書に使用する「腫瘍」という用語は全ゆる
望ましくない細胞の増殖を包含する。この種の増殖は悪
性および非悪性の固形もしくは液状腫瘍，カルシノー
マ，黒色腫，肉腫，白血腫，リンパ腫並びにその他の発
癌性，ネオプラスト性もしくは腫瘍発生性の病気を包含
する。

アクチノマイシン：アクチノマイシンは１種の抗生物質
であって、RNAポリメラーゼの機能を阻止することによ
りDNA転写を阻害すると思われる。本明細書に使用する
「アクチノマイシン」という用語は、一般にアクチノマ
イシンとして知られた種類の関連する抗生物質並びにそ
の誘導体を全て包含する。この用語は、たとえばアクチ
ノマイシンＤを包含する。

LPS:イー・コリの細胞壁から得られるリポ多糖類よりな
る内生毒素である（0.55:B5）（ミシガン州、デトロイ
ト所在のディフコ社）。

BCG:バチルス・カルメット−ゲラン（パッスール・イン
スチチュート、ブラッセル）。

本発明は、原核宿主におけるTNF様ポリペプチドの高
収量の発現に関するものである。しかしながら、本願は
さらに、TNF様ポリペプチドを含有する組成物を陰イオ
ン交換体と接触させ、交換体に結合しない状態で残存す
る組成物の成分を除去し、かつTNF様ポリペプチドを交
換体から溶出させることを特徴とする精製方法をも開示
する。

概要において、TNF様ポリペプチドは、TNFの産生を誘
発するよう特異的に処理した動物（好ましくはウサギ）
の血清を集め、この血清中の活性成分を塩基（好ましく
は硫酸アンモニウム）によってたとえば約60％飽和まで
沈澱させ、中性乃至弱塩基性緩衝液（好ましくはトリス
−HCl）中にペレットを再懸濁し、イオン交換カラムク
ロマトグラフィー（好ましくはDEAE−セファセル）を用
いかつ塩濃度勾配を用いて蛋白を分画し、TNF活性を有
する集めたフラクションを好ましくはアミコンTCF−２
装置で濃縮し、この濃縮物をゲル濾過クロマトグラフカ
ラム（好ましくはAcA34）にて分子量により分画し、TNF
活性を有するフラクションを集めてこれらを好ましくは
モノＱカラム（ファルマシア社）に先ず弱塩基性pHでか
つ次いで弱酸性pHでイオン交換クロマトグラフィーにか
けるという諸工程により精製することができる。勿論、
この精製法（特に陰イオン交換体の使用）を用いてTNF
様ポリペプチドを広範な種類の天然源並びにこれらポリ
ペプチドをコードするDNA配列で形質転換された各種の
原核宿主から精製しうることを了解すべきである。

上記工程で得られた精製TNFのアミノ酸配列を次いで
決定することができる。これらの得られたアミノ酸配列
を本発明の各種の方法で使用することができる。これら
を使用して、本発明のTNF様ポリペプチドおよびTNFをコ
ードするDNA配列の存在下に天然および合成哺乳動物DNA
の各種の保存物をスクリーニングするのに有用な一連の
DNA試料を作成することができる。たとえば、ウサギTNF
のアミノ酸配列から得られたDNA配列を使用して、ウサ
ギもしくはその他の哺乳動物のTNF様ポリペプチドをコ
ードする他のDNA配列につきDNA保存物をスクリーニング
することができる。さらに、このように選択されたDNA
配列、より好ましくはウサギもしくはネズミDNA配列を
使用して、ヒトTNF様ポリペプチドをコードするDNA配列
につきスクリーニングすることもできる。何故なら、ウ
サギとネズミとヒトのTNF間には同属性が予想されるか
らである。

本発明の組換DNA分子を使用して、これらにより形質
転換された各種の原核宿主にてTNF様ポリペプチドを発
現させる。これらのTNF様ポリペプチドは、抗癌および
抗腫瘍用途および治療に使用することができる。概要に
おいて、本発明のこの具体例は、所望のTNF様ポリペプ
チドをコードするDNA配列を持った組換DNA分子により形
質転換された適当な宿主を培養することからなり、前記
配列は組換DNA分子における発現制御配列T4または発現
制御配列pL−T4のいずれかに作用結合している。ここで
もウサギTNFまたはその他の哺乳動物TNFとヒトTNFとの
間には類似性が予想されるので、ヒトの癌，腫瘍および
マラリヤ感染の治療に対し、これらは全て有用である。

さらに、天然もしくは組換原料から得られた精製TNF
を、たとえばTNFとアクチノマイシンＤとの組合せより
なる本発明の組合せ物に使用することができる。より詳
細には、、これらを医薬上有効量のアクチノマイシンＤ
と組合せて医薬上有効量にて使用することにより、腫瘍
を処置することができる。

慣用の腫瘍処置は、たとえば化学療法および照射線の
ような非外科的治療並びに外科治療を包含する。典型的
には、これらの治療は各種の好ましくない副作用を伴
う。免疫抑制作用を伴う非外科的治療は、二次的感染に
対する患者の感受性を増大させうる。形質転換した細胞
を剔出する外科治療は侵食過程を伴う危険を有し、かつ
全形質転換細胞を効果的に除去しまたは排除することが
できない。癌および非悪性腫瘍に対する他の処置方法
は、腫瘍特異性抗原に対するモノクローナル抗体を形質
転換細胞の表面に使用することを含む。典型的にはネズ
ミのモノクローナル抗体を含むこの種の治療の効果は、
しばしばさらにネズミ抗体を投与して得られる効果を阻
害するような反抗体反応を含む各種のファクタにより制
限される〔G.E.グッドマン等、「進行黒色腫を有する患
者におけるネズミモノクローナル抗体のパイロット試
験」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー、
第３巻、第340−351頁（1985）〕。モノクローナル抗体
の治療に関する他の報告された副作用は過敏症，発熱お
よび悪寒を伴う。

この腫の治療の欠点に鑑み、腫瘍発生細胞に対する人
体の免疫反応を人体の腫々のリンホキンレベルを増大さ
せて開始させるため、各種の治療法が開発されている。
たとえば、TNFのみが腫瘍細胞の増殖を阻止し或いは死
滅させることが知られている。さらに、ヒトリンホトキ
シンおよびヒトγ−インタフェロンの組合せは腫瘍増殖
を阻止することが報告されている〔ヨーロッパ特許出願
第128,009号〕。TNFとヒトインタフェロンとの組合せ
は、さらにそれらの個々の効果の合計よりも大きいヒト
腫瘍に対する増殖抑制もしくは細胞毒性作用を示すこと
が報告されている〔L.フランセン等、「組換腫瘍壊死因
子：各種の正常および形質転換ヒトおよびネズミ細胞ラ
インに対するその作用並びにインタフェロン−γとの相
乗作用」、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・カンサー
・アンド・クリニカル・オンコロジー（印刷中）；ヨー
ロッパ特許出願第131,789号〕。さらに、アクチノマイ
シンＤとTNFとの組合せは、インビトロにおける腫瘍細
胞増殖の抑制を示すことが報告されている〔J.M.オスト
ロンおよびG.E.ギフォード、「ウサギ腫瘍壊死因子（40
449）によるＬ−929細胞のDNA合成の刺戟」、Proc.Soc.
Exp.Biol.Med、第160巻、第354−358頁（1978）;M.R.ル
フおよびG.E.ギフォード「ウサギ腫瘍壊死因子：作用メ
カニズム」、インフェクション・アンド・イミュニテ
ィ」、第31巻、第380−385頁（1985）〕。

以下、本発明の組換DNA分子により産生されるTNF様ポ
リペプチドの製造につき説明する。先ず最初に本発明の
方法により精製されたウサギTNFの部分アミノ酸断片に
基づいて作成された一連の合成DNA断片からなるDNA試料
を用いて、TNF関連DNA配列を選別した。TNFおよびTNF様
ポリペプチドをコードする本発明のDNA配列を位置決定
しかつ同定するには、各種のクローン化および選択技術
を理論的に使用しうることを了解すべきである。次い
で、選別したDNA配列自身を試料として使用することに
より、TNF様ポリペプチドをコードする他のウサギおよ
び哺乳動物DNA配列を選択すると共に、これらによりコ
ードされるTNF様ポリペプチドを産生させるべく適当な
原核宿主を形質転換させた。さらに、ウサギDNA試料に
より選別されたDNA配列自身を使用して、哺乳動物TNFお
よびTNF様ポリペプチドをコードするDNAを選別し、かつ
これらDNA配列を使用して適当な原核宿主においてポリ
ペプチドを産生させた。

本発明のDNA配列は、各種の宿主／ベクター組合せで
使用して発現させることができる。たとえば、有用なベ
クターは染色体，非染色体および合成のDNA配列、たと
えば各種の公知細菌性プラスミド、たとえばcolE1,pCR
1,pBR322,pMB9およびその誘導体を含むイー・コリから
のプラスミドの各種の公知誘導体、広範囲の宿主プラス
ミド、たとえばRP4,ファージDNA、たとえばファージλ
の多数の誘導体、たとえばNM989およびその他のDNAファ
ージ、たとえばM13並びにフィラメント状一本鎖DNAファ
ージ、並びにプラスミドとファージDNAとの組合せから
得られるたとえばファージDNAもしくはその他の誘導体
を使用すべく改変させたプラスミドで構成することがで
きる。

本発明のDNA分子は、pL−T4およびT4よりなる群から
選択される特定の発現制御配列を包含する。T4発現制御
配列のみが本発明の組換DNA分子において特に有用であ
ることが判明した。たとえば、TNF様ポリペプチドの特
に有効な発現は、発現系の一部としてプロモータとリボ
ソーム結合部位との両者を含むバクテリオファージT4か
ら得られたDNA配列からなるプラスミドを使用して得る
ことができる。この配列は、ファージT4蛋白32（gp32）
遺伝子の欠失誘導体である〔H.M.クリシおよびB.アレッ
ト、「バクテリオファージT4遺伝子32に含まれるヌクレ
オチド配列：翻訳自己制御」、プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミー・サイエンス、第79巻、第4937−49
41頁（1982）〕。

本発明に使用するT4 DNA配列の断片が有効である少
なくとも１つの理由は、この断片内に３個もしくは４個
の連続断片が存在し、そのそれぞれが順次にプロモータ
ーとして機能することができ（すなわちmRNAの転写を開
始させ）、かつこれらのプロモータが数種のRNAポリメ
ラーゼ分子を封鎖して単一のプロモータよりも多いmRNA
を開始させるからであると思われる。さらに、T4 DNA
配列で開始するmRNAはイー・コリにおいて異常に安定で
あることが判明した〔K.ゴルスキー等、セル（1985）
（印刷中）〕。

本発明は次の発現制御配列からなる組換DNA分子に関
する： 〔ここでＸは存在しない（この場合最後の５個の塩基は
ATATGによって示すことができ）か、またはＸは１〜15
個の塩基の群である〕。好ましくはＸはCGATACT,CGCGAT
ACT,ATACTAAA,ATACT,CGCGATACTAAAおよびCGATACTAAAよ
りなる群から選択される。

Ｘが存在しない発現制御配列は次のように示すことも
できる： 好適発現制御配列はさらに次のように示すこともでき
る： この発現制御配列に対する適当な改変を行なって、配
列を発現系の１部として使用する際にずっと高レベルの
蛋白発現を得ることができる。この配列は、たとえば
（１）部位特異性の突然変異〔B.A.オーストラ等、ネイ
チャー、第304巻、第456−459頁（1983）〕；（２）Cla
I部位における部位操作〔たとえばヌクレオチドを充填
するためのクレノー断片の使用、またはヌクレオチドを
欠失させるためのS1/Bal切断〕；および（３）合成オリ
ゴヌクレオシド断片の挿入などの方法によって改変する
ことができる。特に、Cla I部位或いは断片ATXATGを改
変しうることが判明した。この種の改変配列並びに同様
に改変した配列を組換DNA分子におけるこの配列，宿主
および本発明の方法の代りに使用することができ、かつ
これら全ては本発明の範囲内に入ると思われる。同様
に、この配列を改変させるため上記技術は、この配列の
特定配列を異なる配列に変換するために使用することも
できる。また、当業者は、Ｘの規定内における塩基の異
なる組合せを選択して特定位置における発現レベルを最
適化させ、或いは本発明の組換DNA分子に対し他の所望
の性質を付与することもできる。

pL−T4の使用は、TNF様ポリペプチドの高度の発現を
もたらす。P_Lプロモータからなる組換DNA分子を使用し
て、有利にλリプレッサを有する宿主を形質転換させる
ことができる。本発明の１具体例において、上記発現制
御配列はP_Lプロモータの下流に挿入される〔H.ベルナー
ド等、ジーン、第５巻、第59−76頁（1979）並びにヨー
ロッパ特許出願第81,301413.1号、公告公報第0041767
号〕。

本発明の組換DNA分子はpL−T4およびT4よりなる群か
ら選択される発現制御配列を包含する。これらの配列と
組合せて他の発現制御配列をも使用することができる。
しかしながら、それらはTNF様ポリペプチドの高発現と
いう結果をもたらさないかも知れない。この種の発現制
御配列の例はlac系,trp系,tac系,trc系，ファージλの
主オペレータおよびプロモータ領域,fdコート蛋白の制
御領域，酵母の糖分解プロモータ、たとえば３−ホスホ
グリセレートキナーゼのプロモータ、酵母酸ホスファタ
ーゼのプロモータ（たとえばPho5）並びに酵母α−関連
ファクタ並びに原核細胞およびそのウイルスの遺伝子の
発現を制御することが知られた他の配列のプロモータ或
いはその組合せである。

有用な発現宿主は、T4およびpL−T4が作用する周知の
原核宿主、たとえばイー・コリの菌株、たとえばイー・
コリHB101,イー・コリX1776,イー・コリX2282,イー・コ
リDHI（λ）およびイー・コリMRC1並びシュードモナ
ス，バチルスたとえばバチルス・ズブチリスおよびスト
レプトミセスの菌株を包含する。本発明によるTNFの発
現には、イー・コリ菌株W3110が特に有用であることが
判明した。

勿論、全ての宿主／発現ベクター組合せが本発明のDN
A配列の発現或いは本発明のTNF様ポリペプチドの産生に
際し同等な効率をもって機能するとは限らない。しかし
ながら、宿主／発現ベクター組合せの特定の選択は、本
発明の範囲を逸脱することなく本明細書中に示した原理
を考慮した後に当業者が容易になしうることができる。
たとえば、選択は多数のファクタのバランスに基づくべ
きである。たとえば、これらは宿主とベクターとの適合
性、DNA配列によりコードされた蛋白の宿主に対す毒
性、所望蛋白の回収の容易性、DNA配列およびこれに作
用結合された発現制御配列の発現特性、生物安全性、コ
ストおよび重なり、形態或いは所望蛋白の必要な他の発
現後の改変などを包含する。

さらに、それぞれ特定の発現ベクター内において、本
発明のTNF関連DNA配列を挿入するための各種の部位を選
択することができる。これらの部位は、一般にこれら部
位を切断する制限エンドヌクレアーゼによって命名され
る。これらは当業者により充分確認されている。勿論、
本発明に有用な発現ベクターは、選択DNA断片を挿入す
るための制限エンドヌクレアーゼを必要としないことを
了解すべきである。寧ろ、このベクターは他の手段によ
って断片に結合することができる。発現ベクター、およ
び特に選択DNA断片を挿入するよう選択した部位および
発現制御配列に対するその作用結合は、たとえば特定制
御酵素に感受性の部位の個数、発現すべき蛋白の大き
さ、宿主細胞酵素による蛋白分解に対する所望蛋白の感
受性，精製の際に除去するのが困難な宿主細胞蛋白によ
る発現蛋白の汚染または結合、たとえばベクター配列に
対する開始および停止コドンの位置のような発現特性、
並びに当業者に認識された他の多くのファクタによって
決定される。ベクターおよびDNA配列用の挿入部位の選
択はこれらファクタのバランスによって決定され、必ず
しも全ての選択がそれぞれの場合に同等に有効であると
は限らない。

本発明のDNA配列により形質転換された原核宿主を発
酵させて産生させるTNFおよびTNF様ポリペプチド、並び
に本発明の方法により産生されかつ精製されたTNF様ポ
リペプチドは、抗癌および抗腫瘍処理および治療のため
の各種の組成物および方法に有用である。これらはさら
に抗マラリヤ治療および方法にも有用である。

これらのポリペプチド或いは恐らくこれらからまたは
そのアミノ酸配列を用いて誘導されまたは合成されるペ
プチド或いはそれらの塩類またはその医薬上許容しうる
誘導体の投与は抗癌，抗腫瘍もしくは抗マラリヤ活性を
示す薬剤の投与につき従来認められている任意の方式に
よって行なうことができる。これらは経口，非経口，皮
下，静脈内，病巣内もしくは局部投与を包含する。局
部，病巣内もしくは静脈内注射が好適である。

これらの治療に使用する組成物も各種の形態とするこ
とができる。これらはたとえば固体，半固体および液体
の投与形態、たとえばタブレット，ピル，粉末，溶液も
しくは懸濁液，座薬，注射溶液および潅流溶液を包含す
る。好適形態は、目的とする投与方式および治療用途に
依存する。さらに、これら組成物は好ましくは慣用の医
薬上許容しうるキャリヤを包含し、他の医薬品，キャリ
ヤ，アジュバンド，賦形薬など、たとえばヒト血清アル
ブミンまたは血漿製剤を包含する。好ましくは、本発明
の組成物は単位投与の形態であって、一般に１日１回も
しくはそれ以上の回数で投与する。１回で或いは処置の
期間にわたって投与する活性化合物の量は処置する患
者，病状および腫瘍もしくは癌またはマラリヤ感染の経
過，投与方式および形態，並びに医者の判断に依存す
る。しかしながら、有効投与量は約0.005〜約5mg/kg/
日、好ましくは約0.05〜約0.5mg/kg/日の範囲とするこ
とができ、それより少量および多量の投与も有用である
ことが認められる。

したがって、本発明の方法によって製造されたTNF様
ポリペプチドは、腫瘍学的に有効量の本発明の方法によ
って製造された化合物或いはその医薬的に許容しうる塩
もしくは誘導体を投与することから成る、ヒトを含むほ
乳類における癌もしくは腫瘍の治療において使用するこ
ともできる。勿論、本発明の方法によって製造される組
成物を他の癌もしくは腫瘍治療と組合せて、たとえばIF
N−α,IFN−βおよびIFN−γのようなインタフェロンと
一緒に或いは哺乳動物における癌および腫瘍を治療する
ための化学療法と一緒に使用することができる。

哺乳動物を、医薬的に有効量の本発明の方法によって
製造されたTNF様ポリペプチドと抗生物質とを組み合わ
せて、腫瘍増殖を抑制もしくは阻止し、そして好ましく
は腫瘍細胞を死滅させるのに充分な期間にわたって治療
することができる。哺乳動物は、好ましくはTNFとアク
チノマイシンＤとの組合せからなる組成物で処置する。
代案として、これら２種の成分で順次に処置することも
できる。しかしながら、選択する処置の特定順序は重要
でないと思われる。より詳細には、哺乳動物を皮下，静
脈内，筋肉内もしくは病巣内注射により患者１人当り毎
日約10μｇ〜100mgのTNFで処置することができる。しか
しながら、この投与量は認められた医療基準にしたがっ
て医者により患者の身体状態および許容レベルに応じて
調節すべきである。さらにTNFで処置する前または同時
に或いはその後に医薬上有効量の抗生物質で処置するこ
ともできる〔A.グッドマン等、「治療の薬理基準」、第
1290−1291頁（1980）〕。アクチノマイシンＤは、腫瘍
中へ病巣内注射として投与すべきである。

さらに本発明の方法により製造されたTNF様化合物は
抗マラリヤ剤としても有用である。たとえば、ヒトマラ
リヤ寄生虫、すなわちプラスモジウム・ファルシパルム
（Plasmodium falciparum）は、TNFに感受性であること
が知られている〔プレイフェア等、イミュノロジー・ツ
デイ、第５巻、第165−166頁（1984）〕。

本発明をよりよく理解しうるよう以下実施例を示す。
これらの実施例は例示の目的であって、特定具体例のみ
に本発明を限定するものと解釈すべきでない。

実施例1:TNF様化合物のインビボ誘発および分析 動物においてTNF産生を誘発することが知られた多く
の方法がある。たとえばBCG,コリネバクテリヤおよびチ
モサン（酵母サッカロミセス・セレビシーの細胞壁か
ら）のような物質を動物に感染させると、インビボにて
細網内皮系（RES）の多量増殖を誘発する。次いで、細
菌の細胞壁から生じた内生毒素（たとえばイー・コリか
らのLPS）を使用して、活性化大食細胞によりTNFの放出
を開始させることができる。

本発明の方法におけるその後の使用のためTNF様ポリ
ペプチドの産生を誘発させるべく、ウサギを使用するよ
う選択した。しかしながら、たとえばネズミ，ラッテ，
イヌ，サル，牛などの他の各種の動物を選択することが
できるであろう。代案として、確定した細胞ライン（ヒ
ト，ネズミなど）を使用することもできる（上記）。ウ
サギを使用する好適具体例において、これらウサギに４
×10⁷の生存BCG生物の接種物を静脈内に注入した。RES
系の最大刺戟と内生毒素の最大感作とを与えることが知
られているためBCGを使用した〔E.A.カルスウエル等、
「腫瘍の壊死を生ぜしめる内生毒素誘発の血清ファク
タ」、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス・USA、第72巻、第3666頁（1975）〕。RESが充
分に刺戟された約14日後、各ウサギに100μｇのLPSを静
脈内注入して、TNFの産生を開始させた。２時間後に動
物を出血させて、処理動物の血清を集めた。

TNF分析用に適当な標的細胞を選択するため、インビ
トロで誘発したヒトTNFおよびインビボで誘発したウサ
ギTNFの細胞毒性作用につき各種のヒト細胞ラインの感
受性を検査した。第Ｉ表に要約したように、試験した全
てのヒト形質転換細胞ラインは、試験した形質転換して
ないヒト細胞ラインよりもTNF活性に対しより感受性で
あった。さらに、37℃にて全ての試験した形質転換して
ない細胞ライン（182PE,E15M,WISH,HEK）のヒトTNFに対
する感受性は、37℃にてＬ−929細胞の感受性より10％
低くかった。さらに、正常な繊維芽細胞ラインと融合し
たヘラ細胞から生ずるハイブリッドの１つの対応対
（Ａ）（tu^-およびtu⁺）は、壊死因子に対する感受性に
相関した腫瘍発生性を示したことは興味がある。しかし
ながら、この種のハイブリッドの第２の対（Ｂ）には差
が見られなかった。さらに、試験したヒト細胞はウサギ
TNFに対するよりもヒトTNFに対し感受性が大であるた
め、TNFの作用において種類特異性の程度が存在すると
思われる。

Ｌ−929細胞はTNF活性の証明となる壊死因子に対し最
高の特異的腫瘍関連感受性の１種を示したので、これら
の細胞を本発明の分析用として選択した。分析のため、
実質的にラック等により記載された方法を用いた〔リン
ホキン・レポート、第II巻、（1980）〕。

先ず最初に、TNFを含有すると推定されたフラクショ
ンの一連の希釈物を作成し、これらにＬ−929細胞（細
胞50,000個／穴部）とアクチノマイシンＤとを最終濃度
１μg/mlまで加えた。この混合物を37℃または39.5℃に
て18時間培養した（高い方の温度にてＬ−929標的細胞
は、低い方の温度におけるよりも2.5〜3.0倍感受性が大
であった）。培養期間の後、細胞を染色しかつ計数し
た。代案として、染色細胞を33％HOAcに溶解し、かつ遊
離した染料をコントロン型分光光度計（577nm）を用い
て測定した。

この分析において、1ml当りのTNF単位（Ｕ）は、アク
チノマイシンＤの存在下で行なった死滅分析において18
時間以内に細胞生存率を50％低下させるのに必要とする
TNFの希釈率の逆数を示す。

実施例2:確立した細胞ラインにおけるTNFまたはTNF様活
性の誘発 TNFもしくはTNF様活性は、インビトロにおいて確立細
胞ラインで誘発させることもできる。たとえばヒトTNF
を誘発させるため、ヒト単核Ｕ−937細胞ラインを選択
した〔ヒト組織球のリンパ腫、C.サンドソトロームおよ
びK.ニルソン、インターナショナル・ジャーナル・カン
サー、第17巻、第565−577頁（1976）〕。しかしなが
ら、たとえば胎盤からの他のヒト前単核細胞ライン（た
とえば、HL−60,M1−１）、ヒト単核細胞ライン（たと
えばTPH−1,J−111）またはヒト大食細胞をも使用し
て、ヒトTNF様ポリペプチドを誘発させることができ
た。勿論、ヒトTNFのこれらの各インビトロ原料は、TNF
またはTNF様化合物の最適産生には多かれ少なかれ特異
的誘発手段を必要とすることを了解すべきである。

ヒトTNFを誘発させるために、５％の失活してない予
備選択した胎児牛血清のバッチ（FCS、ギブコ社、スコ
ットランド、ペイスリー在）および５％の馬血清（ギブ
コ社）を添加したRPMI−1640培地にて転動瓶中でＵ−93
7細胞ラインを増殖させた。細胞が1.5×10⁶個/mlの密度
に達した際、これらを32nmのTPA（シグマ社、セントル
イス、USA）にてRPMI−1640、0.1U/mlの牛結晶インシュ
リン（BDH社、プール、英国）、50nMのレチノール酸
（カルビオケム社、フランクフルト、西ドイツ国）、１
％の巨大腫瘍細胞（GTC）−状態調節培地（ギブコ
社）、0.5mg/mlのサイトデックス３（ファルマシア社、
ウプサラ、スエーデン国）で１×10⁶個/mlの細胞の密度
にて回転フラスコ中で24時間誘発させた。

ネズミTNFを誘発させるためには、ネズミ腫瘍大食細
胞ラインPU.5.1.8を選択した〔カンサー・リサーチ、第
37巻、第546−550頁（1977）〕。しかしながら、たとえ
ばＪ−774、RAW309およびWR19Mのような他のネズミ大食
細胞ラインも選択しうるであろう。PU.5.1.8細胞ライン
を誘発させて、メネル等により実質的に記載されたよう
にTNFを産生させた〔インフェクション・アンド・イミ
ュノロジー、第30巻、第523−530頁（1980）〕。概要に
おいて、これら細胞を10％FCS（309ギブコ 011−630
9）を加えたRPMI−1640培地中で転動瓶にて増殖させ
た。次いで、これらの細胞を、RPMI−1640における５μ
ｇのLPS/mlにより転動瓶中で3.5×10⁶の濃度にて４時間
誘発させた。

インビトロで誘発した細胞（ネズミもしくはヒト）を
遠心距離によって集め、これらをTNFもしくはTNF様ポリ
ペプチドをコードする遺伝情報を有するmRNA源として使
用した。さらに、これらをネズミもしくはヒトTNF自身
の原料として使用した。

実施例3:TNF活性をコードする遺伝情報を有するmRNAの
作成 上記で作成したインビトロ誘発のＵ−937（ヒト）ま
たはPU5.1.8（ネズミ）をTNF特異性mRNAの原料として使
用した。細胞をノニデットＰ−40中で溶解させ、次いで
溶解物をフェノール化することにより、前記細胞から全
細胞質RNAを抽出した。次いで、オリゴdT−セルロース
クロマトグラフィーによって溶解物からポリアデニル化
RNA（ポリA⁺RNA）を単離した（３型、共同研究）。さら
に、ベックマンSWA41型ロータを用い４℃、40Kかつ19時
間で15％凍結−解凍蔗糖濃度勾配（５％〜20％の蔗糖勾
配に相当する）にてポリA⁺RNAを分画した。

アフリカ産カエルの卵母細胞中へ所定量を微小注入す
ることにより各フラクションの生物学的活性を分析した
（卵母細胞１個当り50pgのmRNA;1試料当り15個の卵母細
胞）。次いで、これら注入した卵母細胞を卵母細胞の浸
漬培地（0.1％のポリエチレングリコール6000と0.4％の
アプロチニン（シグマ社）と1mMのCuSO₄とを含有する）
中で24時間培養し、前記のインビトロ分析系を用い39.5
℃にてＬ−929細胞につき培地中でTNF活性を分析した。
これらの分析において、ヒトおよびネズミTNF関連RNAに
つきそれぞれ約16Sおよび17Sで沈降したmRNAに対応する
フラクションにおいて再現性のあるTNF生物学的活性を
観察した。第１図は、それぞれヒトおよびネズミmRNA調
製物の２種の代表的蔗糖勾配のOD−経過を示している。

実施例4:ネズミおよびヒトcDNA保存物の作成 ウイケンス等により「リゾチーム，オボムコイドおよ
びオバルブミンmRNAに相補的な二重鎖DNAの合成」、ジ
ャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第253巻、
第2483−2495頁（1978）〕に実質的に記載されたよう
に、卵母細胞中への注入後に最大TNF生物学活性を示し
たポリA⁺RNAのフラクション±８μｇを使用して、ヒト
およびネズミのcDNA保存物を作成した。勿論、これらの
クローン化したcDNA保存物は、他のヒトもしくは動物源
から或いは全細胞RNAから上記の事前の濃縮または寸法
選択なしにポリA⁺RNAから作成しうることも了解されよ
う。

たとえば、ランド等、「真核mRNAの５−末端配列は高
効率にてクローン化することができる」、ヌクレイック
・アッシド・リサーチ、第９巻、第2251−2266頁（198
1）；オカヤマおよびベルグ、「全長cDNAの高効率のク
ローン化」、モレキュラー・アンド・セル・バイオロジ
ー、第２巻、第161−170頁（1982）；またはマニアチス
等、「モレキュラ・クローニング」、（コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー出版、ニューヨー
ク）、第229−第246頁（1982）に記載されたような他の
慣用の方法も使用しうるであろうが、ここではcDNAクロ
ーン化につき次の方法を選択した。

（ａ） 第１ストランドの合成 第1cDNAストランドを合成するため、±80μｇのポリ⁺
RNA/mlと50mMのトリス−CHl（pH8.3）と50mMのKCLと10m
MのMgCl₂と10mMのDTTと0.5mMの各dNTPとを使用し、1/10
00dCTPの代りにα³²P−dCTPを±600Ci/ミリモル（アメ
ルシャム社、バッキンガムシャー、英国）を使用し、さ
らにｐ（dT）₁₀を60μg/ml（ファルマシア−PLバイオケ
ミカルス社、ウプサラ、スエーデン国）にて使用し、ま
た750単位/mlのヒト胎盤RNAアーゼ阻止剤（アメルシャ
ム社）と1000単位/mlのAMV逆転写酵素（アングリアン・
バイオテクノロジー社、コルチェスター、英国）を使用
した。

反応のため、100μの全量と41℃と１時間とを用い
た。次いで、反応混合物をフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（25/24/1）の混合物で２回かつ
ジエチルエーテルで２回抽出し、１容量の4M NH₄OAcと
４容量のエタノールとを添加してDNAを沈澱させた。こ
の沈澱を２回反復した。必要に応じ、さらに反応混合物
へ酵母tRNAをキャリヤとしてエタノールの添加前に加え
た。

（ｂ） RNA雛型の除去および第２ストランドの合成 沈澱したDNAを60μの15mM燐酸カルシウム（pH6.9）
および0.25mMのEPTAに再溶解させ、２μｇのRNAアーゼ
Ａ（ベーリンガー・マンハイム社、西ドイツ国）と250
単位のRNAアーゼT1（BRL社、ノイーアイゼンブルグ、西
ドイツ国）とを加え、この混合物を37℃にて30分間静置
した。

次いで、この混合物を沸とう水浴中で２分間加熱し、
次いで直ちに氷上で急冷した。次いで、燐酸カリウム緩
衝剤（pH6.9）（最終濃度100mMまで）とMgCl₂（最終濃
度10mMまで）とDTT（最終濃度10mMまで）とdNTP（最終
濃度1mMまで）と330U/mlのイー・コリDNAポリメラーゼ
Ｉ（エンドヌクレアーゼを含有しない）（ベーリンガー
・マンハイム社、西ドイツ国）とを加えた。この第２ス
トランドの合成は15℃にて全容積300μにて６時間行
なった。次いで、最終濃度25mMまでEDTAを添加して（pH
8）反応を停止させ、上記と同様に混合物を抽出しかつ
沈澱させた。

ペレットを50mMのトリス−HCl（pH8.3）と50mMのKCl
と10mMのMgCl₂と10mMのDTTと1mMの各dNTPと650U/mlのAM
V逆転写酵素（アングリアン・バイオテクノロジー社、
コルチェスタ、英国）との混合物80μ中に再溶解さ
せ、かつ混合物を41℃にて90分間培養することにより、
第２ストランドのcDNA合成の効率を高めた。次いで、再
び上記と同様な抽出および沈澱によりDNAを単離した。

（ｃ） S1ヌクレアーゼ処理 125mMのNaClと25mMのNaOAcと1mMの酢酸亜鉛（pH4.5）
とを含有する緩衝液80μ中にDNAペレットを溶解さ
せ、2.0単位のS1−ヌクレアーゼ（BRL社、ノイ−アイセ
ンブルグ、西ドイツ国）を加え、かつ混合物を37℃にて
20分間静置した。最終濃度20mMまでEDTA（pH8）を添加
して反応を停止させ、かつ反応混合物を最終濃度200mM
までのトリス−HCl（pH8）の添加によって中和した。次
いで、再びDNAを上記と同様に抽出しかつ沈澱させ、こ
れを30mMのNaClと10mMのトリス−HClと1mMのEDTA（pH
8）とを含有する緩衝液中に再溶解させ、そして同じ緩
衝液に対し平衡化させたセファロースCL4Bカラム（0.8
×12cm）（ファルマシア・ファイン・ケミカルス社、ウ
プサラ、スエーデン国）にて寸法分画した。それぞれ２
滴のフラクションを集め、少なくとも500塩基対もしく
はそれより大のDNAを含有するフラクションを集め、そ
して集めたフラクションを上記と同様に沈澱させた。

（ｄ） 二重鎖cDNA及びPst I−制限pAT153の処理 オリゴーdC末端を有する前記二重鎖cDNAを、次の反応
混合物を用いて処理した：±2.5μｇの二重鎖cDNA/mlと
100mMのカコジル酸カリウム（pH7.2）と2mMのCoCl₂と20
0μＭのDTTと40μＭのデオキシ−（５−H³）−シチジン
三燐酸（17Ci/ミリモル、アメルシャム社、バッキンガ
ムシャー、英国）と400単位/mlの末端デオキシヌクレオ
チジルトランスフェラーゼ（ファルマシア−PLバイオケ
ミカルス社、ウプサラ、スエーデン国）。12−18dC残基
が３′OHに対し組込まれるまで37℃にて反応を続け、次
いで最終濃度20mMまでEDTA（pH8）の添加によって反応
を停止させた。次いで、直ちにこの物質をフェノールに
よって抽出し、次いでジエチルエーテルで２回抽出し、
かつ処理したcDNAを上記のように沈澱させた。

さらに、同様な条件下でPst I制限プラスミドpAT153
＊にオリゴdG−末端を付加したが、ただし（１）デオキ
シ−（５−H³）−シチジン−５′−三燐酸の代りにデオ
キシ−（８−H³）−グアノシン−５′−三燐酸（25Ci/
ミリモル、アメルシャム社、バッキンガムシャー、英
国）を４μＭの濃度で使用し、かつ（２）±16pモル/ml
の線状プラスミドDNAの濃度を使用した。

＊ pTA153（周知の入手しうるクローン化ベクター）を
供給業者（ベーリンガ・マンハイム社、西ドイツ国）の
指示にしたがってPst Iで制限し、ただし３倍多量の酵
素単位を使用した。

（ｅ） オリゴdC−処理二重鎖cDNAとオリゴdG−処理ベ
クターDNAとの融合 dC−処理した二重鎖cDNAとdG−処理した線状化プラス
ミドとをマニアチス等の方法〔「モレキュラ・クローニ
ング」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ース出版、ニューヨーク）、第242頁（1982）〕に実質
的にしたがって融合させたが、ただし混合物を65℃まで
加熱した後にこれを２〜３時間かけて室温まで冷却し
た。

（ｆ） イー・コリ菌株DHI（λ）の形質転換 次いで、イー・コリDHI（λ）〔ハナハン、「プラス
ミドによる大腸菌の形質転換に関する研究」、ジャーナ
ル・モレキュラ・バイオロジー〕を前記の融合した組換
DNAにより、競合細胞100μ当り10ngのベクターDNAを
用いて形質転換させた。次いで、形質転換した混合物を
ミリポアHATF（0.45μＭの孔径）フイルタ（ミリボア・
コーポレーション社、レッドフォード、マサチューセッ
ツ州）に移植し、これらを10μg/mlのテトラサイクリン
を含有するルリアブロス寒天板の表面に載置した。コロ
ニーを発生させた後、20％のグリセリンを含有する新た
なプレートにフイルタを載置し、かつこれを−20℃で保
存した。

この手順を用いて、約60,000種のクローンよりなるヒ
トcDNA保存物と約30,000種のクローンよりなるネズミcD
NA保存物を得た。

実施例5:ウサギ血清からのTNFの精製 第２図を参照して、ここは誘発したウサギ血清からの
TNF様ポリペプチドを精製するための１具体例を概略で
示している。第２図に示した本発明の具体例で示したよ
うに、実施例１に記載したと同様処理した50羽のウサギ
の血清を集めた。典型的実験において、LPSを静脈内注
射した後に、BCG処理したウサギの血清（1800ml）は約
5.2×10⁴U TNF/mlを含有し、その比活性は約5.3×10²U
TNF/蛋白mgであった。

（ａ） ウサギ血清からの蛋白の沈澱 先ず最初に分離したウサギ血清を固体の硫酸アンモニ
ウムで飽和させ、その際この硫酸塩を常に撹拌しながら
４℃にてゆっくり（約6g/min）添加し、35.9％の硫酸ア
ンモニウム飽和に達せしめた。次いで、アンモニウムに
よりpHを7.0に維持し、かつ溶液を絶えず撹拌しながら
４℃にて約18時間保った。次いで、遠心分離（30min、7
500rpm、４℃、ベックマンJA 7.5型ロータを用いる）
によって沈澱物を溶液から除去した。次いで、同じ条件
下で61.6％の飽和に達するまで硫酸アンモニウムを上澄
液に加えた。上記の飽和血清を絶えず撹拌しながら５時
間おいた後、再び上記と同様に沈澱物を集め、かつこの
第２沈澱からのペレットを４℃の50mMトリス−HCl（pH
7.5）の600ml中に再懸濁させた。次いで、この溶液を４
×3000mlの50mMトリス−HCl（pH7.5）に対し40時間透析
して硫酸アンモニウムを除去した。この工程により50mM
トリス−HCl（pH7.5）における760mlの淡白溶液を得
た。この35.9％〜61.6％の硫酸アンモニウムフラクショ
ンをフラクションＡと呼ぶ。

０〜35.9％の硫酸アンモニウムフラクションからのペ
レットも著量のTNF活性を有するので、これを約200mlの
50mMトリス−HCl（pH7.5）に再懸濁させ、かつこの溶液
を2000mlの30.8％硫酸アンモニウム溶液に対し４℃にて
絶えず撹拌しながら18時間透析した。前記と同様に遠心
分離により沈澱物を除去した。上澄液を３×2000mlの50
mMトリス−HCl（pH7.5）に対し４℃にて絶えず撹拌しな
がら３×2.5時間にわたり透析した。この透析により、5
0mMトリス−HCl（pH7.5）における270mlの蛋白溶液が得
られた。この30.8％〜35.9％の硫酸アンモニウムフラク
ションをフラクションＢと呼ぶ。

フラクションＡとＢとを合し、かつ遠心分離（30mi
n、7500rpm、４℃、ペックマンJA7.5型ロータ）の後、
溶液を0.45μｍのニトロセルロースフイルタ（ミリポア
社、ベットフォード、マサチューセッツ州）に通過させ
て、1025mlの30.8％〜61.5％硫酸アンモニウムフラクシ
ョンを得た。この混合したフラクションは約8.0×10⁴U
TNF/ml（ウサギ血清のTNF活性のほぼ全部）と、その
全蛋白の55％のみを含有した。このフラクションの比活
性は8.8×10²U TNF/蛋白mgであった。

（ｂ） イオン交換クロマトグラフィー（緩和なアルカ
リ性pH） 組合せたフラクションにおけるTNF活性をそこに含ま
れる他の多くの蛋白から分離し、その際陰イオン交換樹
脂に対するTNFの強力な結合親和性を利用した。多くの
陰イオン交換クロマトグラフ系が当業者に周知されてい
るが、直径2.6cm×48cmのDEAE、セファセルカラム（フ
ァルマシア社、ウプサラ、スエーデン国）を使用するよ
う選択した。勿論、他の陰イオン交換カラムも選択しう
ることが了解されよう。

予め50mMのトリス−HCl（pH7.5）で平衡化させた選択
カラムにTNF含有溶液を充分過剰に負荷させ、溶液を0.8
ml/minの流速で通した。TNFはカラム上において他の予
め結合した蛋白と競合するので、この手順は溶液中はほ
ぼ全部のTNFが結合したカラムを与えた。このカラムを
同容積の50mMトリス−HCl（pH7.5）と50mMトリス−HCl
（pH7.5）における同容積の0.1MのNaClとで0.8ml/minの
流速にて洗浄した後、これを50mMトリス−HCl（pH7.5）
における0.1Mから0.4MのNaClの直線的塩濃度勾配で同流
速にて溶出させた。この溶出は、0.1MのNacl洗浄工程の
終りにTNF活性を有するフラクションの溶出物を与え
た。第２図に示したように、得られた溶液は2.8×10⁵U
TNF/mlを含有し、比活性は1.6×10⁵U/蛋白mgであっ
た。したがって、この陰イオン交換工程は、99％以上の
非TNF蛋白を除去することができると共に、TNF活性のほ
ぼ全部を保持することができた。

（ｃ） イオン交換物の濃縮 再び第２図を参照して、DEAEセファセルカラムから溶
出させたTNF含有フラクションを集めかつ濃縮した。集
めたフラクションを遠心分離し（30min、13,500rpm、４
℃、ベッグマンJA14型ロータ）、次いでアミコンTCF−
２型装置を用いて上澄液を17倍に濃縮した（セルを1.5
気圧に加圧しかつジアフロUM10膜（アミコン、ダンバ
ー、マサチューセッツ州、USA）を使用した）。得られ
た濃縮物は2.6×10⁶U TNF/mlを含有しかつ1.2×10⁵U/m
gの比活性を有した（第２図）。

（ｄ） ゲル濾過 上記のように作成した濃縮物をゲル濾過により分子量
にしたがって分画した。多数の適当なゲル濾過系が当業
者に周知されているが、20,000〜350,000ダルトンの分
画範囲を有するAcA34ゲル（LKB社、ブロマ、スエーデン
国）を選択した。ここでも、他の濾過系を使用しうるこ
とが了解されよう。

選択したゲルを1MのNaClと50mMのトリス−HCl（pH7.
5）に懸濁させ、このゲルをカラム（直径2.5cm/89cm）
中へ注ぎ込み、かつこのカラムを同じ緩衝液で0.5ml/mi
nの流速にて平衡化させた。TNF濃縮物を調製されたAcA3
4カラムに充填する前に、アミコン濃縮物の塩濃度を、5
0mMのトリス−HCl（pH7.5）における5MのNaCl溶液によ
りカラム緩衝液の塩濃度で平衡化させた。TNF活性を有
するこの工程のゲル濾過フラクションは、約350,000ダ
ルトンの分子量に相当した。

第２図に示したように、ゲル濾過後に残留する30mlの
溶液は4.0×10⁶U TNF/mlを含有しかつ9.3×10⁶U TNF/
蛋白mgの比活性を有した。これは、血清から約20,000倍
TNFが精製されたことを示している。

（ｅ） イオン交換クロマトグラフィー（弱酸性pH） TNF活性を有する集めたゲル濾過フラクションを、20m
Mのヒスチジン−HCl緩衝液（pH5.8）における２×750ml
の0.1M NaClに対し４℃にて１晩透析した。次いで、調
製用のモノ−Ｑカラム（直径1cm×11cm、ファルマシア
社、ウプサラ、スエーデン国）を同じ緩衝液で平衡化さ
せた後、透析したTNF含有の溶液をこのカラムにて20mM
ヒスチジン−HCl緩衝液（pH5.8）における0.1M〜0.4Mの
NaClの直線的勾配により分画した。TNF活性を有するフ
ラクションは約0.26MのNaClの濃度勾配で溶出した（フ
ラクション15および16）。再び第２図を参照して、これ
らのクロマトグラフ工程は、2.5×10⁷U TNF/mlを含有
しかつ4.5×10⁷U TNF/蛋白mgの比活性を有する溶液4ml
を与えた。このフラクションは、血清から約100,000倍
のTNF精製を示した。第２図に示した全TNF活性における
変動は、TNF活性分析における不正確さ（ファクター２
まで）によるものである。

酸性モノＱカラムからの溶出フラクションをSDS−PAG
E（12％）で分析した。次いで、第３図を参照して、約1
8,000ダルトンの分子量に相当する位置に単一の蛋白帯
が活性カラムフラクション内に保持されることを観察し
た。この蛋白帯におけるクーマシー・ブリリアント・ブ
ルー（セルバR250）の染色強度は、対応するカラムフラ
クションのTNF活性と正確さに相関する。SDS−PAGEは蛋
白を変性させるが、非変性ゲルのゲルスライス物から溶
出したTNF活性はSDS−ポリアクリルアミドゲルにおける
電気泳動に際し同じ蛋白帯を示し、したがって18,000ダ
ルトンのバンドはTNF様ポリペプチドを示すことが確認
された。

実施例6:精製したウサギTNFの部分のアミノ酸配列の決
定および各種DNA試料の作成 誘発したウサギ血清からのこのTNF様ポリペプチドを
精製した後、これを使用してそのアミノ酸配列の部分を
決定した。しかしながら、精製TNFを臨床的に用いて、
癌および腫瘍並びにマラリヤ感染に対するTNFの作用並
びにこれらに対する治療効果を研究しうることも了解さ
れよう。さらに、精製したTNFを作用し、精製蛋白を適
当な動物中へ注射したTNF抗体（ポリクローナルまたは
モノクローナル）を生成させることもできる〔たとえば
B.ベナセラフおよびE.ウナヌエ、「テキストブック・オ
ブ・イミュノロジー」、ウイリアムス・アンド・ウイル
キンス（バチルモア、メリーランド州）、第12〜22頁
（1976）〕。これらの抗体は、たとえば分析或いはTNF
自身の精製工程に有用である。

これから誘導される蛋白およびペプチドのアミノ酸配
列を決定する技術は当業界で周知されている。これらの
利用しうる自動化技術の１つを選択して、実施例５で精
製されたウサギTNF様化合物の選択部分に関するアミノ
酸配列を決定した。先ず最初に、精製したウサギTNFのC
NBγ断片を標準条件下で作成した。次いで、これらの断
片をゲル上で分離し、個々のバンドを電気溶出させ、こ
れらを透析しかつアプライド・バイオシステム気相配列
決定装置（モデル470型）に直接施こした。

第４図および第５図を参照して、ここには精製したウ
サギTNFポリペプチドの２種の部分のアミノ酸配列が示
されている（TNF CNBγ−断片３および４）。さらにこ
れらの図面には２種の断片における各アミノ酸をコード
する各種のDNAコドンも示されている。各コドンは、決
定されたアミノ酸配列をコードする縮重群を示してい
る。遺伝子コードの縮重により、多くの存在しうるヌク
レオチド変異を含む多くのDNA試料を所定のアミノ酸配
列につき合成することができる。勿論、DNA試料の合成
には、少なくとも縮重コドンを有するアミノ酸を含有し
たアミノ酸配列を選択するのが好適である。しかしなが
ら、充分長い試料を選択すれば、生じうる不整合は完全
整合の領域によって補われ、高縮重群の試料においてさ
え検出可能なハイブリッド化が生ずるであろう。

精製したウサギTNFから誘導したアミノ酸配列は、各
種のDNA保存物をスクリーニングしてハイブリッド化に
より関連DNA配列を選択する際使用するためのヌクレオ
チド（DNA）試料の合成に有用である。次いで、これら
の選択した配列を処理して、これらにより形質転換され
た原核宿主でTNF発現させることができる。さらに、こ
れらは、哺乳動物TNF、たとえばネズミおよびヒトTNFを
コードするその他の関連DNA配列を選択するためのスク
リーニング試料としても有用である。

さらに、精製TNFを用いかつそのアミノ酸配列に基づ
く合成ペプチドを用いて、適当な動物においてTNFに対
するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を作成
することもできる。これらの抗体はTNFの精製およびTNF
の放射線免疫分析に有用であり、たとえは本発明の方法
により作成されたTNF発現性クローンの直線的選択に使
用することができる。さらに、精製蛋白および合成ペプ
チドは腫瘍，癌およびマラリヤ治療並びにその関連方法
においてTNF活性を臨床的に評価するにも有用である。

再び第４図および第５図を参照して、ここにはTNF断
片３および４につき決定したアミノ酸配列に基づき慣用
のホスホアミドDNA合成技術を用いて作成した各群の縮
重TNFDNA試料が示されている〔たとえばテトラヘドロン
・レタース、第22巻、第1859−1862頁（1981）〕。たと
えばLys（AA No.2）からAla（AA No.12）に到る範囲のT
NF断片３におけるアミノ酸配列に基づき、位置４−６−
19−21にヌクレオチド組換へを有する４種の32量体（RA
B TNF3−Ｉ〜RAB TNF3−IV）を合成した。第４図にお
いて組換部分には下線を施した。さらに、60オリゴヌク
レオチドの長い重複試料を作成した（第４図参照）。

Trp（AA No.3）からLeu（AA No.9）に到る範囲のTNF
断片４におけるアミノ酸配列に基づき、４種の縮重群の
20量体（RAB TNF4−A1〜RAB TNF4−A4）を合成した
（第５図参照）。これらの20量体は位置12にヌクレオチ
ド組換えを有した（第５図において下線を施こす）。異
なる群の試料によるゲノムウサギDNAのサウザンブロッ
ト法における後のハイブリッド化パターンに基づき、RA
B TNF4−A2試料を位置15におけるヌクレオチド組換え
に基づいて３群に分けた（第５図において組換えに下線
を施こす）。断片４のPhe（AA No.13）からAsp（AA No.
19）に到る範囲のアミノ酸配列に基づき、第２群の６種
の20量体（RAB TNF4−B1〜RAB TNF4−B6）を作成し
た。最後に、TNF蛋白のこの部分におけるほぼ全部の公
知アミノ酸配列にわたる長い重複試料を作成した（第５
図参照）。

これらDNA試料を使用してスクリーニングする前に、
各一本鎖DNA試料をT4ポリヌクレオチドキナーゼによっ
て５′末端標識した。４種のα³²P−デオキシヌクレオ
シド三燐酸全部の存在下でクレノー・ポリメラーゼを用
いる充填により、長い重複試料を長い高比活性（＞10⁸/
μｇ試料DNA）まで標識した。

実施例7:ウサギゲノム保存物のスクリーニング １種もしくはそれ以上のDNA試料を用いて全てのDNA収
集物を有効にスクリーニングしうるが、一般に合成DNA
試料の基礎となるポリペプチドの分離に使用したと同じ
動物から得られたDNA保存物を先ず最初にスクリーニン
グするのが好ましい。同じ動物からのDNA保存物の使用
は、ハイブリッド化条件を一層厳格にすることを可能に
する。何故なら、この試料とゲノムDNAにおける対応、
領域との間の類似性が高いからである。DNA試料とDNA保
存物との両者につき同じ動物源を使用することは、短い
DNA試料を使用する場合特に重要である。より長いDNA試
料を使用する場合に、それ程重要ではない。この種の短
い試料につきスクリーニングしてDNAを選択した後、こ
れを単独でまたは組換ファージもしくはプラスミドとし
て使用することにより、同じ動物から得られた或いはヒ
トを含む他の動物から得られたDNA保存物においてハイ
ブリッド化により関連DNAを選択することができる。選
択したDNAはその分離に使用した初期の合成試料よりも
長く、したがって完全整合の領域を含む可能性が大きい
ので、短い合成試料を使用して同じ動物からのDNA配列
を使用すると共に、これらの試料につき選択されたDNA
を使用して種属間のDNAを選択するのが好ましい。

上記原理にしたがって、実質的にマニアチス等の方法
により作成されたウサギゲノムDNAのクローン化保存物
をスクリーニングした〔「真核DNAの保存物からの構造
遺伝子の分離」、セル、第15巻、第687−701頁（197
8）〕。

上記保存物につき、全部で約６×10⁵個のファージを
プレート培養し、次いでこれらを２個のナイロンフイル
タ（PAL）に釣上げた（それぞれ５分および８分の吸着
時間を用いる）。フイルタ上でのファージDNAの変性，
中和および固体の後、高比活性標識した（0.5−1.0×10
⁷cpm/pモルDNA）合成ヌクレオチド試料RAB TNF3−III
を用いて保存物をスクリーニングした（第４図）（この
試料はサウザン切断およびハイブリッド化による予備分
析に基づいて選択した）。これらのフイルタを４×SS
C、15mMの燐酸ナトリウム（pH7）、10×デンハルト溶
液、250μg/mlのｔ−RNAおよび７％のSDSにおいて50℃
で２時間予備ハイブリッド化した。洗浄した後、これら
を10％デキストラン硫酸塩、５×SSC、10×デンハルト
溶液、20mM燐酸ナトリウム（pH7）、500μg/ml ｔ−RN
Aおよび７％SDSにて標識試料と50℃にて１晩ハイブリッ
ド化させた。２×SSC、１％SDS中で50℃にてこれらフイ
ルタを洗浄した後、光学分析にかけた。

このスクリーニングの結果、16種の二重陽性ハイブリ
ッド化クローンを得た。これら16種の陽性クローンから
対応のプラークを分離し、かつTNF断片３および４の両
者から得られたDNA試料を用いてサウザンブロットによ
りそれらのDNAを分析した。それらの分析の１つにおい
て、オリゴヌクレオチド試料RAB TNF3−IIIおよびRNB
TNF4−A2−３による16種のファージDNAのEco RI制限
切断に関するサウザンブロットは、両試料に対しハイブ
リッド化するEco RIバンドを持った１種のファージを与
えることを観察した。この特定クローンはDNA断片を含
有してTNF関連ポリペプチドの両断片３および４に対応
する試料にハイブリッド化するので、これはウサギTNF
遺伝子のほぼ全部を含有する可能性が極めて高いと結論
された。

実施例8:cDNAネズミおよびヒト保存物のプラス−マイナ
ススクリーニング このスクリーニング法は、２種のヒトおよびネズミDN
A試料を並行して使用することに基づいており、一方は
卵母細胞注射の後に最大TNF生物学活性を示したポリA⁺R
NAの蔗糖濃度勾配フラクションから合成されたcDNA（実
施例３）であり、他方は非誘発培養物から得られた同等
なフラクションで合成されたcDNAである。前者をプラス
試料と呼び、後者をマイナス試料と呼ぶ。

実施例４の（ａ）部に実質的に記載したと同様にプラ
ス試料およびマイナス試料につきcDNAを合成し、ただし
0.2mMのデオキシヌクレオシド三燐酸だけを使用しかつ
α³²P−dATP（7000Ci/ミリモル、アメルシャム社、バッ
キンガムシャー、英国）を２μＭの濃度まで添加した。

プラスおよびマイナスのネズミおよびヒト試料を併用
して、２群のランダム選択したネズミおよびヒト原料か
ら得られたcDNA保存物の複製物をそれぞれスクリーニン
グした（実施例４）。ハナハンおよびメセルソンの方法
〔「高コロニー密度におけるプラスミドスクリーニン
グ」、ジーン、第10巻、第63−67頁（1980）〕にしたが
ってcDNA保存物の複製を作成した。マニアチス等により
「モレキュラ・クローニング」（コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリース出版、ニューヨーク）、第
326−328頁（1982）に実質的に記載されたように、フイ
ルタ（ミリポア、HATF、0.45μｍ）にて細菌コロニーを
溶菌させた。

これら保存物のハイブリッド化スクリーニングを行な
うため、同属試料を使用し、すなわちネズミのプラスお
よびマイナス試料を使用して、ネズミのcDNA保存物をス
クリーニングし、かつヒトのプラスおよびマイナス試料
を使用してヒトの保存物をスクリーニングした。さら
に、これらのクローンをプラス試料につき陽性であるが
マイナス試料については陽性でない各保存物において検
査した。

30,000種のクローン保存物からランダム選択された5,
000種のクローンよりなるネズミ保存物を上記のように
プラス／マイナススクリーニングした結果、さらに分析
するための55種の陽性クローンを選択した。ヒト保存物
のプラス／マイナススクリーニングの結果は不明瞭であ
った。したがって、ヒトcDNA保存物のこのプラス／マイ
ナススクリーニングについてはもはや行なわなかった。
その代りに、下記するヒトcDNA保存物をスクリーニング
した。

実施例9:ネズミおよびヒトのTNF特異性cDNAクローンの
分離 （ａ） ネズミTNF特異性cDNAの分離 プラス／マイナススクリーニングにおいて、上記した
選択55cDNAクローンを釣上げ、かつこれらを個々に増殖
させた。次いで、１晩培養した培養物（5mlのルリヤブ
ロス、10μg/mlのテトラサイクリンにおいて増殖）から
プラスミドDNAを、実質的にH.C.バーンボイムおよびJ.
ドリー、ヌクレイック・アシド・リサーチ、第７巻、第
1513−1523頁（1979）に実質的に記載されたように分離
し、かつ11群の５種のクローンをそれぞれその後の研究
に使用した。これらの群のプラスミドから挿入DNAを、P
st I制限および次いでアガロースゲル電気泳動によって
分離した。次いで、これら11群のクローンからの挿入物
DNAをニトロセルロース膜フイルタ（0.45μｍ、ミリポ
ア社）に移して固定した〔これは実質的にE.M.サウザー
ンにより、ジャーナル・モレキュラー・バイオロジー、
第98巻、第503−517頁（1975）に記載されている。〕。

次いで、前記したウサギTNF断片３よび４から得られ
た長い重複試料を使用して、フイルタ結合したDNAをス
クリーニングした（第４図および第５図参照）。このハ
イブリッド化スクリーニングのため、先ず最初にこれら
フイルタを20％ホルムアミド（混合床樹脂を脱イオン化
したもの）、５×SSC、５×デンハルト溶液、5mMのEDT
A、50mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）および20μg/
mlのイー・コリDNA（７分間煮沸して変性させかつMSEソ
ニプレプ150型音波処理器により３×1min、25−30μに
て音波処理したもの）で42℃にて１晩予備ハイブリッド
化した。次いで、これらフイルタを、42℃にて標識試料
DNA（実施例６参照）（７分間煮沸して変性したもの）
と20％のホルムアミド（混合床樹脂にて脱イオン化した
もの）と５×SSCと５×デンハルト溶液と5mMのEDTAと25
mMの燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）と20μg/mlのイー
・コリDNA（前記と同様に作成）との存在下に40時間培
養した。フィルタを２×SSCおよび0.1％のSDSの存在下
に35℃にてそれぞれ１時間２回洗浄した後、これらを光
学分析した。

１つの群（群６）は、断片３から得られた試料を用い
て１種のプラスのクローンを与えた。したがって、この
群の５種の個々の膜を実質的に上記したようにスクリー
ニングし、かつ両者とも同一の２種のプラスクローンを
分離した。このクローンをｐ−mTNF−１と呼ぶ。

次いで、予めニック翻訳によって放射能標識したｐ−
mTNF−１のRsa I断片によって55種のプラス／マイナス
クローンの収集物をスクリーニングし、他の２種の陽性
クローン、すなわちｐ−mTNF−２およびｐ−mTNF−３を
選択した。

次いで、これら３種のクローンの全てがポリA⁺RNAか
らTNF−活性mRNAを選別しうることを確認した。これを
行なうため、選定したクローンを釣上げかつこれを個々
に増殖させた。次いで、プラスミドDNAを１晩培養した
培養物（400μのルリアブロス、10μg/mlのテトラサ
イクリン）から分離した〔これについてはプレイブラン
ク等、「均質溶解およびポリエチレン−グリコール沈澱
によるイー・コリプラスミドDNAの精製方法」、モレキ
ュラ・バイオロジカル・レポート、第９巻、第191−195
頁（1983）に実質的に記載されている〕。

次いで、約30μｇの各調製物をNACS32プレパックカラ
ム（BRL社、ノイーアイセンベルク、西ドイル国）にて
業者により推奨された条件を用いて精製し、エタノール
でDNAを沈澱させ、これを再溶解させると共に、Eco RI
（ベーリンガー・マンハイム社、西ドイツ国）で切断
し、これをフェノール抽出して再沈澱させた。

次いで、この切断されたプラスミドDNAを実質的にカ
ファトス等「ドット・ハイブリッド化法による核酸配列
同属性および相対物濃度の決定」、ヌクレイック・アシ
ッド・リサーチ、第1541−1552頁（1979）に実質的に記
載されているように膜が結合させ、ただしこの場合
（１）ニトロセルロースフイルタの代りに遺伝子スクリ
ーン（ニュー・イングランド・ヌクレア社、ボストン・
マサチュセッツ州）を使用し：（２）酢酸アンモニウム
濃度を1Mから2Mまで増大させ、かつ（３）これらフイル
タを減圧下で処理せずに、チャーチおよびギルバートに
よりプロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス・USA、第81巻、第1991−1995頁（1984）に実質
的に記載されているようにUVで処理した。

次いで、フイルタ結合したEco RI切断プラスミドDNA
を、ポリA⁺RNA（卵母細胞の注射に後に予め最大TNF活性
を示した蔗糖濃度勾配フラクションからのもの、実施例
３参照）とのハイブリッド化によってスクリーニングし
た。この結合したRNAをパルネス等、「ネズミβＺマイ
クログロブリンcDNAクローン；レアmRNAに対応するcDNA
クローンのスクリーニング方法」、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第78巻、
第2253−2257頁（1981）に実質的に記載されているよう
に溶出させ、ただしこの場合（１）RNAを５μｇのポリA
^-RNA（オリゴdTセルロース）の存在下に溶出させ、かつ
（２）フェノール化する代りにRNAを２回沈澱させた。

回収したRNAを実施例３に記載したと同様にアフリカ
産カエルの卵母細胞中へ注入し、かつ適当な培養期間の
後（同じく実施例３参照）、TNF活性につき培地を分析
した（実施例３参照）。上記ハイブリッド選択を用い
て、ｐ−mTNF−１、ｐ−mTNF−２およびｐ−mTNF−３の
挿入物のそれぞれがポリA⁺RNAからTNF活性RNAを選択す
ることを確認した。

次いで、制限分析によって３種のネズミTNFクローン
を分析した（第６図参照）。これらの分析は、３種のク
ローンが同じRNAから生じ、したがって同じ遺伝子から
由来することを示した。これらクローンの詳細な制限マ
ップを第６図に示す。これら３種のクローンは、それぞ
れ約±1550、±350および±1000塩基対のTNF関連挿入物
を有した。

さらに、ｐ−mTNF−１およびｐ−mTNF−３からの複合
挿入物における完全cDNA配列をマキサム−ギルバートの
技術〔A.M.マキサムおよびW.ギルバート、プロシーディ
ング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・USA、第7
4巻、第560−564頁（1977）〕を用いて決定した。これ
から得られた配列およびアミノ配列を第７図に示す。

第７図を参照して、ここにはクローンｐ−mTNF−１お
よびｐ−mTNF−３の配列決定から得られた複合TNF関連D
NA配列における1644ヌクレオチドのヌクレオチド配列が
示されている（クローンｐ−mTNF−１のcDNA挿入物は
３′非コード化領域を有しかつATG開始コドンまで延在
している（第７図参照））。ｐ−mTNF−３のcDNA挿入物
はネズミプレTNFに対する全コード配列と５′非コード
化領域の１部とを有する（第６図参照）。この配列につ
いてはヌクレオチド１から1644まで番号付けされてい
る。全枠内（ATGおよびTGA）は、推定ネズミプレートTN
Fの開始および停止コドンを意味する。破線で示した枠
（ヌクレオチド1614−1619および1630−1635）は、推定
のAAUAAAポリアデニル化信号を示している。連続する読
み枠が、開始コドン（ATG）と停止コドン（TGA）との間
に存在する。この読み枠におけるコドンによってコード
されるアミノ酸は、慣用の１文字記号を用いてこれらの
コドンの下に示されている。ネズミTNFの推定信号配列
（下記するヒトTNFの部分Ｎ−末端アミノ酸配列と比較
して決定）を、これらアミノ酸の下に破線で示す。しか
しながら、ネズミTNFはヒトTNFに比較して成熟蛋白のＮ
−末端にまたはその近くに２個のアミノ酸欠失部を有す
るので、成熟ネズミTNFの第一Ｎ−末端アミノ酸として
のロイシンの確認はヒトTNFについてと同様に精製され
た原ネズミTNFの蛋白配列決定にしたがうことを了解す
べきである。第７図における決定の成熟TNF配列は実線
で示されている。このアミノ酸配列における実線枠は、
グリコシル化信号（Ｎ−Ｘ−S/T）と２個のシスティン
（Ｃ）残基とを示し、これらはジスルフィド結合に関与
すると思われる。

（ｂ） ヒトTNF−特異性cDNAクローンの分離 ヒトTNF−特異性cDNAクローンを選択するため、先ず
最初に１群のヒトTNFcDNAクローン（上記60,000種のcDN
Aクローンの保存物からのランダムに選択したもの）を
ニトロセルロースフイルタ（直径0.45μｍ、ミリポア
社）で増殖させかつこれらを溶解させると共に、D.ハナ
ハンおよびM.メセルソン、ジーン、第10巻、第63−67頁
（1980）に実質的に記載されているようにフイルタへ固
定した。この保存物をネズミTNFcDNA（ｐ−mTNF−１）
（この断片は成熟ネズミTNFに対するコード領域の１部
と重複する、第６図および第７図参照）からのPvu II−
Pvu II制限断片によってスクリーニングした。このDNA
断片をアガロースゲル電気泳動によって精製し、かつこ
れをP.W.J.リグビー等、ジャーナル・モレキュラ・バイ
オロジー、第13巻、第237−251頁（1977）に実質的に記
載されているようなニック翻訳によって放射能標識し
た。このハイブリッド化のため、ネズミTNF−特異性cDN
Aクローン（ｐ−mTNF−１）を分離するために使用した
と実質的に同じ条件を使用した。

コロニーに対する比較的大きいバックグランドを認め
たが、１つのクローンは極めて大きい信号を発生した。
この結果を前記と同様にサウザンハイブリッド化によっ
て確認し、このクローンをｐ−hTNF−１と名付けた。ゲ
ノムヒトDNA保存物（上記ウサギゲノム保存物につき実
質的に上記したと同様に作成）から、同じPvu II−Pvu
II試料につき多数の陽性クローンを選択した。

第８図を参照して、ここにはｐ−hTNF−１の部分制限
マップが示されている。ｐ−hTNF−１におけるTNF−関
連挿入物は長さ約1650塩基対であり、16SヒトTNF mRNA
フラクションから得られた全cDNA寸法に対応するのに必
要な寸法を有する。

次に第９図を参照して、ここにはｐ−hTNF−１のcDNA
挿入物における1606個のヌクレオチドのヌクレオチド配
列が示されている。この配列にはヌクレオチド１〜1606
まで番号付けした。実線枠（ATGおよびTGA）は、推定の
ヒトプレーTNFの開始および停止コドンを示している。
連続読み枠が、開始コドン（ATG）と停止コドン（TGA）
との間に存在する。この読み枠におけるコドンによって
コードされるアミノ酸は、慣用の３文字記号によってコ
ドンの下に示す。ヒトTNFの推定信号配列（誘発U937細
胞（後記）から精製された原ヒトTNFの部分Ｎ−末端ア
ミノ酸配列と比較して決定）を、これらアミノ酸の下に
破線で示す。成熟ヒトTNFについては実線で示す。成熟
ヒトTNFはグリコシル化されていないと思われる。これ
は、ヒトTNFコード配列にグリコシル化信号が存在しな
いことにより裏付けられる。しかしながら、成熟ヒトTN
Fアミノ酸配列には２個のシスティン（Ｃ）が存在す
る。これらのシスティンはジスルフィド結合の形成に関
与すると思われる。

実施例10:ヒト細胞からのTNFの精製 第10図は、TNF産生につき誘発されたＵ−937細胞の培
地からTNF様ポリペプチドを精製する方法を略図で示し
ている（実施例２参照）。第10図に示したように、数種
のＵ−937誘発培地を65.000mlが得られるまで−80℃に
て集め、この量はアミノ酸配列決定および抗体作成につ
き充分量のヒトTNFを与える量であると思われる。この
収集した溶液は約3.0×10³U TNF/mlを含有しかつ約2.7
×10⁴U TNF蛋白mgの比活性を有し、TNF活性は前記と同
様に測定した（実施例１参照）。

（ａ） TNF含有培地の濃縮 37℃の室温で培地を解凍させ、かつ解凍した後直ちに
これを冷室（４℃）に移した。この65,000mlの収集物を
ペリコンカセット系（ミリポア社、ベットフォード、マ
サチューセッツ州）により約80倍濃縮した。この培地を
100,000ダルトンの公称分子量範囲（nmw1）を有するペ
リコン膜カセットおよび30,000ダルトンのnmw1を有する
ペリコン膜カセットに順次通過させた。殆んどのTNF活
性は100,000ダルトンのカセットを通過したが、30,000
ダルトンのカセットにより保持された。次いで、透析濾
過によって30,000ダルトンの保持培地を20mMのエタノー
ルアミン−HCl（EA−Cl）（pH9.0）緩衝液で置換した。
濃縮および透析濾過の後、810mlの溶液は6.0×10⁴U TN
F/mlを含有しかつ約6.8×10⁴U TNF/蛋白mgの比活性を
有した。

（ｂ） イオン交換クロマトグラフィー 濃縮培地のヒトTNF活性をその他多くの蛋白から分離
し、その際陰イオン交換カラムに対するTNFの結合親和
性を利用した。多くの陰イオン交換クロマトグラフ装置
が当業者に周知されているが、調製用モノ−Ｑカラム
（直径1cm×11cm、ファルマシア社、ウルサラ、スエー
デン国）を選択した。この寸法のカラムは約200mgの蛋
白の負荷容量を有する。このカラムを20mMのEA−C1（pH
9.0）で平衡化させた後、200mlの濃縮物を2ml/minの流
速で加えた。次いで、10mM EA−C1（pH9.0）において
０〜0.4MのNaClの範囲の直線濃度勾配を用いて結合蛋白
を分画した。溶出したTNF活性はフラクション24近傍に
ピークを有し、これを約0.16MのNaClの塩濃度で溶出さ
せた。この装填と濃度勾配とを３回反復して、TNF活性
を有するフラクションを集めた。これらの集めたフラク
ションは3.6×10⁶U TNF/mlを含有しかつ1.1×10⁶U TN
F/蛋白mgの比活性を有した（第10図参照）。

各試験に使用した蛋白の量はモノ−Ｑカラムの装填範
囲に丁度一致したので、分離は最適ではない。したがっ
て、最初のモノ−ＱカラムからのTNF含有収集物を他の
モノ−Ｑカラムに通過させることに決定した。先ず最初
に収集物を２×1000mlの10mM EA−Cl（pH9.0）に対し
４℃にて１晩透析した。次いで、このカラムを同じ緩衝
液で平衡化させた後、カラム上の収集物を20mM EA−Cl
（pH9.0）における０〜0.2MのNaClの直線的塩濃度勾配
で溶出させることにより分画した。得られた溶液は1.1
×10⁷U TNF/mlを含有しかつ2.3×10⁶U TNF/蛋白mgの
比活性を有した（第10図参照）。

（ｃ） ゲル濾過 次いで、分子量の差を利用して前記溶液を分画した。
多数の適当なゲル濾過系が当業者に周知されているが、
500〜60,000ダルトンの蛋白の分画範囲を有するTSK−G2
000SWGカラム（LKB社、ブロマ、スエーデン国）を選択
した。モノ−Ｑ収集物を50mMのトリス−HCl（pH7.4）に
おける２×1000mlの1M NaClに対し４℃にて１晩透析
し、かつ透析物の容積をスピード・バック濃縮装置（サ
バント社、ヒックスビル、ニューヨーク）を用いて急速
蒸発により0.85mlまで濃縮した。ゲル濾過カラムを50mM
トリス−HCl（pH7.4）における1M NaClで平衡化させた
後、収集物をこのカラムに1ml/minの流速で透過させ
た。約40,000ダルトンの蛋白が溶出した領域にTNF活性
を検出した。この分画の後、TNF含有領域は3.4×10U T
NF/mlを含有しかつ約1.1×10⁷U TNF/蛋白mgの比活性を
有した（第10図参照）。この精製は、Ｕ−937細胞培地
からほぼ400倍にTNF精製したことに相当する。

この分画した収集物をSDS−PAGE（12％）で分析し
た。約17,000ダルトンの分子量に相当する位置に主たる
バンドが観察された。さらに、約18,000ダルトンの分子
量には、ゆっくり移動する弱いバンドが観察された。こ
れらのことは、原ヒトTNFが２種の蛋白単位で構成され
ていることを強く示唆している。

この精製されたヒトTNFを用いて、部分Ｎ−末端アミ
ノ酸配列を決定した。この配列を第11図に示す。上記の
付加或いはアミノ酸の欠失として示した配列の変化を、
DNA配列から得た。この配列を用いて、ヒトTNFクローン
（上記）が有する推定信号配列および成熟コード配列を
決定した。

実施例11:イー・コリにおけるヒトTNF様ポリペプチドの
発現 第12図を参照して、λP_Lに基づく発現制御配列を用い
ることにより、本発明のTNF様ポリペプチドを産生させ
るための組換DNA分子を作成した（第12図参照）。この
作成のため、先ずヒトTNFをコードするDNA配列の578塩
基Ava I−Hind III断片を作成しかつ精製した。この断
片は、成熟配列（第12図）のアミノ酸８から出発してヒ
トTNFをコードする（アミノ酸８（Pro）に対するコドン
はAva−Ｉ−制限部位の５′末端に位置する）。このTNF
DNA断片はλgt10cDNA保存物（上記）におけるcDNAク
ローンから分離したが、同じ断片をｐ−hTNF−１からAv
a IおよびEco RIを用いて分離することもできるであろ
う（実施例９（ｂ）参照）。

次いで、欠失TNFアミノ酸をコードするCla I−Ava I
合成リンカを作成した（第12図参照）。この断片は578
塩基対のAva I−Hind III TNF断片に相補的な重複Ava
Iの５′末端を有した。さらに、pBR322−trp−IFN−γ
と称するプラスミドの大きい方のCla I−Hind III断片
を作成しかつ精製した（第12図参照）。

これら３種のDNA断片を結合させた後、得られたpBR32
2−trp−hTNF組換発現ベクターによってイー・コリ600
菌株を形質転換させた（第12図）。次いで、形質転換宿
主を燐酸塩緩衝された栄養倍地（グリセリン、酵母抽出
物、カザミノ酸）において振とうフラスコ中で37℃にて
１晩発酵させた。発酵後、菌体をSDS−尿素緩衝液中で
溶菌させ、かつ菌体産生された蛋白をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分析した。このゲルには
hTNF活性に対応するバンドが観察された。この活性は全
イー・コーリ産生蛋白の約10％に相当した。

次いで、pBRR322−trp−hTNFにおけるtrp配列の代り
にpL−T4発現制御配列を使用し、pBR322−pL−T4−HIL
−２と名付けたプラスミドの小さい方のPst I−Cla I制
限断片（1200塩基対）を分離しかつ精製した（第12
図）。第12図に示したように、この断片はアンピシリン
耐性をコードする遺伝子の１部と完全pL−T4制御配列と
を有する。同時に、pBR322−trp−hTNFをPst IおよびCl
a Iで制限すると共に、hTNFコード配列を有する大きい
方の断片を分離しかつ精製した。次いで、これら２種の
断片を合してpBR322−pL−T4−hTNFを作成した（第12
図）。

発現につき分析するため、イー・コリC600菌株をλct
s Kan^Rの低コピー数プラスミドを有するpBR322−pL−T
4−hTNFで形質転換させた。発酵（1.51、28℃、24時
間、次いで42℃、５時間）の後、これは全イー・コリ蛋
白の約30％のTNF活性を生じた。

pL−T4系において、TNF様ポリペプチドの高発現が観
察されたが、この生成物は原アルギニンの代りにヒスチ
ジンを約２アミノ酸として有する変異TNFであった。変
異TNFを生ずる単一の塩基対突然変異がどうして生じた
かは明らかでない。しかしながら、原TNF（arg）配列に
対する部位特異性変位（単一塩基の変位）の後、この手
順ではもはやTNF発現が観察されなかった。恐らく、RNA
の二次構造における何らかの形態がこの現象に関与する
ものと思われる。

したがって、幾つかの振たな作成を行なった。第13図
を参照して、pAT−15欠失（rop−）を有するプラスミド
153−pL−T4−hTNF−CA3（13）を作成した。このプラス
ミドは、発現に際し正確なアミノ酸配列（すなわち、Hi
sでなくArg）をコードするCla I−Ava I（「CA」）合成
リンカーを有する（第13参照）。これは、上記のように
λctsリプレッサ遺伝子と共に、またはそれなしに存在
する。

第13図に示したように、pBR32のヌクレオチド０位置
にはECC R1部位が欠失している。これらのプラスミド
は、形質転換宿主イー・コリW3110においてTNFの高収量
を示した（第１表参照）。しかしながら、発酵の結果
は、この作成物が貯蔵条件下にて不安定であることを示
した。

さらに、プラスミド153−pL−T4−hTNF−CA3−cts−T
4−ter（DSM3460〕を作成し、これはλctsレプレッサ遺
伝子を有した。このプラスミドを作成するため、３′非
コード領域を欠失させ、かつHind III位置に合成T4末端
を加えた。このプラスミドは高発現を示したが、T4末端
の結果として153−pL−T4−hTNF−CA3（13）よりも安定
性が大きかった（第17図参照）。このプラスミドは28℃
で増殖させねばならず、培地の添加後に42℃にて熱誘発
させねらばない。

好適具体例においては、153−T4−hTNF−CA5−T4ter
〔DSM3461〕を作成し、これは欠失したpL部分を有し、
発現ベクターのT4部分のみを残す（第14図，第15図およ
び第16図参照）。欠失の結果、アンピシリンに対する抗
生物質耐性を示す配列の部分が喪失した。したがって、
遺伝子の末端にテトラサイクリン耐性を示す抗生物質耐
性の標識を加えた後、pL配列を除去した。より好適なプ
ラスミドはC5合成リンカーを有する。このリンカーは、
原TNFの最初の７個のアミノ酸（Ava I部位まで）をコー
ドすると共に、次の配列を有する： さらに、T4末端は発現レベルに対する作用をも有す
る。この結果、宿主菌株WA802において25％以上のTNFを
産生する高発現ベクターが得られた（第２表参照）。

上記した方式を用いて他のTNFを作成することができ
る。たとえば、成熟TNFの最初の２個のアミノ酸−val−
arg−を欠失し、かつイー・コリで発現させた場合には
−met−ser−から出発するhTNF誘導体を作成した。この
誘導体をpBR322−pL−T4 △２ hTNFと呼ぶ。その構造
は、その他の点については上記pBR322−pL−T4−hTNFと
同じである（第12図）。

pBR322−pL−T4 △２ hTNFを作成するため、合成リ
ンカー断片： を作成した。この断片をpBR322−pL−T4 hTNFから得ら
れた大きい方のCla I−Hind III断片（第12図）に上記
したように578bpのAva I−Hind III断片の存在下で結合
させた。

上記の作成物pBR322−pL−T4−hTNF,153−pL−T4−hT
NF−CA3（13）,153−pL−T4−hTNF−CA3−CTS−T4terお
よび153−T4−hTNF CA5−T4terは全て、成熟ヒトTNFを
開始させる最初のバリンコドンに直接融合したATG開始
コドンを有する（第12図，第16図および第17図参照）。
pBR322−pL−T4−△２−hTNFは、△２−TNFの最初のセ
リンコドンに融合したATGコドンを有する。したがっ
て、これらの作成物により産生される生成物は恐らくMe
t−成熟hTNF（或いはpBR322−pL−T4−△２−hTNFの場
合にはMet−△２−hTNF）であると思われる。しかしな
がらＮ未満メチオニンはイー・コリによってその増殖ま
たは産生に際し切断され、或いは所望ならば必要に応じ
入手可能な酵素および切断技術を用いて産生蛋白からそ
の後に切断することもできる。

勿論、他のTNF産生宿主も本発明の方法に使用しうる
ことが了解されよう。たとえば、前記した発現ベクター
および原核宿主のいずれも本発明の範囲内で使用するこ
とができる。さらに、本発明のTNF様ポリペプチドをコ
ードするDNA配列を改変して、その発現もしくは生産物
の精製特性を向上させることもできる。たとえば、化学
的もしくは酵素的に作成したオリゴヌクレオチドをTNF
様ポリペプチドの開始コドンの前に挿入したり、或いは
これを使用して、このポリペプチドをコードするDNA配
列のＮ末端にてコドンを置換することもできる。この手
順により、一層好適な一次および高次の構造のmRNAを得
ることもできる。より詳細には、開始AUGコドンがヘア
ピンの頂部或いは他の一本鎖領域のいずれかに容易にア
クセスしうる位置（すなわち二次構造によって遮蔽され
ていない）に生ずるように配列を設計することもでき
る。さらに、シャイン−ダルガルノ断片の位置および配
列も同様に最適化させることができる。この種の構造改
変の重要性は、たとえばD.イセレンタントおよびW.ファ
イエルス、「mRNAの二次構造および翻訳開始の効率」、
ジーン、第９巻、第１〜12頁（1979）に記載されてい
る。

本発明によるTNF様ポリペプチドの細胞生産における
向上は、さらに細胞内で使用しうる遺伝子の個数を増大
させて、たとえば高コピープラスミドを用いて達成する
ことができる〔たとえば、B.ウーリン等、「クローン化
遺伝子の増殖に対する温度依存性コピー数を有するプラ
スミドおよびその生産物」、ジーン、第６巻、第91−10
6頁（1979）〕。

したがって、本発明の各種のTNF関連DNA配列を上記ベ
クターから除去して他のベクターおよび宿主に挿入し、
これらによりコードされる生産物の最終的産生を向上さ
せうることが了解されよう。

さらに、本発明によるTNF様ポリペプチドは融合蛋白
（たとえば原核もしくは組合せＮ末端断片に結合して分
泌を指示すると共に、安定性を向上させかつ精製を改善
し、或いはＮ末端メチオニンもしくは他のＮ末端断片の
切断をも向上させる）の形態、或いはプレーTNF（たと
えば哺乳類TNFのプレ配列またはその他の原核信号配列
の１部または全部から出発する）の形態、或いは成熟TN
F様ポリペプチドの形態、或いはｆ−met−TNF−様ポリ
ペプチドの形態の産生物を全て包含しうることを了解す
べきである。

本発明の方法により製造されたTNF様ポリペプチドの
特に有用な１形態、或いは少なくともその先駆体は、容
易に切断されるアミノ酸或いはそのＮ末端に結合した一
連のアミノ酸を有する成熟TNFである。この構造は適当
な原核宿主における蛋白の合成を可能にし、この場合成
熟TNFに存在しない開始信号が必要とされ、次いで、過
剰のアミノ酸をインビボもしくはインビトロで切断して
成熟TNFを産生させる。この種の方法は、たとえば米国
特許第4,322,892号、第4,338,397号、第4,366,346号お
よび第4,425,437号に見られる。

さらに本発明の方法により製造されたTNF様ポリペプ
チドは、上記DNA配列のコドンの幾つかまたは全部につ
き異なるコドンを特徴とするDNA配列によって発現に際
しコードされるTNF様ポリペプチドをも包含する。これ
らの置換コドンは、これら置換コドンによりコードされ
るものと同一のアミノ酸をコードすることができる。或
いは、産生される化合物の性質を有益に変化させうる
（例えば安定性の向上、溶解性の向上、治療活性の向上
または半減期の増大）ような１つ以上のアミノ酸の置換
をもたらす、もしくはより長いまたは短いTNF様ポリペ
プチドをもたらす、１つの或いは１組のコドンの置換ま
たは欠損は、本発明の方法によって引き起こすことがで
きる。

実施例12:インビボにおけるTNFとアクチノマイシンＤと
の組合物の活性 γ−hTNFと臨床上許容しうる投与量のアクチノマイシ
ンＤとの組合せがインビボにおける腫瘍の増殖速度に対
する作用を示した。１群当り８種からなる３群の裸ネズ
ミに５×10⁶JAMA（卵巣癌）細胞／ネズミ１匹を皮下注
射し、かつ腫瘍を７日間増殖させた。第１群には１×10
⁵Uのγ−hTNFのみを毎日病巣内（「i.1」）接種し、第
２群には同じ１日当り投与量のγ−hTNFを0.3μｇのア
クチノマイシンＤと組合せて接種し（「i.1」にて）、
第３群には同じ１日投与量のγ−hTNF（i.1）を0.3μｇ
のアクチノマイシンＤと組合せて腹腔内（「i.p」）注
射した。８匹のネズミよりなる比較群には処理を施こさ
なかった（群IV）。最後に、６匹のネズミよりなる群
（群Ｖ）には0.3μｇの１日投与量のアクチノマイシン
Ｄをネズミ１匹当りに接種し、３匹のネズミには病巣内
注射し、残り３匹のネズミには腹腔内注射した。

毎日の注射を３週間続けた。各腫瘍を処理前に毎日測
定した。第18図および第19図に示すように、第II群には
顕著な腫瘍増殖抑制および腫瘍の減退さえ観察され、こ
の群はTNFとアクチノマイシンＤとにより病巣内注射で
処理したものである。他の全ての群は、比較群により示
されると同様な腫瘍増殖を示した。

本発明に使用した微生物および組換DNA分子はドイツ
チェ・ザンムルング・ホン・ミクロオルガニスメン、ゲ
ッチンゲン、西ドイツ国に1984年12月17日付けで（Ａお
よびＢ）並びに1984年12月27日付け（Ｃ）で寄託した培
養物で例示され、かつ下記TNF−Ａ〜Ｃとして同定され
た： A.イー・コリDHI（λ）（ｐ−mTNF−３） B.イー・コリDHI（λ）（ｐ−hTNF−１） C.イー・コリC600（pBR322−pL−T4−hTNF）。

これらの培養物にはそれぞれ受託番号DSM3159,3160お
よび3175が付与された。

さらに、下記の微生物および組換DNA分子をドイツチ
ェ・ザンムルング・ホン・ミクロオルガニスメンに1985
年８月29日付けで寄託した。

D.イー・コリW3110（153−pL−T4−CA3−cts−T4−te
r） E.イー・コリW3110（153−T4−CA5−T4−ter）。

これらの寄託物には次の受託番号がそれぞれ付与され
た:DSM3460および3461。

以上、本発明を好適具体例を特に参照して説明した
が、本発明の思想および範囲を逸脱することなく多くの
改変をなしうることが当業者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＤＳＭ ３１７５ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ３４６０ 微生物の受託番号 ＤＳＭ ３４６１ (72)発明者 マルメナウト，アニー ルイス マリー ベルギー国、8370 ブランケンベルク、 グローテ マルクト 22 バス ６ (72)発明者 バン デル ヘイデン，ジヨゼ ベルギー国、9124 ミユンテ、ジンク 197 (72)発明者 アレツト，ベルナール スイス国、1213 オネツクス、リユー ド ボゾン 20 (72)発明者 カワシマ，エリツク エイチ スイス国、1207 ジユネーブ、リユー エルンスト ブロツチ 31 (56)参考文献 特開 昭60−185799（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，312，721−724（1984) Ｎａｔｕｒｅ，313，803−806（1985) Ｓｃｉｅｎｃｅ，228，149−154 （1985) Ｇｅｎｅ，18，297−307（1982) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，79，4937−4941（1982)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】DNA配列が、 （ａ）ｐ−mTNF−３のDNA挿入物（DSM3159）； （ｂ）ｐ−hTNF−１のDNA挿入物（DSM3160）； （ｃ）42℃、20％ホルムアミド、５×SSC、５×デンハ
   ートの溶液、5mM EDTAおよび25mMリン酸ナトリウム緩
   衝液（pH6.5）においてDNA挿入物（ａ）および（ｂ）の
   一方もしくは両方にハイブリッド化し且つ発現に際し腫
   瘍壊死因子の生物学的活性を示すポリペプチドをコード
   するDNA配列；並びに （ｄ）前記DNA挿入物およびDNA配列のいずれかに縮退す
   るDNA配列 よりなる群から選択され、前記DNA配列はT4およびpL−T
   4よりなる群から選択される発現制御配列に作用結合し
   ていることを特徴とする組換DNA分子よりなる群より選
   択された組換DNA分子により形質転換された原核宿主細
   胞を培養する工程からなる腫瘍壊死因子の製造方法。
2. 【請求項２】DNA配列が； よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】DNA配列が； よりなる群から選択される請求項１記載の方法。