DE3750432T2

DE3750432T2 - IL-1 alpha Derivate und Medikamente.

Info

Publication number: DE3750432T2
Application number: DE3750432T
Authority: DE
Inventors: Yoshikatsu - Hirai; Yeong-Man Sanraunjihausu Hong; Kiyoshi - Ishii; Mayumi - Kaneta; Kazuyoshi Haitsu Soreiyu Kawai; Yoshikazu Haitsu-Date Kikumoto; Satoru - Nakai; Setsuko - Takegata; Yasuo Yanagihara
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-03-14
Filing date: 1987-03-12
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2007-03-13
Also published as: DK127787A; US5371204A; DE3750432D1; EP0237073A2; KR950000886B1; US5008374A; DK51493D0; US5342615A; ES2009216A6; JP2572220B2; KR870009023A; EP0578278A1; EP0237073A3; DK127787D0; US5702698A; EP0237073B1; DK51493A; DK171647B1; HK1003115A1; DK172339B1

Description

Die vorliegenden Erfindung betrifft neue Polypeptide, insbesondere neue Derivate von Interleukin-1α (IL-1α) und die medizinische Anwendung der neuen Derivate davon.
Der Zweite Internationale Lymphokin-Workshop beschloß einen einheitlichen Namen, Interleukin-1 (IL-1), für die physiologisch aktiven Stoffe festzulegen, die als Lymphocten-Aktivierungsfaktor (LAF), mitogenes Protein, Helfer-Peak-1, T-Zell-Ersatzfaktor III (TRF-III), T-Zell-Ersatzfaktor MΦ (TRFM), B-Zell-Aktivierungsfaktor, B-Zell-Differenzierungsfaktor, etc. bezeichnet wurden (Cellular Immunol. 48 (1979), 433- 436). Diese Entscheidung basierte auf der Tatsache, daß diese physiologisch aktiven Stoffe voneinander nicht als unterschiedliche Stoffe unterschieden werden können; sondern sie werden nur mit Bezug auf die physiologische Aktivitäten, die aus unterschiedlichen Blickwinkeln interpretiert werden, verschieden bezeichnet.
Weiter wird berichtet, daß IL-1 T-Lymphocyten und B-Lymphocyten aktiviert, die Produktion von Interleukin-2 und Antikörpern fördert, in Lebergeweben die Proteinsynthese fördert und die Wirksamkeit besitzt, die Produktion von Prostaglandinen zu fördern (vgl. Reviews of Infectious Disease, Bd. 6 (1984), Nr. 1, 51-59; New England J. of Med. 311 (1984), 1413, etc.).
Während der Stoff IL-1 selbst noch völlig aufgeklärt werden muß, wurden kürzlich Berichte über das Vorhandensein von Genen veröffentlicht, die Polypeptide codieren, die LAF-Aktivität aufweisen, oder Vorläufer davon (Proc. Natl.
Acad. Sci., Bd. 81 (1984), 7907-7911; Nature, Bd. 315 (1985), 641; Nucleic Acid Research, Bd. 13 (16) (1985), 5869).
Nach diesem Bericht wurde festgestellt, daß ein Kulturüberstand, der durch gentechnische Rekombinationsverfahren erhalten wurde, LAF-Aktivität aufweist, und basierend auf dieser Entdeckung nimmt man an, daß das durch die folgende Formel (A) dargestellte Polypeptid ein Polypeptid ist, das LAF-Aktivität aufweist, und es wird bezeichnet als "IL-1α".
Es wurden jedoch weder Berichte über die Herstellung und Isolierung des vorstehenden aktiven Stoffes und des physiologisch aktiven Stoffes, der in der Literatur als sogenanntes IL-1 bekannt ist, als homogener Stoff veröffentlicht, noch gab es einen Bericht über die physiologische Aktivität eines solchen homogenen Stoffs.
Wir betrieben eine intensive Forschung über IL-1α als einen homogenen Stoff und etablierten bereits ein Verfahren zur Herstellung dieses Stoffs und klärten die Eigenschaften, die physiologische Aktivität, etc. davon auf. Basierend auf diesen Forschungsergebnissen bestätigten wir auch, daß das Polypeptid der vorstehenden Formel (A) LAF-Aktivität aufweist.
Nichtsdestoweniger machten wir die überraschende Feststellung, daß das Polypeptid, obwohl es wie berichtet einem Gen des lebenden Körpers entspricht, als Stoff nicht stabil ist.
Eine Aufgabe der vorliegende Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung eines neuen Polypeptids (IL-1α-Derivat), das sich vom Polypeptid der Formel (A) in der Aminosäuresequenz unterscheidet, als Stoff stabiler ist und geeignete Eigenschaften für medizinische Anwendungen aufweist.
Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Bereitstellung einer neuen medizinischen Zusammensetzung, die das IL-1α-Derivat umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Gen bereit, das ein neues IL-1α-Derivat codiert und ein Verfahren zur Herstellung des IL-1α-Derivats, d. h. eines Polypeptids, durch gentechnische Verfahren unter Verwendung des Gens.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Polypeptid bereit, das eine modifizierte Aminosäuresequenz von Interleukin-1α aufweist, dargestellt durch die vorstehende Formel (A), wobei mindestens ein Aminosäurerest, ausgewählt aus Asn in Position 36 und Cys in Position 141, fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Auf die Aminosäuren und das Polypeptid wird hier durch Symbole gemäß der Nomenklatur oder den Regeln, die durch die IUPAC und IUPAC-IUB empfohlen wurden, oder durch Symbole, die auf dem Fachgebiet üblich sind, verwiesen. Die Nucleinsäuren in den Basensequenzen werden in ähnlicher Weise bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen IL-1α-Derivate weisen physiologische Aktivitäten auf, wie LAF-Aktivität, die Aktivität, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen (GIF-Aktivität), d. h. die Aktivität, das Wachstums von Tumorzellen spezifisch zu hemmen, die Aktivität, die Produktion verschiedener Cytokine zu fördern, wie den Koloniestimulierenden Faktor (CSF), Interferon (IFN), Interleukin-2 (IL-2) und Interleukin-3 (IL-3), d. h. die Aktivität, die Produktion solcher Cytokine, zum Beispiel bei menschlichen Zellen, stark zu fördern, entzündungshemmende Aktivität, d. h. zum Beispiel, die Aktivität das Fortschreiten von Arthritis wirksam zu hemmen, wenn sie Modelltieren mit Arthritis verabreicht wurden, und die Aktivität einer durch Strahlen verursachten Verletzung vorzubeugen, d. h. die Aktivität, möglichen Störungen des lebenden Körpers oder ernsten Nebenwirkungen vorzubeugen, die durch eine systematische Bestrahlung während einer Knochenmarktransplantation, durch Bestrahlung zur Behandlung von Krebserkrankungen und durch einen Strahlenunfall entstehen würden. Die vorliegenden Derivate sind demgemäß als Stimulanzien des Immunsystems sehr nützlich, zum Beispiel zur Förderung der Produktion von Antikörpern und zur Steigerung der Wirkung von Impfstoffen, Antitumormitteln, Mitteln zur Förderung der Produktion von Cytokinen, wie CSF, IFN, IL-2 und IL-3, entzündungshemmenden Mitteln, Mitteln zur Vorbeugung einer durch Strahlen verursachten Verletzung und anderen ähnlichen medizinischen Mitteln. Insbesondere weisen die erfindungsgemäßen Polypeptide das Merkmal auf, ein äußerst stabiler Stoff zu sein und eine geringe Toxizität aufzuweisen. Ferner ist IL-1 bekannt dafür, das es pyrogenetisch ist, während das erfindungsgemäße Polypeptid äußerst wenige solcher Nebenwirkungen aufweist.
Die erfindungsgemäßen Derivate sind insbesondere als Mittel zur Förderung der CSF-Produktion wirksam. Zum Beispiel heilt das Derivat, wenn es dem Mensch verabreicht wird, wirksam Granulocytopenie, die auf einer gestörten Knochenmarkbildung aufgrund einer Chemotherapie oder Strahlentherapie zur Behandlung von Krebserkrankungen beruht, ohne daß es Virusinfektionen oder Antigen-Antikörper-Reaktionen zur Folge hat (Arzneimittel zur Heilung von Granulocytopenie). Das Mittel zur Förderung der CSF-Produktion ist auch zur Vorbeugung und Heilung verschiedener Krankheiten aufgrund der Aktivität von CSF nützlich, dessen Produktion durch das Mittel wie beabsichtigt gefördert wird. Zum Beispiel dient CSF dazu, die Funktion von Granulocyten und Makrophagen zu fördern (Lopez A.F. et al., J. Immunol. 131 (1983), 2983; Handam E. et al., gleiche Zeitschrift 122 (1979), 1134, und Vadas M.A. et al., gleiche Zeitschrift 130 (1983), 795), so daß die klinische Anwendung von CSF zur Vorbeugung und Heilung verschiedener Infektionen erwartet wird. Ähnlich wird erwartet, daß das Mittel zur Förderung der CSF-Produktion für die klinische Anwendung nützlich sein wird.
In den letzten Jahren wurde festgestellt, daß angepaßte Wirte mit gestörter biophylaktischen Fähigkeit an sogenannten opportunistischen Infektionen oder unheilbaren Infektionen leiden, die auftreten wenn harmlose Krankheitserreger pathogen werden. Klinisch sind diese Infektionen Krankheitserregern zuzuschreiben, einschließlich gram-negativen Bacillen, wie Pseudomonas und Serratia, Viren, wie das Herpes-simplex-Virus (HSV), Varicella-Zoster-Virus (VZV) und das Cytomegalievirus (CMV), Pilzen, wie Candida albicans, Aspergillus fumigatus und Nocardia asteroidea, Protozoen, wie Pneumocystis carinii und Toxoplasma gondii, etc. Da die derzeit verwendeten Antibiotika gegen die opportunistischen Infektionen nicht voll wirksam sind, ist es wünschenswert, Forschung zu betreiben und neue Arzneimittel für solche Infektionen zu entwickeln. Die vorliegenden Derivate sind auch bei der Vorbeugung und Heilung opportunistischer Infektionen wirksam, die besonders häufig auftreten, wenn Antikrebsmittel verabreicht werden. Zum Beispiel sind sie zur Vorbeugung und Heilung verschiedener Infektionen nützlich, die sich während einer Chemotherapie bei akuter Leukämie und einer Knochenmarktransplantation entwickeln, wie Candidose, Cryptococcose, Aspergillose, Zygomycose, Chromomycose, Virusinfektionen, Cytomegalievirus- Pneumonie und Komplikationen dieser Infektionen.
Weiter ist das erfindungsgemäße Polypeptid bei der Vorbeugung und Heilung von Arthritis oder ähnlichem wirksam und daher als entzündungshemmendes Mittel nützlich.
Das erfindungsgemäße Polypeptid weist die Aktivität auf, das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen (nachstehend bezeichnet als "GIF-Aktivität)", wie durch das Verfahren, das in dem folgenden Beispiel beschrieben wird, bestimmt wurde und es wirkt spezifisch auf verschiedene Tumorzellen, wobei deren Wachstum gehemmt wird. Die Antitumorzusammensetzung, die das vorliegende Polypeptid als aktiven Bestandteil umfaßt, ist also vorteilhafterweise als chemotherapeutisches Mittel zur Behandlung von Krebserkrankungen verwendbar, besonders in Kombination mit verschiedenen Mitteln zur Behandlung maligner Tumoren, um eine Verkürzung der Therapie zu unterstützen und zur Verkürzung der Langzeittherapie.
Ergänzend zu den vorangegangenen therapeutischen Zwecken, kann das erfindungsgemäße Polypeptid zum Beispiel außerdem bei der Herstellung nützlicher Cytokine in vitro aus einem Zellstamm aufgrund der Aktivität, die Produktion von Cytokinen zu fördern, wirksam verwendet werden. Bei natürlichen Cytokinen ist die Aufmerksamkeit auf die Herstellung von Cytokinen vom Glycoproteintyp gerichtet, die von einem Zellstamm hergestellt werden. Nützliche Cytokine können in großen Mengen effizient hergestellt werden.
Aufgrund unserer Forschung wurden neue biologische Aktivitäten von IL-1α entdeckt. Das erfindungsgemäße IL-1α weist GIF-Aktivität auf und die Aktivität, die Produktion von CSF zu fördern, und kann für diese therapeutischen Zwecke aufgrund dieser biologischen Aktivitäten verwendet werden.
Unter den erfindungsgemäßen Polypeptiden werden jene bevorzugt, die die durch Formel (A) dargestellte Aminosäuresequenz aufweisen, wobei mindestens Asn in Position 36 fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Die Aminosäure, die Asn in Position 36 und Cys in Position 141 ersetzen kann, kann der Rest jeder der α-Aminosäuren sein, aus denen die Proteine des lebenden Körpers gebildet werden. Im Hinblick darauf, daß Cys wegen der SH-Gruppe wahrscheinlich eine inter- oder intramolekulare Bindung eingeht, sind bevorzugte Aminosäuren andere als Cys. Asp wird besonders für das Ersetzen von Asn in Position 36 bevorzugt und Ser wird für das Ersetzen von Cys in Position 141 bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können zum Beispiel durch gentechnische Verfahren unter Verwendung eines Gens, das das erfindungsgemäße spezifische Polypeptid codiert, hergestellt werden, d. h. durch Einschleusen des Gens in einen Mikroorganismusvektor, um die Replikation, Transkription und Translation in der Zelle des Mikroorganismus zu beeinflussen. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, weil es eine Massenproduktion ermöglicht.
Obwohl das in diesem Verfahren verwendete Gen durch die chemische Synthese von Nucleinsäuren durch ein übliches Verfahren vollständig synthetisiert werden kann, zum Beispiel durch das Phosphittriesterverfahren (Nature 310 (1984), 105) oder ein ähnliches, ist es günstig, das Gen, das IL-1α oder einen Vorläufer davon codiert, zu verwenden. Durch ein herkömmliches Verfahren, das die vorstehende chemische Synthese einschließt, wird das Gen zu einer Nucleinsäuresequenz modifiziert, die die vorstehende spezifische Aminosäuresequenz codiert, wodurch das gewünschte Gen einfach hergestellt werden kann.
Das Gen, das IL-1α oder einen Vorläufer davon codiert, ist bereits bekannt. Wir erhielten das Gen, das IL-1α codiert, und hatten bei der Herstellung von IL-1α durch gentechnische Verfahren unter Verwendung dieses Gens Erfolg. Die Reihenfolge der eingesetzten gentechnischen Verfahren wird in den folgenden Referenzbeispielen beschrieben.
Die vorstehend erwähnte modifizierte Sequenz der Nucleinsäuren (Basen) wird ebenfalls durch ein bekanntes Verfahren hergestellt, das entsprechend der Aminosäuresequenz des gewünschten Polypeptids ausgeführt wird (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
Zum Beispiel kann die Spaltung, Ligierung, Phosphorylierung, etc. der DNA durch übliche Verfahren ausgeführt werden, einschließlich der Behandlung mit Enzymen, wie Restriktionsenzyme, DNA-Ligase, Polynucleotidkinase und DNA-Polymerase, die im Handel leicht erhältlich sind. Die Isolierung und Reinigung des Gens und der Nucleinsäuren, die in diesen Verfahren eingeschlossen sind, werden ebenfalls auf übliche Weise durchgeführt, zum Beispiel durch Agarose-Gelelektrophorese. Wie teilweise später beschrieben, wird das erhaltene Gen unter Verwendung eines üblichen Vektors repliziert. Das DNA- Fragment, das die gewünschte Aminosäuresequenz codiert, und synthetische Linker können durch die vorstehend erwähnte Synthese ebenfalls einfach hergestellt werden. Das Codon, das der gewünschten Aminosäure entspricht und das in den vorstehenden Verfahren verwendet wird, ist bekannt und wird ausgewählt wie gewünscht. Für diesen Zweck kann ein übliches Verfahren verwendet werden, zum Beispiel im Hinblick auf die Verwendungshäufigkeit des Codons im verwendeten Wirt (Nucl. Acids Res. 9 (1981), 43-74). Ferner kann zur Modifikation des Codons in der betreffenden Nucleinsäuresequenz ein übliches Verfahren angewendet werden, zum Beispiel eine stellenspezifische Mutagenese (Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 5662-5666), die einen Primer (etwa 15-30 Mer) einsetzt, der ein synthetisches Oligonucleotid umfaßt, das die gewünschte modifizierte Sequenz codiert.
Das gewünschte Gen, das durch das vorangegangene Verfahren erhalten wurde, kann auf seine Basensequenz untersucht werden, zum Beispiel durch das chemische Maxam-Gilbert-Modifikationsverfahren (Meth. Enzym. 65 (1980), 499-560) oder durch das Didesoxynucleotidkettenterminationsverfahren unter Verwendung des M13-Phagen (Messing J. und Vieira J., Gene 19 (1982), 269-276)
Obwohl der vorstehende Prozeß und Verfahren dafür in den folgenden Referenzbeispielen und Beispielen beschrieben werden, ist das Verfahren nicht besonders begrenzt; jedes bereits auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren kann angewendet werden.
So stellt die vorliegende Erfindung auch ein neues Gen bereit, das ein Polypeptid mit der vorstehend spezifizierten Aminosäuresequenz codiert (das Gen wird nachstehend bezeichnet als "vorliegendes Gen" ("present gene")).
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann durch übliche bekannte Rekombinationstechniken unter Verwendung des vorliegenden Gens hergestellt werden. Insbesondere wird es durch Präparation einer rekombinanten DNA, die das vorliegende Gen in Wirtszellen exprimieren kann, Einschleusen der DNA in die Wirtszelle und Inkubation der Transformante hergestellt.
Nützliche Wirtszellen können entweder eukaryontische oder prokaryontische Zellen sein. Die eukaryontischen Zellen schließen Zellen von Wirbeltieren, Hefen, etc. ein. Im allgemeinen werden als Zellen von Wirbeltieren zum Beispiel COS-Zellen verwendet, die aus dem Affen isoliert wurden (Gluzman Y., Cell 23 (1981), 175-182), ein Stamm von Ovarzellen des Chinesischen Hamsters, der einen Dihydrofolatsäure-Reduktasemangel aufweist (Urlaub G. und Chasin L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (1980), 4216-4220, USA), etc., obwohl nützliche Zellen nicht auf diese Zellen begrenzt sind. Nützliche Expressionsvektoren von Wirbeltierzellen sind solche, die einen Promotor aufweisen, der stromaufwärts des zu exprimierenden Gens, der RNA-Splicing-Stellen, der Polyadenylierungsstelle, der Transkriptionterminationssequenz, etc. positioniert ist. Diese Vektoren können ferner einen Replikationsursprung aufweisen, sofern dies erforderlich ist. Beispiele nützlicher Expressionsvektoren schließen pSV2dhfr ein, der einen Initiationspromotor von SV40 aufweist (Subramani S., Mulligan R. und Berg P., Mol. Cell. Biol. 1 (9), 854-864), dies bedeutet keine Einschränkung.
Hefen werden häufig als eukaryontische Mikroorganismen verwendet, unter denen jene der Gattung Saccharomyces im allgemeinen geeignet sind. Beispiele häufiger Expressionsvektoren von Hefen und ähnlichen eukaryontischen Mikroorganismen schließen pAM82 ein, der einen Promotor für das saure-Phosphatase-Gen aufweist (Miyanohara A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983), 1-5, USA), etc.
Im allgemeinen werden E. coli und Bacillus subtilis als prokaryontische Wirte verwendet. Die vorliegende Erfindung setzt zum Beispiel Plasmidvektoren ein, die im Wirt replizieren können. Um das Gen im Vektor zu exprimieren, können Expressionsplasmide verwendet werden, die einen Promotor und eine SD-Basensequenz (Shine-Dalgarno) stromaufwärts des Gens aufweisen und die Sequenz ATG, die zur Initiation der Proteinsynthese erforderlich ist. Ein häufig als Wirt verwendetes E. coli ist der E. coli-Stamm K12. pBR322 ist ein allgemein verwendeter Vektor. Jedoch sind diese Prokaryonten nicht begrenzend und verschiedene bekannte Stämme und Vektoren sind verwendbar. Beispiele geeigneter Promotoren sind der Tryptophan- Promotor, PL-Promotor, lac-Promotor, 1pp-Promotor, etc. Das Gen kann unter Verwendung einer dieser Promotoren exprimiert werden.
Um das Verfahren unter Bezug auf den Fall zu beschreiben, in dem der Tryptophan-Promotor verwendet wird, wird der Vektor pTM1 (Fumio Imamoto, Taisha (Metabolism), Bd. 22 (1985), 389), der den Tryptophan-Promotor und die SD-Sequenz aufweist, als ein Expressionsvektor verwendet. Ein Gen, das das gewünschte erfindungsgemäße Polypeptid codiert und eine ATG-Sequenz aufweist, sofern dies erforderlich ist, wird an die Restriktionsenzymsstelle ClaI gebunden, die stromabwärts der SD-Sequenz vorliegt.
Nicht nur das direkte Expressionssystem sondern auch ein Fusionsprotein-Expressionssystem ist verwendbar, das zum Beispiel die β-Galactosidase, β-Lactamase oder ähnliches einsetzt.
Der so erhaltene Expressionsvektor wird in die Wirtszellen eingeschleust, die auf diese Weise durch übliche Verfahren transformiert werden. Zum Beispiel werden Zellen gesammelt, die sich hauptsächlich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, die mit CaCl&sub2; behandelt werden, damit sie die DNA leicht aufnehmen, worauf der Vektor in die Zellen eingeschleust wird. Bei diesem Verfahren kann MgCl&sub2; oder RbCl zusammen mit dem Vektor vorliegen, wobei eine verbesserte Transformationseffizienz erzielt wird, wie es allgemein bekannt ist. Die Zelle kann vor der Transformation in einen Sphäroplast oder Protoplast umgewandelt werden.
Die so erhaltene gewünschte Transformante kann in üblicher Weise inkubiert werden, wodurch das gewünschte Polypeptid hergestellt und angereichert wird. Das Medium für die Inkubation kann jedes Medium der Medien sein, die im allgemeinen zum Inkubieren von Zellen verwendet werden, wie L-Medium, E-Medium, M9-Medium, etc. Verschiedene Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine, etc., die allgemein bekannt sind, können diesen Medien beigemischt werden. Wenn der Tryptophan-Promotor verwendet wird, ist zum Beispiel das M9-Minimalmedium geeignet, dem üblicherweise Casaminosäure zur Beeinflussung der Wirkung des Promotors beigemischt wird. Eine Chemikalie zur Verstärkung der Wirkung des Tryptophan-Promotors, wie Indolacrylsäure, kann dem Medium in einem geeigneten Inkubationsstadium zugegeben werden.
Das gewünschte erfindungsgemäße Polypeptid kann aus der so erhaltenen Kultur isoliert und durch übliche Verfahren gereinigt werden. Es ist wünschenswert das Polypeptid aus dem Wirt unter einer milden Bedingung zu extrahieren, anstatt durch einen osmotischen Schock, um die höhere Strukturordnung des Polypeptids aufrechtzuerhalten.
Das vorstehende Isolierungs- und Reinigungsverfahren wird im wesentlichen mit dem gleichen Verfahren durchgeführt, das üblicherweise zum Abtrennen eines proteinähnlichen Stoffs von einem biologischen Stoff angewendet wird. Beispielsweise sind verschiedene Verfahren verwendbar, die physikalische oder chemische Eigenschaften des gewünschten Polypeptids ausnutzen (vgl. zum Beispiel "Biological Data Book II", 1175-1259, erste Auflage, Erstdruck 23. Juni 1980, veröffentlicht durch Kabushiki Kaisha Tokyo Kagakudojin). Beispiele für nützliche Verfahren sind die Behandlung mit einem üblichen Proteinfällungsmittel, Ultrafiltration, Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), Flüssigkeits-Chromatographie, Zentrifugation, Elektrophorese, Affinitätschromatographie, Dialyse und Kombinationen dieser Verfahren.
Das gewünschte Polypeptid wird aus dem Überstand teilweise gereinigt abgetrennt. Diese teilweise Reinigung wird zum Beispiel durch eine Behandlung ausgeführt, die als Proteinfällungsmittel ein organisches Lösungsmittel verwendet, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Propanol oder Dimethylformamid (DMF) oder ein saures Reagenz, wie Essigsäure, Perchlorsäure (PCA) oder Trichloressigsäure (TCA), eine Behandlung mit einem Aussalzmittel, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Natriumphosphat, und/oder Ultrafiltration unter Verwendung einer Dialysemembran, Flachmembran, Hohlfasermembran oder ähnlichem. Diese Behandlungen werden wie üblich unter üblichen Bedingungen durchgeführt.
Das so erhaltene grob gereinigte Produkt wird dann einer Gelfiltration unterzogen, wodurch eine Fraktion gesammelt wird, die die Aktivität des gewünschten Stoffs zeigt. Nützliche Gelfiltrationsmittel sind nicht besonders begrenzt. Solche Mittel schließen jene ein, die aus Dextrangel, Polyacrylamidgel, Agarosegel, Polyacrylamid-Agarosegel, Cellulose oder ähnlichem hergestellt wurden. Beispiele nützlicher im Handel erhältlicher Mittel sind Sephadex G-Typ, Sephadex LH-Typ, Sepharose-Typ, Sephacryl-Typ (alle Produkte von Pharmacia Fine Chemicals AB), Cellofine (Chisso Corporation), Biogel P-Typ, Biogel A-Typ (beide Produkte von Bio-Rad- Laboratories), Ultro-Gel (LKB-Podukter AB), TSK-G-Typ (Produkt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.), etc.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann aus der Fraktion als homogener Stoff isoliert werden, zum Beispiel durch Affinitätschromatographie der Fraktion unter Verwendung einer Hydroxyapatitsäule, durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie, wie dem DEAE-, CM- oder SP-Verfahren, Chromatographisches Fokussierungs-Verfahren, Umkehrphasen-Hoch1eistungsflüssigkeits-Chromatographie oder ähnliches, oder durch eine Kombination dieser Verfahren.
Das Chromatographische Fokussierungs-Verfahren kann durch verschiedene bekannte Verfahren ausgeführt werden. Als Säule verwendbar ist zum Beispiel PBE94 (Pharmacia) oder ähnliches, als Ausgangspuffer zum Beispiel Imidazol-Salzsäure oder ähnliches, und als Elutionsmittel zum Beispiel das Gemisch von Polypuffer 74 (Pharmacia) und Salzsäure (pH 4,0) oder ähnliches.
Die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie kann zum Beispiel mit einer C&sub4;-HiPore-Umkehrphasen-HPLC- Säule (Bio-Rad-Laboratories) oder ähnlichem durchgeführt werden, unter Verwendung von Acetonitril, Trifluoressigsäure (TFA), Wasser oder ähnlichem, oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel als Elutionsmittel.
Auf diese Weise kann das erfindungsgemäße IL-1α-Derivat (Polypeptid) nach der Isolation gewonnen werden. Durch ein ähnliches Genrekombinationsverfahren liefert das Gen, das IL-1α codiert, IL-1α.
Das erfindungsgemäße IL-1α und Derivate davon, die, wie bereits festgestellt, hervorragende pharmakologische Aktivitäten aufweisen, können in nützliche Präparate für die vorstehend erwähnten medizinischen Anwendungen formuliert werden.
Beispiele solcher medizinischen Präparate schließen Immunstimulatoren zur Produktion von Antikörpern, zur Steigerung der Wirkung von Impfstoffen und Heilung einer Immunschwäche ein, sowie Antitumormittel, Promotoren der Cytokinproduktion, entzündungshemmende Mittel, Mittel zur Vorbeugung oder Heilung einer durch Strahlung verursachten Krankheit, Mittel zur Vorbeugung oder Heilung opportunistischer Infektionen, etc. Diese medizinischen Präparate werden üblicherweise in Form von Arzneimitteln formuliert, die eine pharmakologisch wirksame Menge von IL-1α oder eines erfindungsgemäßen Derivats davon und einen geeigneten Träger umfassen. Beispiele für nützliche pharmazeutische Träger schließen Excipienten und Verdünnungsmittel ein, wie Füllstoffe, Streckmittel, Bindemittel, ein Benetzungsmittel, Sprengmittel, grenzflächenaktives Mittel, etc., die im allgemeinen zur Herstellung von Arzneimitteln der gewünschten Form verwendet werden, die angewendet werden soll. Die Form der Arzneimittel ist nicht besonders begrenzt, sofern sie eine wirksame Menge des vorliegenden Polypeptids oder von IL-1α enthält, aber sie kann zum Beispiel in Form von Tabletten, Pulver, Granula, Kügelchen oder einem ähnlichen festen Präparat vorliegen. Üblicherweise ist es jedoch günstig, daß die Zusammensetzung in Form einer Lösung, Suspension, Emulsion oder ähnlichem zur Injektion vorliegt. In einer anderen Ausführungsform kann eine solche Zusammensetzung ein Trockenprodukt sein, das vor dem Gebrauch durch die Zugabe eines geeigneten Trägers verflüssigt wird. Die vorstehend erwähnten Arzneimittel können durch übliche Verfahren hergestellt werden.
In Übereinstimmung mit der Form des erhaltenen Arzneimittels wird die Zusammensetzung über einen geeigneten Weg verabreicht. Zum Beispiel werden Arzneimittel zur Injektion intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan, intraperitoneal oder auf andere Weise verabreicht. Die feste Zusammensetzung wird oral oder intraintestinal verabreicht. Die Menge des aktiven Bestandteils der Zusammensetzung und die Dosierung der Zusammensetzung wird gemäß dem Verfahren und der Verabreichungsform, dem Verwendungszweck, den Symptomen des Patienten, etc. geeignet bestimmt und ist nicht genau festlegbar. Im allgemeinen ist es wünschenswert eine Menge von etwa 1 bis etwa 80 Gew.-% des aktiven Bestandteils in das Arzneimittel einzuarbeiten und das Präparat an Erwachsene mit einer täglichen Dosis von etwa 0,1 ug bis etwa 10 mg, bezogen auf den aktiven Bestandteil, zu verabreichen. Das Präparat muß nicht immer nur einmal am Tag verabreicht werden, aber es kann täglich in drei oder vier aufgeteilten Dosen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
In den folgenden Beispielen werden physiologische Aktivitäten durch die folgenden Verfahren bestimmt.

(1) Bestimmung der IL-1α-Aktivität

Ausgedrückt als LAF-Aktivität, wie sie unter Verwendung von Thymuszellen einer Maus des C3H/HeJ-Stamms mit dem Verfahren von J.J. Oppenhein et al. (J. Immunol. 116 (1976), 1466) gemessen wurde.

(2) Bestimmung der GIF-Aktivität

Portionen der Testlösung (0,1 ml) zu unterschiedlichen Konzentrationen verdünnt, wurden in Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Corning Glass Works) gefüllt; dann wurde in jede Vertiefung 0,1 ml Eagle-MEM-Suspension mit 10% FCS gefüllt, die menschliche Melanomzellen A375 in einer Menge von 2 · 10&sup4; Zellen/ml enthielt, und die Zellen wurden in einem CO&sub2;-Brutschrank (Napco Co., Ltd.) vier Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurde in jede Vertiefung 0,05 ml 0,05%iges Neutralrot (Wako Pure Chemical Ind. Ltd.) gefüllt, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 2 Stunden. Nach Entfernen des Überstandes wurde in jede Vertiefung vorsichtig 0,3 ml Phosphorsäure-gepufferte Kochsalzlösung zum Waschen gegossen. Nach Entfernen der Waschlösung wurde in jede Vertiefung 0,1 ml eines Gemisches aus äquivalenten Mengen monobasischem Natriumphosphat und Ethanol gefüllt; die Platte wurde mehrere Minuten mit einem Mikromixer geschüttelt und die Menge des in die Zelle aufgenommenen Farbstoffs wurde bei einer Absorption von 540 nm mit einem Photometer für Mikrotitrationsplatten mit 96 Vertiefungen gemessen (Titer Check Multiscane, Flow-Lab.), wobei die Wachstumshemmaktivität bestimmt wurde. Die Testgruppe zeigte gegenüber der Kontrollgruppe eine Hemmung des Zellwachstums um 50%, d. h. die Testgruppe, die die Hälfte der Absorption zeigte, die bei der Kontrollgruppe gemessen wurde, wurde identifiziert. Der reziproke Wert der Anzahl der Verdünnungen der Testgruppe wurde als Einheit der GIF-Aktivität übernommen. Beträgt zum Beispiel die GIF-Aktivität 10 Einheiten, weist die Testlösung, wenn sie 10fach verdünnt wurde, noch eine Aktivität auf, um das Zellwachstum zu 50% zu hemmen.
Auf die folgenden Zeichnungen wird in Referenzbeispielen und Beispielen verwiesen.
Fig. 1 zeigt Restriktionskarten der cDNA des Plasmids pcD-GIF-16 und des Plasmids pcD-GIF-207;
Fig. 2 ist ein Diagramm, das darstellt, wie das Plasmid ptrpIL-1α-113 aus dem Plasmid pcD-GIF-207 und dem Plasmid pTM1 konstruiert wird.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse eines Antitumoraktivitätstests.
Die Fig. 4 und 5 stellen die Ergebnisse dar, die bei der Prüfung der Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids, die Produktion von CSF zu fördern, erhalten wurden.
Fig. 6 stellt die Ergebnisse dar, die durch Prüfung des erfindungsgemäßen Polypeptids auf entzündungshemmende Wirkung erhalten wurden.
Fig. 7 stellt die Ergebnisse dar, die durch Prüfung der Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids auf Vorbeugung einer durch Strahlung verursachten Verletzung erhalten wurden.
Fig. 8 stellt die Ergebnisse dar, die durch Prüfung der Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids auf Vorbeugung einer opportunistischen Infektion erhalten wurden.

Referenzbeispiel 1

(1) Inkubation von U937-Zellen

Die menschlichen histiocytischen Lymphomzellen U937 (Ascenso J.L. et al., Blood, Bd. 57 (1981), 170) wurden in einer Anzahl von 1,4 · 10&sup9; in RPMI-1640-Kulturmedium überführt, das 25 ng/ml 12-o-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA, Produkt von Pharmacia), 10 ug/ml Concanavalin A (ConA, Produkt von Sigma Chemicals Co.) und 10% FCS enthielt, wobei eine Zellsuspension mit einer Konzentration von 4 · 10&sup5; Zellen/ml hergestellt wurde.
Portionen der Zellsuspension von 10 ml wurden einzeln in Platten mit 9 cm Durchmesser (Falcon 3003) gefüllt und in 5%igem Kohlendioxidgas drei Tage bei 37ºC inkubiert. Nach Entfernen des Kulturüberstands durch Absaugen wurden 10 ml RPMI-1640-Medium, das 10% FCS, 10 ug/ml bakterielles Lipopolysaccharid (LPS, Produkt von Difco), 1 ug/ml Muramyldipeptid (MDP, Produkt von Wako Pure Chemical Ind. Ltd.) und 1 ng/ml TPA enthielt, in jede Platte gefüllt. Die Zellen wurden in diesem Medium in 5%igem Kohlendioxidgas 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die U937-Zellen, die sich am Boden der Platte anhefteten, wurden zur Präparation der mRNA verwendet.

(2) Präparation der mRNA

Die RNA wurde durch die Kombination des Guanidinium/ heißes Phenol-Verfahrens (Feramisco J.R. et al., J. Bio. Chem., Bd. 257 (1982), 11024) und des Guanidinium/ Caesiumchlorid-Verfahrens (Glisin V. et al., Biochemistry, Bd. 13 (1974), 2633) extrahiert.
Um die in Verfahren (1) inkubierten U937-Zellen zu waschen, wurden die Platten nach dem Entfernen des Überstandes mit 5 ml einer PBS-Lösung gespült. Die Zellen wurden dann mit 1 ml einer 4 M Guanidinisothiocyanatlösung (4 M Guanidinisothiocyanat (Produkt von Fluka AG), 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA und 2% Natriumlauroylsarkosinat), die in jede Platte gefüllt wurde, gelöst. Die Lösung wurde mit einem Gummischaber und einer Pasteurpipette gesammelt, wobei 420 ml der Zellösung erhalten wurden, die bei 60ºC gehalten und durch eine 18G-Injektionsnadel gezogen wurden, um die chromosomale DNA zu scheren. Anschließend wurde der Lösung Phenol, das auf 60ºC erhitzt wurde, in einer Menge zugegeben, die der Lösung äquivalent ist, und das Gemisch wurde mit einer 18G-Injektionsnadel weiter geschert. Dem Gemisch wurden dann 210 ml 0,1 M Natriumacetat-10 mM Tris-HCl (pH 7,4)-1 mM EDTA-Lösung und 420 ml eines Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches (Volumenverhältnis 24 : 1) zugegeben. Das so erhaltene Gemisch wurde 15 Minuten bei 60ºC kräftig geschüttelt, dann eisgekühlt und bei 3000 Upm 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der gesammelten wäßrigen Schicht wurde zweimal Ethanol in einer Menge zugegeben, die der Menge der wäßrigen Schicht entspricht. Das Gemisch ließ man über Nacht bei -70ºC stehen, wobei ein rohes RNA-Präzipitat erhalten wurde. Die rohe RNA wurde in 48 ml 6 M Guanidinisothiocyanat-5 mM Natriumcitrat (pH 7,0)-0,1 M β-Mercaptoethanol-0,5% Natriumlauroylsarkosinat-Lösung gelöst. Caesiumchlorid (19,2 g) wurde dann in der Lösung gelöst. Portionen von 7 ml der so erhaltenen Lösung wurden dann über 4 ml 5,7 M Caesiumchlorid-0,1 M EDTA (pH 7,5) geschichtet. Das Gemisch wurde bei 31 500 Upm 20 Stunden bei 25ºC mit einem Beckman SW40Ti-Rotor zentrifugiert, wobei die RNA gesammelt wurde.
Auf diese Weise wurden 9,7 mg RNA gewonnen.
Um die mRNA aus der RNA zu gewinnen, wurde die RNA einer Säulenchromatographie unter Verwendung von Oligo(dT)-Cellulose (Produkt von Collaborative Research Inc.) unterzogen. Für die Adsorption wurden 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)-0,5 M NaCl-1 mM EDTA verwendet. Für die Eluierung wurden 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)-1 mM EDTA verwendet.
Es wurden 400 ug mRNA gewonnen.

(3) Herstellung der cDNA-Bank

Die cDNA-Bank wurde mit dem Okayama-Berg-Verfahren hergestellt, bei dem die cDNA in tierischen Zellen exprimiert werden kann. So wurde der einen dT-Schwanz aufweisende Vektor- Primer, der bei der Clonierung von cDNA verwendet wird, aus dem Plasmid pcDV1 und die einen dG-Schwanz aufweisende Linker- DNA aus dem Plasmid pL1 hergestellt, beide durch das Verfahren von Okayama et al. (Okayama H. und Berg P., Molecular and Cellular Biology, Bd. 3 (1983), 280).
Die in Verfahren (2) erhaltene mRNA wurde in 20 ul wäßriger 5 mM Tris-HCl (pH 7,5)-0,5 mM EDTA (pH 7,5)-Lösung gelöst und 5 Minuten bei 65ºC inkubiert, und dann 5 Minuten bei 37ºC. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Gesamtmenge von 40 ul eingestellt, die 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 0,3 mM Dithiothreit, jeweils 2 ml dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 2,8 ug der Vektor-Primer-DNA, 60 Einheiten eines RNase- Hemmstoffs (Produkt von Promega Biotech) und 40 Einheiten reverse Transferase (Produkt von Bio-Rad) enthielt, gefolgt von einer Inkubation von 1 Stunde bei 37ºC. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2 ul 0,5 M EDTA (pH 7,5) und 2 ul 10%igem SDS beendet. Anschließend wurde das Gemisch einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Chloroform-Extraktion unterzogen und der Extrakt wurde aus Ethanol ausgefällt, wobei die Vektor-Primer-cDNA:mRNA gesammelt wurde.
Die gesammelte Vektor-Primer-cDNA:mRNA wurde in 30 ul eines Reaktionsgemisches, das aus 140 mM Natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM Dithiothreit, 0,3 ug PolyA, 66 uM dCTP und 38 Einheiten der terminalen Desoxynucleotidyltransferase (Produkt von Pharmacia) zusammengesetzt war, 5 Minuten bei 37ºC inkubiert, worauf 1,5 ul 0,5 M EDTA (pH 7,5) und 1,5 ul 10%iges SDS dem Reaktionsgemisch zugegeben wurden, um die Reaktion zu beenden. Das Gemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Chloroform-Extraktion unterzogen und der Extrakt wurde aus Ethanol ausgefällt, wobei der mit einem Oligo-dC-Schwanz versehene cDNA:mRNA-Vektor-Primer gesammelt wurde.
Die gesammelte Nucleinsäure wurde 90 Minuten bei 37ºC in 20 ul eines Reaktionsgemisches inkubiert, das 7 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 60 mM NaCl, 100 ug/ml Rinderserumalbumin und 12 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Produkt von Nippon Gene Co., Ltd.) umfaßte. Anschließend wurde dem Gemisch 1 ul 0,5 M EDTA (pH 7,5) und 1 ul 10%iges SDS zugegeben, um die Reaktion zu beenden, gefolgt von einer Extraktion mit Phenol- Chloroform und dann mit Chloroform, und einer Präzipitation aus Ethanol, wobei der mit HindIII gespaltene mit einem Oligo-dC-Schwanz versehene cDNA:mRNA-Vektor-Primer gesammelt wurde. Das Produkt wurde in 10 ul 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)-1 mM EDTA (pH 7,5) (TE (pH 7,5)) gelöst. Ein Teil der Lösung von 1 ul wurde in 10 ul eines Reaktionsgemisches inkubiert, das das vorstehende TE (pH 7,5), 0,1 M NaCl und die mit einem Oligo-dG-Schwanz versehene Linker-DNA (14 ng) umfaßt, zuerst 2 Minuten bei 65ºC und dann 30 Minuten bei 42ºC. Das Gemisch wurde danach auf 0ºC abgekühlt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf ein Volumen von 100 ul eingestellt, das 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 M KCl, 50 ug/ml Rinderserumalbumin, 0,1 mM β-NAD (Nicotinamid-adenin-dinucleotid, Produkt von Pharmacia) und 0,6 ug der E. coli-DNA-Ligase (Produkt von Pharmacia) enthielt, und bei 12ºC über Nacht inkubiert. Dem Reaktionsgemisch wurden jeweils 40 uM dATP, dGTP, dCTP und dTTP sowie 0,15 mM β-NAD zugegeben. Unter weiterer Zugabe von 0,4 ug E. coli-DNA- Ligase, 4,6 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (Produkt von Boehringer Mannheim) und einer Einheit der E. coli-RNase H (Produkt von Pharmacia) wurde das Gemisch eine Stunde bei 12ºC und dann eine Stunde bei 25ºC inkubiert.
Der E. coli-Stamm HB101 wurde mit dem so erhaltenen Reaktionsgemisch transformiert. Die kompetenten Zellen dieses verwendeten Stamms waren ein Produkt der Bethesda Research Laboratories (BRL). Die Zellen wurden gemäß dem BRL-Handbuch transformiert.
Auf diese Weise wurde eine cDNA-Bank mit etwa 21000 Clonen erhalten.

(4) Transfektion von Affen-COS-1-Zellen

Die in dem vorstehenden Verfahren (3) erhaltene cDNA- Bank wurde in zwei Gruppen mit durchschnittlich je etwa 70 Clonen unterteilt. Aus jeder Gruppe wurde die Plasmid-DNA präpariert.
Die Plasmid-DNA wurde durch das alkalische Lyseverfahren (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 368) präpariert.
Die inkubierten Affenzellen, COS-1-Zellen (Gluzman Y., Cell, Bd. 23 (1981), 175) wurden zur Transfektion mit der so aus jeder Gruppe isolierten Plasmid-DNA infiziert. Die Transfektion wurde mit dem DEAE-Dextran-Verfahren (Yokota T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81 (1984), 1070) durchgeführt. Insbesondere wurden die mit Trypsin behandelten COS-1- Zellen in RPMI-Medium mit 10% FCS suspendiert und auf eine Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden Teile der Lösung von 500 ul in 6 Vertiefungen einer Platte mit Vertiefungen gefüllt, jede enthielt 2 ml RPMI-1640- Medium mit 10% FCS. Nach Inkubieren über Nacht bei 37ºC wurde der Überstand entfernt; die Zellen wurden mit einem serumfreien Medium gewaschen und in jede Vertiefung wurde 1 ml RPMI-1640-Medium gefüllt, das 10 ug/ml der Plasmid-DNA, 0,4 mg/ml DEAE-Dextran (Produkt von Pharmacia), 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 10% FCS enthielt, gefolgt von einer Inkubation für 4,5 Stunden bei 37ºC. Der Überstand wurde danach entfernt; die Zellen wurden mit einem serumfreien Medium gewaschen und 2 ml RPMI-1640-Medium mit 150 uM Chlorquin (Produkt von Sigma) und 10% FCS wurden in jede Vertiefung gefüllt, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 3 Stunden bei 37ºC. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden mit einem serumfreiem Medium gewaschen und danach 72 Stunden bei 37ºC unter Zugabe von 3 ml RPMI-1640-Medium, das 10% FCS enthielt, zu den Zellen jeder Vertiefung inkubiert. Nach dem Sammeln des Überstandes wurde in jede Vertiefung 2 ml RPMI-1640-Medium mit 10% FCS gefüllt, gefolgt von zwei Gefrier-Auftau-Cyclen. Die extrahierten Zellen wurden gesammelt. Der Kulturüberstand und der Zellextrakt wurden auf GIF-Aktivität untersucht.
Die Gruppe, die eine GIF-Aktivität zeigte, wurde in 24 Gruppen von jeweils 10 Clonen unterteilt und das gleiche vorstehende Verfahren wurde unter Verwendung dieser Gruppen zur Bestimmung der GIF-Aktivität wiederholt. Das gleiche vorstehende Verfahren wurde mit den Clonen innerhalb der Gruppe wiederholt, die eine GIF-Aktivität zeigte, wobei der Clon, der eine GIF-Aktivität zeigte, identifiziert wurde.
Auf diese Weise wurden zwei Arten von Clonen erhalten, d. h. pcD-GIF-16 und pcD-GIF-207.
Tabelle 1 zeigt die GIF-Aktivität (GIF-Einheiten/ml) dieser Clone. Tabelle 1 Clon Kulturüberstand Zellextrakt (Kontrolle)

(5) Analyse des Clons

Fig. 1 zeigt Restriktionskarten der cDNA des Plasmids pcD-GIF-16 und des Plasmids pcD-GIF-207.
Die Basensequenz der cDNA dieser Plasmide wurde mit dem Basen-spezifischen chemischen Modifikationsverfahren (Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), 499) und der Didesoxykettentermination (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), 5463) unter Verwendung des M13-Phagenvektors (Gene, Bd. 19 (1982), 269) bestimmt.
Auf diese Weise wurde festgestellt, daß die cDNA von pcD-GIF-207 mit der cDNA des codierenden Bereichs von IL-1α, über den March et al. berichteten (Nature, Bd. 315 (1985), 641), identisch ist.
Der E. coli-Stamm x1776, der das Plasmid pcD-GIF-207 trägt, weist eine cDNA auf, die ein Vorläuferprotein von IL-1α codiert, er wurde unter dem Namen "Escherichia coli 1776/pcD- GIF-207" mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-1294 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, hinterlegt.

(6) Expression und Herstellung des Polypeptids

Das vorstehende Plasmid pcD-GIF-207 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und HincII gespalten und dann einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterworfen, wobei ein etwa 0,66 kb großes HindIII-HincII-DNA-Fragment isoliert und gereinigt wurde, das weiter auf ähnliche Weise mit dem Restriktionsenzym AluI gespalten wurde, wobei bei der Isolierung das etwa 0,5 kb große AluI-HincII-DNA-Fragment erhalten wurde.
Danach wurden die Oligonucleotide (5'- CGATAATGTCAGCACCTTTTAG-3' und 5'-CTAAAAGGTGCTGACATTAT-3') am 5'-Ende mit der T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert und mit dem vorstehend erhaltenen AluI-HincII-DNA-Fragment unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert. Der ligierte Block wurde dann mit dem Restriktionsenzym ClaI gespalten und einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen, wobei ein etwa 0,54 kb großes ClaI-ClaI-Fragment isoliert und gereinigt wurde.
Andererseits wurde das Plasmid pTMI (Fumio Imamoto, Taisha (Metabolism), Bd. 22 (1985), 289) mit dem Restriktionsenzym ClaI gespalten, mit intestinaler alkalischer Phosphatase aus dem Kalb (CIAP) umgesetzt und danach mit dem vorher hergestellten ungefähr 0,54 kb großen ClaI-ClaI-DNA-Fragment unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert, wobei das gewünschte Polypeptid-Expressionsplasmid ptrpIL-1α-113 erhalten wurde.
Dieses Plasmid wurde in den E. coli-Stamm HB101 eingeschleust und die gewünschte Transformante wurde durch die Analyse der Größe der Spaltfragmente, die von der resultierenden Plasmid-DNA erhalten wurden, mit Hilfe des Siedeverfahrens ausgewählt.
Fig. 2 zeigt schematisch das vorstehende Verfahren.
Das Plasmid ptrpIL-1α-113 wurde aus der ausgewählten Transformante extrahiert und in den E. coli-Stamm W3110 eingeschleust, wobei die Transformante E. coli W3110/ptrpIL-1α-113 erhalten wurde.

Beispiel 1

(1) Inkubation der Transformante

Die im Referenzbeispiel 1 (6) erhaltene Transformante (E. coli W3110/ptrpIL-1α-113) wurde unter Schütteln über Nacht bei 37ºC in 10 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% NaCl) inkubiert, das 50 ug/ml Ampicillin und 20 ug/ml L-Tryptophan enthielt. Ein Menge von 400 ml M9-Minimalmedium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 2 mM MgSO&sub4;, 0,2% Glucose und 0,1 mM CaCl&sub2;), die 50 ug/ml Ampicillin und 1% Casaminosäure enthielt, wurde mit 8 ml der Kultur angeimpft, gefolgt von einer Inkubation für 9 Stunden bei 37ºC. Die gewonnenen E. coli-Zellen wurden in 10 ml Na&sub2;HPO&sub4; suspendiert und man ließ sie im Kühlraum über Nacht stehen. Die Suspension wurde dann zwei Tage gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert.
Das erhaltene Dialysat wurde zentrifugiert und dadurch in einen Überstand und ein Sediment aufgetrennt. Es wurde festgestellt, daß der in einer Menge von 28 ml erhaltene Überstand eine GIF-Aktivität von 7,3 · 10&sup7; Einheiten aufweist.

(2) Reinigung des Polypeptids

Eine Menge von 2 ml des in dem vorstehenden Verfahren (1) erhaltenen Überstandes wurde unter den folgenden Bedingungen durch Ionenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DEAE-HPLC) unter Verwendung des ULTROCHROM-GTi-(LBK)- Chromatographiesystems gereinigt.
Säule: TSK-Gel-DEAE-SPW (7,5 · 75 mm, Produkt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.)
Eluent A: 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)
Eluent B: 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 0,5 M NaCl
Durchflußgeschwindigkeit: 1 ml/min
Fraktionsvolumen: 1 ml/min/Röhrchen
Gradientenprofil:
Zeit (min) %B
0 0
5 0
65 60
70 100
80 100
85 0
100 0
Das DEAE-HPLC-Verfahren ergab zwei GIF-aktive Fraktionen, d. h. eine Fraktion von 26 bis 28 Minuten Verweildauer (nachstehend bezeichnet als "Fraktion 1") und eine andere Fraktion von 32,5 bis 34,5 Minuten Verweildauer (nachstehend bezeichnet als "Fraktion 2").
Diese zwei Fraktionen wurden erneut einer DEAE-HPLC und einer Gelfiltrations-HPLC unterzogen, wobei die Fraktionen 1 und 2 gereinigt wurden.
Nachdem dies GIF-aktiven Fraktionen wie vorstehend erhalten wurden, wurden diese Fraktionen zur Bestätigung wie folgt getestet.

(3) SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

Die Fraktionen 1 und 2 wurden einer SDS-PAGE gemäß dem Verfahren von Laemmli U.K. (Nature 277 (1970), 680) unter den folgenden Bedingungen unterzogen.
Probe: Fraktion 1 oder 2 wurde vollständig getrocknet, dann in Laemmli-Probenpuffer (enthält 2-Mercaptoethanol (ME&spplus;) in einer Menge von 1/20 des Puffervolumens) gelöst und 4 Minuten bei 100ºC behandelt.
Gel: 15%iges Polyacrylamidgel, 1,5 mm Dicke.
Apparatur: PROTEAN, Produkt von Bio-Rad.
Elektrophorese: konstanter Strom von 40 mA für zwei Stunden.
Das aus der Elektrophorese erhaltene Gel wurde mit einem Silber-Färbe-Kit (Bio-Rad) gefärbt. Die Fraktionen 1 und 2 wanderten jeweils als einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 18,3 kd, das beinahe dem berechneten Gewicht des Gens von 18 kd entspricht.

(4) Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Die Fraktionen 1 und 2 wurden einer IEF unter Verwendung einer Ampholin-PAG-Platte (LKB) im pH-Bereich von 3,5 bis 9,5 und dem Modell 1415 (Bio-Rad) unter folgenden Bedingungen unterzogen.
Probe: Eine PBS-Lösung der Fraktion 1, die man 2 Tage stehen ließ, das gleiche mit 14 Tagen stehen lassen; eine PBS- Lösung der Fraktion 2, die man 2 Wochen stehen ließ; eine PBS-Lösung, die als Kontrolle diente und die folgenden Markerproteine (pI-Markerproteine), insgesamt fünf Bahnen
Markerproteine:
Amyloglucosidase (3,50)
Trypsin-Inhibitor aus der Sojabohne (4,55)
α-Lactoglobulin A (5,20)
Rinder-Carboanhydrase B (5,85)
menschliche Carboanhydrase B (6,55)
Pferdemyoglobin-saure Bande (6,85)
Pferdemyoglobin-basische Bande (7,35)
Lentillectin-saure Bande (8,15)
Lentillectin-Mittel-Bande (8,45)
Lentillectin-basische Bande (8,65)
Trypsinogen (9,30)
Elektrodenlösungen: Anodenlösung = 1 M H&sub3;PO&sub4;
Kathodenlösung = 1 M NaOH
Elektrophorese: Bei konstanter Stärke von 1 W/cm Gelbreite unter Kühlung (10ºC) für 90 Minuten.
Färbung: Mit einem Silber-Färbe-Kit
Das aus der Elektrophorese erhaltene Gel wurde in einem Abstand von 1 cm in Scheiben geschnitten und unter Schütteln einer Extraktion mit 1 ml entionisiertem Wasser unterzogen (2 Tage). Der isoelektrische Punkt wurde aus der pH-Messung nach der Elektrophorese berechnet.
Es wurde festgestellt, das der isoelektrische Punkt (pI) der Fraktion 2 etwa 5,0 betrug und die Fraktion wanderte an dieser Position als einzelne Bande. Fraktion 1 wies isoelektrische Punkte von etwa 5,2 und etwa 5,0 auf und wanderte als zwei Banden.

(5) Aminosäurezusammensetzung

Die Fraktionen 1 und 2 (30 ul) wurden vorsichtig am Boden eines dickwandigen festen Teströhrchens einer Größe von 12 mm · 120 mm aus Pyrexglas eingefüllt und unter vermindertem Druck in einem Exsikkator mit Natriumhydroxidpellets getrocknet. Eine Menge von 50 ul 4 N Methansulfonsäure (enthaltend 0,2% 3-(2-Aminoethyl)indol und hergestellt von Pierce) wurde der getrockneten Probe im Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden bei 0,1 bis 0,2 mm Hg 1 Minute entlüftet und dann versiegelt. Die Probe wurde in einem Heizgerät bei 118ºC über einen Zeitraum von 24 Stunden hydrolysiert. Nach dem Öffnen des Röhrchens wurde das Gemisch mit 46 ul 4 N Natriumhydroxid neutralisiert und auf eine Menge von 450 ul mit Citronensäurepuffer verdünnt.
Eine Menge von 250 ul der Probenlösung wurde für die Aminosäureanalyse mit einem Aminosäureanalysator (Modell 835, Produkt von Hitachi Ltd.) verwendet. Die abgetrennten Aminosäuren wurden durch das o-Phtalaldehydverfahren nachgewiesen und quantitativ mit Bezug auf Kalibrierungskurven bestimmt, die unter Verwendung von authentischen Aminosäuren hergestellt wurden.
Tabelle 2 stellt die Ergebnisse in Hinsicht auf das Molverhältnis der vorkommenden Aminosäuren basierend auf Phe (10 Mol) dar. Unter den vorstehenden Analysebedingungen sind Pro und Cys nicht bestimmbar.

Tabelle 2

Aminosäure Fraktion 2 (Molverhältnis)
Asp und/oder Asn 20,6
Thr 11,4
Ser 10,1
Glu und/oder Gln 16,8
Gly 6,6
Ala 14,4
Val 5,8
Met 2,3
Ile 9,3
Leu 15,0
Tyr 6,8
Phe (10)
Lys 10,5
His 3,0
Trp 1,6
Arg 2,9

(6) Aminosäuresequenz

Die Fraktionen 1 und 2 (150 ul) wurden mit einem Proteinsequenzanalysegerät (Modell 470A, Applied Biosystems Inc.) analysiert. Jede erhaltene PTH-Aminosäure wurde mit 100 bis 50 ul 33%iger wäßriger Acetonitrillösung geeignet verdünnt und ein Teil der Verdünnung von 5 ul wurde durch einen automatischen Probensammler (Waters 710B) in eine chromatographische Säule injiziert. Für das chromatographische System wurden zwei Pumpen, Beckman Modell 112, durch ein Steuergerät Modell 421 eingesetzt. Die verwendete Säule mit den Maßen 2 mm · 250 mm und gepackt mit Ultrasphere ODS-5 um wurde mit einem Säulen- Heizgerät bei 55ºC gehalten. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 0,3 ml/min. Ein Gemisch aus 20 mM Natriumacetat und Acetonitril wurde zur Gradienteneluierung verwendet. Die Absorption wurde bei 269 nm überwacht. Die Analyse wurde 45 Minuten durchgeführt.
Die Ergebnisse der 40 Analysecyclen zeigen, daß die Aminosäuresequenz der zwei Fraktionen mit Ausnahme der 36sten Aminosäure identisch ist und daß sie die folgende Sequenz aufweisen.
Die 36ste Aminosäure (X in der vorstehenden Formel) der Fraktion 1 war Asn, was aus der Sequenz des Gens vorhergesagt wurde, und die Aminosäure Asp bei Fraktion 2.
Das Vorangehende zeigt, daß die Fraktion 1 das Polypeptid der Formel (A) ist, nämlich IL-1α; weiter zeigte sich, daß die andere Fraktion 2 ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist, das IL-1α entspricht, wobei die 36ste Aminosäure durch Asp ersetzt ist. Dieses erfindungsgemäße Polypeptid wird nachstehend bezeichnet als "Polypeptid I".
IL-1α war als Stoff instabil. Es wurde zum Beispiel festgestellt, daß es sich teilweise in ein stabileres Polypeptid I umwandelt, wenn es in einem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) vorliegt.

Beispiel 2

(1) Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids I

Ein Polypeptid I-Expressionsvektor wurde durch das stellenspezifische Mutagenese-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 5662-5666; Science 224 (1984), 1431) unter Verwendung des im Referenzbeispiel 1 erhaltenen Plasmids ptrpIL-1α-113 hergestellt und das Polypeptid I wurde aus dem Plasmid hergestellt, wie nachstehend beschrieben wird.
Der M13-mp11-Phagenvektor wurde als einzelsträngige DNA-Matrize verwendet. Das EcoRI/BamHI-DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid ptrpIL-1α-113 isoliert und in den M13-mp11-Phagen (RF) an den Restriktionsenzymstellen EcoRI und BamHI cloniert, wobei eine einzelsträngige (ss) DNA (M13-IL-1α-113) erhalten wurde, die dann als Mutagenesematrize verwendet wurde.
Ein synthetisches Oligonucleotid [5'-ATTCGAGCCGATGATCAG -3' (Primer)] wurde mit der T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert und mit der ss-M13-IL-1α-113-DNA hybridisiert. Das Hybrid wurde aneinandergelagert, danach mit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und der T4-DNA-Ligase in Gegenwart von dNTPs behandelt und 18 Stunden bei 15ºC inkubiert.
Die erhaltene DNA wurde zur Transformation in kompetente JM105-Zellen eingeschleust. Der so erhaltene Phagenplaque (50 Kolonien) wurde auf den Intro-Cellulosefilter der Agarplatte überimpft und 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ein Filter, der die Clone enthielt, wurde zur Denaturierung in der üblichen Weise mit einer alkalischen Verbindung behandelt, getrocknet und dann 2 Stunden bei 80ºC gebacken. Der Filter wurde vorhybridisiert und dann bei Raumtemperatur mit einer ³²P-Sonde hybridisiert, die durch Markierung des Primers mit ³²P-γ-ATP hergestellt worden war. Der hybridisierte Filter wurde mit 6xSSC-Puffer 10 Minuten bei Raumtemperatur und noch mal 5 Minuten bei 54ºC gewaschen, getrocknet und danach 18 Stunden einer Autoradiographie bei -70ºC unterzogen.
M13-IL-1α-36D wurde als ein typischer Clon aus 5 mutierten Clonen ausgewählt, mit JM105 infiziert und inkubiert, wobei ssDNA und RF-DNA hergestellt wurde.
Die M13-Didesoxynucleotidsequenzierung wurde für die ssDNA durchgeführt, um die Mutation des beabsichtigten Gens zu bestätigen.
Das EcoRI/BamHI-Fragment wurde aus der in den JM105- Zellen hergestellten RF-DNA präpariert und auf die gleiche Weise wie in dem vorangegangenen Referenzbeispiel in das Expressionsplasmid eingeführt, wobei das gewünschte Polypeptid I-Expressionsplasmid (IL-1α-36D) erhalten wurde.
Unter Verwendung dieses Plasmids wurde das Polypeptid I auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 exprimiert, gefolgt von einer Reinigung (DEAE-HPLC ergab einen einzelnen GIF-Aktivitätspeak), wobei das gewünschte Polypeptid I mit den vorstehenden Eigenschaften gewonnen wurde. Es wurde festgestellt, daß das Produkt eine spezifische Aktivität von etwa 1 · 10&sup7; GIF-Einheiten/mg Protein aufweist.

Beispiel 3

(1) Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide II und III

Das Plasmid ptrpIL-1α-141S für die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids, das IL-1α entspricht, wobei die 141ste Aminosäure (Cys) durch Ser ersetzt ist, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 unter Verwendung von 5'- ACTGGGTGAGCTTGGCAG-3' als Primer hergestellt.
Die gleichen Expressions- und Reinigungsverfahren wie in Beispiel 1 wurden unter Verwendung dieses Plasmids wiederholt, die ähnlich durchgeführte DEAE-HPLC ergab zwei GIF-Aktivitätspeaks. Die Peak-Fraktionen wurden auf die gleiche vorstehende Weise analysiert, mit dem Ergebnis, daß die Peak-Fraktion, die eine kürzere Verweildauer aufwies, als ein erfindungsgemäßes Polypeptid (Polypeptid III) identifiziert wurde, das aus der Gensequenz erwartet wurde, d. h. ein Polypeptid, das IL-1α entspricht, wobei die 141ste Aminosäure (Cys) durch Ser ersetzt war.
Die Analyse ergab, daß die andere Peak-Fraktion ein erfindungsgemäßes Polypeptid war, das IL-1α entspricht, wobei die 36ste Aminosäure (Asn) und die 141ste Aminosäure (Cys) jeweils durch Asp und Ser ersetzt waren. Dieses Polypeptid wird nachstehend bezeichnet als "Polypeptid II".

Beispiel 4

(1) Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids II

Das Plasmid ptrpIL-1α-36D·141S für die Expression des gewünschten Polypeptids II wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, unter Verwendung des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids ptrpIL-1α-141S und der Sequenz 5'- ATTCGAGCCATGATCAG-3' als Primer.
Der HB101-Stamm wurde entsprechend behandelt, damit er das vorstehende Plasmid ptrpIL-1α-36D·141S aufnimmt. Der Stamm wurde unter dem Namen "Escherichia coli HB101/IL-1α-36D141S" mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-1295 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, hinterlegt.
Die gleichen Expressions- und Reinigungsverfahren wie in Beispiel 1 wurden unter Verwendung des vorstehenden Plasmids wiederholt, wobei das gewünschte erfindungsgemäße Polypeptid II erhalten wurde.
Die SDS-PAGE zeigte, daß das Polypeptid ein Molekulargewicht von etwa 18 kd aufwies. Durch IEF wurde festgestellt, daß der isoelektrische Punkt (pI) bei etwa 5,0 lag.
Die spezifische Aktivität (GIF-Aktivität) der Polypeptide II und III war der Aktivität von Polypeptid I äquivalent.

Pharmazeutisches Testbeispiel 1

(1) GIF-Aktivität und LAF-Aktivität

Die GIF-Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde bereits beschrieben. Die LAF-Aktivität der Polypeptide I, II und III war mit deren GIF-Aktivität vergleichbar.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wurde wie folgt getestet.

(2) Test auf Antitumoraktivität

Die Tumorzellen "Meth A" (200 000) wurden intrakutan in jede der BALB/c-Mäuse transplantiert (Tag Null). Am siebten und achten Tag nach der Transplantation wurde das Polypeptid I an der Tumorstelle der Mäuse verabreicht, im ersten Experiment in einer Menge von 0,3, 1 oder 3 ug pro Maus.
In jeder Gruppe wurden sieben Mäuse verwendet. Der Kontrollgruppe wurde auf die gleiche Weise ein Lösungsmittel (1% Mausserum) verabreicht.
Die Testergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, in der die Anzahl der Tage, die nach der Überimpfung der Tumorzellen verstrichen sind, als Abszisse gegen das Gewicht des Tumors (mg) als Ordinate aufgetragen ist. Eine Kontrollgruppe wird durch Kurve (1) dargestellt; eine Gruppe mit einer Dosis von 0,3 ug des Polypeptids I durch Kurve 2; eine Gruppe mit einer Dosis von 1 ug des Polypeptids I durch Kurve (3) und eine Gruppe mit einer Dosis von 3 ug des Polypeptids I durch Kurve (4). Das Gewicht des Tumors wird als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Das Zeichen * bedeutet p< 0,05 im Student-T-Test und das Zeichen ** p< 0,01.
(3) Test auf die Wirkung zur Förderung der CSF-Produktion (3)-1 Der folgende Test wurde unter Verwendung des Zellstamms U-373MG (ATCC-HTB17, Glioblastom, Astrocytom, Mensch) durchgeführt.
Die Zellen des vorstehenden Stamms wurden in Eagle-MEM- Medium (Produkt von Nissui Pharm. Co.), das 10% FCS (Produkt von GIBCO), nicht-essentielle MEM-Aminosäuren (Produkt von Flow) und MEM-Natriumpyruvat (Produkt von Flow) enthielt, in einer Konzentration von 2 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert. Das zu testende Polypeptid I wurde in verschiedenen Konzentrationen Teilen der Lösung zugegeben. Jedes Gemisch wurde in einem Kohlendioxid-Brutschrank 24 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Der Kulturüberstand wurde gesammelt und die Menge des hergestellten und im Überstand angereicherten CSFs wurde unter Verwendung von Knochenmarkzellen der Maus gemessen (Lewis I.C. et al., J. Immunol. 128 (1982), 168).
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt, in der die Konzentration (ng/ml) des Polypeptids I als Abszisse gegen die CSF-Aktivität (U/ml, · 10&supmin;²) als Ordinate aufgetragen ist.
(3)-2 Die folgenden Tierexperimente wurden durchgeführt, um zu bestätigen, daß Polypeptid I, wenn es dem lebenden Körper verabreicht wird, die Produktion von CSF in vivo fördert.
Normalen Mäusen (BALB/c-Stamm, erworben von Experimental Animal Cooperative Association of Shizuoka Prefecture, Japan) wurde intravenös das Polypeptid I in verschiedenen Mengen verabreicht. Den Tieren wurde 8 Stunden nach der Verabreichung Blut abgenommen, das auf CSF-Aktivität, wie vorstehend in (3)-1, untersucht wurde. Als Kontrolle für den Test wurde einer Kontrollgruppe auf die gleiche Weise menschliches Serumalbumin (HSA) verabreicht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt, in der die verabreichte Menge (ug/Maus) des Polypeptids I oder der Menge an HSA als Abszisse und die CSF-Aktivität (Einheit/ml Serum, · 10&supmin;³) als Ordinate aufgetragen ist.

(4) Test zur entzündungshemmenden Wirkung

Der folgende Test wurde gemäß dem Verfahren von Winter et al. (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 111 (1962), 544-547) durchgeführt.
Sechs bis acht Wochen alte männliche Ratten (Spraque- Dawley-Stamm, Nippon Charles River Co., Ltd.) wurden verwendet, die einen Tag vor dem Experiment nach dem Körpergewicht in Gruppen von 6 bis 8 Ratten eingeteilt wurden. Eine Suspension von 1% Carrageenan (Produkt von Marine Colloid) in Kochsalzlösung, das als Mittel zur Verursachung einer Entzündung diente, wurde subkutan in einer Menge von 0,1 ml in die Sohle der rechten Hinterpfote der Ratte injiziert, um eine Schwellung des Fußes herbeizuführen. Um die Schwellung zu bewerten, wurde das Volumen der Sohle zu einem vorherbestimmten Zeitraum vor und nach der Injektion mit einem Plethysmometer (Produkt von Ugo-Vasile) gemessen. Das Verhältnis des erhöhten Volumens aufgrund der Injektion wurde im Verhältnis zum Wert vor der Injektion als Schwellung in % berechnet.
Der zu testende Stoff wurde in Dulbeco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und 0,1 ml der Lösung wurde 1 Stunde vor der Injektion des entzündungsverursachenden Mittels subkutan in den Rücken der Ratte injiziert. Das Lösungsmittel wurde einer Kontrollgruppe verabreicht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, in der die Zeit (Stunden), die nach der Injektion des entzündungsverursachenden Mittels verstrichen ist, als Abszisse gegen die Schwellung in % als Ordinate aufgetragen ist. In dem Diagramm wird die Kontrollgruppe durch Kurve (1) dargestellt; eine Gruppe, der 0,1 ug des Polypeptids I verabreicht wurden, durch Kurve (2); eine Gruppe mit 1 ug des Polypeptids I durch Kurve (3) und eine Gruppe mit 10 ug des Polypeptids I durch Kurve (4).

(5) Test zur Wirkung der Vorbeugung einer durch Strahlung verursachten Verletzung

Ein ug oder 0,3 ug des Polypeptids I wurden intraperitoneal 9-Wochen alten Mäusen des BALB/c-Stamms verabreicht, 20 Stunden bevor die Mäuse einer letalen Dosierung von Röntgenstrahlen ausgesetzt wurden.
Die Mäuse wurden systematisch Röntgenstrahlen einer Dosis von 850 Röntgen durch einen Röntgenbestrahler (MBR-1505R, Produkt von Hitachi Medico Co., Ltd.) ausgesetzt und danach täglich auf das Überleben hin untersucht. Einer Kontrollgruppe wurde PBS verabreicht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt, in der die Anzahl der Tage nach der Bestrahlung als Abszisse gegen die Überlebensrate (%) als Ordinate aufgetragen ist. Die Gruppe, der 1 ug des Polypeptids I verabreicht wurde, wird durch Kurve (1) dargestellt; die Gruppe mit 0,3 ug des Polypeptids I durch Kurve (2) und die Kontrollgruppe durch Kurve (3).
Fig. 7 zeigt, daß alle Mäuse der Kontrollgruppe am 18ten Tag nach der Röntgenbestrahlung starben, während festgestellt wurde, das Polypeptid I abhängig von der Dosierung zur Vorbeugung einer durch Strahlen verursachten Verletzung wirksam ist. Es wurde festgestellt, daß etwa 80% der Gruppe, der die Dosis von 1 ug verabreicht wurde, vor dem Tod aufgrund der durch Strahlen verursachten Verletzung bewahrt wurden und überlebten.

(6) Test zur Wirkung bei der Vorbeugung einer opportunistischen Infektion

Der folgende Test wurde unter Verwendung einer Modellmaus durchgeführt.
Am ersten Tag wurde 6-Wochen alten männlichen Mäusen des ICR-Stamms (7 Mäuse in jeder Gruppe) 100 mg/kg 5-Fluoruracil (5-Fu, Produkt von Kyowa Hakko Co., Ltd.) verabreicht. Am zweiten, vierten und sechsten Tag wurde das erfindungsgemäße Polypeptid I den Mäusen subkutan in einer Dosis von 1 ug/Maus verabreicht. Am siebten Tag wurde den Mäusen zur Infektion intraperitoneal eine spezifizierte Menge von Pseudomonas aeruginosa E-2 verabreicht. Am zehnten Tag wurde die Anzahl der Tiere gezählt, die überlebten, wobei die Überlebensrate (%) bestimmt wurde.
Die Ergebnisse werden in Fig. 8 (1) bis (3) dargestellt. Fig. 8 (1) zeigt das Ergebnis, das durch die so behandelte Gruppe erzielt wurde. Fig. 8 (2) zeigt das Ergebnis, das von einer Kontrollgruppe erzielt wurde, der das Polypeptid I nicht verabreicht wurde (der aber nur 5-Fu verabreicht wurde). Fig. 8 (3) zeigt das Ergebnis, das durch eine andere Kontrollgruppe erzielt wurde, der weder 5-Fu noch das Polypeptid I verabreicht wurde.
In Fig. 8 wird die Überlebensrate (%) als Ordinate gegen die Gruppen A bis F als Abszisse aufgetragen, denen die folgenden Mengen von Pseudomonas verabreicht wurde.
Gruppe Anzahl der Zellen/Maus A 19 000
B 3 800
C 750
D 150
E 30
F 6

(7) Verfahren zur Herstellung von Cytokinen aus tierischen Zellen

HSB-2-C5B2-Zellen (J. Immunol. 131 (1985), 1682-1689) in einer Menge von 2 · 10&sup5; Zellen/Vertiefung wurden 24 Stunden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des Polypeptids II und 0,01% PHA-P inkubiert. Die IL-2-Aktivität des gesammelten Überstandes wurde durch das Verfahren von K.A. Smith et al. (J. Immunol. 120 (1978), 2027) unter Verwendung der IL-2-abhängigen T-Zellen (CTLL 2) der Maus gemessen. Die nachstehende Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 3

Konzentration des Polypeptids II (ng) IL-2-Aktivität (cpm · 10&supmin;³) Mittelwert (n=5) 0 0,4
0,0005 0,4
0,005 0,6
0,05 2,1
0,5 3,2
5 3,5
50 3,9
500 3,8
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids es tierischen Zellen ermöglicht wirksam natürliche Cytokine zu produzieren.
Die für das vorstehende Verfahren verwendete Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids kann sehr klein sein, üblicherweise etwa 10 ng/ml, wobei zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden, während die Verwendung des Polypeptids die Reinigung des abgeleiteten Cytokins vereinfacht.
(8) Wenn Cytokine in tierischen Zellen produziert werden sollen, ist es essentiell, daß das für die Induktion der Produktion verwendete erfindungsgemäße Polypeptid unter den vorherrschenden Bedingung in der Struktur stabil bleibt und an den IL-1-Rezeptor auf der Oberfläche der Zellen gebunden wird. Insbesondere ist es erforderlich, daß das vorliegende Polypeptid an den IL-1-Rezeptor bindet und auf die Zelle ein Signal überträgt, das für die Produktion des Cytokins notwendig ist.
Entsprechend wurde der folgende Test in Verbindung mit der Bindung des vorliegenden Polypeptids an den IL-1-Rezeptor auf Fibroblasten durchgeführt.
BALB/3T3-Zellen (Clon A31: ATCC, CCL-163, 1 · 10&sup6; Zellen/Vertiefung), die beinahe gleichförmig über eine Platte mit 6 Vertiefungen wuchsen, wurden 2 Stunden bei 4ºC mit 50000 cpm/Vertiefung ¹²&sup5;I-markiertem IL-1β (Seikagaku (Biochemistry) 58 (1986), Nr. 8, 840; EPO-Nr. 187991) und 20 ng/ml IL-1β oder Polypeptid II umgesetzt, das 24 Stunden bei 37ºC in D-MEM-Medium ergänzt mit 10% FCS vorinkubiert wurde. Das flüssige Reaktionsgemisch wurde mit einer Pasteurpipette abgesaugt; die Zellen wurden vorsichtig mit 1 ml D-MEM-Medium ergänzt mit 10% FCS gewaschen und der Überstand wurde verworfen. Nach zweimaligen Wiederholen des Waschverfahrens wurden die Zellen mit 1 ml eines Gemisches aus 1% SDS und 0,2 N NaOH solubilisiert. Die Radioaktivität (gebundene Radioaktivität) der solubilisierten Zelllösung und der Lösung, die zum Waschen der Vertiefungen verwendet wurde, wurde mit einem Gamma-Zähler gemessen. Das verwendete ¹²&sup5;I-markierte IL-1β wurde durch das Verfahren von Bolton und Hunter (Biochem. J. 133 (1973), 529) hergestellt und gereinigt. Die spezifische Aktivität betrug mindestens 250 uCi/ug Protein.
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 4

Hemmwirkung (%)

Polypeptid II 100
IL-1β etwa 4
Hemmwirkung (%) = A-B/A-C · 100
wobei
A: der gebundenen Radioaktivität in Abwesenheit des markierten Polypeptids I entspricht;
B: den experimentellen Wert der gebundenen Radioaktivität darstellt und
C: die unspezifisch an die Platte absorbierte Radioaktivität bedeutet.
Dieser Index gibt die Bindungsaktivität des gemeinsam vorliegenden IL-1β oder des Polypeptids II am IL-1-Rezeptor an. Es ist übrigens bekannt, daß das Verhalten von IL-α und IL-1β in Hinsicht auf den IL-1-Rezeptor gleich ist.
Tabelle 4. zeigt, daß das Polypeptid II die ausreichende Bindungsaktivität am IL-1-Rezeptor sogar unter Bedingungen der Cytokininduktion- und -produktion beibehält und es ist daher für diese Anwendung nützlich.

Herstellungsbeispiel 1

Zu einer Lösung von 1 · 10&sup7; Einheiten/ml, berechnet als GIF-Aktivität, des Polypeptids I in Kochsalzlösung wurde menschliches Serumalbumin (HSA) in einer Konzentration von 0,5% gegeben. Das Gemisch wurde gefiltert (0,22 um Membranfilter), in Portionen von 1 ml unter sterilen Bedingungen in Ampullen gefüllt und gefriergetrocknet, wobei ein Präparat zur Injektion erhalten wurde.
Das Präparat wurde in 1 ml entionisiertem Wasser gelöst zur Injektion verwendet.

Claims

1. Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von I1-1α gemäß der Formel (A), die so modifiziert ist, daß mindestens einer der Reste Asn in Position 36 und Cys in Position 141 fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist:

Formel (A)

2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der Aminosäuresequenz von Formel (A) wobei mindestens Asn in Position 36 fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit der Aminosäuresequenz von Formel (A), wobei Asn in Position 36 durch Asp ersetzt ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit der Aminosäuresequenz von Formel (A), wobei Asn in Position 36 und Cys in Position 141 durch Asp bzw. Ser ersetzt sind.

5. Gen, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

6. Vektor, der das Gen nach Anspruch 5 enthält.

7. Mikroorganismus, der einen Vektor nach Anspruch 6 enthält.

8. Medizinische Zusammensetzung, umfassend eine pharmakologisch wirksame Menge des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein medizinisches Hilfsmittel.

9. Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Mittel zur Stimulierung der Immunität ist.

10. Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Mittel für die Heilung eines malignen Tumors ist.

11. Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Mittel zur Förderung der Produktion eines Cytokins ist.

12. Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Mittel zur Heilung einer Entzündung ist.

13. Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Mittel zur Vorbeugung oder Heilung einer durch Strahlen verursachten Verletzung ist.