KR970011308B1 - IL-1β유도체, 이를 코오딩하는 재조합 DNA, 재조합 DNA를 함유하는 벡터, 벡터를 함유하는 형질전환체 및 IL-1β유도체를 함유하는 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

요약 없음.

Description

IL-1β유도체, 이를 코오딩하는 재조합 DNA, 재조합 DNA를 함유하는 벡터, 벡터를 함유하는 형질전환체 및 IL-1β유도체를 함유하는 의약 조성물

제 1 도는 플라스미드 pGIF-αcDNA의 제한효소지도.

제 2 도는 플라스미드 pGIF-α 및 플라스미드 pTMT로 부터 플라스미드 ptrpGIF-α가 어떻게 제조되는가를 보여주는 도표.

제3-a도에서 제3-d도까지는 플라스미드 pcD-GIF-16에서 유래된 GIF활성 또는 플라스미드 pcD-GIF-207에서 유래된 GIF활성에 대한 항-폴리펩티드 I혈청(중화항체)의 영향을 나타내는 그래프.

제 4 도는 플라스미드 pcD-GIF-16 및 플라스미드 pcD-GIF-207의 cDNA에 대한 제한 효소지도.

제 5 도∼제 7 도는 폴리펩티드 I의 CSF 생산 촉진 효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제 8 도는 폴리펩티드 I의 항관절염 효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제 9 도는 본 발명의 IL-1β유도체의 CSF 생산 촉진 효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제10도는 본 발명의 IL-1β유도체의 소염효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제11도는 본 발명의 IL-1β유도체의 방사능 병 예방활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제12도는 본 발명의 IL-1β유도체의 기회주의적 감염 예방활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프.

제13도는 본 발명의 IL-1β유도체의 GM-CSF 생산 유발활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 사진.

제14도는 본 발명의 IL-1β유도체의 BSF-2 생산 유발활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 신규의 폴리펩티드, 더욱 상세하게는 인터루킨-1β(이하 IL-1β로 칭함)의 신규 유도체 및 IL-1β을 약에 사용하는 것 및 그의 신규 유도체에 관한 것이다.

제 2 차 국제 림포카인 연구회(The Second International Lymphokine Workshop)는, 임파구 활성인자(LAF), 유사 분열 촉진 단백질, 헬퍼 피크-1(helper peak-1), T-세포 치환인자 III(TRF-III), T-세포 치환 인자 Mψ(TRFM), B-세포 활성인자, B-세포 분화인자 등으로 알려져 왔던 생리활성 물질에 대해 통일된 명칭인, 인터루킨-1(IL-1)을 채용하였다(Cellular Immunol., 48, 433∼436(1979)). 이 결정은 상기 생리활성 물질을 서로 다른 물질로 구분할 수 없고 단지 여러각도에서 해석된 대로 생리활성이 여러가지로 표현된다는 이유를 근거로 한다.

그리고 IL-1이 T임파구 및 B임파구를 활성화하고, 인터루킨-2 및 항체의 생산을 증진시키는 활성을 갖고, 간조직에 작용하여 단백질 합성을 증진시키고, 그리고 프로스타글란딘의 생산을 촉진하는 활성을 갖고 있다고 보고되었다(참조, Reviews of Infectious Disease, Vol. 6, No. 1, 51∼59(1984), New England J. of Med., 311, 1413(1984), 등).

IL-1 자체는 여전히 하나의 물질로 분류되어 있는데 비하여, LAF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 유전정보를 지정하는 두개의 서로다른 유전자가 존재한다는 것은 최근에야 보고되었다(Proc. Natl. Acad. Scl., Vol. 81, 7907∼7911(1984), Nature, Vol. 315, 641(1985), Nucleic Acid Research, Vol. 13(16), 5869(1985).

상기 보고들은 상기 두 유전자로부터 추정된 159 아미노산 서열을 갖는 "IL-1χ" 및 153 아미노산을 함유하는 "IL-1β"를 언급한다.

그럼에도 불구하고, 조절된 매질을 사용하여 분석된 상기 활성 또는 소위 부분적으로 정제된 IL-1 및 상기 염기서열에서 추정된 폴리펩티드 사이의 관계를 밝히기 위한 연구가 아직 수행되지 않고 있다.

생리 활성물질으로서의 IL-1은 또한 내인성 발열물질(EP)와 동일하고 발열성을 나타내는 것으로 생각된다(참조 Nature, 304, 449(1983); Cell Immunol., 63, 164(1981); J. Exp. Med., 150, 709(1979); J. Immunol., 130(6), 2708(1983); J. Immunol., 132(3), 1311(1984) 등). 이것은 IL-1이, 균일한 물질로 얻을 수 있으면, 물론 생리적으로 활성이 있는 통상의 IL-1이 의약으로 이용하기가 어렵다는 것을 나타낸다.

본 발명의 목적은 신규하고 의약으로 효과적으로 사용하기에 유용한 IL-1β 유도체인 폴리펩티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 신규한 IL-1β유도체인 폴리펩티드를 의약으로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 신규한 IL-1β유도체의 유전정보를 지정하는 유전자 및 상기 유전자를 사용하는 유전자 조작기술에 의하여 IL-1β유도체, 즉 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 균질의 IL-1β그 자체를 신규의 의약으로 사용하는 것을 제공하는 것이다.

상기한 것 및 본 발명의 다른 목적들은 하기 명세서에 확실히 나타날 것이다.

본 발명의 IL-1β유도체(폴리펩티드)는 상기 유도체가 식(A)로 표시되는 인터루킨-1β의 아미노산서열의 a)∼d)의 요구조건 중의 최소한 하나를 만족하는 변형된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

a) 1-위치의 Ala, 3-위치의 Val, 4-위치의 Arg, 5-위치의 Ser, 8-위치의 Cys, 11-위치의 Arg, 30-위치의 His, 71-위치의 Cys, 93-위치의 Lys, 97-위치의 Lys, 98-위치의 Arg, 99-위치의 Phe, 103-위차의 Lys, 120-위치의 Trp, 121-위치의 Tyr 및 153-위치의 Ser중에서 선택된 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결핍되거나 다른 아미노산으로 치환된다.

b) 1-위치의 Ala로부터 9-위치의 Thr까지의 아미노산서열 또는 상기 서열중의 최소한 하나의 아미노산이 결핍된다(단, 1-위치의 Ala, 3-위치의 Val, 4-위치의 Arg, 5-위치의 Ser 및 8-위치의 Cys으로 구성된 군중에서 선택된 최소한 하나의 아미노산이 요구조건 a)에 서술된 대로 결핍된다).

c) 103-위치의 Lys부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열 또는 상기 서열중의 최소한 하나의 아미노산 잔기가 결핍된다(단, 103-위치의 Lys, 120-위치의 Trp, 121-위치의 Tyr 및 153-위치의 Ser으로 구성되는 군에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 잔기가 요구조건 a)에 서술된 대로 결핍된다).

d) Met, 도는 하기 식(B)로 표시되는 1'-위치의 Met부터 116'-위치의 Asp까지의 아미노산 서열, 또는 식(B)의 C 말단쪽의 일부서열이 식(A)의 N말단에 연결된다.

앞으로는 아미노산 및 펩리드는 IUPAC 및 IUPAC-IUB에 의해 추천된 명명법 또는 규칙 또는, 공지기술 분야에서 통상적으로 사용되는 기호로 나타낸다. 염기 서열내의 핵산도 갈은 방법으로 표현한다. 본 발명의 폴리펩티드에 사용된 아미노산의 수 또는 위치는 별다른 언급이 없는한, 결핍 또는 확장이 있는 경우에도 IL-1β의 아미노산 서열, 즉, 식(A)의 아미노산 서열을 기준으로 한다. 그러나, 프라임 표시된 숫자 또는 위치는 식(B)의 아미노산 서열을 기준으로 한다.

본 발명의 IL-1β유도체는 식(A)에 의해 표시되는 IL-1β의 아미노산 서열에서 전기 요구조건 a)∼d)중의 하나, 또는 적어도 2개의 조합을 만족하는 아미노산 서열을 갖는 신규의 폴리펩티드이다.

본 발명의 IL-1β유도체, 즉 폴리펩티드의 바람직한 예는 다음과 같다.

1) 식(A)에서 최소한 1-위치의 Ala가 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

2) 식(A)에서 최소한 3-위치의 Val이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

3) 식(A)에서 최소한 4-위치의 Arg이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

4) 식(A)에서 최소한 5-위치의 Ser이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

5) 식(A)에서 최소한 8-위치의 Cys이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

6) 식(A)에서 최소한 11-위치의 Arg이가 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

7) 식(A)에서 최소한 30-위치의 His이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

8) 식(A)에서 최소한 71-위치의 Cus가 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

9) 식(A)에서 최소한 93-위치의 Lys가 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

10) 식(A)에서 최소한 97-위치의 Lys이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

11) 식(A)에서 최소한 98-위치의 Arg이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

12) 식(A)에서 최소한 99-위치의 Phe이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

13) 식(A)에서 최소한 103-위치의 Lys이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

14) 식(A)에서 최소한 120-위치의 Trp이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

15) 식(A)에서 최소한 121-위치의 Tyr이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

16) 식(A)에서 최소한 153-위치의 Ser이 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

17) 식(A)에서 최소한 1-위치의 Ala부터 3-위치의 Val까지의 아미노산 서열, 1-위치의 Ala부터 6-위치의 Leu까지의 아미노산 서열, 또는 1-위치의 Ala부터 9-위치의 Thr까지의 아미노산 서열이 결핍된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

18) 식(A)에서 최소한 151-위치의 Val부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열, 149-위치의 Gln부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열, 145-위치의 Asp부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열, 141-위치의 Gln부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열, 121-위치의 Tyr부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열, 또는 103-위치의 Lys부터 153-위치의 Ser까지의 아미노산 서열이 결핍된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

19) 식(A)의 N말단이 최소한 Met, 식(B)의 77'-위치의 Met부터 116'-위치의 Asp까지의 아미노산 서열, 71'-위치의 Met부터 116'-위치의 Asp까지의 아미노산 서열, 32'-위치의 Met부터 116'-위치의 Asp까지의 아미노산 서열, 또는 1'-위치의 Met부터 116'-위치의 Asp까지의 아미노산 서열에 연결된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

본 발명의 IL-1 유도체는 특정위치의 특정 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는데, 상기 치환되는 아미노산은 인체 단백질을 구성하는 α-아미노산이면 어느 것이어도 된다. 그러나, Cys는 그의 SH기와 분자내 또는 분자간 -S-S- 결합을 형성하기 쉽다. 이러한 관점에서, Cys 이외의 아미노산들이 바람직하다. 더욱 바람직한 아미노산의 예는 4-위치의 Arg에는 Gly; 8-위치의 Cys에는 Ser 또는 Ala; 11-위치의 Arg에는 Cln; 30-위치의 His에는 Tyr; 71-위치의 Cys에는 Ser, Ala 또는 Val; 93-위치의 Lys에는 Leu; 98-위치의 Arg에는 Leu; 103-위치의 Lys에는 Gln; 120-위치의 Trp에는 Arg; 121-위치의 Tyr에는 Gln이다.

본 발명의 IL-1β유도체 및 본 발명에 따라 수득된 균질의 IL-1β는, 예를들어, LAF 활성, 종양세포의 성장을 억제하는 활성(GIF활성), 즉 종양세포의 성장을 특이적으로 억제하는 활성, 콜로니 자극인자(CSF), 인터페론(IFN), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-3(IL-3)등과 같은 여러가지 시토카인의 생산을 촉진하는 활성, 즉 예를들어 사람세포에 대하여 상기 시토카인의 생산을 크게 촉진하는 활성, 소염활성, 예를들어 모델 동물에 관절염을 투여하였을때 관절염의 진전을 효과적으로 억제하는 활성 및 방사선에 의한 상해를 방지하는 활성, 즉, 골수이식중의 조직적인 방사능 조사, 암치료를 위한 방사능조사 및 방사능사고로 생길 수 있는 생체 질환 또는 심각한 부작용을 예방하는 활성을 갖는다. 따라서, 균질의 IL-1β 및 본 발명에 의한 그의 유도체는 예를들어, 항체 생산을 촉진하고 백신의 효과를 증진시키기 위한 면역제계 자극제, 항암제, CSF, IFN, IL-2 및 IL-3와 같은 시토카인의 생산 촉진제, 소염제, 방사능 병 방지제 및 다른 유사의약으로 대단히 유용하다.

균질의 IL-1β가 관절염 등의 염증을 처리하는데 현저한 효과를 나타낸다는 신규의 발견은 IL-1이 지금까지는 중간체로 작용하고 간접적으로 염증을 유발시킨다고 생각되어 왔다는 점에서 놀라운 것이다. 본 발명의 유도체는 상기 지정한 활성중의 적어도 하나가 탁월하고 및/또는 독성 및 부작용이 낮다.

본 발명의 유도체는 CSF 생산 촉진제로 특히 유용하다. 사람에게 투여되면, 상기 유도체는 바이러스 감염 또는 항원-항체 반응의 가능성을 수반하지 않고 암을 화학적으로 또는 방사선으로 치료함으로 발생하는 골수의 결손에 의한 과립구감소증을 효과적으로 치료한다(과립구감소증 치료약). CSF 생산 촉진제는 또한 하기에 서술되는 제제에 의해 촉진되는 CSF 생산 활성에 의한 여러가지 질병을 예방하고 치료하는데도 사용할 수 있다. 예를들어, CSF는 과립구 및 대식세포의 기능을 증진하도륵 작용하여(Lopez, A. F. 등, J. Immunol., 131, 2983(1983); Handam, E. emd, J. Immunol., 122, 1134(1979) 및 Vadas, M. A.등, J. Immunol., 130, 795(1983)), 여러가지 질병의 예방 및 치로에 CSF의 임상적용이 예상된다. 마찬가지로, CSF 생산 촉진제는 임상적용에 유용하다.

최근에, 무해한 병원체가 병원성을 갖게 되면 생체 방어능이 손상된 절층된 숙주는 소위 기회주의적인 감염 또는 말단 감염을 겪는다는 것이 알려졌다. 임상적으로, 상기 감염은 수도모나스(Pseudomonas) 및 세라티아(Serratia) 등의 그람-음성간균, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV), 바리셀라-조스터 바이러스(Viricella-Zoster virus,VZV) 및 시토메갈로 바이러스(CMV) 등의 바이러스, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 및 노카르디아 아스테로이데아(nocardia asteroidea) 등의 진균, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 등의 프로토조아 등에 기인한다. 현재 사용되는 항생제는 기회주의적인 감염에 완전히 효과적이지 못하기 때문에, 상기 감염에 대한 신규약제의 개발 연구가 요망되고 있다. 본 발명의 IL-1β유도체는 항암제가 투여될때 특히 자주 발생하는 기회주의적 감염의 예방 및 치료에 또한 유효하다. 예를들어, 급성 백혈병의 화학적치료 및 골수이식 중에 발생하는 여러가지 감염증, 즉 칸디도스증, 크립토코코스증, 아스퍼질러스증, 접합균증, 크로모진균증, 바이러스감염, 사이토메갈로바이러스 폐렴 및 상기 감염증의 복합증 등을 치료 및 예방하는데 유용하다.

상기 언급한 의약용도 이외에도, IL-1β 및 본 발명에 의한 그의 유도체는 예를들면, 그것들이 시토카인의 생산을 촉진하는 활성을 갖고 있어서 세포주로부터 여러가지 유용한 시토카인을 시험관에서 제조하는데 유용하다. 천연형의 시토카인, 특히 당단백질인 시토카인을 제조하는데 관심이 주어져왔다. 본 발명 유도체는 시토카인 생산 유발제로 사용되어 유용한 시토카인을 대량으로 효과적으로 수득할 수 있게 한다.

본 발명의 유도체 중에서, 높은 활성을 나타내는 것은 식(A)에서 최소한 71-위치의 Cys가 결핍되어 있거나 또는 다른 아미노산 특히 Ser, Ala, Val 등과 같은 아미노산 1개로 치환된 폴리펩티드이다.

그리고 식(A)에서 최소한 4-위치의 Arg 또는 8-위치의 Cys가 결핍되거나 치환된 본 발명의 유도체 및 최소한 103-위치 이하의 아미노산 중의 최소한 하나가 결핍된 것은 프로스타글란딘 E(PGE)의 생산을 촉진하는 활성이 낮은 특성을 갖고, 그러므로 발열성 등의 부작용이 감소되고 독성이 낮고, 최소한 4-위치의 Arg이 결핍되거나 치환된 것은 GIF 활성 및 LAF 활성보다 CSF 생산 촉진활성 및 소염활성이 높은 특성을 갖는다.

그리고, 최소한 식(A)의 N말단에 연결된 폴리펩티드 또는 상기한 특정 아미노산을 갖는 본 발명 유도체는 GIF 활성 및 LAF 활성보다 CSF 생산 촉진활성 및 소염활성이 높은 특성을 갖고, 의약품 특히 경구약 및 좌약으로 유용한데, 이는 본 발명 유도체가 독성이 낮고 지속성 활성을 나타내기 때문이다.

그리고, 본 발명 유도체, 특히 8-위치의 Cys 및/또는 71-위치의 Cys가 결핍되거나 치환된 것은 여러 조건하에서 IL-1 수용체에 대한 결합활성이 탁월하다. 더욱 바람직한 것은 8-위치 및/또는 71-위치의 Cys가 Ser, Ala 및/또는 Val으로 치환된 것이다.

본 발명 유도체 중에서 IL-1β보다 Cys함량이 낮은 분자 또는 Cys가 없는 것은 Cys의 SH기에 의한 분자내 또는 분자간 결합이 불필요하게 발생할 수 없다는 점에서 더욱 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는, 예를들면, 본 발명의 특정 폴리펩티드의 유전정보를 지정하는 유전자를 사용한 유전자 조작기술, 즉 상기 유전자를 미생물용 운반체에 넣고 미생물내에서 복제, 전사 및 전이를 수행한다. 상기 방법은 대량생산이 가능하다는 점에서 유리하다.

본 방법에서 사용되는 유전자는 통상의 방법, 예를들어, 포스피트 트리에스테르법(Nature, 310, 105(1984)) 등으로 핵산을 화학합성하여 전체를 합성할 수 있으나, IL-1β의 유전정보를 지정하는 유전자 또는 이의 전구체를 이용하는 것이 편리하다. 상기의 화학합성을 포함한 통상의 방법에 의해, 유전자는 상기의 특정한 아미노산 서열의 유전정보를 지정하는 핵산서열로 변형되고, 이에 의해 원하는 유전자가 쉽게 제조될 수 있다.

IL-1β의 유전정보를 지정하는 유전자 및 이의 전구체는 이미 알려져 있다. 본 발명자는 특허 출원 제9675/1985호에 공개 하였듯이 IL-1β의 유전정보를 지정하는 유전자를 수득하여 이 유전자를 사용한 유전자 조작으로 IL-1β를 제조하는데 성공하였다. 사용된 유전자 조작기술들은 하기의 참고 실시예에 서술된 것이다.

상기에서 언급한 변형된 핵산(염기) 서열은 공지방법에 의해 제조되고, 이는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 따라 수행한다(Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory(1982)).

예를들어, DNA의 절단, 접합, 인산화 등은 제한효소, DNA 리가제, 폴리뉴클레오티드기나제 및 DNA폴리머라제 등의 상품으로 쉽게 구할 수 있는 효소의 처리를 포함하는 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 포함된 유전자 및 핵산의 분리 및 정제는 또한, 통상의 방법, 예를들어, 아가로스 겔 전기영동에 의해 수행한다. 조금후에 설명될 것이지만, 수득된 유전자는 통상의 운반제를 사용하여 복제한다. 원하는 아미노산 서열 및 합성링거의 유전 정보를 지정하는 DNA 단편은 상기 언급한 화학 합성으로 쉽게 제조할 수 있다. 원하는 아미노산에 해당하고 상기 방법에서 사용될 코돈은 공지되어 있고 원하는대로 선택되었다. 상기 목적을 위하여, 통상의 방법, 예를들어, 사용될 숙주의 고돈 사용빈도에 따라 사용될 수 있다(Nucl. Acids Res., 9, 43∼73(1981)). 관련된 핵산 서열내의 코돈을 변경시키기 위해, 부위 특이성 변이유발법(site-specific mutagenesis : Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 5662∼5666(1984))이 통상대로 원하는 변형 서열의 유전 정보를 지정하는 약 15∼30량체의 합성 올리고뉴클레오티드를 함유하는 개시제를 사용하여 수행한다.

상기 방법으로 수득한 원하는 유전자는 염기서열을, 예를들면 막삼-길버트 화학변형법(Meth. Enzym., 65, 499∼560(1980)) 또는 M13 파지를 사용하는 다이데옥시뉴클레오티드 연쇄 종결법(Messing, J. 및 Viera, J., Gene, 19, 269∼276(1982))으로 검사할 수 있다.

상기 방법 및 그 과정은 하기 참고예 및 실시예에 서술될 것이나 구체적으로 제한하지 않고, 공지 기술 분야의 모든 공지방법을 사용할 수 있다.

상기와 같이, 본 발명은 또한 상기 지정한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유전정보를 지정하는 신규의 유전자(이 유전자를 이하 "본 발명 유전자"로 칭한다)를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 본 발명 유전자를 사용한 통상의 유전자 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명 유전자를 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있는 재조합 DNA를 제조하여 숙주 세포를 형질 전환시키고 형질전환체를 배양한다.

유용한 숙주는 진핵 또는 무핵세포일 수 있다. 진핵세포는 척추동물의 세포, 효모 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 척추동물 세포는 원숭이 세포인 COS 세포(Y. Gluzman, Cell, 23, 175∼182(1981)), 챠이니즈 햄스터 난소세포의 디히드로 폴레이트 리덕타제 결손주(G. Urlaub 및 L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 77, 4216∼422)(1980)) 등이나, 유용한 세포가 이것으로 제한되는 것은 아니다. 척추동물 세포의 유용한 발현 운반체는 발현될 유전자의 상류에 위치한 프로모터, RNA 접합부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 종결서열 등을 갖는 것이다. 상기 운반채는 필요할때 복제 오리진을 가질 수 있다. 유용한 발현 운반체의 예는 SV40의 초기 프로모터를 갖는 pSV2dhfr(S. Subramani, R. Mulligan 및 P.Berg Mol. Cell. Biol., 1(9), 854∼864)를 포함하나 그것으로 제한하지 않는다.

효모는 진핵 미생물로 널리 사용되고, 그중에서 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 것이 일반적으로 사용된다. 효모의 발현 운반체로 많이 사용되는 것의 예로는 산성 포스파타제유전자의 프로모터를 갖는 pAM82(A. Miyanohara 등, Proc. Natl. Acad. Sei., U. S. A., 80, 1∼5(1983)) 등을 포함한다.

이. 콜리 및 바실루스 서틸리스가 무핵 숙주세포로 널리 사용된다. 본 발명은, 예를들어, 숙주 세포내에서 복제할 수 있는 플라스미드 운반제를 사용한다. 유전자를 운반체에서 발현시키기 위해, 프로모터 및 유전자의 상류에 SD(샤인-달가로노) 염거서열 및 단백질 합성 개시에 필요한 ATG를 갖는 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 널리 사용되는 이. 콜리 숙주는 이. 콜리 K12 균주이다. pBR322가 널리 사용되는 운반체이다. 그러나, 상기는 제한적이 아니고, 여러종류의 균주 및 운반체를 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 프로모터는 트립토판 프로모터, P_L프로모터, 1ac 프로모터, 1pp 프로모터 등이다. 상기 프로모터 중의 어느 것을 사용하여도 유전자가 발현될 수 있다.

트립토판 프로모터가 사용된 경우의 방법을 서술하기 위하여, 트립토판 프로모터 및 SD 서열을 갖는 운반체 pTM1(후미오 이마모또, 다이샤, Vol. 22, 289(1985))를 발현 운반체로 사용한다. 본 발명의 원하는 폴리펩티드의 유전정보를 지정하고 ATG를 갖는 유전자는 필요하면 SD 서열의 하류에 존재하는 제한효소 ClaI부위에 연결된다.

부수적으로, 직접 발현 체계뿐만 아니라 융합 단백질 발현 체계도 예를들어, β-갈락토시다제, β-락타마제 등을 사용하여 이용할 수 있다.

상기와 같이 수득한 발현 운반체를 숙주세포에 도입하고 통상의 방법으로 형질 전환시킨다. 예를들어, 대수 성장기에 있는 세포를 수집하여 CaCl₂로 처리하여 DNA를 쉽게 받아들이게 한다. 이에 의해 운반체가 세포에 도입된다. 상기 방법에서, 공지된 바와같이, MgCl₂또는 RbCl을 함께 사용하여 형질전환 효율을 높일 수 있다. 세포는 형질전환전에 스피로 플라스트 또는 프로토플라스트로 전환될 수 있다.

상기와 같이 수득한 원하는 형질 전환체는 통상의 방법으로 배양하여 원하는 폴리펩티드가 제조되고 축적된다. 배양매질은 L배지, E배지, M9배지 등과 같은 일반적으로 사용되는 세포 배양용이면 된다. 여러종류의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 등은 공지된 대로 상기 배지에 혼합한다. 트립토판 프로모터를 사용하면, 예를들어, M9 최소배지를 카사미노산과 혼합하여 프로모터의 작용을 수행하도록 할수 있다. 인돌 아크릴산과 같은 화학약품이 트립토판 프로모터의 작용을 증진시키기 위해 배양의 적절한 단계에 배지에 가입될 수 있다.

본 발명의 원하는 폴리펩티드는 배양물로 부터 분리하여 통상의 방법으로 정제할 수 있다. 폴리펩티드는 숙주로부터 삽투압 충격등과 같이 순한 조건에서 추출하여 그의 고자구조를 유지하는 것이 바람직하다.

상기의 분리 또는 정제방법은 생물질로 부터 단백질류 물질을 분리하는데 통상적으로 사용되는 것과 같은 방법으로 수행한다. 예를들어, 원하는 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 성질을 이용하는 여러가지 과정을 사용할 수 있다.(참조, "Biological Data Book II", pp. 1175∼1259, 1판, 1차 인쇄, 1980. 6.23, 가부시끼가이샤 도오꾜 가까꾸도진 출판). 유용한 과정의 예는 통상의 단백질 침전제, 한외여과, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 액체 크로마토그래피, 원심분리, 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 투석 및 상기 과정의 조합이다.

원하는 폴리펩티드는 부분적으로 정제된 상등액에서 분리한다. 부분정제는, 예를들어 단백질 침전제로서 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 또는 디메틸 포름아미드(DMF), 와 같은 유기용매, 아세트산, 과염소산(PCA) 또는 트리클로로 아세트산(TCA) 등의 산성 반응제 등을 사용하는 처리, 황산암모늄, 황산나트륨 또는 인산나트륨 등의 염석제를 사용한 처리 및/또는 투석막, 평막, 속이 빈 섬유막(hollow fiber membrane) 등을 사용한 한외여과로 수행한다. 상기 처리는 통상의 조건에서 통상적으로 수행되는 것과 동일한 방법으로 수행한다.

상기와 같이 조악하게 정제된 산물을 겔여과하여 원하는 물질의 활성을 나타내는 분획을 수집한다. 유용한 겔 여과제는 구체적으로 제한하지 않고, 덱스트란 겔, 폴리아크릴아미드 겔, 아가로즈 겔, 폴리아크릴아미드- 아가로즈겔, 셀룰로오즈 등이 있다. 공업적으로 구입 가능한 유용한 제제의 예는 세파덱스 G형, 세파덱스 LH형, 세파로스형, 세파크릴형(모두 파마시아 제품), 셀로핀(치쏘사) 바이오겔 P형, 바이오겔 A형(둘다 바이오-라드 랩사 제품), 울트로 겔-C(LKB), TSK-G형(도요소다 공업사 제품) 등이 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 분획으로 부터 균일물질로 분리할 수 있는데, 예를들어, 각 분획을 히드록시 아파리트 컬럼을 사용한 친화도 크로마토그래피, DEAE의 이온교환 컬럼 크로마토그래피, CM 또는 SP법, 크로마토포거싱법, 역상 HPLC등 또는 상기 방법의 조합으로 수행할 수 있다.

크로마토포커싱법은 여러가지 공지방법으로 수행할 수 있다. 컬럼으로 사용할 수 있는 것은 예를들면, PBE94(파마시아 파인 케미칼스)등, 출발 완충용액으로는, 예를들면, 이미다졸- 염산등, 용출액으로는, 예를들어, 폴리버퍼 74(파마시아 파인 케미칼스) 및 염산(pH 4.0)의 혼합물이다.

역상 HPLC는 예를들어, C₄하이포어 역상 HPLC컬럼(바이오-라드 라보라토리즈) 등으로, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산(TFA), 물등 또는 상기 용매의 혼합물을 용출액으로 하여 수행할 수 있다.

상기 방법으로, 본 발명의 IL-1β유도체(폴리펩티드)는 분리하여 수득할 수 있다. IL-1β의 유전정보를 지정하는 유전자는 유사한 유전자 재조합 과정을 통하여 IL-1β를 제공할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는, 앞에서 서술한대로 탁월한 약리활성을 갖고 있는데, 상기 언급한 의약용도의 유용한 제제로 제제화될 수 있다. 상기 의약제제의 예는 항체생산, 백신효과증진 및 면역 결핍치료용 면역자극제, 항암제, 시로카인 생산촉진제, 소염제, 방사상해 예방 또는 치료제, 기회주의적 감염의 예방 또는 치료제 등을 포함한다. 상기 의약제제는 보통 약학적으로 유효한 본 발명 펩티드 또는 IL-1β 및 적절한 담체를 함유하는 약학 조성물의 형태로 제제화 된다. 유용한 담체의 예는 원하는 형태의 약제 제조에 일반적으로 사용되는 충진제, 확장제, 결합제, 흡습제, 전개제, 계면활성제 등의 희석제 및 부형제를 포함한다. 약학 조성물의 형태는 본 발명 폴리펩티드 또는 IL-1β를 유효하게 함유하는 한 특정한 것으로 한정되지 않으며, 예를들면, 정제, 분말, 과립, 환약 또는 유사한 고체 제제의 형태일 수 있다. 그러나, 통상적으로, 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유화액 등의 주사용일 수 있다. 한편으로는, 상기 조성물은 사용전에 적절한 운반체를 가입하여 액체로 만들 수 있는 건조물일 수 있다. 상기 언급한 약학 조성물은 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

수득된 약학조성물의 형태에 따라서, 조성물은 적절한 경로로 투여된다. 예를들면, 주사용 조성물은 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사, 복강주사로 투여된다. 고체 조성물은 경구 또는 장내로 투여된다. 조성물의 활성성분 함량 및 투여량은 투여의 방법 및 형태, 사용목적, 환자의 증상 등에 따라 적절히 결정한다. 일반적으로는 1∼약 80중량%의 활성성분을 약제에 함입시키고, 활성성분으로 계산해서, 상기 제제를 성인 1일당 약 0.1μg~약 10mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 상기 제제를 항상 한번에 투여해야 할 필요는 없고 3~4회로 분할하여 투여할 수 있다.

본 발명을 IL-1β를 제조하는 참고예 및 본 발명의 유도체를 제조하는 실시에에 따라 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예에서, 서술을 간단히 하기 위해 하기의 기호가 본 발명 유도체에 대해 사용된다.

하기 실시예에서, 생리활성은 하기 방법으로 결정한다.

(1) IL-1 활성의 결정

새앙쥐 C3H/HeJ 세포주의 흉선세포를 사용한 J. J. Oppenhein 등의 방법(J. Immunol., 116, 1466(1976))에 의한 LAF 활성의 항으로 표현된다.

(2) GIF 활성의 결정

여러 농도로 희석된 시료용액 일부(0.1ml)를 96- 웰 마이크로 플레이트(96 well microplate, 코닝사 제품)의 각 홈에 넣고, 인체 흑색종 세포 A375를 2×10⁴세포/ml의 양으로 함유하는 10% FCS의 이글스 MEM 현탁액 0.1ml을 각 홈에 넣은 후 CO₂배양기(납코사)에서 4일간 배양한다. 배양후에 0.05ml의 0.05% 뉴트랄 레드(와코 쥰야꾸사)를 각 홈에 넣고, 37℃에서 2시간 반응시킨다. 상동액을 제거한 후, 0.3ml의 PBS(인산 완충 식염수)를 각 홈에 부드럽게 부어 세척한다. 세척액을 제거한 후, 1 염기성 인산나트륨 및 에탄올의 동량 혼합물 0.1ml을 각 홈에 넣고 미세 혼합기로 수분간 흔들어 준후, 96- 웰 미세 적정판용 광측정기(타이터텍 멀티스캔, 플로우랩 제품)를 사용하여 540mμ의 흡광도로 세포에 흡수된 색소의 양을 측정하여 성장 저해활성을 결정한다. 대조군 세포성장의 50% 저해율을 나타내는 시험군, 즉 대조군에 측정된 흡광도의 1/2을 나타내는 시험군을 찾아낸다. 상기 시험군의 희석배율의 역수를 GIF 활성단위로 취한다. 따라서, 예를들어 GIF 활성이 10 단위이면, 시험용액은, 10배 희석되어도 세포성장을 50% 억제하는 활성을 갖는다.

하기 도면을 참고예 및 실시예에 인용한다.

제 1 도는 플라스미드 pGIF-αcDNA의 제한효소지도이고, 제 2 도는 플라스미드 pGIF-α 및 플라스미드 pTMI로부터 플라스미드 ptrpGIF-α가 어떻게 제조되는가를 보여주는 도표이고, 제3-a도에서 제3-d도까지는 플라스미드 pcD-GIF-16에서 유래된 GIF 활성 또는 플라스미드 pcD-GIF-207에서 유래된 GIF 활성에 대한 항-폴리펩티드 I혈청(중화항체)의 영향을 나타내는 그래프이고, 제 4 도는 플라스미드 pcD-GIF-16 및 플라스미드 pcD-GIF-207의 cDNA에 대한 제한효소지도이고, 제 5 도∼제 7 도는 폴리펩티드 I의 CSF생산 촉진효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제 8 도는 폴리펩티드 I의 항관절염 효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제 9 도는 본 발명의 IL-1β유도체의 CSF 생산 촉진효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제10도는 본 발명의 IL-1β유도체의 소염효과를 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제11도는 본 발명의 IL-1β유도체의 방사능 병 예방활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제12도는 본 발명의 IL-1β유도체의 기회주의적 감염 예방활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 그래프이고, 제13도는 본 발명의 IL-1β유도체의 GM-CSF 생산 유발 활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 사진이고, 제14도는 본 발명의 IL-1β유도체의 BSF-2 생산 유발 활성을 시험하여 수득한 결과를 나타내는 사진이다.

참고예 1

플라스미드 pGIF-α의 제조

(1) 인체 임파구세포의 제조

사람의 말초혈액을 수집하여, 그로부터 피콜-히파크 밀도구배 원심분리법(Eur. J. Immunol. 4, 808(1974))에 의해 1.9×10¹⁰임파구 세포를 수득한다.

임파구 세포를 5% 인혈청 함유 RPMI 1640 배지에 4×10⁸세포/ml의 농도로 현탁시킨다. 현탁액을 페트리 디쉬, 9cm 직경에 분주하고, 5% CO₂존재하에서 37℃로 한시간 배양한다. 각 디쉬의 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하고 10% FCS, 0.5ng/ml의 TPA(시그마제품) 및 10μg/ml의 LPS(디스코제품)을 함유하는 RPMI 1640을 가입한다. 5% CO₂, 37℃에서 4시간 배양한 후에, 9×10⁸의 부착된 임파구를 PBS 및 0.02% EDTA로 수득한다.

(2) mRNA의 제조

과정(1)에서 수득한 인체 임파구세포(9×10⁸세포)를 30ml의 6M 구아니딘 티오시아네이트 용액(6M 구아니딘 이소티오시아네이트, 5mM 소디움 시트레이트(pH 7.0), 0.1M 2-메트캅토 에탄올 및 0.5% 사르코실)에 녹이고, DNA를 G18G 주사 바늘이 달린 50ml 용량 주사기로 건져내고, 12g의 세슘 클로리드(CsCl)을 용액에 완전히 용해시킨다. 용액의 일부(각 6.4ml)를 4ml의 5.7M CsCl(5.7M CsCl-0.1M EDTA)에 올려놓고, 벡크만 SW-40Ti 로타에서 31500r.p.m으로 25℃에서 20시간 원심분리한다. RNA덩어리 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 TE 용액(10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA)에 녹이고 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 및 에탄올을 각각 용액의 1/9 및 2.2배 가입하고 -70℃에서 1시간 방치한다. 혼합물을 15,000r.p.m으로 4℃에서 20분간 원심 분리하여 RNA를 수집하고, 이를 TE 용액에 녹인다.

상기 방법으로, 약 9×10⁸의 부착된 임파구 세포로부터 20μg의 전체 RNA를 제조한다.

RNA로 부터 mRNA를 수득하기 위해서, RNA를 올리고(dT)-셀룰로오즈를 사용한 컬럼(Collaborative Research Inc.)에 크로마토그래피 한다. 흡착을 위해서, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5). 0.5M NaCl 및 1mM EDTA 용액을 사용하고, 이 용액으로 컬럼을 세척한다. RNA는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 및 1mM EDTA 용액으로 용출된다.

결과적으로, 17.5μg의 mRNA를 수득한다.

(3) cDNA의 제조

과정(2)에서 수득한 mRNA로부터, cDNA를 시험관에서 합성하고 오까야마-버그 플라스미드 운반체(Okayma-Berg Plasmid Veotor : Okayma. H. 및 Berg. P. Mol. Cell. Biol., 2, 161(1982))를 사용하여 재조합 DNA를 만들어 이. 콜리에 형질 전환하여 cDNA 도서관을 얻는다. 그 과정은 다음에 있다.

(3-1) 운반체 개시제 및 링커 DNA의 제조

pBR322-SV40(0.71∼0.86) DNA(400μg)을 700단위의 KpnI(NEB)로 37℃에서 5시간동안 절단한다. 반응은 40μl의 0.25M EDTA(pH 8.0) 및 20μl의 10% SDS의 혼합물로 종결된다. 반응 혼합물을 같은 부피의 페놀-클로로포름(1 : 1)로 추출한다. 에탄올로 DNA를 침전시키고 원심 분리한후 70% 에탄올로 세척하여 DNA를 수집한다. 이 DNA를 140mM 소디움 카코딜레이트, 30mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1mM CoCl₂, 0.1mM DTT 및 0.25mM dTTP(0.5μCi의 α-³²P-dTTP함유)의 혼합물 200μl에 용해시키고 400단위의 말단 전이효소로 30분간 처리하여 dT 연쇄를 연장시킨다. 0.25M EDTA 20μl 및 10% SDS 10μl로 반응을 종결시키고 페놀-플로로포룸으로 4번 추출한다. 그 결과로 dT 연쇄는 약 70 염기가 길어진다.

상기와 같이 수득한 DNA를 37℃에서 17 단위의 HpaI(NEB)로 절단하고 아가로즈(저융점 아가로즈, BRL, 1%)로 전기 영동하여 2.7kb DNA단편을 수집한다.

전기 영동후, 0.5μg/ml의 이티디움 브로미드로 DNA를 염색하고, 약 2.7kb 단편을 포함하는 아가로즈를 UV 조사하에서 잘라내고, 잘라낸 아가로즈의 5배 부피의 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)-1mM EDTA를 가입하여 65℃로 5분간 가열하여 아가로즈를 녹인다. 이를 페놀, 그리고는 페놀-클로로포름(1 : 1) 그런 후에 클로로포름으로 추출한다. DNA를 에탄올로 침전시켜 수집한다.

이어서, 운반체 개시제 DNA를 올리고(dA) 셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피로 정제한다. DNA를 1ml의 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)-1mM EDTA-1M NaCl 완충용액에 녹이고, 얼음으로 냉각시킨 후 같은 완충용액으로 평형화된 컬럼에 놓고, 같은 완충용액 1ml로 세척하고 상온으로 전환한다. 그런후 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)-1mM EDTA로 용출하여 피크분획을 수집한다. 에탄올로 침전시켜 DNA를 수집한후, 100μl의 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)-1mM EDTA로 녹여서 4℃에 보관한다.

링커 DNA를 다음 방법으로 제조한다. pBR322-SV40(0.19-0.32) DNA(100μg)을 120단위의 PstI(NEB)로 37℃에서 1.5시간 동안 절단한다. 반응을 종결시키고 페놀-클로로포름으로 추출한후 에탄올로 침전시킨다. 수집된 DNA를 140mM 소디움 카코딜레이트, 30mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1mM CoCl₂, 0.1mM DTT 및 0.25mM dGTP(1μCi의 α-³²P-dGTP 함유)의 혼합물 50μl에 용해한다. 용액을 60단위의 말단전이 효소로 20분간 처리하여 18 염기의 dG 연쇄를 연결한다. 반응을 종결시킨 후, DNA를 수집하고, 50단위의 HindIII(다까라 수조사)로 절단하고 아가로즈(1.8%)에서 상기와 같은 방법으로 전기영동하여 약 0.28kb DNA 단편을 수집하여 0.23μg의 링커 DNA를 수득한다.

(3-2) cDNA 합성 및 cDNA 도서관의 제조

RNA(5μg)을 감압 건조하고, 10μl의 5mM 트리스-HCl(pH 8.3)에서 65℃로 5분간 가열하여 녹이고 즉시 37℃로 냉각한다. 반응 혼합물에 5mM 트리스-HCl(pH 8.3), 8mM MgCl₂, 30mM KCl, 0.3mM DTT, 2mM dNTP 및 10μCi의 α-³²P-dCTP의 혼합물 20μl를 가입하고 37℃로 5분간 유지한다.

역전사 효소 10단위(세이가가꾸고교사 제품)를 혼합물에 가입하여 37℃에서 15분간 반응시킨다. 2μl의 0.5mM EDTA(pH 8.0) 및 1μl의 10% SDS로 반응을 종결시키고 페놀 클로로포름으로 추출하여 추출물에 20μl의 4M 암모늄 아세테이트 및 80μl의 에탄올을 가입한다. 이를 -70℃에 15분간 냉동하고 상온에서 녹여 15000r.p.m에서 4℃ 10분간 원심 분리한다. 침전물을 20μl의 10mM 트리스-HCl(pH 7.3)에 용해하고, 이를 19μl의 4M 암모늄 아세테이트 및 80μl의 에탄올로 재침전시킨다.

침전물을 회수하여 70% 에탄올로 세척하고 140mM 소디움 카코딜레이트, 30mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1mM CoCl₂, 0.1mM DTT, 0.2μg의 폴리 A 및 66μM의(α-³²P) dCTP(10μCi)의 혼합물 15μl에 용해한다. 말단 전이효소(PL. 18단위)를 용액에 가입하고 37℃에서 5분간 반응시키고, 재빨리 0℃로 냉각시키고, 1.3μl의 0.25M EDTA 및 0.65μl의 10% SDS로 반응을 중단시킨후 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시킨다.

침전물을 원심 분리하여 수거하고 4단위의 HindIII(다까라 수조사)로 37℃에서 2시간 절단하고 반응을 중단시킨 후 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전한다. 침전물을 10mM 트리스-HCl(pH 7.3), imM EDTA 용액 10μl에 녹인다. 3μl의 에탄올을 가입하고, -20℃에 보관한다.

상기 시료 1μl를 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA 및 0.1M NaCl의 혼합물 10μl에서 5ng의 링커 DNA와 65℃에서 2분간 유지하고 42℃에서 30분간 유지한다. 상기 혼합물에 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 4mM MgCl₂, 10mM(NH₄)₂SO₄, 0.1M KCl, 0.1mM β-NAD, 50μg/ml BSA 및 6단위/ml의 이. 콜리 DNA 리가제의 혼합용액 90μl를 가입하고 12℃에서 하룻밤 유지한다.

상기 용액에 0.5μl의 10mM dNTP, 0.56μl의 10mM NAD, 0.5μl의 이. 콜리 DNA 폴리머라제I(베링거 만하임사 제품) 및 0.2μl의 RN아제 H(PL)을 가입한다. 혼합물을 12℃에서 1시간 유지하고 25℃에서 1시간 유지한후 -20℃로 얼려서 보존한다.

이. 콜리 HB1이 균주를 LB 배지(10g 박토트립톤, 5g 박토 이스트익스트랙트 및 10g NaCl/ℓ)dptj OD₅₅₀의 0.45까지 배양하여 얼음으로 5분간 냉각시키고 4℃에서 8000r.p.m으로 5분 원심 분리하여 세포를 수거한다. 세포 덩어리를 빙냉한 30mM 포타슘 아세테이트, 100mM RbCl, 10mM CaCl₂, 50mM MnCl 및 15% 글리세린의 혼합물에 풀고, 0℃에서 5분 놓아두고 4℃에서 8000r.p.m으로 5분간 원심 분리한다. 수거된 세포를 다시 10mM MOPS(모르폴리노프로판술폰산), 75mM CaCl₂, 10mM RbCl 및 15% 글리세린 혼합물에 풀고 0℃에서 15분 유지하여 형질전환 가능세포(competent cell)로 만들고, 이는 -70℃에 보관한다.

냉동 현탁세포를 실온에서 녹이고 DNA 시료(200μl)를 400μl의 현탁액에 가하고, 0℃에서 30분간 방치한다. 이를 42℃에서 90초간 열 충격을 주고 다시 0℃에서 1∼2분간 방치한다. 2ml의 LB 배지를 가입하여 37℃에서 30분간 방치한다. LB 배지(혼합물 부피의 50배)를 혼합물로 접종하고 37℃에서 6시간 배양한다. 암피실린을 배양물에 50μg/ml의 농도로 가입하고, 다시 하룻밤 배양하여 cDNA 도서관을 제조한다. cDNA 도서관은 50% 글리세린에서 -20℃로 보관한다.

(3-3) 합성 탐침의 제조

마지막 줄에 나타낸 염기서열은 그 윗줄의 염기서열에 상보적이고 하기 방법으로 제조하여 IL-1β의 유전정보를 지정하는 cDNA를 갖는 형질 전환체를 신별하기 위한 탐침으로 상보서열을 사용한다. 상기와 같이, 완전히 보호된 DNA는 N,N-디알킬메틸 포스포라미디트 유도체가 축합단위로 사용되는 고상 포스피트 트리에스테르법(Nature, 310, 105(1984))으로, 자동합성기(380A DNA 신세사이저, 어플라이드 바이오시스템사, 포스터시, 캘리포니아 94404, 미합중국)를 사용하여 제조한다. 이어서, 완전히 보호된 DNA를 28% 암모니아수로 55℃에서 10시간 처리하여 5' 말단의 수산기에 결합된 DMTr(디메톡시트리틸)을 제외한 보호기(즉 A,G 및 C의 아미노기에 대한 아실기)를 제거하고 부분적으로 보호된 DNA를 수득한다. 다음에, 부분적으로 보호된 DNA를 C₁₈컬럼을 사용한 역상 HPLC로 정제하고 실온에서 80% 아세트산으로 10분간 처리하여 DMTr기를 제거한다. 이와같이 얻은 뉴클레오티드를 7M 요소 및 바이오겔 P-30(바이오-라드 랩)을 함유하는 10% 폴리아크릴아미드겔에 전기 영동하여 정제한다. 여기서 원하는 DNA(60량체)를 수득한다.

상기와 갈이 수득한 DNA(6μg)을 12단위의 T₄폴리뉴클레오티드 키나제(다까라 수조)와 37℃에서 1시간동안 50μl의 반응 혼합물(50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM MgCl₂, 10mM 2-메르캅토 에탄올, 0.2mg/ml 태내 소 흉선 DNA 및 50μCi(γ³²P)-ATP)에서 반응시켜 DNA의 5' 말단을 표지한다. 미반응³²P로 부터 표지된 DNA를 분리하기 위하여, 반응 혼합물을 바이오겔 P-30(바이오-라드)로 크로마토그래피한다. 표지된 DNA 분획을 분획의 1/9 부피의 3M 소디움 아세테이트 및 분획부피의 2.5배의 에탄올로 침전시키고, 원심 분리하여 수집하고 400μl의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 1mM EDTA 혼합물에 용해하고 -20℃에 보존한다.

결과 탐침의 비활성은 최소한 10⁷cpm/μg DNA이다.

(3-4) cDNA 도서관의 선별

직경 80mm 니트로셀룰로오즈 여과지(밀리포어 HAIFO 8250), 24장을 50μg/ml의 암피실린 함유한 LB 한천 배지에 놓고, cDNA 도서관 용액을 여과지위에 퍼뜨려, 각 여과지당 5000콜로니가 투여되게 하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다.

새로운 니트로셀룰로오즈 여과지를 콜로니가 투여된 여과지 위에 놓아 복사판 여과지를 만든다.

원래의 여과지(마스터 여과지)을 4℃에 보관하고, 복사판 여과지를 상기와 같은 한천 배지에 놓고 37℃에서 6시간 배양한 후 200μg/ml의 클로람페니콜을 함유한 LB 한천배지로 옮기고 37℃에서 하룻밤 배양한다.

그리고, 여과지를 0.5N NaOH로 처리하고, 1M 트리스-HCl(pH 8.0), 그런후에, 1M 트리스-HCl(pH 8.0) 및 1.5M NaCl의 혼합물로 처리하여, 공기로 건조시키고 감압하에서 80℃로 2시간 굽는다.

구워진 여과지를, 약간 흔들어 주면서, 1.2M NaCl,0.12M 트리소디움 시트레이트, 10mg/lml의 피콜, 10mg/lml의 폴리비닐피롤리딘, 109mg/lml BSA, 0.1% SDS 및 1mg/lml의 연어정자 DNA의 혼합용액 20ml 내에서 68℃로 하룻밤 유지한다. 상기 용액을 1.2M NaCl, 0.12 트리소디움 시트레이트, mg/lml의 피콜, 10mg/lml의 폴리비닐피롤리딘, 10mg/lml의 BSA, 0.1% SDS 및 10⁶cpm/ml의 탐침용액으로 바꾸어 42℃에서 약하게 흔들어 주며 하룻밤 동안 혼성화시킨다.

혼성화 후에, 여과지를 용액에서 꺼내어, 1.2M NaCl 0.12M 소디움 시트레이트 및 0.1% SDS 용액으로 실온으로 3회 세척한 후 같은 용액으로 60℃에서 여과지의 백그라운드가 GM 서베이 미터로 조사하여 200cpm이 될때까지 계속 세척한다.

여과지를 공기로 건조시키고 -70℃에서 감광지 및 X-선 필림(후지 RX)를 사용하여 2일간 오토레이도그래피 한다.

필름을 현상한 후, 표지 지역에 존재하는 콜로니를 마스터여과자에서 긁어내어, 앞의 과정을 반복하여 양성을 나타내는 콜로니를 분리한다.

연속하여, 강한 신호를 나타내는 클론 I-2를 분리하였다.

(3-5) 클론의 분석

클론 I-2에 포함된 플라스미드 pGIF-αcDNA의 제한효소지도를 제조한다.

제 1 도는 그 지도를 나타내고, 제 1 도는 cDNA가 5' 말단부터 NocI, HindIII, PvuII 및 AccI(Nippon Gene)의 순서로 각 하나씩 절단부위를 갖음을 보여준다. cDNA는 약 18kd의 분자량을 갖는 IL-1β의 유전정보를 지정하기에 충분한 약 1.5kb의 길이를 갖음이 발견되었다.

다음에, pGIF-αcDNA의 염기서열을 막삼-길버트 화학변형법(Meth. Enzym. 65, 499∼566, 1980) 및 M13 파지사용 디데옥시뉴클레오티드 연쇄 종결법(Messing. J. and Viera, J., Gene, 19, 269∼276(1982))으로 결정한다.

상기식은, 5' 말단으로부터 312~371번째 뉴클레오티드의 밑줄친 지역이 합성탐침에 상보적임을 보여준다. 상기 뉴클레오티드 서열은 인체코돈 사용빈도에 따라 결정된 뉴클레오티드 서열과 75% 상동관계를 갖는다.

그리고 pGIF-α의 cDNA에서 가장 긴 리딩프레임을 찾아보면, 이는 5' 말단에서 57∼771번째 뉴클레오티드 지역임을 알게된다. 이는 pGIF-α의 cDNA가 인체 IL-1β 전구체 단백질의 유전정보를 지정하는 cDNA임을 지적한다.

상기 플라스미드 pGIF-α를 이. 콜리×1776에 도입하여 제조한 형질 전환체는 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 1985년12월12일자로 명칭은 "에스캐리키아콜리(Escherichia coli)×1776/pGIF-α", 수탁번호 FERM BP-948(KFCC-10207, 1986년 6월10일자 한국 종균 협회에 기탁되어 있음)로 기탁되었다.

참고예 2

폴리펩티드 I의 제조

(1) 하기의 올리고데옥시 뉴클레오티드(I) 및 (II)를 하기 서술된 방법으로 제조한다.

5' HOCGATAATGGCTCCTGTACGTTCTCTGAACTGCACTCTCOH 3' …(l)

5' HOCGGAGAGTGCAGTTCAGAGAACGTACAGGAGCCATTATOH 3' …(ll)

거대 기공 실리카에 연결된 N-보호 데옥시 뉴클레오시드(어플라이드 바이오시스템스) 및 5'-0-디메톡시트릴틸을 출발물질로 사용한다. 뉴클레오티드 연쇄를 3' 말단에서 5' 말단을 향하여 5'-0-디메톡시트리틸 및 N-보호 데옥시모노뉴클레오시드-3'-포스포아미디트의 축합단위로, 자동 합성기(380A DNA 신세사이저, 어플라이드 바이오시스템스)를 사용하여 연속적으로 늘린다. 결과의 산물을 티오페놀로 탈메틸화하고 실온에서 28% 암모니아수로 처리하여 실리카에서 뉴클레오티드를 띠어내어, 완전히 보호된 올리고뉴클레오티드를 수득한다. 상기 방법은 모두 자동합성기로 수행한다(Hunkapiller등, Nature, 310, 105(1984)).

상기 올리고 뉴클레오티드를 55℃에서 28%의 암모니아수 2ml로 10시간 처리하여 N-보호기를 제거하여 5'-0-디메록시트리틸 올리고뉴클레오티드를 수득한다. 산물의 1/5을 ODS컬럼(야마무라 가가꾸 겐꾸쇼사)을 사용한 역상 HPLC로 정제하고 실온에서 80% 아세트산 150μl로 20분 처리하여 조제올리고 뉴클레오티드를 수득한다. 산물을 ODS 컬럼을 사용한 역상 HPLC로 더욱 정제하여 원하는 올리고 뉴클레오티드를 수득한다.

참고예 1의 과정에서 수득한 플라스미드 pGIF-α를 제한효소 AccI 및 ClaI으로 절단하여 약 1.2kbp의 DNA 단편을 수득하여 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리 정제한다. DNA 단편을 제한효소 AccI 및 ClaI으로 절단된 말단을 DNA 폴리머라제¹(클레노우 단편)로 블런트하게 만든다.

반면에 BamHI 링커(5' HOCGGATCCGOH 3')의 5' 말단을 T₄폴리 뉴클레오티드 키나제로 인산화하여 블런트화된 DNA 단편과 T₄DNA 리가제로 연결하고 제한효소 BamHI으로 절단하고, 이어서 제한효소 MspI으로 절단한다. 결과의 반응산물을 아가로즈 겔에 전기 영동하여 약 540bp의 정제된 MspI-BamHI DNA 단편을 분리한다.

상기에서 합성한 올리고뉴클레오티드 (I) 및 (II)의 5' 말단에 T₄폴리뉴클레오티드 키나제로 인산화하고 T₄DNA 리가제로 MspI-BamHI DNA 단편과 결합한후, 제한효소 BamHI 및 ClaI으로 절단한다. 반응산물을 아가로즈 겔에 전기 영동하여 약 580bp의 정제된 ClaI-BamHI DNA 단편을 분리한다.

한편으로, 플라스미드 pTMI(후미오 이마모또, 다이샤 Vol. 22, 289(1985))를 제한효소 BamHI 및 ClaI으로 절단하고 아가로즈 겔 전기 영동으로 trp 프로모터 부위를 갖는 약 4.4kbp의 DNA 단편을 분리 및 정제한다. 상기 DNA 단편과 상기에서 제조한 약 580bp의 ClaI-BamHI DNA 단편을 T₄DNA리가제로 접합시켜 폴리펩티드 I의 발현용인 원하는 플라스미드 ptrpGIF-α를 수득한다.

이 플라스미드를 이. 콜리 HB 101에 도입하여 형질전환하여 원하는 형질 전환체 이. 콜리 HB 101/ptrp GIP-α를 비동법(T. Maniatis, E. F. Fritsch 및 J. Sambrook, Molecular Cloning, p. 366, Cold Spring Harbor Laboratory(1982))에 의해 수득한 플라스미드 DNA를 제한 효소로 분석하여 선별한다.

제 2 도는 상기 방법을 도식적으로 보여준다.

플라스미드 ptrp GIF-α를 이. 콜리×1776에 도입하여 제조한 형질 전환체는 1985년12월12일자로 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 명칭은 "에스캐리키아 콜리(Escherichia coli)×1776/ptrpGIF-α", 수탁번호 FERM BP-949(KFCC-10208, 1986년 6월10일자로 한국종균협히에 기탁되어 있음)로 기탁되었다.

(2) 형질 전환체의 배양

상기에서 수득한 형질 전환체, 즉 이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α를 50μg/ml의 암피실린 및 20μg/ml의 L-트립토판을 함유한 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 익스트랙트 및 0.5% NaCl) 10ml에서 37℃로 교반하여 하룻밤 배양한다. 배양액 1ml을 50μg/ml의 암피실린 및 1% 카사미노산을 함유하는 M9 최소배지(0.6% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 2mM MgSO₄. 0.2% 글루코오즈 및 0.1mM CaCl₂) 50ml에 접종하여 37℃에서 교반하여 배양한다. 550nm에서의 흡광도(O. D.)가 1.0에 도달하면 세포를 수거하여 15% 수크로오즈, 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 및 50mM EDTA(pH 8.0)의 용액 5ml에 현탁시킨다. 10mg/ml의 리소짐(10mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 용해) 500μl를 상기 현탁액에 가입하고, 0.3% 트리톤×100, 187.5mM EDTA(pH 8.0) 및 150mM 트리스-HCl(pH 8.0)의 용액 5ml을 다시 가입한다. 혼합물을 실온에서 15분 방치하고, 완전히 교반하고 원심 분리하여 GIF 활성이 있는 세포추출물의 상등액을 수득한다.

(3) 폴리펩티드 I의 정제

이온-교환 크로마토그래프(CM-HPLC)

상기와 같이 제조한 세포추출물 상등액을 50mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.5)으로 투석하고, 투석된 것을 하기 조건하의 길손 고침투 액체크로마토그래피(Gilson high permeation liquid chromatography)로 이온-교환 크로마토그래피(CM-HPLC) 한다.

컬럼 : IEX-535CM(6.0×150mm, 도요소다사 제품)

용출액A : 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)

용출액B : 0.5M NaCl 함유 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)

유속 : 0.5ml/분

분획부피 : 체류시간

0∼60분…2ml/4분/시험관

60∼120분…0.5ml/분/시험관

120∼180분…2ml/4분/시험관

역상 HPLC

CM-HPLC 방법은 90∼91분의 체류시간의 분획에 GIF 활성을 나타낸다.

활성성분을 하기 조건의 역상 HPLC 한다.

컬럼 : C₄하이포어 역상 컬럼(RP304, 바이오-라드 250mm×4.6mm(직경))

용출액 : A액=0.1% TFA

B액=아세토니트릴-1% TFA(9 : 1)

유속 : 1ml/분

기록지 속도 : 체류시간

0∼50분…5분/cm

50∼80분…2분/cm

분획부피 : 2ml/2분/시험관

GIF 활성에 해당하는 단일 단백질 흡수피크를 나타내는 원하는 폴리펩티드 I은 체류시간 63.9∼65.3분에서 수득된다.

상기와 같이 수득한 폴리펩티드 I은 IL-1 활성을 갖으며 비활성은 2.7×10⁷GIF 단위/mg 단백질이다.

(4) 폴리펩티드 I의 확인

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

상기 과정(3)에 의해 수득한 폴리펩티드 I을 라엠리법(Laemmli, U. K. Nature, 277, 680(1970))에 따라 SDS-PAGE분석을 하기 조건에서 수행한다.

시편 : 역상 HPLC 법에 의해 수득한 폴리펩티드 I 분획을 완전히 건조시키고, 라엠리 시료완충용액(2-메트캅토 에탄올을 포함하지 않거나(2ME^-) 또는 완충용액의 1y20부피의 2-메트캅토 에탄올을 함유(2ME⁺))에 용해시키고 100℃에서 4분간 처리한다.

겔 : 15% 폴리아크릴아미드 겔, 두께, 1.5mm

기구 : 프로테안, 바이오-라드 제품

전기영동 : 40mA(일정전류), 2시간

전기 영동한 겔을 실버 스태인 키트(Silver Stain Kit, 바이오-라드 제품)으로 염색한다.

그 결과는 폴리펩티드 I의 2ME⁺의 경우에는 약 17kd의 위치에, 2ME^-의 경우에는 약 17.5kd의 위치에 단일 띠로 이동함을 보여준다.

등전접속(IEF : Isoelectrofocusing)

폴리펩티드 I을 하기 조건하에서 pH3.5∼9.5 범위의 pAG판(LKB) 및 모델 1415(바이오-라드)를 사용하여 IEF를 수행한다.

시편 : 4개의 레인을 사용하여, 0.037μg, 0.074μg 및 0.74μg 분획의 폴리펩티드 I(앞의 과정(3)에서 수득) 및 하기의 표시 단백질(pI 표시 단백질)을 분석

표시단백질

아밀로글루코시다제(3.50)

콩의 트립신 억제제(4.55)

β-락토 글로불린 A(5.20)

소카르보닉 안히드라제 B(5.85)

인체 카르보닉 안히드라제 B(5.85)

말 미오글로빈-산성 띠(6.85)

말 미오글로빈-염기성 띠(7.35)

렌틸 렉틴-산성 띠(8.15)

렌틸 렉틴-중성 띠(8.45)

렌틸 렉틴-염기성 띠(8.65)

트립시노겐(9.30)

전극용액 : 양극(anode)용액=1M H₃PO₄

음극(cathode)용액=1M NaOH

전기영동 : 정전력 1W/cm 겔 넓이, 90분, 냉각(10℃)

염색 : 실버 스테인 키트

전기 영동한 겔을 1cm 간격으로 잘라서 1ml의 물을 넣고 흔들어서(2일간) 추출하여 pH를 검사하고, 이를 등전점계산에 사용한다.

폴리펩티드 I은 6.8±0.1의 등전점(pI)를 갖고 이때에 단일 띠로 나타난다.

아미노산 조성

역상 HPLC 과정(3)에서 수득한 폴리펩티드 I 분획(30μl)를 파이렉스 유리로 만든 12mm×120mm의 벽이 두꺼운 시험관의 바닥에 주의하여 놓고 수산화나트륨 덩어리가 들은 건조기에서 감압하여 건조시킨다. 50μl의 4N 메탄술폰산(0.2% 3-(2-아미노에틸) 인돌을 함유, 피어스 제조)를 시험관의 건조시편에 가입한다. 시험관 내벽의 공기를 0.1∼0.2mmHg로 1분간 빼고 입구를 봉한다. 시편을 118℃의 가열기에서 24시간 가수분해 한다. 시험관을 열고 혼합물을 46μl의 4N 수산화나트륨으로 중화하고 시트르산 완충용액으로 450μl로 희석한다.

250μl의 시료용액을 아미노산 분석기(모델 히다찌 835)에 의해 아미노산 분석한다. 분리된 아미노산을 0-프탈알데히드법으로 검출하고 순정 아미노산으로 만든 검정곡선으로 정량한다.

표 1은 Phe(9몰)를 기준으로 하는 구성 아미노산의 몰비율을 나타낸다. 상기 분석조건에서는, Pro 및 Cys가 검출되지 않는다. Ser, Thr 및 Met는 상기 조건에서의 %수율이 괄호안에 주어진다.

[표 1]

아미노산 서열

역상 HPLC과정(3)에서 수득한 150μl 분량의 폴리펩티드 I을 단백질 서열분석기(어플라이드 바이오 시스템스)로 분석한다. 각각의 PTH-아미노산을 100~50μl의 33% 아세토니트릴 수용액으로 적절히 희석하여, 희석액 5μl를 워터스사 710B, 오토샘플러로 크로마토그래피 컬럼에 주입한다. 크로마토그래피 시스템은 두개의 펌프, 벡크만 모델 112가 조절기, 모델 421로 작동한다. 사용된 컬럼은 크기가 2mm×250mm이고 울트라스피어 ODS -5μm로 충진되어 컬럼가열기에서 55℃로 유지된다. 유속은 0.3ml/분이다. 20mM 소디움 아세테이트 및 아세토니트릴의 혼합물이 농도 구배용출액으로 사용된다. 흡광도는 269nm에서 검사하고, 분석은 45분간 수행되었다.

20회 분석한 결과, 과정(3)에서 수득한 폴리펩티드 I이 N말단에 하기 서열의 20 아미노산을 갖음을 알았다.

Ala - Pro - Val - Arg - Ser - Leu - Asn - Cys - Thr - Leu -

Arg - Asp - Ser - Gln - Gln - Lys - Ser - Leu - Val - Met -

Ser을 부산물의 하나로 확인하고, 나아가서 322nm에서 흡광을 나타내는 탈수소형으로 확인한다. 8회 분석에서, 부산물의 피크가 Cys를 나타내고, Cys는 카르복사미데메틸화(carboxamidemethylation)후의 원래 시료를 분석하여 확인한다.

그리고 폴리펩티드 I을 트립신으로 절단하여 펩티드 단편을 수득한다. 단편의 아미노산 조성을 분석하면 C 말단 펩티드가 손상되지 않고 정확하게 포함되어 있음을 보여준다.

더욱 구체적으론, 폴리펩티드 I 60μg을 1% 암모늄수소 카르보네이트 600μl에 용해한다. 이 용액에 1% 암모늄 수소 카르보네이트 내의 트립신(0.2mg/ml, 쿠퍼 바이오메디칼) 용액 20μl를 가입한다. 혼합물을 37℃에서 24시간 방치하여 트립신을 절단된 펩티드를 얻는다. 펩티드 혼합물을 역상 HPLC 한다(C-18, 300Å, 4.6×150mm, A용액=0.1% TFA, B용액=니트릴 부피의 1/10에 1% TFA를 함유하는 아세토니트릴, B용액의 양을 1%/3분의 속도로 증가시키며 용출한다). B용액의 비율이 40%가 될때까지는 모든 성분이 분리딘다. 펩티드를 아미노산 분석하여, 모든 기대하는 펩티드 단편을 확인한다 특히 C 말단 펩티드는 염기성 아미노산이 없고, 분석에 의해 기대하는 아미노산을 함유하는 것을 확인한다. 즉, 과정(3)에서 수득한 폴리펩티드 I은 기대한 바의 정확한 C 말단을 갖는다.

상기와 같은 방법으로, 펩티드 단편의 아미노산 서열을 검사한다. 확인된 모든 아미노산 서열은 IL-1β에 해당함이 발견되었다. 검사된 펩티드 단편의 확인된 서열은 IL-1β의 아미노산 서열에서 하기와 같이 나타난다.

1-4, 5-11, 12-16, 17-27, 28-63, 64-65, 66-74, 75-88, 89-92, 95-98, 99-103, 104-109, 110-138, 139-153.

이들 결과는 방법(3)에 의해 수득된 폴리펩티드 I이 특정 서열을 갖는 폴리펩티드 I 이라는 것을 나타낸다. 폴리펩티드 I의 계산된 분자량은 17376.59이다.

실시예 1

(1)폴리펩티드 VI의 제법

참고예 2에 의해 수득된 ptrpGIF-α를 부위-특이성 변이 유발방법(Pro. Nat. Acad. Sci., 81, 5662~5666(1984) ; Science, 224, 1431 1984)에 따라 N말단으로 부터 71번째 아미노산 Cys가 Ser로 대치된 폴리펩티드 I의 아미노산 서열을 갖는 폴레펩티드 VI의 제조를 위해 사용한다.

M13 mp 11 파지 운반체는 단일가닥 DNA 기판으로 사용한다. EcoRI/BamHI DNA 단편을 플라스미드 ptrpGIF-α로 부터 분리하고, 제한 효소 EcoRI 및 BamHI 부위에서 M13 mp 11 파지에 클로닝하여 단일가닥(SS) DNA(M13-GIF-α)를 수득하고, 변이 유발 기판으로 사용한다. 합성 올리고 뉴클레오티드[5'-CTGTCCTCAGTGTTG-3'(개시제)]를 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제로 인산화하고, ss M13-GIF-αDNA와 혼성화 한다. 혼성체를 어닐링 한후, dNTP 존재하에 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 T4 DNA 리가아제로 처리하고, 15℃에서 18시간동안 반응시킨다.

수득된 DNA를 형질 전환용 JM105 형질 전환 기능 세포에 도입한다. 생성된 파지 플라크(50군락)을 한천 플레이트에 접종시키고, 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 배양물을 함유한 여과지를 통상의 방법으로 알칼리 처리하여 변셩시키고, 건조 시킨 후, 80℃에서 2시간 동안 굽는다. DNA를 예비 혼성화 하고, 개시제를³²P-γ-ATP로 표지시킴으로써 제조된³²P 탐침과 함께 실온에서 혼성화한다. 혼성화로 부터 생성된 여과지를 6×SSC 완충액으로 실온에서 10분간 세척하고, 건조시킨 후, -70℃에서 18시간동안 자동 방사선 사진을 찍는다.

JM 105로 감염된 5변이체 클론으로부터 대표적인 클론으로 M13-GIF-71S를 선택하고 배양하여 ss DNA 및 RF DNA를 제조한다.

ss DNA에 대한 M13 디데옥시뉴클레오티드 서열화를 수행하여 목적하는 유전자의 변이를 확인한다.

또한 새로 생성된 제한 효소 DdeI 부위는 RF DNA에서 확인된다.

EcoRI/BamHI 단편을 상기 (1)에서와 같이 형질 발현 플라스미드에 도입된 JM 105에서 제조된 RF DNA로부터 제조하여 목적하는 폴리펩티드 VI 형질 발현 플라스미드 ptrpGIF-α-71S를 수득한다.

상기의 플라스미드를 갖는 이. 콜리 HB101 형질 전환체는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 "에스케리키아 콜리 HB101/ptrpGIF-α-71S"로 FERM BP-1296의 번호로 기탁되어 있다. 또한, 이균주는 1987년 6월 2일자로 한국종균협회에 KFCC-10376의 수탁번호로 기탁되었다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상측액을 제조하고, GIF 활성을 검사한다. 결과적으로, 이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할 때 GIF 활성은 2.4×10⁶단위/ml 배양물이다.

목적하는 폴레펩티드 VI 를 세포 추출물 상측액으로 부터 분리하고 참고예 2-(3)과 같은 방법으로 정제한다.

(2)폴리펩티드 IV의 제법

플라스미드 ptrpGIF-α를 사용하여 상기 방법(1)과 같은 방법으로 폴리펩티드 IV를 제조한다.

M13 mp 11 파지 운반체를 단일가닥 DNA 기판으로 사용한다. EcoRI/BamHI DNA 단편을 플라스미드 ptrpGIF-α로 부터 분리하고, 제한 효소 EcoRI 및 BamHI 부위에서 M13 mp 11파지에 클로닝하여 단일가닥(ss) DNA(M13-GIF-α)를 수득한 후, 변이 유발 기판으로 사용한다. 합성 올리고 뉴클레오티드[5'-CTGAACTCGACTCTC-3'(개시제)]를 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제로 인산화 하고 ss M13-GIF-αDNA와 혼성화 한다. 혼성체를 어닐링 한 후, dNTPs존재하에 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 T4 DNA리가아제로 처리하고, 15℃에서 18시간동안 반응시킨다.

수득된 DNA를 형질 전환용 JM 105 적합 세포에 도입한다. 생성된 파지 플라크(100군락)을 한천 플레이트에 접종시키고, 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 배양물을 함유한 여과지를 통상의 방법에 의해 알칼리 처리하여 변성 시키고, 건조 시킨 후, 80℃에서 2시간 동안 굽는다. DNA를 예비 혼성화 하고, 개시제를³²P-γ-ATP로 표지 시킴으로써 제조된³²P 탐침과 실온에서 혼성화 한다. 혼성화로 부터 생성된 여과지를 6X SSC 완충액으로 실온에서 10분간 및 37℃에서 10분간 세척하고, 전조시킨 후, -70℃에서 18시간 동안 자동 방사선 사진을 찍는다.

JM 105로 감염된 4변이체클론으로부터 대표적인 클론으로 M1-GIF-8s를 선택하고 배양하여 ss DNA 및 RF DNA를 제조한다.

ss DNA 에 대해 M13 디데옥시 뉴클레오티드 서열화를 수행하여 목적하는 유전자의 변이를 확인한다.

또한 새로 생성된 제한효소 HinfI 부위는 RF DNA에서 확인된다.

EcoRI/BamHI 단편을 참고예 2-(1)에서와 같이 형질발현 플라스미드에 도입된 JM 105에서 제조된 RF DNA로 부터 제조하고, 목적하는 폴리펩티드 VI 형질 발현 플라스미드 ptrpGIF-α-8s를 수득한다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조하고, GIF 활성을 검사한다. 이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할 때 활성은 1.2×10⁵단위/ml 배양물이고, 이. 콜리 W3110을 숙주로 사용할 때, 활성은 6.2×10⁵단위/ml 배양물이다.

세포 추출물 상층액으로부터, 목적하는 폴리펩티드 VI를 분리하고, 참고예 2-(3)과 같은 방법에 의해 정제한다.

(3) 폴리펩티드(V)의 제법

상기 방법에 의해 수득된 플라스미드 ptrpGIF-α-71S 및 ptrpGIF-α-8s를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII으로 절단하여 ptrpGIF-α-8s로 부터 약 400-bp DNA 단편 및 ptrpGIF-α-71S로 부터 약 4600-bp DNA 단편을 분리한다. 이들 단편을 결합시켜 N말단으로부터 8번째 및 71번째 아미노산 Cys가 각각 Ser로 대치된 IL-1β의 아미노산 서열을 갖는 목적하는 폴리펩티드 V(폴리펩티드 I)을 형질발현 하기 위한 폴라스미드 ptrpGIF-α-8S 71S를 수득한다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조한다(이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할때 GIF 활성은 1.4×10⁴단위/ml 배양물이고, 이.콜리 W3110을 사용할때 GIF 활성은 5×10⁵단위/ml 배양물이다.). 목적하는 폴리펩티드 V를 세포 추출물 상층액으로부터 분리하고 참고예 2-(3)에서와 같은 방법으로 정제한다.

(4) 폴리펩티드 II의 제법

상기 방법(1)과 같은 방법으로 개시제로 5'-GCTCCTGAGGTTCTCTG-3' 를 사용하여 폴리펩티드 II의 형질 발현 플라스미드 ptrpGIF-α-4G를 수득한다.

상기의 플라스미드를 함유한다. 이. 콜리 HB101 형질 전환체는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소에 "에스케리키아 콜리 HB101/ptrpGIF-α-4G"로 FERM BP-1297의 번호로 기탁되어 있다. 또한, 이 균주는 1987년 6월 2일자 한국종균협회에 KFCC-10377의 수탁번호로 기탁되었다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로, 이 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조한다(이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할 때 GIF 활성은 2.8×10⁵단위/ml 배양물이다). 목적하는 폴리펩티드 II를 세포 추출물 상층액으로 부터 분리하고, 참고예 2-(3)과 같은 방법으로 정제한다.

이 정제 방법에서, CM-HPLC의 주 피크의 전반부에서 리크로마토그래피 함으로써 정제하여 폴리펩티드 XXXXVIII를 수득한다. 폴리펩티드 XXXXVIII는 CSF의 생산을 촉진하는 활성에 있어 폴리펩티드 II와 실제로 동등하며, GIF 활성, LAF 활상 및 PGE의 생산의 촉진하는 활성중 어느 하나는 낮다.

(5) 폴리펩티드 III의 제법

상기(1)과 같은 방법으로, 개시제로, 5'-GCACTCTCCAGGACTCACA-3'를 사용하여 폴리펩티드 III 형질발현 플라스미드 ptrpGIF-α-11Q를 수득한다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로, 이 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조한다(이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할 때 GIF 활성은 2.8×10⁶단위/ml 배양물이다). 목적하는 폴리펩티드 III을 세포추출물 상층액으로 부터 분리하고, 참고예 2-(3)과 같은 방법으로 정제한다.

(6) 폴리펩티드 VII의 제법

상기(1)과 같은 방법에 의해, 개시제로, 5'-TCTTCAACTAGATAGAA-3'를 사용하여 폴리펩티드 VII 형질발현 플라스미드 ptrpGIF-α-102CT를 수득한다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로, 이 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조한다(이. 콜리 HB101을 숙주로 사용할 때 GIF 활성은 7.4×10⁴단위/ml 배양물이다). 목적하는 폴리펩티드 VII을 세포추출물 상층액으로 부터 분리하고, 참고예 2-(3)과 같은 방법으로 정제한다.

(7) 폴레펩티드 VIII의 제법

상기(1)과 같은 방법에 의해, 개시제로, 5'-AAAGGCGGATAGGATATAA-3'를 사용하여 폴리펩티드 VIII 형질발현 플라스미드 ptrpGIF-α-140CT를 수득한다.

참고예 2-(2)와 같은 방법으로, 이 플라스미드를 사용하여 세포 추출물 상층액을 제조한다(이. 콜리 W3110을 숙주로 사용할 때 GIF 활성은 5.8×10³단위/ml 배양물이다). 목적하는 폴리펩티드 VIII을 세포 추출물 상층액으로 부터 분리하고, 참고예 2-(3)과 같은 방법으로 정제한다.

또한, 플라스미드 ptrpGIF-α-140CT를 형질 발현용 숙주 이. 콜리 HB101 에 도입하여 상기와 같은 방법으로 세포 추출물 상층액(GIF활성 : 1.3×10⁶단위/ml 배양물)을 수득한다. 마찬가지로 상층액으로부터 폴리펩티드 I을 분리하여 정제한다.

상기 경우에서 숙주로 이. 콜리 HB101을 사용할때, supE는 넌센스 서프래서로 작용하며, UAG 스톱코돈은 Gln을 통해 해독되어 폴리펩티드 I을 형질 발현 한다. 한편, 이. 콜리 W3110 이 숙주로 사용될때, supE 유전자가 유전 정보를 지정하지 않기 때문에 UAG가 스톱코돈으로 작용하여, 그 결과 140 아미노산 서열을 함유한 폴리펩티드 VIII 이 형질 발현된다.

(8) 폴리펩티드 I~VIII의 확인

상기 방법(1)~(7)에 의해 제조된 본 발명의 LI-1β 유도체(폴리펩티드 I~VIII)를 참고예 2-(4)와 같은 방법으로 SDS-PAGE(18% 폴리아크릴아미드 겔, 2ME+)한다.

결과적으로, 폴리펩티드 I~VII 각각은 약 17.5kd 위치에서 단일 밴드로 이동하며, 폴리펩티드 VIII는 약 16kd의 위치에서 마찬가지로 이동한다.

폴리펩티드 I의 GIF 활성에 대한 중성 항혈청(통상의 방법에 의해 참고예 2-(3)에서 수득된 폴리펩티드 I으로 토끼를 면역화 함으로써 제조)을 사용하여 폴리펩티드 I~VIII의 웨스턴 블로딩(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76, 1420(1979))을 수행함으로써, 각각의 이들 폴리펩티드는 상응하는 위치에서 단일 밴드로 확인된다.

실시예 2

(1) 참고예 2-(1)에서 수득된 형질전환체(이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α)를 50μg/mg의 암피실린 및 20μg/ml의 L-트립토판을 함유한 LB 배지 400ml에 37℃에서 하룻밤 배양한다. 1% 카사미노산을 함유한 M9 최소배지(20ℓ)를 배양물(400ml)으로 접종 시키고, 37℃에서 8.5시간동안 배양한다.

생성된 배양물을 원심 분리하여 세포를 수거하고, 1M Na₂HPO₄에 현탁 시킨 후, 냉장실에서 밤새 방치한다. 현탁액을 10mM 트리스-HCl 완충액(pH8.0)에 2일 동안 투석시킨다.

수득된 투석물을 원심분리(10000r.p.m. 30분)하여 상층액을 수득한다.

상층액을 이. 콜리 배양액 300ℓ에 상응하는 양으로 수거하여, 100mM 아세트산에 의해 pH 5.0으로 조절하고, 30ml/분의 유속으로 Zeta Prep SP-250카트리지(LKB의 제품)에 통과시킨다. 10mM 소디움 아세테이트(pH 5.3)으로 100분, 0.1M NaCl을 함유한 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)로 220분 및 1M NaCl을 함유한 50mM 소디움 아세테이트(pH5.5)로 용출을 수행한다. 분획을 HPLC로 검사하여 목적 물질을 함유한 분획, 즉 0.1M NaCl을 함유한 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)의 분획 번호 8~10을 수거한다.

합해진 분획을 100mM 아세트산으로 pH4.5로 조절하고, HPLC(TSK 겔 SP-5PW, 5.5×20cm, 도요소다사 제품)한 다음 하기의 조건하에 용출시켜 채류시간(r.t.)이 65~72분인 분획을 수득한다.

용출A : 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)

용출B : 0.5M NaCl을 함유한 50mM 소디움 아세테이트(pH 5.5)

유속 : 30ml/분

그럼으로써 정제된 폴리펩티드 I이 수득된다.

한외여과(YM-5막)에 의해, 완충액을 변화 시킴으로써 20mM 소디움 포스페이트 완충액(pH 7.0)의 용액의 형태로 생성물을 20mg/ml로 농축한다.

농축물을 멸균용 포시다인 여과지 NFZ(노흔 팔의 제품)으로 장치된 여과장치에 통과시켜 발열물질 함량이 100pg/mg 단백질 이하인 순수 생성물을 수득한다.

정제 공정에 의해 300ℓ의 이. 콜리 배양액으로부터 약 3g의 폴리펩티드 I이 얻어진다.

(2) 상기 (1)의 주피크의 전반부의 분획(체류시간 64~65분)을 다시 크로마토그래피하여 폴리펩티드 X를 수득한다. 2.7×10⁶GIF 단위/mg 단백질.

마찬가지로 주피크의 후반부 분획(채류시간 72~76분)으로부터 폴리펩티드 XI를 수득한다.

[표 2]

(4) 폴리펩티드 I은 분자내에 2개의 Cys잔기(9 및 71위치)를 갖는다. 이들 Cys잔기의 측쇄에 존재하는 SH기의 상태는 하기 방법에 의해 검사된다.

a. 참고예 2-(3)에서 수득된 약 5 나노몰의 폴리펩티드 I(0.1M NaCl을 함유한 50TM 소디움 아세테이트(pH5.5)의 100μl 용액 형태)를 각각 3 시험관 A,B 및 C에 넣는다. 0.1M 트리스-HCl(pH 8.45)을 함유한 6M 구아니딘 염산염 용액 300μl을 각 시험관에 더 넣는다.

다음, 25μl의 6M 구아니딘 염산염 용액을 각 시험관 A 및 B에 넣어 블랭크를 제조한다. 시험관 C에, 환원제로 작용하는 2μ몰의 디티오트레이톨을 함유한 6M 구아니딘 염산염 용액 25μl를 넣는다. 질소 기체를 각 시험관에 1분동안 도입하고, 시험관을 50℃에서 2시간 동안 방치한다.

이어서, 25μl의 6M 구아니딘 염산염 용액을 블랭크 시험관 A에 넣고, 4μ몰의 요오드 아세트아미드를 함유한 6M 구아니딘 염산염 용액 25μ몰은 각 시험관 B 및 C에 넣는다. 각 시험관에 질소 기체를 1분 동안 도입한 후, 시험관을 암소에서 25℃로 30분간 방치한다.

이렇게 제조된 시험관 A, B 및 C의 각각의 혼합물에 5μl의 10% TPA를 가하고, 혼합물을 역상 HPLC(C₃)하여 단백질을 정제한다.

약 1/10량의 정제된 단백질을 시험관에 넣고, 건조시킨 후, 4N 메탄 술폰산으로 가수분해하고, 아미노산 조성을 검사한다.

결과로, 거의 동량의 카르복시메틸 시스테인이 시험관 B 및 C로부터 검출되고, 시험관 A의 폴리펩티드 I은 변하지 않고 남아 있다. 이것은 시험관 B 및 C의 폴리펩티드 S-카르복사미드 메틸화 폴리펩티드 I으로 전환 되었으므로(시험관 B의 폴리펩티드는 환원제에 노출되지 않았기 때문), 폴리펩티드 I에서 Cys잔기에 의해 어떤 이황화(S-S)결합도 형성되지 않는다는 것을 나타낸다.

또한 각 시험관 A, B 및 C에 남아있는 생성물을 건조시키고, 600μl의 1% 증탄산 암모늄 용액을 용해시킨다. 이 용액을 1μg/5μl의 농도로 조절한다. 트립신 용액(7.5μl)을 용액에 가하여, 단백질을 37℃에서 20분간 효소 분해한다.

혼합물에 10μl의 10% TFA를 가함으로써 효소 반응을 종결시키고, 펩티드 단면을 역상 HPLC(C₁₈)에 의해 분리 제거한다.

그 결과, 시험관 B 및 C는 거의 같은 패턴을 나타내는 반면, 시험관 A는 그와는 다른 패턴을 나타낸다.

이렇게 분리된 펩티드에 대해 상기와 같은 방법으로 아미노산 조성을 검사한다. 시험관 A에서 펩티드 단편을 Cys부재하에서는 일어나지 않는 펩티드의 존재가 나타난다.

이들 결과는 폴리펩티드의 Cys잔기에 의해 분자 내 또는 분자간에 어떤 이황화 결합도 형성되지 않는다는 것을 나타낸다.

b. 폴리펩티드 I의 SH기를 하기 방식으로 엘만 방법(Arch. Biochen. Biophys., 82, 70(1959))에 의해 정량 측정한다.

참고예 2-(3)에서 수득된 200μg량(11.5μ몰)의 폴리펩티드 I을 6M 구아니딘 염산염 및 1mM EDTA를 함유한 0.1M 트리스 -HCL 완충액(pH 8.0) 1ml에 용해시킨다. 한편, 0.01M DTNB(5,5' - 디티오비스 (2-니트로벤조산))을 함유한 신선한 0.05M 인산 완충액(pH7.0)(이 완충액은 이후 "엘만 완충액"으로 약칭한다)을 제조한다.

6N 구아니딘 염산염 및 10mM EDTA를 함유한 0.1M 트리스-HCl 완충액(pH8.0) 1ml는 대조 셀에 넣고, 폴리펩티드를 함유한 상기 용액 1ml는 시료 셀에 넣는다. 40μl량의 엘만 시약을 각 셀의 내용물과 혼합하고, 412PT에서 혼합물의 흡광도를 측정한다. 최대 흡광도가 얻어진 후, DTNB의 분해로 인한 흡광도의 감소는 SH기의 농도를 결정하는 데 있어 "0"으로 보정한다.

412PT에서 실제로 수득된 흡광도는 0.328이다.

한편, 6M 구아니딘 염산염을 함유한 수용액에서 3-카르 복실레이트-4-니트로티오페놀레이트 이온의 ε412는 12880M^-1·cm^-1이다(Eur. J. Biochem., 30, 32(1972)). 이것은 폴리펩티드 I 용액에서 SH기의 가 M/e로 0.0000245이고, 11.5μ몰의 SH기를 함유한다는 것을 나타낸다.

상기의 결과는 폴리펩티드 I에 포함된 Cys 잔기가 유리된 SH기를 갖는다는 것을 증명한다.

또한, 물 또는 PBS(-)에 용해시킨 폴리펩티드 I의 용액을 반복해서 3~4회 동결 건조시킬 때 엘만 방법에 의해 결정된 SH기의 양 및 GIG 활성에는 거의 또는 전혀 변화가 발견되지 않는다.

(5) 헤테로 단백질을 유전자 재조합 기술에 의해, 이. 콜리 등에 대량으로 형질 발현시킬 때, 단백질은 가끔 이. 콜리 세포에 봉입체로 측적되지 않는다. 이 경우, 세포로부터의 단백질의 수거는 예를 들면 7^M구아니딘 염산염, 8^M우레아, 0.1% SDS 등과 같은 변성체의 사용을 포함한 심한 조건하의 처리를 필요로 한다. 그러나 이런 처리는 그의 고도의 구조를 갖는 목적 단백질에 비가역의 손상을 일으키기 쉽다. 따라서, 유전자 재조합 기술에서, 변성제를 사용하지 않고 온화한 조건하에 목적하는 단백질을 상당한 정도로 분리하는데 관심이 기울어지고 있다. 이런 면에서, 상술한 방법(1)은 목적 단백질이 매우 온화한 조건, 즉 삼투 쇼크에 의해 추출 및 분리될 수 있기 때문에 매우 바람직하다. 이 방법은 또한 수득된 목적 단백질이 천연 생성물과 유사한 고도의 구조를 갖기 때문에 바람직하다.

(6) 플라스미드 ptrpGIF-α를 사용하여, 실시예1-(1)과 같은 방법으로 부위-특이성 변이 유발 방법에 의해 하기 표 3에 기재된 폴리펩티드(본 발명의 IL-1β 유도체)를 제조한다. 폴리펩티드를 형질 발현 및 정제하고, 그의 GIF 활성을 상기 방법(1)에 의해 측정한 후, 참고예 2-(4)와 같은 방법으로, SDS-PAGE를 수행한다. 하기의 예에서 특별한 언급이 없는 한 유사한 방법이 사용된다.

[표 3]

(7) 실시예 1-(6)에서 수득된 플라스미드 ptrpGIF-α-102CT 및 숙주로, 이. 콜리 W3110을 사용하여 유사한 형질 발현 및 정제 방법에 의해 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XXX를 제조한다. 약 11.4kd(SDS-PAGE에 의해).

(8) 플라스미드 ptrpGIF-α-4G 및 프라이머로 5'-GCACTCTCCAGGACTCACA-3'를 사용하여, 방법 (6)과 같은 방법으로 폴리펩티드 XIV 형질 발현 플라스미드 ptrpGIF-α-4G11Q를 제조한다.

이 플라스미드 및 숙주로 이. 콜리 HB101을 사용하여, 유사한 형질 발현 및 정제 방법에 의해 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XIV를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해). 2.7×10⁵GIF 단위/ml 배양물.

(9) 실시예 1-(3)과 같은 방법으로, 플라스미드 ptrpGIF-α-98L을 사용하여 폴리펩티드 XV 형질 발현 플라스미드 ptrpGIF-α-4G98L을 제조한다.

더 구체적으로는, 두 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 및 HindIII으로 절단한다. 이어서, ptrpGIF-α-4G로 부터 약 400bp DNA 단편을 절단해내고, ptrpGIF-α-98L로 부터 약 4.6kbp DNA 단편을 절단해 낸 후 두 단편을 결합시킨다.

플라스미드 ptrpGIF-α-4G98L 및 숙주로 이. 콜리 W3110을 사용하여 유사한 형질 발현 및 정제 방법에 의해 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XV를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해).

(10) 플라스미드 ptrpGIF-α-4G를 플라스미드 ptrpGIF-α-11Q(약 400bp DNA 단편을 사용)로 대치하는 것을 제외하고는 방법(9)와 같은 방법으로 폴리펩티드 XVI의 형질 발현용 플라스미드 ptrpGIF-α-11Q98L을 제조한다.

이 플라스미드를 사용하여 마찬가지로 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XVI를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해).

(11)방법 (9)에서 플라스미드 ptrpGIF-α-4G 대신에 플라스미드 ptrpGIF-α-4G11Q를 사용하여 플라스미드로부터 약 400bp DNA 단편을 수득한다. 이 단편을 사용하여 마찬가지로 폴리펩티드 XIII 형질 발현용 플라스미드 ptrpGIF-α-4G11Q98L을 수득한다.

이 플라스미드를 사용하여 마찬가지로 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XIII를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해).

(12) 플라스미드 ptrpGIF-α-8A 및 플라스미드 ptrpGIF-α-71S를 사용하여 실시예 1-(3)과 같은 방법으로 폴리펩티드 XXXVI 형질 발현용 플라스미드 ptrpGIF-α-8A71S를 제조한다.

더욱 구체적으로는, 두 플라스미드는 제한 효소 EcoRI 및 HindIII으로 절단한다. 이어서, 약 400bp DNA 단편을 ptrpGIF-α-8A로부터 절단하고, 약 4.6kbp DNA 단편을 ptrpGIF-α-71S로부터 절단한 후, 두 단편을 결합시킨다.

플라스미드 ptrpGIF-α-8A71S 및 숙주로 이. 콜리를 사용하여 유사한 형질 발현 및 정제방법에 의해 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XXXVI를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해). 8.7×10⁵GIF/단위/ml 배양물.

(13) 플라스미드 ptrpGIF-α-71S 대신에 플라스미드 ptrpGIF-α-71A(그의 약 4.6kbp DNA 단편 사용)를 사용하는 것을 제외하고는 방법 (12)와 같은 방법으로 플라스미드 ptrpGIF-α-8A71A를 제조한다. 상기의 플라스미드를 함유한 이. 콜리 HB101 형질 전환체는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 "에스케리키아 콜리" HB101/ptrpGIF-α-8A71A 로 FERM BP-1298의 번호로 기탁되어 있다. 또한, 이 균주는 1987년 6월 2일자로 한국종균협회에 KFCC-10378의 수탁번호로 기탁되었다.

이 플라스미드를 사용하여 마찬가지로 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XXXVII를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해). 1.6×10⁶GIF 단위/ml 배양물.

(14) 방법 (12)에서 플라스미드 ptrpGIF-α-71S 대신에 플라스미드 ptrpGIF-α-71V를 사용하여, 이 플라스미드로부터 약 4.6kbp DNA 단편을 수득한다. 이 단편을 수용하여 마찬가지로 폴리펩티드 XXXVIII의 형질 발현용 플라스미드 ptrpGIF-α-8A71V를 수득한다.

이 플라스미드를 사용하여 마찬가지로 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 XXXVIII를 수득한다. 약 17.5kd(SDS-PAGE에 의해). 2.1×10⁶GIF 단위/ml 배양물.

(15) 방법 (1)에 의해 각각 실시예 1-(1)~(7) 및 하기에 설명된 실시예 3-(6)~(9)의 형질 전환체를 사용하여 본 발명의 IL-1β 유도체 폴리펩티드 II~VIII 및 XXXI~XXXIV를 제조한다.

이들 생성물은 SDS-PAGE에 의해 단일 밴드로 이동한다. 폴리펩티드 II~VIII는 상기와 같은 위치에서 이동하며, 폴리펩티드 XXXI~XXXXIV는 하기의 결과를 나타낸다.

폴리펩티드 XXXI약 22kd

폴리펩티드 XXXII약 23kd

폴리펩티드 XXXIII약 27kd

폴리펩티드 XXXIV약 31kd

실시예 3

(1) U937 세포의 배양

1.4×10⁹개의 인체 조직구 임파구 세포(Ascenso, J.L. 등, Blood, Vol. 57, 170(1981))을 25ng/ml의 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TRA, 파라미사 제품). 10μg/ml의 콘카나빌린 A(con A, 시그마 제품) 및 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배양액에 넣어 4×10⁵세포/ml 농도의 세포 현택약을 제조한다.

세포 현탁액을 각각 10ml씩 나누어 배양접시(Falcon 3003, 직경 9cm)에 담아, 5% 이산화탄소 기체 내에서 37℃로 3일간 배양한다. 흡기기(aspirator)를 사용해 배양 상층액을 제거한 후, 세균 유태 리포플리사카라이드(LPS, Difco사 제품) 10μg/ml, 뮤라밀디펩티드(MDP, Wako fure Chemical사 제품) 1μg/ml 및 TPA 1ng/ml를 함유한 RPMI-1640 배지 10ml를 각각의 접시에 담는다. 상기 배지로 5% 이산화탄소 기체 내에서 37℃로 18시간 세포를 배양한다. 접시 바닥에 부착한 U937세포를 mRNA 제조용으로 사용한다.

(2) mRNA의 제조

구아니디늄/온 페놀법(Feramisco, J. R. 등, J. Bid. Chem. Vol. 257, 11024(1982)) 및 구아니디늄/세슘클로라이드법(Glisin,V, 등, Viochemistry, Vol. 13, 2633(1974))을 조합하여 RNA를 추출한다.

공정(1)에 의해 배양된 U937 세포를 세척하기 위해, 상층액을 제거한 후에 PBS(-)용액 5ml로 디쉬를 씻는다. 그다음 각 디쉬에 4M 구아니딘 이소리오시아네이트 용액(Fluka사 제품), 50mM 트리스-HCl(pH 7.6), 10mM EDTA 및 2% 소디움 라우로일 사르코시네이트를 1ml 담고 세포를 용해시킨다. 용액을 고무 찰자와 파스퇴르 피펫으로 세포 용액 420ml를 수거하여, 60℃로 유지하고 18G 주사침을 통과시켜 염색체 DNA를 절단한다. 이어서, 60℃로 가열한 페놀을 용액과 동일한 양으로 용액에 부가하고, 혼합액을 18G 주사침으로 교반하여 보다 많이 절단한다. 혼합액에 0.1M 소디움 아세테이트-10mM 트리스-HCl(pH 7.4)-1mM EDTA 용액 210ml와 클로로포름-이소아밀 알코올 혼합액(부피액 24 : 1)420ml를 부가한다. 혼합액을 60℃에서 15분간 격렬하게 교반한 후, 얼음으로 냉각시키고 4℃에서 20분간 3000r.p.m.으로 원심 분리한다. 수집된 수층의 2배량의 에탄올을 부가한다. 혼합액을 -70℃로 밤새 방치하면 조 mRNA 침전물이 수득된다. 조 mRNA를 6M 구아니딘 이소티오시아네이트-5mM 소디움 시트레이트(pH 7.0)-0.1M β-메르캅토에탄올-0.5% 소디움 라우로일 사르코시네이트 용액 48ml에 용해시킨다. 세슘 클로라이드(19.2g)를 상기 용액에 용해시킨다. 생성된 용액중 7ml를 5.7M 세슘 클로라이드-0.1M EDTA(pH 7.5) 4ml위에 올려 놓는다. 혼합액을 25℃에서 20시간 동안 31500r.p.m.으로 원심 분리(Beckman SW40Ti 로타 사용)하여 RNA를 수집한다.

따라서, RNA 9.7mg이 수득된다.

RNA에서 mRNA를 수득하기 위해, RNA를 올리고(dT)-셀룰로오스(Collaborative Research Inc. 사 제품) 컬럼 크로마토그래피한다. 흡착시키기 위해, 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-0.5M NaCl-1mM EDTA를 사용한다. 용리시키기 위해, 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-1mM EDTA 를 사용한다.

결과적으로 mRNA 400μg이 수득된다.

(3) cDNA 도서관의 제조

cDNA 도서관은 오까야마-버그 법에 의해 제조되며, 이 방법에 의해 cDNA가 동물 세포내에 발현될 수가 있다. cDNA 클로닝에 사용되는 dT 꼬리가 부착된 운반체 개시제는 플라스미드 pcDV1로부터 제조되며, dG 꼬리-부착된 링커 DNA는 플라스미드 pL1로부터 제조되고, 각각 오까야마 등의 방법(Okayama, H. 및 P. Berg, Molecular and Cellular Biology, Vol. 3, p. 280(1983))에 의한다.

공정 (2)에 수득된 mRNA(15μg)를 5mM 트리스-HCl(pH 7.5)-0.5mM EDTA(pH7.5) 수용액 20μl에 용해시켜 65℃에서 5분간 이어 37℃에서 5분간 반응시킨다. 반응 혼합액의 전체 양이 40μl가 되도록 맞추는데, 용액내에는 50mM 트리스-HCl(pH8.3),8mM MgCl₂30mM KCl, 0.3mM 디티오트레이톨, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각각 2mM, 운반체 개시제 DNA 2.8μ, RN 아제 억제제(Promega Biotech사 제품) 60단위 및 역 전사 효소(Bio-Lad사 제품) 40단위가 포함된다. 이어서 37℃에서 1시간 배양한다. 2μl의 0.5M EDTA(pH7.5)와 2μl 의 10% SDS를 가입하여 반응을 종결시키고 계속해서, 반용액을 페놀-클로로포름 추출 및 클로로포름 추출하여 추출물을 에탄올에 침전시면 운반체 개시제 cDNA : mRNA가 수집된다.

수집된 운반체 개시제 cDNA : mRNA를 140mM 소디움 카코딜레이트, 30mM 트리스-HCl(pH6.8), 1mM CaCl₂, 0.1mM 디티오트레이톨, 폴리 A 0.3μg, 66M dCTP 및 말단 데옥시 뉴쿨레오티딜 전이 효소(pPharmacia사 제품) 38단위를 함유하는 반응 혼합액 30μl 내에서 5분 동안 37℃로 반응시킨 후, 0.5M EDTA(pH 7.5) 1.5μl 와 10% SDS 1.5μl를 혼합액을 가입하여 반응을 종결시킨다. 혼합액을 페놀-클로로포름 추출 및 클로로포름 추출하여 추출물을 에탄올로 침전시키면 올리고 dC 꼬리가 부착된다. cDNA : mRNA-운반체 개시제가 수득된다.

수집된 핵산을 7mM 트리스-HCl(pH 7.5) 7mM MgCl₂, 60mM NaCl, 100μg/ml의 소 혈청 알부민 및 제한효소, HindIII(Nippon Gene사 제품) 12단위를 함유하는 반응 혼합액 20μl 내에서 90분간 37℃로 반응시킨다. 계속해서, 0.5M EDTA(pH 7.5) 1μl와 10% SDS 1μl를 혼합액에 가입하여 반응을 종결시킨 후,이어 페널-클로로포름 및 이어 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시키면 HindIII로 절단된 올리고 dC 꼬리가 부착된 cDNA : mRNA-운반체 개시제가 수집된다. 생성물을 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-1mM EDTA(pH 7.5)(TE(pH 7.5))10μl 내에 용해시킨다. 이 용액중 1μl를 상기의 TE(pH 7.5), 0.1M NaCl 및 올리고 dG 꼬리가 부착된 링커 DNA(14ng)으로 구성된 반응 혼합액 10μl 내에서 배양하는데, 처음으로 65℃에서 2분간, 이후에는 42℃에서 30분간 배양한다. 그후 혼합액을 0℃로 냉각시킨다.

반응혼합액을 100μl로 맞추는데, 용액 내에는 20mM 트리스-HCl(pH 7.5), 4mM MgCl₂, 10mM(NH₄)₂SO₄), 0.1M KCl, 50μg/ml 소 혈청 알부민, 0.1mM β-NAD(니코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드, Pharmacia 사 제품) 및 이. 콜리 DNA 리가제(Pharmacia사 제품) 0.6μg이 포함된다. 이어 12℃에서 밤새 배양한다. 반응 혼합액에 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각각 40μM 및 β-NAD 0.15mM를 부가한다. 또한 이. 콜리 DNA 리가제 0.4μg, 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I(Boehringer Mannbeim사 제품) 및 이. 콜리 RN 아제 H(Pharmacia사 제품) 1단위를 부가하고, 혼합액을 12℃에서 1시간 이어 25℃에서 1시간 동안 배양한다.

이. 콜리 HB101을 상기에서 수득된 반응 혼합액을 사용하여 형질 전환시킨다. 상기 균주의 형질 전환 가능 세포로 사용되는 것은 베데스타 리서치 라보라토리즈(BRL)제품이다. BRL의 설명서에 따라서 세포를 형질 전환시킨다.

결과적으로, cDNA 도서관(약 21000클론 함유)이 수득된다.

(4) 원숭이 COS-1 세포의 감염

상기 공정 (3)에 의해 수득된 cDNA 도서관을 평균 약 70클론을 포함하는 군으로 각각 나눈다. 각각의 군으로부터 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법(Molecular Cloning-A 실험서 Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, P. 368)에 의해 제조된다.

배양된 원숭이 세포, COS-1 세포(Gluzman, Y., Cell, Vol. 23, p. 175(1981))를 전이 감염용으로 상기에서 각 군으로부터 제조된 플라스미드 DNA를 사용하여 감염시킨다. 전이 감염은 DEAE-덱스트란법(Yokota, T. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Vol. 81, p. 1070(1984))에 의해 수행된다. 보다 상세히 설명하면, 트립신으로 처리된 COS-1 세포를 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 내에 현탁시켜 농도를 1×106세포/ml로 맞춘다. 계속해서, 현탁액중 500μl를 10% FCS를 함유한 2ml의 RPMI-1640 배지를 함유하는 각각의 웰 플레이트(well plate)의 6개의 홈에 넣는다. 세포를 37℃에서 밤새 배양한 후, 상층액을 제거하고, 세포를 혈정이 없는 배지로 세척하고, 10μg/ml의 플라스미드 DNA, 0.4mg/ml의 DEAE-덱스트란(Pharmacia사 제품), 50mM 트리거-HCl(pH 7.4) 및 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 1ml를 각각의 홈에 넣은 후 37℃에서 4.5시간 동안 배양한다. 그 후 상층액을 제거하고, 세포를 혈청이 없는 배지로 세척GKDU 150μM 클로로퀴(시그마사 제품)과 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 2ml를 각각의 홈에 넣은 후, 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 상층액을 제거하고, 세포를 혈청이 없는 배지로 세척한 후 각각의 홈 내에 있는 세포에 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 3ml를 부가하여 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 상층액을 수집한 후, 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 2ml를 각각의 홈에 넣은 후, 동결-융해 순환을 2번 한다. 그 후 세포 추출물을 수집한다. 배양 상층액과 세포 추출물의 GIF 활성도를 조사한다.

GIF 활성도를 나타내는 군을 각각 10클론씩 24군으로 나누고, 이를 사용하여상기와 동일한 공정을 반복하여 GIF 활성도를 결정한다. GIF 활성도를 나타내는 군 내의 클론이 GIF 활성도를 나타내는 클론 임을 확인하기 위해서 상기와 동일한 공정을 반복한다.

결과적으로, 2종류의 클론, 즉 pcD-GIF-16 및 pcD-GIF-207이 수득된다.

표 4는 상기 클론의 GIF 활성도(GIF 단위/ml)를 나타낸다.

[표 4]

(5) 클론의 분석

2개의 클론에서 유래한 GIF-활성 물질이 동일한가의 여부를 조사하기 위해서, 폴리펩티드 I의 GIF 활성도를 중화시키는데 필요한 항 혈청을 연속적으로 희석하여, 일정한 GIF 활성도를 나타내는 pcD-GIF-16 또는 pcD-GIF-207의 배양 상층액과 세포 추출물 각각에 부가하여, 상층액 및 세포 추출물에 미치는 항 혈청의 영향을 결정한다.

제3-a도(pcD-GIF-16 배양 상층액), 제3-b도(pcD-GIF-16 세포 추출물), 제3-c도(pcD-GIF-207 배양 상층액) 및 제3-d도(pcD-GIF-207 세포 추출물)에 결과를 나타낸다. 상기 각각의 도표에서, GIF 활성(%)은 종축에 혈청 희석률(배율)은 횡측 표시하며, (1)은 폴리펩티드 I의 항 혈청을 나타내고 (2)는 정상 혈청을 나타낸다.

제3-a도 및 제3-b도에 나타난 바와 같이 pcD-GIF-16에서 유래한 GIF 활성도는 혈청 농도에 의존적인 폴리펩티드 I 항 혈청을 부가해 줌으로써 완전하게 중화되는 반면에, 제3-c도 및 제3-d도는 pcD-GIF-207에서 유래한 GIF 활성도가 폴리펩티드 I 항 혈청에 의해 완전히 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. 이것은 pcD-GIF-207에서 유래한 GIF-활성 물질은 폴리펩티드 I 및 pcD-GIF-16에서 유래한 GIF-활성 물질과는 면역학적으로 다르다는 것을 가르킨다.

제 4 도는 플라스미드 pcD-GIF-16와 플라스미드 pcD-GIF-207의 cDNA 제한 효소 지도를 나타낸다. 상기 플라스미드의 cDNA 염기 서열은 염기 특이성 화학적 변형법(Methods in Znzymology, Vol. 65, 499(1980)) 및 M13 파지운반체(Gene, Vol. 19, 269(1982))를 사용하는 디 데옥시 연쇄 종결법(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 74, 5463(1977))로 결정한다.

상기 결과는 pcD-GIF-16의 cDNA는 마아취 등에 의해 결정된 IL-1β의 코딩 지역의 cDNA서열과 동일하고, pcD-GIF-207의 cDNA는 IL-1α의 코딩 지역의 cDNA서열(Carl, J. March 등, Nature, Vol. 315, 641(1985))과 동일함을 확인한다.

(6) 폴리펩티드 XXXIV의 제조

상기 과정 (5)에 의해 수득된 거의 완전한 길이의 IL-1β의 cDNA 클론 pcD-GIF-16을 제한 효소 pvuII로 절단하고, 이어서 제한 효소 NcoI으로 부분 절단하여 아가로즈 겔에 전기 영동하여 380bp의 NcoI-PvuII DNA 단편을 분리 정제한다.

녹두 뉴클레아제를 DNA 단편에 처리하면, 제한 효소 NcoI의 절단에 의해 생성된 점착성 말단이 매끈해진다.

다음, 합성 올리고 뉴클레오티드(5'-GATAATG-3' 및 5'-CATTAT-3'의 5' 말단을 T4 폴리 뉴클레오티드키나제로 인산화 시키고 T4 DNA 리가제로 DNA 단편과 결합시킨다. 결합된 블럭을 제한 효소 ClaI 및 HindIII로 절단하여 아가로즈 겔에서 전기 영동시키면, 약 400-dp의 ClaI-HindIII DNA 단편 A가 분리 정제된다.

한편, 이전에 제조된 발현 플라스미드 ptrpGIF-α를 제한 효소 ClaI와 HindIII로 절단하여, 보다 큰 DNA 단편 B로 아가로즈 겔 전기 영동에 의해 분리 정제한다.

단편 A 및 B를 T4 DNA 리가제로 결합시켜, 결합된 블럭을 이. 콜리 HB101에 형질 전환시킨다.

형질 전환체에서 제조된 플라스미드 DNA를 추출하고, 제한효소로 나타낸 절단을 분석하여 목적하는 형질 전환체를 선택한다.

분리된 목적하는 형질 전환체(이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-V)을 50μg/ml의 L-트립토판을 함유한 LB 배지 10ml 내에서 밤새 37℃에서 흔들어주면서 배양한다. 50μg/ml의 암피실린과 1% 카사미노산을 함유한 M9 최소 배지(50ml)에 1ml의 배양액을 접종한 후, 37℃에서 흔들어주면서 배양한다. 배양액의 흡광도가 550nm에서 약 1.0에 이르면, 세포를 수집하여 15% 수크로즈-50mM 트리스-HCl-50mM EDTA(pH 8.0) 5ml내에 현탁시킨다. 현탁액에 10mg/ml 리소자임 용액(10mM 트리스-HCl(pH 8.0) 내에 용해되어 있다.) 500μl 및 0.3% 트리톤 X100-187.5mM EDTA(pH7.5)-150mM 트리스-HCl(pH 8.0) 용액 5ml를 부가한다. 혼합액을 실온에서 15분간 방치한 후, 음파 파쇄시켜 원심 분리한 세포 추출물의 상층액을 수득한다.

상층액의 CIF 활성도는 112단위/ml 배양액이다.

(7) 폴리펩티드 XXXII의 제조

이전에 수득된 플라스미드 pGIF-α를 제한효소 NcoI와 AccI로 절단하여 아가로스 켈 상에서 전기 영동시켜 약 0.7-kb NcoI-AccI DNA 단편을 분리 정제하고, DNA 폴리펩티드 I(클렌노우 단편)으로 처리하여 반대편 말단이 매끈하게 한다.

한편, 플라스미드 pTM1을 제한 효소 HindIII로 절단하고 DNA 폴리머라제 I(클렌노우 단편)으로 처리하여 절단된 말단을 매끈하게 한다.

2개의 DNA 단편을 T4 DNA 리가제로 결합시키고, 결합된 블럭을 이. 몰리 HB101에 형질 전환시킨다. 플라스미드 DNA를 비동법으로 형질 전환체로부터 추출한다. 목적하는 형질 전환체를 추출물의 제한 효소 지도를 참고하여 선택한다.

이어 분리된 형질 전환체(이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-III)을 상술한 공정 (6)의 이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-V에서와 동일한 방법으로 배양하여 세포 추출 상층액을 수득한다. 이러한 상층액의 GIF 활성도는 190단위/ml 배양액이다.

(8) 폴리펩티드 XXXIII의 제조

상기 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드는 이하에 상세히 설명될 부위-특이성 돌연변이 유발에 의해 불필요한 염기 배열부분을 제거하여 제조된다.

pGIF-α를 제한효소 PstI 및 AccI로 절단한 후 아가로즈 켈 상에서 전기 영동시키면 약 0.9kb PstI-AccI DNA 단편이 분리 정제되며, 이를 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 그 맞은 편 말단을 매끈하게 한다.

T4 DNA 리가제를 사용하여, 상기 단편을 제한 효소 HindIII를 사용하여 절단하고 매끄럽게 절단된 말단을 제공해 준 DNA 폴리머라제를 사용하여 처리하여 플라스미드 pTM1으로부터 분리 제조된 DNA 단편에 결합시킨다. 결합된 블럭을 이. 콜리 HB101로 형질 전환시킨다. 목적하는 형질 전환체는 비등법에 의해 추출된 플라스미드 DNA의 제한 효소 지도를 참고로 해 선택한다. 수득된 플라스미드의 DNA 염기 서열 역시 동일하다. 상기의 플라스미드를 이하에서는 "pTM1-I-2"로 한다.

다음, 플라스미드는 pTM1-I-2를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 아가로즈 겔 상에서 전기 영동하여 약 740-bp EcoRI-HindIII DNA 단편을 분리 정제하고, 이후 이것을 T4 DNA 리가제를 사용하여 M13mp11 상(RF)의 EcoRI나 HindIII 제한 효소 부위에 결합시킨다. 단선 DNA(mp11-trp-I-2(E/M))는 돌연변이 유발에 기판으로 사용하는 생성물로부터 수득된다.

합성 올리고 뉴클레오티드(5'-CACGTAAAAAGGGTATCGATAATGAAGTGCTCCT-3'(개시제)를 T4 폴리 뉴클레오티드 키나제로 인산화시키고 ss mp11-trp-I-2(E/M)로 혼성화시킨다. 혼성체를 어니일링(annealing)시키고, dNTPs 존재하에서 DNA 폴리머라제 I(클렌노우 단편)과 T4 DNA 리가제로 처리하여, 15℃에서 2일 동안 반응시킨다.

수득된 DNA를 JM105 형질 전환 가능 세포로 형질 전환시키고 한천 평판에 생성된 클로니 200을 접종한 후, 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 다 자란 콜로니를 함유한 여과지를 변성시키기 위해 통상적인 방법에 의해 알칼리 처리하여, 건조시키고 80℃에서 2시간 동안 굽는다. 여과지를 혼성화시키고 또한 실온에서 그 5' 말단에³²P-탐침과 혼성화 시킨다. 제조된 여과지를 실온에서 10분간 6×SSC 완충액으로 세척한 후, 이어 60℃에서 5분간 0.25×SSC 완충액으로 세척하고, 건조시킨후, -70℃에서 18시간 방사선 자동 사진을 찍는다.

mp11-trp trp GIF-α-IV(E/M)를 돌연변이를 클론중에서 그 전형적인 예로 선택하여, JM 105로 감염시키고 배양하여 ss DNA와 RF DNA를 제조한다.

제조된 ssDNA을 M13 디 데옥시 연쇄 종결 서열 분석은 목적하는 유전자가 결여되어 있음을 나타낸다.

또한 약 630-bp EcoRI-HindIII DNA 단편을 제조된 RF DNA로부터 아가로즈 겔 전기 영동법에 의해 분리하여 정제한다.

한편, 약 4.2-kb EcoRI-HindIII DNA 단편을 플라스미드 pTM1-I-2로부터 유사 방법으로 분리하여 정제하고, T4 DNA 리아가제를 사용하여 상기의 단편, 즉 약 630-bp EcoRI-HindIII DNA 단편과 결합시킨다. 결합된 블럭을 이. 콜리 HB101에 형질 전환시킨다.

목적하는 형질 전환체는, 수득된 형질 전환체중 비동법에 의해 추출된 플라스미드의 제한 효소 지도를 참고로 하여 선택한다.

분리된 형질 전환체(이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-VI)을 공정 (6)의 이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-V에서와 동일한 방법으로 배양하여 세포 추출 상충액을 수득하고, GIF 활성도는 336단위/ml 배양액으로 나타난다.

(9) 폴리펩티드 XXXXI의 제조

공정 (8)과 동일한 방법으로, 목적하는 폴리펩티드를 발현하는 플라스미드 ptrpGIF-α-II를 함유하는 형질 전환체를 제조한다.

사용된 주형은 상기의 ss DNA mp11-trp-I-2(E/M)에서와 동일하다. 사용된 개시제는 합성 올리고 뉴클레오티드(5'-CACGTAAAAAGGGTATCGATAATGCTGGTTCCCT-3')이다.

형질 전환체(이. 콜리 HB101/ptrpGIF-α-II)를 함유한 플라스미드를 유사하게 배양하면 GIF 활성도가 112단위/ml 배양액인 세포 추출 상층액이 수득된다.

본 발명 IL-1β(폴리펩티드 I) 및 그의 유도체의 GIF 활성을 설명하기 위해, 이하의 시험을 수행한다.

표 5는 폴리펩티드 I의 단백질로서 계산된 폴리펩티드 단위 mg당 LAF 활성도(U)로, 폴리펩티드 I에 대한 상술한 항혈청을 사용하는 RIF 방법에 의해 결정된 것을 나타낸다.

[표 5]

약물학적 시험예 1

폴리펩티드 I의 CSF 생산 유도 효과 시험

(1) 사람의 폐 세포를 사용한 CSF 생산 유도 효과 시험

CSF를 생성하는 태아의 폐 섬유 아세포(HFL-1, ATCC 등록된 세포주 제CCL-153호)를 사용하여 다음 시험을 수행한다.

HFL-1 세포를 10% FCS를 함유하는 농도가 2×10⁵세포/ml인 햄의 F-12K 배양액(Ham, R. G., Proc. Natl. Acad. Sci., 53, 288(1965))에 현탁시킨다.

상술한 참고예에서 수득된 폴리펩티드 I을 여러가지 농도의 세포 현탁액에 부가한다. 각각의 혼합액을 37℃에서 24, 48 또는 72시간 동안 CO₂배양기 내에서 배양한다. 배양 상층액을 수집하여, 상층액 내에 생성되어 축적된 CSF의 양을 새앙쥐의 골수 세포(Lewis, I. C. 등, J. Immunol., 128, 168(1982))를 사용하여 측정한다.

제 5 도는 배양 기간을 달리하여 폴리펩티드 I로 얻은 결과를 나타낸다. 도표에서, CSF 활성도(단위/ml)를 종축에 폴리펩티드 I의 농도(CIF단위/ml)를 횡축에 표시한다.

결과에 의하면, 폴리펩티드 I을 부가하면 폴리펩티드 부재하에 생산되는 양의 100배까지 HFL-1세포 스트레인에 의해 생산되는 CSF의 양이 증가한다.

(2)폴리펩티드 I의 사람의 피부 세포에 의한 CSF 생성 유도효과 시험

다음 시험을 정상인의 피부 세포, CRT-1445(ATCC No.)를 사용하여 수행한다.

상기 세포주를 10% FCS를 함유하는 돌베코(Dullbeco) MEM 배지(Dulbeco, R. 과 Freeman, G., Virology, 8, 396(1959)) 내에 2×10⁵세포/ml의 농도를 현탁시킨다.

상술한 참고예에서 수득된 폴리펩티드 I을 농도를 변화시켜 나눈 세포 현탁액에 부가한다. 각각의 혼합물을 37℃에서 24, 48 또는 72시간 동안 CO₂배양기 내에서 배양한다. 배양 상충액을 수집하여, 상충액 내에 생성되어 축적된 CSF의 양을 시험 (1)의 새앙쥐 골수 세포를 사용하여 측정한다.

제 5 도와 마찬가지로, 제 6 도는 얻은 결과를 나타낸다.

제 6 도는, 정상인 피부에서 유래한 섬유 아세포의 GIF 활성도로 계산된 최소한 1단위/ml의 양에 폴리펩티드를 부가하면 세포가 CSF를 생산하는 능력이 현저히 증가하는 것을 나타낸다.

(3) 생체내 CSF 생성 유도 효과 시험

폴리펩티드 I을 동물에 투여했을 때, 폴리펩티드 I이 생체내에서 CSF 의 생성 유도 작용을 한다는 것을 입증하기 위해 다음의 동물 실험을 수행한다.

정상 새앙쥐(BALB/C주, 일본국 시즈오까현 실험 동물협회에서 구입)에서 참고예 2에서 수득된 폴리펩티드 I을 여러가지 양으로(GIF 활성도로 계산하여 10³~10⁵단위/동물)정맥 주사한다. 투여후 2, 4, 8, 12 및 24시간에 동물에 혈액을 체취하여 생쥐 골수 세포를 사용하여 혈청내 CSF의 농도를 조사한다.

결과는 제 7 도에 나타내고, CSF 활성도(단위/ml 혈청)는 종축에 투여후 경과시간(hours)을 횡축에 표시한다.

도표에서, (1)은 그 투여량이 100,000GIF 단위/동물인 폴리펩티드 I을 투여 받은 군을 나타내며, (2)는 그 투여량이 10,000GIF 단위/동물을 나타내고, (3)은 그 투여량이 1,000GIF 단위/동물을 나타내며, (4)는 대조군에 투여한 HSA의 투여량이 10μg/동물임을 나타낸다.

제 7 도는 동물에 투여한 폴리펩티드 I이 동물 혈청 내의 CSF 농도를 현저히 증가시키는 것을 보여준다. 폴리펩티드 I이 투여량에 비례하여 생체 내 CSF의 생산을 현저하게 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.

약물학적 시험 실시예 2

보조 관절염을 앓는 쥐를 페어슨 빕(Pearson, C. M., Proc. Soc. Exp. Biol. Medl, 91, 95(1956)), 와드 및 존슨법(Ward, J. R. 및 Jones, R. S., Arthritis Rheumatism, 5, 557(1962))에 따라 제조한다. 보다 상세히 설명하면, 마이코박테리움 부티티쿰의 죽은 세포를 유동 파라핀내에 현탁시켜 제조한 보조제 0.05ml를 S.D. 종의 각각의 수컷쥐 꼬리의 하부에 피내 주사한다. 주사후 14일째에, 발의 팽창 정도에 따라 동물을 6군으로 나눈다. 다음 5일동안, 참고예에서 수득된 폴리펩티드 I 또는 폴리펩티드 I의 용매(대조군용 식염수용액)를 동물에 피내 주사한다. 관절염에 미치는 폴리펩티드의 영향을 평가하기 위해서 매일 발의 부피를 잰다.

제 8 도에 나타난 결과는, 종축에 발의 부피(×0.01ml)를 보조제를 주사한 후 경과한 날짜를 횡축에 표시한다. 도표에서, 폴리펩티드 I을 주사시 그 주사량이 100,000GIF로 주사한 군은 (1)로 나타내며, 주사량이 10,000GIF인 군을 (2)로 나타내고, 주사량이 1,000GIF인 군을 (3)으로 나타내며, 주사량이 100GIF인 군을 (4)로 나타내며, 식염수용액을 주사한 대조군을 (5)로 나타내고, 및 정상 쥐의 군을 (6)으로 나타낸다.

제 8 도는 발의 팽창이 대조군 (5)에서는 23일째까지는 심해지지만, 폴리펩티드를 투여한 군(1)~(4)에서는 4일째(투여후, 즉, 보조제투여후 18일째) 이후에는 폴리펩티드 I이 팽창 억제활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. 최종 투여량을 투여한 후 4일까지도(즉, 보조제 투여후 23일째), 폴리펩티드는 여전히 관절염의 진행을 억제하는 데 효과적인 것으로 발견된다.

약물학적 시험 실시예 3

본 발명 유도체의 CSF 생산 유도효과 시험

세포종 U-373MG(ATCC HTB17, 신경교아 세포종, 신경교성 세포종, 사람)을 사용하여 다음 시험을 수행한다.

상기 종의 세포를 10% FCS(GIBCO 제품), MEM 비-필수아미노산(Flow 제품) 및 MEM 소디움 피루베이트(Flow 제품)를 함유한 이글(Eagle's) MEM 배지(Nissui Phar-maceutical Co.사 제품)내에 2×10⁵세포/ml 농도로 현탁시킨다. 시험할 물질을 여러 농도로 각각의 현탁액 내에 부가한다. 각각의 혼합물을 37℃로 24시간 동안 이산화탄소 배양기 내에서 배양한다.

배양 상층액을 수집하여, 상층액 내에 제조되어 축적된 CSF의 양을 생쥐 골수 세포(Lewis, I. G. 등, J. Immunol, 128, 169(1982))를 사용하여 측정한다.

결과는 제 9 도에 있으며, 종축에 CSF 활성도(U/ml)를, 시험 화합물의 농도(ng/ml)를 횡측에 표시한다. 표시에서 곡선(1)~(7)은 시험 물질로 하기의 폴리펩티드를 사용하여 얻은 결과임을 나타낸다.

곡선(1) :폴리펩티드 VI

곡선(2) :폴리펩티드 II

곡선(3) :폴리펩티드 VIII

곡선(4) :폴리펩티드 V

곡선(5) :폴리펩티드 IV

곡선(6) :폴리펩티드 III

곡선(7) :폴리펩티드 XXX

약물학적 시험 실시예 4

본 발명 유도체의 소염 효과 시험

원터 등의 방법(Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 111, 544~547(1962)에 따라서 다음 시험을 수행한다.

생후 6~8주된 수컷쥐(Spraque Dawley 종, Nippong Charles River사 제품)를 사용하여 실험 시작 하루전에 체중에 따라 각각 6~8쥐로 구성된 군으로 나눈다. 염증 유발제로 1% 카타기난 현탁액(Marine Colloid 제품)을 쥐의 오른쪽 뒷다리 발바닥에 0.1ml의 양으로 피하 주사하여 발의 팽창을 유발한다. 팽창 정도를 평가하기 위해서, 발바닥의 부피를 플레티스모미터(plethysmometer, Ugo-Vasile사 제품)를 사용하여 주사전 및 후의 미리 결정된 시간에 측정한다. 주사전의 값에 대한 주사로 인한 증가부피율을 팽창 %로서 계산한다.

시험할 물질을 돌베코 PBS 내에 현탁시켜, 용액중 0.1ml를 염증 유발제 주사 1시간 전에 쥐의 등에 피하 주사한다. 대조군에서는 용매를 주사한다.

제10도에는 종축에 팽창%을 염증 유발제 주사후 경과한 시간을 횡축에 표시한다. 도표에서, 대조군을 곡선(1)로 나타내며, 폴리펩티드 VI 0.1μg을 투여한 군을 곡선(2)로 나타내고, 폴리펩티드 VI 1μg을 투여한 군을 곡선(3)으로 나타내며, 폴리펩티드 VI 10μg을 투여한 군을 곡선(4)로 나타낸다.

약물학적 시험 실시예 5

본 발명 유도체의 방사선 상해 예방 효과 시험

1μg 또는 0.3μg의 폴리펩티드 VI을 새앙쥐(생후 9주된 BALB/c 종)가 X-선의 치사 조사량에 노출되기 20시간전에 각각의 새앙쥐에 복강내 주사한다.

X-선 조사기(MBR-1505R, 하다찌 메디코사 제품)로 850뢴트겐(roentgens)의 X-선을 쥐의 전신에 조사한 후 매일 살아 있는 것을 조사한다. 대조군에는 PBS를 주사한다.

제11도에는 종축에 생존율(%)을 조사 후 경과한 날짜를 횡측에 표시한다. 폴리펩티드 VI 1μg을 주사한 군을 곡선(1)로 나타내며, 폴리펩티드 VI 0.3μg을 주사한 군을 곡선(2)로 나타내고, 대조군을 곡선(3)으로 나타낸다.

제11도는 대조군의 새앙쥐는 X-선 조사후 18일째에 모두 죽은 반면, 폴리펩티드 VI은 그 투여량에 따라서 방사선 상해를 예방하는 효과가 있는 것으로 나타난다. 1μg을 투여한 군 중 80%는 방사선 상해로 인한 죽음에서 벗어나 생존한다는 것을 나타낸다.

약물학적 시험 실시예 6

본 발명 유도체의 기회주의적 감염 예방 효과 시험

모델 새앙쥐를 사용하여 다음 시험을 수행한다.

첫째날, 5-플루오로우라실(5-Fu, 교와 하꼬사 제품) 100mg/kg을 ICR 종의 생호 6주된 수컷 새앙쥐(각 군당 7마리)에 정맥 주사한다. 2일째, 4일째 및 6일째 되는 날 본 발명의 폴리펩티드 VI을 새앙쥐에게 1μg/새앙쥐의 투여량으로 피하 쥐사한다. 7일째 되는 날, 수도모나스 아애루기노사 E-2의 일정량을 새앙쥐에 복강내 주사하여 새앙쥐를 감염시킨다. 10일째 되는 날, 생존한 동물의 수를 세어 생존율(%)을 결정한다.

제12도의 (1)~(3)에 그 결과를 나타낸다. 제12(1)도는 처리 군에 의해 얻은 결과를 나타낸다. 제12(2)도는 폴리펩티드 VI을 투여하지 않은(5-Fu만을 투여한다.) 대조군에 의해 얻은 결과를 나타낸다. 제12(3)도는 5-Fu와 폴리펩티드 VI 둘다 투여하지 않는 또 다른 대조군에 의해 얻은 결과를 나타낸다.

제12도에서는 하기의 수도모나스의 양을 각각 투여한 군 A~E대 생존율(%)을 종축에 표시한다.

제조예 1

식염수 내의 폴리펩티드 VI의 1×10⁷단위/ml 용액(GIF 활성도로 계산한다.)에 인 혈청 알부민을 농도가 0.5%가 될때까지 부가한다. 혼합액을 여과하여(0.22μm 막여과지) 각각 1ml씩 멸군 상태로 바이알에 넣고, 동결 건조시켜 주사용 제제로 제조한다.

제제는 주사용 증류수 1ml에 용해시켜 사용한다.

<동물 세포로부터 시토카인을 제조하는 방법>

(1)HBS-2C5B2 세포(J. Immunol., 131. 1682~1689(1985))를, 2×10⁵세포/홈의 양으로, 여러 농도의 폴리펩티드 XXXVII와 0.01% PHA-P의 존재하에서 24시간동안 반응시킨다. 수집된 상층액의 IL-2 활성도는 IL-2 의존성 생쥐 T 세포(CTLL 2)를 사용하여 K. A. 스미드 등의 방법(J. Immunol., 120, 2027(1978))으로 측정한다. 표 6에 그 결과가 있다.

[표 6]

(2) 사람의 신경 교아 세포종 세포주 U373MG를 10% FCS로 보충한 RPMI-1640 배지 내에서 충분히 배양하고 다시 10% FCS 20ng/ml의 폴리펩티드 XXXVII로 보충한 새로운 RPMI-1640 배지 내에서 배양한다. 18시간 후, 배지를 제거하고, 총 RNA를 구아니디늄-CaCl 법으로 추출하고, 폴리(A)+ RNA를 올리고 -dT-셀룰로오스 크로마토그래피로 선별한다. 폴리(A)+ RNA 10μg을 노던 블롯팅 법에 따라서 1.2% 아가로즈 겔을 통해 분류하여 니트로셀룰로오스 여과지로 옮긴다. 반점을 감압하 80℃에서 구워 20mM 트리스-HCl(pH 8.0) 내에서 100℃에서 5분간 처리한 후, 이어 42℃에서 50% 포름아미드-5×SSC-50mM 소디움 포스페이트(pH 6.5)-4X 덴하르트 용액 200-μg/ml의 변성된 연어정자 DNA 내에서 예비 혼성화시킨다. 5시간 후, 42℃에서 20시간 동안 GM-CSF 의 cDNA 삽입부의 PstI-NcoI DNA 단편과 혼성활 시키거나(Science, 228, 810(1985)) 또는 BSF-2의 cDNA 삽입부의 KpnI-BamHI DNA 단편과 혼성화 시키며(Nature, 324, 73(1986)), 상기 단편을 니크전이로 방사능 표지를 한다. 여과지를 실온에서 15분간 2×SSC-0.1% SDS 내에서 세척하고 이어 50℃에서 1시간 동안 0.1×SSC-0.1% SDS 내에서 세척한다. 강화 스크린 존재하에 -70℃에서 밤새 방사선 자동 사진법을 수행한다.

제13도는 GM-CSF의 DNA 단편을 사용한 결과를 나타냈다. 레인 A는 본 발명 폴리펩티드를 사용하여 얻은 결과를 레인 B는 본 발명의 폴리펩티드를 사용하지 않은 대조의 결과를 나타낸다. 제13도와 같이, 제14도는 BSF-2의 DNA 단편을 사용해서 얻은 결과를 나타낸다.

상기의 결과에 의하면, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하면 동물 세포가 천연형 시토카인을 효율적으로 생산하게 된다.

상기의 방법에 사용된 본 발명의 폴리펩티드의 양은 매우 적은 양일 수 있으며, 통상적으로 약 10ng/ml이고, 그 양으로도 만족할 만한 결과를 얻을 수 있으며, 폴리펩티드의 사용은 생성된 시토카인의 정제를 용이하게 해준다.

(3) 시토카인이 동물 세포로부터 생성될 때, 생성을 유도하는 데 사용되는 본 발명의 폴리펩티드가 통상적인 상황하에서 안정한 구조를 지니며 세포의 표면에 있는 IL-1 수용체와 결합하는 것이 필요하다. 보다 상세히 설명하면, 본 발명의 폴리펩티드가 IL-1 수용체와 결합하여 시토카인의 생성에 필요한 신호를 세포에 전달하는 것이 요구된다.

따라서, 섬유 아세포 상의 IL-1 수용체와 본 발명의 폴리펩티드결합에 관하여 다음 시험을 수행한다.

거의 균일하게 6-홈 플레이트에 자란 Balb/3T3세포(클론 A31 : ATCC, CCL-163.1×16³세포/홈)를 4℃에서 2시간 동안¹²⁵I-표지된 폴리펩티드 I(IL-1β)의 50000cpm/홈과 반응시키고 10% FCS로 보충한 D-MEM 내에서 37℃에서 예비 배양한 폴리펩티드 I 20ng/ml과 반응시킨다. 반응 혼합액을 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거하고, 10% FCS로 보충한 D-EME 1ml로 세포를 서서히 세척하고, 상층액은 제거한다. 세척 과정을 2번 반복한 후, 세포를 1% SDS와 0.2 N NaOH의 혼합액 1ml로 용해시킨다. 용해된 세포용액과 홈 세척용 액의 방사능(결합된 방사능)을 감마-카운터로 측정한다.

사용되는¹²⁵I-표지된 폴리펩티드 I은 볼톤과 혼터법(Biochem. J., 133, 529(1973))에 의해 제조 정제된다. 비활성 : 최소한 250uCi/μg 단백질. 그 결과는 표 7에 있다.

[표 7]

억제 활성도(%)= T 10 × 100

식중 A : 표지되지 않은 폴리펩티드 I 부재하의 결합된 방사능

B : 결합된 방사능의 실험 값

C : 플레이트 상에 비특이적으로 흡착된 방사능

상기의 지수는 IL-1 수용체에 대한 공존 폴리펩티드 I의 결합 활성도를 표현한다.

표 7에서는, 시토카인 유도 조건하에서, 폴리펩티드 I, 즉 IL-1β 자체가 IL-1 수용체에 결합하는 능력의 시간이 지남에 따라 감소함을 나타낸다. 따라서, 24시간 동안 예비 배양한 폴리펩티드 I, VI 또는 XXXVII를 사용하여 상술한 것과 동일한 시험 과정을 반복한다. 하기의 표 8에 그 결과가 있다.

[ 표 8]

상기의 결과에 의하면, 동물 세포로부터 시토카인을 제조하는 데에는 IL-1β 자체보다 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는 것이 보다 바람직하다.

Claims (16)

1. 4-위치의 Arg가 Gly으로 치환된 IL-1β, 11-위치의 Arg가 Gln으로 치환된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ser으로 치화노딘 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ser으로, 71-위치의 Cys가 Ser으로 치환된 IL-1β, 71-위치의 Cys가 Ser으로 치환된 IL-1β, 103-위치의 Lys가 Gln으로 치환된 IL-1β, 121-위치의 Tyr가 Gln으로 치환된 IL-1β, 1-위치의 Ala가 결핍된 IL-1β, 98-위치의 Arg가 Leu으로 치환된 IL-1β, 4-위치 Arg가 Gly으로, 11-위치의 Arg가 Gln으로 치환된 IL-1β, 4-위치의 Arg가 Leu가 Gly으로, 98-위치의 Arg가 Leu으로 치환된 IL-1β, 11-위치의 Arg가 Gln으로, 98-위치의 Arg가 Leu으로 치환된 IL-1β, 4-위치의 Arg가 결핍된 IL-1β, 11-위치의 Arg가 결핍된 IL-1β, 98-위치의 Arg가 결핍된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ala으로 치환된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 결핍된 IL-1β, 71-위치의 Cys가 Ala으로 치환된 IL-1β, 71-위치의 Cys가 Val으로 치환된 IL-1β, 71-위치의 Cys가 결핍된 IL-1β, 93-위치의 Lys가 Leu으로 치환된 IL-1β, 120-위치의 Trp가 Arg으로 치환된 IL-1β, 30-위치의 His가 Tyr으로 치환된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ala으로, 71-위치의 Cys가 Ser으로 치환된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ala으로, 71-위치의 Cys가 Val으로 치환된 IL-1β, 8-위치의 Cys가 Ala으로, 71-위치의 Cys가 Ser으로 치환된 IL-1β, 3-위치의 Val가 결합된 IL-1β, 5-위치의 Ser가 결핍된 IL-1β, 97-위치의 Lys가 결핍된 IL-1β, 99-위치의 Phe가 결핍된 IL-1β 및 153-위치의 Ser가 결핍된 IL-1β로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 4-위치의 Arg가 Gly으로 치환된 IL-1β인 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 71-위치의 Cys가 Ser으로 치환된 IL-1β인 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 8-위치의 Cys가 Ala으로, 71-위치의 Cys가 Ala으로 치환된 IL-1β인 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 정의한, 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자.
6. 제 2 항에 정의한, 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자.
7. 제 3 항에 정의한, 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자.
8. 제 4 항에 정의한, 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자.
9. 제 6 항, 제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 어느 하나의 유전자를 함유하는 ptrpGIF-α-4G, ptrpGIF-α-71S 또는 ptrpGIF-α-8A71A로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 발현 벡터.
10. 제 9 항에 기재된 어느 하나의 벡터를 함유하는, 이. 콜리 (E. coli) HB101/ptrpGIF-α-71S(FERM BP-1296), 이. 콜리(E. coli) HB101/ptrpGIF-α-4G(FERM BP-1297), 또는 이. 콜리(E. coli) HB101/ptrpGIF-α-8A71A (FERM BP-1298)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미생물.
11. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 면역성 자극용 의약 조성물
12. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 악성 종양 치료용 의약 조성물.
13. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 시코카인 생산 촉진용 의약 조성물.
14. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 염증 치료용 의약 조성물.
15. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 방사선 손상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
16. 약학적으로 유효한 양의 제 1 항에 정의한 폴리펩티드 및 의약용 보조제를 함유한, 기회 감염의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

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