JPH06172395A - インターロイキン−１β誘導体及び医薬 - Google Patents
インターロイキン−１β誘導体及び医薬Info
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- JPH06172395A JPH06172395A JP5212076A JP21207693A JPH06172395A JP H06172395 A JPH06172395 A JP H06172395A JP 5212076 A JP5212076 A JP 5212076A JP 21207693 A JP21207693 A JP 21207693A JP H06172395 A JPH06172395 A JP H06172395A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 インターロイキン−１βの特定のアミノ酸を
欠失又は置換した誘導体。 【効果】 優れたインターロイキン−１β誘導体及び医
薬を提供できる。
欠失又は置換した誘導体。 【効果】 優れたインターロイキン−１β誘導体及び医
薬を提供できる。
Description
【発明の詳細な説明】本発明は新しいポリペプチド、更
に詳しくはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の新
しい誘導体、並びにＩＬ−１β及びその新しい誘導体の
医薬用途に関する。第２回国際リンホカインワークシヨ
ツプにおいて、かつてリンパ球活性化因子（Ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；Ｌ
ＡＦ）、マイトジエニツク プロテイン（Ｍｉｔｏｇｅ
ｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヘルパーピーク−１（Ｈｅ
ｌｐｅｒｐｅａｋ−１）、Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ−ｃ
ｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒＩＩＩ（Ｔ
ＲＦ−ＩＩＩ）、Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ Ｍφ（ＴＲＦＭ）〕、Ｂセルアクチベー
テイング フアクター（Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔ
ｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−ｃ
ｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）などの
呼称で報告されてきた生理活性物質は、いずれもインタ
ーロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に統一されること
が決定された〔Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
４８、４３３−４３６（１９７９）〕。この決定は、上
記各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異
なる角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に
基づいている。上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球
やＢリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢
進作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞
に作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プスタグラン
デイン産生を亢進させる作用等を有することも報告され
ている〔Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，５１−５９
（１９８４）、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅ
ｄ．，３１１，１４１３（１９８４）等参照〕。しかし
て、物質としてのＩＬ−１の本体に関しては現在尚不明
ではあるが近になってＬＡＦ活性を有するポリペプチド
もしくはその前駆体をコードする異なる２種の遺伝子の
存在がようやく報告された〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８１，７９０７−７９１１
（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．３１５，６４１
（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｖｏｌ．１３（１６），５８６９（１９８５）〕。
これらの報告は２種の遺伝子の塩基配列から推定される
１５９個のアミノ酸配列を有する「ＩＬ−１α」と１５
３個のアミノ酸からなる「ＩＬ−１β」を記している。
しかしながら、従来よりコンデイシヨンド メデイウム
（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）もしくは部
分精製したと報告されるものの前述の生理活性と、上記
塩基配列から推定されるポリペプチドとの関連は、今尚
明らかにはされていない。また、上記公知の生理活性物
質としてのＩＬ−１は、内因性の発熱物質（ｅｎｄｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎ：ＥＰ）とも同一物質で
あるとされ、発熱性を示すことが知られている〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，３０４，４４９（１９８３）；Ｃｅｌｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，６３，１６４（１９８１）；Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１５０，７０９（１９７９）；Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１３０，（６）２７０８（１９８３）；
同，１３２（３）１３１１（１９８４）等参照〕。この
事実から、従来の生理活性としてのＩＬ−１はもとよ
り、仮に物質として均一なＩＬ−１が提供されたとして
も、その医薬用途への適用は、極めて困難とされてい
る。本発明は医薬用途に有効に使用できる新しい有用な
ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドを提供しようとす
るものである。本発明は新しいＩＬ−１β誘導体である
ポリペプチドの医薬用途を提供しようとするものであ
る。本発明は新しいＩＬ−１β誘導体をコードする遺伝
子及びこれを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１β誘導
体であるポリペプチドを製造する方法を提供しようとす
るものである。本発明はまた均質なＩＬ−１β自身の新
しい医薬用途を提供しようとするものである。上記本発
明の目的及びそれら以外の本発明の目的は以下の記載に
より明かにする。本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリペプ
チド）はインターロイキン−１βの下記（Ａ）式で表わ
されるアミノ酸配列に於て、式（Ａ）
に詳しくはインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の新
しい誘導体、並びにＩＬ−１β及びその新しい誘導体の
医薬用途に関する。第２回国際リンホカインワークシヨ
ツプにおいて、かつてリンパ球活性化因子（Ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；Ｌ
ＡＦ）、マイトジエニツク プロテイン（Ｍｉｔｏｇｅ
ｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ヘルパーピーク−１（Ｈｅ
ｌｐｅｒｐｅａｋ−１）、Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ−ｃ
ｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒＩＩＩ（Ｔ
ＲＦ−ＩＩＩ）、Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ Ｍφ（ＴＲＦＭ）〕、Ｂセルアクチベー
テイング フアクター（Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔ
ｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−ｃ
ｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）などの
呼称で報告されてきた生理活性物質は、いずれもインタ
ーロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に統一されること
が決定された〔Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
４８、４３３−４３６（１９７９）〕。この決定は、上
記各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異
なる角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に
基づいている。上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球
やＢリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢
進作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞
に作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プスタグラン
デイン産生を亢進させる作用等を有することも報告され
ている〔Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ
Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，５１−５９
（１９８４）、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅ
ｄ．，３１１，１４１３（１９８４）等参照〕。しかし
て、物質としてのＩＬ−１の本体に関しては現在尚不明
ではあるが近になってＬＡＦ活性を有するポリペプチド
もしくはその前駆体をコードする異なる２種の遺伝子の
存在がようやく報告された〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８１，７９０７−７９１１
（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．３１５，６４１
（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｖｏｌ．１３（１６），５８６９（１９８５）〕。
これらの報告は２種の遺伝子の塩基配列から推定される
１５９個のアミノ酸配列を有する「ＩＬ−１α」と１５
３個のアミノ酸からなる「ＩＬ−１β」を記している。
しかしながら、従来よりコンデイシヨンド メデイウム
（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）もしくは部
分精製したと報告されるものの前述の生理活性と、上記
塩基配列から推定されるポリペプチドとの関連は、今尚
明らかにはされていない。また、上記公知の生理活性物
質としてのＩＬ−１は、内因性の発熱物質（ｅｎｄｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎ：ＥＰ）とも同一物質で
あるとされ、発熱性を示すことが知られている〔Ｎａｔ
ｕｒｅ，３０４，４４９（１９８３）；Ｃｅｌｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，６３，１６４（１９８１）；Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．，１５０，７０９（１９７９）；Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１３０，（６）２７０８（１９８３）；
同，１３２（３）１３１１（１９８４）等参照〕。この
事実から、従来の生理活性としてのＩＬ−１はもとよ
り、仮に物質として均一なＩＬ−１が提供されたとして
も、その医薬用途への適用は、極めて困難とされてい
る。本発明は医薬用途に有効に使用できる新しい有用な
ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドを提供しようとす
るものである。本発明は新しいＩＬ−１β誘導体である
ポリペプチドの医薬用途を提供しようとするものであ
る。本発明は新しいＩＬ−１β誘導体をコードする遺伝
子及びこれを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−１β誘導
体であるポリペプチドを製造する方法を提供しようとす
るものである。本発明はまた均質なＩＬ−１β自身の新
しい医薬用途を提供しようとするものである。上記本発
明の目的及びそれら以外の本発明の目的は以下の記載に
より明かにする。本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリペプ
チド）はインターロイキン−１βの下記（Ａ）式で表わ
されるアミノ酸配列に於て、式（Ａ）
【化６】 ａ）１位Ａｌａ、３位Ｖａｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅ
ｒ、８位Ｃｙｓ、１１位Ａｒｇ、３０位Ｈｉｓ、７１位
Ｃｙｓ、９３位Ｌｙｓ、９７位Ｌｙｓ、９８位Ａｒｇ、
９９位Ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２
１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒから選ばれた少なくとも
１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミノ
酸で置換されていること、 ｂ）１位のＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されて
いること（但し上記ａに記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａ
ｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅｒ及び８位Ｃｙｓから成る群
から選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つが欠失されて
いる場合を除く）、 ｃ）１０３位のＬｙｓから１５３位のＳｅｒに至るアミ
ノ酸配列又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠
失されていること（但し上記ａに記載の１０３位Ｌｙ
ｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅ
ｒから成る群から選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つ
が欠失されている場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Ｍｅｔ又は下記式（Ｂ）で示
される１′位のＭｅｔから１１６′位のＡｓｐに至るア
ミノ酸配列若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列
が付加されていること、式（Ｂ）
ｒ、８位Ｃｙｓ、１１位Ａｒｇ、３０位Ｈｉｓ、７１位
Ｃｙｓ、９３位Ｌｙｓ、９７位Ｌｙｓ、９８位Ａｒｇ、
９９位Ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２
１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒから選ばれた少なくとも
１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミノ
酸で置換されていること、 ｂ）１位のＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されて
いること（但し上記ａに記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａ
ｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅｒ及び８位Ｃｙｓから成る群
から選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つが欠失されて
いる場合を除く）、 ｃ）１０３位のＬｙｓから１５３位のＳｅｒに至るアミ
ノ酸配列又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠
失されていること（但し上記ａに記載の１０３位Ｌｙ
ｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅ
ｒから成る群から選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つ
が欠失されている場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Ｍｅｔ又は下記式（Ｂ）で示
される１′位のＭｅｔから１１６′位のＡｓｐに至るア
ミノ酸配列若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列
が付加されていること、式（Ｂ）
【化７】 というａ）〜ｄ）の条件の少くとも１つを充足する改変
されたアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる
（但し、少くとも７１位Ｃｙｓが他のアミノ酸で置換さ
れたポリペプチドを除く）。上記及び以下の本明細書に
於けるアミノ酸及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ
及びＩＵＡＣ−ＩＵＢによる命名法又は規則に於ける略
号乃至当該分野で慣用されている略号による表示法に従
うものとする。また塩基配列に於ける核酸の表示も同様
とする。アミノ酸の数又は位置は、欠落及び付加がある
場合であっても、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前
記式（Ａ）アミノ酸配列に従って表示する。但しアミノ
酸位置を示す数値のうちダツシユを付したものは式
（Ｂ）のアミノ酸配列に従う。本発明のＩＬ−１β誘導
体は、ＩＬ−１βの前記式Ａ）に示されるアミノ酸配列
において、上記ａ）〜ｄ）の要件の１つ又は２以上を組
み合わせて充足するアミノ酸配列を含有する新規なポリ
ペプチドである。好ましい誘導体は前記要件ａ）〜ｃ）
の少くとも１つを充足するアミノ酸配列を有するもの及
びａ）〜ｃ）の少くとも１つの要件とｄ）の要件とを同
時に満足するアミノ酸配列を有するものである。本発明
のＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドの好ましい具体
例を挙げると次の通りである。 １）少くとも１位Ａｌａが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ２）少くとも３位Ｖａｌが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ３）少くとも４位Ａｒｇが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ４）少くとも５位Ｓｅｒが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ５）少くとも８位Ｃｙｓが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ６）少くとも１１位Ａｒｇが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ７）少くとも３０位Ｈｉｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ８）少くとも７１位Ｃｙｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ９）少くとも９３位Ｌｙｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 １０）少くとも９７位Ｌｙｓが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １１）少くとも９８位Ａｒｇが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １２）少くとも９９位Ｐｈｅが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １３）少くとも１０３位Ｌｙｓが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １４）少くとも１２０位Ｔｒｐが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １５）少くとも１２１位Ｔｙｒが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １６）少くとも１５３位Ｓｅｒが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １７）１位のＡｌａから３位のＶａｌに至るアミノ酸配
列、１位のＡｌａから６位のＬｅｕに至るアミノ酸配列
又は１位のＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
が少くとも欠失されているポリペプチド。 １８）１５１位Ｖａｌから１５３位Ｓｅｒに至るアミノ
酸配列、１４９位Ｇｌｎから１５３位Ｓｅｒに至るアミ
ノ酸配列、１４５位Ａｓｐから１５３位Ｓｅｒに至るア
ミノ酸配列、１４１位Ｇｌｎから１５３位Ｓｅｒに至る
アミノ酸配列、１２１位Ｔｙｒから１５３位Ｓｅｒに至
るアミノ酸配列又は１０３位Ｌｙｓから１５３位Ｓｅｒ
に至るアミノ酸配列が少くとも欠失されているポリペプ
チド。 １９）式（Ａ）のＮ末端にＭｅｔ、式（Ｂ）で表わされ
るアミノ酸配列７７′位のＭｅｔから１１６′位Ａｓｐ
に至るアミノ酸配列、７１′位Ｍｅｔから１１６′位Ａ
ｓｐに至るアミノ酸配列、３２′位Ｍｅｔから１１６′
位Ｓｅｒに至るアミノ酸配列又は１′位Ｍｅｔから１１
６′位Ａｓｐに至るアミノ酸配列を少くとも有するポリ
ペプチド。 上記本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βのアミノ
酸配列の特定位置の特定アミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含するが、
この置換を行い得る他のアミノ酸は、人体蛋白質を構成
するα−アミノ酸であれば、いずれでもよいが、中性ア
ミノ酸であるのが好適である。但し、Ｃｙｓは、そのＳ
Ｈ基に基づいて、分子内又は分子間ジスルフイド結合を
形成することがあり、これを考慮すれば該アミノ酸はＣ
ｙｓ以外の上記アミノ酸であるのが好ましい。特に好ま
しいものとして例えば４位Ａｒｇの場合はＧｌｙを、８
位Ｃｙｓの場合はＳｅｒ又はＡｌａを、１１位Ａｒｇの
場合はＧｌｎを、３０位Ｈｉｓの場合はＴｙｒを、７１
位Ｃｙｓの場合はＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌを、９３位
Ｌｙｓの場合はＬｅｕを、９８位Ａｒｇの場合はＬｅｕ
を、１０３位Ｌｙｓの場合はＧｌｎを、１２０位Ｔｒｐ
の場合はＡｒｇを、１２１位Ｔｙｒの場合はＧｌｎを、
それぞれ好ましいものとして例示することができる。本
発明のＩＬ−１β誘導体ならびに本明細書に記載の方法
に従い得られる均質なＩＬ−１βは、例えばＬＡＦ活
性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）、即ち腫瘍細
胞に対して特異的にその増殖を抑制する活性、コロニー
刺激因子（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆ
ａｃｔｏｒ：ＣＳＦ）、インターフエロン（ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ：ＩＦＮ）、インターロイキン２（Ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ−２；ＩＬ−２）、インターロイキン３
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３：ＩＬ−３）等の種々の
サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）類の産生促進活性、
即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイン類の
産生を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に例えば
関節炎モデル動物に投与することによって関節炎の進行
を効果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、即ち骨
髄移植時の放射線全身照射、癌治療等における放射線照
射、放射線事故時における生体障害乃至は重篤な副作用
等を予防する作用乃至防止する作用等を有している。本
発明誘導体は上記各活性のいずれか少なくともひとつの
点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低く副作
用が少ない点で優れている。従って本発明誘導体ならび
に上記の均質なＩＬ−１βは例えば抗体産生促進やワク
チンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例えばＣ
ＳＦ、ＩＬ−２及びＩＬ−３等のサイトカイン産生促進
剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品として有用
である。殊に上記均質なＩＬ−１β自身が関節炎等の炎
症に著効を示すという本発明による新たな知見は、従来
ＩＬ−１が炎症をメデイエートし、その惹起に関与する
とされていた事実によれば、おどろくべきことてある。
また、本発明誘導体は記各活性のいずれか少なくともひ
とつの点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低
く副作用が少ない点で優れている。とりわけ、本発明誘
導体は、ＣＳＦ産生促進剤として有効であり、これをヒ
トに投与するときには、ウィルス感染や抗原抗体反応等
の危険性を生じることなく、癌化学療法や放射線療法後
の骨髄低形成による顆粒球減少を有効に回復できる（顆
粒球減少治療剤）。上記ＣＳＦ産生促進剤は、またその
本来のＣＳＦ産生促進作用により、ＣＳＦの作用に基づ
く各種疾病の予防及び治療剤としても有効に利用でき
る。例えば、ＣＳＦは顆粒球やマクロファージの機能を
促進させる作用がある〔ロベッツら（Ｌｏｐｅｚ，Ａ．
Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，
２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈａｎｄａｍ，
Ｅ．ｅｔ ａｌ．），同１２２，１１３４（１９７９）
及びバダスら（Ｖａｄａｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．），
同１３０，７９５（１９８３）〕ので、種々の感染症の
予防及び治療剤として臨床応用が期待されており、上記
ＣＳＦ産生促進剤も同様に臨床応用が期待される。殊
に、近年生体防御能が低下乃至障害された個体（ｃｏｍ
ｐｒｏｍｉｓｅｄｈｏｓｔ）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染
症（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
或いは ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、
臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）セラティア（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ）等のグラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘ，ＨＳＶ）、バリセラ−ゾースタ（Ｖａ
ｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ，ＶＺＶ）、サイトメガ
ロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭ
Ｖ）等のウイルス、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ノカルディア（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ）等の真菌、カリニ原
虫（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ト
キソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）
等の原虫等であり、現用の抗生物質中には、之等の病原
菌に対して充分な効果を奏し難く、該日和見感染症に対
する新しい薬剤の研究開発が切望されている。本発明誘
導体は、かかる日和見感染症の予防及び治療剤としても
有用であり、特にかかる日和見感染症が高頻度に見られ
る抗癌剤投与時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄移植
時における各種の感染症、例えばガンジダ症、クリプト
コックス症、アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感
染症、ウィルス感染症、サイトメロウィルス肺炎、之等
の合併症等の予防及び治療剤として有用なものである。
更に本発明誘導体ならびに上記のＩＬ−１βは、上記医
薬用途以外に、そのサイトカイン産生促進活性に基づい
て、例えば細胞株からの各種有用サイトカインのインビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）製造に際して極めて有効に使
用し得る。かかる細胞株からの天然型サイトカインの製
造は、ことに糖蛋白質であるサイトカインにおいて着目
されており、効率的にかつ大量に有用サイトカインを収
得することができる。本発明誘導体中、少くとも７１位
Ｃｙｓを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃｙｓを
他のアミノ酸、例えばＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ等で置換
したものは、高活性を示す。また、少くとも４位Ａｒｇ
又は少くとも８位Ｃｙｓを置換乃至は欠失させた本発明
誘導体、及び少くとも１０３位以降の少なくともひとつ
のアミノ酸を欠失させた本発明誘導体は、いずれもプロ
スタグランジンＥ（ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従っ
て発熱作用等の副作用ならびに毒性がより少ない特徴を
有し、更に少くとも４位Ａｒｇを置換乃至は欠失させた
本発明誘導体は、ＧＩＦならびにＬＡＦ活性に比較し
て、ＣＳＦ産生促進活性ならびに抗炎症活性がより強い
特徴を有している。更に、本発明誘導体中、式（Ａ）の
Ｎ末端に少くとも上記特定のアミノ酸もしくはポリペプ
チドが付加したものは、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比
してＣＳＦ産生促進作用及び抗炎症作用がより高い特徴
を有し、しかも毒性が低く且つ作用の持続性の点で医薬
品として、殊に経口剤乃至は座剤として利用する場合
に、より有効である。更に、本発明誘導体、ことに少く
とも８位Ｃｙｓ及び／又は７１Ｃｙｓを置換乃至は欠失
させたもの、特に上記Ｃｙｓを他のアミノ酸、例えばＳ
ｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ等で置換したものは、種々の条件
下におけるＩＬ−１受容体への結合性において優れてい
る。尚、本発明誘導体の内でＩＬ−１βに比しその分子
中にＣｙｓをより少なく含むか又は含まないものは、Ｃ
ｙｓのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の不要
な形成を考慮すれば、より好ましいものである。本発明
のポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法により製造
することができる。即ち、前記本発明に係わる特定のポ
リペプチドをコードする遺伝子を利用し、これを微生物
のベクターに組込んで該微生物細胞内で、複製、転写、
翻訳させることによって製造することができる。この方
法は、特に大量生産が可能である点より有利である。上
記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例え
ばホスフアイト トリエステル法〔ネイチヤー（Ｎａｔ
ｕｒｅ），３１０，１０５（１９８４）〕等の常法に従
って、核酸の化学合成により全合成することもできる
が、ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコードする遺伝子
を利用するのが簡便であり、該遺伝子より、上記化学合
成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ酸配列を
コードする核酸配列に改変することにより容易に製造で
きる。ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺伝子は
公知（記述）であり、我々も我々の先の出願（特願昭６
０−１３８２８１号）に記したようにＩＬ−１βをコー
ドする遺伝子を得、これを用いて遺伝子工学的手法でＩ
Ｌ−１βを収得するに成功した。之等の一連の遺伝子工
学的手法は後記の参考例において明らかにする。上記核
酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよく、目
的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実施され
る〔遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）が参照
される〕。例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を
目的とする制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等
の常套手段等が採用でき、それら酵素は市販品として容
易に入手できる。之等各操作における遺伝子乃至核酸の
単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳動法等に従
えばよい。また得られる遺伝子の複製は、一部後述する
ように通常のベクターを利用する方法に従えばよい。ま
た、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合成
リンカーは上記した化学合成により容易に製造できる。
尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドンは自
体公知でありまたその選択は任意でよく、例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えばよい
〔Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．，９，４３−７
４（１９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを一
部改変するには、例えば常法どうり、１５〜３０マー程
度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチド
からなるプライマーを用いたサイトースペシフィック
ミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８１，５６６２−５６６６（１９８
４）〕等の方法を採用することができる。上記方法によ
り得られる所望の遺伝子は、例えばマキサム−ギルバー
トの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ．Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍ．，６５，４９９−５６０（１９８
０）〕やＭ１３フアージを用いるジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒ
ａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６（１９８
２）〕等により、その塩基配列の決定及び確認を行なう
ことができる。上記操作及び方法の具体例は、後記参考
例及び実施例に記述するが、該方法は特に限定されず、
当業界において周知の各種方法のいずれを採用してもよ
い。かくして、本発明によれば前記した特定のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子も
提供される（以下この遺伝子を「本発明遺伝子」とい
う）。本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝子（本
発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝子組換
え技術に従い製造できる。より詳細には、上記本発明遺
伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作
成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転
換体を培養すればよい。ここで宿主細胞としては、真核
生物及び原核生物のいずれをも用いることができる。該
真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含ま
れ、脊推動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣ
ｏｓ細胞〔Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３，１７
５−１８２（１９８１）〕やチヤイニーズ．ハムスター
卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｇ．Ｕｒ
ｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７７，４２１
６−４２２０（１９８０）〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとる遺伝子の上流に
位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリ
アデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使
用でき、これは更に必要により複製起源を保有していて
もよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期
プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｓ．Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉ，Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇｎ ａｎｄ Ｐ．Ｂｅ
ｒｇ，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，１（９），８５
４−８６４〕等を例示できるが、これに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用でき
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを
持つｐＡＭ８２〔Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａ
ｌ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，８０，１−５（１９８３）〕等を好ましく利用でき
る。原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般に
よく用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複
製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に
本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロ
モーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩
基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発
現プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌
としては、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターと
しては一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに
限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも
利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトフ
アン・プロモーター、ＰＬプロモーター、ｌａｃ プロ
モーター、ｌｐｐ プロモーター等を使用することがで
き、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させることが
できる。トリプトフアン．プロモーターを用いる場合を
例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトフア
ン．プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１
〔今本文男、代謝、Ｖｏｌ．２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ
ｌａ１部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポ
リペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。
尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ
やβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系によ
ることもできる。かくして得られる発現ベクターの宿主
細胞への導入及びこれによる形質転換の方法としては、
一般に用いられている方法、例えば主として対数増殖期
にある細胞を集め、ＣａＣｌ２処理して自然にＤＮＡを
取り込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法
等を採用できる。上記方法においては、通常知られてい
るように形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣ
ｌ２やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。また、
宿主細胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト化して
から形質転換させる方法も採用することができる。かく
して得られる所望の形質転換株は、常法に従い培養する
ことができ、該培養により、所望のポリペプチドが生
産、蓄積される。該培養に用いられる培地としては、通
常の細胞培養に慣用される各種の培地のいすれでもよ
く、その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９
培地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示でき
る。尚、上記トリプトフアン・プロモーターを用いた場
合には、一般にプロモーターが働くようにするためにカ
ザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を用いて培養
することができ、該培地中には培養の適当な時期にイン
ドールアクリル酸等のトリプトフアン・プロモーターの
働きを強めるための薬剤を添加することもできる。この
ようにして得られる活性物を含有する培養物からの目的
ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチドの精製、単離は
常法に従って行なうことができる。尚、本発明ポリペプ
チドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧シヨ
ツク法等の温和な条件を採用するのが、その高次構造保
持の面からより好ましい。上記精製、単離は、例えば当
該ポリペプチドの物理、化学的性質を利用した各種の処
理操作に従い実施することができる〔例えば「生化学デ
ーターブツクｌｌ」ｐｐ１１７５〜１２５９、第１版第
１印刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人
発行参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の
蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマト
グラフイー（ゲル濾過）、液体クロマトグラフイー、遠
心分離、電気泳動、アフイニテイクロマトグラフイー、
透析法、之等の組合せ等を採用できる。より具体的に
は、上記操作は、例えば以下のごとくして実施できる。
即ち、まず培養上清より予め目的とするポリペプチドを
部分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタ
ノール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、過塩素酸（ＰＣ
Ａ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋白沈澱剤と
して用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透
析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等に
より行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、通常
のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。次い
で上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すことによ
り目的物質の活性が認められる画分を収得する。ここで
用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、例え
ばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロ
ースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、セル
ロース等を素材とするものをいずれも利用できる。之等
の具体例としては、セフアデツクスＧタイプ、同ＬＨタ
イプ、セフアロースタイプ、セフアクリルタイプ（以
上、フアルマシア社）、セルロフアイン（チツソ株式会
社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオーラド
社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ
（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示できる。目的と
するポリペプチドは、上記ゲル濾過により得られる活性
画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを用いた
アフイニテイークロマトグラフイー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ
法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフイー、
クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマトグラ
フイー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せに
より更に精製することができ、均質な物質として単離す
ることができる。上記クロマトフオーカシング法は、公
知の各種方法により実施できる。カラムとしては、例え
ばＰＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液と
しては、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液と
しては、例えばポリバツフアー７４（フアルマシア社
製）−塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。上記逆相高
速液体クロマトグラフイーは、例えばＣ４ハイボアー逆
相ＨＰＬＣカラム（バイオーラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）等を用いて、移動剤として
アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及
び之等の混合溶媒を用いて実施できる。かくして本発明
ＩＬ−１β誘導体（ポリペプチド）を単離、収得でき
る。ＩＬ−１βをコードする遺伝子から同種の遺伝子組
換え操作でＩＬ−１βを収得できる。得られる本発明ポ
リペプチド又はＩＬ−１βは、前述した如く優れた薬理
活性を有することから、前述した各種の医薬用途に有用
な医薬製剤とすることができる。斯かる医薬製剤にはた
とえば抗体産生やワクチン効果の増強並びに免疫不全症
の治療等の免疫刺激剤、抗腫瘍剤、サイトカイン類の産
生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤、日和見感染症
治療剤等が包含される。該医薬製剤は、通常本発明ポリ
ペプチド又はＩＬ−１βの薬理有効量と共に適当な医薬
製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。該
製剤担体としては使用形態に応じた製剤を調製するのに
通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊
剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用
できる。製剤組成物の形態は、これが本発明ポリペプチ
ド又はＩＬ−１βを効果的に含有する状態であれば、特
に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の
固剤であつてもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注
射剤形態とするのが好適である。またこれは使用前に適
当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とするこ
ともできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調
製され得る。得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。
されたアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる
（但し、少くとも７１位Ｃｙｓが他のアミノ酸で置換さ
れたポリペプチドを除く）。上記及び以下の本明細書に
於けるアミノ酸及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ
及びＩＵＡＣ−ＩＵＢによる命名法又は規則に於ける略
号乃至当該分野で慣用されている略号による表示法に従
うものとする。また塩基配列に於ける核酸の表示も同様
とする。アミノ酸の数又は位置は、欠落及び付加がある
場合であっても、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前
記式（Ａ）アミノ酸配列に従って表示する。但しアミノ
酸位置を示す数値のうちダツシユを付したものは式
（Ｂ）のアミノ酸配列に従う。本発明のＩＬ−１β誘導
体は、ＩＬ−１βの前記式Ａ）に示されるアミノ酸配列
において、上記ａ）〜ｄ）の要件の１つ又は２以上を組
み合わせて充足するアミノ酸配列を含有する新規なポリ
ペプチドである。好ましい誘導体は前記要件ａ）〜ｃ）
の少くとも１つを充足するアミノ酸配列を有するもの及
びａ）〜ｃ）の少くとも１つの要件とｄ）の要件とを同
時に満足するアミノ酸配列を有するものである。本発明
のＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドの好ましい具体
例を挙げると次の通りである。 １）少くとも１位Ａｌａが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ２）少くとも３位Ｖａｌが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ３）少くとも４位Ａｒｇが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ４）少くとも５位Ｓｅｒが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ５）少くとも８位Ｃｙｓが欠失されているか又は他のア
ミノ酸で置換されているポリペプチド。 ６）少くとも１１位Ａｒｇが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ７）少くとも３０位Ｈｉｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ８）少くとも７１位Ｃｙｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 ９）少くとも９３位Ｌｙｓが欠失されているか又は他の
アミノ酸で置換されているポリペプチド。 １０）少くとも９７位Ｌｙｓが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １１）少くとも９８位Ａｒｇが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １２）少くとも９９位Ｐｈｅが欠失されているか又は他
のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １３）少くとも１０３位Ｌｙｓが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １４）少くとも１２０位Ｔｒｐが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １５）少くとも１２１位Ｔｙｒが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １６）少くとも１５３位Ｓｅｒが欠失されているか又は
他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 １７）１位のＡｌａから３位のＶａｌに至るアミノ酸配
列、１位のＡｌａから６位のＬｅｕに至るアミノ酸配列
又は１位のＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
が少くとも欠失されているポリペプチド。 １８）１５１位Ｖａｌから１５３位Ｓｅｒに至るアミノ
酸配列、１４９位Ｇｌｎから１５３位Ｓｅｒに至るアミ
ノ酸配列、１４５位Ａｓｐから１５３位Ｓｅｒに至るア
ミノ酸配列、１４１位Ｇｌｎから１５３位Ｓｅｒに至る
アミノ酸配列、１２１位Ｔｙｒから１５３位Ｓｅｒに至
るアミノ酸配列又は１０３位Ｌｙｓから１５３位Ｓｅｒ
に至るアミノ酸配列が少くとも欠失されているポリペプ
チド。 １９）式（Ａ）のＮ末端にＭｅｔ、式（Ｂ）で表わされ
るアミノ酸配列７７′位のＭｅｔから１１６′位Ａｓｐ
に至るアミノ酸配列、７１′位Ｍｅｔから１１６′位Ａ
ｓｐに至るアミノ酸配列、３２′位Ｍｅｔから１１６′
位Ｓｅｒに至るアミノ酸配列又は１′位Ｍｅｔから１１
６′位Ａｓｐに至るアミノ酸配列を少くとも有するポリ
ペプチド。 上記本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１βのアミノ
酸配列の特定位置の特定アミノ酸が他のアミノ酸で置換
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含するが、
この置換を行い得る他のアミノ酸は、人体蛋白質を構成
するα−アミノ酸であれば、いずれでもよいが、中性ア
ミノ酸であるのが好適である。但し、Ｃｙｓは、そのＳ
Ｈ基に基づいて、分子内又は分子間ジスルフイド結合を
形成することがあり、これを考慮すれば該アミノ酸はＣ
ｙｓ以外の上記アミノ酸であるのが好ましい。特に好ま
しいものとして例えば４位Ａｒｇの場合はＧｌｙを、８
位Ｃｙｓの場合はＳｅｒ又はＡｌａを、１１位Ａｒｇの
場合はＧｌｎを、３０位Ｈｉｓの場合はＴｙｒを、７１
位Ｃｙｓの場合はＳｅｒ、Ａｌａ又はＶａｌを、９３位
Ｌｙｓの場合はＬｅｕを、９８位Ａｒｇの場合はＬｅｕ
を、１０３位Ｌｙｓの場合はＧｌｎを、１２０位Ｔｒｐ
の場合はＡｒｇを、１２１位Ｔｙｒの場合はＧｌｎを、
それぞれ好ましいものとして例示することができる。本
発明のＩＬ−１β誘導体ならびに本明細書に記載の方法
に従い得られる均質なＩＬ−１βは、例えばＬＡＦ活
性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活性）、即ち腫瘍細
胞に対して特異的にその増殖を抑制する活性、コロニー
刺激因子（Ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆ
ａｃｔｏｒ：ＣＳＦ）、インターフエロン（ｉｎｔｅｒ
ｆｅｒｏｎ：ＩＦＮ）、インターロイキン２（Ｉｎｔｅ
ｒｌｅｕｋｉｎ−２；ＩＬ−２）、インターロイキン３
（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３：ＩＬ−３）等の種々の
サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）類の産生促進活性、
即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイン類の
産生を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に例えば
関節炎モデル動物に投与することによって関節炎の進行
を効果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、即ち骨
髄移植時の放射線全身照射、癌治療等における放射線照
射、放射線事故時における生体障害乃至は重篤な副作用
等を予防する作用乃至防止する作用等を有している。本
発明誘導体は上記各活性のいずれか少なくともひとつの
点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低く副作
用が少ない点で優れている。従って本発明誘導体ならび
に上記の均質なＩＬ−１βは例えば抗体産生促進やワク
チンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例えばＣ
ＳＦ、ＩＬ−２及びＩＬ−３等のサイトカイン産生促進
剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品として有用
である。殊に上記均質なＩＬ−１β自身が関節炎等の炎
症に著効を示すという本発明による新たな知見は、従来
ＩＬ−１が炎症をメデイエートし、その惹起に関与する
とされていた事実によれば、おどろくべきことてある。
また、本発明誘導体は記各活性のいずれか少なくともひ
とつの点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低
く副作用が少ない点で優れている。とりわけ、本発明誘
導体は、ＣＳＦ産生促進剤として有効であり、これをヒ
トに投与するときには、ウィルス感染や抗原抗体反応等
の危険性を生じることなく、癌化学療法や放射線療法後
の骨髄低形成による顆粒球減少を有効に回復できる（顆
粒球減少治療剤）。上記ＣＳＦ産生促進剤は、またその
本来のＣＳＦ産生促進作用により、ＣＳＦの作用に基づ
く各種疾病の予防及び治療剤としても有効に利用でき
る。例えば、ＣＳＦは顆粒球やマクロファージの機能を
促進させる作用がある〔ロベッツら（Ｌｏｐｅｚ，Ａ．
Ｆ．ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，
２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈａｎｄａｍ，
Ｅ．ｅｔ ａｌ．），同１２２，１１３４（１９７９）
及びバダスら（Ｖａｄａｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．），
同１３０，７９５（１９８３）〕ので、種々の感染症の
予防及び治療剤として臨床応用が期待されており、上記
ＣＳＦ産生促進剤も同様に臨床応用が期待される。殊
に、近年生体防御能が低下乃至障害された個体（ｃｏｍ
ｐｒｏｍｉｓｅｄｈｏｓｔ）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染
症（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
或いは ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、
臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）セラティア（Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ）等のグラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘ，ＨＳＶ）、バリセラ−ゾースタ（Ｖａ
ｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ，ＶＺＶ）、サイトメガ
ロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭ
Ｖ）等のウイルス、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ノカルディア（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ）等の真菌、カリニ原
虫（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ト
キソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）
等の原虫等であり、現用の抗生物質中には、之等の病原
菌に対して充分な効果を奏し難く、該日和見感染症に対
する新しい薬剤の研究開発が切望されている。本発明誘
導体は、かかる日和見感染症の予防及び治療剤としても
有用であり、特にかかる日和見感染症が高頻度に見られ
る抗癌剤投与時、即ち急性白血病の化学療法や骨髄移植
時における各種の感染症、例えばガンジダ症、クリプト
コックス症、アスペルギルス症、接合菌症、黒色真菌感
染症、ウィルス感染症、サイトメロウィルス肺炎、之等
の合併症等の予防及び治療剤として有用なものである。
更に本発明誘導体ならびに上記のＩＬ−１βは、上記医
薬用途以外に、そのサイトカイン産生促進活性に基づい
て、例えば細胞株からの各種有用サイトカインのインビ
トロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）製造に際して極めて有効に使
用し得る。かかる細胞株からの天然型サイトカインの製
造は、ことに糖蛋白質であるサイトカインにおいて着目
されており、効率的にかつ大量に有用サイトカインを収
得することができる。本発明誘導体中、少くとも７１位
Ｃｙｓを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃｙｓを
他のアミノ酸、例えばＳｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ等で置換
したものは、高活性を示す。また、少くとも４位Ａｒｇ
又は少くとも８位Ｃｙｓを置換乃至は欠失させた本発明
誘導体、及び少くとも１０３位以降の少なくともひとつ
のアミノ酸を欠失させた本発明誘導体は、いずれもプロ
スタグランジンＥ（ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従っ
て発熱作用等の副作用ならびに毒性がより少ない特徴を
有し、更に少くとも４位Ａｒｇを置換乃至は欠失させた
本発明誘導体は、ＧＩＦならびにＬＡＦ活性に比較し
て、ＣＳＦ産生促進活性ならびに抗炎症活性がより強い
特徴を有している。更に、本発明誘導体中、式（Ａ）の
Ｎ末端に少くとも上記特定のアミノ酸もしくはポリペプ
チドが付加したものは、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比
してＣＳＦ産生促進作用及び抗炎症作用がより高い特徴
を有し、しかも毒性が低く且つ作用の持続性の点で医薬
品として、殊に経口剤乃至は座剤として利用する場合
に、より有効である。更に、本発明誘導体、ことに少く
とも８位Ｃｙｓ及び／又は７１Ｃｙｓを置換乃至は欠失
させたもの、特に上記Ｃｙｓを他のアミノ酸、例えばＳ
ｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ等で置換したものは、種々の条件
下におけるＩＬ−１受容体への結合性において優れてい
る。尚、本発明誘導体の内でＩＬ−１βに比しその分子
中にＣｙｓをより少なく含むか又は含まないものは、Ｃ
ｙｓのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の不要
な形成を考慮すれば、より好ましいものである。本発明
のポリペプチドは、例えば遺伝子工学的手法により製造
することができる。即ち、前記本発明に係わる特定のポ
リペプチドをコードする遺伝子を利用し、これを微生物
のベクターに組込んで該微生物細胞内で、複製、転写、
翻訳させることによって製造することができる。この方
法は、特に大量生産が可能である点より有利である。上
記方法において用いられる遺伝子は、通常の方法、例え
ばホスフアイト トリエステル法〔ネイチヤー（Ｎａｔ
ｕｒｅ），３１０，１０５（１９８４）〕等の常法に従
って、核酸の化学合成により全合成することもできる
が、ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコードする遺伝子
を利用するのが簡便であり、該遺伝子より、上記化学合
成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ酸配列を
コードする核酸配列に改変することにより容易に製造で
きる。ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺伝子は
公知（記述）であり、我々も我々の先の出願（特願昭６
０−１３８２８１号）に記したようにＩＬ−１βをコー
ドする遺伝子を得、これを用いて遺伝子工学的手法でＩ
Ｌ−１βを収得するに成功した。之等の一連の遺伝子工
学的手法は後記の参考例において明らかにする。上記核
酸（塩基）配列の改変操作も公知方法に従えばよく、目
的とするポリペプチドのアミノ酸配列に応じて実施され
る〔遺伝子工学的手法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）が参照
される〕。例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等を
目的とする制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチ
ドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理等
の常套手段等が採用でき、それら酵素は市販品として容
易に入手できる。之等各操作における遺伝子乃至核酸の
単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳動法等に従
えばよい。また得られる遺伝子の複製は、一部後述する
ように通常のベクターを利用する方法に従えばよい。ま
た、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合成
リンカーは上記した化学合成により容易に製造できる。
尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドンは自
体公知でありまたその選択は任意でよく、例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えばよい
〔Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．，９，４３−７
４（１９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを一
部改変するには、例えば常法どうり、１５〜３０マー程
度の、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチド
からなるプライマーを用いたサイトースペシフィック
ミュータジエネシス（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８１，５６６２−５６６６（１９８
４）〕等の方法を採用することができる。上記方法によ
り得られる所望の遺伝子は、例えばマキサム−ギルバー
トの化学修飾法〔Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ．Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍ．，６５，４９９−５６０（１９８
０）〕やＭ１３フアージを用いるジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒ
ａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６（１９８
２）〕等により、その塩基配列の決定及び確認を行なう
ことができる。上記操作及び方法の具体例は、後記参考
例及び実施例に記述するが、該方法は特に限定されず、
当業界において周知の各種方法のいずれを採用してもよ
い。かくして、本発明によれば前記した特定のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードする新規な遺伝子も
提供される（以下この遺伝子を「本発明遺伝子」とい
う）。本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝子（本
発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝子組換
え技術に従い製造できる。より詳細には、上記本発明遺
伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮＡを作
成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転
換体を培養すればよい。ここで宿主細胞としては、真核
生物及び原核生物のいずれをも用いることができる。該
真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含ま
れ、脊推動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣ
ｏｓ細胞〔Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３，１７
５−１８２（１９８１）〕やチヤイニーズ．ハムスター
卵巣細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｇ．Ｕｒ
ｌａｕｂ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７７，４２１
６−４２２０（１９８０）〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとる遺伝子の上流に
位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリ
アデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使
用でき、これは更に必要により複製起源を保有していて
もよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期
プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｓ．Ｓｕｂ
ｒａｍａｎｉ，Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇｎ ａｎｄ Ｐ．Ｂｅ
ｒｇ，Ｍｏｌ，Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．，１（９），８５
４−８６４〕等を例示できるが、これに限定されない。
また真核微生物としては酵母が一般によく用いられてお
り、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用でき
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを
持つｐＡＭ８２〔Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａ
ｌ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，８０，１−５（１９８３）〕等を好ましく利用でき
る。原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般に
よく用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複
製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に
本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロ
モーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩
基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した発
現プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌
としては、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターと
しては一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに
限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも
利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトフ
アン・プロモーター、ＰＬプロモーター、ｌａｃ プロ
モーター、ｌｐｐ プロモーター等を使用することがで
き、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させることが
できる。トリプトフアン．プロモーターを用いる場合を
例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトフア
ン．プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１
〔今本文男、代謝、Ｖｏｌ．２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ
ｌａ１部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポ
リペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。
尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラクトシダーゼ
やβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白質発現系によ
ることもできる。かくして得られる発現ベクターの宿主
細胞への導入及びこれによる形質転換の方法としては、
一般に用いられている方法、例えば主として対数増殖期
にある細胞を集め、ＣａＣｌ２処理して自然にＤＮＡを
取り込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法
等を採用できる。上記方法においては、通常知られてい
るように形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣ
ｌ２やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。また、
宿主細胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト化して
から形質転換させる方法も採用することができる。かく
して得られる所望の形質転換株は、常法に従い培養する
ことができ、該培養により、所望のポリペプチドが生
産、蓄積される。該培養に用いられる培地としては、通
常の細胞培養に慣用される各種の培地のいすれでもよ
く、その具体例としては、例えばＬ培地、Ｅ培地、Ｍ９
培地等及び之等に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地を例示でき
る。尚、上記トリプトフアン・プロモーターを用いた場
合には、一般にプロモーターが働くようにするためにカ
ザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を用いて培養
することができ、該培地中には培養の適当な時期にイン
ドールアクリル酸等のトリプトフアン・プロモーターの
働きを強めるための薬剤を添加することもできる。この
ようにして得られる活性物を含有する培養物からの目的
ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチドの精製、単離は
常法に従って行なうことができる。尚、本発明ポリペプ
チドを宿主から抽出するに当っては、例えば浸透圧シヨ
ツク法等の温和な条件を採用するのが、その高次構造保
持の面からより好ましい。上記精製、単離は、例えば当
該ポリペプチドの物理、化学的性質を利用した各種の処
理操作に従い実施することができる〔例えば「生化学デ
ーターブツクｌｌ」ｐｐ１１７５〜１２５９、第１版第
１印刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人
発行参照〕。該方法としては、具体的には例えば通常の
蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマト
グラフイー（ゲル濾過）、液体クロマトグラフイー、遠
心分離、電気泳動、アフイニテイクロマトグラフイー、
透析法、之等の組合せ等を採用できる。より具体的に
は、上記操作は、例えば以下のごとくして実施できる。
即ち、まず培養上清より予め目的とするポリペプチドを
部分精製する。この部分精製は、例えばアセトン、メタ
ノール、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や酢酸、過塩素酸（ＰＣ
Ａ）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋白沈澱剤と
して用いる処理、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸ナトリウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透
析膜、平板膜、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等に
より行なわれる。之等の各処理の操作及び条件は、通常
のこの種方法のそれらと同様のものとすればよい。次い
で上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すことによ
り目的物質の活性が認められる画分を収得する。ここで
用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、例え
ばデキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロ
ースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル、セル
ロース等を素材とするものをいずれも利用できる。之等
の具体例としては、セフアデツクスＧタイプ、同ＬＨタ
イプ、セフアロースタイプ、セフアクリルタイプ（以
上、フアルマシア社）、セルロフアイン（チツソ株式会
社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオーラド
社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ
（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示できる。目的と
するポリペプチドは、上記ゲル濾過により得られる活性
画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを用いた
アフイニテイークロマトグラフイー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ
法、ＳＰ法等のイオン交換カラムクロマトグラフイー、
クロマトフオーカシング法、逆相高速液体クロマトグラ
フイー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せに
より更に精製することができ、均質な物質として単離す
ることができる。上記クロマトフオーカシング法は、公
知の各種方法により実施できる。カラムとしては、例え
ばＰＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液と
しては、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液と
しては、例えばポリバツフアー７４（フアルマシア社
製）−塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。上記逆相高
速液体クロマトグラフイーは、例えばＣ４ハイボアー逆
相ＨＰＬＣカラム（バイオーラド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）等を用いて、移動剤として
アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及
び之等の混合溶媒を用いて実施できる。かくして本発明
ＩＬ−１β誘導体（ポリペプチド）を単離、収得でき
る。ＩＬ−１βをコードする遺伝子から同種の遺伝子組
換え操作でＩＬ−１βを収得できる。得られる本発明ポ
リペプチド又はＩＬ−１βは、前述した如く優れた薬理
活性を有することから、前述した各種の医薬用途に有用
な医薬製剤とすることができる。斯かる医薬製剤にはた
とえば抗体産生やワクチン効果の増強並びに免疫不全症
の治療等の免疫刺激剤、抗腫瘍剤、サイトカイン類の産
生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤、日和見感染症
治療剤等が包含される。該医薬製剤は、通常本発明ポリ
ペプチド又はＩＬ−１βの薬理有効量と共に適当な医薬
製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。該
製剤担体としては使用形態に応じた製剤を調製するのに
通常慣用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊
剤、表面活性剤等の賦形剤乃至は希釈剤をいずれも使用
できる。製剤組成物の形態は、これが本発明ポリペプチ
ド又はＩＬ−１βを効果的に含有する状態であれば、特
に限定はなく、例えば錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の
固剤であつてもよいが、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注
射剤形態とするのが好適である。またこれは使用前に適
当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とするこ
ともできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に従い調
製され得る。得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。
【実施例】以下、ＩＬ−１βを製造する参考例及び本発
明誘導体を製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳し
く説明する。下記各例では、本発明誘導体に関して、之
等を簡略化するため、以下の略号を付した。また、以下
の各例において各種生理活性は、次の方法により測定し
た。
明誘導体を製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳し
く説明する。下記各例では、本発明誘導体に関して、之
等を簡略化するため、以下の略号を付した。また、以下
の各例において各種生理活性は、次の方法により測定し
た。
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】 ＜活性の測定＞ （１）ＩＬ−１活性の測定 オツペンハインら（Ｊ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｎ ｅｔ
ａｌ）の方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６，１４
６６（１９７６）〕に従い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウスの
胸腺細胞を利用して測定したＬＡＦ活性により表示し
た。 （２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
渥度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０４個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニユウト
ラルレツド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこの ＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。 参考例１ プラスミドＰＧＩＦ−αの製造 ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール．ハイパークの密度勾
配遠心法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，８０８
（１９７４）〕により末梢血リンパ球１．９×１０１０
個を得た。このリンパ球を４×１０８／ｍｌの細胞濃度
で、ヒト血清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁さ
せ、直径９ｃｍのシヤーレに分注後、５％炭酸ガス中、
３７℃で１時間培養した。その後、シヤーレ底部に付着
していない細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ
（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）０．５ｎｇ／ｍｌ及びＬ
ＰＳ（デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製）１０μｇ／ｍｌを
含むＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭
酸ガス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．
０２％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９×１０８個を得
た。 ｍＲＮＡの調製 上記で得たヒト付着性リンパ球を、６Ｍ−グアニジン
チオシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシアネ
ート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．
１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル
（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注
射針をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。この溶液に塩化セシウム（ＣｓＣｌ）１２ｇを添加
し、完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７
Ｍ ＣｓＣｌ（５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．１ＭＥＤＴ
Ａ）４ｍｌに重層し、ベツクマンローター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎＳＷ−４０Ｔｉｒｏｔｏｒ）にて２５℃で３１５０
０ｒｐｍで２０時間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレツ
トを７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭト
リスＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
し、１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び
２．２容のエタノールを加えて、−７０℃で１時間放置
した。４℃にて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し、Ｒ
ＮＡを回収し、ＴＥ溶液に溶解させた。 かくして付着
性リンパ球約９×１０８細胞から、全ＲＮＡ２５０μｇ
を得た。次に、上記で得たＲＮＡからｍＲＮＡを取得す
るために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を用い
てカラムクロマトグラフイーを行なつた。吸着は、１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．５ＭＮａＣｌ，
１ｍＭ ＥＤＴＡにて行ない、カラムを同溶液にて洗浄
後、１０ｍＭトリスＨＣｌ （ｐＨ７．５）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。この結果、溶出さ
れたｍＲＮＡ量は、１７．５μｇであつた。 ｃＤＮＡの調製 上記で得たｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを、インビトロで
合成し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１（１９８２）〕を用い
て組換え体ＤＮＡを作成し、これをエシエリヒア・コリ
にトランスホームして、ｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。各手法は次の通りである。 −１）ベクター・プライマーとリンカーＤＮＡの調製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫｐｎＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７
℃で５時間消化し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を
停止させた後、等容のフエノール−クロロホルム（１：
１）で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心
後、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ２，
０．１ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭｄＴＴＰ（α−３２
Ｐ−ｄＴＴＰ ０．５μＣｉを含む）２００μｌに溶解
させ、ターミナルトランスフエラーゼ（ＴＴａｓｅ，Ｐ
Ｌ）４００単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ １０μ
ｌとを加えて反応を停止させ、フエノール−クロロホル
ム抽出を４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを
回収した。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。
次に、上記で得たＤＮＡを、ＨｐａＩ（ＮＥＢ）１７単
位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロース（低融
点アガロース，ＢＲＬ，１％）電気泳動にて約２．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の回収を行なつた。電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド０．５μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、
ＵＶ照射下で約２．７ｋｂの断片を含むアガロースを切
り出し、５倍容の２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
−１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、６５℃で５分間でアガロー
スを溶解後、フエノール抽出、フエノール−クロロホル
ム（１：１）抽出及びクロロホルム抽出を順次行ない、
エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。 次にオリゴ
（ｄＡ）セルロースカラムクロマトグラフイーでベクタ
ープライマーＤＮＡの精製を行なつた。上記ＤＮＡを１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−１Ｍ Ｎａｃｌ緩衝液１ｍｌに溶かし、氷冷した後、
同緩衝液で平衡化したカラムに載せ、同緩衝液１ｍｌで
洗浄後、室温に戻して、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡで、ＤＮＡを溶出した。溶
出のピーク画分を集め、エタノール沈澱にてＤＮＡを回
収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ
ＥＤＴＡ１００μｌに溶かし、４℃で保存した。リンカ
ーＤＮＡを次の通り調製した。即ち、 ｐＢＲ３２２−
ＳＶ４０（０．１９〜０．３２）ＤＮＡ１００μｇを、
ＰｓｔＩ（ＮＥＢ）１２０単位で、３７℃下、１．５時
間消化後、反応を停止させ、フエノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈澱を行なつた。ＤＮＡを回収し、１
４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ ｍＭ
ＤＴＴ、０．２５ ｍＭ ｄＧＴＰ（１μＣｉのα−
３２Ｐ−ｄＧＴＰを含む）５０μｌに溶解し、ＴＴａｓ
ｅ６０単位を２０分間作用させた。この結果、１８残基
のｄＧ鎖が付加された。反応停止後、ＤＮＡを回収し、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）５０単位で消化し、前記し
たようにアガロース（１．８％）電気泳動で約０．２８
ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇのリンカーＤＮ
Ａを得た。−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラ
リーの作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μｌ（５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、３０ｍＭＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μＣｉα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、
５分間３７℃にて保温した。ＲＴａｓｅ（リバーストラ
ンスクリプターゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、
３７℃で１５分間反応させた後、再度ＲＴａｓｅ１０単
位を加え、更に１５分間保温した。０．２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐ８．０）２μｌと１０％ＳＤＳ１μｌとを加え
て反応を停止させた後、フエノール−クロロホルム抽出
を行ない、４Ｍ酢酸アンモニウム２０μｌとエタノール
８０μｌとを加え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室
温で融解し、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心
し、沈澱させた。沈澱を１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）２０μｌに溶かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９
μｌとエタノール８０μｌとを加えて再沈澱させた。沈
澱を回収し、７０％エタノールで洗つた後、１４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ｍＭＤＴＴ、
０．２μｇポリＡ及び６６μＭ〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ
（１０μＣｉ）１５μｌに溶解した。ＴＴａｓｅ（Ｐ，
Ｌ，）１８単位を加え、３７℃で５分間反応させた後、
０℃に急冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１．３μｌと１０
％ＳＤＳ０．６５μｌとで反応を停止させ、フエノール
−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なつた。沈
澱を遠心して回収後、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）４単
位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フエノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なつた。沈澱
を回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）及び１
ｍＭ ＥＤＴＡの１０μｌに溶かし、エタノール３μｌ
を加え、−２０℃で保存した。上記で得た試料１μｌを
リンカーＤＮＡ５ｎｇと共に、１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ１０μｌ中で、６５℃で２分間、次いで４２℃で３０
分間保温した後、０℃に冷却した。これに２０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ
β−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌ
エシエリヒア コリＤＮＡリガーゼの混合溶液を９０μ
ｌ加え、全液量を１００μｌとし、１２℃で一夜保存し
た。次いで、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ、 １０
ｍＭ ＮＡＤ ０．５６μｌ、エシエリヒア・コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社製）０．
５μｌ及びＲＮａｓｅ Ｈ（ＰＬ）０．２μｌを加え、
１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した後、−２０
℃で凍結保存した。エシエリヒア コリＨＢ１０１株
を、ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イ
ースト抽出物５ｇ及びＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ
５５０＝０．４５まで培養し、５分間氷冷後、４℃で８
０００ｒｐｍで５分間遠心して菌体を同収した。菌体の
ペレツトを氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ
ＲｂＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＭｎＣ
ｌ、１５％グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、
４℃、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた菌体
を、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホニ
ツクアシツド）、７５ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｒｂ
Ｃｌ、１５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて１５
分間保温して、コンピテント細胞を作製した。かくして
得られたコンピテント細胞は、その後−７０℃で保存し
た。凍結菌液を室温で融解し、４００μｌの菌液に対し
て上記ＤＮＡ試料２０μｌを加え、３０分間０℃に放置
した後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、再び０℃
で１〜２分間静置した。これにＬＢ培地２ｍｌを加え、
３７℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、
３７℃で６時間培養した後、５０μｇ／ｍｌになるよう
にアンピシリンを加え、更に一夜培養し、ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーは、５
０％グリセリン中で−２０℃にて保存した。 −３）合成プローブの作製 ＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する形質転換株の
選出のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相
補的な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により
合成した。
ａｌ）の方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１６，１４
６６（１９７６）〕に従い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウスの
胸腺細胞を利用して測定したＬＡＦ活性により表示し
た。 （２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
渥度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０４個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニユウト
ラルレツド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこの ＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。 参考例１ プラスミドＰＧＩＦ−αの製造 ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール．ハイパークの密度勾
配遠心法〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，８０８
（１９７４）〕により末梢血リンパ球１．９×１０１０
個を得た。このリンパ球を４×１０８／ｍｌの細胞濃度
で、ヒト血清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁さ
せ、直径９ｃｍのシヤーレに分注後、５％炭酸ガス中、
３７℃で１時間培養した。その後、シヤーレ底部に付着
していない細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ
（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）０．５ｎｇ／ｍｌ及びＬ
ＰＳ（デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製）１０μｇ／ｍｌを
含むＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭
酸ガス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．
０２％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９×１０８個を得
た。 ｍＲＮＡの調製 上記で得たヒト付着性リンパ球を、６Ｍ−グアニジン
チオシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシアネ
ート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．
１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル
（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注
射針をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断し
た。この溶液に塩化セシウム（ＣｓＣｌ）１２ｇを添加
し、完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７
Ｍ ＣｓＣｌ（５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．１ＭＥＤＴ
Ａ）４ｍｌに重層し、ベツクマンローター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎＳＷ−４０Ｔｉｒｏｔｏｒ）にて２５℃で３１５０
０ｒｐｍで２０時間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレツ
トを７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭト
リスＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解
し、１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び
２．２容のエタノールを加えて、−７０℃で１時間放置
した。４℃にて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し、Ｒ
ＮＡを回収し、ＴＥ溶液に溶解させた。 かくして付着
性リンパ球約９×１０８細胞から、全ＲＮＡ２５０μｇ
を得た。次に、上記で得たＲＮＡからｍＲＮＡを取得す
るために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を用い
てカラムクロマトグラフイーを行なつた。吸着は、１０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．５ＭＮａＣｌ，
１ｍＭ ＥＤＴＡにて行ない、カラムを同溶液にて洗浄
後、１０ｍＭトリスＨＣｌ （ｐＨ７．５）及び１ｍＭ
ＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。この結果、溶出さ
れたｍＲＮＡ量は、１７．５μｇであつた。 ｃＤＮＡの調製 上記で得たｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを、インビトロで
合成し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Ｏｋ
ａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１（１９８２）〕を用い
て組換え体ＤＮＡを作成し、これをエシエリヒア・コリ
にトランスホームして、ｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。各手法は次の通りである。 −１）ベクター・プライマーとリンカーＤＮＡの調製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫｐｎＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７
℃で５時間消化し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を
停止させた後、等容のフエノール−クロロホルム（１：
１）で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心
後、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得
られたＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ２，
０．１ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭｄＴＴＰ（α−３２
Ｐ−ｄＴＴＰ ０．５μＣｉを含む）２００μｌに溶解
させ、ターミナルトランスフエラーゼ（ＴＴａｓｅ，Ｐ
Ｌ）４００単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、
０．２５Ｍ ＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ １０μ
ｌとを加えて反応を停止させ、フエノール−クロロホル
ム抽出を４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを
回収した。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。
次に、上記で得たＤＮＡを、ＨｐａＩ（ＮＥＢ）１７単
位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロース（低融
点アガロース，ＢＲＬ，１％）電気泳動にて約２．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の回収を行なつた。電気泳動後、エチジ
ウムブロマイド０．５μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、
ＵＶ照射下で約２．７ｋｂの断片を含むアガロースを切
り出し、５倍容の２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
−１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、６５℃で５分間でアガロー
スを溶解後、フエノール抽出、フエノール−クロロホル
ム（１：１）抽出及びクロロホルム抽出を順次行ない、
エタノール沈澱にてＤＮＡを回収した。 次にオリゴ
（ｄＡ）セルロースカラムクロマトグラフイーでベクタ
ープライマーＤＮＡの精製を行なつた。上記ＤＮＡを１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−１Ｍ Ｎａｃｌ緩衝液１ｍｌに溶かし、氷冷した後、
同緩衝液で平衡化したカラムに載せ、同緩衝液１ｍｌで
洗浄後、室温に戻して、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡで、ＤＮＡを溶出した。溶
出のピーク画分を集め、エタノール沈澱にてＤＮＡを回
収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ
ＥＤＴＡ１００μｌに溶かし、４℃で保存した。リンカ
ーＤＮＡを次の通り調製した。即ち、 ｐＢＲ３２２−
ＳＶ４０（０．１９〜０．３２）ＤＮＡ１００μｇを、
ＰｓｔＩ（ＮＥＢ）１２０単位で、３７℃下、１．５時
間消化後、反応を停止させ、フエノール−クロロホルム
抽出、エタノール沈澱を行なつた。ＤＮＡを回収し、１
４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ ｍＭ
ＤＴＴ、０．２５ ｍＭ ｄＧＴＰ（１μＣｉのα−
３２Ｐ−ｄＧＴＰを含む）５０μｌに溶解し、ＴＴａｓ
ｅ６０単位を２０分間作用させた。この結果、１８残基
のｄＧ鎖が付加された。反応停止後、ＤＮＡを回収し、
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）５０単位で消化し、前記し
たようにアガロース（１．８％）電気泳動で約０．２８
ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇのリンカーＤＮ
Ａを得た。−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラ
リーの作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μｌ（５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、３０ｍＭＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μＣｉα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、
５分間３７℃にて保温した。ＲＴａｓｅ（リバーストラ
ンスクリプターゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、
３７℃で１５分間反応させた後、再度ＲＴａｓｅ１０単
位を加え、更に１５分間保温した。０．２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐ８．０）２μｌと１０％ＳＤＳ１μｌとを加え
て反応を停止させた後、フエノール−クロロホルム抽出
を行ない、４Ｍ酢酸アンモニウム２０μｌとエタノール
８０μｌとを加え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室
温で融解し、１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心
し、沈澱させた。沈澱を１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）２０μｌに溶かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９
μｌとエタノール８０μｌとを加えて再沈澱させた。沈
澱を回収し、７０％エタノールで洗つた後、１４０ｍＭ
カコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ｍＭＤＴＴ、
０．２μｇポリＡ及び６６μＭ〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ
（１０μＣｉ）１５μｌに溶解した。ＴＴａｓｅ（Ｐ，
Ｌ，）１８単位を加え、３７℃で５分間反応させた後、
０℃に急冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１．３μｌと１０
％ＳＤＳ０．６５μｌとで反応を停止させ、フエノール
−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なつた。沈
澱を遠心して回収後、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（宝酒造）４単
位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フエノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なつた。沈澱
を回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）及び１
ｍＭ ＥＤＴＡの１０μｌに溶かし、エタノール３μｌ
を加え、−２０℃で保存した。上記で得た試料１μｌを
リンカーＤＮＡ５ｎｇと共に、１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ１０μｌ中で、６５℃で２分間、次いで４２℃で３０
分間保温した後、０℃に冷却した。これに２０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍ
Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ
β−ＮＡＤ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌ
エシエリヒア コリＤＮＡリガーゼの混合溶液を９０μ
ｌ加え、全液量を１００μｌとし、１２℃で一夜保存し
た。次いで、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μｌ、 １０
ｍＭ ＮＡＤ ０．５６μｌ、エシエリヒア・コリＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社製）０．
５μｌ及びＲＮａｓｅ Ｈ（ＰＬ）０．２μｌを加え、
１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した後、−２０
℃で凍結保存した。エシエリヒア コリＨＢ１０１株
を、ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イ
ースト抽出物５ｇ及びＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ
５５０＝０．４５まで培養し、５分間氷冷後、４℃で８
０００ｒｐｍで５分間遠心して菌体を同収した。菌体の
ペレツトを氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ
ＲｂＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＭｎＣ
ｌ、１５％グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、
４℃、８０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた菌体
を、１０ｍＭ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホニ
ツクアシツド）、７５ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｒｂ
Ｃｌ、１５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて１５
分間保温して、コンピテント細胞を作製した。かくして
得られたコンピテント細胞は、その後−７０℃で保存し
た。凍結菌液を室温で融解し、４００μｌの菌液に対し
て上記ＤＮＡ試料２０μｌを加え、３０分間０℃に放置
した後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、再び０℃
で１〜２分間静置した。これにＬＢ培地２ｍｌを加え、
３７℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、
３７℃で６時間培養した後、５０μｇ／ｍｌになるよう
にアンピシリンを加え、更に一夜培養し、ｃＤＮＡライ
ブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーは、５
０％グリセリン中で−２０℃にて保存した。 −３）合成プローブの作製 ＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する形質転換株の
選出のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相
補的な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により
合成した。
【化１３】 即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロアミダイト誘
導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホスフアイト
トリエステル法〔Ｎａｔｕｒｅ−３１０，１０５（１９
８４）〕にて、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ．Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目的とする
完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護ＤＮＡを
２８％アンモニア水で５５℃で１０時間処理することに
より、５′末端のＯＨ基に結合している保護基としての
ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、
Ｇ、ｃのアミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部
分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴ
ｒ体をＣ１８を担体とする逆相ＨＰＬｃにより精製した
後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記 ＤＭＴ
ｒ基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿索を含
む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びバイオ−
ゲルＰ−３０（バイオ−ラド社製）により精製して、目
的のＤＮＡ（６０ｍｅｒ）を得た。上記で得たＤＮＡ６
μｇを、５０μｌの反応溶液（５０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ２
−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺Ｄ
ＮＡ、５０ μＣｉ〔γ−２１Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルし
た。ラベルされたＤＮＡと未反応の３２Ｐを分別するた
めに、バイオゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカ
ラムクロマトグラフイーを行なつた。ラベルされたＤＮ
Ａ画分を１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエ
タノールにて沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ ４００
μｌに溶解し、−２０℃で保存した。得られたプローブ
の比活性は１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡ以上であつた。 −４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング アン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径８０
ｍｍのニトロセルロースフイルター（ミリポアＨＡＩＦ
０８２５０）を置き、この上にフイルター当り５０００
コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブラリ
ー菌液をまき、３７℃にて一夜培養した。フイルター
は、合計２４枚を作製した。コロニーの出現したフイル
ターに新しいニトロセルロースフイルターを載せること
によつて、レプリカフイルターを作製した。元のフイル
ター（マスターフイルター）を、４℃にて保存し、レプ
リカフイルターを、上記した寒天培地上で３７℃で６時
間培養後、クロラムフエニコール２００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地上に移し替え、３７℃で一夜培養した。
フイルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）及び１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−
１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風乾後、８０℃真空
下で２時間ベーキングを行なつた。ベーキング済みのフ
イルターを、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸
３ナトリウム、 １０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆｉｃｏ
ｌｌ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍ
ｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌ
サルモン スベラム（ＳａｌｍｏｎＳｐｅｒｍ）ＤＮＡ
の２０ｍｌ中で軽く振盪しながら、６８℃にて一夜保温
した。溶液を１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸
３ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び１０６ｃｐｍ／ｍ
ｌプローブに替え、４２℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブ
リダイゼーシヨンを行なつた。ハイブリダイゼーシヨン
の終わつたフイルターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１２Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳに
て室温で３回洗浄し、その後、６０℃で同溶液にてフイ
ルターのバツクグラウンドのカウントがＧＭサーベイメ
ーターで２００ｃｐｍになるまで洗浄した。フイルター
を風乾後、増感紙を用いてＸ線フイルム（フジＲＸ）に
−７０℃にて２日間オートラジオグラムを行なつた。フ
イルムを現像後、シグナル領域に存在するコロニーをマ
スターフイルターよりかき取り、上記の方法を繰返して
ポジテイブシグナルを有するコロニーの単離を行ない、
強いシグナルを有するクローンＩ−２を単離した。 −５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。その結果を図１に示
す。図１よりｃＤＮＡ中には、ＮｃｏＩ（日本ジー
ン）、ＨｉｎｄＩＩＩ（日本ジーン）、ＰｖｕＩＩ（日
本ジーン）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）により切断され
る個所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその
順序で之等制限酵素による切断個所が存在していること
が確認された。また、ｃＤＮＡの長さは、約１．５ｋｂ
であり、分子量約１８ｋｄのＩＬ−１を充分にコードで
きることが判った。次に、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの塩
基配列を、マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１
３フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法に
て決定した。その結果を次式に示す。
導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホスフアイト
トリエステル法〔Ｎａｔｕｒｅ−３１０，１０５（１９
８４）〕にて、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｚｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ．Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目的とする
完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護ＤＮＡを
２８％アンモニア水で５５℃で１０時間処理することに
より、５′末端のＯＨ基に結合している保護基としての
ＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、
Ｇ、ｃのアミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部
分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴ
ｒ体をＣ１８を担体とする逆相ＨＰＬｃにより精製した
後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記 ＤＭＴ
ｒ基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿索を含
む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びバイオ−
ゲルＰ−３０（バイオ−ラド社製）により精製して、目
的のＤＮＡ（６０ｍｅｒ）を得た。上記で得たＤＮＡ６
μｇを、５０μｌの反応溶液（５０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ２
−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺Ｄ
ＮＡ、５０ μＣｉ〔γ−２１Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３
７℃にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルし
た。ラベルされたＤＮＡと未反応の３２Ｐを分別するた
めに、バイオゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカ
ラムクロマトグラフイーを行なつた。ラベルされたＤＮ
Ａ画分を１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエ
タノールにて沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ ４００
μｌに溶解し、−２０℃で保存した。得られたプローブ
の比活性は１０７ｃｐｍ／μｇＤＮＡ以上であつた。 −４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング アン
ピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径８０
ｍｍのニトロセルロースフイルター（ミリポアＨＡＩＦ
０８２５０）を置き、この上にフイルター当り５０００
コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブラリ
ー菌液をまき、３７℃にて一夜培養した。フイルター
は、合計２４枚を作製した。コロニーの出現したフイル
ターに新しいニトロセルロースフイルターを載せること
によつて、レプリカフイルターを作製した。元のフイル
ター（マスターフイルター）を、４℃にて保存し、レプ
リカフイルターを、上記した寒天培地上で３７℃で６時
間培養後、クロラムフエニコール２００μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地上に移し替え、３７℃で一夜培養した。
フイルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）及び１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−
１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風乾後、８０℃真空
下で２時間ベーキングを行なつた。ベーキング済みのフ
イルターを、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸
３ナトリウム、 １０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆｉｃｏ
ｌｌ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍ
ｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌ
サルモン スベラム（ＳａｌｍｏｎＳｐｅｒｍ）ＤＮＡ
の２０ｍｌ中で軽く振盪しながら、６８℃にて一夜保温
した。溶液を１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸
３ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌフイコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び１０６ｃｐｍ／ｍ
ｌプローブに替え、４２℃で一昼夜軽く振盪し、ハイブ
リダイゼーシヨンを行なつた。ハイブリダイゼーシヨン
の終わつたフイルターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．１２Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳに
て室温で３回洗浄し、その後、６０℃で同溶液にてフイ
ルターのバツクグラウンドのカウントがＧＭサーベイメ
ーターで２００ｃｐｍになるまで洗浄した。フイルター
を風乾後、増感紙を用いてＸ線フイルム（フジＲＸ）に
−７０℃にて２日間オートラジオグラムを行なつた。フ
イルムを現像後、シグナル領域に存在するコロニーをマ
スターフイルターよりかき取り、上記の方法を繰返して
ポジテイブシグナルを有するコロニーの単離を行ない、
強いシグナルを有するクローンＩ−２を単離した。 −５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。その結果を図１に示
す。図１よりｃＤＮＡ中には、ＮｃｏＩ（日本ジー
ン）、ＨｉｎｄＩＩＩ（日本ジーン）、ＰｖｕＩＩ（日
本ジーン）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）により切断され
る個所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその
順序で之等制限酵素による切断個所が存在していること
が確認された。また、ｃＤＮＡの長さは、約１．５ｋｂ
であり、分子量約１８ｋｄのＩＬ−１を充分にコードで
きることが判った。次に、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの塩
基配列を、マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１
３フアージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法に
て決定した。その結果を次式に示す。
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】 上記図より、合成プローブと相補的な領域が５′末端よ
り３１２番目〜３７１番目に存在（図に下線を付して示
す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩基配列に７５
％の相同性を示した。また、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡ中
の最長のリーデイングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を検索したところ、５′末端より５７番目から
７７１番目の領域である。上記ヒトＩＬ−１前駆体蛋白
質をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＦ−
αは、これをエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）χ１７７６株に保有させ、該株を工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に、「Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ χ１７７６／ｐＧＩＦ−
α」なる名称で、微工研条寄第９４８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−９４８）として寄託されている。 参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵
素ＡｃｃＩ及びＣｌａＩにより切断した後、約１．２キ
ロベースペアー（ｋｂｐ）のＤＮＡ断片をアガロースゲ
ル電気泳動により単離精製した。このＤＮＡ断片をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素
ＡｃｃＩ及びＣｌａＩ切断部分を平滑末端とした。一方
ＢａｍＨＩリンカー（５′ＨＯＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＯＨ３′）の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
によりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮＡ断
片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制限酵
素ＢａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭｓｐＩで切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、
約５４０ベースペア（ｂｐ）のＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片を単離精製した。次に、下記オリゴデオキシ
ヌクレオチド（Ｉ）及び（ＩＩ）を以下のようにして合
成した。 ５′ＨＯＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧ ＣＡＣＴＣＴＣＯＨ３′ （Ｉ） ５′ＨＯＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧ ＣＣＡＴＴＡＴＯＨ３′ （ＩＩ） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライド バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３′側より５′側へ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフエノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
つた〔Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３１
０，１０５（１９８４）〕。次いで、得られた完全保護
オリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５
℃で１０時間処理してＮ−保護基を脱離させ、５′−Ｏ
−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドを得た。この
１／５量を用いて、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担
体とする逆相高速液体クロマトグラフイーにより精製
後、８０％酢酸１５０μｌで室温で２０分間処理して粗
オリゴヌクレオチドを得た。これをＯＤＳを担体とする
逆相高速液体クロマトグラフイーにより更に精製して、
目的とするオリゴヌクレオチドを得た。上記で合成した
合成オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び（ＩＩ）の
各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリ
ン酸化し、上記で得たＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断
片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びＣｌａＩで切断し、得られた反応物をアガ
ロースゲル電気泳動に付して、約５８０ｂｐのＣｌａＩ
−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を単離精製した。他方、プラス
ミドｐＴＭＩ〔今本文男，代謝，Ｖｏｌ．２２，２８９
（１９８５）〕を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモー
ター領域を含む約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離精製
した。このＤＮＡ断片と、先に調製した約５８０ｂｐの
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結して所望のポリペプチド１発現用プラスミド
ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを得た。該プラスミドを、エシ
エリヒア・コリーＨＢ１０１にトランスフオームさせ、
目的のトランスフオーマントを、ボイリング法（ｂｏｉ
ｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得られるプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析により選択した〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ
３６６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｆｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８２）〕。以上の概略を図２
に示す。また上記トランスフオーマントに組込まれたプ
ラスミドｐｔｒｐ ＧＩＦ−αは、これをエシェリヒア
・コリχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換
体を、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉχ１７７６
／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α」なる名称で１９８５年１２
月１２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第
９４９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９４９）として寄託した。 （２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
及びＬ−トリプトフアン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％Ｎ
ａＣｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この
１ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１％カザミノ
酸を含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．
３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ
４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２％クルコース及び
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）５０ｍｌに植菌し、３７℃で
振盪培養し、５５０ｎｍでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）が１．
０となつた時点で菌体を集め、１５％シユークロースー
５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、１０ｍｇ
／ｍｌリゾチーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で溶解した溶液〕５００μｌを加え、更に０．３％
トリトンＸ１００−１８７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）−１５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶
液５ｍｌを加え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁
させ、遠心分離によつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物
上清を得た。 （３）ポリペプチドＩの精製イオン交換クロマトグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ） 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ギルソンハイパーフオー
マンス リキツド クロマトグラフイー システム（ギ
ルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製）によるイオン交換クロマ
トグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬｃ）にかけた。その条件は
次の通りである。カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０
×１５０ｍｍ、東洋曹達社製）溶離液：Ａ液＝５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５、Ｂ液＝０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ念有５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）流 速：
０．５ｍｌ／分 フラクシヨン容積：リテンシヨンタイム ０〜 ６０分…２ｍｌ／４分／チユーブ ６０〜１２０分…０．５ｍｌ／分／チユーブ １２０〜１８０分…２ｍｌ／４分／チユーブ 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たリテンシヨンタイム９０〜９
１分の画分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイー
に付した。その条件は、次の通りである。 カラム：Ｃ４ハイポアー逆相カラム（ＲＰ３０４）バイ
オ−ラド社、直径４．６×２５０ｍｍ溶離液；Ａ液＝
０．１％ＴＦＡ、Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ
（９：１） 流 速：１ｍｌ／分 チヤートスピード：リテンシヨンタイム ０〜５０分…５分／ｃｍ ５０〜８０分…２分／ｃｍ フラクシヨン容積：２ｍｌ／２分／チユーブ リテンシヨンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的の
ポリペプチドＩが得られた。得られたポリペプチドＩ
は、ＩＬ−１活性を有し、その比活性は、ＧＩＦ活性と
して２．７×１０７単位／ｍｇ蛋白であった。 （４）ポリペプチドＩの同定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の方法
〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，６８０（１９７０）〕に従
い、上記（３）で得たポリペプチドＩのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行なつた。その条件は次の通りである。 試 料：上記逆相高速液体クロマトグラフイーににおけ
るポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエメリーのサン
プル バツフア−〔１／２０体積の２−メルカプトエタ
ノールを含む（２ＭＥ＋）又は含まない（２ＭＥ−）〕
に溶解し、１００℃で４分間処理した。 ゲル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリルアミドゲル
を使用した。 電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製プ
ロテアンを用いた。 泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。 泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキツ
ト（Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ）を用いて染色
した。その結果、ポリペプチドＩは２ＭＥ＋下において
は約１７Ｋの位置に、また２ＭＥ−下においては約１
７．５Ｋの位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動され
た。等電点電気泳動法（１ＥＦ） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜
９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）
及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行な
つた。その条件は次の通りである。 試 料：前記（３）で得たポリペプチドＩの０．０３７
μｇ、０．０７４μｇ及び０．７４μｇの各々、及び以
下のマーカープロテイン（ｐＩマーカープロテイン）の
計４レーンを使用した。 ＜マーカープロテイン＞アミログルコシダーゼ（３．５
０）、大豆トリプシンインヒビター（４．５５）、β−
ラクトグロブリンＡ（５．２０）、ウシ カルボニツク
アンヒドラーゼ（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｃ
ａｎｈｙｄｒａｓｅ）Ｂ（５．８５）、ヒト カルボニ
ツク アンヒドラーゼ（ｈｕｍａｎ ｃａｒｂｏｎｉｃ
ａｎｈｙｄｒａｓｅ）Ｂ（６．５５）、ウマ ミオグ
ロビン−アシデイツクバンド（ｈｏｒｓｅ ｍｙｏｇｌ
ｏｂｉｎ−ａｃｉｄｉｃ ｂａｎｄ）（６．８５）ウマ
ミオグロビン−ベイシツクバンド（ｈｏｒｓｅ ｍｙ
ｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｉｃ ｂａｎｄ）（７．３
５）、レンチル レクチン−アシデツクバンド（ｌｅｎ
ｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ−ａｃｉｄｉｃ ｂａｎｄ）
（８．１５）、レンチル レクチン−ミドルバンド（ｌ
ｅｎｔｉｌｌｅｃｔｉｎ−ｍｉｄｄｌｅ ｂａｎｄ）
（８．４５）、レンチル レクチン−ベイシツクバンド
（ｌｅｎｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ−ｂａｓｉｃ ｂａｎ
ｄ）（８．６５）及びトリプシノーゲン（９．３０）。 電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ３ＰＯ４ 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。 染 色：染色は、シルバー スタイン キツトで行なつ
た。 上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライスし、蒸留水１
ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定し、等電点を
算出した。その結果、ポリペプチドＩの等電点（ｐＩ）
は６．８±０．１であり、この位置に単一のバンドとし
て泳動された。アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより得
られたポリペプチドＩ画分の３０μｌを、１２ｍｍ×１
２０ｍｍのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意
深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターに
て減圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に４Ｎ−メタ
ンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）イ
ンドール含有、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕５０μ
ｌを加え、０．１〜０．２ｍｍＨｇで１分間脱気後、減
圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時
間を要して行なつた。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム
４６μｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌ
とした。アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立
製作所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液
２５０μｌを注入して行なつた。分離されたアミノ酸
は、オルトフタルアルデヒド法で検出した。また定量
は、試料の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検量
線によつて行なつた。その結果を、Ｐｈｅを基準（９モ
ル）として、各アミノ酸の含有モル比で下記第１表に示
す。尚、上記分析条件下においては、Ｐｒｏ及びＣｙｓ
は測定できない。またＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＭｅｔについ
ては、上記分析条件下での回収率を（）内に示した。 アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリペ
プチドＩ画分の１５０μｌを、アプライドバイオシステ
ムズ社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じ
たＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１
００〜５０μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウオータ
ーズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。クロマ
トグラフイーのシステムは、ベツクマン１１２型ポンプ
２台を、４２１型コントローラーで作働させた。カラム
はウルトラスフエアーＯＤＳ−５μｍの充填された２ｍ
ｍ×２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保
つた。流速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジエント
溶出法で分離し、２６９ｎｍでモニターした。分析は４
５分とした。２０サイクルの分析の結果、前記（３）で
得たポリペプチドＩのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、
以下のものであると認められた。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ− 尚、Ｓｅｒは副生物の一つで確認し、更に３２２ｎｍに
吸収を示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイク
ル８では副生物のピークからＣｙｓであると推定し、更
に元の試料をカルボキサミドメチル化した後の分析でＣ
ｙｓと確認した。また、ポリペプチドＩをトリプシンで
消化して得たペプチド断片につき、それらのアミノ酸組
成を分析し、Ｃ端部ペプチドも欠損することなく、正確
に含まれていることを確認した。即ち、ポリペプチドＩ
６０μｇを１％炭酸水素アンモニウム６００μｌに溶
解し、該溶液に、予め１％炭酸水素アンモニウムに溶解
させたトリプシン（０，２ｍｇ／ｍｌ、クーパー社製）
溶液の ２０μｌを加え、３７℃で２４時間放置してト
リプシン切断ペプチドを得た。このペプチド混合物を、
逆相ＨＰＬｃ〔ｃ−１８，３００オングストローム，
４．６×１５０ｍｍ：０．１％ＴＦＡをＡ液及び１％Ｔ
ＦＡ１／１０容を含むアセトニトリルをＢ液として、該
Ｂ液を１％／３分の割合で増加させるプログラムにより
溶出させる〕に付し、Ｂ液が４０％までで全ての成分を
単離した。之等のペプチドをアミノ酸分析に供した。こ
のアミノ酸組成から予想される全てのペプチド断片が同
定でき、特にＣ端部ペプチドについては、塩基性アミノ
酸が含まれておらず、そのアミノ酸組成の結果は、予想
されるアミノ酸を正確に含んでいたことから、前記
（３）で得られたポリペプチドＩのＣ端部は、予想され
た通りに正確であることが確認された。また、各ペプチ
ド断片につき、上記と同様にしてそれらのアミノ酸配列
を分析した。その結果、確認された配列は全てＩＬ−１
βに一致した。確認されたペプチド断片につき、之等を
ＩＬ−１βのアミノ酸番号により次に示す。 ＜確認されたペプチド断片（アミノ酸番号）＞ １〜４、５〜１１、１２〜１６、１７〜２７、２８〜６
３、６４〜６５、６６〜７４、７５〜８８、８９〜９
２、９５〜９８、９９〜１０３、１０４〜１０９、１１
０〜１３８、１３９〜１５３ 以上の結果から、前記（３）で得たポリペプチドＩは、
前記定義の配列で特定されるポリペプチドＩであること
が確認された。尚、ポリペプチドＩの分子量の計算値
は、１７３７６．５９である。 実施例１ 本発明ＩＬ−１β誘導体の製造 ポリペプチドＶＩの製造 上記参考例２で得たｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを利用し
て、サイト−スペシフイツクミュータジエネシス（Ｓｉ
ｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，５６
６２−５６６６（１９８４）〕の方法に従い、ＩＬ−１
β（ポリペプチドＩ）のアミノ末端から７１番目のＣｙ
ｓをＳｅｒに変更したポリペプチドＶＩを以下の通り製
造した。即ち、Ｍ１３ｍｐ１１フアージベクターを、一
本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミ
ドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
ＩＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１フア
ージ（ＲＦ）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイ
トにクローニングし、これから一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ
（Ｍ１３−ＧＩＦ−α）を得、これをミュータジエネシ
スの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチド〔５′−ＣＴ
ＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ−３′（プライマー）〕
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これ
をｓｓＭ１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズ
し、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキユベート
した。得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞に
トランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プレート
上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。
生育したコロニーを含むフイルターを通常の方法により
アルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処
理を行なった。このフイルターをプレハイブリダイズし
た後、このものと、上記プライマーの５′末端を３２Ｐ
−ｒ−ＡＴＰでラベルした３２Ｐ−プローベとを、室温
でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイル
ターを、６×ｓｓｃバッフアーで、室温で １０分間、
次いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃
で１８時間オートラジオグラフイーを行なった。変異し
た５クローンの内から代表としてＭ１３−ＧＩＦ−７１
ｓを選びこれをＪＭ１０５に感染させて培養し、ｓｓＤ
ＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。上記で得たｓｓＤＮ
ＡのＭ１３ジデオキシチェイン ターミネーシヨン シ
ークエンシングにより目的の遺伝子の変異の確認を行な
った。また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくできた制
限酵素ＤｄｅＩサイトも確認できた。ＪＭ１０５で増殖
させたＲＦ ＤＮＡより、 ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフ
ラグメントを調製し、これを前記（１）と同様にして発
現プラスミドに組込み、所望のポリペプチドＶＩ発現プ
ラスミド（ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓ）を得た。
該プラスミドは、これをエシェリヒア・コリＨＢ１０１
に保有させ、該株は微工研に「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１
Ｓ」なる名称で微工研寄第１２９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ
１２９６）として寄託されている。このプラスミドを
用いて、参考例２−（２）と同様にして、菌体抽出物上
清を得、該上清のＧＩＦ活性を測定した。その結果、培
養液１ｍｌ当りのＧＩＦ活性（単位／ｍｌ培養液）は、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として２．４×１
０６であつた。これより、参考例２−（３）と同一の手
段により、目的のポリペプチドＶＩを単離、精製した。 ポリペプチドＩＶの製造 プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを利用して上記と
同様にして、ポリペプチドＩＶを製造した。即ち、Ｍ１
３ｍｐ１１フアージベクターを、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ
鋳型として用いた。まずプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−αより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡフラグメント
を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１フアージ（ＲＦ）のＥｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−α）
を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。合成オ
リゴヌクレオチド〔５′−ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣ
ＴＣ−３′（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し、これをｓｓＭ１３−ＧＩＦ−α
ＤＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ｄＮＴ
Ｐｓの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグ
メント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５℃
で１８時間インキユベートした。得られたＤＮＡをＪＭ
１０５コンピテント細胞にトランスフオームし、生じた
コロニーを、寒天プレート上に１００コロニー植菌し、
３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーを含むフ
イルターを通常の方法によりアルカリ変性し、乾燥後、
８０℃で２時間ベーキング処理を行なった。このフイル
ターをプレハイブリダイズした後、このものと、上記プ
ライマーの５′末端を、３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルし
た３２Ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイズさせたフイルターを、６×ｓｓｃバ
ッフアーで、室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間
各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオ
グラフイーを行なった。変異した４クローンの内から代
表としてＭ１３−ＧＩＦ−８Ｓを選びこれをＪＭ１０５
に感染させて培養し、ｓｓＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調
製した。上記で得たｓｓＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェ
イン ターミネーシヨン シークエンシングにより目的
の遺伝子の変異の確認を行なった。また上記ＲＦ ＤＮ
Ａにおいて、新しくできた制限酵素ＨｉｎｆＩサイトも
確認できた。ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、
これを参考例２−（１）と同様にして発現プラスミドに
組込み、所望のポリペプチドＩＶ発現プラスミド（ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓ）を得た。このプラスミドを
用いて、参考例２−（２）と同様にして、菌体抽出物上
清を得た。該上消のＧＩＦ活性は、宿主してエシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１を用いた場合、１．２×１０５単位
／ｍｌ培養液であり、エシェリヒア・コリＷ３１１０を
用いた場合、６．２×１０５単位／ｍｌ培養液であつ
た。上記上清より、参考例２−（３）と同一の手段によ
り、目的のポリペプチドＶＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶの製造 上記及びで得たプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α
−７１Ｓ及びｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓの各々を、
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断後、ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓから約４００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを、またｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓ
から約４６００ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれ取
り出し、両者をライゲーシヨンして、ＩＬ−１β（ポリ
ペプチドＩ）のＮ末端から８番目及び７１番目のＣｙｓ
をいすれもＳｅｒに変更させた所望のポリペプチドＶの
発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓ７１Ｓ
を得た。このプラスミドを用いて、参考例２−（２）と
同様にして、菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主とする場合はＧＩＦ活性として１．４×１
０４単位／ｍｌ培養液、またエシェリヒア・コリＷ３１
１０を宿主とする場合はＧＩＦ活性として５×１０５単
位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と同
一の手段により、目的のポリペプチドＶを単離、精製し
た。 ポリペプチドＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＴ
ＴＣＴＣＴＧ−３′をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇを得た。該プラスミドは、これをエシェ
リヒア・コリＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に
「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇ」なる名称で微工研寄第１２
９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９７）として寄託されて
いる。該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様
にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ１０１
を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０５単位／
ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と同一の
手段により、目的のポリペプチドＩＩを単離、精製し
た。この精製操作において、ＣＭ−ＨＰＬＣの主ピーク
の前半部の再クロマトグラフイーによりポリペプチドＸ
ＸＸＸＶＩＩＩを精製品として得た。ポリペプチドＸＸ
ＸＸＶＩＩＩは、ポリペプチドＩＩと同程度のＣＳＦ産
生促進活性を有し、同様に、ＧＩＦ活性、ＬＡＦ活性及
びＰＧＥ産生促進活性がいずれも低い特徴を示した。 ポリペプチドＩＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧ
ＡＣＴＣＡＣＡ−３′をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドＩＩＩ発現用プラスミドｐｔｒｐ
ＧＩＦ−α−１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、参
考例２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として
２．８×１０６単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考
例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプチド
ＩＩＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡ
ＴＡＧＡＡ−３′をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドＶＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−１０２ＣＴを得た。該プラスミドを用い
て、参考例２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エ
シェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性
として７．４×１０４単位／ｍｌ培養液）を得、これよ
り参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペ
プチドＶＩＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶＩＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡＧ
ＧＡＴＡＴＡＡ−３′をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドＶＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−１４０ＣＴを得た。該プラスミドを用
いて、参考例２−（２）と同様にして、エシェリヒア・
コリＷ３１１０を宿主として用いることにより、菌体抽
出物上清（ＧＩＦ活性として５．８×１０３単位／ｍｌ
培養液）を得、これより参考例２−（３）と同一の手段
により、目的のポリペプチドＶＩＩＩを単離、精製し
た。また、上記プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−１
４０ＣＴを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主とし
て発現させることによつて、同様に菌体抽出物上清（Ｇ
ＩＦ活性として１．３×１０６単位／ｍｌ培養液）が得
られ、これより上記と同様にしてポリペプチドＩが単
離、精製された。尚、上記において、エシェリヒア・コ
リＨＢ １０１を宿主とする場合には、ナンセンスサプ
レツサーとしてＳｕｐＥが働き、ＵＡＧの終止コドンが
ＧＩｎとして読まれて（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈされ
て）ポリペプチドＩが発現される。一方宿主をエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０とする場合には、ＳｕｐＥ遺伝子
がコードされていないため、上記ＵＡＧが終止コドンと
して働き、１４０個のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドＶＩＩＩが発現される。 ポリペプチドＩ〜ＶＩＩＩの同定 前記〜で得られた本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリ
ペプチドＩ〜ＶＩＩＩ）につき、参考例２−（４）と同
様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％ポリアクリルアミド
ゲル、２ＭＥ＋）を行なった。 その結果、ポリペプチ
ドＩ〜ポリペプチドＶＩＩは、いずれも約１７．５ｋｄ
の位置に、またポリペプチドＶＩＩＩは約１６ｋｄの位
置に、それぞれ単一のバンドとして泳動された。また、
ポリペプチドＩのＧＩＦ活性に対する中和抗血清（参考
例２−（３）で得たポリペプチドＩを通常の方法に従
い、家兎に免疫して作製した抗血清、以下同じ）を用い
たウエスタンプロツテイング〔Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７６，１４２０（１９７９）〕により、
ポリペプチドＩ〜ポリペプチドＶＩＩＩの各々を、相当
する位置に単一のバンドとして確認した。 実施例２ 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシェリヒア
・コリＨＢ１０１／ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α）を、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトフアン２０μｇ
／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌ中で３７℃で一晩培養
し、この４００ｍｌを１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地２０１に植菌し、３７℃で８．５時間培養した。遠心
分離により集菌し、得られる菌体を１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ
４に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、１０ｍＭトリス
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２日間透折した。
得られた透析液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分
間）して上清を得た。大腸菌培養液３００１分に相当す
る上記上清を集め、これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ５．０
に調製した後、ＳＰ−ゼータプレツプ２５０カートリツ
ジ〔ＬＫＢ社製〕に付Ｌ、流速３０ｍｌ／分で始め、１
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で１００分、続い
て０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．５）で２２０分、更に１Ｍ ＮａＣｌを含む
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でそれぞれ溶出
させた。各分画をＨＰＬＣによりチェックし、目的物の
含まれているフラクシヨン、即ち０．１Ｍ ＮａＣｌを
念む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）のフラクシ
ヨン（フラクシヨンＮｏ．８〜１０）を集めた。これを
１００ｍＭ酢酸でｐＨ４．５とした後、ＨＰＬＣ〔東洋
曹達株式会社製、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ、５．５×２
０ｃｍ〕に付し、下記条件で溶出させて、リテンシヨン
タイム（ｒ．ｔ．）６５〜７２分の分画を採取した。 溶離液Ａ：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．５） 流 速 ：３０ｍｌ／分 かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。これを、限外
濾過（ＹＭ−５メンブラン）により、２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液組成となるように
緩衝液を交換しつつ、濃縮（２０ｍｇ／ｍｌ）した。更
に、ポジタインフイルターＮＦＺ（日本ポール社製）を
装着した濾過装置に、上記濃縮液を供して滅菌濾過した
後、パイロジエンが１１００ｐｇ／ｍｇ蛋白以下の精製
品を得た。上記精製法により、大腸菌培養液３００１よ
り、ポリペプチドＩの約３ｇを収得した。 上記のＨＰＬＣ（ＳＰ−５ＰＷ）の溶出におい
て、メインピークの前半のフラクシヨン（ｒ．ｔ．６４
〜６５分）を採取し、これを再度クロマトグラフイーに
付すことにより、ポリペプチドＸを得た。２．７×１０
６ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。また同様に、メインピークの
後半のフラクシヨン（ｒ．ｔ．７２〜７６分）より、ポ
リペプチドＸＩを得た。２．８×１０７ＧＩＦ単位／ｍ
ｇ蛋白。 上記及びで得られたポリペプチドＩ、Ｘ及びＸ
Ｉのアミノ酸分析を、参考例２−（４）と同様にして行
なった。結果を下記第２表に示す。またポリペプチドＸ
及びＸＩについては、参考例２−（４）におけるアミノ
酸配列分析と同様にして、それらのＮ末端部配列を確
認、同定した。
り３１２番目〜３７１番目に存在（図に下線を付して示
す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩基配列に７５
％の相同性を示した。また、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡ中
の最長のリーデイングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を検索したところ、５′末端より５７番目から
７７１番目の領域である。上記ヒトＩＬ−１前駆体蛋白
質をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＦ−
αは、これをエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）χ１７７６株に保有させ、該株を工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）に、「Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ χ１７７６／ｐＧＩＦ−
α」なる名称で、微工研条寄第９４８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−９４８）として寄託されている。 参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵
素ＡｃｃＩ及びＣｌａＩにより切断した後、約１．２キ
ロベースペアー（ｋｂｐ）のＤＮＡ断片をアガロースゲ
ル電気泳動により単離精製した。このＤＮＡ断片をＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素
ＡｃｃＩ及びＣｌａＩ切断部分を平滑末端とした。一方
ＢａｍＨＩリンカー（５′ＨＯＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＯＨ３′）の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
によりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮＡ断
片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制限酵
素ＢａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭｓｐＩで切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、
約５４０ベースペア（ｂｐ）のＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片を単離精製した。次に、下記オリゴデオキシ
ヌクレオチド（Ｉ）及び（ＩＩ）を以下のようにして合
成した。 ５′ＨＯＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧ ＣＡＣＴＣＴＣＯＨ３′ （Ｉ） ５′ＨＯＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧ ＣＣＡＴＴＡＴＯＨ３′ （ＩＩ） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５′−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライド バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３′側より５′側へ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフエノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
つた〔Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３１
０，１０５（１９８４）〕。次いで、得られた完全保護
オリゴヌクレオチドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５
℃で１０時間処理してＮ−保護基を脱離させ、５′−Ｏ
−ジメトキシトリチルオリゴヌクレオチドを得た。この
１／５量を用いて、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担
体とする逆相高速液体クロマトグラフイーにより精製
後、８０％酢酸１５０μｌで室温で２０分間処理して粗
オリゴヌクレオチドを得た。これをＯＤＳを担体とする
逆相高速液体クロマトグラフイーにより更に精製して、
目的とするオリゴヌクレオチドを得た。上記で合成した
合成オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び（ＩＩ）の
各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリ
ン酸化し、上記で得たＭｓｐＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断
片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びＣｌａＩで切断し、得られた反応物をアガ
ロースゲル電気泳動に付して、約５８０ｂｐのＣｌａＩ
−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を単離精製した。他方、プラス
ミドｐＴＭＩ〔今本文男，代謝，Ｖｏｌ．２２，２８９
（１９８５）〕を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで
切断後、アガロースゲル電気泳動によりｔｒｐプロモー
ター領域を含む約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を単離精製
した。このＤＮＡ断片と、先に調製した約５８０ｂｐの
ＣｌａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結して所望のポリペプチド１発現用プラスミド
ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを得た。該プラスミドを、エシ
エリヒア・コリーＨＢ１０１にトランスフオームさせ、
目的のトランスフオーマントを、ボイリング法（ｂｏｉ
ｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）により得られるプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析により選択した〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ
３６６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｆｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８２）〕。以上の概略を図２
に示す。また上記トランスフオーマントに組込まれたプ
ラスミドｐｔｒｐ ＧＩＦ−αは、これをエシェリヒア
・コリχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換
体を、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉχ１７７６
／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α」なる名称で１９８５年１２
月１２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第
９４９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−９４９）として寄託した。 （２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ
及びＬ−トリプトフアン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％Ｎ
ａＣｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この
１ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１％カザミノ
酸を含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．
３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ
４Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．２％クルコース及び
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）５０ｍｌに植菌し、３７℃で
振盪培養し、５５０ｎｍでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）が１．
０となつた時点で菌体を集め、１５％シユークロースー
５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、１０ｍｇ
／ｍｌリゾチーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で溶解した溶液〕５００μｌを加え、更に０．３％
トリトンＸ１００−１８７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）−１５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶
液５ｍｌを加え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁
させ、遠心分離によつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物
上清を得た。 （３）ポリペプチドＩの精製イオン交換クロマトグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ） 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ギルソンハイパーフオー
マンス リキツド クロマトグラフイー システム（ギ
ルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製）によるイオン交換クロマ
トグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬｃ）にかけた。その条件は
次の通りである。カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０
×１５０ｍｍ、東洋曹達社製）溶離液：Ａ液＝５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５、Ｂ液＝０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ念有５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）流 速：
０．５ｍｌ／分 フラクシヨン容積：リテンシヨンタイム ０〜 ６０分…２ｍｌ／４分／チユーブ ６０〜１２０分…０．５ｍｌ／分／チユーブ １２０〜１８０分…２ｍｌ／４分／チユーブ 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たリテンシヨンタイム９０〜９
１分の画分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイー
に付した。その条件は、次の通りである。 カラム：Ｃ４ハイポアー逆相カラム（ＲＰ３０４）バイ
オ−ラド社、直径４．６×２５０ｍｍ溶離液；Ａ液＝
０．１％ＴＦＡ、Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ
（９：１） 流 速：１ｍｌ／分 チヤートスピード：リテンシヨンタイム ０〜５０分…５分／ｃｍ ５０〜８０分…２分／ｃｍ フラクシヨン容積：２ｍｌ／２分／チユーブ リテンシヨンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的の
ポリペプチドＩが得られた。得られたポリペプチドＩ
は、ＩＬ−１活性を有し、その比活性は、ＧＩＦ活性と
して２．７×１０７単位／ｍｇ蛋白であった。 （４）ポリペプチドＩの同定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の方法
〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，６８０（１９７０）〕に従
い、上記（３）で得たポリペプチドＩのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを行なつた。その条件は次の通りである。 試 料：上記逆相高速液体クロマトグラフイーににおけ
るポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエメリーのサン
プル バツフア−〔１／２０体積の２−メルカプトエタ
ノールを含む（２ＭＥ＋）又は含まない（２ＭＥ−）〕
に溶解し、１００℃で４分間処理した。 ゲル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリルアミドゲル
を使用した。 電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製プ
ロテアンを用いた。 泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。 泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタインキツ
ト（Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ）を用いて染色
した。その結果、ポリペプチドＩは２ＭＥ＋下において
は約１７Ｋの位置に、また２ＭＥ−下においては約１
７．５Ｋの位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動され
た。等電点電気泳動法（１ＥＦ） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜
９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）
及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行な
つた。その条件は次の通りである。 試 料：前記（３）で得たポリペプチドＩの０．０３７
μｇ、０．０７４μｇ及び０．７４μｇの各々、及び以
下のマーカープロテイン（ｐＩマーカープロテイン）の
計４レーンを使用した。 ＜マーカープロテイン＞アミログルコシダーゼ（３．５
０）、大豆トリプシンインヒビター（４．５５）、β−
ラクトグロブリンＡ（５．２０）、ウシ カルボニツク
アンヒドラーゼ（ｂｏｖｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｃ
ａｎｈｙｄｒａｓｅ）Ｂ（５．８５）、ヒト カルボニ
ツク アンヒドラーゼ（ｈｕｍａｎ ｃａｒｂｏｎｉｃ
ａｎｈｙｄｒａｓｅ）Ｂ（６．５５）、ウマ ミオグ
ロビン−アシデイツクバンド（ｈｏｒｓｅ ｍｙｏｇｌ
ｏｂｉｎ−ａｃｉｄｉｃ ｂａｎｄ）（６．８５）ウマ
ミオグロビン−ベイシツクバンド（ｈｏｒｓｅ ｍｙ
ｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｉｃ ｂａｎｄ）（７．３
５）、レンチル レクチン−アシデツクバンド（ｌｅｎ
ｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ−ａｃｉｄｉｃ ｂａｎｄ）
（８．１５）、レンチル レクチン−ミドルバンド（ｌ
ｅｎｔｉｌｌｅｃｔｉｎ−ｍｉｄｄｌｅ ｂａｎｄ）
（８．４５）、レンチル レクチン−ベイシツクバンド
（ｌｅｎｔｉｌ ｌｅｃｔｉｎ−ｂａｓｉｃ ｂａｎ
ｄ）（８．６５）及びトリプシノーゲン（９．３０）。 電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ３ＰＯ４ 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。 染 色：染色は、シルバー スタイン キツトで行なつ
た。 上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライスし、蒸留水１
ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定し、等電点を
算出した。その結果、ポリペプチドＩの等電点（ｐＩ）
は６．８±０．１であり、この位置に単一のバンドとし
て泳動された。アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより得
られたポリペプチドＩ画分の３０μｌを、１２ｍｍ×１
２０ｍｍのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意
深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターに
て減圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に４Ｎ−メタ
ンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）イ
ンドール含有、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕５０μ
ｌを加え、０．１〜０．２ｍｍＨｇで１分間脱気後、減
圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時
間を要して行なつた。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム
４６μｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌ
とした。アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立
製作所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液
２５０μｌを注入して行なつた。分離されたアミノ酸
は、オルトフタルアルデヒド法で検出した。また定量
は、試料の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検量
線によつて行なつた。その結果を、Ｐｈｅを基準（９モ
ル）として、各アミノ酸の含有モル比で下記第１表に示
す。尚、上記分析条件下においては、Ｐｒｏ及びＣｙｓ
は測定できない。またＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＭｅｔについ
ては、上記分析条件下での回収率を（）内に示した。 アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリペ
プチドＩ画分の１５０μｌを、アプライドバイオシステ
ムズ社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じ
たＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１
００〜５０μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウオータ
ーズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。クロマ
トグラフイーのシステムは、ベツクマン１１２型ポンプ
２台を、４２１型コントローラーで作働させた。カラム
はウルトラスフエアーＯＤＳ−５μｍの充填された２ｍ
ｍ×２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保
つた。流速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジエント
溶出法で分離し、２６９ｎｍでモニターした。分析は４
５分とした。２０サイクルの分析の結果、前記（３）で
得たポリペプチドＩのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、
以下のものであると認められた。 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｍｅｔ− 尚、Ｓｅｒは副生物の一つで確認し、更に３２２ｎｍに
吸収を示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイク
ル８では副生物のピークからＣｙｓであると推定し、更
に元の試料をカルボキサミドメチル化した後の分析でＣ
ｙｓと確認した。また、ポリペプチドＩをトリプシンで
消化して得たペプチド断片につき、それらのアミノ酸組
成を分析し、Ｃ端部ペプチドも欠損することなく、正確
に含まれていることを確認した。即ち、ポリペプチドＩ
６０μｇを１％炭酸水素アンモニウム６００μｌに溶
解し、該溶液に、予め１％炭酸水素アンモニウムに溶解
させたトリプシン（０，２ｍｇ／ｍｌ、クーパー社製）
溶液の ２０μｌを加え、３７℃で２４時間放置してト
リプシン切断ペプチドを得た。このペプチド混合物を、
逆相ＨＰＬｃ〔ｃ−１８，３００オングストローム，
４．６×１５０ｍｍ：０．１％ＴＦＡをＡ液及び１％Ｔ
ＦＡ１／１０容を含むアセトニトリルをＢ液として、該
Ｂ液を１％／３分の割合で増加させるプログラムにより
溶出させる〕に付し、Ｂ液が４０％までで全ての成分を
単離した。之等のペプチドをアミノ酸分析に供した。こ
のアミノ酸組成から予想される全てのペプチド断片が同
定でき、特にＣ端部ペプチドについては、塩基性アミノ
酸が含まれておらず、そのアミノ酸組成の結果は、予想
されるアミノ酸を正確に含んでいたことから、前記
（３）で得られたポリペプチドＩのＣ端部は、予想され
た通りに正確であることが確認された。また、各ペプチ
ド断片につき、上記と同様にしてそれらのアミノ酸配列
を分析した。その結果、確認された配列は全てＩＬ−１
βに一致した。確認されたペプチド断片につき、之等を
ＩＬ−１βのアミノ酸番号により次に示す。 ＜確認されたペプチド断片（アミノ酸番号）＞ １〜４、５〜１１、１２〜１６、１７〜２７、２８〜６
３、６４〜６５、６６〜７４、７５〜８８、８９〜９
２、９５〜９８、９９〜１０３、１０４〜１０９、１１
０〜１３８、１３９〜１５３ 以上の結果から、前記（３）で得たポリペプチドＩは、
前記定義の配列で特定されるポリペプチドＩであること
が確認された。尚、ポリペプチドＩの分子量の計算値
は、１７３７６．５９である。 実施例１ 本発明ＩＬ−１β誘導体の製造 ポリペプチドＶＩの製造 上記参考例２で得たｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを利用し
て、サイト−スペシフイツクミュータジエネシス（Ｓｉ
ｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１，５６
６２−５６６６（１９８４）〕の方法に従い、ＩＬ−１
β（ポリペプチドＩ）のアミノ末端から７１番目のＣｙ
ｓをＳｅｒに変更したポリペプチドＶＩを以下の通り製
造した。即ち、Ｍ１３ｍｐ１１フアージベクターを、一
本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミ
ドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
ＩＤＮＡフラグメントを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１フア
ージ（ＲＦ）のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイ
トにクローニングし、これから一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ
（Ｍ１３−ＧＩＦ−α）を得、これをミュータジエネシ
スの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチド〔５′−ＣＴ
ＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ−３′（プライマー）〕
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これ
をｓｓＭ１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズ
し、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキユベート
した。得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞に
トランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プレート
上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。
生育したコロニーを含むフイルターを通常の方法により
アルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキング処
理を行なった。このフイルターをプレハイブリダイズし
た後、このものと、上記プライマーの５′末端を３２Ｐ
−ｒ−ＡＴＰでラベルした３２Ｐ−プローベとを、室温
でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイル
ターを、６×ｓｓｃバッフアーで、室温で １０分間、
次いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃
で１８時間オートラジオグラフイーを行なった。変異し
た５クローンの内から代表としてＭ１３−ＧＩＦ−７１
ｓを選びこれをＪＭ１０５に感染させて培養し、ｓｓＤ
ＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。上記で得たｓｓＤＮ
ＡのＭ１３ジデオキシチェイン ターミネーシヨン シ
ークエンシングにより目的の遺伝子の変異の確認を行な
った。また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくできた制
限酵素ＤｄｅＩサイトも確認できた。ＪＭ１０５で増殖
させたＲＦ ＤＮＡより、 ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフ
ラグメントを調製し、これを前記（１）と同様にして発
現プラスミドに組込み、所望のポリペプチドＶＩ発現プ
ラスミド（ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓ）を得た。
該プラスミドは、これをエシェリヒア・コリＨＢ１０１
に保有させ、該株は微工研に「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１
Ｓ」なる名称で微工研寄第１２９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ
１２９６）として寄託されている。このプラスミドを
用いて、参考例２−（２）と同様にして、菌体抽出物上
清を得、該上清のＧＩＦ活性を測定した。その結果、培
養液１ｍｌ当りのＧＩＦ活性（単位／ｍｌ培養液）は、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として２．４×１
０６であつた。これより、参考例２−（３）と同一の手
段により、目的のポリペプチドＶＩを単離、精製した。 ポリペプチドＩＶの製造 プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−αを利用して上記と
同様にして、ポリペプチドＩＶを製造した。即ち、Ｍ１
３ｍｐ１１フアージベクターを、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ
鋳型として用いた。まずプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−αより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡフラグメント
を切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１フアージ（ＲＦ）のＥｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−α）
を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。合成オ
リゴヌクレオチド〔５′−ＣＴＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＣ
ＴＣ−３′（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化し、これをｓｓＭ１３−ＧＩＦ−α
ＤＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ｄＮＴ
Ｐｓの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグ
メント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５℃
で１８時間インキユベートした。得られたＤＮＡをＪＭ
１０５コンピテント細胞にトランスフオームし、生じた
コロニーを、寒天プレート上に１００コロニー植菌し、
３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーを含むフ
イルターを通常の方法によりアルカリ変性し、乾燥後、
８０℃で２時間ベーキング処理を行なった。このフイル
ターをプレハイブリダイズした後、このものと、上記プ
ライマーの５′末端を、３２Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルし
た３２Ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズさせ
た。ハイブリダイズさせたフイルターを、６×ｓｓｃバ
ッフアーで、室温で１０分間、次いで３７℃で１０分間
各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオ
グラフイーを行なった。変異した４クローンの内から代
表としてＭ１３−ＧＩＦ−８Ｓを選びこれをＪＭ１０５
に感染させて培養し、ｓｓＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調
製した。上記で得たｓｓＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェ
イン ターミネーシヨン シークエンシングにより目的
の遺伝子の変異の確認を行なった。また上記ＲＦ ＤＮ
Ａにおいて、新しくできた制限酵素ＨｉｎｆＩサイトも
確認できた。ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、
これを参考例２−（１）と同様にして発現プラスミドに
組込み、所望のポリペプチドＩＶ発現プラスミド（ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓ）を得た。このプラスミドを
用いて、参考例２−（２）と同様にして、菌体抽出物上
清を得た。該上消のＧＩＦ活性は、宿主してエシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１を用いた場合、１．２×１０５単位
／ｍｌ培養液であり、エシェリヒア・コリＷ３１１０を
用いた場合、６．２×１０５単位／ｍｌ培養液であつ
た。上記上清より、参考例２−（３）と同一の手段によ
り、目的のポリペプチドＶＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶの製造 上記及びで得たプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α
−７１Ｓ及びｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓの各々を、
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで切断後、ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓから約４００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを、またｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓ
から約４６００ｂｐのＤＮＡフラグメントをそれぞれ取
り出し、両者をライゲーシヨンして、ＩＬ−１β（ポリ
ペプチドＩ）のＮ末端から８番目及び７１番目のＣｙｓ
をいすれもＳｅｒに変更させた所望のポリペプチドＶの
発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ｓ７１Ｓ
を得た。このプラスミドを用いて、参考例２−（２）と
同様にして、菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主とする場合はＧＩＦ活性として１．４×１
０４単位／ｍｌ培養液、またエシェリヒア・コリＷ３１
１０を宿主とする場合はＧＩＦ活性として５×１０５単
位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と同
一の手段により、目的のポリペプチドＶを単離、精製し
た。 ポリペプチドＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＴ
ＴＣＴＣＴＧ−３′をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇを得た。該プラスミドは、これをエシェ
リヒア・コリＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に
「Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇ」なる名称で微工研寄第１２
９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９７）として寄託されて
いる。該プラスミドを用いて、参考例２−（２）と同様
にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ１０１
を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０５単位／
ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と同一の
手段により、目的のポリペプチドＩＩを単離、精製し
た。この精製操作において、ＣＭ−ＨＰＬＣの主ピーク
の前半部の再クロマトグラフイーによりポリペプチドＸ
ＸＸＸＶＩＩＩを精製品として得た。ポリペプチドＸＸ
ＸＸＶＩＩＩは、ポリペプチドＩＩと同程度のＣＳＦ産
生促進活性を有し、同様に、ＧＩＦ活性、ＬＡＦ活性及
びＰＧＥ産生促進活性がいずれも低い特徴を示した。 ポリペプチドＩＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧ
ＡＣＴＣＡＣＡ−３′をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドＩＩＩ発現用プラスミドｐｔｒｐ
ＧＩＦ−α−１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、参
考例２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として
２．８×１０６単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考
例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプチド
ＩＩＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡ
ＴＡＧＡＡ−３′をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドＶＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−１０２ＣＴを得た。該プラスミドを用い
て、参考例２−（２）と同様にして菌体抽出物上清（エ
シェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、ＧＩＦ活性
として７．４×１０４単位／ｍｌ培養液）を得、これよ
り参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペ
プチドＶＩＩを単離、精製した。 ポリペプチドＶＩＩＩの製造 上記と同様にして、５′−ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡＧ
ＧＡＴＡＴＡＡ−３′をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドＶＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−１４０ＣＴを得た。該プラスミドを用
いて、参考例２−（２）と同様にして、エシェリヒア・
コリＷ３１１０を宿主として用いることにより、菌体抽
出物上清（ＧＩＦ活性として５．８×１０３単位／ｍｌ
培養液）を得、これより参考例２−（３）と同一の手段
により、目的のポリペプチドＶＩＩＩを単離、精製し
た。また、上記プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−１
４０ＣＴを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主とし
て発現させることによつて、同様に菌体抽出物上清（Ｇ
ＩＦ活性として１．３×１０６単位／ｍｌ培養液）が得
られ、これより上記と同様にしてポリペプチドＩが単
離、精製された。尚、上記において、エシェリヒア・コ
リＨＢ １０１を宿主とする場合には、ナンセンスサプ
レツサーとしてＳｕｐＥが働き、ＵＡＧの終止コドンが
ＧＩｎとして読まれて（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈされ
て）ポリペプチドＩが発現される。一方宿主をエシェリ
ヒア・コリＷ３１１０とする場合には、ＳｕｐＥ遺伝子
がコードされていないため、上記ＵＡＧが終止コドンと
して働き、１４０個のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドＶＩＩＩが発現される。 ポリペプチドＩ〜ＶＩＩＩの同定 前記〜で得られた本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリ
ペプチドＩ〜ＶＩＩＩ）につき、参考例２−（４）と同
様にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％ポリアクリルアミド
ゲル、２ＭＥ＋）を行なった。 その結果、ポリペプチ
ドＩ〜ポリペプチドＶＩＩは、いずれも約１７．５ｋｄ
の位置に、またポリペプチドＶＩＩＩは約１６ｋｄの位
置に、それぞれ単一のバンドとして泳動された。また、
ポリペプチドＩのＧＩＦ活性に対する中和抗血清（参考
例２−（３）で得たポリペプチドＩを通常の方法に従
い、家兎に免疫して作製した抗血清、以下同じ）を用い
たウエスタンプロツテイング〔Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７６，１４２０（１９７９）〕により、
ポリペプチドＩ〜ポリペプチドＶＩＩＩの各々を、相当
する位置に単一のバンドとして確認した。 実施例２ 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシェリヒア
・コリＨＢ１０１／ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α）を、アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトフアン２０μｇ
／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌ中で３７℃で一晩培養
し、この４００ｍｌを１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地２０１に植菌し、３７℃で８．５時間培養した。遠心
分離により集菌し、得られる菌体を１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ
４に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、１０ｍＭトリス
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２日間透折した。
得られた透析液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分
間）して上清を得た。大腸菌培養液３００１分に相当す
る上記上清を集め、これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ５．０
に調製した後、ＳＰ−ゼータプレツプ２５０カートリツ
ジ〔ＬＫＢ社製〕に付Ｌ、流速３０ｍｌ／分で始め、１
０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で１００分、続い
て０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ５．５）で２２０分、更に１Ｍ ＮａＣｌを含む
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でそれぞれ溶出
させた。各分画をＨＰＬＣによりチェックし、目的物の
含まれているフラクシヨン、即ち０．１Ｍ ＮａＣｌを
念む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）のフラクシ
ヨン（フラクシヨンＮｏ．８〜１０）を集めた。これを
１００ｍＭ酢酸でｐＨ４．５とした後、ＨＰＬＣ〔東洋
曹達株式会社製、ＴＳＫゲルＳＰ−５ＰＷ、５．５×２
０ｃｍ〕に付し、下記条件で溶出させて、リテンシヨン
タイム（ｒ．ｔ．）６５〜７２分の分画を採取した。 溶離液Ａ：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．５） 流 速 ：３０ｍｌ／分 かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。これを、限外
濾過（ＹＭ−５メンブラン）により、２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液組成となるように
緩衝液を交換しつつ、濃縮（２０ｍｇ／ｍｌ）した。更
に、ポジタインフイルターＮＦＺ（日本ポール社製）を
装着した濾過装置に、上記濃縮液を供して滅菌濾過した
後、パイロジエンが１１００ｐｇ／ｍｇ蛋白以下の精製
品を得た。上記精製法により、大腸菌培養液３００１よ
り、ポリペプチドＩの約３ｇを収得した。 上記のＨＰＬＣ（ＳＰ−５ＰＷ）の溶出におい
て、メインピークの前半のフラクシヨン（ｒ．ｔ．６４
〜６５分）を採取し、これを再度クロマトグラフイーに
付すことにより、ポリペプチドＸを得た。２．７×１０
６ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。また同様に、メインピークの
後半のフラクシヨン（ｒ．ｔ．７２〜７６分）より、ポ
リペプチドＸＩを得た。２．８×１０７ＧＩＦ単位／ｍ
ｇ蛋白。 上記及びで得られたポリペプチドＩ、Ｘ及びＸ
Ｉのアミノ酸分析を、参考例２−（４）と同様にして行
なった。結果を下記第２表に示す。またポリペプチドＸ
及びＸＩについては、参考例２−（４）におけるアミノ
酸配列分析と同様にして、それらのＮ末端部配列を確
認、同定した。
【化１８】 ポリペプチドＩは、分子内に２個のＣｙｓ（８位及
び７１位）を有している。之等Ｃｙｓの側鎖ＳＨ基の存
在状態を、下記方法により調べた。 ａ．参考例２−（３）で得たポリペプチドＩの約５ナノ
モル相当（０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．５）溶液１００μｌ）を、Ａ、Ｂ
及びＣの３本の試験管にそれぞれ分取し、各試験管に
０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４５）を含有させた６
Ｍグアニジン塩酸溶液各３００μｌを加えた。次に試験
管Ａ及びＢには、６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを加
えてブランクとし、試験管Ｃには還元剤であるジチオス
レイトール２μモルを含む６Ｍグアニジン塩酸溶液２５
μｌを加え、各試験管に１分間窒素ガスを吹込んだ後、
５０℃で２時間放置した。次いで、試験管Ａには、ブラ
ンクとして、６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを、試験
管Ｂ及びＣにはヨードアセトアミド４μモルを含む６Ｍ
グアニジン塩酸溶液２５μモルを加え、各試験管に１分
間窒素ガスを吹込んだ後、暗所で２５℃下に ３０分間
放置した。上記の通り処理した試験管Ａ、Ｂ及びＣに、
それぞれ１０％ＴＦＡ５μｌを加え、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ
３）により蛋白質を精製した。精製蛋白質の約１／１０
量を試験管に取り、乾燥後、４Ｎ−メタンスルホン酸に
て加水分解し、アミノ酸組成を調べた。その結果、試験
管Ｂ及びＣからは、カルボキシメチルシステインが、ほ
ぼ同量検出された。このことから、試験管Ａではポリペ
プチドＩはそのままの状態であるのに対し、試験管Ｂ及
びＣでは、Ｓ−カルボキサミドメチル化−ポリペプチド
Ｉに変化したことが確認でき（試験管Ｂは還元剤にさら
していないので）、従ってポリペプチドＩに含まれるＣ
ｙｓは、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を本形成していな
いことが判った。更に、上記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生
成物の残量（％）を乾燥後、これらにそれぞれ１％重炭
酸アンモニウム溶液６００μｌを加えて溶解させて、各
々１μｇ／５μｌ濃度に調製した。之等各液にトリプシ
ン溶液７．５μｌをそれぞれ加え、３７℃で２０時間酵
索消化を行なった。その後、各液に１０％ＴＦＡ１０μ
ｌを加え、酵素反応を停止させ、逆相ＨＰＬＣ
（Ｃ１８）にて、ペプチド断片を分離した。その結果、
試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパターンを示し、試験管Ａは
之等とは異なるパターンを示した。上記で単離した各ペ
プチドのアミノ酸組成を、前記と同様にして求めた結
果、試験管Ａのペプチド断片から、Ｃｙｓ１個を含まな
ければ生じないポプチドの存在を確認した。以上の結果
から、ポリペプチドＩのＣｙｓ残基は、分内及び分子間
のいずれでもジスルフィド結合を形成していないことが
確認された。 ｂ．エルマン法〔Ｅｌｌｍａｎ法、Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２，７０（１９５９）〕
に従い、以下のごとくしてポリペプチドＩのＳＨ基の定
量を行なった。即ち、参考例２−（３）で得たポリペプ
チドＩの２００μｇ（１１．５μモル）を、６Ｍ塩酸グ
アニジン及び１−ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリス
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解させた。一
方、新鮮な０．０１Ｍ ＤＴＮＢ〔５，５′−ジチオビ
ス（２−ニトロベンゾイック アシッド〕を含む０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下これを「エルマ
ン試薬」という）を調製した。対照セルに６Ｎ塩酸グア
ニジン及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを、また試料セルにポ
リペプチドＩを含む上記溶液１ｍｌをそれぞれ導入し、
その各々にエルマン試薬各４０μｌを加えて混合し、直
ちに４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。最大吸光度
になった後、ＤＴＮＢの分解による吸光度の減少を
「０」に補正して、ＳＨ基の濃度を決定した。その結
果、実際に得られた４１２ｎｍでの吸光度は０．３２８
であった。一方、６Ｍ塩酸グアニジンを含む水溶液中で
の３−カルボキシレートー４−ニトロチオフエノレート
（３−ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ−４−ｎｉｔｒｏｔｈｉ
ｏ−ｐｈｅｎｏｌａｔｅ）イオンのε４１２は、１３８
８０Ｍ−１ｃｍ−１であり〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，３０，３２（１９７２）〕、このことより、ポリ
ペプチドＩ溶液のＳＨ基は、０．００００２４５（Ｍ／
ｅ）であり、ポリペプチドＩの１１．５μモル中にＳＨ
基が２４．５μモル存在することとなることが判った。
上記より、ポリペプチドＩに含まれるＣｙｓは、共に遊
離のＳＨ基を有していることが確認された。尚、ポリペ
プチドＩを水又はＰＢＳ（−）に溶解し、凍結乾燥を３
〜４回繰返した場合においても、ＧＩＦ活性及び上記エ
ルマン法によるＳＨ基の定量値には、殆んど変化は認め
られなかった。 遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等で多量に異種蛋
白質を発現させる場合、その蛋白質は大腸菌の菌体中に
不溶性物質（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）として蓄
積されることが多く、このような場合には、目的蛋白質
を菌体から採取するに当って、例えば７Ｍ塩酸グアニジ
ン、８Ｍ尿素又は０．１％ＳＤＳ等の変性剤を使用する
過激な条件下での処理が必要となる。しかるに、この様
な処理によれば、目的蛋白質は、その高次構造を含め
て、不可逆的な損傷を受けるおそれが多分にある。従っ
て、できる限り上記の如き変性剤を使用することなく、
温和な条件下で目的蛋白質を単離抽出できることが、上
記遺伝子組換え技術上の重要な関心事である。しかし
て、前記したに示す方法によれば、目的蛋白質の抽出
単離を、浸透圧ショックという非常に温和な条件の採用
により行なうことができ、この点で該方法は極めて好ま
しい。また該方法に従い得られる目的蛋白質は、より天
然に近い高次構造を保持されており、この点からも望ま
しいものである。 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−αを利用したサイトースペシフィックミュータジ
ェネシスにより、下記３表に示す各ポリペプチド（本発
明ＩＬ−１β誘導体）を得た。尚、各ポリペプチドの発
現、ＧＩＦ活性の測定及び精製は、上記に従うもので
あり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは参考例２−（４）に示す方法
に準じた。以下の各例でも特筆しない限り同様である。
び７１位）を有している。之等Ｃｙｓの側鎖ＳＨ基の存
在状態を、下記方法により調べた。 ａ．参考例２−（３）で得たポリペプチドＩの約５ナノ
モル相当（０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．５）溶液１００μｌ）を、Ａ、Ｂ
及びＣの３本の試験管にそれぞれ分取し、各試験管に
０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４５）を含有させた６
Ｍグアニジン塩酸溶液各３００μｌを加えた。次に試験
管Ａ及びＢには、６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを加
えてブランクとし、試験管Ｃには還元剤であるジチオス
レイトール２μモルを含む６Ｍグアニジン塩酸溶液２５
μｌを加え、各試験管に１分間窒素ガスを吹込んだ後、
５０℃で２時間放置した。次いで、試験管Ａには、ブラ
ンクとして、６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを、試験
管Ｂ及びＣにはヨードアセトアミド４μモルを含む６Ｍ
グアニジン塩酸溶液２５μモルを加え、各試験管に１分
間窒素ガスを吹込んだ後、暗所で２５℃下に ３０分間
放置した。上記の通り処理した試験管Ａ、Ｂ及びＣに、
それぞれ１０％ＴＦＡ５μｌを加え、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ
３）により蛋白質を精製した。精製蛋白質の約１／１０
量を試験管に取り、乾燥後、４Ｎ−メタンスルホン酸に
て加水分解し、アミノ酸組成を調べた。その結果、試験
管Ｂ及びＣからは、カルボキシメチルシステインが、ほ
ぼ同量検出された。このことから、試験管Ａではポリペ
プチドＩはそのままの状態であるのに対し、試験管Ｂ及
びＣでは、Ｓ−カルボキサミドメチル化−ポリペプチド
Ｉに変化したことが確認でき（試験管Ｂは還元剤にさら
していないので）、従ってポリペプチドＩに含まれるＣ
ｙｓは、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を本形成していな
いことが判った。更に、上記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生
成物の残量（％）を乾燥後、これらにそれぞれ１％重炭
酸アンモニウム溶液６００μｌを加えて溶解させて、各
々１μｇ／５μｌ濃度に調製した。之等各液にトリプシ
ン溶液７．５μｌをそれぞれ加え、３７℃で２０時間酵
索消化を行なった。その後、各液に１０％ＴＦＡ１０μ
ｌを加え、酵素反応を停止させ、逆相ＨＰＬＣ
（Ｃ１８）にて、ペプチド断片を分離した。その結果、
試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパターンを示し、試験管Ａは
之等とは異なるパターンを示した。上記で単離した各ペ
プチドのアミノ酸組成を、前記と同様にして求めた結
果、試験管Ａのペプチド断片から、Ｃｙｓ１個を含まな
ければ生じないポプチドの存在を確認した。以上の結果
から、ポリペプチドＩのＣｙｓ残基は、分内及び分子間
のいずれでもジスルフィド結合を形成していないことが
確認された。 ｂ．エルマン法〔Ｅｌｌｍａｎ法、Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８２，７０（１９５９）〕
に従い、以下のごとくしてポリペプチドＩのＳＨ基の定
量を行なった。即ち、参考例２−（３）で得たポリペプ
チドＩの２００μｇ（１１．５μモル）を、６Ｍ塩酸グ
アニジン及び１−ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリス
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解させた。一
方、新鮮な０．０１Ｍ ＤＴＮＢ〔５，５′−ジチオビ
ス（２−ニトロベンゾイック アシッド〕を含む０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下これを「エルマ
ン試薬」という）を調製した。対照セルに６Ｎ塩酸グア
ニジン及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌを、また試料セルにポ
リペプチドＩを含む上記溶液１ｍｌをそれぞれ導入し、
その各々にエルマン試薬各４０μｌを加えて混合し、直
ちに４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。最大吸光度
になった後、ＤＴＮＢの分解による吸光度の減少を
「０」に補正して、ＳＨ基の濃度を決定した。その結
果、実際に得られた４１２ｎｍでの吸光度は０．３２８
であった。一方、６Ｍ塩酸グアニジンを含む水溶液中で
の３−カルボキシレートー４−ニトロチオフエノレート
（３−ｃａｌｂｏｘｙｌａｔｅ−４−ｎｉｔｒｏｔｈｉ
ｏ−ｐｈｅｎｏｌａｔｅ）イオンのε４１２は、１３８
８０Ｍ−１ｃｍ−１であり〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，３０，３２（１９７２）〕、このことより、ポリ
ペプチドＩ溶液のＳＨ基は、０．００００２４５（Ｍ／
ｅ）であり、ポリペプチドＩの１１．５μモル中にＳＨ
基が２４．５μモル存在することとなることが判った。
上記より、ポリペプチドＩに含まれるＣｙｓは、共に遊
離のＳＨ基を有していることが確認された。尚、ポリペ
プチドＩを水又はＰＢＳ（−）に溶解し、凍結乾燥を３
〜４回繰返した場合においても、ＧＩＦ活性及び上記エ
ルマン法によるＳＨ基の定量値には、殆んど変化は認め
られなかった。 遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等で多量に異種蛋
白質を発現させる場合、その蛋白質は大腸菌の菌体中に
不溶性物質（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）として蓄
積されることが多く、このような場合には、目的蛋白質
を菌体から採取するに当って、例えば７Ｍ塩酸グアニジ
ン、８Ｍ尿素又は０．１％ＳＤＳ等の変性剤を使用する
過激な条件下での処理が必要となる。しかるに、この様
な処理によれば、目的蛋白質は、その高次構造を含め
て、不可逆的な損傷を受けるおそれが多分にある。従っ
て、できる限り上記の如き変性剤を使用することなく、
温和な条件下で目的蛋白質を単離抽出できることが、上
記遺伝子組換え技術上の重要な関心事である。しかし
て、前記したに示す方法によれば、目的蛋白質の抽出
単離を、浸透圧ショックという非常に温和な条件の採用
により行なうことができ、この点で該方法は極めて好ま
しい。また該方法に従い得られる目的蛋白質は、より天
然に近い高次構造を保持されており、この点からも望ま
しいものである。 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−αを利用したサイトースペシフィックミュータジ
ェネシスにより、下記３表に示す各ポリペプチド（本発
明ＩＬ−１β誘導体）を得た。尚、各ポリペプチドの発
現、ＧＩＦ活性の測定及び精製は、上記に従うもので
あり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは参考例２−（４）に示す方法
に準じた。以下の各例でも特筆しない限り同様である。
【化１９】
【化２０】 実施例１−で得たプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−α−１０２ＣＴを用いて、宿主をエシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０として、同様に発現及び精製して本発明ＩＬ
−β誘導体であるポリペプチドＸＸＸを得た。約１１．
４ｋｄ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、以下同じ）。 プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇを利用
し、プライマーとして５′−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧ
ＡＣＴＣＡＣＡ−３′を用いて、上記と同様にしてポ
リペプチドＸＩＶ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、エシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、同様に発現
（２．７×１０５ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＩＶ
を得た。約１７．５ｋｄ。 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ及びｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−９８Ｌを用
いて、ポリペプチドＸＶ発現用プラスミドｐｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを得た。即ち、上記両プラスミド
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇから約４００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを、またｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−９８Ｌ
から約４．６ｋｂＰのＤＮＡフラグメントをそれぞれ取
り出し、両者をライゲーションさせた。プラスミドｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを用いて、エシェリヒ
ア・コリＷ３１１０を宿主として同様に発現及び精製し
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＶを得
た。約１７．５ｋｄ。 〔１０〕 上記において、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドｐｔｒｐ ＧＩＦ−
α−１１Ｑ（その約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを
使用）を用いて、同様にしてポリペプチドＸＶＩ発現用
プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−１１Ｑ９８Ｌを得
た。該プラスミドを用い同様にして本発明ＩＬ−１β誘
導体であるポリペプチドＸＶＩを得た。約１７．５ｋ
ｄ。 〔１１〕 上記において、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを用いて、該プラスミドからの約４０
０ｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、同様にしてポ
リペプチドＸＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩ
Ｆ−α−４Ｇ１１Ｑ９８Ｌを得た。該プラスミドを用い
同様にして本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチド
ＸＩＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１２〕 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒ
ｐＧＩＦ−α−８Ａ及びｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１
Ｓを用いて、ポリペプチドＸＸＸＶＩ発現用プラスミド
ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを得た。即ち、上
記両プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨ１ｎｄＩＩ
Ｉで切断後、ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａから約４０
０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、またＰｔｒｐＧＩＦ−
α−７１Ｓから約４．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを
それそれ取り出し、両者をライゲーシヨンさせた。プラ
スミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを用い、エ
シェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として同様に発現
（８．７×１０５ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＸＸＶ
Ｉを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１３〕 上記〔１２〕において、プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−７１Ａ（その約４．６ｋｂｐのＤＮＡフ
ラグメントを使用）を用い、同様にしてポリペプチドＸ
ＸＸＶＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−
８Ａ７１Ａを得た。該プラスミドを保有するエシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１は微工研に「Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ
ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７
１Ａ」なる名称で微工条研第１２９８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ １２９８）として寄託されている。該プラスミドを
用い同様に発現（１．６×１０６ＧＩＦ単位／ｍｌ培養
液）及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペ
プチドＸＸＸＶＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１４〕 上記〔１２〕において、プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−７１Ｖを用いて、該プラスミドからの約
４．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを使用し、同様にし
てポリペプチドＸＸＸＶＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔ
ｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｖを得た。該プラスミドを
用いて同様に発現（２．１×１０６ＧＩＦ単位／ｍｌ培
養液）及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリ
ペプチドＸＸＸＶＩＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１５〕 上記の方法に従い、実施例１−〜及び
後記実施例３−〜の各々で得られた形質転換体よ
り、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＩＩ〜
ＶＩＩＩ及びＸＸＸＩ〜ＸＸＸＩＶを製造した。之等は
いずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドとして泳動さ
れた。またポリペプチドＩＩ〜ＶＩＩＩは、前記と同一
の位置に泳動され、ポリペプチドＸＸＸＩ〜ＸＸＸＩＶ
は、下記の通りであった。 ポリペプチドＸＸＸＩ 約２２ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＩ 約２３ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＩＩ 約２７ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＶ 約３１ｋｄ 実施例３ Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ａｓｃｅｎｓｏ，
Ｊ．Ｌ．ｅｔａ１，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．５７，ｐ１７
０（１９８１）〕１．４×１０９個を、１２−Ｏ−テト
ラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）
（フアルマシア社製）２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリン
Ａ（ＣｏｎＡ）（シグマ社製）１０ μｇ／ｍｌ及び１
０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培
地に入れて、４×１０５個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液１０ｍｌずつを、直径９ｃｍ
のシヤーレ（フアルコン３００３）に分注し、５％炭酸
ガス中、３７℃で３日間培養後、培養上清をアスピレー
ターにて除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサツカラ
イド（ＬＰＳ）（デイフコ社製） １０μｇ／ｍｌ、ム
ラミルジペプチド（ＭＤＰ）（和光純薬社製）１μｇ／
ｍｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０
培地１０ｍｌを、各シヤーレに分注した。この培地にて
５％炭酸ガス中、３７℃で１８時間培養し、シヤーレ底
部に付着したＵ９３７細胞をｍＲＮＡ調製用の材料とし
て利用した。 ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（ｇｕ
ａｎｉｄｉｕｍ／ｈｏｔ ｐｈｅｎｏｌ）法〔Ｆｅｒａ
ｍｉｓｃｏ，Ｊ．Ｒ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，Ｖｏｌ．２５７，ｐ１１０２４（１９８２）〕
とグアニジニウム／セシウムクロライド（ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍ／ｃｅｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）法〔Ｇ
ｌｉｓｉｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，Ｖｏｌ １３，ｐ２６３３（１９７４）〕との組
合せにより行なった。上記で培養したＵ９３７細胞を
洗浄するために、培養上清を除去した後、各シヤーレを
５ｍｌのＰＢＳ（−）溶液にてすすぎ、その後、各シヤ
ーレに１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート
混合液〔４Ｍ−グアニジンイソチオシアネート（Ｆｌｕ
ｋａ社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、
１０ｍＭＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザルコシン酸ナト
リウム〕を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバー
ポリスマンとパスツールピペツトにて回収して、細胞溶
解液４２０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１
８Ｇ注射針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせ
ん断し、その後６０℃に保温したフエノールを等量加
え、１８Ｇ注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。
次いでこの混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウムー１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ ｍＭ ＥＤＴＡ液２
１０ｍｌとクロロホルムーイソアミルアルコール（２
４：１容積比）混液４２０ｍｌとを加え、６０℃に保温
しながら、１５分間激しく攪拌した。混合液を氷冷後、
３０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、水層を回収し
た。水層に２容のエタノールを加え、−７０℃にて一夜
放置後、粗ＲＮＡ沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍグア
ニジン・イソチオシアナート−５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール
−０．５％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム液４８
ｍｌに溶解させ、塩化セシウム１９．２ｇを添加して溶
解させた。次にこの混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ塩化
セシウム−０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４ｍｌに
重層し、ベツクマンＳＷ４０Ｔｉローターにて、２５
℃、３１５００ｒｐｍで２０時間遠心して、ＲＮＡを分
取した。かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇであつ
た。次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを取得する
ため、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（コラボレイテイブ
リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、カラムクロマトグラ
フイーを行なった。吸着は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）−０．５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて
行い、溶出は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１
ｍＭ ＥＤＴＡにて行った。この結果、得られたｍＲＮ
Ａは、４００μｇであつた。 ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Ｏｋ
ａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）法により行った。即ち、ｃＤＮ
Ａクローニングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プ
ライマーは、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の
付加したリンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各
々オカヤマらの方法〔Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ
Ｐ．Ｂｅｒｇ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｒｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，ｐ２８０
（１９８３）〕に従って調製した。次に上記で得たｍ
ＲＮＡ１５μｇを、５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）
−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌ
に溶解し、６５℃で５分間、次いで３７℃で５分間イン
キユベートした後、反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、
３０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭジチオスレイトール、２
ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、
ベクター・プライマー ＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮａｓｅ
インヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）
６０ユニツト、逆転写酵素（バイオ−ラド社製）４０ユ
ニツトになるように調整して、３７℃で１時間インキユ
ベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）２μｌ及
び１０％ＳＤＳ２μｌを加えて反応を停止させた。その
後、フエノール．クロロホルム抽出及びクロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱としてベクター・プライマー
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。 回収されたベクター
・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを、１４０ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．
８）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭジチオスレイト
ール、０．３μｇポリ（Ａ）、６６μＭｄＣＴＰ及び３
８ユニツトのターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼ（フアルマシア社製）からなる反応液３０
μｌ中で３７℃、５分間インキユベートした後、０．５
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１．５μｌ及び１０％ＳＤ
Ｓ１．５μｌを加えて反応を停止させ、フエノール．ク
ロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行なって、エタ
ノール沈澱としてオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ
−ベクター・プライマーを回収した。この回収された核
酸を、７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、６０ｍＭＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清
アルブミン及び１２ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（日本ジーン社製）からなる反応液２０μｌ中で、３７
℃で９０分間インキユベートし、次いで０．５ＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７．５）１μｌ及び１０％ＳＤＳ１μｌを加え
て反応を停止させた。その後、フエノール・クロロホル
ム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱と
して、ＨｉｎｄＩＩＩ分解されたオリゴｄＣ鎖付加ｃＤ
ＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライマーを回収した。こ
れを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．５）（ＴＥ（ｐＨ７．５）１０μｌに
溶解させた。このうちの１μｌを用いて、上記ＴＥ（ｐ
Ｈ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ及びオリゴｄＣ鎖の付
加されたリンカーＤＮＡ１４ｎｇからなる反応液１０μ
ｌ中で、６５℃で２分間インキユベートし、次いで４２
℃で３０分間インキユベートした後、０℃に冷却した。
上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ
４、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ（ニコチンアミド．アデニ
ン．ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及び０．６μ
ｇのエシエリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（フアルマシア
社製）を含む反応液１００μｌとなるように調整し、１
２℃で一夜インキユベートした。この反応液に、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々を４０μＭ
になるように、またβ−ＮＡＤを ０．１５ｍＭになる
ようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・コリＤＮＡリ
ガーゼの０．４μｇ、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）の４．６ユ
ニツト及びエシェリヒア・コリＲＮａｓｅＨ（フアルマ
シア社製）の１ユニツトを加え、１２℃で１時間、次い
で２５℃で１時間インキユベートした。上記で得られた
反応液を用いて、エシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形
質転換させた。エシェリヒア・コリＨＢ１０１株のコン
ピテント．セルとしては、ベテスダ リサーチ ラボラ
トリーズ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：ＢＲＬ）の製品を使用し、該
ＢＲＬ社のマニユアルに従って、上記形質転換を行なっ
た。かくして、約２１０００個からなるｃＤＮＡライブ
ラリーが得られた。 サルＣｏｓ−１細胞へのトランスフェクシヨン 上記で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グループ
当り平均７０クローンのグループに分け、各グループか
らプラスミドＤＮＡを調整した。プラスミドＤＮＡは、
アルカリ溶菌法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，１９８２，ｐ３６８）に従い調製した。かくして各
グループから調製されたプラスミドＤＮＡを、それぞれ
サル培養細胞のＣｏｓ−１細胞〔Ｇｌｕｚｍａｎ，
Ｙ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２３，ｐ１７５（１９８
１）〕にトランスフェクションした。該トランスフェク
ションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によつた〔Ｙｏｋ
ｏｔａ，Ｔ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，，Ｖｏｌ．８１，ｐ１０７０（１
９８４）〕。即ち、Ｃｏｓ−１細胞をトリプシン処理に
より、１０％ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ−１６４０培地に
懸濁させ、細胞数を１×１０６個／ｍｌに調整後、１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエ
ル加えた６ウエルプレートに、各々５００μｌずつ分注
した。一晩３７℃で培養後、上清を除き、血清を含まな
い培地で細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌプラスミドＤＮ
Ａ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（フアル
マシア社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）及
び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を１ｍｌ
／ウエル加えて、４．５時間３７℃で培養した。その
後、上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、
１５０μＭクロロキン（シグマ社製）及び１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え
て、更に３７℃で３時間培養した。上清を除き、血清を
含まない培地で細胞を洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエル加えて、３７℃で
７２時間培養した。上清を回収した後、１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え、凍
結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収した。この培養
上清及び細胞抽出液について、ＧＩＦ活性を測定した。
ＧＩＦ活性を示したグループを１０クローン／グループ
の２４グループに分け、上記と同様の操作を行ない、Ｇ
ＩＦ活性を測定し、活性を示したグループについて、更
にグループ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を
行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同定した。かく
して、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びｐｃＤ−ＧＩＦ−２０
７の２種類のクローンを得た。之等のクローンのＧＩＦ
活性（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を第４表に示す。 クローンの解析 次に、両クローン由来のＧＩＦ活性の物質としての異同
を明白にするため一定のＧＩＦ活性を示すｐｃＤ−ＧＩ
Ｆ−１６又はｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７の培養上清及び細
胞抽出物のそれぞれに対して、ポリペプチドＩのＧＩＦ
活性に対する中和抗血清の順次希釈液を添加し、上記各
上清及び細胞抽出物に与える影響を試験した。その結果
を第３図−ａ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６培養上清）、第３
図−ｂ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６細胞抽出物）、第３図−
ｃ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７培養上清）及び第３図−ｄ
（ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７細胞抽出物）に示す。各図に
おいて横軸は血清希釈倍率を、縦軸はＧＩＦ活性（％）
を各々示す。また各図中（１）は抗ポリペプチドＩ血清
を、（２）は正常血清をそれぞれ示す。第３−ａ図及び
第３−ｂ図に示す通り、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６由来のＧ
ＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清の添加により、濃度
依存的に、完全に中和されたが、第３−ｃ図及び第３−
ｄ図に示す通り、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ
活性は、抗ポリペプチドＩ血清には全く影響されなかっ
た。従って、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ活性
物は、ポリペプチドＩ及びｐｃＤ−ＧＩＦ−１６由来の
ＧＩＦ活性物とは、免疫学的に異なることが判明した。
また、プラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びｐｃＤ−Ｇ
ＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図４に示す。
更に之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化学修飾法
〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．６５，ｐ４９９（１９８０）〕及びフアージＭ１３
ベクター〔Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１９，ｐ２６９（１９８
２）〕を使用したジデオキシ・チエーン・ターミネーシ
ヨン〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，Ｖｏｌ．７４，ｐ５４６３（１９７７）〕により決
定した。その結果、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６の有するｃＤ
ＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１βの翻訳領域ｃＤ
ＮＡ配列と同一であり、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７の有す
るｃＤＮＡは、同じくＩＬ−１αの翻訳領域ｃＤＮＡ配
列と同一であることが確認された〔Ｃａｒｌ Ｊ．Ｍａ
ｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１
５，ｐ６４１（１９８５）〕。 ポリペプチドＸＸＸＩＶの製造 上記で得たフルレングス（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）
に近いＩＬ−１βのｃＤＮＡクローンｐｃＤ−ＧＩＦ−
１６を、制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、更に制限酵素Ｎ
ｃｏＩで部分切断して、３８０ｂｐのＮｃｏＩ−Ｐｖｕ
ＩＩＤＮＡフラグメントを、アロースゲル電気泳動法に
より単離、精製した。このＤＮＡフラグメントにマン
グ．ビーン．ヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ）を作用させて、制限酵素ＮｃｏＩ切断に
より生じた接着末端を平滑末端とした。次に、合成オリ
ゴヌクレオチド〔５′−ＧＡＴＡＡＴＧ−３′及び５′
−ＣＡＴＴＡＴ−３′〕の各５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化し、之等を先のＤＮＡフ
ラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限
酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動法により、約４００ｂｐのＣｌａＩ−
Ｈｉｂｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメント＜Ａ＞を単離、
精製した。他方、前記で得た発現プラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−αを、制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ で切断し、大きい方のＤＮＡフラグメント＜Ｂ＞
を、アガロースゲル電気泳動方により単離、精製した。
上記フラグメント＜Ａ＞と＜Ｂ＞とをＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１
０１にトランスフオームさせた。ボイリング法により、
得られるトランスフォーマントのプラスミドＤＮＡを抽
出し、制限酵素による切断地図を解析して、目的のトラ
ンスフオーマントを選択した。かくして単離された目的
トランスフオーマント（エシエリヒア・コリＨＢ１０１
／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−Ｖ）を、５０μｇ／ｍｌＬ
−トリプトファンを含むＬＢ培地１０ｍｌ中で、３７℃
で一晩振盪培養し、この１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地５０ｍｌ
に植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０ｎｍでの吸光度
が約１．０となった時点で菌体を集め、１５％シューク
ロースー５０ｍＭトリスＨＣｌ−５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、これに１０ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で溶解〕溶液５００μｌを加え、更に０．３％トリ
トンＸ１００−１８７．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）
−１５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌ
を加え、室温で１５分間放置後、超音波処理を行ない、
遠心分離により菌体抽出物上清を得た。得られた菌体抽
出物上清について、ＧＩＦ活性の測定を行なった所、培
養液１ｍｌ当り１１２ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩＩの製造 前記で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＡｃｃＩで切断して、約０．７ｋｂの ＮｃｏＩ
−ＡｃｃＩＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気
泳動法により単離、精製した。このＤＮＡフラグメント
を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いた処
理により、その両末端を平滑末端とした。他方、プラス
ミドｐＴＭ１を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ で切断
後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、
切断部位を平滑末端とした。上記により得られる２つの
ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトラン
スフォームし、ボイリング法によりトランスフォーマン
トからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断
地図から目的のトランスフォーマントを選択した。かく
して単離されたトランスフォーマント（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩＩ）
を、上記に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り１９０ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩＩＩの製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−ス
ペシフィック ミュータジェネシスの方法に従い、以下
に詳述するように不要な塩基配列部位を除去することに
より実施した。即ち、ｐＧＩＦ−αを、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ及び ＡｃｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法
により、約０．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＡｃｃＩＤＮＡフラ
グメントを単離、精製し、その両末端をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端とした。このフラグメント
を、別途にプラスミドｐＴＭ１を制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）
を用いて平滑末端として調製したＤＮＡフラグメント
に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、目的
トランスフォーマントを、ボイリング法により抽出され
たプラスミドＤＮＡの制限酵素地図により選択した。ま
た得られたプラスミドのＤＮＡ塩基配列も確認した。以
下このプラスミドを「ｐＴＭ１−Ｉ−２］と呼ぶ。次い
で、プラスミドｐＴＭ１−Ｉ−２を、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ で切断して、約７４０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、
アガロースゲル電気泳動法により単離、精製した。これ
を、Ｍ１３ｍｐ１１フアージ（ＲＦ）のＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ の制限酵素部位に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。これから一本鎖（ｓｓ） ＤＮＡ
（ｍｐ１１−ｔｒｐ−１２（Ｅ／Ｍ））を得、これをミ
ューダジェネシスの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチ
ド〔５′−ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴ
ＡＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴ−３′（プライマー）〕
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これ
をｓｓ ｍｐ１１−ｔｒｐ−１−２（Ｅ／Ｍ）とハイブ
リダイズし、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理し、１５℃で２晩インキユベートし
た。得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞にト
ランスフォームし、生じたコロニーを、寒天プレート上
に２００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。
生育したコロニーを含むフィルターを通常の方法により
アルカリ処理変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキン
グ処理した。このフィルターをハイブリダイズした後、
このものと上記プライマーの５′末端を３２Ｐ−γ−Ａ
ＴＰでラベルされた３２Ｐ−プローベとを、室温でハイ
ブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイルターを
６×ＳＳＣバッファーを用い、室温で１０分間、次いで
０．２５×ＳＳＣバッファーを用い６０℃で５分間各々
洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオグラ
フィーを行なった。変異したクローンの内から、代表と
してｍｐ１１−ｔｒｐ ＧＩＦ−α一ＩＶ（Ｅ／Ｍ）を
選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養し、ｓｓＤＮ
Ａ及び ＲＦ ＤＮＡを調製した。上記で得られたｓｓ
ＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェイン ターミネーション
シークエンシングにより、目的遺伝子の削除を確認し
た。また、ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡより約
６３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフ
ラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、
精製した。一方、プラスミドｐＴＭ１−Ｉ−２より、同
様にして約４．２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
ＤＮＡフラグメントを、単離、精製し、これと先の約６
３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラ
グメントとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、
連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォ
ームさせた。目的のトランスフォーマントは、ボイリン
グ法に従い、トランスフォーマントよりブラスミドを抽
出し、その制限酵素地図解析により選択した。かくして
単離されたトランスフォーマント（エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＶ）を、前記
に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌体抽出物
上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養液１ｍｌ
当り３３６ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩの製造 上記と同様にして、所望のポリペプチド発現プラスミ
ドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩを保有するトランスフ
ォーマントを作成した。鋳型としては、先の一本鎖ＤＮ
Ａｍｐ１１−ｔｒｐ−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）を用いた。また
プライマーとしては、合成オリゴヌクレオチド〔５′−
ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣ
ＴＧＧＴＴＣＣＣＴ−３′〕を用いた。上記プラスミド
を保有するトランスフォーマント（エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩを同様にし
て培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩ
Ｆ活性は培養液１ｍｌ当り１１２ユニツトであった。本
発明ＩＬ−１β自身（ポリペプチドＩ）及びその本発明
誘導体のＧＩＦ活性については、既に記載したが、加え
て以下の試験を行なった。尚、前記したポリペプチドＩ
に対する抗血清を用いて、ＲＩＡ法により測定したポリ
ペプチドＩ換算蛋白量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）
は、下記第５表に示す通りである。 薬理試験例１：ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試
験 ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験ＣＳＦ
産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Ｈｕｍａ
ｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｕｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔｓ，ＡＴＣＣ登録細胞株Ｎｏ．ＣＣＬ−１５３）を
用い、以下の試験を行なった。まず、上記ＨＦＬ−１細
胞を２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように、１０
％ウシ胎児血清加ハムスター１２Ｋ培養液〔Ｈａｍ，
Ｒ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させた。次いでヒ記
細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した前記参考例で得
たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で
２４時間、４８時間及び７２時間各々培養し、各培養上
清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ量
を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Ｌｅｗｉｓ，
Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２８，
１６８（１９８２）〕。ポリペプチドＩを用いて得られ
た各培養時間（ｈｒ）での結果を図５に示す。図におい
て、横軸はポリペプチドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）
を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ）を示す。上記結果
より、ポリペプチドＩの添加によれば、ＨＦＬ−１細胞
株のＣＳＦ産生量は、該ポリペプチドの無添加に比べて
実に数百倍にも亢進されることが明らかである。 ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対するポリペプチド
Ｉの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてｃＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎｏ．）を利用して以下の試験を行なった。上記
細胞を２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように１０
％ウシ胎児血清加ダルベツコＭＥＭ培養液〔Ｄｕｌｂｅ
ｃｏ，Ｒ．ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕に浮遊させた。上記
細胞浮遊液に、種々の濃度の参考例で得たポリペプチド
Ｉを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４、４８及び
７２時間培養した後、培養上清を集め、産生されたＣＳ
Ｆ量をマウス骨髄細胞を使用して上記試験と同様にし
て測定した。得られた結果を図５と同様にして、図６に
示す。図６より、ＧＩＦ活性として１単位／ｍｌ以上の
ポリペプチドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽細胞に加
えることにより、該細胞のＣＳＦ産生能は著しく促進さ
れることが明らかである。 生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発２されることを以下の動物実験に
より試験した。即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０５
〜１０５単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
た。結果を図７に示す。図において横軸は各種濃度（Ｇ
ＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時間（ｈ
ｒ）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を各々示
す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万ＧＩＦ単
位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／個体投
与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投与群
を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投与
群）を各々示す。図７より、ポリペプチドＩを動物に与
えた場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなって
いることが判明した。即ち、ポリペプヂト１は注射され
た量に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させ
る作用のあることが認められた。 薬理試験例２：ポリペプチドＩの抗関節炎試験 パースン〔Ｐｅａｒｓｏｎ，ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．
Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９１，９５（１
９５６）〕及びワードとジョーンズ〔Ｗａｒｄ，Ｊ．
Ｒ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｓ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒ
ｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５，５５７（１９６２）〕の方法
に準じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。即
ち、雌性Ｓ．Ｄ．系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテ
リウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂ
ｕｔｙｒｉｃｕｍ）死菌を流動パラフインに懸濁させた
アジユバントを０．０５ｍｌ注射した。１４日目に足腫
脹に基づいて群分けし（ｎ＝６）、その翌日より５日間
に亘って、参考例で得たポリペプチドＩ又はその溶媒
（生理食塩水；対照群）を、皮内投与した。経日的に足
容積を測定することにより、関節炎に対する影響を評価
した。結果を図８に示す。図において横軸はアジユバン
ト投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×０．０１ｍ
ｌ）を各々示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１
０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ
単位／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／
個体投与群を、（４）は同１００ＧＩＦ単位／個体投与
群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、また
（６）は正常ラツト群を各々示す。図８より、対照群
（グラフ（５））の足腫脹は、２３日目まで増悪したの
に対し、ポリペプチドＩの投与群（グラフ（１）〜
（４））においては、その投与の４日目（アジユバンド
投与後１８日目）より足腫脹の抑制作用が認められ、最
終投与４日後（アジユバンド投与後２３日目）において
も関節炎の進行を阻止できることが確認された。 薬理試験例３：本発明誘導体のＣＳＦ産生促進効果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇｌｉ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ，Ｈｕｍ
ａｎ〕を用いて、以下の試験を行なった。上記細胞を、
２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％Ｆ
ＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｆｌ
ｏｗ社製）及びＭＥＭピルビン酸ナトリウム（ＦｌｏＷ
社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地（日水社製）に浮
遊させ、種々の濃度となるように被験物質を加えて、炭
酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培養した。各培養上
清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ量
を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Ｌｅｗｉｓ，
Ｉ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２８，１
６８（１９８２）〕。結果を図９に示す。図において、
横軸は被験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ
活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。また、図中、曲線（１）〜
（７）は、以下の各ポリペプチドを被験物質とした時の
結果を示す。 曲線（１）…ポリペプチドＶＩ 曲線（２）…ポリペプチドＩＩ 曲線（３）…ポリペプチドＶＩＩＩ 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドＩＶ 曲線（６）…ポリペプチドＩＩＩ 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐｔｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１１，５４４
−５４７（１９６２）〕に準じて、この試験を行なっ
た。即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Ｓｐｒａｑｕｅ Ｄ
ａｗｌｅｙ系、日本チャールスリバー社）を、実験前日
に体重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。
起炎剤としてカラゲニン（Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｏｉ
ｄ社製）を、生理食塩水に１％となるように懸濁させた
ものを使用し、ラツトの右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注
射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を評価するため、起
炎剤注射の前後の一定時間に、右後肢足蹠容積を、プレ
シモメーター（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ，Ｕｇｏ
−Ｖａｓｉｌｅ社製）を用いて測定した。前値に対する
起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率（ｓｗｅｌｌｉｎｇ
％）として表わした。被験物質は、ダルベッコのリン酸
塩緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｏ ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶解希釈し、
ラツトの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射の１時間
前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群を作成
し、同一実験に供した。結果を図１０に示す。図におい
て横軸は、起炎剤投与後時間（ｈｒ）を、縦軸は浮腫率
（％）を示す。また、図中、曲線（１）は対照群を、曲
線（２）はポリペプチドＶＩの０．１μｇ投与群を、曲
線（３）はポリペプチドＶＩの１μｇ投与群を、曲線
（４）はポリペプチドＶＩの１０μｇ投与群をそれぞれ
示す。 薬理試験例５：本発明誘導体の放射線障害防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドＶＩの１μｇ／マウス
又は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装
置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、
８５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、
以後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
て、ＰＢＳ投与群をおいた。結果を図１１に示す。図に
おいて横軸はＸ線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動
物の生存率（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドＶ
Ｉの１μｇ投与群を、曲線（２）はポリペプチドＶＩの
０．３μｇ投与群を、また曲線（３）はコントロール群
をそれぞれ示す。図１１より、コントロール群では、Ｘ
線照射後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチ
ドＶＩ投与群では、その投与量に依存して、放射線障害
の防止作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放
射線障害による死亡から回避され、生存することが確認
された。 薬理試験例６：本発明誘導体の日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。
ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群７匹）
とし、第１日目に、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ、
協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。第
２日目、第４日目及び第６日目に、ポリペプチドＶＩの
１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、緑膿菌（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＥ−２）
の所定量を腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供
試動物の生存数を計数して、生存率（％）を求めた。結
果を図１２（１）〜（３）に示す。図１２（１）は上記
実験群の結果を、同（２）はポリペプチドＶＩを投与し
なかった（５−Ｆｕのみを投与した）対照群の結果を、
また同（３）は５−Ｆｕ及びポリペプチドＶＩのいずれ
も投与しなかった対照群の結果をそれそれ示す。第１２
図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑膿菌投与
量を採用した群Ａ〜Ｅをそれぞれ示す。 Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 製剤例１ ＧＩＦ活性として１×１０７単位／ｍｌのポリペプチド
ＶＩの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）を０．５％となるように添加して、濾過（０．２２
μｍメンブランフイルター）後、これを無菌的に１ｍｌ
ずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調
製した。かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸
留水１ｍｌに溶解して利用される。 ＜動物細胞からのサイトカインの製造方法＞ 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸＶＩＩ及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞
〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，１６８２−１６８９
（１９８５）〕を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに
て培養した。培養２４時間後の上清を採取し、そのＩＬ
−２活性を、スミス（Ｋ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ）らの方法に
従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を用
いて測定した〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２
７（１９７８））〕。結果を下記第６表に示す。 Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−
１６４０培地で集密的まで培養し、更に２０ｎｇ／ｍｌ
のポリペプチドＸＸＸＶＩＩを含む又は含まない（コン
トロール）上記培地中で１８時間インキュベートした。
培地を除去した後、前記実施例３−に準じて、グアニ
ジニウム／セシウムクロライド法により ＲＮＡを抽出
し、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーに
より、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を収得した。ノ
ザン．ブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）に従い、上記ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの１０μｇ
をアガロースゲル（１．２％）電気泳動に付し分画後、
ニトロセルロース・フィルターに転写した。減圧下に８
０℃でベーキングし、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）中で１００℃５分間の処理後、５０％フォルム
アミド、５×ｓｓｃ、５０ｍＭソジウムフォスフェート
（ｐＨ６．５）、４×デンハード液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び２００μｇ／ｍｌの変性サ
ルモン スペラムＤＮＡ中で４２℃下にプリハイブリダ
イゼーションを行った。５時間後、ニックトランスレー
シヨンで放射能標識したＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ〔Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２２８，８１０（１９８５）〕のＰｓｔＩ−
ＮｃｏＩＤＮＡ断片又はＢＳＦ−２ｃＤＮＡ〔Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３２４，７３（１９８６）〕のＫｐｎＩ−Ｂａ
ｍＨ ＩＤＮＡ断片と、４２℃下に２０時間ハイブリダ
イゼーションを行った。フィルターを、０．１％ＳＤＳ
加２×ｓｓｃで室温下に１５分間、更に０．１％ＳＤＳ
加０．１×ｓｓｃで５０℃下に１時間洗浄した。オート
ラジオグラムは、増感紙を用いて、−７０℃下に一夜行
った。ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用いた時の結果を図
１３に示す。レーンＡは本発明ポリペプチドを用いた結
果を、レーンＢは本発明ポリペプチドを用いないコント
ロールの結果を示す。また、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を
用いた時の結果を図１３に準じて図１４に示す。以上に
示す結果より、本発明ポリペプチドを用いることによ
り、動物細胞からの天然サイトカイン類の生産が効率よ
く行い得ることが判る。また、本発明ポリペプチドの、
かかる方法への適用に際しては、極めて微量、通常１０
ｎｇ／ｍｌ程度の使用で十分であり、誘導されたサイト
カイン類の精製過程をも容易にする。 動物細胞よりサイトカインを生産する場合、産生誘
引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下において
構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ−１受容体に結
合することが必須である。すなわち、本発明ポリペプチ
ドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要
なシグナルを細胞内に伝えることが重要である。そこ
で、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結合に関して、
以下の試験を行った。６−ｗｅｌｌプレート上で、一面
にほぼ均一にまで増殖したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（クロ
ーンＡ３１：ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×１０６ｃ
ｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に、１２５Ｉで標識したポリペプ
チドＩ（ＩＬ−１β）の５００００ｃｐｍ／ｗｅｌｌ及
び事前に１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭ中で３７℃下にイン
キユベートした２０ｎｇ／ｍｌのポリペプチドＩを加
え、４℃で反応させた。反応液をパスツールピペットで
除き、１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの １ｍｌを加えて静
かに洗い上清をすてた。この洗浄操作を２回繰返した
後、１ｍｌの１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨで細胞を
可溶化し、可溶化液及びさらにウエルを洗浄した可溶化
液中の放射能（結合放射能）をγ−カウンターにて測定
した。尚、上記１２５Ｉ標識ポリペプチドＩは、ボルト
ンとハンター（Ｂｏｌｔｏｎａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ）の
方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３３，５２９（１９７
３）〕に従い製造、精製した（比活性；２５０μＣｉ／
μｇｐｒｏｔｅｉｎ以上）。得られた結果を下記第７表
に示す。 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。上記第７表より、ポリペプチ
ドＩ、即ちＩＬ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下
において、時間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合
力が低下してしまうことが明らかとなった。そこで、上
記において、２４時間の事前のインキュベーシヨンを行
ったポリペプチドＩ、ポリペプチドＶＩ又はポリペプチ
ドＸＸＸＶＩＩを用いた同試験を行った。結果を下記第
８表に示す。 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に際
しては、ＩＬ−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。
−α−１０２ＣＴを用いて、宿主をエシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０として、同様に発現及び精製して本発明ＩＬ
−β誘導体であるポリペプチドＸＸＸを得た。約１１．
４ｋｄ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、以下同じ）。 プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇを利用
し、プライマーとして５′−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧ
ＡＣＴＣＡＣＡ−３′を用いて、上記と同様にしてポ
リペプチドＸＩＶ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、エシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、同様に発現
（２．７×１０５ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＩＶ
を得た。約１７．５ｋｄ。 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ及びｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−９８Ｌを用
いて、ポリペプチドＸＶ発現用プラスミドｐｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを得た。即ち、上記両プラスミド
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇから約４００ｂｐのＤＮＡ
フラグメントを、またｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−９８Ｌ
から約４．６ｋｂＰのＤＮＡフラグメントをそれぞれ取
り出し、両者をライゲーションさせた。プラスミドｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを用いて、エシェリヒ
ア・コリＷ３１１０を宿主として同様に発現及び精製し
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＶを得
た。約１７．５ｋｄ。 〔１０〕 上記において、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドｐｔｒｐ ＧＩＦ−
α−１１Ｑ（その約４００ｂｐのＤＮＡフラグメントを
使用）を用いて、同様にしてポリペプチドＸＶＩ発現用
プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−１１Ｑ９８Ｌを得
た。該プラスミドを用い同様にして本発明ＩＬ−１β誘
導体であるポリペプチドＸＶＩを得た。約１７．５ｋ
ｄ。 〔１１〕 上記において、プラスミドｐ ｔｒｐ Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを用いて、該プラスミドからの約４０
０ｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、同様にしてポ
リペプチドＸＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩ
Ｆ−α−４Ｇ１１Ｑ９８Ｌを得た。該プラスミドを用い
同様にして本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチド
ＸＩＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１２〕 実施例１−に準じて、プラスミドｐ ｔｒ
ｐＧＩＦ−α−８Ａ及びｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−７１
Ｓを用いて、ポリペプチドＸＸＸＶＩ発現用プラスミド
ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを得た。即ち、上
記両プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨ１ｎｄＩＩ
Ｉで切断後、ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａから約４０
０ｂｐのＤＮＡフラグメントを、またＰｔｒｐＧＩＦ−
α−７１Ｓから約４．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを
それそれ取り出し、両者をライゲーシヨンさせた。プラ
スミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを用い、エ
シェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として同様に発現
（８．７×１０５ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＸＸＶ
Ｉを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１３〕 上記〔１２〕において、プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−７１Ａ（その約４．６ｋｂｐのＤＮＡフ
ラグメントを使用）を用い、同様にしてポリペプチドＸ
ＸＸＶＩＩ発現用プラスミドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−
８Ａ７１Ａを得た。該プラスミドを保有するエシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１は微工研に「Ｅｓｃｈｅｒｉｈｉａ
ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７
１Ａ」なる名称で微工条研第１２９８号（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ １２９８）として寄託されている。該プラスミドを
用い同様に発現（１．６×１０６ＧＩＦ単位／ｍｌ培養
液）及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペ
プチドＸＸＸＶＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１４〕 上記〔１２〕において、プラスミドｐ ｔｒ
ｐ ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−７１Ｖを用いて、該プラスミドからの約
４．６ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを使用し、同様にし
てポリペプチドＸＸＸＶＩＩＩ発現用プラスミドｐ ｔ
ｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｖを得た。該プラスミドを
用いて同様に発現（２．１×１０６ＧＩＦ単位／ｍｌ培
養液）及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリ
ペプチドＸＸＸＶＩＩＩを得た。約１７．５ｋｄ。 〔１５〕 上記の方法に従い、実施例１−〜及び
後記実施例３−〜の各々で得られた形質転換体よ
り、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＩＩ〜
ＶＩＩＩ及びＸＸＸＩ〜ＸＸＸＩＶを製造した。之等は
いずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドとして泳動さ
れた。またポリペプチドＩＩ〜ＶＩＩＩは、前記と同一
の位置に泳動され、ポリペプチドＸＸＸＩ〜ＸＸＸＩＶ
は、下記の通りであった。 ポリペプチドＸＸＸＩ 約２２ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＩ 約２３ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＩＩ 約２７ｋｄ ポリペプチドＸＸＸＩＶ 約３１ｋｄ 実施例３ Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ａｓｃｅｎｓｏ，
Ｊ．Ｌ．ｅｔａ１，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．５７，ｐ１７
０（１９８１）〕１．４×１０９個を、１２−Ｏ−テト
ラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）
（フアルマシア社製）２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリン
Ａ（ＣｏｎＡ）（シグマ社製）１０ μｇ／ｍｌ及び１
０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培
地に入れて、４×１０５個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液１０ｍｌずつを、直径９ｃｍ
のシヤーレ（フアルコン３００３）に分注し、５％炭酸
ガス中、３７℃で３日間培養後、培養上清をアスピレー
ターにて除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサツカラ
イド（ＬＰＳ）（デイフコ社製） １０μｇ／ｍｌ、ム
ラミルジペプチド（ＭＤＰ）（和光純薬社製）１μｇ／
ｍｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０
培地１０ｍｌを、各シヤーレに分注した。この培地にて
５％炭酸ガス中、３７℃で１８時間培養し、シヤーレ底
部に付着したＵ９３７細胞をｍＲＮＡ調製用の材料とし
て利用した。 ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（ｇｕ
ａｎｉｄｉｕｍ／ｈｏｔ ｐｈｅｎｏｌ）法〔Ｆｅｒａ
ｍｉｓｃｏ，Ｊ．Ｒ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，Ｖｏｌ．２５７，ｐ１１０２４（１９８２）〕
とグアニジニウム／セシウムクロライド（ｇｕａｎｉｄ
ｉｎｉｕｍ／ｃｅｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）法〔Ｇ
ｌｉｓｉｎ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，Ｖｏｌ １３，ｐ２６３３（１９７４）〕との組
合せにより行なった。上記で培養したＵ９３７細胞を
洗浄するために、培養上清を除去した後、各シヤーレを
５ｍｌのＰＢＳ（−）溶液にてすすぎ、その後、各シヤ
ーレに１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート
混合液〔４Ｍ−グアニジンイソチオシアネート（Ｆｌｕ
ｋａ社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ ７．６）、
１０ｍＭＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザルコシン酸ナト
リウム〕を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバー
ポリスマンとパスツールピペツトにて回収して、細胞溶
解液４２０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１
８Ｇ注射針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせ
ん断し、その後６０℃に保温したフエノールを等量加
え、１８Ｇ注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。
次いでこの混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウムー１０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１ ｍＭ ＥＤＴＡ液２
１０ｍｌとクロロホルムーイソアミルアルコール（２
４：１容積比）混液４２０ｍｌとを加え、６０℃に保温
しながら、１５分間激しく攪拌した。混合液を氷冷後、
３０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、水層を回収し
た。水層に２容のエタノールを加え、−７０℃にて一夜
放置後、粗ＲＮＡ沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍグア
ニジン・イソチオシアナート−５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール
−０．５％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム液４８
ｍｌに溶解させ、塩化セシウム１９．２ｇを添加して溶
解させた。次にこの混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ塩化
セシウム−０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４ｍｌに
重層し、ベツクマンＳＷ４０Ｔｉローターにて、２５
℃、３１５００ｒｐｍで２０時間遠心して、ＲＮＡを分
取した。かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇであつ
た。次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを取得する
ため、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（コラボレイテイブ
リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．社製）を用いて、カラムクロマトグラ
フイーを行なった。吸着は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．５）−０．５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて
行い、溶出は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１
ｍＭ ＥＤＴＡにて行った。この結果、得られたｍＲＮ
Ａは、４００μｇであつた。 ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Ｏｋ
ａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ）法により行った。即ち、ｃＤＮ
Ａクローニングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プ
ライマーは、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の
付加したリンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各
々オカヤマらの方法〔Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ
Ｐ．Ｂｅｒｇ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ
ｒｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，ｐ２８０
（１９８３）〕に従って調製した。次に上記で得たｍ
ＲＮＡ１５μｇを、５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）
−０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌ
に溶解し、６５℃で５分間、次いで３７℃で５分間イン
キユベートした後、反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、
３０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭジチオスレイトール、２
ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、
ベクター・プライマー ＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮａｓｅ
インヒビター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）
６０ユニツト、逆転写酵素（バイオ−ラド社製）４０ユ
ニツトになるように調整して、３７℃で１時間インキユ
ベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）２μｌ及
び１０％ＳＤＳ２μｌを加えて反応を停止させた。その
後、フエノール．クロロホルム抽出及びクロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱としてベクター・プライマー
ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。 回収されたベクター
・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを、１４０ｍＭカコジ
ル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ６．
８）、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭジチオスレイト
ール、０．３μｇポリ（Ａ）、６６μＭｄＣＴＰ及び３
８ユニツトのターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼ（フアルマシア社製）からなる反応液３０
μｌ中で３７℃、５分間インキユベートした後、０．５
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１．５μｌ及び１０％ＳＤ
Ｓ１．５μｌを加えて反応を停止させ、フエノール．ク
ロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行なって、エタ
ノール沈澱としてオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ
−ベクター・プライマーを回収した。この回収された核
酸を、７ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２、６０ｍＭＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清
アルブミン及び１２ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
（日本ジーン社製）からなる反応液２０μｌ中で、３７
℃で９０分間インキユベートし、次いで０．５ＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７．５）１μｌ及び１０％ＳＤＳ１μｌを加え
て反応を停止させた。その後、フエノール・クロロホル
ム抽出及びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱と
して、ＨｉｎｄＩＩＩ分解されたオリゴｄＣ鎖付加ｃＤ
ＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライマーを回収した。こ
れを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．５）（ＴＥ（ｐＨ７．５）１０μｌに
溶解させた。このうちの１μｌを用いて、上記ＴＥ（ｐ
Ｈ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ及びオリゴｄＣ鎖の付
加されたリンカーＤＮＡ１４ｎｇからなる反応液１０μ
ｌ中で、６５℃で２分間インキユベートし、次いで４２
℃で３０分間インキユベートした後、０℃に冷却した。
上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ
４、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ（ニコチンアミド．アデニ
ン．ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及び０．６μ
ｇのエシエリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（フアルマシア
社製）を含む反応液１００μｌとなるように調整し、１
２℃で一夜インキユベートした。この反応液に、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々を４０μＭ
になるように、またβ−ＮＡＤを ０．１５ｍＭになる
ようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・コリＤＮＡリ
ガーゼの０．４μｇ、エシェリヒア・コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）の４．６ユ
ニツト及びエシェリヒア・コリＲＮａｓｅＨ（フアルマ
シア社製）の１ユニツトを加え、１２℃で１時間、次い
で２５℃で１時間インキユベートした。上記で得られた
反応液を用いて、エシェリヒア・コリＨＢ１０１株を形
質転換させた。エシェリヒア・コリＨＢ１０１株のコン
ピテント．セルとしては、ベテスダ リサーチ ラボラ
トリーズ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：ＢＲＬ）の製品を使用し、該
ＢＲＬ社のマニユアルに従って、上記形質転換を行なっ
た。かくして、約２１０００個からなるｃＤＮＡライブ
ラリーが得られた。 サルＣｏｓ−１細胞へのトランスフェクシヨン 上記で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グループ
当り平均７０クローンのグループに分け、各グループか
らプラスミドＤＮＡを調整した。プラスミドＤＮＡは、
アルカリ溶菌法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，１９８２，ｐ３６８）に従い調製した。かくして各
グループから調製されたプラスミドＤＮＡを、それぞれ
サル培養細胞のＣｏｓ−１細胞〔Ｇｌｕｚｍａｎ，
Ｙ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２３，ｐ１７５（１９８
１）〕にトランスフェクションした。該トランスフェク
ションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によつた〔Ｙｏｋ
ｏｔａ，Ｔ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，，Ｖｏｌ．８１，ｐ１０７０（１
９８４）〕。即ち、Ｃｏｓ−１細胞をトリプシン処理に
より、１０％ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ−１６４０培地に
懸濁させ、細胞数を１×１０６個／ｍｌに調整後、１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエ
ル加えた６ウエルプレートに、各々５００μｌずつ分注
した。一晩３７℃で培養後、上清を除き、血清を含まな
い培地で細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌプラスミドＤＮ
Ａ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（フアル
マシア社製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）及
び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を１ｍｌ
／ウエル加えて、４．５時間３７℃で培養した。その
後、上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、
１５０μＭクロロキン（シグマ社製）及び１０％ＦＣＳ
を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え
て、更に３７℃で３時間培養した。上清を除き、血清を
含まない培地で細胞を洗浄後、１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエル加えて、３７℃で
７２時間培養した。上清を回収した後、１０％ＦＣＳを
含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍｌ／ウエル加え、凍
結融解を２回繰返し、細胞抽出液を回収した。この培養
上清及び細胞抽出液について、ＧＩＦ活性を測定した。
ＧＩＦ活性を示したグループを１０クローン／グループ
の２４グループに分け、上記と同様の操作を行ない、Ｇ
ＩＦ活性を測定し、活性を示したグループについて、更
にグループ内の各クローンにつき、上記と同様の操作を
行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同定した。かく
して、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びｐｃＤ−ＧＩＦ−２０
７の２種類のクローンを得た。之等のクローンのＧＩＦ
活性（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を第４表に示す。 クローンの解析 次に、両クローン由来のＧＩＦ活性の物質としての異同
を明白にするため一定のＧＩＦ活性を示すｐｃＤ−ＧＩ
Ｆ−１６又はｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７の培養上清及び細
胞抽出物のそれぞれに対して、ポリペプチドＩのＧＩＦ
活性に対する中和抗血清の順次希釈液を添加し、上記各
上清及び細胞抽出物に与える影響を試験した。その結果
を第３図−ａ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６培養上清）、第３
図−ｂ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６細胞抽出物）、第３図−
ｃ（ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７培養上清）及び第３図−ｄ
（ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７細胞抽出物）に示す。各図に
おいて横軸は血清希釈倍率を、縦軸はＧＩＦ活性（％）
を各々示す。また各図中（１）は抗ポリペプチドＩ血清
を、（２）は正常血清をそれぞれ示す。第３−ａ図及び
第３−ｂ図に示す通り、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６由来のＧ
ＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清の添加により、濃度
依存的に、完全に中和されたが、第３−ｃ図及び第３−
ｄ図に示す通り、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ
活性は、抗ポリペプチドＩ血清には全く影響されなかっ
た。従って、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ活性
物は、ポリペプチドＩ及びｐｃＤ−ＧＩＦ−１６由来の
ＧＩＦ活性物とは、免疫学的に異なることが判明した。
また、プラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びｐｃＤ−Ｇ
ＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図４に示す。
更に之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化学修飾法
〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．６５，ｐ４９９（１９８０）〕及びフアージＭ１３
ベクター〔Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１９，ｐ２６９（１９８
２）〕を使用したジデオキシ・チエーン・ターミネーシ
ヨン〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ，Ｖｏｌ．７４，ｐ５４６３（１９７７）〕により決
定した。その結果、ｐｃＤ−ＧＩＦ−１６の有するｃＤ
ＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１βの翻訳領域ｃＤ
ＮＡ配列と同一であり、ｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７の有す
るｃＤＮＡは、同じくＩＬ−１αの翻訳領域ｃＤＮＡ配
列と同一であることが確認された〔Ｃａｒｌ Ｊ．Ｍａ
ｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１
５，ｐ６４１（１９８５）〕。 ポリペプチドＸＸＸＩＶの製造 上記で得たフルレングス（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）
に近いＩＬ−１βのｃＤＮＡクローンｐｃＤ−ＧＩＦ−
１６を、制限酵素ＰｖｕＩＩで切断し、更に制限酵素Ｎ
ｃｏＩで部分切断して、３８０ｂｐのＮｃｏＩ−Ｐｖｕ
ＩＩＤＮＡフラグメントを、アロースゲル電気泳動法に
より単離、精製した。このＤＮＡフラグメントにマン
グ．ビーン．ヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅ）を作用させて、制限酵素ＮｃｏＩ切断に
より生じた接着末端を平滑末端とした。次に、合成オリ
ゴヌクレオチド〔５′−ＧＡＴＡＡＴＧ−３′及び５′
−ＣＡＴＴＡＴ−３′〕の各５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化し、之等を先のＤＮＡフ
ラグメントにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結後、制限
酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動法により、約４００ｂｐのＣｌａＩ−
Ｈｉｂｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメント＜Ａ＞を単離、
精製した。他方、前記で得た発現プラスミドｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−αを、制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ で切断し、大きい方のＤＮＡフラグメント＜Ｂ＞
を、アガロースゲル電気泳動方により単離、精製した。
上記フラグメント＜Ａ＞と＜Ｂ＞とをＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１
０１にトランスフオームさせた。ボイリング法により、
得られるトランスフォーマントのプラスミドＤＮＡを抽
出し、制限酵素による切断地図を解析して、目的のトラ
ンスフオーマントを選択した。かくして単離された目的
トランスフオーマント（エシエリヒア・コリＨＢ１０１
／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−Ｖ）を、５０μｇ／ｍｌＬ
−トリプトファンを含むＬＢ培地１０ｍｌ中で、３７℃
で一晩振盪培養し、この１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地５０ｍｌ
に植菌し、３７℃で振盪培養し、５５０ｎｍでの吸光度
が約１．０となった時点で菌体を集め、１５％シューク
ロースー５０ｍＭトリスＨＣｌ−５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、これに１０ｍ
ｇ／ｍｌリゾチーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で溶解〕溶液５００μｌを加え、更に０．３％トリ
トンＸ１００−１８７．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）
−１５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌ
を加え、室温で１５分間放置後、超音波処理を行ない、
遠心分離により菌体抽出物上清を得た。得られた菌体抽
出物上清について、ＧＩＦ活性の測定を行なった所、培
養液１ｍｌ当り１１２ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩＩの製造 前記で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＡｃｃＩで切断して、約０．７ｋｂの ＮｃｏＩ
−ＡｃｃＩＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気
泳動法により単離、精製した。このＤＮＡフラグメント
を、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いた処
理により、その両末端を平滑末端とした。他方、プラス
ミドｐＴＭ１を、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ で切断
後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、
切断部位を平滑末端とした。上記により得られる２つの
ＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトラン
スフォームし、ボイリング法によりトランスフォーマン
トからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断
地図から目的のトランスフォーマントを選択した。かく
して単離されたトランスフォーマント（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩＩ）
を、上記に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ
ｔｒｐ ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り１９０ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩＩＩの製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−ス
ペシフィック ミュータジェネシスの方法に従い、以下
に詳述するように不要な塩基配列部位を除去することに
より実施した。即ち、ｐＧＩＦ−αを、制限酵素Ｐｓｔ
Ｉ及び ＡｃｃＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法
により、約０．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＡｃｃＩＤＮＡフラ
グメントを単離、精製し、その両末端をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端とした。このフラグメント
を、別途にプラスミドｐＴＭ１を制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）
を用いて平滑末端として調製したＤＮＡフラグメント
に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、目的
トランスフォーマントを、ボイリング法により抽出され
たプラスミドＤＮＡの制限酵素地図により選択した。ま
た得られたプラスミドのＤＮＡ塩基配列も確認した。以
下このプラスミドを「ｐＴＭ１−Ｉ−２］と呼ぶ。次い
で、プラスミドｐＴＭ１−Ｉ−２を、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ で切断して、約７４０ｂｐのＥ
ｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメントを、
アガロースゲル電気泳動法により単離、精製した。これ
を、Ｍ１３ｍｐ１１フアージ（ＲＦ）のＥｃｏＲＩとＨ
ｉｎｄ ＩＩＩ の制限酵素部位に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結した。これから一本鎖（ｓｓ） ＤＮＡ
（ｍｐ１１−ｔｒｐ−１２（Ｅ／Ｍ））を得、これをミ
ューダジェネシスの鋳型とした。合成オリゴヌクレオチ
ド〔５′−ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴ
ＡＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴ−３′（プライマー）〕
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これ
をｓｓ ｍｐ１１−ｔｒｐ−１−２（Ｅ／Ｍ）とハイブ
リダイズし、アニーリング後、ｄＮＴＰｓの存在下にＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで各々処理し、１５℃で２晩インキユベートし
た。得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント細胞にト
ランスフォームし、生じたコロニーを、寒天プレート上
に２００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養した。
生育したコロニーを含むフィルターを通常の方法により
アルカリ処理変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキン
グ処理した。このフィルターをハイブリダイズした後、
このものと上記プライマーの５′末端を３２Ｐ−γ−Ａ
ＴＰでラベルされた３２Ｐ−プローベとを、室温でハイ
ブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイルターを
６×ＳＳＣバッファーを用い、室温で１０分間、次いで
０．２５×ＳＳＣバッファーを用い６０℃で５分間各々
洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオグラ
フィーを行なった。変異したクローンの内から、代表と
してｍｐ１１−ｔｒｐ ＧＩＦ−α一ＩＶ（Ｅ／Ｍ）を
選び、これをＪＭ１０５に感染させて培養し、ｓｓＤＮ
Ａ及び ＲＦ ＤＮＡを調製した。上記で得られたｓｓ
ＤＮＡのＭ１３ジデオキシチェイン ターミネーション
シークエンシングにより、目的遺伝子の削除を確認し
た。また、ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡより約
６３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフ
ラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、
精製した。一方、プラスミドｐＴＭ１−Ｉ−２より、同
様にして約４．２ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
ＤＮＡフラグメントを、単離、精製し、これと先の約６
３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラ
グメントとを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、
連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォ
ームさせた。目的のトランスフォーマントは、ボイリン
グ法に従い、トランスフォーマントよりブラスミドを抽
出し、その制限酵素地図解析により選択した。かくして
単離されたトランスフォーマント（エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＶ）を、前記
に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ
ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌体抽出物
上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養液１ｍｌ
当り３３６ユニツトであった。 ポリペプチドＸＸＸＩの製造 上記と同様にして、所望のポリペプチド発現プラスミ
ドｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩを保有するトランスフ
ォーマントを作成した。鋳型としては、先の一本鎖ＤＮ
Ａｍｐ１１−ｔｒｐ−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）を用いた。また
プライマーとしては、合成オリゴヌクレオチド〔５′−
ＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣ
ＴＧＧＴＴＣＣＣＴ−３′〕を用いた。上記プラスミド
を保有するトランスフォーマント（エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１／ｐ ｔｒｐ ＧＩＦ−α−ＩＩを同様にし
て培養後、菌体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩ
Ｆ活性は培養液１ｍｌ当り１１２ユニツトであった。本
発明ＩＬ−１β自身（ポリペプチドＩ）及びその本発明
誘導体のＧＩＦ活性については、既に記載したが、加え
て以下の試験を行なった。尚、前記したポリペプチドＩ
に対する抗血清を用いて、ＲＩＡ法により測定したポリ
ペプチドＩ換算蛋白量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）
は、下記第５表に示す通りである。 薬理試験例１：ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試
験 ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験ＣＳＦ
産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Ｈｕｍａ
ｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｕｎｇ Ｆｉｂｒｏｂｌａ
ｓｔｓ，ＡＴＣＣ登録細胞株Ｎｏ．ＣＣＬ−１５３）を
用い、以下の試験を行なった。まず、上記ＨＦＬ−１細
胞を２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように、１０
％ウシ胎児血清加ハムスター１２Ｋ培養液〔Ｈａｍ，
Ｒ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させた。次いでヒ記
細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した前記参考例で得
たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で
２４時間、４８時間及び７２時間各々培養し、各培養上
清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ量
を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Ｌｅｗｉｓ，
Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２８，
１６８（１９８２）〕。ポリペプチドＩを用いて得られ
た各培養時間（ｈｒ）での結果を図５に示す。図におい
て、横軸はポリペプチドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）
を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ）を示す。上記結果
より、ポリペプチドＩの添加によれば、ＨＦＬ−１細胞
株のＣＳＦ産生量は、該ポリペプチドの無添加に比べて
実に数百倍にも亢進されることが明らかである。 ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対するポリペプチド
Ｉの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてｃＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎｏ．）を利用して以下の試験を行なった。上記
細胞を２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように１０
％ウシ胎児血清加ダルベツコＭＥＭ培養液〔Ｄｕｌｂｅ
ｃｏ，Ｒ．ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．，Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕に浮遊させた。上記
細胞浮遊液に、種々の濃度の参考例で得たポリペプチド
Ｉを加え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４、４８及び
７２時間培養した後、培養上清を集め、産生されたＣＳ
Ｆ量をマウス骨髄細胞を使用して上記試験と同様にし
て測定した。得られた結果を図５と同様にして、図６に
示す。図６より、ＧＩＦ活性として１単位／ｍｌ以上の
ポリペプチドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽細胞に加
えることにより、該細胞のＣＳＦ産生能は著しく促進さ
れることが明らかである。 生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発２されることを以下の動物実験に
より試験した。即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０５
〜１０５単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
た。結果を図７に示す。図において横軸は各種濃度（Ｇ
ＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時間（ｈ
ｒ）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を各々示
す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万ＧＩＦ単
位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／個体投
与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投与群
を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投与
群）を各々示す。図７より、ポリペプチドＩを動物に与
えた場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなって
いることが判明した。即ち、ポリペプヂト１は注射され
た量に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させ
る作用のあることが認められた。 薬理試験例２：ポリペプチドＩの抗関節炎試験 パースン〔Ｐｅａｒｓｏｎ，ｃ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．
Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，９１，９５（１
９５６）〕及びワードとジョーンズ〔Ｗａｒｄ，Ｊ．
Ｒ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｓ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒ
ｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５，５５７（１９６２）〕の方法
に準じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。即
ち、雌性Ｓ．Ｄ．系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテ
リウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂ
ｕｔｙｒｉｃｕｍ）死菌を流動パラフインに懸濁させた
アジユバントを０．０５ｍｌ注射した。１４日目に足腫
脹に基づいて群分けし（ｎ＝６）、その翌日より５日間
に亘って、参考例で得たポリペプチドＩ又はその溶媒
（生理食塩水；対照群）を、皮内投与した。経日的に足
容積を測定することにより、関節炎に対する影響を評価
した。結果を図８に示す。図において横軸はアジユバン
ト投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×０．０１ｍ
ｌ）を各々示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１
０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ
単位／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／
個体投与群を、（４）は同１００ＧＩＦ単位／個体投与
群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、また
（６）は正常ラツト群を各々示す。図８より、対照群
（グラフ（５））の足腫脹は、２３日目まで増悪したの
に対し、ポリペプチドＩの投与群（グラフ（１）〜
（４））においては、その投与の４日目（アジユバンド
投与後１８日目）より足腫脹の抑制作用が認められ、最
終投与４日後（アジユバンド投与後２３日目）において
も関節炎の進行を阻止できることが確認された。 薬理試験例３：本発明誘導体のＣＳＦ産生促進効果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇｌｉ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ，Ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ，Ｈｕｍ
ａｎ〕を用いて、以下の試験を行なった。上記細胞を、
２×１０５個／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％Ｆ
ＣＳ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｆｌ
ｏｗ社製）及びＭＥＭピルビン酸ナトリウム（ＦｌｏＷ
社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地（日水社製）に浮
遊させ、種々の濃度となるように被験物質を加えて、炭
酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培養した。各培養上
清を集め、之等培養上清中に産生蓄積されたＣＳＦ量
を、マウス骨髄細胞を使用して測定した〔Ｌｅｗｉｓ，
Ｉ．Ｃ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２８，１
６８（１９８２）〕。結果を図９に示す。図において、
横軸は被験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ
活性（Ｕ／ｍｌ）を示す。また、図中、曲線（１）〜
（７）は、以下の各ポリペプチドを被験物質とした時の
結果を示す。 曲線（１）…ポリペプチドＶＩ 曲線（２）…ポリペプチドＩＩ 曲線（３）…ポリペプチドＶＩＩＩ 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドＩＶ 曲線（６）…ポリペプチドＩＩＩ 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）らの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐｔｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１１１，５４４
−５４７（１９６２）〕に準じて、この試験を行なっ
た。即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Ｓｐｒａｑｕｅ Ｄ
ａｗｌｅｙ系、日本チャールスリバー社）を、実験前日
に体重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。
起炎剤としてカラゲニン（Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏｌｌｏｉ
ｄ社製）を、生理食塩水に１％となるように懸濁させた
ものを使用し、ラツトの右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注
射して足浮腫を惹起させた。足浮腫を評価するため、起
炎剤注射の前後の一定時間に、右後肢足蹠容積を、プレ
シモメーター（ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ，Ｕｇｏ
−Ｖａｓｉｌｅ社製）を用いて測定した。前値に対する
起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率（ｓｗｅｌｌｉｎｇ
％）として表わした。被験物質は、ダルベッコのリン酸
塩緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｏ ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に溶解希釈し、
ラツトの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射の１時間
前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群を作成
し、同一実験に供した。結果を図１０に示す。図におい
て横軸は、起炎剤投与後時間（ｈｒ）を、縦軸は浮腫率
（％）を示す。また、図中、曲線（１）は対照群を、曲
線（２）はポリペプチドＶＩの０．１μｇ投与群を、曲
線（３）はポリペプチドＶＩの１μｇ投与群を、曲線
（４）はポリペプチドＶＩの１０μｇ投与群をそれぞれ
示す。 薬理試験例５：本発明誘導体の放射線障害防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドＶＩの１μｇ／マウス
又は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装
置（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、
８５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、
以後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
て、ＰＢＳ投与群をおいた。結果を図１１に示す。図に
おいて横軸はＸ線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動
物の生存率（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドＶ
Ｉの１μｇ投与群を、曲線（２）はポリペプチドＶＩの
０．３μｇ投与群を、また曲線（３）はコントロール群
をそれぞれ示す。図１１より、コントロール群では、Ｘ
線照射後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチ
ドＶＩ投与群では、その投与量に依存して、放射線障害
の防止作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放
射線障害による死亡から回避され、生存することが確認
された。 薬理試験例６：本発明誘導体の日和見感染防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。
ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物（１群７匹）
とし、第１日目に、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ、
協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した。第
２日目、第４日目及び第６日目に、ポリペプチドＶＩの
１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、緑膿菌（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＥ−２）
の所定量を腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供
試動物の生存数を計数して、生存率（％）を求めた。結
果を図１２（１）〜（３）に示す。図１２（１）は上記
実験群の結果を、同（２）はポリペプチドＶＩを投与し
なかった（５−Ｆｕのみを投与した）対照群の結果を、
また同（３）は５−Ｆｕ及びポリペプチドＶＩのいずれ
も投与しなかった対照群の結果をそれそれ示す。第１２
図中、縦軸は生存率（％）を、横軸は下記各緑膿菌投与
量を採用した群Ａ〜Ｅをそれぞれ示す。 Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 製剤例１ ＧＩＦ活性として１×１０７単位／ｍｌのポリペプチド
ＶＩの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）を０．５％となるように添加して、濾過（０．２２
μｍメンブランフイルター）後、これを無菌的に１ｍｌ
ずつバイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調
製した。かくして得られた製剤は、これを用時注射用蒸
留水１ｍｌに溶解して利用される。 ＜動物細胞からのサイトカインの製造方法＞ 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸＶＩＩ及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞
〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１，１６８２−１６８９
（１９８５）〕を、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに
て培養した。培養２４時間後の上清を採取し、そのＩＬ
−２活性を、スミス（Ｋ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ）らの方法に
従い、ＩＬ−２依存性マウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を用
いて測定した〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２０，２０２
７（１９７８））〕。結果を下記第６表に示す。 Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−
１６４０培地で集密的まで培養し、更に２０ｎｇ／ｍｌ
のポリペプチドＸＸＸＶＩＩを含む又は含まない（コン
トロール）上記培地中で１８時間インキュベートした。
培地を除去した後、前記実施例３−に準じて、グアニ
ジニウム／セシウムクロライド法により ＲＮＡを抽出
し、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーに
より、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を収得した。ノ
ザン．ブロッティング法（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ）に従い、上記ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの１０μｇ
をアガロースゲル（１．２％）電気泳動に付し分画後、
ニトロセルロース・フィルターに転写した。減圧下に８
０℃でベーキングし、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
８．０）中で１００℃５分間の処理後、５０％フォルム
アミド、５×ｓｓｃ、５０ｍＭソジウムフォスフェート
（ｐＨ６．５）、４×デンハード液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び２００μｇ／ｍｌの変性サ
ルモン スペラムＤＮＡ中で４２℃下にプリハイブリダ
イゼーションを行った。５時間後、ニックトランスレー
シヨンで放射能標識したＧＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ〔Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２２８，８１０（１９８５）〕のＰｓｔＩ−
ＮｃｏＩＤＮＡ断片又はＢＳＦ−２ｃＤＮＡ〔Ｎａｔｕ
ｒｅ， ３２４，７３（１９８６）〕のＫｐｎＩ−Ｂａ
ｍＨ ＩＤＮＡ断片と、４２℃下に２０時間ハイブリダ
イゼーションを行った。フィルターを、０．１％ＳＤＳ
加２×ｓｓｃで室温下に１５分間、更に０．１％ＳＤＳ
加０．１×ｓｓｃで５０℃下に１時間洗浄した。オート
ラジオグラムは、増感紙を用いて、−７０℃下に一夜行
った。ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用いた時の結果を図
１３に示す。レーンＡは本発明ポリペプチドを用いた結
果を、レーンＢは本発明ポリペプチドを用いないコント
ロールの結果を示す。また、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を
用いた時の結果を図１３に準じて図１４に示す。以上に
示す結果より、本発明ポリペプチドを用いることによ
り、動物細胞からの天然サイトカイン類の生産が効率よ
く行い得ることが判る。また、本発明ポリペプチドの、
かかる方法への適用に際しては、極めて微量、通常１０
ｎｇ／ｍｌ程度の使用で十分であり、誘導されたサイト
カイン類の精製過程をも容易にする。 動物細胞よりサイトカインを生産する場合、産生誘
引に使用する本発明ポリペプチドがその条件下において
構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ−１受容体に結
合することが必須である。すなわち、本発明ポリペプチ
ドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカイン産生に必要
なシグナルを細胞内に伝えることが重要である。そこ
で、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体への結合に関して、
以下の試験を行った。６−ｗｅｌｌプレート上で、一面
にほぼ均一にまで増殖したＢａｌｂ／３Ｔ３細胞（クロ
ーンＡ３１：ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×１０６ｃ
ｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に、１２５Ｉで標識したポリペプ
チドＩ（ＩＬ−１β）の５００００ｃｐｍ／ｗｅｌｌ及
び事前に１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭ中で３７℃下にイン
キユベートした２０ｎｇ／ｍｌのポリペプチドＩを加
え、４℃で反応させた。反応液をパスツールピペットで
除き、１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの １ｍｌを加えて静
かに洗い上清をすてた。この洗浄操作を２回繰返した
後、１ｍｌの１％ＳＤＳ、０．２Ｎ ＮａＯＨで細胞を
可溶化し、可溶化液及びさらにウエルを洗浄した可溶化
液中の放射能（結合放射能）をγ−カウンターにて測定
した。尚、上記１２５Ｉ標識ポリペプチドＩは、ボルト
ンとハンター（Ｂｏｌｔｏｎａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ）の
方法〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１３３，５２９（１９７
３）〕に従い製造、精製した（比活性；２５０μＣｉ／
μｇｐｒｏｔｅｉｎ以上）。得られた結果を下記第７表
に示す。 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。上記第７表より、ポリペプチ
ドＩ、即ちＩＬ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下
において、時間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合
力が低下してしまうことが明らかとなった。そこで、上
記において、２４時間の事前のインキュベーシヨンを行
ったポリペプチドＩ、ポリペプチドＶＩ又はポリペプチ
ドＸＸＸＶＩＩを用いた同試験を行った。結果を下記第
８表に示す。 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に際
しては、ＩＬ−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。
【図１】図１は、プラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの
制限酵素地図を示す。
制限酵素地図を示す。
【図２】図２はプラスミドｐＧＩＦ−αとプラスミドｐ
ＴＭＩとからプラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−αを構築する
概略図を示す。
ＴＭＩとからプラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−αを構築する
概略図を示す。
【図３】図３−ａ乃至図３−ｄはプラスミドｐｃＤ−Ｇ
ＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性物及びプラスミドｐｃＤ−
ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ活性物の各々に対する抗ポ
リペプチドＩ血清（中和抗体）の影響を示すグラフであ
る。
ＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性物及びプラスミドｐｃＤ−
ＧＩＦ−２０７由来のＧＩＦ活性物の各々に対する抗ポ
リペプチドＩ血清（中和抗体）の影響を示すグラフであ
る。
【図４】図４はプラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−１６及びプ
ラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素
地図を示す。
ラスミドｐｃＤ−ＧＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素
地図を示す。
【図５】図５はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。
進効果試験結果を示すグラフである。
【図６】図６はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。
進効果試験結果を示すグラフである。
【図７】図７はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。
進効果試験結果を示すグラフである。
【図８】図８はポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示
すグラフである。
すグラフである。
【図９】図９は本発明ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促
進試験の結果を示すグラフである。
進試験の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は本発明ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試
験の結果を示すグラフである。
験の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は本発明ＩＬ−１β誘導体の放射線障
害防止作用試験の結果を示すグラフである。
害防止作用試験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は本発明ＩＬ−１β誘導体の日和見感
染症防御効果試験の結果を示すクラフである。
染症防御効果試験の結果を示すクラフである。
【図１３】図１３は本発明ＩＬ−１の誘導体のＧＭ−Ｃ
ＳＦ誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
ＳＦ誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
【図１４】図１４は本発明ＩＬ−１β誘導体のＢＳＦ−
２誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
２誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 特願昭61−200324 (32)優先日 昭61(1986)８月27日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 洪 英満 鳴門市撫養町北浜字宮ノ西129−４ サン ラウンジハウス105号 (72)発明者 河合 一吉 徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130− ２ ソレイユ503号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５−49
Claims (9)
- 【請求項１】 インターロイキン−１βの下記式（Ａ）
で表されるアミノ酸配列に於いて、 【化１】 ａ）１位がＡｌａ、３位Ｖａｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅ
ｒ、８位Ｃｙｓ、１１位Ａｒｇ、３０位Ｈｉｓ、７１位
Ｃｙｓ、９３位Ｌｙｓ、９７位Ｌｙｓ、９８位Ａｒｇ、
９９位Ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２
１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒから選ばれた少なくとも
１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミノ
酸で置換されていること、 ｂ）１位がＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失され
ていること（但し、上記ａ記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａ
ｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅｒ及び８位Ｃｙｓからなる群
から選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失され
ていることを除く）、 ｃ）１０３位のＬｙｓから１５３位のＳｅｒに至るアミ
ノ酸配列又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が
欠失されていること（但し、上記ａ記載の１０３位Ｌｙ
ｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅ
ｒから成る群から選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１
つが欠失されていることを除く）、 ｄ）Ｎ末端に、Ｍｅｔ又は下記式（Ｂ）で示される１′
位のＭｅｔから１１６′位のＡｓｐに至るアミノ酸配列
若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加され
ていること、式（Ｂ） 【化２】 というａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充足する改
変されたアミノ酸配列を有することにより特徴付けられ
るポリペプチド（但し、少なくとも７１位のＣｙｓが他
のアミノ酸で置換されたポリペプチドを除く）。 - 【請求項２】 少なくとも４位Ａｒｇが改変されている
請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項３】４位ＡｒｇがＧｌｙで置換されている請求
項２記載のポリペプチド。 - 【請求項４】以下の配列を有する請求項１記載のポリペ
プチド。 【化３】 - 【請求項５】 少なくとも８位Ｃｙｓが改変されている
請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 少なくとも１０３位以降のアミノ酸を欠
失させた請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 少なくとも８位Ｃｙｓおよび７１位Ｃｙ
ｓが改変されている請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項８】 インターロイキン−１βを有効成分とし
て含有することを特徴とする抗炎症剤。 - 【請求項９】 インターロイキン−１βの下記式（Ａ）
で表されるアミノ酸配列に於いて、 【化４】 ａ）１位がＡｌａ、３位Ｖａｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅ
ｒ、８位Ｃｙｓ、１１位Ａｒｇ、３０位Ｈｉｓ、７１位
Ｃｙｓ、９３位Ｌｙｓ、９７位Ｌｙｓ、９８位Ａｒｇ、
９９位Ｐｈｅ、１０３位Ｌｙｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２
１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅｒから選ばれた少なくとも
１つのアミノ酸残基が欠失されているか又は他のアミノ
酸で置換されていること、 ｂ）１位がＡｌａから９位のＴｈｒに至るアミノ酸配列
又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失され
ていること（但し、上記ａ記載の１位Ａｌａ、３位Ｖａ
ｌ、４位Ａｒｇ、５位Ｓｅｒ及び８位Ｃｙｓからなる群
から選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１つが欠失され
ていることを除く）、 ｃ）１０３位のＬｙｓから１５３位のＳｅｒに至るアミ
ノ酸配列又はその中の少なくとも１つのアミノ酸残基が
欠失されていること（但し、上記ａ記載の１０３位Ｌｙ
ｓ、１２０位Ｔｒｐ、１２１位Ｔｙｒ及び１５３位Ｓｅ
ｒから成る群から選ばれたアミノ酸残基の少なくとも１
つが欠失されていることを除く）、 ｄ）Ｎ末端に、Ｍｅｔ又は下記式（Ｂ）で示される１′
位のＭｅｔから１１６′位のＡｓｐに至るアミノ酸配列
若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加され
ていること、式（Ｂ） 【化５】 というａ）〜ｄ）の条件の少なくとも１つを充足する改
変されたアミノ酸配列を有することにより特徴付けられ
るポリペプチド（但し、少なくとも７１位のＣｙｓが他
のアミノ酸で置換されたポリペプチドを除く）をコード
する遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5212076A JP2608023B2 (ja) | 1986-03-14 | 1993-06-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-57885 | 1986-03-14 | ||
| JP5788586 | 1986-03-14 | ||
| JP14583086 | 1986-06-20 | ||
| JP16118486 | 1986-07-09 | ||
| JP61-200324 | 1986-08-27 | ||
| JP20032486 | 1986-08-27 | ||
| JP61-145830 | 1986-08-27 | ||
| JP61-161184 | 1986-08-27 | ||
| JP5212076A JP2608023B2 (ja) | 1986-03-14 | 1993-06-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62052781A Division JP2591615B2 (ja) | 1986-03-14 | 1987-03-06 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7343919A Division JP2753694B2 (ja) | 1986-03-14 | 1995-12-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06172395A true JPH06172395A (ja) | 1994-06-21 |
| JP2608023B2 JP2608023B2 (ja) | 1997-05-07 |
Family
ID=27523409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5212076A Expired - Lifetime JP2608023B2 (ja) | 1986-03-14 | 1993-06-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2608023B2 (ja) |
-
1993
- 1993-06-28 JP JP5212076A patent/JP2608023B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| J.IMMINOL.=1985 * |
| J.IMMUNOL.=1985 * |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2608023B2 (ja) | 1997-05-07 |
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