KR950000886B1

KR950000886B1 - IL-Iα 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR950000886B1
Application number: KR1019870002331A
Authority: KR
Inventors: 사또루 나가이; 마유미 가네다; 요시까즈 기꾸모도; 홍영만; 가즈요시 가와이; 세스꼬 다께가따; 기요시 이시이; 야스오 야나기하라; 요시가쓰 히라이
Original assignee: 오오쓰까세이야꾸 가부시끼가이샤; 오오쓰까 아끼히꼬
Priority date: 1986-03-14
Filing date: 1987-03-14
Publication date: 1995-02-03
Also published as: DK127787A; US5008374A; DK171647B1; DK127787D0; EP0237073B1; EP0237073A2; US5371204A; JPS63164899A; US5342615A; ES2009216A6; DE3750432T2; JP2572220B2; DK51493D0; EP0237073A3; DK172339B1; EP0578278A1; DE3750432D1; HK1003115A1; KR870009023A; US5702698A

Abstract

내용 없음.

Description

IL-1α 유도체의 제조방법

제 1 도는 플라스미드 pcD-GIF-16 및 플라스미드 pcD-GIF-207의 cDNA의 제한효소 지도를 나타내고 ;

제 2 도는 플라스미드 pcD-GIF-207 및 플라스미드 PTM1으로부터 플라스미드 ptrpIL-1α-113이 구성되는 방법을 나타내는 도면이고 ;

제 3 도는 항암활성 시험결과를 나타내고 ;

제 4 도 및 제 5 도는 본 발명의 폴리펩티드의 CSF 생산촉진효과를 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ;

제 6 도는 본 발명 폴리펩티드의 소염효과를 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ;

제 7 도는 본 발명의 폴리펩티드의 방사선 상해 예방활성을 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ;

제 8 도는 본 발명 폴리펩티드의 기회주의적 감염예방활성을 시험하여 얻은 결과를 나타낸다.

본 발명은 신규의 폴리펩티드, 더욱 상세하게는 인터루킨-1α(이하 IL-1α로 칭함)의 신규 유도체 및 IL-1β을 약에 사용하는 것 및 그의 신규 유도체에 관한 것이다.

제 2 차 국제 림포카인 연구회(The Second International Lymphokine Workshop)는, 임파구 활성인자(LAF), 유사분열 촉진 단백질, 헬퍼 피크-1(helper peak-1), T-세포치환인자 Ⅲ(TRF-Ⅲ), T-세포치환인자 Mø(TRFM), B-세포활성인자, B-세포분화인자등으로 알려져 왔던 생리활성 물질에 대해 통일된 명칭인 인터루킨-1(IL-1)을 채용하였다.(Cellular immunol., 48, 433∼436(1979)). 이 결정은 상기 생리활성 물질을 서로 다른 물질로 구분할 수 없고 단지 여러 각도에서 해석된대로 생리활성이 여러가지로 표현된다는 이유를 근거로 한다.

그리고 IL-1이 T 임파구 및 B 임파구를 활성화하고, 인터루킨-2 및 항체의 생산을 증진시키는 활성을 갖고, 간 조직에 작용하여 단백질 합성을 증진시키고, 그리고 프로스타글란딘의 생산을 촉진하는 활성을 갖고 있다고 보고되었다.(참조. Review of Infectious Disease, Vol. 6, NO. 1, 51∼59(1984), New England J. of Med., 311, 1413(1984)등).

IL-1 자체는 여전히 하나의 물질로 분류되어 있는데 비하여 LAF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 유전정보를 지정하는 두개의 서로 다른 유전자가 존재한다는 것을 최근에야 보고되었다.(Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.81, 7907∼7911(1984), Nature, Vol.315, 641(1985), Nucleic Acid Research, Vol. 13(16), 5896(1985)).

상기 보고에 따르면, 유전자 재조합 기술에 의해 수득한 배양 상층액이 LAF 활성을 가짐이 발견되었고, 상기 발견으로, 하기 식(A)로 표시되는 폴리펩티드가 LAF 활성을 갖는 폴리펩티드이고, "IL-1α"라 명명하였다.

그러나, 소위 IL-1으로 알려진 생리활성 물질뿐만 아니라 상기 활성물질을 균질로 분리 및 제조한 보고도 없고, 상기 균질물질의 생리활성에 대한 보고도 전혀 없다.

본 발명자는 IL-1α의 균질물질에 대한 심도있는 연구를 하여 이 물질의 제법에 관한 기술을 이미 확립하고 그의 특성, 물리적 성질 등을 밝혔다. 연구결과를 바탕으로 본 발명자는 또한 상기 식(A)의 폴리펩티드가 LAF 활성을 갖는 것을 확인하였다.

그럼에도 불구하고, 폴리펩티드가 비록 보고된대로 생체 유전자에 해당한다 할지라도 물질 자체로는 불안정하다.

따라서, 본 발명의 목적은 식(A)와 아미노산 서열이 다르고, 물질자체로 더욱 안정하고 의약용에 적합한 특성을 갖는 신규 폴리펩티드(IL-1α 유도체)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 IL-1α를 함유하는 신규 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 신규 IL-1α 유도체의 유전정보를 지정하는 유전자 및 상기 유전자를 사용하는 유전공학 기술에 의해, IL-1α 유도체, 즉 폴리펩티드의 제법을 제공하는 것이다.

그리고 본 발명은 IL-1α 그 자체의 새로운 의약용도를 제공하는 것이다.

더욱 구체적으로는, 본 발명이 식(A)에서 36위치의 Asn 및 141 위치의 Cys중에서 선택된 최소한 하나의 아미노산 잔기가 결핍되거나 또는 다른 아미노산으로 치환된 것으로 표시되는 인터루킨-1α의 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

본 명세서에서 아미노산과 폴리펩티드는 IUPAC 및 IUPAC-IUB에 의해 추천된 규칙 또는 명명법 또는 공지기술 분야에서 통상적으로 사용되는 부호에 따라 부른다. 염기서열의 핵산도 같은 방법으로 표현된다.

본 발명의 IL-1α 유도체는 LAF 활성, 종양세포의 성장을 억제하는 활성(GIF 활성), 즉 종양세포의 성장을 특이적으로 억제하는 활성, 콜로니자극인자(CSF), 인터페론(IPN), 인터루킨-2(IL-2) 및 인터루킨-3(IL-3) 등과 같은 여러가지 시토카인의 생산을 촉진하는 활성, 즉 예를들어 사람세포에 대하여 상기 시토카인의 생산을 크게 촉진하는 활성, 소염활성, 예를들어 모델동물에 관절염을 투여하였을때 관절염의 진전을 효과적으로 억제하는 활성, 및 방사선에 의한 상해를 방지하는 활성, 즉 골수이식중의 조직적인 방사능조사, 암치료를 위한 방사능조사 및 방사능사고로 생길 수 있는 생체질환 또는 심각한 부작용을 예방하는 활성을 갖는다. 따라서, 균질의 본 발명에 의한 유도체는, 예를들어, 항체생산을 촉진하고 백신의 효과를 증진시키기 위한 면역체계 자극제, 항암제, CSF, IFN, IL-2 및 IL-3와 같은 시토카인의 생산촉진제, 소염제, 방사능병 방지제 및 다른 유사의약으로 대단이 유용하다. 특히 본 발명의 폴리펩티드는 대단히 안정한 물질인 특성을 갖고 독성이 낮다. 그리고 IL-1이 발열성이 있다고 알려져 있는 반면에 본 발명의 폴리펩티드는 상기의 부작용이 낮은 점이 탁월하다.

본 발명의 유도체 CSF 생산 촉진제로 특히 유용하다. 사람에게 투여되면, 상기 유도체는 바이러스감염 또는 항원-항체반응의 가능성을 수반하지 않고 암을 화학적으로 또는 방사선으로 치료함으로 발생하는 골수의 결손에 의한 과립구 감소증을 효과적으로 치료한다(과립구 감소증 치료약). CSF 생산 촉진제는 또한 하기에 서술되는 제제에 의해 촉진되는 CSF 생산 활성에 의한 여러가지 질병을 예방하고 치료하는데도 사용할 수 있다. 예를들어, CSF는 과립구 및 대식세포의 기능을 증진하도록 작용하여(Lopez, A.F.등, J. Immunol.,131, 2983(1983) ; Handam, E. 등, J.Immunol., 122, 1134(1979) 및 Vadas, M.A.등, J.Immunol. 130, 795(1983)), 여러가지 질병의 예방 및 치료에 CSF의 임상적용이 예상된다. 마찬가지로, CSF 생산촉진제는 임상적용에 유용하다.

최근에, 무해한 병원체가 병원성을 갖게 되면 생체방어능이 손상된 절충된 숙주는 소위 기회주의적인 감염 또는 말단감염을 겪는다는 것이 알려졌다. 임상적으로, 상기 감염은 수도모나스(Pseudmonas) 및 세라티아(Serratia)등의 그람-음성간균, 허피스 심플렉스 바이러스(HSV), 바리셀라-조스터 바이러스(Viricella-zoster virus, VZV) 및 시토메갈로바이러스(CMV) 등의 바이러스, 칸디다 알비칸스(candida albicans), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)등의 진균, 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)등의 프로토조아 등에 기인한다. 현재 사용되는 항생제는 기회주의적인 감염에 완전히 효과적이지 못하기 때문에 , 상기 감염에 대한 신규약제의 개발연구가 요망되고 있다. 본 발명의 유도체는 항암제가 투여될때 특히 자주 발생하는 기회주의적 감염의 예방 및 치료에 또한 유효하다. 예를들어, 급성 백혈병의 화학적 치료 및 골수이식종에 발생하는 여러가지 감염증, 즉 칸디도스증, 크립토코코스증, 아스퍼질러스증, 접합균증, 크로모진균중, 바이러스감염, 사이토메갈로바이러스폐렴 및 상기 감염증의 복합증 등을 치료 및 예방하는데 유용하다.

그리고, 본 발명의 폴리펩티드는 관절염등의 예방 및 치료에 유효하고, 그러므로 소염제로 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드는 종양세포의 성장을 억제하는 활성(이하 "GIF 활성"이라 한다)을 갖는데, 이는 하기에 서술되는 방법으로 결정하고, 여러 종류의 종양세포에 특이적으로 작용하여 그의 성장을 억제한다. 따라서 본 발명 폴리펩티드를 활성성분으로 함유하는 항암조성물은 암치료제로 사용하기 유리하며, 특히 악성 종양치료를 위한 강화된 완화요법 및 완화유지요법용 여러가지 제제와 조합하여 사용하면 유리하다.

그리고, 상기 언급한 의약 용도외에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예를들면, 그것들이 시토카인의 생산을 촉진하는 활성을 갖고 있어서 세포주로부터 여러가지 유용한 시토카인을 시험관에서 제조하는데 유용하다. 천연형의 시토카인, 특히 당단백질인 시토카인을 제조하는데 관심이 주어져왔다. 유용한 시토카인을 대량으로 효율적으로 생산할 수 있다.

본 연구는 IL-1α의 신규 생물학적 활성을 발견하였다. 본 발명의 IL-α는 GIF 활성 및 CSF 생산 촉진활성을 갖고, 이들 활성으로 상기한 여러가지 치료목적에 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드중에서 바람직한 것은 식(A)의 최소한 36위치의 Asn이 결핍되거나 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것이다. 36위치의 Asn 및 141위치의 Cys와 치환될 수 있는 아미노산은 생체 단백질을 구성하는 α-아미노산이면 어느것이어도 좋다. 그러나 Cys가 SH기를 갖고 있어 분자내 또는 분자간 결합을 형성하기 쉬워서, Cys 이외의 아미노산이 바람직하다. 구체적으로는, 36위치의 Asn 치환용으로는 Asp이 바람직하고 141 위치의 Cys 치환용으로 Ser이 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드는, 예를들면, 본 발명의 특정 폴리펩티드의 유전정보를 지정하는 유전자를 사용한 유전자 조작기술에 의하여, 즉 상기 유전자를 미생물용 운반체에 넣고 미생물내에서 복제, 전사 및 전이를 수행하여 제조할 수 있다. 상기 방법은 대량생산이 용이하다는 점에서 유리하다.

본 방법에서 사용되는 유전자는 통상의 방법, 예를들어 포스피트 트리에스테르법(Nature, 310, 105(1984))등으로 핵산을 화학합성하여 전체를 합성할 수 있으나, IL-1α의 유전정보를 지정하는 유전자 또는 이의 전구체를 이용하는 것이 편리하다. 상기의 화학합성을 포함한 통상의 방법에 의해, 유전자는 상기의 특정한 아미노산 서열의 유전정보를 지정하는 헥산서열로 변형되고, 이에 의해 원하는 유전자가 쉽게 제조될 수 있다.

IL-1α의 유전정보를 지정하는 유전자 및 이의 전구체는 이미 알려져 있다. 본 발명자는 IL-1α의 유전정보를 지정하는 유전자를 수득하여 이 유전자를 사용한 유전자 조작으로 IL-1α를 제조하는데 성공하였다. 사용되 유전자 조작기술들은 하기의 참고예에 서술될 것이다.

상기에서 언급한 변형된 핵산(염기)서열은 공지방법에 의해 제조되고, 이는 원하는 폴리펩티드의 아미노산서열에 따라 수행한다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1982)).

예를들어, DNA의 절단, 접합, 인산화 등은 제한효소, DNA 리가제, 폴리뉴클레오티드키나제 및 DNA 폴리머라제 등의 상품으로 쉽게 구할 수 있는 효소의 처리를 포함하는 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 포함된 유전자 및 핵산의 분리 및 정제는 또한 통상의 방법, 예를들어, 아가로스 겔 전기영동에 의해 수행한다. 조금후에 설명될 것이지만, 수득된 유전자는 통상의 운반체를 사용하여 복제한다. 원하는 아미노산 서열 및 합성 링커의 유전정보를 지정하는 DNA 단편은 상기 언급한 화학합성으로 쉽게 제조할 수 있다. 원하는 아미노산에 해당하고 상기 방법에서 사용될 코돈은 공지되어 있고 원하는대로 선택되었다. 상기 목적을 위하여 통상의 방법, 예를들어, 사용될 숙주의 코돈 사용빈도에 따라 사용될 수 있다(Nucl. Acids Res., 9, 43∼73(1981)). 관련된 헥산서열내의 코돈을 변경시키기 위해, 부위 특이성 변이유발법(site-specific mutagenesis : Proc. Natl. Acad. Sci., 81,5662∼5666(1984))이 통상대로 원하는 변형서열의 유전정보를 지정하는 약 15∼30량체의 합성 올리고뉴클레오티드를 함유하는 개시제를 사용하여 수행한다.

상기 방법으로 수득한 원하는 유전자는 염기서열을, 예를들면 막삼-길버트 화학변형법(Meth. Enzym., 65, 499∼560(1980)) 또는 M13 파지를 사용하는 다이데옥시뉴클레오티드 연쇄종결법(Messing. J. 및 Viera. J, Gene, 19, 269∼276(1982))으로 검사할 수 있다.

상기 방법 및 그 과정은 하기 참고예 및 실시예에 서술될 것이나 구체적으로 제한하지 않고 ; 공지 기술분야의 모든 공지방법을 사용할 수 있다.

상기와 같이 본 발명은 또한 상기 지정한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 유전정보를 지정하는 신규의 유전자(이 유전자를 이하 "본 발명 유전자"로 칭한다)를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 본 발명 유전자를 사용한 통상의 유전자 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명 유전자를 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있는 재조합 DNA를 제조하여 숙주세포를 형질전환시키고 형질전환체를 배양한다.

유용한 숙주는 진핵 또는 무핵세포일 수 있다. 진핵세포는 척추동물의 세포, 효모등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 척추동물 세포는 원숭이세포인 COS 세포(Y, Gluzman, Cell, 23, 175∼182(1981)), 챠이니즈 햄스터 난소세포의 디히드로 플레이트 리덕타제 결손주(G. Urlaub 및 L.A., Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216∼4220(1980))등이나, 유용한 세포가 이것으로 제한되는 것은 아니다. 척추동물 세포의 유용한 발현 운반체는 발현될 유전자의 상류에 위치한 프로모터, RNA 접합부위, 폴리아데닐화 부위, 전사종결서열 등을 갖는 것이다. 상기 운반체는 필요할때 복제 오리진을 가질 수 있다. 유용한 발현 운반체의 예는 SV40의 초기 프로모터를 갖는 pSV2dhfr(S.Subramani, R.Mulligan 및 P.Berg. Mol. Cell. Biol., 1(9), 854∼864)를 포함하나 그것으로 제한하지 않는다.

효모는 진핵 미생물로 널리 사용되고, 그중에서 사카로미세스(Saccharomyces)속의 것이 일반적으로 사용된다. 효모의 발현 운반체로 많이 사용되는 것의 예로는 산성 포스파타제 유전자의 프로모터를 갖는 pAM82(A. Miyanohara등, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80, 1∼5(1983))등을 포함한다.

이. 콜리 및 바실루스 서틸리스가 무핵 숙주세포로 널리 사용된다. 본 발명은, 예를들어, 숙주세포내에서 복제할 수 있는 플라스미드 운반체를 사용한다. 유전자를 운반체에서 발현시키기 위해, 프로모터 및 유전자의 상류에 SD(샤인-달가르노) 염기서열 및 단백질 합성 개시에 필요한 ATG를 갖는 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 널리 사용되는 이. 콜리 숙주는 이. 콜리 K12 균주이다. pBR322가 널리 사용되는 운반체이다. 그러나, 상기는 제한적이 아니고, 여러 종류의 균주 및 운반체를 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 프로모터는 트립토판 프로모터, P_L프로모터, lac프로모터, lpp 프로모터 등이다. 상기 프로모터중의 어느것을 사용하여도 유전자가 발현될 수 있다.

트립토판 프로모터가 사용된 경우의 방법을 서술하기 위하여, 트립토판 프로모터 및 SD 서열을 갖는 운반체 pTM1(후미오 이마모또, 다이샤, Vol.22, 289(1985))를 발현 운반체로 사용한다. 본 발명의 원하는 폴리펩티드의 유전정보를 지정하고 ATG를 갖는 유전자는 필요하면 SD서열의 하류에 존재하는 제한효소 Cla I 부위에 연결된다.

부수적으로, 직접 발현체계뿐만 아니라 융합 단백질 발현체계도 예를들어, β-갈락토시다제, β-락타마제 등을 사용하여 이용할 수 있다.

상기와 같이 수득한 발현 운반체를 숙주세포에 도입하고 통상의 방법으로 형질전환 시킨다. 예를들어, 대수성장기에 있는 세포를 수집하여 CaCl₂로 처리하여 DNA를 쉽게 받아들이게 한다. 이에 의해 운반체가 세포에 도입된다. 상기 방법에서, 공지된 바와 같이, MgCl₂또는 RbCl을 함께 사용하여 형질전환 효율을 높일 수 있다. 세포는 형질전환전에 스피로플라스트 또는 프로토플라스트로 전환될 수 있다.

상기와 같이 수득한 원하는 형질전환체는 통상의 방법으로 배양하여 원하는 폴리펩티드가 제조되고 축적된다. 배양매질은 L 배지, E 배지, M9 배지등과 같은 일반적으로 사용되는 세포배양용이면 된다. 여러 종류의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 등은 공지된대로 상기 배지에 혼합한다. 트립토판 프로모터를 사용하면, 예를들어, M9 최소배지를 카사미노산과 혼합하여 프로모터의 작용을 수행하도록 할 수 있다. 인돌아크릴산과 같은 화학약품이 트립토판 프로모터의 작용을 증진시키기 위해 배양의 적절한 단계에 배지에 가입될 수 있다.

본 발명의 원하는 폴리펩티드는 배양물로 부터 분리하여 통상의 방법으로 정제할 수 있다. 폴리펩티드 숙주로부터 삼투압 충격등과 같이 순한 조건에서 추출하여 그의 고차구조를 유지하는 것이 바람직하다.

상기의 분리 또는 정제방법은 생물질로부터 단백질류 물질을 분리하는데 통상적으로 사용되는 것과 같은 방법으로 수행한다. 예를들어, 원하는 폴리펩티드의 물리적 또는 화학적 성질을 이용하는 여러가지 과정을 사용할 수 있다(참조. "Biological Data Book Ⅱ" pp.1175∼1259, 1판 1차인쇄 1980. 6. 23 가부시끼가이샤 도오꾜 가가꾸도진출판). 유용한 과정의 예는 통상의 단백질, 침전제, 한외여과, 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 액체 크로마토그래피, 원심분리, 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 투석 및 상기 과정의 조합이다.

원하는 폴리펩티드는 부분적으로 정제된 상등액에서 분리한다. 부분정제는, 예를들어 단백질 침전제로서 아세톤, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 디메틸포름아미드(DMF)와 같은 유기용매, 아세트산, 과염소산(PCA) 또는 트리클로로아세트산(TCA)등의 산성 반응제 등을 사용하는 처리, 황산암모늄, 황산나트륨 또는 인산나트륨 등의 염석제를 사용한 처리 및/또는 투석막, 평막, 속이빈 섬유막(hollow fiber membrance)등을 사용한 한외여과로 수행한다. 상기 처리는 통상의 조건에서 통상적으로 수행되는 것과 동일한 방법으로 수행한다.

상기와 같이 조악하게 정제된 산물을 겔여과하여 원하는 물질의 활성을 나타내는 분획을 수집한다. 유용한 겔 여과제는 구체적으로 제한하지 않고, 덱스트란 겔, 폴리아크릴 아미드겔, 아가로즈겔, 폴리아크릴아미드-아가로즈겔, 셀룰로오즈등이 있다. 공업적으로 구입가능한 유용한 제제의 예는 세파덱스 G형, 세파덱스 LH형, 세파로스형, 세파크릴형(모두 파마시아 제품), 셀로핀(치쏘사) 바이오겔 P형, 바이오겔 A형(둘다 바이오-라드 랩사 제품), 울트로겔-C(LKB), TSK-G형(도요소다공업사 제품)등이 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 분획으로부터 균일물질들로 분리할 수 있는데, 예를들어, 각 분획을 히드록시아파티트 컬럼을 사용한 친화도 크로마토그래피, DEAE의 이온교환 컬럼 크로마토그래피, CM 또는 SP법, 크로마토포커싱법, 역상 HPLC등 또는 상기 방법의 조합으로 수행할 수 있다.

크로마토포커싱법은 여러가지 공지방법으로 수행할 수 있다. 컬럼으로 사용할 수 있는 것을 예를들면, PBE94(파마시아 파인 케미칼스)등, 출발 완충용액으로는 예를들면, 이미다졸-염산등, 용출액으로는, 예를들어, 폴리버퍼 74(파마시아 파인 케미칼스) 및 염산(pH 4.0)의 혼합물이다.

역상 HPLC는 예를들어, C₄하이포어 역상 HPLC 컬럼(바이오-라드 라보라토리즈) 등으로, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산(TFA), 물 등 또는 상기 용매의 혼합물을 용출액으로 하여 수행할 수 있다.

상기 방법으로, 본 발명의 IL-1α 유도체(폴리펩티드)는 분리하여 수득할 수 있다. IL-1α의 유전정보를 지정하는 유전자는 유사한 유전자 재조합과정을 통하여 IL-1α를 제공할 수 있다.

IL-1α 및 본 발명에 의한 그의 유도체는, 앞에서 서술한대로 탁월한 약리활성을 갖고 있는데, 상기 언급한 의약용도의 유용한 제제로 제제화될 수 있다. 상기 의약제제의 예는 합체생산, 백식효과증진 및 면역결핍 치료용 면역자극제, 항암제, 시토카인 생산 촉진제, 소염제, 방사상해 예방 또는 치료제, 기회주의적 감염의 예방 또는 치료제 등을 포함한다. 상기 의약제제는 보통 약학적으로 유효한 본 발명 펩티드 또는 IL-1α 및 적절한 담체를 함유하는 약학 조성물의 형태로 제제화된다. 유용한 담체의 예는 원하는 형태의 약제제조에 일반적으로 사용되는 충진제, 확장제, 결합제, 흡습제, 전개제, 계면활성제 등의 희석제 및 부형제를 포함한다. 약학 조성물의 형태는 본 발명 폴리펩티드 또는 IL-1α를 유효하게 함유하는 한 특정한 것으로 한정되지 않으며, 예를들면, 정제, 분말, 과립, 환약 또는 유사한 고체제제의 형태일 수 있다. 그러나, 통상적으로 상기 조성물은 용액, 현탁액, 유화액 등의 주사용일 수 있다. 한편으로는, 상기 조성물은 사용전에 적절한 운반체를 접하여 액체로 만들 수 있는 전조물일 수 있다. 상기 언급한 약학 조성물은 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

수득된 약학 조성물의 형태에 따라서, 조성물은 적절한 경로로 투여된다. 예를들면, 주사용 조성물은 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사, 복강주사로 투여된다. 고체 조성물은 경구 또는 장내로 투여된다. 조성물의 활성성분 함량 및 투여량은 투여의 방법 및 형태, 사용목적, 환자의 증상 등에 따라 적절히 결정한다. 일반적으로는 1∼약 80중량%의 활성성분을 약제에 함입시키고, 활성성분으로 계산해서 상기 제제를 성인 1일당 약 0.1㎍∼약 10mg으로 투여하는 것이 바람직하다. 상기 제제를 항상 한번에 투여해야 할 필요는 없고 3∼4회로 분할하여 투여할 수 있다.

하기 실시예에서, 생리활성은 하기 방법으로 결정한다.

(1) IL-1 활성을 결정.

새앙쥐 C3H/HeJ 세포수의 흉선세포를 사용한 J.J.Openhein등의 방법(J.Immunol., 116, 1466(1976))에 의한 LAF 활성의 항으로 표현된다.

(2) GIF 활성의 결정

여러 농도로 희석된 시료용액 일부(0.1ml)를 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate, 코닝사제품)의 각 홈에 넣고, 인체 흑색종 세포 A375를 2×10⁴세포/ml의 양으로 함유하는 10% FCS의 이글스 MEM 현탁액 0.1ml을 각 홈에 넣은 후 CO₂배양기(납코사)에서 4일간 배양한다. 배양 후에 0.05ml의 0.05% 뉴트랄 레드(와코 준야꾸사)를 각 홈에 넣고, 37℃에서 2시간 반응시킨다. 상등액을 제거한 후, 0.3ml의 PBS(인산완충 식염수)를 각 홈에 부드럽게 부어 세척한다. 세척액을 제거한 후 1염기성 인산 나트륨 및 에탄올의 동량 혼합물 0.1ml을 각 홈에 넣고 미세 혼합기로 수분한 흔들어 준 후, 96-웰 미세 적정판용 광측정기(타이터 텍 멀티스캔, 플로우랩 제품)를 사용하여 540㎛의 흡광도로 세포에 흡수된 색소의 양을 측정하여 성장저해 활성을 결정한다. 대조군 세포성장의 50% 저해율을 나타내는 시험군, 즉 대조군에 측정된 흡광도의 1/2를 나타내는 시험군을 찾아낸다. 상기 시험군의 희석배율의 역수를 GIF 활성단위로 취한다. 따라서, 예를들어 GIF 활성이 10단위이면, 시험용액은 10배 희석되어도 세포성장을 50% 억제하는 활성을 갖는다.

하기 도면을 참고예 및 실시예를 인용한다.

제 1 도는 플라스미드 pcD-GIF-16 및 플라스미드 pcD-GIF-207의 cDNA의 제한효소 지도를 나타내고 ; 제 2 도는 플라스미드 pcD-GIF-207 및 플라스미드 pTM1으로부터 플라스미드 ptrpIL-1α 113이 구성되는 방법을 나타내는 도면이고 ; 제 3 도는 항암활성 시험결과를 나타내고 ; 제 4 도 및 제 5 도는 본 발명의 폴리펩티드의 CSF 생산촉진효과를 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ; 제 6 도는 본 발명 폴리펩티드의 소염효과를 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ; 제 7 도는 본 발명 폴리펩티드의 방사선 상에 예방활성을 시험하여 얻은 결과를 나타내고 ; 제 8 도는 본 발명 폴리펩티드의 기회주의적 감염예방 활성을 시험하여 얻은 결과를 나타낸다.

[참고예 1]

(1) U937 세포의 배양

1.4×10⁹의 인체 조직구 임파구 U937세포(Ascenso, J.L.등, Blood, Vol.57,170(1981))를 25ng/ml의 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA, 파마시아제품), 10㎍/ml의 콘카나발린 A(ConA, 시그마제품) 및 10% FCS를 함유하는 RPMI-1640 배양액에 넣어 4×10⁵세포/ml의 농도를 갖는 현탁액을 제조한다.

세포 현탁액을 각각 10ml씩 나누어 배양접시(Falcon 3003, 직경 9cm)에 담아, 5% 이산화탄소 기체내에서 37℃로 3일간 배양한다. 흡기기(aspirator)를 사용해 배양 상층액을 제거한 후, 세균유래 리포폴리사카라이드(LPS, Difco사 제품) 10㎍/ml, 뮤라밀디펩티드(MDP, Wako Pure Chemical사 제품) 1㎍/ml 및 TPA 1ng/ml를 함유한 RPMI-1640 배지 10ml를 각각의 접시에 담는다. 상기 배지로 5% 이산화탄소 기체내에서 37℃로 18시간 포를 배양한다. 접시바닥에 부착한 U937 세포를 mRNA 제조용으로 사용한다.

(2) mRNA의 제조

구아니디늄/은 페놀법(Feramisco, J. R. 등, J. Bio. Chem. Vol. 257, 11024(1982)) 및 구아니디늄/세슘클로라이드법(Glisin, V, 등, Biochemistry, vol.13, 2633(1974))를 조합하여 mRNA를 추출한다.

공정(1)에 의해 배양된 U937 세포를 세척하기 위해, 상승액을 제거한 후에 PBS(-) 용액 5ml로 디쉬를 씻는다. 그다음 각 디쉬에 4M 구아니딘 이소티오시아네이트 용액(Fluka 사 제품), 50mM 트리스-HCI(Ph-7.6), 10MM EDTA 및 2% 소디움 라우로일 사르코시네이트를 1ml 담고 세포를 용해시킨다. 용액을 고무찰자와 파스퇴르 피펫으로 세포용액 420ml를 수거하여, 60℃로 유지하고 18G 주사침을 통과시켜 염색체 DNA를 절단한다. 이어서, 60℃로 가열한 페놀을 용액과 동일한 양으로 용액에 부가하고, 혼합액을 18G 주사침으로 교반하여 보다 많이 절단한다. 혼합액 0.1M 소디움 아세테이트 -10mM 트리스-HCl(pH7.4)-1mM EDTA 용액 210ml와 클로로포름-이소아밀알코올 혼합액(부피비 24 : 1) 420ml를 부가한다. 혼합액을 60℃에서 15분간 격렬하게 교반한후, 얼음으로 냉각시키고 4℃에서 20분간 3000r.p.m 으로 원심분리한다. 수집된 수층에 수층의 2배량의 에탄올을 부가한다. 혼합액을 -70℃로 밤새 방치하면 조 RNA 침전물이 수득된다. 조 RNA를 6M 구아니딘 이소티오시아네이트 -5mM 소디움 시트레이트(pH7.0)-0.1M β-메프캅토에탄올-0.5% 소디움 라우로일 사르코시네이트 용액 48ml에 용해시킨다. 세슘클로라이드(19.2g)를 상시 용액에 용해시킨다. 생성된 용액중 7ml를 5.7M 세슘클로라이드-0.1M EDTA(pH7.5) 4ml 위에 올려 놓는다. 혼합액을 25℃에서 20시간 동안 31500r.p.m 으로 원심분리(Beckman SW40Ti로 타사용))하여 RNA를 수집한다. 따라서 RNA 9.7mg이 수득된다.

RNA에서 mRNA를 수득하기 위해, RNA를 올리고 (dY)-셀룰로오스(Collaborative Rearch Inc사 제품) 컬럼 크로마토그래피한다. 흡착시키기 위해, 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-0.5M NaCl1-1mM EDTA를 사용한다. 용리시키기 위해, 10mM 트리스-HCl(pH7.5)-1mM EDTA를 사용한다. 결과적으로 mRNA 400㎍이 수득된다.

[cDNA 도서관의 제조]

cDNA 도서관은 오까야마-버그법에 의해 제조되며, 이 방법에 의해 cDNA가 동물세포내에 발현될 수가 있다. cDNA 클로닝에 사용되는 dT 꼬리가 부착된 운반체는 플라스미드 pcDV1로부터 제조되며, dG 꼬리-부착된 링커 DNA는 플라스미드 PL1로부터 제조되고, 각각 오까야마 등의 방법(Okayama, H. 및 P. Berg. Molecular and Celluar Biology, Vol., 3, p.280 (1983))에 의한다.

공정(2)에 의해 수득된 mRNA(15㎍)를 5mM 트리스-HCl(pH7.5)-0.5mM EDTA(pH7.5) 수용액 20㎕에 용해시켜 65℃에서 5분간 이어 37℃에서 5분간 반응시킨다. 반응 혼합액의 전체양이 40㎕가 되도록 맞추는데, 용액내에는 50mM 트리스-HCl(pH8.3), 8mM MgCl₂, 30mM KCl, 0.3mM 디티오트레이톨, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각각 2mM 운반체 DNA 2.8㎍, RN 아제 억제제(Pronega Biotech사 제품) 60단위 및 역전사효소(Bio Lad사 제품) 40단위가 포함된다. 이어서 37℃에서 1시간 배양한다. 2㎕의 0.5M EDTA(pH7.5)와 2㎕의 10% SDS를 가입하여 반응을 종결시키고 계속해서, 반응액을 페놀-클로로포름 추출 및 클로로포름 추출하여 추출물을 에탄올로 침전시키면 운반체 cDNA : mRNA가 수집된다.

수집된 운반체 cDNA : mRNA를 140mM 소듐 카고딜레이트, 30mM 트리스-HCl(pH6.8), 1mM CaCl₂, 0.1mM디티오트레이톨, 폴리 A 0.3㎍, 66μM dCTP 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(Pharmacia사 제품) 38단위를 함유하는 반응 혼합액 30㎕ 내에서 5분동안 37℃로 반응시킨 후 0.5M EDTA(pH7.5) 1.5㎕와 10% SDS 1.5㎕를 혼합액에 가입하여 반응을 종결시킨다. 혼합액을 페놀-클로로포름 추출 및 클로로포름 추출하여 에탄올로 침전시키면 올리고 dC 꼬리가 부착된 cDNA : mDNA-운반체가 수득된다.

수집된 헥산을 7mM 트리스 HCl(pH7.5), 7ml MgCl₂, 60mM NaCl, 100㎍/ml 의 소혈청 알부민 및 제한효소 힌드 Ⅲ(Nippon Gene 사 제품) 12단위를 함유하는 반응 혼합액 20㎕ 내에서 90분간 37℃로 반응시킨다. 계속해서 0.5M EDTA(pH7.5)1㎕와 10% SDS 1㎕를 혼합액에 가입하여 반응을 종결시킨 후, 이어 페놀-클로로포름 및 이어 클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시키면 Hind Ⅲ로 절단된 올리고 dC꼬리가 부착된 cDNA : mRNA-운반체가 수집된다. 생성물을 10mM 트랜스-HCl(pH7.5)-1mM EDTA)pH7.5)(TE(pH7.5))10㎕내에 용해시킨다. 이 용액중 1㎕를 상기의 TE(pH7.5), 0.1M NaCl 및 올리고 dG 꼬리가 부착된 링커 DNA(14ng)으로 구성된 반응 혼합액 10㎕ 내에서 배양하는데, 처음에는 65℃에서 2분간 이후에는 42℃에서 30분간 배양한다. 그후 혼합액을 0℃로 냉각시킨다.

반응혼합액을 100㎕로 맞추는데, 용액내에는 20mM 트리스 HCl(pH 7.5), 4mM MgCl₂, 10mM (NH₄)₂SO, 0.1M KCl, 50㎍/ml 소혈청 알부민, 0.1mM β-NAD(니코틴아미드-아데닌-디뉴클레오티드, Pharmacia 사 제품) 및 이 콜리 DNA 리가제 (Pharmacia 사 제품) 0.6㎍이 포함된다. 이어 12℃에서 밤새 배양한다. 반응 혼합액에 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP를 각각 40μM 및 -NAD 0.15mM를 부가한다. 또한 이. 콜리 DNA리가제 0.4㎍. 이.콜리 DNA 폴리머라제Ⅰ(Boehringer Mannheim 사 제품) 및 이.콜리 RN 아제 H(Pharmacia 사 제품) 1단위를 부가하고, 혼합액을 12℃에서 1시간 이어 25℃에서 1시간 동안 배양한다.

이. 콜리 HB101을 상기에서 수득된 반응 혼합액을 사용하여 형질전환시킨다. 상기 균주의 형질전환 가능세포로 사용되는 것은 베데스타 리서치 라보라토리즈(BRL) 제품이다. BRL의 설명서에 따라서 세포를 형질전환시킨다.

결과적으로 cDNA 도서관(약 21000클론 함유)이 수득된다.

(4) 원숭이 COS-1 세포의 감염

상기 공정(3)에 의해 수득된 cDNA 도서관을 평균 약 70클론을 포함하는 군으로 각각 나눈다. 각각의 군으로부터 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법(Molecular Cloning-A 실험서, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p. 368)에 의해 배양된 원숭이 세포, COS-1 세포(Gluzman, Y., Cell, Vo1. 23, p. 175(1981)) 전이감염용으로 상기에서 각 군으로부터 제조된 플라스미드 DNA를 사용하여 감염시킨다. 전이감염은 DEAE-덱스트란법(Yokota, T. 등, Proc. Nat1. Acad. Sci, U.S.A. Vol. 81, p. 1070(1984)에 의해 수행된다. 보다 상세히 설명하면, 트립신으로 처리된 COS-1 세포를 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지내에 현탁시켜 농도를 1×10⁶세포/ml로 맞춘다. 계속해서, 현탁액중 500㎕를 10% FCS를 함유한 2ml의 RPMI-1640배지를 함유하는 각각의 웰 플레이트 (Well plate)의 6개 홈에 넣는다. 세포를 37℃에서 밤새 배양한후, 상층액을 제거하고, 세포를 혈청이 없는 배지로 세척하고, 10㎍/ml의 플라스미드 DNA, 0.4mg/ml의 DEAE-덱스트란(Pharmacia 사 제품), 50mM 트리스-HCl(pH7.4) 및 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 메디움 1ml를 각각의 홈에 넣은후 37℃에서 4.5시간동안 배양한다. 그 후 상충액을 제거하고, 세폴르 혈청이 없는 배지로 세척하여 150μM 클로로킨(Sigma 사 제품)과 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 2ml를 각각의 홈에 넣은 후, 37℃에서 3시간동안 배양한다. 상층액을 제거하고, 세포를 혈청이 없는 배지로 세척한후 각각의 홈내에 있는 세포에 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 3ml를 부가하여 37℃에서 72시간 동안 배양한다. 상응액을 수집한 후, 10% FCS를 함유한 RPMI-1640 배지 2ml를 각각의 홈에 넣은후, 동결-융해 순환을 2번 한다. 그후 세포 추출물을 수집한다. 배양 상층액과 세포 추출물의 GIF 활성도를 조사한다.

GIF 활성도를 나타내는 군을 각각 10클론씩 24군으로 나누고, 이를 사용하여 상기와 동일한 공정을 반복하여 GIF 활성도를 결정한다. GIF 활성도를 나타내는 군내의 클론이 GIF 활성도를 나타내는 클론임을 확인하기 위해서 상기와 동일한 공정을 반복한다.

결과적으로, 2종류의 클론, 즉 pcD-GIF-16 및 pcD-GIF-207이 수득된다.

표 1은 상기 클론의 GIF 활성도(GIF단위/ml)를 나타낸다.

[표 1]

(5) 클론의 분석

제 1 도는 플라스미드 pcD-GIF-16 및 플라스미드 pCD-GIF-207의 cDNA의 제한효소 지도를 보여준다.

상기 플라스미드 각각의 cDNA의 염기서열을 염기-특이성 화학적 변형법(Methods in Enzymology, Vo1. 65. 499 (1980) 및 M13 피지운반체를 사용하는 디데옥시 연쇄 종결법(Proc. Nat1. Acad. Sci., U.S.A., Vo174, 5463 (1977))[Gene, Vo1. 19, 269 (1982)]으로 결정한다.

결과적으로, pcD-GIF-207의 cDNA는 마치(March 등, Nature, Vo1.315, 641 (1985) 등이 보고한 IL-1α의 코딩지역의 cDNA와 동일함을 알았다.

IL-1α의 전구체 단백질의 유전정보를 지정하는 cDNA를 갖는 플라스미드 pcD-GIF-207을 함유하는 이 콜리 균주 X1776은 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 수탁번호 FERM BP 1294. "에스케리키아콜리 X1776/pCD-GIF-207"라는 명칭으로 기탁되었다. 또한, 이 균주는 1987년 6월 2일자로 한국종균협회에 KFCC-10374의 수탁번호로 기탁되었다.

(6) 폴리펩티드의 발현 및 제조

상기 플라스미드 pcD-GIF-207을 제한효소 HindⅢ 및 HincⅡ로 절단하고, 아가로즈 겔에 전기 영동하여 약 0.66 kb HimdⅢ-HincⅢ DNA 단편을 분리정제하고, 제한효소 Alu Ⅰ으로 처리하여 약 0.5-kb AluⅠ-HincⅡDNA 단편을 분리하여 수득한다.

다음에, 합성 올리고뉴클레오티드(5' CGATAATGTCAGCACCTTTTAG 3' 및 5' CTAAAAGGTGCTGACATTAT 3')을 5' 말단에서 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 인산화시키고 상기에서 수득한 Alu Ⅰ-HincⅡ DNA 단편과 T4 DNA 리가제로 접합시킨다. 접합된 단편을 제한효소 Cla Ⅰ으로 절단하고, 아가로즈 겔에 전기영동하여 약 0.54-kb Cla I-Cla I DNA 단편을 분리 및 정제한다.

한편으로, 플라스미드 pTM I (후미오이마모또, 디이샤(대사) Vo1.22 289(1985))를 제한효소 Cla I으로 절단하고, 송아지 창자 알카리 포스파타제(CIAP)와 반응시킨 후 앞에서 제조한 약 0.54-kb Cla Ⅰ-Cla Ⅰ DNA 단편과 T4 DNA 리가제로 결합하여 목적하는 폴리펩티드의 발현 플라스미드 ptrpIL-1α-113을 수득한다.

상기 플라스미드를 이 콜리 HB101에 형질전환시키고, 비등법에 의해 수득된 플라스미드 DNA의 절단단편의 크기를 분석하여 목적하는 형질전환체를 선별한다.

제 2 도는 상기 방법을 도식적으로 보여준다.

플라스미드 ptrpIL-1α-113을 선택된 형질전환체에서 추출하여 이. 콜리 W3110에 형질전환하여 이. 콜리 W3110/ptrpIL-1α-113을 수득한다.

[실시예 1]

(1) 형질전환체의 배양

참고예 1, (6)에서 수득한 형질전환체(이.콜리 W3110/ptrpIL-1α-113)을 50㎍/ml의 암피실린 및 20㎍/ml의 L-트립토판을 함유하는 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 익스트랙트 및 0.5% NaCl) 10ml로 37℃에서 교반하며 하룻밤 배양한다. 배양물 8ml로, 50㎍/ml의 암피실린 및 1% 카사미노산을 함유하는 M9 최소배지(0.6% Na₂HPO₄, 0.3% KH₂PO₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 2mM MgSO₄, 0.2% 글루코오즈 및 0.1mM CaCl₂) 400ml을 접종하여 37℃에서 9시간 배양한다. 수득한 이. 콜리 세포를 10ml의 1M Na₂HPO₄에 현탁시키고 냉장실에서 하룻밤 방치한 후 10mM 트리스-HCl 완충용액(pH8.0)으로 2일간 투석한다.

투석물을 원심분리하여 침전물과 상층액으로 분리한다. 상응액은 28ml 수득되고 7.3×10⁷단위의 GIF 활성을 갖는 것으로 발견되었다.

(2) 폴리펩티드의 정제

상기 과정(1)에서 수득한 상층액 2ml을 하기 조건에서 울트로크롬 GTi(ULTROCHROM GTi, LKB) 크로마토그래피시스템을 사용한 이온교환 HLPC로 정제한다.

컬 럼 : TSK 겔 DEAE-5PW(7.5×75mm, 도요소다사제품)

용리액 A : 20mM 트리스-HCl 완충용액(pH8.0)

용리액 B : 0.5M NaCl 함유 20mM 트리스-HCl 완충용액(pH8.0)

유 속 : 1ml/분

분획부피 : 1ml/분/시험관

구배프로필 :

DEAE-HPLC를 거치면 두개의 GIF-활성분획, 즉, 체류시간 26∼28분의 분획(이하 "분획 1"이라 한다) 및 체류시간 32.5∼34.5의 분획(이하 "분획 2"라 한다)를 얻는다.

상기의 두개 분획을 DEAE-HPLC 및 겔여과 HPLC하여 분획 1 및 2를 정제상태로 수득한다.

분리된 GIF-활성 분획이 상기와 같이 수득되었디 때문에, 상기 분획을 하기와 같이 시험하여 확인한다.

(3) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

분획 1 또는 2를 U.K. 라엠리의 방법(U.K.Larmmli ; Nature, 277 680 (1970))에 따라 하기 조건에서 SDS-PAGE를 수행한다.

시편 : 분획 1 또는 2를 완전히 건조시킨후, 라엠리 시료 완충용액(완충용액부피의 1/20양의 2-메르캅토에탄올 함유(2ME⁺))으로 용해하고 100℃에서 4분간 처리.

겔 : 15% 폴리아크릴아미드, 두께 : 1.5mm.

기구 : 프로테안(PROTEAN), 바이오-라드제품.

전기영동 : 일정정류 40mA, 2시간.

전기영동한 겔을 실버 스테인 키트(바이오-라드)로 염색한다. 결과로, 분획 1 및 2는 각각 약 18.3kd의 분자량에 단일 띠로 이동하는데, 이는 유전자로 계산한 18kd의 분자량에 거의 일치한다.

(4) 등전집속(IEF)

분획 1 및 2를 3.5∼9.5pH 범위의 암폴린 PAG판(LKB) 및 모델 1415(바이오-라드)를 사용하여 하기 조건으로 IEF를 수행한다.

시편 : 분획 1의 PBS 용액을 2일 방치한 것 및 2주일 방치한 것.

분획 2의 PBS 용액을 2일 방치한 것 및 2주일 방치한 것.

PBS 용액 : 대조 및 하기 표지 단백질(pl 표지 단백질)의 모두 5레인.

표지단백질 :

아밀로글로코시다제(3.50)

콩 트립신 억제제(4.55)

β-락토글로불린 A(5.20)

소 카르보닉 안히드라제 B(5.85)

인체 카르보닉 안히드라제 B(6.55)

말 미오글로빈-산성 띠(6.85)

말 미오글로빈-염기성 띠(7.35)

랜틸 랙틴-산송띠(8.15)

렌틸 렉틴-종성띠(8.45)

렌틸 렉틴-염기성(8.65)

트립시노겐(9.30)

전극용액 : 양극용액=1M H₃PO₄

음극용액=1M NaOH

전기영동 ; 정전력 1W/cm 겔넓이, 10℃로 냉각, 90분.

염색 : 실버스테인 키트 사용.

전기 영동한 겔을 1cm 간격으로 잘라서 1ml의 증류수로 2일간 교반하며 추출한다. 전기영동후의 pH값을 측정하여 등전점을 계산한다.

분획 2의 등전점은 약 5.0으로 나타났고, 5.0에서 단일 띠로 이동한다. 분획 1은 약 5.2 및 5.0의 등전점을 갖고 두개의 띠로 이동한다.

(5) 아미노산 조정

분획 1 및 2 각각을(30μi) 12mm×120mm의 벽이 두껍고 단단한 파이렉스 유리 시험관의 바닥에 주의하여 넣고, 수산화나트륨 덩어리를 함유한 건조기에서 감압건조한다. 50μi의 4N 메탄-술폰산(0.2% 3-(2-아미노에틸)인돌함유, 피어스제조)을 시험관내의 건조된 시편에 가하고, 시험관의 공기를 0.1∼0.2mmHg로 1분간 빼내고 마개를 막는다. 시편을 118℃에서 24시간 이상의 기간동안 가열기내에서 가수분해한다. 시험관의 마개를 열과, 46μi의 4N 수산화나트륨으로 혼합물로 중화하고 시트르산 완충용액으로 희석하여 450μi를 만든다.

시편용액 250μi를 아미노산 분석기(모델 835, 히다찌사 제품)를 사용한 아미노산 분석에 사용한다. 분리된 아미노산은 O-프탈알데히드법으로 검출하고 순정아미노산을 사용하여 만든 검정곡선으로 정량한다.

표 2는 Phe(10몰)을 기준으로 구성 아미노산의 몰비를 나타낸다. 상기 분석조건에서는 Pro 및 Cys는 검출되지 않는다.

[표 2]

(6) 아미노산 서열

분획 1 및 2(150μi) 각각을 단백질 서열분석기(모델 470A, 어플라이드 바이오시스템스사)로 분석한다. 생성된 PTH-아미노산 각각을 100∼50μi의 33% 아세토니트릴수용액으로 적절히 희석하고, 희석액중 5μi를 크로마토그래피 컬럼에 워터스 710B의 자동시료 주입기로 주입한다. 크로마토그래피 시스템은 벡크만 모델 112 펌프 2개가 모델 421 조절기로 작동한다. 사용한 컬럼은 규격이 2mm×250mm이고 울트로스피어 ODS-5㎛로 충진된 것으로 컬럼 가열기로 55℃로 유지한다. 유속은 0.3ml/분이다. 20mM 소디움 아세테이트 및 아세토니트릴의 혼합물이 구배용리에 사용하였다. 흡광도는 269nm에서 측정한다. 45분간 분석을 수행한다.

40회 분석한 결과 두 분획이 하기 서열의 36번째 아미노산을 제외하고는 동일한 아미노산 서열이 같다는 것을 알았다.

분획 1의 36번째 아미노산(상기식의 X)은 Asn이고 이는 유전자 서열로부터 예측할 수 있고, 분획 2는 Asp이다.

분획 1이 식(A)의 폴리펩티드, 즉 IL-1α이고, 분획 2의 IL-1α의 36번째 아미노산이 Asp으로 치환된 본 발명의 유도체임을 알 수 있다. 상기한 본 발명의 폴리펩티드를 "폴리펩티드 Ⅰ"이라 한다.

IL-1α는 물질 자체로는 불안정하고 트리스-HCl 완충용액(pH 8.0)에 존재하면 더욱 안정한 폴리펩티드 Ⅰ으로 일부가 전환됨이 발견되었다.

[실시예 2]

(1) 본 발명의 폴리펩티드 Ⅰ의 제조 : 폴리펩티드 Ⅰ 발현 폴라스미드를 참고예 1에서 수득한 플라스미드 ptrpIL-1α-113을 사용하여 부위-특이성 변이유발법(Proc. Nat1. Acad. Sci., 81, 5662-5666(1984) : Science, 224, 1431(1984))으로 제조하고, 폴리펩티드 Ⅰ은 하기 서술된 대로 상기 플라스미드에서 제조한다.

M13mp 11파지 운반체는 단선 DNA기판으로 사용된다. EcoRI/BamHI DNA단편을 플라스미드 ptrpIL-1α-113에서 분리하고 EcoRI 및 BamHI 제한효소 부위에 M13mp 11파지(RF)에 끼워넣어 단선(SS) DNA(M13-IL-1α-113)을 얻고, 이를 변이유발 기판으로 사용한다.

합성 올리고 뉴클레오티드[5'ACTGGGTGAGCTTGGCAG‥3'(개시제)]를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 인산화하고 ss M13-IL-1α-113 DNA로 혼성화한다. 혼성화물을 접합시키고 dNTPs 존재하에서 DNA 폴리머라제 Ⅰ(클레노우 단편) 및 T4 DNA 리가제로 15℃에서 18시간 반응시킨다.

수득된 DNA를 JM 105 형질전환 가능 세포에 도입하여 형질전환한다. 생성된 파지 플라크(50콜로니)를 한천 평판상에서 니트로 셀룰로오즈 여과지에 접종하고 37℃에서 18시간 배양한다. 클론을 함유하는 여과지를 통상의 방법으로 알칼리 처리하여 변성시키고, 건조시킨 후 80℃에서 2시간 굽는다. 여과지를, 개시제를³²p-r-ATP로 표지하여 제조한³²P 탐침으로 상온에서 전혼성화 및 혼성화한다. 혼성화된 여과지를 상온에서 10분 그런후에 54℃에서 5분간 6_×SSC 완충용액으로 세척하고, 건조시킨 후에 -70℃에서 18시간동안 자동방사선 사진을 찍는다.

상기의 5개의 변이클론 중에서 M13-IL-1α-36D가 대표적 클론으로 선별되어, JM 105를 감염시키고 ss DNA 및 RF DNA를 제조한다.

ss DNA에 대해 M13 디데옥시뉴클레오티드 서열 분석을 행하여 상기 유전자의 변이를 확인한다.

JM 105로부터 RF DNA를 제조하고, 이어서 EcoRI/BamHI단편을 잘라내어, 상기 참고예와 같은 방식으로 발현 플라스미드에 도입하여 목적하는 폴리펩티드 Ⅰ 발현 플라스미드(IL-1α-36D)를 수득한다.

이 플라스미드를 사용하여, 실시예 1에서돠 같은 방법으로 폴리펩티드 Ⅰ을 발현시키고, 정제(DEAE-HPLC하면 단일의 GIF활성 피크가 나타난다)하여 하기 특성을 갖는 목적의 폴리펩티드 Ⅰ을 수득한다.

비활성 : 약 1×10⁷GIF 단위/mg 단백질.

[실시예 3]

(1) 본 발명 폴리펩티드 Ⅱ 및 Ⅲ의 제조

141번째 아미노산(Cys)가 Ser으로 치환된 IL-1α에 해당하는 본 발명의 폴리펩티드의 발현용 플라스미드 ptrpIL-1α-141S는 5'ACTGGGTGAGCTTGGCAG-3'를 개시제로 사용하여 실시예 2의 방법으로 제조한다.

상기 플라스미드로 실시예 1에서의 같은 발현 및 정제 과정을 반복한다. DEAE-HPLC하면 GIF 활성피크가 2개 나타난다. 피크 분획을 상기 방법으로 분석하고, 체류시간이 빠른 피크 분획이 유전자 서열에서 기대되는 본 발명의 폴리펩티드(폴리펩티드 Ⅲ), 즉 141번째 아미노산(Cys)가 Ser으로 치환된 IL-1α로 확인한다.

분석에 의하면 다른 분획은 본 발명의 폴리펩티드로서 36번째 아미노산(Asn) 및 141번째 아미노산(Cys)이 각각 ASP 및 Ser으로 치환된 IL-1α에 해당한다. 이 폴리펩티드는 이하 "폴리펩티드 Ⅱ"로 명한다.

[실시예 4]

(1) 본 발명 폴리펩티드 Ⅱ의 제조

실시예 3에서 수득한 플라스미드 ptrpIL-1α-141S를 사용하고 5'ATTCGAGCCGATGATCAG-3'을 개시제로 하여 실시예 3에서와 같은 방법으로 목적하는 폴리펩티드 Ⅱ의 발현용 플라스미드 ptrpIL-1α-36D141S를 제조한다. 상기 플라스미드를 HB101이 균주에 형질전환한다. 이 균주는 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-1295. 명칭"에 스케리아콜리 HB101/IL-1α-36D141S로 기탁되어 있다. 또한, 이 균주는 1987년 6월 2일자로 한국 종균협회에 KFCC-10375의 수탁번호로 기탁되었다.

상기 플라스미드를 사용하여 실시예 1에서와 같은 발현 및 정제과정을 반복하여 본 발명의 목적하는 폴리펩티드 Ⅱ를 수득한다.

SDS-PAGE는 상기 폴리펩티드가 분자량이 약 18kd임을 지적한다. 그외 등전점(PI)는 IEF에 의해 약 5.0으로 발견되었다.

폴리펩티드 Ⅱ 및 Ⅲ는 비활성(GIF활성)이 폴리펩티드 Ⅰ과 동등하다.

약제시험예 1

(1) GIF활성 및 LAF활성

본 발명 폴리펩티드의 GIF활성은 전에 서술하였고, 폴리펩티드 Ⅰ,Ⅱ 및 Ⅲ의 LAF활성을 GIF활성과 비교한다.

본 발명의 폴리펩티드를 하기와 같이 시험한다.

(2) 항암 활성시험

종양세포(200,000), "데트 A"를 BALB/C 새앙쥐(0일) 각각에 피내이식한다. 이식후 7일 및 8일째에, 첫번째 실험의 새앙쥐의 종양부위에 폴리펩티드 Ⅰ을 1마리당 0.3, 1 또는 3㎍의 양을 투여한다.

7마리를 1군으로 한다. 대조군에는 용매(1% 새앙쥐 혈청)를 같은 방식으로 투여한다.

시험 결과를 제 3 도에 나타내고, 여기에서는 종양세포 접종 후 경과한 날짜가 횡좌표로, 종양의 중량(mg)이 종좌표로 나타난다. 대조군은 곡선(1)로 표시되고, 0.3㎍의 폴리펩티드 Ⅰ을 투여한 군은 곡선 (2), 1㎍의 폴리펩티드 Ⅰ을 투여한 군은 곡선(3), 그리고 3㎍의 폴리펩티드 Ⅰ을 투여한 군은 곡선(4)로 표시된다. 종양의 중량은 평균 ±표준편차(SD)로 표시된다. *표는 스튜던트 T-테스트에서 P〈0.05임을 **표는 P〈0.01임을 나타낸다.

(3) CSF생산 촉진 효과 실험

(3) -1. 세포주 U-373MG(ATCC HTB17. 신경교아세포종, 신경교성세포종, 사람)를 사용하여 하기 시험을 수행한다.

상기 세포주를 10%FCS(GIBCO), MEM-필수아미노산 없음(Flow) 및 MEM소디움 피푸베이트(Flow)를 함유한 이글스 MEM배지(Eagle's MEM 니쓰이사 제품)에 2×105 세포/ml의 농도로 현탁시킨다. 시험할 폴리펩티드 Ⅰ을 여러가지 농도로 현탁액에 가입한다. 각 혼합물을 CO2 배양기에서 37℃로 24시간 배양한다.

배양 상층액을 수집하여 생산되어 상층액에 축적된 CSF의 양을 새앙쥐 골수세포를 사용하여 측정한다(Lewis, I.C. 등, J. Immunol, 128, 168(1982)).

결과를 제 4 도에 나타낸다. 여기에서 폴리펩티드 Ⅰ의 농도(ng/ml)를 횡축에 CSF활성(단위/ml, ×10^-2)을 종축에 나타낸다.

(3)-2. 폴리펩티드 I이 생체에 투여되면 생체내에서 CSF 생산을 촉진하는 활성을 나타냄을 실증하기 위해 하기의 동물시험을 수행한다.

정상의 새앙쥐(BALB/C, 일본국 시즈오까현의 실험동물협회에서 구입)여러가지 양의 폴리펩티드 Ⅰ을 정맥주사한다. 투여후 8시간만에 혈액을 채취하여 상기 (3)-1에서와 같이 CSF활성을 검사한다. 대조로서 인체 혈청알부민(HSA)를 같은 방법으로 시험대조군에 투여한다.

결과를 표 5에 나타낸다. 투여된 폴리펩티드 Ⅰ 또는 HSA의 양(㎍/새양쥐)은 횡축에 CSF활성(단위/ml혈청, ×10^-3)은 종축에 나타낸다.

(4) 소염효과시험

원터 등의 방법(Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 111, 544-547(1962)에 따라 하기 시험을 수행한다.

6-∼8-주생 수컷 쥐(스프라쿠에 다울레이주, 니톤 챨스 리버샤)를 실험하루전에 체중에 따라 6∼8마리의 군으로 분류한다. 식염수내 1% 카라기난(마린 콜로이드 산물)의 현탁액을 염증유발제로 오른쪽 뒷 발바닥에 0.1ml 피하주사하여 발을 붓게 한다. 붓는 정도를 평가하기 위해, 주사 전후의 일정기간에 플레티스모미터(Ugc-Vasile 제품)을 사용하여 발바닥부피를 측정한다. 주사로 인하여 증가된 부피의 주사전의 값에 대한 비율을 팽윤%로 계산한다.

시험할 물질을 둘베코의 PBS에 용해시켜, 그중 0.1ml을 염증 유발제 주사 1시간 전에 쥐의 등에 주사한다. 대조군에는 용매를 주사한다.

결과는 표 6에 나타나는데, 염증유발제 주사후 경과시간(시간)을 횡축에, 팽윤%를 종축에 나타낸다. 상기 도표에서, 대조군은 곡선(1), 0.1㎍의 폴리펩티드는 곡선(2), 0.1㎍의 폴리펩티드 Ⅰ의 곡선(3), 그리고 10㎍의 폴리펩티드 Ⅰ은 곡선(4)로 표시된다.

(5) 방사선 상해 예방효과 시험

1㎍ 또는 0.3㎍의 폴리펩티드 Ⅰ을 9주생 BALB/C 새앙쥐 각각의 복강에 투여하고 20시간 후에 치사량의 X-선을 조사한다.

새앙쥐는 X-선 조사기(MBR-1505R, 히다찌 메디코사 제품)로 850뢴트겐의 양을 조직적으로 조사한 후 생존을 매일 검사한다. 대조군에는 PBS를 투여한다.

결과를 제 7 도에서, 조사후 경과일 수는 횡축으로, 생존비율(%)은 종축으로하여 나타낸다. 1㎍의 폴리펩티드 Ⅰ이 투여된 군은 곡선(1), 0.3㎍의 폴리펩티드 Ⅰ이 투여된 군은 곡선(2), 그리고 대조군은 곡선 (3)으로 표현된다.

제 7 도는 대조군의 모든 새앙쥐는 X-선 조사후 18일만에 모두 죽은 반면에, 폴리펩티드 Ⅰ은 투여량에 따라 방사선 상해의 예방에 유효함을 보여준다. 1㎍이 투여된 군의 약 80%가 방사선 상해로 인한 죽음으로부터 살아남음을 알 수 있다.

(6) 기회주의적 감염예방 효과시험

모델 새앙쥐를 사용하여 하기 시험을 수행한다. 첫째날, 100mg/kg의 5-플루오로우라실(5-Fu, 교와하꼬사 제품)을 6주생 수컷 새앙쥐 ICR주(각 군당 7마리)에 정맥주사한다. 제 2, 4 및 6일에 본 발명의 폴리펩티드 Ⅰ을 새앙쥐에게 1㎍/새앙쥐의 양으로 피하주사한다. 7일째 되는날, 수도모나스 아에루게노사 E-2의 일정량을 새앙쥐의 복강에 주사하여 감염시킨다. 제10일에 생존한 동물의 수를 세어 생존율(5)을 계산한다.

결과는 제 8 도의 (1)∼(3)에 주어진다. 제 8 도(1)은 상기와 같이 처리한 군에서 수득한 결과를 제 8 도 (2)는 폴리펩티드 I은 투여되지 않고 5-Fu만 투여된 대조군에서 수득한 결과를 제 8 도(3)은 폴리펨티드 Ⅰ과 5-Fu이 둘다 투여되지 않은 대조군에서 수득한 결과를 나타낸다. 제 8 도에서 생존비율(%)은 종축에 하기량의 수도모나스가 주어진 A∼F군은 횡축에 표시한다.

(7) IL-1α의 CSF 생산 촉진효과 시험

CSF를 생산하는 태아의 폐섬유아세포(HFL-1, ATCC에 제 CCL-153호로 등록된 세포주)를 사용하여 하기 시험을 수행한다.

10% FCS를 함유하는 쥐세포 12K 배양물(Ham, R.G.Proc. Natl. Acad. Sci., 53, 288(1965))에 HFL-1 세포를 2×10⁵세포/ml의 농도로 현탁시킨다.

실시예 1에서 수득한 IL-1α를 여러 농도로 세포 현탁액에 가입한다. 각각의 혼합물을 CO₂배양기에서 37℃로 24, 48 또는 72시간 배양한다. 배양 상층액을 수집하여, 생산되어 상층액에 축적된 CSF의 양을 새앙쥐 골수세포를 사용(Lewis, I.C. 등, J. Immumol., 128, 168(1982))하여 측정한다.

결과를 하기의 표 3에 나타낸다.

[표 3]

상기 결과는 IL-1α를 가입하면 HFL-1α의 세포주의 CSF 생산이 촉진됨을 보여준다.

(8) 동물세포에서 시토카인을 제조하는 방법

HSB-2 C5B2세포(J. Immumol., 131, 1682-1689(1982))를 2×10⁵세포/홈의 양으로 0.01% PHA-P 및 여러가지 농도의 폴리펩티드 Ⅱ의 존재하에서 24시간 배양한다. 수집된 상층액의 IL-2의 활성을 새앙쥐 세포(CTLL2)의 IL-2를 사용하는 스미스의 방법(K.A. Smith 등. J. Immunol., 120, 2027(1978))으로 측정한다. 결과는 하기 표 4에 나타낸다.

[표 4]

상기 결과는 본 발명의 폴리펩티드를 사용하면 동물세포가 시토카인을 효율적으로 생산하게 됨을 보여준다.

상기 방법에 사용되는 본 발명의 폴리펩티드의 양은 매우 작아도 되고, 보통은 약 10ng/ml로서, 만족할만한 결과를 얻을 수 있고, 상기 폴리펩티드를 사용하면 유도된 시토카인의 정제가 용이하다.

(a) 동물세포에서 시토카인이 생산되면, 생산 유도용으로 사용되는 본 발명의 폴리펩티드는 반드시 지배적 조건하에서 구조가 안정하고 세포 표면의 IL-1수용기에 결합하여 시토카인 생산에 필요한 신호를 세포에 전달해야 한다.

따라서, 하기 시험을 본 발명 폴리펩티드를 섬유아세포 IL-1 수용기에 연결하여 수행한다.

6-홈 플레이트에 거의 균일하게 배양된 Balb/3T3 세포(클론 A31 : ATCC, CCL-163, 1×10⁶세포/홈)을 50000cpm/홈의¹²⁵I- 표지된 IL-1β(세이가가꾸(생화학) 58, NO. 8, 840(1986) ; 유럽특허 제 187991호) 및 10% FCS 첨가돈 D-MEN에서 37℃로 24시간 전배양한 IL-1β 또는 폴리펩티드 Ⅱ의 20ng/ml와 4℃에서 2시간 반응시킨다. 반응혼합액을 파스퇴르 피펫으로 뽑아내고, 10% FCS가 첨가된 D-MEN 1ml로 세포를 부드럽게 세척하여 상등액을 제거한다. 세척과정을 2회 반복한 후, 1% SDS 및 0.2N NaOH 혼합물 1ml로 세포를 용해시키고, 이 용액의 방사능(결합된 방사능) 및 세포세척에 사용된 용액의 방사능을 감마-계수기로 측정한다. 사용된¹²⁵I- 표지된 IL-1β는 볼튼 및 헌터의 방법(Biochem. j., 133, 529(1973))으로 제조 및 정제한다.

비활성 : 최소한 250μCi/㎍ 단백질.

표 5에 결과를 나타낸다.

[표 5]

상기식에서 A : 표시되지 않은 폴리펩티드 Ⅰ의 부재시 결합된 방사능, B : 결합된 방사능의 실험지, C : 플레이토에 특이적으로 흡착된 방사능.

상기 지수는 IL-1수용기에 함께 존재하는 IL-1β 또는 폴리펩티드 Ⅱ의 결합활성을 나타낸다. 부수적으로 IL-1α 및 IL-1β가 IL-1 수용기에 대하여 공통임을 공지되어 있다.

표 5는 폴리펩티드 Ⅱ가 시토카인 유발-생산조건하에서도 IL-1 수용기에 대한 만족스러운 결합능을 보유함을 나타내고, 따라서 상기한 용도에 유용하다.

[제조예 1]

GIF 활성을 계산하여, 1×107단위/ml의 폴리펩티드 Ⅰ의 식염수 용액에 인형청 알부민(HSA)을 0.5%의 농도로 가입하고 여과(0.22㎛ 막여과지)하여, 멸균상태로 각 바이알당 1ml씩 넣고, 주사용 제제로 동결건조 한다.

상기 제제는 1ml 증류수에 용해하여 주사용으로 사용된다.

Claims

하기 식(A)에서 36위치의 Asn 및 141위치의 Cys중 적어도 어느 하나가 결핍되거나 다른 아미노산으로 치환된 변형된 IL-1α 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 IL-1α 유도체를 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 운반체를 갖는 재조합 미생물을 배양하여 상기 유도체를 생성시키고 생성된 유도체를 수집함을 특징으로 하는 IL-1α 유도체의 제조방법.

식(A) :
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 식(A)에서 적어도 36위치의 Asn이 결핍되거나 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 IL-1α 유도체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 식(A)에서 36위치의 Asn이 Asp로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 IL-1α 유도체의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 식(A)에서 36위치의 Asn 및 141위치의 Cys가 각각 Asp 및 Ser으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 IL-1α 유도체의 제조방법.
IL-1α를 코딩하는 유전자의 핵산 서열을 변형시켜 제 1 항에 정의된 폴리펩티드의 변형된 아미노산 서열을 갖는 유전자를 수득함을 특징으로 한는 제 1 항에 정의된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 제조방법.
제 5 항의 방법으로 수득한 유전자를 상기 유전자가 발현되도록 하는 위치의 운반체에 삽입함을 특징으로 하는, 제 1 항에 정의된 폴리펩티드용 형질 발현 유도체의 제조방법.
제 6 항의 방법으로 수득한 발현 운반체를 숙주세포에 도입함을 특징으로 하는 재조합 미생물의 제조방법.